CN103533939A

CN103533939A - 多发性骨髓瘤治疗

Info

Publication number: CN103533939A
Application number: CN201280021432.XA
Authority: CN
Inventors: C·J·伯恩斯; A·斯宾塞; K·A·莫纳汉
Original assignee: Australia Ym Bioscience Private LP
Current assignee: YM Biosciences Australia Pty Ltd; Australia Ym Bioscience Private LP
Priority date: 2011-05-02
Filing date: 2012-05-01
Publication date: 2014-01-22
Also published as: EP2704722A1; AP2013007281A0; CA2834414A1; BR112013028420A2; WO2012149602A1; AU2012250491A1; MA35129B1; EA201391591A1; MD20130089A2; US20140171433A1; CL2013003143A1; SG194212A1; MX2013012785A; ZA201308918B; EP2704722A4; IL228981A0; KR20140081757A; CO6900134A2; JP2014514337A; PE20140750A1

Abstract

治疗表现为处于下列阶段的多发性骨髓瘤的受试者的方法，所述阶段的特征是MM细胞的占有率增加，所述MM细胞(1)是IL-6无应答的和/或(2)具有CD45-表型，所述方法包括向所述受试者施用一定量的式Ib化合物：

Description

多发性骨髓瘤治疗

技术领域

本发明涉及酶，Janus激酶2或JAK2。更具体地，本发明涉及JAK2抑制剂在治疗多发性骨髓瘤和相关的骨髓增生性肿瘤中的用途。

背景技术

多发性骨髓瘤(MM)是一种定位于骨髓的、无法治愈的、耐药的克隆B细胞恶性肿瘤，其最终与浆细胞过度产生单克隆抗体有关，导致破坏性溶骨性病变以及肾功能不全和心功能不全形式的终末器官损害。目前的研究集中于减少白介素(IL-6)活性的药剂，据认为白介素-6通过其对负责浆细胞生长和增殖的JAK/STAT途径的刺激在MM的发病机理中起核心作用。

在缺少外源性IL-6的情况下，一些人骨髓瘤细胞系(HMCL)不能增殖或存活[9,10]，并且一些常规药物在IL-6的存在下无效[11-13]。已知为MM细胞提供支持信号的骨髓微环境(BMME)产生IL-6[14]，因此减小IL-6的促存活效应可能清除MM的耐药表型。

Janus激活激酶(JAK)是被充分表征的信号传导激酶，其包括4个家族成员JAK1、JAK2、JAK3和TYK2，它们在血液恶性肿瘤中很重要，因为已经表明JAK突变对骨髓增生性病症[1-3]和白血病[4]两者的发病机理有促进作用。JAK在多种细胞的信号传导中具有确定的作用[由5综述]。在MM中，JAK被多种细胞因子激活，这些细胞因子包括白介素-6(IL-6)[6,7]、干扰素-α[6,8]和表皮生长因子[6]。JAK的许多下游途径被恶性细胞利用。

近年来已经开发了各种JAK抑制剂，并且正在研究它们作为MM治疗的实用性。CYT387是一种新型JAK抑制剂，其可以抑制JAK1、JAK2、JAK3和TYK2激酶活性[15,16]。近年来已经描述了该化合物的结构和开发[17]。目前正处于研发的各个阶段的其他JAK抑制剂包括INCB000020[18]、NCB16562[19]、AG490[20,21]、AZD1480[22]和吡啶酮6[23],以及WP1066[24]。鉴于IL-6在MM耐药中的推定作用，正在研究JAK抑制剂作为用于MM的单一药剂或联合治疗的潜在用途。此外，初步体外数据已经证明抑制JAK/STAT以使MM细胞对常规治疗敏感的可能性[21]。

尽管这些努力，MM仍然是一种无法治愈的疾病，每年导致11,000人死亡，并且每年影响16,000名另外的患病者。提供用于治疗患有这种疾病的受试者的其他药剂和方法将是有用的。

发明内容

现在已经发现CYT387在多发性骨髓瘤的治疗中有效，且特别是在多种形式的MM——其中靶MM细胞是CD45和/或IL-6无应答的——的治疗中有效。因此相对于也表现出JAK抑制活性的其他药剂，CYT387的这种作用扩展了可以治疗的多发性骨髓瘤的类型。

更具体地，且在其一个方面中，本发明提供了CYT387抑制具有CD45表型的MM细胞的生长和/或增殖，即生存力的用途。另外，且在其另一个方面中，本发明提供了CYT387抑制被认为IL-6无应答的MM细胞的生长和/或增殖,即，生存力的用途。具有类似于CYT387的JAK激酶抑制谱的化合物也可用于本发明的方法中。

CYT387的活性允许治疗处于疾病的较晚阶段的MM，此时MM细胞在表型上从CD45+表型转变成主要是CD45-表型,由此能够延长对治疗绝望的患者的存活。

在相关的方面，本发明的方法包括下列的步骤：评估受试者或从其获得的生物样品，确定满足上述标准中的至少一个的多发性骨髓瘤受试者，然后使用CYT387或相关化合物治疗所确定的受试者。

在本发明的另一个方面，提供了制品，其包含CYT387或相关化合物以及指示治疗表现为至少一种所述标准的受试者的标签。

在本发明的相关方面，提供了试剂盒，其包含CYT387或相关化合物以及印刷的说明书，所述印刷的说明书教导基于本文所述的选择标准选择用于CYT387或相关化合物治疗的受试者的方法。

现在参考附图更详细地说明本发明的这些和其他方面和实施方式，在附图中：

附图说明

图1:CYT387防止IL-6的下游信号传导或共培养刺激。在存在或不存在CYT387(0.5–2μM)的条件下将HMCL温育1小时，然后用10ng/ml IL-6刺激15分钟。然后收获细胞并测量p-STAT3(pY705)。(A)通过细胞内FACS，对几何平均荧光强度进行测量并作图(n=3，均值±SE,使用单因素ANOVA以及Tukey事后检验分析刺激细胞±CYT387，*=p<0.05,**=p<0.01,***=p<0.001)。(B)通过p-STAT3(pY705)的蛋白质印迹，总STAT3和α-微管蛋白作为加样对照。(C)使用与HS5永生化骨髓基质细胞或原代骨髓基质细胞的直接共培养(CC)或与HS5的transwell(TW)“仅可溶”CC在HMCL中也诱导p-STAT3。HMCL用CD38或CD138荧光标记，并在采用或不采用与2μM CYT387共同处理的条件下刺激15分钟。NCI-H929的代表性绘图,(n=3,对于NCI-H929,OCI-MY1和U266)。(D)在用或不用与2μM CYT387共同处理的条件下，使NCI-H929、OCI-MY1和U266细胞饥饿过夜并用5ng/ml IL-6和100ng/ml IGF-1刺激15分钟。通过细胞内FACS测量p-AKT(pS473)和p-ERK1/2(pT202/pY204)，将几何平均荧光强度对未处理的(UT)对照归一化并平均化(n=4，均值±SE。使用单因素ANOVA以及Tukey事后检验分析刺激细胞±CYT387，*=p<0.05,**=p<0.01)。

图2:CYT387抑制HMCL增殖。(A)CYT387以时间和剂量依赖方式抑制HMCL。在UT、CYT387(0.1,0.5,1,2.5或5μM)或载体(DMSO)的条件下，将IL-6表型HMCL(ANBL-6、OCIMY1、U266和XG-1)和非IL-6表型HMCL(LP-1、NCI-H929、OPM2和RPMI-8226)培养24,48和72小时。然后通过MTS分析测定细胞增殖(显示72小时数据,n=3，均值±SE)(B)甚至在IL-6的存在下，用CYT387处理抑制骨髓瘤细胞增殖。通过单独(未处理的)、与IL-6(10ng/ml)、与CYT387(0.5–1μM)或与IL-6和CYT387培养的HMCL的血细胞计数确定活细胞的绝对细胞数。在72小时内(仅在时间0处理)与CYT387的培养极大地减少HMCL的增殖。结果表示为三次独立实验的均值±SE。(C)CYT387阻止细胞周期。HMCL用CYT387(1μM或5μM)处理24和72小时，然后将它们饥饿并固定，并通过FACS分析细胞周期。CIH929UT或5μM CYT387的24或72小时的代表性细胞周期绘图，处于细胞周期的G2/M期的周期细胞的4次独立实验的均值±SE。

图3:CYT387诱导HMCL的凋亡。(A)NCI-H929的代表性膜联蛋白-V和碘化丙啶(PI)绘图。UT，载体(DMSO)处理的，24小时5μMCYT387处理和72小时5μM CYT387处理。(B)与UT相比，在CYT387处理后活(膜联蛋白-V-和PI-)细胞的比例。显示的数据为4次独立实验的均值±SE。

图4:CYT387在HMCL中与马法兰和硼替佐米有协同作用。(A)在CYT387处理(0.5–10μM)24和48小时处理后的NCI-H929、OCI-MY1和U266的剂量效应曲线，通过PI+细胞的比例减去背景死亡（background death）(未处理的)确定。4次独立实验的均值±SE。(B)CYT387与马法兰或硼替佐米的组合显示协同作用。使用通过Calcusyn软件计算的联合用药指数测量协同作用，其中小于1的值表示协同作用，针对用各种剂量/比率的药物杀死的细胞的分数作图。在马法兰和CYT387之间在一定范围的剂量/比率/细胞系和时间点观察到协同作用。硼替佐米和CYT387证明以18/24的组合有协同效应或几乎相加效应。从4次独立实验的均值的剂量效应曲线计算协同作用。

图5:CYT387作为单一药剂或与马法兰和硼替佐米组合诱导原代样品的凋亡。(A)在48小时CYT387处理(n=6)后凋亡的(Apo2.7+)CD38+CD45-原代患者骨髓瘤细胞的比例。(B)在24小时处理后CYT387和马法兰或硼替佐米之间的协同作用，通过calcusyn软件在原代患者CD38+CD45-细胞中确定。

具体实施方式

CYT387是苯基氨基嘧啶化合物，CAS登记号CAS1056634-68-4,化学名称为N-(氰甲基)-4-[2-[[4-(4-吗啉基)苯基]氨基]-4-嘧啶基]-苯甲酰胺,并且具有下面显示的结构：

CYT387的合成、剂型和治疗用途记述在2008年9月18日公开的WO2008/109943;和Blood,2010,115(25):5232-40中。当然，如果需要，CYT387可以以盐、溶剂化物或前药的形式使用。

“相关化合物”是通过它们的选择性JAK抑制特征和通过它们与下式的结构一致性而与CYT387相关的化合物、或其对映体、其前药或其药学上可接受的盐，其中相对于JAK3和激酶家族的其他成员，显示结合并抑制JAK2和JAK1的偏好：

其中

Z独立地选自N和CH;

R¹独立地选自H、卤素、OH、CONHR²、CON(R²)₂、CF₃、R²OR²、CN、吗啉代、硫代吗啉基、硫代吗啉代-1,1-二氧化物、取代的或未取代的哌啶基、取代的或未取代的哌嗪基、咪唑基、取代的或未取代的吡咯烷基，以及C_1-4亚烷基，其中碳原子任选地用被吗啉代、硫代吗啉基、硫代吗啉代-1,1-二氧化物、取代的或未取代的哌啶基、取代的或未取代的哌嗪基、咪唑基或取代的或未取代的吡咯烷基取代的NR^Y和/或O替代;

R²是取代的或未取代的C_1-4烷基;

R^Y是H或取代的或未取代的C_1-4烷基;

R⁸是R^XCN;

R^X是取代的或未取代的C_1-4亚烷基，其中多达2个碳原子可以任选地用CO、NSO₂R¹、NR^Y、CONR^Y、SO、SO₂或O替代;

R¹¹是H或C_1-4烷基

。

术语“C_1-4烷基”是指具有1-4个碳原子的直链或支链烃基。实例包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基。

术语“卤素”是指氟、氯、溴和碘。

术语“取代的”是指用选自下列的一个或多个基团取代的基团：C_1-4烷基、C_3-6环烷基、C_2-6烯基、C_2-6炔基、C_1-6烷基芳基、芳基、杂环基、卤代、卤代C_1-6烷基、卤代C_3-6环烷基、卤代C_2-6烯基、卤代C_2-6炔基、卤代芳基、卤代杂环基、羟基、C_1-6烷氧基、C_2-6烯氧基、C_2-6炔氧基、芳氧基、杂环氧基、羧基、卤代C_1-6烷氧基、卤代C_2-6烯氧基、卤代C_2-6炔氧基、卤代芳氧基、硝基、硝基C_1-6,烷基、硝基C_2-6烯基、硝基芳基、硝基杂环基、叠氮基、氨基、C_1-6烷基氨基、C_2-6烯基氨基、C_2-6炔基氨基、芳基氨基、杂环基氨基酰基、C_1-6烷基酰基、C_2-6烯基酰基、C_2-6炔基酰基、芳基酰基、杂环基酰基、酰基氨基、酰氧基、醛基、C_1-6烷基磺酰基、芳基磺酰基、C_1-6烷基磺酰基氨基、芳基磺酰基氨基、C_1-6烷基磺酰氧基、芳基磺酰氧基、C_1-6烷基硫苯基、C_2-6烷基硫苯基、芳基硫苯基（sulphenyl）、烷氧基羰基、芳氧基羰基、巯基、C_1-6烷硫基、芳硫基、硫代酰基、氰基等。优选的取代基选自C_1-4烷基、C_3-6环烷基、C_2-6烯基、C_2-6炔基、C_1-6烷基芳基、芳基、杂环基、卤代、卤代芳基、卤代杂环基、羟基、C_1-4烷氧基、芳氧基、羧基、氨基、C_1-6烷基酰基、芳基酰基、杂环基酰基、酰基氨基、酰氧基、C_1-6烷基硫苯基、芳基磺酰基和氰基。

术语“芳基”是指芳族烃的单个、多核、缀合或稠合的残基。实例包括苯基、联苯基、三联苯基、四联苯基、萘基、四氢萘基、蒽基、二氢蒽基、苯并蒽基、二苯并蒽基(dibenxanthracenyl)和菲基(phenanthrenyl)。

术语“不饱和的含N的5元或6元杂环基”是指含有至少一个氮的不饱和的环状烃基。

合适的含N杂环基团包括含有1-4个氮原子的不饱和的5元至6元单杂环基团，例如，吡咯基、吡咯啉基、咪唑基、吡唑基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、三唑基或四唑基；含有1-2个氧原子和1-3个氮原子的不饱和的5元或6元单杂环基团，诸如，

唑基、异

唑基或

二唑基；以及含有1-2个硫原子和1-3个氮原子的不饱和的5元或6元单杂环基团，诸如，噻唑基或噻二唑基。

在优选的实施方式中，与CYT387相关的化合物包括其中R¹在对位被吗啉基取代且在邻位被H取代，Z是碳，且R¹¹是H、甲基或甲氧基的那些。

在特别优选的实施方式中，R⁸是–C(O)-NH-CH₂-CH=N;–C(O)-NH-C(CH₃)₂CH=N;或-NH-C(O)-CH₂-CH=N。

根据本发明的方法可使用的与CYT387相关的具体化合物包括：

N-(氰甲基)-4-(2-(4-吗啉代苯基氨基)嘧啶-4-基)苯甲酰胺;

N-(氰甲基)-3-(2-(4-吗啉代苯基氨基)嘧啶-4-基)苯甲酰胺;

N-(氰甲基)-3-甲基-4-(2-(4-吗啉代苯基氨基)嘧啶-4-基)苯甲酰胺;

N-(氰甲基)-2-甲基-4-(2-(4-吗啉代苯基氨基)嘧啶-4-基)苯甲酰胺;

2-氰基-N-(3-(2-(4-吗啉代苯基氨基)嘧啶-4-基)苄基)乙酰胺;

2-氰基-N-(3-(2-(4-吗啉代苯基氨基)嘧啶-4-基)苯基)乙酰胺;

N-(氰甲基)-4-(2-(3-吗啉代苯基氨基)嘧啶-4-基)苯甲酰胺;

N-(氰甲基)-4-(2-(4-硫代吗啉代苯基氨基)嘧啶-4-基)苯甲酰胺;和

N-(氰甲基)-4-(2-(4-(吗啉代甲基)苯基氨基)嘧啶-4-基)苯甲酰胺。

在本发明中，CYT387和相关化合物被用于治疗具有CD45阴性(CD45-)表型的多发性骨髓瘤(MM)细胞，和/或被认为IL-6无应答的MM细胞。MM细胞是形成浆细胞瘤肿瘤的患病细胞，其是多发性骨髓瘤的标志。“CD45-表型”是指对于已知为CD45——其是所有造血干细胞的公知标志物——的蛋白标志物的表面表达测试呈阴性或暗淡——与中间至明亮完全不同——的MM细胞。CD45-表型在本文中也参照MM细胞群描述，其中在该群内CD45-细胞的占有率超过该群的至少约10%，诸如该群的至少约15%、或20%、或25%、或30%、或35%、或40%、或45%或至少约50%。使用荧光标记的CD45单克隆抗体和已建立的荧光激活细胞分选(FACS)技术或用于鉴定结合CD45抗体的细胞的任何相关手段很容易实现对细胞表面上CD45的检测。参考文献例如可以参见由Moreau等人,Haematologica,2004,89(5):547,和由Kumar等人,Leukemia,2005,19:1466发表的文章，这些文章的公开内容通过引用并入本文中。

“IL-6无应答的”MM细胞被确定为不依赖于白介素-6(IL-6)的存在存活的细胞。因此，就诸如IL-6受体刺激或下游信号传导事件而言，当与另外刺激量的IL-6温育时，IL-6无应答的MM细胞显示无实质性的应答。此类MM细胞可以具体地包括驻留在骨髓环境中并且因此在与骨髓基质细胞相同的环境中生长的那些MM细胞，但它们还包括循环中的不暴露于骨髓环境的MM细胞。

在MM及其进展和发展的范围内，CD45代表疾病MM细胞的早期标志物。随着疾病的进展，那些细胞的CD45表型发生转变，其中CD45+细胞的主导地位下降，而疾病浆细胞群体变成CD45-占优势(参见Kumar等人,Leukemia,2005,19(8):1466)。IL-6无应答的细胞的数目也发生转变，此细胞形式在疾病的晚期变得占优势。

在本发明的方法中，提议使用JAK抑制剂来治疗MM细胞,和由其产生的浆细胞瘤肿瘤，它们已经获得CD45-和/或IL-6无应答的表型。已知对IL-6受体的刺激的JAK2应答据认为在MM进展中具有核心和重要的作用，JAK抑制对此特定细胞群的效果是令人惊奇的。即使当此IL-6途径不参与MM疾病进展时，CYT387也起抑制这些细胞的生长和/或增殖的作用。

“相关病症”是与MM相关的病症，为以产生单克隆蛋白(M蛋白，或副蛋白)的造血B细胞的克隆群为特征的浆细胞病症。这些病症的临床表现由浆细胞克隆的不受控制的和进行性增殖，正常骨髓置换的效应，和单克隆蛋白的过多产生导致。MM是浆细胞失调并且包括新诊断的以及复发的MM。

使用已建立的诊断标准和分期参数中的任一种可以确定表现为MM的受试者，大多数主要是人患者。这些包括由国际多发性骨髓瘤基金会（International Myeloma Workshop）建立的标准，其通过M蛋白在血清或尿中的存在，克隆性骨髓浆细胞增多症或浆细胞瘤和相关的器官和组织损害将有症状的MM受试者与具有无症状MM或意义未定的丙种球蛋白病(MGUS)的那些受试者区分开。对于MM的分期，可以使用由西南肿瘤小组(Southwest Oncology Group)(SWOG)提出的指南，其基本上依赖于测量B2-微球蛋白和血清蛋白的相对存在，>5.5mg/Lβ2-M和<3.0g/dL指示IV期疾病。使用Duire和Salmon分期体系(使用血红蛋白、血清钙、放射线照相术和M蛋白)已经建立了其他有用的指南。

在本发明的方法中，选择用于治疗的受试者是那些表现为MM的受试者，他们还表现出在MM细胞群内CD45-细胞的存在增加。相对于患有冒烟型MM或MGUS的受试者，在具有新诊断的或复发的MM的受试者中观察到CD45-细胞的存在增加。具有CD45-MM细胞的占有率相对大幅度增加的受试者具体包括诊断为疾病III期或IV期的那些MM受试者。在优选的实施方式中，该群体内CD45-细胞的数目为总群体的至少10%，诸如总MM细胞群的15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%或更高。因此，在从受试者提取的100个MM细胞的代表性样品中，被靶向通过本发明的方法治疗的患者群体包括那些表现为其中10-50%或更多的MM细胞对于CD45标志物测试呈阴性的MM细胞群的患者。

在本发明的方法中，诊断有MM的受试者首先被筛选以选择表现为其中相对于患有早期阶段的疾病——诸如冒烟型MM阶段——的受试者CD45-表型增加的MM细胞群的那些受试者。利用从受试者提取的MM细胞群实现筛选，然后诸如通过基于CD45MAb的流式细胞术确定其中存在CD45-MM细胞增加的受试者来测定该群体。MM细胞群也可以被评估以揭示IL-6无应答的细胞的占有率，其存在指示该受试者是通过本发明的方法治疗的候选者。

为了在本发明方法中使用，CYT387或相关化合物根据标准制药实践进行配制。

化合物可以被制成为药学上可接受的盐，诸如药学上可接受的阳离子诸如钠、钾、锂、钙、镁、铵和烷基铵的盐；药学上可接受的无机酸诸如盐酸、正磷酸、硫酸、磷酸、硝酸、碳酸、硼酸、氨基磺酸和氢溴酸的酸加成盐；或药学上可接受的有机酸诸如乙酸、丙酸、丁酸、酒石酸、马来酸、羟基马来酸、富马酸、柠檬酸、乳酸、粘酸、葡糖酸、苯甲酸、琥珀酸、草酸、苯基乙酸、甲磺酸、三卤代甲磺酸、甲苯磺酸、苯磺酸、羟乙磺酸、水杨酸，对氨基苯磺酸、天冬氨酸、谷氨酸、依地酸、硬脂酸、棕榈酸、油酸、月桂酸、泛酸、鞣酸、抗坏血酸、戊酸和乳清酸的盐。胺基团的盐也可以包括季铵盐，其中氨基氮原子携带合适的有机基团诸如烷基、烯基、炔基或芳烷基部分。

当化合物拥有手性中心时，化合物可以用作纯化的对映体或非对映体，或任何比率的立体异构体的混合物。然而，优选的是该混合物包含至少70%、80%、90%、95%、97.5%或99%的优选异构体，其中所述优选异构体提供所需水平的功效和选择性。

也可以施用式Ib化合物的前药。例如，具有游离氨基、酰胺基、羟基或羧酸基团的式Ib化合物可以转变成前药。前药包括其中氨基酸残基，或两个或更多个(例如，两个、三个或四个)氨基酸残基的多肽链通过肽键与本发明的化合物的游离氨基、羟基和羧酸基团共价连接的化合物。氨基酸残基包括通常由三个字母符号表示的20种天然存在的氨基酸，并且还包括4-羟基脯氨酸、羟基赖氨酸、锁链赖氨酸(demosine)、异锁链赖氨酸(isodemosine)、3-甲基组氨酸、正缬氨酸、β-丙氨酸、γ-氨基丁酸、瓜氨酸、高半胱氨酸、高丝氨酸、鸟氨酸和甲硫氨酸砜。前药还包括其中碳酸酯、氨基甲酸酯、酰胺和烷基酯与本发明的化合物的上述取代基通过羰基碳前药侧链共价键合的化合物。前药还包括通过磷-氧键与式Ib化合物的游离羟基连接的化合物的磷酸酯(盐)衍生物(诸如，酸，酸的盐，或酯)。前药还可以包括式Ib中合适的氮原子和硫原子的N-氧化物和S-氧化物。

所述化合物可以作为包含至少一种式Ib化合物和药学上可接受的载体的药物组合物施用。所述载体必须是“药学上可接受的”，意味着其与组合物的其他成分相容并且对受试者无害。该组合物可以包含如下所述的其他治疗剂，并且可以例如通过采用常规固体或液体媒介物或稀释剂，以及适合于所需给药模式的类型的药物添加剂(例如，赋形剂、粘合剂、防腐剂、稳定剂、矫味剂等)根据药物配制领域所公知的技术(参见，例如，Remington:The Science and Practice of Pharmacy,21st Ed.,2005,Lippincott Williams&Wilkins)进行配制。

所述化合物可以通过任何合适的方式给药，例如，经口，诸如以片剂、胶囊剂、颗粒剂或散剂的形式；经舌下；经颊部；胃肠外,诸如通过皮下、静脉内、肌内、皮内(透皮)，或脑池内注射或输注技术(例如，作为无菌可注射水性或非水性溶液或悬浮液)；经鼻，诸如通过雾化吸入或吹入；局部，诸如以软膏剂或油膏剂的形式；经眼部，以溶液或悬浮液的形式；经阴道，以阴道栓剂、卫生棉塞或软膏剂的形式；或经直肠，诸如以栓剂的形式；以含有无毒的药学上可接受的媒介物或稀释剂的剂量单位制剂。所述化合物可以，例如以适合于立即释放或延长释放的形式给药。立即释放或延长释放可以通过使用合适的包含所述化合物的药物组合物，或具体在延长释放的情况下，通过使用诸如皮下植入物或渗透泵的装置来实现。

用于给药的药物组合物可以方便地以剂量单位形式存在，并且可以通过药学领域中公知的任何方法制备。这些方法通常包括使式Ib化合物与构成一种或多种辅料成分的载体结合的步骤。通常，通过使化合物与液体载体或细碎的固体载体或两者均匀地和紧密地结合，然后，如果需要，将产物成形为所需的制剂来制备药物组合物。在所述药物组合物中，活性目标化合物以足以在疾病的过程或状况下产生所需的效应的量包含在其中。如本文所用，术语“组合物”意图涵盖包含特定量的特定成分的产品，以及直接地或间接地由特定量的特定成分的组合得到的任何产品。

药物组合物可以是适合于口服使用的形式，例如片剂、药片、锭剂、水性或油性混悬剂、可分散性散剂或颗粒剂、乳剂、硬或软胶囊剂、或糖浆剂或酏剂）。意图口服使用的组合物可以根据本领域所知晓的用于制造药物组合物的任何方法制备，并且这些组合物可以含有一种或多种药剂，诸如甜味剂、矫味剂、着色剂和防腐剂，例如以提供药学上稳定的和适口的制剂。片剂含有与适合用于制造片剂的无毒的药学上可接受的赋形剂混合的式Ib化合物。这些赋形剂可以是，例如惰性稀释剂，诸如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；成粒剂和崩解剂，例如玉米淀粉，或褐藻酸；粘合剂，例如淀粉、明胶和阿拉伯胶，和润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。片剂可以是未包衣的，或者它们可以通过已知技术被包衣以延缓在胃肠道内的崩解和吸收并且因此提供长时间的持续作用。例如，可以采用延时材料诸如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。它们还可以被包衣以形成用于控制释放的渗透泵治疗片剂。

用于口服使用的制剂还可以作为硬明胶胶囊提供，其中式Ib化合物与惰性固体稀释剂，例如碳酸钙、磷酸钙或高岭土混合，或作为软明胶胶囊提供，其中式Ib化合物与水或油介质，例如花生油、液体石蜡或橄榄油混合。

水性混悬剂含有与适合于制造水性混悬剂的赋形剂混合的活性物质。这些赋形剂是助悬剂，例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍树胶和阿拉伯树胶；分散剂或润湿剂可以是天然存在的磷脂，例如卵磷脂或环氧烷与脂肪酸的缩合产物，例如聚氧乙烯硬脂酸酯，或环氧乙烷与长链脂族醇的缩合产物，例如十七烷乙烯氧基十六醇，或环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇的偏酯的缩合产物，例如聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯，或环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合产物，例如聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯。水性混悬剂还可以包含ー种或多种防腐剂，例如对羟基苯甲酸乙酯或正丙酯、一种或多种着色剂、一种或多种矫味剂以及一种或多种甜味剂，诸如蔗糖或糖精。

可通过将式Ib化合物悬浮在植物油，例如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油，或矿物油，例如液体石蜡中来配制油性混悬剂。油性混悬剂还可以包含增稠剂，例如蜂蜡、固体石蜡或鲸蜡醇。可以加入甜味剂，例如上文所述的那些，以及矫味剂以提供适口的口服制剂。这些组合物可以通过加入抗氧化剂如抗坏血酸来保存。

适于通过加入水而制备水悬浮液的可分散性散剂和颗粒剂提供与分散剂或润湿剂、助悬剂和ー种或多种防腐剂混合的化合物。适当的分散剂或润湿剂以及助悬剂的实例如上文所提及的那些。还可以存在其它的赋形剂，例如甜味剂、矫味剂和着色剂。

所述药物组合物还可以是水包油型乳剂的形式。油相可以是植物油，例如橄榄油或花生油，或矿物油，例如液体石蜡，或它们的混合物。适当的乳化剂可以是天然存在的树胶，例如阿拉伯树胶或黄蓍树胶，天然存在的磷脂，例如大豆、卵磷脂，以及衍生自脂肪酸和己糖醇酐的酯或偏酯，例如脱水山梨糖醇单油酸酯，和所述偏酯和环氧乙烷的缩合产物，例如聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯。乳剂还可以包含甜味剂和矫味剂。

可以用甜味剂如甘油、丙二醇、山梨醇或蔗糖配制糖浆剂和酏剂。此类制剂还可包含缓和剂、防腐剂、矫味剂和着色剂。

所述药物组合物可以是无菌可注射用水性或油性混悬剂的形式。此混悬剂可以根据已知方法使用如上所述的那些合适的分散剂或润湿剂和助悬剂进行配制。无菌可注射用制剂还可以是在无毒的胃肠外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射用溶液或悬浮液，如在1,3-丁二醇中的溶液。在可以采用的可接受的媒介物和溶剂中的是水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。另外，无菌的不挥发性油常规地被用作溶剂或悬浮介质。为此目的，可以采用任何温和的不挥发性油，包括合成的甘油一酯或甘油二酯。另外，脂肪酸诸如油酸发现用于制备可注射用制剂。

对于向呼吸道的给药，包括鼻内给药，活性化合物可以通过本领域中采用的用于向呼吸道给药的任何方法和制剂给药。

因此，通常活性化合物可以以溶液或悬浮液的形式或作为干粉给药。

溶液和悬浮液通常是水性的，例如由水单独制成(例如无菌的或无热原水)，或由水和生理学可接受的共溶剂(例如乙醇、丙二醇或聚乙二醇诸如PEG400)制成。

此类溶液或悬浮液可以另外含有其他赋形剂，例如防腐剂(诸如苯扎氯铵)，增溶剂/表面活性剂，诸如聚山梨醇酯(例如，Tween80、Span80、苯扎氯铵)，缓冲剂，等渗性调节剂(例如氯化钠)，吸收促进剂和粘度促进剂。悬浮液可以另外地包含助悬剂(例如微晶纤维素和羧甲基纤维素钠)。

溶液或悬浮液通过常规的方式直接施用到鼻腔，例如，采用点滴器、吸液管或喷雾器。制剂可以以单剂量或多剂量形式提供。在后者的情况下，合乎需要地提供剂量计量的方式。在点滴器或吸液管的情况下，这可以通过受试者施用合适的、预定体积的溶液或悬浮液来实现。在喷雾器的情况下，这可以例如通过计量雾化喷雾泵的方式来实现。

向呼吸道的给药也可以通过气溶胶制剂的方式来实现，其中化合物在具有合适推进剂，诸如氯氟烃(CFC)，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷或二氯四氟乙烷，二氧化碳或其他合适的气体的加压包中提供。气溶胶也可以方便地含有表面活性剂，诸如卵磷脂。活性化合物的剂量可以通过提供计量阀来控制。

可选地，活性化合物可以以干粉的形式提供，例如在合适的粉体基体，诸如乳糖、淀粉、淀粉衍生物如羟丙基甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)中的化合物的粉末混合物。方便地，粉末载体将在鼻腔中形成凝胶。粉末组合物可以以单位剂量形式存在，例如在明胶的胶囊或药筒中，或在泡罩包装中，粉末可以通过吸入器的方式由它们给药。

在意图向呼吸道给药的制剂中，包括鼻内制剂，活性化合物通常将具有小的粒度，例如大约5微米或更小。这种粒度可以通过本领域中已知的方式获得，例如，通过微粉化。

当需要时，可以采用适于提供活性化合物的持续释放的制剂。

活性化合物可以作为自由流动粉末经由“Diskhaler”(Glaxo GroupLtd的商标)或计量剂量气溶胶吸入器通过经口吸入给药。

化合物也可以以用于药物的直肠给药的栓剂形式给药。这些组合物可以通过将药物与合适的无刺激性赋形剂混合，所述赋形剂在常温下是固体但在直肠温度下是液体并且因此将在直肠中熔化而释放药物。此类物质是可可脂和聚乙二醇。

适合于阴道给药的组合物可以作为除了活性成分以外还含有本领域中已知的合适载体的阴道栓剂、卫生棉塞、软膏剂、凝胶剂、糊剂、泡沫剂或喷雾剂存在。

对于局部施用，采用含有所述化合物的软膏剂、油膏剂、凝胶剂、溶液剂或混悬剂等。为了本申请的目的，局部应用可以包括漱口剂和含潄剂。

对于向眼部的应用，活性化合物可以为在合适的无菌水性或非水性媒介物中的溶液或悬浮液的形式。还可以包括添加剂，例如缓冲剂、防腐剂，包括杀菌剂和杀真菌剂，诸如乙酸或硝酸苯汞、苯扎氯铵、或洗必泰（chlorohexidine）和增稠剂，诸如羟丙基甲基纤维素。

所述化合物还可以以脂质体的形式给药。如本领域已知的，脂质体通常源自磷脂或其他脂质物质。脂质体通过分散在水性介质中的单层或多层水合液体晶体形成。可以使用能够形成脂质体的任何无毒的、生理学上可接受的和可代谢的脂质。本发明的脂质体形式的组合物除了本发明的化合物以外可以含有稳定剂、防腐剂、赋形剂等。优选的脂质是磷脂和磷脂酰胆碱，天然的和合成的。形成脂质体的方法是本领域中已知的。

所述化合物还可以用于兽医用组合物的形式中，其可以例如通过本领域中常规的方法制备。此类兽医用组合物的实例包括适用于下列的那些：

(a)口服给药，外部施用，例如兽用顿服药(drench)(例如，水性或非水性溶液或悬浮液；片剂或大丸药；用于与饲料混合的散剂、颗粒剂或药丸；用于施用到舌头上的糊剂；

(b)胃肠外给药，例如通过皮下、肌内或静脉内注射，例如，作为无菌溶液或悬浮液；或(当适用时)通过乳房内注射，其中悬浮液或溶液经由乳头引入至乳房内；

(c)局部施用，例如作为施用到皮肤上的软膏剂、油膏剂或喷雾剂；或

(d)经直肠或经阴道，例如作为阴道栓剂、软膏剂或泡沫剂。

药物组合物还可以包含如本文所述的其他治疗活性化合物，其通常应用于上述病理状况的治疗中。用于联合治疗中的合适药剂的选择可以由本领域普通技术人员根据常规制药原理进行。治疗剂的组合可以协同地作用以实现上述各种病症的治疗或预防。使用这种方法，可能能够实现以各种药剂的较低剂量实现疗效，由此降低了不良副作用的可能性。

其他治疗剂的实例包括下列：内皮素受体拮抗剂（如安倍生坦、波生坦、司他生坦），PDE-V抑制剂（如西地那非、他达拉非、伐地那非），钙通道阻滞剂（如氨氯地平、非洛地平、异搏定（varepamil）、地尔硫卓、薄荷脑），前列环素，曲罗尼尔，伊洛前列素，贝前列素，一氧化氮，氧，肝素，华法林，利尿剂，地高辛，环孢菌素（例如，环孢素A），CTLA4Ig，抗体诸如ICAM-3，抗-IL-2受体（抗Tac），抗CD45RB，抗CD2，抗CD3（OKT3），抗CD4，抗CD80，抗CD86，阻断CD40和gp39之间的相互作用的药剂，如对CD40和/或gp39（即CD154）特异的抗体，由CD40和gp39（CD401g和CD8gp39）构建的融合蛋白，NFκB功能的抑制剂，诸如核转位抑制剂，如脱氧精胍菌素（DSG），胆固醇生物合成抑制剂如HMG CoA还原酶抑制剂（洛伐他汀和辛伐他汀），非甾体类抗炎药（NSAID）如布洛芬，阿司匹林，对乙酰氨基酚，来氟米特，脱氧精胍菌素，环氧合酶抑制剂诸如塞来昔布，类固醇激素诸如强的松或地塞米松，金化合物，β-受体激动剂诸如沙丁胺醇，LABA类诸如沙美特罗，白三烯拮抗剂诸如孟鲁司特，抗增殖剂诸如甲氨蝶呤，FK506（他克莫司，普乐可复），霉酚酸酯，细胞毒性药物诸如硫唑嘌呤，VP-16，依托泊苷，氟达拉滨，doxorubin，阿霉素，安吖啶，喜树碱，阿糖胞苷，吉西他滨，氟脱氧尿苷，马法兰和环磷酰胺，抗代谢药物诸如氨甲喋呤，拓扑异构酶抑制剂诸如喜树碱，DNA烷化剂诸如顺铂，激酶抑制剂如索拉非尼，微管毒剂诸如紫杉醇，TNF-α抑制剂诸如替尼达普，抗TNF抗体或可溶性TNF受体，羟基脲和雷帕霉素（西罗莫司或雷帕鸣）或其衍生物。

在一个实施方式中，MM受试者用CYT387或相关化合物与马法兰的组合进行治疗。

在另一个实施方式中，MM受试者用CYT387或相关化合物与硼替佐米的组合进行治疗。

当其他治疗剂与本发明的化合物联合应用时，它们可以例如以医生案头参考资料(PDR)中提到的用量使用或由本领域普通技术人员另外确定的用量使用。

在优选的实施方式中，本发明的方法利用CYT387与选自马法兰和硼替佐米的化合物的组合。

本发明还提供制品和试剂盒，其包括容器，所述容器包含有效治疗MM的量的CYT387或相关化合物。容器可以简单地是包含口服剂量形式的化合物的瓶子，每个剂量形式包含单位剂量的化合物，所述单位剂量的量为例如约50mg至400mg,诸如200mg或300mg。所述试剂盒将进一步包含印刷的说明书，所述印刷的说明书教导选择用于治疗的受试者的本发明方法。所述制品将包含标签等，其指示根据本发明的选择患者方法治疗受试者。

通常，术语“治疗”意指影响受试者、组织或细胞以获得所需的药理学和/或生理学效应并且包括：(a)预防疾病在对所述疾病可能易感但还没有被诊断为患有所述疾病的受试者中发生;(b)抑制所述疾病，即，停止其发展；或(c)缓解或减轻所述疾病的影响，即，使所述疾病的影响消退。在一个实施方式中，治疗在接受的受试者中实现减少CD45-和/或IL-6无应答MM细胞的数目的效果。

术语“受试者”是指具有需要通过本发明方法治疗的疾病的任何动物。除了灵长类动物，诸如人类以外，各种其他哺乳动物也可以使用本发明的方法治疗。例如，可以治疗包括但不限于奶牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、豚鼠、大鼠或其他牛科、羊科、马科、犬科、猫科、啮齿目或鼠科物种的哺乳动物。具体已知狗会经历多发性骨髓瘤。

术语“给药”应当被理解为意指向需要治疗的受试者提供本发明的化合物。

术语“治疗有效量”是指将对研究者、兽医、医学博士或其他临床医生所探寻的组织、系统、动物或人引起生物学或医学反应的化合物量。

在多发性骨髓瘤的治疗或预防中，适当的化合物剂量水平将通常为约0.01-500mg/kg患者体重/天，其可以以单次或多次剂量给药。优选地，该剂量水平将为约0.1至约250mg/kg/天；更优选地为约0.5至约100mg/kg/天。合适的剂量水平可以为约0.01至250mg/kg/天，约0.05至100mg/kg/天，或约0.1至50mg/kg/天。在此范围内，剂量可以为0.05至0.5，0.5至5或5至50mg/kg/天。对于口服给药，组合物优选地以片剂的形式提供，所述片剂含有1.0至1000毫克活性成分，具体地1.0,5.0,10.0,15.0.20.0,25.0,50.0,75.0,100.0,150.0,200.0,250.0,300.0,400.0,500.0,600.0,750.0,800.0,900.0和1000.0毫克的活性成分。剂量可以选择为，例如这些范围中的任一个内的任何剂量，以对待治疗的患者根据疗效和/或症状调整剂量。所述化合物将优选地以每天1-4次，优选一天一次或两次的治疗方案给药。

要理解对于任何具体患者的具体剂量水平和给药频次可以发生变化并将取决于各种因素包括采用的具体化合物的活性，该化合物的代谢稳定性和作用时长，年龄，体重，一般健康状况，性别，饮食，给药模式和时间，排泄率，药物组合，具体病症的严重性，以及经历治疗的宿主。

为了例示本发明的本质使得其可以更清晰地被理解，提供下面的非限制性实施例。

在本说明书中提及的所有出版物通过引用并入本文中。本领域技术人员将理解，在不背离被广义描述的本发明的精神或范围的情况下，可以对在具体实施方式中所示的发明做出大量的变化和/或改动。因此，本发明的实施方式在所有方面都被认为是说明性的而非限制性的。

实施例

CYT387是激酶JAK1和JAK2的抑制剂，其已经被认为在已知为骨髓增生性肿瘤包括骨髓纤维化的血液学病症家族中有意义，以及在大量病症中有意义，包括在血液学、肿瘤学和炎性疾病中的适应证。骨髓纤维化是一种慢性衰竭性疾病，其中患者的骨髓被瘢痕组织代替，并且对其的治疗选择有限或不令人满意。

CYT387的合成

4-乙氧基羰基苯基硼酸(23.11g,119mmol)、2,4-二氯嘧啶(16.90g,113mmol)、甲苯(230mL)和碳酸钠水溶液(2M,56mL)的混合物被强力搅拌，并使氮气通过悬浮液鼓泡15分钟。加入四(三苯基膦)钯[0](2.61g,2.26mmol)。使氮气再通过鼓泡10分钟，将混合物加热至100.℃,然后在75℃过夜。将混合物冷却，用乙酸乙酯(200mL)稀释，加入水(100mL)，并分离各层。水层用乙酸乙酯(100ml)萃取，合并两种有机萃取物。有机物用盐水洗涤，通过硫酸钠过滤，浓缩，所得的固体与甲醇(100mL)研磨并过滤。固体用甲醇(2x30mL)洗涤并风干。将此物质溶解在乙腈(150mL)和二氯甲烷(200mL)中，用MP.TMT Pd-清除树脂(Agronaut part number800471)(7.5g)搅拌2天。过滤溶液，用二氯甲烷(2×100mL)洗涤固体，并将滤液浓缩得到4-(2-氯嘧啶-4-基)苯甲酸乙酯，其为灰白色固体(17.73g,60%)—用二氯甲烷进行额外的洗涤得到另外的1.38g和0.5g产物。

将4-(2-氯嘧啶-4-基)苯甲酸乙酯(26.15g,99.7mmol)和4-吗啉代苯胺(23.10g,129.6mmol)的混合物悬浮在1,4-二

烷(250mL)中。加入对甲苯磺酸一水合物(17.07g,89.73mmol)。将混合物加热回流40h.，冷却至环境温度，浓缩，然后将残余物分配在乙酸乙酯和1:1饱和碳酸氢钠/水(总计1L)之间。有机相用水(2×100mL)洗涤并浓缩。水相用二氯甲烷(3×200mL)萃取。通过过滤收集在此后处理（workup）过程中沉淀的物质并搁在一边。将液态有机物合并，浓缩，与甲醇(200mL)研磨并过滤得到额外的黄色固体。将固体合并，悬浮在甲醇(500mL)中，使其静置过夜，然后超声处理并过滤。用甲醇(2×50mL)洗涤固体，在干燥后，得到4-(2-(4-吗啉代苯基氨基)嘧啶-4-基)苯甲酸乙酯(35.39g,88%)。

将4-(2-(4-吗啉代苯基氨基)嘧啶-4-基)苯甲酸乙酯(35.39g,87.6mmol)在3:1甲醇/四氢呋喃(350mL)中的溶液用在水(90mL)中的氢氧化锂(4.41g,183.9mmol)处理。混合物加热回流2h.,冷却，浓缩并用盐酸(2M,92.5mL,185mmol)酸化。过滤黑色沉淀物，用水洗涤，并在真空下干燥。用研钵和杵棒将固体碾磨成粉末，与甲醇(500mL)研磨，然后再次过滤得到4-(2-(4-吗啉代苯基氨基)嘧啶-4-基)苯甲酸，其为泥状固体。将该物质用乙醚（ether）洗涤，风干过夜，并且用研钵和杵棒将其碾磨成细粉。在质量回收率(34.49g)的基础上，产率被假定为是定量的。

向4-(2-(4-吗啉代苯基氨基)嘧啶-4-基)苯甲酸(理论上为32.59g,86.6mmol)在DMF(400mL)中的悬浮液中加入三乙胺(72.4mL,519.6mmol,6eq.)。将混合物超声处理以确保溶解。加入氨基乙腈盐酸盐(16.02g,173.2mmol)，然后加入N-羟基苯并三唑(无水的,14.04g,103.8mmol)和1-乙基-3-(二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(19.92g,103.8mmol)。将悬浮液强力搅拌过夜。减压蒸发溶剂，残余物用5%碳酸氢钠(400mL)和水(300mL)稀释，得到黄色固体，将其粉碎并过滤。固体用多份100mL水洗涤数次，与热甲醇/二氯甲烷(500mL,1:1)研磨，浓缩成大约300mL的体积)，冷却并过滤。固体用冷甲醇(3×100mL),乙醚(200mL)和己烷(200mL)洗涤，然后干燥得到CYT387(31.69g,88%).M.p.238-243℃。

相关化合物的合成记述在Burns等人，Bioorganic&MedicinalChemistry Letters,2009,19:5887和在WO2008/109943中，两篇文献的公开内容通过引用并入本文中。

材料和方法

试剂

将JAK1/2抑制剂CYT387溶解在DMSO中。将蛋白酶体抑制剂硼替佐米(Janssen-Cilag)在盐水中重构。将烷化剂马法兰(Sigma)溶解在0.5%HCl.EtOH中。将所有药物储备溶液在完全RPMI-1640培养基中稀释成用于实验的各种浓度。

细胞系和培养条件

HMCL LP-1、NCI-H929、OPM2、RPMI-8226和U266以及人基质细胞系HS5获自美国模式培养物保藏所（American Type CultureCollection），USA。ANBL6、OCI-MY1和XG-1由Winthrop P RockefellerCancer Institute,Arkansas馈赠。HMCL在补充有10%热灭活胎牛血清(FBS,Lonza)和2mM L谷氨酰胺(Gibco,Invitrogen)的RPMI-1640培养基(Gibco,Invitrogen)中以2.0和5.0×105细胞/ml的密度生长和处理。IL-6依赖性细胞系根据需要用2–5ng/ml IL-6培养。所有细胞培养在37℃具有5%CO2的加湿温育箱中。所有HMCL在实验安排前24小时传代以确保高生存力和周期。

原代样品

在签署知情同意书并得到Alfred医院研究和伦理委员会(AlfredHospital Research and Ethics Committee)批准后从来自复发性和难治性MM患者的骨髓抽吸物获得原代MM样品，并如以前所述将其分离和处理[25]。简言之，用Ficoll-Paque Plus(Amersham Biosciences)分离骨髓单核细胞(BMMC)，将其在PBS中洗涤，并用NH4Cl溶液(8.29g/L氯化铵，0.037g/L EDTA,1g/L碳酸氢钾)溶解红细胞。然后将细胞再次在PBS中洗涤，并通过血细胞计数器进行定量。BMMC样品然后在完全RPMI-1640培养基(如上面用于HMCL的)中培养24小时。随后将BMMC以5×105细胞/ml铺板，并单独用CYT387(5–50μM)或(取决于细胞数)与硼替佐米(5–40nM)或马法兰(50–200μM)组合处理24和/或48小时。然后通过染色CD45FITC(BD),CD38PerCP-Cy5.5(BD)和Apo2.7PE(Immunotech)确定CD45-CD38+MM细胞中的凋亡，将药物诱导的MM特异性细胞凋亡与未处理的对照和载体对照进行比较。随后通过FACS分析样品。也从患者BMMC采集原代骨髓基质细胞(BMSC)，将在最初24小时培养后粘附在培养瓶上的细胞培养经数代继续选择粘附细胞。一旦细胞在培养中被扩充，则将它们被用于共培养(CC)以与利用HS5基质细胞系的实验平行地刺激MM细胞。

蛋白质印迹(WB)

HMCL用CYT387(1或2μM)处理60分钟，然后用10ng/ml IL-6刺激15分钟。CYT387处理的和未处理的HMCL的蛋白质溶解物用RIPA缓冲液(50mM Tris.HCl pH7.4,150mM NaCl,1mM PMSF,1mM EDTA,5μg/ml抑肽酶,5μg/ml亮抑肽酶,1%曲拉通X-100,1%脱氧胆酸钠和0.1%SDS)制备。简言之，将细胞在冰上的RIPA缓冲液中温育30–60分钟，然后以16,100×g在4℃离心20分钟，并收集上清液。使用DC蛋白质测定法(Bio-Rad)根据制造商的说明书定量蛋白浓度。随后，100μg每种蛋白质溶解物通过10%SDS-PAGE分离并使用Bio-Rad半干转移系统(Bio-Radsemi-dry transfer system)点样在硝酸纤维素(Hybond ECL,Amersham)上。膜用5%脱脂奶粉、0.1%吐温-20/PBS封闭60分钟，然后与鼠单克隆抗磷酸化-STAT3(pY705,Santa Cruz)、鼠单克隆抗-STAT3(Santa Cruz)或鼠单克隆抗α-微管蛋白(Sigma-Aldrich)在室温下温育1-2小时或在4℃温育过夜。印迹在0.1%吐温-20/PBS中洗涤3次，15分钟，然后与二级HRP标记抗体(猪抗兔Ig HRP(Dako)或兔抗鼠Ig HRP(Dako))在室温下温育1–2小时，然后如上进行洗涤。印迹用Supersignal west pico ECL试剂(Pierce)可视化。

细胞内FACS

JAK/STAT、PI3K/AKT和Ras/MAPK途径的激活使用细胞内流式细胞术测量STAT3在酪氨酸705(p-STAT3)处，AKT在丝氨酸473(p-AKT)处和ERK1/2在苏氨酸202和酪氨酸204(p-ERK)处的磷酸化进行研究。HMCL用10ng/ml IL-6±200ng/ml IGF-1单独刺激或在用或不用CYT387处理的情况下在与HS5基质细胞或原代BMSC的CC中进行刺激。对于CC，HS5和原代BMSC以2×105细胞/ml接种在24孔板中，并使其放置4小时，之后，加入用CD38或CD138FITC(BD)预染色的HMCL。MM细胞单独刺激(10ng/ml IL-6或5ng/ml IL-6和100ng/ml IGF-1),或在用或不用60分钟CYT387预处理或15分钟CYT387共处理的情况下在CC(与基质的直接CC或与基质的transwell(TW)CC)中进行刺激。在刺激±处理后，将MM细胞收获并用2%多聚甲醛固定10–30分钟，洗涤，然后用甲醇透化过夜。洗掉甲醇并将细胞重悬浮在p-STAT3PE(BD),p-AKT PE(BD)或p-ERK(BD)中，并在室温下染色45–60分钟。洗掉未结合的抗体，并将细胞重新悬浮在2%FBS PBS中，并通过FACS获得。

增殖和生存力测定

CYT387处理的HMCL和未处理的对照/载体对照的生存力和增殖使用如以前所述的各种方法测定[26]。首先使用Celltiter96AQeous单溶液细胞增殖测定MTS试剂(Promega)在一组8种HMCL上测量增殖。细胞以2.0×105细胞/ml于96孔板中在100μl新鲜培养基中与CYT387(0.1–5μM)一起培养24、48和72小时。加入20μl MTS试剂用于最后4小时的处理，并且使用Fluostar Optima平板读数仪(BMG Labtech)在490nm对培养板读数。还通过台盼蓝染色和血细胞计数器计数测量在与或不与IL-6共处理的情况下用CYT387处理的一组5种HMCL的活细胞数目。然后选择HMCL NCI-H929、OCI-MY1和U266用于进一步分析。CYT387处理的细胞的凋亡通过FACS用膜联蛋白-V和碘化丙啶(PI)染色评估。HMCL用1或5μM CYT387处理24或72小时，然后收获并在膜联蛋白缓冲液(0.01HEPES,0.14M NaCl,2.5mM CaCl2,pH7.4)中洗涤，并用在膜联蛋白缓冲液中配制的膜联蛋白-V FITC(Biosource)在室温下染色30分钟。然后用膜联蛋白缓冲液洗掉未结合的抗体，并将细胞重悬浮在具有62.5ng/ml PI(Sigma-Aldrich)的膜联蛋白缓冲液中并通过FACS分析。

对于协同实验，HMCL用CYT387组合硼替佐米或马法兰处理24和48小时，然后将其收获并重悬浮在补充有62.5ng/ml PI(Sigma-Aldrich)的FACS缓冲液(在PBS中的0.5%HI FBS)中。细胞立即通过FACS分析。通过减去未处理细胞的背景死亡定量PI阳性细胞的比例。单一药物处理的细胞与组合处理的细胞相比较，并且使用Calcusyn软件(Biosoft)计算协同作用。

细胞周期

在24和72小时后测量CYT387处理对HMCL细胞周期的影响。收获CYT38(1或5μM)处理的和未处理的HMCL，在PBS中洗涤，并将其重悬浮在100μl PBS中。用1ml冷70%乙醇固定细胞，同时进行涡旋。将试管保存在-20℃直至分析。一旦收集了所有样品，将试管以500×g离心10分钟，将上清液小心地去除，并将细胞在5ml PBS中洗涤。在最后洗涤后，将细胞重悬浮于250–500μl PI/RNase染色缓冲液(BD)中并在暗处在室温温育15分钟，然后通过FACS进行分析。

数据分析

所有FACS数据在BD FACScalibur上获取，并且使用Flowjo7.6软件(Treestar,USA)完成数据分析。使用GraphPad Prism5.03软件(USA)完成所有统计学分析。

结果

JAK/STAT信号传导被CYT387抑制。通过JAK/STAT途径的IL-6信号传导在MM细胞中得到充分表征，其中IL-6与其受体的结合诱导JAK2磷酸化STAT3。CYT387抑制JAK2的能力首先通过蛋白质印迹和FACS测量STAT3磷酸化水平而得到证实。HMCL(NCI-H929、OCI-MY1和U266)与CYT387温育1小时，然后用IL-6刺激15分钟以诱导p-STAT3。CYT387(0.5–2μM)抑制IL-6刺激样品中STAT3的磷酸化，如通过FACS(图1A)证明和通过蛋白质印迹(图1B)证实的。总STAT3蛋白不受影响。

鉴于BMME在MM生长和存活中的重要性，重要的是确定CYT387是否可以类似地调节在与BMSC的CC中的MM细胞的信号传导。这采用永生化BMSC(HS5)和原代患者BMSC两者来完成。在每种情况下，与BMSC(接触或不接触)的CC进行15分钟能够诱导MM细胞中的STAT3的磷酸化，而用CYT387的同时处理极大地减少了HMCL中p-STAT3的量(图1C)。因此，证明CYT387能够防止MM-BMSC微环境内的可溶物所诱导的MM细胞中的STAT3激活以及由BMSC向MM提供的接触诱导的信号传导。

CYT387抑制PI3K/AKT和Ras/MAPK信号传导

JAK信号传导激酶参与许多细胞途径，使得我们去探究在NCI-H929、OCI-MY1和U266细胞中CYT387对IL-6和IGF-1诱导的PI3K/AKT和Ras/MAPK信号传导的影响(图1D)。在IL-6和IGF-1刺激后OCI-MY1显示截然不同的p-AKT激活，其被CYT387共处理显著地减少。IL-6和IGF-1刺激在U266细胞中诱导p-ERK，其被CYT387显著地抑制。在NCI-H929中p-AKT和p-ERK的水平响应于IL-6和IGF-1刺激仅显示小的增加。

CYT387抑制HMCL中的增殖

CYT387(0.1-5μM)对细胞增殖的影响通过对一组8种HMCL(IL-6无应答表型——LP-1,NCI-H929,OPM2,RPMI-8226和IL-6应答表型——ANBL-6,OCI-MY1,U266和XG-1)在24,48和72小时进行MTS测定来测量(图2A)。在24小时内8种HMCL中的6种对CYT387具有时间和剂量依赖性响应，在一些HMCL中发生抑制。在72小时时，NCI-H929和XG-1对CYT387处理最敏感。

还通过血细胞计数器对活细胞数目定量来评估在72小时内用CYT387培养的HMCL的增殖(图2B)。因为IL-6信号传导和CYT387对JAK2的抑制之间的明显关系，在添加IL-6和/或CYT387的情况下测量3种HMCL(NCI-H929、OCI-MY1和U266)的增殖。在补充或不补充10ng/ml IL-6的条件下3种HMCL在完全培养基中均增殖良好，并且CYT387(0.5–1μM)能够减少培养中的HMCL的增殖，即使在IL-6的存在下。72小时后，CYT387抑制细胞增殖达50%的NCI-H929(1μM),50%的OCI-MY1(0.5μM)和44%的U266(1μM)。

用CYT387处理HMCL导致处于细胞周期G2/M期的细胞积累

通过评价用CYT387处理的HMCL的细胞周期来进一步表征CYT387的抗增殖效应。用CYT387(1–5μM)处理的HMCL(NCI-H929、OCI-MY1和U266)显示处于细胞周期G2/M期的细胞显著积累。这在NCI-H929细胞中最突出(图2C)，其中与未处理的或载体处理的对照相比，在24和72小时处理后，在药物处理的样品中处于G2/M的细胞有2倍多的增加。在CYT387处理的样品中发现了另外的多倍体群，表明CYT387处理导致与MM细胞的正常细胞周期的进一步偏离。

CYT387诱导HMCL和原代MM细胞中的凋亡

使用膜联蛋白-V/碘化丙啶FACS染色在3种HMCL(NCIH929、OCI-MY1和U266)中研究CYT387处理的细胞的凋亡。在所有3种HMCL中检测到凋亡细胞的比例增加，在NCI-H929中最明显(图3A)，在用5μM CYT387处理后，在24和72小时时分别检测到活细胞21和52%的减少(图3B)。为了评估CYT387作为联合疗法的部分，用一定范围剂量的CYT387、硼替佐米、马法兰处理NCI-H929、OCI-MY1和U266以确定在与CYT387联合和使用CalcusynTM软件测量协同作用前各个药物的剂量效应曲线。每种化合物生成的剂量效应曲线(马法兰和硼替佐米数据未显示)显示CYT387(0.5–10μM)在3种HMCL中以时间和剂量依赖方式诱导凋亡(图4A)。CYT387表现出与硼替佐米和马法兰两者均有协同作用，但在不同的药物剂量和分析时间点观察到协同的水平有变化(图4B)。

还研究了CYT387作为单一药剂和作为联合疗法的部分对离体原代MM细胞的影响。MM患者BMA与各种剂量的CYT387(5–50μM)培养24和48小时，之后，通过流式细胞术评估CD38+CD45-MM细胞群的凋亡。6名患者被治疗，并且在48小时后在5-59%的用20μM CYT387处理的MM细胞中观察到凋亡(图5A)。还研究了CYT387联合马法兰和硼替佐米的效应。观察到在2/3患者中CYT387与马法兰有协同作用，并且还观察到在一些患者/剂量下与硼替佐米的协同作用(图5B)。

讨论

多种证据已经证实了IL-6/JAK/STAT信号传导在MM中的作用，包括证明一些MM细胞的IL-6依赖性，IL-6对MM细胞增殖的上调，IL-6对药物诱导的凋亡的抑制，以及对本研究最重要的，通过抑制IL-6/JAK/STAT途径对MM细胞中凋亡的直接诱导的实验。这些数据和IL-6在BMME中的丰度使得JAK/STAT信号传导成为新化疗药物抑制的合理靶标并且得到初步体外研究的支持，所述体外研究已经证明经由JAK/STAT途径的siRNA靶向的MM细胞凋亡诱导[27]。此外，JAK在其他重要途径中的信号转导作用[由5综述]和JAK突变在其他血液恶性肿瘤中的促生存效应[1-4]已经证明JAK抑制的治疗潜力。然后，治疗上的挑战是在IL-6或BMSC的存在下抑制MM细胞。在此我们已经通过研究较宽范围的HMCL，通过在共培养模型的背景下证明CYT387可以抑制JAK-STAT激活，以及通过证明CYT387对原代MM肿瘤细胞的影响扩展了以前评价MM中的JAK抑制的工作。假设在MM的较早期阶段，恶性细胞为CD45+占优势，而在更晚期的耐药性疾病中，CD45MM细胞占优势[28]。而且，CD45-MM细胞被认为与CD45+MM相比对IL-6应答较少并且表达较少的IL-6受体[29]。JAK抑制的其他研究已经主要集中于CD45+IL-6响应HMCL，并且尽管这是初步研究的逻辑中心，但必须强调的是这些靶细胞群仅代表MM细胞的一个亚组。此外，患者可能是显示CD45-和CD45+MM细胞两者的混合群[29]。重要的是，我们已经证明CYT387针对NCI-H929——一种被认为具有IL-6无应答表型的HMCL——的有效性，提示CYT387将对一定范围的MM表型有效，而其他人[19]已经报道使用可选的JAK抑制剂针对CD45-MM仅有有限的成功。我们的数据证明了CYT387和硼替佐米或马法兰之间针对数种HMCL和原代MM肿瘤细胞的协同作用，证实了以前发表的工作[19]。

可获得的数据提示在MM细胞中对JAK的抑制可能具有不同于直接抑制JAK/STAT途径的下游效应。IL-6在MM细胞存活中的重要性已经就JAK/STAT途径进行了充分表征，但现在表现为不断增加的在各种HMCL中IL-6诱导的PI3K/AKT激活[18,30]和Ras/MAPK激活[20,30-33]的证据。鉴于在MM中除了JAK/STAT途径以外已确定的PI3K/AKT和Ras/MAPK途径两者的重要性，可以调节所有三种途径的小分子抑制剂具有巨大的临床潜力。

研究JAK抑制对PI3K/AKT和Ras/MAPK途径的影响得到了迥异的结果。已经显示AZD1480和AG490减少IL-6诱导的Ras/MAPK激活[20,22],但在他人手中AG490显示在IL-6诱导的Ras/MAPK激活中未减少[31]。JAK抑制剂INCB20可以抑制MM.1S细胞中IL-6诱导的Ras/MAPK激活，但不影响INA-6细胞中的组成性Ras/MAPK激活[18]。用AG490抑制JAK也消除了PTEN突变的OPM2MM细胞中AKT激活[30]。类似地，INCB20也可以抑制IL-6诱导的p-AKT，但对INA-6细胞中IGF-1诱导的p-AKT没有影响[18]。可利用的数据中的变化性可能是抑制剂的不同以及普遍研究的HMCL中的异质性的结果。在我们的研究中，在U266细胞中存在IL-6和IGF-1诱导的p-ERK的显著减少，以及在OCIMY1细胞中IL-6和IGF-1诱导的p-AKT的大幅减少，支持了其他人提示JAK抑制可以具有比最初预期的更宽的抗MM活性的数据。抑制IL-6诱导的JAK/STAT和PI3K/AKT信号传导也可以导致MM细胞表面上的IL-6R表达的减少[30],其也可以导致IL-6的促存活效应的减小。

在单一剂量后CYT387对各种HMCL的具有深远意义的抗增殖效应是其有效性的重要证明。此外，甚至在外源IL-6——其已经多次被证明是耐药性的介质[11-13]——的存在下CYT387抑制HMCL生长的能力是值得注意的。这种JAK抑制的显著效应可能是HMCL对用于增殖信号的JAK/STAT有一些依赖性的结果，或更可能是参与并随后抑制上面提及的可选信号传导途径。对增殖的效应也见于细胞周期分析中，这证明CYT387可以阻止细胞周期。

还感兴趣的是由CYT387处理诱导的另外的多倍性群(8n)，其可以提示JAK信号传导对导致细胞周期调节的作用或可以是CYT387抑制参与细胞周期的其他激酶——诸如由Pardanani等人，2009所描述的auroraB,aurora C,细胞周期蛋白A或细胞周期蛋白B——的结果。JAK抑制剂对细胞周期蛋白的直接或下游影响得到了对其他JAK抑制剂的研究的支持；Scuto等人发现AZD1480抑制两种HMCL中的细胞周期蛋白D2[22]。在原代骨髓共培养物中诱导MM细胞凋亡是对CYT387的潜力的至关重要的证明。相反，抑制IL-6信号传导的其他研究还没有证明当MM细胞在BMSC的存在下进行处理时凋亡的任何令人信服的证据[32]。研究人员认为这可能表示在BMSC的存在下MM细胞不依赖于IL-6。我们对CYT387的发现可以被解释为反驳了后者或可选地与JAK信号传导抑制中断非IL-6介导的存活途径的能力相一致。与后者一致的是用CYT387处理的原代MM样品代表了自体全骨髓共培养物，其中CD38+CD45-MM细胞占处理细胞的4-67%。因此，证明CYT387能够诱导这些难以处理的MM细胞的凋亡是特别令人鼓舞的。

其他的化合物评价

式Ib化合物可以在如在Dalton,W.和Anderson,K.C.,ClinicalCancer Research,2006:12(22),6603-6610中所述的多发性骨髓瘤的小鼠模型中进行测试。小鼠模型5T2MM和5T33MM在Dalton等人中被报道为具有类似于人类疾病的临床特征，包括多发性骨髓瘤细胞在骨髓中的定位，血清中可测量到的M-蛋白，诱导溶骨性骨病以及骨髓中增加的血管发生。两种模型因此可以用来测试式Ib化合物并且允许测试所述化合物是否影响疾病发作前或疾病发作后多发性骨髓瘤细胞的归巢。使用这些模型，可以确定所述化合物对血清M-蛋白水平的影响并且也可以确定所述化合物对抑制疾病发展的影响，诸如减少溶骨性骨病，减少肿瘤载荷和改善存活。

为了考察式Ib化合物对人骨髓瘤的影响，所述化合物可以针对人骨髓瘤在小鼠中的异种移植物模型进行测试。对于这些测试，人骨髓瘤肿瘤或细胞系的异种移植物模型可以移植到例如SCID-Hu或NOD/SCID小鼠中。SCID-Hu模型可以用来研究人微环境中的骨髓瘤并且还可以研究式Ib化合物对原代骨髓瘤细胞的可繁殖性生长的影响。NOD/SCID模型涉及用绿色荧光蛋白标记多发性骨髓瘤细胞。此模型可以用来跟踪疾病进展。

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Claims

1.治疗表现为处于下列阶段的多发性骨髓瘤的受试者的方法，所述阶段的特征是MM细胞的占有率增加，所述MM细胞(1)是IL-6无应答的和/或(2)具有CD45-表型，所述方法包括向所述受试者施用有效减少所述MM细胞的生存力的量的式Ib化合物:

其中

Z独立地选自N和CH;

R¹独立地选自H,卤素、OH、CONHR²、CON(R²)₂、CF₃、R²OR²、CN、吗啉代、硫代吗啉基、硫代吗啉代-1,1-二氧化物、取代的或未取代的哌啶基、取代的或未取代的哌嗪基、咪唑基、取代的或未取代的吡咯烷基，以及C_1-4亚烷基，其中碳原子任选地被用吗啉代、硫代吗啉基、硫代吗啉代-1,1-二氧化物、取代的或未取代的哌啶基、取代的或未取代的哌嗪基、咪唑基或取代的或未取代的吡咯烷基取代的NR^Y和/或O替代;

R²是取代的或未取代的C_1-4烷基;

R^Y是H或取代的或未取代的C_1-4烷基;

R⁸是R^XCN;

R^X是取代的或未取代的C_1-4亚烷基，其中多达2个碳原子可以任选地被CO、NSO₂R¹、NR^Y、CONR^Y、SO、SO₂或O替换;

R¹¹是H或C_1-4烷基，

或其对映体、其前药或其药学上可接受的盐。

2.治疗表现为多发性骨髓瘤的受试者的方法，包括以下步骤：(1)选择被诊断为IL-6无应答的和/或(2)具有CD45-表型的MM细胞的占有率增加的受试者进行治疗；和(2)向所述受试者施用有效减少所述MM细胞的生存力的量的权利要求1中所限定的式Ib化合物。

3.治疗表现为多发性骨髓瘤的受试者的方法，包括以下步骤：(1)从所述受试者获得MM细胞的样品；(2)分析所述MM细胞中的IL-6无应答的和/或具有CD45-表型的细胞的占有率；(3)选择其中所述MM细胞的占有率相对于处于多发性骨髓瘤早期阶段的受试者增加的受试者进行治疗，和(4)向所选择的受试者施用有效减少所述MM细胞的生存力的量的权利要求1中所限定的式Ib化合物。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述受试者用CYT387或其对映体、其前药或其药学上可接受的盐治疗，所述CYT38是N-(氰甲基)-4-[2-[[4-(4-吗啉基)苯基]氨基]-4-嘧啶基]-苯甲酰胺，具有下面显示的结构:

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述受试者患有新诊断的或复发的多发性骨髓瘤。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述受试者表现为其中至少10%的MM细胞是CD45-细胞的MM细胞群。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述受试者用CYT387和第二治疗剂进行治疗，所述第二治疗剂选自马法兰和硼替佐米。

8.制品，其包括容器和与所述容器相关联的标签，所述容器包含权利要求1所限定的式Ib化合物，所述标签指示治疗表现为其中MM细胞是IL-6无应答的或具有CD45-表型的新诊断的或复发的多发性骨髓瘤的受试者。

9.试剂盒，其包括容器和与其相关联的印刷说明书，所述容器包含可用于治疗其中MM细胞是IL-6无应答的或具有CD45-表型的新诊断的或复发的多发性骨髓瘤的量的权利要求1所限定的式Ib化合物，所述印刷说明书教导根据权利要求1-7中任一项所述的方法。