CN103460038A - 检测人类胚胎中的非整倍性的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于确定一个或多个胚胎或多潜能细胞的发育潜力和/或一个或多个胚胎或多潜能细胞中存在染色体异常的方法、组合物和试剂盒。这些方法、组合物和试剂盒在体外确定在人类中治疗不育症中最有用的胚胎和卵母细胞中有用。

Description

检测人类胚胎中的非整倍性的方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2011年2月23日提交的美国临时专利申请第61/445,863号和2011年9月21日提交的美国临时专利申请第61/537,336号的优先权，其两者为了所有目的通过引用全文并入本文。

发明领域

本发明涉及为了预测成活力和检测非整倍性的目的进行人类胚胎的生物和临床测试以及尤其是成像和评估的领域。2010年12月30日提交的美国申请第12/982,341号；2010年8月23日提交的美国申请第12/861,571号；2010年5月7日提交的美国申请第61/332,651号；2009年8月22日提交的美国申请第61/236,085号；2011年2月23日提交的美国申请第61/445,863号和2011年9月21日提交的美国申请第61/537,336号通过引用全文并入本文。

发明背景

美国处于生育期年龄的人口中近10-15%夫妇不能生育。因此，很多不育夫妇已选择体外受精(IVF)，IVF在20世纪八十年代初期就引入美国。根据美国疾病控制和预防中心，仅2006年，在美国就进行了约140,000个周期的IVF，而在2008年，这增加到差不多150,000个周期(cdc.gov/art)。这表明，寻找IVF的夫妇数量在增加，并且可能持续，如果一般人群继续推迟要孩子的话。根据这些IVF周期，估计每年产生超过一百万个胚胎，它们通常具有用于成功植入并且发育足月的可变并且很不明确的潜力。而且，IVF之后的每个周期平均活胎出生率仅为30%，并且自从30年前引入人类IVF以来，该百分率就未发生显著改变(cdc.gov/art)。尽管IVF失败的可能原因有可能不同，但是认为，染色体异常或非整倍性已促成所谓的IVF成功率和活胎出生率(Munne等人(2003)Reprod Biomed Online,7:91-97；Olgilvie(2008)Obstetrician&Gynaecol10:88-92)。

先前研究已表明，非整倍性存在于50-70%的卵裂期人类胚胎(Vanneste等人(2009)Nat Med,15:577-583；Johnson等人(2010)HumReprod25:1066-1075)中。尽管已尝试使形态学与非整倍性相关联，但是公知的是，非整倍性胚胎对于在传统IVF评价技术下转移通常看似正常且适合的(Baltaci等人(2006)Reprod Biomed Online12:77-82)。目前，最常用的用于诊断非整倍性的方法是第3天活检卵裂球的预植入基因筛检(PGS)，该方法对于胚胎是侵入性的，遭受镶嵌性(mosaicism)并且仅由较少比例的辅助生殖患者采用(Kuo等人，(1998)J.AssistReprod Genet,15:276-280；Baart等人，(2006)Hum Repro21:223-233)。替代方法诸如延长培养胚胎至胚泡期和经由滋养外胚层活检分析染色体状态也已用于评价非整倍性。然而，另外的潜在风险(包括引入表观遗传变异、胚胎停滞和其它破坏胚胎完整性的因素)被认为与延长的胚胎培养有关(Khosla等人，(2001)Hum Reprod Update,7:419-427；Katari,等人(2009)Hum Mol Genet,18:3769-3778；Lim等人，(2009)Hum Reprod24:741-747；Fernandez-Gonzalez等人，(2009)Reproduction137:271-283。

基础胚胎发育领域中的认知受到限制，因为对人类胚胎生物学的研究仍然具有争议并且常常从研究资金中免除。结果，胚胎发育的现有知识中的大部分来源于模式生物的研究。然而，当来自不同物种的胚胎经历相似的发育时期时，时机因物种而不同。这些不同以及许多其他不同使得其不适于直接从一个物种推知到另一个物种(Taft,R.E.(2008)Theriogenology69(1):10-16)。人类发育的一般途径，以及根本的基本分子决定因素，对于人类胚胎发育来说是独一无二的。例如，在小鼠中，胚胎转录在受精后约12个小时被活化，与第一次卵裂分裂同时，而在人类胚胎中，胚胎基因活化(EGA)的主波发生在第3天，约8细胞时期(Bell,C.E.等人(2008)Mol.Hum.Reprod.14:691-701；Braude,P.等人(1988)Nature332:459-461；Hamatani,T.等人(2004)Proc.Natl.Acad.Sci.101:10326-10331；Dobson,T.等人(2004)Human Molecular Genetics13(14):1461–1470)。此外，很多在早期人类发育中被调节的基因是独一无二的(Dobson,T.等人(2004)Human Molecular Genetics13(14):1461–1470)。而且，在其他物种例如小鼠中，超过85%的体外培养的胚胎达到胚泡期(哺乳动物发育中的第一大界标之一)，而培养的人类胚胎具有约30-50%的平均胚泡形成率，以及镶嵌性和不正常表型例如碎裂和发育停滞的高发生率(Rienzi,L.等人(2005)Reprod.Biomed.Online10:669-681；Alikani,M.等人(2005)Mol.Hum.Reprod.11:335-344；Keltz,M.D.等人(2006)Fertil.Steril.86:321-324；French,D.B.等人(2009)Fertil.Steril.)。虽然有这些不同，但是大部分的植入前胚胎发育研究来源于模式生物并且很难与人类胚胎发育相关(Zernicka-Goetz,M.(2002)Development129:815-829；Wang,Q.等人(2004)Dev Cell.6:133-144；Bell,C.E.等人(2008)Mol.Hum.Reprod.14:691-701；Zernicka-Goetz,M.(2006)Curr.Opin.Genet.Dev.16:406-412；Mtango,N.R.等人(2008)Int.Rev.Cell.Mol.Biol.268:223-290)。

最近，已实现延时成像分析来监控发育中的人类胚胎并且潜在地评估成活力(Mio和Maeda(2008)Am J.Obstet Gynecol199:660-665；Nakahara等人，(2010)J Assist Reprod Genet,27:93-96)。除了提供评价早期胚胎发育的非侵入性方和避免其它限制诸如镶嵌性之外，检测和测量人类胚胎中的动态成像参数对于所有IVF患者是可得到的。在这些研究中，分析发育事件(包括受精、分裂、胚泡形成和胚胎孵化)并且在第3天与传统IVF形态学标准相关联。然而，没有与胚泡形成或妊娠结果有关的成像参数。其他方法已经关注作为指示的第一次卵裂的开始以预测人类胚胎的成活力(Fenwick等人(2002)HumanReproduction,17:407-412；Lundin等人(2001)Human Reproduction16:2652-2657)。然而，这些方法没有认可胞质分裂的持续时间或早期分裂之间的时间间隔的重要性。

其他方法也已经使用延时成像以测量早期胚胎发育期间细胞分裂的时机和程度(WO/2007/144001)。然而，这些方法仅公开用于牛胚胎的延时成像的基本和一般方法，其在发育潜力、形态学表现、分子和后生程序以及转移附近的时机和参数上基本上与人类胚胎不同。例如，牛胚胎与人类胚胎相比花费长得多的时间来植入(分别为30天和9天)。(Taft,(2008)Theriogenology69(1):10-16)。而且，没有公开可以预计人类胚胎成活力的特定的成像参数或时间间隔。

最近，延时成像已经被用于观察受精之后最初24小时期间的人类胚胎发育(Lemmen等人(2008)Reproductive BioMedicine Online17(3):385-391)。发现首次分裂之后细胞核的同步与妊娠结果有关。然而，这一工作得出结论早期首次卵裂不是重要的预计参数，其与之前的研究相矛盾(Fenwick等人(2002)Human Reproduction17:407-412；Lundin等人(2001)Human Reproduction16:2652-2657)。

最终，没有研究通过与胚胎的分子程序或胚胎的染色体组成相关联而确认成像参数。因此在若干方面缺少人类胚胎评估的方法并且可通过本方法改进，其包括时间间隔显微镜（time-lapse microscopy）的新应用、图像分析和成像参数与分子谱和染色体组成的关联性。令人惊讶的是，本发明人已发现某些细胞周期成像参数不仅预测胚胎成活力，而且通过将成像行为与经成像胚胎的染色体组成相关联来预测人类胚胎中的非整倍性(包括简单且复杂的镶嵌性、单体性和三体性)。

发明概述

提供了用于确定一个或多个胚胎的发育潜力和/或染色体组成的方法、组合物和试剂盒。这些方法在体外鉴定具有正常染色体组成和/或有利发育潜力即发育成为胚泡的能力(ability)或能力(capacity)的胚胎中是有用的，其因此在治疗人类中的不育症的方法中是有用的。

在本发明的一些方面中，提供了用于确定胚胎或多潜能细胞的发育潜力的方法。在这些方面中，测量胚胎或多潜能细胞的一个或多个细胞参数以获得细胞参数测量结果。然后细胞参数被用于提供对所述胚胎或多潜能细胞的发育潜力的确定，所述确定可被用于指导临床的行动方针。在一些实施方案中，细胞参数是通过时间间隔显微镜（time-lapse microscopy）可测量的形态学事件。在一些实施方案中，例如，当胚胎被测定时，所述一个或多个细胞参数是：胞质分裂事件例如胞质分裂1的持续时间；胞质分裂1和胞质分裂2之间的时间间隔和胞质分裂2和胞质分裂3之间的时间间隔。在某些实施方案中，细胞周期1的持续时间也用作细胞参数。在一些实施方案中，细胞参数测量结果通过将其与来自参考胚胎的可比较的细胞参数测量结果相比较并且使用这一比较的结果来提供所述胚胎发育潜力的确定来使用。在一些实施方案中，胚胎是人类胚胎。在一些实施方案中，细胞参数是被测量以获得基因表达测量结果的基因表达水平。在一些实施方案中，基因表达测量结果通过将其与来自参考多潜能细胞或胚胎或来自其的一个或多个细胞的基因表达测量结果相比较来使用，其中这一比较的结果被用来提供所述多潜能细胞或胚胎的发育潜力的确定。在一些实施方案中，所述胚胎通过体内卵母细胞的体外受精来制备。在其它实施方案中，所述胚胎通过体内卵母细胞的胞浆内精子注射来制备。在一些实施方案中，所述卵母细胞体外成熟。在其它实施方案中，所述卵母细胞体内成熟。在一些实施方案中，所述胚胎为非整倍体。

在本发明的一些方面中，提供了将证实具有有利发育潜力的胚胎转移至雌性动物的方法。在一些方面中，在有利于促进发育的条件下培养胚胎并且测量一个或多个细胞参数以获得细胞参数测量结果。细胞参数之后被用于提供对胚胎的发育潜力的确定。在一些实施方案中，细胞参数是通过时间间隔显微镜可测量的形态学事件。在一些实施方案中，例如当胚胎被测定时，所述一个或多个细胞参数是：胞质分裂事件例如胞质分裂1的持续时间；胞质分裂1和胞质分裂2之间的时间间隔；和胞质分裂2和胞质分裂3之间的时间间隔。在某些实施方案中，细胞周期1的持续时间也用作细胞参数。在一些实施方案中，提供了将一个或多个证实具有有利发育潜力的胚胎转移至雌性动物的方法。在一些实施方案中，所述胚胎是人类胚胎。在一些实施方案中，所述胚胎通过体内卵母细胞的体外受精来制备。在其它实施方案中，所述胚胎通过体内卵母细胞的胞浆内精子注射来制备。在一些实施方案中，所述卵母细胞体外成熟。在其它实施方案中，所述卵母细胞体内成熟。在一些实施方案中，在有利于促进发育的条件下在培养皿中培养胚胎。在一些实施方案中，所述培养皿含有一个或多个微孔。在进一步的实施方案中，在将胚胎转移至需要其的雌性动物受者之前首先从培养皿除去经确定具有有利发育潜力的胚胎。

在本发明的一些方面中，提供了用于检测胚胎中的非整倍性的方法。在本发明的这类方面中，提供了首先确定胚胎到达胚泡的潜力、然后确定存在或不存在胚胎中碎裂和/或其水平的方法，其中碎裂、特别是高碎裂水平的存在指示非整倍体胚胎。在一些实施方案中，到达胚泡的潜力通过确定一个或多个细胞参数来测量。在某些方面中，细胞参数包括第一胞质分裂的持续时间、胞质分裂1和胞质分裂2之间的时间间隔、胞质分裂2和胞质分裂3之间的时间间隔、直到第一细胞分裂的时间、胚胎形态学、基因表达模式、或本领域已知的确定胚胎到达胚泡的潜力的任何其它方法及其组合。

在本发明的一些方面中，提供了用于检测胚胎中的非整倍性的方法。在这类方面中，测量胚胎或多潜能细胞的一个或多个细胞参数以获得细胞参数测量结果。细胞参数测量结果被用于提供胚胎是否为非整倍体的确定，所述确定可被用于指导临床的行动方针。在一些实施方案中，细胞参数是通过时间间隔显微镜可测量的形态学事件。在一些实施方案中，例如当胚胎被测定时，所述一个或多个细胞参数是：胞质分裂事件例如胞质分裂1的持续时间；胞质分裂1和胞质分裂2之间的时间间隔；和胞质分裂2和胞质分裂3之间的时间间隔。在某些实施方案中，细胞周期1的持续时间也用作细胞参数。在一些实施方案中，提供了确定经确定为非整倍体的胚胎是否为归因于有丝分裂或减数分裂错误的非整倍体的方法。在一些实施方案中，所述胚胎是人类胚胎。在一些实施方案中，所述胚胎为非整倍体。在一些实施方案中，所述非整倍性是三体性。在一些实施方案中，所述三体性是三体性21。在其它实施方案中，所述非整倍性是单体性。在一些实施方案中，所述单体性是单体性22。在一些实施方案中，所述胚胎是人类胚胎。在一些实施方案中，所述胚胎通过体内卵母细胞的体外受精来制备。在其它实施方案中，所述胚胎通过体内卵母细胞的胞浆内精子注射来制备。在一些实施方案中，所述卵母细胞体外成熟。在其它实施方案中，所述卵母细胞体内成熟。在一些实施方案中，在测量细胞参数之前所述胚胎被冷冻。在其它实施方案中，在测量细胞参数之前所述胚胎未被冷冻。

在本发明的一些方面中，提供了用于选择具有正常染色体计数的胚胎的方法。在这类方面中，测量胚胎或多潜能细胞的一个或多个细胞参数以获得细胞参数测量结果。然后细胞参数被用于提供对所述胚胎是否具有正常染色体计数的确定，所述确定可被用于指导临床的行动方针。在一些实施方案中，细胞参数通过时间间隔显微镜可测量的形态学事件。在一些实施方案中，例如当胚胎被测定时，所述一个或多个细胞参数是：胞质分裂事件例如胞质分裂1的持续时间；胞质分裂1和胞质分裂2之间的时间间隔；和胞质分裂2和胞质分裂3之间的时间间隔。在某些实施方案中，细胞周期1的持续时间也用作细胞参数。在一些实施方案中，所述胚胎是人类胚胎。在一些实施方案中，所述胚胎通过体内卵母细胞的体外受精来制备。在其它实施方案中，所述胚胎通过体内卵母细胞的胞浆内精子注射来制备。在一些实施方案中，所述卵母细胞体外成熟。在其它实施方案中，所述卵母细胞体内成熟。在一些实施方案中，在测量细胞参数之前在有利于促进发育的条件下在培养皿中培养胚胎。在一些实施方案中，所述培养皿含有一个或多个微孔。在进一步的实施方案中，从培养皿除去经确定具有正常染色体计数的胚胎。在进一步的实施方案中，在从培养皿除去经确定具有正常染色体计数的胚胎之后将所述胚胎进一步移植至雌性动物受者中。

在本发明的一些方面中，提供了用于选择具有正常染色体计数的胚胎的方法。在本发明的这类方面中，提供了首先确定胚胎到达胚泡的潜力、然后确定存在或不存在胚胎中碎裂和/或其水平的方法，其中碎裂、特别是高碎裂水平的存在指示非整倍体胚胎并且碎裂的不存在指示具有正常染色体计数的胚胎。低碎裂水平与具有高碎裂水平的胚胎相比指示较低风险的非整倍性并且与根本没有碎裂的胚胎相比指示较高风险的非整倍性。换句话说，碎裂水平越低，则胚胎将为非整倍体的可能性越低，并且碎裂水平越高，则胚胎将为非整倍体的可能性越高。在一些实施方案中，到达胚泡的潜力通过确定一个或多个细胞参数来测量。在某些方面中，细胞参数包括，第一胞质分裂的持续时间、胞质分裂1和胞质分裂2之间的时间间隔、胞质分裂2和胞质分裂3之间的时间间隔、直到第一细胞分裂的时间、胚胎形态学、基因表达模式、或本领域已知的确定胚胎到达胚泡的潜力的任何其它方法及其组合。

在本发明的一些方面中，提供了将证实具有正常染色体计数的胚胎转移至雌性动物的方法。在一些方面中，在有利于促进发育的条件下培养胚胎并且测量一个或多个细胞参数以获得细胞参数测量结果。然后细胞参数被用于提供对胚胎是否具有正常染色体计数的确定。在一些实施方案中，细胞参数通过时间间隔显微镜可测量的形态学事件。在一些实施方案中，(例如)当胚胎被测定时，所述一个或多个细胞参数是：胞质分裂事件例如胞质分裂1的持续时间；胞质分裂1和胞质分裂2之间的时间间隔；和胞质分裂2和胞质分裂3之间的时间间隔。在某些实施方案中，细胞周期1的持续时间也用作细胞参数。在一些实施方案中，提供了用于将一个或多个具有正常染色体计数的胚胎转移至雌性动物的方法。在一些实施方案中，所述胚胎是人类胚胎。在一些实施方案中，所述胚胎通过体内卵母细胞的体外受精来制备。在其它实施方案中，所述胚胎通过体内卵母细胞的胞浆内精子注射来制备。在一些实施方案中，所述卵母细胞体外成熟。在其它实施方案中，所述卵母细胞体内成熟。在一些实施方案中，在测量细胞参数之前胚胎被冷冻。在其它实施方案中，在测量细胞参数之前胚胎未被冷冻。

在本发明的一些方面中，提供用于将胚胎或多潜能细胞按照它们相对于组中其他胚胎或多潜能细胞的染色体含量分级的方法。在这些实施方案中，测量所述组中的所述胚胎或多潜能细胞的一个或多个细胞参数以获得所述胚胎或多潜能细胞的每一个的细胞参数测量结果。然后将所述细胞参数测量结果用于确定所述组中所述胚胎或多潜能细胞的每一个相对于彼此的染色体含量，所述确定可被用于指导临床的行动方针。在一些实施方案中，细胞参数是通过时间间隔显微镜可测量的形态学事件。在一些实施方案中，(例如)当胚胎被分级时，一个或多个细胞参数是胞质分裂事件例如胞质分裂1的持续时间；胞质分裂1和胞质分裂2之间的时间间隔和胞质分裂2和胞质分裂3之间的时间间隔。在某些实施方案中，细胞周期1的持续时间也被测量。在一些实施方案中，将胚胎分级为具有正常染色体计数的胚胎，归因于有丝分裂错误的非整倍体或归因于减数分裂错误的非整倍体。在一些实施方案中，一个或多个细胞参数测量结果通过将来自所述组中的所述胚胎或多潜能细胞中的每一个的所述细胞参数测量结果彼此比较以确定所述胚胎或多潜能细胞相对于彼此的染色体含量。在一些实施方案中，所述一个或多个细胞参数测量结果通过将每个细胞参数测量结果与来自参考胚胎或多潜能细胞的细胞参数测量结果相比较以确定来自每个胚胎或多潜能细胞的染色体含量并且将这些染色体含量相比较以确定所述胚胎或多潜能细胞相对于彼此的染色体含量来使用。

附图简述

当结合所附附图阅读时，从下列详细描述最好地理解本发明。强调的是，根据惯例，附图的不同特征是不按比例的。相反，为了清楚不同特征的直径是任意放大或缩小的。附图包括下列各图。

图1是显示用于评估胚胎的流程图。

图2显示6天的时间段的细胞卵裂和分裂的一系列照片。图像被标明第1天至第6天。比例尺代表50μm。

图3是显示从1细胞胚胎(合子)成功发育为胚泡的百分比的柱状图。4个不同实验的过程中，通过时间间隔显微镜观察总共100个胚胎直到第5天或第6天。显示了达到每个标明的阶段(胚泡，8细胞、4至7细胞、2至3细胞和1细胞)的细胞的百分比。

图4是为了标明的时期而关注的一系列四个不同的胚胎。

图5是显示用于本评估的阶段之间的延时的图表，包括第一次胞质分裂的持续时间，第一次和第二次分裂之间的时间(测量为胞质分裂1的结束和胞质分裂2的开始之间的时间间隔)以及第二次和第三次有丝分裂之间的时间(测量为胞质分裂2的起始和胞质分裂3的起始之间的时间间隔)。

图6是显示一大组胚胎的三个事件的测量的3-D点图，包括第一次胞质分裂的持续时间，第一次和第二次细胞分裂之间的时间间隔(测量为胞质分裂1的结束和胞质分裂2的开始之间的时间间隔)以及第二次细胞和第三次细胞分裂之间的时间间隔(测量为胞质分裂2的起始和胞质分裂3的起始之间的时间间隔)。达到胚泡阶段的胚胎(用圆环标记)显示在3-D图上聚集在一起，而在达到胚泡前停滞的胚胎(用X标记)分散各处。

图7是显示用于使用3维形态学参数预测胚泡形成的接受者操作表征(ROC)曲线的图表。

图8是显示来自6个停滞的1至2细胞胚胎和5个正常的1至2细胞胚胎的52个基因的基因表达水平的雷达图表。如通过曼-惠特尼检验所确定的，正常和不正常胚胎之间的表达水平上的差异对于以黄色加亮并且用星号指示的那些基因来说是统计学上显著的。

图9是显示停滞的2细胞胚胎和正常的2细胞胚胎中不同基因的表达水平的柱状图。顶部显示停滞的2细胞胚胎的选择数量的延时图像。

图10是显示图9中在停滞的4细胞胚胎和正常的4细胞胚胎中存在的相同基因的比较的柱状图。顶部显示停滞的4细胞胚胎的选择数量的延时图像。

图11是显示具有4个不同模式的基因表达模式(ESSP)的一系列柱状图。标明的是胚胎基因活化(第2天)和第3天的典型表达之前的早期转移的时机。

图12显示来自不同阶段的单个卵裂球的基因的基因表达。(A)来自标绘在不同细胞时期的单个卵裂球的两个基因CTNNB1和CDX2的基因表达以及在不同阶段例如2细胞、3细胞、桑椹胚和胚泡这些基因表达水平上的变化。(B)柱状的基因表达标记代表与来自合子程序的基因表达比较的母体程序中的基因表达。

图13是用于使用延时图像分析和有关的分子分析测定胚胎成活力的模型的图。

图14是显示体外卵母细胞成熟过程中发育的三个阶段的一系列照片。

图15是显示体外卵母细胞成熟后胚胎发育的过程的一系列照片。

图16是显示用于测定卵母细胞的程序的流程图。

图17是显示用于测定干细胞和多潜能干细胞的程序的流程图。

图18是显示诱导的多潜能干细胞分化为神经元玫瑰花状簇(rosette)的过程的一系列照片。

图19是测定表达水平的基因可被分类的类别的表，包括每类别基因的数目。

图20是在141个正常发育的单个胚胎和单个卵裂球的基因表达分析中确定的四个胚胎期特异模式(ESSP)和将所述基因分类至这些类别中的每一个的表。

图21显示证明成像参数预测胚泡形成的能力的自动图像分析。(A)显示单个胚胎的跟踪算法的结果。(B)显示被分析的一组14个胚胎。(C)显示对胞质分裂的持续时间的手动图像分析与自动成像分析的比较。(D)显示对第一次和第二次有丝分裂之间的时间的手动图像分析的比较。(E)显示良好胚泡形态学与不良胚泡形态学的比较。

图22是根据本发明的暗视野显微镜的示意图；左边的插图显示激光加工的暗视野片装置。

图23是如图22中所描述的三个显微镜的阵列的示意图，装载在支架上以便安装在孵育器中并用与电脑连接。图23A显示显微镜而图23B显示显微镜内部和孵育器。

图24是在本操作中使用的图像捕获软件的屏幕截图，显示从3个通道成像的胚胎。

图25A至D是显示来自实验2，位置2的所选择的延时图像的一系列四张照片。图25A和25B是在培养基更换前捕获的图像而图25C和25D是在培养基更换后捕获的图像。

图26A至D是显示来自实验1，位置2的所选择的延时图像的一系列四张照片。图26A和26B是在培养基更换前捕获的图像而图26C和26D是在培养基更换后捕获的图像。

图27A和B是具有微孔的定制培养皿的图。图27A显示具有不同维数的培养皿的图而图27B显示微孔的3D视图。

图28A和B是显示具有和不具有前期图像配准的细胞活性的图表。图28A和28B一起显示配准净化了结果并且除去归因于胚胎移位或旋转的峰。

图29A和B是显示正常和不正常胚胎的细胞活性的图表(左)和细胞照片(右)。图29A和图29B一起显示在第三天胚胎具有相似的形态学但是它们的细胞活性曲线图却完全不同并且它们中仅一个发育为胚泡。

图30是显示胚胎发育期间连续成对图像之间的像素强度的差异的图表。这可被独立使用以测定胚胎成活力或作为通过确定应当使用多少粒子(预测的胚胎模型)改善其他算法例如粒子滤波器的方法。

图31A-G是显示不同细胞阶段的来自2D跟踪的结果的一系列七张照片。细胞过程通过与每个照片对相关联的帧序号标明：15帧(图31A)、45(B)、48(C)、189(D)、190(E)、196(F)和234(G)。底部箭头显示所覆盖的模拟图像。轮廓是可见的细胞膜而白色虚线是闭塞的膜。每5分钟捕获图像帧并且仅展示了一些。

图32A和B是显示3D细胞跟踪的两个成功实例的一系列照片和图。在胚胎的每张照片下的说明显示3D模型的俯视图，除了帧314和帧228，其分别在帧314和帧228中显示模型的侧视图。每5分钟捕获图像帧。

图33是1细胞至2细胞分裂的粒子滤波器结果的图解表示。数据点是细胞中心的3D定位。点显示1细胞模型、2细胞模型、3细胞模型和4细胞模型。顶部箭头显示预测之后的粒子而底部箭头显示重采样之后的粒子。

图34A和B是显示对一组14个胚胎的自动与手动分析的对比的图表。图34A显示第一次胞质分裂的持续时间的对比而图34B显示第一次和第二次有丝分裂之间的时间的对比。

图35是显示图像分析如何被用于模型胚胎并且测量某些形态学参数的流程图。

图36A、B和C是显示各时间参数中的每一个和基于时序参数中的每一个的正常胚胎、有丝分裂非整倍体和减数分裂非整倍体胚胎的聚集的三维图。

图37A是显示各时间参数中的每一个和基于时序参数中的每一个的正常胚胎、三倍体正常胚胎、单体性22胚胎、单体性其它胚胎、三体性21胚胎和三体性其它胚胎的聚集的三维图。B是显示正常胚胎、三体性胚胎和单体性胚胎中的每个染色体的拷贝数。拷贝数是基于染色体1相比于染色体2的平均信号的标准化的CGH值的log2比率。

图38A显示低镶嵌和高镶嵌胚胎中的每种染色体的拷贝数。拷贝数是基于染色体1相比于染色体2的平均信号的标准化的CGH值的log2比率。B是显示各时间参数中的每一个和基于时序参数中的每一个的低镶嵌和高镶嵌胚胎的聚集的三维图。

图39是显示各时间参数中的每一个和基于时序参数中的每一个的正常胚胎、三倍体正常胚胎、低镶嵌胚胎、高镶嵌胚胎、单体性22胚胎、单体性其它胚胎、三体性21胚胎和三体性其它胚胎的聚集的三维图。

图40是显示正常胚胎、具有有丝分裂错误的胚胎和具有减数分裂错误的胚胎的各时间参数分析的表。

图41A是显示各时间参数中的每一个和没有碎裂的整倍体胚胎、没有碎裂的非整倍体胚胎、具有碎裂的整倍体胚胎、具有碎裂的非整倍体胚胎、没有碎裂的正常三倍体胚胎和具有碎裂的正常三倍体胚胎的聚集的三维图；B是显示各时间参数中的每一个和具有碎裂的正常胚胎、具有碎裂的正常三倍体胚胎、归因于减数分裂错误的具有碎裂的非整倍体胚胎和归因于有丝分裂错误的具有碎裂的非整倍体胚胎的聚集的三维图；C是显示各时间参数中的每一个和具有碎裂的正常胚胎、具有碎裂的正常三倍体胚胎、具有碎裂的低镶嵌胚胎；和具有碎裂的高镶嵌胚胎的聚集的三维图；D是显示各时间参数中的每一个和具有高碎裂水平的胚胎和具有低碎裂水平的胚胎的聚集的三维图；E是显示各时间参数中的每一个和在1个细胞期、2个细胞期和3个或更多个细胞期碎裂起始的胚胎的聚集的三维图。

图42是显示评价胚胎的染色体异常的过程的流程图。

图43显示在预植入发育期间表观遗传擦除和转座子激活之间的关联。

图44显示碎裂的时序指示胚胎中的染色体异常。A显示取自延时序列的独立帧；B显示碎裂的时序和细胞周期成像参数之间的关系的3维图；C显示基于碎裂时序、再吸收和潜在的染色体异常的人类胚胎非整倍性的来源的建议模型。

图45显示隔离细胞碎片内的染色体的证据。A显示正确染色体拷贝数与不正确染色体拷贝数+或-碎裂之间的关系的3维图；B显示展示细胞碎裂的不含透明带的卵裂期胚胎的共焦成像；C显示通过差分图像对比度成像的另一碎裂胚胎的3维模型；D显示延时成像序列的最后帧，其在4-细胞期显示具有碎裂的胚胎。

发明详述

在描述本方法和组合物之前，应当理解的是，本发明不限于所描述的具体方法和组合物，因为这些当然可以变化。还应当理解的是，在本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，而不意为限制性的，因为本发明的范围将仅由所附的权利要求书限定

当提供数值的范围时，应当理解的是，在所述范围的上限和下限之间的每个中间值(自到所述下限的单位的十分之一，除上下文以其他方式明确地说明以外)也被特别地公开。在指定的范围内的任何指定的值或中间值与在该指定的范围内任何其它指定的值或中间值之间的每个更小的范围包含于本发明的范围内。这些更小的范围的上限和下限可以独立地包括或排除在所述更小的范围之内，任一、无一或两个限值包括在所述更小的范围之内时的每个范围也包含本发明的范围内，并受在所指定的范围内特别排除任何值的限制。当指定的范围包括两个限值之一或两者时，排除了所包括的限值之一或两者的范围也包括在本发明的范围之内。

除另外定义以外，本文使用的所有技术术语和科学术语与本发明所属技术领域普通技术人员通常所理解的含义相同。尽管类似于或等同于在本文描述的那些的任何方法和材料可以用于本发明的实践或试验，但现在描述了一些可能的和优选的方法和材料。在本文中提及的所有出版物通过引用并入本文以公开和描述与所述出版物所引用的相关的方法和/或材料。应当理解的是，当存在矛盾时，本公开内容替代所并入的出版物的任何公开。

必须注意的是，如在本文和在附随的权利要求书中使用的，除上下文中以其他方式明确说明以外，单数形式“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”，包括复数的指称对象。因此，例如，提及“一个细胞”包括多个这样的细胞，提及“该肽”包括提及一种或多种肽和本领域技术人员已知的其等价物，例如多肽，等等。

本文讨论的出版物仅为了其在本申请提交日之前的公开而提供。此处不应解释为承认本发明没有权利凭借在先发明而先于上述出版物。此外，所提供的出版物的日期可能不同于实际的出版日期，其可能需要被各自确认。

定义

提供了用于确定一个或多个胚胎或多潜能细胞的发育潜力和/或一个或多个胚胎或多潜能细胞中染色体异常的存在的方法、组合物和试剂盒。这些方法、组合物和试剂盒在体外确定在治疗人类中的不育症中最有用的胚胎和卵母细胞中有用。本发明的这些和其他的对象、优点和特征对本领域那些技术人员来说在阅读如下文更加全面地描述的主题方法和组合物的细节时变得显而易见。

术语“发育潜力”和“发育感受态”被用于本文意指健康胚胎或多潜能细胞生长或发育的能力(ability)或能力(capacity)。

术语“胚胎”本文被用于意指当两个单倍体配子细胞例如未受精的次级卵母细胞和精子结合以形成二倍体全能细胞例如受精的卵母细胞时形成的合子和由紧接随后的直到桑椹胚即16细胞阶段和胚泡阶段的细胞分裂例如胚胎卵裂(分化的滋养外胚层和内细胞团)产生的胚胎两者。

术语“多潜能细胞”本文被用于意指具有分化为生物体中多种类型的细胞的能力的任何细胞。多潜能细胞的实例包括干细胞卵母细胞和1细胞胚胎(即合子)。

术语“干细胞”本文被用于意指细胞或细胞群，其：(a)具有自我更新的能力和(b)具有产生不同的分化的细胞类型的潜力。通常，干细胞具有产生多重谱系的细胞的潜力。如本文所用的，干细胞可以是全能干细胞，例如受精的卵母细胞，其产生生物体的所有的胚胎和胚外组织；多潜能干细胞，例如胚胎干(ES)细胞，胚胎胚(EG)细胞或诱导的多潜能干(iPS)细胞，其产生生物体的所有胚胎组织，即内胚层、中胚层和外胚层谱系；多潜能干细胞，例如间质干细胞，其产生生物体的胚胎组织中的至少两种，即，内胚层、中胚层和外胚层谱系中的至少两种或其可以是组织特异性干细胞，其产生特定组织的多种类型的分化细胞。组织特异性干细胞包括产生特定组织的细胞的组织特异性胚胎细胞和位于成年组织中并且可产生这一组织的细胞的体干细胞，例如产生中枢神经系统的所有细胞的神经干细胞、产生骨骼肌的卫星细胞和产生造血系统的所有细胞的造血干细胞。

术语“卵母细胞”本文被用于意指未受精的雌性卵母细胞或配子。本申请的卵母细胞可以是初级卵母细胞，在这种情况下它们被放置通过或正在通过减数分裂I，或次级卵母细胞，在这种情况下它们被放置通过或正在通过减数分裂II。

“减数分裂”意指导致配子产生的细胞周期事件。在第一次减数分裂细胞周期或减数分裂I中，细胞的染色体被复制并且分至两个子细胞中。然后这些子细胞在并未伴随DNA合成的第二次减数分裂细胞周期或减数分裂II中分离，产生具有单倍体数的染色体的配子。

“生发泡”阶段意指与减数分裂I细胞周期的前期I有关的初级卵母细胞的成熟的阶段，即在核质的第一次分裂之前。这一时期的卵母细胞也称为“生发泡卵母细胞”，因为特有地巨大细胞核，称为生发泡。在体外培养的正常的人类卵母细胞中，生发泡在成熟开始后约6-24小时发生。

“中期I”阶段意指与减数分裂I细胞周期的中期I有关的初级卵母细胞的成熟的阶段。与生发泡卵母细胞相比，中期I卵母细胞没有大的，清楚界定的细胞核。在体外培养的正常的人类卵母细胞中，中期I在成熟开始后约12-36小时发生。

“中期II”阶段意指与减数分裂II细胞周期的中期II有关的次级卵母细胞的成熟的阶段。中期II是可通过第一极体的排出辨别的。在体外培养的正常的人类卵母细胞中，中期II在成熟开始后约24-48小时发生。

“有丝分裂细胞周期”意指细胞中导致细胞的染色体的复制以及将这些染色体和细胞的细胞质分至两个子细胞中的事件。有丝分裂细胞周期分为两个时期：分裂间期和有丝分裂。在分裂间期，细胞生长并且复制其DNA。在有丝分裂中，细胞起始并且完成细胞分裂，首先分隔其核质并且之后将其胞质和其分隔的核质(胞质分裂)分到两个分离的细胞中。

“第一次有丝分裂细胞周期”或“细胞周期1”意指从受精至第一次胞质分裂事件即受精的卵母细胞分裂为两个子细胞的时间间隔。在卵母细胞被体外受精的实例中，注射人绒毛膜促性腺激素(HCG)(通常在卵母细胞提取前施用)至第一次胞质分裂时间完成之间的时间间隔可用作替代的时间间隔。

“第二次有丝分裂细胞周期”或“细胞周期2”意指在胚胎中观察到的第二次细胞周期事件，通过有丝分裂从受精的卵母细胞产生子细胞和通过有丝分裂从这些子细胞中的一个(“前导子细胞”或子细胞A)的产生第一组第三代细胞(granddaughter cell)之间的时间间隔，当完成细胞周期2时，胚胎由3个细胞组成。换句话说，细胞周期2可以直观地确定为包含2细胞的胚胎和包含3细胞的胚胎之间的时间。

“第三次有丝分裂细胞周期”或“细胞周期3”意指在胚胎中观察到的第三次细胞周期事件，通常是通过有丝分裂从受精的卵母细胞产生子细胞至通过有丝分裂从第二子细胞中的一个(“延迟子细胞”或子细胞B)产生第二组第三代细胞时间间隔，当完成细胞周期3时，胚胎由4个细胞组成。换句话说，细胞周期3可以直观地确定为包含3细胞的胚胎和包含4细胞的胚胎之间的时间。

“第一次卵裂事件”意指第一次分裂，即，卵母细胞分裂为两个子细胞，即细胞周期1。当第一次卵裂事件完成时，胚胎由2细胞组成。

“第二次卵裂事件”意指第二组分裂，即，前导子细胞分裂为两个第三代子细胞和延迟子细胞分裂为两个第三代子细胞。换句话说，第二次卵裂事件由细胞周期2和细胞周期3两者组成。当第二次卵裂事件完成时，胚胎由4细胞组成。

“第三次卵裂事件”意指第三组分裂，即，所有第三代子细胞的分裂。当第三次卵裂事件完成时，胚胎由8细胞组成。

“胞质分裂”或“细胞分裂”意指细胞经历细胞分裂的有丝分裂的时期。换句话说，其是细胞的分隔的核质和其胞质被分开以产生两个子细胞的有丝分裂的阶段。胞质分裂的时间段可被确定为当细胞膜的收缩(“卵裂沟”)被首次观察到时和这一收缩事件的结束即两个子细胞产生之间的时间段或窗口。卵裂沟的起始可以直观地确定为细胞膜的曲率从凸的(向外的圆形的)变为凹的(向里弯曲具有凹痕或凹入)的点。这通过点在2个卵裂沟处的白色箭头描述于图4顶部组。细胞延长的起始同样可用于标记胞质分裂的起始，在这种情况下胞质分裂的时间段被定义为细胞延长的起始和细胞分裂的结束之间的时间段。

“第一次胞质分裂”或“胞质分裂1”意指受精之后的第一次细胞分裂事件，即受精的卵母细胞分裂以产生两个子细胞。第一次细胞分裂通常发生在受精后一天。

“第二次胞质分裂”或“胞质分裂2”意指在胚胎中观察到的第二次细胞分裂事件，即受精的卵母细胞分裂的一个子细胞(“前导子细胞”或子代A)分裂为第一组两个第三代。

“第三次胞质分裂”或“胞质分裂3”意指在胚胎中观察到的第三次细胞分裂事件，即受精的卵母细胞分裂的另一个子细胞(“延迟子细胞”或子代B)分裂为第二组两个第三代。

术语“基信标记(fiduciary marker)”或“基准标记”在成像系统的视野领域中使用的物品，其出现在所产生的图像中，被用作参考的点或度量。其可以是被放置在成像对象中或之上的某物或在光学仪器的十字线中的一个或一组标记物。

术语“微孔”是指细胞水平大小的容器，优选地提供用于接纳单个真核细胞。

“非整倍性”意指特征在于异常的染色体数量的染色体异常类型。非整倍体胚胎可具有一个或多个缺失染色体和/或一个或多个额外染色体。非整倍性可以是“有丝分裂错误”或“减数分裂错误”的结果。“非整倍体胚胎”是含有非整倍性的胚胎。术语“整倍体”和“异常”或“异常染色体计数”在本文可互换使用。

“整倍体”意指特征为在染色体方面正常的胚胎。整倍体或正常胚胎具有适当数量的染色体对。整倍体人类胚胎例如具有23对染色体，共计46个染色体。术语“整倍体”和“正常”或“正常染色体计数”在本文可互换使用。

“有丝分裂错误”意指由有丝分裂期间染色体分离的错误引起的非整倍性类型。

“减数分裂错误”意指由减数分裂期间染色体分离的错误引起的非整倍性类型。

“三体性”意指其中含有特定染色体的三个拷贝而不是两个拷贝的非整倍性类型。“三体性胚胎”是其中染色体计数异常并且含有一个或多个染色体的三个拷贝而不是两个拷贝的胚胎。

“单体性”意指其中含有特定染色体的一个拷贝而不是两个拷贝的非整倍性类型。“单体性胚胎”是其中染色体计数异常并且含有一个或多个染色体的一个拷贝而不是两个拷贝的胚胎。

“正常染色体计数”意指人类的23个染色体中的每一个的两个拷贝。

“镶嵌”或“镶嵌性”意指具有不同染色体含量的细胞群体。“镶嵌胚胎”是含有具有不同染色体含量的细胞群体的胚胎。

“低镶嵌”意指具有不同染色体含量的细胞群体，其中由有丝分裂错误产生的四个或更少的染色体受影响。

“高镶嵌”意指具有不同染色体含量的细胞群体，其中由有丝分裂错误产生的超过四个的染色体受影响。

“高碎裂水平”意指按体积计超过约25%的胞质碎裂。

“低碎裂水平”意指按体积计约25%或更少的胞质碎裂。

“碎裂”意指可能或不可能含有核DNA的膜结合胞质的部分。

感兴趣的多潜能细胞和胚胎

在本发明的方法中，通过测量一个或多个胚胎或多潜能细胞的一个或多个细胞参数并将这些测量用于确定所述胚胎或多潜能细胞的发育潜力、非整倍性和/或染色体含量来评价所述胚胎或多潜能细胞的发育潜力、非整倍性和/或染色体含量。由此产生的信息可被用于指导临床决策，例如是否转移受精的胚胎，是否植入培养的一个或多个细胞。

可通过本发明的方法测定的胚胎的实例包括1细胞胚胎(也称为合子)、2细胞胚胎、3细胞胚胎、4细胞胚胎、5细胞胚胎、6细胞胚胎、8细胞胚胎等等，通常高达16细胞胚胎并且包括16细胞胚胎，其中的任一种可通过任何方便的方式从例如已经体内成熟的卵母细胞或已经体外成熟的卵母细胞产生。

可通过本发明的方法测定的多潜能细胞的实例包括全能干细胞例如卵母细胞诸如初级卵母细胞和次级卵母细胞；多潜能干细胞例如ES细胞、EG细胞、iPS细胞和类似细胞；多潜能细胞，例如间质干细胞和组织特异性干细胞。它们可以来自生命的任何阶段，例如胚胎的、新生期的、少年的、成年的和任何性别，即XX或XY。

胚胎和多潜能细胞可来源于任何生物体，例如任何哺乳细胞种类例如人类、灵长类动物、马科动物、牛科动物、猪科动物、犬科动物、猫科动物等。优选地，它们来源于人类。它们可以是之前被冷冻的，例如，1细胞阶段的冷冻保存并且之后解冻的胚胎或冷冻并解冻的卵母细胞和干细胞。可选择地，它们可以是新鲜制备的，例如，通过体外受精技术或胞浆内精子注射从卵母细胞新鲜制备的胚胎；通过体外成熟技术新鲜采集和/或新鲜成熟或者来源于体外分化为生殖细胞并且成熟为卵母细胞的多潜能干细胞的卵母细胞；通过本领域已知的方法从组织的解离和培养新鲜制备的干细胞以及类似细胞。它们可在本领域中已知的任何适合的条件下培养以促进有待被测定的样品的存活、生长和/或发育，例如对于胚胎，在例如体外受精领域或胞浆内精子注射中所用的那些的条件下；参见例如美国专利第6,610,543号、美国专利第6,130,086号、美国专利第5,837,543号，其公开内容通过引用并入本文；对于卵母细胞，在例如本领域中所用的以促进卵母细胞成熟的那些的条件下；参见例如美国专利第5,882,928号和美国专利第6,281,013号，其公开内容通过引用并入本文；对于干细胞，在例如本领域中所用的以促进增殖的那些的条件下；参见例如美国专利第6,777,233号、美国专利第7037892号、美国专利第7,029,913号、美国专利第5,843,780号和美国专利第6,200,806号、美国专利申请第2009/0047263号、美国专利申请第2009/0068742号，其公开内容通过引用并入本文。通常，胚胎/多潜能细胞在配合所测定的特定胚胎/多潜能细胞的需要已经补充了血清或血清物质、氨基酸和生长因子的商业上可得的培养基例如KnockOut DMEM、DMEM-F12或Iscoves改良杜尔贝可培养基中培养。

延时成像分析

在一些实施方案中，胚胎/多潜能细胞通过经由延时成像测量细胞参数来测定。胚胎/多潜能细胞可在标准培养皿中培养。可选择地胚胎/多潜能细胞可在定制培养皿例如具有如本文描述的光学品质的微孔的定制培养皿中培养。在这些定制培养皿中，每个微孔装有一个单个的胚胎/多潜能细胞并且每个微孔的底部表面具有光学品质光洁度以致单个皿中的整组胚胎可通过具有足够分辨率的单个小型显微镜同时成像以跟随细胞有丝分裂过程。整组的微孔共享培养皿中同一个培养基滴头(drop)并且还可包括放置在微孔周围的用于稳定培养基滴头的外部孔以及邻近微孔放置的基准标记物。可用等离子刻蚀或另一种处理调整表面的疏水性以防止用培养基充满时微孔中形成气泡。无论使用标准培养皿还是定制培养皿，培养期间，可在同一培养基中培养一个或多个发育的胚胎，例如每皿可培养1个至25个之间的胚胎。

随时间获取图像并且之后分析图像以获得一个或多个细胞参数的测量。可用装配用于数字图像存储和分析的任何计算机控制的显微镜例如装配加热台和培养箱的倒置显微镜或适于常规孵育器内部的定制微型显微镜阵列进行延时成像。微型显微镜的阵列使得在同一孵育器中的多个皿的样品能够同时培养并且大小可调节以适应多个通道而对连续图像捕获之间的最小时间间隔没有限制。使用多个显微镜消除了移动样品的需要，其增加了系统准确度和整个系统的可靠性。孵育器中的单个显微镜可以是部分或全部分离的，为每个培养皿提供自身的控制的环境。这允许皿被转移至成像位置或从成像位置转移而不影响其他样品的环境。

用于延时成像的成像系统可使用亮视野照明、暗视野照明、相位对比、霍夫曼调制相衬(Hoffman modulation contrast)、微差干涉对比或荧光。在一些实施方案中，暗视野照明可被用来为随后的特征提取和图像分析提供增强的图像对比。此外，红色或近红外光源可被用来减少光毒性并且提高细胞膜和细胞的内部部分之间的对比度。

所获取的图像可在连续基底上储存在活动视频中或在间断基底上(如在延时照相术中)，其中对象被反复成像在静止的照片上。优选地，图像之间的时间间隔应在1至30分钟之间以便捕获如下文所描述的重要的形态学事件。在可选择的实施方案中，图像之间的时间间隔可取决于细胞活性的量而变化。例如，在活性期间，可以每几秒或每分钟这么频繁地获取图像，而在非活性期间，可以每10或15分钟或更久地获取图像。对所捕获的图像的实时图像分析可被用于检测什么时候和如何变化时间间隔。在我们的方法中，样品接收的光的总量估计等于5天成像大约24分钟的连续低水平曝光。用于延时成像系统的光强度比通常用于辅助生殖显微镜的光强度低得多，归因于LED的低功率(例如使用相比于通常100W卤素灯泡的1W LED)和照相机传感器的高敏感度。因此，使用延时成像系统由胚胎接收到的光能量的总量能够与IVF临床的常规操作期间接收到的能量的量差不多或更少。此外，曝光时间可显著缩短以减少对胚胎/多潜能细胞的曝光的总量。对于2天的成像，在每5分钟以0.5秒曝光/图像捕获图像的情况下，低水平曝光的总量小于5分钟。

图像采集之后，提取并分析图像的不同的细胞参数例如大小，透明带的厚度、碎裂的程度，从细胞分裂产生的子细胞的对称性、前几次有丝分裂之间的时间间隔和胞质分裂的持续时间。

可通过延时成像测量的细胞参数通常是形态学事件。例如，在测定胚胎时，延时成像可被用于测量胞质分裂事件例如胞质分裂1、胞质分裂2、胞质分裂3、胞质分裂4的持续时间，其中胞质分裂事件的持续时间定义为首次观察到卵裂沟(胞质分裂的起始)和卵裂沟分离为两个子细胞(即两个子细胞的产生)之间的时间间隔。感兴趣的另一个参数是细胞周期事件例如细胞周期1、细胞周期2、细胞周期3或细胞周期4的持续时间，其中细胞周期事件的持续时间被定义为一个细胞(对于细胞周期1来说，卵子的受精；对于之后的细胞周期来说，在胞质分裂结束时)的产生和来自这一细胞的两个子细胞的产生之间的时间间隔。可通过延时成像测量的感兴趣的其他细胞参数包括由这些细胞事件定义的时间间隔，例如(a)胞质分裂1和胞质分裂2之间的时间间隔，可定义为胞质分裂1的起始和胞质分裂2的起始之间的间隔、胞质分裂1的结束和胞质分裂2的结束之间的间隔、胞质分裂1的起始和胞质分裂2的结束之间的间隔或胞质分裂1的结束和胞质分裂2的起始之间的间隔的任一个；或者(b)胞质分裂2和胞质分裂3之间的时间间隔，可定义为胞质分裂2的起始和胞质分裂3的起始之间的间隔、或胞质分裂2的结束和胞质分裂3的结束之间的间隔、或胞质分裂2的起始和胞质分裂3的结束之间的间隔或胞质分裂2的结束和胞质分裂3的起始之间的间隔的任一个。

为了体外受精和胞浆内精子注射的目的，被认为是有利的发育中早期例如第2天或第3天即直到8细胞阶段将胚胎转移至子宫以减少胚胎损失(归因于培养条件相对于体外环境的缺点)并减少与可在培养期间发生的后生错误有关的可能的不良后果(Katari等人(2009)Hum Mol Genet.18(20):3769-78；Sepúlveda等人(2009)Fertil Steril.91(5):1765-70)。因此，优选的是，尽管分析的时间较长，例如约36小时、约54小时、约60小时、约72小时、约84小时、约96小时或更长，本方法同样预期在受精的2天中发生的细胞参数的测量。

可通过延时成像测定的正在成熟的卵母细胞的细胞参数的实例包括但不限于卵母细胞细胞膜的形态学上的变化，例如从透明带分离的速度和程度；卵母细胞细胞核的形态学上的变化，例如胚泡破裂(GVBD)的起始、完成和速度；细胞质和细胞核中颗粒的运动速度和方向；卵母细胞和第一极体的胞质分裂以及第一极体的排出的运动和/或持续时间。其他的参数包括成熟次级卵母细胞和第二极体的胞质分裂的持续时间。

可通过延时成像测定的干细胞或干细胞群中的细胞参数的实例包括但不限于胞质分裂事件的持续时间，胞质分裂事件之间的时间，胞质分裂事件之前和过程中干细胞的大小和形状、由胞质分裂事件产生的子细胞的数目、卵裂沟的空间定向、所观察到的非对称分裂的速度和/或数目(即其中一个子细胞保持干细胞而其他的分化)、所观察到的对称分裂的速度和/或数目(即其中两个子细胞都保持干细胞或都分化)以及胞质分裂事件的结束和当干细胞开始分化之间的时间间隔。

参数可手动测量或者它们可被自动测量，例如通过图像分析软件。当使用图像分析软件时，可以使用利用以序贯蒙特卡罗方法为基础的随机模型估算技术的图像分析算法，例如产生假定的胚胎/多潜能细胞模型的分布，以简单的光学模型为基础模拟图像并将这些模拟与观察到的图像数据比较。当使用这样的随机模型估算时，细胞可以被建模为任何适合的形状，例如2D空间中的椭圆的集合，3D空间中的椭圆体的集合以及类似形状。为了处理遮挡和深度不确定性，方法可实行相应于所期望的实体行为的几何约束。为了提高鲁棒性，可在一个或多个焦平面上捕获图像。

基因表达分析

在一些实施方案中，通过测量基因表达测定胚胎或多潜能细胞。在这些实施方案中，细胞参数是基因表达水平或基因表达谱。测定一个或多个基因的表达，即获得表达谱或表达评估，可通过测量感兴趣的一个或多个基因的核酸转录物(例如mRNA)例如核酸表达谱进行；或通过测量为感兴趣的一个或多个基因的表达产物的一个或多个不同蛋白/多肽的水平即蛋白组表达谱来进行。换句话说，术语“表达谱”和“表达评估”被宽泛使用以包括RNA水平或蛋白水平的基因表达谱。

在一些实施方案中，基因的表达可通过获得核酸表达谱来估计，其中确定样品中的一种或多种核酸的量或水平，例如感兴趣的一种或多种基因的核酸转录物。在这些实施方案中，被测定以产生表达谱的样品是核酸样品。核酸样品包括多个或一群不同核酸，其包括正被评估的胚胎或细胞的感兴趣的基因的表达信息。核酸可包括RNA或DNA核酸，例如mRNA、cRNA、cDNA等，只要样品保留其所获得自的宿主细胞或组织的表达信息。样品可以许多不同方式制备，如本领域中已知的，例如通过从细胞分离mRNA，其中所分离的mRNA如在差异表达领域中已知的被用来扩增、使用以制备cDNA、cRNA等。使用标准程序，样品可从单个细胞制备，例如感兴趣的多潜能细胞的培养基的多潜能细胞或来自感兴趣的胚胎的单个细胞(卵裂球)；或来自几个细胞，例如多潜能细胞的培养基的一部分或感兴趣的胚胎的2、3、或4或者更多个卵裂球。

表达谱可使用任何常规程序从初始核酸样品产生。当产生表达谱的多种不同方式是已知的，例如在差异基因表达分析的领域中使用的那些时，用于产生表达谱的一个代表性且适宜性类型的程序是以阵列基础的基因表达谱产生程序。这些应用是杂交测定，其中使用在有待被产生的谱中展示用于有待被测定或进行谱分析的基因中的每一种的“探针”核酸的核酸。在这些测定中，首先从正在测定的初始核酸样品制备靶核酸的一个样品，其中，制备可包括用标记物例如信号表达系统的一员来标记靶核酸。靶核酸样品制备之后，将样品在杂交条件下与阵列接触，由此在与连接至阵列表面的探针序列互补的靶核酸之间形成复合物。之后定性或者定量地检测杂交复合物的存在。

可实行以产生在主题方法中使用的表达谱的特异杂交技术包括描述于美国专利第5,143,854；5,288,644；5,324,633；5,432,049；5,470,710；5,492,806；5,503,980；5,510,270；5,525,464；5,547,839；5,580,732；5,661,028；5,800,992号，其公开内容通过引用并入本文；以及WO95/21265；WO96/31622；WO97/10365；WO97/27317；EP373 203和EP785 280中的技术。在这些方法中，如上文描述的将包括用于其表达正被测定的表型决定基因中的每一种的探针的“探针”核酸的阵列与靶核酸接触。在杂交条件例如严格杂交条件下进行接触，并且之后除去未结合的核酸。如本文所用的，术语“严格测定条件”是指适于产生具有足够互补性以在测定中提供所期望的特异性水平的核酸例如表面结合的和溶液相核酸的结合对而较不适于形成具有不足以提供所期望的特异性的互补性的结合成员之间的结合对的条件。严格互补条件是杂交和清洗条件的总和或组合(全体)。

所得到的杂交的核酸的模式提供关于已经被探针探测的基因中的每一种的表达信息，其中表达信息是以基因是否表达以及典型地什么水平表达的方式，其中表达信息，即表达谱(例如以转录组(transcriptosome)形式)，都可以是定性和定量的。

可选择地，可使用用于将样品中的一个或多个核酸的水平定量的非阵列基础的方法，包括以扩增程序为基础的那些例如聚合酶链式反应(PCR)基础的测定，包括定量PCR、逆转录PCR(RT-PCR)、实时PCR等。

在一些实施方案中，基因的表达可通过获得蛋白组表达谱来评估，其中确定样品中的一种或多种蛋白/多肽的量或水平，例如由感兴趣的基因编码的蛋白/多肽。在这些实施方案中，被测定以产生所述方法中使用的表达谱的样品是蛋白样品。当表达谱是蛋白组表达谱，即样品中一种或多种蛋白水平的谱时，可使用用于评估蛋白水平的任何常规程序，其中确定所测定的样品中的一种或多种蛋白的水平。

尽管用于蛋白水平的多种不同方式的测定是本领域中已知的，但用于测定蛋白水平的一种代表性且适宜性类型的方案是ELISA。在ELISA和以ELISA基础的测定中，对于感兴趣的蛋白来说特异性的一种或多种抗体可被固定在所选择的固体表面上，优选地展示蛋白亲和性的表面例如聚苯乙烯微量滴定板的孔。清洗以除去不完全吸附的材料之后，将测定板孔用对于测试样品例如牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白或奶粉溶液来说已知抗原中性的非特异性“封闭”蛋白包被。这允许封闭固定表面上的非特异性吸附位点，由此减少由所述表面上抗原的非特异性结合导致的背景。清洗以除去未结合封闭的封闭蛋白之后，将固定的表面与有待被测试的样品在有助于免疫复合物(抗原/抗体)形成的条件下接触。这些条件包括同样有助于帮助减少非特异性背景的用稀释液例如溶于盐酸缓冲盐水(PBS)/吐温或PBS/Triton-X100中的BSA或牛血清丙种球蛋白(BGG)稀释样品和允许样品在约25℃-27℃的温度(尽管也可使用其他温度)孵育约2-4小时。孵育后，清洗抗血清接触的表面以便除去非免疫复合的材料。示例性的清洗程序包括用溶液例如PBS/吐温、PBS/Triton-X100或硼酸盐缓冲液清洗。免疫复合物形成的出现和量然后可通过使结合的免疫复合物经历对与第一抗体不同的靶具有特异性的第二抗体并且检测第二抗体的结合来确定。在某些实施方案中，第二抗体具有所结合的酶，例如尿素酶、过氧化物酶或碱性磷酸化酶，其将在与适当的显色底物孵育时产生有色沉淀。例如，可使用尿素酶或过氧化物酶轭合的抗人类IgG一段时间并且在有利于免疫复合物形成的发展的条件下(例如在含有PBS的溶液例如PBS/吐温中于室温孵育2小时)。这样用第二抗体孵育并且清洗以除去未结合的材料之后，将标记的量定量，例如通过在尿素酶标记的实例中用显色底物例如尿素和溴甲酚紫或在过氧化物酶标记物的实例中用2,2’-联氮-双-(3-乙基-苯并噻唑啉)-6-磺酸(ABTS)和H₂O₂孵育。然后通过测量颜色生成的程度例如使用可见光谱分光光度计获得定量。

之前的格式可通过首先将样品与测定板结合来改变。之后将初级抗体与测定板孵育，之后使用对初级抗体具有特异性的标记的次级抗体检测结合的初级抗体。

一种或多种抗体固定于其上的固体基质可由许多种材料制成并且为许多种形状例如微量滴定板、微珠、测验片、树脂颗粒等。可以选择基质以最大化信噪比，从而最小化背景结合以及便于分离和包被。可以适合所使用的基质的方式实施清洗，例如通过将微珠或测验片从储器除去，将储器例如微量滴定板孔清空或稀释或者用清洗溶液或溶剂漂洗珠、颗粒、层析柱或滤器。

可选择地，可使用用于测量样品中一种或多种蛋白的水平的以非ELISA基础的方法。代表性的实例包括但不限于质谱、蛋白组阵列、xMAP^TM微球技术、流式细胞计、蛋白质印迹和免疫组织化学。

所得到的结果提供了与已经被探针探测的基因中的每一种的表达有关的信息，其中表达信息以基因是否表达以及通常以什么水平表达的方式并且其中表达数据可以是定性并且定量的。

在产生表达谱时，在一些实施方案中，测定样品以产生包括至少一个基因/蛋白、有时多个基因/蛋白的表达数据的表达谱，其中复数意指至少两种不同的基因/蛋白以及经常至少约3种，通常至少约10种或更多，常常至少约15种不同的基因/蛋白或更多，例如50种或更多或者100种或更多等。

在最广泛的意义上，表达评估可以是定性或者定量的。像这样，当检测是定性的时，所述方法提供读数或评价，例如评估靶分析物例如核酸或表达产物是否存在于被测定的样品中。在又其他的实施方案中，所述方法提供了靶分析物是否存在于被评估的样品中的定量检测，即估计或评估靶分析物例如被测定的样品中的核酸或蛋白的真实量或相对丰度。在这些实施方案中，定量检测可以是绝对的或如果所述方法是检测样品中的两种或更多种不同分析物例如核酸或蛋白的方法时是相对的。像这样，术语“定量”用于定量样品中的靶分析物例如一种或多种核酸或蛋白的上下文时，可指绝对或相对定量。绝对定量可通过包含已知浓度的一种或多种对照分析物并且用已知的对照分析物(例如通过产生标准曲线)参照即标准化靶分析物的检测水平来完成。可选择地，可通过将两种或更多种不同的靶分析物之间的检测水平或量比较以提供两种或更多种不同分析物中的每一种的相对定量例如相对于彼此来完成相对定量。

表达水平预测合子发育潜力的基因的实例包括Cofillin(NM_005507)，DIAPH1(NM_001079812、NM_005219)，ECT2(NM_018098)，MYLC2/MYL5(NM_002477)，DGCR8(NM_022720)，Dicer/DICER1(NM_030621、NM_177438)，TARBP2(NM_004178、NM_134323、NM_134324)，CPEB1(NM_001079533，NM_001079534、NM_001079535、NM_030594)，偶对蛋白(Symplekin)/SYMPK(NM_004819)，YBX2(NM_015982)，ZAR1(NM_175619)，CTNNB1(NM_001098209、NM_001098210、NM_001098210、NM_001904)，DNMT3B(NM_006892、NM_175848、NM_175849、NM_175850)，TERT(NM_198253、NM_198255)，YY1(NM_003403)，IFGR2/IFNGR2(NM_005534)，BTF3(NM_001037637、NM_001207),和NELF(NM_001130969、NM_001130970、NM_001130971，NM_015537)。表达水平可作为预测胚胎发育潜力的细胞参数的其他基因提供于图8中。获得基因表达水平测量时，基因水平常常被评估并且之后对标准对照例如已知在整个发育中恒定的基因例如GAPDH或RPLPO或者在这一时间点其表达已知的基因的样品中的表达水平进行标准化。

基因表达水平可从单个细胞、例如来自感兴趣的胚胎的分裂球或分离的卵母细胞或来自干细胞的培养基的分离的细胞等确定，或者它们可以从胚胎例如感兴趣的胚胎的2、3或4或更多个卵裂球直到并且包括感兴趣的全胚胎、或者来自干细胞的培养基的多个细胞直到并且包括干细胞的整个培养基等确定。

在其他的方面，本发明包括用于在单个细胞上进行同时的基因分型和基因表达分析的程序。对于胚胎，这可用于改善着床前胚胎遗传学诊断(PGD)，一种将单个细胞从胚胎除去并且检测其DNA的染色体组型缺陷或者特定疾病基因的存在的程序。我们的方法允许同时的遗传和基因表达分析。所述方法包括下列步骤：(1)将单个细胞收集到小体积的培养基或缓冲液中，(2)使用基因分型和基因表达分析引物的混合物进行一步逆转录和聚合酶链式反应(PCR)扩增，(3)小于18个循环的PCR之后收集等份的扩增的cDNA以维持扩增的线性，(4)使用cDNA等份用标准技术例如定量实时PCR进行基因表达分析，(5)使用剩余的样品进行第二轮PCR以为了基因分型的目的进一步扩增遗传信息和(6)使用标准技术例如凝胶电泳进行基因分型。

检测非整倍性的方法

在一些实施方案中，评价胚胎或多潜能细胞的染色体含量。在一个实施方案中，提供了用于检测胚胎中的非整倍性的方法。在一些实施方案中，所述胚胎是人类胚胎。在一些实施方案中，通过测量一个或多个细胞参数以获得细胞测量结果以及使用测量结果以确定胚胎是否为非整倍体，从而测定胚胎的非整倍性。在本发明的某些实施方案中，证实为非整倍体的胚胎为归因于有丝分裂错误的非整倍体并且在其它实施方案中，证实为非整倍体的胚胎为归因于减数分裂错误的非整倍体。因此，本文提供的是用于从正常至最严重类型的非整倍体分级胚胎的方法。更特别地，提供了用于基于细胞参数测量结果将胚胎分级为含有正常染色体含量、归因于有丝分裂错误的非整倍体、或归因于减数分裂错误的非整倍体的方法。

在一些实施方案中，提供了首先确定胚胎到达胚泡的潜力、然后确定已确定存在或不存在具有胚泡潜力的胚胎中碎裂的和/或其水平的方法，其中碎裂、特别是高碎裂水平的存在指示非整倍体胚胎并且碎裂的不存在指示具有正常染色体计数的胚胎。低碎裂水平与具有高碎裂水平的胚胎相比指示较低风险的非整倍性并且与根本没有碎裂的胚胎相比指示较高风险的非整倍性。碎裂水平越低，则胚胎将为非整倍体的可能性越低，并且碎裂水平越高，则胚胎将为非整倍体的可能性越高。在一个实施方案中，高碎裂的特征在于按体积计超过约15%的胞质碎裂。在又一实施方案中，高碎裂的特征在于按体积计超过约20%的胞质碎裂。在又一实施方案中，高碎裂的特征在于按体积计超过约25%的胞质碎裂。在又一实施方案中，高碎裂的特征在于按体积计超过约30%的胞质碎裂。在另一实施方案中，低碎裂的特征在于按体积计少于约30%的胞质碎裂。在另一实施方案中，低碎裂的特征在于按体积计少于约25%的胞质碎裂。在再一实施方案中，低碎裂的特征在于按体积计少于约20%的胞质碎裂。在再一实施方案中，低碎裂的特征在于按体积计少于约15%的胞质碎裂。

该方法进一步包括通过首先确定胚胎到达胚泡的潜力并且然后测量存在或不存在具有到达胚泡的潜力的胚胎的碎裂和/或其水平以及选择展示碎裂不存在或低碎裂水平的胚胎来选择具有正常染色体计数的胚胎。除了碎裂水平之外，也可评估胚胎的碎裂动力学来确定选择具有正常染色体计数的胚胎的可能性。例如，时间间隔显微镜测量的另外的碎裂标准诸如细胞碎裂的程度和发育时序，或卵裂球不对称的包含有助于胚胎评估。可通过确定一个或多个细胞参数或通过本领域已知的预测胚泡形成的任何其它方法来测量到达胚泡的潜力。在某些方面中，细胞参数包括，第一胞质分裂的持续时间、胞质分裂1和胞质分裂2之间的时间间隔、胞质分裂2和胞质分裂3之间的时间间隔、直到第一细胞分裂的时间、胚胎形态学、基因表达模式、或本领域已知的确定胚胎到达胚泡的潜力的任何其它方法及其组合。

在一些实施方案中，确定为非整倍体的胚胎为三体性胚胎。可通过本发明的方法检测的示例性三体性的非限制性列表包括三体性21(唐氏综合征)、三体性18(爱德华氏综合征)、三体性13(帕陶氏综合征)；三体性8(Warkany综合征2)、三体性9、三体性16和三体性22(猫眼综合征)。

在一些实施方案中，确定为非整倍体的胚胎为单体性胚胎。可通过本发明的方法检测的示例性单体性的非限制性列表包括单体性22、单体性4、单体性5、单体性7、单体性11、单体性17或单体性X(特纳综合征)。

从图像和/或基因表达分析确定发育潜力

一旦已经获得细胞参数测量结果，所述测量就被用来确定胚胎/多潜能细胞的发育潜力。如上文所讨论的，术语“发育潜力”和“发育感受性”是指多潜能细胞或组织生长或发育的能力(ability)或能力(capacity)。例如，在卵母细胞或胚胎的实例中，发育潜力可以是卵母细胞或胚胎生长或发育为健康胚泡的能力(ability)或能力(capacity)。作为另一个实例，在干细胞的实例中，发育潜力是生长或发育为感兴趣的一个或多个细胞例如神经元、肌肉、B或T细胞和类似细胞的能力(ability)或能力(capacity)。在一些实施方案中，卵母细胞或胚胎的发育潜力是所述卵母细胞或胚胎发育为健康胚泡；以成功植入子宫；以经过妊娠和/或以活着出生的能力(ability)或能力(capacity)。在一些实施方案中，多潜能细胞的发育潜力是所述多潜能细胞发育为感兴趣的一个或多个细胞例如神经元、肌肉、B或T细胞和类似细胞和/或体内促进感兴趣的组织的能力(ability)或能力(capacity)。

“良好发育潜力”或“有利发育潜力”意指胚胎/多潜能细胞统计学上很可能如所期望的发育，即其具有如所期望的发育的55%、60%、70%、80%、90%、95%或更高的概率，例如100%的概率。换句话说，证明曾获得对有利发育潜力的确定的细胞参数测量结果的100个中55个、100个中60个、100个中70个、100个中80个、100个中90个、100个中95个或整个100个中100个胚胎或多潜能细胞事实上确实如所期望的继续发育。相反地，“不良发育潜力”意指胚胎/多潜能细胞统计学上很可能不如所期望的发育，即其具有如所期望的发育的50%、40%、30%、20%、10%、5%或更少的概率，例如0%的概率。换句话说，证明曾获得对不良发育潜力的确定的细胞参数测量结果的100个中仅50个、100个中40个、100个中30个、100个中20个、100个中10个、100个中5个或更少的胚胎或多潜能细胞事实上确实如所期望的继续发育。如本文所用的，“正常的”或“健康的”胚胎和多潜能细胞证明有利发育潜力而“不正常的”胚胎和多潜能细胞表现出不良的发育潜力。

在一些实施方案中，细胞参数测量结果被直接用于确定胚胎或多潜能细胞的发育潜力。换句话说，测量本身的绝对值足以确定发育潜力。使用延时成像测量细胞单数的实施方案中这样的实例包括但不限于下列，其单独或组合中的任一种指示人类胚胎中的有利发育潜力：(a)持续约0-30分钟例如，约6-20分钟，平均约14.3±6.0分钟的胞质分裂1；(b)持续约20-27小时例如约25-27小时的细胞周期1；(c)约8-15小时，例如约9-13小时，具有约11.1+/-2.1小时的平均值的胞质分裂1的结束和胞质分裂2的开始之间的时间间隔；(d)约0-5小时，例如约0-3小时，具有约1.0+/-1.6小时的平均时间的胞质分裂2的起始和胞质分裂3的起始之间的时间间隔，即同步性。单独或组合中的任一种指示人类胚胎中不良发育潜力的直接的测量的实例包括但不限于(a)持续超过约30分钟例如约32、35、40、45、50、55或60分钟或更多的胞质分裂1；(b)持续超过约27小时例如28、29或30或更多小时的细胞周期1；(c)持续超过15小时例如16、17、18、19或20或更多小时或少于8小时例如约7、5、4或3或更少小时的胞质分裂1的结束和胞质分裂2的开始之间的时间间隔；(d)6、7、8、9或10或者更多小时的胞质分裂2的起始和胞质分裂3的起始之间的时间间隔。在一些实施方案中，在确定胚胎具有有利发育潜力时，从其中胚胎正被培养的培养皿除去胚胎。在一些实施方案中，将确定具有有利发育潜力且从其正被培养的培养皿除去的胚胎转移到雌性动物受者。

在一些实施方案中，通过将其与来自参照或对照胚胎/多潜能细胞的细胞参数测量结果比较并且使用这一比较的结果以提供对所述胚胎/多潜能细胞的发育潜力的确定来使用细胞参数测量结果。术语“参照”和“对照”如本文所用的意指被用来解释给定胚胎/多潜能细胞的细胞参数测量结果并且给出对其发育潜力的确定的标准化的胚胎或细胞。参考或对照可以是已知具有所期望的表型例如有利发育潜力并且因此可以是阳性参照或对照胚胎/多潜能细胞的胚胎/多潜能细胞。可选择地，所述参照/对照胚胎/多潜能细胞可以是已知不具有所期望的表型并且因此是阴性参照或对照胚胎/多潜能细胞的胚胎/多潜能细胞。

在某些实施方案中，将所获得的一个或多个细胞参数测量结果与来自单个参照/对照胚胎/多潜能细胞的可比较的一个或多个细胞参数测量结果比较以获得与评估的所述胚胎/细胞的表型有关的信息。在又其他的实施方案中，将所获得的一个或多个细胞参数测量结果与来自两个或更多个不同参照/对照胚胎或多潜能细胞的可比较的一个或多个细胞参数测量结果比较以获得与评估的所述胚胎/细胞的表型有关的更深入的信息。例如，可将从所评估的所述一个或多个胚胎或多潜能细胞获得的细胞参数测量结果与阳性和阴性胚胎或多潜能细胞两者相比较以获得与所述胚胎/细胞是否具有感兴趣的表型有关的确定的信息。

作为一个实例，正常人类胚胎即具有有利发育潜力的胞质分裂1为约0-30分钟，更经常地约6-20分钟，平均约14.3±6.0分钟，即约1、2、3、4或5分钟，更经常地约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20分钟，在某些实例中为21、22、23、24、25、26、27、28、29或多达约30分钟。当与从正常参照胚胎所观察到的相比所评估的胚胎中完成胞质分裂1的较长的时间段指示不良发育潜力。作为第二个实例，正常人类胚胎中的细胞周期1即从受精到胞质分裂1完成的时间，通常在约20-27小时中，更经常地在约25-27小时，即约15、16、17、18或19小时，更经常地约20、21、22、23或24小时和更经常地约25、26或27小时中完成。当与从正常参照胚胎所观察到的相比所评估的胚胎中较长的细胞周期1指示不良发育潜力。作为第三个实例，正常人类胚胎中胞质分裂1的结束和胞质分裂2的开始是约8-15小时，更常常约9-13小时，具有约11+/-2.1小时的平均值，即6、7或8小时，更经常地约9、10、11、12、13、14或多达约15小时。与从正常参照胚胎所观察到的相比所评估的胚胎中较长或较短的细胞周期2指示不良发育潜力。作为第四个实例，正常人类胚胎中胞质分裂2的起始和胞质分裂3的起始之间的时间间隔即第二次和第三次有丝分裂的同步性是通常约0-5小时，更经常地约0、1、2或3小时，具有约1.0+/-1.6小时的平均值，与从正常参照胚胎所观察到的相比所评估的胚胎中胞质分裂2的完成和胞质分裂3之间的较长的间隔指示不良发育潜力。最后，作为当使用基因表达水平作为评估发育潜力的参数时可如何应用这一实施方案的实例，Cofillin、DIAPH1、ECT2、MYLC2、DGCR8、Dicer、TARBP2、CPEB1、偶对蛋白、YBX2、ZAR1、CTNNB1、DNMT3B、TERT、YY1、IFGR2、BTF3和/或NELF的较低的表达水平即与从正常参照2细胞胚胎所观察到的相比所评估的2细胞胚胎中低1.5-倍、2-倍、3-倍、4-倍、5-倍、10-倍、20-倍、50-倍或100-倍的表达指示不良发育潜力，而等于或大于从正常参照2细胞胚胎所观察到的表达的表达指示有利发育潜力。其他实例可来自于经验数据，例如通过观察有待被测定的胚胎/多潜能细胞旁边的一个或多个参照胚胎或多潜能细胞。可使用任何参照胚胎/多潜能细胞，例如具有有利发育潜力的正常参照样品或具有不良发育潜力的异常参照样品。在一些实例中，可使用不只一个参照样品，例如正常参照样品和异常参照样品两者都可使用。

在一些实施方案中，使用通过时间间隔显微镜或通过表达谱分析但不是通过时间间隔显微镜和表达谱分析两者获取的细胞参数测量结果是可以期望的。在其他的实施方案中，使用通过时间间隔显微镜获取的细胞参数测量结果以及通过表达谱分析获取的细胞参数测量结果是可以期望的。

如上文所讨论的，可测量并使用一个或多个参数来确定胚胎或多潜能细胞的发育潜力。在一些实施方案中，单个参数的测量可能足以获得对发育潜力的确定。在一些实施方案中，使用不只一个参数例如2个细胞参数、3个细胞参数或4个或更多个细胞参数的测量是可以期望的。

在某些实施方案中，对于多个参数的测定是可以期望的，因为对多个参数的测定可提供更高的敏感性和特异性。敏感性意指正确鉴定为阳性的实际上阳性的比例。这可被算术表示为：

因此，在其中“阳性”是具有有利发育潜力即将发育为胚泡的胚胎而“阴性”是具有不良发育潜力即将不会发育为胚泡的胚胎的方法中，100%的敏感性意指测试识别像这样将发育为胚泡的所有胚胎。在一些实施方案中，测定的敏感性可以是约70%、80%、90%、95%、98%或更高，例如100%。特异性意指被正确鉴定为阴性的阴性的比例。这可被算术地描述为：

因此，在其中阳性是具有有利发育潜力即将发育为胚泡的胚胎而阴性是具有不良发育潜力即将不会发育为胚泡的胚胎的方法中，100%的特异性意指测试识别将不会发育为胚泡即将在胚泡期之前停滞的所有胚胎。在一些实施方案中，测定的特异性可以是约70%、80%、90%、95%、98%或更高，例如100%。

如下文实施例部分和图7中所证明的，三个参数的使用提供94%的敏感性和93%的特异性以及3倍于胚泡分布的标准偏差的截止点。换句话说，本发明的方法能够在胚泡阶段之前正确鉴定94%的机会(敏感性)将要发育成为胚泡的胚胎的数目和93%的机会(特异性)将要停滞的胚胎的数目。此外所述特定的平均值和/或截止点可取决于用于计算这些值的数据集以及特定应用而修改。

从图像分析确定非整倍体或染色体含量

一旦已经获得细胞参数测量结果，测量结果就被用来确定胚胎的非整倍性状态和/或染色体含量。如上文所述，“非整倍性”是指具有异常染色体含量的胚胎，包括但不限于由有丝分裂错误或减数分裂错误引起的那些，包括例如，三体性、单体性和镶嵌性。

“正常”或“正常染色体计数”意指胚胎含有物种的适当数量的染色体对。例如，“正常”人类胚胎将含有23个染色体对，共计46个染色体。

在一些实施方案中，细胞参数测量结果被用于直接确定胚胎/多潜能细胞的非整倍性状态和/或染色体计数。换句话说，其测量结果的绝对值足以确定胚胎/多潜能细胞的非整倍性状态和/或染色体计数。使用延时成像以测量细胞参数的实施方案中这样的实例包括下列，其单独或组合中的任一种指示人类胚胎中的非整倍性：(a)超过约0至约30分钟的正常范围的胞质分裂1；(b)超过约8至约15小时的正常范围的胞质分裂1和胞质分裂2之间的时间间隔；(c)超过约0至约5小时的正常范围的胞质分裂2和胞质分裂3之间的时间间隔。特别地，单独或组合的下列中的任一种指示非整倍性：(a)超过约30分钟的胞质分裂1；(b)少于约8小时的胞质分裂1和胞质分裂2之间的时间间隔；和/或(c)超过约90分钟的胞质分裂2和胞质分裂3之间的时间间隔。

在一些实施方案中，细胞参数测量结果可被用于确定经检测的非整倍体是否是有丝分裂或减数分裂错误的结果。例如，单独或组合的下列细胞测量结果中的一个或多个指示经检测的非整倍体归因于有丝分裂错误产生：(a)多于约35分钟，例如约35.5、36、38、40、42、44、46、48、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100分钟或更长时间，的胞质分裂的持续时间；(b)少于约7小时、例如约6.5、6、5、4、3、2或1小时或更少时间的胞质分裂1和胞质分裂2之间的时间间隔；和/或(c)多于约2小时、例如约2.5、3、4、5、6、7、8或9小时或更长时间的胞质分裂2和胞质分裂3之间的时间间隔。特别地，单独或组合的下列测量结果特别指示归因于有丝分裂错误的非整倍体：(a)为约36.0±66.9分钟的第一胞质分裂的持续时间；(b)为约6.4±6.6小时的胞质分裂1和胞质分裂2之间的时间间隔；和/或(c)为约2.0±3.9小时的胞质分裂2和胞质分裂3之间的时间间隔。在另一个实例中，单独或组合的下列细胞测量结果中的一个或多个指示经检测的非整倍体归因于减数分裂错误产生：(a)多于约100分钟(例如约105、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375或400分钟或更长时间)的胞质分裂的持续时间；(b)少于约4小时(例如约3.5、3、2或1小时或更少)的胞质分裂1和胞质分裂2之间的时间间隔；和/或(c)多于约2小时(例如约2.5、3、4、5、6、7、8或9小时或更长时间)的胞质分裂2和胞质分裂3之间的时间间隔。特别地，单独或组合的下列测量结果特别指示归因于有丝分裂错误的非整倍体：(a)为约117.2±166.5分钟的第一胞质分裂的持续时间；(b)为约4.0±5.2小时的胞质分裂1和胞质分裂2之间的时间间隔；和/或(c)为约2.0±4.3小时的胞质分裂2和胞质分裂3之间的时间间隔。在另一个实例中，细胞参数测量结果被用于以递增的严重度水平将胚胎分级，从正常胚胎、到非整倍性是归因于一个或多个有丝分裂错误的非整倍体胚胎、到非整倍性是归因于一个或多个减数分裂错误的非整倍体胚胎。

在一些实施方案中，细胞参数测量结果被用于选择一个或多个具有正常染色体计数的胚胎。换句话说，其测量结果的绝对值足以确定胚胎是否具有正常染色体计数。使用延时成像以测量细胞参数的实施方案中这样的实例包括下列，其单独或组合中的任一种指示人类胚胎中的正常染色体计数：(a)持续约0-30分钟(例如，约6-20分钟，平均约14.4±4.2分钟)的胞质分裂1；(b)持续约20-27小时、例如约25-27小时的细胞周期1；(c)为约8-15小时，例如约9-13小时，具有约11.8+/-0.71小时的平均值的胞质分裂1的结束和胞质分裂2的开始之间的时间间隔；(d)约0-5小时(例如约0-3小时)、具有约0.96+/-0.84小时的平均时间的胞质分裂2的起始和胞质分裂3的起始之间的时间间隔，即同步性。在另一实施方案中，向需要其的雌性动物提供一个或多个归因于正常染色体计数通过细胞参数测量结果选择的胚胎。

报告发育潜力和/或染色体异常

在一些实施方案中，胚胎或多潜能细胞的评估包括产生包括受治疗者胚胎/多潜能细胞的技术人员评估，例如“发育潜力评估”、“染色体异常的评估”等的书面报告。因此，主题方法可进一步包括产生或输出提供这样的评估的结果的报告的步骤，所述报告可以电子介质(例如在电脑监视器上电子显示)的形式或实体介质(例如打印在纸上或其他实体介质上的报告)的形式提供。

如本文所描述的，“报告”是电子或实体文件。其包括提供与通过本发明的方法获取的评估有关的感兴趣的信息的报告元素。可完全或部分电子地生成受治疗者报告。受治疗者报告包括至少受治疗者胚胎或多潜能细胞的发育潜力的评估、染色体异常的存在的可能性的评估等。受治疗者报告可进一步包括下列中的一个或多个：1)与测试装置有关的信息；2)服务提供者信息；3)受治疗者数据；4)样品数据；5)详细的评估报告部分，提供与如何获得评估有关的信息，例如a)所获取的细胞参数测量、b)所使用的参照值，如果有的话；和6)其他特征。

报告可包括关于测试机构的信息，所述信息与进行样品采集和/或数据生成的医院、临床或实验室有关。样品采集可包括如何生成样品，例如如何从受治疗者收获样品和/或如何培养样品等。数据生成可包括如何获得图像或如何分析基因表达谱。这一信息可包括与例如测试机构的名称和位置、进行所述测定和/或输入数据的实验室技术人员的身份、进行和/或分析测定的日期和时间、样品和/或结果数据储存的位置、测定中使用的试剂(例如试剂盒等)的批量编号以及类似信息有关的一个或多个细节。具有这一信息的报告领域(Report field)可通常使用由使用者提供的信息填充。

报告可包括关于服务提供者的信息，所述服务提供者可位于使用者所在的卫生保健机构外或卫生保健机构内。这样的信息的实例可包括服务提供者的名称和位置，查阅者的名称以及需要或期望时进行样品分离和/或数据生成的个人的名字。具有这一信息的报告领域通常可使用由使用者输入的数据填充，其可从预制脚本选择中选择(例如使用下拉菜单)。报告中其他的服务提供者信息可包括与结果有关和/或与说明性报告有关的技术信息的联系信息。

报告可包括受治疗者数据部分，包括从其收集卵母细胞或多潜能细胞的受治疗者的医疗史、患者年龄、体外受精或胞浆内精子注射周期表证(例如受精速度、第3天卵泡刺激素(FSH)水平)和何时收集卵母细胞、合子/胚胎队列参数(例如胚胎的总数)。该受治疗者数据可被并入以促进胚胎评估和/或帮助确定转移的胚胎的优化数目。报告还可包括管理性受治疗者数据(也就是对于评估发育潜力来说非必需的信息)例如确定受治疗者的信息(诸如名字、受治疗者的出生日期(DOB)、性别、邮箱和/或居住地址、医疗记录号码(MRN)、医疗卫生机构中的房间和/或床位号)，保险信息以及类似信息)，安排发育潜力的评估的受治疗者的医师或其他卫生专业人员的名字以及(如果与进行安排的医师不同)受治疗者的护理负责的工作医师(例如初级护理医师)的名字。

报告可包括样品数据部分，其可提供与评估中分析的生物样品有关的信息，例如样品的类型(胚胎或多潜能细胞以及多潜能细胞的类型)，如何处理样品(例如储存温度、制备程序)和收集的日期和时间。具有这一信息的报告领域通常可使用由使用者输入的数据填充。其中一些可提供为预制脚本的选择(例如使用下拉菜单)。

报告可包括评估报告部分，其可包括与如何如本文中所描述的获取评估/确定有关的信息。说明性报告可包括例如所评估的胚胎或多潜能细胞的延时图像和/或基因表达结果。报告的评估部分还可任选地包括推荐部分。例如，当结果指示胚胎的有利发育潜力时，推荐可包括在如本领域推荐的生育治疗期间将有限数目的胚胎植入子宫的推荐。

还应当很容易理解的是报告可包括另外的元素或修饰的元素。例如，当为电子的时，报告可包含指向提供与所选择的报告的元素有关的更详细信息的内部或外部数据库的超链接。例如，报告的患者信息元素可包括电子患者记录或获取这样的患者记录的站点的超链接，所述患者记录保留在机密数据库中。后面的这一实施方案可能在医院系统或临床应用(clinic setting)中感兴趣。当以电子的形式时，报告记录在适合的物理介质上，例如计算机可读的介质诸如计算机存储器、zip驱动器、CD、DVD等上。

应当很容易理解的是报告可包括上文元素中的全部或一些，条件是所述报告通常包括至少足以提供使用者所需要的分析(例如发育潜力的评估)的元素。

效用

如上文所讨论的，本发明的方法可被用于评估胚胎或多潜能细胞以确定它们的发育潜力以检测非整倍性，以选择具有正常染色体含量的胚胎和/或以基于非整倍性类型来分级胚胎。这些确定可被用于指导临床决策和/或行动。例如，为了增加妊娠率，临床医师常常将多个胚胎转移至患者中，可能导致给母亲和胎儿都带来健康风险的多胎妊娠。使用从本发明的方法获得结果，可在植入之前确定将被转移以发育为胎儿的胚胎的发育潜力，允许医生决定转移多少胚胎以便将足月妊娠的成功的机会最大化同时将风险最小化。此外，本发明的方法可被用于选择具有正常染色体含量且不是非整倍体的胚胎用于植入，从而不仅增加妊娠率，而且减少流产率及减少非致命性非整倍性出生率，例如通过能够针对可能具有致命性染色体异常诸如，例如三体性16或非致命性异常诸如三体性21的胚胎进行选择。

通过下列本发明的方法进行的评估还可在将一组胚胎或多潜能细胞中的胚胎或多潜能细胞按照它们的发育潜力分级中找到用途。例如，在某些实例中，多个胚胎能够发育为胚泡，即将具有有利发育潜力。然而，某些胚胎将更可能达到胚泡阶段或者是比其他质量更高的胚泡，即它们将具有比其他胚胎更好的发育潜力。在这样的情况下，本发明的方法可被用来将组中的胚胎分级。在这样的方法中，测量每个胚胎/多潜能细胞的一个或多个细胞参数以获取每个胚胎/多潜能细胞的细胞参数测量结果。之后来自所述胚胎或多潜能细胞中的每一个的一个或多个细胞参数测量结果被用于确定所述胚胎或多潜能细胞相对于彼此的发育潜力。在一些实施方案中，来自所述胚胎或多潜能细胞中的每一个的细胞参数测量结果通过将它们直接与彼此比较以确定所述胚胎或多潜能细胞的发育潜力来使用。在某些实施方案中，来自所述胚胎或多潜能细胞中的每一个的细胞参数测量结果通过将所述细胞参数测量结果与来自参照胚胎/多潜能细胞的细胞参数测量结果比较以确定每个胚胎或多潜能细胞的发育潜力并且之后比较每个胚胎或多潜能细胞的确定的发育潜力以确定所述胚胎或多潜能细胞相对于彼此的发育潜力来使用。以这样的方式，评估例如多个合子/胚胎的医生可仅选择质量最好的胚胎，即具有最好发育潜力的那些来转移以便将足月妊娠的成功的机会最大化同时将风险最小化。

类似地，本发明的方法也可用于基于其染色体含量来分级胚胎。例如，在一些情况下多个胚胎将被证实为非整倍体。然而，一些非整倍性将不如其它非整倍性严重。例如，由有丝分裂细胞分裂中的错误引起的非整倍性通常不如由减数分裂细胞分裂中的错误引起的非整倍性。在这样的实例下，本发明的方法可用于将组中的胚胎分级。在这样的方法中，测量每个胚胎的一个或多个细胞参数以获取每个胚胎的细胞参数测量结果。之后来自所述胚胎的每一个的一个或多个细胞参数测量结果被用于确定所述胚胎是否为非整倍体以及其为非整倍体时确定该非整倍体是否是较不严重的由一个或多个有丝分裂错误导致的非整倍性或者是更严重的由一个或多个减数分裂错误导致的非整倍性。在一些实施方案中，来自所述胚胎或多潜能细胞中的每一个的细胞参数测量结果通过将它们直接与彼此比较以确定所述胚胎的非整倍性的类型/严重度来使用。在一些实施方案中，来自所述胚胎或多潜能细胞中的每一个的细胞参数测量结果通过将所述细胞参数测量结果与来自参照胚胎的细胞参数测量结果比较以确定每个胚胎或多潜能细胞的非整倍性的类型/严重度并且之后比较每个胚胎的确定的非整倍性以确定所述胚胎相对于彼此的非整倍性的类型/严重度来使用。以这样的方式，评估例如多个合子/胚胎的医生可仅选择质量最好的胚胎，即正常的或具有较不严重的非整倍性类型的胚胎，来转移以便将足月妊娠的成功的机会最大化同时将风险最小化。

通过下列本发明的方法进行的评估还可被用于确定体外成熟的卵母细胞和体外培养的干细胞的发育潜力。通过本发明的方法获得的关于卵母细胞的发育潜力的信息可指导医生对用于受精的卵母细胞的选择，产生从这些卵母细胞得到胚泡的更高的成功可能性。同样，关于干细胞的发育潜力的信息可告知医师对例如在需要其的受治疗者中体内重组或替换组织的程序中使用的干细胞的选择。

试剂、设备和试剂盒

同样提供的是用于实行上文描述的方法中的一种或多种的其试剂、设备和试剂盒。其主题试剂、设备和试剂盒可变化很大。就测量上文提及的细胞参数中的任一个的方法而言，感兴趣的试剂和设备包括上文所提及的那些，其中这些试剂可包括培养板、培养基、显微镜、成像软件、成像分析软件、核酸引物、核酸探针的阵列、抗体、信号生产系统试剂等等，取决于待进行的具体的测量程序。例如，如上文所描述的，试剂可包括对基因Cofillin、DIAPH1、ECT2、MYLC2/MYL5、DGCR8、Dicer/DICER1、TARBP2、CPEB1、偶对蛋白/SYMPK、YBX2、ZAR1、CTNNB1、DNMT3B、TERT、YY1、IFGR2/IFNGR2、BTF3和NELF中的一种或多种具有特异性的PCR引物。试剂的其他实例包括包含对感兴趣的基因中的一种或多种具有特异性的引物或由感兴趣的这些基因编码的蛋白的抗体的阵列。

除了上文的元件，主题试剂盒将进一步包括用于实行主题方法的说明书。这些说明书将以各种形式存在于主题试剂盒中，其中的一个或多个可存在于试剂盒中。这些说明书可存在于其中的一种形式是作为在适合的介质或基底上的打印的信息，例如信息被打印于其上的一张或几张纸，在试剂盒的包装中，在包装说明书中等。还有另一种方式将是信息已经被记录于其上的计算机可读的介质，例如软盘、CD等。可存在的还有另一种方式是可经由互联网使用在移动站点获得信息的网站地址。任何常规方式可存在于试剂盒中。

使用显微镜阵列的自动细胞成像

上文描述的方法中的一些需要经由延时成像观察胚胎和干细胞发育的能力。这可使用由可适于标准孵育器内部的微型、多通道显微镜阵列构成的系统获得。这允许将多个样品迅速并且同时成像而不必在物理上移动皿。显示于图22中的一种说明性原型由具有暗视野照明的3通道显微镜阵列构成，尽管可使用其他类型的照明。“三通道”意指有将三个不同培养皿同时成像的三个独立的显微镜。用步进电机调整聚焦或获取3D图像栈(image stack)的焦点位置。白光LED被用于照明，尽管我们已经观察到对于人类胚胎来说红色或近红外(IR)LED可提高细胞膜和细胞内部之间的对比度。这一提高的对比度可用手动和自动的成像分析来辅助。此外，移至红外区可减少对样品的光毒性。由低成本高分辨率摄像头获取图像，但是可使用其他类型的照相机。

如图22中所示，上文描述的原型系统的每个显微镜被用来将可包含1-25个不等的胚胎的培养皿成像。显微镜收集来自与帮助消散由LED产生的任何热量的散热装置连接的白光LED的光，其对于短的曝光时间来说非常小。光通过挡住直射光的常规暗视野片，通过聚光透镜到样本标记的“培养皿”上，其是保留被培养和研究的胚胎的培养皿。培养皿可具有帮助在将皿带入或带出孵育器时保留细胞的次序并且阻止它们移动的孔。孔可以是空间上足够接近在一起以便胚胎可共享同一个培养基滴头。之后散射光通过显微镜物镜，之后通过消色差双合透镜(achromat doublet)并且到CMOS传感器上。CMOS传感器作为数码相机并且与计算机连接以便如上文所述的图像分析和示踪。

这一设计容易改变大小以提供多得多的通道和不同的照明技术并且可被修改以适应用于进样的流体设备。此外，设计可与反馈控制系统整合，其中将培养条件例如温度、CO2(以控制pH)和培养基基于反馈并从成像数据实时优化。这一系统被用于获取人类胚胎发育的延时视频，其在确定用于体外受精(IVF)或胞浆内精子注射(ICSI)程序的胚胎成活力中具有效用。其他应用包括干细胞治疗、药物筛选和组织工程。

在设备的一个实施方案中，照明由安装在铝散热装置上并且由BuckPuck电流调节驱动供能的Luxeon白光发射二极管(LED)提供。来自LED的光通过准直透镜。之后如图22中所示准直光通过定制激光加工挡光片并且使用非球面聚光透镜聚焦为中空的光锥。直接透射通过样品的光被物镜拒绝，而由样品散射的光被收集。在一个实施方案中，使用具有20X放大率的Olympus物镜，尽管可使用更小的放大率以增加视野，或可使用更大的放大率以增加分辨率。之后将收集的光通过消色差双合透镜(即镜筒透镜)以减少染色质和球面相差的影响。可选择地，从成像物镜收集的光可通过指向相反的方向的作为对镜筒透镜的替代的另一个物镜。在一个实施方案中，成像物镜可以是10X物镜，而镜筒透镜可以是4X物镜。所得到的图像可通过具有2兆像素分辨率(1600x1200像素)的CMOS传感器捕捉。也可使用不同类型的传感器和分辨率。

图23A显示具有3个相同的显微镜的多通道显微镜阵列的示意图。所有光学元件被安装在显微镜筒中。在阵列系统的操作中，培养皿被装载在安装在手动2轴倾斜台的聚丙烯平台上，其允许相对于光轴调整像平面。这些台被固定在显微镜的底座上并且在初始对准之后没有移动。由LED、平行光管透镜、挡光片和聚光透镜组成的照明组件被安装手动xyz台上以便放置并且聚焦照明光。由物镜、消色差透镜和CMOS传感器组成的成像组件同样安装在手动xyz台上以便将视野定位并且将物镜聚焦。所有2个成像组件被连接至线性滑轨并且由使用步进电机驱动的单个杠杆臂支撑。这允许图像栈的电脑控制的聚焦和自动捕获。可使用自动聚焦以及驱动(actuation)的其他方法。

如图23B中所示，将显微镜阵列放置在标准孵育器内部。CMOS图像传感器经过USB连接与位于孵育器内部的单个集线器(hub)连接，其传递至伴随其它通信和电源线路的外部PC。所有电子线缆通过用硅酮胶密封的橡皮塞的中心引出孵育器。

上文描述的显微镜阵列被用于记录早期人类胚胎发育的延时图像并且证明了从合子开始经过胚泡期的生长。四个不同的实验监测了总共242个胚胎。这一组中，将100个胚胎成像直到第5或6天；将其他胚胎在基因表达分析的不同时间点从成像位置移出。图像捕获软件的屏幕截图和所成像的胚胎示于图24中。以每张图像大致1秒的低曝光每5分钟捕获图像。样品接收的光的总量等于24分钟的持续曝光，与在处理期间在IVF诊所中经历的总水平相似。每张图像1秒持续时间的曝光是可以减少的。在用人类胚胎操作之前，我们用小鼠植入前胚胎进行了多方面的对照实验以确保胚泡形成速度和基因表达模式不受成像过程的影响。

图25和26显示来自延时序列的选择的图像。显示了第1天、第2.5天、第4天和第5.5天的图像。对于图25中所示的序列，9个胚胎中的3个发育为胚泡，对于图26中显示的序列，12个胚胎中的5个发育为胚泡。随时间关注单个胚胎，即便它们在摄影区内的位置由于胚胎在第3天经历培养基更换而转移。需要使用连续培养基来满足发育中胚胎的阶段特异性需求。在培养基更换期间，将胚胎从成像位置移出几分钟并且转移至新的培养皿中。为了在培养基更换期间掌握每个胚胎的身份，将样品从一个皿至其他皿的转移摄影以证实胚胎没有被弄混。在收集用于基因表达分析的样品期间同样使用这一过程。追踪胚胎身份的问题可以通过使用孔以帮助将胚胎以特定顺序排列而解决。

具有微孔的培养皿

当在不同的位置之间转移培养皿时，胚胎有时可能移位，致使难以掌握胚胎身份。当在一个位置进行延时成像并且随后胚胎被移至用于胚胎选择和转移的第二个位置时提出了挑战。一个方法是在单独的培养皿中培养胚胎。然而，这需要每个胚胎具有其自己的培养基滴头。在典型的IVF或ICSI程序中，通常期望在同一个培养皿中并且用同一个培养基滴头培养患者的全部胚胎。为了解决这一问题，我们已经设计了具有微孔的定制培养皿。这在转移到或转移出孵育器或成像位点时防止胚胎移位并且保持它们在培养皿上的排列。此外，孔是足够小并且空间上靠近在一起的以便它们可分享同一个培养基滴头并且所有的由同一个显微镜同时观察。每个微孔的底部表面具有光学品质光洁度。图27A显示具有一个实施方案的尺寸的图。在这一视图中，在1.7x1.7mm的视野中有25个空间上靠近在一起的微孔。图27B显示微孔的3D视图，其凹入皿表面中约100微米。皿上包括基信标记(包括字母、数字和其他标记)，以帮助鉴别。

本文引用的所有参考文献(包括但不限于分别于2011年2月23日和2011年9月21日提交的US61/445,863和US61/537,336中的每一个的全部内容和附图)为了所有目的通过引用以其整体并入本文。

实施例

列出以下实施例以对为本领域那些技术人员提供如何进行和使用本发明的公开内容和描述，并且不意为限制发明人认为是本发明的范围，它们也不意为表示以下实验是进行的所有或仅有的实验。已经努力确保就所使用的数字(如量、温度等等)而言的准确性，但应考虑到一些实验错误和偏差。除非另外指明，否则份是重量份，分子量是重量平均分子量，温度是摄氏度，压力是大气压或接近大气压。

样品来源

这一研究中所用的所有胚胎是在多年期间的能力收集的并且由多个胚胎学家受精并且冷冻保存。我们的研究中每个患者的平均胚胎数目是3并且包括在一般IVF中心遇到的所有年龄组。刺激程序是标准的长lupron方案(cdc.gov/art)。额外的人类胚胎的冷冻保存通过将它们于室温(22+2℃)放置在冷冻培养基(1.5M1,2丙二醇+0.2M蔗糖)上25分钟来完成。之后使用缓慢冷冻方案(-1℃/分钟至-6.5℃；保持5分钟；接种；保持5分钟；-0.5℃/分钟至-80℃；投入液氮中)将胚胎冷冻。委员会。没有受保护的健康信息可与胚胎相关联。

确认一大组冷冻保存的胚胎并且进行下列观察：1)胚胎证实指示正常胚胎发育的界标方式的时机，所述界标包括：卵裂为2个细胞(在第2天早期发生)，RNA降解的开始(在第1至3天发生)，卵裂为4和8个细胞(分别在第2天和第3天晚期发生)，胚胎基因组的活化(在第3天8细胞阶段)以及桑椹胚和胚泡的形成(分别在第4和5天发生)。2)胚胎证实达到为典型的在临床情况下获得的胚胎的胚泡阶段的效率。这很可能归因于胚胎在2PN阶段被冷冻并且代表在IVF会诊中遇到的胚胎的阵列这一事实，因为在于1细胞阶段(典型的在第3天或胚泡阶段较晚冷冻保存的胚胎)冷冻保存之前没有进行将会或者将不会发育这样的“类选法(triage)”。因此，我们的数据证实与在典型的IVF诊所中观察到的那些相比这些胚胎表现出相似的胚泡形成速率。3)之前的研究已经证实与新鲜胚胎相比于2PN阶段保存的胚胎表现出发育、移植、临床妊娠和分娩的相似的潜力。其他的研究对于冷冻的卵母细胞同样显示相似的结果，我们的研究同样显示，对于冷冻的卵母细胞相似的结果表明人类胚胎发育的最早事件在冷冻保存后保持适当的时间线。4)我们关注不取决于受精的时间或者解冻时间的参数。我们测量的第一个参数(第一次胞质分裂的持续期间)具有很短的持续时间(大约10-15分钟)并且并不取决于这一研究中的受精的时间(其能够在所有胚胎中被独立测量而不管最终结果)。而且，相对于这一初始测量点测量所有随后的参数并且将在成功发育为胚泡和未能发育为胚泡的胚胎之间进行比较。5)最终，我们注意到为3PN的新鲜(未冷冻的)胚胎已知按照与新鲜正常胚胎相同的时间框架发育；我们比较了我们从斯坦福IVF诊所获得的新鲜3PN胚胎中的参数并且观察到它们与我们冷冻保存的胚胎或公开的报告的那些没有不同。

实验计划

在四个实验设置中，我们追踪242个前核期胚胎(分别是61、80、64和37个)的发育。在实验的每个设置中，在第1天将人类合子解冻并且以小组培养在多个板上。在不同的成像位置在暗视野照明下用时间间隔显微镜独立观察每个板。以大约24小时的时间间隔，从成像系统移除一个板的胚胎并且收集为单个的胚胎或单个的细胞(卵裂球)用于高通量实时定量PCR基因表达分析。每个板通常包含在收获时达到所期望的发育阶段的胚胎(称为“正常的”)和在较早的发育阶段停滞或延迟或者极大碎裂的那些(称为“异常的”)的混合物。将胚胎作为单一的完整胚胎分析或者分离为单一的卵裂球，之后进行基因特异性RNA扩增。将一亚组的胚胎(242个中的100个)成像直到第5或6天以便监测胚泡形成。

人类胚胎培养和显微镜

通过将冷冻瓶从液氮贮槽移出并且将它们放置于室温将人类胚胎解冻。一旦将小瓶解冻，将其打开并且胚胎在解剖显微镜下可见。之后将小瓶的内容物倒入3003培养皿的底部，胚胎被放入滴头并且评估和记录每个胚胎的存活。在室温，将胚胎转移至3037培养皿(其包含1.0M1,2丙二醇+0.2M蔗糖)5分钟，然后转移至3037培养皿(其包含0.5M1,2丙二醇+0.2M蔗糖)5分钟，以及转移至3037培养皿(其包含0.0M1,2丙二醇+0.2M蔗糖)5分钟。随后，使用油下的微滴，在第1至3天之间将胚胎在补充了10%Quinn’s Advantage血清蛋白替代物(SPS；CooperSurgical)的Quinn’s Advantage卵裂培养基(CooperSurgical)中培养并且在第3天之后在具有10%SPS的Quinn’sAdvantage胚泡培养基(CooperSurgical)中培养。所有这些实验使用相同类型的卵裂期培养基，除了在第一个实验中的两个位置，其使用Global培养基(LifeGlobal,Guilford,CT)。在这一个小的亚组(12个胚胎)中，胚胎表现出稍微低的胚泡形成速度(12个中的3个，或25%)，但是对于这个组我们预测参数的敏感性和特异性都是100%。

在多个系统上进行延时成像以适应多个样品的同时分析并且验证不同平台的数据的一致性。系统由7个不同的显微镜组成：(1)装备了Tokai Hit加热台、白光Luxeon LED和用于暗视野照明的光圈的两个修改的Olympus IX-70/71显微镜；(2)装备了加热台、白光Luxeon LED和霍夫曼调制相衬照明(Modulation Contrast illumination)的两个修改的Olympus IX-40/41显微镜(注意：决定暗视野照明对于测量参数来说是优选的之后仅在4个实验中的第一个期间使用这些系统)；和(3)适于标准孵育器内部的定制3通道微型显微镜阵列，装备有白光Luxeon LED和用于暗视野照明的孔。我们观察到在发育行为、胚泡形成速度或基因表达谱上在这些不同系统上培养的胚胎之间没有显著差别；事实上，我们的用于胚泡预测的参数在多个系统和实验之间是一致的。

所有系统的光强度都比辅助生殖显微镜通常使用的光低得多，归因于LED的低功率(相对于通常100W的卤素灯泡)和照相机传感器的高灵敏度。使用光功率计，我们确定在473nm的波长典型的辅助生殖显微镜(Olympus IX-71霍夫曼调制相衬)的功率在大约7至10mW的范围内(取决于放大率)，而我们的成像系统的功率在相同的波长测量在0.2和0.3mW之间。以1秒的曝光时间每5分钟捕获图像多达5至6天，产生约24分钟的持续曝光，在0.3mW的功率，其等于在典型的辅助生殖显微镜下大约1分钟的曝光。

为了在相关的成像和基因表达实验期间追踪每个胚胎的身份，我们在立体显微镜上安装了摄像机并且记录培养基更换和样品收集期间样品转移的过程。我们用小鼠植入前胚胎(n=56)和一小亚组的人类胚胎(n=22)进行对照实验并且在成像的和对照的胚胎之间的胚泡形成速度上没有观察到显著的差异(p=0.96)。

高通量qRT-PCR分析

对于单个胚胎或单个胚泡qRT-PCR分析来说，首先用酸性Tyrode溶液处理胚胎以除去透明带。为了收集单个卵裂球，用精密移液将胚胎于37℃在具有HEPES的Quinn’s Advantage无Ca²⁺Mg²⁺的培养基(CooperSurgical)中培养5至20分钟。将样品直接收集至10μl反应缓冲液中，随后如之前所描述的进行一步逆转录/预扩增反应。在逆转录和预扩增反应期间将合并的20X ABI assay-on-demandqRT-PCR引物和探针混合物(Applied Biosystems)用作基因特异性引物。如之前所描述的，用使用ABI assay-on-demand qRT-PCR探针的Fluidigm Biomark96.96动态Array进行高通量qRT-PCR。所有样品以3或4个技术重复(technical replicate)装载。用qBasePlus(Biogazelle)、Microsoft Excel和定制软件进行qRT-PCR数据分析。某些基因在数据分析中被省略，归因于不好的数据质量(例如不好的PCR扩增曲线)或在所评估的胚胎中始终低至无表达。对于卵裂球时期的分析，所使用的母系转录物小组包括DAZL、GDF3、IFITM1、STELLAR、SYCP3、VASA、GDF9、PDCD5、ZAR1和ZP1，而胚胎基因小组包括ATF7IP、CCNA1、EIF1AX、EIF4A3、H2AFZ、HSP70.1、JARID1B、LSM3、PABPC1和SERTAD1。使用geNorm和ΔΔCt法计算每种基因相对于参照基因GAPDH和RPLP0以及相对于基因平均值的表达值。经验上基于基因稳定性值和变异系数(对于GAPDH，为1.18和46%以及对于RPLP0，为1.18和34%)，选择GAPDH和RPLP0作为这一研究的参照基因。这些在我们测试的10个管家基因中是最稳定的并且正好在典型的异源样品集合的范围中。第二，我们观察到在单个卵裂球中，如所期望的，RPLP0和GAPDH转录物的量在1细胞和8细胞期之间每次分裂降低约1Ct值，符合在人类发育的头3天期间EGA之前不存在新的转录物的情况下每个细胞随着每次卵裂分裂遗传约一半mRNA池的预期。第三，我们注意到EGA开始之后，单个卵裂球中这些参照基因的表达水平在8细胞至桑椹胚期之间保持稳定。在完整的胚胎水平，RPLP0和GAPDH的Ct值在整个发育中直到桑椹胚期在很大程度上保持恒定，在胚泡期有轻微升高，可能归因于较大数目的卵裂球存在时增加的转录物水平。在这一研究中进行的基因表达分析中的大部分集中在桑椹胚期之前的发育期，当参照基因的表达水平非常稳定时。

自动细胞跟踪

我们的细胞跟踪算法使用以序列蒙特卡洛方法为基础的概率框架，其在计算机视觉领域中常被称为粒子滤波器。粒子滤波器随时间追踪三个主要变量的增长：状态、对照和测量。状态变量是胚胎的模型并且表示为椭圆的集合。对照变量是转化状态变量的输入并且由我们的细胞增殖和分裂模型组成。测量变量是对状态的观察并且由通过时间间隔显微镜获得的我们的图像组成。我们对在每个时间步骤的现有状态的估计用后验概率分布来表示，其近似于一组称为粒子的加权样品。我们可相互交替地使用术语粒子和胚胎，其中粒子是给定时间胚胎模型的一个假设。初始化之后，粒子滤波器重复应用三个步骤：预测、测量和更新。

预测：细胞被表示为2D空间中的椭圆并且每个细胞具有方向和重叠指数。重叠指数详细说明细胞的相对高度。通常，我们希望预测两个类型的行为：细胞运动和细胞分裂。对于细胞运动，我们的对照输入采用粒子并且随机扰乱每个细胞的每个参数，包括位置、方向以及长轴和短轴的长度。扰乱是随机地从具有相对小的方差(初始化的值的5%)的正常分布取样。对于细胞分裂，我们使用下列方法。在时间上给定的点，对于每个粒子，我们指定细胞中的一个将要分裂的50%的可能性。这一值是经验选择的并且包括大范围的可能的细胞分裂同时保持现有构型的良好的覆盖度。如果预期了分裂，那么将随机选择分裂的细胞。当细胞被选择来分裂，我们使用沿椭圆的长轴的对称分裂，产生相同大小和形状的两个子细胞。之后我们随机扰乱子细胞的每个值。最后，我们随机选择两个子细胞的重叠指数同时保持它们向对于剩下的细胞的正确的重叠。

使用对照输入之后，我们将每个粒子转化为模拟图像。这通过使用重叠指数将每个细胞的椭圆形形状投射在模拟的图像上来完成。相应的像素值被设定为二元值1并且扩大以产生与所观察到的图像数据同等的膜厚度。由于胚胎是部分透明的并且收集离焦光，胚胎底部的细胞膜仅有时可见。相应地，具有10%的可能性增加闭合的细胞膜。实际上，我们已经发现，这些闭合的膜点对于正确的形状建模来说是决定性的，但是使得它们足够稀疏以便它们不类似于可见的边缘是重要的。

测量：一旦我们生成假定模型的分布，就将相应的模拟图像与真实的显微镜图像相比较。显微镜图像是预先进行的以使用基本曲率为基础的方法以及之后的阈值分析产生细胞膜的二值图像。使用对称截短倒角距离估计比较的准确性，其之后被用于为每个粒子指定重量或者可能性。

更新：指定重量之后，与它们的重量成比例地选择粒子以产生用于下一个重复的一组新的粒子。这关注最高可能性区域中的粒子分布。放弃具有低可能性的粒子，而增加具有高可能性的粒子。使用低方差法进行粒子重采样。

如正文中所讨论的，一旦胚胎被建模，我们就可以提取动态显像参数，例如胞质分裂的持续时间和有丝分裂之间的时间。我们的细胞追踪软件之前被应用于Matlab并且估算时间在每张图像两秒至半分钟的范围内(取决于粒子的数目)。我们现有的软件版本被应用于C并且计算时间取决于粒子的数目在1至5秒的范围内。

实施例1

确定胚胎的发育潜力的图像分析。

方法

将冷冻的1细胞人类胚胎，也称为合子，解冻并且放入培养基中并且在培养条件例如在IVF或ICSI程序中使用的那些条件下培养。如上文更加详细地描述的，当它们在2PN期被冷冻并且因此无差别地冷冻保存时，这些胚胎显示是体外受精(IVF)群的典型代表。这与通常在被发现在新鲜周期期间具有最高质量的那些胚胎转移之后发育的较晚期冷冻保存的胚胎相反。对于一些实验，胚胎被放置在标准培养皿中。对于其他实验，胚胎在具有光学品质微孔的定制培养皿中培养。

之后将生长的胚胎，通常每皿1至25个，用计算机控制的装配用于数码图像存储和分析的显微镜各自延时成像。在一些实例中，使用装配加热台和孵育箱的倒置显微镜进行延时成像。在其他实例中，使用适于常规孵育器内部的定制的微型显微镜阵列进行延时成像，其使得在同一孵育器中的多皿样品能够同时培养并且大小可变以适应多通道而没有对连续图像捕获之间的最小时间间隔的限制。使用多个显微镜同样消除了对移动样品的需要，其增加了系统准确性和整个系统的可靠性。成像系统使用暗视野照明，其为随后的特征提取和图像分析提供增强的图像对比，虽然已经注意到其他照明已经是足够的。将孵育器中的单个显微镜彼此分离，给每个培养皿提供其自己的受控环境。这允许皿从成像位置转入和转出而不破坏其他样品的环境。

收集延时图像用于随后的细胞形态学分析，包括下列细胞参数中的至少一个的测量：第一次胞质分裂的持续时间，第一次和第二次细胞分裂之间的时间间隔以及第二次和第三次细胞分裂之间的时间间隔。图中显示的图像是在多达5或6天每5分钟以1秒的曝光时间获取的。如下文更加详细描述的，第一次胞质分裂通过常在受精后一天发生并且持续约14分钟。第一次和第二次细胞分裂通常间隔平均约11小时。第二次和第三次细胞分裂通常间隔平均约1小时。因此，成像是在受精后持续约36小时(加或减几小时)的一段时间。

结果

一个六天的时间段中通过延时成像证实了培养中健康人类植入前胚胎的发育时间线(图2)。观察到正常人类合子在第2天早期经历第一次卵裂分裂。随后，在第4天紧密结合为桑椹胎之前，胚胎分别在第2天和第3天分裂为4细胞和8细胞胚胎。当全能卵裂球分化为产生类似于胎座的胚胎结构的滋养层细胞或者体内发育为胚胎并且体外发育为多潜能干细胞的内细胞群时，在胚泡形成期间的第5天和第6天观察到最初的形态学上明显的细胞分化。

接下来我们在四个独立的实验设置中追踪242个正常受精的胚胎并且证实培养至第5天或第6天的样品中正常和停滞的胚胎的分布。在242个胚胎中，将100个胚胎培养至第5天或第6天并且观察胚泡形成速度在33%–53%之间，与在典型IVF诊所的胚泡形成速度相似(图3)。剩余的胚胎在发育的不同时期停滞，最常在2细胞和8细胞期之间并且被定义为不正常(图3)。为了确定预测胚胎成功发育至胚泡阶段的定量成像参数，我们提取并分析了来自延时录像的几个参数，包括卵裂球大小、透明带厚度、碎裂的程度、第一个细胞周期的长度、头几次有丝分裂之间的时间间隔和第一次有丝分裂的持续时间。在发育正常和不正常的胚胎的录像图像分析期间，我们观察到在许多停滞的胚胎在第一次细胞分裂期间经历异常的胞质分裂。正常的胚胎在从卵裂沟的出现至子细胞的完全分离的14.3+/-6.0分钟的狭窄的时间窗口中以平稳且受控的方式完成胞质分裂。这显示于图4顶部。相反，不正常胚胎通常显示两个异常胞质分裂表型中的一个。在温和的表型中，胞质分裂的形态学和机制似乎是正常的，但是完成过程所需要的时间更长，从额外的几分钟到一小时(图4)。偶尔，经历稍微延长的胞质分裂的胚胎仍然发育为胚泡。在更多的几个表型中，胞质分裂的形态学和机制被扰乱。例如，如图4的下组中的实施例中所示，胚胎形成单面的卵裂沟并且在最终碎裂为较小的部分之前经历一系列不正常的膜边缘波动事件几个小时。同样观察到这些行为的其他变化。另外，证明这些更严重的表型的不正常的胚胎常常变成碎片，提供了胚胎碎裂可能是随后导致不正常的胚胎发育的异常胞质分裂的副产物。

对我们的图像结果的详细分析表明在胚胎基因活化(EGA)开始之前，在早期分裂期间的胞质分裂和有丝分裂中正常胚胎遵循严格的时间，表明胚胎的发育潜力是由所遗传的母系程序预先决定的。特别地，我们注意到在早期胚胎的细胞周期中被严格调控的三个时态区间或者参数：(1)第一次胞质分裂的持续期间，(2)第一次和第二次有丝分裂之间的时间间隔和(3)第二次和第三次有丝分裂的同步性。这三个时间间隔和形态学变化之间的关系示于图5中，对于正常胚胎，我们测量这些参数分别为大约14.3+/-6.0分钟、11.1+/-2.1小时和1.0+/-1.6小时(本文给定为平均正/负标准偏差)。

我们同样对新鲜(未冷冻保存)的是从单细胞期开始的3PN(三倍体)的胚胎的小集合(n=10)进行成像。3PN胚胎已经显示遵循与正常新鲜胚胎相同的界标事件的时间线直到至少头三个细胞周期。在我们的主要实验之前将这些胚胎成像以便验证成像系统(但是由于技术原因没有对胚泡实行)。这一新鲜胚胎的集合中，3个胚胎遵循与我们的冷冻保存的2PN胚胎相似的事件时间线，具有从15至30分钟范围的胞质分裂的持续时间，9.6至13.8小时范围内的第一次和第二次有丝分裂之间的时间，0.3至1.0小时范围内的第二次和第三次有丝分裂之间的时间。然而，在7个胚胎中，我们观察到独特的胞质分裂表型，其特征为3个卵裂沟同时出现、胞质分裂稍微延长和最终分裂为3个子细胞(图4)。这些胚胎具有从15至70分钟范围内的胞质分裂持续时间(特征为卵裂沟的起始直到完全分裂为3个子细胞之间的时间)、8.7至12.7小时范围内的第一次和第二次有丝分裂(3细胞至4细胞)之间的时间以及0.3至2.6小时范围内的第二次和第三次有丝分裂(4细胞至5细胞)之间的时间。这一观察与由不正常胚胎表现的胞质分裂表型的不同范围一起表明我们的冷冻保存的胚胎发育上没有被冷冻保存过程延迟并且行为与分裂为两个卵裂球的新鲜合子相似。

通过具有约0至33分钟之间的第一次胞质分裂、7.8至14.3小时之间的第一次和第二次有丝分裂之间的时间和0至5.8小时之间的第二次和第三次有丝分裂之间的时间能够预测达到胚泡期的胚胎，分别具有94%和93%的敏感性和特异性(图6)。相反，表现出这些窗口中的一个或多个之外的值的胚胎被预测停滞。所有成功发育为胚泡的正常胚胎在所有三个参数中表现出相似的值。相反，不正常的胚胎在它们完成所述间隔所花费的时间的长度上表现出高量的变化性(图6)。我们观察到(1)比正常更长的完成第一次胞质分裂的时间段指示不良发育潜力；(2)比正常更长或更短的第一次和第二次细胞分裂之间的间隔表明指示不良发育潜力；和(3)比正常更长或更短的第二次和第三次细胞分裂之间的间隔表明指示不良发育潜力。因此，这些参数是对胚胎行进至胚泡形成的能力和胚泡质量的预测。

最后，我们注意到尽管每个参数独立地预测胚胎的发育潜力，但所有三个参数的使用提供了都超过90%的敏感性和特异性，具有3倍于标准偏差的截止点。这些参数的接受者操作表征(ROC)曲线显示于图7中。在这一图中的曲线显示不同标准偏差截止的真阳性率(敏感性)与假阳性率(1-特异性)对比。为了获取这一ROC，使用了下列数目：真阳性的数目=34(正确预测达到胚泡)；真阴性的数目=54(正确预测停滞)；假阳性的数目=4(不正确预测达到胚泡)；假阴性的数目=2(不正确预测停滞)。

讨论

我们的分析显示在头三次卵裂分裂期间的有丝分裂和胞质分裂中遵循严格时间的胚胎有高得多的可能发育到胚泡期并且形成具有扩大的内细胞群(ICM)的高质量胚泡。动态形态学参数可被用来选择用于在IVF程序中的转移或冷冻保存的最佳的胚胎。这些参数还可用来分辨胚泡的不同品质，允许将组中胚胎的相对发育潜力分级。IVF诊所中的标准实践是在8细胞期(第3天)转移。一些诊所选择将胚胎培养至胚泡期(第5天)，因为胚泡转移与在第3天转移相比最高将植入率加倍。然而，很多诊所避免延长培养，归因于增加的表观遗传疾病的风险。预测成像参数可被用来在4细胞期(第2天)并且在胚胎基因活化之前预测胚胎成活力。这可允许比通常实行的早整一天并且在胚胎经历它们的分子程序上的显著变化之前将胚胎转移或冷冻保存。这还可允许选择最佳的胚胎，用于PGD或其他类型的分析。

实施例2

通过基因表达分析验证成像参数和基因表达分析确定发育潜力的用途。

方法

将冷冻的1细胞人类胚胎，也称为合子，解冻并且放入培养基中并且在培养条件例如在IVF程序中使用的那些条件下培养。对于一些实验，胚胎被放置在标准培养皿中。对于其他实验，胚胎在具有光学品质微孔的定制培养皿中培养。

将胚胎从培养基和成像系统移出并且收集为用于基因表达分析的单个胚胎或单个细胞(卵裂球)。每个板通常包含胚胎的混合物，一些在收获的时候达到了所期望的发育阶段而其他的在较早的发育阶段停滞或者广泛碎裂。在收获的时候达到了所期望的发育阶段的那些被分类为“正常的”，而停滞的那些被认为是“不正常的”。例如，当为了收集样品将一个板的胚胎在第二天晚期从成像位置移出，已经达到4细胞期并且超过的任何胚胎将被定义为正常的，而没能达到4细胞期的那些将被标记为停滞的。将这些停滞的胚胎按照它们开始停滞的发育期分类，以使在第2天晚期仅具有2个胚泡的胚胎将被分析为停滞的2细胞胚胎。在样品收集的时候小心排除形态学上似乎是死亡的并且有孔的胚胎(例如退化的卵裂球)。仅显示活着的胚胎(正常的和停滞的两种)被用于基因表达分析。然而，可能的是收集的时候显示正常的胚胎如果它们被允许生长至较晚期的话可能最终停滞。通过定量RT-PCR(qRT-PCR)进行代表这些种类中的每一种的胚胎的基因表达分析。以大约24小时的间隔，从单个成像系统收集胚胎用于高通量的qRT-PCR基因表达分析，具有对96个样品测定的多达96个基因的多路反应。使用Fluidigm Biomark系统进行基因表达分析，其可以纳升的量实现多达9216个同时发生的以TaqMan测定为基础的qRT-PCR反应。

结果

为了解释可能成为形态学事件的基础的分子机制，我们对有关的基因表达谱分析。每个样品评估属于不同类别的96个不同基因的表达水平，包括管家基因、生殖细胞标记、母体因子、EGA标记、滋养层标记、内细胞团标记、多潜能标记、表观遗传学调节因子、转录因子、激素受体和其他(表1，在图19中)。在两个不同的实验设定中评估了两个有所不同但是重叠的集合的基因，提供诊断人类胚胎命运的独一无二的基因集合。所述独一无二的基因集合是从关于来自模式生物的胚胎或人类胚胎干细胞的基因表达的数据以及从我们自身未公布的微点阵数据编译的。在这一研究中第一次展示了人类植入前胚胎中这些基因集合的表达状态。

使用geNorm法(

T等人(2009)Hum Reprod)和AACt法(Vanneste E等人(2009)Nat Med15:577-83)计算每个基因相对于参照基因GAPDH和RPLPO以及相对于基因平均值的表达值。基因稳定性值和变异系数是1.18和46%(对于GAPDH)以及1.18和34%(RPLPO)，在我们测试的10个管家基因中是最稳定的并且正好在典型的异源样品集合的范围中。在单个的卵裂球中，如所期望的，RPLPO和GAPDH转录物的量在1细胞和8细胞期之间的每次分裂降低约1Ct值，归因于卵裂分裂的减半影响和人类发育的头3天内缺少EGA。单个卵裂球中这些参照基因的表达水平在8细胞至桑椹胚期之间保持稳定。在完整的胚胎水平，RPLPO和GAPDH的Ct值在整个发育中直到桑椹胚期在很大程度上保持恒定。在胚泡期RPLPO和GAPDH的表达水平显著升高，最有可能归因于存在增加数目的卵裂球。这些变化没有影响RPLPO和GAPDH作为参照基因的可靠性。在这一研究中进行的基因表达分析中的大多数聚焦于桑椹胚期之前的发育期，此时参照基因的表达水平非常稳定。

正常和不正常胚胎之间的差别基因表达。图8显示来自6个不正常的1至2细胞胚胎和5个正常的1至2细胞胚胎的52个基因的平均表达水平以对数比例标绘在雷达图中。通常停滞的胚胎显示与正常胚胎相比mRNA的减少的量，促进胞质分裂、RNA加工和miRNA生物发生的基因受到最严重的影响。用星号突显的基因表示如曼尼惠特尼测试所确定的在正常和不正常胚胎之间的统计学上的显著差异(p<0.05)。这18种基因是Cofillin、DIAPH1、ECT2、MYLC2、DGCR8、Dicer、TARBP2、CPEB1、偶对蛋白、YBX2、ZAR1、CTNNB1、DNMT3B、TERT、YY1、IFGR2、BTF3和NELF。每种基因属于如图中所指示的组，即胞质分裂：Cofillin、DIAPH1、ECT2和MYCL2；miRNA生物发生：DGCR8、Dicer和TARBP2；RNA加工：YBX2；母体因子：ZAR1；管家：CTNNB1；多潜能：DNMT3B、TERT和YY1；受体：IGFR2以及转录因子：BTF3和NELF。在大多数实例中，这些基因的表达水平在正常的1和2细胞胚胎中比在停滞的1和2细胞胚胎中更高。

有趣的是，某些基因类别在不正常胚胎中比在其他的中更受影响。例如，在不正常的胚胎中，大多数的管家基因、激素受体和母体因子在基因表达上一点都不改变，然而胞质分裂和miRNA生物发生所涉及的许多基因显示出显著降低的表达。而且，在受影响的基因中，某些基因在正常和不正常胚胎之间显示比其他大得多的差异。例如，miRNA生物发生通路中涉及的基因，诸如DGCR8、Dicer和TARBP2，在不正常的胚胎中表现出高度减少的表达水平。值得注意的是，CPEB1和偶对蛋白，受到最严重影响的基因中的两个，属于调节母源mRNA储存和通过处理转录物poly(A)尾的活化的相同的分子机制(Bettegowda,A.等人(2007)Front.Biosci.12:3713-3726)。这些数据表明胚胎不正常性与胚胎的mRNA调节程序中的缺陷有关。

将胞质分裂与基因表达谱相关联。用编码关键胞质分裂组分的基因进行基因表达分析。通过在立体显微镜上安装照相机并且将培养基更换和样品收集期间的样品转移过程摄像来追踪每个胚胎的身份。当评估不正常胚胎的基因表达谱时，我们观察到在异常胞质分裂和关键胞质分裂成分的较低基因表达水平中的强烈关联。有趣的是，不正常胚胎的基因表达谱和它们的异常形态学表型一样是不同并且可变的。

已发现胞质分裂基因在正常2细胞胚胎和不正常2细胞胚胎间(图9)以及在正常4细胞胚胎和不正常4细胞胚胎间(图10)是不同的。图9和10显示与不同的胞质分裂表型相关的在正常的2细胞人类胚胎(图9)和正常的4细胞胚胎(图10)中更高表达的基因的相对表达。如在图9中所表现的，在第一次胞质分裂期间显示不正常的膜边缘波动的停滞的2细胞胚胎对所有所测试的胞质分裂调节基因具有显著降低的表达水平。图9中显示差异的基因是苯胺素(anillin)、cofillin、DIAPH1、DIAPH2、DNM2、ECT2、MKLP2、MYCL2和RhoA。正常表达水平以右边的柱给出并且可以看出在每个基因中都更高。在图9的图表上方的照片中，显示不正常的两个细胞胚胎，比例尺代表50μm。图10显示从在第一次分裂期间经历具有单面胞质分裂沟和大大延长的胞质分裂的异常胞质分裂的停滞的4细胞胚胎的结果，所述显示胞质分裂调节因子苯胺素(Anillin)和ECT2的降低的表达。图10中的比例尺也代表50μm。

胚胎期特异基因表达模式。图11显示在对141个正常发育的单个胚胎和单个卵裂球的基因表达分析期间鉴定的四个胚胎期特异模式(ESSP)。分入四个ESSP中每一个的基因列在表2中(图20)。图11中的图通过以相似的表达模式为基础将基因分类并且将它们的表达值(相对于参照基因)的平均来产生。ESSP的相对表达水平通过将具有相似表达模式的基因的表达水平平均来计算。将基因表达水平对不同的细胞期做图，即，1c=一个细胞；M=桑椹胚，B=胚泡。在图11中，四个ESSP的每一个中的基因的相对表达显示为发育的函数，从1细胞(1c)至桑椹胚和胚泡。ESSP1显示母系遗传，ESSP2显示基因转录活化，ESSP3显示晚期活化而ESSP4显示持久的转录物。如ESSP2中所指示的，IVF诊所中典型的转移点发生在第3天，此时胚胎正在经历归因于胚胎基因活化的显著的发育变化。延时成像数据指示胚胎的发育潜力可通过4细胞期来鉴定，由此允许胚胎在第2天并且在这一基因活化之前较早的转移。这一早期转移对于提高IVF程序的成功率是有用的。

表2(图20)列出属于所鉴定的四个ESSP中的每一个的基因。对参照基因(GAPDH和RPLPO)并且相对于基因平均值估算每种基因的相对基因表达水平。对照胚胎的发育时间线每种基因的表达模式遵循下列四个ESSP中的一个：ESSP模式(1)早期，开始高，缓慢降低并且在胚泡之前关闭的基因；ESSP模式(2)中期：4细胞期之后开启的基因；ESSP模式(3)晚期：在桑椹胚或胚泡时开启的基因和ESSP模式(4)恒定：具有相对恒定的表达值的基因。

ESSP1描述母系遗传的基因的模式。这些转录物以合子期的高表达水平开始并且随后随着胚胎发育为胚泡而降低。这些转录物的半衰期是大约21小时。来自其他模式生物的典型的母体因子例如GDF9和ZAR1以及生殖细胞(卵母细胞)特异基因VASA和DAZL在这一分类中。ESSP2包括胚胎活化基因，其在4细胞期之后在胚胎中首次转录。这一分类中的一些基因显示表现出两波活化，第一次并且较小的一次在5至6细胞期而第二次并且较大的一次在8细胞期。来自其他的模式生物的已知的EGA基因(例如EIF1AX31和JARID1B32)在这一分类中。ESSP3由直到胚泡期才表达的晚期活化的基因组成，包括滋养层标记GCM1。ESSP4包含在整个发育中相对于参照基因保持稳定表达的持久转录物。这些基因的半衰期是193小时，比ESSP1长约9倍，这一分类包括管家基因、转录因子、表观遗传调节因子、激素受体和其他的混合物。在使用单个正常胚胎和卵裂球的61个样品的另一个实验设定中证实基因表达的这些4种模式。

在第一次分裂期间表现出异常的细胞动力学和有丝分裂行为的不正常的胚胎与高不稳定的基因表达谱有关，尤其是涉及胚胎RNA管理的基因中。因此，一种方法可结合这些方法学以提供可被用于预测植入前胚胎成活力的方法。结果表明不正常的胚胎以RNA加工和miRNA生物发生中的缺陷程序开始生活，导致母系mRNA的过度降解。这些未调节的RNA降解的随机性质导致转录物的随机破坏，引起在不正常胚胎中观察到的各种各样的异常表型。下降水平的miRNA引起调节的母系RNA降解中的缺陷，导致在不同时期的发育停滞。

单个的卵裂球分析。为了评估人类植入前胚胎中何时开始分子分化，分析了从处于不同发育期的17个胚胎收获的单个卵裂球中CDX2表达水平。图12A显示两个基因CTBBN1(黑柱)和CDX2(浅柱)的相对表达水平为发育期的函数，从2细胞至胚泡。如可见的，在来自4细胞期之前的胚胎的单个卵裂球中CDX2以较低水平偶然被表达(图12A)。然而，从6细胞期开始，每个胚胎包含以显著水平表达CDX2的至少一个卵裂球。也显示在图12A中的管家基因CTNNB1的表达水平在来自相同胚胎的卵裂球中保持恒定，指示CDX2的多样化表达模式不是qPCR的人工产物。来自独立实验的数据证实相似的观察。这些结果表明人类植入前胚胎的分子分化可在4细胞期之后尽可能早地立即发生。

有趣的是，对单个卵裂球中的基因表达谱的检查显示包含具有相应于不同发育期的基因表达标签的卵裂球的胚胎。任何给定的时间的任何给定的胚胎的基因表达谱等于母系mRNA降解和EGA的和。早期发育期的较年轻的卵裂球通常含有高量的母系转录物和低量的合子基因并且相反的对处于较高等的发育期的较年长的卵裂球适用。在这一实验中，具体程序被定义为10个ESSP1标记(母系转录物)的平均表达值而胚胎程序则通过10个ESSP2标记(胚胎转录物)的平均表达水平。所使用的母系转录物组包括DAZL、GDF3、IFITM1、STELLAR、SYCP3、VASA、GDF9、PDCD5、ZAR1和ZP1，而胚胎基因组包括ATF7IP、CCNA1、EIF1AX、EIF4A3、H2AFZ、HSP70.1、JARID1B、LSM3、PABPC1和SERTAD1。在从这一特定的8细胞胚胎中成功收集的6个卵裂球中，3个卵裂球显示出与来自正常的3细胞胚胎样品相似的基因表达标签，而其余3个卵裂球与来自正常的8细胞胚胎的卵裂球相似(图12B)。这一观察的最可能的解释是胚胎中一个亚群的细胞的停滞。这一部分停滞表型同样在我们测试的样品中的另一个9细胞胚胎和2个桑椹胚中观察到。母系转录物水平在已经在培养中花费与它们的正常的姐妹细胞相同的时间量的停滞的卵裂球中仍然高的事实，表明母系RNA的降解不是随时间简单发生的自发过程而最可能需要特异RNA降解机制例如微RNA(miRNA)的作用。这些数据同样提供了母系mRNA降解是哺乳动物胚胎发生期间保守的发育事件并且是正常的胚胎发育所需要的进一步的证据(Bettegowda,A.等人(2008)Reprod.Fertil.Dev.20:45-53)。此外，这些数据表明胚胎中单个的卵裂球是自发的并且可彼此独立地发育。另外，这些结果指示可使用本文描述的基因表达水平测试以在有待被测试的细胞中测试mRNA的水平(其指示基因表达水平)，其中RNA是已知为母系程序的一部分的基因并且在胚胎发育的晚期中这一发育水平的持续与不正常结果的可能性有关，或者是胚胎程序的一部分，其中随时间的缺乏指示不正常结果的可能性。本文检验的母系程序基因是ZAR1、PDCD5、NLRP5、H5F1、GDF9和BNC2。其他的母系影响基因是已知的并且可用的。

胚胎基因活化。本方法是至少部分以不正常的发育停滞的胚胎在EGA(胚胎基因活化)发生之前的头三次分裂期间通常表现出异常胞质分裂和有丝分裂时间的发现为基础的。这表明胚胎发育的命运主要由母系遗传决定，一个与由Hardy等人在200134中进行的人类植入前发育的数学模型显著一致的发现。而且胞质分裂和有丝分裂的异常与调节miRNA生物发生和母系mRNA遮蔽、储存和再活化的基因中母系转录物的降低的水平强烈相关。miRNA通过促进不同生物过程中的mRNA降解来调节翻译，包括生物发育和分化(Blakaj,A.&Lin,H.(2008)J.Biol.Chem.283:9505-9508；Stefani,G.&Slack,F.J.(2008)Nat.Rev.Mol.Cell Biol.9:219-230)。来自模式生物的增加的证据显示miRNA可以是在早期胚胎中母系转录物降解的关键调节因子(Bettegowda,A.等人(2008)Reprod.Fertil.Dev.20:45-53)。因此，miRNA生物发生上的缺陷将很可能导致不正常的胚胎发育，另一方面，不能正确管理母系mRNA同样导致不良胚胎发生。哺乳动物卵母细胞合成在母亲生产前支持早期胚胎生长所需要的大量母系RNA转录物。这些转录物被抑制并且贮存一段延长的时间，直到它们在受精之后被再活化。这一母系RNA管理程序中的缺陷将可能影响母系转录物的量和质量并且因此损害成功发育的机会。

评估胚胎成活力的模型。图13显示以相关的成像和分子分析为基础的人类胚胎发育的模型。所显示的是包括预测成功发育成胚泡的关键的短暂时间的从合子发育至胚泡的时间线和胚胎发育的图解。如所图解的，关键分子数据指示人类胚胎以遗传自母亲的不同集合的卵母细胞RNA开始生活。这一集合的RNA通过卵中特异RNA管理程序保持并且包装。受精之后，对卵特异的一个亚集合的母系RNA(ESSP1：胚胎期特异模式1)的降解必定随从卵母细胞至胚胎的转变的开始而降低。同时，其他的RNA随发育继续(ESSP4)而理想上平均地分配给每个卵裂球。RNA的成功降解和分配随细胞自发形式的胚胎基因组活化(EGA)和ESSP2的基因的转录而结束。值得注意的是，在卵裂分裂期间，胚胎卵裂球可独立地停滞或进行。胚胎中细胞自发发育的结果是单个卵裂球可停滞或进行并且当8细胞进行至桑椹胚期并且超过时，胚泡质量将受到停滞或进行超过8细胞的细胞的数目的冲击。成像数据证实有预测成功或失败的发育的关键期：第一次胞质分裂、第二次卵裂分裂以及第二次和第三次卵裂分裂的同步性。这些参数可使用之前描述的细胞追踪算法和软件自动测量。所描述的系统和方法被用于使用关键成像预测因子诊断胚胎结果并且可允许发育中较早期的较少胚胎的转移(在EGA之前)。

实施例3

将卵母细胞成熟和随后的胚胎发育成像。

结果

现有IVF操作的主要限制中的一个是卵母细胞质量和可用性。例如，现有IVF方案从小周期池(small cyclic pool)补充卵母细胞，提供用于受精的少量的卵母细胞(例如1-20个)。而且，IVF操作期间激素刺激之后获取的约20%的卵母细胞被分类为不成熟的并且通常因为在现有培养条件下减少的胚胎发育的潜力而被排除。

增加卵母细胞池的一种方法是通过体外成熟。图14显示体外成熟期间发育的三个时期，包括生发泡、中期I和中期II。生发泡和中期I期被定义为未成熟的卵母细胞而中期II因为在体外起始之后24-28小时发生的第一极体的存在而被定义为成熟的。

增加卵母细胞池的另一个方法是从初级和次级池补充卵母细胞，提供多达几千的卵母细胞。在这一操作中，休眠滤泡从卵巢补充并且进行体外程序以产生具有正常染色体组成、表观遗传状态、RNA表达和形态学的卵母细胞。在另一方面，卵母细胞可来源于体外分化为生殖细胞的多潜能干细胞并且成熟为人类卵母细胞。

如图14中说明的，卵母细胞的体外成熟过程由可被用于定义在本发明的方法中用于测量和分析的细胞参数的若干细胞变化来标记。这些包括（例如）卵母细胞膜形态学上的变化，诸如从透明带分离的速度和程度；卵母细胞核形态学上的变化，诸如胚泡破裂(GVBD)的启动、完成和速度；细胞质和细胞核中颗粒的运动的速度和方向以及第一极体的运动和排出。

实施例4

将干细胞分化成像。

结果

延时成像分析还可被用于评估其他类型的细胞的成活力、发育潜能和结果，诸如干细胞、诱导的多潜能干细胞(iPSC)和人类胚胎干细胞(hESC)。干细胞的发育潜力可通过使用延时图像分析来评估以测量细胞发育和分化期间形态学上的变化(图17)。之后可分析并且选择用于体内移植或其他用途的分化的细胞。可从延时成像数据提取并分析干细胞的几个参数，例如胞质分裂的持续时间、有丝分裂事件之间的时间、细胞大小和形状、细胞的数目、细胞的运动、分裂模式、分化、不对称分裂(此时一个子细胞保持干细胞而另一个子细胞分化)、对称分裂(此时两个子细胞均保持为干细胞或两个均分化)和命运特定化(当干细胞分化时之前确定的)。

干细胞治疗的基本程式是未分化的干细胞可体外培养，分化为特定的细胞类型并且随后移植至受体以便受伤的组织和/或器官再生。延时成像分析可被用作高通量非侵入装置以鉴定形成能够整合到成熟组织中的非致癌的分化的后代的干细胞。可能的应用包括神经疾病例如阿尔茨海默病和帕金森症、血管系统疾病和心脏疾病、肌肉和骨骼疾病诸如关节炎、自身免疫性疾病和癌症的治疗以及通过评估指标的药物开发和新型治疗。

在人类中，受损的组织通常通过体内干细胞的持续的补充和分化来代替。然而，身体再生的能力随着年龄而降低。这样的一个实例是由括约肌缺损导致的尿失禁。年龄据信是括约肌缺损的主要成因中的一个，因为肌肉纤维的数目和神经密度随时间而减少。为了治疗患有失禁的患者，iPSC可来源于从阴道壁组织培养的成纤维细胞以便产生分化的平滑肌细胞。之后这些分化的细胞可被体内移植。在移植之前，延时成像分析可被用于将iPSC就多潜能性、分化、甲基化和致癌性来表征。其他的应用包括来源于患有帕金森症的患者的皮肤细胞并且分化为用于移植的神经元的iPSC的延时成像(图18)。

实施例5

通过自动分析证实成像参数

如我们的延时图像数据所证明的，人类胚胎发育是在同龄的胚胎之间高度变化的过程并且胚胎可在细胞分裂期间表现出各种各样的行为。因此，某些发育事件例如高度不正常的胞质分裂的持续时间(图4)的手动表征可以被解释。为了证实我们的成像参数和系统地预测胚泡形成的能力，我们开发了用于自动追踪细胞分裂直到4细胞期的算法。我们的追踪算法使用以序贯蒙特卡罗方法为基础的概率模型评估技术。这一技术通过产生假定胚胎模型的分布、以简单的光学模型为基础模拟图像并且将这些模拟与观察到的图像数据相比较来运行(图21a)。

将胚胎建模为具有位置、方向和重叠指数的椭圆的集合(以表示细胞的相对高度)。关于这些模型，可提取胞质分裂的持续时间和有丝分裂之间的时间。胞质分裂通常通过胞质分裂沟的首次出现(当两极凹陷沿着卵裂轴形成)至完成子细胞的分离来定义。我们通过将胞质分裂大致估计为1细胞至2细胞分裂之前的细胞延长的持续时间来将问题简化。如果轴长度上的差距超过15%(经验地选择)细胞被认为延长。有丝分裂之间的时间直接通过将每个模型中细胞计数来提取。

我们在一组14个人胚胎上测试了我们的算法(图21b)并且将自动的测量与手动图像分析相比较(图21c、图21d)。在这一数据组中，14个胚胎中的8个达到了具有良好形态学的胚泡阶段(图21e，上图)。自动测量与手动测量非常吻合并且所有8个胚胎被正确预测达到胚泡。14个胚胎中的两个达到具有不良形态学的胚泡(不良质量的内细胞群，图21e，下图)。对于这些胚胎，手动评估显示1个将达到胚泡而1个将停滞，而自动测量预测两者都将停滞。最后，14个胚胎中的4个在胚泡期之前停滞并且所有的两种方法都正确预测停滞。

粒子滤波器框架

粒子滤波器是以蒙特卡罗模拟为基础的模型模拟技术。它被用来通过产生假定的模型的分布并且将这些模型与所观察到的数据比较来模拟未知的或“隐藏的”模型。其适应任意运动动力学和测量不确定性的能力使得其是追踪细胞分裂的理想候选者。

粒子滤波器随时间追踪三个主要变量的增值：状态x、对照u和测量z。状态变量x是我们希望评估的胚胎的模型并且被表示为椭圆(2D)或椭圆体(3D)的集合。对照变量u是将状态变量转化的输入并且由我们的细胞增殖和分裂模型构成。测量变量z是状态的观察并且由我们通过时间间隔显微镜获得的图像构成。在下面部分中更加详细地描述这些参数。

用后概率分布表示每个时间步骤t的现有的状态x的估算。这一后概率通常被称为置信(the belief)并且被定义为给定所有的过去的图像测量z_1:t和过去的对照u_1:t的现有状态x_t的条件概率

bel(x_t)=p(x_t|u_1:t,z_1:t).

粒子滤波器用一组加权的样品或粒子大致估计在后，表示为：

$x_t=x_t^{\left[1\right]},x_t^{\left[2\right]},...,x_t^{\left[M\right]},$

其中M是粒子的数目。术语粒子和胚胎模型在本文可互换使用。因此，单个粒子xt^[m](其中1<=m<=M)是时间t时的胚胎模型的一个假设。

起始之后，粒子滤波器重复应用三个步骤。第一个步骤是假设，其中每个粒子使用对照输入来增值：

$x_t^{\left[m\right]}~p\left(x_t\right|u_t,x_{t-1}^{\left[m\right]}).$

所获得的粒子的集合是所述先验概率的近似值。第二步是测量更新，其中每个粒子被指定相应于现有测量的概率的重要性权重：

$w_t^{\left[m\right]}=p\left(z_t\right|x_t^{\left[m\right]}).$

所述加权的粒子的集合是在后的bel(xt)的近似值。

粒子滤波器的主要成分在第三步中出现，其中粒子的集合根据它们的权重重新采样。这一重新采样步骤关注最高概率的区域中的粒子分布。

细胞表示

将细胞表示为2D空间中的椭圆。每个细胞具有主轴、短轴和笛卡儿坐标中的2维位置，通过下列方程给出：

$\frac{{(x-x_0)}^2}{a^2}+\frac{{(y-y_0)}^2}{b^2}=1.$

每个椭圆同样具有朝向方向θ(偏转)，这允许其在x-y平面中旋转。由于椭圆几乎总是彼此重叠，我们同样指示重叠指数h，其指定重叠的次序(或者细胞的相对高度)。时间t时的每个胚胎模型的参数因此给定为：

$x_t^{\left[m\right]}=\left[\begin{array}{cccccc}{x}_{0_1}& y_{0_1}& a_1& b_1& {\mathrm{\&theta;}}_1& h_1\\ x_{0_2}& y_{0_2}& a_2& b_2& {\mathrm{\&theta;}}_2& h_2\\ \&CenterDot;& \&CenterDot;& \&CenterDot;& \&CenterDot;& \&CenterDot;& \&CenterDot;\\ \&CenterDot;& \&CenterDot;& \&CenterDot;& \&CenterDot;& \&CenterDot;& \&CenterDot;\\ \&CenterDot;& \&CenterDot;& \&CenterDot;& \&CenterDot;& \&CenterDot;& \&CenterDot;\\ x_{0_N}& y_{0_N}& a_N& b_N& {\mathrm{\&theta;}}_N& h_N\end{array}\right],$

其中N是该模型中的细胞的数目。

细胞扰乱和分裂

粒子滤波器的第一步是预测，其中使用对照输入将每个粒子增值。为了我们的应用，有我们想要建模的两种类型的行为。第一种类型的行为包括细胞运动，其包括平移、关于偏转角的旋转以及主轴和短轴的长度上的变化。第二种类型的行为是细胞分裂，其中一个细胞分裂为两个新细胞。

为了将细胞运动建模，我们的对照输入采用粒子并且随机扰乱每个细胞的每个值：x_0i、y_0i、a_i、b_i、θ_i。所述扰乱是使用相对小的变量从正常分布随即采样的(通常设定为初始化的值的5%)。

为了将细胞分裂建模，我们使用了下列方法。在时间上给定的点，对于每个粒子，我们假定细胞中的一个将要分裂的50%概率。该值是经经验选择的并且跨越大范围的可能的细胞分裂同时保持对现有构型的良好覆盖。如果分裂是预期的，那么所述分裂的细胞是随机选择的。更加复杂的模型将考虑另外的因素例如粒子中细胞的数目和这些分裂模式的历史并且将可能以所观察到的来自真实数据的行为为基础产生模型。

当细胞被选择分裂时，使用沿椭圆的主轴的对称分裂，产生相同尺寸和形状的两个子细胞。之后随机扰乱子细胞的每个值。从正常分布但是用较大的变量对扰乱再次取样(初始值的10%)以适应新细胞形状上大的变化性。最后，两个子细胞的重叠指标被随机选择而保持它们相对于剩余细胞的共同的重叠。

图像模拟

将对照输入应用至每个粒子之后，粒子表示必须被转化至可与真实图像相比较的模拟的图像中。精确的图像模拟可能是困难的任务并且常常需要使用射线追踪技术和光学模型。本发明的方法关注在图像中容易鉴定的模拟特征而不是试图模拟实际图像。特别地，对细胞膜的图像进行模拟。

有必须考虑的两个实体观察。首先，尽管显微镜通过胚胎聚焦在单相上，但是视场的深度非常大并且从几乎全胚胎收集失焦光线。并且其次，胚胎被部分透明，其意指胚胎底部的细胞的膜有时(但不总是)可通过胚胎顶部的细胞被看到。

考虑到这些实体观察，现在所描述的是图像模拟模型。对于每个细胞，使用重叠指数h将相应的椭圆形形状投影到模拟的图像上。相应的像素值被设定为1的二元值并且扩大以产生可与所观察到图像数据相比的膜厚度。重叠指数h指定细胞位于相互的顶部的次序。由于闭合的细胞膜仅有时可见，如果检测闭合的点，那么它们被放置在具有低概率(通常大约10%)的模拟的图像中。实际上，当这些闭合的膜点对于精确的形状建模来说是必须的时，重要的是使得它们足够稀疏以致它们不会类似于可见边缘。

图像预加工

现在将描述测量变量z。本发明的方法的目的是从显微镜图像提取细胞膜的二进制图像用于与模拟的图像比较。这些膜表现出高曲率和高对比，但是使用密度或颜色基础的阈值化技术并不容易提取。因此，使用了主曲率为基础的检测器。这一方法使用Hessian算符：

$H(s,\mathrm{\&sigma;})=\left(\begin{array}{cc}{I}_{\mathrm{xx}}(s,\mathrm{\&sigma;})& I_{\mathrm{xy}}(s,\mathrm{\&sigma;})\\ I_{\mathrm{xy}}(s,\mathrm{\&sigma;})& I_{\mathrm{yy}}(s,\mathrm{\&sigma;})\end{array}\right),$

其中，Ixx、Ixy和Iyy，是在像素位点s和高斯尺度σ估算的二级偏导数。2x2高斯矩阵的特征值提供关于主曲率的的信息，而特征值的符号将“谷”与“脊”43区分开来。为了检测明亮的峰或脊，每个轴的主曲率被计算为

P(s)=|min(λ₂,0)|，

其中，λ2是最小特征值。为了检测不同厚度的膜，使用了覆盖一定范围的尺度(即σ_min<=σ<=σ_max)的Hessian算符并且提取了整个这一范围的最大曲率。最终，Hessian图像被阈值化以产生所提取的细胞膜的二值图像。阈值水平通常被设置为两倍于Hessian中的轴像素值的标准方差。

粒子权重

如题为“粒子滤波器框架”的部分中所描述的，粒子滤波器的第二个主要步骤是测量更新，其中相应于给定粒子模型的现有测量的概率指定粒子的重要性权重。在我们的实例中，重要性权重是通过将上文讨论的预加工的显微镜图像与同样是上文讨论的模拟图像相比较来确定的。

之前已经研究过这一问题，其中粒子滤波器权重通过使用正常交互信息将模拟的图像与实际图像相比较来计算。这一方式与占据网格匹配的想法相似，其寻找都被占据(值1)或都是空的(值0)的像素位点。这些方法在所述模仿的和实际的图像在形状上相似但是稍微不重合时有麻烦。反而，正在描述的方法是用以倒角距离为基础的可能性函数，其测量从一个点集到另一个的最近距离的平均值。定义两个点集A(尺寸m的真实数目的集合中)和B(尺寸n的真实数目的集合中)，分别相应于模拟图像和实际图像中的非零像素。从点集A至B的向前的倒角距离给定为：

$d(A,B)=\frac{1}{m}\underset{a_i\&Element;A}{\mathrm{\&Sigma;}}\underset{b_j\&Element;B}{\min }\left|\right|a_i-b_j\left|\right|.$

相似地定义向后的倒角距离。本发明的方法使用对称的倒角距离，其提供对模拟图像与真实图像匹配得多好以及真实图像与模拟图像匹配得多好的量度：

d_sym(A,B)=d(A,B)+d(B,A).

实际上，单个的距离测量被缩短以减少噪音的影响。为了减少计算时间，距离通过寻找图像的距离转化中的像素位点来确定。

倒角距离被用作给定模拟模型的我们的数据测量的可能性测量。也就是说，在时间t，对于给定的图像测量zt和粒子模型xt[m]，粒子重要性权重被给定为：

$w_t^{\left[m\right]}\&Proportional;\exp [-\mathrm{\&lambda;}\&CenterDot;d_{\mathrm{sym}}(z_t,x_t^{\left[m\right]})].$

常数λ通常设置为1并且可变化以控制可能性分布的平面性。

粒子重新采样和动态分布

粒子滤波器中第三个主要步骤是重新采样，其中将粒子与它们的权重成比例地选择以产生新的粒子的集合。具有低概率的粒子被排除，而具有高概率的粒子被加倍。已经有开发用于重新采样的有效算法的大量前期工作。本方法使用低变量方法。

粒子滤波器中的一个重要问题是粒子数目的选择。最简单的选择是使用固定值，称作M=1000。之后对于每个时间步骤，M粒子的集合被转化至相同大小的另一个集合中。在本申请的上下文中，在细胞是无活性的或仅轻微改变的大小和位置期间可能有相对长的一段时间。利用这一观察的优点以通过根据细胞活性的量动态分配粒子的数目来减少处理负荷。也就是说，当细胞是活性的并且分裂的时，我们增加粒子的数目而当粒子是无活性的时，我们减少粒子的数目。

为了测量细胞活性的程度，计算新图像(通过显微镜获得)和之前的图像之间的像素密度的平方差的和(SSD)。为了减少噪音，首先用高斯滤波器将图像平滑并且随时间用因果移动平均值将SSD的值平滑。之后将粒子的数目与这一值成比例地动态调节并且缩短以停留在界线100<M<1000中。图30是显示粒子的数目可如何被分配用于从1细胞至4细胞期的胚胎分裂的图表。应当注意到的是这一方法仅提供图像中“活性”的量的测量，但是没有区分细胞分裂和胚胎运动(转移和/或旋转)，因为没有进行之前的图像配准。在这一情况(确定粒子的数目)下，这是可接受的，因为粒子的数目在任一个事件中都应当增加。实际上，在最可能的胚胎模型中我们同样以细胞的数目为基础调整了粒子的数目。也就是说，当更多的细胞据信存在于图像中时，产生更多的粒子。

二维追踪的局限性

上文描述的2D细胞追踪算法被用于确定胚胎中细胞的数目以及它们的2D形状。然而，其被没有潜在的实体表示的事实所局限。这对于自动追踪细胞分裂以便测定胚胎成活力来说可能是或可能不是重要的。例如，某些参数例如胞质分裂的持续时间和细胞分裂之间的时间可使用2D细胞追踪算法来测量。在下一个部分中，我们将我们的2D模型扩展为3D。为了处理从2D图像模拟3D形状所产生的闭合和深度不确定性，使用了对细胞体积浓度的几何约束和约束条件。

细胞表示和三维追踪

这一部分描述了用于细胞分裂的3D追踪的算法。来自2D算法的步骤中的许多延续至这一算法中，具有几个关键的例外。有用于3D用途的新的细胞表示。细胞现在被表示为3D空间中的椭圆体，通过下列公式给出：

$\frac{{(x-x_0)}^2}{a^2}+\frac{{(y-y_0)}^2}{b^2}+\frac{{(z-z_0)}^2}{c^2}=1..$

每个椭圆体同样具有朝向方向θ、螺距ψ和滚转α。因此，时间t的每个细胞模型的表示被给定为：

$\begin{array}{c}{x}_t^{\left[m\right]}=\\ \left[\begin{array}{ccccccccc}{x}_{0_1}& y_{0_1}& z_{0_1}& a_1& b_1& c_1& {\mathrm{\&theta;}}_1& \mathrm{\&psi;}1& {\mathrm{\&alpha;}}_1\\ x_{0_2}& y_{0_2}& z_{0_2}& a_2& b_2& c_2& {\mathrm{\&theta;}}_2& \mathrm{\&psi;}2& {\mathrm{\&alpha;}}_2\\ \&CenterDot;& \&CenterDot;& \&CenterDot;& \&CenterDot;& \&CenterDot;& \&CenterDot;& \&CenterDot;& \&CenterDot;& \&CenterDot;\\ \&CenterDot;& \&CenterDot;& \&CenterDot;& \&CenterDot;& \&CenterDot;& \&CenterDot;& \&CenterDot;& \&CenterDot;& \&CenterDot;\\ \&CenterDot;& \&CenterDot;& \&CenterDot;& \&CenterDot;& \&CenterDot;& \&CenterDot;& \&CenterDot;& \&CenterDot;& \&CenterDot;\\ x_{0_N}& y_{0_N}& z_{0_N}& a_N& b_N& c_N& {\mathrm{\&theta;}}_N& {\mathrm{\&psi;}}_N& {\mathrm{\&alpha;}}_N\end{array}\right]\end{array}$

这一修订的模型的一个重要影响是可能有与从2D图像推断的3D形状有关的不确定性。例如，形状上是球体的细胞将具有与具有较长主轴和较长螺距旋转的细胞相似的外观。这不是主要的重要的事，因为如将在下文所显示的，粒子分布将保持这些多个假设直到可获得足够的信息以产生区别(例如从事件诸如细胞分裂)。

椭圆体被认为是严密的；也就是说，变形不能被清楚地建模。然而，我们允许相邻椭圆体之间的少量的重叠并且在这些重叠的区中，我们假设细胞对彼此是平面化的。这是重要原因，因为其通常在胚胎中观察到并且我们在下列部分中解释它。

细胞扰乱和分裂

我们的3D细胞分裂和扰乱模型与部分4“细胞扰乱和分裂”中的模型相似，具有少数例外。3D形状的模拟可被用于迫使体积守恒。这防止细胞生长得任意大，尤其是在z方向。体积守恒被用于两种情况。第一，用于细胞扰乱，单轴a和b是变化的并且计算c以便单个细胞的体积被保持。第二，用于细胞分裂，使用下列约束条件：

$\frac{4}{3}\mathrm{\&pi;}{a}_p{b}_p{c}_p=\frac{4}{3}\mathrm{\&pi;}(a_{d_1}{b}_{d_1}{c}_{d_1}+a_{d_2}{b}_{d_2}{c}_{d_2}),$

其中下标p指示母细胞而下标d1和d2指示两个子细胞。事实上，我们通过使得胚胎总体积在原始体积的正/负5%之间波动而允许轻微违反这些约束条件。这被用于补偿原始体积模拟中的可能的不准确性。

当3D中细胞被选择分裂时，其分裂以下列方式被建模。首先，对于所选择的单个细胞，使用沿椭圆形的长轴的分裂，其可以是a、b或c，取决于构型。考虑到母细胞的旋转，子细胞被初始化以在尺寸和空间的均匀部分上相等。之后再次使用具有设定为初始值的10%的变量的正常分布将它们的参数扰乱以覆盖大范围的可能的构型。

几何约束

闭合和深度不确定性的问题通过体积的守恒而部分缓和。然而，同样需要关于相邻的椭圆体的空间关系的约束条件。第一个约束条件是细胞不得在直径上重叠超过20%。对于重叠可接受的量的细胞，做了它们对彼此平面化的假设。所描述的粒子模型通过在图像模拟期间忽略相交椭圆体内部的点表示这一现象。这是经验激发的并且与实体观察行为良好相关。

强加了保持细胞非常近似的第二约束条件。这一约束条件直接与人类胚胎的实体行为有关，其中细胞被称为透明带的膜约束。所述带被建模为球壳并且使用其强加边界条件。所述带的半径被设定为比1细胞胚胎的半径大30%。

如下文实施这些约束条件。如上文所描述的，对于给定时间的每个粒子，随机对照输入被用于产生新的粒子。如果实体约束条件中的任一个被违反，新的粒子被排除并且使用新的随机对照。如果在一定数目的尝试之后没有产生满意的新的粒子，那么粒子被排除。

图像模拟

实施例中所用的暗视野照明的优点是细胞膜比细胞内部散射更多光。这一影响在细胞膜与光轴(z-轴)平行的位点最显著。因此，为了模拟图像，在我们的3D模型中搜寻这些位点，因为它们的旋转其不是必然定位于在椭圆体的赤道。考虑到可见并且闭合的边缘，如上文讨论的，之后遵循了相似的规则。

2D中的细胞追踪实施例

这一实施例与自动细胞显微术有关并且使用上文描述的用于细胞分裂的2D追踪的算法。设计这一模型以追踪图像中细胞的数目以及细胞膜的2D轮廓。第一步是图像获取，其激发随后的部分例如图像模拟和图像预加工。用具有10X物镜的定制的Olympus IX-50倒置显微镜获取用于这一实施例的延时图像序列。显微镜被调整用于暗视野照明，其中中空的光锥通过在光源和聚光透镜之间放置圆孔而聚焦在样品上。物镜收集通过样品散射的光并且直接反射透射光，在暗背景上产生明亮的图像。暗视野照明的优点是细胞膜往往比细胞内部散射更多的光，由此增加它们的对比。用加热台和定制的孵育箱装备显微镜以允许在多达5或6天的时间段中培养胚胎。通过架设在IX-50侧面的Olympus SLR数码相机图像以5分钟的间隔捕获图像。

胚胎的成像在它们是合子或者具有粗略球形形状的合子时开始。为了将粒子的集合初始化，如第6部分“图像预加工”中描述的计算阈值化的Hessian并且使用最小二乘法拟合圆。之后使用从均匀分布取样的随机趋向将所有粒子初始化为圆。

图31显示用于追踪从1细胞至4细胞期的细胞分裂的2D算法的结果。结果显示细胞膜通过所述算法成功提取，甚至是对于朝向底部的部分闭合的细胞。应当注意到的是在大多数粒子滤波器应用中，“单个”最佳模型常常被表示为来自粒子分布的状态参数的加权的和。然而，对于本文中的结果，展示了具有最高概率的粒子。

3D中的细胞追踪实施例

图32显示上文描述的用于追踪从1细胞至4细胞期的3D算法的两个成功的应用。图33是显示粒子在1细胞至2细胞分裂期间如何分布的实施例(相应于图32中显示的第一个实施例)的图表。这一张图显示每个细胞中心的3D位置。当细胞开始分裂，预测显示出关于哪个子细胞将位于另一个顶部的不确定性，但是这在一对构架中被解决。

提取预测参数

一旦使用之前描述的方法将胚胎建模，就可从模型提取某些参数。通常，使用最好或最大可能性的模型。这些参数包括例如第一次胞质分裂的持续时间、第一次和第二次细胞分裂之间的时间以及第二次和第三次细胞分裂之间的时间。通过测量细胞的模型在其分裂为两个细胞之前伸长多长时间来大致估算胞质分裂的持续时间。伸长可通过关注椭圆形的主轴和短轴的比例来测量。可从模型提取的其他参数包括受精和第一次细胞分裂之间的时间、细胞的形状和对称性以及分裂过程、分裂的角度、碎裂等等。可使用2D细胞追踪算法或3D细胞追踪算法提取参数。

通过胞质分裂沟首次出现至子细胞完成分离来定义胞质分裂。由于我们的胚胎模型是由不变形的椭圆形组成的，鉴定胞质分裂沟的出现是具有挑战性的任务。一种方法将允许椭圆形变形，但是这导致更复杂的追踪问题。另一种方法将是寻找预加工的显微镜图像中曲率的变化；然而，这破坏了努力直接从胚胎模型测量我们的预测参数的目的。因此，我们通过将第一次胞质分裂的持续时间大致估计为1细胞至2细胞分裂之前的细胞伸长的持续时间来将问题简化。伸长通过计算椭圆形的主轴与短轴的比例来定量。如果：

则细胞被认为是伸长的。

15%这一值是经验选择的并且对于这一特定的数据集合来说运行良好；然而可使用其他值。一旦胚胎模型分裂为2细胞，我们可通过计算1细胞模型的伸长的持续时间来提取第一次胞质分裂的大致估计的持续时间。

原则上，测量有丝分裂事件之间的时间是简单的。例如，第一次和第二次有丝分裂之间的时间被测量为2细胞模型和3细胞模型之间的时间。然而，在某些实例中，胚胎可表现出不寻常和随机的行为。这包括例如从1细胞进行到2细胞，从2细胞进行到明显的3细胞或4细胞以及之后回到2细胞的胚胎。所描述的算法能够追踪这一类型的行为，但是它对确定有丝分裂事件之间的时间间隔提出了挑战。

处理这一行为的一种方式如下：代替测量2细胞和3细胞模型之间的时间(为了寻找第一次和第二次有丝分裂之间的时间)，这可通过简单地计算图像构架(其中2细胞模型是最可能的)的数目来大致估计。这在某些实例中运行良好但是不总是代表有丝分裂事件之间的真实时间。可通过在以细胞的数目为基础的模型上强加限制来处理这些事件。也就是说，当从每次迭代的分布选择最好或最可能的模型时，可需要模型中的细胞的数目总是保持相同或增加，但是从不下降。强加这一约束条件后，计算有丝分裂事件之间的时间是简单的。这一约束条件也用于将可能显示少量抖动的追踪结果过滤，例如其可在模型在1细胞和2细胞模型之间来回切换时偶尔发生。

用于追踪预测参数的方法

图35显示概括了上文描述的方法的流程图。流程图显示可如何分析单个胚胎(尽管这可被用于多个胚胎或其他类型的细胞和干细胞)。在第一步中，用时间间隔显微镜获取胚胎的图像(“测量”)。这一图像可被保存至文件并且在后面的时间点重新打开。图像通常被预加工以增强某些特征，尽管这不是必须的。预测可能的胚胎构型的模型并且从这些模型模拟图像(“预测”)。所模拟的图像可包括如上文描述的细胞膜的图像或者更精确地代表预加工之前的显微镜图像的图像。之后将模型与预加工的显微镜图像相比较(“比较”)。使用这一比较，保留最好的预测，同时排除不良预测。之后所得到的预测的集合被用于改善对下一个图像的预测。对多个连续图像进行这一过程之后，直接从最好的一个或多个模型测量形态学参数是可能的，例如胞质分裂的持续时间和有丝分裂事件之间的时间。如之前所讨论的，这些参数可被用于评估胚胎的成活力。

实施例6

细胞活性的自动分析

上文描述的方法需要经由显微镜追踪细胞发育的能力。对于胚胎，所期望的是追踪在同一个皿中一起培养的多个胚胎。本文所用的分析方法同样需要周期获取的图像(例如对于胚胎每1-30分钟一次，持续1-5天；不同的时间间隔可被用于其他类型的细胞例如干细胞)。因此设计成像方法以自动追踪胚胎发育。

在时间间隔显微镜中，细胞在控制的条件下生长并且在延长的一段时间内被成像以监测进程例如活动力(在环境中的运动)、增殖(生长和分裂)和形态学上的变化(大小和形状)。归因于实验的长度和所产生的巨大量的图像数据，提取参数例如细胞分裂的持续时间和之间的时间可能是冗长的任务。这对于其中多个样品被同时成像的高通量的应用来说尤其真实。因此，有对能够自动提取所期望的信息的图像分析软件的需要。

评估胚胎成活力的一种方式是测量图像中“细胞活性”的量。这可简单地通过获取连续成对的图像并且比较它们的像素值来完成。更特别地，为了测量每个新图像的细胞活性的量，计算新图像(标记为I)和之前的图像(标记为I’)之间的像素密度的差值平方和(SSD)，整个所有重叠的像素i：

$\mathrm{SSD}=\underset{i}{\mathrm{\&Sigma;}}{[I^{\&prime;}(x_i^{\&prime;},y_i^{\&prime;})-I(x_i,y_i)]}^2=\underset{i}{\mathrm{\&Sigma;}}{e}_i^2..$

为了减少噪音，图像可首先用高斯滤波器来平滑。图28显示单个胚胎第1天至第3天的细胞活性的曲线图。如所显示的，有相应于人类胚胎中1细胞至2细胞分裂、2细胞至4细胞分裂和4细胞质8细胞分裂的尖锐的峰。峰的宽度代表细胞分裂的持续时间。

该方法的局限性之一是SSD度量仅测量图像中的活性的量并且事件例如胚胎运动(诸如移位或旋转)看上去可与细胞分裂非常相似。对于这一问题的一种解决方法是在计算SSD之前进行图像配准。图像配准是寻找两个图像之间的几何关系以便将它们在相同的坐标系中校准的过程并且可使用多种不同的技术完成。例如，可使用Levenberg-Marquardt迭代非线性程序的一种变型，其通过将重叠的像素密度的SSD最小化将图像配准。LM算法使用3x3单应性矩阵转化像素位点：

$\left[\begin{array}{c}{\tilde{x}}^{\&prime;}\\ {\tilde{y}}^{\&prime;}\\ {\tilde{w}}^{\&prime;}\end{array}\right]=\left[\begin{array}{ccc}{h}_0& h_1& h_2\\ h_3& h_4& h_5\\ h_6& h_7& 1\end{array}\right]\left[\begin{array}{c}x\\ y\\ 1\end{array}\right],,$

其中目的像素位点x’和y’被标准化为：

$x^{\&prime;}=\frac{{\tilde{x}}^{\&prime;}}{w^{\&prime;}},y^{\&prime;}={\frac{\tilde{y}}{w^{\&prime;}}}^{\&prime;}..$

因此

$x^{\&prime;}=\frac{h_{0}x+h_{1}y+h_2}{h_{6}x+h_{7}y+h_8},$

$y^{\&prime;}=\frac{h_{3}x+h_{4}y+h_5}{h_{6}x+h_{7}y+h_8}.$

单应性矩阵可被用于多种图像转化并且这一应用中的合理的选择将是刚体(欧几里德)转化。这将转移和平面旋转(沿照相机轴)中的胚胎的图像校准。然而，稍微一般化并且使用仿射变换是可能的，其允许图像相位差。该一般化取决于努力测量的信号而可能是或可能不是预期的。因此运动公式是：

x′=h₀x+h₁y+h₂

y′=h₃x+h₄y+h₅.

LM算法首先使用链式法则计算e对于未知运动参数h_k的偏导数：

$\frac{\mathrm{\&delta;e}}{{\mathrm{\&delta;h}}_k}=\frac{{\mathrm{\&delta;I}}^{\&prime;}}{{\mathrm{\&delta;x}}^{\&prime;}}\frac{{\mathrm{\&delta;x}}^{\&prime;}}{{\mathrm{\&delta;h}}_k}+\frac{{\mathrm{\&delta;I}}^{\&prime;}}{{\mathrm{\&delta;y}}^{\&prime;}}\frac{{\mathrm{\&delta;y}}^{\&prime;}}{{\mathrm{\&delta;h}}_k}.$

对于仿射运动参数，这些偏导数是：

$\frac{\mathrm{\&delta;e}}{{\mathrm{\&delta;h}}_0}=x\frac{{\mathrm{\&delta;I}}^{\&prime;}}{{\mathrm{\&delta;x}}^{\&prime;}},$

$\frac{\mathrm{\&delta;e}}{{\mathrm{\&delta;h}}_1}=y\frac{{\mathrm{\&delta;I}}^{\&prime;}}{{\mathrm{\&delta;x}}^{\&prime;}},$

$\frac{\mathrm{\&delta;e}}{{\mathrm{\&delta;h}}_2}=\frac{{\mathrm{\&delta;I}}^{\&prime;}}{{\mathrm{\&delta;x}}^{\&prime;}},$

$\frac{\mathrm{\&delta;e}}{{\mathrm{\&delta;h}}_3}=x\frac{{\mathrm{\&delta;I}}^{\&prime;}}{{\mathrm{\&delta;y}}^{\&prime;}},$

$\frac{\mathrm{\&delta;e}}{{\mathrm{\&delta;h}}_4}=y\frac{{\mathrm{\&delta;I}}^{\&prime;}}{{\mathrm{\&delta;y}}^{\&prime;}},$

$\frac{\mathrm{\&delta;e}}{{\mathrm{\&delta;h}}_5}=\frac{{\mathrm{\&delta;I}}^{\&prime;}}{{\mathrm{\&delta;y}}^{\&prime;}}.$

随后，使用这些偏导数，LM算法通过加上来自每个像素的贡献来计算近似的 Hessian矩阵A(在大小6x6的真实数目的集合中)和加权的梯度矢量b(在大小6x1的真实数目的集合中)：

$a_{\mathrm{kl}}=\underset{i}{\mathrm{\&Sigma;}}\frac{{\mathrm{\&delta;e}}_i}{{\mathrm{\&delta;h}}_k}\frac{{\mathrm{\&delta;e}}_i}{{\mathrm{\&delta;h}}_l},$

$b_k=-\underset{i}{\mathrm{\&Sigma;}}\frac{{\mathrm{\&delta;e}}_i}{{\mathrm{\&delta;h}}_k}.$

最后，通过加入增加的运动更新运动参数：

ΔH=(A+λI)^-1b，

其中常量λ调节运动更新的步长并且I是单位矩阵。

在算法的每次迭代中，根据所更新的运动评估将第一图像扭曲并且通过计算重叠区域中的像素密度的SSD与第二图像比较。本应用假设连续图像之间的胚胎运动是非常小的并且因此仅进行小的固定量的迭代。图28B显示没有(28A)和有(28B)对每对图像进行图像配准的细胞活性的曲线图。由于Levenberg-Marquardt程序的方差公式是SSD，简单地将每次校准的残差绘图。图29比较了正常和不正常胚胎发育的细胞活性的曲线图。在第3天，在胚胎学家通常评估形态学的点，胚胎看起来相似并且可能地都被认为是有活力的。然而，它们的细胞活性曲线图却大大不同，因为胚胎中的一个胚胎经历典型的一系列细胞分裂而其他胚胎从1细胞胚胎分裂为多细胞并且碎裂。如所期望的，具有正常活性曲线图的胚胎最终在第5.5天前达到胚泡。

在计算像素密度中的SSD之前可使用其他类型图像配准。这包括例如交互相关、标准化交互相关、交互相位相关、交互信息、特征检测和追踪、尺度不变特征变换(SIFT)、光流法和梯度下降。在配准之前，图像预加工例如特征或对比增强可以是或者可以不是所预期的。

用于评估胚胎成活力的模型

图13显示以相关的成像和分子分析为基础的人类胚胎发育的模型。所显示的是从合子发育至胚泡的时间线，包括用于预测成功发育至胚泡的关键的短暂时间和胚胎发育的图表。如图解的，主要分子数据表明人类胚胎用遗传自母亲的不同集合的卵母细胞RNA开始生活。这一RNA的集合在卵中通过特异的RNA管理程序被保持并且正确地包装。受精之后，对卵特异性的亚集合母系RNA(ESSP1：胚胎期特异性模式1)的降解必须随卵母细胞向胚胎的转换开始而降解。同时，其他RNA随发育继续被理想地平均分配给每个卵裂球(ESSP4)。RNA的成功降解和分配随细胞自主方式的胚胎基因组活化(EGA)和ESSP2基因的转录而结束。值得注意的是，在卵裂分裂期间，胚胎卵裂球可独立地停滞或进行。胚胎中细胞自主发育的结果是单个的卵裂球可停滞或前进并且随着8细胞胚胎前进至桑椹胚期，胚泡质量将受到停滞或前进超过8细胞的细胞数目的影响。成像数据证实有预测成功或失败的发育的关键时期：第一次胞质分裂、第二次卵裂分裂以及第二次和第三次卵裂分裂的同步性。这些参数可使用之前描述的细胞追踪算法和软件自动测量。所描述的系统和方法可被用于用关键成像预测因子诊断胚胎结果并且可允许转移发育中较早(EGA之前)的较少的胚胎。自动与手动图像分析的比较。

图34显示14个胚胎的集合的自动图像分析与手动图像分析的比较。胚胎1至10(如曲线图上所标记的)达到胚泡期，具有不同的形态学。胚胎11至14停滞并且没有达到胚泡期。图34A显示测量第一次胞质分裂的持续时间的比较，而图34B显示测量第一次和第二次有丝分裂之间的时间的比较。如所示的，两个方法通常显示出良好的一致性。第一次胞质分裂的持续时间的少量的偏差是预期的，因为如之前所讨论的，它们可归因于我们的自动分析通过测量延长而产生近似值。在几个实例中，胞质分裂的持续时间以及第一次和第二次有丝分裂之间的时间两者的自动和手动分析之间有较大的不一致。这出现在几个不正常的胚胎上并且由手动难以表征而且难以自动追踪的异常行为所导致。对于这一组胚胎和仅使用头两个标准(第一次胞质分裂的持续时间和第一次和第二次有丝分裂之间的时间)，自动算法具有零假阳性。这在假阳性必须被避免的IVF程序中将是非常重要的。手动图像分析具有一个假阴性(胚胎9)而自动算法具有两个假阴性(胚胎9和10)。然而，尽管胚胎9和10技术上达到胚胎期，但是它们与其他的胚泡相比显示不良形态学并且将是转移的较不佳的候选者。对于手动图像分析，胚胎14将是以这两个标准为基础的假阳性并且需要第二次和第三次有丝分裂之间的持续时间的第三参数以给出真正的阴性。然而，自动算法仅使用头两个标准就做出了正确的预测。这些结果表明我们的自动算法可成功地预测胚泡与非胚泡以及不同质量的胚泡之间的区别。因此，对于多个胚胎被确定具有有利发育潜力的情况，IVF程序期间计算它们相对质量的等级以便选择最好的1或2个胚胎用于转移是可能的。

前述的仅仅是说明本发明的原则。应当理解的是，本领域技术人员能够设计各种方案，其虽然没有在本文明确地描述或显示，但实现了本发明的原理并被包括在本发明的精神和范围之内。此外，在本文叙述的所有实施例和条件性语言原则上旨在帮助读者理解本发明的原理和发明人为改进现有技术所贡献的概念而不被视为限制到这些特别叙述的实施例和条件。此外，本文叙述本发明的原理、方面和实施方案以及其特定的实施例的所有陈述预期涵盖其结构和功能等同物。另外，预期这些等同物包括当前已知的等同物和将来开发的等同物，即，不考虑结构而实现相同的功能所开发的任何元件。因而，本发明的范围并非预期限制于在本文显示和描述的示例性实施方案。而是，本发明的范围和精神由所附的权利要求书体现。

实施例7

确定胚胎发育潜力的成像分析

方法

通过2步快速解冻方案使用Quinn’s Advantage解冻试剂盒(Cooper Surgical,Trumbull,CT)解冻在合子或2原核(2PN)阶段冷冻的人类胚胎。简言之，将冷冻管(cryostraw)或瓶从液氮移出，且暴露于空气，然后在37℃水浴中孵育。一旦解冻，将胚胎转移至0.5-mol/L蔗糖溶液10分钟，之后转移至0.2-mol/L蔗糖溶液持续另外的10分钟。然后将胚胎在具有Hepes(Cooper Surgical)+5%血清蛋白替代物(SPS；CooperSurgical)的Quinn’s Advantage培养基中洗涤，且各自转移至60μl微滴的在矿物油(Sigma,St.Louis,MO)下补充了10%SPS的Quinn’s Advantage卵裂培养基(CooperSurgical)，在37℃和6%CO2、5%O2和89%N2培养。将胚胎在定制苯乙烯培养皿中培养，该培养皿专门用来帮助在成像期间追踪胚胎身份以及随后操作。该培养皿设计与用于IVF的商业培养皿类似，除了位于中心的25个单独的微孔的阵列。每个微孔为250微米宽和100微米深并且容纳单个发育中胚胎。每孔的底部具有扁平和光学品质光洁度，使胚胎清楚成像。为了维持组培养，所有微孔分享共同的培养基滴头，其由挤压环稳定。小基准标记(字母和数字)位于微孔附近以帮助鉴定。在使用前测试该培养皿对人类胚胎的毒性通过标准小鼠胚胎测定(MEA)程序。

收集延时图像用于随后的细胞形态学分析，包括下列细胞参数中的至少一个的测量：第一次胞质分裂的持续时间，第一次和第二次细胞分裂之间的时间间隔以及第二次和第三次细胞分裂之间的时间间隔。图中显示的图像是每5分钟以0.6秒的曝光时间获取的，至多2天(约30小时)直到大多数胚胎达到4细胞期。如下文更加详细描述的，第一次胞质分裂通过常在受精后一天发生并且持续约14分钟。第一次和第二次细胞分裂通常间隔平均约11小时。第二次和第三次细胞分裂通常间隔平均约1小时。因此，成像是在受精后持续约30小时(加或减几小时)的一段时间。

在成像后，将胚胎转移至Acidified Tyrode's Solution(Millipore)以移除透明带(ZP)且将不含ZP的胚胎在具有Hepes(CooperSurgical)+10%Human Albumin(CooperSurgical)的Quinn’s Advantage不含钙镁培养基中解聚。一旦解聚，将每个胚胎卵裂球在10μl滴的非粘性洗涤缓冲液中洗涤三次，且转移至无菌PCR管。在显微镜下确认单个卵裂球在每个管中的存在。根据制造商说明(BlueGnome)使用SurePlex Kit完成DNA提取和预扩增。简言之，在75℃用细胞提取酶(Cell Extraction Enzyme)从每个样品提取DNA10min，其在95℃下灭活4min。使DNA变性，且用PicoPlex Pre-Amp Enzyme通过95℃热启动2min和12周期的梯度PCR(95℃15秒，15℃50秒，25℃40秒，35℃30秒，65℃40秒，和75℃40秒)进行预扩增，然后使DNA再变性，且用PicoPlex Amplification Enzyme通过在95℃2min和14周期(95℃15秒，65℃1min和75℃1min)进行扩增。在全基因组扩增后，每个样品用Cy3或Cy5进行荧光标记，并与BlueGnome CytoChip杂交，其为大于5000个复制克隆的被设计以检测亚微观的拷贝数变化的BAC阵列，且覆盖约30%的人基因组(www.cytochip.com)。分析扫描图像，且使用先前描述的CytoChip算法和BlueFuse软件(BlueGnome)(Gutiérrez-Mateo等人，(2011)FertilSteril95:953-958)定量并报告染色体拷贝数比率。

结果

一个2天的时间段中通过延时成像证实了培养中健康人类植入前胚胎的发育时间线。观察到正常人类合子在第2天早期经历第一次卵裂分裂。随后，在第4天紧密结合为桑椹胎之前，胚胎分别在第2天和第3天分裂为4细胞和8细胞胚胎。

为了研究我们细胞周期参数与非整倍性之间的关系，我们培养了作为合子解冻的胚胎2天直到大部分胚胎达到4细胞阶段且通过延时成像监控胚胎发育。在成像后，使胚胎分解且通过阵列比较性基因组杂交(A-CHG)分析单独卵裂球的染色体组成，A-CHG是一种检测通过在所有24个染色体中以高分辨率基因组重排诸如缺失、复制、反转和易位而引起的拷贝数变化(CNV)的基于微阵列的技术。

我们追踪75个正常受精的胚胎的发育并且证实培养至第2天的样品中正常和停滞的胚胎的分布。为了鉴定预测胚胎成功发育至胚泡期的定量成像参数，我们提取并分析了来自延时录像的几个参数，包括第一个细胞周期的长度、头几次有丝分裂之间的时间间隔和第一次有丝分裂的持续时间。在发育正常和不正常的胚胎的录像图像分析期间，我们观察到在许多停滞的胚胎在第一次细胞分裂期间经历异常的胞质分裂。正常的胚胎在从卵裂沟的出现至子细胞的完全分离的14.4+/-4.2分钟的狭窄的时间窗口中以平稳且受控的方式完成胞质分裂。

对我们的图像结果的详细分析表明在胚胎基因活化(EGA)开始之前，在早期分裂期间的胞质分裂和有丝分裂中正常胚胎遵循严格的时间，表明胚胎的发育潜力是由所遗传的母系程序预先决定的。特别地，我们注意到在早期胚胎的细胞周期中被严格调控的三个时态区间或者参数：(1)第一次胞质分裂的持续期间，(2)第一次和第二次有丝分裂之间的时间间隔和(3)第二次和第三次有丝分裂的同步性。对于正常胚胎，我们测量这些参数分别为大约14.4+/-4.2分钟、11.8+/-0.71小时和0.96+/-0.84小时(本文给定为平均正/负标准偏差)。

一旦三个成像参数在一起作图，在Wong/Loewke等人(Wong/Loewke等人，(2010)Nat.Biotechnol25:1115-1121)；图36A、B、C)中观察到绝大多数的正常染色体组型在与非停滞或非延迟的胚胎类似的区域中聚集在一起的胚胎。相比之下，通过CGH确定为非整倍体的胚胎表现出在正常胚胎时间窗之外的参数值，因此，集中于作图表时远离整倍体胚胎聚集的其它区域中。而且，基于CGH分析的结果，我们也能够区分每个受影响的胚胎中非整倍性的类型。具有差别染色体组成的非整倍体胚胎被视为有丝分裂错误，而具有相同卵裂球的非整倍体胚胎被指定为减数分裂错误，只要是第一细胞分裂应该产生具有类似染色体组成的卵裂球。这通过单独的参数分析确认，因为具有有丝分裂错误的胚胎在第二和第三参数方面偏离正常胚胎更多以及所有三个参数在具有减数分裂错误的胚胎中均受影响(表3，图40)。尽管25个具有有丝分裂错误的胚胎中的11个集中于与具有具有正常CGH谱的胚胎类似的区域，但是具有减数分裂错误的胚胎表现出更多的零星的参数聚集(图36A、B和C)。

有趣的是，我们也鉴定了几个看似为三倍体的胚胎，基于先前的观察：3PN胚胎在单个有丝分裂事件中表现出从单细胞分裂成三个子细胞的不同形态学特征(Wong/Loewke等人，(2010)Nat.Biotechnol25:1115-1121)。与具有正常胞质分裂的胚胎(其在1细胞至2细胞分裂之前表现出两个卵裂沟)不同，三倍体胚胎在1细胞至3细胞的转变之前表现出三个卵裂沟。因为CGH仅可检测某些类型的多倍性诸如69XXY(Gutiérrez-Mateo等人，(2011)Fertil Steril95:953-958)以及我们表征为三倍体的胚胎为雌性或XYY，所以我们不能确认这些胚胎为三倍体。相反地，包括荧光原位杂交(FISH)或定量-PCR(Q-PCR)的替代方法可被用于检测多倍性，如前所述(Gutiérrez-Mateo等人，(2011)Fertil Steril95:953-958)。但是，即使通过CGH该胚胎组不能被公认为三倍体，这些胚胎中的几个也被鉴定为非整倍体并且基于我们成像参数分析，将不会是可行的用于转移的候选者(图36A、B和C)。

通过成像分析检测单体性和三体性胚胎

除了能够区分减数分裂和有丝分裂错误之外，我们也已确定，常常由减数分裂错误繁殖的更多的染色体缺陷也可被检测为在早期细胞周期参数中的细微的行为变化。使用我们成像和动态参数分析，我们确定单体性和三体性(其中染色体的一个或三个拷贝分别存在于胚胎的每个卵裂球中)也可从发育期间的正常胚胎辨别。如图37A证实，我们鉴定几个三体性胚胎，其参数值完全在具有正常染色体组型的胚胎的参数值之外。更特别地，我们检测出至少两个具有三体性21(幸存到出生、导致唐氏综合征的常染色体三体性的最常见类型之一；图37B)的胚胎并且确定这些胚胎表现出非典型的细胞周期特征，特别是在第二参数，或第一次和第二次有丝分裂之间的时间方面。类似地，我们也能够鉴定几个单体性胚胎，包括相当多的具有单体性22的胚胎(图37B)，它们易于远离正常胚胎聚集并且证实与三体性21胚胎类似的低第二参数值(图37A)。因为几乎所有染色体单体性为胚胎致命的(唯一的例外是X染色体)，所以单体性胚胎与正常的未受影响的胚胎之间的细胞周期参数的差异可通过每个胚胎的潜在的染色体组成来解释。因此，我们的延时成像分析可准确地检测人类胚胎中的染色体重复(三体性)和缺失(单体性)并且可潜在地避免两种胚胎类型的转移。

低和高镶嵌有丝分裂错误与正常胚胎的聚集

除染色体异常的这些极端情况之外，我们也能够辨别镶嵌性程度的变化，如通过具有由有丝分裂错误引起的不同成像特性的胚胎之间受影响的染色体的数量测量。基于我们对细胞周期参数和染色体组成的综合分析，我们确定四个或更少的染色体存在缺陷的胚胎应被视为低镶嵌，而四个以上染色体受影响的胚胎可被指定为高镶嵌(图38A)。如图38B中所示，12个有丝分裂低镶嵌胚胎中的9个在正常胚胎附近聚集，而由有丝分裂错误引起的高镶嵌胚胎表现出更零星的参数聚集。对染色体组成更详细的分析也揭示，高镶嵌胚胎更有可能表现出非分离，其中染色体对在分裂期间不适当地与各子细胞隔离，这可影响通过延时成像可检测的细胞周期行为。这种发现由先前研究确认，显示具有低镶嵌性程度的胚胎更接近正常且更可能通过胚泡期自我修正，而预测具有高镶嵌性程度的胚胎是异常的且不可能存活(Baart等人(2004)Hum Reprod.19:685-693；Munné等人(2005)Fertil Steril84:1328-1334；Barbash-Hazan等人(2008)Fertil Steril92:890-896；Johnson等人(2010)Hum Reprod25:1066-1075)。因此，我们的成像技术能提供顾及具有整倍体镶嵌性的胚胎分等级并且可有助于决定哪个胚胎转移的信息。

细胞碎裂与非整倍性之间的关联

目前，用作对人类胚胎的发育能力的评估的的最常见的形态学特征是细胞碎裂(一种通常仅在人类胚胎发育中观察到的现象)的程度(Antczak和Van Blerkom,1999Human Reprod.14,429-447；Alikani等人，1999Fertil.Steril.71,836-842；Ebner等人，2001Fertil.Steril.76,281-285)。假定非整倍体胚胎的单独卵裂球表现出染色体损失或增加，其总和不一定增加至每个卵裂球每个染色体的两个拷贝(例如，对于每个染色体，4个卵裂球应具有8个拷贝的总和)，我们推断，缺失染色体可能已以碎片形式从发育中胚胎掐掉。当发育继续进行时，这些碎片仍然作为DNA和细胞质的独立单元或通过相同或邻近的卵裂球再吸收。尽管8个整倍体胚胎中仅有1个观察到碎裂，但是34个非整倍体胚胎中有27个表现出碎裂(图40A)。在7个没有具有碎片的非整倍体胚胎中，至少5个胚胎在具有正常参数时序的胚胎的聚集之外作图并且不可能是用于转移的候选者。有趣的是，3个我们公认为三倍体的胚胎中的2个基于其不寻常的第一胞质分裂也检测出碎裂，表明碎裂也可被用于与1细胞至3卵裂球表型或其它参数结合以帮助鉴定三倍体胚胎(图40A)。

对30个观察到碎裂的胚胎的进一步分析后，我们确定8个具有减数分裂错误的胚胎中的7个表现出碎裂(比较图36B和图40B)，而20个具有有丝分裂错误的胚胎中的14个检测出碎裂(比较图36C和40B)。假定仅有1个具有减数分裂错误的胚胎和6个具有有丝分裂错误的胚胎聚集在与正常胚胎类似的区域中，碎裂分析以及我们的细胞周期参数测量可被用于避免选择和转移此类非整倍体胚胎(图40B)。此外，表现出碎裂的具有有丝分裂错误的胚胎中，9个在整倍体胚胎附近集中的胚胎中的5个和11个在整倍体胚胎附近集中的胚胎中的1个分别具有潜在的低镶嵌和高镶嵌有丝分裂错误(图40C)。这表明在我们的参数分析下包含碎裂也可帮助分级聚集在正常参数时序的区域周围的胚胎。

最后，另外的碎裂标准诸如细胞碎裂的程度和发育时机也可有助于胚胎分等级。如图40D证实，没有具有高碎裂程度(如按细胞质体积计多于25%碎裂测量)的胚胎，和表现出低碎裂程度(如按细胞质体积计少于25%碎裂测量)的胚胎的大约一半蓄积在与正常胚胎类似的区域。而且，在观察到正常参数时序的区域中聚集的所有胚胎中，仅在2细胞阶段开始时检测出碎裂(图40E)。相比之下，在1细胞阶段开始时或在分裂至3个或更多细胞后表现出碎裂的胚胎集中于作图表时聚集的整倍体胚胎之外的其它区域中。这表明在受精(1细胞)后的最早发育阶段发生的碎裂或2细胞阶段后通过随后有丝分裂分裂繁殖的碎裂可具有正常参数时序和胚胎成活力的严重后果。

讨论

我们的分析进一步确认并改进观察结果，即在头三次卵裂分裂期间的有丝分裂和胞质分裂中遵循严格时间的胚胎有高得多的可能发育到胚泡期并且形成具有扩大的内细胞群(ICM)的高质量胚泡。这些结果进一步确认，动态形态学参数可被用于选择用于在IVF或ICSI程序中的转移或冷冻保存的最佳的胚胎。

此外，我们的分析建立我们的延时成像分析可被用于区分错误类型(减数分裂对有丝分裂错误)，用于检测染色体重复(三体性)和缺失(单体性)以及用于分辨人类胚胎中的有丝分裂镶嵌性程度(图39)。假定较大比例的染色体异常母系地在减数分裂期间产生(Fragouli等人，(2006)Cytogenet Genome Res114:30-38；Fragouli等人，(2006)HumReprod21:2319-2328；Frumkin等人，(2008)Mol Cell Endocrinol282:112-119；Johnson等人(2010)Hum Reprod25:1066-1075)，则体外成熟的卵母细胞的发育潜力也可在成熟和随后受精及胚胎发育期间使用该系统来评估。为此，我们的成像技术也可被用于评估其它干细胞类型(包括诱导的多潜能干细胞(iPSC)和人类胚胎干细胞(hESC))的成活力、发育潜力和染色体状态，已报导相当数量所述干细胞携带完全和/或部分染色体畸变(Mayshar等人，(2010)Cell Stem Cell,7:521-531)。总之，这也表明与非整倍性评估和综合碎裂分析(碎裂的存在/不存在、程度和时序)结合的我们的细胞周期参数可有助于确定哪个胚胎在发育上有能力用于转移。

实施例8

细胞碎裂动力学与非整倍性之间的关联

方法

透明带(ZP)通过用Acidified Tyrone’s Solution(Millipore)处理来移除，如上所述，而不含ZP的胚胎在具有0.1%牛血清白蛋白(BSA；Sigma-Aldrich)的磷酸盐缓冲溶液(PBS；Invitrogen,Carlsbad)中洗涤三次，之后于室温(RT)在含4%多聚甲醛的PBS(USB Corp.,Cleveland,OH)中固定20分钟。一旦固定，就在PBS-0.1%BSA中洗涤胚胎三次以除去任何残留的固定剂，且于RT用1μg/ml DAPI和0.5μg/mlMitoTracker Red CMXRos(Invitrogen)免疫染色15分钟。通过连续成像使免疫荧光可视化，其中使用在http://nism.stanford.edu/Equipment/LSM510Meta01v01.html描述的Zeiss LSM510Meta倒置激光扫描共焦显微镜，转换每个框架的通道追踪以避免通道之间的交叉污染。在全胚胎中以1μm间隔捕获共焦部分，且在ImageJ(NIH)中处理共焦部分用于Z-堆栈成像分析。用IMARIS(Bitplane)完成胚胎的三维重构。

通过首先孵育1%柠檬酸三钠低张缓冲液，之后固定于Carnoy’s溶液(3:1比率的甲醇与冰醋酸)，然后装载在聚-L-赖氨酸处理的载玻片(Fisher Scientific,Pittsburgh,PA)，在60℃成熟过夜来执行FISH分析。在37℃加湿室中使用荧光标记的DNA探针(Abbott Molecular,DesPlaines,IL)2天来完成与染色体18和Y染色体的杂交并且通过荧光显微术使正信号可视化。

结果

目前，基于可包括卵裂球数量和不对称和/或细胞碎裂程度的形态学特征，最通常在第3天或第5天评估人类胚胎的发育能力。有趣的是，通常仅在人类胚胎中观察到碎裂。也有证据表明细胞碎裂在人类胚胎体内发生，指示碎裂不是体外培养的结果。当我们分析表现出和不表现出碎裂的胚胎中的细胞周期成像参数时，我们确定对碎裂的动态评估能够区分整倍体胚胎或正常胚胎与聚集在正常参数时序的区域中的非整倍体胚胎(图41A)。对观察到碎裂的胚胎的进一步分析后，我们确定具有潜在的减数分裂和有丝分裂错误、高和低镶嵌性和看似为三倍体的胚胎的数量(图41B)。此外，我们也证实另外的碎裂标准诸如细胞碎裂的程度和发育时机或包含卵裂球不对称与我们的参数分析的结合可能也有助于胚胎评估(图44B)。

碎片内的染色体的包含促成复合非整倍性

当评估每个胚胎的染色体组成时，我们观察到非整倍体胚胎的单独卵裂球常常表现出染色体损失或增加，其总和并不总是增加至每个卵裂球每个染色体的2个拷贝。因此，假定观察到非整倍体胚胎看似与碎裂相关(图41)，则我们探究缺失染色体在发育期间是否已隔离到碎片中。的确，我们确定在大多数不具有正确的给定染色体拷贝总数的胚胎(14个中的11个)观察到碎裂并且三个非碎裂的非整倍体胚胎中仅有一个落在整倍体或正常参数时序窗口范围内(图45A)。我们怀疑三个展示不正确的染色体拷贝数的胚胎中观察到的碎裂的缺失可由下述先前发现所解释：一些碎片可能并不容易通过光显微术(包括延时显微成像)检测，但是可使用替代光学以较高放大倍数来识别。

为了进一步测试碎片是否含有缺失染色体，我们对不含透明带的卵裂阶段人类胚胎进行用核酸染料4’6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)和线粒体DNA染料Mitotracker Red的免疫荧光分析，以通过使用共焦显微术区分核DNA和线粒体DNA。如通过图45B中的单帧共焦成像所示，我们观察到碎片内DNA的区域化，其不与线粒体DNA共区域化。有趣的是，我们观察到与DAPI-阳性碎片相邻的对于DAPI染色阴性的碎片，表明并非所有碎片含有核DNA(图45B)。类似结果由全胚胎的Z-堆栈共焦成像和3维建模获得，其在也可通过DIC光学检测的数个碎片(图45C)中表现出阳性DAPI信号(图45C)。这些发现进一步由人类胚胎发育中最常见的受影响的染色体的FISH得以支持，如图45D中所示的实施例所证实。在这种情况下，我们观察到在通过对具有Y-染色体的4个拷贝的胚胎延时成像而可视的碎片内有染色体18的2个拷贝。因此，与当染色体聚合且然后在细胞分裂期间彼此分离时染色体错误在纺锤体上显示的普通观念相反，我们的分析表明染色体错误的产生可经由携带人类染色体的卵裂球的碎裂发生。

早期人类胚胎中非整倍性起源的模型

尽管碎裂可通常在人类胚胎中发生，我们的延时图像分析表明，当发育继续进行时，碎片可作为染色体DNA和我们称为微核的细胞质的分立单元保存。可选地，这些微核也可通过它们从其产生的同一卵裂球再吸收，与邻近的卵裂球融合(图44A)。如果含有染色体的微核与其所源自的卵裂球融合，则其可在核膜破裂后潜在地恢复胚胎整倍性状态(图44C)并且可解释关于胚胎发育期间偶尔染色体校正的先前发现。然而，等于或更有可能的是具有隔离的染色体的微核与邻近的卵裂球的融合(图44C)，在该研究及其它中导致复杂基因型。

在进一步评价碎裂时序与细胞周期成像参数之间的关联后，我们在碎裂在1细胞阶段或在3-4细胞期的发育后期发生的胚胎中观察到对参数窗口的最显著效应(图44B)。在对胚胎染色体组成的分析后，我们确定具有减数分裂错误的胚胎或通过成像看似为三倍体的胚胎通常表现出1细胞阶段的碎裂。相反，在具有有丝分裂错误的胚胎中1细胞至2细胞的分裂后最通常观察到碎裂。这表明人类胚胎具有感测到潜在的染色体异常的能力并且经受碎裂作为校正胚胎非整倍性(图44C)或可能起始其最终灭亡的过程的方法。对于具有有丝分裂错误的胚胎，我们也在我们早期人类胚胎发育的模型中建议，这些胚胎可能在所有染色体具有适当地对齐有丝分裂纺锤体的可能性之前分裂(图44C)。

讨论

我们已证实，独特高概率的人类胚胎非整倍性可源自经由可通过自动追踪检测的细胞碎裂与减数分裂和有丝分裂纺锤体不同的人类高特异性现象的产物。不仅我们提供用于在称为微核的细胞碎片(其随后可能通过或可能不通过胚胎卵裂球被再吸收)内包含染色体的证据，而且基于碎裂时序和我们图像分析，我们也表明人类胚胎知道其染色体组成且可经受碎裂以便存活。

基于这些结果，我们期望基于胚胎的基本细胞性质对人类胚胎和单独卵裂球的发育的评价可考虑到在转移之前整倍体与非整倍体胚胎之间的差别。这应该改善通过潜在地避免将最有可能导致胚胎致命性和自发流产的胚胎的疏忽转移来IVF结果。

实施例9

在预植入发育期间表观遗传擦除和转座子激活之间的关联

方法

使用BioMark Dynamic Array微流体系统(Fluidigm Corp.,So.SanFrancisco,CA)分析人类胚胎中的基因表达。在具有Hepes+5%SPS的Quinn’s Advantage Medium中洗涤不含ZP的胚胎三次，然后在干冰上具有0.1%牛血清白蛋白(BSA；Sigma-Aldrich)的磷酸盐缓冲溶液(PBS；Invitrogen,Carlsbad)中快速冷冻，用于在-80℃贮存直到使用。根据制造商方案(Fluidigm Corp.)使用CellsDirect One-Step qRT-PCR试剂盒(Invitrogen)和20X TaqMan基因表达测定(Applied Biosystems,Foster City,CA)预扩增各胚胎。与2X Universal Master Mix(AppliedBiosystems)和样品加样缓冲液(Sample Loading Buffer)(Fluidigm Corp.)一起，将2.25ul预扩增的cDNA装载到48.48或96.96Dynamic Array(DA；Fluidigm Corp.)的样品入口。对于每个探针，将20X TaqMan基因表达测定和测定加样缓冲液(Assay Loading Buffer)(FluidigmCorp.)装载到DA上的测定入口。一式三份地测定每个样品并且分析6至10个管家基因的表达作为对照。计算的标准化相对量(CNRQ)值被计算且使用qBasePlus1.3分析软件(http://www.biogazelle.com)对CTNNB1和GAPDGH标准化。

结果

经估计至多45%的人类基因组由称为DNA转座子的移动元件组成，其通过直接的DNA“剪切和粘贴(cut-and-paste)”机理进行调换。转座子通常被启动子CpG甲基化经由表观遗传机理沉默，除了在由哺乳动物发育的桑椹胚期完成的整体脱甲基化的短暂时期。假定转座子在预植入发育期间避免表观遗传沉默并且一旦活动可导致可在减数分裂和有丝分裂期间妨碍染色体配对的基因组重排，可能导致不等交换和非分离，则我们推断卵裂期人类胚胎中观察到的染色体不稳定性的高发病率可能归因于增加的转座子活性。基于最近发现：DNA甲基化、组蛋白修饰、H3赖氨酸4和赖氨酸9甲基化以及RNA干扰(RNAi)与转座子沉默或激活有关，我们评价重新DNA甲基转移酶、DNMT3A和DNMT3B、组蛋白修饰酶、SETD7和SETDB1(其分别介导组蛋白的H3赖氨酸4和赖氨酸9的甲基化)，及RNAi-相关酶DICER在整个人类预植入发育中的表达。当表观遗传擦除完全且观察到高水平的镶嵌性时，除了SETD7(已显示其组蛋白修饰与增加的转座子活性有关)以外，DNMT3A、DNMT3B、SETDB1和DICER的表达在桑椹胚期之前均显著降低，表明在预植入胚胎发育期间表观遗传和RNAi调节的缺失可有助于由作为染色体拷贝数的差异被检测到的转座子引起的基因组重排。(图43)

Claims (102)

1.一种用于确定人类胚胎的发育潜力的方法，其包括测量以下的至少一种：

(a)所述第一胞质分裂的持续时间；

(b)胞质分裂1和胞质分裂2之间的时间间隔；和/或

(c)胞质分裂2和胞质分裂3之间的时间间隔；且

使用所述测量结果以确定所述胚胎的发育潜力，其中所述胚胎的有利发育潜力由以下指示：

(i)为约14.3±6.0min的第一胞质分裂的持续时间；

(ii)为约11.1±2.1小时的胞质分裂1和胞质分裂2之间的时间间隔；和/或

(iii)为约1.0±1.6小时的胞质分裂2和胞质分裂3之间的时间间隔。

2.如权利要求1所述的方法，其包括测量以下的至少两种：

(a)所述第一胞质分裂的持续时间；

(b)胞质分裂1和胞质分裂2之间的时间间隔；和/或

(c)胞质分裂2和胞质分裂3之间的时间间隔。

3.如权利要求1所述的方法，其包括测量以下的所有三种：

(a)所述第一胞质分裂的持续时间；

(b)胞质分裂1和胞质分裂2之间的时间间隔；和

(c)胞质分裂2和胞质分裂3之间的时间间隔。

4.如权利要求1所述的方法，其中所述测量结果是通过时间间隔显微镜测量的。

5.如权利要求1所述的方法，还包括测量细胞周期1的持续时间。

6.如权利要求5所述的方法，其中所述人类胚胎的有利发育潜力由为约20-27小时的细胞周期1的持续时间指示。

7.如权利要求1所述的方法，还包括测量所述人类胚胎中的一个或多个基因的基因表达水平以获得基因表达测量结果。

8.如权利要求7所述的方法，其中所述一个或多个基因选自由下列组成的组：Cofillin、DIAPH1、ECT2、MYLC2/MYL5、DGCR8、Dicer/DICER1、TARBP2、CPEB1、偶对蛋白/SYMPK、YBX2、ZAR1、CTNNB1、DNMT3B、TERT、YY1、IFGR2/IFNGR2、BTF3和NELF。

9.如权利要求7所述的方法，还包括将所述人类胚胎的一个或多个基因的基因表达水平与参考胚胎的一个或多个基因的基因表达水平相比较以提供对所述人类胚胎的发育潜力的确定。

10.如权利要求9所述的方法，其中相对于所述参照胚胎，所述胚胎中一个或多个选自由下列组成的组的基因的较低表达水平指示不良发育潜力：Cofillin、DIAPH1、ECT2、MYLC2/MYL5、DGCR8、Dicer/DICER1、TARBP2、CPEB1、偶对蛋白/SYMPK、YBX2、ZAR1、CTNNB1、DNMT3B、TERT、YY1、IFGR2/IFNGR2、BTF3和NEF。

11.如权利要求1所述的方法，其中所述第一胞质分裂的持续时间大于约30分钟且所述胚胎为非整倍体。

12.如权利要求1所述的方法，其中胞质分裂1和胞质分裂2之间的时间间隔少于约8小时且所述胚胎为非整倍体。

13.如权利要求1所述的方法，其中胞质分裂2和胞质分裂3之间的时间间隔多于约90分钟且所述胚胎为非整倍体。

14.一种向雌性动物提供具有有利发育潜力的人类胚胎的方法，其包括：

(a)在足以进行胚胎发育的条件下培养一个或多个胚胎；

(b)测量所述一个或多个胚胎中的一个或多个细胞参数以获得细胞参数测量结果；

(c)使用所述细胞参数测量结果以提供对所述一个或多个胚胎的发育潜力的确定，其中所述人类胚胎的有利发育潜力由以下指示：

(i)为约14.3±6.0min的第一胞质分裂的持续时间；

(ii)为约11.1±2.1小时的胞质分裂1和胞质分裂2之间的时间间隔；或

(iii)为约1.0±1.6小时的胞质分裂2和胞质分裂3之间的时间间隔；且

(d)将显示有利发育潜力的所述一个或多个胚胎转移至需要其的雌性动物。

15.如权利要求14所述的方法，其包括测量以下的至少一种：

(a)所述第一胞质分裂的持续时间；

(b)胞质分裂1和胞质分裂2之间的时间间隔；和/或

(c)胞质分裂2和胞质分裂3之间的时间间隔。

16.如权利要求14所述的方法，其包括测量以下的至少两种：

(a)所述第一胞质分裂的持续时间；

(b)胞质分裂1和胞质分裂2之间的时间间隔；和/或

(c)胞质分裂2和胞质分裂3之间的时间间隔；

17.如权利要求14所述的方法，其包括测量以下的所有三种：

(a)所述第一胞质分裂的持续时间；

(b)胞质分裂1和胞质分裂2之间的时间间隔；和

(c)胞质分裂2和胞质分裂3之间的时间间隔。

18.如权利要求14所述的方法，其中所述胚胎通过卵母细胞的体外受精来产生。

19.如权利要求18所述的方法，其中所述卵母细胞体外成熟。

20.如权利要求18所述的方法，其中所述卵母细胞体内成熟。

21.如权利要求1所述的方法，其中在测量之前所述人类胚胎被冷冻。

22.如权利要求1所述的方法，其中在测量之前所述人类胚胎未被冷冻。

23.如权利要求1所述的方法，其中所述胚胎通过胞浆内精子注射来制备。

24.一种检测人类胚胎中的非整倍性的方法，其包括：

(a)测量所述人类胚胎的一个或多个细胞参数以获得细胞参数测量结果；

(b)使用所述细胞参数测量结果以确定所述人类胚胎是否为非整倍体。

25.如权利要求24所述的方法，其中所述细胞参数通过时间间隔显微镜来测量。

26.如权利要求24所述的方法，其中所述一个或多个细胞参数选自由以下组成的组：

(a)所述第一胞质分裂的持续时间；

(b)胞质分裂1和胞质分裂2之间的时间间隔；和

(c)胞质分裂2和胞质分裂3之间的时间间隔。

27.如权利要求26所述的方法，其中非整倍性通过超过一个或多个所测量细胞参数的正常范围的细胞测量结果来检测，其中所测量细胞参数的正常范围为：

(a)为约0至约30分钟的所述第一胞质分裂的持续时间；

(b)为约8-15小时的胞质分裂1和胞质分裂2之间的时间间隔；和/或

(c)为约0-5小时的胞质分裂2和胞质分裂3之间的时间间隔。

28.如权利要求26所述的方法，其中检测非整倍性且一个或多个细胞参数包括：

(a)多于约30分钟的所述第一胞质分裂的持续时间；

(b)少于约8小时的胞质分裂1和胞质分裂2之间的时间间隔；和/或

(c)多于约90分钟的胞质分裂2和胞质分裂3之间的时间间隔。

29.如权利要求27所述的方法，其中所测量细胞参数的正常范围为：

(a)为14.4±4.2min的所述第一胞质分裂的持续时间；

(b)为11.8±0.71小时的胞质分裂1和胞质分裂2之间的时间间隔；和

(c)为约0.96±0.84小时的胞质分裂2和胞质分裂3之间的时间间隔。

30.如权利要求24所述的方法，还包括确定非整倍性是否由有丝分裂或减数分裂错误产生。

31.如权利要求30所述的方法，其中有丝分裂错误通过以下来确定：

(a)多于约35分钟的所述第一胞质分裂的持续时间；

(b)少于约7小时的胞质分裂1和胞质分裂2之间的时间间隔；和/或

(c)长于约2小时的胞质分裂2和胞质分裂3之间的时间间隔。

32.如权利要求31所述的方法，其中有丝分裂错误通过以下来确定：

(a)为约36.0±66.9分钟的所述第一胞质分裂的持续时间；

(b)为约6.4±6.6小时的胞质分裂1和胞质分裂2之间的时间间隔；和/或

(c)为约2.0±3.9小时的胞质分裂2和胞质分裂3之间的时间间隔。

33.如权利要求30所述的方法，其中减数分裂错误通过以下来确定：

(a)多于约100分钟的所述第一胞质分裂的持续时间；

(b)少于约4小时的胞质分裂1和胞质分裂2之间的时间间隔；和/或

(c)多于约2小时的胞质分裂2和胞质分裂3之间的时间间隔，

34.如权利要求31所述的方法，其中减数分裂错误通过以下来确定：

(a)为约117.2±166.5分钟的所述第一胞质分裂的持续时间

(b)为约4.0±5.2小时的胞质分裂1和胞质分裂2之间的时间间隔；和/或

(c)为约2.0±4.3小时的胞质分裂2和胞质分裂3之间的时间间隔。

35.如权利要求24所述的方法，其中所述检测的非整倍性为单体性。

36.如权利要求35所述的方法，其中所述单体性是单体性22。

37.如权利要求24所述的方法，其中所述检测的非整倍体是三体性。

38.如权利要求35所述的方法，其中所述三体性是三体性21。

39.如权利要求24所述的方法，其中所述人类胚胎通过卵母细胞的体外受精来产生。

40.如权利要求39所述的方法，其中所述卵母细胞体外成熟。

41.如权利要求39所述的方法，其中所述卵母细胞体内成熟。

42.如权利要求24所述的方法，其中在测量之前所述人类胚胎被冷冻。

43.如权利要求24所述的方法，其中在测量之前所述人类胚胎未被冷冻。

44.如权利要求24所述的方法，其中所述人类胚胎通过胞浆内精子注射来制备。

45.一种用于选择具有正常染色体计数的胚胎的方法，其包括：

(a)测量所述人类胚胎的一个或多个细胞参数以获得细胞参数测量结果；

(b)使用所述细胞参数测量结果以确定所述人类胚胎是否具有正常染色体计数。

46.如权利要求45所述的方法，其中所述细胞参数通过时间间隔显微镜来测量。

47.如权利要求45所述的方法，其中所述一个或多个细胞参数选自由以下组成的组：

(a)所述第一胞质分裂的持续时间；

(b)胞质分裂1和胞质分裂2之间的时间间隔；和

(c)胞质分裂2和胞质分裂3之间的时间间隔。

48.如权利要求47所述的方法，其包括测量以下的至少两种：

(a)所述第一胞质分裂的持续时间；

(b)胞质分裂1和胞质分裂2之间的时间间隔；和/或

(c)胞质分裂2和胞质分裂3之间的时间间隔。

49.如权利要求47所述的方法，其包括测量以下的所有三种：

(a)所述第一胞质分裂的持续时间；

(b)胞质分裂1和胞质分裂2之间的时间间隔；和

(c)胞质分裂2和胞质分裂3之间的时间间隔。

50.如权利要求47所述的方法，其中正常染色体计数由以下的一种或多种指示：

(a)为约0至约30分钟的所述第一胞质分裂的持续时间；

(b)为约8-15小时的胞质分裂1和胞质分裂2之间的时间间隔；和/或

(c)为约0-5小时的胞质分裂2和胞质分裂3之间的时间间隔。

51.如权利要求50所述的方法，其中正常染色体计数由以下的一种或多种指示：

(a)为14.4±4.2min的所述第一胞质分裂的持续时间；

(b)为11.8±0.71小时的胞质分裂1和胞质分裂2之间的时间间隔；和/或

(c)为约0.96±0.84小时的胞质分裂2和胞质分裂3之间的时间间隔。

52.如权利要求45所述的方法，还包括测量细胞周期1的持续时间。

53.如权利要求52所述的方法，其中正常染色体计数由为约20-27小时的细胞周期1的持续时间指示。

54.一种向雌性动物提供具有正常染色体计数的人类胚胎的方法，其包括：

(a)在足以进行胚胎发育的条件下培养一个或多个胚胎；

(b)测量所述一个或多个胚胎中的一个或多个细胞参数以获得细胞参数测量结果；

(c)使用所述细胞参数测量结果以确定所述胚胎是否具有正常染色体计数，其中所述人类胚胎的正常染色体计数由以下指示：

(i)为约14.4±4.2min的所述第一胞质分裂的持续时间；

(ii)为约11.8±0.71小时的胞质分裂1和胞质分裂2之间的时间间隔；和/或

(iii)为约0.96±0.84小时的胞质分裂2和胞质分裂3之间的时间间隔；且

(d)将具有正常染色体计数的所述一个或多个胚胎转移至需要其的雌性动物。

55.如权利要求45所述的方法，其中所述胚胎通过卵母细胞的体外受精来制备。

56.如权利要求55所述的方法，其中所述卵母细胞体外成熟。

57.如权利要求55所述的方法，其中所述卵母细胞体内成熟。

58.如权利要求45所述的方法，其中在测量之前所述人类胚胎被冷冻。

59.如权利要求45所述的方法，其中在测量之前所述人类胚胎未被冷冻。

60.如权利要求45所述的方法，其中所述胚胎通过胞浆内精子注射来制备。

61.一种用于将人类胚胎分级为以下的方法：

(a)具有正常染色体计数；

(b)归因于有丝分裂错误的非整倍体；或

(c)归因于减数分裂错误的非整倍体，所述方法包括

测量所述人类胚胎的一个或多个细胞参数以获得细胞参数测量结果和使用所述细胞测量结果以确定所述人类胚胎是否具有正常染色体计数、是否是归因于有丝分裂错误的非整倍体或归因于减数分裂错误的非整倍体。

62.如权利要求61所述的方法，其中所述细胞参数通过时间间隔显微镜来测量。

63.如权利要求61所述的方法，其中所述一个或多个细胞参数选自由以下组成的组：

(a)所述第一胞质分裂的持续时间；

(b)胞质分裂1和胞质分裂2之间的时间间隔；和

(c)胞质分裂2和胞质分裂3之间的时间间隔。

64.如权利要求63所述的方法，其包括测量以下的至少两种：

(a)所述第一胞质分裂的持续时间；

(b)胞质分裂1和胞质分裂2之间的时间间隔：和/或

(c)胞质分裂2和胞质分裂3之间的时间间隔。

65.如权利要求63所述的方法，其包括测量以下的所有三种：

(a)所述第一胞质分裂的持续时间；

(b)胞质分裂1和胞质分裂2之间的时间间隔：和

(c)胞质分裂2和胞质分裂3之间的时间间隔。

66.如权利要求61所述的方法，还包括测量第一细胞周期的持续时间。

67.如权利要求61所述的方法，其中正常染色体计数由以下的一种或多种指示：

(a)为约0至约30分钟的所述第一胞质分裂的持续时间；

(b)为约8-15小时的胞质分裂1和胞质分裂2之间的时间间隔；和/或

(c)为约0-5小时的胞质分裂2和胞质分裂3之间的时间间隔；

68.如权利要求67所述的方法，其中正常染色体计数由以下的一种或多种指示：

(a)为约14.4±4.2分钟的所述第一胞质分裂的持续时间；

(b)为约11.8±0.71小时的胞质分裂1和胞质分裂2之间的时间间隔；和/或

(c)为约0.96±0.84小时的胞质分裂2和胞质分裂3之间的时间间隔。

69.如权利要求67所述的方法，其中正常染色体计数由以下的两种或更多种指示：

(a)为约14.4±4.2分钟的所述第一胞质分裂的持续时间；

(b)为约11.8±0.71小时的胞质分裂1和胞质分裂2之间的时间间隔；和/或

(c)为约0.96±0.84小时的胞质分裂2和胞质分裂3之间的时间间隔。

70.如权利要求67所述的方法，其中正常染色体计数由以下指示：

(a)为约14.4±4.2分钟的所述第一胞质分裂的持续时间；

(b)为约11.8±0.71小时的胞质分裂1和胞质分裂2之间的时间间隔；和

(c)为约0.96±0.84小时的胞质分裂2和胞质分裂3之间的时间间隔。

71.如权利要求61所述的方法，其中归因于有丝分裂错误的人类非整倍体胚胎由以下的一种或多种指示：

(a)多于约35分钟的所述第一胞质分裂的持续时间；

(b)少于约7小时的胞质分裂1和胞质分裂2之间的时间间隔；和/或

(c)多于约2小时的胞质分裂2和胞质分裂3之间的时间间隔。

72.如权利要求71所述的方法，其中归因于有丝分裂错误的人类非整倍体胚胎由以下的一种或多种指示：

(a)为约36.0±66.9分钟的所述第一胞质分裂的持续时间；

(b)为约6.4±6.6小时的胞质分裂1和胞质分裂2之间的时间间隔；和/或

(c)为约2.0±3.9小时的胞质分裂2和胞质分裂3之间的时间间隔。

73.如权利要求71所述的方法，其中归因于有丝分裂错误的人类非整倍体胚胎由以下的两种或更多种指示：

(a)为约36.0±66.9分钟的所述第一胞质分裂的持续时间；

(b)为约6.4±6.6小时的胞质分裂1和胞质分裂2之间的时间间隔；和/或

(c)为约2.0±3.9小时的胞质分裂2和胞质分裂3之间的时间间隔。

74.如权利要求71所述的方法，其中归因于有丝分裂错误的人类非整倍体胚胎由以下指示：

(a)为约36.0±66.9分钟的所述第一胞质分裂的持续时间；

(b)为约6.4±6.6小时的胞质分裂1和胞质分裂2之间的时间间隔；和

(c)为约2.0±3.9小时的胞质分裂2和胞质分裂3之间的时间间隔。

75.如权利要求61所述的方法，其中归因于减数分裂错误的人类非整倍体胚胎由以下的一种或多种指示：

(a)多于约100分钟的所述第一胞质分裂的持续时间；

(b)少于约4小时的胞质分裂1和胞质分裂2之间的时间间隔；和/或

(c)多于约2小时的胞质分裂2和胞质分裂3之间的时间间隔。

76.如权利要求75所述的方法，其中归因于减数分裂错误的人类非整倍体胚胎由以下的一种或多种指示：

(a)为约117.2±166.5分钟的所述第一胞质分裂的持续时间；

(b)为约4.0±5.2小时的胞质分裂1和胞质分裂2之间的时间间隔；和/或

(c)多于约2小时的胞质分裂2和胞质分裂3之间的时间间隔。

77.如权利要求75所述的方法，其中归因于减数分裂错误的人类非整倍体胚胎由以下的两种或更多种指示：

(a)为约117.2±166.5分钟的所述第一胞质分裂的持续时间；

(b)为约4.0±5.2小时的胞质分裂1和胞质分裂2之间的时间间隔；和/或

(c)多于约2小时的胞质分裂2和胞质分裂3之间的时间间隔。

78.如权利要求75所述的方法，其中归因于减数分裂错误的人类非整倍体胚胎由以下指示：

(a)为约117.2±166.5分钟的所述第一胞质分裂的持续时间；

(b)为约4.0±5.2小时的胞质分裂1和胞质分裂2之间的时间间隔；和

(c)多于约2小时的胞质分裂2和胞质分裂3之间的时间间隔。

79.如权利要求24所述的方法，还包括检测存在或不存在所述胚胎的碎裂和/或其水平。

80.一种用于检测人类胚胎中的非整倍性的方法，其包括：

(a)测量所述人类胚胎的一个或多个细胞参数以获得细胞参数测量结果；

(b)检测存在或不存在所述胚胎的碎裂和/或其水平；和

(c)使用所述细胞参数以确定所述人类胚胎是否为非整倍体。

81.如权利要求80所述的方法，其中所述细胞参数测量结果和碎裂通过时间间隔显微镜来测量。

82.如权利要求80所述的方法，其中所述一个或多个细胞参数选自由以下组成的组：

(a)所述第一胞质分裂的持续时间；

(b)胞质分裂1和胞质分裂2之间的时间间隔；和

(c)胞质分裂2和胞质分裂3之间的时间间隔。

83.如权利要求82所述的方法，其中非整倍性通过超过一个或多个所测量细胞参数的正常范围的细胞测量结果来检测，其中所测量细胞参数的正常范围为：

(a)为约0至约30分钟的所述第一胞质分裂的持续时间；

(b)为约8-15小时的胞质分裂1和胞质分裂2之间的时间间隔；和

(c)为约0-5小时的胞质分裂2和胞质分裂3之间的时间间隔。

84.如权利要求82所述的方法，其中检测非整倍性且一个或多个细胞参数包括：

(a)多于约30分钟的所述第一胞质分裂的持续时间；

(b)少于约8小时的胞质分裂1和胞质分裂2之间的时间间隔；和/或

(c)多于约90分钟的胞质分裂2和胞质分裂3之间的时间间隔。

85.如权利要求83所述的方法，其中所述所测量细胞参数的正常范围为：

(a)为14.4±4.2min的所述第一胞质分裂的持续时间；

(b)为11.8±0.71小时的胞质分裂1和胞质分裂2之间的时间间隔；和

(c)为约0.96±0.84小时的胞质分裂2和胞质分裂3之间的时间间隔。

86.如权利要求24所述的方法，其中所述非整倍性是归因于增加的转座子活性。

87.一种用于检测人类胚胎中的非整倍性的方法，其包括：

(a)测量所述人类胚胎中的转座子活性；

(b)使用所述转座子活性测量结果以确定所述人类胚胎是否为非整倍体。

88.一种用于检测人类胚胎中的非整倍性的方法，其包括：

(a)确定胚胎到达胚泡的潜力和选择具有达到胚泡的潜力的胚胎；

(b)测量具有达到胚泡的潜力的所述胚胎中的碎裂水平；

其中高碎裂水平指示非整倍体。

89.如权利要求88所述的方法，其中高碎裂水平为按体积计超过约25%的碎裂。

90.如权利要求88所述的方法，其中所述碎裂水平通过时间间隔显微镜来确定。

91.如权利要求88所述的方法，其中确定胚胎到达胚泡的潜力通过测量一个或多个细胞参数、测量基因表达水平和/或模式、或分析胚胎形态学来实现。

92.一种用于选择具有正常染色体计数的胚胎的方法，其包括：

a)确定胚胎到达胚泡的潜力和选择具有达到胚泡的潜力的胚胎；

(b)测量具有达到胚泡的潜力的所述胚胎中的碎裂水平；

其中低碎裂水平指示具有正常染色体计数的胚胎。

93.如权利要求92所述的方法，其中低碎裂水平为按体积计少于约25%的碎裂。

94.如权利要求92所述的方法，其中所述碎裂水平通过时间间隔显微镜来确定。

95.如权利要求92所述的方法，其中确定胚胎到达胚泡的潜力通过测量一个或多个细胞参数、测量基因表达水平和/或模式、或分析胚胎形态学来实现。

96.如权利要求1所述的方法，其中在测量以下的至少一种之前在培养皿中培养所述胚胎：

(a)所述第一胞质分裂的持续时间；

(b)胞质分裂1和胞质分裂2之间的时间间隔；和/或

(c)胞质分裂2和胞质分裂3之间的时间间隔。

97.如权利要求96所述的方法，还包括当确定所述胚胎具有有利发育潜力时从所述培养皿除去所述胚胎。

98.如权利要求97所述的方法，其中将在已确定所述胚胎具有有利发育潜力之后从所述培养皿除去的所述胚胎进一步移植到雌性动物受者中。

99.如权利要求14所述的方法，其中在足以进行胚胎发育的条件下在培养皿中进行一个或多个胚胎的所述培养。

100.如权利要求99所述的方法，其中在步骤(d)转移所述胚胎之前将在步骤(c)中经确定具有有利发育潜力的胚胎从所述培养皿除去。

101.如权利要求54所述的方法，其中在足以进行胚胎发育的条件下在培养皿中进行一个或多个胚胎的所述培养。

102.如权利要求101所述的方法，其中在步骤(d)转移所述胚胎之前将在步骤(c)中经确定具有有利发育潜力的胚胎从所述培养皿除去。

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