CN103073479B - 从植物芜青中提取纯化分离制备一种天然吡咯衍生物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及从植物芜青（BrassicarapaL.）中提取、分离纯化制备一种天然吡咯衍生物即4-（甲酰基-5-羟甲基-1氢-吡咯-1-基）丁酸的方法，属于天然产物提取领域。目前国内外天然提取4-（甲酰基-5-羟甲基-1氢-吡咯-1-基）丁酸的方法都存在得率低，方法繁琐复杂，成本较高等不足之处。本发明提供了一种从植物芜青中提取、分离纯化获得纯度高于98%的4-（甲酰基-5-羟甲基-1氢-吡咯-1-基）丁酸的方法。本发明对芜青的深加工，提升其附加值具有意义，提取方法操作简便、产品得率和纯度高、成本较低。
Description
技术领域
本发明涉及从植物芜青（Brassica rapa L.）中提取、分离纯化制备一种天然吡咯衍生物即4-（甲酰基-5-羟甲基-1氢-吡咯-1-基）丁酸的方法，属于天然产物提取领域。
背景技术
芜青（Brassica rapa L.）为十字花科芸苔属植物（《中国植物志》，33卷）。芜青在我国传统医学和民族医学上有着悠久的使用历史。芜青古名葑, 始载于《诗经》，药用始载于《名医别注》。目前我国芜青被广泛栽培，在北方主要被称为“蔓菁”，在东南沿海地区称为“盘菜”，在青藏高原地区称为“圆根”，在新疆称为“恰玛古”，仅在四川凉山州就有超过80万吨的年产量，但目前主要作为蔬菜和饲料，经济附加值不高。
现代药理实验表明，4-（甲酰基-5-羟甲基-1氢-吡咯-1-基）丁酸具有保护肝脏（Young-Won Chin etc，Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters，vol.13（1）,2003,p79-81）和增加外周血流量（Miwa Matsui etc.，Natural Medicines，vol.52(3),1998,p232-235）等生物活性。目前，从天然产物中获得的4-（甲酰基-5-羟甲基-1氢-吡咯-1-基）丁酸仅在枸杞（Lycium chinense Miller）干燥果实（含量约为0.18mg/kg）、拟鸢尾（Iris spuria L.）新鲜根（含量约为2.1mg/kg）和日本乌头（Aconitum japonicum Thunb.）干燥根（含量约为3.1mg/kg）中被报道发现，而此前在十字花植物中未见报道。但是，天然来源的4-（甲酰基-5-羟甲基-1氢-吡咯-1-基）丁酸的方法都存在原材料成本较高，目标成分含量低，提取分离纯化方法繁琐复杂等不足之处。
传统中医将芜青的干燥或新鲜的块根和叶入药，始载于《别录》，列为上品，主治消食下气，解毒消肿，主宿食不化，心腹冷痛，咳嗽，疔疮痈肿。目前，国内外尚无从植物芜青中提取4-（甲酰基-5-羟甲基-1氢-吡咯-1-基）丁酸的研究报道。
本发明首次在芜青中发现了其含有较高含量的4-（甲酰基-5-羟甲基-1氢-吡咯-1-基）丁酸，作为一种大规模种植的高产量植物，相比上述其它天然提取4-（甲酰基-5-羟甲基-1氢-吡咯-1-基）丁酸的原料植物，芜青中提取4-（甲酰基-5-羟甲基-1氢-吡咯-1-基）丁酸具有更好的经济性。
4-（甲酰基-5-羟甲基-1氢-吡咯-1-基）丁酸除自少量植物中提取外，4-（甲酰基-5-羟甲基-1氢-吡咯-1-基）丁酸也可以由单糖和γ-氨基丁酸在高温高压下通过发生美拉德反应生成。此外本发明人所提出个另一项发明专利申请《一种吡咯衍生物的化学合成方法》中也提出了一种新途径有机合成4-（甲酰基-5-羟甲基-1氢-吡咯-1-基）丁酸方法。
需要指出的是，从植物中提取和有机合成4-（甲酰基-5-羟甲基-1氢-吡咯-1-基）丁酸方法属于不同的领域，同有机合成的生物活性物质比较，天然提取的相同产物往往在市场上具有更高的价格，但有着较低的产量。相比有机合成，植物中提取的4-（甲酰基-5-羟甲基-1氢-吡咯-1-基）丁酸提取物和粗制品中具有复杂的糖类、糖苷类化合物和有机酸类化合物组成，且往往存在很多性质与目标化合物相似的物质，所以其分离纯化4-（甲酰基-5-羟甲基-1氢-吡咯-1-基）丁酸工艺途径是完全不同的。
发明内容
本发明目的在于提供从芜青中提取、分离纯化制备获得天然吡咯衍生物（即4-（甲酰基-5-羟甲基-1氢-吡咯-1-基）丁酸）的方法。
1、 4-（甲酰基-5-羟甲基-1氢-吡咯-1-基）丁酸的提取
使用粉碎机将干燥的芜青粉碎，加入PH=2.0~6.8酸化后的溶剂，按10~30倍料液比（m/V）提取1~4次，过滤。合并滤液，用旋转蒸发仪浓缩至浸膏状，得含4-（甲酰基-5-羟甲基-1氢-吡咯-1-基）丁酸成分的提取物浸膏。
在上述的提取方法中，可以采用包括但不限于浸出法、渗滤法、回流法、超声波辅助提取等方法提取，所述提取溶剂也可以是纯水、其它有机溶剂或其含水溶液。调节PH值时可以采用包括但不限于磷酸、盐酸、乙酸、甲酸、磷酸二氢钠等其它有机酸、无机酸或者盐。
2、 4-（甲酰基-5-羟甲基-1氢-吡咯-1-基）丁酸的分离纯化
将上述的提取物浸膏溶于蒸馏水中，等体积加入乙酸乙酯萃取2~20次，合并乙酸乙酯萃取相脱去溶剂分离得粗制品。
将粗制品溶于水中，使用制备高效液相色谱进行分离，以PH=2~7的缓冲水溶液作为流动相A相，有机溶剂甲醇或者乙腈作为流动相B相，将AB两相按一定梯度程序洗脱，检测波长范围200~400nm，根据计算机实时采集的色谱图收集4-（甲酰基-5-羟甲基-1氢-吡咯-1-基）丁酸色谱峰流出片段，脱去溶剂后得精制4-（甲酰基-5-羟甲基-1氢-吡咯-1-基）丁酸（纯度98~99.5%）。
上述梯度程序为0~60min内，将A相：B相按0：100~100:0的比例进行梯度混合。制备高效液相色谱固定相包括但不限于C18、C8填料，流动相B相可采用包括但不限于乙腈、甲醇或者其含水溶液。调节PH配置缓冲水溶液时可以采用包括但不限于磷酸、盐酸、乙酸、甲酸、磷酸二氢钠等其它有机酸、无机酸或者盐。
所述的4-（甲酰基-5-羟甲基-1氢-吡咯-1-基）丁酸，通过高分辨质谱得[M-1]=210.07730，确定其分子式为C10H13NO4, 分子量: 211。
核磁共振数据为1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ9.44(s, 1H), 6.96(d, J = 4.0 Hz, 1H), 6.20 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 4.52 (s, 2H), 4.28 (m, 3H), 2.23 (t, J = 7.5 Hz, 3H), 1.88 (p, J = 7.4 Hz, 3H)。13C NMR (150MHz, DMSO-d6) δ179.80 , 174.29 , 143.85 , 132.03 , 124.44 , 110.13 , 55.19 , 44.64 , 31.16 , 26.77。结合1H-13C HMBC、1H-13CHMQC、1H-1H COSY、1H-1H NOSEY谱图分析确定其化学结构为4-（甲酰基-5-羟甲基-1氢-吡咯-1-基）丁酸。
按上述方法从干燥的芜青材料中提取4-（甲酰基-5-羟甲基-1氢-吡咯-1-基）丁酸得率为303.2~506.4mg/kg，即从干燥的芜青中可获得0.03~0.05%质量分数的4-（甲酰基-5-羟甲基-1氢-吡咯-1-基）丁酸。
附图说明
图1为4-（甲酰基-5-羟甲基-1氢-吡咯-1-基）丁酸HPLC色谱图，纵坐标为mAU（吸光值），横坐标为min(保留时间)
图2为4-（甲酰基-5-羟甲基-1氢-吡咯-1-基）丁酸高分辨质谱图，纵坐标为相对丰度，横坐标为m/z(质荷比)
具体实施方式
下面给出的实施例对本发明作进一步的说明，以下实施例不能理解为对本发明保护范围的限制。
实施例1
1. 取干燥芜青全株500g，粉碎后过60目筛；
2. 加入5000ml用冰乙酸调节PH值为3.2的75%体积分数乙醇水溶液浸泡30min后 ，超声波（180w、25℃、40kHz）超声提取30min，过滤，滤渣加入5000ml75%体积分数乙醇水溶液后超声波（180w、25℃、40kHz）超声提取30min，过滤，弃去滤渣，合并两次提取滤液，用旋转蒸发仪浓缩滤液至粘稠浸膏状，得提取物浸膏；
3. 提取物浸膏用500ml蒸馏水溶解，等体积加入乙酸乙酯萃取4次，合并乙酸乙酯萃取相，减压蒸发脱去乙酸乙酯溶剂，得粗制品2.55g；
4. 将步骤3中所述的粗制品200mg溶于5ml水中，使用制备高效液相色谱进行精制；
色谱柱填料：C18键合硅胶柱（250mm*30mm）
流动相A相为：PH=3的冰乙酸水溶液
流动相B相为：甲醇
梯度程序为：0~5min，A：5%，B：95%
5~35min, A：25%，B：75%
35~40min, A：5%，B：95%
流速:30ml/min
柱温：25℃
检测波长：290nm
5. 根据计算机实时采集的色谱图收集4-（甲酰基-5-羟甲基-1氢-吡咯-1-基）丁酸色谱峰流出片段；
6. 按步骤5中所述方法，重复制备步骤3中所述的粗制品，合并4-（甲酰基-5-羟甲基-1氢-吡咯-1-基）丁酸色谱峰流出片段，减压浓缩脱去溶剂得精制4-（甲酰基-5-羟甲基-1氢-吡咯-1-基）丁酸151.6mg（纯度经HPLC分析为99.5%）。
实施例2
1. 取干燥芜青块根500g，粉碎后过80目筛；
2. 加入15000ml PH=5.0的盐酸水溶液浸泡7天后 ，过滤，弃去滤渣，滤液用旋转蒸发仪浓缩滤液至粘稠浸膏状，得提取物浸膏；
3. 提取物浸膏用1000ml蒸馏水溶解，，等体积加入乙酸乙酯萃取8次，合并乙酸乙酯萃取相，减压蒸发脱去乙酸乙酯溶剂，得粗制品7.1g；
4. 将步骤3中所述的粗制品300mg溶于5ml水中，使用制备高效液相色谱进行精制；
色谱柱填料：C8键合硅胶柱（250mm*30mm）
流动相A相为：PH=6.4的20mmol/L的甲酸铵水溶液
流动相B相为：乙腈
梯度程序为：0~5min，A：2%，B：98%
5~15min, A：15%，B：85%
15~20min, A：2%，B：98%
流速:40ml/min
柱温：30℃
检测波长：280nm
5. 根据计算机实时采集的色谱图收集4-（甲酰基-5-羟甲基-1氢-吡咯-1-基）丁酸色谱峰流出片段；
6. 按步骤5中所述方法，重复制备步骤3中所述的粗制品，合并4-（甲酰基-5-羟甲基-1氢-吡咯-1-基）丁酸色谱峰流出片段减压浓缩脱去溶剂，得纯度经HPLC分析为98 %的精制4-（甲酰基-5-羟甲基-1氢-吡咯-1-基）丁酸253.2mg。
Claims (1)
1.从植物芜青中提取分离纯化制备一种天然吡咯衍生物即4-（甲酰基-5-羟甲基-1氢-吡咯-1-基）丁酸的方法，其特征是采用下述方法之一：
方法（一），其主要步骤如下：
（1）取干燥芜青全株500g，粉碎后过60目筛；
（2）加入5000ml用冰乙酸调节PH值为3.2的75%体积分数乙醇水溶液浸泡30min后 ，超声波在180w、25℃、40kHz条件下超声提取30min，过滤，滤渣加入5000ml75%体积分数乙醇水溶液后超声波在180w、25℃、40kHz条件下超声提取30min，过滤，弃去滤渣，合并两次提取滤液，用旋转蒸发仪浓缩滤液至粘稠浸膏状，得提取物浸膏；
（3）提取物浸膏用500ml蒸馏水溶解，等体积加入乙酸乙酯萃取4次，合并乙酸乙酯萃取相，减压蒸发脱去乙酸乙酯溶剂，得粗制品；
（4）将步骤3中所述的粗制品200mg溶于5ml水中，使用制备高效液相色谱进行精制：
色谱柱填料：C18键合硅胶柱 250mm*30mm
流动相A相为：PH=3的冰乙酸水溶液
流动相B相为：甲醇
梯度程序为：0~5min，A：5%，B：95%
5~35min, A：25%，B：75%
35~40min, A：5%，B：95%
流速:30ml/min
柱温：25℃
检测波长：290nm；
（5）根据计算机实时采集的色谱图收集4-（甲酰基-5-羟甲基-1氢-吡咯-1-基）丁酸色谱峰流出片段；
（6）按步骤5中所述方法，重复制备步骤3中所述的粗制品，合并4-（甲酰基-5-羟甲基-1氢-吡咯-1-基）丁酸色谱峰流出片段，减压浓缩脱去溶剂得精制4-（甲酰基-5-羟甲基-1氢-吡咯-1-基）丁酸；
方法（二），其主要步骤如下：
（1）取干燥芜青块根500g，粉碎后过80目筛；
（2）加入15000ml PH=5.0的盐酸水溶液浸泡7天后 ，过滤，弃去滤渣，滤液用旋转蒸发仪浓缩滤液至粘稠浸膏状，得提取物浸膏；
（3）提取物浸膏用1000ml蒸馏水溶解，等体积加入乙酸乙酯萃取8次，合并乙酸乙酯萃取相，减压蒸发脱去乙酸乙酯溶剂，得粗制品；
（4）将步骤3中所述的粗制品300mg溶于5ml水中，使用制备高效液相色谱进行精制：
色谱柱填料：C8键合硅胶柱250mm*30mm
流动相A相为：PH=6.4的20mmol/L的甲酸铵水溶液
流动相B相为：乙腈
梯度程序为：0~5min，A：2%，B：98%
5~15min, A：15%，B：85%
15~20min, A：2%，B：98%
流速:40ml/min
柱温：30℃
检测波长：280nm；
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