本申请要求2010年4月6日提交的No.61/321,392、2010年5月6日提交的No.61/332,174、2010年5月25日提交的No.61/348,214、2010年5月26日提交的No.61/348,685、2010年6月11日提交的No.61/354,125、2010年6月16日提交的No.61/355,387、2010年7月8日提交的No.61/362,674、2010年11月12日提交的No.61/413,377、2010年4月9日提交的No.61/322,690、2010年5月13日提交的No.61/334,547、2010年8月2日提交的No.61/370,088、2010年10月8日提交的No.61/391,504、2010年10月15日提交的No.61/393,823、2010年11月23日提交的No.61/416,560、2010年4月6日提交的No.61/321,407、2010年6月21日提交的No.61/356,974、2010年9月2日提交的No.61/379,670、2010年9月9日提交的No.61/381,305、2010年9月15日提交的No.61/383,305以及2010年11月9日提交的No.61/411,890的美国临时专利申请的权益。
附图简述
图1(a)-(g)示出了表格,其列出了按细胞/组织的谱系、组比较和特定的疾病状态的示例性癌症,以及对这些癌症、分组细胞/组织比较和特定的疾病状态具有特异性的抗原。此外,所述的抗原可以为生物标志物。所述的一种或多种生物标志物可以为存在或不存在的,表达不足或过表达的,突变的或修饰的(例如外遗传修饰的或翻译后修饰的)。
图2(a)-(f)示出了表格,其列出了按细胞/组织的谱系、组比较和特定的疾病状态的示例性癌症,以及对这些癌症、组细胞/组织比较和特定的疾病状态具有特异性的结合剂。
图3(a)-(b)是列出了示例性乳腺癌生物标志物的表格,其中所述的生物标志物可以来自乳腺癌特异性的囊泡且对其进行分析以产生乳腺癌特异性的囊泡生物印记。此外,所述的一种或多种生物标志物可以为存在或不存在的,表达不足或过表达的,突变的或修饰的(例如外遗传修饰的或翻译后修饰的)。
图4(a)-(b)是列出了示例性卵巢癌生物标志物的表格,其中所述的生物标志物可以来自卵巢癌特异性的囊泡且对其进行分析以产生卵巢癌特异性的生物印记。此外,所述的一种或多种生物标志物可以为存在或不存在的,表达不足或过表达的,突变的或修饰的(例如外遗传修饰的或翻译后修饰的)。
图5是列出了示例性肺癌生物标志物的表格,其中所述的生物标志物可以来自肺癌特异性的囊泡且对其进行分析以产生肺癌特异性的生物印记。此外,所述的一种或多种生物标志物可以为存在或不存在的,表达不足或过表达的,突变的或修饰的(例如外遗传修饰的或翻译后修饰的)。
图6(a)-(d)是列出了示例性结肠癌生物标志物的表格,其中所述的生物标志物可以来自结肠癌特异性的囊泡且对其进行分析以产生了结肠癌特异性的生物印记。此外,所述的一种或多种生物标志物可以为存在或不存在的,表达不足或过表达的,突变的或修饰的(例如外遗传修饰的或翻译后修饰的)。
图7是列出了对腺瘤对增生性息肉具有特异性的示例性生物标志物的表格,其中所述的生物标志物可以来自腺瘤对增生性息肉特异性的囊泡且对其进行分析。此外,所述的一种或多种生物标志物可以为存在或不存在的,表达不足或过表达的,突变的或修饰的(例如外遗传修饰的或翻译后修饰的)。
图8是列出了对于炎性肠病(IBD)对正常具有特异性的示例性生物标志物的表格,其中所述的生物标志物可以来自对炎性肠病相对正常组织具有特异性的囊泡且对其进行分析。此外,所述的一种或多种生物标志物可以为存在或不存在的,表达不足或过表达的,突变的或修饰的(例如外遗传修饰的或翻译后修饰的)。
图9(a)-(b)是列出了对于腺瘤相对结肠直肠癌(CRC)具有特异性的示例性生物标志物的表格,其中所述的生物标志物可以来自对于腺瘤对结肠直肠癌具有特异性的囊泡且对其进行分析。此外,所述的一种或多种生物标志物可以为存在或不存在的,表达不足或过表达的,突变的或修饰的(例如外遗传修饰的或翻译后修饰的)。
图10是列出了对于IBD相对CRC具有特异性的示例性生物标志物的表格,其中所述的生物标志物可以来自对于IBD对CRC具有特异性的囊泡且对其进行分析。此外,所述的一种或多种生物标志物可以为存在或不存在的,表达不足或过表达的,突变的或修饰的(例如外遗传修饰的或翻译后修饰的)。
图11(a)-(c)是列出了对于Dukes CRC B相对Dukes CRC C-D具有特异性的示例性生物标志物的表格,其中所述的生物标志物可以来自对于Dukes CRC B相对Dukes CRC C-D具有特异性的囊泡且对其进行分析。此外,所述的一种或多种生物标志物可以为存在或不存在的,表达不足或过表达的,突变的或修饰的(例如外遗传修饰的或翻译后修饰的)。
图12(a)-(d)是列出了对于低度异型增生的腺瘤对高度异型增生的腺瘤具有特异性的示例性生物标志物的表格,其中所述的生物标志物可以来自对于低度异型增生的腺瘤对高度异型增生的腺瘤具有特异性的囊泡且对其进行分析。此外,所述的一种或多种生物标志物可以为存在或不存在的,表达不足或过表达的,突变的或修饰的(例如外遗传修饰的或翻译后修饰的)。
图13(a)-(b)是列出了对于溃疡性结肠炎(UC)相对克罗恩病(CD)具有特异性的示例性生物标志物的表格,其中所述的生物标志物可以来自对于UC相对CD具有特异性的囊泡且对其进行分析。此外,所述的一种或多种生物标志物可以为存在或不存在的,表达不足或过表达的,突变的或修饰的(例如外遗传修饰的或翻译后修饰的)。
图14是列出了对于增生性息肉相对正常具有特异性的示例性生物标志物的表格,其中所述的生物标志物可以来自对于增生性息肉相对正常具有特异性的囊泡且对其进行分析。此外,所述的一种或多种生物标志物可以为存在或不存在的,表达不足或过表达的,突变的或修饰的(例如外遗传修饰的或翻译后修饰的)。
图15是列出了对于具有低度异型增生的腺瘤相对正常具有特异性的示例性生物标志物的表格,其中所述的生物标志物可以来自对于具有低度异型增生的腺瘤相对正常具有特异性的囊泡且对其进行分析。此外,所述的一种或多种生物标志物可以为存在或不存在的,表达不足或过表达的,突变的或修饰的(例如外遗传修饰的或翻译后修饰的)。
图16是列出了对于腺瘤相对正常具有特异性的示例性生物标志物的表格,其中所述的生物标志物可以来自对于腺瘤相对正常具有特异性的囊泡且对其进行分析。此外,所述的一种或多种生物标志物可以为存在或不存在的,表达不足或过表达的,突变的或修饰的(例如外遗传修饰的或翻译后修饰的)。
图17是列出了对于CRC相对正常具有特异性的示例性生物标志物的表格,其中所述的生物标志物可以来自对于CRC相对正常具有特异性的囊泡且对其进行分析。此外,所述的一种或多种生物标志物可以为存在或不存在的,表达不足或过表达的,突变的或修饰的(例如外遗传修饰的或翻译后修饰的)。
图18是列出了良性前列腺增生特异性的示例性生物标志物的表格,其中所述的生物标志物可以来自良性前列腺增生特异性的囊泡且对其进行分析。此外,所述的一种或多种生物标志物可以为存在或不存在的,表达不足或过表达的,突变的或修饰的(例如外遗传修饰的或翻译后修饰的)。
图19(a)-(c)是列出了示例性前列腺癌生物标志物的表格,其中所述的生物标志物可以来自前列腺癌特异性的囊泡且对其进行分析以产生前列腺癌特异性的生物印记。此外,所述的一种或多种生物标志物可以为存在或不存在的,表达不足或过表达的,突变的或修饰的(例如外遗传修饰的或翻译后修饰的)。
图20(a)-(c)是列出了示例性黑色素瘤生物标志物的表格,其中所述的生物标志物可以来自黑色素瘤特异性的囊泡且对其进行分析以产生黑色素瘤特异性的生物印记。此外,所述的一种或多种生物标志物可以为存在或不存在的,表达不足或过表达的,突变的或修饰的(例如外遗传修饰的或翻译后修饰的)。
图21(a)-(b)是列出了示例性胰腺癌生物标志物的表格,其中所述的生物标志物可以来自胰腺癌特异性的囊泡且对其进行分析以产生胰腺癌特异性的生物印记。此外,所述的一种或多种生物标志物可以为存在或不存在的,表达不足或过表达的,突变的或修饰的(例如外遗传修饰的或翻译后修饰的)。
图22是列出了脑癌特异性的示例性生物标志物的表格,其中所述的生物标志物可以来自脑癌特异性的囊泡且对其进行分析以产生脑癌特异性的生物印记。此外,所述的一种或多种生物标志物可以为存在或不存在的,表达不足或过表达的,突变的或修饰的(例如外遗传修饰的或翻译后修饰的)。
图23(a)-(b)是列出了示例性银屑病生物标志物的表格,其中所述的生物标志物可以来自银屑病特异性的囊泡且对其进行分析以产生银屑病特异性的生物印记。此外,所述的一种或多种生物标志物可以为存在或不存在的,表达不足或过表达的,突变的或修饰的(例如外遗传修饰的或翻译后修饰的)。
图24(a)-(c)是列出了示例性心血管疾病生物标志物的表格,其中所述的生物标志物可以来自心血管疾病特异性的囊泡且对其进行分析以产生心血管疾病特异性的生物印记。此外,所述的一种或多种生物标志物可以为存在或不存在的,表达不足或过表达的,突变的或修饰的(例如外遗传修饰的或翻译后修饰的)。
图25是列出了血液恶性肿瘤特异性的示例性生物标志物的表格,其中所述的生物标志物可以来自血液恶性肿瘤特异性的囊泡且对其进行分析以产生血液恶性肿瘤特异性的生物印记。此外,所述的一种或多种生物标志物可以为存在或不存在的,表达不足或过表达的,突变的或修饰的(例如外遗传修饰的或翻译后修饰的)。
图26(a)-(b)是列出了B细胞慢性淋巴细胞性白血病特异性的示例性生物标志物的表格,其中所述的生物标志物可以来自B细胞慢性淋巴细胞性白血病特异性的囊泡且对其进行分析以产生B细胞慢性淋巴细胞性白血病特异性的生物印记。此外,所述的一种或多种生物标志物可以为存在或不存在的,表达不足或过表达的,突变的或修饰的(例如外遗传修饰的或翻译后修饰的)。
图27是列出了B细胞淋巴瘤及B细胞淋巴瘤-DLBCL特异性的示例性生物标志物的表格,其中所述的生物标志物可以来自B细胞淋巴瘤及B细胞淋巴瘤-DLBCL特异性的囊泡且对其进行分析。此外,所述的一种或多种生物标志物可以为存在或不存在的,表达不足或过表达的,突变的或修饰的(例如外遗传修饰的或翻译后修饰的)。
图28是列出了B细胞淋巴瘤-DLBCL-生发中心样、B细胞淋巴瘤-DLBCL-活化B细胞样和B细胞淋巴瘤DLBCL特异性的示例性生物标志物的表格,其中所述的生物标志物可以来自B细胞淋巴瘤-DLBCL-生发中心样、B细胞淋巴瘤-DLBCL-活化B细胞样和B细胞淋巴瘤-DLBCL特异性的囊泡且对其进行分析。此外,所述的一种或多种生物标志物可以为存在或不存在的,表达不足或过表达的,突变的或修饰的(例如外遗传修饰的或翻译后修饰的)。
图29是列出了示例性伯基特氏淋巴瘤生物标志物的表格,其中所述的生物标志物可以来自伯基特氏淋巴瘤特异性的囊泡且对其进行分析以产生伯基特氏淋巴瘤特异性的生物印记。此外,所述的一种或多种生物标志物可以为存在或不存在的,表达不足或过表达的,突变的或修饰的(例如外遗传修饰的或翻译后修饰的)。
图30(a)-(b)是列出了示例性肝细胞癌生物标志物的表格,其中所述的生物标志物可以来自肝细胞癌特异性的囊泡且对其进行分析以产生肝细胞癌特异性的生物印记。此外,所述的一种或多种生物标志物可以为存在或不存在的,表达不足或过表达的,突变的或修饰的(例如外遗传修饰的或翻译后修饰的)。
图31是列出了示例性宫颈癌生物标志物的表格,其中所述的生物标志物可以来自宫颈癌特异性的囊泡且对其进行分析。此外,所述的一种或多种生物标志物可以为存在或不存在的,表达不足或过表达的,突变的或修饰的(例如外遗传修饰的或翻译后修饰的)。
图32是列出了示例性子宫内膜癌生物标志物的表格,其中所述的生物标志物可以来自子宫内膜癌特异性的囊泡且对其进行分析以产生子宫内膜癌特异性的生物印记。此外,所述的一种或多种生物标志物可以为存在或不存在的,表达不足或过表达的,突变的或修饰的(例如外遗传修饰的或翻译后修饰的)。
图33(a)-(b)是列出了示例性头颈癌生物标志物的表格,其中所述的生物标志物可以来自头颈癌特异性的囊泡且对其进行分析以产生头颈癌的特异性的生物印记。此外,所述的一种或多种生物标志物可以为存在或不存在的,表达不足或过表达的,突变的或修饰的(例如外遗传修饰的或翻译后修饰的)。
图34是列出了示例性炎性肠病(IBD)生物标志物的表格,其中所述的生物标志物可以来自IBD特异性的囊泡且对其进行分析以产生IBD特异性的生物印记。此外,所述的一种或多种生物标志物可以为存在或不存在的,表达不足或过表达的,突变的或修饰的(例如外遗传修饰的或翻译后修饰的)。
图35是列出了示例性糖尿病生物标志物的表格,其中所述的生物标志物可以来自糖尿病特异性的囊泡且对其进行分析以产生糖尿病特异性的生物印记。此外,所述的一种或多种生物标志物可以为存在或不存在的,表达不足或过表达的,突变的或修饰的(例如外遗传修饰的或翻译后修饰的)。
图36是列出了示例性巴雷特食管(Barrett's Esophagus)生物标志物的表格,其中所述的生物标志物可以来自巴雷特食管特异性的囊泡且对其进行分析以产生巴雷特食管特异性的生物印记。此外,所述的一种或多种生物标志物可以为存在或不存在的,表达不足或过表达的,突变的或修饰的(例如外遗传修饰的或翻译后修饰的)。
图37是列出了示例性纤维肌痛生物标志物的表格,其中所述的生物标志物可以来自纤维肌痛特异性的囊泡且对其进行分析。此外,所述的一种或多种生物标志物可以为存在或不存在的,表达不足或过表达的,突变的或修饰的(例如外遗传修饰的或翻译后修饰的)。
图38是列出了示例性中风生物标志物的表格,其中所述的生物标志物可以来自中风特异性的囊泡且对其进行分析以产生中风特异性的生物印记。此外,所述的一种或多种生物标志物可以为存在或不存在的,表达不足或过表达的,突变的或修饰的(例如外遗传修饰的或翻译后修饰的)。
图39是列出了示例性多发性硬化症(MS)生物标志物的表格,其中所述的生物标志物可以来自MS特异性的囊泡且对其进行分析以产生MS特异性的生物印记。此外,所述的一种或多种生物标志物可以为存在或不存在的,表达不足或过表达的,突变的或修饰的(例如外遗传修饰的或翻译后修饰的)。
图40(a)是列出了示例性帕金森氏病生物标志物的表格,其中所述的生物标志物可以来自帕金森氏病特异性的囊泡且对其进行分析以产生帕金森氏病特异性的生物印记。此外,所述的一种或多种生物标志物可以为存在或不存在的,表达不足或过表达的,突变的或修饰的(例如外遗传修饰的或翻译后修饰的)。
图41是列出了示例性风湿病生物标志物的表格,其中所述的生物标志物可以来自风湿病特异性的囊泡且对其进行分析以产生风湿病特异性的生物印记。此外,所述的一种或多种生物标志物可以为存在或不存在的,表达不足或过表达的,突变的或修饰的(例如外遗传修饰的或翻译后修饰的)。
图42(a)-(b)是列出了示例性阿尔茨海默氏病生物标志物的表格,其中所述的生物标志物可以来自阿尔茨海默氏病特异性的囊泡且对其进行分析以产生阿尔茨海默氏病特异性的生物印记。此外,所述的一种或多种生物标志物可以为存在或不存在的,表达不足或过表达的,突变的或修饰的(例如外遗传修饰的或翻译后修饰的)。
图43是列出了示例性朊病毒疾病生物标志物的表格,其中所述的生物标志物可以来自朊病毒疾病特异性的囊泡且对其进行分析以产生朊病毒疾病特异性的生物印记。此外,所述的一种或多种生物标志物可以为存在或不存在的,表达不足或过表达的,突变的或修饰的(例如外遗传修饰的或翻译后修饰的)。
图44是列出了示例性脓毒症生物标志物的表格,其中所述的生物标志物可以来自脓毒症特异性的囊泡且对其进行分析以产生脓毒症特异性的生物印记。此外,所述的一种或多种生物标志物可以为存在或不存在的,表达不足或过表达的,突变的或修饰的(例如外遗传修饰的或翻译后修饰的)。
图45是列出了示例性慢性神经病理性疼痛生物标志物的表格,其中所述的生物标志物可以来自慢性神经病理性疼痛特异性的囊泡且对其进行分析。此外,所述的一种或多种生物标志物可以为存在或不存在的,表达不足或过表达的,突变的或修饰的(例如外遗传修饰的或翻译后修饰的)。
图46是列出了示例性周围神经病理性疼痛生物标志物的表格,其中所述的生物标志物可以来自周围神经病理性疼痛特异性的囊泡且对其进行分析。此外,所述的一种或多种生物标志物可以为存在或不存在的,表达不足或过表达的,突变的或修饰的(例如外遗传修饰的或翻译后修饰的)。
图47是列出了示例性精神分裂症生物标志物的表格,其中所述的生物标志物可以来自精神分裂症特异性的囊泡且对其进行分析以产生精神分裂症特异性的生物印记。此外,所述的一种或多种生物标志物可以为存在或不存在的,表达不足或过表达的,突变的或修饰的(例如外遗传修饰的或翻译后修饰的)。
图48是列出了示例性双相型障碍或疾病生物标志物的表格,其中所述的生物标志物可以来自双相型障碍特异性的囊泡且对其进行分析以产生双相型障碍特异性的生物印记。此外,所述的一种或多种生物标志物可以为存在或不存在的,表达不足或过表达的,突变的或修饰的(例如外遗传修饰的或翻译后修饰的)。
图49是列出了示例性抑郁症生物标志物的表格,其中所述的生物标志物可以来自抑郁症特异性的囊泡且对其进行分析以产生抑郁症特异性的生物印记。此外,所述的一种或多种生物标志物可以为存在或不存在的,表达不足或过表达的,突变的或修饰的(例如外遗传修饰的或翻译后修饰的)。
图50是列出了示例性胃肠道间质瘤(GIST)生物标志物的表格,其中所述的生物标志物可以来自GIST特异性的囊泡且对其进行分析以产生GIST特异性的生物印记。此外,所述的一种或多种生物标志物可以为存在或不存在的,表达不足或过表达的,突变的或修饰的(例如外遗传修饰的或翻译后修饰的)。
图51(a)-(b)是列出了示例性肾细胞癌(RCC)生物标志物的表格,其中所述的生物标志物可以来自RCC特异性的囊泡且对其进行分析以产生RCC特异性的生物印记。此外,所述的一种或多种生物标志物可以为存在或不存在的,表达不足或过表达的,突变的或修饰的(例如外遗传修饰的或翻译后修饰的)。
图52是列出了示例性肝硬化生物标志物的表格,其中所述的生物标志物可以来自肝硬化特异性的囊泡且对其进行分析以产生肝硬化特异性的生物印记。此外,所述的一种或多种生物标志物可以为存在或不存在的,表达不足或过表达的,突变的或修饰的(例如外遗传修饰的或翻译后修饰的)。
图53是列出了示例性食管癌生物标志物的表格,其中所述的生物标志物可以来自食管癌特异性的囊泡且对其进行分析以产生食管癌特异性的生物印记。此外,所述的一种或多种生物标志物可以为存在或不存在的,表达不足或过表达的,突变的或修饰的(例如外遗传修饰的或翻译后修饰的)。
图54是列出了示例性胃癌生物标志物的表格,其中所述的生物标志物可以来自胃癌特异性的囊泡且对其进行分析以产生胃癌特异性的生物印记。此外,所述的一种或多种生物标志物可以为存在或不存在的,表达不足或过表达的,突变的或修饰的(例如外遗传修饰的或翻译后修饰的)。
图55是列出了示例性孤独症生物标志物的表格,其中所述的生物标志物可以来自孤独症特异性的囊泡且对其进行分析以产生孤独症特异性的生物印记。此外,所述的一种或多种生物标志物可以为存在或不存在的,表达不足或过表达的,突变的或修饰的(例如外遗传修饰的或翻译后修饰的)。
图56是列出了示例性器官排斥反应生物标志物的表格,其中所述的生物标志物可以来自器官排斥反应特异性的囊泡且对其进行分析以产生器官排斥反应特异性的生物印记。此外,所述的一种或多种生物标志物可以为存在或不存在的,表达不足或过表达的,突变的或修饰的(例如外遗传修饰的或翻译后修饰的)。
图57是列出了示例性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌生物标志物的表格,其中所述的生物标志物可以来自耐甲氧西林金黄色葡萄球菌特异性的囊泡且对其进行分析以产生耐甲氧西林金黄色葡萄球菌特异性的生物印记。此外,所述的一种或多种生物标志物可以为存在或不存在的,表达不足或过表达的,突变的或修饰的(例如外遗传修饰的或翻译后修饰的)。
图58是列出了示例性易损斑块生物标志物的表格,其中所述的生物标志物可以来自易损斑块特异性的囊泡且对其进行分析以产生易损斑块特异性的生物印记。此外,所述的一种或多种生物标志物可以为存在或不存在的,表达不足或过表达的,突变的或修饰的(例如外遗传修饰的或翻译后修饰的)。
图59(a)-(h)是列出了示例性基因融合的表格,其中所述的基因融合可以来自囊泡或由囊泡进行分析。所述的基因融合可以为生物标志物,并且可以为存在或不存在的,表达不足或过表达的,或修饰的(例如外遗传修饰的或翻译后修饰的)。
图60(a)-(b)为基因及其相关miRNA的表格,其中所述的基因(例如该基因的mRNA)、其相关miRNA或者它们的任意组合可以用作可由囊泡分析得到的一种或多种生物标志物。此外,所述的一种或多种生物标志物可以为存在或不存在的,表达不足或过表达的,突变的或修饰的。
图61A描述了鉴定包含核酸的生物印记以表征表型的方法。图61B描述了鉴定囊泡或囊泡群体的生物印记以表征表型的方法。
图62详细说明了对囊泡上的蛋白质进行筛选所获得的结果,所述蛋白质可用作为所述囊泡的生物标志物。针对所述蛋白质的抗体可用作为结合剂。经鉴定为囊泡的生物标志物的蛋白质的实例包括Bcl-XL、ERCC1、角蛋白15、CD81/TAPA-1、CD9、上皮特异性抗原(ESA)和肥大细胞糜蛋白酶。所述生物标志物在囊泡中或囊泡上可以是存在或不存在的,表达不足或过表达的,突变的或修饰的,并且可用于表征状况。
图63详细描述了通过评估囊泡生物印记而表征表型的方法。图63A为涂敷有捕获抗体的平面基底的简图,所述的捕获抗体捕获表达所述蛋白质的囊泡。所述捕获抗体是针对囊泡蛋白质(其对源自病变细胞的囊泡(“疾病囊泡”)具有或不具有特异性)的。所述检测抗体与捕获的囊泡结合并提供荧光信号。所述检测抗体可检测通常与囊泡相关的抗原,或检测与细胞源或疾病(如癌症)相关的抗原。图63B为涂敷有捕获抗体的珠的简图,所述捕获抗体捕获表达所述蛋白质的囊泡。所述的捕获抗体是针对囊泡蛋白质(其对于源自病变细胞的囊泡(“疾病囊泡”)具有或不具有特异性)的。所述检测抗体与捕获的囊泡结合并提供荧光信号。所述检测抗体可检测通常与囊泡相关的抗原,或检测与细胞源或疾病(如癌症)相关的抗原。图63C为筛选方案的实例,其可以通过使用如图63B中所示的珠以多重方式实施。图63D示出了捕获或检测囊泡以表征表型的说明性示意图。图63E示出了用于评估囊泡有效负载以表征表型的示意图。
图64为蛋白质表达模式的示意图。通常,不同的蛋白质并非平均或均一地分布于囊泡的壳上。囊泡特异性的蛋白质通常更为常见,而癌症特异性的蛋白质是较少见的。使用更常见的较低癌症特异性的蛋白质可以更容易地完成囊泡的捕获,而癌症特异性的蛋白质可以用于检测阶段中。
图65详细说明了可以在本发明的一些示例性实施方案中使用的计算机系统。
图66A-B描绘了EpCam偶联的珠的扫描电子显微照片(SEM),其中所述的珠已经与VcaP囊泡一起孵育。
图67详细说明了使用检测来自受试者的囊泡的基于珠的方法描述结果的方法。图67A是对于单个患者,使用在图63B中所描述的筛选方案的珠数量和信号强度的图,其中~100个捕获珠用于每个患者的各捕获/检测结合分析。对于给定的患者而言,输出结果显示了相对信号强度的所检测的珠的数量。在给定强度下捕获的珠的数量为囊泡以怎样的频率在所述强度下表达检测蛋白质的指示。对于给定的珠而言,信号的强度越强,则检测蛋白质的表达越多。图67B为通过将正常的患者组合到一条曲线中而将癌症患者组合到另一条曲线中,并使用生物统计分析区分所述曲线而得到的归一化的图。对由各个个体得到的数据归一化以考虑由检测仪器所读取的珠的数量的差异,将这些数据加和,然后再次归一化考虑各群体中不同的样品数量。
图68详细说明了图示了前列腺癌的生物印记。图68(A)为由使用微球平台的多重试验而收集的强度值的柱状图,其中珠被CD63抗体功能化,与由患者血浆纯化的囊泡孵育,然后用藻红蛋白(PE)偶联的EpCam抗体标记。较深的阴影的柱(蓝)表示12名正常受试者的群体,而较浅的阴影的柱(绿)得自7名3期前列腺癌患者。图68(B)是根据图67所述对图68(A)中所示出的各柱状图进行归一化的图。对于前列腺癌患者样品和正常样品两者,分布为对来自图68(A)的微球结果的强度值的高斯拟合。图68(C)为图68(B)中示出的前列腺癌生物印记之一的实例,即CD63对CD63生物印记(上方的图),其中CD63用作检测剂及捕获抗体。下方的3个图示出了在3种前列腺癌细胞系(VCaP、Lncap和22RV1)上的流式细胞分析的结果。水平线上方的点表示捕获了具有CD63的囊泡(包含B7H3)的珠。垂直线右侧的珠表示捕获了具有CD63的囊泡(具有PSMA)的珠。在线上方和线右侧的这些珠具有所有的3种抗原。CD63是与囊泡相关的表面蛋白质,PSMA是与前列腺细胞相关的表面蛋白质,而B7H3是与侵袭性癌症(具体而言为前列腺癌、卵巢癌和非小细胞肺癌)相关的表面蛋白质。所有这3种抗原结合在一起鉴定出来自癌症前列腺细胞的囊泡。大部分表达CD63的前列腺癌囊泡还具有前列腺特异性膜抗原PSMA和B7H3(参与调节肿瘤细胞迁移和入侵,并且为侵袭性癌症及临床结果的指示)。图68(D)为前列腺癌囊泡的形态。上方的图示出了使用CD63、CD9和CD81以多种组合进行捕获和标记的结果。几乎所有的点都位于右上象限,表明这3种标志物是高度偶合的。下一列描述了使用B7H3捕获并使用CD63和PSMA标记细胞系囊泡的结果。VCaP和22RV1都表明,使用B7H3捕获的大多数囊泡还具有CD63,并且存在两种群体,即,具有PSMA的群体和不具有PSMA的群体。由于LNcap不具有大量的包含B7H3的囊泡(不存在大量具有CD63的点),B7H3的存在可以是癌症侵袭性程度的指示。LnCap为早期前列腺癌类似细胞系。
图69说明了结肠癌的生物印记。(A)描述了由使用了微球平台的各种多重试验而收集的强度值的柱状图,其中使用捕获抗体对珠功能化,将其与从患者血浆纯化的囊泡一起孵育,然后用检测抗体标记。较深的阴影柱(蓝)表示来自正常的群体,而较浅的阴影柱(绿)来自结肠癌患者。(B)示出了(A)中所示各柱状图的归一化图。(C)描述了由多重试验收集的强度值的柱状图,其中被CD66抗体(捕获抗体)功能化的珠与由患者血浆纯化的囊泡一起孵育,然后用与PE偶联的EpCam抗体(检测抗体)标记。红色的群体来自6名正常的受试者,而绿色群体来自21名结肠癌患者。将由各个体得到的数据归一化以考虑所检测的珠数目的差异,将这些数据加在一起,然后再次归一化以考虑各群体中不同的样品数目。
图70显示多重检测剂可以增大信号。(A)当囊泡标记有多种与前列腺特异性PE偶联的抗体时,中位强度值被绘制为来自VCaP细胞系的纯化浓度的函数。各图的右侧列出了以EpCam(左侧的图)或PCSA(右侧的图)捕获的囊泡以及通过检测抗体所检测的多种蛋白质。在这两种情况下,CD9与CD63的组合均得到了超出背景的最佳信号增加(底部图描绘增加百分率)。CD9与CD63的组合得到超出背景的大约200%的百分增加。(B)进一步显示前列腺癌/前列腺囊泡特异性标志物的复用改善了前列腺癌细胞源的囊泡的检测。当使用多种前列腺特异性PE偶联的抗体进行标记时,中位强度值被绘制为来自VCaP细胞系的纯化浓度的函数。描绘了以PCSA(左侧的图)和EpCam(右侧的图)捕获的囊泡。在这两种情况下,B7H3与PSMA的组合均得到了超出背景的最佳信号增加。
图71说明了使用CD63检测剂和CD63捕获按阶段对于结肠癌的结肠癌生物印记。强度柱状图得自使用CD63涂敷的珠捕获的并使用CD63偶联PE标记的囊泡。在对照组中有6位患者(A),I期中有4位患者(B),II期中有5位患者(C),III期中有8位患者(D),和IV期中有4位患者(E)。由各个个体得到的数据经归一化以考虑所检测的珠数量的变化,将这些数据加在一起,然后再次归一化以考虑各群体中的不同样品数(F)。
图72说明了使用EpCam检测剂和CD9捕获对于按阶段的结肠癌的结肠癌生物印记。强度柱状图得自使用CD9涂敷的珠捕获的并使用EPCam标记的囊泡。其中,在对照组(A)、I期(B)、II期(C)、III期(D)和VI期(E)中都有患者。由各个个体得到的数据以归一化以考虑所检测的珠数量的变化,将这些数据加在一起,然后再次归一化以考虑各群体中的不同样品数(F)。
图73说明了(A)使用针对所列蛋白质的抗体(列出作为检测和捕获抗体)检测前列腺癌的灵敏度、特异性以及置信度水平。CD63、CD9和CD81为一般标志物,并且EpCam为癌症标志物。单个结果描绘于(B)中,对于EpCam对CD63而言,以99%的置信度,100%(n=8)的癌症患者样品不同于广义正态分布,并且以99%的置信度,77%(n=10)的正常患者样品不同于广义正态分布;(C)对于CD81对CD63而言,以99%的置信度,90%(n=5)的癌症患者样品不同于广义正态分布,以99%的置信度,77%(n=10)的正常患者样品不同于广义正态分布;(D)对于CD63对CD63而言,以99%的置信度,60%(n=5)的癌症患者样品不同于广义正态分布,以99%的置信度,80%(n=10)的正常患者样品不同于广义正态分布;(E)对于CD9对CD63而言,以99%的置信度,90%(n=5)的癌症患者样品不同于广义正态分布,以99%的置信度,77%(n=10)的正常患者样品不同于广义正态分布。
图74说明了(A)使用针对所列蛋白质的抗体(列出作为检测和捕获抗体)检测结肠癌的灵敏度和置信度水平。CD63和CD9为一般标志物,EpCam为癌症标志物,并且CD66为结肠标志物。单个结果描绘于(B)中,对于EpCam对CD63而言,以99%的置信度,95%(n=20)的癌症患者样品不同于广义正态分布,以99%的置信度,100%(n=6)正常患者样品不同于广义正态分布;(C)对于EpCam对CD9而言,以99%的置信度,90%(n=20)的癌症患者样品不同于广义正态分布,以99%的置信度,77%(n=6)正常患者样品不同于广义正态分布;(D)对于CD63对CD63而言,以99%的置信度,60%(n=20)的癌症患者样品不同于广义正态分布,以99%的置信度,80%(n=6)的正常患者样品不同于广义正态分布;(E)对于CD9对CD63而言,以99%的置信度,90%(n=20)的癌症患者样品不同于广义正态分布,以99%的置信度,77%(n=6)的正常患者样品不同于广义正态分布;(F)对于CD66对CD9而言,以99%的置信度,90%(n=20)的癌症患者样品不同于广义正态分布,以99%的置信度,77%(n=6)的正常患者样品不同于广义正态分布。
图75说明了通过评估TMPRSS2-ERG表达使用EpCam对来自血浆的前列腺癌细胞源囊泡的捕获。(A)将渐变量的VCAP纯化囊泡掺入正常血浆中。使用具有EPCAM抗体或其同种型对照的Dynal珠分离囊泡。分离来自囊泡的RNA,并使用qRT-PCR测量TMPRSS2:ERG融合转录物的表达。(B)将VcaP纯化的囊泡掺入到正常血浆中,然后与涂敷有EpCam或同种型对照抗体的Dynal磁珠一起孵育。由Dynal珠上直接分离RNA。使用来自各样品的等体积RNA来进行RT-PCR以及随后的Taqman分析。(C)在使用EpCam和IgG2同种型阴性对照珠捕获的22RV1囊泡之间SPINK1和GAPDH转录物的循环阈值(CT)差异。CT值越高表明转录物的表达越低。
图76A说明了在VCaP前列腺癌细胞源囊泡与正常血浆囊泡之间的前10种差异表达的微RNA。通过超速离心、接着通过RNA分离得到VCAP细胞系囊泡和来自正常血浆的囊泡。使用qRT-PCR分析得到微RNA谱。前列腺癌细胞系源囊泡具有较高水平(较低CT值)的所示微RNA,如在柱状图中所描述的。
图77描述了使用CD9珠捕获的miR-21表达的柱状图。将得自前列腺癌患者的1ml血浆、250ng/ml的LNCaP或正常的纯化囊泡与CD9涂敷的Dynal珠孵育。由所述的珠和珠上清液中分离RNA。此外,对一份样品(#6)不进行捕获以用于比较。使用qRT-PCR测量miR-21的表达,并比较各样品的平均CT值。CD9捕获改善了前列腺癌样品中miR-21的检测。
图78描述了使用CD9珠捕获的miR-141表达的柱状图。本实验按照图77实施,其中使用qRT-PCR测量miR-141的表达,而并非miR-21。
图79是示出了使用对CD9、CD63、CD81、PSMA、PCSA、B7H3和EpCam的捕获剂对从样品(#126)分离的囊泡检测生物标志物CD9、CD81和CD63(A-D)或B7H3和EpCam(E-H)的图,所述囊泡使用具有100kDa MWCO的500μl柱(Millipore,Billerica,MA)(A、E)、具有150kDa MWCO的7ml柱(Rockford,IL)(B、F)、具有100kDa MWCO的15ml柱(Millipore,Billerica,MA)(C、G)或具有150kDa MWCO的20ml柱(Rockford,IL)(D、H)分离。
图80是示出了使用对CD9、CD63、CD81、PSMA、PCSA、B7H3和EpCam的捕获剂对从样品(#342)分离的囊泡的生物标志物CD9、CD81和CD63(A-D)或B7H3和EpCam(E-H)进行检测的图,所述囊泡使用具有100kDa MWCO的500μl柱(Millipore,Billerica,MA)(A、E)、具有150kDa MWCO的7ml柱(Rockford,IL)(B、F)、具有100kDa MWCO的15ml柱(Millipore,Billerica,MA)(C、G)或具有150kDa MWCO的20ml柱(Rockford,IL)(D、H)分离。
图81是示出了在一种样品(#126)(A-C)相对另一种样品(#117)(D-F)的对比中使用对CD9、CD63、CD81、PSMA、PCSA、B7H3和EpCam的捕获剂对囊泡的生物标志物CD9、CD81和CD63或B7H3和EpCam进行检测的图,其使用了具有150kDa MWCO的7ml柱(Rockford,IL)(A、D)、具有100kDa MWCO的15ml柱(Millipore,Billerica,MA)(B、E)或150kDa MWCO的20ml柱(Rockford,IL)(C、F)。
图82是显示了生物标志物CD9、CD63和CD81的检测的图,其使用了捕获剂A)CD9、B)PCSA、C)PSMA和D)EpCam。囊泡分离自对照样品(健康样品)和前列腺癌样品,II期前列腺癌(PCa)样品。与囊泡的超离心分离相比,通过使用基于柱的过滤分离方法改善了PCa和对照之间的分离。
图83描述了分离自患者样品(#126)的囊泡的各种生物标志物的检测水平在使用超离心与基于过滤器的方法之间的比较,所述基于过滤器的方法使用了具有100kDa分子量截止值(MWCO)的500μl柱(Millipore,Billerica,MA)。所述图描述了A)超离心纯化的样品;B)Microcon样品;C)超离心纯化样品和10ug Vcap以及D)具有10ug Vcap的Microcon样品。所使用的捕获剂是CD9、CD63、CD81、PSMA、PCSA、B7H3和EpCam,并且检测到了CD9、CD81和CD63。
图84描述了分离自患者样品(#342)的囊泡的各种生物标志物的检测水平在使用超离心与基于过滤器的方法之间的比较,所述基于过滤器的方法使用了具有100kDa MWCO的500μl柱(Millipore,Billerica,MA)。所述图描述了A)超离心纯化的样品;B)Microcon样品;C)超离心纯化样品和10ug Vcap以及D)具有10ug Vcap的Microcon样品。所使用的捕获剂是CD9、CD63、CD81、PSMA、PCSA、B7H3和EpCam,并且检测到了CD9、CD81和CD63。
图85详细说明了使用MoFlo XDP进行的囊泡分离和鉴定。
图86A-86D详细说明了血浆中囊泡的流式分选。图86A示出了对前列腺癌患者血浆中PCSA阳性囊泡的检测和分选。图86B示出了对正常和前列腺癌患者血浆中CD45阳性囊泡的检测和分选。图86C示出了对正常和乳腺癌患者血浆中CD45阳性囊泡的检测和分选。图86D示出了对正常和前列腺癌患者血浆中DLL4阳性囊泡的检测和分选。
图87是检测样品中囊泡的示意图,其中使用微球平台评估所希望的囊泡的存在或水平。图87A是使用基于柱的过滤方法从血浆中分离囊泡的示意图,其中所述分离的囊泡随后使用微球平台进行评估。图87B是由于诸如超离心这样的高速离心而导致囊泡膜压缩的示意图。图87C是使用激光检测对结合于微球的囊泡进行检测的示意图。
图88A详细说明了囊泡生物印记区分正常前列腺和PCa样品的能力。癌症标志物包括EpCam和B7H3。一般囊泡标志物包括CD9、CD81和CD63。前列腺特异性标志物包括PCSA。据发现所述测试对于PCa对比正常样品具有96%的灵敏度和95%的特异性。图88B在Y轴上示出了正常和前列腺癌患者中图88A的囊泡标记物的平均荧光强度(MFI)。
图89A本发明的囊泡分析对比传统PCa测试的改善的灵敏度。图89B详细说明了本发明的囊泡分析对比传统PCa测试的改善的特异性。
图90详细说明了使用CD63对对BPH样品与正常和PCa样品的区分。
图91详细说明了囊泡生物印记区分正常前列腺和PCa样品的能力。癌症标志物包括EpCam和B7H3。一般囊泡标志物包括CD9、CD81和CD63。前列腺特异性标志物包括PCSA。据发现所述测试对于PCa对比正常和BPH样品具有98%的灵敏度和84%的特异性。
图92详细说明了用于PCa的本发明囊泡分析对比传统测试的改善特异性,即使在包括BPH样品的情况下。
图93详细说明了本发明的囊泡分析对比传统PCa测试的ROC曲线。
图94示出了一般囊泡(如囊泡“MV”)水平、前列腺特异性MV和具有癌症标志物的MV的水平之间的相关性。
图95详细说明了在PCa和正常样品之间显著不同的囊泡标志物。
图96是A)囊泡前列腺癌分析的示意图,其产生了决策树B)、C)、D)以用于确定样品对于前列腺癌是否为阳性。
图97A示出了根据所述决策树针对前列腺癌的囊泡检测分析相对于使用提高的PSA水平进行检测的结果。图97B示出了根据所述决策树对933例PCa和非PCa患者样品的同龄组进行的针对前列腺癌的囊泡检测分析的结果。图97C示出了对应于图97B中示出的数据的ROC曲线。
图98详细说明了使用聚类分析设定前列腺癌囊泡生物标志物的MFI阈值。A)149例样品的原始数据和log转换数据。所述原始数据在左栏中作图并且所述转换数据在右栏中作图。B)使用log转换数据作为输入进行PSMA vs B7H3的聚类分析。圆环(正常)和×(癌症)显示了发现的两个聚类。空心大圆环显示了用作为聚类中心的点。蓝线显示了针对各参数选择的截止值。C)使用log转换数据作为输入进行的PCSA vs B7H3的聚类分析。圆环(正常)和×(癌症)显示了发现的两个聚类。空心大圆环显示了用作聚类中心的点。蓝线显示了针对各参数选择的截止值。D)使用log转换数据作为输入进行的PSMA vs PCSA的聚类分析。圆环和×显示了发现的两个聚类。红色空心大圆环显示了用作聚类中心的点。蓝线示出了针对各参数选择的截止值。E)将在B-D)中确定的阈值应用于包含313例样品的更大数据组,并且产生了92.8%的灵敏度和78.7%的特异性。
图99以y轴上示出了评估前列腺癌(癌症)和正常(正常)样品中的囊泡的平均荧光强度(MFI)。囊泡蛋白生物标志物在x轴上标示,其从左至右包括CD9、PSMA、PCSA、CD63、CD81、B7H3、IL-6、OPG-13(也称为OPG)、IL6R、PA2G4、EZH2、RUNX2、SERPINB3和EpCam。
图100详细说明了使用抗体阵列进行的BPH相对III期PCa的区分。
图101详细说明了分离自对照和PCa样品的囊泡中的miR-145水平。
图102A-102B详细说明了分离自对照(非PCa)和前列腺癌样品的囊泡中的miR-107(图102A)和miR-574-3p(图102B)水平,如在X轴上标明的。使用Taqman分析在分离的囊泡中检测miR。该图下方示出了P值。Y轴示出了检测到的miR的拷贝数。在图102B中,将来自各样品组的两个离群值样品排除于分析之外,所述离群值样品具有远超样品偏差的拷贝数。
图103A-103D详细说明了分离自转移性(M1)和非转移性(MO)前列腺癌样品的囊泡中的miR-141(图103A)、miR-375(图103B)、miR-200b(图103C)和miR-574-3p(图103D)的水平。使用Taqman分析检测分离的囊泡中的miR。
图104A-104D详细说明了使用miR-107和miR141确认来自基于囊泡的前列腺癌诊断分析的假阴性。图104A详细说明了使用囊泡中miR的分析以将假阴性转换成真阳性的示意图,由此改善了灵敏度。图104B详细说明了使用囊泡中miR的分析以将假阳性转换成为真阴性的示意图,由此改善特异性。miR-107(图104C)和miR-141(图104D)的归一化水平在Y轴上针对所述囊泡诊断分析所得的真阳性(TP)、所述囊泡诊断分析所得的真阴性(TN)、所述囊泡诊断分析所得的假阳性(FP)和所述囊泡诊断分析所得的假阴性(FN)示出。
图105A-105F详细说明了在患有或未患PCa且PSA≥或<4.0ng/ml的患者中的hsa-miR-432(图105A)、hsa-miR-143(图105B)、hsa-miR-424(图105C)、hsa-miR-204(图105D)、hsa-miR-581f(图105E)和hsa-miR-451(图105F)升高的柱形图。使用Taqman分析检测分离的囊泡中的miR。Taqman分析所检测的miR水平在Y轴上显示。X轴示出了四个样品组。从左至右,“对照非”是PSA≥4.0的对照患者;“对照是”是PSA<4.0的对照患者;“患病非”是PSA≥4.0的前列腺癌患者;以及“患病是”是PSA<4.0的前列腺癌患者。
图106详细说明了在分离自前列腺癌(PCa)和对照的血浆样品的囊泡中的微RNAmiR-29a和miR-145的水平。
图107详细说明了微珠分析的平板设计布置。
图108A-D详细说明了用于捕获区分结肠直肠癌(CRC)与正常样品的囊泡的各种不同捕获抗体的能力。图108A说明了CRC囊泡样品相对正常样品的捕获抗体抗原(X轴)的倍数变化(Y轴),其根据抗体阵列测定。图108B与之类似,不同之处在于根据图例所示,Y轴是CRC和正常样品中的中位荧光强度。图108C类似于图108B,其在另外的样品组上实施。图108D示出了使用CD24作为结肠标志物,TROP2作为癌症标志物,并且四跨膜蛋白CD9、CD63和CD81作为一般囊泡标志物进行的分析。
图109A-H详细说明了通过使用TMEM211和/或CD24检测囊泡从而在血浆样品中检测CRC。图109A详细说明了使用生物标志物TMEM211进行的本发明的囊泡分析的ROC曲线分析。图109B详细说明了使用生物标志物CD24进行的本发明的囊泡分析的ROC曲线分析。图109C详细说明了对于正常、患有结肠直肠癌(CRC)的受试者和混淆者的本发明囊泡分析方法的分析。图109D详细说明了在后续研究中使用生物标志物TMEM211针对正常、患有结肠直肠癌(CRC)的受试者和混淆者的囊泡样品分析。图109E详细说明了使用生物标志物TMEM211进行的本发明囊泡分析的ROC曲线分析。图109F-109H详细说明了来自具有扩大的患者同龄组进行的另外研究的结果。在图109F中,TMEM211的中位荧光强度(MFI)在X轴上示出,并且CD24的MFI在Y轴上示出。TMEM211和CD24单独地用于区分各种不同类样品的结果分别在图109G和图109H中示出。
图110详细说明了结肠直肠癌(CRC)细胞系对正常囊泡的TaqMan低密度阵列(TLDA)miRNA卡比较。CRC细胞系在图右侧标出。Y轴显示了CRC细胞系与正常对照相比表达上的倍数变化。受监测的miRNA在X轴上标出,并且从左至右为miR-548c-5p、miR-362-3p、miR-422a、miR-597、miR-429、miR-200a和miR-200b。对于各个miR,从左至右的柱形对应于细胞系LOVO、HT29、SW260、COLO205、HCT116和RKO。这些miRNA在正常或黑色素瘤细胞中未过表达。
图111A详细说明了使用miR92和miR491对正常和CRC样品的区分。图111B详细说明了使用miR92和miR21对正常和CRC样品的区分。图111C详细说明了使用miR92、miR21、miR9和miR491的复用对正常和CRC样品的区分。
图112详细说明了结肠直肠癌(CRC)细胞系和患者样品中的KRAS测序。样品包含获自细胞系(B)或从来自所述患者的组织样品(D)获得的基因组DNA,或获自从所述细胞系(A)脱落的或来自所述患者(C)的血浆样品中囊泡中的RNA有效负载的cDNA。
图113详细说明了通过检测来自血浆样品的微囊泡中的TMEM211和MUC1而对CRC的辨别。X轴(MUC1)和Y轴(TMEM211)对应于所述样品中被检测囊泡的中位荧光强度(MFI)。水平和垂直线分别是针对TMEM211和MUC1而检测CRC的MFI阈值。
图114A详细说明了描述在乳腺癌患者样品(n=10)或正常对照(即,无乳腺癌)中检测到的生物标志物的超出正常值的倍数变化。使用系留于珠上的所标示抗原的抗体捕获血浆样品中的囊泡。使用针对四跨膜蛋白CD9、CD63和CD81的标记抗体检测所捕获的囊泡。Y轴上的倍数变化是在所述乳腺癌样品中检测到的囊泡与正常样品相比较的中位荧光强度(MFI)的倍数变化。图114B详细说明了在源自乳腺癌细胞系MCF7、T47D和MDA的囊泡中检测到的各种不同生物标志物的水平。T47D和MDA是转移性细胞系。
图115A详细说明了来自肺癌样品的膜囊泡中的各种不同生物标志物与正常样品相比较的倍数变化,其使用针对所标出的囊泡抗原的抗体进行检测。黑色柱是肺癌样品与正常样品的比率。白色柱是非肺癌样品与正常样品的比率。下划线标出的数据在图115B中示出。图115B说明了使用针对所标示的囊泡抗原的抗体检测的膜囊泡荧光水平。荧光水平是来自以下样品的平均值:正常(白色)、非肺癌样品(灰色)以及分期肺癌样品(黑色)。图115C示出了使用EPHA2(i)、CD24(ii)、EGFR(iii)和CEA(iV)在来自肺癌患者和正常对照的样品中进行的囊泡检测的中位荧光强度(MFI)。图115D和图115E在Y轴上给出了在来自肺癌和正常(非肺癌)受试者的样品中检测到的囊泡的平均荧光强度(MFI)。捕获抗体沿X轴标出。
图116给出了使用所标出的用于检测囊泡的捕获抗体以检测肺癌的决策树。
图117A详细说明了源自血浆的囊泡中相对于循环肿瘤细胞(CTC)的CD81标记的囊泡水平比照肿瘤细胞(CTC)。以受到计数的CD81和CTC测量了对于收集自患者(14例最左侧的“CTC”样品)和正常血浆(4例最右侧样品)的囊泡,对以CD81和CTC测量的囊泡进行计数。图117B详细说明了源自EpCAM+血浆的囊泡中相对于CTC的miR-21拷贝数。示出了患者样品(15例最左侧的“CTC”样品)和正常样品(7例最右侧的“正常”样品)。通过来自RNA的miR-21qRT-PCR评估拷贝数,所述RNA提取自源于EpCAM+血浆的囊泡。CTC计数获自相同样品。
图118A-118C详细说明了来自乳腺癌患者的血浆中的囊泡水平,其在从所述样品耗尽CD31+阳性囊泡后使用针对CD31(图118A)、DLL4(118B)和CD9(图118C)的抗体进行检测。
图119详细说明了对在来自正常(非癌症)血浆样品、乳腺癌(BCa)血浆样品和前列腺癌(PCa)血浆样品的囊泡内的组织因子(TF)的检测。使用系留于微球上的抗组织因子抗体捕获血浆样品中的囊泡。使用针对四跨膜蛋白CD9、CD63和CD81的标记抗体检测所捕获的囊泡。
图120A-C示出了使用抗TMEM211兔多克隆抗体进行的抗原决定部位表位定位。所述抗体针对来自TMEM211的一系列交重叠的肽而测试所述抗体。图120A示出了以抗TMEM211兔多克隆抗体和山羊抗兔IgG HRP二级抗体对所述肽的结合。图120B示出了以对照兔多克隆抗体和山羊抗兔IgG HRP二级抗体对所述肽的结合。图120C示出了以抗TMEM211兔多克隆抗体和山羊抗小鼠IgG HRP二级抗体对所述肽的结合的结果。
图121A-C示出了使用抗B7H3(B7-H3)大鼠单克隆抗体进行的表位定位。所述抗体针对B7H3的一系列重叠的肽测试。图121A示出了以抗B7H3大鼠单克隆抗体和山羊抗大鼠IgG HRP二级抗体对所述肽的结合。图121B示出了以对照大鼠多克隆抗体和山羊抗大鼠IgGHRP二级抗体对所述肽的结合。图121C示出了以抗B7H3大鼠单克隆抗体和山羊抗兔IgG HRP二级抗体对所述肽的结合的结果。
图122A-B示出了使用噬菌体ELISA对来自淘选(panning)的输出噬菌体的筛选。针对靶抗人CD9小鼠单克隆抗体对噬菌体文库进行淘选。以所述靶抗体(图122A)或抗小鼠IgG对照抗体(图122B)对来自三轮淘选的输出噬菌体进行筛选。
发明详述
本文公开了用于表征生物样品(如,来自细胞培养物、生物体或受试者的样品)的表型的方法和系统。可通过评估一种或多种生物标志物表征所述表型。所述生物标志物可与囊泡或囊泡群体关联,其为存在的囊泡表面抗原或囊泡有效负载。如本文所使用的,囊泡有效负载包含封装于囊泡内的实体。囊泡相关的生物标志物可包含膜结合的和可溶的生物标志物。所述生物标志物还可以是循环生物标志物,诸如在体液中评估的微RNA或蛋白质。除非另行说明,本文中提及囊泡或生物标志物组分而使用的术语“纯化的”或“分离的”指的是这些组分从细胞或生物体中部分的或完全的纯化和分离。此外,除非另行说明,所称的使用结合剂进行的囊泡分离包括将囊泡与所述结合剂结合,无论该结合是否使得所述囊泡与起始材料中的其它生物实体的完全分离。
通过分析循环生物标志物(如核酸生物标志物)而表征表型的方法描述于图61A的方案6100A中,其为非限制性说明实例。在第一步骤6101中获得生物样品,如体液、组织样品或细胞培养物。从所述样品中分离核酸6103。所述核酸可以是DNA或RNA,如微RNA。对这些核酸的评估可提供该表型的生物印记。通过对与目标表型(如疾病对比健康、治疗前和治疗后)相关的核酸取样,可测定作为表型的指示的一种或多种核酸标志物。本发明的各个方面涉及通过评估在所述样品中存在的一种或多种核酸分子(如微RNA)而确定生物印记6105,其中所述生物印记对应于预定的表型6107。图61B详细说明了使用囊泡分离所述核酸分子的方案6100B。在一个实施例中,获得了生物样品6102,并且从所述样品中分离一种或多种囊泡6104,如来自特定细胞源的囊泡和/或与特定疾病状态相关的囊泡。通过表征与所述囊泡关联的表面抗原和/或测定所述囊泡中存在的组分(“有效负载”)的存在或水平而分析所述囊泡6106。除非另行说明,本文所使用的术语“抗原”通常指的是可被结合剂结合的生物标志物,无论所述结合剂是抗体、适体、凝集素或用于所述生物标志物的其它结合剂,并且无论这些生物标志物是否在宿主中引发免疫应答。囊泡有效负载可以是蛋白质(包括肽和多肽)和/或核酸(如DNA和RNA)。RNA有效负载包括信使RNA(mRNA)和微RNA(本文中亦称为miRNA或miR)。根据所述囊泡的生物印记表征表型6108。在本发明的另一个说明性方法中,方案6100A和6100B一起实施以表征表型。在这样的方案中,评估了囊泡和核酸(如微RNA),从而表征所述表型。
在一个相关的方面,本文提供了用于发现生物标志物的方法,其包括评估一个样品中的囊泡表面标志物或有效负载标志物以及将所述标志物与另一样品进行比较。在所述样品之间区分的标志物可用作本发明的生物标志物。这些样品可以来自受试者或受试者组。例如,所述组可以是,例如,对于给定疾病或失调的给定治疗的已知反应者和非反应者。发现区分所述已知反应者和非反应者的生物标志物提供了关于受试者是否可能对治疗(诸如治疗剂,如药物或生物制品)有反应的生物印记。
表型
本文公开了通过分析囊泡(诸如膜囊泡)来表征个体的表型的产品和方法。表型可以为受试者的任何可观察的特征或性状,例如疾病或状况、疾病阶段或状况阶段、疾病或状况的易感性、疾病阶段或状况的预后、生理状态或对治疗的反应。表型可以由受试者的基因表达及环境因素的影响以及这二者之间的相互作用引起,以及由对核酸序列的外遗传修饰引起。
受试者中的表型可以通过从受试者获得生物样品并分析所述样品中的一种或多种囊泡来表征。例如,表征受试者或个体的表型可以包括检测疾病或状况(包括症状前的早期阶段检测),确定疾病或状况的预后、诊断或治疗诊断,或者确定疾病或状况的阶段或进程。表征表型还可以包括鉴定针对特定疾病、状况、疾病阶段或状况阶段的适当治疗或治疗效力、疾病进展的预测和可能性分析,特别是疾病复发、转移扩散或疾病恶化。表型还可以为状况或疾病(例如癌症或肿瘤)的临床上独特的类型或亚型。表型的确定还可以为生理状况的确定、器官危境或器官排斥(例如移植后)的评估。本文所述的产品和方法可以在个体的基础上评估受试者,其可以提供在治疗中的更有效和更经济的决策的益处。
在一个方面,本发明涉及囊泡分析以提供预测受试者是否可能对疾病或失调的治疗有反应的生物印记。表征表型包括预测所述受试者的响应者/非响应者状态,其中响应者对疾病的治疗有反应而非响应者对所述治疗无反应。可在所述受试者中分析囊泡并与已知对治疗有反应或没有反应的先前受试者的囊泡分析进行比较。如果所述受试者中的囊泡生物印记与已知对所述治疗有反应的先前受试者更为接近,则所述受试者可表征或预测为所述治疗的响应者。类似地,如果所述受试者中的囊泡生物印记与已知对所述治疗无反应的此前受试者更为接近,则所述受试者可表征或预测为所述治疗的非响应者。所述治疗可以针对任意适当的疾病、失调或其它状况。在与响应者/非响应者状态相关的囊泡生物印记已知的情况下,所述方法可用于任意疾病情况中。
本发明所使用的术语“表型”可以指贡献于囊泡生物印记的任何性状或特征,该生物印记使用本发明的方法而鉴定。例如,表型可以是受试者可能对治疗有反应的标识,或更广义地其可为治疗诊断基于针对获自受试者的样品鉴定的生物印记的诊断、预后或治疗诊断确定。
在一些实施方案中,所述的表型包括疾病或状况如表1中所列的那些。例如,所述的表型可包括肿瘤、赘生物或癌症的存在或发生肿瘤、赘生物或癌症的可能性。通过本文所述的产品或方法检测或评估的癌症包括但不限于乳腺癌、卵巢癌、肺癌、结肠癌、增生性息肉、腺瘤、结肠直肠癌、高度异型增生(high grade dysplasia)、低度异型增生(low gradedysplasia)、前列腺增生、前列腺癌、黑色素瘤、胰腺癌、脑癌(例如成胶质细胞瘤)、血液恶性肿瘤、肝细胞癌、宫颈癌、子宫内膜癌、头颈癌、食管癌、胃肠道间质瘤(GIST)、肾细胞癌(RCC)或胃癌。所述的结肠直肠癌可以为CRC Dukes B或CRC Dukes C-D。所述的血液恶性肿瘤可以为B细胞慢性淋巴细胞性白血病、B细胞淋巴瘤-DLBCL、B细胞淋巴瘤-DLBCL-生发中心样、B细胞淋巴瘤-DLBCL-活化B细胞样以及伯基特氏淋巴瘤。
所述表型可以是恶变前状况,诸如光化性角化病、萎缩性胃炎、白斑病、增殖性红斑、淋巴瘤样肉芽肿病、白血病前期、纤维症、宫颈非典型增生、子宫颈非典型增生、着色性干皮病、巴雷特食管、结肠直肠息肉或有可能发展成为恶性肿瘤的其它异常组织生长或病灶。诸如HIV和HPV的转化型病毒感染也提供了可根据本发明进行评估的表型。
通过本发明的方法表征的癌症可包括但不限于,癌瘤、肉瘤、淋巴瘤或白血病、生殖细胞瘤、胚细胞瘤或其它癌症。癌瘤包括但不限于,上皮肿瘤、鳞状细胞肿瘤鳞状细胞癌、基底细胞肿瘤基底细胞癌、移行细胞乳头状瘤和癌、腺瘤和腺癌(腺体)、腺瘤、腺癌、革囊胃胰岛瘤(linitis plastica insulinoma)、高血糖素瘤、胃泌素瘤、血管活性肠肽瘤、胆管癌、肝细胞癌、囊性腺样癌、阑尾类癌瘤、泌乳素瘤、大嗜酸粒细胞瘤、许特莱氏细胞腺瘤(hurthle cell adenoma)、肾细胞癌、格拉维茨瘤(grawitz tumor)、多发性内分泌腺瘤、子宫内膜腺瘤、附件和皮肤附件肿瘤、粘液表皮样肿瘤、囊性、粘液性和浆液性肿瘤、囊腺瘤、腹膜假粘液瘤、导管、小叶和髓质肿瘤、腺泡细胞肿瘤、复合上皮肿瘤、沃辛肿瘤(warthin'stumor)、胸腺瘤、特化生殖腺肿瘤、性索间质瘤、泡膜细胞瘤、粒膜细胞瘤、卵巢含睾丸母细胞瘤、支持细胞睾丸间质细胞瘤、血管球瘤、副神经节瘤、嗜铬细胞瘤、血管神经肌瘤、痣与黑色素瘤、黑素细胞痣、恶性黑色素瘤、黑色素瘤、结节性黑色素瘤、发育不良痣、恶性痣性黑色素瘤、浅表扩散性黑色素瘤以及恶性肢端着色斑性黑色素瘤。肉瘤包括但不限于,Askin肿瘤、葡萄状肉瘤(botryodies)、软骨肉瘤、尤文氏肉瘤、恶性血管内皮细胞瘤、恶性神经鞘瘤、骨肉瘤、软组织肉瘤,其包括:腺泡状软组织肉瘤、血管肉瘤、叶状囊肉瘤、皮肤纤维肉瘤、硬纤维瘤、促结缔组织增生性小圆形细胞瘤、上皮样肉瘤、骨外软骨肉瘤、骨外骨肉瘤、纤维肉瘤、血管外皮细胞瘤、血管肉瘤、卡波济氏肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、神经纤维肉瘤、横纹肌肉瘤和滑膜肉瘤。淋巴瘤和白血病包括但不限于,慢性淋巴细胞性白血病/小淋巴细胞性淋巴瘤、B细胞幼淋巴细胞性白血病、淋巴浆细胞性淋巴瘤(lymphoplasmacytic lymphoma)(诸如巨球蛋白血症)、脾边缘区淋巴瘤、浆细胞骨髓瘤、浆细胞瘤、单克隆免疫球蛋白沉积病、重链病、亦称为malt淋巴瘤的结外边缘区B细胞淋巴瘤、结节性边缘区B细胞淋巴瘤(nmzl)、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤/白血病、T细胞幼淋巴细胞性白血病、T细胞大颗粒淋巴细胞白血病、侵袭性NK细胞白血病、成人T细胞性白血病/淋巴瘤、结外NK/T细胞淋巴瘤,鼻型、肠病型T细胞淋巴瘤、肝脾T细胞淋巴瘤、母细胞性NK细胞淋巴瘤、蕈样霉菌病/塞泽里综合征(sezary syndrome)、原发性皮肤CD30阳性T细胞淋巴组织增生性疾病、原发性皮肤间变性大细胞淋巴瘤、淋巴瘤样丘疹病、血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤、非指定、间变性大细胞淋巴瘤、典型霍奇金淋巴瘤(结节性硬化、混合细胞性、富淋巴细胞、淋巴细胞耗尽或非耗尽)以及结节性淋巴细胞为主型霍奇金淋巴瘤。生殖细胞肿瘤包括但不限于,生殖细胞瘤、无性细胞瘤、精原细胞瘤、非生殖细胞瘤性生殖细胞瘤、胚胎癌、内胚窦肿瘤、绒毛膜癌、畸胎瘤、多胚瘤和成性腺细胞瘤。胚细胞瘤包括但不限于,肾母细胞瘤、成神经管细胞瘤和视网膜母细胞瘤。其它癌症包括但不限于,唇癌、喉癌、咽癌、舌癌、唾液腺癌、胃癌、腺癌、甲状腺癌(延髓和乳头状甲状腺癌)、肾癌、肾实质癌、子宫颈癌、子宫体癌、子宫内膜癌、绒毛膜癌、睾丸癌、泌尿系癌、黑色素瘤、脑肿瘤(如胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、脑膜瘤、髓母细胞瘤和外周神经外胚层肿瘤)、胆囊癌、支气管癌、多发性骨髓瘤、基底细胞癌、畸胎瘤、视网膜母细胞瘤、脉络膜黑色素瘤、精原细胞瘤、横纹肌肉瘤、颅咽管瘤(craniopharyngeoma)、骨肉瘤、软骨肉瘤、肌肉瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、尤文氏肉瘤和浆细胞瘤。
在进一步的实施方案中,进行分析的癌症可以是肺癌,其包括非小细胞肺癌和小细胞肺癌(包括小细胞癌(燕麦细胞癌)、小细胞/大细胞混合癌以及复合性小细胞癌)、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌、胰腺癌、脑癌、肾癌、卵巢癌、胃癌、皮肤癌、骨癌、胃的癌、乳腺癌、胰腺癌、胶质细胞瘤、胶质母细胞瘤、肝细胞癌、乳头状癌肾癌、头颈部鳞状细胞癌、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤或实体肿瘤。
在实施方案中,所述癌症包括急性成淋巴细胞性白血病;急性骨髓性白血病;肾上腺皮质癌;AIDS相关癌症;AIDS相关淋巴瘤;肛门癌;阑尾癌;星形细胞瘤;非典型畸胎样瘤/横纹肌样瘤;基底细胞癌;膀胱癌;脑干胶质瘤;脑肿瘤(包括脑干胶质瘤、中枢神经系统非典型畸胎样瘤/横纹肌样瘤、中枢神经系统胚胎样瘤、星形细胞瘤、颅咽管瘤、成室管膜母细胞瘤、室管膜瘤、髓母细胞瘤、髓上皮瘤、中度分化的松果体实质肿瘤、幕上原始神经外胚层肿瘤和成松果体细胞瘤);乳腺癌;支气管肿瘤;伯基特氏淋巴瘤;原发部位不明癌;类癌瘤;原发部位不明肿瘤;中枢神经系统非典型畸胎样瘤/横纹肌样瘤;中枢神经系统胚胎性肿瘤;宫颈癌;儿童期癌症;脊索瘤;慢性淋巴细胞性白血病;慢性骨髓性白血病;慢性骨髓增殖紊乱;结肠癌;结肠直肠癌;颅咽管瘤;皮肤T细胞淋巴瘤;内分泌胰岛细胞瘤;子宫内膜癌;成室管膜母细胞瘤;室管膜瘤;食管癌;成感觉神经细胞瘤(esthesioneuroblastoma);尤文氏肉瘤;颅外生殖细胞瘤;性腺外生殖细胞肿瘤;肝外胆管癌;胆囊癌;胃的(胃)癌;胃肠道类癌肿瘤;胃肠道间质细胞瘤;胃肠道间质瘤(GIST);妊娠滋养细胞肿瘤;神经胶质瘤;毛细胞白血病;头颈癌;心脏癌;霍奇金淋巴瘤;喉咽癌;眼内黑色素瘤;胰岛细胞瘤;卡波济氏肉瘤;肾癌;朗格汉斯细胞组织细胞增生症;喉癌;唇癌;肝癌;恶性纤维组织细胞瘤骨癌;髓母细胞瘤;髓上皮瘤;黑色素瘤;Merkel细胞癌;Merkel细胞皮肤癌;间皮瘤;隐匿原发性的转移性鳞状颈癌;口腔癌;多发性内分泌肿瘤综合征;多发性骨髓瘤;多发性骨髓瘤/浆细胞肿瘤;蕈样肉芽肿;骨髓发育异常综合征;骨髓增生性肿瘤;鼻腔癌;鼻咽癌;神经母细胞瘤;非霍奇金淋巴瘤;非黑色素瘤皮肤癌;非小细胞肺癌;口癌;口腔癌;口咽癌;骨肉瘤;其它脑和脊髓肿瘤;卵巢癌;卵巢上皮癌;卵巢生殖细胞肿瘤;卵巢低恶性潜在肿瘤;胰腺癌;乳头状瘤病;副鼻窦癌;甲状旁腺癌;盆腔癌;阴茎癌;咽癌;中度分化的松果体实质肿瘤;成松果体细胞瘤;垂体瘤;浆细胞肿瘤/多发性骨髓瘤;胸膜肺母细胞瘤;原发性中枢神经系统(CNS)淋巴瘤;原发性肝细胞肝癌;前列腺癌;直肠癌;肾癌;肾细胞(肾)癌;肾细胞癌;呼吸道癌;视网膜母细胞瘤;横纹肌肉瘤;唾液腺癌症;Sézary综合征;小细胞肺癌;小肠癌;软组织肉瘤;鳞状细胞癌;鳞状颈癌;胃(胃的)癌;幕上原始神经外胚层肿瘤;T细胞淋巴瘤;睾丸癌;咽喉癌;胸腺癌;胸腺瘤;甲状腺癌;移行细胞癌;肾盂和输尿管的移行细胞癌;滋养细胞肿瘤;输尿管癌;尿道癌;子宫癌;子宫肉瘤;阴道癌;外阴癌;巨球蛋白血症或肾母细胞瘤。本发明的方法可用于表征这些及其它癌症。因此,对表型的表征可提供本文公开的癌症之一的诊断、预后和治疗诊断。
所述的表型还可以为炎性疾病、免疫疾病或自身免疫疾病。例如,所述的疾病可以为炎性肠病(IBD)、克罗恩氏病(CD)、溃疡性结肠炎(UC)、盆腔炎症、脉管炎、银屑病、糖尿病、自身免疫性肝炎、多发性硬化症、重症肌无力、I型糖尿病、类风湿性关节炎、牛皮癣、系统性红斑狼疮(SLE)、桥本甲状腺炎、格雷夫斯病、强直性脊柱炎、Sjogrens病、CREST综合征、硬皮病、风湿病、器官排斥反应、原发性硬化性胆管炎或脓毒症。
所述的表型还可以包括心血管疾病,例如动脉粥样硬化、充血性心力衰竭、易损斑块、中风或局部缺血。所述的心血管疾病或状况可以为高血压、狭窄症、血管阻塞或血栓形成事件。
所述的表型还可以包括神经疾病,例如多发性硬化症(MS)、帕金森氏病(PD)、阿尔兹海默氏病(AD)、精神分裂症、双相型障碍、抑郁症、孤独症、朊病毒病、皮克病、痴呆、亨廷顿病(HD)、唐氏综合征、脑血管疾病、Rasmussen脑炎、病毒性脑膜炎、神经精神性系统性红斑狼疮(NPSLE)、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、克雅氏病、Gerstmann-Straussler-Scheinker病、传染性海绵状脑病、缺血再灌注损伤(例如中风)、脑外伤、微生物感染或慢性疲劳综合征。所述的表型还可以为诸如纤维肌痛、慢性神经病理性疼痛或周围神经病理性疼痛的状况。
所述的表型还可以包括感染性疾病,例如细菌、病毒或酵母菌感染。例如,所述的疾病或状况可以为惠普尔氏病、朊病毒病、肝硬化、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、HIV、肝炎、梅毒、脑膜炎、疟疾、结核病或流行性感冒。可以评估囊泡中的病毒蛋白质(例如HIV或HCV样颗粒)从而表征病毒状况。
所述的表型还可以包括围产期或妊娠相关的状况(例如先兆性子痫或早产)、代谢疾病或状况(例如与铁代谢有关的代谢疾病或状况)。例如,可以测定在囊泡中的铁调素(hepcidin)从而表征铁缺乏。所述的代谢疾病或状况还可以为糖尿病、炎症或围产期状况。
本发明的方法可用于表征这些疾病或失调以及可通过生物标志物评估的其它疾病或失调。因此,对表型的表征可提供对本文公开的疾病或失调之一的诊断、预后和治疗诊断。
受试者
可通过分析从受试者获得的生物样品中的一种或多种囊泡(如多种囊泡)来确定受试者的一种或多种表型。受试者或患者可以包括但不限于哺乳动物,例如牛、鸟、犬、马、猫、绵羊、猪或灵长动物(包括人及非人灵长动物)。受试者还可以包括:由于濒危而变得重要的哺乳动物,例如西伯利亚虎;或者具有经济意义的动物(例如用于人消费的农场饲养动物),或对人类而言具有社会意义的动物(例如作为宠物或在动物园中饲养的动物)。此类动物的实例包括但不限于:食肉动物,例如猫和狗;猪,包括畜养猪、食用猪和野猪;反刍动物或有蹄类动物,例如牛、公牛、绵羊、长颈鹿、鹿、山羊、野牛、骆驼或马。此外,还包括濒危的或在动物园中饲养的鸟;以及禽类,更特别的是家养的禽类,即,家禽,例如火鸡和鸡、鸭、鹅、珍珠鸡。还包括家养的猪和马(包括赛马)。此外,与商业活动有关的任何动物种类也都被包括在内,例如与农业、水产业和其它活动有关的动物,所述行业中为了经济生产率和/或食物链的安全,疾病监测、诊断和疗法的选择是常规措施。
所述的受试者可以患有此前存在的疾病或状况,例如癌症。或者,所述的受试者可以并未患任何已知的此前存在的状况。所述的受试者还可以对现有或过去的治疗是非反应性的,例如对癌症的治疗是非反应性的。
样品
得自所述受试者的生物样品可以为任何体液。例如,所述的生物样品可以为外周血、血清、血浆、腹水、尿、脑脊液(CSF)、痰、唾液、骨髓、滑液、房水、羊水、耳垢、乳汁、支气管肺泡灌洗液、精液(包括前列腺液)、考珀液或预射精液、女性射出液、汗液、排泄物、毛发、泪液、囊液、胸腔积液和腹水液、心包液、淋巴液、食物糜、乳糜、胆汁、间质液、经血、脓液、皮脂、呕吐物、阴道分泌物、粘膜分泌物、稀便、胰液、鼻腔灌洗液、支气管肺抽吸液或其它灌洗液。生物样品还可以包括囊胚腔、脐带血或母体循环血(其可以为胎儿来源或母体来源的)。所述的生物样品还可以为组织样品或活体组织,从中可获得囊泡和其它循环生物标志物。例如,可以培养得自样品的细胞,并且从所述培养物中分离囊泡(例如参见实施例1)。在各个实施方案中,可由这些生物样品直接评估本发明公开的生物标志物或更特别地生物印记(如,对核酸或多肽生物标志物或其功能性片段的存在或水平的鉴定),其使用各种方法,诸如,从血液、血浆、血清或任意前述生物样品中提取核酸分子,使用蛋白质或抗体阵列鉴定多肽(或功能性片段)生物标志物,以及本领域中已知用于鉴定与评估核酸和多肽分子的其它阵列、测序、PCR和蛋白质组技术。
表1列出了疾病、状况或生物学状态的说明性实例,以及可以对其中的囊泡进行分析的生物样品的相应列表。
表1:针对各种疾病、状况或生物学状态,用于囊泡分析的生物样品的实例
本发明的方法可用于使用血液样品或血液衍生物表征表型。血液衍生物包括血浆和血清。血浆是全血的液体组分,并且约占总血液体积的55%。其主要由水和溶液中的少量矿物质、盐类、离子、营养物质和蛋白质组成。在全血中,红细胞、白细胞和血小板悬浮于血浆中。血清指的是不含纤维蛋白原或其它凝血因子的血浆(即,全血减去细胞和凝血因子)。
所述生物样品可通过第三方获得,诸如不进行所述生物标志物的分析的一方,无论是对生物样品的直接评估或通过对得自所述生物样品的一种或多种囊泡进行分型。例如,所述的样品可以通过样品所来源的受试者的临床医生、医师或其它保健管理人员获得。或者,所述的生物样品可以由分析囊泡的同一方获得。此外,进行分析的生物样品在防腐条件下归档(如,冷冻)或者储存。
用于生物标志物分析的生物样品的体积可以为0.1-20mL,例如低于约20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1或0.1mL。
体液样品可用作为表征表型的样品。例如,可对样品中的生物标志物进行评估以提供疾病的诊断、预后和/或治疗诊断。所述生物标志物可以是循环生物标志物,诸如循环蛋白质或核酸。所述生物标志物还可与囊泡或囊泡群体相关。本发明的方法可应用于评估一种或多种囊泡,以及一种或多种可存在于生物样品或受试者中的不同囊泡群体。生物样品中一种或多种生物标志物的分析可用于确定是否应获取另外的生物样品以进行分析。例如,对体液样品中一种或多种囊泡的分析可有助于确定是否应获取组织活检样品。
来自患者的样品可在保持循环生物标志物和其所包含的其它目标实体以用于随后的分析的条件下进行采集。在一个实施方案中,使用CellSave Preservative Tubes(CellSave Preservative Tube)(Veridex,North Raritan,NJ)、PAXgene Blood DNATubes(Blood DNA Tubes)(QIAGEN GmbH,Germany)和RNAlater(QIAGEN GmbH,Germany)中的一种或多种处理所述样品。
CellSave Preservative Tubes(CellSave管)是无菌的真空采血管。各管包含溶液,所述溶液包含Na2EDTA和细胞保存剂。EDTA吸收钙离子,由此可降低或消除血液凝结。所述保存剂保持上皮细胞和其它细胞的形态和细胞表面抗原表达。可根据制造商提供的方案中的描述实施所述采集和处理。各管经排空以抽取静脉全血,其根据本领域的技术人员所知的标准静脉放血程序进行。CellSave管公开于美国专利No.5,466,574;5,512,332;5,597,531;5,698,271;5,985,153;5,993,665;6,120,856;6,136,182;6,365,362;6,551,843;6,620,627;6,623,982;6,645,731;6,660,159;6,790,366;6,861,259;6,890,426;7,011,794;7,282,350;7,332,288;5,849,517和5,459,073中,其各自以引用方式全文并入本文。
所述PAXgene Blood DNA管(PAXgene管)是用于采集核酸分离用的全血的塑料真空管。该管可用于血液采集、全血样本的运输和贮存以及对其中所包含的核酸的分离,如DNA或RNA。血液以标准的静脉放血方案采集进入包含添加剂的真空管中。可根据制造商提供的方案中的描述实施所述采集和处理。PAXgene管公开于美国专利申请No.5,906,744;4,741,446;4,991、4,991,104中,其各自均以引用方式全文并入本文。
所述RNAlater RNA Stabilization Reagent(RNAlater)用于对组织中的RNA进行直接稳定化。RNA在收获的样品中可能是不稳定的。水性RNAlater试剂渗透组织和其它样品,由此稳定和保护其所包含的RNA。这种保护有助于确保下游分析反映在该组织或其它样品中的RNA表达谱。在采集后立即将所述样品浸入适当体积的RNAlater试剂中。可根据制造商提供的方案中的描述实施所述采集和处理。根据制造商,所述试剂在37℃下保持RNA最长达1天,在18-25℃下7天或在2-8℃下4周,从而允许无需液氮或干冰而对样品进行处理、运输、贮存和运送。所述样品也可置于-20℃或-80℃下,例如进行存档贮存。保存的样品可用于分析任意类型的RNA,包括但不限于总RNA、mRNA和微RNA。RNAlater还可用于采集可用于DNA、RNA和蛋白质分析的样品。RNAlater公开于美国专利申请No.5,346,994中,其各以引用方式全文并入本文。
囊泡
本发明的方法可包括评估一种或多种囊泡,其包括评估囊泡群体。本文所使用的囊泡是从细胞上脱落的膜囊泡。囊泡或膜囊泡包括但不限于:循环微囊泡(cMV)、微囊泡、外来体、纳米囊泡、dexosome、水泡、气泡、前列腺小体、微粒、管腔内囊泡、膜片段、管腔内核内体囊泡、核内体样囊泡、胞吐媒介、核内体囊泡、核内体的囊泡、凋亡小体、多泡体、分泌囊泡、磷脂囊泡、脂质体囊泡、argosome、texasome、secresome、tolerosome、黑色素体、oncosome或胞吐的媒介。此外,尽管囊泡可通过不同的细胞过程产生,本发明的方法并不限于或依赖于任何单一机制,只要这些囊泡存在于生物样品中并且能够通过本发明公开的方法进行表征即可。除非另行说明,否则使用某一种囊泡的方法可用于其它类型的囊泡。囊泡包含球状结构,其具有环绕内腔的类似于细胞膜的脂质双层,所述内腔可包含有时被称为有效负载的可溶性组分。在一些实施方案中,本发明的方法使用了外来体,其为直径约40–100nm的小的分泌囊泡。对于膜囊泡(包括类型和特征)的综述参见Thery等,Nat RevImmunol.2009年8月;9(8):581-93。不同类型囊泡的一些性质包括表2中的性质:
表2:囊泡特性PCR
缩写:磷脂酰丝氨酸(PPS);电子显微法(EM)
囊泡包括脱落的膜结合颗粒,或称“微粒”,其源自于质膜或内膜。囊泡可以从细胞释放进入细胞外环境中。释放囊泡的细胞包括但不限于源自或衍生自外胚层、内胚层或中胚层的细胞。所述细胞可发生遗传的、环境的和/或任意其它的变异或变化。例如,所述细胞可为肿瘤细胞。囊泡可反映来源细胞的任何变化,并且由此而反映起源细胞中的变化,如,具有各种基因突变的细胞。在一种机制中,当细胞膜的片段自发地内陷并最终被胞吐出来时,囊泡在细胞内生成(例如参见Keller等,Immunol.Lett.107(2):102–8(2006))。囊泡还包括脂质双层膜所结合的细胞源的结构,其由突出的外翻(起泡)分离和质膜部分的封闭所产生,或者由包含各种肿瘤来源的膜结合蛋白质的任何细胞内膜结合囊泡结构的外送而生成,其中所述膜结合蛋白质包括源自宿主循环的表面结合分子,该分子选择性地结合肿瘤源蛋白质以及包含在囊泡腔中的分子,其包括但不限于肿瘤衍生的微RNA或细胞内蛋白质。水泡和起泡在Charras等,Nature Reviews Molecular and Cell Biology,第9卷第11章,p.730-736(2008)中有进一步的描述。从肿瘤细胞上脱落进入循环或体液中的囊泡可称作为“循环肿瘤源囊泡”。当这种囊泡是外来体时,其可被称为循环肿瘤源外来体(CTE)。在一些情况下,囊泡可源自特定细胞源。CTE,如细胞源特异性囊泡一样,一般具有一种或多种独特的生物标志物,其允许所述CTE或细胞源特异性囊泡例如与体液中分离且某些时候以特异性方式分离。例如,使用细胞或组织特异性标志物以鉴定细胞源。本文公开了这些细胞或组织特异性标志物的实例并且其可进一步见于组织特异性基因表达和调控(TiGER)数据库(Tissue-specific Gene Expression and Regulation Database),其可获自bioinfo.wilmer.jhu.edu/tiger/;Liu等(2008)TiGER:a database for tissue-specificgene expression and regulation.BMC Bioinformatics.9:271;组织分布数据库(TissueDistributionDB),可获自genome.dkfz-heidelberg.de/menu/tissue_db/index.html。
囊泡可具有超过约10nm、20nm或30nm的直径。囊泡可具有超过40nm、50nm、100nm、200nm、500nm、1000nm或超过10,000nm的直径。囊泡可具有约30-1000nm、约30-800nm、约30-200nm或约30-100nm的直径。在一些实施方案中,所述囊泡具有低于10,000nm、1000nm、800nm、500nm、200nm、100nm、50nm、40nm、30nm、20nm或低于10nm的直径。本文在提及数值时所使用的术语“约”意指高于或低于所述数值10%的变化属于所指明数值具有的范围内。各种类型的囊泡的典型大小在表2中示出。可评估囊泡以测量单一囊泡或多个囊泡的直径。例如,可测定囊泡群体的直径范围或囊泡群体的平均直径。囊泡直径可使用本领域中已知的方法评估,如,诸如电子显微术这样的成像技术。在一个实施方案中,使用光学粒子检测(optical particle detection)测定一种或多种囊泡的直径。例如,参见2010年7月6日授权的题为“Optical Detection and Analysis of Particles”的美国专利7,751,053;以及2010年7月15日授权的题为“Optical Detection and Analysis of Particles”的美国专利7,399,600。
在一些实施方案中,在没有生物样品的先行分离、纯化或浓缩的情况下直接从所述生物样品分析囊泡。例如,样品中的囊泡量本身可提供生物印记,其提供诊断、预后或治疗诊断确定。或者,可在分析前从样品中分离、捕获、纯化或浓缩样品中的囊泡。如所说明的,本文所使用的分离、捕获或纯化包括与样品中的其它组分部分分离、部分捕获或部分纯化。囊泡分离可使用本文所述的各种技术实施,如,色谱、过滤、离心、流式细胞法、亲和捕获(如,捕获到平面或珠)和/或使用微流体技术。
可以通过将囊泡特征与参照进行比较而评估囊泡如外来体以提供表型表征。在一些实施方案中,评估了囊泡上的表面抗原。所述表面抗原可提供囊泡的解剖学来源和/或细胞的标识,以及其它表型信息,如肿瘤状态。例如,其中针对指示结肠直肠来源和癌症存在的表面抗原评估患者样品(如,体液,诸如血液、血清或血浆)中发现的囊泡。所述表面抗原可包含可在囊泡膜表面上检测到的任何信息性生物实体,其包括但不限于表面蛋白质、脂质、碳水化合物和其它膜组分。例如,对表达肿瘤抗原的结肠源囊泡的阳性检测可表示所述患者患有结肠直肠癌。据此,本发明的方法可用于表征与解剖学或细胞来源相关的任意疾病或状况,其通过评估,例如,获自受试者的一种或多种囊泡的疾病特异性和细胞特异性生物标志物而完成。
在另一个实施方案中,对一种或多种囊泡有效负载进行评估以提供表型表征。囊泡的有效负载包括在包封于所述囊泡内的情况下可检测的任何信息性生物实体,其包括但不限于蛋白质和核酸,如,基因组的或cDNA、mRNA或其功能性片段,以及微RNA(miR)。此外,本发明的方法涉及检测囊泡表面抗原(在囊泡有效负载以外进行或排除囊泡有效负载)以提供表型表征。例如,可使用对于囊泡表面抗原特异性的结合剂(如抗体或适体)鉴定囊泡,并且可进一步评估结合的囊泡以鉴定其中揭示的一种或多种有效负载组分。根据本文所述,具有目标表面抗原或具有目标有效负载的囊泡的水平可与参照进行比较以表征表型。例如,与参照对比,癌症相关表面抗原或囊泡有效负载(如肿瘤相关mRNA或微RNA)在样品中的过表达可指示所述样品中癌症的存在。根据所需目标样品的选择以及目标样品与所希望的参照样品的比较,所评估的生物标志物可存在或不存在,提高或降低。目标样品的非限制实例包括:疾病;治疗/未治疗;不同时间点,如在纵向研究中;并且参照样品的非限制实例:非疾病;不同时间点;以及对候选治疗的敏感或抗性。
微RNA
可在生物样品或获自这类生物样品的囊泡中评估各种生物标志物分子。微RNA包含通过本发明的方法评估的一类生物标志物。在本文中亦称为miRNA或miR的微RNA是长约21-23个核苷酸的短RNA链。miRNA由基因编码,其由DNA转录但并不翻译成为蛋白质并且因此而包含非编码RNA。miR由称作原miRNA(pri-miRNA)的原始转录物加工而成为称作前miRNA(pre-miRNA)的短茎环结构,并且最终加工成所获得的单链miRNA。pre-miRNA一般形成在自体互补区域中折回到自身的结构。这些结构随后在动物中由核酸酶DIcer加工,或在植物中由DCL1加工。成熟的miRNA分子与一种或多种信使RNA(mRNA)分子部分地互补并且可发挥调控蛋白质翻译的功能。经鉴定的miRNA序列可在公开可得的数据库中获得,诸如www.microRNA.org、www.mirbase.org或www.mirz.unibas.ch/cgi/miRNA.cgi。
通常根据命名惯例“mir-[数字]”而对miRNA赋予编号。miRNA的编号根据其相对于此前鉴定的miRNA种类的发现顺序而设定。例如,如果最后公布的miRNA为mir-121,则下一个被发现的miRNA将被命名为mir-122,等等。当miRNA被发现与来自不同生物体的已知miRNA同源时,其命名可以提供[生物体标识]-mir-[数字]的形式的任选生物体标识符。标识符包括用于智人的hsa和用于小鼠的mmu。例如,mir-121的人同源物可称为hsa-mir-121,而小鼠同源物可称为mmu-mir-121。
成熟微RNA通常赋予前缀“miR”,而基因或前体miRNA赋予前缀“mir”。例如,mir-121是miR-121的前体。当差异的miRNA基因或前体被加工成为相同的成熟miRNA时,所述基因/前体可通过编号的后缀描述。例如,mir-121-1和mir121-2可以指被加工成为miR-121的不同基因或前体。字母后缀用于标示紧密相关的成熟序列。例如,mir-121a和mir-121b可分别被加工成为紧密相关的miRNA miR-121a和miR-121b。在本发明的情况中,本文中使用前缀mir-*或miR-*指称的任何微RNA(miRNA或miR)被认为涵盖了前体和/或成熟种类,除非另行明确说明。
有时观察到两种成熟miRNA序列源自于相同的前体。当序列之一比另一种更为丰富时,“*”后缀可用于指示较不常见的变体。例如,miR-121应是主要的产物,而miR-121*是位于前体的相对臂上发现的较不常见的变体。如果未识别出主要变体,则可通过对于来自前体5'臂的变体的后缀“5p”以及对于来自3'臂的变体的后缀“3p”来区分所述miR。例如,miR-121-5p源自于前体的5’臂,而miR-121-3p源自于3'臂。较不常见的情况下,5p和3p变体分别被称为正义(“s”)和反义(“as”)形式。例如,miR-121-5p可称为miR-121-s,而miR-121-3p可称为miR-121-as。
上述命名惯例已经随时间发生演化并且是一般性指导参考而非绝对规定。例如,miRNA的let和lin家族继续使用这些名称指代。用于前体/成熟形式的mir/miR惯例依然是指导原则,并且应考虑上下文以确定是指何种形式。miR命名的进一步细节可见于www.mirbase.org或Ambros等,A uniform system for microRNA annotation,RNA 9:277-279(2003)。
植物miRNA遵循不同的命名惯例,其描述于Meyers等,Plant Cell.2008 20(12):3186-3190中。
基因调控中涉及大量miRNA,并且miRNA是不断增长的非编码RNA类别的一部分,其现在被认为是基因控制的主要层级。在某些情况下,miRNA可通过嵌入其靶mRNA的3′-UTR中的调控位点而干扰翻译,从而导致了翻译的阻遏。靶标识别涉及靶位点与述miRNA的种子区域(所述miRNA 5′端的2-8位)的互补碱基配对,尽管种互补性的精确程度未被准确地测定并且可通过3′配对进行修饰。在其它情况下,miRNA与小干扰RNA(siRNA)类似地发挥功能,并且结合于完全互补的mRNA序列以破坏靶转录物。
多种miRNA的表征显示它们影响多种过程,包括早期发育、细胞增殖和细胞死亡、细胞凋亡和脂肪代谢。例如,已经显示某些miRNA(诸如lin-4、let-7、mir-14、mir-23和bantam)在细胞分化和组织发育中起关键作用。其它miRNA据信由于它们差异的空间和时间表达模式而具有类似重要的作用。
可获自miRBase(www.mirbase.org)的miRNA数据库包含已发表miRNA序列和注释的可检索数据库。关于miRBase的进一步信息可见于下列文章,各文章全文以引用的方式并入本文:Griffiths-Jones等,miRBase:tools for microRNA genomics.NAR 2008 36(Database Issue):D154-D158;Griffiths-Jones等,miRBase:microRNA sequences,targets and gene nomenclature.NAR 2006 34(Database Issue):D140-D144;以及Griffiths-Jones,S.The microRNA Registry.NAR 2004 32(Database Issue):D109-D111。代表性miRNA包含于miRBase的第16期发行(Release16)中,其自2010年6月起可得。
根据本文所述,微RNA已知参与癌症和其它疾病并且可进行评估以用于表征样品中的表型。例如,参见,Ferracin等,Micromarkers:miRNAs in cancer diagnosis andprognosis,Exp Rev Mol Diag,2010年4月,第10卷,第3期,第297-308页;Fabbri,miRNAsas molecular biomarkers of cancer,Exp Rev Mol Diag,2010年5月,第10卷,第4期,第435-444页。分离和表征囊泡和miR的技术对于本领域的技术人员是已知的。除本文提供的方法外,另外的方法可见于2011年2月15日授权的题为“METHODS FOR ASSESSING RNAPATTERNS”的美国专利No.7,888,035,以及2010年11月30日提交的题为“METHODS ANDSYSTEMS FOR ISOLATING,STORING,AND ANALYZING VESICLES”的国际专利申请No.PCT/US2010/058461以及2011年1月13日提交的题为“DETECTION OF GASTROINTESTINALDISORDERS”的PCT/US2011/021160,各申请全文以引用的方式并入本文。
循环生物标志物
循环生物标志物包括在体液(如血液、血浆、血清)中可检测的生物标志物。循环癌症生物标志物的实例包括心肌肌钙蛋白T(cTnT)、前列腺癌的前列腺特异性抗原(PSA)以及卵巢癌的CA125。本发明的循环生物标志物包括可于体液中检测的任意适当生物标志物,其包括但不限于蛋白质、核酸(如DNA、mRNA和微RNA)、脂质、碳水化合物和代谢物。循环生物标志物可包括未与细胞相结合的生物标志物,诸如膜结合的、包埋于膜片段中的、生物复合物的部分或游离于溶液中的生物标志物。在一个实施方案中,循环生物标志物是与受试者生物液体中存在的一种或多种囊泡相关的生物标志物。
已经鉴定出用于表征各种表型的循环生物标志物。例如,参见Ahmed N,等,Proteomic-based identification of haptoglobin-1 precursor as a novelcirculating biomarker of ovarian cancer.Br.J.Cancer 2004;Mathelin等,Circulating proteinic biomarkers and breast cancer,Gynecol Obstet Fertil.2006年7-8月;34(7-8):638-46.2006年7月28日电子出版;Ye等,Recent technical strategiesto identify diagnostic biomarkers for ovarian cancer.Expert RevProteomics.2007年2月;4(1):121-31;Carney,Circulating oncoproteins HER2/neu,EGFR and CAIX(MN)as novel cancer biomarkers.Expert Rev Mol Diagn.2007年5月;7(3):309-19;Gagnon,Discovery and application of protein biomarkers for ovariancancer,Curr Opin Obstet Gynecol.2008年2月;20(1):9-13;Pasterkamp等,Immuneregulatory cells:circulating biomarker factories in cardiovasculardisease.Clin Sci(Lond).2008年8月;115(4):129-31;Fabbri,miRNAs as molecularbiomarkers of cancer,Exp Rev Mol Diag,2010年5月,Vol.10,No.4,435-444页;PCT专利公开号WO/2007/088537;美国专利7,745,150和7,655,479;美国专利公开号20110008808、20100330683、20100248290、20100222230、20100203566、20100173788、20090291932、20090239246、20090226937、20090111121、20090004687、20080261258、20080213907、20060003465、20050124071和20040096915,各公开全文以引用的方式并入本文。
囊泡富集
可以在分析之前和/或期间分离、纯化、浓缩或另外地富集囊泡或囊泡群体。除非另行说明,本文中提及囊泡或生物标志物组分而使用的术语“纯化的”或“分离的”包括这些组分从细胞或生物体的部分的或完全的纯化和分离。在分析之前可以纯化或浓缩囊泡。囊泡的分析可以包括定量生物样品的一种或多种囊泡群体的量。例如,可以对囊泡的异质群体进行定量,或者可以由囊泡的异质群体分离均质的囊泡群体(例如具有特定生物标志物分布、特定的生物印记或源自特定的细胞类型的囊泡群体),并进行定量。如本文所述,囊泡分析还可以包括定量地或定性地检测囊泡的一种或多种特定的生物标志物分布或生物印记。
囊泡可以储存和归档例如在生物流体库(bio-fluid bank)中,并根据需要取回以用于分析。此外,囊泡还可以由之前已经由活体或死亡的受试者中采集或储存的生物样品中分离得到。此外,囊泡可以由已经按照King等,Breast Cancer Res 7(5):198-204(2005)中所述收集的生物样品分离得到。囊泡可以由归档的或储存的样品分离得到。或者,囊泡可以由生物样品中分离得到并且不经储存或归档样品而进行分析。此外,第三方可以获得或储存所述生物样品,或者获得或储存所述囊泡以用于分析。
富集的囊泡群体可以由生物样品得到。例如,可以使用尺寸排阻色谱、密度梯度离心、差速离心、纳米膜超滤、免疫吸附捕获、亲和纯化、微流体分离或它们的组合来从生物样品浓缩或分离囊泡。
可以使用尺寸排阻色谱(例如凝胶渗透柱)、离心或密度梯度离心以及过滤方法。例如,可以通过差速离心、阴离子交换和/或凝胶渗透色谱(例如在美国专利No.6,899,863和6,812,023中所述的)、蔗糖密度梯度、细胞器电泳(例如在美国专利No.7,198,923中所述的)、磁激活细胞分选术(MACS)或纳米膜超滤浓缩器来分离囊泡。还可以使用分离或浓缩方法的各种结合。
高丰度蛋白质(例如白蛋白和免疫球蛋白)可能妨碍囊泡从生物样品的分离。例如,可以使用利用了多种抗体的系统来从生物样品分离外来体,所述抗体对于生物样品(例如血液)中所存在的最丰富的蛋白质是特异性的。这种系统可以一次性地除去多种蛋白质,由此显现出较低丰度的物质,例如细胞源特异性的囊泡。
这种类型的系统可以用于从生物样品(例如血液、脑脊液或尿液)分离囊泡。此外,还可以通过在Chromy等J Proteome Res 2004;3:1120-1127中所述的高丰度蛋白质的去除方法来增强生物样品中囊泡的分离。在另一个实施方案中,还可以根据Zhang等,Mol CellProteomics 2005;4:144-155所述的使用糖肽捕获去除血清蛋白质,而增强生物样品中囊泡的分离。此外,可以如Pisitkun等,Proc Natl Acad Sci U S A,2004;101:13368-13373中所述通过差速离心、然后与针对细胞质或抗细胞质的表位的抗体相接触来分离生物样品(例如尿液)的囊泡。
还可以通过使用声处理(例如通过施加超声波)或者去污剂、其它膜活化剂或它们的任何组合来增强生物样品中囊泡的分离或富集。例如,可以将超声能量施加到潜在的肿瘤位点,并且不被理论所限制,可以增加组织中囊泡的释放,从而可以使用本文公开的一种或多种方法来分析或评估来自生物样品的富集的囊泡群体。
样品处理
通过本文描述的检测循环生物标志物的方法(如抗体亲和分离),必要时可使用各种浓缩或分离程序优化所得结果的一致性。这些步骤可包括搅拌(诸如振荡或涡旋)、不同的分离技术(诸如基于聚合物如PEG的分离)和在过滤和其它步骤期间浓缩至不同水平。本领域的技术人员应当了解,这些处理可在测试包含囊泡的样品的各个不同阶段进行。在一个实施方案中,所述样品自身(如,体液,诸如血浆或血清)进行涡旋。在一些实施方案中,在一个或多个样品处理步骤(如,囊泡分离)进行之后对所述样品进行涡旋。可根据需要在一些或全部适当的样品处理步骤中进行搅拌。可在各个不同步骤中引入添加剂以改善所述处理,例如,控制目标生物标志物的聚集或降解。
还可按照需要通过使用各种不同试剂处理所述样品而优化所述结果。这些试剂包括用于控制聚集的添加剂或用于调节pH或离子强度的添加剂。控制聚集的添加剂包括封闭剂(诸如牛血清白蛋白(BSA)和牛奶)、离液剂(盐酸胍)和去污剂或表面活性剂。可用的离子型去污剂包括十二烷基硫酸钠(SDS,月桂基硫酸钠(SLS))、月桂醇聚醚硫酸钠(SLS,月桂基醚硫酸钠(SLES))、月桂基硫酸铵(ALS)、西曲溴铵(cetrimonium bromide)、西曲氯铵(cetrimonium chloride)、西曲硬脂酸铵(cetrimonium stearate)等。可用的非离子(两性离子)去污剂包括聚乙二醇、聚山梨醇酯20(亦称为吐温20)、其它聚山梨醇酯类(如40、60、65、80等)、Triton-X(如X100、X114)、3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸(CHAPS)、CHAPSO、脱氧胆酸、脱氧胆酸钠、NP-40、糖苷类、辛基-硫代葡萄糖苷、麦芽糖苷等。在一些实施方案中,Pluronic F-68(一种显示降低血小板聚集的表面活性剂)被用于在分离和/或检测期间处理包含囊泡的样品。F68可在0.1%至10%的浓度下使用,例如,1%、2.5%或5%的浓度。可使用各种酸、碱、缓冲剂或盐调节所述溶液的pH和/或离子强度,其包括但不限于,氯化钠(NaCl)、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、tris缓冲的盐水(TBS)、磷酸钠、氯化钾、磷酸钾、柠檬酸钠和盐水-柠檬酸钠(SSC)缓冲剂。在一些实施方案中,以0.1%至10%的浓度添加NaCl,例如1%、2.5%或5%的最终浓度。在一些实施方案中,以0.005%至2%的浓度添加吐温20,例如0.05%、0.25%或0.5%的最终浓度。用于本发明的封闭剂包含惰性蛋白质,如乳蛋白、脱脂干乳蛋白(non-fat dry milk protein)、白蛋白、BSA、酪蛋白或血清,诸如新生牛血清(NBCS)、山羊血清、兔血清或鲑鱼血清。所述蛋白质可以0.1%至10%的浓度加入,如1%、2%、3%、3.5%、4%、5%、6%、7%、8%、9%或10%的浓度。在一些实施方案中,BSA可以0.1%至10%的浓度加入,如1%、2%、3%、3.5%、4%、5%、6%、7%、8%、9%或10%的浓度。在一个实施方案中,根据2005年7月13日提交的美国专利申请11/632946中给出的方法处理所述样品,该申请全文以引用的方式并入本文。可使用可商购的封闭剂,诸如来自Pierce(Thermo Fisher Scientific,Rockford,IL的分部)的SuperBlock、StartingBlock、Protein-Free。在一些实施方案中,以0.1%至10%的浓度加入SSC/去污剂(如,具有0.5%的吐温20或0.1%的Triton-X 100的20X SSC),例如以1.0%或5.0%的浓度。
可根据需要使用本文所述的方案和处理的各种不同组合优化检测囊泡和其它循环生物标志物的方法。可通过搅拌、分离方法和添加剂的各种不同组合优化检测方案。在一些实施方案中,在分离步骤之前和之后涡旋患者样品,并且使用封闭剂(包括BSA和/或F68)处理所述样品。这些处理可减少大聚集物或者蛋白质或其它生物碎片的形成,并且因此提供了更为一致的检测结果输出。
过滤器
可通过以过滤模块过滤来自受试者的生物样品,并从所述过滤模块收集包含囊泡的渗余物从而从所述生物样品分离囊泡而从生物样品中分离囊泡。所述方法可包括,通过包含过滤器的过滤模块过滤来自受试者的生物样品,并从所述过滤模块收集包含囊泡的渗余物,由此而从所述生物样品分离囊泡。在一个实施方案中,所述滤器截留超过约100千道尔顿的分子。
所述方法可进一步包括测定囊泡的生物印记。所述方法还可进一步包括将渗余物应用于多种基底,其中各个基底偶联于一种或多种捕获剂,并且所述多种基底的各个亚组包含不同于所述多种基底的另一亚组的捕获剂或捕获剂组合。
本文还提供了测定样品中的囊泡生物印记的方法,其包括:通过过滤模块过滤来自患有病症的受试者的生物样品,从所述过滤模块收集包含一种或多种囊泡的渗余物,并且测定所述一种或多种囊泡的生物印记。在一个实施方案中,所述过滤模块包含截留超过约100或150千道尔顿的分子的过滤器。
本文公开的方法可进一步包括表征受试者的表型,其通过以过滤模块过滤来自受试者的生物样品,从所述过滤模块收集包含一种或多种囊泡的渗余物;检测所述一种或多种囊泡的生物印记;以及根据所述生物印记表征受试者的表型而实现,其中表征具有至少70%的灵敏度。在一些实施方案中,表征包括测定具有所述生物印记的一种或多种囊泡的量。此外,所述表征可具有约80%至100%的灵敏度。
本文还提供了用于复用多种囊泡的分析的方法。在一些实施方案中,所述方法包括通过过滤模块过滤来自受试者的生物样品;从所述过滤模块收集包含所述多种囊泡的渗余物;将所述多种囊泡应用于多种捕获剂,其中所述多种捕获剂偶联于多个基底,并且所述多个基底的各亚组与所述多种基底的另一亚组不同地差异标记;捕获所述多种囊泡的至少一个亚组;以及针对所述被捕获囊泡的至少一个亚组确定生物印记。在一个实施方案中,各个基底偶联于一种或多种捕获剂,并且所述多个基底的各个亚组包含与所述多个基底的另一亚组相比不同的捕获剂或捕获剂组合。在一些实施方案中,所述多个基底的至少一个亚组本征地标记,如包含一种或多种标记。所述基底可以是颗粒或珠,或其任意组合。在一个实施方案中,所述过滤模块包含过滤器,其截留超过约100或150千道尔顿的分子。
在一些实施方案中,用于复用多种囊泡的分析的方法包括通过过滤模块过滤来自受试者的生物样品,其中所述过滤模块包含截留超过约100千道尔顿的分子的过滤器;从所述过滤模块收集包含所述多种囊泡的渗余物;将所述多种囊泡应用于多种捕获剂,其中所述多种捕获剂偶联于微阵列;在所述微阵列上捕获所述多种囊泡的至少一个亚组;以及对于所述被捕获囊泡的至少一个亚组确定生物印记。在一个实施方案中,所述过滤模块包含过滤器,其截留超过约100或150千道尔顿的分子。
可在通过过滤进行分离之前净化所述生物样品。例如,可除去非囊泡组分如细胞碎片。所述净化可通过低速离心进行,诸如约5,000×g、4,000×g、3,000×g、2,000×g、1,000×g或更低。随后对包含所述囊泡的上清液或净化的生物样品进行收集和过滤以从所述净化生物样品分离囊泡。在一些实施方案中,生物样品在通过过滤分离囊泡之前不进行净化。
在一些实施方案中,从样品分离囊泡不使用高速离心,如超离心。例如,分离可能不需要使用诸如约100,000×g或更高的离心速度。在一些实施方案中,从样品分离囊泡使用了低于50,000×g、40,000×g、30,000×g、20,000×g、15,000×g、12,000×g或10,000×g的离心速度。
用于从样品分离囊泡的过滤模块可以是基于纤维的滤芯。例如,所述纤维可以是中空的聚合纤维,如聚丙烯中空纤维。可通过使用诸如蠕动泵这样的泵设备将样品流体(诸如本发明公开的生物流体)泵送进入所述模块,从而将生物样品引入所述过滤模块中。泵流速可变,诸如约0.25、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9或10mL/分钟。
所述过滤模块可以是膜过滤模块。例如,所述膜过滤模块可包含滤片膜,诸如装配于搅拌腔仪器(如包含磁力搅拌器)中的亲水聚偏二氟乙烯(PVDF)滤片膜。在一些实施方案中,所述样品由于在所述滤膜任一侧所建立的压力梯度而通过过滤器。
所述过滤器可包含具有低疏水吸附性和/或高亲水特性的材料。例如,所述过滤器可具有保留囊泡而透过大多数蛋白质的平均孔径以及亲水性的表面,由此限制蛋白质吸附。例如,所述过滤器可包含选自由聚丙烯、PVDF、聚乙烯、聚氟乙烯、纤维素、二醋酸纤维素、聚乙烯醇和乙烯-乙烯醇(Kuraray Co.,Okayama,Japan)组成的组的材料。可用于过滤器中的其它材料包括但不限于,聚砜和聚醚砜。
所述过滤模块可具有截留超过约50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、400或500千道尔顿(kDa)的分子的过滤器,诸如具有约50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、400或500的MWCO(分子量截止值)的过滤器。在一些实施方案中,过滤模块中的过滤器具有约0.01μm至约0.15μm的平均孔径,并且在一些实施方案中,具有约0.05μm至约0.12μm的平均孔径。在一些实施方案中,所述这滤器具有约0.06μm、0.07μm、0.08μm、0.09μm、0.1μm或0.11μm的平均孔径。
所述过滤模块可以是可商购的柱,诸如通常用于浓缩蛋白质或用于分离蛋白质的柱。实例包括但不限于,来自Millpore(Billerica,MA)的柱,诸如离心过滤器,或来自(Rockford,IL)的柱,诸如Pierce Concentrator过滤器装置。来自Pierce的可用柱包括具有9kDa、20kDa和/或150kDa的MWCO的一次性超滤离心装置。这些浓缩器由与圆锥装置结合的高性能再生纤维素膜组成。所述过滤器可以是如美国专利6,269,957或6,357,601中描述的,两个申请全文均以引用的方式并入本文。
可从所述过滤模块收集包含被分离的囊泡的渗余物。可通过从所述过滤器上冲洗所述渗余物而收集该渗余物。不受理论的束缚,选择具有亲水表面特性的过滤器组成并由此限制蛋白质吸附可用于更为简易地收集所述渗余物并且将严苛或耗时的收集技术的使用降至最低。
可如本发明进一步描述的,随后将所收集的渗余物用于随后的分析,诸如评估所述渗余物中的一种或多种囊泡的生物印记。可在所收集的渗余物上直接实施所述分析。或者,可在对一种或多种囊泡进行分析之前进一步浓缩或纯化所收集的渗余物。例如,可使用尺寸排阻色谱、密度梯度离心、差速离心、免疫吸附捕获、亲和纯化、微流体分离或它们的组合,诸如本发明描述的,进一步浓缩所述渗余物或从所述渗余物中进一步分离囊泡。在一些实施方案中,所述渗余物可进行另一步过滤。或者,在使用过滤器分离囊泡之前,使用尺寸排阻色谱、密度梯度离心、差速离心、免疫吸附捕获、亲和纯化、微流体分离或它们的组合来浓缩或分离所述囊泡。
例如,在通过具有截留超过约50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、400或500千道尔顿(kDa)的分子的过滤器(诸如具有约50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、400或500的MWCO(分子量截止值)的过滤器)的过滤模块过滤生物样品之前,可首先通过具有约0.01μm至约2μm、约0.05μm至约1.5μm的孔隙或孔径的过滤器过滤所述生物样品。在一些实施方案中,所述过滤器具有约0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或2.0μm的孔径。所述过滤器可以是针筒过滤器。因此,在一个实施方案中,所述方法包括在通过包含截留超过约100或150千道尔顿的分子的过滤器的过滤模块过滤所述样品之前通过过滤器(诸如针筒过滤器)过滤所述生物样品,其中所述针筒过滤器具有超过约1μm的孔隙。在一个实施方案中,所述过滤器是1.2μM的过滤器并且在过滤之后将所述样品通过具有150kDa截止值的7ml或20ml的浓缩器柱。
所述过滤模块可以是微流体设备的部件。亦可以称为“芯片实验室”系统、生物医学微电子机械系统(bioMEM)或多部件集成系统的微流体装置可用于分离和分析囊泡。这类系统使得允许囊泡结合、生物标志物检测的处理过程以及其它过程(诸如本发明进一步描述的过程)微型化和区室化。
微流体装置还可通过包含过滤模块而用于囊泡分离。例如,微流体装置可使用一个或多个通道以根据生物样品的大小将囊泡从生物样品分离。可将生物样品引入一个或多个微流体通道,其选择性地允许囊泡通过。所述微流体装置可进一步包含结合剂或超过一种过滤模块以根据所述囊泡的特性(例如,大小、形状、可变形性、生物标志物分布或生物印记)选择囊泡。
结合剂
结合剂是结合循环生物标志物(诸如囊泡或囊泡的组分)的试剂。所述结合剂可用作为捕获剂和/或检测剂。捕获剂可结合和捕获循环生物标志物,诸如,通过结合囊泡的组分或生物标志物而进行。例如,所述捕获剂可以是捕获抗体或捕获抗原,其结合于囊泡上的抗原。检测剂可结合于循环生物标志物,由此帮助对所述生物标志物的检测。例如,包含与基底相隔离的抗原或适体的捕获剂可用于捕获样品中的囊泡,并且包含携带标记的抗原或适体的检测剂可用于通过对检测剂的标记物的检测而检测所捕获的囊泡。在一些实施方案中,使用识别相同囊泡生物标志物的捕获剂和检测剂评估囊泡。例如,可使用四跨膜蛋白捕获囊泡群体(诸如通过使用结合于基底的抗CD9抗体),并且可使用荧光标记的抗CD9抗体标记所捕获的囊泡,从而检测所捕获的囊泡。在其它实施方案中,使用识别不同囊泡生物标志物的捕获剂和检测剂评估囊泡。例如,可使用细胞特异性标志物捕获囊泡群体(诸如通过使用结合于基底的抗PCSA抗体),并且可使用荧光标记的抗CD9抗体标记所捕获的囊泡,从而检测所捕获的囊泡。类似地,可使用一般囊泡标志物捕获囊泡群体(诸如通过使用结合于基底的抗CD9抗体),并且可使用针对细胞特异性或疾病特异性标志物的荧光标记抗体标记所捕获的囊泡,从而检测所捕获的囊泡。
在一个实施方案中,使用结合于囊泡上的生物标志物的捕获剂捕获囊泡。根据本发明进一步描述的,所述捕获剂可偶联于基底并且用于分离囊泡。在一个实施方案中,将捕获剂用于对存在于基底或样品中的囊泡的亲和捕获或分离。
可以在从生物样品中浓缩或分离囊泡之后使用结合剂。例如,在分离或检测具有特定生物印记的囊泡之前,可首先从生物样品分离囊泡。可使用所述生物标志物的结合剂分离或检测具有特定生物印记的囊泡。可从囊泡的异质群体中分离或检测具有特定生物印记的囊泡。或者,可在不进行事先的分离或浓缩步骤的情况下对包含囊泡的生物样品使用结合剂。例如,将结合剂用于直接从生物样品分离或检测具有特定生物印记的囊泡。
结合剂可以是核酸、蛋白质或可结合囊泡组分的其它分子。所述结合剂可以包含DNA、RNA、单克隆抗体、多克隆抗体、Fab、Fab'、单链抗体、合成抗体、适体(DNA/RNA)、类肽、zDNA、肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)、凝集素、合成或天然形成的化学化合物(包括但不限于药物、标记试剂)、枝状物或它们的组合。例如,所述结合剂可以是捕获抗体。在本发明的实施方案中,所述结合剂是膜蛋白标记剂。例如,参见,公开于Alroy等的美国专利公开号US2005/0158708中的膜蛋白标记剂。在一个实施方案中,根据本发明描述分离或捕获囊泡,并且将一种或多种膜蛋白标记剂用于检测所述囊泡。
在某些情况下,可以使用单一的结合剂来分离或检测囊泡。在其它情况中,可以使用不同结合剂的组合来分离或检测囊泡。例如,可以使用至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、50、75或100种不同的结合剂来从生物样品中分离或检测囊泡。此外,根据下文中进一步描述,用于囊泡的一种或多种不同的结合剂可以形成囊泡的生物印记。
还可以使用不同的结合剂来进行复用。例如,可以通过使用不同的结合剂来分离或检测各种囊泡群体从而实施多于一种囊泡群体的分离或检测。不同的结合剂可以与不同的颗粒结合,其中所述不同的颗粒被标记。在另一个实施方案中,可以将包含不同结合剂的阵列用于多重分析,其中所述不同的结合剂被差异地标记,或者可以根据结合剂在阵列上的位置来确定。可以在最高标记物或检测方法的分辨能力下完成复用,如下文中所述。可将所述结合剂用于检测囊泡,诸如用于检测细胞源特异性囊泡。一种结合剂或多种结合剂本身可形成结合剂分布,其提供了囊泡的生物印记。一种或多种结合剂可选自图2。例如,如果在囊泡的异质杂群体的囊泡的差异检测或分离中使用2种、3种、4种或更多种结合剂检测或分离囊泡群体,则所述囊泡群体的特定结合剂分布提供了该特定囊泡群体的生物印记。可使用多种结合剂以多重方式检测囊泡。因此,所述结合剂还可用于形成囊泡的生物印记。所述生物印记可用于表征表型。
所述结合剂可以是凝集素。凝集素是选择性地结合多糖和糖蛋白的蛋白质,且广泛地分布于植物和动物中。例如,为分离囊泡可使用来自雪花莲(Galanthus nivalis)的雪莲花凝集素(“GNA”)形式的凝集素、来自黄水仙(Narcissus pseudonarcissus)的黄水仙凝集素(“NPA”)形式的凝集素或来自蓝绿藻类椭孢念珠藻(Nostoc ellipsosporum)的名为“蓝藻抗病毒蛋白(cyanovirin)”的凝集素(Boyd等,Antimicrob Agents Chemother 41(7):15211530,1997;Hammar等,Ann N Y Acad Sci 724:166 169,1994;Kaku等,ArchBiochem Biophys 279(2):298 304,1990)。这些凝集素可结合于具有高甘露糖含量的糖蛋白(Chervenak等,Biochemistry 34(16):5685 5695,1995)。高甘露糖糖蛋白指的是具有α-1→3或α-1→6甘露糖-甘露糖键形式的甘露糖-甘露糖连接的糖蛋白。
所述结合剂可以是结合一种或多种凝集素的物质。凝集素捕获可应用于生物标志物组织蛋白酶D的分离,这是因为其为能够结合凝集素雪莲花凝集素(GNA)以及伴刀豆蛋白A(ConA)的糖基化蛋白质。
使用凝集素以捕获囊泡的方法和装置描述于2010年11月30日提交的题为“METHODS AND SYSTEMS FOR ISOLATING,STORING,AND ANALYZING VESICLES”的国际专利申请PCT/US2010/058461;2009年12月3日提交的题为“AFFINITY CAPTURE OF CIRCULATINGBIOMARKERS”的PCT/US2009/066626;2010年6月4日提交的题为“METHODS AND MATERIALSFOR ISOLATING EXOSOMES”的PCT/US2010/037467;以及2007年3月9日提交的题为“EXTRACORPOREAL REMOVAL OF MICROVESICULAR PARTICLES”的PCT/US2007/006101,各个申请全文均以引用的方式并入本文。
结合剂可以为抗体。例如,可以使用对囊泡上存在的一种或多种抗原具有特异性的一种或多种抗体来分离囊泡。例如,囊泡可在其表面上具有CD63,并且针对CD63的抗体或捕获抗体可以用于分离所述囊泡。或者,源自肿瘤细胞的囊泡可表达EpCam,可以使用针对EpCam和CD63的抗体来分离所述囊泡。用于分离囊泡的其它抗体可包括针对CD9、PSCA、TNFR、CD63、B7H3、MFG-E8、EpCam、Rab、CD81、STEAP、PCSA、PSMA或5T4的抗体或捕获抗体。用于分离囊泡的其它抗体可包括针对DR3、STEAP、epha2、TMEM211、MFG-E8、组织因子(TF)、unc93A、A33、CD24、NGAL、EpCam、MUC17、TROP2或TETS的抗体或捕获抗体。
在一些实施方案中,所述捕获剂是针对CD9、CD63、CD81、PSMA、PCSA、B7H3、EpCam、PSCA、ICAM、STEAP或EGFR的抗体。捕获剂还可用于鉴定囊泡的生物标志物。例如,捕获剂如针对CD9的抗体识别CD9作为囊泡的生物标志物。在一些实施方案中可使用多种捕获剂,诸如在多重分析中。所述多种捕获剂可包括针对CD9、CD63、CD81、PSMA、PCSA、B7H3、EpCam、PSCA、ICAM、STEAP和EGFR中的一种或多种的结合剂。在一些实施方案中,所述多种捕获剂包括针对CD9、CD63、CD81、PSMA、PCSA、B7H3、MFG-E8和/或EpCam的结合剂。在又其它的实施方案中,所述多种捕获剂包括针对CD9、CD63、CD81、PSMA、PCSA、B7H3、EpCam、PSCA、ICAM、STEAP和/或EpCam的结合剂。所述多种捕获剂包括针对TMEM211、MFG-E8、组织因子(TF)和/或CD24的结合剂。
本文所提及的抗体可以为免疫球蛋白分子或免疫球蛋白分子的免疫活性部分,即,包含特异性地结合抗原的抗原结合位点的分子和合成抗体。免疫球蛋白分子可以为免疫球蛋白分子的任何种类(例如IgG、IgE、IgM、IgD或IgA)或亚类。抗体包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、双特异性抗体、合成抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单链抗体、Fab片段和F(ab')2片段、Fv或Fv'部分、由Fab表达文库产生的片段、抗独特型(抗-Id)抗体或者上文所述的任意抗体的表位结合片段。如果抗体优先地与抗原结合,并且例如与另一种分子具有低于约30%、20%、10%、5%或1%的交叉反应性,则该抗体,或者通常情况下的任何分子,“特异性地结合”抗原(或其它分子)。
结合剂还可以为多肽或肽。多肽以最广义的理解使用,并且可以包括亚单元氨基酸、氨基酸类似物或拟肽的序列。所述的亚单元可以通过肽键连接。所述的多肽可以为天然存在的、天然存在多肽的加工形式(例如通过酶促消化)、化学合成的多肽或重组表达的。可以使用标准的技术对用于本发明的方法中的多肽进行化学合成。所述的多肽可以包含D-氨基酸(其对L-氨基酸特异性蛋白酶具有抗性)、D-和L-氨基酸的组合、β氨基酸或各种其它设计或非天然存在的氨基酸(例如β-甲基氨基酸、Cα-甲基氨基酸和Nα-甲基氨基酸等),从而赋予特定的性质。合成的氨基酸可以包括对应赖氨酸的鸟氨酸及对应亮氨酸或异亮氨酸的正亮氨酸。此外,所述的多肽可以具有拟肽键,例如酯键,从而制备具有新性质的多肽。例如,可以生成引入了还原肽键(即,R1-CH2-NH-R2,其中R1和R2为氨基酸残基或序列)的多肽。可以将还原肽键作为二肽亚单元引入。这种多肽对蛋白酶活性具有抗性,并且在体内具有延长的半衰期。多肽还可以包括类肽(N-取代的甘氨酸),其中侧链连接到分子主链上的氮原子上,而并非如在氨基酸中一样与α-碳相连。在本申请的全文中,多肽和肽意图可互换地使用,即,在使用术语肽的情况下,其还可以包括多肽,而在使用术语多肽的情况下,其还可包括肽。
可使用结合剂分离、捕获或检测囊泡。所述结合剂可以是结合囊泡“管家蛋白(housekeeping protein)”或一般囊泡生物标志物的物质。所述生物标志物可以为CD63、CD9、CD81、CD82、CD37、CD53、Rab-5b、膜联蛋白V或MFG-E8。四跨膜蛋白,具有四个跨膜结构域的膜蛋白家族,可用作为一般囊泡标志物。所述四跨膜蛋白包括CD151、CD53、CD37、CD82、CD81、CD9和CD63。哺乳动物中已经鉴定了超过30种四跨膜蛋白,其包括TSPAN1(TSP-1)、TSPAN2(TSP-2)、TSPAN3(TSP-3)、TSPAN4(TSP-4、NAG-2)、TSPAN5(TSP-5)、TSPAN6(TSP-6)、TSPAN7(CD231、TALLA-1、A15)、TSPAN8(CO-029)、TSPAN9(NET-5)、TSPAN10(视素蛋白(Oculospanin))、TSPAN11(CD151样)、TSPAN12(NET-2)、TSPAN13(NET-6)、TSPAN14、TSPAN15(NET-7)、TSPAN16(TM4-B)、TSPAN17、TSPAN18、TSPAN19、TSPAN20(UP1b、UPK1B)、TSPAN21(UP1a、UPK1A)、TSPAN22(RDS、PRPH2)、TSPAN23(ROM1)、TSPAN24(CD151)、TSPAN25(CD53)、TSPAN26(CD37)、TSPAN27(CD82)、TSPAN28(CD81)、TSPAN29(CD9)、TSPAN30(CD63)、TSPAN31(SAS)、TSPAN32(TSSC6)、TSPAN33和TSPAN34。其它常见的囊泡标志物包括表3中列出的标志物。可使用任意这些蛋白质作为囊泡标志物。
表3:来自多细胞类型的囊泡中观察到的蛋白质
所述结合剂还可以是结合源自特定细胞类型(诸如肿瘤细胞)(如,针对组织因子、EpCam、B7H3或CD24的结合剂)或特定细胞源的囊泡的物质。用于分离或检测囊泡的结合剂可以是针对选自图1中的抗原的结合剂。囊泡的结合剂还可选自图2中列出的结合剂。所述结合剂可以针对抗原,诸如四跨膜蛋白、MFG-E8、膜联蛋白V、5T4、B7H3、小窝蛋白(caveolin)、CD63、CD9、E-钙粘蛋白、组织因子、MFG-E8、TMEM211、CD24、PSCA、PCSA、PSMA、Rab-5B、STEAP、TNFR1、CD81、EpCam、CD59、CD81、ICAM、EGFR或CD66。用于血小板的结合剂可以是糖蛋白,诸如GpIa-IIa、GpIIb-IIIa、GpIIIb、GpIb或GpIX。可以使用一种或多种结合剂(例如针对两种或更多种抗原的一种或多种结合剂)来分离或检测囊泡。可以根据分离或检测衍生自特定细胞类型的囊泡或细胞源特异性囊泡的需要来选择所用的结合剂。
可以使用一种或多种结合剂(例如针对两种或更多种抗原的一种或多种结合剂)来分离或检测囊泡。可以根据分离或检测源自特定细胞类型的囊泡或细胞源特异性囊泡的需要来选择所用的结合剂。
结合剂还可以与固体表面或基底直接或间接连接。固体表面或基底可以是结合剂可直接或间接附接的任意可物理分离的固体,包括但不限于通过微阵列和孔、颗粒(例如珠)、柱、光纤、拭子、玻璃和改性的或功能化的玻璃、石英、云母、重氮化的膜(纸或尼龙)、聚甲醛、纤维素、醋酸纤维素、纸、陶瓷、金属、类金属、半导体材料、量子点、涂敷的珠或颗粒、其它色谱材料、磁性颗粒所提供的表面;塑料(包括丙烯酸类、聚苯乙烯、苯乙烯或其它材料的共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚亚安酯、TEFLONTM等)、多糖、尼龙或硝基纤维素、树脂、二氧化硅或基于二氧化硅的材料(包括硅和改性硅)、碳、金属、无机玻璃、塑料、陶瓷、导电聚合物(包括诸如聚吡咯和聚吲哚这样的聚合物)所提供的表面;微结构或纳米结构的表面,例如核酸铺盖的阵列、纳米管、纳米线或者纳米颗粒装饰的表面;或者多孔表面或凝胶,例如甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、糖聚合物、纤维素、硅酸盐或者其它纤维状或链状聚合物。此外,如本领域中已知的,可以使用具有多种材质(包括聚合物,如右旋糖苷、丙烯酰胺、明胶或琼脂糖)的钝化或化学衍生化的涂层来涂敷基底。这些涂层可以有助于将阵列用于生物样品。
例如,用于分离囊泡的抗体可以结合于固体基底如孔,如市售可得的平板(例如得自Nunc,Milan,Italy)。可以使用抗体涂覆各孔。在一些实施方案中,用于分离囊泡的抗体与诸如阵列的固体基底结合。所述的阵列可以具有预定的分子相互作用、结合岛、生物分子、区带、域的空间排列,或者结合岛或者分布于离散区域内的结合剂的空间排列。此外,术语阵列在本文中可以用于指在表面上排列的多阵列,例如可以为表面上具有阵列的多个拷贝的情况。这种具有多阵列的表面还可以称为多重阵列或重复阵列。
结合剂还可以与颗粒结合,例如珠或微球。例如,对囊泡成分具有特异性的抗体可以与颗粒结合,并且抗体结合的颗粒可以用于从生物样品分离囊泡。在一些实施方案中,所述的微球可以为磁性的或荧光标记的。此外,用于分离囊泡的结合剂可以为固体基底本身。例如,可以使用胶乳珠,例如醛/硫酸盐珠(Interfacial Dynamics,Portland,OR)。
此外,还可以使用与磁珠结合的结合剂来分离囊泡。例如,可以收集来自患者的生物样品(例如血清)以用于结肠癌筛查。所述的样品可以与偶联到磁微珠上的抗-CCSA-3(结肠癌特异性抗原)一起孵育。低密度的微柱可以放置在MACS分离器的磁场中,然后用缓冲溶液(例如Tris缓冲盐水)洗涤该柱。然后,将磁性免疫复合物施加到柱上,并丢弃未结合的非特异性的物质。可以通过从分离器中移除柱并将其放置在收集管上来回收CCSA-3选择的囊泡。可以将缓冲剂加入到所述的柱上,并可以通过施加与该柱一起提供的柱塞来释放磁性标记的囊泡。可以在IgG洗脱缓冲液中稀释分离的囊泡,然后将复合物离心从而将微珠与囊泡分离。可将分离的细胞源特异性囊泡的沉淀重悬浮于缓冲液(例如磷酸盐缓冲盐水)中,并进行定量。或者,由于抗体捕获的细胞源特异性囊泡与磁微珠之间的强吸附力,可以使用蛋白水解酶(例如胰蛋白酶)来释放捕获的囊泡而无需离心。可以将蛋白水解酶与抗体捕获的细胞源特异性囊泡一起孵育足以释放所述囊泡的时间。
用于分离囊泡的结合剂(例如抗体)优选地与包含目标囊泡的生物样品接触持续至少足以使所述结合剂结合所述囊泡的成分的时间。例如,抗体可以与生物样品接触由数秒至数天的各种时间段,包括但不限于约10分钟、30分钟、1小时、3小时、5小时、7小时、10小时、15小时、1天、3天、7天或10天。
结合剂(例如对图1中所列的抗原具有特异性的抗体或者图2中所列的结合剂)可以用包括但不限于以下的物质标记:磁性标记物、荧光部分、酶、化学发光探针、金属颗粒、非金属胶状颗粒、聚合物染料颗粒、颜料分子、颜料颗粒、电化学活性物质、半导体纳米晶体或其它纳米颗粒(包括量子点或金颗粒)。所述的标记物可以为但不限于荧光团、量子点或放射性标记物。例如,所述的标记物可以为放射性同位素(放射性核素),例如3H、11C、14C、18F、32P、35S、64Cu、68Ga、86Y、99Tc、111In、123I、124I、125I、131I、133Xe、177Lu、211At或213Bi。所述的标记物可以为荧光标记物,例如稀土螯合物(铕螯合物);荧光素类,例如但不限于FITC、5-羧基荧光素、6-羧基荧光素;罗丹明类,例如但不限于TAMRA;丹酰;丽丝胺(Lissamine);花青素;藻红蛋白;德克萨斯红;以及它们的类似物。所述荧光标记物可以是FAM、dRHO、5-FAM、6FAM、dR6G、JOE、HEX、VIC、TET、dTAMRA、TAMRA、NED、dROX、PET、BHQ、Gold540和LIZ中的一种或多种。
结合剂可以直接或间接标记,例如,所述的标记物通过生物素-抗生蛋白链菌素与抗体连接。或者,抗体未经标记,而是随后在第一抗体与目奈抗原结合后与标记的第二抗体接触。
例如,各种酶-底物标记物是可得的或被公开的(例如参见美国专利No.4,275,149)。酶通常催化发色底物的化学改变,所述改变可以使用各种技术测量。例如,酶可以催化底物的颜色变化,其可进行分光光度法测量。或者,酶可以改变底物的荧光或化学发光。酶标记物的实例包括荧光素酶(例如萤火虫荧光素酶和细菌荧光素酶;美国专利No.4,737,456)、荧光素、2,3-二氢酞嗪二酮、苹果酸脱氢酶、脲酶、过氧化物酶(例如辣根过氧化物酶(HRP))、碱性磷酸酶(AP)、β-半乳糖苷酶、葡萄糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶以及葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)、杂环氧化酶(例如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶)、乳过氧化物酶、微过氧化物酶等。酶-底物组合的实例包括但不限于:使用过氧化氢酶作为底物的辣根过氧化物酶(HRP),其中过氧化氢酶氧化染料前体(例如邻苯二胺(OPD)或3,3',5,5'-四甲基联苯胺盐酸盐(TMB));使用对硝基苯基磷酸盐作为发色体底物的碱性磷酸酶(AP);以及使用发色体底物(例如对硝基苯基-β-D-半乳糖苷酶)或发荧光底物(4-甲基伞形基-β-D-半乳糖苷酶)的β-D-半乳糖苷酶(β-D-Gal)。
根据所用的分离或检测方法,所述的结合剂可以与固体表面或基底(例如阵列、颗粒、孔和上文所述的其它基底)连接。用于将抗体与细胞表面直接化学偶联的方法在本领域中是已知,并且可以包括(例如)使用戊二醛或马来酰亚胺活化的抗体进行偶联。用于使用多步过程进行化学偶联的方法包括生物素化、使用(例如)三硝基苯酚(TNP)或地高辛配基的琥珀酰亚胺酯来偶联这些化合物。可以通过(例如)使用D-生物素基-N-羟基琥珀酰亚胺来完成生物素化。琥珀酰亚胺基团在pH值高于7,并且优选在约pH 8.0至约pH 8.5之间的条件下与氨基基团有效地反应。可以通过(例如)使用二硫苏糖醇处理细胞然后加入生物素马来酰亚胺而完成生物素化。
流式细胞分析
还可以使用流式细胞分析来实施使用颗粒如珠或微球对囊泡的分离或检测。可以使用流式细胞分析来分选悬浮于流体流中的微观颗粒。当颗粒通过时,它们可以选择性地带电并在它们离开时可以偏转到独立的流路径中。因此,有可能以高度的精确性和速度分离来自原始混合物(例如生物样品)的群体。流式细胞分析允许对流过光学/电子检测装置的单细胞的物理和/或化学特征同时进行多参数分析。单频率(颜色)的光束(通常为激光)指向在流体动力学聚焦的流体流上。多个检测器瞄准于流体流经过光束的点;一个与该光束重合(正向散射或FSC)并且几个垂直于该光束(侧向散射或SSC)以及一种或多种荧光检测器。
通过光束的各悬浮颗粒以某种方式散射光线,并且颗粒中的荧光化学物质可以被激发以发射频率低于光源的光。散射光与荧光的这种组合被检测器所拾取,并通过分析各检测器(各个荧光发射峰的一个检测器)处亮度的波动,有可能推断关于各单个颗粒的物理和化学结构的各种因素。FSC与单元尺寸相关,而SSC取决于微粒的内部复杂性,例如细胞核的形状、细胞质颗粒物的量和类型或者膜的粗糙度。一些流式细胞仪无需荧光而仅使用光散射来进行测量。
流式细胞仪可以以“实时”的方式每秒分析几千个颗粒,并且可以主动地分开并分离具有指定性质的颗粒。它们提供了在各分析阶段中对于大量单一细胞的设定参数的高通量的自动化的定量和分离。流式细胞仪可以具有多个激光和荧光检测器,从而允许使用多种标记物以按照目标群体的表型更精确地对其加以指定。因此,流式细胞仪(诸如多色流式细胞仪)可用于检测具有多种荧光标记或颜色的一种或多种囊泡。在一些实施方案中,所述流式细胞仪还可分选或分离不同囊泡群体,诸如根据大小或根据不同的标志物。
所述流式细胞仪可具有一种或多种激光,诸如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种激光。在一些实施方案中,所述流式细胞仪可检测多于一种颜色或荧光标记,诸如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种不同颜色或荧光标记。例如,所述流式细胞仪可具有至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个荧光检测器。
可用于检测或分析一种或多种囊泡、用于分选或分离不同的囊泡群体的商购可得的流式细胞仪的实例包括但不限于MoFloTM XDP Cell Sorter(Beckman Coulter,Brea,CA)、MoFloTM Legacy Cell Sorter(Beckman Coulter,Brea,CA)、BD FACSAriaTM CellSorter(BD Biosciences,San Jose,CA)、BDTM LSRII(BD Biosciences,San Jose,CA)以及BD FACSCaliburTM(BD Biosciences,San Jose,CA)。根据下文进一步描述的,使用多色或多荧光细胞计数仪可用于囊泡的多重分析。在一些实施方案中,所述流式细胞仪可分选,并且因此根据一种或多种特征收集或分选超过一种囊泡群体。例如,两种囊泡群体在大小上不同,从而使各个群体中的囊泡具有相似的大小范围并且可被差异地检测或分选。在另一个实施方案中,两种不同的囊泡群体进行差异标记。
可将得自流式细胞仪的数据以1维的方式作图从而得到柱状图,或者以2维的方式如点状图或使用较新的软件以3维方式作图。这些点上的区域可以通过一系列亚提取步骤(其称为门控)来顺序分离。存在用于诊断和临床目的的特定的门控方案,特别是涉及血液学。这些作图通常以对数比例完成。因为不同荧光染料的发射谱重叠,所以在检测器处的信号不得不通过电学以及计算方式来补偿。用于标记生物标志物的荧光团可包括Ormerod,Flow Cytometry第2版,Springer-Verlag,New York(1999)和Nida等,GynecologicOncology 2005;4 889-894中所述的荧光团,其以引用的方式并入本文。
多复分析
多重实验包括可在单一分析中同时测量多种分析物的实验。可以以多重方式评估囊泡和相关生物标志物。不同的结合剂可以用于复用不同的囊泡群体。可以使用不同的结合剂来分离或检测不同的囊泡群体。可以使用不同的信号标记物(例如荧光团、量子点或放射性标记物,如上文所描述的)标记生物样品中的各群体。所述的标记物可以与结合剂直接偶联,或者间接用于检测结合囊泡的结合剂。在多重分析中检测的群体数量取决于标记物的分辨能力和信号的总和,因为与两种或更多种亲和元件结合的两种以上的差异标记的囊泡群体可以产生总和的信号。
可以进行至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、50、75或100种不同的囊泡群体的复用。例如,对细胞源具有特异性的一种囊泡群体可以与对不同细胞源具有特异性的第二种囊泡群体一起分析,其中各群体以不同标记物标记。或者,具有特定的生物标志物或生物印记的囊泡群体可以与具有不同生物标志物或生物印记的第二种囊泡群体一起分析。在某些情况下,可在单一分析中评估数百种或数千种囊泡。
在一个实施方案中,通过将包含多于一种囊泡群体的多种囊泡施加到多个基底(例如珠)上来进行多重分析。各珠与一种或多种捕获剂偶联。将多个珠分为亚组,其中具有相同捕获剂或捕获剂组合的珠形成珠的亚组,从而使珠的各个亚组具有不同于另一个珠亚组的捕获剂或捕获剂组合。然后,所述的珠可以用于捕获包含与所述捕获剂相结合的成分的囊泡。所述不同亚组可以用于捕获不同的囊泡群体。然后,可以通过检测一种或多种生物标志物来分析捕获的囊泡。
流式细胞仪可以与基于颗粒或基于珠的分析方法组合使用。可以使用多参数免疫分析方法或其它高通量的检测分析方法(其使用具有同源配基的珠涂层以及具有与高度灵敏度自动化技术相容的特异活性的报告分子)。例如,各亚组中的珠与另一亚组的珠是差异标记的。在基于颗粒的分析系统中,用于囊泡的结合剂或捕获剂(例如捕获抗体)可以固定于可编址的珠或微球上。用于各单个结合分析(例如当结合剂为抗体时的免疫测定)的各结合剂可以与截然不同类型的微球(即,微珠)偶联,并且结合分析反应发生在微球的表面上。微球可以根据不同的标记物而相区别,例如与具有不同捕获剂的另一种微球相比,具有特定捕获剂的微球具有不同的信号标记物。例如,微球可以染色为具有离散的荧光强度,从而使得具有特定结合剂的微球的荧光强度不同于具有不同结合剂的另一种微球的荧光强度。
所述的微球可以使用至少2种不同的标记物或染料进行标记或染色。在一些实施方案中,使用至少3、4、5、6、7、8、9或10种不同的标记物对所述的微球进行标记。多种微球中的不同微球可以具有多于一种的标记物或染料,其中各种微球亚组具有不同比例和组成的标记物或染料,从而可以检测具有不同结合剂的不同微球。例如,各种不同比例和组成的标记物和染料可以允许不同的荧光强度。或者,各种不同比例和组成可以用于产生不同的检测模式以鉴定结合剂。所述的微球可进行外部标记或染色,或者可以具有内在的荧光或信号标记。珠可以单独地加载它们合适的结合剂,并因此可以根据差异标记的微球(不同的结合剂与其偶联)上的不同结合剂来分离不同的囊泡群体。
在另一个实施方案中,可以使用平面基底进行多重分析,其中所述的基底包含多种捕获剂。所述的多种捕获剂可以捕获一种或多种囊泡群体,并检测所捕获囊泡的一种或多种生物标志物。根据下文进一步描述的,平面基底可以为微阵列或其它基底。
新型结合剂
可以使用针对囊泡的新型成分的结合剂(例如对于目标囊泡特异性的新抗原的抗体)来分离或检测囊泡。可以使用与基底(例如阵列或多个颗粒)结合的已知组成的不同测试化合物来分离或鉴别目标囊泡特异性的新抗原,其可以允许仅使用小部分空间而对大量的化学/结构空间进行充分取样。所鉴定的新抗原还可作为所述囊泡的生物标志物发挥作用。例如,针对细胞源特异性的囊泡鉴定的新抗原可以为有用的生物标志物。
可以通过针对测试化合物筛选均质的或异质的囊泡群体来鉴定结合剂。由于基底表面上各测试化合物的组成是已知的,所以这构成了对亲和性元件的筛选。例如,测试化合物阵列在基底可编址位置上的特定位置处包含测试化合物,并可以用于鉴定用于囊泡的一种或多种结合剂。基于核心序列或结构的较小变化,测试化合物全部都可以是不相关的或者是相关的。不同的测试化合物可以包括给定测试化合物的变体(例如多肽的异型体)、结构上或组成上不相关的测试化合物或它们的组合。
测试化合物可以是类肽、多糖、有机化合物、无机化合物、聚合物、脂质、核酸、多肽、抗体、蛋白质、多糖或其它化合物。所述的测试化合物可以为天然的或合成的。所述的测试化合物可以包含基于多种键或键组合(例如酰胺、酯、醚、硫醇、自由基加成、金属配位等)的线性或分支的杂聚合化合物、枝状结构、环状结构、腔结构或者具有多个临近的连接位点从而在进行特定的加成时起到支架作用的其它结构,或者由它们组成。可以使用本领域中的标准方法将测试化合物点样于基底上或进行原位合成。此外,所述的测试化合物可以以组合方式进行点样或原位合成以检测有用的相互作用,例如协同结合。
所述的测试化合物可以为具有已知的氨基酸序列的多肽,因此,对测试化合物与囊泡的结合进行检测可以实现对可以用作结合剂的已知氨基酸序列的多肽的鉴定。例如,可以将囊泡的均质群体施加到载玻片(包含数种至1,000,000种具有可变氨基酸长度的测试多肽)上的点样阵列上。所述的多肽可以通过C-末端与表面连接。所述多肽序列可以由19种氨基酸(不包括半胱氨酸)随机生成。结合反应可以包括非特异性的竞争剂(例如使用另一种染料标记的过量的细菌蛋白质),从而可以测定针对各多肽结合靶的特异性比率。可以选择具有最高特异性和结合的多肽。各点上多肽的身份是已知的,且由此可以容易地鉴定。一旦鉴定出对所述均质囊泡群体(例如细胞源特异性囊泡)具有特异性的新抗原,则随后在下文所述的方法中可以使用这些抗原分离这类细胞源特异性囊泡。
此外,还可以使用阵列来鉴定作为囊泡结合剂的抗体。测试抗体可以与阵列连接,并针对异质囊泡群体进行筛选,以鉴定可以用于分离或鉴定囊泡的抗体。此外,还可以使用抗体阵列来筛选均质的囊泡群体(例如细胞源特异性囊泡)。除了鉴定抗体以分离或检测均质的囊泡群体之外,还可以鉴定对均质的群体具有特异性的一种或多种蛋白质生物标志物。可以使用市售可得的平台,其具有连接于所述阵列的预选的测试抗体或定制选择的测试抗体。例如,可以使用前列腺癌细胞源的囊泡来筛选来自Full Moon Biosystems的抗体阵列,其将针对Bcl-XL、ERCC1、角蛋白15、CD81/TAPA-1、CD9、上皮特异性抗原(ESA)和肥大细胞糜蛋白酶的抗体鉴定为结合剂(例如参见图62),并且所鉴定的蛋白质可以用作所述囊泡的生物标志物。
还可以通过肽阵列鉴定待用作结合剂的抗体或合成抗体。另一种方法是使用通过抗体噬菌体展示产生合成抗体。抗体(例如Fab)的M13噬菌体文库作为外壳蛋白的融合体呈现在噬菌体颗粒的表面上。各噬菌体颗粒呈现独特的抗体,并且还包封了包含编码DNA的载体。可以构建高度多样的文库,并作为噬菌体库而表示,其可以用于选择结合固定的抗原的抗体。固定的抗原保持了抗原结合噬菌体,而未结合的噬菌体通过洗涤除去。可以通过大肠杆菌宿主的感染来扩增保持的噬菌体库,并可将扩增的库用于另外若干轮次的选择,从而最终得到抗原结合克隆占优势的群体。在这一阶段,可以分离单个噬菌体克隆并进行DNA测序,从而解码抽呈现的抗体的序列。通过使用噬菌体展示以及本领域中已知的其它方法,可以产生针对囊泡的高亲和性设计抗体。
此外,基于珠的分析还可以用于鉴定新型结合剂以分离或检测囊泡。测试抗体或肽可以与颗粒偶联。例如,珠可以与抗体或肽偶联,并用于检测和定量在囊泡群体的表面上表达的蛋白质,从而发现并特异性地选择可以靶向来自特定组织或肿瘤类型的囊泡的新型抗体。可以通过使用市售可得的试剂盒根据制造商提供的说明书使器官源(organicorigin)的任何分子顺利地与聚苯乙烯珠偶联。各珠的组都可以以特定可检测的波长发色,并且各组都可以与已知的抗体或肽连接,其中所述的抗体或肽可以用于特异性地测量哪些珠与外来体蛋白质连接,从而与之前偶联的抗体或肽的表位相匹配。所述的珠可以离散的荧光强度染色,使得具有不同强度的各个珠具有上文所述的不同结合剂。
例如,根据经验确定的动态分析范围,可以将纯化的囊泡制剂在分析缓冲液中稀释至合适的浓度。可以制备足量体积的偶联珠,并将大约1μl的抗体偶联珠等分至孔中和调节至最终体积约50μl。一旦将抗体偶联的珠加入到真空相容性板中,可对该珠进行洗涤以确保合适的结合条件。然后,可以将适量体积的囊泡制剂加入到待测定的各孔中并孵育所述混合物,例如15-18小时。可以使用检测抗体稀释溶液制备足量体积的检测抗体,并与所述混合物孵育1小时或所需的时间。随后,在加入由抗生蛋白链菌素藻红蛋白构成的检测抗体(表达生物素)混合物之前洗涤所述珠。然后,可以洗涤珠,并真空抽吸几次,然后使用与仪器一起提供的软件在悬液阵列系统上进行分析。之后,可以从该分析阐明可用于选择性地提取囊泡的抗原的身份。
使用了成像系统的分析可以用于检测并定量在囊泡的表面上表达的蛋白质,从而发现并特异性地选择和富集来自特定组织、细胞或肿瘤类型的囊泡。可以使用与多孔复合碳涂覆板偶联的抗体、肽或细胞。可以通过使用列于图案化的碳工作表面上的捕获抗体对孔中的多种分析物进行同时测量。然后,可以在具有增强电-化学发光板的电极孔中,使用标记有试剂的抗体检测分析物。器官源的任何分子可以顺利地与所述碳涂覆板偶联。可以通过该分析鉴定出囊泡表面上表达的蛋白质,并可将其作为靶标用于特异性地选择和富集来自特定组织或肿瘤类型的囊泡。
所述结合剂还可以为适体,其指的是可与其互补序列之外的分子结合的核酸。适体一般包含30-80个核酸并且对于特定的靶分子具有高亲和性(所报道的Kd介于10-11-10-6摩尔/1)。可以使用指数富集的配体系统进化(SELEX)技术鉴定用于靶的适体(Tuerk&Gold,Science 249:505-510,1990;Ellington&Szostak,Nature 346:818-822,1990),例如在美国专利No.5,270,163,6,482,594,6,291,184,6,376,190以及US 6,458,539中所述的。可以将核酸文库与目标囊泡相接触,并将特异性地与所述靶结合的那些核酸与文库中剩余的核酸(其不能特异性地结合所述靶)分开。将分开的核酸扩增以产生配体富集库。多轮的结合、分开和扩增(即,选择)实现了对具有所需活性的一种或多种适体的鉴定。用于鉴定适体从而分离囊泡的另一种方法在美国专利No.6,376,190中有所描述,所述文献描述了通过文库中核酸与化学合成的肽的结合而使得该核酸的频率增加或降低。还可以使用改进的方法,例如在美国专利公开No.20090264508中所描述的Laser SELEX或deSELEX。
微流体装置
用于分离或鉴定囊泡的方法可以与微流体装置组合使用。可以使用微流体装置实施诸如本文所述的分离或检测囊泡的方法。亦可称为“芯片实验室”系统、生物医学微电子机械系统(bioMEM)或多部件集成系统的微流体装置可用于分离和分析囊泡。这类系统使得允许囊泡结合、生物标志物检测的过程以及其它过程微型化和区室化。
微流体装置还可以用于通过大小差异或亲和性选择来分离囊泡。例如,微流体装置可以根据大小或者通过使用用于从生物样品分离囊泡的一种或多种结合剂而使用用于从生物样品分离囊泡的一个或多个通道。可以将生物样品引入到一个或多个微流体通道中,其选择性地允许囊泡通过。可以根据囊泡的性质(例如囊泡的大小、形状、可变形性或生物印记)来进行选择。
在一个实施方案中,可以将囊泡的异质群体引入到微流体装置中,并可以得到一种或多种不同的均质囊泡群体。例如,不同的通道可以具有不同的大小选择或结合剂以选择不同的囊泡群体。因此,微流体装置可以分离多种囊泡,其中该多种囊泡的至少一个亚组包含不同于所述多种囊泡的另一个亚组的生物印记。例如,所述的微流体装置可以分离至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90或100个不同的囊泡亚组,其中各囊泡亚组包含不同的生物印记。
在一些实施方案中,所述的微流体装置可以包含允许囊泡的进一步富集或选择的一个或多个通道。在通过第一通道后已经富集的囊泡群体可以被引入到第二通道中,其允许所需囊泡或囊泡群体通过以进一步富集,例如经过存在于第二通道中的一种或多种结合剂。
可以与微流体装置一起使用基于阵列的分析和基于珠的分析。例如,结合剂可以与珠偶联,并且可以在微流体装置中实施所述珠与囊泡之间的结合反应。此外,还可以使用微流体装置进行复用。不同的区室可以包含针对不同的囊泡群体的不同结合剂,其中各群体为不同细胞源特异性的囊泡群体。在一个实施方案中,各群体具有不同的生物印记。可以在微流体装置中实施微球与囊泡之间的杂交反应,并且反应混合物可以被输递到检测装置中。所述的检测装置(例如双或多激光检测系统)可以为所述微流体系统的一部分,并且可以通过珠或微球的色彩编码使用激光来鉴定各珠或微球,而另一束激光可以检测与各珠相关的杂交信号。
可用于囊泡或经适应以用于囊泡的微流体装置的实例包括但不限于描述于美国专利No.7,591,936、7,581,429、7,579,136、7,575,722、7,568,399、7,552,741、7,544,506、7,541,578、7,518,726、7,488,596、7,485,214、7,467,928、7,452,713、7,452,509、7,449,096、7,431,887、7,422,725、7,422,669、7,419,822、7,419,639、7,413,709、7,411,184、7,402,229、7,390,463、7,381,471、7,357,864、7,351,592、7,351,380、7,338,637、7,329,391、7,323,140、7,261,824、7,258,837、7,253,003、7,238,324、7,238,255、7,233,865、7,229,538、7,201,881、7,195,986、7,189,581、7,189,580、7,189,368、7,141,978、7,138,062、7,135,147、7,125,711、7,118,910、7,118,661、7,640,947、7,666,361、7,704,735;以及国际专利公开号WO 2010/072410中的那些装置;各专利或申请全文以引用的方式并入本文。用于本发明所公开方法的另一实例描述于Chen等,“Microfluidic isolation andtranscriptome analysis of serum vesicles,”Lab on a Chip,2009年12月8日DOI:10.1039/b916199f中。
在一个实施方案中,用于分离或检测囊泡的微流体装置包括宽度上于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55或60mm或者宽度介于2-60、3-50、3-40、3-30、3-20或4-20mm之间的通道。微通道可具有小于约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、45、50、55、60、65或70μm或者介于约10-70、10-40、15-35或20-30μm的深度。此外,微通道具有小于约1、2、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10cm的长度。所述微流体装置可在其顶板上具有沟槽,其宽度小于约40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、65、70、75或80μm或介于约40-80、40-70、40-60或45-55μm之间。所述沟槽的深度可小于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45或50μm,如介于约1-50、5-40、5-30、3-20或5-15μm之间。
所述微流体装置可具有连接于通道表面或存在于通道中的一种或多种结合剂。例如,所述微通道可具有一种或多种捕获剂,诸如针对EpCam、CD9、PCSA、CD63、CD81、PSMA、B7H3、PSCA、ICAM、STEAP和EGFR的捕获剂。在一个实施方案中,微通道表面用抗生物素蛋白处理,并且可向所述通道中注入经生物素化的捕获剂(诸如抗体)以结合抗生物素蛋白。
可将生物样品流入所述微流体装置或微通道中,其流速为如至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45或50μl每分钟,如介于约1-50、5-40、5-30、3-20或5-15μl每分钟之间。所述微流体装置中可捕获和直接检测一种或多种囊泡。或者,所捕获的囊泡可在分析前释放并且离开所述微流体装置。在另一个实施方案中,在所述微通道中裂解一种或多种被捕获的囊泡并分析裂解物。可使裂解缓冲液流过所述通道并裂解所捕获的囊泡。例如,可将裂解缓冲液流入所述装置或微通道,其流速为如至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、26、27、28、29、30、35、40、45或50μl每分钟,如介于约1-50、5-40、10-30、5-30或10-35μl每分钟之间。可收集并分析所述裂解物,诸如进行RT-PCR、PCR、质谱、Western印迹或其它分析以检测所述囊泡的一种或多种生物标志物。
细胞源和疾病特异性囊泡
本文所公开的结合剂可以用于分离或检测囊泡,例如细胞源囊泡或具有特定生物印记的囊泡。所述结合剂可用于从样品分离或检测异质囊泡群体或可用于从异质囊泡群体分离或检测均质囊泡群体,例如具有特定生物印记的细胞源特异性囊泡。
可分析均质囊泡群体(诸如细胞源特异性囊泡)并用于表征受试者的表型。细胞源特异性囊泡为源自特定细胞类型的囊泡,其可以包含但不限于特定组织的细胞、来自特定的目标肿瘤或者目标疾病组织的细胞、循环肿瘤细胞或者母体或胎儿来源的细胞。所述的囊泡可以源自肿瘤细胞或肺细胞、胰腺细胞、胃细胞、肠细胞、膀胱细胞、肾细胞、卵巢细胞、睾丸细胞、皮肤细胞、结肠直肠细胞、乳腺细胞、前列腺细胞、脑细胞、食管细胞、肝细胞、胎盘细胞或胎儿细胞。所述分离的囊泡还可以来自特定的样品类型,例如尿囊泡。
生物样品的细胞源特异性囊泡可以使用对细胞源具有特异性的一种或多种结合剂来分离。用于分析疾病或状况的囊泡可以使用对该疾病或状况的生物标志物具有特异性的一种或多种结合剂来分离。
在对细胞源特异性囊泡进行分离和检测之前,可以按照上文所述将囊泡浓缩,诸如通过离心、色谱或过滤,从而在分离细胞源特异性囊泡之前得到异质囊泡群体。或者,在分离细胞源囊泡之前所述的囊泡未经浓缩,或者所述的生物样品并未针对囊泡进行富集。
图61B说明了描绘用于分离或鉴定细胞源特异性囊泡的方法6100B的流程图。首先,在步骤6102中,由受试者获得生物样品。所述的样品可以得自第三方,或者得自实施所述分析的同一方。然后,在步骤6104中从生物样品分离细胞源特异性囊泡。随后在步骤6106中分析经分离的细胞源特异性囊泡,并在步骤6108中针对特定的表型来鉴定生物标志物或生物印记。所述的方法可以用于多种表型。在一些实施方案中,在步骤6104之前,将囊泡由生物样品浓缩或分离,从而得到均质的囊泡群体。例如,可以使用离心、色谱、过滤或上文所述的其它方法来分离异质囊泡群体,然后使用特别地用于分离或鉴定源自特定细胞类型的囊泡的一种或多种结合剂。
可以通过使用以高度的特异性与细胞源特异性囊泡相结合的一种或多种结合剂来从受试者的生物样品分离细胞源特异性囊泡。在某些情况下,可以使用单一结合剂来分离细胞源特异性囊泡。在其它情况中,可以使用结合剂的组合来分离细胞源特异性囊泡。例如,可以使用至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、50、75或100种不同的结合剂来分离细胞源的囊泡。因此,可以通过使用单一或多种结合剂来鉴定囊泡群体(例如具有相同的结合剂谱的囊泡)。
可以根据一种或多种结合剂针对对于细胞源(例如民肿瘤、自身免疫疾病、心血管疾病、神经疾病、感染或其它疾病或失调相关的细胞源)特异性的目标抗原的特异性来选择这些结合剂。所述细胞源可来自对于诊断、预后、疾病分级、治疗诊断、响应者/非响应者状态预判、疾病监控、治疗监控等提供这些疾病或失调相关的信息的细胞。所述细胞源还可以来自有可用于发现用于其中的生物标志物的细胞。可以单独使用或组合地使用以分离细胞源特异性囊泡、疾病特异性囊泡或肿瘤特异性囊泡的抗原的非限制实例如图1所示,并在下文还将进行描述。所述的抗原可以包含结合剂可接触的膜结合抗原。所述的抗原可以为与表征表型相关的生物标志物。
本领域的技术人员应当了解,本发明包括可用于分离信息性囊泡的任何可适用抗体。根据本文概述的,可选择识别表面抗原和/或其片段的结合剂,如抗体、适体和凝集素。所述结合剂可识别对于所需细胞类型或定位特异性的抗原,和/或识别与所需细胞相关的生物标志物。所述细胞可以是,例如,肿瘤细胞、其它患病细胞、用作为疾病标志物的细胞,诸如活化的免疫细胞等。本领域的技术人员应当了解,针对任意目标细胞的结合剂可用于分离与这些细胞相关的囊泡。本领域的技术人员应进一步了解,本文公开的结合剂可用于检测目标囊泡。作为非限制实例,针对囊泡生物标志物的结合剂可直接或间接标记以检测被一种或多种相同或不同的结合剂所结合的囊泡。
可用于结合与癌症、自身免疫疾病、心血管疾病、神经疾病、感染或其它疾病或失调相关的囊泡的结合剂的许多靶标在表4中示出。可使用该表中的抗原之一鉴定源自与所列的失调之一相关的细胞的囊泡。所述结合剂(如抗体或适体)可识别所列抗原的表位、其片段,或者结合剂可针对任意适当的组合使用。也可识别与所述疾病或失调相关的其它抗原以鉴定所述囊泡。本领域的技术人员应当了解,本发明包括可用于评估信息性囊泡的任意可适用抗体以用于分离、捕获或检测,从而鉴定囊泡。
表4:用于鉴定各种疾病和失调的说明性抗原
根据上文所述的方法,可使用新型结合剂来分离细胞源特异性的囊泡。此外,还可以使用基于这些囊泡的细胞结合伴体或结合剂的分离方法来从生物样品分离细胞源特异性的囊泡。这些细胞结合伴体可以包括但不限于肽、蛋白质、RNA、DNA、适体、细胞或血清相关的蛋白质,它们仅在存在一种或多种特异性生物标志物时结合这些囊泡。可以使用单一的结合伴体或结合剂、或者结合伴体或结合剂的组合来实施细胞源特异性的囊泡的分离或检测,所述的伴体或结合剂的单独使用或组合使用可以进行细胞源特异性的分离或检测。这些结合剂的非限制实例在图2中提供。例如,可以使用一种或多种结合剂分离用于表征乳腺癌的囊泡,其中所述的结合剂包括但不限于雌激素、孕酮、赫塞汀(Herceptin)(曲妥珠单抗)、CCND1、MYC PNA、IGF-1PNA、MYC PNA、SC4适体(Ku)、AII-7适体(ERB2)、半乳凝集素-3、粘蛋白型O-聚糖、L-PHA、半乳凝集素-9或者它们的任何组合。
结合剂还可以根据i)对细胞源特异性囊泡具特异性的抗原的存在,ii)对细胞源特异性的囊泡具特异性的标志物的不存在,或者iii)对细胞源特异性的囊泡具特异性的生物标志物的表达水平而用于分离或检测细胞源特异性的囊泡。可将异质囊泡群体施加于涂覆有特异性结合剂的表面上,其中所述的结合剂被设计成能够排除或确认囊泡的细胞源特征。各种结合剂如抗体可以列于固体表面或基底上,并且可以使所述异质囊泡群体与所述的固体表面或基底接触足以发生相互作用的时间。然后,与所述阵列表面或基底上的给定抗体位置的特异性结合或非特异性结合可以用于鉴定对给定细胞源具有特异性的囊泡群体的抗原特异性特征。
根据上文所述,可以使用磁捕获方法、荧光激活细胞分选术(FACS)或激光细胞计数法以一种或多种结合剂来富集或分离细胞源特异性的囊泡。磁捕获方法可以包括但不限于使用磁性激活细胞分选器(MACS)微珠或磁柱。可以使用的免疫亲和与磁性颗粒方法的实例在美国专利No.4,551,435、4,795,698、4,925,788、5,108,933、5,186,827、5,200,084或5,158,871中有所描述。还可以根据美国专利No.7,399,632中所述的一般方法,通过使用对囊泡具特异性的抗原的组合来分离细胞源特异性的囊泡。
相对于生物样品,用于分离或另外地富集所述细胞源特异性囊泡的任何其它适当方法也可以与本发明组合使用。例如,尺寸排阻色谱(例如凝胶渗透柱)、离心或密度梯度离心以及过滤方法可以与本文所述的抗原选择方法组合使用。也可按照Koga等,AnticancerResearch,25:3703-3708(2005)、Taylor等,Gynecologic Oncology,110:13-21(2008)、Nanjee等,Clin Chem,2000;46:207-223或美国专利No.7,232,653中所描述的方法来分离所述细胞源特异性囊泡。
因此,可分离出与所来源的肿瘤或者自身免疫疾病、心血管疾病、神经疾病、感染或其它疾病或失调的位点的细胞分离的囊泡。在一些实施方案中,分离的囊泡源自与这些疾病或失调相关的细胞,例如,在所述疾病的病因学中发挥作用的免疫细胞,并且对所述细胞的分析提供了诊断、预后、疾病分级、治疗诊断、响应者/非响应者状态预测、疾病监控、治疗监控等与这些疾病或失调相关的信息。所述囊泡进一步可用于发现生物标志物。根据本文所述,可随后评估分离的囊泡以表征表型。
囊泡的评估
可通过分析来自受试者的生物样品并且测定所述样品中的一种或多种囊泡群体的水平、量或浓度而对表征所述受试者的表型。可在测定囊泡量之前纯化或浓缩囊泡。或者,可在不经先行纯化或浓缩的情况下直接分析样品的囊泡量。所述囊泡可为细胞源特异性囊泡或具有特定生物印记的囊泡。可在表征表型(诸如诊断、预后、治疗诊断或预测响应者/非响应者状态)的时候使用该囊泡量。在一些实施方案中,所述量用于确定生理或生物学状态,诸如妊娠或妊娠阶段。囊泡量还可用于确定治疗效力、疾病或状况的阶段或者疾病或状况的进展。例如,囊泡量可以与疾病阶段或进程的递进成正比或反比。囊泡的量还可用于监测疾病或状况的进展或监测受试者对治疗的反应。
可以通过将囊泡的水平与囊泡的参照水平或值相比较来评估囊泡。参照值对于物理或时间终点而言可以是特定的。例如,参照值可以来自与进行样品评估的同一受试者,或者参照值可以得自代表性的样品群体(例如来自并未表现出疾病症状的正常受试者的样品)。因此,参照值可以提供可将其与在给定样品中分析的囊泡群体的受试者样品读数相比较的阈值测量值。可以根据由对应于特定同龄组的多组样品而汇集的数据来设定这种参照值,其中所述的同龄组包括但不限于年龄(例如新生儿、婴儿、青少年、青年、中年成人、老年以及不同年龄的成人)、人种/种族群组、正常人对患病受试者、吸烟者、非吸烟者、接受治疗的受试者对未治疗的受试者、具有相似诊断或治疗的特定受试者个体或组的不同治疗时间点或其组合。此外,通过对特定个体测定不同治疗时间点的囊泡水平,可监测所述个体对治疗的反应或者监测个体进行治疗的疾病或状况的进展。
参照值可以基于由相同的受试者评估的样品,以便提供个体跟踪。频繁地对患者进行测试可以提供与特定患者此前所建立的参照值之间的更好比较,并且可以使医生更准确地评估患者的疾病阶段或进程,从而为更好的治疗决策提供信息。降低的个体内囊泡水平差异可以为患者定义更加特异性和个性化的阈值。时间上的受试者内差异使得各个个体为疾病或生理状态的最佳分析起到纵向对照的作用。
可以针对不具有特定的表型的未受影响的个体(具有不同的年龄、种族背景和性别),通过测定未受影响的个体中的囊泡量来建立参照值。例如,参照群体的参照值可以用作在测试受试者中检测一种或多种囊泡群体的基线。如果来自受试者的样品具有与所述的参照值相似的水平或值,则所述的受试者可以鉴定为未患有所述疾病,或者发生所述疾病的低可能性。
或者,可以针对具有特定表型的个体,通过在具有所述表型的个体中测定一种或多种囊泡群体的量来建立参照值或水平。此外,可以针对特定的表型创建值的指数。例如,不同的疾病阶段可以具有不同的值,诸如得自具有不同疾病阶段的个体。可以将受试者的值与所述的指数比较,并且可以确定所述疾病的诊断或预后,例如疾病的阶段或进程。在其它实施方案中,针对疗效创建了值的指数。例如,可以建立患有特定疾病的个体的囊泡水平,并注明对于该个体而言什么样的治疗是有效的。所述的水平可以用于创建与受试者的值进行比较的值,并可针对该个体选择处理或治疗,例如,通过从所述水平预测所述受试者可能是治疗为响应者或非响应者。
在一些实施方案中,可以使用特异性地靶向特定癌症的生物标志物的抗原来分离或检测囊泡,从而针对未受所述特定癌症影响的个体来确定参照值。作为非限制性实例,可使用与针对未受影响个体所描述的相同技术检查患有不同阶段结肠直肠癌和非癌息肉的个体,并且可测定各组的循环囊泡水平。在一些实施方案中,所述水平被定义为来自于以至少一式三份重复进行的至少两个独立实验的平均值±标准偏差。可使用统计检验进行这些组间的比较以确定区分所观察到的生物标志物的统计显著性。在一些实施方案中,使用参数统计检验确定统计显著性。所述参数统计检验可包括但不限于,部分析因设计、方差分析(ANOVA)、t检验、最小二乘法、皮尔逊相关、简单线性回归、非线性回归、多元线性回归或多元非线性回归。或者,所述参数统计检验可包含单因素方差分析、双因素方差分析或重复测量方差分析。在其它实施方案中,使用非参数统计检验确定统计显著性。其实例包括但不限于,威尔科克森符号秩检验(Wilcoxon signed-rank test)、曼-惠特尼检验(Mann-Whitneytest)、Kruskal-Wallis检验、弗里德曼检验(Friedman test)、斯皮尔曼秩次相关系数(Spearman ranked order correlation coefficient)、Kendall Tau分析和非参数回归检验。在一些实施方案中,统计显著性在低于0.05、0.01、0.005、0.001、0.0005或0.0001的p值下确定。还可针对多重比较校正p值,例如使用邦弗朗尼校正(Bonferroni correction)、其改进方法或本领域的技术人员所知的其它技术,如Hochberg校正、Holm-Bonferroni校正、校正、Dunnett's校正或Tukey’s多重比较。在一些实施方案中,为进行来自各群体的生物标志物的检验后比较,在ANOVA后进行了Tukey’s校正。
还可以建立参照值以用于疾病的复发监测(或MS中的恶化阶段)、用于治疗反应监测或用于预测响应者/非响应者状态。
在一些实施方案中,使用人工囊泡(本文亦称为合成囊泡)测定针对获自囊泡的微RNA的参照值。用于制备人工囊泡的方法为本领域的技术人员所知,如使用脂质体。可使用公开于US20060222654和US4448765中的方法制备人工囊泡,其全文以引用的方式并入本文。可使用已知标志物构建人工囊泡以利于捕获和/或检测。在一些实施方案中,在处理前将人工囊泡掺入身体样品中。可在处理期间跟踪完整合成囊泡的水平(例如,使用过滤或本文公开的其它分离方法)以提供初始样品对处理样品的囊泡量的对照。类似地,人工囊泡可在任意处理步骤之前或之后掺入样品中。在一些实施方案中,人工囊泡用于校准用于囊泡分离和检测的设备。
人工囊泡可经制备和使用对照以测试分析(诸如基于珠的分析)的可行性。所述人工囊泡与所述珠和与检测抗体结合。因此,所述人工囊泡包含各个抗体结合的氨基酸序列/构象。所述人工囊泡可包含抗体结合的纯化蛋白质或合成肽序列。所述人工囊泡可以是能够使生物分子与之连接的珠,如聚苯乙烯珠。如果所述珠具有可用的羧基基团,则所述蛋白质或肽可经由可用的氨基基团结合于所述珠,诸如使用碳二亚胺偶联。
在另一个实施方案中,所述人工囊泡可以是涂覆有抗生物素蛋白的聚苯乙烯珠,并且生物素在合成时或通过生物素-马来酰亚胺化学反应置于所选择的蛋白质或肽。将置于珠上的蛋白质/肽可以在将要使用所述人工囊泡的应用所特有的比率下混合在一起,并随后与所述珠偶联。这些人工囊泡可随后作为捕获珠和检测抗体之间的连接发挥作用,由此而提供了对照用以显示所述分析的组分工作正常。
所述的值可以为定量的值或定性的值。所述的值可以为囊泡水平的直接量度(例如质量/体积),或者为间接量度,诸如特异性生物标志物的量。所述的值可以为定量的,例如数值。在其它实施方案中,所述的值为定性的,例如没有囊泡、低水平的囊泡、中等水平的囊泡、高水平的囊泡或其变型。
参照值可以储存在数据库中,并可以根据微RNA的水平或量(例如微RNA的总量)或者微RNA特定群体的量(例如细胞源特异性的微RNA或来自具有特定生物印记的囊泡的微RNA)而作为参照用于疾病或状况的诊断、预后、治疗诊断、疾病分级、疾病监控、治疗监控、响应者/非响应者状态预测。在一个说明性实例中,对确定癌症诊断的方法加以考虑。来自患有或未患所述癌症的参照受试者的微RNA受到评估并且储存在数据库中。所述参照受试者提供了指示所述癌症或另一状态,如健康状态的生物印记。随后分析来自测试受试者的样品并且将微RNA生物印记与所述数据库中的生物印记进行比较。如果所述受试者的生物印记与指示癌症的参照值更为紧密地相关,则可作出癌症的诊断。相反,如果所述受试者的生物印记与指示健康状态的参照值更为紧密地相关,则可确定所述受试者未患有所述疾病。本领域的技术人员应当了解,该实例是非限制性的并且可被扩展用于评估其它表型,如其它疾病、预后、治疗诊断、疾病分级、疾病监控、治疗监控或响应者/非响应者状态预测等等。
可通过检测微RNA和/或囊泡而确定用于表征表型的生物印记。可在囊泡内评估微RNA。或者,在不将微RNA从囊泡中分离的情况下对样品中的微RNA和囊泡进行分析以表征所述表型。存在许多的分析技术可用于评估囊泡。在一些实施方案中,可以根据本领域已知的方法使用质谱分析法、流式细胞术、免疫细胞化学染色、Western印迹、电泳、色谱或x射线晶体学来鉴定囊泡的水平。例如,可以按照Clayton等,Journal of Immunological Methods2001;163-174中所述的,使用流式细胞术对囊泡进行鉴定和定量测量,所述的文献全文以引用方式并入本文。根据上文所述可以使用结合剂来确定囊泡的水平。例如,囊泡的结合剂可以被标记,然后检测标记物并用于确定样品中囊泡的量。如上文所述,所述的结合剂可以结合于基底,诸如阵列或颗粒。或者,可以直接标记囊泡。
电泳标签或eTag可以用于测定囊泡的量。eTag为与核酸或抗体连接的小荧光分子,并被设计为分别与一种特定核酸序列或蛋白质结合。在eTag与其靶标结合后,使用酶将结合的eTag从靶标上切下。由释放的eTag(称为“报告物”)产生的信号与样品中靶核酸或蛋白质的量成比例。可以通过毛细管电泳鉴定eTag报告物。各eTag报告物的独特的电荷-质量比(即,其电荷除以其分子量)使得其在毛细管电泳读数上以特定的峰显示。由此,通过将eTag靶向于囊泡的特定生物标志物,可以测定囊泡的量或水平。
可以由异质囊泡群体(例如样品中的总囊泡群体)来确定囊泡水平。或者,由均质的囊泡群体或实质上均质的囊泡群体来确定囊泡水平,诸如特定细胞源囊泡的水平,如来自前列腺癌细胞的囊泡。在再其它的实施方案中,测定具有特定的生物标志物或生物标志物组合(例如对前列腺癌具有特异性的生物标志物)的囊泡的水平。测定囊泡水平可以与确定囊泡的生物标志物或生物标志物组合结合实施。或者,可以在确定囊泡的生物标志物或生物标志物组合之前或者之后来测定囊泡的量。
对囊泡量的测定可以以多重方式来分析。例如,可以测定多于一种囊泡群体(例如具有不同生物标志物或生物标志物组合的不同细胞源特异性囊泡)的量,如本文所公开的那些。
通常使用统计学手段评估诊断或相关检验的性能。可通过测量灵敏度、特异性和相关度量而评估所述表征的性能。例如,可分析目标微RNA的水平以表征表型,如检测疾病。测定了所述分析对于检测所述疾病的灵敏度和特异性。
真阳性是具有特征(如疾病或失调)被正确地鉴别为具有所述特征的受试者。假阳性是被所述测试而不当地鉴定为具有所述特征而不具有所述特征的受试者。真阴性是被所述测试正确地鉴定为不具有所述特征的不具有所述特征的受试者。假阴性是具有所述特征而被所述测试不当地鉴定为不具有该特征的人。所述测试区分这些类别的能力提供了测试性能的度量。
测试的特异性被定义为真阴性数目除以实际阴性(即,真阴性和假阳性之和)数目。特异性是多少受试者被正确地鉴别为阴性的量度。100%的特异性意味着所述测试识别出所有实际阴性,例如,全部健康人士应被识别为健康。较低的特异性表明更多的阴性会被确定为阳性。
测试的灵敏度被定义为真阳性数目除以实际阳性(即,真阳性和假阴性之和)数目。特异性是多少受试者被正确地鉴别为阳性的量度。100%的灵敏度意味着所述测试识别出全部实际阳性—例如,全部患病人士应被识别为患病。较低的灵敏度表明较多的阳性会错误地确定为阴性。
测试的精确性被定义为真阳性和真阴性的数目除以全部真阳性和假阳性以及全部真阴性和假阴性之和。其提供了一个将灵敏度和特异性度量相结合的数值。
在特定的辨识阈值下确定灵敏度、特异性和精确性。例如,前列腺癌(PCa)检测的常用阈值是血清中4ng/mL的前列腺特异抗原(PSA)。等于或高于所述阈值的PSA水平被认为对于PCa是阳性并且之下的任意水平被认为是阴性。随着阈值变化,灵敏度和特异性也发生变化。例如,随着检测癌症的阈值提高,特异性提高,这是因为更为难于将受试者认作阳性,其导致了更少的假阳性。与此同时,灵敏度将降低。受试者工作特征曲线(ROC曲线)是随着阈值变化,二元分类法系统的真阳性率(即灵敏度)对假阳性率(即,1-特异性)的示意图。所述ROC曲线显示了灵敏度和特异性如何随着阈值变化而变化。ROC曲线的曲线下面积(AUC)提供了指示在阈值的整个范围上的测试性能的总计数值。所述AUC等于分类法将随机选择的阳性样本分级为高于随机选择的阴形样本的概率。0.5的AUC表明所述测试具有50%的适当分级的概率,其相当于无辨识力(掷硬币也有50%的正确分级概率)。1.0的AUC意味着所述测试适当地对全部受试者分级(分类)。AUC等同于Wilcoxon秩检验。
根据本发明的生物印记可以用于以至少50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69或70%的灵敏度(例如,以至少71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86或87%的灵敏度)表征表型。在一些实施方案中,所述表型以至少87.1、87.2、87.3、87.4、87.5、87.6、87.7、87.8、87.9、88.0或89%的灵敏度进行表征,例如至少90%的灵敏度。所述的表型可以以至少91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的灵敏度进行表征。
根据本发明的生物印记可以用于以至少50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96或97%的特异性(例如以至少97.1、97.2、97.3、97.4、97.5、97.6、97.7、97.8、97.8、97.9、98.0、98.1、98.2、98.3、98.4、98.5、98.6、98.7、98.8、98.9、99.0、99.1、99.2、99.3、99.4、99.5、99.6、99.7、99.8、99.9或100%的特异性)表征受试者的表型。
根据本发明的生物印记可以用于以至少50%的灵敏度和至少60、65、70、75、80、85、90、95、99或100%的特异性;至少55%的灵敏度和至少60、65、70、75、80、85、90、95、99或100%的特异性;至少60%的灵敏度和至少60、65、70、75、80、85、90、95、99或100%的特异性;至少65%的灵敏度和至少60、65、70、75、80、85、90、95、99或100%的特异性;至少70%的灵敏度和至少60、65、70、75、80、85、90、95、99或100%的特异性;至少80%的灵敏度和至少60、65、70、75、80、85、90、95、99或100%的特异性;至少85%的灵敏度和至少60、65、70、75、80、85、90、95、99或100%的特异性;至少86%的灵敏度和至少60、65、70、75、80、85、90、95、99或100%的特异性;至少87%的灵敏度和至少60、65、70、75、80、85、90、95、99或100%的特异性;至少88%的灵敏度和至少60、65、70、75、80、85、90、95、99或100%的特异性;至少89%的灵敏度和至少60、65、70、75、80、85、90、95、99或100%的特异性;至少90%的灵敏度和至少60、65、70、75、80、85、90、95、99或100%的特异性;至少91%的灵敏度和至少60、65、70、75、80、85、90、95、99或100%的特异性;至少92%的灵敏度和至少60、65、70、75、80、85、90、95、99或100%的特异性;至少93%的灵敏度和至少60、65、70、75、80、85、90、95、99或100%的特异性;至少94%的灵敏度和至少60、65、70、75、80、85、90、95、99或100%的特异性;至少95%的灵敏度和至少60、65、70、75、80、85、90、95、99或100%的特异性;至少96%的灵敏度和至少60、65、70、75、80、85、90、95、99或100%的特异性;至少97%的灵敏度和至少60、65、70、75、80、85、90、95、99或100%的特异性;至少98%的灵敏度和至少60、65、70、75、80、85、90、95、99或100%的特异性;至少99%的灵敏度和至少60、65、70、75、80、85、90、95、99或100%的特异性;或基本上为100%的灵敏度和至少60、65、70、75、80、85、90、95、99或100%的特异性来表征受试者的表型(例如基于微RNA水平或其它特征)。
根据本发明的生物印记可以用于以至少60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96或97%的精确性(例如以至少97.1、97.2、97.3、97.4、97.5、97.6、97.7、97.8、97.8、97.9、98.0、98.1、98.2、98.3、98.4、98.5、98.6、98.7、98.8、98.9、99.0、99.1、99.2、99.3、99.4、99.5、99.6、99.7、99.8、99.9或100%的精确性)表征受试者的表型。
在一些实施方案中,根据本发明的生物印记可以用于以至少0.60、0.61、0.62、0.63、0.64、0.65、0.66、0.67、0.68、0.69、0.70、0.71、0.72、0.73、0.74、0.75、0.76、0.77、0.78、0.79、0.80、0.81、0.82、0.83、0.84、0.85、0.86、0.87、0.88、0.89、0.90、0.91、0.92、0.93、0.94、0.95、0.96或0.97的AUC(例如以至少0.971、0.972、0.973、0.974、0.975、0.976、0.977、0.978、0.978、0.979、0.980、0.981、0.982、0.983、0.984、0.985、0.986、0.987、0.988、0.989、0.99、0.991、0.992、0.993、0.994、0.995、0.996、0.997、0.998、0.999或1.00的AUC)表征受试者的表型。
此外,可以以至少50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%的置信度确定用于测定特异性、灵敏度、精确性或AUC的置信水平。
其它相关性能的量度包括阳性和阴性概率比[阳性LR=灵敏度/(1-特异性);阴性LR=(1-灵敏度)/特异性]。这些量度还可用于估量根据本发明的方法的测试性能。
分类
根据本发明的生物印记可用于对样品分类。辨识分析技术对于本领域的技术人员是已知的。例如,可将样品分类为或预测为针对用于给定疾病或失调的给定治疗的响应者或非响应者。多种统计分类技术对于本领域的技术人员是已知的。在监督学习方法中,使用统计分类方法分析了来自两个或更多组的样品组。可以发现可用于建立区分所述两个或更多组的分类器的生物标志物。随后可分析新的样品从而使所述分类器可将所述新样品与所述两个或更多组中的一组相关联。常用的监督分类器包括但不限于神经网络(多层感知器)、支持向量机、k紧邻算法、高斯混合模型、高斯法、朴素贝叶斯法(naive Bayes)、决策树和径向基函数(RBF)分类器。线性分类法包括费雪线性判别(Fisher's lineardiscriminant)、逻辑回归、朴素贝叶斯分类器、感知器和支持向量机(SVM)。用于本发明的其它分类器包括二次分类器、k紧邻算法、增强算法、决策树、随机森林法、神经网络、模式识别、贝叶斯网络(Bayesian networks)和隐马尔可夫模型(Hidden Markov models)。技术人员应了解,这些和其它分类器(包括对其中任意分类器的改进)被设想在本发明的范围之内。
使用监督方法进行的分类通常按下列方法实施:
为解决监督学习的给定问题(如,学习识别手写字体),必须考虑各种不同步骤:
1.获得训练集。这可包括,例如,来自患有或未患疾病或失调的受试者、已知对于治疗有反应或无反应的受试者、其疾病有发展或无发展的受试者等等的样品。所述训练样品用于“训练”所述分类器。
2.确定学习函数(learned function)的输入“特征”表示。所述学习函数的准确性取决于如何表示输入对象。一般将输入对象转化成为特征向量,其包含对于所述对象描述性的多个特征。由于维数灾难(curse of dimensionality)的缘故,特征的数目不应过大;但是应大到足以精确地预测输出。所述特征可包括一组生物标志物,诸如源自本文描述的囊泡的生物标志物。
3.确定学习函数的结构以及对应的学习算法。选择学习算法,例如,人工神经网络、决策树、贝叶斯分类器或支持向量机。所述学习算法用于建立该分类器。
4.建立所述分类器。学习算法运行被收集的训练集。可通过优化在所述训练集的亚集(称为验证集)在的性能或通过交叉验证而调整所述学习算法的参数。在参数调整和学习之后,可在原始样品的测试集(其与所述训练集分离)上测量所述算法的性能。
一旦如上所述确定分类器,则其可用于对样品分类,例如,以本发明的方法进行分析的受试者的样品。例如,可使用患有和未患疾病的参照受试者中的目标微RNA水平的数据作为所述训练集和测试集而建立分类器。对来自测试受试者的样品中所见的微RNA水平进行评估并且所述分类器用于将所述受试者分类为患有或未患所述疾病。另举一例,可使用已发现对于特定疾病有反应或无反应的参照受试者中的目标囊泡生物标志物水平的数据作为所述训练集和测试集而建立分类器。对来自测试受试者的样品中所见的囊泡生物标志物水平进行评估并且将所述分类器用于将所述受试者分类为患有或未患所述疾病。
也可将非监督学习方法用于本发明。聚类法是一种非监督学习方法,其中聚类算法在不使用标记的情况下将一系列样品进行关联。最为类似的样本被分类成“群”。可将新样本分类到群中并且由此与其最为紧密关联的其它成员归类。本领域的技术人员所熟知的大量聚类算法可用于本发明,诸如层次聚类法。
生物印记
据本发明通过评估囊泡群体而获得生物印记,包括表面和有效负载的囊泡相关生物标志物和/或循环生物标志物,包括微RNA和蛋白质。源自受试者的生物印记可用于表征所述受试者的表型。生物印记可进一步包括一种或多种另外的生物标志物的水平,例如,循环生物标志物或与目标囊泡相关的生物标志物。目标囊泡的生物印记可包括存在于所述囊泡上的特定抗原或生物标志物。所述生物印记还可包括一种或多种抗原或生物标志物,其作为囊泡中的有效负载被携带,包括进行检验的微RNA。所述生物印记可以包含存在于囊泡(其具有在囊泡中检测的一种或多种生物标志物)上的一种或多种抗原或生物标志物的组合。所述生物印记可进一步包含除生物标志物以外的关于囊泡的其它信息。这些信息可包括囊泡大小、循环半衰期、代谢半衰期以及体内或体外的特定活性。所述生物印记可包含所述生物标志物或用于建立分类器的其它特征。
在一些实施方案中,直接在生物样品中检测微RNA。例如,体液中的RNA可使用市售的试剂盒进行分离,诸如mirVana试剂盒(Applied Biosystems/Ambion,Austin,TX)、MagMAXTM RNA分离试剂盒(Applied Biosystems/Ambion,Austin,TX)以及QIAzol LysisReagent and RNeasy Midi试剂盒(Qiagen Inc.,Valencia CA)。可根据下文描述使用阵列或PCR技术测定微RNA的特定种类。
在一些实施方案中,对囊泡的微RNA有效负载进行评估以表征表型。可以纯化或浓缩所述囊泡,然后确定所述生物印记。例如,可分离细胞源特异性囊泡并测定其生物印记。或者,可以在未经先行纯化或浓缩的情况下直接从样品测定囊泡的生物印记。本发明的生物印记可以用于确定疾病或状况的诊断、预后或治疗诊断,或者本文所述的类似量度。生物印记还可以用于确定治疗效力、疾病或状况的阶段、或疾病或状况的进程、或响应者/非响应者状态。此外,生物印记可以用于确定生理状态,例如妊娠。
可以对囊泡中或囊泡本身的囊泡特征进行评估以确定生物印记。所述的特征可以用于诊断、检测或确定疾病的阶段或进程,疾病或状况的治疗意义,或者用于表征生理状态。这些特征包括但不限于囊泡的水平或量、囊泡的大小、对囊泡半衰期变化的时效评估、循环囊泡半衰期、囊泡的代谢半衰期或者囊泡的活性。
生物印记中可包括的生物标志物包括一种或多种蛋白质或肽(例如提供了蛋白质印记)、核酸(例如,如所述的RNA印记或DNA印记)、脂质(例如脂质印记)或者它们的组合。在一些实施方案中,所述的生物印记还可以包括存在于囊泡中的药物或药物代谢物的类型或量(例如,提供了药物印记),因为这些药物可以由所述生物样品所获自的受试者摄入,这产生了携带所述药物或所述药物的代谢物的囊泡。
生物印记还可包括一种或多种生物标志物的表达水平、存在、不存在、突变、变异体、拷贝数量变化、截短、重复、修饰或分子关联。遗传变异体或核苷酸变体指的是基因或cDNA序列在特定基因座的变化或改变,其包括但不限于,编码和非编码区中的核苷酸碱基缺失、插入、倒位和置换。缺失可以是单核苷酸碱基的缺失、所述基因的核苷酸序列的一部分或一个区域的缺失或者完整基因序列的缺失。插入可以是一个或多个核苷酸碱基的插入。所述遗传变异体可存在于转录调控区域、mRNA的非翻译区域、外显子、内含子或外显子/内含子连接区域。所述遗传变异体可以导致或不导致终止密码子、移码、氨基酸缺失、改变的基因转录物剪接形式或改变的氨基酸序列。
在实施方案中,包括囊泡中的核酸有效负载在内的核酸生物标志物进行核苷酸变体的评估。所述核酸生物标志物可包含一种或多种RNA物质,例如,mRNA、miRNA、snoRNA、snRNA、rRNA、tRNA、siRNA、hnRNA、shRNA或其组合。类似地,可评估DNA有效负载以形成DNA印记。
RNA印记或DNA印记还可包括突变的外遗传修饰,或存在于囊泡中的RNA或DNA的遗传变异体分析。外遗传修饰包括DNA甲基化模式。例如,参见Lesche R.和Eckhardt F.,DNAmethylation markers:a versatile diagnostic tool for routine clinical use.CurrOpin Mol Ther.2007年6月;9(3):222-30,其全文以引用的方式并入本文。因此,生物标志物可以是DNA片段的甲基化状态。
生物印记可以包括与一种或多种其它印记(包括但不限于mRNA印记、DNA印记、蛋白质印记、肽印记、抗原印记或它们的任何组合)相结合的一种或多种miRNA印记。例如,所述的生物印记可以包含一种或多种miRNA生物标志物以及一种或多种DNA生物标志物、一种或多种mRNA生物标志物、一种或多种snoRNA生物标志物、一种或多种蛋白质生物标志物、一种或多种肽生物标志物、一种或多种抗原生物标志物、一种或多种抗原生物标志物、一种或多种脂质生物标志物或者它们的任意组合。
生物印记可以包含一种或多种抗原或结合剂的组合(例如结合一种或多种结合剂的能力),诸如分别列于图1和图2中或本文它处描述的那些。所述的生物印记可以进一步包含一种或多种其它的生物标志物,例如但不限于miRNA、DNA(例如单链DNA、互补DNA或非编码DNA)或mRNA。囊泡的生物印记可以包含一种或多种抗原(例如如图1所示)、一种或多种结合剂(例如如图2所示)以及针对状况或疾病的一种或多种生物标志物(例如如图3-60所示)的组合。所述的生物印记可以包含一种或多种生物标志物(例如miRNA)以及对癌细胞具有特异性的一种或多种抗原(例如,如图1所示)。
在一些实施方案中,用于本方法中的囊泡具有特异于所述细胞源的生物印记,并且用于得到疾病特异性或生物状态特异性的诊断、预后或治疗相关生物印记(其为细胞源代表性的)。在其它实施方案中,囊泡具有对于给定的疾病或生理状况特异性的生物印记,其不同于用于诊断、预后、分期、治疗相关性测定或生理状态表征的细胞源生物印记。生物印记还可包含细胞源特异性和非特异性的囊泡的组合。
生物印记可以用于评估诊断标准,例如疾病的存在、疾病分期、疾病监测、疾病分级或检测的监控,疾病的转移、复发或进展。生物印记还可在临床上用于进行涉及治疗模式的决策,包括治疗干预。生物印记可以进一步在临床上用于作出治疗决策,包括是否实施手术,或者与手术一起应该使用何种治疗标准(例如术前或术后)。作为说明性实例,指示癌症的侵袭性形式的微RNA(miRNA)生物印记可能需要更为激进的手术措施和/或更为激进的治疗方案以治疗所述患者。
生物印记可以用于治疗相关的诊断,从而提供可用于诊断疾病或选择正确的治疗方案的测试,例如提供治疗诊断。治疗诊断包括诊断测试,其提供影响疾病状态的疗法或治疗的能力。治疗诊断测试以与诊断或预后测试分别提供诊断或预后相类似的方式提供了治疗诊断。本文所使用的治疗诊断涵盖了任意所需形式的治疗相关测试,其包括预测医学、个性化医疗、综合医学、药物诊断学(pharmacodiagnostics)和Dx/Rx伙伴(Dx/Rxpartnering)。治疗相关测试可以用于预测和评估个体受试者中的药物反应,即,提供个性化的医疗。预测药物反应可确定受试者是否是候选治疗剂的可能响应者或可能非响应者,例如,在所述受试者暴露于所述治疗或另外地用所述治疗进行处理之前。评估药物反应可以监测对药物的反应,例如,在开始治疗后的一段时期内监测受试者的改善或改善的缺乏。治疗相关测试可用于针对治疗方法选择受试者,所述的受试者特别可能受益于所述的治疗或者特别有可能在个体受试者中提供具有治疗效力的早期或客观的指征。因此,本文公开的生物印记可以指示应改变治疗以选择更有希望的治疗,由此避免了拖延有益治疗的巨大代价并避免了施用无效药物的经济成本和病痛成本。
此外,治疗相关诊断还可以用于对多种疾病或失调的临床诊断和管理,所述疾病或失调包括但不限于心血管疾病、癌症、感染性疾病、脓毒症、神经疾病、中枢神经系统相关疾病、血管内相关疾病以及自身免疫相关疾病。治疗相关诊断还有助于对药物毒性、药物抗性或药物反应的预测。可开发任意适当诊断测试形式的治疗相关测试,其包括但不限于(例如)免疫组织化学测试方法、临床化学、免疫分析、基于细胞的技术、核酸测试或躯体成像方法。治疗相关测试可以进一步包括但不限于,有助于治疗确定的测试、监测治疗毒性测试或对治疗的反应的测试。因此,生物印记可用于预测或监测受试者对于治疗的反应。在开始、去除或改变特定治疗之后,可在不同的时间点对受试者测定生物印记。
在一些实施方案中,根据生物标志物(即,目标微RNA、囊泡和/或生物标志物)的一种或多种组分的量的变化、特定生物标志物的一种或多种组分的量或针对所述组分而检测的生物标志物作出受试者是否对治疗有反应的测定或预测。在另一个实施方案中,通过在不同时间点测定生物标志物而监测受试者的状况。确定状况的进程、消退或复发。也可在一段时程上测量对治疗的反应。因此,本发明提供了在受试者中监测疾病的状态或其它医学状况的方法,其包括从来自所述受试者的生物样品分离和检测生物印记,检测特定生物印记的组分的总量或者检测一种或多种组分的生物印记(诸如生物标志物的存在、不存在或表达水平)。所述生物印记可用于监测所述疾病或状况的状态。
在一些实施方案中,生物印记用于确定特定疾病或状况是否对于药物具有抗性。如果受试者对药物具有抗性,医生无需将宝贵的时间浪费在这种药物治疗上。为获得对药物选择或治疗方案的早期验证,对于得自受试者的样品确定生物印记。所述生物印记用于评估特定受试者的疾病是否具有与药物抗性相关的生物标志物。这种确定能够使医生将关键的时间以及患者的经济资源投入到有效的治疗中。
此外,生物印记可以用于评估受试者是否患有疾病、是否处于发生疾病的风险中或者用于评估疾病的阶段或进程。例如,生物印记可以用于评估受试者是否患有前列腺癌(例如图68、73)或者结肠癌(例如图69、74)。此外,生物印记可以用于确定疾病或状况的阶段,例如结肠癌(例如图71、72)。
此外,对囊泡(例如异质囊泡群体)的量以及一种或多种均质囊泡群体(例如具有相同生物印记的囊泡群体)的量进行测定可以用于表征表型。例如,对样品中囊泡的总量(即,非细胞类型特异性的)进行测定以及对一种或多种不同细胞源特异性囊泡的存在的确定可以用于表征表型。根据下文中进一步描述的,可以根据正常受试者与具有目标表型的受试者的比较来确定阈值或者参照值或量,并且根据所确定的阈值或参照值确定标准。不同的标准可以用于表征表型。
一种标准可以是基于样品中异质囊泡群体的量。在一个实施方案中,一般囊泡标志物(例如CD9、CD81和CD63)可以用于测定样品中囊泡的量。可检测CD9、CD81、CD63或其组合的表达水平并且如果所述水平高于阈值水平,则满足所述标准。在另一个实施方案中,如果CD9、CD81、CD63或其组合的水平低于阈值或参照值,则满足所述标准。在另一实施方案中,所述的标准可以基于囊泡的量是否高于阈值或参照值。另一种标准可以基于具有特定生物印记的囊泡的量。如果具有所述特定生物印记的囊泡的量低于阈值或参照值,则满足所述标准。在另一个实施方案中,如果具有所述特定生物印记的囊泡的量高于阈值或参照值,则满足所述标准。此外,标准还可以基于源自特定细胞类型的囊泡的量。如果所述的量低于阈值或参照值,则满足所述标准。在另一个实施方案中,如果所述的量高于阈值,则满足所述标准。
在非限制性实例中,考虑通过检测生物标志物PCSA或PSCA而测定来自前列腺细胞的囊泡,和如果所检测的PCSA或PSCA的水平高于阈值水平则满足标准。阈值可以是来自对照细胞系或对照受试者的样品中相同标志物的水平。另一种标准可以基于源自癌细胞或包含一种或多种癌症特异性生物标志物的囊泡的量。例如,可测定生物标志物B7H3、EpCam或两者,并且如果所检测的B7H3和/或EpCam的水平高于阈值水平或处于预定范围内则满足标准。如果所述的量低于或高于阈值或参照值,则满足所述标准。标准也可以为结果的可靠性,例如满足质量控制措施或值。测试样品中检测的B7H3和/或EpCam的量超过对照样品中这些标志物的量可以指示癌症存在于所述测试样品中。
如所描述的,可将对多种标志物的分析加以结合以评估是否满足标准。在说明性实例中,通过检测一般囊泡标志物CD9、CD63和CD81中的一种或多种、包括PCSA和PSMA在内的一种或多种的前列腺上皮标志物以及一种或多种癌症标志物(如B7H3和/或EpCam),将生物印记用于评估受试者是否患有前列腺癌。与未患前列腺癌的对照个体的样品相比,来自受试者的样品中标志物的较高水平表明了所述受试者中前列腺癌的存在。在一些实施方案中,以多重方式评估所述多种标志物。
技术人员应当了解,这些基于满足所描述的标准的规则可应用于任意适当的生物标志物。例如,所述标准可应用于囊泡特征,诸如存在的囊泡量、存在的具有特定生物印记的囊泡量、存在的囊泡有效负载生物标志物的量、存在的微RNA或其它循环生物标志物的量,等等。可测定适当生物标志物的比率。作为说明性实例,所述标准可以是囊泡表面蛋白与另一种囊泡表面蛋白的比率、囊泡表面蛋白与微RNA的比率、一种囊泡群体与另一种囊泡群体的比率、一种循环生物标志物与另一种循环生物标志物的比率,等等。
可以根据满足多种有用标准来表征受试者的表型。在一些实施方案中,至少一种标准用于各生物标志物。在一些实施方案中,使用至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90或至少100种标准。例如,就癌症的表征而言,当所述受试者被诊断为患有癌症时,可以使用多种不同的标准:1)是否来自受试者的样品中微RNA的量高于参照值;2)是否细胞类型特异性囊泡(即,源自特定的组织或器官的囊泡)中的微RNA的量高于参照值;或者3)是否具有一种或多种癌症特异性生物标志物的囊泡中微RNA的量高于参照值。如果微RNA的量低于所述参照值或与之相同,可应用类似的规则。所述的方法可以进一步包括质量控制措施,从而在所述的样品满足所述质量控制措施的情况下为受试者提供结果。在一些实施方案中,如果满足所述标准但是质量控制存疑,则重新评估所述受试者。
在其它实施方案中,针对多种生物标志物的评估测定了单一量度,并且所述度量与参照值进行比较。作为举例,对前列腺癌的测试可包括将PSA的水平乘以血样中的miR-141的水平。如果所述水平的积超过阈值,则满足所述标准,这表明癌症的存在。另举一例,针对一般囊泡标志物的多种结合剂可携带相同的标记物,如,相同的荧光团。可将所检测的标记物水平与阈值进行比较。
在相同类型的多种生物标志物以外,可将标准应用于多个类型的生物标志物。例如,可将一种或多种循环生物标志物(如RNA、DNA、肽)、囊泡、突变等的水平与参照进行比较。生物印记的不同成分可具有不同的标准。作为非限制性实例,用于诊断癌症的生物印记可包括一种miR物质与参照相比的过表达以及囊泡表面抗原与另一参照相比的表达不足。
可以通过比较囊泡的量、囊泡的结构或囊泡的任意其它信息性特征来确定生物印记。可以使用透射电子显微法(例如参见Hansen等,Journal of Biomechanics 31,Supplement 1:134-134(1)(1998))或扫描电子显微法评估囊泡的结构。可以使用方法和技术的多种不同组合或者对一种或多种囊泡的分析来确定受试者的表型。
生物印记可以包括但不限于生物标志物的存在或不存在、拷贝数、表达水平或者活性水平。其它有用的生物印记成分包括生物标志物的突变(例如影响转录或翻译产物活性的突变,诸如置换、缺失或插入突变)、变异体或翻译后修饰的存在。蛋白质生物标志物的翻译后修饰包括但不限于所述生物标志物的酰化、乙酰化、磷酸化、泛素化、脱乙酰作用、烷基化、甲基化、酰胺化、生物素化、γ-羧基化、谷氨酰胺化、糖基化、甘氨酰化、羟基化、亚铁血红素部分的共价连接、碘化、异戊二烯化、脂化、异戊烯化、GPI锚定形成、肉豆蔻酰化、法尼基化、香叶酰基香叶酰化、核苷酸或其衍生物的共价连接、ADP-核糖基化、黄素连接、氧化、棕榈酰化、聚乙二醇化、磷脂酰肌醇的共价连接、磷酸泛酰巯基乙胺化、多唾液酸化、焦谷氨酸形成、通过脯氨酰异构酶的脯氨酸外消旋化、tRNA介导的氨基酸添加(例如精氨酰化)、硫酸化、硫酸基团添加到酪氨酸上或者硒化。
本文所述的方法还可以用于鉴定与疾病、状况或生理状态有关的生物印记。所述的生物印记还可以用于确定受试者是否患有癌症或者是否处于发生癌症的风险中。处于发生癌症的风险中的受试者可以包括可能易感的受试者或者具有前症状早期阶段疾病的受试者。
还可以利用生物印记来针对其它疾病提供诊断或治疗的决断,所述的其它疾病包括但不限于自身免疫疾病、炎性肠病、阿尔兹海默氏病、帕金森氏病、多发性硬化症、脓毒症、胰腺炎或者在图3-58中所列的任何疾病、状况或症状。
所述的生物印记还可以用于从外周血、脐带血或羊水鉴定给定的妊娠状态或不利的妊娠结果(例如对唐氏综合征具有特异性的miRNA印记),例如先兆子痫、早产、胎膜早破、宫内生长迟缓或反复流产。所述的生物印记还可以用于指示母亲、所有发育阶段的胎儿、植入前胚胎或新生儿的健康情况。
生物印记可以用于前症状的诊断。此外,所述的生物印记可以用于检测疾病、确定疾病的阶段或进程、确定疾病的复发、确认治疗方法、确定治疗方法的效力或者评价与年纪或环境暴露有关的个体生理状态。
监测囊泡的生物印记还可用于鉴定受试者的毒性暴露,其包括但不限于早期暴露或暴露于未知的或未鉴定的毒剂的情形。不被任何一种作用机制的特定理论所束缚,囊泡可以从损伤细胞上脱落,并在这一过程中对细胞的特定内含物进行区室化,包括膜成分以及吞没的细胞质内含物。暴露于毒性剂/化学制品的细胞可能增加囊泡的脱落以排出毒性剂或其代谢物,由此导致提高的囊泡水平。因此,监测囊泡水平、囊泡生物印记或这两者允许评估个体对潜在毒性剂的反应。
通过检测一种或多种特异性抗原、结合剂、生物标志物或它们的任何组合,可将囊泡和/或本发明的其它生物标志物用于鉴定药物诱导的毒性或受损器官的状态。囊泡的水平、囊泡生物印记的变化或这两者可以用于监测个体急性、慢性或职业性暴露于多种毒性剂的情况,所述毒性剂包括但不限于药物、抗生素、工业化学制品、毒性抗生素代谢物、草药、日用化学制品以及通过天然形成或自然合成由其它生物体产生的化学物质。此外,生物印记可以用于鉴定状况或疾病,其包括未知起源的癌症,也称为不明原发部位的癌症(CUP)。
可以如此前描述的从生物样品分离囊泡从而得到异质囊泡群体。然后,将异质囊泡群体与涂覆有特异性结合剂的基底相接触,所述的结合剂设计为排除或鉴定对给定细胞源具有特异性的囊泡群体的抗原特异性特征。此外,按照上文所述的,囊泡的生物印记可以与细胞的癌症状态关联。在受试者中抑制癌症的化合物可以引起可随时间或治疗过程通过对囊泡进行系列分离而监测的变化,例如囊泡的生物印记的变化。可以监测具有特定生物印记的囊泡水平或囊泡水平的变化。
在一个方面,本发明涉及生物标志物发现和生物印记发现。在一个实施方案中,对疗法有反应的一名或多名受试者(响应者)以及对相同的疗法无反应的一名或多名受试者(非响应者)可受到对其囊泡的探查。可进行探查以鉴定一种或多种生物标志物的存在,所述生物标志物包括本文所述的任何生物标志物。在一个方面,分析了miR的存在、数量和有效负载。miR的有效负载可以是,例如,表面或内部蛋白质、核酸、脂质或碳水化合物。
在响应者而不在非响应者中生物印记的存在与否可用于治疗诊断。可针对以下一种或多种分析来自响应者的样品:囊泡量、独特囊泡亚组或种类的量、这些囊泡中的生物标志物、这些囊泡的生物印记,等等。在一种情况下,针对一种或多种miRNA(诸如miRNA 122、miR-548c-5p、miR-362-3p、miR-422a、miR-597、miR-429、miR-200a和/或miR-200b)的存在和/或量分析来自响应者和非响应者的囊泡,诸如微囊泡或外来体。响应者和非响应者之间生物印记的差异可用于治疗诊断。在另一个实施方案中,从具有疾病或状况的受试者获得囊泡。还从未有该疾病或状况的受试者获得囊泡。针对独特的生物印记而对来自两组受试者的囊泡进行分析,所述独特生物印记与该组中的全部受试者相关但不与来自另一组的受试者相关。这些生物印记或生物标志物随后可用作为针对所述状况或疾病存在与否的诊断,或用于将所述受试者归类于所述组中的一个组(患有/未患疾病、侵袭性/非侵袭性疾病、响应者/非响应者的组,等)。
在进一步的实例中,通过患有I期癌症和患有II期或III期的同一种癌症的患者对囊泡进行分析。鉴定了来自各组患者的囊泡之间的生物标志物或生物印记的差异(例如,来自III期癌症的囊泡可能具有一种或多种基因或miR的提高表达),由此而鉴定了区分疾病不同阶段的生物印记或生物标志物。随后可将该生物印记用于对患有所述疾病的患者进行预后。
在某些情况下,通过在一段时间(例如,每日、每周、每月或每年)内分析来自受试者的囊泡而确定生物印记。因此,响应者和非响应者或处于I期和II/III期的患者可随时间(例如,每月)受到对其囊泡的探查。可比较所述囊泡在各时间点处的有效负载或物理性质。因此时间模式可形成随后可用于治疗诊断、诊断、预后、疾病分级、治疗监控、疾病监控或作出响应者/非响应者状态预测的生物印记。作为非限制实例,囊泡中生物标志物(如miR122)随时程提高的量可与转移性癌症相关,这与囊泡中生物标志物随时程不变的量可与非转移性癌症相关相反。时程可持续超过至少1周、2周、3周、4周、1个月、6周、8周、2个月、10周、12周、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月或至少12个月。
囊泡的水平、具有特定生物印记的囊泡的水平或囊泡的生物印记也可以用于评估针对状况的治疗效力。例如,囊泡的水平、具有定生物印记的囊泡的水平或囊泡的生物印记可以用于评估癌症治疗的效力,例如化疗、放疗或者可用于抑制受试者中的癌症的任何其它治疗方法。此外,生物印记可以用于筛选分析以鉴定对囊泡的生物印记具有调控性作用的候选物或测试化合物或试剂(例如蛋白质、肽、拟肽、类肽、小分子或其它药物)。通过所述的筛选分析所鉴定的化合物可以用于(例如)调节状况或疾病,例如抑制、改善、治疗或预防状况或疾病。
例如,囊泡的生物印记可以得自对特定的癌症正进行成功治疗的患者。可以对得自未使用相同的药物进行治疗的癌症患者的细胞进行培养,并从所述培养物获得囊泡以用于确定生物印记。所述的细胞可以使用测试化合物处理,并且可以将得自所述培养物的囊泡的生物印记与得自进行成功治疗的患者的囊泡的生物印记进行比较。可以选择产生与正进行成功治疗的患者的生物印记相似的生物印记的测试化合物以用于进一步的研究。
此外,囊泡的生物印记还可以用于监测试剂(例如药物化合物)在临床试验中对生物印记的影响。此外,监测囊泡的水平、囊泡生物印记的变化或这两者也可以用于评估测试化合物的效力的方法,例如用于抑制癌细胞的测试化合物。
此外,囊泡的水平、囊泡的生物印记或这两者还可以用于确定特定治疗干预(药物的或非药物的)的有效性以及用于改变所述的干预从而1)降低发生不利结果的风险,2)增强干预的有效性或者3)鉴别抗性状态。因此,除了诊断或证实疾病、状况或症状的存在或发生风险外,本文所公开的方法和组合物还提供了用于优化对患有所述的疾病、状况或症状的受试者的治疗的系统。例如,可以通过鉴定囊泡的生物印记来确定治疗疾病、状况或症状的治疗相关途径(其通过将诊断和治疗加以整合从而改善受试者的实时治疗)。
鉴定囊泡的水平、囊泡生物印记或这两者的测试方法可以用于鉴定最适于特定治疗的患者,并对药物如何良好地发挥作用提供反馈,从而优化治疗方案。例如,在妊娠诱导的高血压和相关状况中,治疗相关的诊断可以随时间灵活地监测重要参数的变化(例如细胞因子和/或生长因子的水平),从而优化治疗。
在FDA、MDA、EMA、USDA和EMEA所定义的研究用药物的临床试验情况中,通过本文所公开的生物印记确定的治疗相关的诊断可以为优化试验设计、监测效力以及增加药物安全性提供关键的信息。例如,就试验设计而言,治疗相关的诊断可以用于患者分级、患者资格的确定(入组/排除)、同质治疗组的创建、以及对经优化以匹配病例对照同龄组的患者样品的选择。因此,该治疗相关的诊断可以提供患者效力富集(patient efficacy enrichment)的手段,由此将试验募集所需的个体数量降至最低。例如,就效力而言,治疗相关的诊断可以用于监测治疗诊断治疗并评估效力标准。或者,就安全性而言,治疗相关的诊断可以用于预防不良药物反应或避免医疗错误以及监测对治疗方案的顺应性。
在一些实施方案中,本发明提供了鉴定针对进行临床试验的治疗的响应者和非响应者的方法,其包括在参与所述临床试验的患者中检测包含微RNA的生物印记,以及鉴定在响应者和非响应者之间不同的生物印记。在进一步的实施方案中,在药物初治受试者中测量所述生物印记并将其用于预测所述受试者应为响应者或非响应者。所述预测可根据所述药物初治受试者的生物印记是否与经鉴定为响应者的临床试验受试者更为紧密地关联,由此而预测所述药物初治受试者应为响应者。相反地,如果所述药物初治受试者的生物印记与经鉴定为非响应者的临床试验受试者更为紧密地关联,则本发明的方法可预测所述药物初治受试者应为非响应者。因此,所述预测可用于对所述治疗的潜在响应者和非响应者加以区分。在一些实施方案中,所述预测用于指导疗程,如,通过帮助治疗医师决定是否施用所述药物。在一些实施方案中,所述预测用于指导对参与进一步临床试验的患者的选择。在非限制性实例中,在II期试验中预测响应者/非响应者状态的生物印记可用于选择进行III期试验的患者,由此而提高了III期患者群体中有反应的可能性。技术人员应当了解,所述方法可经调整用于鉴定生物印记,从而根据除响应者/非响应者状态之外的标准对受试者加以区分。在一个实施方案中,所述标准是治疗安全性。因此,根据上文遵循所述方法以鉴定对所述治疗有可能具有或不会具有不良状况的受试者。在非限制性实例中,在II期试验中预测安全性特征的生物印记可用于选择进行III期试验的患者,由此提高了所述III期患者群体中的治疗安全性特征。
因此,所述囊泡水平、囊泡生物印记或两者均可用于监测药效、测定对给定药物的反应或抗性或者两者,从而增强了药物安全性。例如,在结肠癌中,囊泡一般从结肠癌细胞上脱落并且可从外周血中分离并用于分离一种或多种生物标志物,如KRAS mRNA,其可随后进行测序以检测KRAS突变。在mRNA生物标志物的情况中,所述mRNA可以逆转录成为cDNA并进行测序(例如通过Sanger测序、焦磷酸测序、NextGen测序、RT-PCR分析),从而确定是否存在赋予药物(例如西妥昔单抗或帕尼单抗)抗性的突变。在另一个实施例中,从生物样品中分离从肺癌细胞上特异性地脱落的囊泡,并将其用于分离肺癌的生物标志物,例如EGFRmRNA。将EGFR mRNA加工成cDNA并测序,从而确定是否存在EGFR突变(其显示出对用于肺癌的特定药物治疗的抗性或反应)。
可以将一种或多种生物印记分组,从而使所获得的有关特定组中的生物印记集的信息为进行临床相关决策提供合理基础,例如但不限于诊断、预后或治疗管理,例如治疗选择。
与大多数诊断性标志物一样,使用足以作出正确的医学判断的最少数量的标志物通常是理想的。这防止了在等待进一步分析的治疗延误以及时间和资源的不适当使用。
此外,本文公开了对样品(例如血清和组织生物库)实施回顾性分析的方法,以达到将定性和定量性质(例如囊泡的生物印记)与疾病状态、疾病阶段、进展、预后方面的临床结果;治疗效力或选择;或者生理状况相关联的目的。此外,本文所公开的方法和组合物用于对样品(例如在临床试验中由个体收集的血清和/或组织)的前瞻性分析,以达到将定性和定量的囊泡生物印记与疾病状态、疾病阶段、进展、预后方面的临床结果;治疗效力或选择;或者生理状况相关联的目的。如本文所用,囊泡的生物印记可用于鉴定细胞源特异性的囊泡。此外,生物印记可以根据囊泡的表面标志物分布或囊泡的内含物来确定。
用于根据本发明表征表型的生物印记可包含多种成分(如,微RNA、囊泡或其它生物标志物)或特征(如,囊泡大小或形态)。所述生物印记可以包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、75或100种成分或特征。具有多于一种成分或特征(例如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、75或100种成分)的生物印记可以在表征表型方面提供更高的灵敏度和/或特异性。在一些实施方案中,与评估较少成分或特征的情况相比,评估多种成分或特征提供了增强的灵敏度和/或特异性。另一方面,使用足以作出正确的医学判断的最少数量的成分或特征通常是理想的。更少的标志物可避免对分类器的统计学过拟合并且可防止在等待进一步分析的治疗延误以及时间和资源的不适当使用。因此,本发明的方法包括确定成分或特征的最佳数量。
根据本发明的生物印记可用于以上述的灵敏度、特异性、精确性或类似的性能度量来表征表型。所述生物印记还可用于建立分类器以将样品归类为属于某一组,诸如属于患有或未患疾病的组、患有侵袭性疾病或未患侵袭性疾病的组、响应者或非响应者的组。在一个实施方案中,分类器用于确定受试者是否患有侵袭性或非侵袭性癌症。在前列腺癌的示例性情况下,这可辅助医师确定是否对所述癌症进行观察(即,开具“观察等待”处方)或者实施前列腺切除术。在另一个实施方案中,分类器用于确定乳腺癌患者是否有可能对他莫昔芬有反应或无反应,从而辅助医师确定是否使用他莫昔芬或另一药物治疗所述患者。
生物标志物
用于表征表型的生物印记可以包含一种或多种生物标志物。所述生物标志物可以是循环标志物、膜相关标志物或存在于囊泡内或囊泡表面上的成分。这些生物标志物包括但不限于核酸(例如RNA(mRNA、miRNA等)或DNA)、蛋白质、肽、多肽、抗原、脂质、碳水化合物或蛋白聚糖。
所述的生物印记可以包括生物标志物(例如图1、3-60中所列的任何一种或多种生物标志物)的存在或不存在、表达水平、突变状态、遗传变体状态或任何修饰(例如外遗传修饰、翻译后修饰)。可以将生物标志物的表达水平与对照或参照相比,以确定样品中生物标志物的过表达或表达不足(或者上调或下调)。在一些实施方案中,所述对照或参照水平包括得自不具有或未表现出状况或疾病的受试者的对照样品中的相同生物标志物(例如miRNA)的量。在另一个实施方案中,所述对照或参照水平包括不同生物学状况(诸如患病对未患病状态)中水平受到最低影响(如果有影响的话)的管家标志物的水平。在又另一个实施方案中,所述对照或参照水平包括同一受试者中但是在不同时间点采集的样品中相同标志物的水平。本文描述了其它类型的对照。
核酸生物标志物包括各种RNA或DNA物质。例如,所述的生物标志物可以为mRNA、微RNA(miRNA)、小核仁RNA(snoRNA)、小核RNA(snRNA)、核糖体RNA(rRNA)、不均一核RNA(hnRNA)、核糖体RNA(rRNA)、siRNA、转运RNA(tRNA)或shRNA。所述的DNA可以为双链DNA、单链DNA、互补DNA或非编码DNA。miRNA是短的核糖核酸(RNA)分子,其平均长约22个核苷酸。miRNA作为转录后调节剂发挥作用,其结合靶信使RNA(mRNA)的3'非翻译区(3'UTR)中的互补序列,这可导致基因沉默。一种miRNA可作用于1000种mRNA。miRNA在负向调控中发挥多种作用,例如,转录物降解和隔离、翻译压制,并且还可在正向调控中发挥作用,例如,转录和翻译激活。通过影响基因调控,miRNA可影响许多生物过程。在不同的细胞类型和组织中发现不同的表达miRNA集。
用于本发明的生物标志物进一步包括肽、多肽或蛋白质,这些术语在全文中可互换地使用,除非另行注明。在一些实施方案中,所述蛋白质生物标志物包括其修饰状态、截短、突变、表达水平(诸如,与参照水平相比过表达或表达不足)和/或翻译后修饰,例如上文所述。在非限制性实例中,疾病的生物印记可包括具有特定翻译后修饰的蛋白质,其在与所述疾病关联的样品中比不与其关联的样品中更为普遍。
生物印记可以包括多种相同类型的生物标志物(例如两种不同的微RNA物质),或者一种或多种不同类型的生物标志物(例如mRNA、miRNA、蛋白质、肽、配体和抗原)。
一种或多种生物印记可以包括选自图1、3-60中所列的至少一种生物标志物。特定细胞源生物印记可以包括一种或多种生物标志物。图3-58描绘了罗列了多种疾病或状况特异性生物标志物的表,其中所述的生物标志物可由囊泡得到并分析。此外,所述的生物标志物还可以为CD24、中期因子(midkine)、铁调素、TMPRSS2-ERG、PCA-3、PSA、EGFR、EGFRvIII、BRAF变体、MET、cKit、PDGFR、Wnt、β-连环蛋白、K-ras、H-ras、N-ras、Raf、N-myc、c-myc、IGFR、PI3K、Akt、BRCA1、BRCA2、PTEN、VEGFR-2、VEGFR-1、Tie-2、TEM-1、CD276、HER-2、HER-3或HER-4。此外,所述的生物标志物还可以为膜联蛋白V、CD63、Rab-5b或小窝蛋白或者miRNA,例如let-7a、miR-15b、miR-16、miR-19b、miR-21、miR-26a、miR-27a、miR-92、miR-93、miR-320或miR-20。此外,所述的生物标志物还可以为在PCT公开号No.WO2009/100029中所公开的任何基因或其片段,例如其中的表3-15中所列的那些。
在本文所公开的方法和组合物中可用于评估的其它生物标志物包括与美国专利No.6329179和7,625,573;美国专利公开号No.2002/106684、2004/005596、2005/0159378、2005/0064470、2006/116321、2007/0161004、2007/0077553、2007/104738、2007/0298118、2007/0172900、2008/0268429、2010/0062450、2007/0298118、2009/0220944和2010/0196426;美国专利申请No.12/524,432、12/524,398、12/524,462;加拿大专利CA 2453198;以及国际PCT专利公开No.WO1994022018、WO2001036601、WO2003063690、WO2003044166、WO2003076603、WO2005121369、WO2005118806、WO/2005/078124、WO2007126386、WO2007088537、WO2007103572、WO2009019215、WO2009021322、WO2009036236、WO2009100029、WO2009015357、WO2009155505、WO2010/065968和WO 2010/070276中所公开的状况或生理状态相关的生物标志物;各专利或申请全文以引用的方式并入本文。这些专利和申请中公开的生物标志物(包括囊泡生物标志物和微RNA)可作为用于表征表型(诸如提供癌症或其它疾病的诊断、预后或治疗诊断)的印记的一部分进行评估。此外,本文公开的方法和技术可用于评估生物标志物,包括囊泡生物标志物和微RNA。
可用于在本文公开的方法和组合物中进行评估的另一组可用生物标志物包括与癌症诊断、预后或治疗诊断相关的生物标志物,如公开于美国专利6,692,916、6,960,439、6,964,850、7,074,586;美国专利申请No.11/159,376、11/804,175、12/594,128、12/514,686、12/514,775、12/594,675、12/594,911、12/594,679、12/741,787、12/312,390;以及国际PCT专利申请No.PCT/US2009/049935、PCT/US2009/063138、PCT/US2010/000037中的;各专利或申请全文以引用的方式并入本文。有用的生物标志物进一步包括针对炎性疾病在美国专利申请No.10/703,143和US 10/701,391中;针对类风湿关节炎在11/529,010中;针对多发性硬化症在11/454,553和11/827,892中;针对移植排斥反应在11/897,160中;针对狼疮在12/524,677中;针对骨关节炎的PCT/US2009/048684中;针对感染性疾病和脓毒症在10/742,458中;针对脓毒症在12/520,675中描述的;各专利或申请全文以引用的方式并入本文。这些专利和申请中公开的生物标志物(包括微RNA)可作为用于表征表型(诸如提供癌症或其它疾病的诊断、预后或治疗诊断)的印记的部分进行评估。此外,本文公开的方法和技术可用于评估生物标志物,包括囊泡生物标志物和微RNA。
可在本文公开的方法和组合物中用于评估的再另外的生物标志物包括与Wieczorek等.Isolation and characterization of an RNA-proteolipid complexassociated with the malignant state in humans,Proc Natl Acad Sci U S A.1985年5月;82(10):3455-9;Wieczorek等.Diagnostic and prognostic value of RNA-proteolipid in sera of patients with malignant disorders following therapy:first clinical evaluation of a novel tumor marker,Cancer Res.1987年12月1日;47(23):6407-12;Escola等Selective enrichment of tetraspan proteins on theinternal vesicles of multivesicular endosomes and on exosomes secreted byhuman B-lymphocytes.J.Biol.Chem.(1998)273:20121-27;Pileri等Binding ofhepatitis C virus to CD81Science,(1998)282:938-41);Kopreski等Detection ofTumor Messenger RNA in the Serum of Patients with Malignant Melanoma,Clin.Cancer Res.(1999)5:1961-1965;Carr等Circulating Membrane Vesicles inLeukemic Blood,Cancer Research,(1985)45:5944-51;Weichert等Cytoplasmic CD24expression in colorectal cancer independently correlates with shortenedpatient survival.Clinical Cancer 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可在本文公开的方法和组合物中用于评估的再另外的生物标志物包括与Rajendran等,Proc Natl Acad Sci U S A 2006;103:11172-11177、Taylor等,GynecolOncol 2008;110:13-21、Zhou等,Kidney Int 2008;74:613-621,Buning等,Immunology2008、Prado等J Immunol 2008;181:1519-1525、Vella等(2008)Vet ImmunolImmunopathol 124(3-4):385-93、Gould等(2003).Proc Natl Acad Sci U S A 100(19):10592-7、Fang等(2007).PLoS Biol 5(6):e158,Chen,B.J.and R.A.Lamb(2008).Virology372(2):221-32,Bhatnagar,S.and J.S.Schorey(2007).J Biol Chem 282(35):25779-89、Bhatnagar等(2007)Blood 110(9):3234-44、Yuyama等(2008).J Neurochem 105(1):217-24、Gomes等(2007).Neurosci Lett 428(1):43-6、Nagahama等(2003).Autoimmunity 36(3):125-31、Taylor,D.D.,S.Akyol等(2006).J Immunol176(3):1534-42、Peche等(2006).Am J Transplant 6(7):1541-50、Iero,M.,M.Valenti等(2008).Cell Death andDifferentiation 15:80–88、Gesierich,S.,I.Berezoversuskiy等(2006),Cancer Res 66(14):7083-94、Clayton,A.,A.Turkes等(2004).Faseb J 18(9):977-9、Skriner.,K.Adolph等(2006).Arthritis Rheum 54(12):3809-14、Brouwer,R.,G.J.Pruijn等(2001).Arthritis Res3(2):102-6、Kim,S.H.,N.Bianco等(2006).Mol Ther 13(2):289-300、Evans,C.H.,S.C.Ghivizzani等(2000).Clin Orthop Relat Res(379Suppl):S300-7、Zhang,H.G.,C.Liu等(2006).J Immunol 176(12):7385-93、Van Niel,G.,J.Mallegol等(2004).Gut 52:1690-1697、Fiasse,R.和O.Dewit(2007).Expert Opinion onTherapeutic Patents 17(12):1423-1441(19)中公开的状况或生理状态相关的生物标志物。这些出版物中公开的生物标志物(包括囊泡生物标志物和微RNA)可作为用于表征表型(诸如提供癌症或其它疾病的诊断、预后或治疗诊断)的印记的一部分进行评估。此外,本文公开的方法和技术可用于评估生物标志物,包括囊泡生物标志物和微RNA。
可以由囊泡得到并分析的生物标志物为miRNA(miR)、miRNA*无义(miR*)以及其它RNA(包括但不限于mRNA、preRNA、priRNA、hnRNA、snRNA、siRNA、shRNA)。miRNA生物标志物不仅包括其miRNA和微RNA*无义,而且包括其前体分子:原微RNA(原miR)和前微RNA(前miR)。miRNA的序列可以自公开可得的数据库得到,例如http://www.mirbase.org/、http://www.microrna.org/或者任何其它可得的数据库。所述生物标志物还可以是核酸分子(如DNA)、蛋白质或肽。可以测定所述生物标志物的存在或不存在、表达水平、突变(例如基因突变,如缺失、易位、重复、核苷酸或氨基酸置换等)。还可以分析生物标志物的任何外遗传调控或拷贝数变异。
进行分析的一种或多种生物标志物可以为特定组织或细胞来源、疾病或生理状态的指示。此外,本文所描述的一种或多种生物标志物的存在、不存在或表达水平可以与受试者的表型(包括疾病、状况、预后或药效)相关。下文给出的特定生物标志物和生物印记构成了各疾病、状况比较、状况和/或生理状态的非包含性实例。此外,针对表型所评估的一种或多种生物标志物可以为细胞源特异性的囊泡。
用于表征表型的一种或多种miRNA可以选自在PCT公开号No.WO2009/036236中所述的miRNA。例如,在其中表I-VI(图6-11)中所列的一种或多种miRNA可以用于表征结肠腺癌、结肠直肠癌、前列腺癌、肺癌、乳腺癌、b-细胞淋巴瘤、胰腺癌、弥漫性大BCL癌、CLL、膀胱癌、肾癌、乏氧肿瘤、子宫肌瘤、卵巢癌、丙型肝炎病毒相关肝细胞癌、ALL、阿尔兹海默氏病、骨髓纤维变性、骨髓纤维化、真性红细胞增多症、血小板增多症、HIV或HIV-I潜伏,如本文中进一步描述的。
可以在囊泡中检测一种或多种miRNA。所述一种或多种miRNA可以为miR-223、miR-484、miR-191、miR-146a、miR-016、miR-026a、miR-222、miR-024、miR-126和miR-32。此外,还可以在PBMC中检测一种或多种miRNA。所述一种或多种miRNA可以为miR-223、miR-150、miR-146b、miR-016、miR-484、miR-146a、miR-191、miR-026a、miR-019b或miR-020a。所述一种或多种miRNA可以用于表征特定的疾病或状况。例如,对于膀胱癌疾病而言,可以检测一种或多种miRNA,例如miR-223、miR-26b、miR-221、miR-103-1、miR-185、miR-23b、miR-203、miR-17-5p、miR-23a、miR-205或它们的任何组合。所述的一种或多种miRNA可以被上调或过表达。
在一些实施方案中,所述的一种或多种miRNA用于表征乏氧肿瘤。所述的一种或多种miRNA可以为miR-23、miR-24、miR-26、miR-27、miR-103、miR-107、miR-181、miR-210或miR-213,并且可以上调。一种或多种miRNA还可以用于表征子宫肌瘤。例如,用于表征子宫肌瘤的一种或多种miRNA可以为let-7家族的成员、miR-21、miR-23b、miR-29b或miR-197。所述的miRNA可以被上调。
还可以通过一种或多种miRNA表征骨髓纤维变性,例如miR-190(其可以上调);miR-31、miR-150和miR-95(其可以受到下调);或者它们的任何组合。此外,还可以通过检测一种或多种miRNA来表征骨髓纤维化、真性红细胞增多症或血小板增多症,例如但不限于miR-34a、miR-342、miR-326、miR-105、miR-149、miR-147或者它们的任何组合。所述的一种或多种miRNA可以下调。
可以通过评估囊泡的一种或多种生物标志物来表征的表型的其它实例在下文中进一步描述。
可以使用探针检测一种或多种生物标志物。探针可以包括寡核苷酸(例如DNA或RNA)、适体、单克隆抗体、多克隆抗体、Fab、Fab'、单链抗体、合成抗体、类肽、zDNA、肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)、凝集素、合成或天然形成的化学化合物(包括但不限于药物或标记试剂)、枝状物或它们的组合。可以通过例如直接标记来直接检测所述的探针,或者通过例如标记试剂来间接检测所述的探针。所述的探针可以选择性地识别生物标志物。例如,作为寡核苷酸的探针可以选择性地与miRNA生物标志物杂交。
在多个方面中,本发明用于对受试者的疾病或失调进行诊断、治疗诊断、预后、疾病分级、治疗监控或作出响应者/非响应者状态预测。本发明包括对来自受试者的囊泡进行评估,其包括评估存在于所述囊泡上的生物标志物和/或评估所述囊泡中的有效负载,诸如蛋白质、核酸或其它生物分子。可使用囊泡进行评估并且与疾病或失调相关的任何适当的生物标志物可用于实施本发明的方法。此外,可使用任何适当的技术评估本文所述的囊泡。可根据本发明的方法进行评估的对于特定疾病的示例性生物标志物包括以下:
乳腺癌
乳腺癌特异性生物标志物可以包括一种或多种(例如2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种或更多种)过表达的miR、表达不足的miR、mRNA、基因突变、蛋白质、配体、肽、snoRNA或者它们的任何组合,例如图3中所列。
可以评估一种或多种乳腺癌特异性生物标志物,从而提供乳腺癌特异性生物印记。例如,所述的生物印记可以包括一种或多种过表达的miR,包括但不限于miR-21、miR-155、miR-206、miR-122a、miR-210、miR-21、miR-21、miR-155、miR-206、miR-122a、miR-210或miR-21或者它们的任何组合。
所述的生物印记还可以包括一种或多种表达不足的miR,例如但不限于let-7、miR-10b、miR-125a、miR-125b、miR-145、miR-143、miR-145、miR-16、let-7、let-7、let-7、miR-10b、miR-125a、miR-125b或miR-145或它们的任何组合。
可以分析的mRNA可以包括但不限于ER、PR、HER2、MUC1或EGFR或它们的任何组合。突变(包括但不限于与KRAS、B-Raf或CYP2D6,或者它们的任何组合相关的突变)也可以用作来自囊泡的乳腺癌特异性生物标志物。此外,可以用作来自乳腺癌特异性囊泡的生物标志物的蛋白质、配体或肽包括但不限于hsp70、MART-1、TRP、HER2、hsp70、MART-1、TRP、HER2、ER、PR、III类b-微管蛋白或VEGFA,或它们的任何组合。此外,可以用作乳腺癌的外来体生物标志物的snoRNA包括但不限于GAS5。基因融合物ETV6-NTRK3也可以用作乳腺癌的生物标志物。
本发明还提供了分离的囊泡,其包含一种或多种乳腺癌特异性生物标志物,例如ETV6-NTRK3;或者图3和图1中所列的对于乳腺癌的生物标志物。还提供了包含分离的囊泡的组合物。因此,在一些实施方案中,所述的组合物包含囊泡群体,该群体包含一种或多种乳腺癌特异性生物标志物,例如ETV6-NTRK3;或者图3和图1中所列的对于乳腺癌的生物标志物。所述的组合物可以包含明显富集的囊泡群体,其中所述的囊泡群体是基本上均质的乳腺癌特异性囊泡或者包含一种或多种乳腺癌特异性生物标志物(例如ETV6-NTRK3)或图3和图1中所列的对于乳腺癌的生物标志物的囊泡。
为表征乳腺癌,还可以通过本文所述的一种或多种系统来检测一种或多种乳腺癌特异性生物标志物(例如ETV6-NTRK3)或图3和图1中所列的对于乳腺癌的生物标志物。例如,检测系统可以包括一种或多种探针以检测生物样品的一种或多种囊泡的一种或多种乳腺癌特异性生物标志物(例如ETV6-NTRK3)或图3和图1中所列的对于乳腺癌的生物标志物。
卵巢癌
来自囊泡的卵巢癌特异性生物标志物可以包括一种或多种(例如,2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种或更多种)过表达的miR、表达不足的miR、mRNA、基因突变、蛋白质、配体、肽、snoRNA或者它们的任何组合,例如图4中所列的,并且可以用于建立卵巢癌特异性生物印记。例如,所述的生物印记可以包括一种或多种过表达的miR,诸如但不限于miR-200a、miR-141、miR-200c、miR-200b、miR-21、miR-141、miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-203、miR-205、miR-214、miR-199*或miR-215或它们的任何组合。此外,所述的生物印记还可以包括一种或多种表达不足的miR,例如但不限于miR-199a、miR-140、miR-145、miR-100、miR-let-7群或miR-125b-1或它们的任何组合。可以进行分析的一种或多种mRNA可包括但不限于ERCC1、ER、TOPO1、TOP2A、AR、PTEN、HER2/neu、CD24或EGFR,或它们的任何组合。
可在囊泡中进行评估的卵巢癌生物标志物突变包括但不限于KRAS突变、B-Raf突变或者卵巢癌特异性的突变的任何组合。可在囊泡中进行评估的蛋白质、配体或肽可以包括但不限于VEGFA、VEGFR2或HER2,或它们的任何组合。此外,分离或测定的囊泡可以为卵巢癌细胞特异性的或者源自卵巢癌细胞。
本发明还提供了分离的囊泡,其包含一种或多种卵巢癌特异性生物标志物,例如CD24;或者图4和图1中所列的对于卵巢癌的生物标志物。还提供了包含分离的囊泡的组合物。因此,在一些实施方案中,所述组合物包含囊泡群体,该群体包含一种或多种卵巢癌特异性生物标志物,例如CD24;或者图4和图1中所列的对于卵巢癌的生物标志物。所述的组合物可以包含明显富集的囊泡群体,其中所述的囊泡群体是基本上均质的卵巢癌特异性囊泡或者包含一种或多种卵巢癌特异性生物标志物(例如CD24)或图4和图1中所列的那些的囊泡。
为表征卵巢癌,还可以通过本文所述的一种或多种系统来检测一种或多种卵巢癌特异性生物标志物(例如CD24)或图4和图1中所列的卵巢癌特异性生物标志物。例如,检测系统可以包括一种或多种探针,以检测生物样品中一种或多种囊泡的一种或多种卵巢癌特异性生物标志物(例如CD24)或图4和图1中所列的那些。
肺癌
来自囊泡的肺癌特异性生物标志物可以包括一种或多种(例如,2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种或更多种)过表达的miR、表达不足的miR、mRNA、基因突变、蛋白质、配体、肽、snoRNA或者它们的任何组合,例如图5中所列,并且可以用于建立肺癌特异性生物印记。
所述的生物印记可以包括一种或多种过表达的miR,例如但不限于miR-21、miR-205、miR-221(保护性的)、let-7a(保护性的)、miR-137(风险性的)、miR-372(风险性的)、miR-122a(风险性的)或它们的任何组合。所述的生物印记可以包括一种或多种上调或过表达的miRNA,例如miR-17-92、miR-19a、miR-21、miR-92、miR-155、miR-191、miR-205或miR-210;一种或多种下调或表达不足的miRNA,例如miR-let-7,或它们的任何组合。所述一种或多种生物标志物可以是miR-92a-2*、miR-147、miR-574-5p,如用于小细胞肺癌。
可以进行分析的一种或多种mRNA可以包括但不限于EGFR、PTEN、RRM1、RRM2、ABCB1、ABCG2、LRP、VEGFR2、VEGFR3、III类b-微管蛋白或它们的任何组合。
可在囊泡中进行评估的肺癌的生物标志物突变包括但不限于EGFR、KRAS、B-Raf、UGT1A1的突变;或者肺癌特异性的突变的任何组合。可在囊泡中进行评估的蛋白质、配体或肽可以包括但不限于KRAS、hENT1或它们的任何组合。
所述的生物标志物还可以为中期因子(MK或MDK)。此外,所分离或分析的囊泡可以为肺癌细胞特异性的或者源自肺癌细胞。
本发明还提供了分离的囊泡,其包含一种或多种肺癌特异性生物标志物,例如RLF-MYCL1、TGF-ALK或CD74-ROS1;或者图5和图1中所列的那些。还提供了包含分离的囊泡的组合物。因此,在一些实施方案中,所述的组合物包含囊泡群体,该群体包含一种或多种肺癌特异性生物标志物,例如RLF-MYCL1、TGF-ALK或CD74-ROS1;或者图5和图1中所列的那些。所述的组合物可以包含明显富集的囊泡群体,其中所述的囊泡群体是基本上均质的肺癌特异性囊泡、或者包含一种或多种肺癌特异性生物标志物(例如RLF-MYCL1、TGF-ALK或CD74-ROS1)或图5和图1中所列的那些的囊泡。
为表征肺癌,还可以通过本文所述的一种或多种系统来检测一种或多种肺癌特异性生物标志物(例如RLF-MYCL1、TGF-ALK或CD74-ROS1)或图5和图1中所列的对于肺癌的那些生物标志物。例如,检测系统可以包括一种或多种探针以检测生物样品中一种或多种囊泡的一种或多种肺癌特异性生物标志物(例如RLF-MYCL1、TGF-ALK或CD74-ROS1)或图5和图1中所列的对于肺癌的那些生物标志物。
结肠癌
来自囊泡的结肠癌特异性生物标志物可以包括一种或多种(例如,2、3、4、5、6、7、8或更多种)过表达的miR、表达不足的miR、mRNA、基因突变、蛋白质、配体、肽、snoRNA或者它们的任何组合,例如图6中所列的,并且可以用于建立结肠癌特异性生物印记。例如,所述的生物印记可以包括一种或多种过表达的miR,例如但不限于miR-24-1、miR-29b-2、miR-20a、miR-10a、miR-32、miR-203、miR-106a、miR-17-5p、miR-30c、miR-223、miR-126、miR-128b、miR-21、miR-24-2、miR-99b、miR-155、miR-213、miR-150、miR-107、miR-191、miR-221、miR-20a、miR-510、miR-92、miR-513、miR-19a、miR-21、miR-20、miR-183、miR-96、miR-135b、miR-31、miR-21、miR-92、miR-222、miR-181b、miR-210、miR-20a、miR-106a、miR-93、miR-335、miR-338、miR-133b、miR-346、miR-106b、miR-153a、miR-219、miR-34a、miR-99b、miR-185、miR-223、miR-211、miR-135a、miR-127、miR-203、miR-212、miR-95或miR-17-5p或它们的任何组合。所述的生物印记还可以包括一种或多种表达不足的miR,例如miR-143、miR-145、miR-143、miR-126、miR-34b、miR-34c、let-7、miR-9-3、miR-34a、miR-145、miR-455、miR-484、miR-101、miR-145、miR-133b、miR-129、miR-124a、miR-30-3p、miR-328、miR-106a、miR-17-5p、miR-342、miR-192、miR-1、miR-34b、miR-215、miR-192、miR-301、miR-324-5p、miR-30a-3p、miR-34c、miR-331、miR-548c-5p、miR-362-3p、miR-422a或miR-148b或它们的任何组合。
所述的一种或多种生物标志物可以为上调的或过表达的miRNA(例如miR-20a、miR-21、miR-106a、miR-181b或miR-203)以用于表征结肠腺癌。所述的一种或多种生物标志物可以用于表征结肠直肠癌,例如上调或过表达miRNA(所述miRNA选自miR-19a、miR-21、miR-127、miR-31、miR-96、miR-135b和miR-183);下调或表达不足的miRNA(例如miR-30c、miR-133a、mirl43、miR-133b、miR-145)或它们的任何组合。所述一种或多种生物标志物可用于表征结肠直肠癌,诸如上调或过表达的miRNA,其选自:miR-548c-5p、miR-362-3p、miR-422a、miR-597、miR-429、miR-200a和miR-200b,或它们的任何组合。
可以进行分析的一种或多种mRNA可以包括但不限于EFNB1、ERCC1、HER2、VEGF或EGFR或它们的任何组合。可在囊泡中进行评估的结肠癌的生物标志物突变包括但不限于EGFR、KRAS、VEGFA、B-Raf、APC或p53的突变;或者结肠癌特异性的突变的任何组合。可在囊泡中进行评估的蛋白质、配体或肽可以包括但不限于AFR、Rabs、ADAM10、CD44、NG2、ephrin-B1、MIF、b-连环蛋白、接合蛋白、盘状球蛋白、半乳凝集素-4、RACK1、四跨膜蛋白-8、FasL、TRAIL、A33、CEA、EGFR、二肽酶1、hsc-70、四跨膜蛋白、ESCRT、TS、PTEN或TOPO1,或它们的任何组合。此外,所分离或分析的囊泡可以为结肠癌细胞特异性的或者源自结肠癌细胞。
本发明还提供了分离的囊泡,其包含一种或多种结肠癌特异性生物标志物,例如图6和图1中所列的对于结肠癌的生物标志物。此外,还提供了包含分离的囊泡的组合物。因此,在一些实施方案中,所述的组合物包含囊泡群体,该群体包含一种或多种结肠癌特异性生物标志物,例如图6和图1中所列的对于结肠癌的生物标志物。所述的组合物可以包含明显富集的囊泡群体,其中所述的囊泡群体是基本上均质的结肠癌特异性囊泡、或者包含一种或多种结肠癌特异性生物标志物(例如图6和图1中所列的对于结肠癌的生物标志物)的囊泡。
为表征结肠癌,还可以通过本文所述的一种或多种系统来检测一种或多种结肠癌特异性生物标志物(例如图6和图1中所列的对于结肠癌的生物标志物)。例如,检测系统可以包含一种或多种探针以检测生物样品中一种或多种囊泡的一种或多种结肠癌特异性生物标志物(例如图6和图1中所列的对于结肠癌的生物标志物)。
腺瘤对增生性息肉
来自囊泡的腺瘤对增生性息肉特异性生物标志物可以包括一种或多种(例如,2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种或更多种)过表达的miR、表达不足的miR、mRNA、基因突变、蛋白质、配体、肽或者它们的任何组合,例如图7中所列,并且可以用于建立腺瘤对增生性息肉的特异性生物印记。例如,可以分析的一种或多种mRNA可以包括但不限于ABCA8、KIAA1199、GCG、MAMDC2、C2orf32、229670_at、IGF1、PCDH7、PRDX6、PCNA、COX2或MUC6,或它们的任何组合。
可在囊泡中进行评估的用于区分腺瘤对增生性息肉的生物标志物突变包括但不限于KRAS的突变、B-Raf的突变或者特异性地区分腺瘤与增生性息肉的突变的任何组合。可在囊泡中进行评估的蛋白质、配体或肽可以包括但不限于hTERT。
本发明还提供了分离的囊泡,其包含一种或多种用于区分腺瘤和增生性息肉的特异性生物标志物,例如图7中所列的。此外,还提供了包含分离的囊泡的组合物。因此,在一些实施方案中,所述的组合物包含囊泡群体,该群体包含一种或多种用于区分腺瘤和增生性息肉的特异性生物标志物,例如图7中所列的。所述的组合物可以包含明显富集的囊泡群体,其中所述的囊泡群体为具有用于区分腺瘤和增生性息肉的一种或多种特异性生物标志物的基本上均质的,例如图7中所列的。
为区分腺瘤和增生性息肉,还可以通过本文所述的一种或多种系统来检测用于区分腺瘤和增生性息肉的一种或多种特异性生物标志物(例如图7中所列的)。例如,检测系统可以包含一种或多种探针以检测生物样品中一种或多种囊泡的、用于区分腺瘤和增生性息肉的一种或多种特异性生物标志物(例如图7中所列的)。
膀胱癌
膀胱癌的生物标志物可用于根据本发明的方法评估膀胱癌。所述生物标志物可以包括一种或多种(例如2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种或更多种)过表达的miR、表达不足的miR、mRNA、基因突变、蛋白质、配体、肽、snoRNA或者它们的任何组合。膀胱癌的生物标志物包括但不限于miR-223、miR-26b、miR-221、miR-103-1、miR-185、miR-23b、miR-203、miR-17-5p、miR-23a、miR-205或其任意组合中的一种或多种。膀胱癌的其它生物标志物包括FGFR3、EGFR、pRB(视网膜母细胞瘤蛋白)、5T4、p53、Ki-67、VEGF、CK20、COX2、p21、细胞周期蛋白D1、p14、p15、p16、Her-2、MAPK(有丝分裂原活化蛋白激酶)、Bax/Bcl-2、PI3K(磷酸肌醇-3-激酶)、CDK(细胞周期蛋白依赖性激酶)、CD40、TSP-1、HA-ase、端粒酶、存活素、NMP22、TNF、细胞周期蛋白E1、p27、半胱天冬酶、存活素、NMP22(核基质蛋白22)、BCLA-4、细胞角蛋白(8、18、19和20)、CYFRA 21-1、IL-2以及补体因子H相关蛋白。在一个实施方案中,非受体酪氨酸激酶ETK/BMX和/或碳酸酐酶IX用作用于诊断、预后和治疗诊断目的的膀胱癌标志物。参见,Guo等,Tyrosine Kinase ETK/BMX Is Up-Regulated in Bladder Cancer and PredictsPoor Prognosis in Patients with Cystectomy.PLoS One.2011年3月7日;6(3):e17778.;Klatte等,Carbonic anhydrase IX in bladder cancer:a diagnostic,prognostic,and therapeutic molecular marker.Cancer.2009年4月1日;115(7):1448-58。所述生物标志物可以是与膀胱癌关联的一种或多种囊泡生物标志物,如描述于Pisitkun等,Discovery of urinary biomarkers.Mol Cell Proteomics.2006年10月;5(10):1760-71;Welton等,Proteomics analysis of bladder cancer exosomes.Mol CellProteomics.2010年6月;9(6):1324-38中。这些生物标志物可用于评估膀胱癌。所述标志物还可与囊泡或囊泡群体关联。
肠易激疾病(IBD)
来自囊泡的IBD对正常的生物标志物可以包括一种或多种(例如,2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种或更多种)过表达的miR、表达不足的miR、mRNA、基因突变、蛋白质、配体、肽、snoRNA或者它们的任何组合,例如图8中所列的,并且可以用于建立IBD对正常的特异性生物印记。例如,可以分析的一种或多种mRNA可以包括但不限于REG1A、MMP3或它们的任何组合。
本发明还提供了分离的囊泡,其包含一种或多种用于区分IBD与正常样品的特异性生物标志物,例如图8中所列的。还提供了包含分离的囊泡的组合物。因此,在一些实施方案中,所述的组合物包含囊泡群体,该群体包含一种或多种用于区分IBD与正常样品的特异性生物标志物,例如图8中所列的。所述的组合物可以包含明显富集的囊泡群体,其中所述的囊泡群体为具有用于区分IBD与正常样品的一种或多种特异性生物标志物的基本上均质的,例如图8中所列的。
为区分IBD和正常样品,还可以通过本文所述的一种或多种系统来检测用于区分IBD和正常样品的一种或多种特异性生物标志物(例如图8中所列的)。例如,检测系统可以包含一种或多种探针以检测生物样品中一种或多种囊泡的、用于区分IBD和正常样品的一种或多种特异性生物标志物(例如图8中所列的)。
腺瘤对结肠直肠癌(CRC)
来自囊泡的腺瘤对CRC特异性的生物标志物可以包括一种或多种(例如,2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种或更多种)过表达的miR、表达不足的miR、mRNA、基因突变、蛋白质、配体、肽、snoRNA或者它们的任何组合,例如图9中所列的,并且可以用于建立腺瘤对CRC的特异性生物印记。例如,可以分析的一种或多种mRNA可以包括但不限于GREM1、DDR2、GUCY1A3、TNS1、ADAMTS1、FBLN1、FLJ38028、RDX、FAM129A、ASPN、FRMD6、MCC、RBMS1、SNAI2、MEIS1、DOCK10、PLEKHC1、FAM126A、TBC1D9、VWF、DCN、ROBO1、MSRB3、LATS2、MEF2C、IGFBP3、GNB4、RCN3、AKAP12、RFTN1、226834_at、COL5A1、GNG2、NR3C1*、SPARCL1、MAB21L2、AXIN2、236894_at、AEBP1、AP1S2、C10orf56、LPHN2、AKT3、FRMD6、COL15A1、CRYAB、COL14A1、LOC286167、QKI、WWTR1、GNG11、PAPPA或ELDT1或它们的任何组合。
本发明还提供了分离的囊泡,其包含一种或多种用于区分腺瘤和CRC的特异性生物标志物,例如图9中所列的。此外,还提供了包含分离的囊泡的组合物。因此,在一些实施方案中,所述的组合物包含囊泡群体,该群体包含一种或多种用于区分腺瘤和CRC的特异性生物标志物,例如图9中所列的。所述的组合物可以包含明显富集的囊泡群体,其中所述的囊泡群体为具有用于区分腺瘤和CRC的一种或多种特异性生物标志物的实质上均质的,例如图9中所列的。
为区分腺瘤和CRC,还可以通过本文所述的一种或多种系统来检测用于区分腺瘤和CRC的一种或多种特异性生物标志物(例如图9中所列的)。例如,检测系统可以包含一种或多种探针以检测生物样品中一种或多种囊泡的、用于区分腺瘤和CRC的一种或多种特异性生物标志物(例如图9中所列的)。
IBD对CRC
来自囊泡的IBD对CRC特异性生物标志物可以包括一种或多种(例如,2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种或更多种)过表达的miR、表达不足的miR、mRNA、基因突变、蛋白质、配体、肽、snoRNA或者它们的任何组合,例如图10中所列的,并且可以用于建立IBD对CRC的特异性生物印记。例如,可以分析的一种或多种mRNA可以包括但不限于227458_at、INDO、CXCL9、CCR2、CD38、RARRES3、CXCL10、FAM26F、TNIP3、NOS2A、CCRL1、TLR8、IL18BP、FCRL5、SAMD9L、ECGF1、TNFSF13B、GBP5或GBP1或它们的任何组合。
本发明还提供了分离的囊泡,其包含一种或多种用于区分IBD与CRC的特异性生物标志物,例如图10中所列的。此外,还提供了包含分离的囊泡的组合物。因此,在一些实施方案中,所述的组合物包含囊泡群体,该群体包含一种或多种用于区分IBD与CRC的特异性生物标志物,例如图10中所列的。所述的组合物可以包含明显富集的囊泡群体,其中所述的囊泡群体为具有用于区分IBD与CRC的一种或多种特异性生物标志物的实质上均质的,例如图10中所列的。
为区分IBD与CRC,还可以通过本文所述的一种或多种系统来检测用于区分IBD与CRC的一种或多种特异性生物标志物(例如图10中所列的)。例如,检测系统可以包括一种或多种探针以检测生物样品中一种或多种囊泡的、用于区分IBD与CRC的一种或多种特异性生物标志物(例如图10中所列的)。
CRC Dukes B对Dukes C-D
来自囊泡的CRC Dukes B对Dukes C-D特异性生物标志物可以包括一种或多种(例如,2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种或更多种)过表达的miR、表达不足的miR、mRNA、基因突变、蛋白质、配体、肽、snoRNA或者它们的任何组合,例如图11中所列的,并且可以用于建立CRC Dukes B对C-D的特异性生物印记。例如,可以分析的一种或多种mRNA可以包括但不限于TMEM37*、IL33、CA4、CCDC58、CLIC6、VERSUSNL1、ESPN、APCDD1、C13orf18、CYP4X1、ATP2A3、LOC646627、MUPCDH、ANPEP、C1orf115、HSD3B2、GBA3、GABRB2、GYLTL1B、LYZ、SPC25、CDKN2B、FAM89A、MOGAT2、SEMA6D、229376_at、TSPAN5、IL6R或SLC26A2或它们的任何组合。
本发明还提供了分离的囊泡,其包含一种或多种用于区分CRC Dukes B与CRCDukes C-D的特异性生物标志物,例如图11中所列的。此外,还提供了包含分离的囊泡的组合物。因此,在一些实施方案中,所述的组合物包含囊泡群体,该群体包含一种或多种用于区分CRC Dukes B与CRC Dukes C-D的特异性生物标志物,例如图11中所列的。所述的组合物可以包含明显富集的囊泡群体,其中所述的囊泡群体为具有用于区分CRC Dukes B与CRCDukes C-D的一种或多种特异性生物标志物的基本上均质的,例如图11中所列的。
为区分CRC Dukes B与CRC Dukes C-D,还可以通过本文所述的一种或多种系统来检测用于区分CRC Dukes B与CRC Dukes C-D的一种或多种特异性生物标志物(例如图11中所列的)。例如,检测系统可以包括一种或多种探针以检测生物样品中一种或多种囊泡的、用于区分CRC Dukes B与CRC Dukes C-D的一种或多种特异性生物标志物(例如图11中所列的)。
具有低度异型增生的腺瘤对具有高度异型增生的腺瘤
来自囊泡的具有低度异型增生的腺瘤对具有高度异型增生的腺瘤的特异性生物标志物可以包括一种或多种(例如,2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种或更多种)过表达的miR、表达不足的miR、mRNA、基因突变、蛋白质、配体、肽、snoRNA或者它们的任何组合,例如图12中所列的,并且可以用于建立具有低度异型增生的腺瘤对具有高度异型增生的腺瘤的特异性生物印记。例如,可以分析的一种或多种mRNA可以包括但不限于SI、DMBT1、CFI*、AQP1、APOD、TNFRSF17、CXCL10、CTSE、IGHA1、SLC9A3、SLC7A1、BATF2、SOCS1、DOCK2、NOS2A、HK2、CXCL2、IL15RA、POU2AF1、CLEC3B、ANI3BP、MGC13057、LCK*、C4BPA、HOXC6、GOLT1A、C2orf32、IL10RA、240856_at、SOCS3、MEIS3P1、HIPK1、GLS、CPLX1、236045_x_at、GALC、AMN、CCDC69、CCL28、CPA3、TRIB2、HMGA2、PLCL2、NR3C1、EIF5A、LARP4、RP5-1022P6.2、PHLDB2、FKBP1B、INDO、CLDN8、CNTN3、PBEF1、SLC16A9、CDC25B、TPSB2、PBEF1、ID4、GJB5、CHN2、LIMCH1或CXCL9或它们的任何组合。
本发明还提供了分离的囊泡,其包含一种或多种用于区分具有低度异型增生的腺瘤与具有高度异型增生的腺瘤的特异性生物标志物,例如图12中所列的。此外,还提供了包含分离的囊泡的组合物。因此,在一些实施方案中,所述的组合物包含囊泡群体,该群体包含一种或多种用于区分具有低度异型增生的腺瘤与具有高度异型增生的腺瘤的特异性生物标志物,例如图12中所列的。所述的组合物可以包含明显富集的囊泡群体,其中所述的囊泡群体为具有用于区分具有低度异型增生的腺瘤与具有高度异型增生的腺瘤的一种或多种特异性生物标志物的(例如图12中所列的)基本上均质的。
为区分具有低度异型增生的腺瘤与具有高度异型增生的腺瘤,还可以通过本文所述的一种或多种系统来检测用于区分具有低度异型增生的腺瘤与具有高度异型增生的腺瘤的一种或多种特异性生物标志物(例如图12中所列的)。例如,检测系统可以包括一种或多种探针以检测生物样品中一种或多种囊泡的、用于区分具有低度异型增生的腺瘤与具有高度异型增生的腺瘤的一种或多种特异性生物标志物(例如图12中所列的)。
溃疡性结肠炎(UC)对克罗恩氏病(CD)
来自囊泡的溃疡性结肠炎(UC)对克罗恩氏病(CD)的特异性生物标志物可以包括一种或多种(例如,2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种或更多种)过表达的miR、表达不足的miR、mRNA、基因突变、蛋白质、配体、肽、snoRNA或者它们的任何组合,例如图13中所列的,并且可以用于建立UC对CD的特异性生物印记。例如,可以分析的一种或多种mRNA可以包括但不限于IFITM1、IFITM3、STAT1、STAT3、TAP1、PSME2、PSMB8、HNF4G、KLF5、AQP8、APT2B1、SLC16A、MFAP4、CCNG2、SLC44A4、DDAH1、TOB1、231152_at、MKNK1、CEACAM7*、1562836_at、CDC42SE2、PSD3、231169_at、IGL@*、GSN、GPM6B、CDV3*、PDPK1、ANP32E、ADAM9、CDH1、NLRP2、215777_at、OSBPL1、VNN1、RABGAP1L、PHACTR2、ASH1L、213710_s_at、CDH1、NLRP2、215777_at、OSBPL1、VNN1、RABGAP1L、PHACTR2、ASH1、213710_s_at、ZNF3、FUT2、IGHA1、EDEM1、GPR171、229713_at、LOC643187、FLVCR1、SNAP23*、ETNK1、LOC728411、POSTN、MUC12、HOXA5、SIGLEC1、LARP5、PIGR、SPTBN1、UFM1、C6orf62、WDR90、ALDH1A3、F2RL1、IGHV1-69、DUOX2、RAB5A或CP;或者它们的任何组合也都可以用作来自囊泡的UC对CD的特异性生物标志物。
可在囊泡中进行评估的用于区分UC与CD的生物标志物突变包括但不限于CARD15的突变或者特异性地区分UC与CD的突变的任何组合。可在囊泡中进行评估的蛋白质、配体或肽可以包括但不限于(P)ASCA。
本发明还提供了分离的囊泡,其包含一种或多种用于区分UC与CD的特异性生物标志物,例如图13中所列的。此外,还提供了包含分离的囊泡的组合物。因此,在一些实施方案中,所述的组合物包含囊泡群体,该群体包含一种或多种用于区分UC与CD的特异性生物标志物,例如图13中所列的。所述的组合物可以包含明显富集的囊泡群体,其中所述的囊泡群体对于具有用于区分UC与CD的一种或多种特异性生物标志物(例如图13中所列的)是基本上均质的。
为区分UC与CD,还可以通过本文所述的一种或多种系统来检测用于区分UC与CD的一种或多种特异性生物标志物(例如图13中所列的)。例如,检测系统可以包括一种或多种探针以检测生物样品中一种或多种囊泡的、用于区分UC与CD的一种或多种特异性生物标志物(例如图13中所列的)。
增生性息肉
来自囊泡的增生性息肉对正常的特异性生物标志物可以包括一种或多种(例如,2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种或更多种)过表达的miR、表达不足的miR、mRNA、基因突变、蛋白质、配体、肽、snoRNA或者它们的任何组合,例如图14中所列的,并且可以用于建立增生性息肉对正常的特异性生物印记。例如,可以分析的一种或多种mRNA可以包括但不限于SLC6A14、ARHGEF10、ALS2、IL1RN、SPRY4、PTGER3、TRIM29、SERPINB5、1560327_at、ZAK、BAG4、TRIB3、TTL、FOXQ1或任何组合。
本发明还提供了分离的囊泡,其包含一种或多种增生性息肉的特异性生物标志物,例如图14中所列的。还提供了包含分离的囊泡的组合物。因此,在一些实施方案中,所述的组合物包含囊泡群体,该群体包含一种或多种增生性息肉的特异性生物标志物,例如图14中所列的。所述的组合物可以包含明显富集的囊泡群体,其中所述的囊泡群体对于增生性息肉特异性囊泡或者包含一种或多种增生性息肉特异性生物标志物(例如图14中所列的)的囊泡是基本上均质的。
为表征增生性息肉,还可以通过本文所述的一种或多种系统来检测一种或多种增生性息肉的特异性生物标志物(例如图14中所列的)。例如,检测系统可以包括一种或多种探针以检测图14中所列的一种或多种。生物样品中一种或多种囊泡的一种或多种增生性特异性生物标志物(例如图14中所列的)。
具有低度异型增生的腺瘤对正常
来自囊泡的具有低度异型增生的腺瘤对正常的特异性生物标志物可以包括一种或多种(例如,2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种或更多种)过表达的miR、表达不足的miR、mRNA、基因突变、蛋白质、配体、肽、snoRNA或者它们的任何组合,例如图15中所列的,并且可以用于建立具有低度异型增生的腺瘤对正常的特异性生物印记。例如,可以分析的RNA可以包括但不限于UGT2A3、KLK11、KIAA1199、FOXQ1、CLDN8、ABCA8或PYY或它们的任何组合,并且可以用作来自囊泡的具有低度异型增生对正常的特异性生物标志物。此外,可以用作具有低度异型增生对正常的外来体生物标志物的snoRNA可以包括但不限于GAS5。
本发明还提供了分离的囊泡,其包含一种或多种用于区分具有低度异型增生的腺瘤与正常的特异性生物标志物,例如图15中所列的。还提供了包含分离的囊泡的组合物。因此,在一些实施方案中,所述的组合物包含囊泡群体,该群体包含一种或多种用于区分具有低度异型增生的腺瘤与正常的特异性生物标志物,例如图15中所列的。所述的组合物可以包含明显富集的囊泡群体,其中所述的囊泡群体对于具有用于区分具有低度异型增生的腺瘤与正常的一种或多种特异性生物标志物(例如图15中所列的)为基本上均质的。
此外,为区分具有低度异型增生的腺瘤与正常,还可以通过本文所述的一种或多种系统来检测用于区分具有低度异型增生的腺瘤与正常的一种或多种特异性生物标志物(例如图15中所列的)。例如,检测系统可以包括一种或多种探针以检测生物样品中一种或多种囊泡的、用于区分具有低度异型增生的腺瘤与正常的一种或多种特异性生物标志物(例如图15中所列的)。
腺瘤对正常
来自囊泡的腺瘤对正常的特异性生物标志物可以包括一种或多种(例如,2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种或更多种)过表达的miR、表达不足的miR、mRNA、基因突变、蛋白质、配体、肽、snoRNA或者它们的任何组合,例如图16中所列的,并且可以用于建立腺瘤对正常的特异性生物印记。例如,可以分析的一种或多种RNA可以包括但不限于KIAA1199、FOXQ1或CA7或它们的任何组合。可以用作来自囊泡的生物标志物(其对腺瘤对正常具有特异性)的蛋白质、配体或肽可以包括但不限于丛生蛋白。
本发明还提供了分离的囊泡,其包含一种或多种用于区分腺瘤与正常的特异性生物标志物,例如图16中所列的。此外,还提供了包含分离的囊泡的组合物。因此,在一些实施方案中,所述的组合物包含囊泡群体,该群体包含一种或多种用于区分腺瘤与正常的特异性生物标志物,例如图16中所列的。所述的组合物可以包含明显富集的囊泡群体,其中所述的囊泡群体对于具有用于区分腺瘤与正常的一种或多种特异性生物标志物(例如图16中所列的)为基本上均质的。
为区分腺瘤与正常,还可以通过本文所述的一种或多种系统来检测用于区分腺瘤与正常的一种或多种特异性生物标志物(例如图16中所列的)。例如,检测系统可以包括一种或多种探针以检测生物样品中一种或多种囊泡的、用于区分腺瘤与正常的一种或多种特异性生物标志物(例如图16中所列的)。
CRC对正常
来自囊泡的CRC对正常的特异性生物标志物可以包括一种或多种(例如,2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种或更多种)过表达的miR、表达不足的miR、mRNA、基因突变、蛋白质、配体、肽、snoRNA或者它们的任何组合,例如图17中所列的,并且可以用于建立CRC对正常的特异性生物印记。例如,可以分析的一种或多种mRNA可以包括但不限于VWF、IL8、CHI3L1、S100A8、GREM1或ODC或它们的任何组合,并且可以用作来自囊泡的CRC对正常的特异性生物标志物。
可在囊泡中进行评估的用于CRC对正常的生物标志物突变包括但不限于KRAS、BRAF、APC、MSH2或MLH1的突变;或者特异性地区分CRC与正常的突变的任何组合。可在囊泡中进行评估的蛋白质、配体或肽可以包括但不限于细胞角蛋白13、钙调神经磷酸酶(clacineurin)、CHK1、网格蛋白轻链、磷酸-ERK、磷酸-PTK2或MDM2或它们的任何组合。
本发明还提供了分离的囊泡,其包含一种或多种用于区分CRC与正常的特异性生物标志物,例如图17中所列的。此外,还提供了包含分离的囊泡的组合物。因此,在一些实施方案中,所述的组合物包含囊泡群体,该群体包含一种或多种用于区分CRC与正常的特异性生物标志物,例如图17中所列的。所述的组合物可以包含明显富集的囊泡群体,其中所述的囊泡群体对于具有用于区分CRC与正常的一种或多种特异性生物标志物(例如图17中所列的)为基本上均质的。
为区分CRC与正常,还可以通过本文所述的一种或多种系统来检测用于区分CRC与正常的一种或多种特异性生物标志物(例如图17中所列的)。例如,检测系统可以包括一种或多种探针以检测生物样品中一种或多种囊泡的、用于区分CRC与正常的一种或多种特异性生物标志物(例如图17中所列的)。
良性前列腺增生(BPH)
来自囊泡的良性前列腺增生(BPH)特异性生物标志物可以包括一种或多种(例如,2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种或更多种)过表达的miR、表达不足的miR、mRNA、基因突变、蛋白质、配体、肽、snoRNA或者它们的任何组合,例如图18中所列的,并且可以用于建立BPH特异性生物印记。可在囊泡中进行评估的蛋白质、配体或肽可以包括但不限于完整纤连蛋白。
本发明还提供了分离的囊泡,其包含一种或多种BPH特异性生物标志物,例如图18和图1中对于BPH所列的生物标志物。还提供了包含分离的囊泡的组合物。因此,在一些实施方案中,所述的组合物包含囊泡群体,该群体包含一种或多种BPH特异性生物标志物,例如图18和图1中所列的对于BPH的生物标志物。所述的组合物可以包含明显富集的囊泡群体,其中所述的囊泡群体是对于BPH特异性囊泡或者包含一种或多种BPH特异性生物标志物(例如图18和图1中所列的对于BPH的生物标志物)的囊泡基本上是均质的。
为表征BPH,还可以通过本文所述的一种或多种系统来检测一种或多种BPH特异性生物标志物(例如图18和图1中所列的对于BPH的那些生物标志物)。例如,检测系统可以包括一种或多种探针以检测生物样品中一种或多种囊泡的一种或多种BPH特异性生物标志物(例如图18和图1中所列的对于BPH的那些生物标志物)。
前列腺癌
来自囊泡的前列腺癌特异性生物标志物可以包括一种或多种(例如,2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种或更多种)过表达的miR、表达不足的miR、mRNA、基因突变、蛋白质、配体、肽、snoRNA或者它们的任何组合,例如图19中所列的,并且可以用于建立前列腺癌特异性生物印记。例如,前列腺癌的生物印记可以包括miR-9、miR-21、miR-141、miR-370、miR-200b、miR-210、miR-155或miR-196a。在一些实施方案中,所述的生物印记可以包括一种或多种过表达的miR,例如但不限于miR-202、miR-210、miR-296、miR-320、miR-370、miR-373、miR-498、miR-503、miR-184、miR-198、miR-302c、miR-345、miR-491、miR-513、miR-32、miR-182、miR-31、miR-26a-1/2、miR-200c、miR-375、miR-196a-1/2、miR-370、miR-425、miR-425、miR-194-1/2、miR-181a-1/2、miR-34b、let-7i、miR-188、miR-25、miR-106b、miR-449、miR-99b、miR-93、miR-92-1/2、miR-125a或miR-141或它们的任何组合。
所述的生物印记还可以包括一种或多种表达不足的miR,例如但不限于let-7a、let-7b、let-7c、let-7d、let-7g、miR-16、miR-23a、miR-23b、miR-26a、miR-92、miR-99a、miR-103、miR-125a、miR-125b、miR-143、miR-145、miR-195、miR-199、miR-221、miR-222、miR-497、let-7f、miR-19b、miR-22、miR-26b、miR-27a、miR-27b、miR-29a、miR-29b、miR-30_5p、miR-30c、miR-100、miR-141、miR-148a、miR-205、miR-520h、miR-494、miR-490、miR-133a-1、miR-1-2、miR-218-2、miR-220、miR-128a、miR-221、miR-499、miR-329、miR-340、miR-345、miR-410、miR-126、miR-205、miR-7-1/2、miR-145、miR-34a、miR-487或et-7b或它们的任何组合。所述的生物印记可以包括上调或过表达的miR-21;下调或表达不足的miR-15a、miR-16-1、miR-143或miR-145;或它们的任何组合。
可以分析的一种或多种mRNA可以包括但不限于AR、PCA3或它们的任何组合,并且可以用作来自囊泡的前列腺癌的特异性生物标志物。
可在囊泡中进行评估的蛋白质、配体或肽可以包括但不限于FASLG、TNFSF10或它们的任何组合。此外,分离或分析的囊泡可以为前列腺癌细胞特异性的,或者源自前列腺癌细胞的。此外,可以用作前列腺癌的外来体生物标志物的snoRNA可以包括但不限于U50。前列腺癌生物印记的实例在下文中进一步描述。
本发明还提供了分离的囊泡,其包含一种或多种前列腺癌特异性生物标志物,例如ACSL3-ETV1、C15ORF21-ETV1、FLJ35294-ETV1、HERV-ETV1、TMPRSS2-ERG、TMPRSS2-ETV1/4/5、TMPRSS2-ETV4/5、SLC5A3-ERG、SLC5A3-ETV1、SLC5A3-ETV5或KLK2-ETV4;或者图19、图60以及图1中所列的对于前列腺癌的生物标志物。在一些实施方案中,所述分离的囊泡是EpCam+、CK+、CD45-。还提供了包含分离的囊泡的组合物。因此,在一些实施方案中,所述的组合物包含囊泡群体,该群体包含一种或多种前列腺癌特异性生物标志物,例如ACSL3-ETV1、C15ORF21-ETV1、FLJ35294-ETV1、HERV-ETV1、TMPRSS2-ERG、TMPRSS2-ETV1/4/5、TMPRSS2-ETV4/5、SLC5A3-ERG、SLC5A3-ETV1、SLC5A3-ETV5或KLK2-ETV4;或者图19、图60以及图1中所列的对于前列腺癌的那些生物标志物。在一些实施方案中,所述组合物包含囊泡群体,其为EpCam+、CK+、CD45-。所述的组合物可以包含明显富集的囊泡群体,其中所述的囊泡群体对于前列腺癌特异性囊泡或者包含一种或多种前列腺癌特异性生物标志物例如ACSL3-ETV1、C15ORF21-ETV1、FLJ35294-ETV1、HERV-ETV1、TMPRSS2-ERG、TMPRSS2-ETV1/4/5、TMPRSS2-ETV4/5、SLC5A3-ERG、SLC5A3-ETV1、SLC5A3-ETV5或KLK2-ETV4或者图19、图60以及图1中所列的对于前列腺癌的那些生物标志物的囊泡为基本上均质的。在一个实施方案中,所述组合物包含明显富集的囊泡群体,其为EpCam+、CK+、CD45-。
为表征前列腺癌,还可以通过本文所述的一种或多种系统来检测一种或多种前列腺癌特异性生物标志物(例如ACSL3-ETV1、C15ORF21-ETV1、FLJ35294-ETV1、HERV-ETV1、TMPRSS2-ERG、TMPRSS2-ETV1/4/5、TMPRSS2-ETV4/5、SLC5A3-ERG、SLC5A3-ETV1、SLC5A3-ETV5或KLK2-ETV4;或者图19、图60以及图1中所列的对于前列腺癌的那些生物标志物)。在一些实施方案中,为表征前列腺癌,通过本文公开的一种或多种系统检测生物标志物EpCam、CK(细胞角蛋白)和CD45,诸如对于受试者的前列腺癌或受试者的治疗抗性的确定。例如,检测系统可以包括一种或多种探针以检测生物样品中一种或多种囊泡的一种或多种前列腺癌特异性生物标志物(例如ACSL3-ETV1、C15ORF21-ETV1、FLJ35294-ETV1、HERV-ETV1、TMPRSS2-ERG、TMPRSS2-ETV1/4/5、TMPRSS2-ETV4/5、SLC5A3-ERG、SLC5A3-ETV1、SLC5A3-ETV5或KLK2-ETV4;或者图19、图60以及图1中所列的对于前列腺癌的那些生物标志物)。在一个实施方案中,所述检测系统可包括一种或多种用于检测EpCam、CK、CD45或其组合的探针。
黑色素瘤
来自囊泡的黑色素瘤特异性生物标志物可以包括一种或多种(例如,2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种或更多种)过表达的miR、表达不足的miR、mRNA、基因突变、蛋白质、配体、肽、snoRNA或者它们的任何组合,例如图20中所列的,并且可以用于建立黑色素瘤特异性生物印记。例如,所述的生物印记可以包括一种或多种过表达的miR,例如但不限于miR-19a、miR-144、miR-200c、miR-211、miR-324-5p、miR-331或miR-374或它们的任何组合。所述的生物印记还可以包括表达不足的miR,例如但不限于miR-9、miR-15a、miR-17-3p、miR-23b、miR-27a、miR-28、miR-29b、miR-30b、miR-31、miR-34b、miR-34c、miR-95、miR-96、miR-100、miR-104、miR-105、miR-106a、miR-107、miR-122a、miR-124a、miR-125b、miR-127、miR-128a、miR-128b、miR-129、miR-135a、miR-135b、miR-137、miR-138、miR-139、miR-140、miR-141、miR-149、miR-154、miR-154#3、miR-181a、miR-182、miR-183、miR-184、miR-185、miR-189、miR-190、miR-199、miR-199b、miR-200a、miR-200b、miR-204、miR-213、miR-215、miR-216、miR-219、miR-222、miR-224、miR-299、miR-302a、miR-302b、miR-302c、miR-302d、miR-323、miR-325、let-7a、let-7b、let-7d、let-7e或let-7g或它们的任何组合。
可以分析的一种或多种mRNA可以包括但不限于MUM-1、β-连环蛋白或Nop/5/Sik或它们的任何组合,并且可以用作来自囊泡的黑色素瘤特异性生物标志物。
可在囊泡中进行评估的黑色素瘤的生物标志物突变包括但不限于CDK4的突变或者黑色素瘤特异性突变的任何组合。可在囊泡中进行评估的蛋白质、配体或肽可以包括但不限于DUSP-1、Alix、hsp70、Gib2、Gia、膜突蛋白、GAPDH、苹果酸脱氢酶、p120连环蛋白、PGRL、突触融合蛋白结合蛋白1&2、胞裂蛋白-2或含WD重复蛋白1或它们的任何组合。可以用作黑色素瘤的外来体生物标志物的snoRNA包括但不限于H/ACA(U107f)、SNORA11D或它们的任何组合。此外,所分离或分析的囊泡可以为黑色素瘤细胞特异性的,或者源自黑色素瘤细胞。
本发明还提供了分离的囊泡,其包含一种或多种黑色素瘤特异性生物标志物,例如图20和图1中所列的对于黑色素瘤的生物标志物。还提供了包含分离的囊泡的组合物。因此,在一些实施方案中,所述的组合物包含囊泡群体,该群体包含一种或多种黑色素瘤特异性生物标志物,例如图20和图1中所列的对于黑色素瘤的生物标志物。所述的组合物可以包含明显富集的囊泡群体,其中所述的囊泡群体对于黑色素瘤特异性囊泡或者包含一种或多种黑色素瘤特异性生物标志物(例如图20和图1中所列的对于黑色素瘤的生物标志物)的囊泡为基本上均质的。
为了表征黑色素瘤,还可以通过本文所述的一种或多种系统来检测一种或多种黑色素瘤特异性生物标志物(例如图20和图1中所列的对于黑色素瘤的生物标志物)。例如,检测系统可以包括一种或多种探针以检测生物样品中一种或多种囊泡的一种或多种癌症特异性生物标志物(例如图20和图1中所列的对于黑色素瘤的生物标志物)。
胰腺癌
来自囊泡的胰腺癌特异性生物标志物可以包括一种或多种(例如,2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种或更多种)过表达的miR、表达不足的miR、mRNA、基因突变、蛋白质、配体、肽、snoRNA或者它们的任何组合,例如图21中所列的,并且可以用于建立胰腺癌特异性生物印记。例如,所述的生物印记可以包括一种或多种过表达的miR,例如但不限于miR-221、miR-181a、miR-155、miR-210、miR-213、miR-181b、miR-222、miR-181b-2、miR-21、miR-181b-1、miR-220、miR-181d、miR-223、miR-100-1/2、miR-125a、miR-143、miR-10a、miR-146、miR-99、miR-100、miR-199a-1、miR-10b、miR-199a-2、miR-221、miR-181a、miR-155、miR-210、miR-213、miR-181b、miR-222、miR-181b-2、miR-21、miR-181b-1、miR-181c、miR-220、miR-181d、miR-223、miR-100-1/2、miR-125a、miR-143、miR-10a、miR-146、miR-99、miR-100、miR-199a-1、miR-10b、miR-199a-2、miR-107、miR-103、miR-103-2、miR-125b-1、miR-205、miR-23a、miR-221、miR-424、miR-301、miR-100、miR-376a、miR-125b-1、miR-21、miR-16-1、miR-181a、miR-181c、miR-92、miR-15、miR-155、let-7f-1、miR-212、miR-107、miR-024-1/2、miR-18a、miR-31、miR-93、miR-224或let-7d或它们的任何组合。
所述的生物印记还可以包括一种或多种表达不足的miR,例如但不限于miR-148a、miR-148b、miR-375、miR-345、miR-142、miR-133a、miR-216、miR-217或miR-139或它们的任何组合。可以分析的一种或多种mRNA可以包括但不限于PSCA、间皮素或骨桥蛋白或它们的任何组合,并且可以用作来自囊泡的胰腺癌特异性生物标志物。
可在囊泡中进行评估的胰腺癌的生物标志物突变包括但不限于KRAS、CTNNLB1、AKT、NCOA3或B-RAF的突变;或者胰腺癌特异性突变的任何组合。所述的生物标志物还可以为BRCA2、PALB2或p16。此外,分离或分析的囊泡可以为胰腺癌细胞特异性的,或者源自胰腺癌细胞。
本发明还提供了分离的囊泡,其包含一种或多种胰腺癌特异性生物标志物,例如图21中所列的。还提供了包含分离的囊泡的组合物。因此,在一些实施方案中,所述的组合物包含囊泡群体,该群体包含一种或多种胰腺癌特异性生物标志物,例如图21中所列的。所述的组合物可以包含明显富集的囊泡群体,其中所述的囊泡群体对于胰腺癌特异性囊泡或者包含一种或多种胰腺癌特异性生物标志物(例如图21中所列的)的囊泡为基本上均质的。
为表征胰腺癌,还可以通过本文所述的一种或多种系统来检测一种或多种胰腺癌特异性生物标志物(例如图21中所列的)。例如,检测系统可以包括一种或多种探针以检测生物样品中一种或多种囊泡的一种或多种胰腺癌特异性生物标志物(例如图21中所列的)。
脑癌
来自囊泡的脑癌(包括但不限于神经胶质瘤、成胶质细胞瘤、脑膜瘤、听神经瘤/神经鞘瘤、成神经管细胞瘤)特异性生物标志物可以包括一种或多种(例如,2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种或更多种)过表达的miR、表达不足的miR、mRNA、基因突变、蛋白质、配体、肽、snoRNA或者它们的任何组合,例如图22中所列的,并且可以用于建立脑癌特异性生物印记。例如,所述的生物印记可以包括一种或多种过表达的miR,例如但不限于miR-21、miR-10b、miR-130a、miR-221、miR-125b-1、miR-125b-2、miR-9-2、miR-21、miR-25或miR-123或它们的任何组合。
所述的生物印记还可以包括一种或多种表达不足的miR,例如但不限于miR-128a、miR-181c、miR-181a或miR-181b或它们的任何组合。可以分析的一种或多种mRNA可以包括但不限于MGMT,其可以用作来自囊泡的对于脑癌的特异性生物标志物。可在囊泡中进行评估的蛋白质、配体或肽可以包括但不限于EGFR。
本发明还提供了分离的囊泡,其包含一种或多种脑癌特异性生物标志物,例如GOPC-ROS1;或者图22和图1中所列的对于脑癌的生物标志物。还提供了包含分离的囊泡的组合物。因此,在一些实施方案中,所述的组合物包含囊泡群体,该群体包含一种或多种脑癌特异性生物标志物,例如GOPC-ROS1;或者图22和图1中所列的对于脑癌的生物标志物。所述的组合物可以包含明显富集的囊泡群体,其中所述的囊泡群体脑癌特异性囊泡或者包含一种或多种脑癌特异性生物标志物例如GOPC-ROS1或者图22和图1中所列的对于脑癌的生物标志物的囊泡为基本上均质的。
为表征脑癌,还可以通过本文所述的一种或多种系统来检测一种或多种脑癌特异性生物标志物(例如图22和图1中对于脑癌所列的)。例如,检测系统可以包括一种或多种探针以检测生物样品中一种或多种囊泡的一种或多种脑癌特异性生物标志物(例如GOPC-ROS1)或者图22和图1中所列的对于脑癌的那些生物标志物。
银屑病
来自囊泡的银屑病特异性生物标志物可以包括一种或多种(例如,2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种或更多种)过表达的miR、表达不足的miR、mRNA、基因突变、蛋白质、配体、肽、snoRNA或者它们的任何组合,例如图23中所列的,并且可以用于建立银屑病特异性生物印记。例如,所述的生物印记可以包含一种或多种过表达的miR,例如但不限于miR-146b、miR-20a、miR-146a、miR-31、miR-200a、miR-17-5p、miR-30e-5p、miR-141、miR-203、miR-142-3p、miR-21或miR-106a或它们的任何组合。所述的生物印记还可以包含一种或多种表达不足的miR,例如但不限于miR-125b、miR-99b、miR-122a、miR-197、miR-100、miR-381、miR-518b、miR-524、let-7e、miR-30c、miR-365、miR-133b、miR-10a、miR-133a、miR-22、miR-326或miR-215或它们的任何组合。
可以分析的一种或多种mRNA可以包括但不限于IL-20、VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3或EGR1或它们的任何组合,并且可以用作来自囊泡的银屑病的特异性生物标志物。可在囊泡中进行评估的银屑病的生物标志物突变包括但不限于MGST2的突变;或者银屑病特异性的突变的任何组合。
本发明还提供了分离的囊泡,其包含一种或多种银屑病特异性生物标志物,例如图23和图1中所列的对于银屑病的生物标志物。还提供了包含分离的囊泡的组合物。因此,在一些实施方案中,所述的组合物包含囊泡群体,该群体包含一种或多种银屑病特异性生物标志物,例如图23和图1中对于银屑病所列的。所述的组合物可以包含明显富集的囊泡群体,其中所述的囊泡群体对于银屑病特异性囊泡或者包含一种或多种银屑病特异性生物标志物(例如图23和图1中对于银屑病所列的)的囊泡为基本上均质的。
为用于表征银屑病,还可以通过本文所述的一种或多种系统来检测一种或多种银屑病特异性生物标志物(例如图23和图1中对于银屑病所列的)。例如,检测系统可以包括一种或多种探针以检测生物样品中一种或多种囊泡的一种或多种银屑病特异性生物标志物(例如图23和图1中对于银屑病所列的)。
心血管疾病(CVD)
来自囊泡的CVD特异性生物标志物可以包括一种或多种(例如,2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种或更多种)过表达的miR、表达不足的miR、mRNA、基因突变、蛋白质、配体、肽、snoRNA或者它们的任何组合,例如图24中所列的,并且可以用于建立CVD特异性生物印记。例如,所述的生物印记可以包括一种或多种过表达的miR,例如但不限于miR-195、miR-208、miR-214、let-7b、let-7c、let-7e、miR-15b、miR-23a、miR-24、miR-27a、miR-27b、miR-93、miR-99b、miR-100、miR-103、miR-125b、miR-140、miR-145、miR-181a、miR-191、miR-195、miR-199a、miR-320、miR-342、miR-451或miR-499或它们的任何组合。
所述的生物印记还可以包括一种或多种表达不足的miR,例如但不限于miR-1、miR-10a、miR-17-5p、miR-19a、miR-19b、miR-20a、miR-20b、miR-26b、miR-28、miR-30e-5p、miR-101、miR-106a、miR-126、miR-222、miR-374、miR-422b或miR-423或它们的任何组合。可以分析的mRNA可以包括但不限于MRP14、CD69或它们的任何组合,并且可以用作来自囊泡的CVD的特异性生物标志物。
可在囊泡中进行评估的CVD的生物标志物突变包括但不限于MYH7、SCN5A或CHRM2的突变;或者CVD的特异性突变的任何组合。
可在囊泡中进行评估的蛋白质、配体或肽可以包括但不限于CK-MB、cTnI(心肌肌钙蛋白)、CRP、BPN、IL-6、MCSF、CD40、CD40L或它们的任何组合。此外,分离或分析的囊泡可以为CVD细胞特异性的,或者源自心肌细胞的。
本发明还提供了分离的囊泡,其包含一种或多种CVD特异性生物标志物,例如图24和图1中对于CVD所列的。还提供了包含分离的囊泡的组合物。因此,在一些实施方案中,所述的组合物包含囊泡群体,该群体包含一种或多种CVD特异性生物标志物,例如图24和图1中对于CVD所列的。所述的组合物可以包含明显富集的囊泡群体,其中所述的囊泡群体对于CVD特异性囊泡或者包含一种或多种CVD特异性生物标志物(例如图24和图1中对于CVD所列的生物标志物)的囊泡为基本上均质的。
为表征CVD,还可以通过本文所公开的一种或多种系统来检测一种或多种CVD特异性生物标志物(例如图24和图1中对于CVD所列的)。例如,检测系统可以包括一种或多种探针以检测生物样品中一种或多种囊泡的一种或多种CVD特异性生物标志物(例如图24和图1中对于CVD所列的)。
miRNA或miRNA组合(诸如miR-21、miR-129、miR-212、miR-214、miR-134或其组合)的增加(如美国公开号No.2010/0010073中所公开的)可用于诊断发生心脏肥大和/或心力衰竭的风险增加或者心脏肥大和/或心力衰竭的已然存在。miR-182、miR-290或其组合的下调可用于诊断发生心脏肥大和/或心力衰竭的风险增加或者心脏肥大和/或心力衰竭的已然存在。miR-21、miR-129、miR-212、miR-214、miR-134或其组合的表达增加与miR-182、miR-290或其组合的表达降低可用于诊断发生心脏肥大和/或心力衰竭的风险增加或者心脏肥大和/或心力衰竭的存在。
血癌
来自囊泡的血液恶性肿瘤特异性生物标志物可以包括一种或多种(例如,2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种或更多种)过表达的miR、表达不足的miR、mRNA、基因突变、蛋白质、配体、肽、snoRNA或者它们的任何组合,例如图25中所列的,并且可以用于建立血液恶性肿瘤特异性生物印记。例如,可以分析的一种或多种mRNA可以包括但不限于HOX11、TAL1、LY1、LMO1或LMO2或它们的任何组合,并且可以用作来自囊泡的血液恶性肿瘤的特异性生物标志物。
可在囊泡中进行评估的血癌的生物标志物突变包括但不限于c-kit、PDGFR或ABL突变;或者血液恶性肿瘤特异性突变的任何组合。
本发明还提供了分离的囊泡,其包含一种或多种血癌特异性生物标志物,例如图25和图1中对于血癌所列的。还提供了包含分离的囊泡的组合物。因此,在一些实施方案中,所述的组合物包含囊泡群体,该群体包含一种或多种血癌特异性生物标志物,例如图25和图1中对于血癌所列的。所述的组合物可以包含明显富集的囊泡群体,其中所述的囊泡群体对于血癌特异性囊泡或者包含一种或多种血癌特异性生物标志物(例如图25和图1中对于血癌所列的)的囊泡为基本上均质的。
为表征血癌,还可以通过本文所公开的一种或多种系统来检测一种或多种血癌特异性生物标志物(例如图25和图1中对于血癌所列的)。例如,检测系统可以包括一种或多种探针以检测生物样品中一种或多种囊泡的一种或多种血癌特异性生物标志物(例如图25和图1中对于血癌所列的)。
所述的一种或多种血癌特异性生物标志物还可以为基因融合体,其对于急性淋巴性白血病(ALL)选自TTL-ETV6、CDK6-MLL、CDK6-TLX3、ETV6-FLT3、ETV6-RUNX1、ETV6-TTL、MLL-AFF1、MLL-AFF3、MLL-AFF4、MLL-GAS7、TCBA1-ETV6、TCF3-PBX1或TCF3-TFPT;对于T细胞急性淋巴细胞性白血病(T-ALL)选自BCL11B-TLX3、IL2-TNFRFS17、NUP214-ABL1、NUP98-CCDC28A、TAL1-STIL或ETV6-ABL2;对于间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)选自ATIC-ALK、KIAA1618-ALK、MSN-ALK、MYH9-ALK、NPM1-ALK、TGF-ALK或TPM3-ALK;对于慢性骨髓性白血病(CML)选自BCR-ABL1、BCR-JAK2、ETV6-EVI1、ETV6-MN1或ETV6-TCBA1;对于AML选自CBFB-MYH11、CHIC2-ETV6、ETV6-ABL1、ETV6-ABL2、ETV6-ARNT、ETV6-CDX2、ETV6-HLXB9、ETV6-PER1、MEF2D-DAZAP1、AML-AFF1、MLL-ARHGAP26、MLL-ARHGEF12、MLL-CASC5、MLL-CBL、MLL-CREBBP、MLL-DAB21P、MLL-ELL、MLL-EP300、MLL-EPS15、MLL-FNBP1、MLL-FOXO3A、MLL-GMPS、MLL-GPHN、MLL-MLLT1、MLL-MLLT11、MLL-MLLT3、MLL-MLLT6、MLL-MYO1F、MLL-PICALM、MLL-SEPT2、MLL-SEPT6、MLL-SORBS2、MYST3-SORBS2、MYST-CREBBP、NPM1-MLF1、NUP98-HOXA13、PRDM16-EVI1、RABEP1-PDGFRB、RUNX1-EVI1、RUNX1-MDS1、RUNX1-RPL22、RUNX1-RUNX1T1、RUNX1-SH3D19、RUNX1-USP42、RUNX1-YTHDF2、RUNX1-ZNF687或TAF15-ZNF-384;对于慢性淋巴细胞性白血病(CLL)选自CCND1-FSTL3;以及对于嗜酸性粒细胞增多/慢性嗜酸性粒细胞增多选自FLIP1-PDGFRA、FLT3-ETV6、KIAA1509-PDGFRA、PDE4DIP-PDGFRB、NIN-PDGFRB、TP53BP1-PDGFRB或TPM3-PDGFRB。
CLL的一种或多种生物标志物还可以包括以下上调或过表达的miRNA中的一种或多种,例如miR-23b、miR-24-1、miR-146、miR-155、miR-195、miR-221、miR-331、miR-29a、miR-195、miR-34a或miR-29c;以及以下下调或表达不足的miR中的一种或多种,例如miR-15a、miR-16-1、miR-29或miR-223;或它们的任何组合。
ALL的一种或多种生物标志物还可以包括以下上调或过表达的miRNA中的一种或多种,例如miR-128b、miR-204、miR-218、miR-331、miR-181b-1、miR-17-92或它们的任何组合。
B细胞慢性淋巴细胞性白血病(B-CLL)
来自囊泡的B-CLL特异性生物标志物可以包括一种或多种(例如,2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种或更多种)过表达的miR、表达不足的miR、mRNA、基因突变、蛋白质、配体、肽、snoRNA或者它们的任何组合,例如图26中所列的,并且可以用于建立B-CLL特异性生物印记。例如,所述的生物印记可以包括一种或多种过表达的miR,例如但不限于miR-183-prec、miR-190、miR-24-1-prec、miR-33、miR-19a、miR-140、miR-123、miR-10b、miR-15b-prec、miR-92-1、miR-188、miR-154、miR-217、miR-101、miR-141-prec、miR-153-prec、miR-196-2、miR-134、miR-141、miR-132、miR-192或miR-181b-prec或它们的任何组合。
所述的生物印记还可以包括一种或多种表达不足的miR,例如但不限于miR-213、miR-220或它们的任何组合。可以分析的一种或多种mRNA可以包括但不限于ZAP70、AdipoR1或它们的任何组合,并且可以用作来自囊泡的B-CLL的特异性生物标志物。可在囊泡中进行评估的B-CLL的生物标志物突变包括但不限于IGHV、P53、ATM的突变;或者B-CLL特异性的突变的任何组合。
本发明还提供了分离的囊泡,其包含一种或多种B-CLL特异性生物标志物,例如BCL3-MYC、MYC-BTG1、BCL7A-MYC、BRWD3-ARHGAP20或BTG1-MYC;或者图26中所列的那些。还提供了包含分离的囊泡的组合物。因此,在一些实施方案中,所述的组合物包含囊泡群体,该群体包含一种或多种B-CLL特异性生物标志物,例如BCL3-MYC、MYC-BTG1、BCL7A-MYC、BRWD3-ARHGAP20或BTG1-MYC;或者图26中所列的那些。所述的组合物可以包含明显富集的囊泡群体,其中所述的囊泡群体对于B-CLL特异性囊泡或者包含一种或多种B-CLL特异性生物标志物,例如BCL3-MYC、MYC-BTG1、BCL7A-MYC、BRWD3-ARHGAP20或BTG1-MYC,或者图26中所列的那些生物标志物的囊泡为基本上均质的。
为表征B-CLL,还可以通过本文所公开的一种或多种系统来检测一种或多种B-CLL特异性生物标志物(例如BCL3-MYC、MYC-BTG1、BCL7A-MYC、BRWD3-ARHGAP20或BTG1-MYC或者图26中所列的那些)。例如,检测系统可以包括一种或多种探针以检测生物样品中一种或多种囊泡的一种或多种B-CLL特异性生物标志物(例如BCL3-MYC、MYC-BTG1、BCL7A-MYC、BRWD3-ARHGAP20或BTG1-MYC或者图26中所列的那些生物标志物)。
B-细胞淋巴瘤
来自囊泡的B-细胞淋巴瘤特异性生物标志物可以包括一种或多种(例如,2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种或更多种)过表达的miR、表达不足的miR、mRNA、基因突变、蛋白质、配体、肽、snoRNA或者它们的任何组合,例如图27中所列的,并且可以用于建立B-细胞淋巴瘤特异性生物印记。例如,所述的生物印记可以包括一种或多种过表达的miR,例如但不限于miR-17-92多顺反子、miR-155、miR-210或miR-21、miR-19a、miR-92、miR-142miR-155、miR-221miR-17-92、miR-21、miR-191、miR-205或它们的任何组合。此外,可以用作B-细胞淋巴瘤的外来体生物标志物的snoRNA可以包括但不限于U50。
本发明还提供了分离的囊泡,其包含一种或多种B-细胞淋巴瘤特异性生物标志物,例如图27中所列的。还提供了包含分离的囊泡的组合物。因此,在一些实施方案中,所述的组合物包含囊泡群体,该群体包含一种或多种B-细胞淋巴瘤特异性生物标志物,例如图27中所列的。所述的组合物可以包含明显富集的囊泡群体,其中所述的囊泡群体对于B-细胞淋巴瘤特异性囊泡或者包含一种或多种B-细胞淋巴瘤特异性生物标志物(例如图27中所列的)的囊泡为基本上均质的。
为表征B-细胞淋巴瘤,还可以通过本文所公开的一种或多种系统来检测一种或多种B-细胞淋巴瘤特异性生物标志物(例如图27中所列的)。例如,检测系统可以包括一种或多种探针以检测生物样品中一种或多种囊泡的一种或多种B-细胞淋巴瘤特异性生物标志物(例如图27中所列的)。
弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)
来自囊泡的DLBCL特异性生物标志物可以包括一种或多种(例如,2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种或更多种)过表达的miR、表达不足的miR、mRNA、基因突变、蛋白质、配体、肽、snoRNA或者它们的任何组合,例如图28中所列的,并且可以用于建立DLBCL特异性生物印记。例如,所述的生物印记可以包括一种或多种过表达的miR,例如但不限于miR-17-92、miR-155、miR-210或miR-21或它们的任何组合。可以分析的一种或多种mRNA可以包括但不限于A-myb、LMO2、JNK3、CD10、bcl-6、细胞周期蛋白D2、IRF4、Flip、CD44或它们的任何组合,并且可以用作来自囊泡的DLBCL的特异性生物标志物。
本发明还提供了分离的囊泡,其包含一种或多种DLBCL特异性生物标志物,例如CITTA-BCL6、CLTC-ALK、IL21R-BCL6、PIM1-BCL6、TFCR-BCL6、IKZF1-BCL6或SEC31A-ALK;或者图28中所列的那些生物标志物。还提供了包含分离的囊泡的组合物。因此,在一些实施方案中,所述的组合物包含囊泡群体,该群体包含一种或多种DLBCL特异性生物标志物,例如CITTA-BCL6、CLTC-ALK、IL21R-BCL6、PIM1-BCL6、TFCR-BCL6、IKZF1-BCL6或SEC31A-ALK或者图28中所列的那些生物标志物。所述的组合物可以包含明显富集的囊泡群体,其中所述的囊泡群体对于DLBCL特异性囊泡或者包含一种或多种DLBCL特异性生物标志物(例如CITTA-BCL6、CLTC-ALK、IL21R-BCL6、PIM1-BCL6、TFCR-BCL6、IKZF1-BCL6或SEC31A-ALK或者图28中所列的那些生物标志物)的囊泡为基本上均质的。
为表征DLBCL,还可以通过本文所公开的一种或多种系统来检测一种或多种DLBCL特异性生物标志物(例如CITTA-BCL6、CLTC-ALK、IL21R-BCL6、PIM1-BCL6、TFCR-BCL6、IKZF1-BCL6或SEC31A-ALK或者图28中所列的那些生物标志物)。例如,检测系统可以包括一种或多种探针以检测生物样品中一种或多种囊泡的一种或多种DLBCL特异性生物标志物(例如CITTA-BCL6、CLTC-ALK、IL21R-BCL6、PIM1-BCL6、TFCR-BCL6、IKZF1-BCL6或SEC31A-ALK或者图28中所列的那些)。
伯基特氏淋巴瘤
来自囊泡的伯基特氏淋巴瘤特异性生物标志物可以包括一种或多种(例如,2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种或更多种)过表达的miR、表达不足的miR、mRNA、基因突变、蛋白质、配体、肽、snoRNA或者它们的任何组合,例如图29中所列的,并且可以用于建立伯基特氏淋巴瘤特异性生物印记。例如,所述的生物印记还可以包括一种或多种表达不足的miR,例如但不限于pri-miR-155或它们的任何组合。可以分析的一种或多种mRNA可以包括但不限于MYC、TERT、NS、NP、MAZ、RCF3、BYSL、IDE3、CDC7、TCL1A、AUTS2、MYBL1、BMP7、ITPR3、CDC2、BACK2、TTK、MME、ALOX5或TOP1或它们的任何组合,并且可以用作来自囊泡的伯基特氏淋巴瘤的特异性生物标志物。可在囊泡中进行评估的蛋白质、配体或肽可以包括但不限于BCL6、KI-67或它们的任何组合。
本发明还提供了分离的囊泡,其包含一种或多种伯基特氏淋巴瘤特异性生物标志物,例如IGH-MYC、LCP1-BCL6;或者图29中所列的那些生物标志物。还提供了包含分离的囊泡的组合物。因此,在一些实施方案中,所述的组合物包含囊泡群体,该群体包含一种或多种伯基特氏淋巴瘤特异性生物标志物(例如IGH-MYC、LCP1-BCL6或者图29中所列的那些生物标志物)。所述的组合物可以包含明显富集的囊泡群体,其中所述的囊泡群体伯基特氏淋巴瘤特异性囊泡或者包含一种或多种伯基特氏淋巴瘤特异性生物标志物(例如IGH-MYC、LCP1-BCL6或者图29中所列的那些生物标志物)的囊泡为基本上均质的。
为表征伯基特氏淋巴瘤,还可以通过本文所公开的一种或多种系统来检测一种或多种伯基特氏淋巴瘤特异性生物标志物(例如IGH-MYC、LCP1-BCL6)或者图29中所列的那些生物标志物。例如,检测系统可以包括一种或多种探针以检测生物样品中一种或多种囊泡的一种或多种伯基特氏淋巴瘤特异性生物标志物(例如IGH-MYC、LCP1-BCL6或者图29中所列的那些生物标志物)。
肝细胞癌
来自囊泡的肝细胞癌特异性生物标志物可以包括一种或多种(例如,2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种或更多种)过表达的miR、表达不足的miR、mRNA、基因突变、蛋白质、配体、肽、snoRNA或者它们的任何组合,例如图30中所列的,并且可以用于建立肝细胞癌特异性生物印记。例如,所述的生物印记可以包括一种或多种过表达的miR,例如但不限于miR-221。所述的生物印记也可以包括一种或多种表达不足的miR,例如但不限于let-7a-1、let-7a-2、let-7a-3、let-7b、let-7c、let-7d、let-7e、let-7f-2、let-fg、miR-122a、miR-124a-2、miR-130a、miR-132、miR-136、miR-141、miR-142、miR-143、miR-145、miR-146、miR-150、miR-155(BIC)、miR-181a-1、miR-181a-2、miR-181c、miR-195、miR-199a-1-5p、miR-199a-2-5p、miR-199b、miR-200b、miR-214、miR-223或pre-miR-594或它们的任何组合。可以分析的一种或多种mRNA可以包括但不限于FAT10。
生物印记的一种或多种生物标志物还可以用于表征丙型肝炎病毒相关肝细胞癌。所述的一种或多种生物标志物可以为miRNA,例如过表达的或表达不足的miRNA。例如,上调或过表达的miRNA可以为miR-122、miR-100或miR-10a,而下调的miRNA可以为miR-198或miR-145。
本发明还提供了分离的囊泡,其包含一种或多种肝细胞癌特异性生物标志物,例如图30和图1中对于肝细胞癌所列的。还提供了包含分离的囊泡的组合物。因此,在一些实施方案中,所述的组合物包含囊泡群体,该群体包含一种或多种肝细胞癌特异性生物标志物,例如图30和图1中对于肝细胞癌所列的。所述的组合物可以包含明显富集的囊泡群体,其中所述的囊泡群体对于肝细胞癌特异性囊泡或者包含一种或多种肝细胞癌特异性生物标志物(例如图30和图1中对于肝细胞癌所列的)的囊泡为基本上均质的。
为表征肝细胞癌,还可以通过本文所公开的一种或多种系统来检测一种或多种肝细胞癌特异性生物标志物(例如图30和图1中对于肝细胞癌所列的)。例如,检测系统可以包括一种或多种探针以检测生物样品中一种或多种囊泡的一种或多种肝细胞癌特异性生物标志物(例如图30和图1中对于肝细胞癌所列的)。
子宫颈癌
来自囊泡的宫颈癌特异性生物标志物可以包括一种或多种(例如,2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种或更多种)过表达的miR、表达不足的miR、mRNA、基因突变、蛋白质、配体、肽、snoRNA或者它们的任何组合,例如图31中所列的,并且可以用于建立宫颈癌特异性生物印记。例如,可以分析的一种或多种mRNA可以包括但不限于HPV E6、HPV E7或p53或它们的任何组合,并且可以用作来自囊泡的宫颈癌的特异性生物标志物。
本发明还提供了分离的囊泡,其包含一种或多种宫颈癌特异性生物标志物,例如图31和图1中对于宫颈癌所列的。此外,还提供了包含分离的囊泡的组合物。因此,在一些实施方案中,所述的组合物包含囊泡群体,该群体包含一种或多种宫颈癌特异性生物标志物,例如图31和图1中对于宫颈癌所列的。所述的组合物可以包含明显富集的囊泡群体,其中所述的囊泡群体对于宫颈癌特异性囊泡或者包含一种或多种宫颈癌特异性生物标志物(例如图31和图1中对于宫颈癌所列的生物标志物)的囊泡为基本上均质的。
为表征宫颈癌,还可以通过本文所公开的一种或多种系统来检测一种或多种宫颈癌特异性生物标志物(例如图31和图1中对于宫颈癌所列的)。例如,检测系统可以包括一种或多种探针以检测生物样品中一种或多种囊泡的一种或多种宫颈癌特异性生物标志物(例如图31和图1中对于宫颈癌所列的)。
子宫内膜癌
来自囊泡的子宫内膜癌特异性生物标志物可以包括一种或多种(例如,2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种或更多种)过表达的miR、表达不足的miR、mRNA、基因突变、蛋白质、配体、肽、snoRNA或者它们的任何组合,例如图32中所列的,并且可以用于建立子宫内膜癌特异性生物印记。例如,所述的生物印记可以包含一种或多种过表达的miR,例如但不限于miR-185、miR-106a、miR-181a、miR-210、miR-423、miR-103、miR-107或let-7c或它们的任何组合。所述的生物印记还可以包含一种或多种表达不足的miR,例如但不限于miR-7i、miR-221、miR-193、miR-152或miR-30c或它们的任何组合。
可在囊泡中进行评估的子宫内膜癌的生物标志物突变包括但不限于PTEN、K-RAS、B-连环蛋白、p53、Her2/neu的突变;或者子宫内膜癌特异性的突变的任何组合。可在囊泡中进行评估的蛋白质、配体或肽可以包括但不限于NLRP7、αVβ6整联蛋白或它们的任何组合。
本发明还提供了分离的囊泡,其包含一种或多种子宫内膜癌特异性生物标志物,例如图32和图1中对于子宫内膜癌所列的。还提供了包含分离的囊泡的组合物。因此,在一些实施方案中,所述的组合物包含囊泡群体,该群体包含一种或多种子宫内膜癌特异性生物标志物,例如图32和图1中对于子宫内膜癌所列的。所述的组合物可以包含明显富集的囊泡群体,其中所述的囊泡群体对于子宫内膜癌特异性囊泡或者包含一种或多种子宫内膜癌特异性生物标志物(例如图32和图1中对于子宫内膜癌所列的)的囊泡为基本上均质的。
为表征子宫内膜癌,还可以通过本文所公开的一种或多种系统来检测一种或多种子宫内膜癌特异性生物标志物(例如图32和图1中对于子宫内膜癌所列的)。例如,检测系统可以包括一种或多种探针以检测生物样品中一种或多种囊泡的一种或多种子宫内膜癌特异性生物标志物(例如图32和图1中对于子宫内膜癌所列的)。
头颈癌
来自囊泡的头颈癌特异性生物标志物可以包括一种或多种(例如,2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种或更多种)过表达的miR、表达不足的miR、mRNA、基因突变、蛋白质、配体、肽、snoRNA或者它们的任何组合,例如图33中所列的,并且可以用于建立头颈癌的特异性生物印记。例如,所述的生物印记可以包含一种或多种过表达的miR,例如但不限于miR-21、let-7、miR-18、miR-29c、miR-142-3p、miR-155、miR-146b、miR-205或miR-21或它们的任何组合。所述的生物印记还可以包含一种或多种表达不足的miR,例如但不限于miR-494。可以分析的一种或多种mRNA包括但不限于HPV E6、HPV E7、p53、IL-8、SAT、H3FA3或EGFR或它们的任何组合,并且可以用作来自囊泡的头颈癌的特异性生物标志物。
可在囊泡中进行评估的头颈癌的生物标志物突变包括但不限于GSTM1、GSTT1、GSTP1、OGG1、XRCC1、XPD、RAD51、EGFR、p53的突变;或者头颈癌的特异性突变的任何组合。可在囊泡中进行评估的蛋白质、配体或肽可以包括但不限于EGFR、EphB4或EphB2或它们的任何组合。
本发明还提供了分离的囊泡,其包含一种或多种头颈癌特异性生物标志物,例如CHCHD7-PLAG1、CTNNB1-PLAG1、FHIT-HMGA2、HMGA2-NFIB、LIFR-PLAG1或TCEA1-PLAG1;或者图33和图1中对于头颈癌所列的那些生物标志物。还提供了包含分离的囊泡的组合物。因此,在一些实施方案中,所述的组合物包含囊泡群体,该群体包含一种或多种头颈癌特异性生物标志物,例如CHCHD7-PLAG1、CTNNB1-PLAG1、FHIT-HMGA2、HMGA2-NFIB、LIFR-PLAG1或TCEA1-PLAG1;或者图33和图1中对于头颈癌所列的那些生物标志物。所述的组合物可以包含明显富集的囊泡群体,其中所述的囊泡群体对于头颈癌特异性囊泡或者包含一种或多种头颈癌特异性生物标志物,例如CHCHD7-PLAG1、CTNNB1-PLAG1、FHIT-HMGA2、HMGA2-NFIB、LIFR-PLAG1或TCEA1-PLAG1;或者图33和图1中对于头颈癌所列的那些生物标志物的囊泡为基本上均质的。
为表征头颈癌,还可以通过本文所公开的一种或多种系统来检测一种或多种头颈癌特异性生物标志物(例如图33和图1中对于头颈癌所列的那些)。例如,检测系统可以包括一种或多种探针以检测生物样品中一种或多种囊泡的一种或多种头颈癌特异性生物标志物(例如CHCHD7-PLAG1、CTNNB1-PLAG1、FHIT-HMGA2、HMGA2-NFIB、LIFR-PLAG1或TCEA1-PLAG1;或者图33和图1中对于头颈癌所列的那些生物标志物)。
炎性肠病(IBD)
来自囊泡的IBD特异性生物标志物可以包括一种或多种(例如,2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种或更多种)过表达的miR、表达不足的miR、mRNA、基因突变、蛋白质、配体、肽、snoRNA或者它们的任何组合,例如图34中所列的,并且可以用于建立IBD特异性生物印记。可以分析的一种或多种mRNA可以包括但不限于胰蛋白酶原IV、SERT或它们的任何组合,并且可以用作来自囊泡的IBD的特异性生物标志物。
可在囊泡中进行评估的IBD的生物标志物突变可以包括但不限于CARD15的突变;或者IBD特异性的突变的任何组合。可在囊泡中进行评估的蛋白质、配体或肽可以包括但不限于II-16、II-1β、II-12、TNF-α、干扰素γ、II-6、Rantes、MCP-1、抵抗素或5-HT或它们的任何组合。
本发明还提供了分离的囊泡,其包含一种或多种IBD特异性生物标志物,例如图34和图1中对于IBD所列的。此外,还提供了包含分离的囊泡的组合物。因此,在一些实施方案中,所述的组合物包含囊泡群体,该群体包含一种或多种IBD特异性生物标志物,例如图34和图1中对于IBD所列的。所述的组合物可以包含明显富集的囊泡群体,其中所述的囊泡群体对于IBD特异性囊泡或者包含一种或多种IBD特异性生物标志物(例如图34和图1中对于IBD所列的)的囊泡为基本上均质的。
为表征IBD,还可以通过本文所公开的一种或多种系统来检测一种或多种IBD特异性生物标志物(例如图34和图1中对于IBD所列的)。例如,检测系统可以包括一种或多种探针以检测生物样品中一种或多种囊泡的一种或多种IBD特异性生物标志物(例如图34和图1中对于IBD所列的)。
糖尿病
来自囊泡的糖尿病特异性生物标志物可以包括一种或多种(例如,2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种或更多种)过表达的miR、表达不足的miR、mRNA、基因突变、蛋白质、配体、肽、snoRNA或者它们的任何组合,例如图35中所列的,并且可以用于建立糖尿病特异性生物印记。例如,可以分析的一种或多种mRNA可以包括但不限于Il-8、CTSS、ITGB2、HLA-DRA、CD53、PLAG27或MMP9或它们的任何组合,并且可以用作来自囊泡的糖尿病的特异性生物标志物。可在囊泡中进行评估的蛋白质、配体或肽可以包括但不限于RBP4。
本发明还提供了分离的囊泡,其包含一种或多种糖尿病特异性生物标志物,例如图35和图1中对于糖尿病所列的。此外,还提供了包含分离的囊泡的组合物。因此,在一些实施方案中,所述的组合物包含囊泡群体,该群体包含一种或多种糖尿病特异性生物标志物,例如图35和图1中对于糖尿病所列的生物标志物。所述的组合物可以包含明显富集的囊泡群体,其中所述的囊泡群体对于糖尿病特异性囊泡或者包含一种或多种糖尿病特异性生物标志物(例如图35和图1中对于糖尿病所列的)的囊泡为基本上均质的。
为表征糖尿病,还可以通过本文所公开的一种或多种系统来检测一种或多种糖尿病特异性生物标志物(例如图35和图1中对于糖尿病所列的)。例如,检测系统可以包括一种或多种探针以检测生物样品中一种或多种囊泡的一种或多种糖尿病特异性生物标志物(例如图35和图1中对于糖尿病所列的)。
巴雷特食管
来自囊泡的巴雷特食管特异性生物标志物可以包括一种或多种(例如,2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种或更多种)过表达的miR、表达不足的miR、mRNA、基因突变、蛋白质、配体、肽、snoRNA或者它们的任何组合,例如图36中所列的,并且可以用于建立巴雷特食管特异性生物印记。例如,所述的生物印记可以包含一种或多种过表达的miR,例如但不限于miR-21、miR-143、miR-145、miR-194或miR-215或它们的任何组合。可以分析的一种或多种mRNA包括但不限于S100A2、S100A4或它们的任何组合,并且可以用作来自囊泡的巴雷特食管的特异性生物标志物。
可在囊泡中进行评估的巴雷特食管的生物标志物突变可以包括但不限于p53的突变;或者巴雷特食管特异性突变的任何组合。可在囊泡中进行评估的蛋白质、配体或肽可以包括但不限于p53、MUC1、MUC2或它们的任何组合。
本发明还提供了分离的囊泡,其包含一种或多种巴雷特食管特异性生物标志物,例如图36和图1中对于巴雷特食管所列的。还提供了包含分离的囊泡的组合物。因此,在一些实施方案中,所述的组合物包含囊泡群体,该群体包含一种或多种巴雷特食管特异性生物标志物,例如图36和图1中对于巴雷特食管所列的。所述的组合物可以包含明显富集的囊泡群体,其中所述的囊泡群体对于巴雷特食管特异性囊泡或者包含一种或多种巴雷特食管特异性生物标志物(例如图36和图1中对于巴雷特食管所列的)的囊泡为基本上均质的。
为表征巴雷特食管,还可以通过本文所公开的一种或多种系统来检测一种或多种巴雷特食管的特异性生物标志物(例如图36和图1中对于巴雷特食管所列的生物标志物)。例如,检测系统可以包括一种或多种探针以检测生物样品中一种或多种囊泡的一种或多种巴雷特食管特异性生物标志物(例如图36和图1中对于巴雷特食管所列的)。
纤维肌痛
来自囊泡的纤维肌痛特异性生物标志物可以包括一种或多种(例如,2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种或更多种)过表达的miR、表达不足的miR、mRNA、基因突变、蛋白质、配体、肽、snoRNA或者它们的任何组合,例如图37中所列的,并且可以用于建立纤维肌痛特异性生物印记。可以分析的一种或多种mRNA包括但不限于NR2D,其可以用作来自囊泡的纤维肌痛的特异性生物标志物。
本发明还提供了分离的囊泡,其包含一种或多种纤维肌痛特异性生物标志物,例如图37和图1中对于纤维肌痛所列的生物标志物。还提供了包含分离的囊泡的组合物。因此,在一些实施方案中,所述的组合物包含囊泡群体,该群体包含一种或多种纤维肌痛特异性生物标志物,例如图37和图1中对于纤维肌痛所列的生物标志物。所述的组合物可以包含明显富集的囊泡群体,其中所述的囊泡群体对于纤维肌痛特异性囊泡或者包含一种或多种纤维肌痛特异性生物标志物(例如图37和图1中对于纤维肌痛所列的生物标志物)的囊泡为基本上均质的。
为表征纤维肌痛,还可以通过本文所公开的一种或多种系统来检测一种或多种纤维肌痛的特异性生物标志物(例如图37和图1中对于纤维肌痛所列的生物标志物)。例如,检测系统可以包括一种或多种探针以检测生物样品中一种或多种囊泡的一种或多种纤维肌痛特异性生物标志物(例如图37和图1中对于纤维肌痛所列的生物标志物)。
中风
来自囊泡的中风特异性生物标志物可以包括一种或多种(例如,2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种或更多种)过表达的miR、表达不足的miR、mRNA、基因突变、蛋白质、配体、肽、snoRNA或者它们的任何组合,例如图38中所列的,并且可以用于建立中风特异性生物印记。例如,可以分析的一种或多种mRNA可以包括但不限于MMP9、S100-P、S100A12、S100A9、凝血因子V、精氨酸酶I、CA-IV、单羧酸转运蛋白、ets-2、EIF2α、细胞骨架相关的蛋白质4、N-甲酰基肽受体、核糖核酸酶2、N-乙酰神经氨酸丙酮裂解酶、BCL-6或糖原磷酸化酶或它们的任何组合,并且可以用作来自囊泡的中风的特异性生物标志物。
本发明还提供了分离的囊泡,其包含一种或多种中风特异性生物标志物,例如图38和图1中对于中风所列的。此外,还提供了包含分离的囊泡的组合物。因此,在一些实施方案中,所述的组合物包含囊泡群体,该群体包含一种或多种中风特异性生物标志物,例如图38和图1中对于中风所列的生物标志物。所述的组合物可以包含明显富集的囊泡群体,其中所述的囊泡群体对于中风特异性囊泡或者包含一种或多种中风特异性生物标志物(例如图38和图1中对于中风所列的生物标志物)的囊泡为基本上均质的。
为表征中风,还可以通过本文所公开的一种或多种系统来检测一种或多种中风的特异性生物标志物(例如图38和图1中对于中风所列的生物标志物)。例如,检测系统可以包括一种或多种探针以检测生物样品中一种或多种囊泡的一种或多种中风特异性生物标志物(例如图38和图1中对于中风所列的生物标志物)。
多发性硬化症(MS)
来自囊泡的MS特异性生物标志物可以包括一种或多种(例如,2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种或更多种)过表达的miR、表达不足的miR、mRNA、基因突变、蛋白质、配体、肽、snoRNA或者它们的任何组合,例如图39中所列的,并且可以用于建立MS特异性生物印记。例如,可以分析的一种或多种mRNA可以包括但不限于IL-6、IL-17、PAR-3、IL-17、T1/ST2、JunD、5-LO、LTA4H、MBP、PLP或α-β晶状体球蛋白或它们的任何组合,并且可以用作来自囊泡的MS的特异性生物标志物。
本发明还提供了分离的囊泡,其包含一种或多种MS特异性生物标志物,例如图39和图1中对于MS所列的。此外,还提供了包含分离的囊泡的组合物。因此,在一些实施方案中,所述的组合物包含囊泡群体,该群体包含一种或多种MS特异性生物标志物,例如图39和图1中对于MS所列的生物标志物。所述的组合物可以包含明显富集的囊泡群体,其中所述的囊泡群体对于MS特异性囊泡或者包含一种或多种MS特异性生物标志物(例如图39和图1中对于MS所列的生物标志物)的囊泡为基本上均质的。
为表征MS,还可以通过本文所公开的一种或多种系统来检测一种或多种MS的特异性生物标志物(例如图39和图1中对于MS所列的生物标志物)。例如,检测系统可以包括一种或多种探针以检测生物样品中一种或多种囊泡的一种或多种MS特异性生物标志物(例如图39和图1中对于MS所列的生物标志物)。
帕金森氏病
来自囊泡的帕金森氏病特异性生物标志物可以包括一种或多种(例如,2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种或更多种)过表达的miR、表达不足的miR、mRNA、基因突变、蛋白质、配体、肽、snoRNA或者它们的任何组合,例如图40(a)中所列的,并且可以用于建立帕金森氏病特异性生物印记。例如,所述的生物印记可以包括但不限于一种或多种表达不足的miR,例如miR-133b。可以分析的一种或多种mRNA可以包括但不限于Nurr1、BDNF、TrkB、gstm1或S100β或它们的任何组合,并且可以用作来自囊泡的帕金森氏病的特异性生物标志物。
可在囊泡中进行评估的帕金森氏病的生物标志物突变可以包括但不限于FGF20、α-突触核蛋白、FGF20、NDUFV2、FGF2、CALB1、B2M的突变;或者帕金森氏病的特异性突变的任何组合。可在囊泡中进行评估的蛋白质、配体或肽可以包括但不限于apo-H、血浆铜蓝蛋白、BDNF、IL-8、β2-微球蛋白、apoAII、tau、Aβ1-42、DJ-1或它们的任何组合。
本发明还提供了分离的囊泡,其包含一种或多种帕金森氏病特异性生物标志物,例如图40(a)和图1中对于帕金森氏病所列的。此外,还提供了包含分离的囊泡的组合物。因此,在一些实施方案中,所述的组合物包含囊泡群体,该群体包含一种或多种帕金森氏病特异性生物标志物,例如图40(a)和图1中对于帕金森氏病所列的生物标志物。所述的组合物可以包含明显富集的囊泡群体,其中所述的囊泡群体对于帕金森氏病特异性囊泡或者包含一种或多种帕金森氏病特异性生物标志物(例如图40(a)和图1中对于帕金森氏病所列的生物标志物)的囊泡为基本上均质的。
为表征帕金森氏病,还可以通过本文所公开的一种或多种系统来检测一种或多种帕金森氏病的特异性生物标志物(例如图40(a)和图1中对于帕金森氏病所列的生物标志物)。例如,检测系统可以包括一种或多种探针以检测生物样品中一种或多种囊泡的一种或多种帕金森氏病特异性生物标志物(例如图40(a)和图1中对于帕金森氏病所列的生物标志物)。
风湿病
来自囊泡的风湿病特异性生物标志物可以包括一种或多种(例如,2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种或更多种)过表达的miR、表达不足的miR、mRNA、基因突变、蛋白质、配体、肽、snoRNA或者它们的任何组合,例如图41中所列的,并且可以用于建立风湿病特异性生物印记。例如,所述的生物印记可以包括一种或多种表达不足的miR,例如但不限于miR-146a、miR-155、miR-132、miR-16或miR-181或它们的任何组合。可以分析的一种或多种mRNA可以包括但不限于HOXD10、HOXD11、HOXD13、CCL8、LIM同源框2或CENP-E或它们的任何组合,并且可以用作来自囊泡的风湿病的特异性生物标志物。可在囊泡中进行评估的蛋白质、配体或肽可以包括但不限于TNFα。
本发明还提供了分离的囊泡,其包含一种或多种风湿病特异性生物标志物,例如图41和图1中对于风湿病所列的生物标志物。此外,还提供了包含分离的囊泡的组合物。因此,在一些实施方案中,所述的组合物包含囊泡群体,该群体包含一种或多种风湿病特异性生物标志物,例如图41和图1中对于风湿病所列的生物标志物。所述的组合物可以包含明显富集的囊泡群体,其中所述的囊泡群体对于风湿病特异性囊泡或者包含一种或多种风湿病特异性生物标志物(例如图41和图1中对于风湿病所列的生物标志物)的囊泡为基本上均质的。
为表征风湿病,还可以通过本文所公开的一种或多种系统来检测一种或多种风湿病特异性生物标志物(例如图41和图1中对于风湿病所列的生物标志物)。例如,检测系统可以包括一种或多种探针以检测生物样品中一种或多种囊泡的一种或多种风湿病特异性生物标志物(例如图41和图1中对于风湿病所列的生物标志物)。
阿尔兹海默氏病
来自囊泡的阿尔兹海默氏病特异性生物标志物可以包括一种或多种(例如,2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种或更多种)过表达的miR、表达不足的miR、mRNA、基因突变、蛋白质、配体、肽、snoRNA或者它们的任何组合,例如图42中所列的,并且可以用于建立阿尔兹海默氏病特异性生物印记。例如,所述的生物印记还可以包括一种或多种表达不足的miR,例如miR-107、miR-29a、miR-29b-1或miR-9或它们的任何组合。所述的生物印记还可以包括一种或多种过表达的miR,例如miR-128或它们的任何组合。
可以分析的一种或多种mRNA可以包括但不限于HIF-1α、BACE1、Reelin、CHRNA7或3Rtau/4Rtau或它们的任何组合,并且可以用作来自囊泡的阿尔兹海默氏病的特异性生物标志物。
可在囊泡中进行评估的阿尔兹海默氏病的生物标志物突变可以包括但不限于APP、早衰蛋白1、早衰蛋白2、APOE4的突变;或者阿尔兹海默氏病的特异性突变的任何组合。可在囊泡中进行评估的蛋白质、配体或肽可以包括但不限于BACE1、Reelin、Cystatin C、截短的Cystatin C、淀粉蛋白β、C3a、t-Tau、补体因子H或α-2-巨球蛋白或它们的任何组合。
本发明还提供了分离的囊泡,其包含一种或多种阿尔兹海默氏病特异性生物标志物,例如图42和图1中对于阿尔兹海默氏病所列的生物标志物。此外,还提供了包含分离的囊泡的组合物。因此,在一些实施方案中,所述的组合物包含囊泡群体,该群体包含一种或多种阿尔兹海默氏病特异性生物标志物,例如图42和图1中对于阿尔兹海默氏病所列的生物标志物。所述的组合物可以包含明显富集的囊泡群体,其中所述的囊泡群体对于阿尔兹海默氏病特异性囊泡或者包含一种或多种阿尔兹海默氏病特异性生物标志物(例如图42和图1中对于阿尔兹海默氏病所列的生物标志物)的囊泡为基本上均质的。
为表征阿尔兹海默氏病,还可以通过本文所公开的一种或多种系统来检测一种或多种阿尔兹海默氏病特异性生物标志物(例如图42和图1中对于阿尔兹海默氏病所列的生物标志物)。例如,检测系统可以包括一种或多种探针以检测生物样品中一种或多种囊泡的一种或多种阿尔兹海默氏病特异性生物标志物(例如图42和图1中对于阿尔兹海默氏病所列的生物标志物)。
朊病毒病
来自囊泡的朊病毒特异性生物标志物可以包括一种或多种(例如,2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种或更多种)过表达的miR、表达不足的miR、mRNA、基因突变、蛋白质、配体、肽、snoRNA或者它们的任何组合,例如图43中所列的,并且可以用于建立朊病毒特异性生物印记。例如,可以分析的一种或多种mRNA可以包括但不限于淀粉样蛋白B4、App、IL-1R1或SOD1或它们的任何组合,并且可以用作来自囊泡的朊病毒特异性生物标志物。可在囊泡中进行评估的蛋白质、配体或肽可以包括但不限于PrP(c)、14-3-3、NSE、S-100、Tau、AQP-4或它们的任何组合。
本发明还提供了分离的囊泡,其包含一种或多种朊病毒特异性生物标志物,例如图43和图1中对于朊病毒病所列的生物标志物。此外,还提供了包含分离的囊泡的组合物。因此,在一些实施方案中,所述的组合物包含囊泡群体,该群体包含一种或多种朊病毒特异性生物标志物,例如图43和图1中对于朊病毒病所列的生物标志物。所述的组合物可以包含明显富集的囊泡群体,其中所述的囊泡群体对于朊病毒病特异性囊泡或者包含一种或多种朊病毒病特异性生物标志物(例如图43和图1中对于朊病毒病所列的生物标志物)的囊泡为基本上均质的。
为表征朊病毒病,还可以通过本文所公开的一种或多种系统来检测一种或多种朊病毒病特异性生物标志物(例如图43和图1中对于朊病毒病所列的生物标志物)。例如,检测系统可以包括一种或多种探针以检测生物样品中一种或多种囊泡的一种或多种朊病毒病特异性生物标志物(例如图43和图1中对于朊病毒病所列的生物标志物)。
脓毒症
来自囊泡的脓毒症特异性生物标志物可以包括一种或多种(例如,2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种或更多种)过表达的miR、表达不足的miR、mRNA、基因突变、蛋白质、配体、肽、snoRNA或者它们的任何组合,例如图44中所列的,并且可以用于建立脓毒症特异性生物印记。例如,可以分析的一种或多种mRNA可以包括但不限于15-羟基-PG脱氢酶(向上)、LAIR1(向上)、NFKB1A(向上)、TLR2、PGLYPR1、TLR4、MD2、TLR5、IFNAR2、IRAK2、IRAK3、IRAK4、PI3K、PI3KCB、MAP2K6、MAPK14、NFKB1A、NFKB1、IL1R1、MAP2K1IP1、MKNK1、FAS、CASP4、GADD45B、SOCS3、TNFSF10、TNFSF13B、OSM、HGF或IL18R1或它们的任何组合,并且可以用作来自囊泡的脓毒症的特异性生物标志物。
本发明还提供了分离的囊泡,其包含一种或多种脓毒症特异性生物标志物,例如图44所列的。此外,还提供了包含分离的囊泡的组合物。因此,在一些实施方案中,所述的组合物包含囊泡群体,该群体包含一种或多种脓毒症特异性生物标志物,例如图44中所列的。所述的组合物可以包含明显富集的囊泡群体,其中所述的囊泡群体对于脓毒症特异性囊泡或者包含一种或多种脓毒症特异性生物标志物(例如图44中所列的生物标志物)的囊泡为基本上均质的。
为表征脓毒症,还可以通过本文所公开的一种或多种系统来检测一种或多种脓毒症特异性生物标志物(例如图44中所列的生物标志物)。例如,检测系统可以包括一种或多种探针以检测生物样品中一种或多种囊泡的一种或多种脓毒症特异性生物标志物(例如图44中所列的生物标志物)。
慢性神经病理性疼痛
来自囊泡的慢性神经病理性疼痛(CNP)特异性生物标志物可以包括一种或多种(例如,2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种或更多种)过表达的miR、表达不足的miR、mRNA、基因突变、蛋白质、配体、肽、snoRNA或者它们的任何组合,例如图45中所列的,并且可以用于建立CNP特异性生物印记。例如,可以分析的一种或多种mRNA可以包括但不限于ICAM-1(啮齿动物)、CGRP(啮齿动物)、TIMP-1(啮齿动物)、CLR-1(啮齿动物)、HSP-27(啮齿动物)、FABP(啮齿动物)或载脂蛋白D(啮齿动物)或它们的任何组合,并且可以用作来自囊泡的CNP的特异性生物标志物。可在囊泡中进行评估的蛋白质、配体或肽可以包括但不限于趋化因子、趋化因子受体(CCR2/4)或它们的任何组合。
本发明还提供了分离的囊泡,其包含一种或多种慢性神经病理性疼痛特异性生物标志物,例如图45和图1中对于慢性神经病理性疼痛所列的生物标志物。此外,还提供了包含分离的囊泡的组合物。因此,在一些实施方案中,所述的组合物包含囊泡群体,该群体包含一种或多种慢性神经病理性疼痛特异性生物标志物,例如图45和图1中对于慢性神经病理性疼痛所列的生物标志物。所述的组合物可以包含明显富集的囊泡群体,其中所述的囊泡群体对于慢性神经病理性疼痛特异性囊泡或者包含一种或多种慢性神经病理性疼痛特异性生物标志物(例如图45和图1中对于慢性神经病理性疼痛所列的生物标志物)的囊泡为基本上均质的。
为表征慢性神经病理性疼痛,还可以通过本文所公开的一种或多种系统来检测一种或多种慢性神经病理性疼痛特异性生物标志物(例如图45和图1中对于慢性神经病理性疼痛所列的生物标志物)。例如,检测系统可以包括一种或多种探针以检测生物样品中一种或多种囊泡的一种或多种慢性神经病理性疼痛特异性生物标志物(例如图45和图1中对于慢性神经病理性疼痛所列的生物标志物)。
周围神经病理性疼痛
来自囊泡的周围神经病理性疼痛(PNP)特异性生物标志物可以包括一种或多种(例如,2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种或更多种)过表达的miR、表达不足的miR、mRNA、基因突变、蛋白质、配体、肽、snoRNA或者它们的任何组合,例如图46中所列的,并且可以用于建立PNP特异性生物印记。例如,可在囊泡中进行评估的蛋白质、配体或肽可以包括但不限于OX42、ED9或它们的任何组合。
本发明还提供了分离的囊泡,其包含一种或多种周围神经病理性疼痛特异性生物标志物,例如图46和图1中对于周围神经病理性疼痛所列的生物标志物。还提供了包含分离的囊泡的组合物。因此,在一些实施方案中,所述的组合物包含囊泡群体,该群体包含一种或多种周围神经病理性疼痛特异性生物标志物,例如图46和图1中对于周围神经病理性疼痛所列的生物标志物。所述的组合物可以包含明显富集的囊泡群体,其中所述的囊泡群体对于周围神经病理性疼痛特异性囊泡或者包含一种或多种周围神经病理性疼痛特异性生物标志物(例如图46和图1中对于周围神经病理性疼痛所列的生物标志物)的囊泡为基本上均质的。
为表征周围神经病理性疼痛,还可以通过本文所公开的一种或多种系统来检测一种或多种周围神经病理性疼痛特异性生物标志物(例如图46和图1中对于周围神经病理性疼痛所列的生物标志物)。例如,检测系统可以包括一种或多种探针以检测生物样品中一种或多种囊泡的一种或多种周围神经病理性疼痛特异性生物标志物(例如图46和图1中对于周围神经病理性疼痛所列的生物标志物)。
精神分裂症
来自囊泡的精神分裂症特异性生物标志物可以包括一种或多种(例如,2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种或更多种)过表达的miR、表达不足的miR、mRNA、基因突变、蛋白质、配体、肽、snoRNA或者它们的任何组合,例如图47中所列的,并且可以用于建立精神分裂症特异性生物印记。例如,所述的生物印记可以包括一种或多种过表达的miR,例如但不限于miR-181b。所述的生物印记还可以包括一种或多种表达不足的miR,例如但不限于miR-7、miR-24、miR-26b、miR-29b、miR-30b、miR-30e、miR-92或miR-195或它们的任何组合。
可以分析的一种或多种mRNA可以包括但不限于IFITM3、SERPINA3、GLS或ALDH7A1BASP1或它们的任何组合,并且可以用作来自囊泡的精神分裂症的特异性生物标志物。可在囊泡中进行评估的精神分裂症的生物标志物突变包括但不限于DISC1、dysbindin、神经调节蛋白-1、seratonin 2a受体、NURR1的突变;或者精神分裂症的特异性突变的任何组合。
可在囊泡中进行评估的蛋白质、配体或肽可以包括但不限于ATP5B、ATP5H、ATP6V1B、DNM1、NDUFV2、NSF、PDHB或它们的任何组合。
本发明还提供了分离的囊泡,其包含一种或多种精神分裂症特异性生物标志物,例如图47和图1中对于精神分裂症所列的生物标志物。此外,还提供了包含分离的囊泡的组合物。因此,在一些实施方案中,所述的组合物包含囊泡群体,该群体包含一种或多种精神分裂症特异性生物标志物,例如图47和图1中对于精神分裂症所列的生物标志物。所述的组合物可以包含明显富集的囊泡群体,其中所述的囊泡群体对于精神分裂症特异性囊泡或者包含一种或多种精神分裂症特异性生物标志物(例如图47和图1中对于精神分裂症所列的生物标志物)的囊泡为基本上均质的。
为表征精神分裂症,还可以通过本文所公开的一种或多种系统来检测一种或多种精神分裂症特异性生物标志物(例如图47和图1中对于精神分裂症所列的生物标志物)。例如,检测系统可以包括一种或多种探针以检测生物样品中一种或多种囊泡的一种或多种精神分裂症特异性生物标志物(例如图47和图1中对于精神分裂症所列的生物标志物)。
双相型疾病
来自囊泡的双相型疾病特异性生物标志物可以包括一种或多种(例如,2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种或更多种)过表达的miR、表达不足的miR、mRNA、基因突变、蛋白质、配体、肽、snoRNA或者它们的任何组合,例如图48中所列的,并且可以用于建立双相型疾病特异性生物印记。例如,可以分析的一种或多种mRNA可以包括但不限于FGF2、ALDH7A1、AGXT2L1、AQP4或PCNT2或它们的任何组合,并且可以用作来自囊泡的双相型疾病的特异性生物标志物。可在囊泡中进行评估的双相型疾病的生物标志物突变包括但不限于dysbindin、DAOA/G30、DISC1、神经调节蛋白-1的突变;或者双相型疾病特异性突变的任何组合。
本发明还提供了分离的囊泡,其包含一种或多种双相型疾病特异性生物标志物,例如图48中所列的。还提供了包含分离的囊泡的组合物。因此,在一些实施方案中,所述的组合物包含囊泡群体,该群体包含一种或多种双相型疾病特异性生物标志物,例如图48中所列的。所述的组合物可以包含明显富集的囊泡群体,其中所述的囊泡群体对于双相型疾病特异性囊泡或者包含一种或多种双相型疾病特异性生物标志物(例如图48中所列的生物标志物)的囊泡为基本上均质的。
为表征双相型疾病,还可以通过本文所公开的一种或多种系统来检测一种或多种双相型疾病特异性生物标志物(例如图48中所列的生物标志物)。例如,检测系统可以包括一种或多种探针以检测生物样品中一种或多种囊泡的一种或多种双相型疾病特异性生物标志物(例如图48中所列的生物标志物)。
抑郁症
来自囊泡的抑郁症特异性生物标志物可以包括一种或多种(例如,2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种或更多种)过表达的miR、表达不足的miR、mRNA、基因突变、蛋白质、配体、肽、snoRNA或者它们的任何组合,例如图49中所列的,并且可以用于建立抑郁症特异性生物印记。例如,可以分析的一种或多种mRNA可以包括但不限于FGFR1、FGFR2、FGFR3或AQP4或它们的任何组合,并且还可以用作来自囊泡的抑郁症的特异性生物标志物。
本发明还提供了分离的囊泡,其包含一种或多种抑郁症特异性生物标志物,例如图49中所列的。此外,还提供了包含分离的囊泡的组合物。因此,在一些实施方案中,所述的组合物包含囊泡群体,该群体包含一种或多种抑郁症特异性生物标志物,例如图49中所列的生物标志物。所述的组合物可以包含明显富集的囊泡群体,其中所述的囊泡群体对于抑郁症特异性囊泡或者包含一种或多种抑郁症特异性生物标志物(例如图49中所列的生物标志物)的囊泡为基本上均质的。
为表征抑郁症,还可以通过本文所公开的一种或多种系统来检测一种或多种抑郁症特异性生物标志物(例如图49中所列的生物标志物)。例如,检测系统可以包括一种或多种探针以检测生物样品中一种或多种囊泡的一种或多种抑郁症特异性生物标志物(例如图49中所列的生物标志物)。
胃肠道间质瘤(GIST)
来自囊泡的GIST特异性生物标志物可以包括一种或多种(例如,2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种或更多种)过表达的miR、表达不足的miR、mRNA、基因突变、蛋白质、配体、肽、snoRNA或者它们的任何组合,例如图50中所列的,并且可以用于建立GIST特异性生物印记。例如,可以分析的一种或多种mRNA可以包括但不限于DOG-1、PKC-θ、KIT、GPR20、PRKCQ、KCNK3、KCNH2、SCG2、TNFRSF6B或CD34或它们的任何组合,并且还可以用作来自囊泡的GIST的特异性生物标志物。
可在囊泡中进行评估的GIST的生物标志物突变可以包括但不限于PKC-θ的突变;或者GIST特异性突变的任何组合。可在囊泡中进行评估的蛋白质、配体或肽可以包括但不限于PDGFRA、c-kit或它们的任何组合。
本发明还提供了分离的囊泡,其包含一种或多种GIST特异性生物标志物,例如图50和图1中对于GIST所列的生物标志物。此外,还提供了包含分离的囊泡的组合物。因此,在一些实施方案中,所述的组合物包含囊泡群体,该群体包含一种或多种GIST特异性生物标志物,例如图50和图1中对于GIST所列的生物标志物。所述的组合物可以包含明显富集的囊泡群体,其中所述的囊泡群体对于GIST特异性囊泡或者包含一种或多种GIST特异性生物标志物(例如图50和图1中对于GIST所列的生物标志物)的囊泡为基本上均质的。
为表征GIST,还可以通过本文所公开的一种或多种系统来检测一种或多种GIST特异性生物标志物(例如图50和图1中对于GIST所列的生物标志物)。例如,检测系统可以包括一种或多种探针以检测生物样品中一种或多种囊泡的一种或多种GIST特异性生物标志物(例如图50和图1中对于GIST所列的生物标志物)。
肾细胞癌
来自囊泡的肾细胞癌特异性生物标志物可以包括一种或多种(例如,2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种或更多种)过表达的miR、表达不足的miR、mRNA、基因突变、蛋白质、配体、肽、snoRNA或者它们的任何组合,例如图51中所列的,并且可以用于建立肾细胞癌特异性生物印记。例如,所述的生物印记还可以包括一种或多种表达不足的miR,例如但不限于miR-141、miR-200c或它们的任何组合。所述的一种或多种上调或过表达的miRNA可以为miR-28、miR-185、miR-27、miR-let-7f-2或它们的任何组合。
可以分析的一种或多种mRNA可以包括但不限于层粘连蛋白受体1、betaig-h3、半乳凝集素-1、a-2巨球蛋白、脂肪分化相关蛋白、促血管新生蛋白因子2、钙调素结合蛋白1、II类MHC-相关不变链(CD74)、胶原蛋白IV-a1、补体成分、补体组分3、细胞色素P450、IIJ亚家族多肽2、δ睡眠诱导肽、Fc g受体IIIa(CD16)、HLA-B、HLA-DRa、HLA-DRb、HLA-SB、IFN-诱导的跨膜蛋白3、IFN-诱导的跨膜蛋白1或赖氨酰氧化酶或它们的任何组合,并且可以用作得自囊泡的肾细胞癌特异性生物标志物。
可在囊泡中进行评估的肾细胞癌的生物标志物突变包括但不限于VHL的突变;或者肾细胞癌特异性突变的任何组合。
可在囊泡中进行评估的蛋白质、配体或肽可以包括但不限于IF1α、VEGF、PDGFRA或它们的任何组合。
本发明还提供了分离的囊泡,其包含一种或多种RCC特异性生物标志物,例如ALPHA-TFEB、NONO-TFE3、PRCC-TFE3、SFPQ-TFE3、CLTC-TFE3或MALAT1-TFEB;或者图51和图1中对于RCC所列的那些生物标志物。此外,还提供了包含分离的囊泡的组合物。因此,在一些实施方案中,所述的组合物包含囊泡群体,该群体包含一种或多种RCC特异性生物标志物,例如ALPHA-TFEB、NONO-TFE3、PRCC-TFE3、SFPQ-TFE3、CLTC-TFE3或MALAT1-TFEB;或者图51和图1中对于RCC所列的生物标志物。所述的组合物可以包含明显富集的囊泡群体,其中所述的囊泡群体对于RCC特异性囊泡或者包含一种或多种RCC特异性生物标志物(例如ALPHA-TFEB、NONO-TFE3、PRCC-TFE3、SFPQ-TFE3、CLTC-TFE3或MALAT1-TFEB或者图51和图1中对于RCC所列的生物标志物)的囊泡为基本上均质的。
为表征RCC,还可以通过本文所公开的一种或多种系统来检测一种或多种RCC特异性生物标志物(例如ALPHA-TFEB、NONO-TFE3、PRCC-TFE3、SFPQ-TFE3、CLTC-TFE3或MALAT1-TFEB;或者图51和图1中对于RCC所列的生物标志物)。例如,检测系统可以包括一种或多种探针以检测生物样品中一种或多种囊泡的一种或多种RCC特异性生物标志物(例如ALPHA-TFEB、NONO-TFE3、PRCC-TFE3、SFPQ-TFE3、CLTC-TFE3或MALAT1-TFEB;或者图51和图1中对于RCC所列的生物标志物)。
肝硬化
来自囊泡的肝硬化特异性生物标志物可以包括一种或多种(例如,2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种或更多种)过表达的miR、表达不足的miR、mRNA、基因突变、蛋白质、配体、肽、snoRNA或者它们的任何组合,例如图52中所列的,并且可以用于建立肝硬化特异性生物印记。可以分析的一种或多种mRNA包括但不限于NLT,其可以用作来自囊泡的肝硬化非特异性生物标志物。
可在囊泡中进行评估的蛋白质、配体或肽可以包括但不限于NLT、HBsAG、AST、YKL-40、透明质酸、TIMP-1、α2巨球蛋白、a-1-抗胰蛋白酶PlZ等位基因、结合珠蛋白或酸性磷酸酶ACP AC或它们的任何组合。
本发明还提供了分离的囊泡,其包含一种或多种肝硬化特异性生物标志物,例如图52和图1中对于肝硬化所列的生物标志物。此外,还提供了包含分离的囊泡的组合物。因此,在一些实施方案中,所述的组合物包含囊泡群体,该群体包含一种或多种肝硬化特异性生物标志物,例如图52和图1中对于肝硬化所列的生物标志物。所述的组合物可以包含明显富集的囊泡群体,其中所述的囊泡群体对于肝硬化特异性囊泡或者包含一种或多种肝硬化特异性生物标志物,例如图52和图1中对于肝硬化所列的生物标志物的囊泡为基本上均质的。
为表征肝硬化,还可以通过本文所公开的一种或多种系统来检测一种或多种肝硬化特异性生物标志物(例如图52和图1中对于肝硬化所列的生物标志物)。例如,检测系统可以包括一种或多种探针以检测生物样品中一种或多种囊泡的一种或多种肝硬化特异性生物标志物(例如图52和图1中对于肝硬化所列的生物标志物)。
食管癌
来自囊泡的食管癌特异性生物标志物可以包括一种或多种(例如,2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种或更多种)过表达的miR、表达不足的miR、mRNA、基因突变、蛋白质、配体、肽、snoRNA或者它们的任何组合,例如图53中所列的,并且可以用于建立食管癌特异性生物印记。例如,所述的生物印记可以包括一种或多种过表达的miR,例如但不限于miR-192、miR-194、miR-21、miR-200c、miR-93、miR-342、miR-152、miR-93、miR-25、miR-424或miR-151或它们的任何组合。所述的生物印记还可以包括一种或多种表达不足的miR,例如但不限于miR-27b、miR-205、miR-203、miR-342、let-7c、miR-125b、miR-100、miR-152、miR-192、miR-194、miR-27b、miR-205、miR-203、miR-200c、miR-99a、miR-29c、miR-140、miR-103或miR-107或它们的任何组合。可以分析的一种或多种mRNA包括但不限于MTHFR,并且可以用作来自囊泡的食管癌的特异性生物标志物。
本发明还提供了分离的囊泡,其包含一种或多种食管癌特异性生物标志物,例如图53和图1中对于食管癌所列的生物标志物。此外,还提供了包含分离的囊泡的组合物。因此,在一些实施方案中,所述的组合物包含囊泡群体,该群体包含一种或多种食管癌特异性生物标志物,例如图53和图1中对于食管癌所列的生物标志物。所述的组合物可以包含明显富集的囊泡群体,其中所述的囊泡群体对于食管癌特异性囊泡或者包含一种或多种食管癌特异性生物标志物,例如图53和图1中对于食管癌所列的生物标志物的囊泡为基本上均质的。
为表征食管癌,还可以通过本文所公开的一种或多种系统来检测一种或多种食管癌特异性生物标志物(例如图53和图1中对于食管癌所列的生物标志物)。例如,检测系统可以包括一种或多种探针以检测生物样品中一种或多种囊泡的一种或多种食管癌特异性生物标志物(例如图53和图1中对于食管癌所列的生物标志物)。
胃癌
来自囊泡的胃癌特异性生物标志物可以包括一种或多种(例如,2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种或更多种)过表达的miR、表达不足的miR、mRNA、基因突变、蛋白质、配体、肽、snoRNA或者它们的任何组合,例如图54中所列的,并且可以用于建立胃癌特异性生物印记。例如,所述的生物印记可以包括一种或多种过表达的miR,例如但不限于miR-106a、miR-21、miR-191、miR-223、miR-24-1、miR-24-2、miR-107、miR-92-2、miR-214、miR-25或miR-221或它们的任何组合。所述的生物印记还可以包括一种或多种表达不足的miR,例如但不限于let-7a。
可以分析的一种或多种mRNA包括但不限于RRM2、EphA4或存活素或它们的任何组合,并且可以用作来自囊泡的胃癌特异性生物标志物。可在囊泡中进行评估的胃癌的生物标志物突变包括但不限于APC的突变;或者胃癌特异性的突变的任何组合。可在囊泡中进行评估的蛋白质、配体或肽可以包括但不限于EphA4。
本发明还提供了分离的囊泡,其包含一种或多种胃癌特异性生物标志物,例如图54中所列的。此外,还提供了包含分离的囊泡的组合物。因此,在一些实施方案中,所述的组合物包含囊泡群体,该群体包含一种或多种胃癌特异性生物标志物,例如图54中所列的。所述的组合物可以包含明显富集的囊泡群体,其中所述的囊泡群体对于胃癌特异性囊泡或者包含一种或多种胃癌特异性生物标志物的囊泡,例如图54中所列的生物标志物,为基本上均质的。
为表征胃癌,还可以通过本文所公开的一种或多种系统来检测一种或多种胃癌特异性生物标志物(例如图54中所列的)。例如,检测系统可以包括一种或多种探针以检测生物样品中一种或多种囊泡的一种或多种胃癌特异性生物标志物(例如图54中所列的生物标志物)。
孤独症
来自囊泡的孤独症特异性生物标志物可以包括一种或多种(例如,2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种或更多种)过表达的miR、表达不足的miR、mRNA、基因突变、蛋白质、配体、肽、snoRNA或者它们的任何组合,例如图55中所列的,并且可以用于建立孤独症特异性生物印记。例如,所述的生物印记可以包括一种或多种过表达的miR,例如但不限于miR-484、miR-21、miR-212、miR-23a、miR-598、miR-95、miR-129、miR-431、miR-7、miR-15a、miR-27a、miR-15b、miR-148b、miR-132或miR-128或它们的任何组合。所述的生物印记还可以包括一种或多种表达不足的miR,例如但不限于miR-93、miR-106a、miR-539、miR-652、miR-550、miR-432、miR-193b、miR-181d、miR-146b、miR-140、miR-381、miR-320a或miR-106b或它们的任何组合。可在囊泡中进行评估的蛋白质、配体或肽可以包括但不限于GM1、GDla、GDlb或GTlb或它们的任何组合。
本发明还提供了分离的囊泡,其包含一种或多种孤独症特异性生物标志物,例如图55和图1中对于孤独症所列的生物标志物。此外,还提供了包含分离的囊泡的组合物。因此,在一些实施方案中,所述的组合物包含囊泡群体,该群体包含一种或多种孤独症特异性生物标志物,例如图55和图1中对于孤独症所列的生物标志物。所述的组合物可以包含明显富集的囊泡群体,其中所述的囊泡群体对于孤独症特异性囊泡或者包含一种或多种孤独症特异性生物标志物,例如图55和图1中对于孤独症所列的生物标志物的囊泡为基本上均质的。
为表征孤独症,还可以通过本文所公开的一种或多种系统来检测一种或多种孤独症特异性生物标志物(例如图55和图1中对于孤独症所列的生物标志物)。例如,检测系统可以包括一种或多种探针以检测生物样品中一种或多种囊泡的一种或多种孤独症特异性生物标志物(例如图55和图1中对于孤独症所列的生物标志物)。
器官排斥反应
来自囊泡的器官排斥反应的特异性生物标志物可以包括一种或多种(例如,2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种或更多种)过表达的miR、表达不足的miR、mRNA、基因突变、蛋白质、配体、肽、snoRNA或者它们的任何组合,例如图56中所列的,并且可以用于建立器官排斥反应特异性生物印记。例如,所述的生物印记可以包括一种或多种过表达的miR,例如但不限于miR-658、miR-125a、miR-320、miR-381、miR-628、miR-602、miR-629或miR-125a或它们的任何组合。此外,所述的生物印记还可以包括一种或多种表达不足的miR,例如但不限于miR-324-3p、miR-611、miR-654、miR-330_MM1、miR-524、miR-17-3p_MM1、miR-483、miR-663、miR-516-5p、miR-326、miR-197_MM2或miR-346或它们的任何组合。可在囊泡中进行评估的蛋白质、配体或肽可以包括但不限于基质金属蛋白酶-9、蛋白酶3或HNP或它们的任何组合。所述生物标志物可以是基质金属蛋白酶的成员。
本发明还提供了分离的囊泡,其包含一种或多种器官排斥反应特异性生物标志物,例如图56中所列的。此外,还提供了包含分离的囊泡的组合物。因此,在一些实施方案中,所述的组合物包含囊泡群体,该群体包含一种或多种器官排斥反应特异性生物标志物,例如图56中所列的。所述的组合物可以包含明显富集的囊泡群体,其中所述的囊泡群体对于器官排斥反应特异性囊泡或者包含一种或多种器官排斥反应特异性生物标志物的囊泡(例如图56中所列的)为基本上均质的。
为表征器官排斥反应,还可以通过本文所公开的一种或多种系统来检测一种或多种器官排斥反应特异性生物标志物(例如图56中所列的)。例如,检测系统可以包括一种或多种探针以检测生物样品中一种或多种囊泡的一种或多种器官排斥反应特异性生物标志物(例如图56中所列的)。
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌
来自囊泡的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌特异性生物标志物可以包括一种或多种(例如,2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种或更多种)过表达的miR、表达不足的miR、mRNA、基因突变、蛋白质、配体、肽、snoRNA或者它们的任何组合,例如图57中所列的,并且可以用于建立耐甲氧西林金黄色葡萄球菌特异性生物印记。
可以分析的一种或多种mRNA包括但不限于TSST-1,其可以用作来自囊泡的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的特异性生物标志物。可在囊泡中进行评估的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的生物标志物突变包括但不限于mecA、蛋白质A SNP的突变;或者耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的特异性突变的任何组合。可在囊泡中进行评估的蛋白质、配体或肽可以包括但不限于ETA、ETB、TSST-1或杀白细胞素或它们的任何组合。
本发明还提供了分离的囊泡,其包含一种或多种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌特异性生物标志物,例如图57中所列的。此外,还提供了包含分离的囊泡的组合物。因此,在一些实施方案中,所述的组合物包含囊泡群体,该群体包含一种或多种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌特异性生物标志物,例如图57中所列的。所述的组合物可以包含明显富集的囊泡群体,其中所述的囊泡群体对于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌特异性囊泡或者包含一种或多种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌特异性生物标志物(例如图57中所列的)的囊泡为基本上均质的。
为表征耐甲氧西林金黄色葡萄球菌,还可以通过本文所公开的一种或多种系统来检测一种或多种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌特异性生物标志物(例如图57中所列的)。例如,检测系统可以包括一种或多种探针以检测生物样品中一种或多种囊泡的一种或多种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌特异性生物标志物(例如图57中所列的)。
易损斑块
来自囊泡的易损斑块特异性生物标志物可以包括一种或多种(例如,2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种或更多种)过表达的miR、表达不足的miR、mRNA、基因突变、蛋白质、配体、肽、snoRNA或者它们的任何组合,例如图58中所列的,并且可以用于建立易损斑块特异性生物印记。可在囊泡中进行评估的蛋白质、配体或肽可以包括但不限于IL-6、MMP-9、PAPP-A、D-二聚体、纤维蛋白原、Lp-PLA2、SCD40L、Il-18、oxLDL、GPx-1、MCP-1、PIGF或CRP或它们的任何组合。
本发明提供了分离的囊泡,其包含一种或多种易损斑块特异性生物标志物,例如图58和图1中对于易损斑块所列的生物标志物。还提供了包含分离的囊泡的组合物。因此,在一些实施方案中,所述的组合物包含囊泡群体,该群体包含一种或多种易损斑块特异性生物标志物,例如图58和图1中对于易损斑块所列的生物标志物。所述的组合物可以包含明显富集的囊泡群体,其中所述的囊泡群体对于易损斑块特异性囊泡或者包含一种或多种易损斑块特异性生物标志物(例如图58和图1中对于易损斑块所列的生物标志物)的囊泡为基本上均质的。
为表征易损斑块,还可以通过本文所公开的一种或多种系统来检测一种或多种易损斑块特异性生物标志物(例如图58和图1中对于易损斑块所列的生物标志物)。例如,检测系统可以包括一种或多种探针以检测生物样品中一种或多种囊泡的一种或多种易损斑块特异性生物标志物(例如图58和图1中对于易损斑块所列的生物标志物)。
自身免疫疾病
本发明还提供了分离的囊泡,其包含一种或多种自身免疫疾病特异性生物标志物,例如图1中对于自身免疫疾病所列的生物标志物。还提供了包含分离的囊泡的组合物。因此,在一些实施方案中,所述的组合物包含囊泡群体,该群体包含一种或多种自身免疫疾病特异性生物标志物,例如图1中对于自身免疫疾病所列的生物标志物。所述的组合物可以包含明显富集的囊泡群体,其中所述的囊泡群体对于自身免疫疾病特异性囊泡或者包含一种或多种自身免疫疾病特异性生物标志物(例如图1中对于自身免疫疾病所列的生物标志物)的囊泡为基本上均质的。
为表征自身免疫疾病,还可以通过本文所公开的一种或多种系统来检测一种或多种自身免疫疾病特异性生物标志物(例如图1中对于自身免疫疾病所列的生物标志物)。例如,检测系统可以包括一种或多种探针以检测生物样品中一种或多种囊泡的一种或多种自身免疫疾病特异性生物标志物(例如图1中对于自身免疫疾病所列的生物标志物)。
结核病(TB)
本发明还提供了分离的囊泡,其包含一种或多种TB疾病特异性生物标志物,例如图1中对于TB疾病所列的。还提供了包含分离的囊泡的组合物。因此,在一些实施方案中,所述的组合物包含囊泡群体,该群体包含一种或多种TB疾病特异性生物标志物,例如图1中对于TB疾病所列的生物标志物。所述的组合物可以包含明显富集的囊泡群体,其中所述的囊泡群体对于TB疾病特异性囊泡或者包含一种或多种TB疾病特异性生物标志物(例如图1中对于TB疾病所列的生物标志物)的囊泡为实质上均质的。
为表征TB疾病,还可以通过本文所公开的一种或多种系统来检测一种或多种TB疾病特异性生物标志物(例如图1中对于TB疾病所列的生物标志物)。例如,检测系统可以包括一种或多种探针以检测生物样品中一种或多种囊泡的一种或多种TB疾病特异性生物标志物(例如图1中对于TB疾病所列的生物标志物)。
HIV
本发明还提供了分离的囊泡,其包含一种或多种HIV疾病特异性生物标志物,例如图1中对于HIV疾病所列的生物标志物。还提供了包含分离的囊泡的组合物。因此,在一些实施方案中,所述的组合物包含囊泡群体,该群体包含一种或多种HIV疾病特异性生物标志物,例如图1中对于HIV疾病所列的生物标志物。所述的组合物可以包含明显富集的囊泡群体,其中所述的囊泡群体对于HIV疾病特异性囊泡或者包含一种或多种HIV疾病特异性生物标志物(例如图1中对于HIV疾病所列的生物标志物)的囊泡为实质上均质的。
为表征HIV疾病,还可以通过本文所公开的一种或多种系统来检测一种或多种HIV疾病特异性生物标志物(例如图1中对于HIV疾病所列的生物标志物)。例如,检测系统可以包括一种或多种探针以检测生物样品中一种或多种囊泡的一种或多种HIV疾病特异性生物标志物(例如图1中对于HIV疾病所列的生物标志物)。
所述的一种或多种生物标志物还可以为miRNA,例如上调或过表达的miRNA。所述的上调的miRNA可以为miR-29a、miR-29b、miR-149、miR-378或miR-324-5p。一种或多种生物标志物还可以用于表征HIV-1潜伏,例如通过评估一种或多种miRNA。所述的miRNA可以为miR-28、miR-125b、miR-150、miR-223和miR-382,并且是上调的。
哮喘
本发明还提供了分离的囊泡,其包含一种或多种哮喘疾病特异性生物标志物,例如图1中对于哮喘疾病所列的生物标志物。还提供了包含分离的囊泡的组合物。因此,在一些实施方案中,所述的组合物包含囊泡群体,该群体包含一种或多种哮喘疾病特异性生物标志物,例如图1中对于哮喘疾病所列的生物标志物。所述的组合物可以包含明显富集的囊泡群体,其中所述的囊泡群体对于哮喘疾病特异性囊泡或者包含一种或多种哮喘疾病特异性生物标志物(例如图1中对于哮喘疾病所列的生物标志物)的囊泡为基本上均质的。
为表征哮喘疾病,还可以通过本文所公开的一种或多种系统来检测一种或多种哮喘疾病特异性生物标志物(例如图1中对于哮喘疾病所列的生物标志物)。例如,检测系统可以包括一种或多种探针以检测生物样品中一种或多种囊泡的一种或多种哮喘疾病特异性生物标志物(例如图1中对于哮喘疾病所列的生物标志物)。
狼疮
本发明还提供了分离的囊泡,其包含一种或多种狼疮疾病特异性生物标志物,例如图1中对于狼疮疾病所列的生物标志物。还提供了包含分离的囊泡的组合物。因此,在一些实施方案中,所述的组合物包含囊泡群体,该群体包含一种或多种狼疮疾病特异性生物标志物,例如图1中对于狼疮疾病所列的生物标志物。所述的组合物可以包含明显富集的囊泡群体,其中所述的囊泡群体对于狼疮疾病特异性囊泡或者包含一种或多种狼疮疾病特异性生物标志物(例如图1中对于狼疮疾病所列的生物标志物)的囊泡为实质上均质的。
为表征狼疮疾病,还可以通过本文所公开的一种或多种系统来检测一种或多种狼疮疾病特异性生物标志物(例如图1中对于狼疮疾病所列的生物标志物)。例如,检测系统可以包括一种或多种探针以检测生物样品中一种或多种囊泡的一种或多种狼疮疾病特异性生物标志物(例如图1中对于狼疮疾病所列的生物标志物)。
流行性感冒
本发明还提供了分离的囊泡,其包含一种或多种流行性感冒疾病特异性生物标志物,例如图1中对于流行性感冒疾病所列的生物标志物。还提供了包含分离的囊泡的组合物。因此,在一些实施方案中,所述的组合物包含囊泡群体,该群体包含一种或多种流行性感冒疾病特异性生物标志物,例如图1中对于流行性感冒疾病所列的生物标志物。所述的组合物可以包含明显富集的囊泡群体,其中所述的囊泡群体对于流行性感冒疾病特异性囊泡或者包含一种或多种流行性感冒疾病特异性生物标志物(例如图1中对于流行性感冒疾病所列的生物标志物)的囊泡为基本上均质的。
为表征流行性感冒疾病,还可以通过本文所公开的一种或多种系统来检测一种或多种流行性感冒疾病特异性生物标志物(例如图1中对于流行性感冒疾病所列的生物标志物)。例如,检测系统可以包括一种或多种探针以检测生物样品中一种或多种囊泡的一种或多种流行性感冒疾病特异性生物标志物(例如图1中对于流行性感冒疾病所列的生物标志物)。
甲状腺癌
本发明还提供了分离的囊泡,其包含一种或多种甲状腺癌特异性生物标志物,例如乳头状甲状腺癌特征性的AKAP9-BRAF、CCDC6-RET、ERC1-RETM、GOLGA5-RET、HOOK3-RET、HRH4-RET、KTN1-RET、NCOA4-RET、PCM1-RET、PRKARA1A-RET、RFG-RET、RFG9-RET、Ria-RET、TGF-NTRK1、TPM3-NTRK1、TPM3-TPR、TPR-MET、TPR-NTRK1、TRIM24-RET、TRIM27-RET或TRIM33-RET;或者滤泡状甲状腺癌特征性的PAX8-PPARy。还提供了包含分离的囊泡的组合物。因此,在一些实施方案中,所述的组合物包含囊泡群体,该群体包含一种或多种甲状腺癌特异性生物标志物,例如图1中对于甲状腺癌所列的生物标志物。所述的组合物可以包括明显富集的囊泡群体,其中所述的囊泡群体对于甲状腺癌特异性囊泡或者包含一种或多种甲状腺癌特异性生物标志物(例如图1中对于甲状腺癌所列的生物标志物)的囊泡为基本上均质的。
为表征甲状腺癌,还可以通过本文所公开的一种或多种系统来检测一种或多种甲状腺癌特异性生物标志物(例如图1中对于甲状腺癌所列的生物标志物)。例如,检测系统可以包括一种或多种探针以检测生物样品中一种或多种囊泡的一种或多种甲状腺癌特异性生物标志物(例如图1中对于甲状腺癌所列的生物标志物)。
基因融合
囊泡的所评估的一种或多种生物标志物可以为基因融合体,例如图59中所列出的一种或多种。融合基因为通过将两个之前独立的基因并列而建立的杂合基因。这可以通过染色体易位或倒位、删除或通过反式剪接来形成。所得的融合基因可以导致基因的异常时间和空间表达,例如引起细胞生长因子、血管生成因子、肿瘤启动剂或有助于细胞的肿瘤转化和肿瘤生成的其它因子的异常表达。所述的融合基因可以由于以下的并置而致癌的:1)邻接于细胞生长因子、肿瘤启动剂或促进癌形成的其它基因的编码区域的一个基因的强启动子区域,从而导致提高的基因表达;或者2)由于两个不同基因的编码区域的融合,导致嵌合的基因并由此得到具有异常活性的嵌合蛋白质。
融合基因的实例为BCR-ABL,其为~90%的慢性骨髓性白血病(CML)和急性白血病亚组中的特征性分子异常(Kurzrock等,Annals of Internal Medicine 2003;138(10):819-830)。BCR-ABL是由于染色体9和22之间的易位所导致的。所述的易位将BCR基因的5’区与ABL1的3’区域合在一起,从而得到嵌合的BCR-ABL1基因,其编码具有组成型活性的酪氨酸激酶活性的蛋白质(Mittleman等,Nature Reviews Cancer 2007;7(4):233-245)。异常的酪氨酸激酶活性导致了失调的细胞信号转导、细胞生长和细胞存活、细胞凋亡抗性和细胞因子非依赖性,所有这些都造成白血病的病理生理(Kurzrock等,Annals of InternalMedicine 2003;138(10):819-830)。
另一个融合基因为IGH-MYC,其为~80%的伯基特氏淋巴瘤的标志性特征(Ferry等Oncologist 2006;11(4):375-83)。造成该结果的原因事件是染色体8与14之间的易位,从而使c-Myc致癌基因与免疫球蛋白重链基因的强启动子相邻,导致c-myc过表达(Mittleman等,Nature Reviews Cancer2007;7(4):233-245)。c-myc重排是淋巴瘤生成的关键事件,这是由于其导致持久的增殖状态。其对于通过细胞循环、细胞分化、细胞凋亡和细胞粘附的进程具有广泛的作用(Ferry等Oncologist 2006;11(4):375-83)。
多种频发的融合基因已经收录于Mittleman数据库(cgap.nci.nih.gov/Chromosomes/Mitelman)中,并且可以在囊泡中进行评估,而且可以用于表征表型。所述的基因融合体可以用于表征血液恶性肿瘤或上皮肿瘤。例如可以检测TMPRSS2-ERG、TMPRSS2-ETV和SLC45A3-ELK4融合并用于表征前列腺癌;并且可以检测ETV6-NTRK3和ODZ4-NRG1用于表征乳腺癌。
此外,评估融合基因的存在或不存在或者表达水平可以用于诊断表型(例如癌症)以及监测治疗反应以选择治疗。例如,BCR-ABL融合基因的存在不仅为用于诊断CML的特征,而且为用于治疗CML的Novartis药物甲磺酸伊马替尼(Gleevec)(其为受体酪氨酸激酶抑制剂)的靶标。伊马替尼的治疗导致分子应答(BCR-ABL+血细胞的消失),以及BCR-ABL+CML患者中改善的无进展存活(Kantarjian等,Clinical Cancer Research 2007;13(4):1089-1097)。
针对基因融合体的存在、不存在或表达水平来评估囊泡可以是通过针对基因融合体的存在、不存在或表达水平评估异质的囊泡群体。或者,所评估的囊泡可以源自特定的细胞类型,例如细胞源特异性囊泡,如上文所述。可评估用以表征表型的融合体的应用的实例包括以下:
乳腺癌
为了表征乳腺癌,可以针对一种或多种乳腺癌特异性的融合体(包括但不限于ETV6-NTRK3)来评估囊泡。所述的囊泡可以源自乳腺癌细胞。
肺癌
为了表征肺癌,可以针对一种或多种肺癌特异性的融合体(包括但不限于RLF-MYCL1、TGF-ALK或CD74-ROS1)来评估囊泡。所述的囊泡可以源自肺癌细胞。
前列腺癌
为了表征前列腺癌,可以针对一种或多种前列腺癌特异性的融合体(包括但不限于ACSL3-ETV1、C15ORF21-ETV1、FLJ35294-ETV1、HERV-ETV1、TMPRSS2-ERG、TMPRSS2-ETV1/4/5、TMPRSS2-ETV4/5、SLC5A3-ERG、SLC5A3-ETV1、SLC5A3-ETV5或KLK2-ETV4)来评估囊泡。所述的囊泡可以源自前列腺癌细胞。
脑癌
为了表征脑癌,可以针对一种或多种脑癌特异性的融合体(包括但不限于GOPC-ROS1)来评估囊泡。所述的囊泡可以源自脑癌细胞。
头颈癌
为了表征头颈癌,可以针对一种或多种头颈癌特异性的融合体(包括但不限于CHCHD7-PLAG1、CTNNB1-PLAG1、FHIT-HMGA2、HMGA2-NFIB、LIFR-PLAG1或TCEA1-PLAG1)来评估囊泡。所述的囊泡可以源自头和/或颈部癌细胞。
肾细胞癌(RCC)
为了表征RCC,可以针对一种或多种RCC特异性的融合体(包括但不限于ALPHA-TFEB、NONO-TFE3、PRCC-TFE3、SFPQ-TFE3、CLTC-TFE3或MALAT1-TFEB)来评估囊泡。所述的囊泡可以源自RCC细胞。
甲状腺癌
为了表征甲状腺癌,可以针对一种或多种甲状腺癌特异性的融合体(包括但不限于:乳头状癌甲状腺特征性的AKAP9-BRAF、CCDC6-RET、ERC1-RETM、GOLGA5-RET、HOOK3-RET、HRH4-RET、KTN1-RET、NCOA4-RET、PCM1-RET、PRKARA1A-RET、RFG-RET、RFG9-RET、Ria-RET、TGF-NTRK1、TPM3-NTRK1、TPM3-TPR、TPR-MET、TPR-NTRK1、TRIM24-RET、TRIM27-RET或TRIM33-RET;或者滤泡性甲状腺癌特征性的PAX8-PPARy)来评估囊泡。所述的囊泡可以源自甲状腺癌细胞。
血癌
为了表征血癌,可以针对一种或多种血癌特异性的融合性(包括但不限于:急性淋巴性白血病(ALL)特征性的TTL-ETV6、CDK6-MLL、CDK6-TLX3、ETV6-FLT3、ETV6-RUNX1、ETV6-TTL、MLL-AFF1、MLL-AFF3、MLL-AFF4、MLL-GAS7、TCBA1-ETV6、TCF3-PBX1或TCF3-TFPT;T细胞急性淋巴细胞性白血病(T-ALL)特征性的BCL11B-TLX3、IL2-TNFRFS17、NUP214-ABL1、NUP98-CCDC28A、TAL1-STIL或ETV6-ABL2;间变性大细胞瘤(ALCL)特征性的ATIC-ALK、KIAA1618-ALK、MSN-ALK、MYH9-ALK、NPM1-ALK、TGF-ALK或TPM3-ALK;慢性骨髓性白血病(CML)特征性的BCR-ABL1、BCR-JAK2、ETV6-EVI1、ETV6-MN1或ETV6-TCBA1;AML特征性的CBFB-MYH11、CHIC2-ETV6、ETV6-ABL1、ETV6-ABL2、ETV6-ARNT、ETV6-CDX2、ETV6-HLXB9、ETV6-PER1、MEF2D-DAZAP1、AML-AFF1、MLL-ARHGAP26、MLL-ARHGEF12、MLL-CASC5、MLL-CBL、MLL-CREBBP、MLL-DAB21P、MLL-ELL、MLL-EP300、MLL-EPS15、MLL-FNBP1、MLL-FOXO3A、MLL-GMPS、MLL-GPHN、MLL-MLLT1、MLL-MLLT11、MLL-MLLT3、MLL-MLLT6、MLL-MYO1F、MLL-PICALM、MLL-SEPT2、MLL-SEPT6、MLL-SORBS2、MYST3-SORBS2、MYST-CREBBP、NPM1-MLF1、NUP98-HOXA13、PRDM16-EVI1、RABEP1-PDGFRB、RUNX1-EVI1、RUNX1-MDS1、RUNX1-RPL22、RUNX1-RUNX1T1、RUNX1-SH3D19、RUNX1-USP42、RUNX1-YTHDF2、RUNX1-ZNF687或TAF15-ZNF-384;慢性淋巴细胞性白血病(CLL)特征性的CCND1-FSTL3;B细胞慢性淋巴细胞性白血病(B-CLL)特征性的BCL3-MYC、MYC-BTG1、BCL7A-MYC、BRWD3-ARHGAP20或BTG1-MYC;弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)特征性的CITTA-BCL6、CLTC-ALK、IL21R-BCL6、PIM1-BCL6、TFCR-BCL6、IKZF1-BCL6或SEC31A-ALK;嗜酸性粒细胞增多/慢性嗜酸性粒细胞增多特征性的FLIP1-PDGFRA、FLT3-ETV6、KIAA1509-PDGFRA、PDE4DIP-PDGFRB、NIN-PDGFRB、TP53BP1-PDGFRB或TPM3-PDGFRB;Burkitt淋巴瘤特征性的IGH-MYC或LCP1-BCL6)来评估囊泡。所述的囊泡可以源自血癌细胞。
本发明还提供了分离的囊泡,其包含一种或多种本文公开的基因融合体,例如图59中所列的。还提供了包含分离的囊泡的组合物。因此,在一些实施方案中,所述的组合物包含囊泡群体,该群体包含一种或多种基因融合体,例如图59中所列的。所述的组合物可以包含明显富集的囊泡群体,其中所述的囊泡群体对于包含一种或多种基因融合体(例如图59中所列的)的囊泡为基本上均质的。
本文还提供了用于检测一种或多种基因融合体的检测系统,例如图59中所列的基因融合体。例如,检测系统可以包括一种或多种探针以检测图59中所列的一种或多种基因融合体。一种或多种基因融合体的检测可以用于表征癌症。
基因相关性MiRNA生物标志物
所评估的一种或多种生物标志物还可以包括一种或多种基因,其选自PFKFB3、RHAMM(HMMR)、cDNA FLJ42103、ASPM、CENPF、NCAPG、雄性激素受体、EGFR、HSP90、SPARC、DNMT3B、GART、MGMT、SSTR3和TOP2B。与一种或多种所述基因相互作用的微RNA也可以为生物标志物(例如参见图60)。此外,所述的一种或多种生物标志物可以用于表征前列腺癌。
本发明还提供了分离的囊泡,其包含一种或多种由PFKFB3、RHAMM(HMMR)、cDNAFLJ42103、ASPM、CENPF、NCAPG、雄性激素受体、EGFR、HSP90、SPARC、DNMT3B、GART、MGMT、SSTR3和TOP2B组成的生物标志物或者与该一种或多种基因相互作用的微RNA(例如参见图60)。本发明进一步提供了包含所述分离的囊泡的组合物。因此,在一些实施方案中,所述的组合物包含囊泡群体,该群体包含一种或多种生物标志物,所述生物标志物由PFKFB3、RHAMM(HMMR)、cDNA FLJ42103、ASPM、CENPF、NCAPG、雄性激素受体、EGFR、HSP90、SPARC、DNMT3B、GART、MGMT、SSTR3和TOP2B组成;或者与该一种或多种基因相互作用的微RNA(例如参见图60)。所述的组合物可以包含明显富集的囊泡群体,其中所述的囊泡群体对于包含一种或多种由PFKFB3、RHAMM(HMMR)、cDNA FLJ42103、ASPM、CENPF、NCAPG、雄性激素受体、EGFR、HSP90、SPARC、DNMT3B、GART、MGMT、SSTR3和TOP2B组成的生物标志物或者与该一种或多种基因相互作用的微RNA(例如参见图60)的囊泡为基本上均质的。
还可以通过本文公开的一种或多种系统来检测一种或多种前列腺癌特异性生物标志物(例如图60中所列的)。例如,检测系统可以包含一种或多种探针以检测生物样品中一种或多种囊泡的一种或多种前列腺癌特异性生物标志物(例如图60中所列的)。
与PFKFB3相互作用的miRNA可以为miR-513a-3p、miR-128、miR-488、miR-539、miR-658、miR-524-5p、miR-1258、miR-150、miR-216b、miR-377、miR-135a、miR-26a、miR-548a-5p、miR-26b、miR-520d-5p、miR-224、miR-1297、miR-1197、miR-182、miR-452、miR-509-3-5p、miR-548m、miR-625、miR-509-5p、miR-1266、miR-135b、miR-190b、miR-496、miR-616、miR-621、miR-650、miR-105、miR-19a、miR-346、miR-620、miR-637、miR-651、miR-1283、miR-590-3p、miR-942、miR-1185、miR-577、miR-602、miR-1305、miR-220c、miR-1270、miR-1282、miR-432、miR-491-5p、miR-548n、miR-765、miR-768-3p或miR-924,并且可以用作生物标志物。
本发明还提供了分离的囊泡,其包含与PFKFB3相互作用的一种或多种miRNA。本文还提供了包含所述分离的囊泡的组合物。因此,在一些实施方案中,所述的组合物包含囊泡群体,该群体包含一种或多种由与PFKFB3相互作用的miRNA组成的生物标志物。所述的组合物可以包含明显富集的囊泡群体,其中所述的囊泡群体对于包含一种或多种与PFKFB3相互作用的miRNA的囊泡为基本上均质的。此外,还可以通过本文公开的一种或多种系统来检测与PFKFB3相互作用的一种或多种miRNA。例如,检测系统可以包括一种或多种探针以检测生物样品中一种或多种囊泡的与PFKFB3相互作用的一种或多种miRNA。
与RHAMM相互作用的miRNA可以为miR-936、miR-656、miR-105、miR-361-5p、miR-194、miR-374a、miR-590-3p、miR-186、miR-769-5p、miR-892a、miR-380、miR-875-3p、miR-208a、miR-208b、miR-586、miR-125a-3p、miR-630、miR-374b、miR-411、miR-629、miR-1286、miR-1185、miR-16、miR-200b、miR-671-5p、miR-95、miR-421、miR-496、miR-633、miR-1243、miR-127-5p、miR-143、miR-15b、miR-200c、miR-24或miR-34c-3p。
本发明还提供了分离的囊泡,其包含一种或多种与RHAMM相互作用的miRNA。本发明进一步提供了包含所述分离的囊泡的组合物。因此,在一些实施方案中,所述的组合物包含囊泡群体,该群体包含一种或多种由与RHAMM相互作用的miRNA组成的生物标志物。所述的组合物可以包含明显富集的囊泡群体,其中所述的囊泡群体对于包含一种或多种与RHAMM相互作用的miRNA的囊泡为基本上均质的。此外,还可以通过本文公开的一种或多种系统来检测与RHAMM相互作用的一种或多种miRNA。例如,检测系统可以包括一种或多种探针以检测生物样品中一种或多种囊泡的与RHAMM相互作用的一种或多种miRNA。
与CENPF相互作用的miRNA可以为miR-30c、miR-30b、miR-190、miR-508-3p、miR-384、miR-512-5p、miR-548p、miR-297、miR-520f、miR-376a、miR-1184、miR-577、miR-708、miR-205、miR-376b、miR-520g、miR-520h、miR-519d、miR-596、miR-768-3p、miR-340、miR-620、miR-539、miR-567、miR-671-5p、miR-1183、miR-129-3p、miR-636、miR-106a、miR-1301、miR-17、miR-20a、miR-570、miR-656、miR-1263、miR-1324、miR-142-5p、miR-28-5p、miR-302b、miR-452、miR-520d-3p、miR-548o、miR-892b、miR-302d、miR-875-3p、miR-106b、miR-1266、miR-1323、miR-20b、miR-221、miR-520e、miR-664、miR-920、miR-922、miR-93、miR-1228、miR-1271、miR-30e、miR-483-3p、miR-509-3-5p、miR-515-3p、miR-519e、miR-520b、miR-520c-3p或miR-582-3p。
本文还提供了分离的囊泡,其包含一种或多种与CENPF相互作用的miRNA。本发明进一步提供了包含所述分离的囊泡的组合物。因此,在一些实施方案中,所述的组合物包含囊泡群体,该群体包含一种或多种由与CENPF相互作用的miRNA组成的生物标志物。所述的组合物可以包含明显富集的囊泡群体,其中所述的囊泡群体对于包含一种或多种与CENPF相互作用的miRNA的囊泡为基本上均质的。此外,还可以通过本文公开的一种或多种系统来检测与CENPF相互作用的一种或多种miRNA。例如,检测系统可以包括一种或多种探针以检测生物样品中一种或多种囊泡的与CENPF相互作用的一种或多种miRNA。
与NCAPG相互作用的miRNA可以为miR-876-5p、miR-1260、miR-1246、miR-548c-3p、miR-1224-3p、miR-619、miR-605、miR-490-5p、miR-186、miR-448、miR-129-5p、miR-188-3p、miR-516b、miR-342-3p、miR-1270、miR-548k、miR-654-3p、miR-1290、miR-656、miR-34b、miR-520g、miR-1231、miR-1289、miR-1229、miR-23a、miR-23b、miR-616或miR-620。
本发明还提供了分离的囊泡,其包含一种或多种与NCAPG相互作用的miRNA。本发明进一步提供了包含所述分离的囊泡的组合物。因此,在一些实施方案中,所述的组合物包含囊泡群体,该群体包含一种或多种由与NCAPG相互作用的miRNA组成的生物标志物。所述的组合物可以包含明显富集的囊泡群体,其中所述的囊泡群体对于包含一种或多种与NCAPG相互作用的miRNA的囊泡为基本上均质的。此外,还可以通过本文公开的一种或多种系统来检测与NCAPG相互作用的一种或多种miRNA。例如,检测系统可以包括一种或多种探针以检测生物样品中一种或多种囊泡的与NCAPG相互作用的一种或多种miRNA。
与雄性激素受体相互作用的miRNA可以为miR-124a、miR-130a、miR-130b、miR-143、miR-149、miR-194、miR-29b、miR-29c、miR-301、miR-30a-5p、miR-30d、miR-30e-5p、miR-337、miR-342、miR-368、miR-488、miR-493-5p、miR-506、miR-512-5p、miR-644、miR-768-5p或miR-801。
与EGFR相互作用的miRNA可以为miR-105、miR-128a、miR-128b、miR-140、miR-141、miR-146a、miR-146b、miR-27a、miR-27b、miR-302a、miR-302d、miR-370、miR-548c、miR-574、miR-587或miR-7。
本发明还提供了分离的囊泡,其包含一种或多种与AR相互作用的miRNA。本发明进一步提供了包含所述分离的囊泡的组合物。因此,在一些实施方案中,所述的组合物包含囊泡群体,该群体包含一种或多种由与AR相互作用的miRNA组成的生物标志物。所述的组合物可以包含明显富集的囊泡群体,其中所述的囊泡群体对于包含一种或多种与AR相互作用的miRNA的囊泡为基本上均质的。此外,还可以通过本文公开的一种或多种系统来检测与AR相互作用的一种或多种miRNA。例如,检测系统可以包括一种或多种探针以检测生物样品中一种或多种囊泡的与AR相互作用的一种或多种miRNA。
与HSP90相互作用的miRNA可以为miR-1、miR-513a-3p、miR-548d-3p、miR-642、miR-206、miR-450b-3p、miR-152、miR-148a、miR-148b、miR-188-3p、miR-23a、miR-23b、miR-578、miR-653、miR-1206、miR-192、miR-215、miR-181b、miR-181d、miR-223、miR-613、miR-769-3p、miR-99a、miR-100、miR-454、miR-548n、miR-640、miR-99b、miR-150、miR-181a、miR-181c、miR-522、miR-624、miR-130a、miR-130b、miR-146、miR-148a、miR-148b、miR-152、miR-181a、miR-181b、miR-181c、miR-204、miR-206、miR-211、miR-212、miR-215、miR-223、miR-23a、miR-23b、miR-301、miR-31、miR-325、miR-363、miR-566、miR-9或miR-99b。
本发明还提供了分离的囊泡,其包含一种或多种与HSP90相互作用的miRNA。本发明进一步提供了包含所述分离的囊泡的组合物。因此,在一些实施方案中,所述的组合物包含囊泡群体,该群体包含一种或多种由与HSP90相互作用的miRNA组成的生物标志物。所述的组合物可以包含明显富集的囊泡群体,其中所述的囊泡群体对于包含一种或多种与HSP90相互作用的miRNA的囊泡为基本上均质的。此外,还可以通过本文公开的一种或多种系统来检测与HSP90相互作用的一种或多种miRNA。例如,检测系统可以包括一种或多种探针以检测生物样品中一种或多种囊泡的与HSP90相互作用的一种或多种miRNA。
与SPARC相互作用的miRNA可以为miR-768-5p、miR-203、miR-196a、miR-569、miR-187、miR-641、miR-1275、miR-432、miR-622、miR-296-3p、miR-646、miR-196b、miR-499-5p、miR-590-5p、miR-495、miR-625、miR-1244、miR-512-5p、miR-1206、miR-1303、miR-186、miR-302d、miR-494、miR-562、miR-573、miR-10a、miR-203、miR-204、miR-211、miR-29、miR-29b、miR-29c、miR-339、miR-433、miR-452、miR-515-5p、miR-517a、miR-517b、miR-517c、miR-592或miR-96。
本发明还提供了分离的囊泡,其包含一种或多种与SPARC相互作用的miRNA。本发明进一步提供了包含所述分离的囊泡的组合物。因此,在一些实施方案中,所述的组合物包含囊泡群体,该群体包含一种或多种由与SPARC相互作用的miRNA组成的生物标志物。所述的组合物可以包含明显富集的囊泡群体,其中所述的囊泡群体对于包含一种或多种与SPARC相互作用的miRNA的囊泡为基本上均质的。此外,还可以通过本文公开的一种或多种系统来检测与SPARC相互作用的一种或多种miRNA。例如,检测系统可以包括一种或多种探针以检测生物样品中一种或多种囊泡的与SPARC相互作用的一种或多种miRNA。
与DNMT3B相互作用的miRNA可以为miR-618、miR-1253、miR-765、miR-561、miR-330-5p、miR-326、miR-188、miR-203、miR-221、miR-222、miR-26a、miR-26b、miR-29a、miR-29b、miR-29c、miR-370、miR-379、miR-429、miR-519e、miR-598、miR-618或miR-635。
本发明还提供了分离的囊泡,其包含一种或多种与DNMT3B相互作用的miRNA。本发明进一步提供了包含所述分离的囊泡的组合物。因此,在一些实施方案中,所述的组合物包含囊泡群体,该群体包含一种或多种由与DNMT3B相互作用的miRNA组成的生物标志物。所述的组合物可以包含明显富集的囊泡群体,其中所述的囊泡群体对于包含一种或多种与DNMT3B相互作用的miRNA的囊泡为基本上均质的。此外,还可以通过本文公开的一种或多种系统来检测与DNMT3B相互作用的一种或多种miRNA。例如,检测系统可以包括一种或多种探针以检测生物样品中一种或多种囊泡的与DNMT3B相互作用的一种或多种miRNA。
与GART相互作用的miRNA可以为miR-101、miR-141、miR-144、miR-182、miR-189、miR-199a、miR-199b、miR-200a、miR-200b、miR-202、miR-203、miR-223、miR-329、miR-383、miR-429、miR-433、miR-485-5p、miR-493-5p、miR-499、miR-519a、miR-519b、miR-519c、miR-569、miR-591、miR-607、miR-627、miR-635、miR-636或miR-659。
本发明还提供了分离的囊泡,其包含一种或多种与GART相互作用的miRNA。本发明进一步提供了包含所述分离的囊泡的组合物。因此,在一些实施方案中,所述的组合物包含囊泡群体,该群体包含一种或多种由与GART相互作用的miRNA组成的生物标志物。所述的组合物可以包含明显富集的囊泡群体,其中所述的囊泡群体对于包含一种或多种与GART相互作用的miRNA的囊泡为基本上均质的。此外,还可以通过本文公开的一种或多种系统来检测与GART相互作用的一种或多种miRNA。例如,检测系统可以包括一种或多种探针以检测生物样品中一种或多种囊泡的与GART相互作用的一种或多种miRNA。
与MGMT相互作用的miRNA可以为miR-122a、miR-142-3p、miR-17-3p、miR-181a、miR-181b、miR-181c、miR-181d、miR-199b、miR-200a、miR-217、miR-302b、miR-32、miR-324-3p、miR-34a、miR-371、miR-425-5p、miR-496、miR-514、miR-515-3p、miR-516-3p、miR-574、miR-597、miR-603、miR-653、miR-655、miR-92、miR-92b或miR-99a。
本发明还提供了分离的囊泡,其包含一种或多种与MGMT相互作用的miRNA。本发明进一步提供了包含所述分离的囊泡的组合物。因此,在一些实施方案中,所述的组合物包含囊泡群体,该群体包含一种或多种由与MGMT相互作用的miRNA组成的生物标志物。所述的组合物可以包含明显富集的囊泡群体,其中所述的囊泡群体对于包含一种或多种与MGMT相互作用的miRNA的囊泡为基本上均质的。此外,还可以通过本文公开的一种或多种系统来检测与MGMT相互作用的一种或多种miRNA。例如,检测系统可以包括一种或多种探针以检测生物样品中一种或多种囊泡的与MGMT相互作用的一种或多种miRNA。
与SSTR3相互作用的miRNA可以为miR-125a、miR-125b、miR-133a、miR-133b、miR-136、miR-150、miR-21、miR-380-5p、miR-504、miR-550、miR-671、miR-766或miR-767-3p。
本发明还提供了分离的囊泡,其包含一种或多种与SSTR3相互作用的miRNA。本发明进一步提供了包含所述分离的囊泡的组合物。因此,在一些实施方案中,所述的组合物包含囊泡群体,该群体包含一种或多种由与SSTR3相互作用的miRNA组成的生物标志物。所述的组合物可以包含明显富集的囊泡群体,其中所述的囊泡群体对于包含一种或多种与SSTR3相互作用的miRNA的囊泡为基本上均质的。此外,还可以通过本文公开的一种或多种系统来检测与SSTR3相互作用的一种或多种miRNA。例如,检测系统可以包括一种或多种探针以检测生物样品中一种或多种囊泡的与SSTR3相互作用的一种或多种miRNA。
与TOP2B相互作用的miRNA可以为miR-548f、miR-548a-3p、miR-548g、miR-513a-3p、miR-548c-3p、miR-101、miR-653、miR-548d-3p、miR-575、miR-297、miR-576-3p、miR-548b-3p、miR-624、miR-548n、miR-758、miR-1253、miR-1324、miR-23b、miR-320a、miR-320b、miR-1183、miR-1244、miR-23a、miR-451、miR-568、miR-1276、miR-548e、miR-590-3p、miR-1、miR-101、miR-126、miR-129、miR-136、miR-140、miR-141、miR-144、miR-147、miR-149、miR-18、miR-181b、miR-181c、miR-182、miR-184、miR-186、miR-189、miR-191、miR-19a、miR-19b、miR-200a、miR-206、miR-210、miR-218、miR-223、miR-23a、miR-23b、miR-24、miR-27a、miR-302、miR-30a、miR-31、miR-320、miR-323、miR-362、miR-374、miR-383、miR-409-3p、miR-451、miR-489、miR-493-3p、miR-514、miR-542-3p、miR-544、miR-548a、miR-548b、miR-548c、miR-548d、miR-559、miR-568、miR-575、miR-579、miR-585、miR-591、miR-598、miR-613、miR-649、miR-651、miR-758、miR-768-3p或miR-9。
此外,本文还提供了分离的囊泡,其包含一种或多种与TOP2B相互作用的miRNA。本发明进一步提供了包含所述分离的囊泡的组合物。因此,在一些实施方案中,所述的组合物包含囊泡群体,该群体包含一种或多种由与TOP2B相互作用的miRNA组成的生物标志物。所述的组合物可以包含明显富集的囊泡群体,其中所述的囊泡群体对于包含一种或多种与TOP2B相互作用的miRNA的囊泡为基本上均质的。此外,还可以通过本文公开的一种或多种系统来检测与TOP2B相互作用的一种或多种miRNA。例如,检测系统可以包括一种或多种探针以检测生物样品中一种或多种囊泡的与TOP2B相互作用的一种或多种miRNA。
其它微RNA生物标志物
可在囊泡中检测或评估并用于表征表型的其它微RNA包括但不限于hsa-let-7a、hsa-let-7b、hsa-let-7c、hsa-let-7d、hsa-let-7e、hsa-let-7f、hsa-miR-15a、hsa-miR-16、hsa-miR-17-5p、hsa-miR-17-3p、hsa-miR-18a、hsa-miR-19a、hsa-miR-19b、hsa-miR-20a、hsa-miR-21、hsa-miR-22、hsa-miR-23a、hsa-miR-189、hsa-miR-24、hsa-miR-25、hsa-miR-26a、hsa-miR-26b、hsa-miR-27a、hsa-miR-28、hsa-miR-29a、hsa-miR-30a-5p、hsa-miR-30a-3p、hsa-miR-31、hsa-miR-32、hsa-miR-33、hsa-miR-92、hsa-miR-93、hsa-miR-95、hsa-miR-96、hsa-miR-98、hsa-miR-99a、hsa-miR-100、hsa-miR-101、hsa-miR-29b、hsa-miR-103、hsa-miR-105、hsa-miR-106a、hsa-miR-107、hsa-miR-192、hsa-miR-196a、hsa-miR-197、hsa-miR-198、hsa-miR-199a、hsa-miR-199a*、hsa-miR-208、hsa-miR-129、hsa-miR-148a、hsa-miR-30c、hsa-miR-30d、hsa-miR-139、hsa-miR-147、hsa-miR-7、hsa-miR-10a、hsa-miR-10b、hsa-miR-34a、hsa-miR-181a、hsa-miR-181b、hsa-miR-181c、hsa-miR-182、hsa-miR-182*、hsa-miR-183、hsa-miR-187、hsa-miR-199b、hsa-miR-203、hsa-miR-204、hsa-miR-205、hsa-miR-210、hsa-miR-211、hsa-miR-212、hsa-miR-181a*、hsa-miR-214、hsa-miR-215、hsa-miR-216、hsa-miR-217、hsa-miR-218、hsa-miR-219、hsa-miR-220、hsa-miR-221、hsa-miR-222、hsa-miR-223、hsa-miR-224、hsa-miR-200b、hsa-let-7g、hsa-let-7i、hsa-miR-1、hsa-miR-15b、hsa-miR-23b、hsa-miR-27b、hsa-miR-30b、hsa-miR-122a、hsa-miR-124a、hsa-miR-125b、hsa-miR-128a、hsa-miR-130a、hsa-miR-132、hsa-miR-133a、hsa-miR-135a、hsa-miR-137、hsa-miR-138、hsa-miR-140、hsa-miR-141、hsa-miR-142-5p、hsa-miR-142-3p、hsa-miR-143、hsa-miR-144、hsa-miR-145、hsa-miR-152、hsa-miR-153、hsa-miR-191、hsa-miR-9、hsa-miR-9*、hsa-miR-125a、hsa-miR-126*、hsa-miR-126、hsa-miR-127、hsa-miR-134、hsa-miR-136、hsa-miR-146a、hsa-miR-149、hsa-miR-150、hsa-miR-154、hsa-miR-154*、hsa-miR-184、hsa-miR-185、hsa-miR-186、hsa-miR-188、hsa-miR-190、hsa-miR-193a、hsa-miR-194、hsa-miR-195、hsa-miR-206、hsa-miR-320、hsa-miR-200c、hsa-miR-155、hsa-miR-128b、hsa-miR-106b、hsa-miR-29c、hsa-miR-200a、hsa-miR-302a*、hsa-miR-302a、hsa-miR-34b、hsa-miR-34c、hsa-miR-299-3p、hsa-miR-301、hsa-miR-99b、hsa-miR-296、hsa-miR-130b、hsa-miR-30e-5p、hsa-miR-30e-3p、hsa-miR-361、hsa-miR-362、hsa-miR-363、hsa-miR-365、hsa-mir-302b*、hsa-miR-302b、hsa-miR-302c*、hsa-miR-302c、hsa-miR-302d、hsa-miR-367、hsa-miR-368、hsa-miR-369-3p、hsa-miR-370、hsa-miR-371、hsa-miR-372、hsa-miR-373*、hsa-miR-373、hsa-miR-374、hsa-miR-375、hsa-miR-376a、hsa-miR-377、hsa-miR-378、hsa-miR-422b、hsa-miR-379、hsa-miR-380-5p、hsa-miR-380-3p、hsa-miR-381、hsa-miR-382、hsa-miR-383、hsa-miR-340、hsa-miR-330、hsa-miR-328、hsa-miR-342、hsa-miR-337、hsa-miR-323、hsa-miR-326、hsa-miR-151、hsa-miR-135b、hsa-miR-148b、hsa-miR-331、hsa-miR-324-5p、hsa-miR-324-3p、hsa-miR-338、hsa-miR-339、hsa-miR-335、hsa-miR-133b、hsa-miR-325、hsa-miR-345、hsa-miR-346、ebv-miR-BHRF1-1、ebv-miR-BHRF1-2*、ebv-miR-BHRF1-2、ebv-miR-BHRF1-3、ebv-miR-BART1-5p、ebv-miR-BART2、hsa-miR-384、hsa-miR-196b、hsa-miR-422a、hsa-miR-423、hsa-miR-424、hsa-miR-425-3p、hsa-miR-18b、hsa-miR-20b、hsa-miR-448、hsa-miR-429、hsa-miR-449、hsa-miR-450、hcmv-miR-UL22A、hcmv-miR-UL22A*、hcmv-miR-UL36、hcmv-miR-UL112、hcmv-miR-UL148D、hcmv-miR-US5-1、hcmv-miR-US5-2、hcmv-miR-US25-1、hcmv-miR-US25-2-5p、hcmv-miR-US25-2-3p、hcmv-miR-US33、hsa-miR-191*、hsa-miR-200a*、hsa-miR-369-5p、hsa-miR-431、hsa-miR-433、hsa-miR-329、hsa-miR-453、hsa-miR-451、hsa-miR-452、hsa-miR-452*、hsa-miR-409-5p、hsa-miR-409-3p、hsa-miR-412、hsa-miR-410、hsa-miR-376b、hsa-miR-483、hsa-miR-484、hsa-miR-485-5p、hsa-miR-485-3p、hsa-miR-486、hsa-miR-487a、kshv-miR-K12-10a、kshv-miR-K12-10b、kshv-miR-K12-11、kshv-miR-K12-1、kshv-miR-K12-2、kshv-miR-K12-9*、kshv-miR-K12-9、kshv-miR-K12-8、kshv-miR-K12-7、kshv-miR-K12-6-5p、kshv-miR-K12-6-3p、kshv-miR-K12-5、kshv-miR-K12-4-5p、kshv-miR-K12-4-3p、kshv-miR-K12-3、kshv-miR-K12-3*、hsa-miR-488、hsa-miR-489、hsa-miR-490、hsa-miR-491、hsa-miR-511、hsa-miR-146b、hsa-miR-202*、hsa-miR-202、hsa-miR-492、hsa-miR-493-5p、hsa-miR-432、hsa-miR-432*、hsa-miR-494、hsa-miR-495、hsa-miR-496、hsa-miR-193b、hsa-miR-497、hsa-miR-181d、hsa-miR-512-5p、hsa-miR-512-3p、hsa-miR-498、hsa-miR-520e、hsa-miR-515-5p、hsa-miR-515-3p、hsa-miR-519e*、hsa-miR-519e、hsa-miR-520f、hsa-miR-526c、hsa-miR-519c、hsa-miR-520a*、hsa-miR-520a、hsa-miR-526b、hsa-miR-526b*、hsa-miR-519b、hsa-miR-525、hsa-miR-525*、hsa-miR-523、hsa-miR-518f*、hsa-miR-518f、hsa-miR-520b、hsa-miR-518b、hsa-miR-526a、hsa-miR-520c、hsa-miR-518c*、hsa-miR-518c、hsa-miR-524*、hsa-miR-524、hsa-miR-517*、hsa-miR-517a、hsa-miR-519d、hsa-miR-521、hsa-miR-520d*、hsa-miR-520d、hsa-miR-517b、hsa-miR-520g、hsa-miR-516-5p、hsa-miR-516-3p、hsa-miR-518e、hsa-miR-527、hsa-miR-518a、hsa-miR-518d、hsa-miR-517c、hsa-miR-520h、hsa-miR-522、hsa-miR-519a、hsa-miR-499、hsa-miR-500、hsa-miR-501、hsa-miR-502、hsa-miR-503、hsa-miR-504、hsa-miR-505、hsa-miR-513、hsa-miR-506、hsa-miR-507、hsa-miR-508、hsa-miR-509、hsa-miR-510、hsa-miR-514、hsa-miR-532、hsa-miR-299-5p、hsa-miR-18a*、hsa-miR-455、hsa-miR-493-3p、hsa-miR-539、hsa-miR-544、hsa-miR-545、hsa-miR-487b、hsa-miR-551a、hsa-miR-552、hsa-miR-553、hsa-miR-554、hsa-miR-92b、hsa-miR-555、hsa-miR-556、hsa-miR-557、hsa-miR-558、hsa-miR-559、hsa-miR-560、hsa-miR-561、hsa-miR-562、hsa-miR-563、hsa-miR-564、hsa-miR-565、hsa-miR-566、hsa-miR-567、hsa-miR-568、hsa-miR-551b、hsa-miR-569、hsa-miR-570、hsa-miR-571、hsa-miR-572、hsa-miR-573、hsa-miR-574、hsa-miR-575、hsa-miR-576、hsa-miR-577、hsa-miR-578、hsa-miR-579、hsa-miR-580、hsa-miR-581、hsa-miR-582、hsa-miR-583、hsa-miR-584、hsa-miR-585、hsa-miR-548a、hsa-miR-586、hsa-miR-587、hsa-miR-548b、hsa-miR-588、hsa-miR-589、hsa-miR-550、hsa-miR-590、hsa-miR-591、hsa-miR-592、hsa-miR-593、hsa-miR-595、hsa-miR-596、hsa-miR-597、hsa-miR-598、hsa-miR-599、hsa-miR-600、hsa-miR-601、hsa-miR-602、hsa-miR-603、hsa-miR-604、hsa-miR-605、hsa-miR-606、hsa-miR-607、hsa-miR-608、hsa-miR-609、hsa-miR-610、hsa-miR-611、hsa-miR-612、hsa-miR-613、hsa-miR-614、hsa-miR-615、hsa-miR-616、hsa-miR-548c、hsa-miR-617、hsa-miR-618、hsa-miR-619、hsa-miR-620、hsa-miR-621、hsa-miR-622、hsa-miR-623、hsa-miR-624、hsa-miR-625、hsa-miR-626、hsa-miR-627、hsa-miR-628、hsa-miR-629、hsa-miR-630、hsa-miR-631、hsa-miR-33b、hsa-miR-632、hsa-miR-633、hsa-miR-634、hsa-miR-635、hsa-miR-636、hsa-miR-637、hsa-miR-638、hsa-miR-639、hsa-miR-640、hsa-miR-641、hsa-miR-642、hsa-miR-643、hsa-miR-644、hsa-miR-645、hsa-miR-646、hsa-miR-647、hsa-miR-648、hsa-miR-649、hsa-miR-650、hsa-miR-651、hsa-miR-652、hsa-miR-548d、hsa-miR-661、hsa-miR-662、hsa-miR-663、hsa-miR-449b、hsa-miR-653、hsa-miR-411、hsa-miR-654、hsa-miR-655、hsa-miR-656、hsa-miR-549、hsa-miR-657、hsa-miR-658、hsa-miR-659、hsa-miR-660、hsa-miR-421、hsa-miR-542-5p、hcmv-miR-US4、hcmv-miR-UL70-5p、hcmv-miR-UL70-3p、hsa-miR-363*、hsa-miR-376a*、hsa-miR-542-3p、ebv-miR-BART1-3p、hsa-miR-425-5p、ebv-miR-BART3-5p、ebv-miR-BART3-3p、ebv-miR-BART4、ebv-miR-BART5、ebv-miR-BART6-5p、ebv-miR-BART6-3p、ebv-miR-BART7、ebv-miR-BART8-5p、ebv-miR-BART8-3p、ebv-miR-BART9、ebv-miR-BART10、ebv-miR-BART11-5p、ebv-miR-BART11-3p、ebv-miR-BART12、ebv-miR-BART13、ebv-miR-BART14-5p、ebv-miR-BART14-3p、kshv-miR-K12-12、ebv-miR-BART15、ebv-miR-BART16、ebv-miR-BART17-5p、ebv-miR-BART17-3p、ebv-miR-BART18、ebv-miR-BART19、ebv-miR-BART20-5p、ebv-miR-BART20-3p、hsv1-miR-H1、hsa-miR-758、hsa-miR-671、hsa-miR-668、hsa-miR-767-5p、hsa-miR-767-3p、hsa-miR-454-5p、hsa-miR-454-3p、hsa-miR-769-5p、hsa-miR-769-3p、hsa-miR-766、hsa-miR-765、hsa-miR-768-5p、hsa-miR-768-3p、hsa-miR-770-5p、hsa-miR-802、hsa-miR-801以及hsa-miR-675。
例如,不受理论的束缚,miR-128A5、miR-129和miR-128B在脑中高度富集;miR-194、miR-148和miR-192在肝脏中高度富集;mIR-96、miR-150、miR-205、miR-182和miR-183于胸腺中高度富集;miR-204、miR-IOB5、miR-154和miRl 34于睾丸中高度富集;并且miR-122、miR-210、miR-221、miR-141、miR-23A、miR-200C和miR-136于胎盘中高度富集。包含一种或多种前述miR的生物印记可用于区分患有宫颈癌、结肠癌和乳腺癌的患者的阳性和阴性淋巴结。
在另一个实施方案中,生物印记可包含下列miR中的一种或多种:miR-125b-1、miR125b-2、miR-145、miR-21、miR-155、miR-10b、miR-009-1(miR131-1)、miR-34(miR-170)、miR-102(miR-29b)、miR-123(miR-126)、miR-140-as、miR-125a、miR-125b-1、miR-125b-2、miR-194、miR-204、miR-213、let-7a-2、let-7a-3、let-7d(let-7d-v1)、let-7f-2、let-71(let-7d-v2)、miR-101-1、miR-122a、miR-128b、miR-136、miR-143、miR-149、miR-191、miR-196-1、miR-196-2、miR-202、miR-203、miR-206和miR-210,其可用于表征乳腺癌。
在另一个实施方案中,在囊泡中检测miR-375表达并用于表征胰岛或腺泡肿瘤。
在又另一个实施方案中,可在囊泡中检测以下miR中的一种或多种:miR-103-2、miR-107、miR-103-1、miR-342、miR-100、miR-24-2、miR-23a、miR-125a、miR-26a-l、miR-24-1、miR-191、miR-15a、miR-368、miR-26b、miR-125b-2、miR-125b-1、miR-26a-2、miR-335、miR-126.miR-1-2、miR-21、miR-25、miR-92-2、miR-130a、miR-93、miR-16-1、miR-145、miR-17、miR-99b、miR-181b-l、miR-146、miR-181b-2、miR-16-2、miR-99a、miR-197、miR-10a、miR-224、miR-92-1、miR-27a、miR-221、miR-320、miR-7-1、miR-29b-2、miR-150、miR-30d、miR-29a、miR-23b、miR-135a-2、miR-223、miR-3p21-v、miR-128b、miR-30b、miR-29b-l、miR-106b、miR-132、miR-214、miR-7-3、miR-29c、miR-367、miR-30c-2、miR-27b、miR-140、miR-10b、miR-20、miR-129-1、miR-340、miR-30a、miR-30c-l、miR-106a、miR-32、miR-95、miR-222、miR-30e、miR-129-2、miR-345、miR-143、miR-182、miR-1-1、miR-133a-l、miR-200c、miR-194-1、miR-210、miR-181c、miR-192、miR-220、miR-213、miR-323和miR-375,其中所述一种或多种miR的高表达或过表达可用于表征胰腺癌。
可在囊泡中检测以下miR中一种或多种的表达并用于表征巨核细胞生成:miR-101、miR-126、miR-99a、miR-99-prec、miR-106、miR-339、miR-99b、miR-149、miR-33、miR-135和miR-20。
据信细胞增殖与miR-31、miR-92、miR-99a、miR-100、miR-125a、miR-129、miR-130a、miR-150、miR-187、miR-190、miR-191、miR-193、miR-204、miR-210、miR-21 1、miR-212、miR-213、miR-215、miR-216、miR-217、miR-218、miR-224、miR-292、miR-294、miR-320、miR-324、miR-325、miR-326、miR-330、miR-331、miR-338、miR-341、miR-369、miR-370、et-7a、Let-7b、Let-7c、Let-7d、Let-7g、miR-7、miR-9、miR-10a、miR-10b、miR-15a、miR-18、miR-19a、miR-17-3p、miR-20、miR-23b、miR-25、miR-26a、miR-26a、miR-30e-5p、miR-31、miR-32、miR-92、miR-93、miR-100、miR-125a、miR-125b、miR-126、miR-127、miR-128、miR-129、miR-130a、miR-135、miR-138、miR-139、miR-140、miR-141、miR-143、miR-145、miR-146、miR-150、miR-154、miR-155、miR-181a、miR-182、miR-186、miR-187、miR-188、miR-190、miR-191、miR-193、miR-194、miR-196、miR-197、miR-198、miR-199、miR-201、miR-204、miR-216、miR-218、miR-223、miR-293、miR-291-3p、miR-294、miR-295、miR-322、miR-333、miR-335、miR-338、miR-341、miR-350、miR-369、miR-373、miR-410和miR-412的表达关联。对一种或多种上述miR的检测可用于表征癌症。
在囊泡中检测并用于表征癌症的miR的其它实例公开于美国专利No.7,642,348(其描述了与前列腺癌相关的3,765种独特的核酸序列的鉴定)和美国专利No.7,592,441中,其描述了与肝癌相关的微RNA。
通常在实体癌症(诸如结肠癌、肺癌、乳腺癌、胃癌、前列腺癌和胰腺癌)中表达的其它微RNA也可在囊泡中检测并用于表征癌症。例如,可在囊泡中检测以下miR中的一种或多种并用于表征实体癌症:miR-21、miR-17-5p、miR-191、miR-29b-2、miR-223、miR-128b、miR-199a-1、miR-24-1、miR-24-2、miR-146、miR-155、miR-181b-1、miR-20a、miR-107、miR-32、miR-92-2、miR-214、miR-30c、miR-25、miR-221和miR-106a。
可在囊泡中检测的微RNA的其它实例公开于PCT公开号No.WO2006126040、WO2006033020、WO2005116250和WO2005111211,美国公开号No.US20070042982和US20080318210;以及EP公开号No.EP1784501A2和EP1751311A2中,其各自以引用的方式并入本文。
生物标志物检测
根据本文公开的,可通过检测微RNA、囊泡或其它生物标志物的存在、水平或浓度定性地或定量地检测生物印记。可使用本领域的技术人员所知的多种技术检测这些生物印记成分。例如,可通过微阵列分析、聚合酶链反应(PCR)(包括基于PCR的方法,例如实时聚合酶链反应(RT-PCR)、定量实时聚合酶链反应(Q-PCR/qPCR)等)、与等位基因特异性探针的杂交、酶突变检测、连接酶链反应(LCR)、寡核苷酸连接分析(OLA)、流式细胞异源双链分析、错配的化学切割、质谱、核酸测序、单链构象多态性(SSCP)、变性梯度凝胶电泳(DGGE)、温度梯度凝胶电泳(TGGE)、限制片段长度多态性、基因表达的系列分析(SAGE)或它们的组合检测生物标志物。可在检测前扩增生物标志物,诸如核酸。还可通过免疫分析、免疫印迹、免疫沉淀、酶联免疫吸附分析(ELISA,EIA)、放射免疫分析(RIA)、流式细胞法或电子显微法(EM)检测生物标志物。
根据本文所述的,可使用捕获剂和检测剂检测生物印记。捕获剂可包含抗体、适体或识别生物标志物并且可用于捕获所述生物标志物的其它实体。可被捕获的生物标志物包括循环生物标志物,如,体液的溶液中的蛋白质、核酸、脂质或生物复合物。类似地,所述捕获剂可用于捕获囊泡。检测剂可包含抗体或识别生物标志物并且可用于检测所述生物标志物囊泡或者识别囊泡并且可用于检测囊泡的其它实体。在一些实施方案中,所述检测剂被标记并且对标记物进行检测,由此而检测所述生物标志物或囊泡。所述检测剂可以是结合剂,如抗体或适体。在其它实施方案中,所述检测剂包含小分子,诸如膜蛋白标记剂。例如,参见,公开于Alroy等的美国专利公开号US 2005/0158708中的膜蛋白标记剂。在实施方案中,根据本发明描述分离或捕获囊泡,并且将一种或多种膜蛋白标记剂用于检测所述囊泡。在许多情况下,由所述捕获剂和检测剂所识别的抗原或其它囊泡部分是可互换的。作为一个非限制性实例,考虑在其表面上具有细胞源特异性抗原和在其表面具有癌症特异性抗原的囊泡。在一种情况下,所述囊泡可使用针对所述细胞源特异性抗原的抗体进行捕获(例如通过将捕获抗体系留于基底上),并且所述囊泡随后使用针对所述癌症特异性抗原的抗体进行检测(例如通过使用荧光染料标记所述检测抗体并且检测所述染料发射的荧光辐射)。在另一种情况下,所述囊泡可使用针对所述癌症特异性抗原的抗体进行捕获(例如通过将所述捕获抗体锚定于基底上),并且所述囊泡随后使用针对所述细胞源特异性抗原的抗体进行检测(例如通过使用荧光染料标记所述检测抗体并且检测所述染料发射的荧光辐射)。
在一些实施方案中,捕获剂和检测剂两者识别同一生物标志物。可根据情况使用该方案。在一个实施方案中,所述生物标志物足以检测目标囊泡,例如,足以捕获细胞源特异性囊泡。在其它实施方案中,所述生物标志物是多功能的,如,具有细胞源特异性和癌症特异性特性。所述生物标志物可以与同样用于捕获和检测的其它生物标志物协调使用。
检测生物标志物的一种方法包括如上文所述从生物样品纯化或分离异质囊泡群体并且进行夹心分析(sandwich assay)。可以使用捕获剂捕获所述群体中的囊泡。所述捕获剂可以是捕获抗体,诸如初级抗体。所述捕获抗体可结合于基底,例如阵列、孔或颗粒。可使用检测剂(诸如检测抗体)检测捕获或结合的囊泡。例如,所述检测抗体可以针对所述囊泡的抗原。所述的检测抗体可以直接标记和检测。或者,所述检测剂可间接标记和检测,诸如通过可与所述检测剂反应的酶连接的二级抗体。可加入检测试剂或检测底物,并检测反应,例如PCT公开号No.WO2009092386中所描述的。在其中所述结合剂结合Rab-5b并且所述检测剂结合或检测CD63或小窝蛋白-1的说明性实例中,所述捕获剂可以是抗Rab 5b抗体并且所述检测剂可以是抗CD63或抗小窝蛋白-1抗体。在一些实施方案中,所述捕获剂结合CD9、PSCA、TNFR、CD63、B7H3、MFG-E8、EpCam、Rab、CD81、STEAP、PCSA、PSMA或5T4。例如,所述捕获剂可以是针对CD9、PSCA、TNFR、CD63、B7H3、MFG-E8、EpCam、Rab、CD81、STEAP、PCSA、PSMA或5T4的抗体。所述捕获剂还可以是针对MFG-E8、膜联蛋白V、组织因子、DR3、STEAP、epha2、TMEM211、unc93A、A33、CD24、NGAL、EpCam、MUC17、TROP2或TETS的抗体。所述检测剂可以是结合或检测CD63、CD9、CD81、B7H3或EpCam的试剂,诸如针对CD63、CD9、CD81、B7H3或EpCam的检测抗体。捕获剂和/或检测剂的各种不同组合可协调使用。在一个实施方案中,所述捕获剂包含PCSA、PSMA、B7H3并且可任选地包含EpCam,并且所述检测剂包含一种或多种四跨膜蛋白,诸如CD9、CD63和CD81。在另一个实施方案中,所述捕获剂包含TMEM211和CD24,并且所述检测剂包含一种或多种四跨膜蛋白,诸如CD9、CD63和CD81。在另一个实施方案中,所述捕获剂包含CD66和EpCam,并且所述检测剂包含一种或多种四跨膜蛋白,诸如CD9、CD63和CD81。提高数量的这些四跨膜蛋白和/或其它一般囊泡标志物在某些情况下可改善所述检测信号。也可使用夹心方法检测蛋白质或其它循环生物标志物。可收集所述捕获的囊泡和用于分析其中所包含的有效负载,如mRNA、微RNA、DNA和可溶性蛋白。
在一些实施方案中,所述捕获剂结合或靶向于EpCam、B7H3或CD24,并且在所述囊泡上检测的一种或多种生物标志物是CD9和/或CD63。在一个实施方案中,所述捕获剂结合或靶向于EpCam,并且在所述囊泡上检测的一种或多种生物标志物是CD9、EpCam和/或CD81。单一捕获剂可以选自CD9、PSCA、TNFR、CD63、B7H3、MFG-E8、EpCam、Rab、CD81、STEAP、PCSA、PSMA或5T4。所述单一捕获剂还可以是针对DR3、STEAP、epha2、TMEM211、unc93A、A33、CD24、NGAL、EpCam、MUC17、TROP2、MFG-E8、TF、膜联蛋白V或TETS的抗体。在一些实施方案中,所述单一捕获剂选自PCSA、PSMA、B7H3、CD81、CD9和CD63。
在其它实施方案中,所述捕获剂靶向于PCSA,并且在捕获的囊泡上检测的一种或多种生物标志物是B7H3和/或PSMA。在其它实施方案中,所述捕获剂靶向于PSMA,并且在捕获的囊泡上检测的一种或多种生物标志物是B7H3和/或PCSA。在其它实施方案中,所述捕获剂靶向于B7H3,并且在捕获的囊泡上检测的一种或多种生物标志物是PSMA和/或PCSA。在再另外的实施方案中,所述捕获剂靶向于CD63,并且在捕获的囊泡上检测的一种或多种生物标志物是CD81、CD83、CD9和/或CD63。本文所公开的不同捕获剂和生物标志物组合可用于表征表型,诸如检测、诊断或预后疾病,如癌症。在一些实施方案中,可使用靶向于EpCam的捕获剂及CD9和CD63的检测;使用靶向于PCSA的捕获剂及B7H3和PSMA的检测;或者使用CD63的捕获剂及CD81的检测来分析囊泡,从而表征前列腺癌。在其它实施方案中,使用靶向于CD63的捕获剂及CD63的检测或者靶向于CD9的捕获剂与CD63的检测偶联将囊泡用于表征结肠癌。技术人员应当了解,捕获剂和检测剂的靶标可互换使用。在说明性实例中,考虑了靶向于PCSA的捕获剂和靶向于B7H3和PSMA的检测剂。由于全部这些标志物可用于检测PCa源的囊泡,可以通过所述捕获剂靶向于B7H3或PSMA并且可通过检测剂识别PCSA。例如,在一些实施方案中,所述检测剂靶向于PCSA,并且用于捕获所述囊泡的一种或多种生物标志物包含B7H3和/或PSMA。在其它实施方案中,所述捕获剂靶向于PSMA,并且用于捕获所述囊泡的一种或多种生物标志物包含B7H3和/或PCSA。在其它实施方案中,所述检测剂靶向于B7H3,并且用于捕获所述囊泡的一种或多种生物标志物包含PSMA和/或PCSA。在一些实施方案中,本发明提供了使用针对PSMA、B7H3和/或PCSA的捕获剂和/或检测剂在体液中检测前列腺癌细胞的方法。所述体液可包含血液,其包括血清或血浆。所述体液可包含射出液或精子。在另外的实施方案中,检测前列腺癌的方法进一步使用针对CD81、CD83、CD9和/或CD63的捕获剂和/或检测剂。所述方法还提供了表征GI失调的方法,其包括使用DR3、STEAP、epha2、TMEM211、unc93A、A33、CD24、NGAL、EpCam、MUC17、TROP2和TETS中的一种或多种捕获囊泡,以及使用一种或多种一般囊泡抗原(诸如CD81、CD63和/或CD9)检测所捕获的囊泡。另外的试剂可改善测试性能,如,改善测试精确性或AUC,其通过提供额外的生物分辨力和/或通过降低实验噪音而实现。
用于本发明的检测生物标志物的技术包括使用平面基底,诸如阵列(如生物芯片或微阵列),其具有固定于所述基底上的分子以作为辅助对特定生物印记的检测的捕获剂。所述阵列可作为用于分析一种或多种生物标志物或囊泡的试剂盒的一部分而提供。对上文所述的及图3-60中示出的生物标志物以及图1示出的抗原进行鉴定的分子可以包含在用于检测和诊断疾病(包括症状前疾病)的阵列中。在一些实施方案中,阵列包含定制阵列,其包含经选择以特异性地识别目标生物标志物的生物分子。可改进定制阵列以检测提高统计性能的生物标志物,如对在多元预测模型(如,逻辑回归、辨识分析或回归树模型)中产生改善的交叉验证错误率的生物印记进行鉴定的额外生物分子。在一些实施方案中,构建了定制阵列以研究疾病、状况或症状的生物学并且对限定生理状态下的生物印记进行分型。用于包含在所述定制阵列的标志物可根据统计标准加以选择,例如在区分表型或生理状态中具有所需水平的统计显著性。在一些实施方案中,选用p值=0.05的标准显著性以排除或包括在所述微阵列中的生物分子。所述p值可针对多重比较进行校正。作为说明性实例,从来自患有或未患疾病的受试者的样品中提取的核酸可与高密度微阵列杂交,所述微阵列结合数千种基因序列。与具有或不具所述疾病的样品之间具有显著不同水平的核酸可被选为生物标志物以区分样品是否具有所述疾病。可构建定制阵列以检测被选择的生物标志物。在一些实施方案中,定制阵列包含低密度微阵列,其指的是具有较低数量(如,数十或数百种,而非数千种)的可编址结合剂的阵列。可在基底上形成低密度阵列。在一些实施方案中,定制的低密度阵列使用在平板孔内的PCR扩增,如,Gene Expression Assays(LifeTechnologies Corporation,Carlsbad,CA的Applied Biosystems)。
平面阵列通常以阵列形式包含生物分子的可编址位置(例如便签(pad)、地址或微位置)。阵列的大小应取决于所述阵列的构成和最终用途。可以制备包含2种不同的分子至数千种不同分子的阵列。通常,所述的阵列包含2种至多至100,000种或更多种分子,这取决于所述阵列的最终用途以及制造方法。用于本发明的微阵列包含至少一种生物分子,该分子鉴定或捕获存在于目标生物印记中的生物标志物,例如微RNA或构成所述生物印记的其它生物分子或囊泡。在一些阵列中,使用了具有不同或相同组成的多个基底。因此,平面阵列可包含多个较小的基底。
本发明可使用多类型的阵列以检测生物标志物,例如,与目的生物印记相关的生物标志物。可用的阵列或微阵列包括但不限于DNA微阵列(诸如cDNA微阵列、寡核苷酸微阵列和SNP微阵列)、微RNA阵列、蛋白质微阵列、抗体微阵列、组织微阵列、细胞微阵列(亦称为转染微阵列)、化学化合物微阵列以及碳水化合物阵列(糖阵列)。这些阵列在以上更详尽地描述。在一些实施方案中,微阵列包含生物芯片,其提供了识别分子(如抗体)的高密度固定化阵列,其中对生物标志物结合进行间接监测(如通过荧光)。图2A示出了说明性配置,其中针对目标囊泡抗原的捕获抗体系留于表面上。随后使用针对相同或不同目标囊泡抗原的检测抗体检测所捕获的囊泡。在可用的和理想的情况下,可使用系留的适体取代所述捕获抗体。示出了荧光检测剂。可类似地使用其它检测剂,例如,酶学反应、可检测纳米颗粒、放射标记等。在其它实施方案中,阵列包含参与通过生物化学或分子间相互作用与通过质谱(MS)进行的检测相结合而捕获蛋白质的形式。可从表面洗脱所述囊泡并可以分析其有效负载,如微RNA。
可用于检测生物印记的一种或多种生物标志物的阵列或微阵列可根据描述于美国专利No.6,329,209;6,365,418;6,406,921;6,475,808和6,475,809以及美国专利申请系列No.10/884,269中的方法制备,其各自全文以引用的方式并入本文。可使用描述于这些专利中的方法制备用于检测本文所述的生物标志物的特定选组的定制阵列。可商购的微阵列也可用于实施本发明的方法,其包括但不限于来自Affymetrix(Santa Clara,CA)、Illumina(San Diego,CA)、Agilent(Santa Clara,CA)、Exiqon(Denmark)或Invitrogen(Carlsbad,CA)的那些微阵列。定制阵列和/或商业化阵列包括用于如本文所述的检测蛋白质、核酸以及其它生物分子和实体(如细胞、囊泡、病毒)的阵列。
在一些实施方案中,待固定于阵列上的分子包括蛋白质或肽。一种或多种类型的蛋白质可以被固定在表面上。在特定实施方案中,使用使蛋白质的变性最小化、使蛋白质的活性变化最小化或者使蛋白质与其所固定的表面之间的相互作用最小化的方法和材料来固定所述的蛋白质。
可用的阵列表面可以为任何所需的形状、形式或大小。表面的非限制实例包括芯片、连续的表面、弧形表面、柔性表面、薄膜、平板、薄片或管。表面可以具有一平方微米至大约500cm2的面积。表面的面积、长度和宽度可以根据待实施分析的需求而变化。需要考虑的因素可以包括(例如)操作的简易性、形成表面的材料的限制、检测系统的需要、沉积系统(例如阵列仪)的需要等。
在特定的实施方案中,希望的是使用物理手段来分离多组或多个阵列的结合岛或固定的生物分子:这种物理分离有助于将不同的组或阵列暴露于不同的目标溶液。因此,在特定的实施方案中,阵列处于具有任意数量的孔的微孔板中。在这样的实施方案中,所述孔的底可以起到形成阵列的表面的作用,或者阵列可以在其它表面上形成然后被放置在孔中。在特定的实施方案中,例如其中使用不具有孔的表面的情况下,可以形成结合岛或者可将分子固定在表面上和衬垫上,其具有空间排列的洞以使它们对应于所述岛或使生物分子可以被置于表面上。这种衬垫优选为液体密封的。衬垫可以在制备阵列的过程中的任何时间放置在表面上,并且如果对组或阵列的隔离不再是必需的,则可以除去。
在一些实施方案中,固定的分子可以结合与固定分子接触的生物样品中存在的一种或多种生物标志物或囊泡。在一些实施方案中,所述的固定分子修饰了接触于所述固定分子的一种或多种囊泡中存在的分子,或者被该分子所修饰。与所述样品接触一般包括将所述样品覆盖于所述阵列上。
可以使用本领域已知的检测技术来检测溶液中或固定在阵列上的分子的修饰或结合。这些技术的实例包括免疫技术,例如竞争性结合分析和夹心分析;使用诸如共焦扫描仪、共焦显微镜或基于CCD的系统之类的装置以及诸如荧光、荧光偏振(FP)、荧光共振能量转移(FRET)、全内反射荧光(TIRF)、荧光相关谱(FCS)之类的技术进行的荧光检测;比色/光谱技术;表面等离子共振(通过该技术可以测量被表面所吸附的物质质量的变化);使用放射性同位素的技术,包括传统的同位素结合以及闪烁迫近分析法(SPA);质谱,例如基质辅助激光解吸/电离质谱(MALDI)和MALDI飞行时间(TOF)质谱;椭圆光度法,其为测量蛋白质薄膜厚度的光学方法;石英晶体微天平(QCM),其为测量吸附在表面上的材料质量的极灵敏的方法;扫描探针显微法,例如原子力显微法(AFM)和扫描力显微法(SEM);以及诸如电化学、阻抗技术、声学技术、微波和IR/Raman检测这样的技术。例如参见Mere L等,"Miniaturized FRET assays and microfluidics:key components for ultra-high-throughput screening,"Drug Discovery Today4(8):363-369(1999)及其引用的文献;Lakowicz J R,Principles of Fluorescence Spectroscopy,第2版,Plenum Press(1999)或Jain KK:Integrative Omics,Pharmacoproteomics,and Human Body Fluids.In:Thongboonkerd V编辑,Proteomics of Human Body Fluids:Principles,Methods andApplications.Volume 1:Totowa,N.J.:Humana Press,2007,各文献全文均以引用方式并入本文。
微阵列技术可以与质谱(MS)分析和其它工具相结合。质谱的电喷雾的接口可以与微流体设备中的毛细管集成。例如,一种市售可得的系统包含eTag报告物,其为具有独特且良好定义的电泳迁移率的荧光标记物;各个标记物通过可切割的键而与生物或化学探针偶联。各个eTag报告物的不同的迁移率定址使得这些标记物的混合物能够通过毛细管电泳快速地解卷积和定量。该系统可以对同一样品同时进行基因表达、蛋白质表达和蛋白质功能的分析,Jain KK:Integrative Omics,Pharmacoproteomics,and Human Body Fluids.In:Thongboonkerd V编辑,Proteomics of Human Body Fluids:Principles,Methods andApplications.第1卷:Totowa,N.J.:Humana Press,2007,其全文以引用方式并入本文。
生物芯片可包括用于微流体或纳米流体分析的组分。微流体装置可用于分离或分析生物标志物,诸如测定生物印记。微流体系统允许对用于分离、捕获或检测囊泡、检测微RNA、检测循环生物标志物、检测生物印记中的一种或多种过程以及其它过程微型化和区室化。在所述系统的至少一个方面,所述的微流体装置可以使用一种或多种检测试剂,并且该检测试剂可以用于检测一种或多种生物标志物。在一个实施方案中,所述装置检测分离的或结合的囊泡上的生物标志物。各种探针、抗体、蛋白质或其它结合剂可用于检测微流体系统中的生物标志物。所述检测剂可以固定于所述微流体装置的不同区室内或通过所述装置的各个通道而进入杂交或检测反应中。
微流体装置中的囊泡可在所述微流体装置中裂解并对其内含物进行检测,诸如蛋白质或核酸,如DNA或RNA,诸如miRNA或mRNA。所述核酸可在所述微流体装置中在检测前扩增或直接检测。因此,微流体系统也可被用于对各种不同标记物的检测进行多重检测。在一个实施方案中,在所述微流体装置中捕获囊泡,所捕获的囊泡被裂解,并且测定来自所述囊泡有效负载的微RNA的生物印记。所述生物印记可进一步包含用于捕获所述囊泡的捕获剂。
新型的纳米加工技术开启了生物传感应用(其依赖于高密度、精确的阵列的加工,例如基于核苷酸的芯片和另外称为异质纳米阵列的蛋白质阵列)的可能性。纳米流体允许将微芯片中流体分析物的量进一步减少至纳升水平,并且本文所用的芯片称为纳米芯片。(例如参见Unger M等,Biotechniques 1999;27(5):1008-14、Kartalov EP等,Biotechniques 2006;40(1):85-90,各文献全文以引用方式并入本文。)目前,市售可得的纳米芯片提供了简单的单步骤分析,例如总胆固醇、总蛋白质或葡萄糖分析,其可以通过将样品与试剂相结合,混合并监测反应来运行。基于液相色谱(LC)和纳米LC分离的无凝胶分析方法(Cutillas等,Proteomics,2005;5:101-112以及Cutillas等,Mol Cell Proteomics2005;4:1038-1051,各文献全文以引用方式并入本文)可以与纳米芯片结合使用。
本文进一步提供了有助于检测生物样品中的特定生物印记的快速检测装置。所述装置可以将生物样品的制备与聚合酶链式反应(PCR)集成在芯片上。所述装置可有助于检测生物样品中囊泡的特定生物印记,并且其实例如Pipper等,Angewandte Chemie,47(21),p.3900-3904(2008)中描述的提供,其全文以引用方式并入本文。可以使用用于诊断应用的微/纳米电化学系统(MEMS/NEMS)传感器和口服流体来引入囊泡的生物印记,如在Li等,AdvDent Res 18(1):3-5(2005)中所述,其全文以引用方式并入本文。
作为平面阵列的替代,使用微粒的分析(例如基于珠的测定,如本文所述)可以与流式细胞术结合使用。可以使用多参数分析或其它高通量的检测分析(其使用了具有同源配体的珠涂层以及具有与高度灵敏性自动化技术相一致的特定活性的报告分子)。在基于珠的分析系统中,在可寻址微球上固定用于生物标志物或囊泡的结合剂,诸如捕获剂(例如捕获抗体)。用于各单个结合分析的各种结合剂可与不同类型的微球(即,微珠)偶联,并且分析反应在微球的表面上发生,例如图63B所描述的。用于囊泡的结合剂可以是与珠偶联的捕获抗体。具有离散荧光强度的染色微球独立地加载它们适宜的结合剂或捕获探针。根据需要可以将携带不同结合剂的不同组的珠汇聚在一起,从而形成定制珠阵列。然后,将珠阵列在单个反应容器中与所述样品孵育以进行分析。可以使用的或者经适应以用于本发明的微流体装置的实例包括但不限于本文所描述的那些。
可以使用基于荧光的报告系统检测所述的生物标志物与固定的捕获分子或结合剂的产物形成(例如参见图63A-B)。所述的生物标志物可以以荧光团直接标记,或者通过第二荧光标记的捕获生物分子进行检测。可以在流式细胞仪中测量衍生自捕获的生物标志物的信号强度。流式细胞仪可首先通过其单独的颜色编码鉴定各微球。例如,不同的珠可以染色有离散的荧光强度,使得具有不同强度的各个珠具有不同结合剂。所述的珠可以使用至少2种不同的标记物或染料进行标记或染色。在一些实施方案中,使用至少3、4、5、6、7、8、9或10种不同的标记物对所述的珠进行标记。此外,具有多于一种标记物或染料的珠还可以具有不同比例和组成的标记物或染料。所述的珠可进行外部标记或染色,或者可以具有内在的荧光或信号标记物。
各单个珠上捕获的生物标志物的量可以通过对结合的靶特异性的第二颜色荧光来测量。这允许在同一实验中由单一的样品得到多种靶的多重定量。可以相对标准的微滴定ELISA过程比较灵敏度、可靠性和精确性,或者可以加以改善。基于珠的系统的益处在于囊泡的捕获生物分子或结合剂与不同的微球单独偶联提供了复用的能力。例如,根据图63C所描述,5种不同的待检测的(通过针对抗原的抗体进行检测,例如CD63,CD9,CD81,B7H3和EpCam)生物标志物与20种生物标志物(针对该标志物来捕获囊泡(使用捕获抗体,例如针对CD9、PSCA、TNFR、CD63、B7H3、MFG-E8、EpCam、Rab、CD81、STEAP、PCSA、PSMA、5T4和/或CD24的抗体))的组合可以得到大约100种待检测的组合。根据图63C中作为“EpCam 2×”、“CD63 2×”所示出的,针对单一靶标的多种抗体可用于探测针对各种表位的检测。在另一个实例中,多重分析包括使用针对CD24的结合剂捕获囊泡并且使用针对CD9、CD63和/或CD81的结合剂检测所捕获的囊泡。可使用检测剂(诸如抗体)检测所捕获的囊泡。根据本文所述,所述的检测试剂可以直接或间接标记。
可以对至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、50、75或100种不同的生物标志物进行复用。例如,可以使用多种差异标记的颗粒来进行异质囊泡群体的分析。可以有至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、75或100种差异标记的颗粒。所述的颗粒可以外部标记(例如使用标签),或者它们可以内在地标记。各差异标记的颗粒可以与囊泡的捕获剂偶联,例如结合剂,从而捕获囊泡。可选择多种捕获剂以表征目标表型,其包括针对一般囊泡生物标志物、细胞源特异性生物标志物和疾病生物标志物的捕获剂。随后可通过多种结合剂检测所捕获囊泡的一种或多种生物标志物。可对所述结合剂进行直接标记以辅助检测。或者,可通过第二试剂标记所述结合剂。例如,所述结合剂可以是针对所述囊泡上的生物标志物的抗体。所述结合剂与生物素连接。第二试剂包含与报告物连接的抗生蛋白链菌素,并且可被加入以检测所述生物标志物。在一些实施方案中,可以针对至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、50、75或100种不同的生物标志物来分析所捕获的囊泡。例如,多种检测剂(即,捕获的囊泡或囊泡群体的多种生物标志物的检测)可以增加所得的信号,允许提高的灵敏度、特异性或者这二者,并且使用较少量的样品。例如,与使用较少数量检测标志物(如单一标志物)相比,使用超过一种一般囊泡标志物进行的检测可改善所述信号。为进行说明,使用针对CD9、CD63和/或CD81中的两种或三种的标记的结合剂检测囊泡与单独使用所述四跨膜蛋白中的任意一种进行的检测相比可以改善所述信号。
基于免疫分析的方法或夹心分析也可用于检测囊泡的生物标志物。一个实例包括ELISA。结合剂或捕获剂可与孔结合。例如,针对囊泡抗原的抗体可与孔连接。可根据本文描述的方法检测所捕获的囊泡上的生物标志物。图63A示出了夹心型免疫分析的说明性示意图。捕获抗体可以针对目标囊泡抗原,如一般囊泡生物标志物、细胞源标志物或疾病标志物。在该图中,使用针对目标囊泡抗原的荧光标记抗体检测所捕获的囊泡。可使用多种捕获抗体,如,在阵列上的可区分地址或免疫分析板的不同孔中使用。所述检测抗体可以针对所述捕获抗体相同的抗原,或可针对其它标志物。所述捕获抗体可以由替代的结合剂取代,诸如系留的适体或凝集素,和/或所述检测抗体可以被类似地取代,例如,被可检测的(如,标记的)适体、凝集素或其它结合蛋白质或实体取代。在一个实施方案中,针对一般囊泡生物标志物、细胞源标志物和/或疾病标志物的一种或多种捕获剂可与针对一般囊泡生物标志物(诸如四跨膜蛋白,包括但不限于CD9、CD63和CD81中的一种或多种)的检测剂一起使用。
图63D示出了根据本发明的方法分析囊泡的说明性示意图。捕获剂用于捕获囊泡,检测剂用于检测所捕获的囊泡,并且所述捕获和检测抗体的水平或存在用于表征表型。捕获剂、检测剂和表征表型可以是本文所述的任意一种。例如,捕获剂包括系留于基底上的抗体或适体,其识别目标囊泡抗原,检测剂包括针对目标囊泡抗原的标记抗体或适体,并且表征表型包括对疾病的诊断、预后或治疗诊断。在图63D i)中示出的示意图中,使用针对一般囊泡生物标志物的一种或多种捕获剂捕获囊泡群体(6300)。随后使用针对细胞源生物标志物的检测剂(6301)和/或针对疾病特异性生物标志物的检测剂(6302)标记所捕获的囊泡。如果仅使用细胞源检测剂(6301),用于表征所述表型(6303)的生物印记可包括所述一般囊泡标志物(6300)和所述细胞源生物标志物(6301)。如果仅使用疾病检测剂(6302),用于表征所述表型(6303)的生物印记可包括所述一般囊泡标志物(6300)和所述疾病生物标志物(6302)。或者,使用检测剂检测细胞源生物标志物(6301)和疾病特异性生物标志物(6302)。在这种情况下,用于表征所述表型(6403)的生物印记可包括所述一般囊泡标志物(6300)、所述细胞源生物标志物(6301)和所述疾病生物标志物(6302)。所述生物标志物组合经选择以表征目标表型并且可选自本文所述的生物标志物和表型。
在图63D ii)中示出的示意图中,使用针对细胞源生物标志物(6310)和/或疾病生物标志物(6311)的一种或多种捕获剂捕获囊泡群体。随后使用针对一般囊泡生物标志物的检测剂(6312)检测所捕获的囊泡。如果仅使用了细胞源捕获剂(6310),用于表征所述表型的生物印记(6313)可包括所述细胞源生物标志物(6310)和所述一般囊泡标志物(6312)。如果仅使用了疾病生物标志物捕获剂(6311),用于表征所述表型的生物印记(6313)可包括所述疾病生物标志物(6311)和所述一般囊泡生物标志物(6312)。或者,针对一种或多种细胞源生物标志物(6310)和一种或多种疾病特异性生物标志物(6311)的捕获剂被用于捕获囊泡。在该情况下,用于表征所述表型的生物印记(6313)可包括所述细胞源生物标志物(6310)、所述疾病生物标志物(6311)和所述一般囊泡标志物(6313)。所述生物标志物组合经选择以表征目标表型并且可选自本文所述的生物标志物和表型。
可分析包含生物标志物的囊泡有效负载以表征表型。有效负载包含生物实体,其包含在囊泡膜内。这些实体包括但不限于核酸(如mRNA、微RNA或DNA片段);蛋白质(如可溶蛋白和膜相关蛋白);碳水化合物;脂质;代谢物;以及各种小分子,如激素。所述有效负载可以是细胞环境的一部分,其在囊泡形成于所述细胞环境时被包封。在本发明的一些实施方案中,除检测囊泡表面抗原之外还分析了所述有效负载。可根据上文所述捕获特定的囊泡群体,随后所捕获的囊泡中的有效负载可用于表征表型。例如,可进一步分离在基底上捕获的囊泡以评估其中的有效负载。或者,对样品中的囊泡进行检测和分选而不捕获。可进一步分离用该方式检测的囊泡以评估其中的有效负载。在一个实施方案中,通过流式细胞法分选囊泡群体并且分析了所分选的囊泡中的有效负载。在图63E iii)中示出的示意图中,使用一种或多种细胞源生物标志物(6320)、疾病生物标志物(6321)和一般囊泡标志物(6322)捕获和/或检测囊泡群体(6320)。评估了分离的囊泡的有效负载(6323)。在所述有效负载中检测的生物印记可用于表征表型(6324)。在一个非限制性实例中,可使用针对一种或多种目标囊泡抗原的抗体在来自患者的血浆样品中分析囊泡群体。所述抗体可以是系留于基底上以分离所需囊泡群体的捕获抗体。或者,所述抗体可以直接标记并且通过使用流式细胞法进行分选对所标记的囊泡进行分离。从所述被分离的囊泡群体中提取的微RNA或mRNA的存在或水平可用于检测生物印记。所述生物印记随后用于诊断、预后或治疗诊断所述患者。
在其它实施方案中,在未首先捕获或检测囊泡亚群的情况下在囊泡群体中分析囊泡有效负载。例如,根据本文所述,通常可使用离心、过滤、色谱或其它技术从样品中分离囊泡。此后可分析所分离的囊泡的有效负载以检测生物印记并且表征表型。在图63E iv)中示出的示意图中,分离了囊泡群体(6330)并且评估了所分离的囊泡的有效负载(6331)。在所述有效负载中检测的生物印记可用于表征表型(6332)。在非限制性实例中,使用尺寸排阻和膜过滤从来自患者的血浆样品中分离囊泡群体。从所述囊泡群体中提取的微RNA或mRNA的存在或水平用于检测生物印记。所述生物印记随后用于诊断、预后或治疗诊断所述患者。
可以通过质谱或流式细胞法来分析肽或蛋白质生物标志物。可以根据本领域众所周知的程序通过免疫细胞化学染色、Western印迹、电泳、SDS-PAGE、色谱、x射线晶体学或其它蛋白质分析技术进行囊泡的蛋白质组分析。在其它实施方案中,可以使用Chromy等,JProteome Res,2004;3:1120-1127(其全文以引用方式并入本文)中所述的2D差异凝胶电泳或者使用Zhang等,Mol Cell Proteomics,2005;4:144-155(其全文以引用方式并入本文)中所述的液相色谱质谱来分析囊泡的蛋白质生物印记。囊泡可以进行基于活性的蛋白质分型,其描述于,例如,Berger等,Am J Pharmacogenomics,2004;4:371-381中,其全文以引用方式并入本文。在其它实施方案中,囊泡可以使用Pisitkun等,Proc Natl Acad Sci U SA,2004;101:13368-13373中所述的纳米喷雾液相色谱-串联质谱来分型,其全文以引用方式并入本文。在另一个实施方案中,囊泡使用串联质谱(MS)(例如液相色谱/MS/MS(LC-MS/MS)分型,其使用,例如,LTQ和LTQ-FT离子阱质谱仪。可以按照Smalley等,J Proteome Res,2008;7:2088-2096所述比较谱计数来确定蛋白质的身份并评估相对的量,其全文以引用方式并入本文。
还可以鉴定循环蛋白质生物标志物的表达或囊泡内的蛋白质有效负载。后一分析可任选地在使用针对目标捕获群体的捕获剂进行的特定囊泡的分离之后进行。在一个实施方案中,使用免疫细胞化学染色以分析蛋白质表达。所述样品可以重悬浮于缓冲液中,使用细胞离心法在粘性玻片上在100×g下离心(例如)3分钟,以准备用于免疫细胞化学染色。可以将细胞离心涂片空气干燥过夜,并储存在-80℃下直至进行染色。然后使用无血清封闭试剂固定并封闭玻片。之后,将所述的玻片与特定抗体一起孵育,从而检测目标蛋白质的表达。在一些实施方案中,所述的囊泡在进行蛋白质表达分析之前未经纯化、分离或浓缩。
包含生物印记的囊泡有效负载可以通过分析所述囊泡中的代谢物标志物或代谢物来鉴定。已经描述了各种代谢物定向的方法,例如代谢物靶分析、代谢物分型或者代谢物指纹,例如参见Denkert等,Molecular Cancer2008;7:4598-4617、Ellis等,Analyst 2006;8:875-885、Kuhn等,Clinical Cancer Research 2007;24:7401-7406、Fiehn O.,CompFunct Genomics2001;2:155-168、Fancy等,Rapid Commun Mass Spectrom 20(15):2271-80(2006)、Lindon等,Pharm Res,23(6):1075-88(2006)、Holmes等,Anal Chem.2007年4月1日;79(7):2629-40.2007年2月27日电子出版,Erratum in:Anal Chem.2008年8月1日;80(15):6142-3、Stanley等,Anal Biochem.2005年8月15日;343(2):195-202.,等,J Biol Chem.2003年11月14日;278(46):45915-23,各文献全文以引用方式并入本文。
可以通过Jain KK:Integrative Omics,Pharmacoproteomics,and Human BodyFluids.In:Thongboonkerd V编辑,Proteomics of Human Body Fluids:Principles,Methods and Applications.Volume 1:Totowa,N.J.:Humana Press,2007中所述的系统来分析肽,其全文以引用方式并入本文。该系统可以生成在体液以及囊泡中存在的蛋白质的灵敏分子指纹。商业应用(包括色谱/质谱以及人体中所有的稳定代谢物的基准文库的使用,例如Paradigm Genetic’s Human Metabolome Project)可以用于确定代谢物生物印记。用于分析代谢谱的其它方法可以包括在美国专利No.6,683,455(Metabometrix)、美国专利申请公开号No.20070003965和20070004044(Biocrates Life Science)中所述的方法和装置,各文献全文以引用方式并入本文。其它蛋白质组分型技术在Kennedy,ToxicolLett 120:379-384(2001)、Berven等,Curr Pharm Biotechnol 7(3):147-58(2006)、Conrads等,Expert Rev Proteomics2(5):693-703、Decramer等,World J Urol 25(5):457-65(2007)、Decramer等,Mol Cell Proteomics 7(10):1850-62(2008)、Decramer等,Contrib Nephrol,160:127-41(2008)、Diamandis,J Proteome Res 5(9):2079-82(2006)、Immler等,Proteomics 6(10):2947-58(2006)、Khan等,J Proteome Res 5(10):2824-38(2006)、Kumar等,Biomarkers 11(5):385-405(2006)、Noble等,Breast Cancer Res Treat104(2):191-6(2007)、Omenn,Dis Markers 20(3):131-4(2004)、Powell等,Expert RevProteomics 3(1):63-74(2006)、Rai等,Arch Pathol Lab Med,126(12):1518-26(2002)、Ramstrom等,Proteomics,3(2):184-90(2003)、Tammen等,Breast Cancer Res Treat,79(1):83-93(2003)、Theodorescu等,Lancet Oncol,7(3):230-40(2006)或Zurbig等,Electrophoresis,27(11):2111-25(2006)中有所描述。
对于mRNA、miRNA或其它小RNA的分析而言,可以使用用于分离核酸的任何其它已知的方法分离总RNA,例如在美国专利申请公开号No.2008132694中所述的方法,其全文以引用方式并入本文。所述的方法包括但不限于用于实施基于膜的RNA纯化的试剂盒,该试剂盒是市售可得的。通常,试剂盒可以用于由细胞和组织进行小规模RNA制备(30mg或更少),用于由细胞和组织进行中等规模RNA制备(250mg组织),以及用于由细胞和组织进行大规模RNA制备(最多1g)。用于有效地分离包含小RNA的总RNA的其它市售可得的试剂盒也是可得的。这些方法可用于从囊泡中分离核酸。
或者,可以使用美国专利No.7,267,950中所述的方法来分离RNA,其全文以引用方式并入本文。美国专利No.7,267,950描述了由生物系统(细胞、细胞片段、细胞器、组织、器官或生物体)中提取RNA的方法,其中将包含RNA的溶液与RNA可以结合的基底相接触,并通过施加负压而由所述的基底上回收RNA。或者,可以使用在美国专利申请No.20050059024(其描述了小RNA分子的分离)中所述的方法来分离RNA,其全文以引用方式并入本文。其它方法在美国专利申请No.20050208510、20050277121、20070238118中有所描述,其各自均以引用方式全文并入本文。
在一个实施方案中,可以在由样品分离的囊泡的mRNA上进行mRNA表达分析。在一些实施方案中,所述的囊泡为细胞源特异性的囊泡。由囊泡所产生的表达模式可以指示给定的疾病状态、疾病阶段、治疗相关性印记或生理状况。
在一个实施方案中,一旦分离得到总RNA,则可以合成cDNA,并根据制造商的方案来进行针对特定mRNA靶的qRT-PCR分析(例如Applied Biosystem’s 分析),或者进行表达微阵列以在一个实验中观察高度复用的表达标志物集。用于建立基因表达谱的方法包括测定由基因(其可以编码蛋白质或肽)所产生的RNA的量。这可以通过定量逆转录酶PCR(qRT-PCR)、竞争性RT-PCR、实时RT-PCR、差示RT-PCR、Northern印迹分析或其它相关测试来完成。虽然可以使用单独的PCR反应来实施所述的这些技术,但是还可以扩增由mRNA产生的互补DNA(cDNA)或互补RNA(cRNA),并通过微阵列对其进行分析。
可以使用适用于检测生物样品中mRNA表达水平的任何适当的技术(包括但不限于Northern印记分析、RT-PCR、qRT-PCR、原位杂交或微阵列分析)来测量样品中miRNA产物的水平。例如,通过使用基因特异性的引物和靶cDNA,qRT-PCR实现了对少量的靶miRNA进行的灵敏且定量的miRNA测量(通过单重或多重分析),或者可以使平台适应于过使用96孔或384孔平板形式实施高通量的测量。例如参见Ross JS等,Oncologist.2008May;13(5):477-93,其全文以引用方式并入本文。大量不同的阵列构型以及用于产生微阵列的方法是本领域的技术人员已知的,并且描述于美国专利中,诸如:美国专利No.5,445,934;5,532,128;5,556,752;5,242,974;5,384,261;5,405,783;5,412,087;5,424,186;5,429,807;5,436,327;5,472,672;5,527,681;5,529,756;5,545,531;5,554,501;5,561,071;5,571,639;5,593,839;5,599,695;5,624,711;5,658,734或5,700,637,其各自以引用方式全文并入本文。miRNA分型的其它方法在Taylor等,Gynecol Oncol.2008年7月;110(1):13-21、Gilad等,PLoS ONE.2008年9月5日;3(9):e3148、Lee等,Annu Rev Pathol.2008年9月25日以及Mitchell等,Proc Natl Acad Sci U S A.20087月29日;105(30):10513-8、Shen R等,BMCGenomics.2004年12月14日;5(1):94、Mina L等,Breast Cancer Res Treat.2007年6月;103(2):197-208、Zhang L等,Proc Natl Acad Sci U S A.2008年5月13日;105(19):7004-9、Ross JS等,Oncologist.2008年5月;13(5):477-93、Schetter AJ等,JAMA.2008年1月30日;299(4):425-36、Staudt LM,N Engl J Med 2003;348:1777-85、Mulligan G等,Blood.2007年4月15日;109(8):3177-88.2006年12月21日电子出版、McLendon R等,Nature.2008年10月23日;455(7216):1061-8,以及美国专利No.5,538,848、5,723,591、5,876,930、6,030,787、6,258,569和5,804,375中有所描述,各文献全文以引用方式并入本文。在一些实施方案中,微RNA组阵列用于同步探询多种miR的表达。Exiqon mIRCURY LNA微RNA PCR系统组(Exiqon,Inc.,Woburn,MA)或来自Applied Biosystem的微RNA分析和分析系统(Foster City,CA)可用于这些目的。
微阵列技术允许同时测量数千个转录物或miRNA的稳态mRNA或miRNA水平,由此提供了用于鉴定效果(例如对非受控细胞增殖的发作、阻断或调控)的有力工具。可以使用诸如cDNA阵列和寡核苷酸阵列的双微阵列技术。这些分析的结果通常为由标记探针接收的信号强度的量度,其中所述标记探针用于检测来自样品的cDNA序列,该序列与所述微阵列上已知位置的核酸序列杂交。所述信号的强度通常与cDNA的量成比例,因此与在所述样品细胞中表达的mRNA或miRNA的量成比例。大量的此类技术是可得和可用的。用于测定基因表达的方法可见于Linsley等的美国专利No.6,271,002、Friend等的美国专利No.6,218,122、Peck等的美国专利No.6,218,114或者Wang等的美国专利No.6,004,755,其各自全文以引用方式并入本文。
可以通过对比这些强度来进行表达水平的分析。这可以通过生成测试样品中基因的表达强度与对照样品中基因的表达强度的比例矩阵来进行。所述的对照样品可以用作参照,并且可以使用考虑年龄、种族和性别的不同参照。不同的参照可以用于不同的状况或疾病、以及疾病或状况的不同阶段以及用于确定疗效。
例如,源自疾病组织的mRNA或miRNA(包括分离自患病组织的mRNA或miRNA)的基因表达强度可以与相同类型正常组织中的相同实体的表达强度作对比(例如患病乳腺组织样品对正常乳腺组织样品)。这些表达强度的比例指示了在所述测试样品与对照样品之间基因表达的倍数变化。或者,如果正常情况下囊泡并不存在于正常组织(例如乳腺)中,则如本领域已知的,可以使用绝对定量方法来定义所存在的miRNA分子的数量而无需由源自正常组织的囊泡分离的miRNA或mRNA。
此外,还可以以多种方式展示基因表达谱。常用的方法是将原始荧光强度或比例矩阵排列于树枝形图中,其中竖列表示测试样品和横行表示基因。对数据进行排列以使具有相似表达谱的基因彼此相邻。以颜色显示各基因的表达比例。例如,比例低于1(表示下调)可以显示为光谱的蓝色部分,而比例大于1(表示上调)可以显示为光谱的红色部分的颜色。市售可得的计算机软件程序可以用于展示这些数据。
被认为是差异表达的mRNA或miRNA在患病患者中相对于无疾病个体可以是过表达或表达不足的。过表达或表达不足是相对的术语,是指发现mRNA或miRNA的表达量相对于某些基线具有可检测的差异(在用于测量的系统中高出噪声影响的部分)。在这种情况下,所述的基线为非疾病个体的测量mRNA/miRNA表达。患病细胞中的目标mRNA/miRNA相对于使用相同的测量方法得到的基线水平则是过表达或表达不足的。就这一方面而言,患病的是指身体状态的改变,这种改变会在发生细胞未受控的增殖的同时打断或干扰身体功能的正确执行,或者具有干扰肌体功能正确执行的潜在可能。当个体的基因型或表型的某些方面与疾病的发生相一致时,其被诊断为患有这种疾病。然而,进行诊断或预后的活动包括对疾病/状态问题的确定,诸如确定复发或转移的可能性以及进行治疗监测。在治疗监测中,通过对比一段时间内基因的表达来确定mRNA/miRNA的表达说是否已经变为或者是否正在变为与正常组织更加一致的模式,从而对给定的疗程的效果作出临床判断。
根据杂交微阵列探针的强度测量值的倍数变化来区分过表达和表达不足的水平。为进行该区分2×差异是优选的,或者小于0.05的p值。即,在mRNA/miRNA在疾病/复发对正常/非复发细胞中差异表达之前,疾病细胞被发现产生了高出或低于所述正常细胞至少2倍的强度。倍数差异越大,所述基因作为诊断或预后的工具的应用则越优选。针对本发明的表达谱所选的mRNA/miRNA具有的表达水平通过超出了使用临床试验仪器的背景信号的量产生了与正常或非调控基因的信号可区分的信号。
统计数值可以用于可信地将调控的mRNA/miRNA与非调控的mRNA/miRNA和噪声加以区分。统计学测试发现在多种样品组之间mRNA/miRNA具有最显著的差异。Student's t检验为稳定的统计检验的实例,其可以用于发现两组之间的显著差异。p值越低,基因在不同组之间显示出差异的证据则越可信。尽管如此,由于微阵列一次测量了多于一种的mRNA/miRNA,同时可以实施数万次统计学检验。鉴于此,很少可能偶然地观察到小的p值,并可以使用Sidak校正以及随机/轮排实验作出针对这一情况的调整。根据t-检验的小于0.05的p值为基因具有显著差异的证据。更可信的证据为在包括Sidak校正的因素后p值小于0.05。对于各组中的大量样本而言,在随机/轮排检验之后p值小于0.05是具有显著性差异的最可信证据。
在一个实施方案中,可以通过由统计显著数量的患者得到mRNA或miRNA(生物标志物)表达数据;对所述的数据进行线性判别分析从而得到所选的生物标志物;并将加权的表达水平应用于具有判别函数因子的所选生物标志物以得到可以用作后验概率得分的预测模型,由此形成能够进行诊断、预后、治疗相关的或者生理状态特异性的生物印记得分的后验概率得分的方法。此外,其它分析工具也可以用于解答相同的问题,例如逻辑回归和神经网络方法。
例如,以下说明可以用于线性判别分析:
其中
I(psid)=括号内所包括的探针集以2为底的强度的对数。d(cp)=疾病阳性类的判别函数。d(CN)=疾病阴性类的判别函数。
P(CP)=疾病阳性类的后验p值。
P(CN)=疾病阴性类的后验p值。
模式识别的多种其它众所周知的方法是可用的。以下参考文献提供了一些实例:加权表决:Golub等(1999);支持向量机:Su等(2001);以及Ramaswamy等(2001);k紧邻算法:Ramaswamy(2001);以及相关系数:van't Veer等(2002),所有文献全文均以引用方式并入本文。
可以建立下文进一步描述的生物印记集合,使得所述集合中的生物标志物的组合相对于单独的生物标志物或生物标志物的随机选择的组合而言具有改善的灵敏度和特异性。在一个实施方案中,可以以倍数差异反映生物印记集合的灵敏度,例如通过在疾病状态中相对于正常状态的转录物表达所表现的。特异性可反映于对转录物表达的信号与目标状况之间的相关性进行的统计学测量中。例如,标准差异可以用作这种度量。在考虑将一组生物标志物包含在生物印记集合中,表达测量中的小标准差异与较高的特异性相关。此外,变异的其它测量(例如相关系数)也可以用于这种能力。
可以用于选择mRNA/miRNA的另一个参数为绝对信号差异的测量值的使用,其中所述的mRNA/miRNA会产生高于非调控mRNA/miRNA或噪声的信号。由调控的mRNA/miRNA表达物所产生的信号与正常的或非调控基因(在绝对值基础上)所产生的信号具有至少20%的差异。更优选的是,这种mRNA/miRNA会产生与正常的或非调控的mRNA/miRNA具有至少30%的差异的表达谱。
此外,还可以通过由生物样品进行扩增来检测和测量miRNA,并且可以使用在美国专利No.7,250,496,美国申请公开号No.20070292878,20070042380或20050222399及其中所引用的参考文献中所述的方法来测量miRNA,其各自以引用方式全文并入本文。可如2011年2月15日授权的题为“METHODS FOR ASSESSING RNA PATTERNS”的美国专利No.7,888,035评估微RNA,该申请全文以引用的方式并入本文。
可以在生物印记分析中使用肽核酸(PNA),其为合成核酸类似物的新种类,其中磷酸-糖多核苷酸主链被柔性的假肽聚合物取代。PNA能够以高亲和性和特异性杂交于互补RNA和DNA序列并且对于核酸酶与蛋白酶的降解具有高度抗性。肽核酸(PNA)是引人注目的探针新种类,其具有对人类染色体进行快速原位鉴定以及检测拷贝数变异(CNV)的细胞遗传学的应用。多色肽核酸-荧光原位杂交(PNA-FISH)方案已经描述用于鉴定几种人CNV相关的失调和感染性疾病。PNA还可以作为分子诊断的工具用于以肿瘤靶向的放射性核素-PNA-肽嵌合体非侵入性地测量致癌性mRNA。使用PNA的方法在Pellestor F等,Curr PharmDes.2008;14(24):2439-44、Tian X等,Ann N Y Acad Sci.2005年11月;1059:106-44、Paulasova P与Pellestor F,Annales de Génétique,47(2004)349–358、StenderH.Expert Rev Mol Diagn.2003年9月;3(5):649-55.综述、Vigneault等,Nature Methods,5(9),777-779(2008)中有进一步的描述,各参考文献均全文以引用方式并入本文。这些方法可以用于筛选从囊泡分离得到的遗传物质。当对细胞源特异性的囊泡应用这些技术时,它们可以用于鉴定与细胞源直接相关的给定分子信号。
可以对mRNA和DNA(包括由囊泡鉴定的那些)进行突变分析。对于RNA来源的靶或生物标志物的突变分析而言,所述的RNA(mRNA、miRNA或其它RNA)可以被逆转录成为cDNA并随后进行测序或分析,诸如针对已知的SNP(例如通过Taqman SNP分析)或单核苷酸突变进行测序和测定,以及使用测序来观察插入或删除从而确定在所述细胞源中存在的突变。多重连接依赖性的探针扩增(MLPA)可以替代地用于在小的特定目标区域中鉴定CNV的目的。例如,一旦由分离的结肠癌特异性囊泡得到总RNA,则可以合成cDNA,并且KRAS基因的外显子2和3的特异性引物可以用于扩增包含KRAS基因的密码子12、13和61的这两个外显子。用于PCR扩增的相同引物可以在ABI 3730上用于Big Dye Terminator序列分析,从而鉴定KRAS的外显子2和3中的突变。已知这些密码子中的突变赋予对药物如西妥昔单抗和帕尼单抗的抗性。实施突变分析的方法在Maheswaran S等,2008年7月2日(10.1056/NEJMoa0800668)和Orita,M等,PNAS 1989,(86):2766-70中有所描述,各文献均全文以引用方式并入本文。
实施突变分析的其它方法包括miRNA测序。鉴定和miRNA分型的应用可以通过克隆技术、以及使用毛细管DNA测序或“下一代”测序技术来实施。当前可用的新型测序技术允许鉴定低丰度miRNA或者在样品之间表现中度表达差异的miRNA,其可能不为基于杂交的方法所检出。这些新的测序技术包括在Nakano等2006,Nucleic Acids Res.2006;34:D731–D735.doi:10.1093/nar/gkj077中所述的大规模平行签名测序(MPSS)方法、Margulies等2005,Nature.2005;437:376–380中所述的Roche/454平台或者Berezikov等Nat.Genet.2006b;38:1375–1377中所述的Illumina测序平台,各文献均全文以引用方式并入本文。
用于确定生物印记的其它方法包括通过等位基因特异性PCR(其包括特异性的引物以用于同时扩增和区分基因的两个等位基因)、单链构象多态性(SSCP)(其涉及基于序列中的微小差异对单链核苷酸进行电泳分离)以及DNA和RNA适体来测定生物印记。DNA和RNA适体为短的寡核苷酸序列,该序列可以根据其以高度的亲和性结合特定分子的能力由随机库中选择。使用适体的方法在Ulrich H等,Comb Chem High Throughput Screen.2006年9月;9(8):619-32、Ferreira CS等,Anal Bioanal Chem.2008年2月;390(4):1039-50、Ferreira CS等,Tumour Biol.2006;27(6):289-301中有所描述,各文献均全文以引用方式并入本文。
还可以使用荧光原位杂交(FISH)技术来检测生物标志物。使用FISH来检测和定位特定DNA序列、在组织样品中定位特定mRNA或者鉴定染色体异常的方法在Shaffer DR等,Clin Cancer Res.2007年4月1日;13(7):2023-9、Cappuzo F等,Journal of ThoracicOncology,第2卷,第5期,2007年5月,Moroni M等,Lancet Oncol.2005年5月;6(5):279-86中有所描述,各文献均全文以引用方式并入本文。
在图63E中给出了针对其有效负载分析囊泡群体的说明性示意图。在一个实施方案中,本发明的方法包括表征表型,其通过捕获囊泡(6330)和测定其中所包含的微RNA物质的水平(6331)完成从而表征所述表型(6332)。
包含循环生物标志物或囊泡的生物印记可包含针对其的结合剂。所述的结合剂可以为DNA、RNA、适体、单克隆抗体、多克隆抗体、Fab、Fab'、单链抗体、合成抗体、适体(DNA/RNA)、类肽、zDNA、肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)、凝集素、合成或天然存在的化学化合物(包括但不限于药物和标记试剂)。
按照上文所述,结合剂可以通过与囊泡的组分相结合而用于分离或检测所述囊泡。所述的结合剂可以用于检测囊泡,例如检测细胞源特异性的囊泡。一种或多种结合剂其自身可形成结合剂谱,其提供了囊泡的生物印记。一种或多种结合剂可选自图2。例如,如果在异质囊泡群体的囊泡差异检测或分离中使用2种、3种或4种结合剂检测或分离囊泡群体,针对所述囊泡群体的特定结合剂谱提供了所述特定囊泡群体的生物印记。
作为说明性实例,可使用一种或多种结合剂检测用于表征癌症的囊泡,所述结合剂包括但不限于PSA、PSMA、PCSA、PSCA、B7H3、EpCam、TMPRSS2、mAB 5D4、XPSM-A9、XPSM-A10、半乳凝集素-3、E-选择蛋白、半乳凝集素-1或E4(IgG2aκ),或它们的任何组合。
所述结合剂还可以是针对一般囊泡生物标志物,诸如“管家蛋白”或抗原。所述生物标志物可以是CD9、CD63或CD81。例如,所述结合剂可以是针对CD9、CD63或CD81的抗体。所述结合剂还可以是针对其它蛋白质,诸如组织特异性或癌症特异性囊泡。所述结合剂可以针对PCSA、PSMA、EpCam、B7H3或STEAP。所述结合剂可以针对DR3、STEAP、epha2、TMEM211、MFG-E8、膜联蛋白V、TF、unc93A、A33、CD24、NGAL、EpCam、MUC17、TROP2或TETS。例如,所述结合剂可以是针对PCSA、PSMA、EpCam、B7H3、DR3、STEAP、epha2、TMEM211、MFG-E8、膜联蛋白V、TF、unc93A、A33、CD24、NGAL、EpCam、MUC17、TROP2或TETS的抗体或适体。
通常,各种不同的蛋白质并非平均或均一地分布于囊泡壳上。例如,参见图64,其显示了蛋白质表达模式的示意图。囊泡特异性的蛋白质通常更为常见,而癌症特异性的蛋白质是较少见的。在一些实施方案中,囊泡的捕获使用更为常见的癌症特异性较低的蛋白质来完成,诸如一种或多种管家蛋白或抗原或一般囊泡抗原(如四跨膜蛋白),并且在检测阶段使用一种或多种癌症特异性生物标志物和/或一种或多种细胞源特异性生物标志物。在另一个实施方案中,使用一种或多种癌症特异性生物标志物和/或一种或多种细胞源特异性生物标志物进行捕获,并且使用一种或多种管家蛋白或抗原或一般囊泡抗原(如四跨膜蛋白)进行检测。在实施方案中,对于捕获和检测使用相同的生物标志物。可使用针对相同生物标志物的不同结合剂,诸如结合抗原的不同表位的抗体或适体。
通过本领域已知的任何常规方法或根据本文所述,可鉴定另外的细胞结合伴体或结合剂,并且其可另外用作诊断、预后和治疗相关标志物。
作为说明性实例,可以使用一种或多种结合剂来检测用于肺癌分析的囊泡,其中所述的结合剂包括但不限于SCLC特异性适体HCA 12、SCLC特异性适体HCC03、SCLC特异性适体HCH07、SCLC特异性适体HCH01、A-p50适体(NF-KB)、西妥昔单抗、帕尼单抗、贝伐单抗、L19Ab、F16 Ab、抗CD45(抗ICAM-1、aka UV3)或L2G7 Ab(抗HGF)或它们的任何组合。
可以使用一种或多种结合剂来检测用于表征结肠癌的囊泡,其中所述的结合剂包括但不限于促血管生成因子2特异性适体、β-连环蛋白适体、TCF1适体、抗Derlin1 ab、抗RAGE、mAbgb3.1、半乳凝集素-3、西妥昔单抗、帕尼单抗、马妥珠单抗、贝伐单抗、Mac-2或它们的任何组合。
可以使用一种或多种结合剂来检测用于表征腺瘤对结肠直肠癌(CRC)的囊泡,其中所述的结合剂包括但不限于补体C3、富含组氨酸的糖蛋白、激肽原-1或半乳凝集素-3或它们的任何组合。
可以使用结合剂来检测用于表征具有低度异型增生的腺瘤对具有高度异型增生的腺瘤的囊泡,其中所述的结合剂例如但不限于半乳凝集素-3或者对这种对比具有特异性的结合剂的任何组合。
可以使用一种或多种结合剂来检测用于表征CRC对正常状态的囊泡,其中所述的结合剂包括但不限于抗ODC mAb、抗CEA mAb或Mac-2或它们的任何组合。
可使用一种或多种结合剂来检测用于表征前列腺癌的囊泡,其中所述的结合剂包括但不限于PSA、PSMA、TMPRSS2、mAB 5D4、XPSM-A9、XPSM-A10、半乳凝集素-3、E-选择蛋白、半乳凝集素-1或E4(IgG2aκ)或它们的任何组合。
可以使用一种或多种结合剂来检测用于表征黑色素瘤的囊泡,其中所述的结合剂包括但不限于曲美木单抗(Tremelimumab)(抗CTLA4)、易普利单抗(Ipilimumumab)(抗CTLA4)、CTLA-4适体、STAT-3肽适体、半乳凝集素-1、半乳凝集素-3或PNA或它们的任何组合。
可使用一种或多种结合剂来检测用于表征胰腺癌的囊泡,其中所述的结合剂包括但不限于H38-15(抗HGF)适体、H38-21(抗HGF)适体、马妥珠单抗、西妥昔单抗(Cetuximanb)或贝伐单抗或它们的任何组合。
可使用一种或多种结合剂来检测用于表征脑癌的囊泡,其中所述的结合剂包括但不限于适体III.1(pigpen)和/或TTA1(腱生蛋白-C)适体或它们的任何组合。
可使用一种或多种结合剂来检测用于表征银屑病的囊泡,其中所述的结合剂包括但不限于E-选择蛋白、ICAM-1、VLA-4、VCAM-1、αEβ7或它们的任何组合。
可使用一种或多种结合剂来检测用于表征心血管疾病(CVD)的囊泡,其中所述的结合剂包括但不限于RB007(因子IXA适体)、ARC1779(抗VWF)适体或LOX1或它们的任何组合。
可使用一种或多种结合剂来检测用于表征血液恶性肿瘤的囊泡,其中所述的结合剂包括但不限于抗CD20和/或抗CD52或它们的任何组合。
可以使用一种或多种结合剂来检测用于表征B细胞慢性淋巴细胞性白血病的囊泡,其中所述的结合剂包括但不限于利妥昔单抗、阿仑单抗、Apt48(BCL6)、R0-60、D-R15-8或它们的任何组合。
可使用一种或多种结合剂来检测用于表征B-细胞淋巴瘤的囊泡,其中所述的结合剂包括但不限于替伊莫单抗、托西莫单抗、抗CD20抗体、阿仑单抗、加利昔单抗、抗CD40抗体、依帕珠单抗、鲁昔单抗、Hu1D10、半乳凝集素-3或Apt48或它们的任何组合。
可以使用一种或多种结合剂来检测用于表征伯基特氏淋巴瘤的囊泡,其中所述的结合剂包括但不限于TD05适体、IgM mAB(38-13)或它们的任何组合。
可使用一种或多种结合剂来检测用于表征宫颈癌的囊泡,其中所述的结合剂包括但不限于半乳凝集素-9和/或HPVE7适体或它们的任何组合。
可使用一种或多种结合剂来检测用于表征子宫内膜癌的囊泡,其中所述的结合剂包括但不限于半乳凝集素-1或对子宫内膜癌具有特异性的结合剂的任何组合。
可以使用一种或多种结合剂来检测用于表征头颈癌症的囊泡,其中所述的结合剂包括但不限于(111)In-cMAb U36、抗LOXL4、U36、BIWA-1、BIWA-2、BIWA-4或BIWA-8或它们的任何组合。
可使用一种或多种结合剂来检测用于表征IBD的囊泡,其中所述的结合剂包括但不限于ACCA(抗聚糖Ab)、ALCA(抗聚糖Ab)或AMCA(抗聚糖Ab)或它们的任何组合。
可使用一种或多种结合剂来检测用于表征糖尿病的囊泡,其中所述的结合剂包括但不限于RBP4适体或对糖尿病具有特异性的结合剂的任何组合。
可使用一种或多种结合剂来检测用于表征纤维肌痛的囊泡,其中所述的结合剂包括但不限于L-选择蛋白或对纤维肌痛具有特异性的结合剂的任何组合。
可使用一种或多种结合剂来检测用于表征多发性硬化症(MS)的囊泡,其中所述的结合剂包括但不限于那他珠单抗(Tysabri)或对MS具有特异性的结合剂的任何组合。
此外,可以使用一种或多种结合剂来检测用于表征风湿病的囊泡,其中所述的结合剂包括但不限于利妥昔单抗(抗CD20 Ab)和/或凯利昔单抗(抗CD4 Ab)或对风湿病具有特异性的结合剂的任何组合。
可以使用一种或多种结合剂来检测用于表征阿尔兹海默氏病的囊泡,其中所述的结合剂包括但不限于TH14-BACE1适体、S10-BACE1适体、抗Aβ、巴匹珠单抗(AAB-001)-Elan、LY2062430(抗淀粉样蛋白βAb)-Eli Lilly或BACE1-反义或它们的任何组合。
可以使用一种或多种结合剂来检测用于表征朊病毒特异性疾病的囊泡,其中所述的结合剂包括但不限于rhuPrP(c)适体、DP7适体、硫代适体97、SAF-93适体、15B3(抗PrPScAb)、单克隆抗PrPSc抗体P1:1、1.5D7、1.6F4 Abs、mab 14D3、mab 4F2、mab 8G8或mab 12F10或它们的任何组合。
可使用一种或多种结合剂来检测用于表征脓毒症的囊泡,其中所述的结合剂包括但不限于HA-1A mAb、E-5 mAb、TNF-αMAb、阿非莫单抗或E-选择蛋白或它们的任何组合。
可使用一种或多种结合剂来检测用于表征精神分裂症的囊泡,其中所述的结合剂包括但不限于L-选择蛋白和/或N-CAM或对精神分裂症具有特异性的结合剂的任何组合。
可使用一种或多种结合剂来检测用于表征抑郁症的囊泡,其中所述的结合剂包括但不限于GPIb或对抑郁症具有特异性的结合剂的任何组合。
可使用一种或多种结合剂来检测用于表征GIST的囊泡,其中所述的结合剂包括但不限于ANTI-DOG1 Ab或对GIST具有特异性的结合剂的任何组合。
可使用一种或多种结合剂来检测用于表征食管癌的囊泡,其中所述的结合剂包括但不限于CaSR结合剂或对食管癌具有特异性的结合剂的任何组合。
可使用一种或多种结合剂来检测用于表征胃癌的囊泡,其中所述的结合剂包括但不限于钙蛋白酶nCL-2结合剂和/或drebrin结合剂或对胃癌具有特异性的结合剂的任何组合。
可使用一种或多种结合剂来检测用于表征COPD的囊泡,其中所述的结合剂包括但不限于CXCR3结合剂、CCR5结合剂、CXCR6结合剂或对COPD具有特异性的结合剂的任何组合。
可以使用一种或多种结合剂来检测用于表征哮喘的囊泡,其中所述的结合剂包括但不限于VIP结合剂、PACA结合剂、CGRP结合剂、NT3结合剂、YKL-40结合剂、S-亚硝基硫醇、SCCA2结合剂、PAI结合剂、双调蛋白结合剂或periostin结合剂或对哮喘具有特异性的结合剂的任何组合。
可使用一种或多种结合剂来检测用于表征易损斑块的囊泡,其中所述的结合剂包括但不限于Gd-DTPA-g-mimRGD(αvβ3整联蛋白结合肽)或MMP-9结合剂或对易损斑块具有特异性的结合剂的任何组合。
可使用一种或多种结合剂来检测用于表征卵巢癌的囊泡,其中所述的结合剂包括但不限于(90)Y-muHMFG1结合剂和/或OC125(抗CA125抗体)或对卵巢癌具有特异性的结合剂的任何组合。
所述结合剂还可针对一般囊泡生物标志物,诸如“管家蛋白”或抗原。所述生物标志物可以是CD9、CD63或CD81。例如,所述结合剂可以是针对CD9、CD63或CD81的抗体。所述结合剂还可以针对其它蛋白质,诸如对于前列腺特异性的或癌症特异性的囊泡。所述结合剂可以针对PCSA、PSMA、EpCam、B7H3或STEAP。例如,所述结合剂可以是针对PCSA、PSMA、EpCam、B7H3或STEAP的抗体。
此外,通过本领域已知的传统方法或根据本文所述,可鉴定另外的细胞结合伴体或结合剂,并且其可另外被用作诊断、预后和治疗相关标志物。
针对前列腺癌、GI癌症和卵巢癌的生物印记
如本文所述,包含循环生物标志物的生物印记可用于表征癌症。本章节给出了可用作生物印记(例如,用于前列腺、GI或卵巢癌症)的部分的生物标志物的非穷尽的列表。在一些实施方案中,所述循环生物标志物与囊泡或囊泡群体关联。例如,与囊泡关联的循环生物标志物可用于捕获和/或检测囊泡或囊泡群体。本章节给出了可用作生物印记(例如,用于前列腺、GI或卵巢癌症)的部分的生物标志物的非穷尽的列表。
应当理解,本文给出的生物标志物可用于其它疾病(如其它增殖性失调和其它细胞或组织起源的癌症)的生物印记中。例如,各种不同细胞类型中的转化可能由于共同事件所导致,如p53或其它肿瘤抑制因子的突变。包含细胞源生物标志物和癌症生物标志物的生物印记可用于进一步评估癌症的特性。转移性癌症的生物标志物可与细胞源生物标志物一起使用以评估转移性癌症。用于本发明的这些生物标志物包括Dawood,Novel biomarkersof metastatic cancer,Exp Rev Mol Diag 2010年7月,第10卷,第5章,第581-590页中的那些生物标志物,该出版物全文以引用的方式并入本文。
本发明的生物印记可包含依据参照而为上调的、下调的或无变化的标志物。仅仅出于说明的目的,如果所述参照是正常样品,则在所述受试者的生物印记与所述参照相比无变化的情况下所述生物印记可表明所述受试者是正常的。或者,所述生物印记可包含突变的核酸或氨基酸序列,从而使正常参照和患病样品之间所述生物印记中成分的水平相同。在另一种情况下,所述参照可以是癌症样品,从而在所述受试者的生物印记基本上类似于所述参照的情况下该受试者的生物印记表示癌症。所述受试者的生物印记可同时包含与所述参照相比上调和下调的成分。仅仅出于说明目的,如果所述参照是正常样品,则癌症生物印记可同时包含上调的致癌基因和下调的肿瘤抑制基因。囊泡标志物也可在各种不同环境下差异地表达。例如,与非癌症囊泡相比,四跨膜蛋白可在癌症囊泡中过表达,而与癌症囊泡相比,MFG-E8可在非癌症囊泡中过表达。
前列腺癌
前列腺特异性抗原(PSA)是由前列腺的细胞所产生的蛋白质。PSA在正常男性血清中存在少量的,并且其在前列腺癌(PCa)和其它前列腺失调存在的情况下通常有所升高。用于测量PSA的血液检验目前用于筛查前列腺癌,但其有效性也受到质疑。例如,前列腺感染、刺激、良性前列腺增生(BPH)、直肠指检(DRE)和新近射精可导致PSA水平提高,从而产生假阳性结果,这可能导致不必要的前列腺活组织切片检查和伴随的痛苦。BPH是PSA水平上升的常见原因。PSA可显示前列腺是否出现某些问题,但其不能有效地区分BPH和PCa。PCA3(据发现是前列腺癌细胞过表达的转录物)被认为对于PCa具有略高的特异性,但这取决于用于PSA和PCA3的截止值以及所研究的群体。
本发明提供了循环生物标志物,其可用于区分BPH和PCa。对生物标志物小组进行评估从而将BPH同PCa加以区分。所述小组可用于检测呈现特定表面标志物的囊泡。在一些实施方案中,所述表面标志物包括BCMA、CEACAM-1、HVEM、IL-1 R4、IL-10 Rb和Trappin-2中的一种或多种。可对源自血液样品的囊泡中的生物标志物的水平进行分析并随后用于区分BPH与PCa。
在另一个方面,微RNA(miR)用于区分BPH和前列腺癌。所述miR可从患者样品直接分离和/或可针对源自患者样品的囊泡中所包含的miR有效负载分析所述囊泡。所述样品可以是体液,包括精液、尿液、血液、血清或血浆。所述样品还可包括组织或活组织切片检查样品。可利用大量不同方法用于检测根据本文所述的miR。在一些实施方案中,miR小组的阵列用于同时探查多种miR的表达。例如,Exiqon mIRCURY LNA微RNA PCR系统小组(Exiqon,Inc.,Woburn,MA)可用于这类目的。区分BPH和PCa的miR与PCa样品相比可在BPH样品中过表达,其包括但不限于hsa-miR-329、hsa-miR-30a、hsa-miR-335、hsa-miR-152、hsa-miR-151-5p、hsa-miR-200a和hsa-miR-145中的一种或多种。或者,区分BPH和PCa的miR相对于BPH样品可在PCa样品中过表达,其包括但不限于hsa-miR-29a、hsa-miR-106b、hsa-miR-595、hsa-miR-142-5p、hsa-miR-99a、hsa-miR-20b、hsa-miR-373、hsa-miR-502-5p、hsa-miR-29b、hsa-miR-142-3p、hsa-miR-663、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-15a、hsa-miR-888、hsa-miR-361-3p、hsa-miR-365、hsa-miR-10b、hsa-miR-199a-3p、hsa-miR-181a、hsa-miR-19a、hsa-miR-125b、hsa-miR-760、hsa-miR-7a、hsa-miR-671-5p、hsa-miR-7c、hsa-miR-1979和hsa-miR-103中的一种或多种。
可对一种或多种上述miR的表达水平进行评估并且将其与参照水平进行比较以检测差异表达的miR,由此提供了诊断、预后或治疗诊断的结果输出。所述参照水平可以是源自正常患者(如未患前列腺疾病的患者)的外来体中的miR的水平。因此,一种或多种miR与所述参照水平不同的差异表达可表示所述样品有别于正常,例如,包含BPH或PCa。所述参照水平可以是源自BPH患者的外来体中的miR的水平。因此,一种或多种miR与所述参照水平不同的差异表达可表示所述样品有别于BPH,例如,包含正常或PCa。所述参照水平可以是源自PCa患者的外来体中的miR的水平。因此,一种或多种miR与所述参照水平不同的差异表达可表示所述样品有别于PCa,例如,包含正常或BPH。
在一些实施方案中,测试样品中的一种或多种miR的水平与在参照样品中相同miR的水平相互关联,由此提供诊断、预后或治疗诊断的结果输出。所述参照样品可包含具有BPH、PCa的一个或多个样品的miR水平,或者可来自不具有BPH或PCa的正常者。当测试样品中的一种或多种miR的水平与正常参照水平最紧密地相关时,所述测试样品可归类为正常。当所述测试样品中的一种或多种miR的水平与BPH参照水平最紧密地相关时,所述测试样品可归类为BPH。当测试样品中的一种或多种miR的水平与PCa参照水平最紧密地相关时,所述测试样品可归类为PCa。
生物印记可用于表征前列腺癌。如上文所述,前列腺癌的生物印记可以包括与前列腺癌有关的结合剂(例如图2所示);以及一种或多种其它生物标志物,例如图19所示。例如,前列腺癌的生物印记可以包括针对PSA、PSMA、TMPRSS2、mAB 5D4、XPSM-A9、XPSM-A10、半乳凝集素-3、E-半乳凝集素、半乳凝集素-1、E4(IgG2aκ)或它们的任何组合的结合剂;以及一种或多种其它生物标志物,例如一种或多种miRNA、一种或多种DNA、一种或多种与前列腺癌有关的其它肽、蛋白质或抗原,例如但不限于图19中所示。
前列腺癌的生物印记可以包括与前列腺癌有关的抗原,例如图1所示,以及一种或多种其它生物标志物,例如图19所示。前列腺癌的生物印记可以包括与前列腺癌有关的一种或多种抗原,例如但不限于KIA1、完整的纤连蛋白、PSA、TMPRSS2、FASLG、TNFSF10、PSMA、NGEP、IL-7RI、CSCR4、CysLT1R、TRPM8、Kv1.3、TRPV6、TRPM8、PSGR、MISIIR或它们的任何组合。前列腺癌的生物印记可以包括一种或多种前述的抗原以及一种或多种其它生物标志物,例如但不限于miRNA、mRNA、DNA或它们的任何组合。
前列腺癌的生物印记还可以包含一种或多种与前列腺癌有关的抗原,例如但不限于KIA1、完整的纤连蛋白、PSA、PCA3、TMPRSS2、TMPRSS2-ERG、FASLG、TNFSF10、PSMA、NGEP、IL-7RI、CSCR4、CysLT1R、TRPM8、Kv1.3、TRPV6、TRPM8、PSGR、MISIIR或它们的任何组合;以及一种或多种miRNA生物标志物,例如但不限于miR-202、miR-210、miR-296、miR-320、miR-370、miR-373、miR-498、miR-503、miR-184、miR-198、miR-302c、miR-345、miR-491、miR-513、miR-32、miR-182、miR-31、miR-26a-1/2、miR-200c、miR-375、miR-196a-1/2、miR-370、miR-425、miR-425、miR-194-1/2、miR-181a-1/2、miR-34b、let-7i、miR-188、miR-25、miR-106b、miR-449、miR-99b、miR-93、miR-92-1/2、miR-125a、miR-141、let-7a、let-7b、let-7c、let-7d、let-7g、miR-16、miR-23a、miR-23b、miR-26a、miR-92、miR-99a、miR-103、miR-125a、miR-125b、miR-143、miR-145、miR-195、miR-199、miR-221、miR-222、miR-497、let-7f、miR-19b、miR-22、miR-26b、miR-27a、miR-27b、miR-29a、miR-29b、miR-30_5p、miR-30c、miR-100、miR-141、miR-148a、miR-205、miR-520h、miR-494、miR-490、miR-133a-1、miR-1-2、miR-218-2、miR-220、miR-128a、miR-221、miR-499、miR-329、miR-340、miR-345、miR-410、miR-126、miR-205、miR-7-1/2、miR-145、miR-34a、miR-487或let-7b或它们的任何组合。
前列腺癌的生物印记还可包含一种或多种循环生物标志物,诸如与前列腺癌相关的微RNA,其包括描述于Brase等,Circulating miRNAs are correlated with tumorprogression in prostate cancer.Int J Cancer.2011年2月1日;128(3):608-16;Wach等,MiRNA profiles of prostate carcinoma detected by multi-platform miRNAscreening.Int J Cancer.2011年3月11日.doi:10.1002/ijc.26064;Gordanpour等,miR-221Is Down-regulated in TMPRSS2:ERG Fusion-positive ProstateCancer.Anticancer Res.2011年2月;31(2):403-10;Hagman等,miR-34c isdownregulated in prostate cancer and exerts tumor suppressive functions.Int JCancer.2010年12月15日;127(12):2768-76;Sun等,miR-99 Family of MicroRNAsSuppresses the Expression of Prostate-Specific Antigen and Prostate CancerCell Proliferation.Cancer Res.2011年2月15日;71(4):1313-24;Bao等,Polymorphismsinside MicroRNAs and MicroRNA Target Sites Predict Clinical Outcomes inProstate Cancer Patients Receiving Androgen-Deprivation Therapy.Clin CancerRes.2011年2月15日;17(4):928-936;Moltzahn等,Microfluidic-based multiplex qRT-PCR identifies diagnostic and prognostic microRNA signatures in the sera ofprostate cancer patients.Cancer Res.2011年1月15日;71(2):550-60;Carlsson等,Validation of suitable endogenous control genes for expression studies ofmiRNA in prostate cancer tissues.Cancer Genet Cytogenet.2010年10月15日;202(2):71-75;Zhang等,Serum miRNA-21:elevated levels in patients with metastatichormone-refractory prostate cancer and potential predictive factor for theefficacy of docetaxel-based chemotherapy.Prostate.2011年2月15日;71(3):326-31;Majid等,MicroRNA-205-directed transcriptional activation of tumor suppressorgenes in prostate cancer.Cancer.2010年12月15日;116(24):5637-49;Kojima等,MiR-34a attenuates paclitaxel-resistance of hormone-refractory prostate cancerPC3 cells through direct and indirect mechanisms.Prostate.2010年10月1日;70(14):1501-12;Lewinshtein等,Genomic predictors of prostate cancer therapyoutcomes.Expert Rev Mol Diagn.2010年7月;10(5):619-36中的微RNA;各出版物全文以引用的方式并入。
此外,前列腺癌生物印记的miRNA可以为与PFKFB3、RHAMM(HMMR)、cDNA FLJ42103、ASPM、CENPF、NCAPG、雄性激素受体、EGFR、HSP90、SPARC、DNMT3B、GART、MGMT、SSTR3、TOP2B或它们的任何组合相互作用的miRNA,例如本文所述以及图60中所示的那些。所述的miRNA也可以为miR-9、miR-629、miR-141、miR-671-3p、miR-491、miR-182、miR-125a-3p、miR-324-5p、miR-148B、miR-222或它们的任何组合。
前列腺癌的生物印记可以包含一种或多种与前列腺癌有关的抗原,例如但不限于KIA1、完整的纤连蛋白、PSA、TMPRSS2、FASLG、TNFSF10、PSMA、NGEP、IL-7RI、CSCR4、CysLT1R、TRPM8、Kv1.3、TRPV6、TRPM8、PSGR、MISIIR或它们的任何组合;以及一种或多种其它生物标志物,例如但不限于之前所述的miRNA、mRNA(例如但不限于AR或PCA3)、snoRNA(例如但不限于U50)或它们的任何组合。
此外,所述的生物印记还可以包括一种或多种基因融合,例如ACSL3-ETV1、C15ORF21-ETV1、FLJ35294-ETV1、HERV-ETV1、TMPRSS2-ERG、TMPRSS2-ETV1/4/5、TMPRSS2-ETV4/5、SLC5A3-ERG、SLC5A3-ETV1、SLC5A3-ETV5或KLK2-ETV4。
可以针对一种或多种miRNA和一种或多种与前列腺癌有关的抗原来对囊泡进行分离、分析或这两者,从而提供诊断、预后或治疗诊断谱,例如癌症的阶段、癌症的效力或癌症的其它特征。或者,可以由样品直接分析囊泡,由此在针对一种或多种miRNA或者与前列腺癌有关的抗原进行分析之前,所述的囊泡是未经纯化或浓缩的。
如图68所示,前列腺癌的生物印记可以包括分析囊泡的EpCam、CD63、CD81、CD9或它们的任何组合。所述的前列腺癌的生物印记可以包括检测EpCam、CD9、CD63、CD81、PCSA或它们的任何组合。例如,所述的前列腺癌的生物印记可以包括EpCam、CD9、CD63和CD81或PCSA、CD9、CD63和CD81(例如参见图70A)。所述的前列腺癌的生物印记还可以包括PCSA、PSMA、B7H3或它们的任何组合(例如参见图70B)。
此外,与评估少于多种生物标志物的情况相比,评估多种生物标志物可以提供增加的灵敏度、特异性或信号强度。例如,与单独评估PMSA或B7H3相比,评估PSMA和B7H3可以在检测中提供增加的灵敏度。与单独评估CD9或CD63相比,评估CD9和CD63可以在检测中提供增加的灵敏度。在一个实施方案中,检测了一种或多种以下生物标志物:EpCam、CD9、PCSA、CD63、CD81、PSMA、B7H3、PSCA、ICAM、STEAP和EGFR。在另一个实施方案中,检测了EpCam+、CK+、CD45-囊泡。
还可以根据满足至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个标准来表征前列腺癌。例如,可以使用多种不同的标准:1)是否来自受试者的样品中的囊泡的量高于参照值;2)是否前列腺细胞源的囊泡的量高于参照值;以及3)是否具有一种或多种癌症特异性生物标志物的囊泡的量高于参照值,则所述的受试者被诊断为患有前列腺癌。所述的方法可以进一步包括定性对照测量。
在另一个实施方案中,囊泡的一种或多种生物印记被用于在正常前列腺和前列腺癌之间或者在正常前列腺、BPH和PCa之间作出诊断。本文公开的任意适当的生物标志物可用于辨识PCa。在一些实施方案中,针对生物标志物(或捕获生物标志物,由捕获剂检测或结合的生物标志物)的一种或多种常用捕获剂可用于从来自受试者的样品捕获一种或多种囊泡。
前列腺特异性生物标志物可用于鉴定前列腺特异性囊泡。癌症生物标志物可用于鉴定癌症特异性囊泡。在一些实施方案中,CD9、CD81和CD63中的一种或多种被用作捕获生物标志物。在一些实施方案中,PCSA被用作前列腺生物标志物。在一些实施方案中,所述一种或多种癌症生物标志物包含EPCam和B7H3中的一种或多种。可将PCa与正常相区分的另外生物标志物包括ICAM1、EGFR、STEAP1和PSCA。
在一些实施方案中,在受试者中鉴定前列腺癌的方法包括:(a)使用捕获剂在来自所述受试者的样品中捕获囊泡群体;(b)在所述囊泡群体中测定一种或多种癌症生物标志物的水平;(c)在所述囊泡群体中测定一种或多种前列腺生物标志物的水平;以及(d)如果所述一种或多种癌症生物标志物的水平和一种或多种前列腺生物标志物的水平满足预设阈值,将所述受试者鉴定为患有前列腺癌。在一些实施方案中,所述捕获剂包含一种或多种针对CD9、CD81和CD63的结合剂。在一些实施方案中,所述一种或多种前列腺生物标志物包括PCSA和/或PSMA。在一些实施方案中,所述一种或多种癌症生物标志物包括EPCam和B7H3中的一种或多种。在其它实施方案中,所述一种或多种前列腺和/或癌症生物标志物的结合剂用作捕获剂,且所述一种或多种一般囊泡标志物的结合剂用作检测剂。在一些实施方案中,所述预设阈值包括可检测标记物的测量值。例如,可检测标记物可以是荧光部分并且所述值可以是该部分的发光值。
在另一个实施方案中,通过检测EpCam、CK(细胞角蛋白)和/或CD45的表达而确定前列腺癌的预后。在一个实施方案中,在检测出或以高水平检测出EpCam和CK并且对CD45的检测较低或不存在(即为EpCam+、CK+、CD45-的囊泡)时提供不良预后。
可使用本发明的方法区分前列腺癌的阶段和程度。前列腺癌的分期是对癌症扩散到前列腺之外的风险进行归类的过程。这种扩散与通过局部治疗(诸如手术或放射)治愈的可能性相关。在这种预后分类中所考虑的信息是基于临床和病理学因素,其包括身体检查、成像研究、血液检验和/或活组织切片检查。
用于对前列腺癌进行分期的最常用的方案由美国癌症联合会(American JointCommittee on Cancer)发布,并且称为TNM系统。所述TNM系统评估肿瘤的大小、牵涉的淋巴结的程度、转移,并且还考虑癌症等级。与多种其它癌症一样,这些癌症通常按期分组(例如I-IV期)。通常情况下,I期疾病是当前列腺组织由于其它原因(诸如良性前列腺癌增生)而取得时偶见于小部分样品中的癌症,并且细胞密切地类似于正常细胞和腺体对于检验的手指感觉正常。在II期中,牵涉到更多的前列腺并且在腺体内可感觉到团块。在III期中,肿瘤扩散至整个前列腺囊并且可在腺体的表面感觉到团块。在IV期疾病中,肿瘤已经侵入邻近结构,或者已经扩散至淋巴结或其它器官。
Whitmore-Jewett分期是目前较不常用的另一种分期方案。Gleason分级系统(Gleason Grading System)是基于来自活组织切片检查的细胞内容物和组织结构,其提供了对该疾病的破坏潜力和最终预后的估计。
所述TNM肿瘤分类系统可用于描述受试者体内癌症的程度。T描述所述肿瘤的大小以及是否其已经侵入了邻近组织,N描述牵涉的局部淋巴结,和M描述远转移。TNM由国际抗癌联盟(International Union Against Cancer)(UICC)进行维护并且由美国癌症联合会(AJCC)和国际妇产科联盟(FIGO)使用。本领域的技术人员了解,并非所有的癌症具有TNM分类,例如脑癌。通常情况下,T(a,is,(0),1-4)测定为原发肿瘤的大小或直接程度。N(0-3)指的是向局部淋巴结的扩散的程度:N0是指局部淋巴结不存在肿瘤细胞,N1是指肿瘤细胞扩散至最邻近或少数的局部淋巴结,N2是指肿瘤细胞扩散程度介于N1和N3之间;N3是指肿瘤细胞扩散至最远处或大量的局部淋巴结。M(0/1)指的是转移的存在:MX意为远转移未被评估;M0意为不存在远转移;M1意为转移已经发生于远距离器官(超出局部淋巴结)。M1可进一步描述如下:M1a表示癌症已经扩散到超出局部淋巴结的淋巴结;M1b表示癌症已经扩散至骨骼;并且M1c表示癌症已经扩散至其它部位(无论是否涉及骨骼)。也可评定其它参数。G(1-4)指的是癌细胞的等级(即,如果它们表现得类似于正常细胞则它们为低等级的,而如果它们表现为分化不良则为高等级的)。R(0/1/2)指的是手术的完全性(即,无癌细胞的切除边界与否)。L(0/1)指的是侵入到淋巴管中。V(0/1)指的是侵入到静脉中。C(1-4)指的是对V的确定性(特性)的修正符。
前列腺肿瘤通常使用Gleason评分系统进行评估。所述Gleason评分系统是基于当解释活组织切片检查标本时由病理学家评定的显微肿瘤模式。当活组织切片检查中存在前列腺癌时,所述Gleason评分是根据正常腺体组织结构(即,所述腺体的形状、大小和分化)的损失程度。经典的Gleason评分系统具有5种基本组织模式,其在技术上称为肿瘤“等级”。对由癌症导致的正常腺体结构的这一损失进行的显微检查通过等级表示,其为介于1与5之间的数字,5为最差等级。1级一般是其中癌性前列腺密切类似于正常前列腺组织的情况。腺体是小的,结构良好的(well-formed)和紧密包封的。在2级中,组织仍然具有结构良好的腺体,但是其较大并且其间具有更多的组织,而在3级中组织仍然具有可识别的腺体,但是细胞更暗。在高放大倍率下,3级样品中的一些细胞已经脱离腺体并且开始侵入周围组织。4级样品具有几乎不存在可识别的腺体的组织,并且许多的细胞正在侵入周围组织。对于5级样品,组织不具有可识别的腺体并且通常为遍及周围组织的细胞片层。
区分转移性和非转移性前列腺癌的miR相对于非转移性样品可在转移性样品中过表达。或者,区分转移性和非转移性前列腺癌的miR相对于转移性样品可在非转移性样品中过表达。对于区分转移性前列腺癌的可用miR包括miR-495、miR-10a、miR-30a、miR-570、miR-32、miR-885-3p、miR-564和miR-134中的一种或多种。在另一个实施方案中,用于区分转移性前列腺癌的miR包括hsa-miR-375、hsa-miR-452、hsa-miR-200b、hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-1296、hsa-miR-17*、hsa-miR-100、hsa-miR-574-3p、hsa-miR-20a*、hsa-miR-572、hsa-miR-1236、hsa-miR-181a、hsa-miR-937和hsa-miR-23a*中的一种或多种。在又另一个实施方案中,用于区分转移性前列腺癌的可用miRN包括hsa-miR-200b、hsa-miR-375、hsa-miR-582-3p、hsa-miR-17*、hsa-miR-1296、hsa-miR-20a*、hsa-miR-100、hsa-miR-452和hsa-miR-577中的一种或多种。用于区分转移性前列腺癌的miR可以是miR-141、miR-375、miR-200b和miR-574-3p中的一种或多种。
在另一个方面,微RNA(miR)用于区别癌症和非癌症样品。用于将癌症与非癌症加以区分的可用miR包括hsa-miR-574-3p、hsa-miR-331-3p、hsa-miR-326、hsa-miR-181a-2*、hsa-miR-130b、hsa-miR-301a、hsa-miR-141、hsa-miR-432、hsa-miR-107、hsa-miR-628-5p、hsa-miR-625*、hsa-miR-497和hsa-miR-484中的一种或多种。在另一个实施方案中,用于区分癌症和非癌症的可用miR包括hsa-miR-574-3p、hsa-miR-141、hsa-miR-331-3p、hsa-miR-432、hsa-miR-326、hsa-miR-2110、hsa-miR-107、hsa-miR-130b、hsa-miR-301a和hsa-miR-625*中的一种或多种。在又另一个实施方案中,用于区分癌症和非癌症的可用miR包括hsa-miR-107、hsa-miR-326、hsa-miR-432、hsa-miR-574-3p、hsa-miR-625*、hsa-miR-2110、hsa-miR-301a、hsa-miR-141或hsa-miR-373*中的一种或多种。用于将癌症与非癌症加以区分的生物印记可包含miR-148a、miR-122、miR-146a、miR-22和miR-24中的一种或多种。
本发明的生物印记可包含多种标志物。例如,多种蛋白质标志物和miR可用于将前列腺癌与正常、BPH和PCa加以区分,或将转移性疾病与非转移性疾病加以区分。以这一方式,可获得改善的灵敏度、特异性和/或精确性。在一些实施方案中,对患者样品中hsa-miR-432、hsa-miR-143、hsa-miR-424、hsa-miR-204、hsa-miR-581f和hsa-miR-451中的一种或多种的水平进行检测以评估前列腺癌的存在。在患有PCa的患者中这些miR中的任何miR可有所提高,但是具有<4.0ng/ml的血清PSA。在一个实施方案中,本发明提供了评估前列腺癌的方法,其包括测定来自受试者的样品中hsa-miR-432、hsa-miR-143、hsa-miR-424、hsa-miR-204、hsa-miR-581f和hsa-miR-451中的一种或多种的水平。所述样品可以是体液,例如血液、血浆或血清。可在分离自所述样品的囊泡中分离所述miR。所述受试者在血液样品中可具有低于某阈值的PSA水平,诸如2.0、2.2、2.4、2.6、2.8、3.0、3.2、3.4、3.6、3.8、4.0、4.2、4.4、4.6、4.8、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8或6.0ng/ml。高于参照样品的miR水平可表示所述样品中PCa的存在。在一些实施方案中,所述参照包含来自未患PCa的受试者的对照样品中的一种或多种miR的水平。在一些实施方案中,所述参照包含来自患者PCa并且PSA水平≥某阈值(诸如2.0、2.2、2.4、2.6、2.8、3.0、3.2、3.4、3.6、3.8、4.0、4.2、4.4、4.6、4.8、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8或6.0ng/ml)的受试者的对照样品中一种或多种miR的水平。所述阈值可以是4.0ng/ml。
本发明提供了对前列腺失调的评估,包括检测选自上文列举的生物标志物的一种或多种循环生物标志物的存在或水平。所述一种或多种循环生物标志物还可选自BCMA、CEACAM-1、HVEM、IL-1R4、IL-10Rb、Trappin-2、p53、hsa-miR-103、hsa-miR-106b、hsa-miR-10b、hsa-miR-125b、hsa-miR-142-3p、hsa-miR-142-5p、hsa-miR-145、hsa-miR-151-5p、hsa-miR-152、hsa-miR-15a、hsa-miR-181a、hsa-miR-1979、hsa-miR-199a-3p、hsa-miR-19a、hsa-miR-200a、hsa-miR-20b、hsa-miR-29a、hsa-miR-29b、hsa-miR-30a、hsa-miR-329、hsa-miR-335、hsa-miR-361-3p、hsa-miR-365、hsa-miR-373、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-502-5p、hsa-miR-595、hsa-miR-663、hsa-miR-671-5p、hsa-miR-760、hsa-miR-7a、hsa-miR-7c、hsa-miR-888、hsa-miR-99a及其组合。所述一种或多种循环生物标志物可选自以下:hsa-miR-100、hsa-miR-1236、hsa-miR-1296、hsa-miR-141、hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-17*、hsa-miR-181a、hsa-miR-200b、hsa-miR-20a*、hsa-miR-23a*、hsa-miR-331-3p、hsa-miR-375、hsa-miR-452、hsa-miR-572、hsa-miR-574-3p、hsa-miR-577、hsa-miR-582-3p、hsa-miR-937、miR-l0a、miR-134、miR-141、miR-200b、miR-30a、miR-32、miR-375、miR-495、miR-564、miR-570、miR-574-3p、miR-885-3p及其组合。更进一步,所述一种或多种循环生物标志物可选自以下:hsa-let-7b、hsa-miR-107、hsa-miR-1205、hsa-miR-1270、hsa-miR-130b、hsa-miR-141、hsa-miR-143、hsa-miR-148b*、hsa-miR-150、hsa-miR-154*、hsa-miR-181a*、hsa-miR-181a-2*、hsa-miR-18a*、hsa-miR-19b-1*、hsa-miR-204、hsa-miR-2110、hsa-miR-215、hsa-miR-217、hsa-miR-219-2-3p、hsa-miR-23b*、hsa-miR-299-5p、hsa-miR-301a、hsa-miR-301a、hsa-miR-326、hsa-miR-331-3p、hsa-miR-365*、hsa-miR-373*、hsa-miR-424、hsa-miR-424*、hsa-miR-432、hsa-miR-450a、hsa-miR-451、hsa-miR-484、hsa-miR-497、hsa-miR-517*、hsa-miR-517a、hsa-miR-518f、hsa-miR-574-3p、hsa-miR-595、hsa-miR-617、hsa-miR-625*、hsa-miR-628-5p、hsa-miR-629、hsa-miR-634、hsa-miR-769-5p、hsa-miR-93、hsa-miR-96。所述循环生物标志物可以是hsa-miR-1974、hsa-miR-27b、hsa-miR-103、hsa-miR-146a、hsa-miR-22、hsa-miR-382、hsa-miR-23a、hsa-miR-376c、hsa-miR-335、hsa-miR-142-5p、hsa-miR-221、hsa-miR-142-3p、hsa-miR-151-3p、hsa-miR-21和hsa-miR-16中的一种或多种。在一个实施方案中,所述循环生物标志物包括CD9、PSMA、PCSA、CD63、CD81、B7H3、IL 6、OPG-13、IL6R、PA2G4、EZH2、RUNX2、SERPINB3和EpCam中的一种或多种。所述生物标志物可包括FOX01A、SOX9、CLNS1A、PTGDS、XPO1、LETMD1、RAD23B、ABCC3、APC、CHES1、EDNRA、FRZB、HSPG2和TMPRSS2_ETV1融合体中的一种或多种。参见WO2010056993,该申请全文以引用的方式并入本文。在另一个实施方案中,所述循环生物标志物包括A33、a33 n15、AFP、ALA、ALIX、ALP、膜联蛋白V、APC、ASCA、ASPH(246-260)、ASPH(666-680)、ASPH(A-10)、ASPH(D01P)、ASPH(D03)、ASPH(G-20)、ASPH(H-300)、AURKA、AURKB、B7H3、B7H4、BCA-225、BCNP1、BDNF、BRCA、CA125(MUC16)、CA-19-9、C-Bir、CD1.1、CD10、CD174(Lewis y)、CD24、CD44、CD46、CD59(MEM-43)、CD63、CD66e CEA、CD73、CD81、CD9、CDA、CDAC11a2、CEA、C-Erb2、C-erbB2、CRMP-2、CRP、CXCL12、CYFRA21-1、DLL4、DR3、EGFR、Epcam、EphA2、EphA2(H-77)、ER、ErbB4、EZH2、FASL、FRT、FRT c.f23、GDF15、GPCR、GPR30、Gro-α、HAP、HBD 1、HBD2、HER 3(ErbB3)、HSP、HSP70、hVEGFR2、iC3b、IL 6 Unc、IL-1B、IL6Unc、IL6R、IL8、IL-8、INSIG-2、KLK2、L1CAM、LAMN、LDH、MACC-1、MAPK4、MART-1、MCP-1、M-CSF、MFG-E8、MIC1、MIF、MIS RII、MMG、MMP26、MMP7、MMP9、MS4A1、MUC1、MUC1seq1、MUC1seq11A、MUC17、MUC2、Ncam、NGAL、NPGP/NPFF2、OPG、OPN、p53、p53、PA2G4、PBP、PCSA、PDGFRB、PGP9.5、PIM1、PR(B)、PRL、PSA、PSMA、PSME3、PTEN、R5-CD9 Tube 1、Reg IV、RUNX2、SCRN1、seprase、SERPINB3、SPARC、SPB、SPDEF、SRVN、STAT 3、STEAP1、TF(FL-295)、TFF3、TGM2、TIMP-1、TIMP1、TIMP2、TMEM211、TMPRSS2、TNF-α、Trail-R2、Trail-R4、TrKB、TROP2、Tsg 101、TWEAK、UNC93A、VEGF A和YPSMA-1中的一种或多种。生物印记中可使用这些标志物的任意组合以评估前列腺癌。所述循环生物标志物可与囊泡关联,如囊泡表面标志物或囊泡有效负载。所述前列腺癌失调包括但不限于良性障碍(诸如BPH)或前列腺癌,包括各种不同分期和等级的癌症。例如,参见表5:
表5:用于前列腺失调的生物标志物
这些标志物的任意组合可用于生物印记中以评估前列腺失调(诸如BPH)和前列腺癌。所述生物印记还可用于评估所述前列腺癌的分期或等级。
可以使用本文公开的一种或多种方法以至少60、61、62、63、64、65、66、67、68、69或70%灵敏度来表征前列腺癌。可以以至少80、81、82、83、84、85、86或87%灵敏度来表征前列腺癌。例如,可以以至少87.1、87.2、87.3、87.4、87.5、87.6、87.7、87.8、87.9、88.0或89%灵敏度(例如以至少90%灵敏度,例如至少91、92、93、94、95、96,97,98,99或100%灵敏度)来表征前列腺癌。
还可以以至少70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96或97%特异性(例如以至少97.1、97.2、97.3、97.4、97.5、97.6、97.7、97.8、97.8、97.9、98.0、98.1、98.2、98.3、98.4、98.5、98.6、98.7、98.8、98.9、99.0、99.1、99.2、99.3、99.4、99.5、99.6、99.7、99.8、99.9或100%特异性)来表征受试者的前列腺癌。
此外,还可以以至少70%灵敏度和至少80、90、95、99或100%特异性;至少80%灵敏度和至少80、85、90、95、99或100%特异性;至少85%灵敏度和至少80、85、90、95、99或100%特异性;至少86%灵敏度和至少80、85、90、95、99或100%特异性;至少87%灵敏度和至少80、85、90、95、99或100%特异性;至少88%灵敏度和至少80、85、90、95、99或100%特异性;至少89%灵敏度和至少80、85、90、95、99或100%特异性;至少90%灵敏度和至少80、85、90、95、99或100%特异性;至少95%灵敏度和至少80、85、90、95、99或100%特异性;至少99%灵敏度和至少80、85、90、95、99或100%特异性;或者至少100%灵敏度和至少80、85、90、95、99或100%特异性来表征前列腺癌。
在一些实施方案中,所述生物印记以至少70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96或97%精确性(例如以至少97.1、97.2、97.3、97.4、97.5、97.6、97.7、97.8、97.8、97.9、98.0、98.1、98.2、98.3、98.4、98.5、98.6、98.7、98.8、98.9、99.0、99.1、99.2、99.3、99.4、99.5、99.6、99.7、99.8、99.9或100%精确性)来表征受试者的表型。
在一些实施方案中,所述生物印记以至少0.70、0.71、0.72、0.73、0.74、0.75、0.76、0.77、0.78、0.79、0.80、0.81、0.82、0.83、0.84、0.85、0.86、0.87、0.88、0.89、0.90、0.91、0.92、0.93、0.94、0.95、0.96或0.97的AUC(例如以至少0.971、0.972、0.973、0.974、0.975、0.976、0.977、0.978、0.978、0.979、0.980、0.981、0.982、0.983、0.984、0.985、0.986、0.987、0.988、0.989、0.99、0.991、0.992、0.993、0.994、0.995、0.996、0.997、0.998、0.999或1.00的AUC)来表征受试者的表型。
此外,可以以至少70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%的置信度确定用于测定特异性、灵敏度、精确性和/或AUC的置信水平。
胃肠癌症
所述胃肠(GI)道包括但不限于口腔、牙床、牙龈、舌头、唾液腺、食管、胰脏、肝脏、胆囊、小肠(十二指肠、空肠、回肠)、胆管、胃脏、大肠(盲肠、结肠、直肠)、阑尾和肛门。所述生物标志物生物印记可用于检测或表征这些组分部件的癌症,如结肠直肠癌(CRC)、胃癌、肠癌、肝癌或食管癌。胃肠(GI)道的生物印记可以包含图1中所列的任意一种或多种抗原、用于表征结肠癌的与分离的囊泡有关的任意一种或多种结合剂(例如,如图2中所示的)、任意一种或多种另外的生物标志物,如图6中所示的。
结肠癌
虽然结肠镜检查是筛查和确认结肠直肠癌(CRC)的金标准,但是据估计半数被建议进行结肠镜检查的患者并不依从。依从性的缺乏通常是由于很多人感觉结肠镜检查为不适且具侵入性的过程。可鉴别具有基于血液的生物印记(其指示通过结肠镜检查进行检测和活组织检查的需要)的患者的较低侵入性的诊断测试可改善依从性。这一策略将使得癌症更早被确认并且防止无疾病的个体受到不必要的侵入性过程。当前基于血液的测试依赖于癌胚抗原(CEA)或碳水化合物抗原决定簇(CA 19-9)的增高的水平。不幸的是,CEA和CA19-9既非器官特异性的亦非肿瘤特异性的。本发明改善使用这些标志物的基于囊泡的检测分析。
本发明提供了使用了源自来自受试者的样品的生物印记鉴定有可能患或正患有CRC的受试者的方法。所述样品可以是体液(诸如血液、血浆或血清)或者粪便。所述生物印记可包含循环生物标志物,包括与囊泡相关的生物标志物。所述生物印记可包含通过对核酸(如囊泡内包含的RNA)进行测序而检测的突变。
在本发明的一个方面,生物印记源自分离自患有和未患有CRC的患者血浆的囊泡。囊泡表面蛋白用于多重分析中以捕获和检测囊泡。具有显著浓度的这些表面蛋白的囊泡的量导致形成可区分CRC样品与正常囊泡特异性生物印记。CRC患者的血浆中存在的这些囊泡提供了可在早至组织学1级的情况下诊断CRC的印记。在一些实施方案中,使用针对各种表面蛋白的抗体捕获囊泡。捕获的囊泡可使用囊泡特异性标志物进行检测,如CD9、CD81和CD63中的一种或多种。在一些实施方案中,基于囊泡的生物印记包括测量CD9、CD81、CD63、EpCam、EGFR和STEAP中的一种或多种的水平。在一些实施方案中,将一种或多种以下标志物用于捕获和/或检测囊泡:CD9、NGAL、CD81、STEAP、CD24、A33、CD66E、EPHA2、TMEM211、TROP2、TROP2、EGFR、DR3、UNC93A、MUC17、EpCAM、MUC17、CD63、B7H3。在一些实施方案中,将一种或多种以下标志物用于捕获和/或检测囊泡:TMEM211、MUC1、GPR110(GPCR 110)、CD24、CD9、CD81和CD63。在一些实施方案中,将一种或多种以下标志物用于捕获和/或检测囊泡:DR3、STEAP、epha2、TMEM211、unc93A、A33、CD24、NGAL、EpCam、MUC17、TROP2和TETS。在一些实施方案中,TMEM211用于捕获和/或检测囊泡。在一些实施方案中,MUC1用于捕获和/或检测囊泡。在一些实施方案中,GPR110用于捕获和/或检测囊泡。在一些实施方案中,CD24用于捕获和/或检测囊泡。在一些实施方案中,将TMEM211、MUC1、GPR110(GPCR 110)和CD24中的一种或多种用于捕获囊泡并且一种或多种一般囊泡标志物用于检测所述被捕获的囊泡。
在本发明的另一方面,与囊泡相关的微RNA(miR)用于确定生物印记。所述miR可源自分离自患者样品(如血液)的囊泡(如外来体)。在一些实施方案中,一种或多种以下miR用于产生CRC生物印记:miR 92、miR 21、miR 9和miR 491。
在本发明的又另一个方面,评估了囊泡内的有效负载。KRAS和BRAF突变筛查可用于对肿瘤样品的结肠癌监测。如实施例4所示的,KRAS突变见于源自结肠细胞系囊泡的RNA。实施例5表明可在源自血浆样品的RNA囊泡中对KRAS进行测序。在一些实施方案中,对囊泡内的KRAS和/或BRAF核酸的测序可用于检测CRC。所述核酸可以是RNA,如mRNA。CRC生物印记可包括对分离自囊泡的KRAS和BRAF RNA的测序。
结肠癌的生物印记可以包括如图1中所列的针对结肠癌的任意一种或多种抗原、任意一种或多种与分离或检测用于表征结肠癌的囊泡有关的结合剂(例如图2中所示)、任意一种或多种其它生物标志物。如图6中所示。
所述的生物印记可以包括一种或多种选自miR-24-1、miR-29b-2、miR-20a、miR-10a、miR-32、miR-203、miR-106a、miR-17-5p、miR-30c、miR-223、miR-126、miR-128b、miR-21、miR-24-2、miR-99b、miR-155、miR-213、miR-150、miR-107、miR-191、miR-221、miR-20a、miR-510、miR-92、miR-513、miR-19a、miR-21、miR-20、miR-183、miR-96、miR-135b、miR-31、miR-21、miR-92、miR-222、miR-181b、miR-210、miR-20a、miR-106a、miR-93、miR-335、miR-338、miR-133b、miR-346、miR-106b、miR-153a、miR-219、miR-34a、miR-99b、miR-185、miR-223、miR-211、miR-135a、miR-127、miR-203、miR-212、miR-95或miR-17-5p或它们的任何组合中的miRNA。所述的生物印记还可以包括一种或多种表达不足的miR,例如miR-143、miR-145、miR-143、miR-126、miR-34b、miR-34c、let-7、miR-9-3、miR-34a、miR-145、miR-455、miR-484、miR-101、miR-145、miR-133b、miR-129、miR-124a、miR-30-3p、miR-328、miR-106a、miR-17-5p、miR-342、miR-192、miR-1、miR-34b、miR-215、miR-192、miR-301、miR-324-5p、miR-30a-3p、miR-34c、miR-331、miR-148b、miR-548c-5p、miR-362-3p和miR422a。
所述的生物印记可以包含评估一种或多种基因,例如EFNB1、ERCC1、HER2、VEGF和EGFR。此外,可在囊泡中评估的结肠癌的生物标志物突变还可以包括EGFR、KRAS、VEGFA、B-Raf、APC或p53的一种或多种突变。所述的生物印记还可以包括可评估的囊泡的一种或多种蛋白质、配体或肽,例如AFR、Rab、ADAM10、CD44、NG2、Ephrin-B1、MIF、b-连环蛋白、接合、盘状球蛋白、半乳凝集素-4、RACK1、四跨膜蛋白-8、FasL、TRAIL、A33、CEA、EGFR、二肽酶1、hsc-70、四跨膜蛋白、ESCRT、TS、PTEN或TOPO1。
可以分离和分析囊泡以用于提供诊断、预后或治疗诊断谱,例如癌症的阶段、癌症的效力或癌症的其它特征。或者,可以由样品直接分析囊泡,由此在针对与结肠癌有关的生物印记进行分析之前,所述的囊泡是未经纯化或浓缩的。
如图69所示,对于诸如结肠癌这样的GI癌症,生物印记可以包括检测囊泡的EpCam、CD63、CD81、CD9、CD66或它们的任何组合。此外,用于癌症的各个不同阶段的结肠癌生物印记可以包含CD63、CD9、EpCam或它们的任何组合(例如参见图71和图72)。例如,所述的生物印记可以包括CD9和EpCam。在一些实施方案中,所述GI癌症生物印记包含选自miR-548c-5p、miR-362-3p、miR-422a、miR-597、miR-429、miR-200a和miR-200b的一种或多种miRNA。如图110所示,这些miRNA可在GI癌症中过表达。所述miRNA印记可与上文所列的生物标志物相结合。所述生物印记可提供诊断、预后或治疗诊断谱,例如癌症的阶段、癌症的效力或癌症的其它特征。
本发明提供了对胃肠失调的评估,其包括检测选自上文列举的生物标志物的一种或多种循环生物标志物的存在和水平。所述一种或多种循环生物标志物可选自CD9、EGFR、NGAL、CD81、STEAP、CD24、A33、CD66E、EPHA2、铁蛋白、GPR30、GPR110、MMP9、OPN、p53、TMEM211、TROP2、TGM2、TIMP、EGFR、DR3、UNC93A、MUC17、EpCAM、MUC1、MUC2、TSG101、CD63、B7H3及其组合。所述一种或多种循环生物标志物可选自以下:DR3、STEAP、epha2、TMEM211、unc93A、A33、CD24、NGAL、EpCam、MUC17、TROP2、TETS及其组合。再进一步,所述一种或多种循环生物标志物选自以下:A33、AFP、ALIX、ALX4、ANCA、APC、ASCA、AURKA、AURKB、B7H3、BANK1、BCNP1、BDNF、CA-19-9、CCSA-2、CCSA-3&4、CD10、CD24、CD44、CD63、CD66CEA、CD66e CEA、CD81、CD9、CDA、C-Erb2、CRMP-2、CRP、CRTN、CXCL12、CYFRA21-1、DcR3、DLL4、DR3、EGFR、Epcam、EphA2、FASL、FRT、GAL3、GDF15、GPCR(GPR110)、GPR30、GRO-1、HBD 1、HBD2、HNP1-3、IL-1B、IL8、IMP3、L1CAM、LAMN、MACC-1、MGC20553、MCP-1、M-CSF、MIC1、MIF、MMP7、MMP9、MS4A1、MUC1、MUC17、MUC2、Ncam、NGAL、NNMT、OPN、p53、PCSA、PDGFRB、PRL、PSMA、PSME3、RegIV、SCRN1、Sept-9、SPARC、SPON2、SPR、SRVN、TFF3、TGM2、TIMP-1、TMEM211、TNF-α、TPA、TPS、Trail-R2、Trail-R4、TrKB、TROP2、Tsg 101、TWEAK、UNC93A和VEGFA及其组合。在一个实施方案中,所述循环生物标志物包括miR 92、miR 21、miR 9和miR 491中的一种或多种和/或hsa-miR-376c、hsa-miR-215、hsa-miR-652、hsa-miR-582-5p、hsa-miR-324-5p、hsa-miR-1296、hsa-miR-28-5p、hsa-miR-190、hsa-miR-590-5p、hsa-miR-202和hsa-miR-195中的一种或多种。在另一个实施方案中,所述循环生物标志物包括TMEM211、MUC1、CD24和/或GPR110(GPCR 110)中的一种或多种。所述循环生物标志物可与囊泡关联,如囊泡表面标志物或囊泡有效负载。所述胃肠失调包括但不限于良性失调(诸如良性息肉)或癌症(诸如结肠直肠癌),其包括各种分期和等级的癌症。例如,参见表6。
表6:用于胃肠失调的生物标志物
可以以至少60、61、62、63、64、65、66、67、68、69或70%灵敏度使用本文所述的一种或多种方法来表征结肠癌。可以以至少71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86或87%灵敏度来表征结肠癌。例如,可以以至少87.1、87.2、87.3、87.4、87.5、87.6、87.7、87.8、87.9、88.0或89%灵敏度(例如以至少90%灵敏度,例如至少91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%灵敏度)来表征结肠癌。
还可以以至少70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96或97%特异性(例如以至少97.1、97.2、97.3、97.4、97.5、97.6、97.7、97.8、97.8、97.9、98.0、98.1、98.2、98.3、98.4、98.5、98.6、98.7、98.8、98.9、99.0、99.1、99.2、99.3、99.4、99.5、99.6、99.7、99.8、99.9或100%特异性)来表征受试者的结肠癌。
还可以以至少70%灵敏度和至少80、90、95、99或100%特异性;至少80%灵敏度和至少80、85、90、95、99或100%特异性;至少85%灵敏度和至少80、85、90、95、99或100%特异性;至少86%灵敏度和至少80、85、90、95、99或100%特异性;至少87%灵敏度和至少80、85、90、95、99或100%特异性;至少88%灵敏度和至少80、85、90、95、99或100%特异性;至少89%灵敏度和至少80、85、90、95、99或100%特异性;至少90%灵敏度和至少80、85、90、95、99或100%特异性;至少95%灵敏度和至少80、85、90、95、99或100%特异性;至少99%灵敏度和至少80、85、90、95、99或100%特异性;或者至少100%灵敏度和至少80、85、90、95、99或100%特异性来表征结肠癌。
此外,用于测定特异性、灵敏度、精确性和/或其它统计性能量度的置信水平可以具有至少70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%的置信度。
卵巢癌
用于表征卵巢癌的生物印记可以包括与卵巢癌有关的抗原(例如图1所示),以及一种或多种其它生物标志物,例如图4所示。在一个实施方案中,卵巢癌的生物印记可包含一种或多种与卵巢癌相关的抗原,诸如但不限于,CD24、CA125、VEGF1、VEGFR2、HER2、MISIIR或它们的任何组合。卵巢癌的生物印记可以包括一种或多种前述的抗原以及一种或多种其它生物标志物,例如但不限于miRNA、mRNA、DNA或它们的任何组合。卵巢癌的生物印记可包含一种或多种与卵巢癌相关的抗原,诸如但不限于CD24、CA125、VEGF1、VEGFR2、HER2、MISIIR,或它们的任何组合,一种或多种miRNA生物标志物,诸如但不限于,miR-200a、miR-141、miR-200c、miR-200b、miR-21、miR-141、miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-203、miR-205、miR-214、miR-215、miR-199a、miR-140、miR-145、miR-125b-1或它们的任何组合。
卵巢癌的生物印记可包含一种或多种与卵巢癌相关的抗原,诸如但不限于CD24、CA125、VEGF1、VEGFR2、HER2、MISIIR或它们的任何组合,以及一种或多种miRNA生物标志物(诸如前述miRNA)、mRNA(诸如但不限于ERCC1、ER、TOPO1、TOP2A、AR、PTEN、HER2/neu、EGFR)、突变(包括但不限于,与KRAS和/或B-Raf相关的突变)或它们的任何组合。
可以针对一种或多种miRNA和与卵巢癌有关的一种或多种抗原来分离、分析或分离和分析囊泡,从而提供诊断、预后或治疗诊断谱。或者,可以由样品直接分析囊泡,由此在针对一种或多种与卵巢癌相关的miRNA或者抗原进行分析之前,所述的囊泡是未经纯化或浓缩的。
器官移植排斥和自身免疫状况
囊泡还可以用于确定表型,例如器官危境和/或器官移植排斥。如本文所用,器官移植包括部分器官或组织移植。可评估囊泡中存在的一种或多种生物标志物的存在、不存在或水平以监测器官排斥或成活。样品中囊泡的水平或量还可以用于评估器官排斥或成活。此外,可以以至少70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%的特异性、灵敏度或这两者来确定评估情况。例如,可以以至少97.5、97.6、97.7、97.8、97.8、97.9、98.0、98.1、98.2、98.3、98.4、98.5、98.6、98.7、98.8、98.9、99.0、99.1、998.2、99.3、99.4、99.5、99.6、99.7、99.8、99.9%的灵敏度、特异性或者这二者来确定评估情况。
可在分析之前纯化或浓缩囊泡。或者,可在不经先行纯化或浓缩的情况下直接从样品分析囊泡的水平或量。所述囊泡可以被定量。例如,可以使用对特定器官具有特异性的一种或多种结合剂来分离细胞或组织特异性的囊泡。可以针对一种或多种分子特征(例如与器官危境或器官移植排斥有关的一种或多种生物标志物)来评估细胞源特异性囊泡。可评估所存在的一种或多种生物标志物的存在、不存在或水平以监测器官排斥或成活。
可以分析一种或多种囊泡以用于评估、检测或诊断受试者的组织或器官移植的排斥。所述组织或器官移植排斥可以为超急性、急性或慢性排斥。此外,还可以分析囊泡以用于评估、检测或诊断受试者的移植物抗宿主病。所述的受试者可以为自体、同种异体或异种的组织或器官移植的接受者。
还可以分析囊泡以检测组织或器官移植的排斥。所述的囊泡可以通过组织或器官移植产生。这些组织或器官包括但不限于心脏、肺、胰腺、肾、眼睛、眼角膜、肌肉、骨髓、皮肤、软骨、骨、附属器官、毛发、脸、腱、胃、肠、静脉、动脉、分化的细胞、部分分化的细胞或干细胞。
所述的囊泡可以包括至少一种生物标志物,所述生物标志物用于评估、诊断或确定受试者对组织或器官移植的排斥的可能性或发生。生物标志物还可以用于评估、诊断或检测受试者的移植物抗宿主病。所述的生物标志物可以为蛋白质、多糖、脂肪酸或核酸(例如DNA或RNA)。所述的生物标志物可以与特定的组织或器官排斥或者系统性器官衰竭有关。可以分析多于一的生物标志物,例如,一种或多种蛋白质标志物可以与一种或多种核酸标志物结合分析。所述的生物标志物可以为细胞内或细胞外标志物。
可以针对至少一种标志物来分析所述囊泡,以用于评估、检测或诊断相关于或导致受试者中组织或器官移植排斥的细胞凋亡或坏死。
生物标志物的存在可以为受试者中组织或器官排斥的指示,其中所述的生物标志物包括但不限于CD40、CD40配体、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶前体、脂联蛋白、AMBP蛋白前体、C4b-结合蛋白质a链前体、血浆铜蓝蛋白前体、补体C3前体、补体成分C9前体、补体因子D前体、α1-B-糖蛋白、β2-糖蛋白I前体、肝素辅因子II前体、免疫球蛋白μ链C区蛋白、富含亮氨酸的α2-糖蛋白前体、色素上皮细胞源因子前体、血浆视黄醇结合蛋白前体、翻译起始因子3亚基10、核糖体蛋白L7、β-转导蛋白、1-TRAF或赖氨酰-tRNA合成酶。
也可以通过针对β-转导蛋白的存在来分析囊泡从而检测受试者的肾脏排斥。还可以通过从表达CD40的细胞中分离细胞源特异性的囊泡并检测Bcl-2或TNFα的增加以检测移植组织的排斥。
可以通过针对F1抗原标志物的存在来分析囊泡从而检测受试者对肝脏移植的排斥。不被理论所限制,具有对肝脏的特异性的F1抗原可以用于检测肝细胞源特异性的囊泡的增加。这种增加可以用作器官危境/排斥的早期指标。
此外,还可以通过分析囊泡来诊断由于骨髓和/或肺移植或其它原因引起的闭塞性细支气管炎、或移植动脉硬化/移植静脉硬化。
此外,还可以分析囊泡以用于检测、诊断或评估受试者中的自身免疫或其它免疫反应相关的表型。这种失调的实例包括但不限于系统性红斑狼疮(SLE)、盘状狼疮、狼疮性肾炎、肉样瘤病、炎性关节炎(包括幼年关节炎、类风湿性关节炎、银屑病关节炎、Reiter综合征、强直性脊柱炎和痛风性关节炎)、多发性硬化症、高IgE综合征、结节性多动脉炎、原发性胆汁性肝硬化、炎性肠病、克罗恩氏疾病、脂泻病(谷蛋白敏感性肠病)、自身免疫性肝炎、恶性贫血、自身免疫性溶血性贫血、银屑病、硬皮病、重症肌无力、自身免疫性血小板减少性紫癜、自身免疫性甲状腺炎、格雷夫斯病、桥本甲状腺炎、免疫复合体疾病、慢性疲劳免疫功能紊乱综合征(CFIDS)、多肌炎和皮肌炎、冷球蛋白血症、血栓溶解、心肌病、寻常性天疱疮、肺间质纤维化、哮喘、Churg-Strauss综合征(变应性肉芽肿)、特应性皮炎、变应性和刺激性接触性皮炎、荨麻疹、IgE介导的过敏症、动脉粥样硬化、脉管炎、特发性炎性肌病、溶血病、阿尔兹海默氏病、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经根神经病和AIDS。
来自囊泡的一种或多种生物标志物可以用于评估、诊断或确定受试者中的自身免疫或其它免疫反应相关性失调发生的可能性。所述的生物标志物可以为蛋白质、多糖、脂肪酸或核酸(例如DNA或RNA)。所述的生物标志物可以与特定自身免疫失调、系统性自身免疫失调和其它免疫反应相关性失调有关。可以分析多于一种生物标志物。例如,一种或多种蛋白质标志物可以与一种或多种核酸标志物组合分析。所述的生物标志物可以为细胞内或细胞外标志物。此外,所述的生物标志物可以用于检测、诊断或评估炎症。
对来自受试者的囊泡的分析可用于鉴定患有与哮喘、肉瘤样病、肺气肿、囊性纤维化、特发性肺纤维化、慢性支气管炎、过敏性鼻炎和肺的过敏性疾病(例如高反应性肺炎、嗜酸粒细胞性肺炎以及胶原蛋白所导致的肺纤维症)、脉管炎和自身免疫疾病(例如类风湿性关节炎)有关的炎症的受试者。
治疗诊断
根据本文所公开,公开了用于通过评估一种或多种生物标志物(包括囊泡生物标志物和/或循环生物标志物)表征受试者的表型的方法。所述生物标志物可使用对本文公开的囊泡生物标志物进行多重分析的方法加以评估。表征表型可包括提供对受试者的治疗诊断,诸如确定受试者是否被预测对治疗具有反应或被预测对治疗无反应。对治疗有反应的受试者可命名为响应者,而无反应的受试者可命名为非响应者。根据但不限于状况的一种或多种症状的改善;现有治疗的一种或多种副作用的降低;与此前的或其它的治疗相比较一种或多种症状的改善或改善率的提高;或与未进行治疗或与此前的或其它的治疗相比更长的存活期,可认为罹患所述状况的受试者是所述治疗的响应者。例如,根据有益或所需的治疗后果可认为罹患状况的受试者是所述治疗的响应者,所述治疗后果包括但不限于,一种或多种症状的改善或缓解、疾病程度的降低、疾病状态的稳定化(即,未见恶化)、预防疾病的扩散、疾病进程的延迟或减慢、疾病状态的缓解或减轻以及病程缓解(无论部分或完全),无论是可检测或非可检测的。治疗还包括与在未接受治疗或接受不同治疗的情况下所预期的存活期相比延长的存活期。
本文公开的系统和方法可用于为有需求的患者选择候选治疗。对疗法的选择可基于囊泡的一种或多种特征,诸如囊泡的生物印记、囊泡量或这两者。囊泡的定型或分型(诸如囊泡生物印记的身份、囊泡量或这两者)可用于为罹患状况的个体鉴定一种或多种候选治疗剂。例如,囊泡分型可用于确定受试者对于特定疗法(诸如在所述受试者罹患癌症的情况下的癌症疗法)是非响应者或响应者。
囊泡分型可用于对受试者提供治疗或预后,并且可根据所述诊断或预后选择疗法。或者,治疗选择可直接基于受试者的囊泡谱。此外,受试者的囊泡谱可用于追踪疾病的演化、用于评估药物效力、使现有治疗适应罹患疾病或状况的受试者或为罹患疾病或状况的受试者选择新的治疗。
受试者对治疗的反应可使用生物标志物进行评估,其包括囊泡、微RNA和其它循环生物标志物。在一个实施方案中,基于进行任何治疗前评估的受试者囊泡谱将所述受试者确定、分类或鉴定为非响应者或响应者。在预治疗期间,可将受试者分类为非响应者或响应者,由此而减少了不必要的治疗选项,并且避免了来自无效疗法的副作用。此外,可将所述受试者鉴定为对于特定治疗的响应者,并且由此囊泡分型可用于通过提供个性化治疗选项而延长受试者的存活期,改善所述受试者的症状或状况或这两者。因此,罹患状况的受试者可具有使用本文公开的一种或多种系统和方法由囊泡和其它循环生物标志物产生的生物印记,并且所述谱可随后用于确定受试者对于所述状况的特定治疗是否可能是非响应者或响应者。根据用于预测所述受试者对于最初设想用于治疗所述受试者状况的治疗是否为非响应者或响应者的生物标志物的使用,可为所述受试者选择设想用于治疗所述受试者的状况的特定治疗,或可选择其它可能更佳的治疗。
在一些实施方案中,罹患状况的受试者正受到治疗剂的治疗。可在治疗前和治疗期间的一个或多个时间点从所述受试者中获取样品。可评估包括来自所述样品的囊泡或其它生物标志物在内的生物印记并将其用于确定所述受试者对于所述药物的反应,诸如根据所述生物印记随时间的变化。如果所述受试者对于所述治疗无反应,例如,所述生物印记并未显示所述患者作出反应,则所述受试者可被分类为对于所述治疗无反应性,或为非响应者。类似地,可检测与恶化的状况相关的一种或多种生物标志物从而使所述生物印记指示患者未对所述治疗产生有利反应。在另一个实施例中,尽管进行了治疗,但与所述状况相关的一种或多种生物标志物保持不变,这显示了所述状况并未改善。因此,根据所述生物印记,可改变或调整对于所述受试者的治疗方案,包括选择不同治疗剂。
或者,可确定所述受试者对于所述治疗有反应,并且可将所述受试者分类为对于所述治疗具有反应性,或为响应者。例如,可检测与所述状况或失调的改善相关的一种或多种生物标志物。在另一实例中,与所述状况相关的一种或多种生物标志物有所变化,因而显示了改善。因此,现有的治疗可以继续。在另一个实施方案中,即使存在改善的迹象,在所述生物印记显示了另一类治疗可能更为有效的情况下可调整或改变现有的治疗。现有的治疗可结合另一治疗剂,可增加当前治疗剂的剂量,或选择不同的候选治疗或治疗剂。用于选择不同候选治疗的标准可取决于设置。在一个实施方案中,所述候选治疗可能已知对于现有治疗成功的受试者是有效的。在另一实施方案中,所述候选治疗可能已知对于具有类似生物印记的其它受试者是有效的。
在一些实施方案中,所述受试者正在受到第二、第三或更多类治疗,诸如癌症治疗。可在进行第二、第三或更多类治疗之前对所述受试者确定本发明的生物印记,以确定受试者对于所述第二、第三或更多类治疗是否为响应者或非响应者。在另一个实施方案中,在进行第二、第三或更多类治疗期间对所述受试者确定生物印记,从而确定受试者对于所述第二、第三或更多类治疗是否有反应。
本文所述的用于评估一种或多种囊泡的方法和系统可用于确定罹患状况的受试者是否对于治疗具有反应性,并且因此可用于选择改善所述状况的一种或多种症状的治疗;减少现有治疗的一种或多种副作用;与此前的或其它的治疗相比较提高一种或多种症状的改善或其改善速度;或与未进行治疗或与此前的或其它的治疗相比延长存活期。因此,本文所述的方法可通过提供个性化的治疗选项而用于延长受试者的存活期,和/或可为受试者减少不必要的治疗选项和不必要的副作用。
所述延长的存活期可以是提高的无疾病进展存活率(PFS),其指的罹患疾病(如癌症)的个体或群体在开始疗程后保持无疾病进展的机率。其可以指在指定的时间期间后所述群体中疾病可能保持稳定(如,未显示进展迹象)的个体的百分比。无进展存活率是特定治疗有效性的指示。在其它实施方案中,所述延长的存活率是无疾病存活率(DFS),其指的是罹患癌症的个体或个体组在开始特定治疗后保持无疾病的机率。其可以指在指定的时间期间后所述群体中可能无疾病的个体的百分比。无疾病存活率是特定治疗有效性的指示。可在通过类似的患者群体获得的无疾病存活率的基础上比较两种治疗策略。当描述癌症存活时,无疾病存活率通常与术语总体存活率一起使用。
根据本文所述通过囊泡分型选择的候选治疗可与非囊泡分型选择的治疗相比较,其通过将使用通过囊泡分型(B期)选择的疗法的无进展存活(PFS)与所述受试者刚刚发生进展的时间上最为接近的疗法的PFS(A期)加以比较而进行。在一种设定中,≥1.3的PFSB/PFSA比用于显示所述囊泡分型选择的疗法为受试者提供了益处(例如,参见RobertTemple,Clinical measurement in drug evaluation.Wu Ningano和G.T.Thicker编著,John Wiley and Sons Ltd.1995;Von Hoff,D.D.Clin Can Res.4:1079,1999;Dhani等,Clin Cancer Res.15:118-123,2009)。
对囊泡分型选择的治疗进行比较的其它方法可通过测定反应率(RECIST)和4个月无进展或死亡的受试者百分比而与非囊泡分型所选择的治疗进行比较。在PFS的数值的情况中使用的术语“约”指的是相对所述数值+/-百分之十(10%)的变动。与非囊泡分型选择的治疗相比,来自囊泡分型选择的治疗的PFS可扩大了至少10%、15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或至少90%。在一些实施方案中,与非囊泡分型选择的治疗相比,来自囊泡分型选择的治疗的PFS可扩大至少100%、150%、200%、300%、400%、500%、600%、700%、800%、900%或至少约1000%。在又其它的实施方案中,所述PFS比率(囊泡分型选择的疗法或新治疗的PFS/此前疗法或治疗的PFS)为至少约1.3。在再其它的实施方案中,所述PFS比率至少约为1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或2.0。在再其它的实施方案中,所述PFS比率至少约为3、4、5、6、7、8、9或10。
类似地,可在确定或未确定根据本发明的生物印记的情况下对其治疗进行选择的受试者中比较所述DFS。与非囊泡分型选择的治疗相比,来自囊泡分型选择的治疗的DFS可扩大至少10%、15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或至少90%。在一些实施方案中,与非囊泡分型选择的治疗相比,来自囊泡分型选择的治疗的DFS可扩大至少100%、150%、200%、300%、400%、500%、600%、700%、800%、900%或至少约1000%。在再其它的实施方案中,所述DFS比率(囊泡分型选择的疗法或新治疗的DFS/此前疗法或治疗的DFS)为至少约1.3。在再其它的实施方案中,所述DFS比率至少约为1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或2.0。在再其它的实施方案中,所述DFS比率至少约为3、4、5、6、7、8、9或10。
在一些实施方案中,通过微囊泡分型选择的候选治疗并未在受试者中提高所述PFS比率或DFS比率;尽管囊泡分型向受试者提供了益处。例如,在一些实施方案中,无已知的治疗可用于所述受试者。在这些情况下,囊泡分型提供了在当前未鉴定出治疗的情况下鉴定了候选治疗的方法。所述囊泡分型可将PFS、DFS或寿命延长至少1周、2周、3周、4周、1个月、5周、6周、7周、8周、2个月、9周、10周、11周、12周、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、13个月、14个月、15个月、16个月、17个月、18个月、19个月、20个月、21个月、22个月、23个月、24个月或2年。所述囊泡分型可将PFS、DFS或寿命延伸至少21/2年、3年、4年、5年或更长。在一些实施方案中,本发明的方法改善了结果从而使受试者处于缓解中。
可通过其它量度检测治疗的效能。完全反应(CR)包含了所述疾病的完全消失:在检查、扫描或其它测试中未证明疾病。部分反应(PR)指的是在体内存留某些疾病,但是在病灶大小或数量上已经减少了30%或更多。稳定疾病(SD)指的是在病灶大小和数量上保持相对不变的疾病。通常情况下,在大小上低于50%的降低或轻微的提高可被描述为稳定疾病。进行性疾病(PD)指的是在治疗时所述疾病在大小或数量上有所提高。在一些实施方案中,根据本发明的囊泡分型导致了完全反应或部分反应。在一些实施方案中,本发明的方法导致了稳定疾病。在一些实施方案中,本发明能够实现稳定疾病,而非囊泡分型导致了进行性疾病。
根据本发明的生物印记的治疗诊断可针对表型,其包括但不限于本文所列举的那些表型。表征表型包括为受试者确定治疗诊断,诸如预测受试者是否可能对治疗具有反应(“响应者”)或是否对治疗无反应(“非响应者”)。根据本文所使用,将受试者鉴定为对于治疗的“响应者”或对于所述治疗的“非响应者”包含将所述受试者分别鉴定为可能对于所述治疗有反应,或可能对于所述治疗无反应,并且无需确定所述受试者的反应的明确预测。获自受试者的一种或多种囊泡或囊泡群体用于通过评估本文公开的生物标志物(如,表7中列出的生物标志物)而确定受试者对于特定治疗是否为非响应者或响应者。对生物标志物的高或低表达水平的检测或对生物标志物的突变的检测可用于为患有状况的受试者选择候选治疗,诸如药物干预。表7包含说明性状况以及对这些状况的药物干预。该表列出了影响所述干预效力的生物标志物。可使用本发明的方法评估所述生物标志物,如,作为循环生物标志物或与囊泡相关的生物标志物。
表7:针对状况的生物标志物和药物干预的实例
癌症
囊泡生物印记可用于癌症的治疗诊断中,诸如鉴定罹患癌症的受试者对于特定的癌症治疗是否可能为响应者或非响应者。本方法可用于治疗诊断癌症包括本文所列的那些癌症(如,在上文“表型”部分)。这些癌症包括但不限于肺癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌(包括小细胞癌(燕麦细胞癌)、小细胞/大细胞癌以及混合性小细胞癌)、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌、胰腺癌、脑癌、肾癌、卵巢癌、胃癌、黑色素瘤、骨癌、胃癌、乳腺癌、胶质细胞瘤、胶质母细胞瘤、肝细胞癌、乳头状癌肾癌、头颈部鳞状细胞癌、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤或其它实体肿瘤。
癌症:生物印记
可确定生物印记以为受试者提供治疗诊断。囊泡的生物印记可包含一种或多种生物标志物,诸如但不限于,本文所述的任意一种或多种生物标志物,例如但不限于,在图1、3、6、7、9-12、14-22、25-33、50-51、53-54、59和60中列出的生物标志物。
本发明提供了鉴定生物印记以表征癌症的多种方法。本文进一步提供了生物标志物,其受到评估以鉴定所述生物印记。在一个实施方案中,用于前列腺癌的生物印记包含一种或多种以下生物标志物:EpCam、CD9、PCSA、CD63、CD81、PSMA、B7H3、PSCA、ICAM、STEAP和EGFR。在另一个实施方案中,用于将前列腺癌分类为去势抗性型(castration-resistant)的生物印记包含EpCam+、CK+、CD45-囊泡。在另一个实施方案中,用于治疗诊断小细胞肺癌的囊泡生物印记包含miR-451、miR-92a-2*、miR-147和/或miR-574-5p。在又另一个实施方案中,用于结肠直肠癌治疗诊断的生物印记包含选自miR-548c-5p、miR-362-3p、miR-422a、miR-597、miR-429、miR-200a和miR-200b的一种或多种miR。用于治疗诊断癌症的生物印记可包含CAIX、CMET、VEGFR2、VEGF、波形蛋白、CD44v6、Ckit、Axl、RET(ret原癌基因)、E钙粘蛋白和V钙粘蛋白中的一种或多种。
癌症:护理标准
来自罹患癌症的受试者的样品中的循环生物标志物(包括与囊泡相关的标志物)的生物印记可用于为所述受试者选择候选治疗。可根据本文给出的本发明的方法确定所述生物印记。在一些实施方案中,候选治疗包括对所述癌症的护理标准。所述生物印记可用于确定受试者对于特定治疗或护理标准为非反应者或反应者。所述治疗可以是癌症的治疗,诸如放射治疗、手术治疗、化疗或其组合。所述癌症治疗可以是治疗剂诸如抗癌剂或化疗方案。用于本发明的方法的癌症治疗包括但不限于表8中所列出的治疗:
表8:癌症治疗
根据表8所示,癌症治疗包括各种手术和药物治疗。抗癌剂包括药物,诸如小分子和生物制剂。本发明的方法可用于鉴定包含循环生物标志物的生物印记,其可随后用于治疗诊断目的,诸如监测治疗效力、将受试者分类为对于治疗的反应者或非反应者或选择候选治疗剂。本发明可用于为任意癌症治疗提供治疗诊断,其包括但不限于涉及表8-10中的癌症治疗的治疗诊断。可根据本发明的方法鉴定为候选治疗的癌症疗法包括但不限于表8-10中列出的化疗剂及其任意适当的组合。在一个实施方案中,所述治疗对于特定类型的癌症是特异性的,诸如表8中对于前列腺癌、结肠直肠癌、乳腺癌和肺癌所列出的的治疗。在其它的实施方案中,所述治疗对于表现出特定的生物印记的肿瘤是特异性的,而无论其起源,如包含表9-10所列的标志物或表11所列的药物相关标志物的生物印记。
本发明提供了监测癌症治疗的方法,其包括随时程(诸如治疗前和治疗后)或随着治疗后的时间鉴定受试者中的一系列生物印记。所述生物印记与参照进行比较以确定所述治疗的效力。在一个实施方案中,所述治疗选自表8-10,诸如放射、手术、化疗、生物疗法、新辅助疗法、辅助疗法或观察等待。所述参照可来自另一个体或个体组或来自相同受试者。例如,具有指示癌症治疗前的生物印记的受试者在成功的治疗后可具有指示健康状态的生物印记。相反,受试者在不成功的治疗后可具有指示癌症的生物印记。所述生物印记可随时间进行比较以确定所述受试者的生物印记是否指示状况的改善、恶化或无变化。如果所述癌症随时间恶化或无变化,则可能需要另外的治疗。例如,可在手术或放疗之外使用激素疗法以治疗更具侵袭性的前列腺癌。以下一种或多种miR可用于监测前列腺癌治疗效力的生物印记中:hsa-miR-1974、hsa-miR-27b、hsa-miR-103、hsa-miR-146a、hsa-miR-22、hsa-miR-382、hsa-miR-23a、hsa-miR-376c、hsa-miR-335、hsa-miR-142-5p、hsa-miR-221、hsa-miR-142-3p、hsa-miR-151-3p、hsa-miR-21、hsa-miR-16。以下出版物中所列的一种或多种miR可用于监测GI道癌症的治疗的生物印记中:Albulescu等,Tissular and soluble miRNAsfor diagnostic and therapy improvement in digestive tract cancers,Exp Rev MolDiag,11:1,101-120。
在一些实施方案中,本发明提供了鉴定来自受试者的样品中的生物印记以选择候选治疗剂的方法。例如,所述生物印记可表明药物相关靶标发生突变或差异性表达,由此而表明所述受试者对于特定治疗可能有反应或无反应。候选治疗可选自表8-10中确定的抗癌剂或治疗剂类别。在一些实施方案中,根据本方法确定的候选治疗选自至少以下治疗组成的组:5-氟尿嘧啶、阿巴瑞克、阿仑单抗、氨鲁米特、阿那曲唑、天冬酰胺酶、阿司匹林、ATRA、阿扎胞苷、贝伐单抗、蓓萨罗丁、比卡鲁胺、骨化三醇、卡培他滨、卡铂、塞来昔布、西妥昔单抗、化疗、胆骨化醇、顺铂、阿糖胞苷、达沙替尼、柔红霉素、地西他滨、多柔比星、表柔比星、厄洛替尼、依托泊苷、依西美坦、氟他胺、氟维司群、吉非替尼、吉西他滨、戈那瑞林、戈舍瑞林、羟基脲、伊马替尼、伊立替康、拉帕替尼、来曲唑、亮脯利特、脂质体多柔比星、甲羟孕酮、甲地孕酮、醋酸甲地孕酮、氨甲蝶呤、丝裂霉素、nab-紫杉醇、奥曲肽、奥沙利铂、紫杉醇、帕尼单抗、培门冬酶、培美曲塞、喷司他丁、索拉非尼、舒尼替尼、他莫昔芬、紫杉烷类、替莫唑胺、托瑞米芬、曲妥珠单抗、VBMCP和长春新碱。
与选择候选治疗相类似,本发明还提供了确定到底是否对癌症进行治疗的方法。例如,前列腺癌可以是非侵袭性的疾病,其实质上可能不伤害受试者。伴随雄激素去除(激素降低)的放疗是治疗局部晚期前列腺癌的标准方法。激素疗法的病状包括性无能、潮热和性欲缺乏。此外,诸如前列腺切除术这样的治疗可具有诸如性无能或失禁这样的病状。因此,本发明提供了指示癌症的侵袭性或进展(如分期或等级)的生物印记。非侵袭性癌症或局部化癌症可能无需立即治疗而是可以进行观察,如,对前列腺癌的“观察等待”。而侵袭性或晚期病灶需同时地进行更为积极的治疗方案。
可检测的生物标志物的实例以及可选择或可能加以避免的治疗剂的实例列于表9中。例如,为患有前列腺癌的受试者鉴定生物印记,其中所述生物印记包含雄激素受体(AR)的水平。AR的过表达或过量产生(诸如囊泡中mRNA水平或蛋白质水平的高水平)为提供了所述受试者的候选治疗的确定。这些治疗包括用于治疗所述受试者的药物,诸如比卡鲁胺、氟他胺、亮脯利特或戈舍瑞林。所述受试者因此被确定为对于比卡鲁胺、氟他胺、亮脯利特或戈舍瑞林的反应者。在另一个说明性实例中,在来自罹患NSCLC的受试者的囊泡中检测出高水平的BCRP mRNA、蛋白质或两者。所述受试者因而可被确定为药物顺铂和卡铂的非反应者,或者所述药物被认为在所述受试者中对于治疗NSCLC效力低于其它药物并且不被选择用于治疗所述受试者。可在获自受试者的囊泡中评估下列任意生物标志物,并且所述生物标志物可以为包括但不限于一种或多种核酸、多肽、肽或拟肽物质的形式。在又另一个说明性实例中,KRAS、BRAF、PIK3CA和/或c-kit中的一种或多种的突变可用于选择候选治疗。例如,患者中KRAS或BRAF的突变可表明西妥昔单抗和/或帕尼单抗可能在治疗所述患者中较为低效。
表9:生物标志物、谱系和药物的实例
可检测的生物标志物以及可根据所述生物印记加以选择或可能加以避免的其它治疗剂的实例列于表10中。例如,对于罹患癌症的受试者,在来自受试者的囊泡中检测到ADA的过表达用于将所述受试者分类为对于喷司他丁的响应者,或用于将喷司他丁鉴定为用于治疗所述受试者的药物。在另一个实施方案中,对于罹患癌症的受试者,在来自所述受试者的囊泡中检测到BCRP的过表达用于将所述受试者分类为对于顺铂、卡铂、伊立替康和托泊替康的非响应者,这意味着顺铂、卡铂、伊立替康和托泊替康被鉴定为对于治疗所述受试者非最佳的药物。
表10:生物标志物、药物和抗性的实例
本发明的实施方案中使用的进一步药物关联与规则可见于2010年2月12日提交的美国专利申请12/658,770;2010年2月11日提交的国际PCT专利申请PCT/US2010/000407;2010年10月27日提交的国际PCT专利申请PCT/US2010/54366;以及2010年12月28日提交的美国临时专利申请61/427,788;全部申请全文以引用的方式并入本文。例如,参见PCT/US2010/54366中的“Table 4:Rules Summary for Treatment Selection”。
任意药物关联靶标可以是用于提供治疗诊断的生物印记的一部分。包含可使用治疗剂(诸如小分子和生物制品)进行调节的靶的“可用药靶(druggable target)”是包含在本发明的生物印记中的候选者。药物关联靶标还可包括可导致对治疗的抗性的生物标志物,诸如表9和10中所示出的。所述生物印记可基于基因(如,DNA序列)和/或基因产物(如mRNA或蛋白质)或者所述药物关联靶标。这些核酸和/或多肽可就其存在与否、水平或量、活性、突变、序列、单倍型、重排、拷贝数或其它可测量特征中的可适用特征进行分型。所述基因或基因产物可与囊泡群体相关联,例如,作为囊泡表面标志物或囊泡有效负载。在一个实施方案中,本发明提供了治疗诊断癌症的方法,其包括鉴定生物印记(其包含一种或多种药物关联靶标的存在情况或水平)以及根据所述生物印记选择候选治疗剂。所述药物关联靶标可以是循环生物标志物、囊泡或囊泡相关生物标志物。由于药物关联靶标可能与组织或细胞源无关,因此包含药物关联靶标的生物印记可用于提供对于任意增殖性疾病的治疗诊断,诸如来自各种不同解剖学起源的癌症,包括未知源的癌症,诸如CUPS。
使用本发明的方法评估的药物关联靶标包括但不限于:ABCC1、ABCG2、ACE2、ADA、ADH1C、ADH4、AGT、AR、AREG、ASNS、BCL2、BCRP、BDCA1、βIII微管蛋白、BIRC5、B-RAF、BRCA1、BRCA2、CA2、小窝蛋白、CD20、CD25、CD33、CD52、CDA、CDKN2A、CDKN1A、CDKN1B、CDK2、CDW52、CES2、CK 14、CK 17、CK 5/6、c-KIT、c-Met、c-Myc、COX-2、细胞周期蛋白D1、DCK、DHFR、DNMT1、DNMT3A、DNMT3B、E-钙粘蛋白、ECGF1、EGFR、EML4-ALK融合体、EPHA2、表皮调节素、ER、ERBR2、ERCC1、ERCC3、EREG、ESR1、FLT1、叶酸受体、FOLR1、FOLR2、FSHB、FSHPRH1、FSHR、FYN、GART、GNRH1、GNRHR1、GSTP1、HCK、HDAC1、hENT-1、Her2/Neu、HGF、HIF1A、HIG1、HSP90、HSP90AA1、HSPCA、IGF-1R、IGFRBP、IGFRBP3、IGFRBP4、IGFRBP5、IL13RA1、IL2RA、KDR、Ki67、KIT、K-RAS、LCK、LTB、淋巴毒素β受体、LYN、MET、MGMT、MLH1、MMR、MRP1、MS4A1、MSH2、MSH5、Myc、NFKB1、NFKB2、NFKBIA、ODC1、OGFR、p16、p21、p27、p53、p95、PARP-1、PDGFC、PDGFR、PDGFRA、PDGFRB、PGP、PGR、PI3K、POLA、POLA1、PPARG、PPARGC1、PR、PTEN、PTGS2、RAF1、RARA、RRM1、RRM2、RRM2B、RXRB、RXRG、SPARC、SRC、SSTR1、SSTR2、SSTR3、SSTR4、SSTR5、存活素、TK1、TLE3、TNF、TOP1、TOP2A、TOP2B、TS、TXN、TXNRD1、TYMS、VDR、VEGF、VEGFA、VEGFC、VHL、YES1和ZAP70,以及它们的任意组合。包括这些标志物中的一种或组合的生物印记可用于根据本发明表征表型,诸如提供治疗诊断。已知这些标志物在多种化疗剂对抗增殖性疾病的效力中发挥作用。因此,可对所述标志物进行评估以针对所述癌症独立于癌症来源或类型选择候选治疗。在一个实施方案中,本发明提供了针对癌症选择候选治疗剂的方法,其包括鉴定包含一种或多种药物关联靶标的水平或存在的生物印记,以及根据其对于具有所述生物印记的患者的预期效力而选择候选治疗剂。所述一种或多种药物关联靶标可以是上文所列或表9-11中示出的靶标之一。在一些实施方案中,评估所述一种或多种药物关联靶标中的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、45或至少50种。所述一种或多种药物关联靶可以核酸(如DNA、mRNA)或蛋白质的形式与囊泡相关,例如,作为囊泡表面标志物或囊泡有效负载。在一些实施方案中,评估了已知与所述一种或多种药物关联靶标相互作用的微RNA的存在或水平,其中已知抑制所述一种或多种药物关联靶标的高水平微RNA可表示所述一种或多种药物关联靶标的较低表达,并且由此提示了对针对所述药物关联靶标的治疗的反应可能较低。所述一种或多种药物关联靶标可以是循环生物标志物。所述一种或多种药物关联靶标可以在组织样品中评估。可通过将所述一种或多种药物关联靶标的存在和水平与参照值相比较而确定所述预期效力,其中高于所述参照的水平提示所述受试者可能是响应者。可使用分类算法确定所述预期效力,其中通过将已知对于所述候选治疗是响应者或非响应者的受试者中的一种或多种药物关联靶标的生物印记加以比较而训练所述分类器。所述一种或多种药物关联靶标与适当的候选靶标的分子关联示于本文的表9-10中以及2010年2月12日提交的美国专利申请12/658,770;2010年2月11日提交的国际PCT专利申请PCT/US2010/000407;2010年10月27日提交的国际PCT专利申请PCT/US2010/54366;以及2010年12月28日提交的美国临时专利申请61/427,788之中;全部申请全文以引用的方式并入本文。
表11提供了根据本发明的方法进行分析的许多治疗诊断靶标的基因和对应的蛋白质代号和名称的列表。根据本领域的技术人员所理解,基因和蛋白质在科技文献中已经演变出大量的替代性名称。因此,表11中的列举包含了说明性但非穷尽的汇总。基因别名和描述的进一步列表可使用多种在线数据库寻获,其包括(www.genecards.org)、HUGO Gene Nomenclature(www.genenames.org)、Entrez Gene(www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=gene)、UniProtKB/Swiss-Prot(www.uniprot.org)、UniProtKB/TrEMBL(www.uniprot.org)、OMIM(www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=OMIM)、GeneLoc(genecards.weizmann.ac.il/geneloc/)以及Ensembl(www.ensembl.org)。一般地,下文的基因代号和名称通常对应于HUGU所核准的代号和名称,并且蛋白质名称是由UniProtKB/Swiss-Prot建议的名称。还提供了常用代称。在蛋白质名称表示前体的情况下,还包含了成熟的蛋白质。在本申请的全文中,基因和蛋白质代号可互换地使用并且所述含义在必要时可从上下文推知。
表11:用于癌症治疗诊断的基因和相关蛋白质
已知在癌症中起作用并可包含于本发明的生物印记中的基因和基因产物包括但不限于2AR、解聚素、甲状腺和维甲酸受体激活剂(ACTR)、ADAM 11、脂肪生成抑制因子(ADIF)、α6整合素亚基、αV整合素亚基、α-连环蛋白、乳腺癌扩增物1(AIB1)、乳腺癌扩增物3(AIB3)、乳腺癌扩增物4(AIB4)、淀粉样前体蛋白分泌酶(APPS)、AP-2γ、APPS、ATP结合框转运体(ABCT),胎盘特异性的(ABCP)、ATP结合框亚家族C成员(ABCC1)、BAG-1、BASIGIN(BSG)、BCEI、B细胞分化因子(BCDF)、B细胞白血病2(BCL-2)、B-细胞刺激因子-2(BSF-2)、BCL-1、BCL-2相关X蛋白(BAX)、BCRP、β1整合素亚基、β3整合素亚基、β5整合素亚基、β-2干扰素、β-连环蛋白、β-连环蛋白、骨涎蛋白(BSP)、乳腺癌雌激素诱导型序列(BCEI)、乳腺癌抗性蛋白(BCRP)、乳腺癌1型(BRCA1)、乳腺癌2型(BRCA2)、乳腺癌扩增序列2(BCAS2)、钙粘蛋白、表皮钙粘蛋白-11、钙粘蛋白相关蛋白、降钙素受体(CTR)、钙胎盘蛋白(CAPL)、钙细胞周期蛋白(CALCYCLIN)、CALLA、CAM5、CAPL、癌胚抗原(CEA)、连环蛋白,α1、组织蛋白酶B、组织蛋白酶D、组织蛋白酶K、组织蛋白酶L2、组织蛋白酶O、组织蛋白酶O1、组织蛋白酶V、CD10、CD146、CD147、CD24、CD29、CD44、CD51、CD54、CD61、CD66e、CD82、CD87、CD9、CEA、细胞视黄醇结合蛋白1(CRBP1)、C-ERBB-2、CK7、CK8、CK18、CK19、CK20、紧密连接蛋白-7、c-Met、胶原酶、成纤维细胞、胶原酶,间质性、胶原酶、常见急性淋巴细胞性白血病抗原(CALLA)、连接蛋白26(Cx26)、连接蛋白43(Cx43)、皮层肌动蛋白、COX-2、CTLA-8、CTR、CTSD、细胞周期蛋白D1、环氧合酶-2、细胞角蛋白18、细胞角蛋白19、细胞角蛋白8、细胞毒性T淋巴细胞相关丝氨酸酯酶8(CTLA-8)、分化抑制活性(DIA)、乳腺癌中的DNA扩增物1(DAM1)、DNA拓扑异构酶IIα、DR-NM23、E-钙粘蛋白、细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(EMMPRIN)、EMS1、血管内皮细胞生长因子(ECGR),血小板源性(PD-ECGF)、脑啡肽、表皮生长因子受体(EGFR)、EPISIALIN、上皮细胞膜抗原(EMA)、ER-α、ERBB2、ERBB4、ER-β、ERF-1、红系增强活性(EPA)、ESR1、雌激素受体-α、雌激素受体-β、ETS-1、细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(EMMPRIN)、纤连蛋白受体,β多肽(FNRB)、纤粘连蛋白受体β亚基(FNRB)、FLK-1、GA15.3、GA733.2、半乳凝集素-3、γ-连接蛋白、间隙连接蛋白(26kDa)、间隙连接蛋白(43kDa)、间隙连接蛋白α-1(GJA1)、间隙连接蛋白β-2(GJB2)、GCP1、明胶酶A、明胶酶B、明胶酶(72kDa)、明胶酶(92kDa)、胶质抑制剂(GLIOSTATIN)、糖皮质激素受体相互作用蛋白1(GRIP1)、谷胱甘肽-S-转移酶p、GM-CSF、粒细胞趋化蛋白1(GCP1)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、生长因子受体结合物-7(GRB-7)、GSTp、HAP、热休克蛋白70(HSC70)、热稳定抗原、肝细胞生长因子(HGF)、肝细胞生长因子受体(HGFR)、肝细胞刺激因子III(HSF III)、HER-2、HER2/neu、HERMES抗原、HET、HHM、体液恶性高钙血症(HHM)、ICERE-1、INT-1、细胞间粘附分子-1(ICAM-1)、γ-干扰素诱导因子(IGIF)、白介素-1α(IL-1A)、白介素-1β(IL-1B)、白介素-11(IL-11)、白介素-17(IL-17)、白介素-18(IL-18)、白介素-6(IL-6)、白介素-8(IL-8)、雌激素受体表达负相关1(ICERE-1)、KAI1、KDR、角蛋白8、角蛋白18、角蛋白19、KISS-1、白血病抑制因子(LIF)、LIF、炎性乳腺癌缺失物(LIBC)、LOT(“转化缺失”)、淋巴细胞归巢受体、巨噬细胞集落刺激因子、MAGE-3、乳腺球蛋白、MASPIN、MC56、M-CSF、MDC、MDNCF、MDR、黑色素瘤细胞粘附分子(MCAM)、膜金属内肽酶(MME)、膜相关中性内肽酶(NEP)、富含半胱氨酸蛋白(MDC)、转移蛋白(METASTASIN)(MTS-1)、MLN64、MMP1、MMP2、MMP3、MMP7、MMP9、MMP11、MMP13、MMP14、MMP15、MMP16、MMP17、膜突蛋白、单核细胞精氨酸-丝氨酸蛋白酶抑制剂、单核细胞源中性粒细胞趋化因子、单核细胞源性纤溶酶原激活物抑制剂、MTS-1、MUC-1、MUC18、粘蛋白样癌相关抗原(MCA)、MUCIN、MUC-1、多药耐药蛋白1(MDR,MDR1)、多药耐药相关蛋白1(MRP,MRP-1)、N-钙粘蛋白、NEP、NEU、中性内肽酶、中性粒细胞激活肽1(NAP1)、NM23-H1、NM23-H2、NME1、NME2、核受体共激活因子1(NCOA-1)、核受体共激活因子-2(NCOA-2)、核受体共激活因子-3(NCOA-3)、核苷二磷酸激酶A(NDPKA)、核苷二磷酸激酶B(NDPKB)、抑瘤素M(OSM)、鸟氨酸脱羧酶(ODC)、破骨细胞分化因子(ODF)、破骨细胞分化因子受体(ODFR)、骨连接蛋白(OSN,ON)、骨桥蛋白(OPN)、催产素受体(OXTR)、p27/Kip1、p300/CBP COINTEGRATOR相关蛋白(P/CIP)、P53、p9Ka、PAI-1、PAI-2、甲状旁腺腺瘤1(PRAD1)、甲状旁腺激素样激素(PTHLH)、甲状旁腺激素相关肽(PTHrP)、P-钙粘蛋白、PD-ECGF、PDGF、花生反应性尿粘蛋白(PUM)、p-糖蛋白(P-GP)、PGP-1、PHGS-2、PHS-2、PIP、盘状球蛋白、纤溶酶原激活物抑制剂(1型)、纤溶酶原激活物抑制剂(2型)、纤溶酶原激活剂(组织型)、纤溶酶原激活剂(尿激酶型)、血小板糖蛋白IIIa(GP3A)、PLAU、多形性腺瘤基因样1(PLAGL1)、多形上皮粘蛋白(PEM)、PRAD1、孕激素受体(PGR)、孕激素抗性、前列腺素内过氧化物合成酶-2、前列腺素G/H合成酶-2、前列腺素H合成酶-2、pS2、PS6K、牛皮癣素(PSORIASIN)、PTHLH、PTHrP、RAD51、RAD52、RAD54、RAP46、受体相关共激活因子3(RAC3)、雌激素受体活性抑制物(REA)、S100A4、S100A6、S100A7、S6K、SART-1、骨架附着因子B(SAF-B)、散射因子(SF)、分泌型磷酸蛋白-1(SPP-1)、分泌蛋白,酸性富含半胱氨酸(SPARC)、STANNICALCIN、类固醇受体共激活因子1(SRC-1)、类固醇受体共激活因子2(SRC-2)、类固醇受体共激活因子3(SRC-3)、类固醇受体RNA激活剂(SRA)、基质分解素-1、基质分解素-3、腱生蛋白-C(TN-C)、睾丸特异性蛋白酶50、凝血栓蛋白I、凝血栓蛋白II、胸腺嘧啶磷酸化酶(TP)、甲状腺激素受体活化分子1(TRAM-1)、紧密连接蛋白1(TJP1)、TIMP1、TIMP2、TIMP3、TIMP4、组织因子(TF)、组织型纤溶酶原激活剂、TN-C、TP53、tPA、转录中间因子2(TIF2)、三叶因子1(TFF1)、TSG101、TSP-1、TSP1、TSP-2、TSP2、TSP50、肿瘤细胞胶原酶刺激因子(TCSF)、肿瘤相关上皮粘蛋白、uPA、uPAR、尿激酶、尿激酶型纤溶酶原激活剂、尿激酶型纤溶酶原激活剂受体(uPAR)、桑椹胚粘着蛋白(UVOMORULIN)、血管内皮生长因子、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)、血管内皮生长因子-A、血管通透因子、VEGFR2、极晚期T细胞抗原β(VLA-β)、波形蛋白、玻连蛋白受体α多肽(VNRA)、玻连蛋白受体、血管性血友病因子、VPF、VWF、WNT-1、ZAC、ZO-1和闭锁带-1。所述基因和/或基因产物可以是用于治疗诊断癌症的生物印记的一部分。
作为说明,可以为罹患非小细胞肺癌的受试者选择治疗。可从来自所述受试者的囊泡评估一种或多种生物标志物,诸如但不限于,EGFR、切除修复交叉互补组1(ERCC1)、p53、Ras、p27、III类β微管蛋白、乳腺癌基因1(BRCA1)、乳腺癌基因1(BRCA2)以及核糖核苷还原酶信使1(RRM1)。根据所述一种或多种生物标志物的一种或多种特征,可将所述受试者确定为针对治疗(诸如但不限于厄洛替尼、卡铂、紫杉醇、吉非替尼或其组合)的响应者或非响应者。
在另一个实施方案中,可为罹患结肠直肠癌的受试者选择治疗,并且可从来自所述受试者的囊泡评估生物标志物,诸如但不限于K-ras。根据所述一种或多种生物标志物的一种或多种特征,可将所述受试者确定为针对治疗(诸如但不限于帕尼单抗、西妥昔单抗或其组合)的响应者或非响应者。
在另一个实施方案中,可以为罹患乳腺癌的受试者选择治疗。可从来自所述受试者的囊泡评估一种或多种生物标志物,诸如但不限于HER2、拓扑异构酶IIα、雌激素受体以及黄体激素受体。根据所述一种或多种生物标志物的一种或多种特征,可将所述受试者确定为针对治疗(诸如但不限于曲妥珠单抗、蒽环类、紫杉烷、甲氨蝶呤、氟尿嘧啶或其组合)的响应者或非响应者。
如所描述的,用于治疗诊断癌症的生物印记可包括对一种或多种生物标志物(其可以是蛋白质或核酸)的分析,包括mRNA或微RNA。可在体液中检测所述生物标志物,并且/或者可检测与囊泡相关的生物标志物,如,作为囊泡抗原或囊泡有效负载。在一个说明性的实例中,所述生物印记用于将患者鉴定为对于酪氨酸激酶抑制剂的响应者或非响应者。所述生物标志物可以是在2010年4月19日提交的题为“METHODS AND KITS TO PREDICTTHERAPEUTIC OUTCOME OF TYROSINE KINASE INHIBITORS”的WO/2010/121238;或2009年2月19日提交的题为“SYSTEMS AND METHODS OF CANCER STAGING AND TREATMENT”的WO/2009/105223中描述的一种或多种生物标志物,两申请全文均以引用的方式并入本文。
在一个方面,本发明提供了测定受试者对于酪氨酸激酶抑制剂是否可能有反应或无反应的方法,所述方法包括在来自所述受试者的样品的囊泡群体中鉴定一种或多种生物标志物,其中与参照相比所述一种或多种生物标志物在所述样品中的差异表达显示所述受试者对于所述酪氨酸激酶抑制剂是响应者或非响应者。在一个实施方案中,所述一种或多种生物标志物包含miR-497,其中miR-497表达的降低指示所述受试者是响应者(即,对于所述酪氨酸激酶抑制剂敏感)。在另一个实施方案中,所述一种或多种生物标志物包含miR-21、miR-23a、miR-23b和miR-29b中的一种或多种,其中所述微RNA的上调指示所述受试者可能是非响应者(即,对所述酪氨酸激酶抑制剂有抗性)。在一些实施方案中,所述一种或多种生物标志物包含hsa-miR-029a、hsa-let-7d、hsa-miR-100、hsa-miR-1260、hsa-miR-025、hsa-let-7i、hsa-miR-146a、hsa-miR-594-Pre、hsa-miR-024、FGFR1、MET、RAB25、EGFR、KIT和VEGFR2中的一种或多种。在另一个实施方案中,所述一种或多种生物标志物包含FGF1、HOXC10或LHFP,其中所述生物标志物的较高表达指示所述受试者是非响应者(即,对所述酪氨酸激酶抑制剂有抗性)。所述方法可用于测定癌症对于所述酪氨酸激酶抑制剂的敏感性,例如,非小细胞肺癌细胞、肾癌或GIST。所述酪氨酸激酶抑制剂可以是厄洛替尼、凡德他尼、舒尼替尼和/或索拉非尼,或通过类似作用机制工作的其它抑制剂。酪氨酸激酶抑制剂包括以特异性或非特异性方式抑制一种或多种酪氨酸激酶的作用的任何药物。酪氨酸激酶抑制剂包括小分子、抗体、肽或任意适当实体,其直接地、间接地、变构地或以任意其它方式抑制酪氨酸残基的磷酸化。酪氨酸激酶抑制剂的特定实例包括N-(三氟甲基苯基)-5-甲基异噁唑-4-甲酰胺、3-[(2,4-二甲基吡咯-5-基)亚甲基)二氢吲哚-2-酮、17-(烯丙氨基)-17-去甲氧基格尔德霉素、4-(3-氯-4-氟苯基氨基)-7-甲氧基-6-[3-(4-吗啉基)丙氧基]q-喹唑啉、N-(3-乙炔基苯基)-6,7-二(2-甲氧基乙氧基)-4-喹唑啉胺、BIBX1382、2,3,9,10,11,12-六氢-10-(羟甲基)-10-羟基-9-甲基-9,12-环氧-y-lH-[1,2,3-fg:3',2',1'-kl]吡咯并[3,4-i][l,6]苯并二氨芳辛-1-酮、SH268、染料木黄酮、STI571、CEP2563、4-(3-氯苯基氨基)-5,6-二甲基-7H-吡咯并[2,3-d〕嘧啶甲烷磺酸酯、4-(3-溴-4-羟基苯基)氨基-6,7-二甲氧基喹唑啉、4-(4'-羟基苯基)氨基-6,7-二甲氧基喹唑啉、SU6668、STI571A、N-4-氯苯基-4-(4-吡啶基甲基)-1-酞嗪胺(phthalazinamine)、N-[2-(二乙胺基)乙基]-5-[(z)-(5-氟-1,2-二氢-2-氧代-3H-吲哚-3-亚基)甲基]-2,4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺(通常称为舒尼替尼)、A-[-A-[[4-氯-3-(三氟甲基)苯基]-甲氨酰氨基]-苯氧基}-N-甲基-吡啶-2-甲酰胺(通常称为索拉非尼)、EMD121974和N-(3-乙炔基苯基)-6,7-双(2-甲氧基乙氧基)喹唑啉-4-胺(通常称厄洛替尼)。在一些实施方案中,所述酪氨酸激酶抑制剂对于表皮生长因子受体(EGFR)、VEGFR、PDGFRβ和/或FLT3具有抑制活性。
因此,可根据通过本发明的方法鉴定的生物印记为罹患癌症的受试者选择治疗。因此,所述生物印记可包含循环生物标志物(包括微RNA、囊泡或任何可用的囊泡相关生物标志物)的存在或水平。
心血管
评估囊泡可用于心血管状况、失调或疾病的治疗诊断。心血管状况包括但不限于,慢性风湿性心脏病、高血压病、缺血性心脏病、肺循环疾病、心脏病、脑血管疾病、动脉、小动脉和毛细血管疾病以及静脉和淋巴系统疾病。慢性风湿性心脏病包括但不限于,二尖瓣疾病、主动脉瓣疾病、二尖瓣及主动脉瓣疾病以及其它心内膜结构疾病。高血压疾病包括但不限于、原发性高血压、恶性高血压、良性高血压、不明高血压、高血压性心脏病、高血压性肾病、不明高血压性肾病并发肾衰竭、高血压性心脏及肾脏疾病、恶性肾血管高血压和良性肾血管高血压。缺血性心脏病包括但不限于急性心肌梗塞,急性前外侧心肌梗塞、急性前壁心肌梗塞、急性下外侧心肌梗塞、急性下后壁心肌梗塞、急性下壁心肌梗塞、急性其它下壁心肌梗塞、急性其它侧壁心肌梗塞、急性正后壁心肌梗塞、急性心内膜下心肌心肌梗塞、急性spec心肌梗塞、急性不明心肌梗塞、心肌梗塞后综合征、中间冠脉综合征、陈旧性心肌梗塞、心绞痛、卧位型心绞痛、变异型心绞痛、冠状动脉粥样硬化、心脏动脉瘤和夹层、心脏壁瘤、冠状动脉瘤、冠状动脉夹层和不明的慢性缺血性心脏疾病。
肺循环疾病包括但不限于,肺循环的疾病、急性肺心病、非医源性肺栓塞、慢性肺心病以及不明慢性肺心病。心脏病包括但不限于急性心包炎、其它和不明急性心包炎、急性非特异性心包炎、急性和亚急性心内膜炎、急性细菌性心内膜炎急性心肌炎、其它和非特异性急性心肌炎、先天性心肌炎、其它心包疾病、其它心内膜疾病、二尖瓣瓣膜障碍、主动脉瓣瓣膜障碍、三尖瓣瓣膜障碍、肺动脉瓣瓣膜障碍、心肌病、肥厚型梗阻性心肌病、传导障碍、三度房室传导阻滞、一度房室传导阻滞、莫氏II房室传导阻滞、文氏房室传导阻滞、左束支传导阻滞、右束支传导阻滞、窦心脏传导阻滞、异常房室传导激发、预激综合征、心脏心率失常、阵发性室上性心动过速、心房纤颤和扑动、心房纤颤、心房扑动、心室纤颤和扑动、心室纤颤、心脏停搏、早搏、其它特定心率不齐、病态窦房结综合征、窦性心动过缓、不明心率失常、奔马律、心力衰竭、充血性心力衰竭、急性肺水肿、收缩期不明心力衰竭、急性收缩性心力衰竭、慢性收缩性心力衰竭、舒张期不明心力衰竭、舒张慢性心力衰竭、合并不明心力衰竭和心脏肥大。
脑血管疾病包括但不限于,蛛网膜下腔出血、脑内出血、其它和不明的颅内出血、颅内出血、大脑前动脉闭塞和狭窄、基底动脉闭塞及狭窄、颈动脉的闭塞和狭窄、椎动脉的闭塞和狭窄、脑动脉闭塞、脑血栓形成、无脑梗死性脑血栓形成、脑梗死性脑血栓形、脑栓塞、无脑梗死性脑栓塞、脑梗死性脑栓塞、短暂性脑缺血、基底动脉综合征、椎动脉综合征、锁骨下动脉窃血综合征、椎基底动脉综合征、短暂性脑缺血发作、急性不明确的脑血管疾病、不明确的脑血管疾病、脑动脉粥样硬化、其它广义缺血性脑血管疾病、高血压脑病、未破裂的脑动脉瘤、脑动脉炎、烟雾病、颅内静脉窦非生脓性血栓形成、短暂性全面遗忘症、脑血管疾病的后期效果、认知缺陷、言语和语言缺陷、不明音语和语言缺陷、失语、吞咽困难、其它言语和语言缺陷、偏瘫/轻偏瘫、不明侧偏瘫、惯用侧偏瘫、非惯用侧偏瘫、上肢单瘫、下肢单瘫、其它麻痹综合征、脑血管疾病的其它后期影响、脑血管疾病失用症、脑血管疾病吞咽困难、面瘫、共济失调和眩晕。
动脉、小动脉和毛细血管疾病包括但不限于动脉粥样硬化、肾动脉动脉粥样硬化性、自体四肢动脉动脉粥样硬化、间歇性跛行、无溃疡四肢动脉粥样硬化、非心脑动脉粥样硬化、主动脉瘤、主动脉夹层、破裂腹主动脉瘤、无破裂腹主动脉动脉瘤、不明主动脉动脉瘤、其它动脉瘤、其它外周血管疾病、雷诺氏综合征(raynaud's syndrome)、血栓闭塞性脉管炎、其它动脉夹层、颈内动脉夹层、髂动脉夹层、肾动脉夹层、椎动脉夹层、其它动脉夹层、红斑性肢痛症、不明的外周血管疾病、动脉栓塞和血栓形成、结节性多动脉炎及相关状况、结节性多动脉炎、川崎病/急性发热性皮肤粘膜淋巴结综合征、过敏性脉管炎、古德帕斯丘综合征、致死性中线肉芽肿、韦格纳氏肉芽肿、巨细胞动脉炎、血栓性微血管病、Takayasu病、其它动脉和微动脉疾病、获得性动静脉瘘、不明动脉炎、血管炎、非肿瘤性血管痣。
静脉和淋巴系统疾病包括但不限于,静脉炎和血栓性静脉炎、股深静脉血栓形成、其它腿部静脉的深静脉血栓形成、上肢浅静脉的其它部位的静脉炎、不明的血栓性静脉炎、门静脉血栓形成、其它静脉栓塞和血栓形成、不明的深静脉血栓形成、近端深静脉血栓形成、远端深静脉血栓形成、不明的静脉栓塞、下肢静脉曲张、无溃疡静脉曲张、无炎症性静脉曲张、无溃疡无炎症性静脉曲张、无症状静脉曲张、痔疮、内痔不伴并发症、外痔不伴并发症、外痔栓塞、其它部位静脉曲张性痔疮、食管静脉曲张无出血、食管静脉曲张无出血、精索静脉曲张、淋巴管非感染性障碍、乳腺切除术后淋巴水肿综合征、低血压、体位性低血压、医源性低血压、其它循环系统障碍、其它特定循环系统障碍以及不明的静脉功能不全。
心脏状况的其它实例包括但不限于,冠状动脉闭塞(例如,由于血脂/胆固醇沉积、巨噬细胞/炎症细胞募集、斑块破裂、血栓形成、血小板沉积或血管内膜增生导致的或与其相关的);缺血综合征(例如,由于心肌梗塞、稳定型心绞痛、不稳定型心绞痛、冠状动脉再狭窄或再灌注损伤导致的或与其相关的);心肌病(例如,由于缺血综合征、心脏毒素、感染、高血压、代谢性疾病(如尿毒症、脚气病或糖原贮积病)、辐射、神经肌肉疾病、浸润性疾病(如类肉瘤病、血色素沉着病、淀粉样变性病、Fabry氏病或Hurler氏综合征)、创伤或先天性原因导致的或与其相关的);心率失常或心率不齐(例如,由于缺血性综合征、心脏毒素、阿霉素、感染、高血压、代谢性疾病、辐射、神经肌肉疾病、浸润性疾病、创伤或先天性原因导致的或与其相关的);感染(例如,由致病剂所引起,如细菌、病毒、真菌或寄生虫);炎症状况(例如,与心肌炎、心包炎、心内膜炎、免疫性心脏排斥相关的或由先天性、自身免疫性或结缔组织疾病之一所导致的炎性状况)。
心血管:生物印记
可评估囊泡的生物印记而为受试者提供治疗诊断。所述囊泡的生物印记可包含一种或多种生物标志物,诸如但不限于,本文所述的任一种或多种生物标志物,如但不限于,在图24中列出的生物标志物、miR-21、miR-129、miR-212、miR-214、miR-134以及其它,诸如描述于美国公开号No.2010/0010073中的生物标志物。
心血管:护理标准
对来自罹患心脏状况、失调或疾病的受试者的样品的囊泡生物印记、囊泡量或两者进行测定可用于为所述受试者选择护理标准。所述护理标准可包括治疗剂或过程(如,血管成形术)。治疗剂的实例包括但不限于,血管形成促进剂(如,血管内皮生长因子、一氧化氮释放剂或生成剂、成纤维细胞生长因子、血小板源生长因子、白介素6、单核细胞趋化蛋白1、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、转化生长因子β)、抗血栓形成剂(如,阿司匹林、肝素、PPACK、依诺肝素、水蛭素)、抗凝血剂、抗生素、抗血小板剂、溶栓剂(如,组织型纤溶酶原激活剂)、抗增殖剂、抗炎剂、抑制增生的药物、抑制再狭窄的药物、平滑肌细胞抑制剂、生长因子、生长因子抑制剂、细胞粘附抑制剂、化疗剂及它们的组合。
例如,对一种或多种微RNA生物标志物(诸如miR-21、miR-129、miR-212、miR-214、miR-134或它们的组合)的检测可用于表征心肌肥厚和/或心力衰竭,其提供了用于所述心肌肥厚的治疗诊断。所述治疗诊断可包括对诸如施用血管形成促进剂这样的疗法的选择。治疗的其它实例包括用于治疗胆固醇和甘油三酯血液水平异常的治疗,诸如表12中所列的。
表12:用于心血管状况治疗的药物类别的实例
在一个实施方案中,可以为罹患外周动脉疾病的受试者选择治疗。可通过来自所述受试者的囊泡评估一种或多种生物标志物,诸如但不限于,C反应蛋白(CRP)、血清淀粉样蛋白A(SAA)、白介素6、细胞内粘附分子(ICAM)、血管粘附分子(VCAM)、CD40L、纤维蛋白原、纤维蛋白D-二聚体、血纤肽A、von Willibrand因子、组织型纤溶酶原激活剂抗原(t-PA)、因子VII、凝血酶原片段1、氧化低密度脂蛋白(oxLDL)和脂蛋白A。根据所述一种或多种生物标志物的一种或多种特征,可将所述受试者确定为针对治疗(诸如但不限于阿伐他汀、辛伐他汀、罗苏伐他汀、普伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀或其组合)的响应者或非响应者。
在另一个实施方案中,可以为罹患心率不齐的受试者选择治疗。可通过来自所述受试者的囊泡评估一种或多种生物标志物,诸如但不限于SERCA、AAP、连接蛋白40、连接蛋白43、ATP敏感型钾通道、Kv1.5通道和乙酰胆碱激活钾通道。根据所述一种或多种生物标志物的一种或多种特征,可将所述受试者确定为对于治疗的响应者或非响应者,所述治疗诸如,但不限于,丙吡胺、氟卡尼、利多卡因、美西律、莫雷西嗪、普鲁卡因胺、盐酸普罗帕酮、奎宁、妥卡尼、醋丁洛尔、倍他洛尔、比索洛尔、卡维地洛、艾司洛尔、美托洛尔、纳多洛尔、普萘洛尔、索他洛尔、噻吗洛尔、胺碘达隆、阿齐利特、苄普地尔、多非利特、伊布利特、替地沙米、硫氮酮、维拉帕米、阿齐利特、决奈达隆、胺碘达隆、PM101、ATI-2042、替地沙米、尼非卡兰、氨巴利特、艾生利特、曲西利特、阿莫兰特、D-索他洛尔、BRL-32872、HMR1556、L768673、Vernakalant、AZD70009、AVE0118、S9947、NIP-141/142、XEN-D0101/2、雷诺嗪、吡西卡尼、JTV519、罗替加肽、GAP-134或它们的组合。
在另一个实施方案中,可以为罹患凝血功能异常的受试者选择治疗。可从来自所述受试者的囊泡中评估一种或多种生物标志物,诸如但不限于F1.2、TAT、FPA、β血小板球蛋白、血小板因子4、可溶性P-选择蛋白、IL-6和CRP。根据所述一种或多种生物标志物的一种或多种特征,可将所述受试者确定为针对治疗(诸如但不限于阿司匹林、抗凝血剂、希美加群、肝素、华法林或其组合)的响应者或非响应者。
在另一个实施方案中,可以为罹患早产儿动脉粥样硬化(PrematureAtherosclerosis)的受试者选择治疗。可从来自所述受试者的囊泡评估一种或多种生物标志物,诸如但不限于CRP、NF-kB、IL-1、IL-6、IL-18、Apo-B、Lp-PLA2、纤维蛋白原、Hcy和Hcy-硫代内酯。根据所述一种或多种生物标志物的一种或多种特征,可将所述受试者确定为针对治疗的响应者或非响应者。
在又另一个实施方案中,可以为罹患高血压的受试者选择治疗。可从来自所述受试者的囊泡评估一种或多种生物标志物,诸如但不限于脑利钠肽和N末端激素原BNP。根据所述一种或多种生物标志物的一种或多种特征,可将所述受试者确定为针对治疗的响应者或非响应者。
在另一个实施方案中,可以为罹患心血管疾病的受试者选择治疗。可从来自所述受试者的囊泡评估一种或多种生物标志物,诸如但不限于ACE抑制剂或血管紧张素。根据所述一种或多种生物标志物的一种或多种特征,可将所述受试者确定为针对治疗(诸如但不限于赖诺普利、坎地沙坦、依那普利或其组合)的响应者或非响应者。
因此,可根据受试者的囊泡的生物印记为罹患心脏病学相关状况或心血管状况的所述受试者选择治疗。
自身免疫
评估囊泡可用于自身免疫状况、失调或疾病的治疗诊断。自身免疫状况是哺乳动物的免疫系统开始与其自身组织发生反应的状况。这些状况包括但不限于,系统性红斑狼疮(SLE)、盘状狼疮、狼疮性肾炎、结节病、炎症性关节炎(包括幼年型关节炎、类风湿性关节炎、银屑病关节炎、Reiter综合征、强直性脊柱炎和痛风性关节炎)、多发性硬化症、超IgE综合征、结节性多动脉炎、原发性胆汁性肝硬化肝硬化、炎症性肠病、克罗恩氏病、脂泻病(谷蛋白敏感性肠病)、自身免疫性肝炎、恶性贫血、自身免疫性溶血性贫血、牛皮癣、硬皮病、重症肌无力、自身免疫性血小板减少性紫癜、自身免疫性甲状腺炎、格雷夫斯病、桥本氏甲状腺炎、免疫复合物病、慢性疲劳免疫功能障碍综合征(CFIDS)、多发性肌炎和皮肌炎、冷球蛋白血症、血栓溶解、心肌病、寻常型天疱疮、肺间质纤维化、哮喘、Churg-Strauss综合征(变应性肉芽肿)、特应性皮炎、过敏性和刺激性接触性皮炎、荨麻疹、IgE介导型过敏、动脉粥样硬化、脉管炎、特发性炎症性肌病、溶血性疾病、阿尔兹海默氏病、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病、南美锥虫病、慢性阻塞性肺病、皮肌炎、1型糖尿病、子宫内膜异位症、古德帕斯丘综合征、格雷夫斯氏病、格-巴二氏综合征(gbs)、桥本氏病、化脓性汗腺炎、川崎氏症、IgA肾病、特发性血小板减少性紫癜、间质性膀胱炎、红斑狼疮i、混合结缔组织病、硬斑病、重症肌无力、发作性睡病、神经性肌强直、寻常型天疱疮、恶性贫血、银屑病、银屑病关节炎、多发性肌炎、原发性胆汁性肝硬化、类风湿性关节炎、精神分裂症、硬皮病、斯耶格伦氏综合征、僵人综合征、颞动脉炎、溃疡性结肠炎、血管炎、白癜风、韦格纳肉芽肿和AID。
自身免疫:生物印记
可评估囊泡的生物印记以为受试者提供治疗诊断。所述囊泡的生物印记可包含一种或多种生物标志物,诸如但不限于,诸如图1中针对自身免疫疾病所列举的生物标志物,或其它自身免疫疾病的生物标志物,诸如但不限于图23、34、35、36、39、41、42和56中所列的生物标志物。
自身免疫:护理标准
对来自罹患自身免疫状况、失调或疾病的受试者的样品的囊泡生物印记、囊泡量或两者进行测定可用于为所述受试者选择护理标准。大多数自身免疫疾病尚不能直接地治疗,而是根据与所述状况关联的症状进行治疗。护理标准包括,例如,开具皮质类固醇药物、非甾体类抗炎药物(NTHE)或更为强力的免疫抑制药物,诸如环磷酰胺、甲氨蝶呤和咪唑硫嘌呤,所述药物抑制免疫应答并且阻止疾病的进展。对淋巴结的照射和血浆置换(将患病细胞和有害分子从血液循环中去除的措施)是治疗自身免疫疾病的其它方式。
可基于来自受试者的生物标志物的分型加以选择的用于治疗自身免疫疾病的药物或药剂的实例包括表13中用于罹患糖尿病的受试者的药物,表14中用于罹患多发性硬化症的药物。
表13:用于糖尿病治疗的药物类别的实例
表14:用于多发性硬化症治疗的药物类别
在一个实施方案中,对来自囊泡的miR-326的检测可用于表征多发性硬化症,并且可为所述受试者选择选自表14的一种或多种治疗。在另一个实施方案中,所述表征可包括选择诸如干扰素β-1b和干扰素β-1a的疗法。
在另一个实施方案中,可以为罹患类风湿性关节炎的受试者选择治疗。可从来自所述受试者的囊泡评估一种或多种生物标志物,诸如但不限于677CC/1298AA MTHFR、677CT/1298AC MTHFR、677CT MTHFR、G80AA RFC-1、3435TT MDR1(ABCB1)、3435TT ABCB1、AMPD1/ATIC/ITPA、IL1-RN3、HLA-DRB103、CRP、HLA-D4、HLA DRB-1、含抗瓜氨酸表位肽、抗A1/RA33、红细胞沉降率(ESR)、C反应蛋白(CRP)、SAA(血清淀粉样相关蛋白)、类风湿因子、IL-1、TNF、IL-6、IL-8、IL-1Ra、透明质酸、聚集蛋白聚糖、Glc-Gal-PYD、骨保护素、RNAKL、软骨寡聚基质蛋白(COMP)和钙卫蛋白。根据所述一种或多种生物标志物的一种或多种特征,可将所述受试者确定为治疗(诸如但不限于甲氨蝶呤、英夫利昔单抗、阿达木单抗、依那西普、柳氮磺吡啶或其组合)的反应者或非反应者。
因此,可根据受试者的囊泡的生物印记为罹患自身免疫状况的受试者选择治疗。
感染性疾病
对囊泡的评估可用于治疗诊断感染性疾病,诸如细菌性、病毒性或其它感染性状况或疾病。感染性或寄生虫病可源于细菌、病毒、真菌或其它寄生虫感染。例如,所述的疾病或状况可以为惠普尔氏病、朊病毒疾病、肝硬化、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、HIV、肝炎、梅毒、脑膜炎、疟疾、结核病或流行性感冒。
感染性或寄生虫疾病可包括但不限于肠感染疾病、结核、动物传染的细菌性疾病、其它细菌性疾病、人免疫缺陷病毒hiv感染、脊髓灰质炎以及其它非节肢动物传播的中枢神经系统病毒性疾病、皮疹所伴随的病毒性疾病、节肢动物传播的病毒性疾病、由于病毒和衣原体导致的其它疾病、立克次氏体属及其它节肢动物传播疾病、梅毒和其它性病、其它螺旋体疾病、霉菌病、蠕虫病、其它感染性和寄生虫疾病,以及感染性和寄生虫疾病的后期效果。肠感染性疾病包括但不限于霍乱、伤寒和副伤寒、沙门氏菌胃肠炎、志贺氏菌病、不明志贺氏菌病、葡萄球菌属食物中毒、阿米巴病、急性阿米巴痢疾(未述及脓肿)、慢性肠道阿米巴病(未述及脓肿)、非痢疾性阿米巴性结肠炎、阿米巴肝脓肿、阿米巴肺脓肿、阿米巴脑脓肿、阿米巴性皮肤溃疡、其它部位的阿米巴感染、不明的阿米巴病、小袋纤毛虫病、贾第虫病、球虫病、肠滴虫病、隐孢子虫病、圆孢球虫病、不明原生动物性肠病、由其它生物所致的肠道感染、由于轮状病毒所致的肠炎、由其它病毒肠炎所致的肠炎、未另外分类的由其它生物体所致的肠感染、不明确的肠感染、结肠炎肠炎和推测感染源的胃肠炎。
人免疫缺陷病毒感染包括但不限于,具明确状况的人免疫缺陷病毒感染、导致其它明确明确状况的人免疫缺陷病毒感染以及其它人免疫缺陷病毒感染。
脊髓灰质炎和其它非节肢动物传播的中枢神经系统病毒性疾病包括但不限于,急性脊髓灰质炎、中枢神经系统的慢病毒感染、苦鲁病(kuru)、克雅氏病、由于肠病毒所致的脑膜炎、中枢神经系统的其它肠病毒疾病以及其它非节肢动物传播的中枢神经系统病毒性疾病。皮疹所伴随的病毒性疾病包括但不限于天花、牛痘和副牛痘疹、水痘、带状疱疹、单纯疱疹、生殖器疱疹、疱疹性龈口炎、无并发症的疱疹性疾病、麻疹、风疹、其它病毒性疹病、五号病、不明病毒性皮疹、婴儿玫瑰疹、其它人疱疹病毒性脑炎、其它人疱疹病毒感染、其它痘病毒感染、其它痘病毒感染、猴痘、其它副痘病毒感染、牛口炎、海豹痘、亚塔痘病毒感染、特纳河痘、雅巴猴肿瘤病毒、其它痘病毒感染以及不明的痘病毒感染。
节肢动物传播的病毒性疾病包括但不限于,黄热病、登革热、蚊媒病毒性脑炎、蚊媒不明病毒性脑炎、蜱媒病毒性脑炎、其它及不明节肢动物传播的病毒性脑炎、节肢动物传播的出血热、不明埃博拉病、其它节肢动物传播的病毒性疾病以及不明西尼罗河病毒。
由于病毒和衣原体所致的其它疾病包括但不限于病毒性肝炎、甲型肝炎伴发肝昏迷、无昏迷的甲型肝炎、乙型肝炎伴发肝昏迷、无昏迷的乙型肝炎、急性的其它明确的病毒性肝炎(述及肝昏迷)、其它明确的病毒性肝炎(未述及肝昏迷)、不明确的病毒性丙型肝炎、病毒性丙型肝炎伴发肝昏迷、病毒性丙型肝炎伴发肝昏迷、病毒性肝炎、狂犬病、腮腺炎、无并发症的腮腺炎、鸟疫、由于柯萨奇病毒所致的明确疾病、疱疹性咽峡炎、手足口病、单核细胞增多症、沙眼、由于病毒和衣原体所致的其它结膜炎疾病、由于病毒和衣原体所致的其它疾病、接触性软疣、所有部位的疣病、尖锐湿疣、出汗发热、猫抓病、脚和口病、CMV病、另外分类的状况中的以及不明部位的病毒感染、鼻病毒、hpv以及呼吸道合胞病毒。立克次氏体及其它节肢动物传播疾病包括但不限于,虱传播的流行性斑疹伤寒、其它斑疹伤寒、蜱媒立克次体病、落基山斑疹热、其它立克次体病、疟疾、利什曼病、锥虫病(trypa omiasis)、回归热、其它节肢动物传播的疾病、其它明确的节肢动物传染的疾病、莱姆病和巴贝斯虫病。
病毒宿主包括但不限于腺病毒、星状病毒、禽流感病毒、柯萨奇病毒、登革热病毒、埃博拉病毒、埃可病毒、肠道腺病毒、肠病毒、汉坦病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、单纯疱疹病毒(HSV)、人巨细胞病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)、人乳头状瘤病毒(HPV)、流感病毒、日本脑炎病毒(JEV)、拉沙热病毒、马尔堡病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、诺沃克病毒、副流感病毒、脊髓灰质炎病毒、狂犬病病毒、呼吸道合胞病毒、轮状病毒、风疹病毒、SARS冠状病毒、蜱传播脑炎病毒(TBEV)、天花病毒、西尼罗河病毒以及黄热病病毒。真菌宿主包括但不限于白色念珠菌。寄生虫宿主包括但不限于,疟原虫属、曼氏血吸虫以及阴道毛滴虫。
细菌宿主包括但不限于,鲍氏不动杆菌、炭疽芽孢杆菌、巴尔通氏体属、百日咳杆菌、伯氏菌属、布鲁杆菌属、肺炎衣原体、沙眼衣原体、肉毒梭菌、白喉棒杆菌、伯氏考克斯体、埃利希氏体属、肠球菌属、肠病毒、大肠杆菌、土拉弗氏菌、杜克嗜血杆菌、幽门螺杆菌、肺炎克雷伯氏菌、嗜肺军团菌、问号钩端螺旋体、结核分枝杆菌、生殖支原体、肺炎衣原体、淋病奈瑟菌、脑膜炎奈瑟菌、恙虫病东方体(orientia tsutsugamushi)、铜绿假单胞菌、立克次氏体、沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、化脓性链球菌、梅毒密螺旋体、解脲脲原体、霍乱弧菌、创伤弧菌和鼠疫耶尔森氏菌。
动物传染的细菌性疾病包括但不限于,瘟疫、腺鼠疫、兔热病、炭疽病、布氏杆菌病、马鼻疽、类鼻疽、大鼠咬热、李斯特菌病、丹毒丝菌感染和巴氏杆菌病。其它细菌性疾病包括但不限于麻风病、由于其它分枝杆菌所致疾病、白喉、百日咳、链球菌喉咙痛和猩红热、链球菌咽炎、猩红热、丹毒、流行性脑脊髓膜炎、破伤风、败血症、肺炎球菌败血症、革兰氏阴性败血症、不明败血症和放线菌感染。
结核病包括但不限于,原发性结核感染、肺结核、脑膜和中枢神经系统结核病、肠、腹膜和肠系膜淋巴结结核病、骨和关节结核病、脊柱结核病、卜德氏病(pott's disease)、泌尿生殖系统结核病、其它器官结核病、结核中伴随超敏反应的结节性红斑、巴辛病(bazindisease)、外周淋巴结结核病、淋巴结结核以及粟粒状结核病。
梅毒和其它性病包括但不限于先天性梅毒、具症状早期梅毒、原发性生殖器梅毒、潜伏性早期梅毒、心血管梅毒、神经梅毒、其它形式的具症状晚期梅毒、潜伏晚期梅毒、其它和不明确的梅毒、淋球菌感染、急性下泌尿生殖道淋病、淋菌性结膜炎以及非淋菌性尿道炎。其它螺旋体疾病包括但不限于细螺旋体病、溃疡膜性咽峡炎、雅司病以及品他病。霉菌病包括但不限于脚气、头皮/胡须脚气、灰指甲、手臂的皮肤真菌病、足癣、体癣、其它及不明皮肤真菌性、花斑癣、不明皮肤真菌病、念珠菌病、口腔念珠菌病、外阴/阴道念珠菌病、念珠菌性龟头炎、皮肤/指趾甲念珠菌病、球孢子菌病、组织胞浆菌病、不明组织胞浆菌感染、芽生菌感染、其它霉菌病以及机会性霉菌病。
蠕虫病包括但不限于,血吸虫病、其它吸虫感染、包虫病、其它绦虫感染、trichiis、丝虫感染和麦地那龙线虫病、钩虫病和板口线虫病、其它肠道蠕虫病、蛔虫病、异尖线虫病、类圆线虫病、鞭虫病、蛲虫病、毛细线虫病、毛圆线虫病、其它和不明的蠕虫病以及不明的肠道寄生虫病。其它感染性和或寄生虫病包括但不限于弓形虫病、不明的弓形虫病、滴虫病、泌尿生殖道滴虫病、滴虫性阴道炎、滴虫性尿道炎、虱病和阴虱侵扰、头虱虱病、体虱虱病、阴虱虱病、不明虱病、疥疮、疥癣、恙螨、结节病、箍指病、白塞氏综合征、肺囊虫病、胶孢子虫病和肉孢子虫病。感染性和寄生虫疾病的后期效果包括但不限于结核病的后期效果以及脊髓灰质炎的后期效果。
感染性疾病:生物印记
可评估囊泡的生物印记以为受试者提供治疗诊断。所述囊泡的生物印记可包含一种或多种生物标志物,诸如但不限于,本文所述的任意一种或多种生物标志物,如但不限于,在图1中针对感染性疾病列出的生物标志物及图24和43中列出的的生物标志物。
在一些实施方案中,可以通过检测囊泡中的病原体(诸如病毒、细菌或其它感染物)的成分而表征感染性疾病。例如,所述成分可以是ABC转运体(白色念珠菌)、ABC转运体(肠球菌)、AMA-1(顶膜抗原1)、ATP酶、Aac(6')-Aph(2”)酶、Ace(副霍乱肠毒素)、Acf(辅助定殖因子)、Acr(α-晶体蛋白)蛋白、AhpC和AhpD、β-淀粉样蛋白、AroC、附着糖蛋白(G)(呼吸道合胞病毒)、自溶素(N-乙酰胞壁酰基-L-丙氨酸酰胺酶)、BacA、BmpA(P39)、肉毒杆菌神经毒素、BvgA,-S和-R、BvrR-BvrS、C4BP(C4b结合蛋白)、C5a肽酶、CAMP因子(溶血促进因子(cohemolysin))、CBP(胆碱结合蛋白)、CME型β-内酰胺酶、CSP(环子孢子蛋白)、CT(霍乱毒素)、CTX-M金属-β-内酰胺酶、CagA(细胞毒素相关抗原)、衣壳蛋白(C)(登革热病毒)、衣壳蛋白(C)(日本脑炎病毒)、衣壳蛋白(C)(蜱媒脑炎病毒)、衣壳蛋白(C)(西尼罗河病毒)、衣壳蛋白(C)(黄热病病毒)、衣壳蛋白(星状病毒)、衣壳蛋白(柯萨奇病毒)、衣壳蛋白(埃可病毒)、衣壳蛋白(肠病毒)、衣壳蛋白(甲型肝炎病毒)、衣壳蛋白(脊髓灰质炎病毒)、衣壳蛋白(轮状病毒)、儿茶酚铁载体ABC转运体、Com-1、CrmB(细胞因子反应调节剂)、溶细胞素、D-Ala-D-Lac连接酶、DHFR(二氢叶酸还原酶)、DHPS(二氢喋呤合成酶)、DbpA(核心蛋白聚糖结合蛋白A)、白喉毒素、Dot/Icm复合体、E1和E2蛋白(风疹病毒)、E1A蛋白(腺病毒)、E1A蛋白(肠道腺病毒)、E1B蛋白(腺病毒)、E1B蛋白(肠道腺病毒)、E2早期转录区2、E3蛋白(腺病毒)、E4蛋白(腺病毒)、E6早期转录区6、E7早期转录区7、EF(水肿因子)、ESAT-6和CFP-10、弹性蛋白酶(创伤弧菌)、Env、包膜糖蛋白(E)(登革热病毒)、包膜糖蛋白(E)(日本脑炎病毒)、包膜糖蛋白(E)(蜱媒脑炎病毒)、包膜糖蛋白(E)(西尼罗河病毒)、包膜糖蛋白(E)(黄热病病毒)、Esp(肠球菌表面蛋白)、Esp(III型系统分泌蛋白质)、F1被膜(F1抗原)、FH(因子H)、FHA(丝状血凝素)、Falcipain1/2、纤维蛋白(腺病毒)、纤维蛋白(肠道腺病毒)、纤连蛋白结合蛋白II(蛋白F/sfbII)(化脓性链球菌)、纤连蛋白结合蛋白(问号钩端螺旋体)、纤连蛋白结合蛋白(FBP54)(化脓性链球菌)、纤毛蛋白、鞭毛蛋白(FlaB和-A)(幽门螺杆菌)、鞭毛蛋白(H-抗原)(大肠杆菌)、鞭毛蛋白(H-抗原)(沙门氏菌)、鞭毛蛋白(创伤弧菌)、FopA(43kDa脂蛋白)、融合蛋白(F)(腮腺炎病毒)、融合蛋白(F)(副流感病毒)、融合蛋白(F)(呼吸道合胞病毒)、G6PD(葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)、GES(圭亚那超广谱β-内酰胺酶)、GTP环式水解酶、Gag、糖蛋白(G)(狂犬病病毒)、糖蛋白(GP)(埃博拉病毒)、糖蛋白(GP)(拉沙病毒)、糖蛋白(GP)(马尔堡病毒)、糖蛋白(Gn/Gn)(汉坦病毒)、HMW(Cytadherence辅助蛋白)、HRP2(富含组氨酸蛋白2)、血凝素(禽流感病毒)、血凝素(流感病毒)、血凝素(麻疹病毒)、血凝素(天花病毒)、血凝素酯酶糖蛋白(HE)、血凝素-神经氨酸酶(HN)(腮腺炎病毒)、血凝素–神经氨酸苷酶(HN)(副流感病毒)、溶血素(Vvh)、六邻体蛋白(腺病毒)、六邻体蛋白(肠道腺病毒)、HSP60(热休克蛋白60)、透明质酸裂解酶、透明质酸酶、IMP金属-β-内酰胺酶(鲍氏不动杆菌)、IMP金属-β-内酰胺酶(肺炎克雷伯菌)、ICSA和ICSB、IgA蛋白酶(淋球菌)、IgA1蛋白酶(肺炎链球菌)、HSV 1/2的IgG和IgM、InhA、Intimin、InvA(立克次氏体)、侵袭素(大肠杆菌)、侵袭素(鼠疫耶尔森氏菌)、IpaA、-B、-C、-D和-H、KPC金属-β-内酰胺酶、KatG、L蛋白(拉沙病毒)、L1晚期转录区1、LF(致死因子)、LSA1(肝期抗原1)、LT(不耐热毒素)、LcrV(V抗原)、LigA和LigB、脂蛋白、M蛋白、MSP(裂殖子表面蛋白)、基质蛋白(M)(狂犬病病毒)、基质蛋白(M)(呼吸道合胞病毒)、基质蛋白(禽流感病毒)、基质蛋白(流感病毒)、MexAB-OprM、MexCD-OprJ、MexEF-OprN、MexXY-OprM、Mip(巨噬细胞感染性增强剂)、NSE(神经元特异性烯醇酶)、Nef、神经氨酸酶(禽流感病毒)、神经氨酸酶(流感病毒)、神经氨酸酶(肺炎链球菌)、非结构蛋白(NS)(呼吸道合胞病毒)、非结构蛋白1(NS1)(登革热病毒)、非结构蛋白1(NS1)(日本脑炎病毒)、非结构蛋白1(NS1)(蜱媒脑炎病毒)、非结构蛋白1(NS1)(西尼罗河病毒)、非结构蛋白1(NS1)(黄热病病毒)、非结构蛋白2A(NS2A)(登革热病毒)、非结构蛋白2A(NS2A)(日本脑炎病毒)、非结构蛋白2A(NS2A)(蜱媒脑炎病毒)、非结构蛋白2A(NS2A)(西尼罗河病毒)、非结构蛋白2A(NS2A)(黄热病病毒)、非结构蛋白2B(NS2B)(登革热病毒)、非结构蛋白2B(NS2B)(日本脑炎病毒)、非结构蛋白2B(NS2B)(蜱媒脑炎病毒)、非结构蛋白2B(NS2B)(西尼罗河病毒)、非结构蛋白2B(NS2B)(黄热病病毒)、非结构蛋白3(NS3)(登革热病毒)、非结构蛋白3(NS3)(日本脑炎病毒)、非结构蛋白3(NS3)(蜱媒脑炎病毒)、非结构蛋白3(NS3)(西尼罗河病毒)、非结构蛋白3(NS3)(黄热病病毒)、非结构蛋白4(轮状病毒)、非结构蛋白4A(NS4A)(登革热病毒)、非结构蛋白4A(NS4A)(日本脑炎病毒)、非结构蛋白4A(NS4A)(蜱媒脑炎病毒)、非结构蛋白4A(NS4A)(西尼罗河病毒)、非结构蛋白4A(NS4A)(黄热病病毒)、非结构蛋白4B(NS4B)(登革热病毒)、非结构蛋白4B(NS4B)(日本脑炎病毒)、非结构蛋白4B(NS4B)(蜱媒脑炎病毒)、非结构蛋白4B(NS4B)(西尼罗河病毒)、非结构蛋白4B(NS4B)(黄热病病毒)、非结构蛋白5(NS5)(登革热病毒)、非结构蛋白5(NS5)(日本脑炎病毒)、非结构蛋白5(NS5)(蜱媒脑炎病毒)、非结构蛋白5(NS5)(西尼罗河病毒)、非结构蛋白5(NS5)(黄热病病毒)、非结构蛋白(禽流感病毒)、非结构蛋白(流感病毒)、核衣壳(汉坦病毒)、核衣壳(麻疹病毒)、核衣壳(副流感病毒)、核衣壳(SARS冠状病毒)、核蛋白(N)(狂犬病病毒)、核蛋白(NP)(呼吸道合胞病毒)、核蛋白(主要核蛋白)(马尔堡病毒)、核蛋白(禽流感病毒)、核蛋白(埃博拉病毒)、核蛋白(流感病毒)、核蛋白(拉沙病毒)、ORF1(戊型肝炎病毒)、ORF2(戊型肝炎病毒)、ORF3(戊型肝炎病毒)、OXA金属-β-内酰胺酶(鲍氏不动杆菌)、OXA金属-β-内酰胺酶(肺炎克雷伯菌)、OmpA和OmpB(立克次氏体)、OmpL1(问号钩端螺旋体)、OmpQ(外膜孔道蛋白)(百日咳杆菌)、OmpS(嗜肺军团菌)、混浊因子、OprD、Osp(外表面蛋白)、外膜蛋白(肺炎衣原体)、外膜蛋白(埃利希氏体属)、P1粘附素、P30粘附素、PA(保护性抗原)、PBP(青霉素结合蛋白)、PCRMP 1-4(半胱氨酸重复模块化蛋白质)、PER金属-β-内酰胺酶、Pat1、肽聚糖(胞壁质)水解酶、百日咳杆菌粘附素(P69)、百日咳毒素、PfEMP1(恶性疟原虫红细胞膜蛋白1)、磷蛋白(P)(呼吸道合胞病毒)、磷蛋白(麻疹病毒)、Pla(纤维蛋白溶酶原激活剂)、纤溶酶原结合蛋白、Pld、肺炎球菌自溶酶、Pol、聚-D-谷氨酸包膜、聚合酶(L)(狂犬病毒)、孔道蛋白、前膜/膜蛋白(PRM/M)(登革热病毒)、前膜/膜蛋白(PRM/M)(日本脑炎病毒)、前膜/膜蛋白(PRM/M)(蜱媒脑炎病毒)、前膜/膜蛋白(PRM/M)(西尼罗河病毒)、前膜/膜蛋白(PRM/M)(黄热病病毒)、双组分调节系统的蛋白(埃立克体)、双组分调节系统的蛋白(结核分枝杆菌)、gB、gC、gD、gH和gL蛋白、PsaA、PspA(肺炎球菌表面蛋白A)、PurE、热原外毒素、RBP 1/2(网织红细胞结合蛋白1/2)、RdRp(RNA依赖性RNA聚合酶)(诺如病毒)、RdRp(RNA依赖性RNA聚合酶)(星状病毒)、RdRp(RNA依赖性RNA聚合酶)(SARS冠状病毒)、Rev、RfbE、RibD和RibE、Rmp、S-层蛋白、S100B(S100蛋白β链)、SHV金属-β-内酰胺酶、SIM金属-β-内酰胺酶、ST(热稳定毒素)、沙门菌质粒毒力(SPV)蛋白、丝氨酸蛋白酶(星状病毒)、ShET1/2、志贺毒素(梅毒病毒)、SipA(沙门氏菌侵袭蛋白A)、SlyA、小疏水性蛋白、Sop(沙门氏菌外蛋白)、刺突糖蛋白(S)、链球菌DNA酶、链阳性菌素A乙酰转移酶、链激酶、链球菌溶血素O、StxA/B(志贺毒素A/B)、SucB(二氢硫辛酰胺琥珀酰转移酶)(结核分枝杆菌)、SucB(二氢硫辛酰胺琥珀酰转移酶)(贝氏柯克斯体)、Syc(Yop分子伴侣)、T蛋白、TCP(毒素共调菌毛)、TEM金属-β-内酰胺酶、TRAP(凝血栓蛋白相关无名蛋白质)、Tat、Tau蛋白、TcfA(气管定殖因子)、Tir(易位intimin受体)、TlyA和TlyC、ToxR(毒素调节蛋白)、Tul4(17kDa脂蛋白)、IV型菌毛、脲酶(布鲁氏菌)、脲酶(幽门螺杆菌)、VEB金属-β-内酰胺酶、VETF(病毒早期转录因子)、VIM金属-β-内酰胺酶(鲍氏不动杆菌)、VIM金属-β-内酰胺酶(肺炎克雷伯菌)、VP1(诺如病毒)、VP2(诺如病毒)、VP24(埃博拉病毒)、VP24(马尔堡病毒)、VP30(微小核蛋白)(埃博拉病毒)、VP30(微小核蛋白)(马尔堡病毒)、VP35(P-样蛋白质)(埃博拉病毒)、VP35(P-样蛋白质)(马尔堡病毒)、VP40(基质蛋白)(埃博拉病毒)、VP40(基质蛋白)(马尔堡病毒)、VacA(空泡细胞毒素)、Vag8(毒力激活基因8)、Vif蛋白、VirB IV型分泌系统、VlsE(35kDa脂蛋白)、Vpr、Vpu/Vpx、XerD、Yops(耶尔森氏菌外膜蛋白)、Ysc(Yop分泌器)、Z蛋白(拉沙病毒)、Zot(闭锁小带毒素)、GG1(HSV-1)和GG2(HSV-2)、p41i、p83和p100、pLDH(疟原虫乳酸脱氢酶)、α/β/γ蛋白、120kDa基因、16S和5S rRNA基因(嗜肺军团菌)、16S rRNA基因(巴尔通氏体属)、16SrRNA基因(包柔氏螺旋体属)、16S rRNA基因(布鲁氏菌)、16S rRNA基因(埃立克体)、16SrRNA基因(肺炎克雷伯菌)、16S rRNA(恙虫病东方体)、16S rRNA基因(立克次氏体)、16SrRNA基因(鲍氏不动杆菌)、16S rRNA基因(肺炎衣原体)、16S rRNA基因(肉毒杆菌)、16SrRNA基因(肺炎支原体)、16S rRNA基因(淋病奈瑟氏球菌)、16S rRNA基因(创伤弧菌)、16S-23S rRNA基因间隔区(巴尔通氏体属)、16S-23S rRNA基因间隔区(贝氏柯克斯体)、17kDa基因、18S ssrRNA、23S rRNA基因(鲍氏不动杆菌)、23S rRNA基因(淋病奈瑟氏球菌)、2C基因、3'NCR(登革热病毒)、3'NCR(日本脑炎病毒)、3'NCR(蜱媒脑炎病毒)、3'NCR(西尼罗河病毒)、3'NCR(黄热病病毒)、5'NCR(柯萨奇病毒)、5'NCR(登革热病毒)、5'NCR(埃可病毒)、5'NCR(肠病毒)、5'NCR(日本脑炎病毒)、5'NCR(脊髓灰质炎病毒)、5'NCR(蜱媒脑炎病毒)、5'NCR(西尼罗河病毒)、5'NCR(黄热病病毒)、56kDa基因、A13L基因、ARE1基因、ATF2基因、B12R基因、B6R基因、B8R基因、C基因(登革热病毒)、C基因(日本脑炎病毒)、C基因(蜱媒脑炎病毒)、C基因(西尼罗河病毒)、C基因(黄热病病毒)、C3L基因、CDR 1/2基因、E基因(登革热病毒)、E基因(日本脑炎病毒)、E基因(蜱媒脑炎病毒)、E基因(西尼罗河病毒)、E基因(黄热病病毒)、E1和E2基因、E1A基因(腺病毒)、E1A基因(肠道腺病毒)、E1B基因(腺病毒)、E1B基因(肠道腺病毒)、E2基因、E3基因(腺病毒)、E3L基因、E4基因(腺病毒)、E6基因、E7基因、ERG基因、ESAT-6和CFP-10基因、F基因(腮腺炎病毒)、F基因(副流感病毒)、F基因(呼吸道合胞病毒)、G基因(狂犬病病毒)、G基因(呼吸道合胞病毒)、GP基因(埃博拉病毒)、GP基因(拉沙病毒)、GP基因(马尔堡病毒)、H基因(麻疹病毒)、HA基因(禽流感病毒)、HA基因(流感病毒)、HE基因(SARS冠状病毒)、HN基因(腮腺炎病毒)、HN基因(副流感病毒)、IS100、IS1081、IS1533(问号钩端螺旋体)、IS285、IS481(BP0023)、IS6110、IS711(布鲁氏菌)、ISFtu、J7R基因、L基因(拉沙病毒)、L基因(狂犬病病毒)、L片段、L1基因、LEE(肠细胞消除的基因座)、长控制区(LCR)、M基因(狂犬病病毒)、M基因(呼吸道合胞病毒)、M基因(禽流感病毒)、M基因(流感病毒)、M片段、MDR1基因、MEC3基因、N基因(麻疹病毒)、N基因(狂犬病病毒)、N基因(SARS冠状病毒)、NA基因(禽流感病毒)、NA基因(流感病毒)、NC基因(副流感病毒基因)、NP基因(禽流感病毒)、NP基因(埃博拉病毒)、NP基因(流感病毒)、NP基因(拉沙病毒)、NP基因(马尔堡病毒)、NP基因(呼吸道合胞病毒)、NS基因(禽流感病毒)、NS基因(流感病毒)、NS基因(呼吸道合胞病毒)、NS1基因(登革热病毒)、NS1基因(日本脑炎病毒)、NS1基因(蜱媒脑炎病毒)、NS1基因(西尼罗河病毒)、NS1基因(黄热病病毒)、NS2A基因(登革热病毒)、NS2A基因(日本脑炎病毒)、NS2A基因(蜱媒脑炎病毒)、NS2A基因(西尼罗河病毒)、NS2A基因(黄热病病毒)、NS2B基因(登革热病毒)、NS2B基因(日本脑炎病毒)、NS2B基因(蜱媒脑炎病毒)、NS2B基因(西尼罗河病毒)、NS2B基因(黄热病病毒)、NS3基因(登革热病毒)、NS3基因(日本脑炎病毒)、NS3基因(蜱媒脑炎病毒)、NS3基因(西尼罗河病毒)、NS3基因(黄热病病毒)、NS4基因(轮状病毒)、NS4A基因(登革热病毒)、NS4A基因(日本脑炎病毒)、NS4A基因(蜱媒脑炎病毒)、NS4A基因(西尼罗河病毒)、NS4A基因(黄热病病毒)、NS4B基因(登革热病毒)、NS4B基因(日本脑炎病毒)、NS4B基因(蜱媒脑炎病毒)、NS4B基因(西尼罗河病毒)、NS4B基因(黄热病病毒)、NS5基因(登革热病毒)、NS5基因(日本脑炎病毒)、NS5基因(蜱媒脑炎病毒)、NS5基因(西尼罗河病毒)、NS5基因(黄热病病毒)、ORF 1A(星状病毒)、ORF 1B(星状病毒)、ORF 2(星状病毒)、ORF1(戊型肝炎病毒)、ORF1(诺如病毒)、ORF2(戊型肝炎病毒)、ORF2(诺如病毒)、ORF3(戊型肝炎病毒)、ORF3(诺如病毒)、P基因(麻疹病毒)、P基因(呼吸道合胞病毒)、PDH1基因、肽基转移酶突变、质粒(QpH1、QpRS、QpDG、QpDV)、PrM/M基因(登革热病毒)、PrM/M基因(日本脑炎病毒)、PrM/M基因(蜱媒脑炎病毒)、PrM/M基因(西尼罗河病毒)、PrM/M基因(黄热病病毒)、ORF 1ab中的RdRp基因(SARS冠状病毒)、S基因(SARS冠状病毒)、S片段、SH基因(腮腺炎病毒)、SNP(单核苷酸多态性)、沙门氏菌病原性岛(SPI)、沙门氏菌质粒毒力(SPV)操纵子、ShET1/2基因、VNTR(可变数目串联重复序列)(炭疽杆菌)、VNTR(可变数目串联重复序列)(布鲁氏菌)、VNTR(可变数目串联重复序列)(土拉弗朗西斯菌)、VNTR(可变数目串联重复序列)(鼠疫耶尔森氏菌)、VP24基因(埃博拉病毒)、VP24基因(马尔堡病毒)、VP30基因(埃博拉病毒)、VP30基因(马尔堡病毒)、VP35基因(埃博拉病毒)、VP35基因(马尔堡病毒)、VP40基因(埃博拉病毒)、VP40基因(马尔堡病毒)、Z基因(拉沙病毒)、aac(3)基因、aac(6')基因、aac(6')-aph(2”)基因、aad基因、ace基因、acpA基因、agrBDCA基因座、ahpC和ahpD基因、arlRS基因座、atxA基因、bclA基因、blaCTX-M基因、blaGES基因、blaGIM基因(绿脓杆菌)、blaIMP基因(鲍氏不动杆菌)、blaIMP基因(肺炎克雷伯菌)、blaIMP基因(绿脓杆菌)、blaKPC基因、blaOXA基因(鲍氏不动杆菌)、blaOXA基因(肺炎克雷伯菌)、blaOXA基因(绿脓杆菌)、blaSHV基因、blaSIM基因(肺炎克雷伯菌)、blaSIM基因(绿脓杆菌)、blaTEM基因、blaVIM基因(鲍氏不动杆菌)、blaVIM基因(肺炎克雷伯菌)、blaVIM基因(绿脓杆菌)、bvg基因座(bvgA、-S和-R基因)、cagA基因、cap基因座(capB、-C和-A基因)(炭疽杆菌)、cap操纵子(capB和-C)(土拉弗朗西斯菌)、衣壳基因(柯萨奇病毒)、衣壳基因(埃可病毒)、衣壳基因(肠病毒)、衣壳基因(甲型肝炎病毒)、衣壳基因(脊髓灰质炎病毒)、衣壳基因(轮状病毒)、cme基因、cnt基因、com-1基因、cppB基因、cps基因、crmB基因、ctx基因、cya基因、cyl基因、eaeA基因、east基因(大肠杆菌)、env基因、ery基因、esp基因(肠球菌)、esp基因(大肠杆菌)、纤维基因(腺病毒)、纤维基因(肠道腺病毒)、菌毛基因、flaB基因(包柔氏螺旋体属)、flaB基因(问号钩端螺旋体)、鞭毛蛋白基因、fljA、fljB和fliC基因、fopA基因、ftsZ基因、gG1和gG2基因、gag基因、双组分调控系统的基因、gB、gC、gD、gH和gL的基因、gerX基因座(gerXC、-A和-B基因)、glpQ基因、gltA(柠檬酸合成酶)基因(巴尔通氏体属)、gltA(柠檬酸合成酶)基因(立克次氏体)、groEL基因(巴尔通氏体属)、groEL基因(恙虫病东方体)、groESL基因(肺炎衣原体)、gyrA和gyrB基因(绿脓杆菌)、gyrA基因(淋病奈瑟氏球菌)、gyrB基因(炭疽杆菌)、六邻体蛋白基因(腺病毒)、六邻体蛋白基因(肠道腺病毒)、hin基因、hlyA基因、hmw基因、hspX(Rv2031c)基因、htpAB相关重复元件(IS1111a)、hyl基因、icsA和icsB基因、ileS基因、inhA基因、inv基因(大肠杆菌)、inv基因(沙门氏菌)、ipaA、-B、-C、-D和-H基因、katG基因、lef基因、letA基因、lidA基因、lpsB基因、lrgAB基因座、luxS基因、lytA基因、lytRS基因座、mecA基因、mglA基因、mgrA(大鼠)基因、mip基因、mtgA基因、mucZ基因、多基因家族、mupA基因、nanA和nanB基因、nef基因、omp基因(布鲁氏菌)、omp基因(肺炎衣原体)、ompA和B基因(立克次氏体)、ompQ基因、opa基因、osp基因、p1基因、p30基因、pagA基因、pap31基因、parC和parE基因(绿脓杆菌)、parC基因(淋病奈瑟氏球菌)、per基因、pilQ基因、ply基因、pmm基因、pol基因、porA和porB基因、prn4(百日咳杆菌粘附素)基因、psaA基因、pspA基因、pst1片段和HL-1/HR-1引物、ptx(启动子区域和完整基因)、rap 1/2基因、rev基因、rpo18基因、rpoB基因、rpoS基因、rpsL基因、rrf(5S)-rrL(23S)基因间隔区、rek基因、rtx基因(创伤弧菌)、rtxA基因(嗜肺军团菌)、sap基因(炭疽杆菌)、sar基因、satA(vatD)和satG(vatE)基因、sca4基因、secY基因、stx(vt)基因、stxA/B(stx1/2)基因、sucB基因、tat基因、tcp基因、tir基因、tox基因、toxR基因、tul4基因、脲酶基因、vacA基因、van A-E基因、veb基因、vif基因、viuB基因、vpr基因、vpu/vpx基因、vvh(创伤弧菌溶血素)基因、vvpE(创伤弧菌弹性蛋白酶)基因、wboA基因、wzy(O-抗原聚合酶)基因、zot基因、α/β/γ基因、C-多糖(鼠李糖/N-乙酰葡糖胺)、CPS(包膜多糖)、环状β-1,2葡聚糖、透明质酸壳包膜、LPS(脂多糖)(巴尔通氏体属)、LPS(脂多糖)(布鲁氏菌)、LPS(脂多糖)(贝氏柯克斯体)、LPS(脂多糖)(立克次氏体)、LPS(脂多糖)(创伤弧菌)、O-抗原(大肠杆菌)、O-抗原(沙门氏菌)、O-抗原(霍乱弧菌)、Vi-抗原(沙门氏菌)或儿茶酚铁载体。
感染性疾病:护理标准
对来自罹患感染性或寄生虫疾病的受试者的样品的囊泡生物印记、囊泡量或两者进行测定可用于为所述受试者选择护理标准。感染性或寄生虫疾病可根据与所述状况相关的症状而进行治疗。所述护理标准包括,例如,使用一种或多种抗生素和抗病毒剂进行治疗。
抗生素包括但不限于阿米卡星、庆大霉素、卡那霉素、新霉素、乙基西梭霉素、链霉素、妥布霉素、巴龙霉素、格尔德霉素、除莠霉素、劳拉卡帕、厄他培南、多尼培南、亚胺培南/西司他丁、美罗培南、头孢羟氨苄、头孢唑啉、头孢噻吩或噻孢霉素、头孢氨苄、头孢克洛、头孢孟多、头孢西丁、头孢丙烯、头孢呋辛、头孢克肟、头孢地尼、头孢妥仑、头孢哌酮、头孢噻肟、头孢泊肟、头孢他啶、头孢布烯、头孢唑肟、头孢曲松、头孢吡肟、头孢吡普、替考拉宁、万古霉素、阿奇霉素、克拉霉素、地红霉素、红霉素、罗红霉素、醋竹桃霉素、泰利霉素、大观霉素、氨曲南、阿莫西林、氨苄青霉素、阿洛西林、羧苄青霉素、邻氯青霉素、双氯西林、氟氯西林、美洛西林、甲氧西林、萘夫西林、苯唑西林、青霉素、哌拉西林、替卡西林、杆菌肽、多粘菌素、多粘菌素B、环丙沙星、依诺沙星、加替沙星、左氧氟沙星、洛美沙星、莫西沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、曲伐沙星、格帕沙星、司帕沙星、替马沙星、磺胺米隆、2,4-二氨基偶氮苯-4-磺酰胺(Sulfonamidochrysoidine)、磺胺醋酰、对氨基苯磺酰胺、柳氮磺胺吡啶、磺胺异噁唑、甲氧苄氨嘧啶、甲氧苄啶、磺胺甲噁唑、地美环素、多西环素、米诺环素、土霉素、四环素、磺胺嘧啶、磺胺甲二唑、砷凡纳明、氯霉素、克林霉素、林可霉素、乙胺丁醇、磷霉素、夫西地酸、呋喃唑酮、异烟肼、利奈唑、甲硝唑、莫匹罗星、呋喃妥因、平板霉素、吡嗪酰胺、奎奴普丁或达福普汀、利福平、甲砜霉素、替硝唑、氨苯砜和氯法齐明。抗生素的实例列于表15中。
抗病毒剂包括但不限于阿巴卡韦、阿昔洛韦、无环鸟苷、阿德福韦酯、金刚烷胺、安普那韦、安普利根(Ampligen)、阿比朵尔、阿扎那韦、Atripla、波西普韦(Boceprevir)、西多福韦、双汰芝、地瑞那韦、地拉韦啶、去羟肌苷、二十二烷醇、依度尿苷、依法韦仑、恩曲他滨、恩夫韦、恩替卡韦、泛昔洛韦、福米韦生、福沙那韦、膦甲酸、膦乙醇、更昔洛韦、伊巴他滨、异丙肌苷、碘苷、咪喹莫特、茚地那韦、肌苷、III型干扰素、Ⅱ型干扰素、I型干扰素、拉米夫定、洛匹那韦、洛韦胺、马拉韦罗、吗啉胍、奈非那韦、奈韦拉平、Nexavir、奥司他韦、聚乙二醇干扰素α-2A、喷昔洛韦、帕拉米韦、普来可那立、鬼臼毒素、雷特格韦、利巴韦林、金刚乙胺、利托那韦、Pyramidine、沙奎那韦、司他夫定、茶树油、替诺福韦、替诺福韦酯、替拉那韦、氟尿苷、Trizivir、曲金刚胺、特鲁瓦达、伐昔洛韦、缬更昔洛韦、Vicriviroc、阿糖腺苷、Viramidine、扎西他滨、扎那米韦和齐多夫定。
表15:抗生素药物及其结构类别的实例
在一个实施方案中,受试者患有HIV感染。可从来自所述受试者的囊泡评估一种或多种生物标志物,诸如但不限于,p24抗原、TNF-α、TNFR-II、CD3、CD14、CD25、CD27、Fas、FasL、β2微球蛋白、新喋呤、HIV RNA和HLA-B*5701。根据所述一种或多种生物标志物的一种或多种特征,可将所述受试者确定为针对治疗(诸如但不限于齐多夫定、去羟肌苷、扎西他滨、司他夫定、拉米夫定、沙奎那韦、利托那韦、茚地那韦、Nevirane、奈非那韦、地拉夫定、司他夫定、依非韦伦、依曲韦林、恩夫韦地、地瑞纳韦、阿巴卡韦、安瑞那韦、Lonavir/利托那韦、替诺福韦、替拉那韦或它们的组合)的响应者或非响应者。
因此,可根据受试者的囊泡的生物印记为罹患感染性疾病或状况的受试者选择治疗。
神经学
对囊泡的评估还可用于神经疾病的治疗诊断,诸如,例如多发性硬化症(MS)、帕金森氏病(PD)、阿尔兹海默氏病(AD)(非炎性或炎性)、精神分裂症、双相型障碍、抑郁症、孤独症、朊病毒疾病、皮克病、痴呆、亨廷顿病(HD)、唐氏综合征、脑血管疾病、Rasmussen脑炎、病毒性脑膜炎、神经精神病系统性红斑狼疮(NPSLE)、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、克雅氏病、Gerstmann-Straussler-Scheinker病、传染性海绵状脑病、缺血再灌注损伤(例如中风)、脑外伤、微生物感染或慢性疲劳综合征。
神经失调包括但不限于中枢神经系统的炎性疾病、中枢神经系统的遗传性退行性疾病、疼痛、其它头痛综合征、中枢神经系统的其它失调以及外周神经系统的失调。中枢神经系统的炎性疾病包括但不限于,细菌性脑膜炎、脑膜炎、嗜血杆菌脑膜炎、细菌脑膜炎、由于其它生物体所致的脑膜炎、隐球菌脑膜炎、不明原因脑膜炎、脑炎、脊髓炎和脑脊髓炎、感染后脑炎、不明脑炎、颅内和椎管内脓肿、颅内静脉窦的静脉炎和血栓性静脉炎、颅内静脉窦血栓形成、颅内脓肿或化脓性感染的后期效果、睡眠障碍、不明器质性失眠、由于另外分类的医学状况所致的失眠以及由于精神障碍所致的失眠。中枢神经系统的遗传性和退行性疾病包括但不限于通常表现在儿童期的脑退化、脑白质营养不良、克拉贝病(krabbedisease)、佩利措伊斯-梅茨巴赫病、脑脂质沉积、泰-萨克斯病、其它脑退化、阿尔兹海默氏病、皮克病、老年性大脑退化、交通性脑积水、梗阻性脑积水、特发性常压脑积水、其它脑退化、瑞氏综合征、路易体痴呆症、所谓的轻度认知功能障碍、帕金森氏症、原发帕金森氏症、其它锥体外系疾病和异常运动失调、基底神经节的其它退化性疾病、橄榄桥脑小脑萎缩、夏-德综合征(shy drager syndrome)、特发性震颤/家族性震颤、肌阵挛、拉福拉病(lafora's disease)、翁弗里希特病(unverricht disease)、亨廷顿氏舞蹈病、扭转性肌张力障碍、眼睑痉挛、其它及不明锥体外系疾病和异常运动失调、其它锥体外系疾病和异常运动失调、多动腿、五羟色胺综合征、脊髓小脑疾病、弗里德赖希氏共济失调、脊髓小脑性共济失调、遗传性痉挛性截瘫、原发性小脑退化、其它小脑性共济失调、另外分类的小脑性共济失调疾病、其它脊髓小脑疾病、共济失调毛细血管扩张症、皮质脊髓退化、不明的脊髓小脑疾病、脊髓前角细胞疾病、运动神经元疾病、肌萎缩性侧索硬化症、进行性肌萎缩、进行性延髓麻痹、假性球麻痹、原发性侧索硬化症、其它运动神经元疾病、其它脊髓疾病、脊髓空洞症和延髓空洞症、自主神经系统的其它失调、特发性外周自主神经病变、不明的特发性外周自主神经病变、颈动脉窦综合征、其它特发性外周自主神经病变、另外分类的失调的外周自主神经病变、反射性交感神经营养不良、自主神经反射异常以及自主神经系统的不明失调。
疼痛包括但不限于,中枢性疼痛综合征、急性疼痛、慢性疼痛、肿瘤相关的急慢性疼痛以及慢性疼痛综合征。其它头痛综合征包括但不限于,丛集性头痛和其它三叉自主神经头痛、不明丛集性头痛综合征、发作性丛集性头痛、慢性丛集性头痛、发作性阵发性偏头痛、慢性阵发性偏头痛、短持续的单侧类神经痛性头痛(具结膜充血和流泪)、其它三叉自主神经头痛、紧张性头痛、不明紧张性头痛、发作性紧张性头痛、慢性紧张型头痛、创伤后头痛、不明的创伤后头痛、急性创伤后头痛、慢性创伤后头痛、未另外分类的药物引起的头痛、并发性头痛综合征、连续性偏头痛、新的每日持续性头痛、原发性霹雳性头痛、其它并发性头痛综合征、其它明确的头痛综合征、睡眠头痛、性行为相关头痛、原发性咳嗽头痛、原发性奋力头痛以及原发性刺痛性头痛。
中枢神经系统的其它失调包括但不限于,多发性硬化症、中枢神经系统的其它脱髓鞘性疾病、视神经脊髓炎、谢耳德病(schilder's disease)、急性脊髓炎横向脊髓炎、偏瘫、弛缓性偏瘫、痉挛性偏瘫、小儿脑瘫、先天性截瘫脑性麻痹、先天性偏瘫脑性麻痹、四肢瘫痪性脑性麻痹、其它麻痹综合征、四肢瘫痪和四肢轻瘫、截瘫、上肢双瘫、下肢单瘫、上肢单瘫、不明单瘫、马尾综合征、其它明确的状态锁定的麻痹综合征、癫痫、难治性癫痫、无状态强直阵挛性癫痫、无状态颞叶癫痫、无状态不明癫痫、偏头痛、经典非顽固性偏头痛、常见非顽固性偏头痛、非顽固性丛集性头痛、不明非顽固性偏头痛、猝倒和发作性睡病、无猝倒发作性睡病、脑囊肿、缺氧性脑损伤、假性脑瘤、不明脑病、代谢性脑病、脑的压缩、脑水肿、后脊椎穿刺、后硬脑膜穿刺头痛、脑脊液鼻漏以及中毒性脑病。
外周神经系统的失调包括但不限于,三叉神经失调、三叉神经痛、面神经失调、贝尔氏麻痹、其它颅神经失调、神经根和神经丛失调、胸廓出口综合征、幻肢、上肢单神经炎和腕管多发性单神经炎、下肢单神经炎、坐骨神经病变、感觉异常性股痛、其它股神经病变、侧腘神经病变、内侧腘神经病变、踝管综合征、足底神经病变、莫顿氏神经瘤、下肢不明单神经炎、不明部位单神经炎、遗传和特发性外周神经病变、炎症和中毒性神经病、格林-巴利综合征、多发性神经病、酒精多发性神经病、肌神经失调、伴随恶化的重症肌无力、无恶化重症肌无力、肌营养不良症及其它肌病、良性先天性肌病、中央轴空病、中央核肌病、肌管肌病、线样小体疾病(nemaline body disease)和遗传肌肉萎缩。
可评估囊泡的生物印记以为受试者提供治疗诊断。所述囊泡的生物印记可包含一种或多种生物标志物,诸如但不限于,下表所公开的那些生物标志物:
神经学:生物印记
可评估囊泡的生物印记以为受试者提供治疗诊断。所述囊泡的生物印记可包含一种或多种生物标志物,诸如但不限于,图1、45、46、47、48和49中所列的生物标志物。所述囊泡的生物印记可包含一种或多种生物标志物,其包括但不限于淀粉样蛋白β、ICAM-1(啮齿类)、CGRP(啮齿类)、TIMP-1(啮齿类)、CLR-1(啮齿类)、HSP-27(啮齿类)、FABP(啮齿类)、ATP5B、ATP5H、ATP6V1B、DNM1、NDUFV2、NSF、PDHB、FGF2、ALDH7A1、AGXT2L1、AQP4、PCNT2、FGFR1、FGFR2、FGFR3、AQP4、Dysbindin的突变、DAOA/G30、DISC1、神经调节蛋白-1、IFITM3、SERPINA3、GLS、ALDH7A1、BASP1、OX42、ED9、载脂蛋白D(啮齿类)、miR-7、miR-24、miR-26b、miR-29b、miR-30b、miR-30e、miR-92、miR-195、miR-181b、DISC1、dysbindin、神经调节蛋白-1、血清素(seratonin)2a受体和NURR1。
神经学:护理标准
对来自罹患神经性失调或疾病的受试者的样品的囊泡生物印记、囊泡量或两者进行测定可用于为所述受试者选择护理标准。神经性失调或疾病可根据与所述状况相关的症状而进行治疗。护理标准可包括,例如,药物。药物可包括但不限于,阿司匹林、双嘧达莫、那拉曲坦、阿朴吗啡、多奈哌齐、苹果酸阿莫曲坦、卢非酰胺、溴芬酸、carbatrol、cenestin、他达拉非、氯硝西泮、恩他卡朋、醋酸格拉默、匹莫林、双丙戊酸、二氟泼尼酯、酒石酸唑吡坦、酒石酸利伐斯的明、右哌甲酯、琥珀酸夫罗曲坦、醋酸锌、舒马曲坦、帕潘立酮、iontocaine、吗啡、左乙拉西坦、拉莫三嗪、伐地那非、利多卡因、右佐匹克隆、磷丙泊酚二钠、普瑞巴林、苯甲酸利扎曲坦、美罗培南、哌醋甲酯、甲磺酸二氢麦角胺、普拉克索、rimabotulinumtoxinB、纳屈酮、美金刚胺、替戈汀、加巴喷丁)、氢可酮、米托蒽醌、阿莫达非尼、羟考酮、普拉克索、来昔决南钐153、干扰素β-1a、右芬氟拉明、氢溴酸依利普坦、氢溴酸加兰他敏、盐酸罗匹尼罗、利鲁唑、雷美尔通、丙炔苯丙胺、丙戊酸、托莫西汀、托卡朋、卡马西平、托吡酯、奥卡西平、那他珠单抗、对乙酰氨基酚、曲马多、咪达唑仑、拉科胺、碘克沙醇、二甲磺酸赖右苯丙胺、丁苯那嗪、羟丁酸钠、盐酸替扎尼定、佐米曲普坦和唑尼沙胺。
可根据受试者的囊泡谱而选择的其它治疗包括表14中针对患有多发性硬化症的受试者而列出的治疗;表16中针对患有帕金森氏病的受试者而列出的治疗;或者表17中针对患有抑郁症的受试者而列出的治疗。
表16:用于帕金森氏病治疗的药物类别
表17:用于抑郁症治疗的药物类别
在一个实施方案中,可以为罹患阿尔兹海默氏病的受试者选择治疗。可从来自所述受试者的囊泡评估一种或多种生物标志物,诸如但不限于β-淀粉样蛋白、淀粉样前体蛋白(APP)、APP670/671、APP693、APP692、APP715、APP716、APP717、APP723、早衰蛋白1、早衰蛋白2、脑脊液淀粉样β蛋白42(CSF-Aβ42)、脑脊液淀粉样β蛋白40(CSF-Aβ40)、F2异前列烷、4-羟基壬烯醛、F4 neuroprostane和丙烯醛。根据所述一种或多种生物标志物的一种或多种特征,可将所述受试者确定为针对治疗(诸如但不限于多奈哌齐、加兰他敏、美金刚、利伐斯的明、他克林或其组合)的响应者或非响应者。
在另一个实施方案中,可以为罹患帕金森氏病的受试者选择治疗。可从来自所述受试者的囊泡评估一种或多种生物标志物,诸如但不限于α突触核蛋白、PARK7(DJ-1)、S期激酶相关蛋白1A(p19A/SKP1A)、热休克蛋白70kDa、AMP调控磷酸蛋白(ARPP-21)、囊泡单胺成员2(VMAT2)、醇脱氢酶5(ADH5)、醛脱氢酶1A1(ALDH1A1)、埃格尔9同源物1(EGLN1)、脯氨酸羟化酶2(PHD2)以及缺氧诱导因子(HIF)。根据所述一种或多种生物标志物的一种或多种特征,可将所述受试者确定为针对治疗(诸如但不限于表16所列的那些)的响应者或非响应者。
在另一个实施方案中,可以为罹患帕金森氏病的受试者选择治疗。可从来自所述受试者的囊泡评估一种或多种生物标志物,诸如但不限于CRP、TNF、IL-6、S100B和MMP。根据所述一种或多种生物标志物的一种或多种特征,可将所述受试者确定为针对治疗的响应者或非响应者。
因此,可根据受试者的囊泡的生物印记为罹患神经相关状况或神经状况或疾病的受试者选择治疗。
生物印记发现
本文提供的系统和方法可用于鉴定囊泡的新型生物印记,诸如用于对表型进行诊断、预后或治疗诊断的一种或多种新型生物标志物。在一个实施方案中,可从具有表型的受试者分离一种或多种囊泡并且确定所述一种或多种囊泡的生物印记。所述生物印记可与不具所述表型的受试者进行比较。可测定两种生物印记之间的差异并将其用于形成新型生物印记。所述新型生物印记可随后用于将另一受试者鉴定为具有所述表型或不具所述表型。
来自具有特定表型的受试者的生物印记可与来自不具所述特定表型的受试者的生物印记进行差异比较。所述一种或多种差异可以是所述囊泡的任意特征的差异。例如,在来自具有特定表型的受试者的生物印记与来自不具有所述特定表型的受试者的生物印记之间,样品中的囊泡的水平和量、囊泡的半衰期、囊泡的循环中半衰期、囊泡的代谢半衰期或者囊泡的活性或其任意组合可以不同。
在一些实施方案中,在来自具有特定表型的受试者的生物印记与来自不具有所述特定表型的受试者的生物印记之间,一种或多种生物标志物不同。例如,在来自具有特定表型的受试者的生物印记与来自不具有所述特定表型的受试者的生物印记之间,一种或多种生物标志物的表达水平、存在、不存在、突变、变异体、拷贝数量变异、截短、重复、修饰、分子关联或其任意组合可不同。所述生物标志物可以是本文公开的任意生物标志物,或者是可用于表征生物实体的生物标志物,其包括循环生物标志物(诸如蛋白质或微RNA)、囊泡或存在于囊泡中或囊泡上的组分,诸如任意核酸(如RNA或DNA)、蛋白质、肽、多肽、抗原、脂质、碳水化合物或蛋白聚糖。
在一个方面,本发明提供了发现新型生物印记的方法,包括对两个或更多个样品组之间的生物标志物进行比较以鉴定在样品组之间显示出差异的生物标志物。可以以小组形式(panel format)评估多种标志物以潜在地改善单个标志物的性能。在一些实施方案中,以多重的方式评估所述多种标志物。可使用本文所述的统计判别分析和归类方法评估单个标志物和标志物组区分各个组的能力。标志物的最优小组可用作用于表征所分析的表型的生物印记,诸如提供对疾病或状况的诊断、预后或治疗诊断。优化可基于多种标准进行,包括但不限于最大化ROC AUC、精确性、特定特异性下的灵敏度或特定灵敏度下的特异性。所述小组可包括来自多种类型的生物标志物。例如,所述生物印记可包含可用于捕获目标囊泡群体的囊泡抗原,并且所述生物印记可进一步包含所述囊泡群体中的有效负载标志物,其包括但不限于微RNA、mRNA或可溶蛋白。最优组合可确认为在比较两种情况时具有最高ROC AUC值的囊泡抗原和有效负载标志物的组合。作为另一实例,可通过评估囊泡群体以及评估并非由分离外来体而获得的循环生物标志物(诸如循环蛋白质和/或微RNA)而确定所述生物印记。
所述表型可以是本文所列的任意表型,如,列于上文“表型”部分中。例如,所述表型可以是增殖性失调,诸如癌症或非恶性生长,围产期或妊娠相关状况、感染性疾病、神经失调、心血管疾病、炎性疾病、免疫疾病或自身免疫疾病。所述癌症包括但不限于肺癌、非小细胞癌、小细胞肺癌(包括小细胞癌(燕麦细胞癌)、小细胞/大细胞混合癌以及复合性小细胞癌)、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌、胰腺癌、脑癌、肾癌、卵巢癌、胃癌、黑色素瘤、骨癌、胃的癌、乳腺癌、胶质细胞瘤、胶质母细胞瘤、肝细胞癌、乳头状肾癌、头颈部鳞状细胞癌、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤或其它实体肿瘤。
可评估本文所述的任意生物标志物类型或特定生物标志物以发现新型生物印记。在一个实施方案中,选择用于发现的生物标志物包含本文所列的细胞特异性生物标志物,其包括但不限于图1-60、表9-11或表27-41中所列的基因和微RNA。所述生物标志物可包含一种或多种药物相关靶标,诸如ABCC1、ABCG2、ACE2、ADA、ADH1C、ADH4、AGT、AR、AREG、ASNS、BCL2、BCRP、BDCA1、βIII微管蛋白、BIRC5、B-RAF、BRCA1、BRCA2、CA2、小窝蛋白、CD20、CD25、CD33、CD52、CDA、CDKN2A、CDKN1A、CDKN1B、CDK2、CDW52、CES2、CK 14、CK 17、CK 5/6、c-KIT、c-Met、c-Myc、COX-2、细胞周期蛋白D1、DCK、DHFR、DNMT1、DNMT3A、DNMT3B、E-钙粘蛋白、ECGF1、EGFR、EML4-ALK融合体、EPHA2、表皮调节素、ER、ERBR2、ERCC1、ERCC3、EREG、ESR1、FLT1、叶酸受体、FOLR1、FOLR2、FSHB、FSHPRH1、FSHR、FYN、GART、GNRH1、GNRHR1、GSTP1、HCK、HDAC1、hENT-1、Her2/Neu、HGF、HIF1A、HIG1、HSP90、HSP90AA1、HSPCA、IGF-1R、IGFRBP、IGFRBP3、IGFRBP4、IGFRBP5、IL13RA1、IL2RA、KDR、Ki67、KIT、K-RAS、LCK、LTB、淋巴毒素β受体、LYN、MET、MGMT、MLH1、MMR、MRP1、MS4A1、MSH2、MSH5、Myc、NFKB1、NFKB2、NFKBIA、ODC1、OGFR、p16、p21、p27、p53、p95、PARP-1、PDGFC、PDGFR、PDGFRA、PDGFRB、PGP、PGR、PI3K、POLA、POLA1、PPARG、PPARGC1、PR、PTEN、PTGS2、RAF1、RARA、RRM1、RRM2、RRM2B、RXRB、RXRG、SIK2、SPARC、SRC、SSTR1、SSTR2、SSTR3、SSTR4、SSTR5、存活素、TK1、TLE3、TNF、TOP1、TOP2A、TOP2B、TS、TXN、TXNRD1、TYMS、VDR、VEGF、VEGFA、VEGFC、VHL、YES1和ZAP70。所述生物标志物可包含一种或多种一般囊泡标志物、一种或多种细胞特异性囊泡标志物和/或一种或多种疾病特异性囊泡标志物。
用于生物印记发现的生物标志物可包含通常与囊泡相关的标志物,其包括但不限于HSPA8、CD63、Actb、GAPDH、CD9、CD81、ANXA2、HSP90AA1、ENO1、YWHAZ、PDCD6IP、CFL1、SDCBP、PKN2、MSN、MFGE8、EZR、YWHAG、PGK1、EEF1A1、PPIA、GLC1F、GK、ANXA6、ANXA1、ALDOA、ACTG1、TPI1、LAMP2、HSP90AB1、DPP4、YWHAB、TSG101、PFN1、LDHB、HSPA1B、HSPA1A、GSTP1、GNAI2、GDI2、CLTC、ANXA5、YWHAQ、TUBA1A、THBS1、PRDX1、LDHA、LAMP1、CLU和CD86中的一种或多种。所述生物标志物可进一步包括CD63、GAPDH、CD9、CD81、ANXA2、ENO1、SDCBP、MSN、MFGE8、EZR、GK、ANXA1、LAMP2、DPP4、TSG101、HSPA1A、GDI2、CLTC、LAMP1、Cd86、ANPEP、TFRC、SLC3A2、RDX、RAP1B、RAB5C、RAB5B、MYH9、ICAM1、FN1、RAB11B、PIGR、LGALS3、ITGB1、EHD1、CLIC1、ATP1A1、ARF1、RAP1A、P4HB、MUC1、KRT10、HLA-A、FLOT1、CD59、C1orf58、BASP1、TACSTD1和STOM中的一种或多种。其它生物标志物可选自ExoCarta数据库中公开的生物标志物,所述数据库可见于exocarta.ludwig.edu.au,其公开了在外来体中鉴定的蛋白质和RNA分子。还参见Mathivanan和Simpson,ExoCarta:A compendium of exosomal proteinsand RNA.Proteomics.2009年11月9日(21):4997-5000。
用于生物印记发现的生物标志物可包含通常与囊泡相关的标志物,其包括但不限于A33、a33 n15、AFP、ALA、ALIX、ALP、膜联蛋白V、APC、ASCA、ASPH(246-260)、ASPH(666-680)、ASPH(A-10)、ASPH(D01P)、ASPH(D03)、ASPH(G-20)、ASPH(H-300)、AURKA、AURKB、B7H3、B7H4、BCA-225、BCNP1、BDNF、BRCA、CA125(MUC16)、CA-19-9、C-Bir、CD1.1、CD10、CD174(Lewis y)、CD24、CD44、CD46、CD59(MEM-43)、CD63、CD66e CEA、CD73、CD81、CD9、CDA、CDAC11a2、CEA、C-Erb2、C-erbB2、CRMP-2、CRP、CXCL12、CYFRA21-1、DLL4、DR3、EGFR、Epcam、EphA2、EphA2(H-77)、ER、ErbB4、EZH2、FASL、FRT、FRT c.f23、GDF15、GPCR、GPR30、Gro-α、HAP、HBD1、HBD2、HER 3(ErbB3)、HSP、HSP70、hVEGFR2、iC3b、IL 6 Unc、IL-1B、IL6 Unc、IL6R、IL8、IL-8、INSIG-2、KLK2、L1CAM、LAMN、LDH、MACC-1、MAPK4、MART-1、MCP-1、M-CSF、MFG-E8、MIC1、MIF、MIS RII、MMG、MMP26、MMP7、MMP9、MS4A1、MUC1、MUC1seq1、MUC1seq11A、MUC17、MUC2、Ncam、NGAL、NPGP/NPFF2、OPG、OPN、p53、p53、PA2G4、PBP、PCSA、PDGFRB、PGP9.5、PIM1、PR(B)、PRL、PSA、PSMA、PSME3、PTEN、R5-CD9 Tube 1、Reg IV、RUNX2、SCRN1、seprase、SERPINB3、SPARC、SPB、SPDEF、SRVN、STAT 3、STEAP1、TF(FL-295)、TFF3、TGM2、TIMP-1、TIMP1、TIMP2、TMEM211、TMPRSS2、TNF-α、Trail-R2、Trail-R4、TrKB、TROP2、Tsg 101、TWEAK、UNC93A、VEGFA和YPSMA-1中的一种或多种。所述生物标志物可包括NSE、TRIM29、CD63、CD151、ASPH、LAMP2、TSPAN1、SNAIL、CD45、CKS1、NSE、FSHR、OPN、FTH1、PGP9、膜联蛋白1、SPD、CD81、EPCAM、PTH1R、CEA、CYTO 7、CCL2、SPA、KRAS、TWIST1、AURKB、MMP9、P27、MMP1、HLA、HIF、CEACAM、CENPH、BTUB、INTG b4、EGFR、NACC1、CYTO 18、NAP2、CYTO 19、ANNEXIN V、TGM2、ERB2、BRCA1、B7H3、SFTPC、PNT、NCAM、MS4A1、P53、INGA3、MUC2、SPA、OPN、CD63、CD9、MUC1、UNCR3、PAN ADH、HCG、TIMP、PSMA、GPCR、RACK1、PCSA、VEGF、BMP2、CD81、CRP、PRO GRP、B7H3、MUC1、M2PK、CD9、PCSA和PSMA中的一种或多种。所述生物标志物可包括TFF3、MS4A1、EphA2、GAL3、EGFR、N-gal、PCSA、CD63、MUC1、TGM2、CD81、DR3、MACC-1、TrKB、CD24、TIMP-1、A33、CD66 CEA、PRL、MMP9、MMP7、TMEM211、SCRN1、TROP2、TWEAK、CDACC1、UNC93A、APC、C-Erb、CD10、BDNF、FRT、GPR30、P53、SPR、OPN、MUC2、GRO-1、tsg 101和GDF15中的一种或多种。在实施方案中,用于发现生物印记的生物标志物包含在图99、100、108A-C、114A和/或115A-E中示出的一种或多种生物标志物。
技术人员应当理解,本文公开或可用于在两个目标样品或样品组之间进行比较的任意标志物可用于针对任意给定可加以比较的生物学状况发现新型生物印记。
所述一种或多种差异可随后用于形成所述特定表型的新型生物印记,诸如对状况的诊断、对疾病或状况的阶段的诊断、对状况的预后或对状况的治疗诊断。所述新型生物印记可随后用于在其它受试者中鉴定所述表型。可确定针对新受试者的囊泡生物印记并将其与所述新型印记进行比较以确定所述受试者是否具有所述新型生物印记从中鉴定的特定表型。
例如,患有癌症的受试者的生物印记可与未患癌症的另一受试者进行比较。任何差异可用于形成用于所述癌症的诊断的新型生物印记。在另一个实施方案中,患有晚期癌症的受试者的生物印记可与患有较早期癌症的另一受试者进行比较。任何差异可用于形成新型生物印记以用于对癌症阶段的分类。在又另一个实施方案中,患有晚期癌症的受试者的生物印记可与患有较早期癌症的受试者进行比较。任何差异可用于形成新型生物印记以用于对癌症阶段的分类。
在一个实施方案中,所述表型是药物抗性或对于疗法的非反应性。可从对特定治疗的非响应者中分离一种或多种囊泡并且确定所述囊泡的生物印记。获自所述非响应者的囊泡的生物印记可与来自响应者的囊泡的生物印记进行比较。可比较来自所述非响应者的生物印记与来自所述响应者的生物印记之间的差异。所述一种或多种差异可以是囊泡的任意特征的差异。例如,在来自非响应者的生物印记与来自响应者的生物印记之间,所述样品的囊泡的水平和量、囊泡的半衰期、囊泡的循环半衰期、囊泡的代谢半衰期、囊泡的活性或其任意组合可不同。
在一些实施方案中,在来自非响应者的生物印记与来自响应者的生物印记之间,一种或多种生物标志物不同。例如,在来自非响应者的生物印记与来自响应者的生物印记之间,一种或多种生物标志物的表达水平、存在、不存在、突变、变异体、拷贝数量变异、截短、重复、修饰、分子关联或其任意组合可不同。
在一些实施方案中,所述差异可在于囊泡中存在的药物或药物代谢物的量。可使用治疗剂治疗响应者和非响应者。可进行所述响应者的生物印记和所述非响应者的生物印记之间的比较,来自所述响应者的囊泡中存在的药物或药物代谢物的量可不同于来自所述非响应者的囊泡中存在的药物或药物代谢物的量。所述差异也可在于所述药物或药物代谢物的半衰期。所述药物或药物代谢物的量或半衰期的差异可用于形成新型生物印记以用于鉴定非响应者和响应者。
可用于本文所述的方法和组合物的囊泡可通过利用其生理化学特征而发现。例如,囊泡可根据其大小而发现,例如,通过在已知的30-120nm直径范围内过滤生物物质。可将基于大小的发现方法用于囊泡分离,诸如差速离心、蔗糖梯度离心或过滤。
囊泡可根据其分子成分而发现。基于分子特性的发现方法包括但不限于,使用识别与囊泡相关的分子的抗体进行的免疫分离。例如,与囊泡相关的表面分子包括但不限于,MHC-II分子、CD63、CD81、LAMP-1、Rab7或Rab5。
本领域中已知的多种技术可应用于囊泡的验证和鉴定。可用于囊泡的验证和鉴定的技术包括但不限于,Western印迹、电子显微法、免疫组织化学、免疫电子显微法、FACS(荧光激活细胞分选术)、电泳(1维、2维)、液相色谱、质谱、MALDI-TOF(基质辅助激光解吸/电离飞行时间)、ELISA、LC-MS-MS和nESI(纳米电喷雾)。例如美国专利2009/0148460描述了ELISA方法用于鉴定囊泡的用途。美国专利2009/0258379描述了膜囊泡从生物液体中的分离。
可针对一种或多种核酸、脂质或多肽(诸如表面蛋白或肽,或者囊泡内的蛋白质或肽)进一步分析囊泡。可通过各种技术(包括与如液相色谱这样的纯化方法偶联的质谱)鉴定候选肽。可随后分离肽并通过测序鉴定其序列。基于肽精确质量预测序列的计算机程序也可用于揭示分离自囊泡的肽的序列。例如,LTQ-Orbitrap质谱可用于高灵敏度和高准确性的肽测序。LTQ-Orbitrap法已经被描述(Simpson等,Expert Rev.Proteomics 6:267-283,2009),其全文以引用的方式并入本文。
囊泡组合物
此外,本文还提供了具有特定生物印记的分离的囊泡。分离的囊泡可以包括对特定的细胞类型特异性的或者用于表征表型的一种或多种生物标志物或生物印记,如上文所述。例如,分离的囊泡可以包括一种或多种生物标志物,例如CD63、EpCam、CD81、CD9、PCSA、PSMA、B7H3、TNFR、MFG-E8、Rab、STEAP、5T4或CD59。分离的囊泡可以包含一种或多种以下生物标志物:EpCam、CD9、PCSA、CD63、CD81、PSMA、B7H3、PSCA、ICAM、STEAP和EGFR。在一个实施方案中,所述囊泡是EpCam+、CK+、CD45-。所述分离的囊泡在其表面上或所述囊泡中可以具有该一种或多种生物标志物。此外,所述分离的囊泡还可以包括一种或多种miRNA,例如miR-9、miR-629、miR-141、miR-671-3p、miR-491、miR-182、miR-125a-3p、miR-324-5p、miR-148B或miR-222。在一个实施方案中,所述囊泡包含一种或多种miRNA,例如miR-548c-5p、miR-362-3p、miR-422a、miR-597、miR-429、miR-200a和miR-200b。在又另一个实施方案中,所述囊泡包含一种或多种miRNA,例如miR-92a-2*、miR-147、miR-574-5p。分离的囊泡可以包含生物标志物,例如CD66,并且进一步包含选自EpCam、CD63或CD9的一种或多种生物标志物。分离的囊泡还可以包含融合基因或蛋白质,例如TMRSSG2:ERG。
分离的囊泡还可以包含一种或多种生物标志物,其中与源自正常细胞(即,来自不具有目标表型的受试者的细胞)的分离囊泡相比,分离的囊泡的所述一种或多种生物标志物的表达水平较高、较低或相同。例如,分离的囊泡可以包含选自:B7H3、PSCA、MFG-E8、Rab、STEAP、PSMA、PCSA、5T4、miR-9、miR-629、miR-141、miR-671-3p、miR-491、miR-182、miR-125a-3p、miR-324-5p、miR-148b和miR-222中的一种或多种生物标志物,其中与源自正常细胞的囊泡相比,所述分离的囊泡的一种或多种生物标志物的表达水平更高。所述分离的囊泡可以包含选自所述组中的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、13、14、15、16、17、18或19种生物标志物。所述分离的囊泡可以进一步包含选自EpCam、CD63、CD59、CD81或CD9中的一种或多种生物标志物。
分离的囊泡可以包含生物标志物PCSA、EpCam、CD63和CD8;生物标志物PCSA、EpCam、B7H3和PSMA。分离的囊泡可以包含生物标志物miR-9、miR-629、miR-141、miR-671-3p、miR-491、miR-182、miR-125a-3p、miR-324-5p、miR-148b和miR-222。
本文还提供了包含分离的囊泡的组合物。所述的组合物可以包含一种或多种分离的囊泡。例如,所述的组合物可以包含多种囊泡或者囊泡的一个或多个群体。
所述的组合物可以为囊泡明显富集的。例如,所述的组合物基本上不存在细胞碎片、细胞、非外来体蛋白质、肽或核酸(例如所述囊泡中不包含的生物分子)。所述细胞碎片、细胞、非外来体蛋白质、肽或核酸可能与囊泡一起存在于生物样品中。基本上不存在细胞碎片、细胞、非外来体蛋白质、肽或核酸(例如非包含于所述囊泡中的生物学分子)的组合物可以通过本文所公开的任何方法得到,例如通过使用针对一种或多种囊泡的一种或多种结合剂或捕获剂。所述的囊泡可以占总组合物的重量或质量的至少30、40、50、60、70、80、90、95或99%。所述组合物的囊泡可以为异质的或均质的囊泡群体。例如,均质的囊泡群体包括对于一种或多种性质或特征而言为均质的囊泡。例如,所述的一种或多种特征可以选自:一种或多种相同的生物标志物、基本上相似或一致的生物印记、源自相同的细胞类型、特定大小的囊泡以及它们的组合。
因此,在一些实施方案中,所述的组合物包含明显富集的囊泡群体。所述的组合物可以对于就一种或多种性质或特征而言至少30、40、50、60、70、80、90、95或99%均质的囊泡群体为富集的。例如,所述的一种或多种特征可以选自:一种或多种相同的生物标志物、基本上相似或一致的生物印记、源自相同的细胞类型、特定大小的囊泡以及它们的组合。例如,所述的囊泡群体可以通过全部具有特定的生物印记、具有相同的生物标志物、具有相同的生物标志物组合或者源自相同的细胞类型而成为均质的。在一些实施方案中,所述的组合物包括基本上均质的囊泡群体,例如,具有特定生物印记、源自特定的细胞或者这二者的群体。
囊泡群体可以包含一种或多种相同的生物标志物。所述的生物标志物可以为任何成分,例如,任何核酸(例如RNA或DNA)、蛋白质、肽、多肽、抗原、脂质、碳水化合物或蛋白聚糖。例如,群体中的各囊泡可以包含相同或一致的一种或多种生物标志物。在一些实施方案中,各囊泡包含相同的1、2、3、4、5、6、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、50、75或100种生物标志物。所述的一种或多种生物标志物可以选自图1、3-60。
包含相同或一致的生物标志物的囊泡群体可以指所述群体中的各囊泡具有相同的所述生物标志物的存在或不存在、表达水平、突变状态或修饰。例如,富集的囊泡群体可以包含其中各囊泡具有存在的相同生物标志物、缺乏的相同生物标志物、相同的生物标志物表达水平、相同的生物标志物修饰或者相同的生物标志物突变的囊泡。生物标志物的相同表达水平可以指定量或定性量度,例如,与参照水平相比,所述群体中的囊泡对于生物标志物是表达不足的、过表达的或者具有相同的表达水平。
或者,生物标志物的相同表达水平可以为代表对于群体中各囊泡相似的生物标志物表达的数值。例如,各囊泡的miRNA的拷贝数、蛋白质的量或者mRNA的水平可以对于群体中的各囊泡在数量上是近似的,使得各囊泡的数量值与所述群体中各其它囊泡的量相差±1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20%,只要这种变异是合适的即可。
在一些实施方案中,所述的组合物包含明显富集的囊泡群体,其中在所述富集群体中的囊泡具有基本上相似或一致的生物印记。所述的生物印记可以包含一种或多种囊泡特征,例如囊泡的水平或量、囊泡半衰期变异的时间评价、循环囊泡半衰期、囊泡的代谢半衰期或者囊泡的活性。所述的生物印记还可以包括生物标志物的存在或不存在、表达水平、突变状态或修饰,诸如本文所述的那些。
所述群体中各囊泡的生物印记可以至少30、40、50、60、70、80、90、95或99%相同。在一些实施方案中,各囊泡的生物印记为100%相同。在所述富集的群体中各囊泡的生物印记可以具有相同的1种、2种、3种、4种、5种、6种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种、12种、13种、14种、15种、16种、17种、18种、19种、20种、25种、50种、75种或100种特征。例如,在富集的群体中囊泡的生物印记可以为第一生物标志物存在、第二生物标志物存在以及第三生物标志物表达不足。相同的群体中的另一囊泡可以为100%相同,即具有存在的相同第一和第二生物标志物以及第三生物标志物表达不足。或者,相同群体中的囊泡可以具有相同的第一和第二生物标志物,但是没有第三生物标志物的表达不足。
在一些实施方案中,所述的组合物包含明显富集的囊泡群体,其中所述的囊泡源自相同的细胞类型。例如,所述的囊泡可以全部源自特定组织的细胞、来自特定目标肿瘤或目标疾病组织的细胞、循环肿瘤细胞或者母体或胎儿起源的细胞。所述的囊泡可以全部源自肿瘤细胞。所述的囊泡可以全部源自肺、胰腺、胃、肠、膀胱、肾、卵巢、睾丸、皮肤、结肠直肠、乳腺、前列腺、脑、食管、肝脏、胎盘或胎儿细胞。
包含明显富集的囊泡群体的组合物还可以包含特定大小的囊泡。例如,所述的囊泡可以全部具有大于约10、20或30nm的直径。它们可以全部具有约30-1000nm、约30-800nm、约30-200nm或者约30-100nm的直径。在一些实施方案中,所述的囊泡可以全部具有小于约10,000nm、1000nm、800nm、500nm、200nm、100nm或50nm的直径。
对于一种或多种特征而言为均质的囊泡群体可以占所述组合物的总囊泡群体的至少约30、40、50、60、70、80、90、95或99%。在一些实施方案中,包含明显富集的囊泡群体的组合物与所述组合物所来源的生物样品中囊泡的浓度相比,前者包含至少2、3、4、5、10、20、25、50、100、250、500或1000倍的囊泡浓度。在再其它的实施方案中,所述的组合物可以进一步包含第二富集的囊泡群体,其中对于如本文所述的一种或多种特征而言,所述的囊泡群体为至少30%均质的。
可以使用多重分析来获得对于多于一种囊泡群体(例如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10种囊泡群体)明显富集的组合物。各明显富集的囊泡群体可以占所述组合物的重量或质量的至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、46、47、48或49%。在一些实施方案中,明显富集的囊泡群体占所述组合物的重量或质量的至少约30、40、50、60、70、80、90、95或99%。
明显富集的囊泡群体可以通过使用本文所公开的一种或多种方法、工艺或系统来获得。例如,由样品中分离囊泡群体可以通过使用针对囊泡的一种或多种生物标志物的一种或多种结合剂来实施,例如使用靶向于囊泡的两种或更多种生物标志物的两种或更多种结合剂。可以使用一种或多种捕获剂来获得明显富集的囊泡群体。可以使用一种或多种检测试剂来鉴定明显富集的囊泡群体。
在一个实施方案中,具有特定生物印记的囊泡群体是通过使用针对所述生物印记的生物标志物的一种或多种结合剂而获得的。可以分离所述囊泡,从而得到包含具有特定生物印记的明显富集的囊泡群体的组合物。在另一个实施方案中,具有特定目标生物印记的囊泡群体可以通过使用针对并非目标生物印记的成分的生物标志物的一种或多种结合剂来获得。因此,所述的结合剂可以用于除去不具有目标生物印记的囊泡,并且所得的组合物对于具有特定目标生物印记的囊泡群体而言是明显富集的。所得的组合物可以基本上不存在包含所述结合剂针对的生物标志物的囊泡。
检测系统和试剂盒
还提供了配置为确定囊泡的一种或多种生物印记的检测系统。该检测系统可以用于检测异质囊泡群体或者一种或多种均质囊泡群体。所述的检测系统可以配置为检测多种囊泡,其中所述多种囊泡的至少一个亚组包含不同于所述多种囊泡的另一个亚组的生物印记。所述的检测系统检测至少2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、15种、20种、25种、30种、40种、50种、60种、70种、80种、90种或100种不同的囊泡亚组,其中各囊泡亚组包含不同的生物印记。例如,检测系统(例如使用了本文所公开的一种或多种方法、工艺和组合物)可以用于检测至少2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、15种、20种、25种、30种、40种、50种、60种、70种、80种、90种或100种不同的囊泡群体。
所述的检测系统可以被配置为评估一种或多种囊泡的至少2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、15种、20种、25种、30种、40种、50种、60种、70种、80种、90种、100种、1000种、2500种、5000种、7500种、10,000种、100,000种、150,000种、200,000种、250,000种、300,000种、350,000种、400,000种、450,000种、500,000种、750,000种或1,000,000种不同的生物标志物。在一些实施方案中,所述的一种或多种生物标志物选自图1、3-60,或者如本文所公开的生物标志物。所述的检测系统可以配置为评估特定的囊泡群体,例如来自特定细胞源的囊泡;或者用于评估多种特定的囊泡群体,其中各囊泡群体具有特定的生物印记。
所述的检测系统可以为低密度检测系统或高密度检测系统。例如,低密度检测系统可以检测最多达1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种或10种不同的囊泡群体,而高密度检测系统可以检测至少大约15种、20种、25种、50种或100种不同的囊泡群体。在另一个实施方案中,低密度检测系统可以检测最多达约100种、200种、300种、400种或500种不同的生物标志物,而高密度检测系统可以检测至少大约750种、1000种、2000种、3000种、4000种、5000种、6000种、7000种、8000种、9,000种、10,000种、15,000种、20,000种、25,000种、50,000种或100,000种不同的生物标志物。在又另一个实施方案中,低密度检测系统可以检测至多大约100种、200种、300种、400种或500种不同的生物印记或生物标志物组合,而高密度检测系统可以检测至少大约750种、1000种、2000种、3000种、4000种、5000种、6000种、7000种、8000种、9,000种、10,000种、15,000种、20,000种、25,000种、50,000种或100,000种生物印记或生物标志物组合。
所述的检测系统可以包含选择性地与囊泡杂交的探针。所述的检测系统可以包含用于检测囊泡的多种探针。在一些实施方案中,多种探针用于检测异质囊泡群体中的囊泡的量。在再其它的实施方案中,多种探针用于检测均质的囊泡群体。多种探针可以用于分离或检测至少两种不同的囊泡亚组,其中各囊泡亚组包含不同的生物印记。
检测系统(例如使用了本文所公开的一种或多种方法、工艺和组合物)可以包含多种探针,这些探针配置用于检测或分离(例如使用本文所公开的一种或多种方法、工艺和组合物)至少2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、15种、20种、25种、30种、40种、50种、60种、70种、80种、90种或100种不同的囊泡亚组,其中各囊泡亚组包含不同的生物印记。
例如,检测系统可以包含多种探针,这些探针被配置用于检测至少2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、15种、20种、25种、30种、40种、50种、60种、70种、80种、90种或100种不同的囊泡群体。所述的检测系统可以包含多种探针,这些探针被配置用于选择性地与一种或多种囊泡的至少2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、15种、20种、25种、30种、40种、50种、60种、70种、80种、90种、100种、1000种、2500种、5000种、7500种、10,000种、100,000种、150,000种、200,000种、250,000种、300,000种、350,000种、400,000种、450,000种、500,000种、750,000种或1,000,000种不同的生物标志物杂交。在一些实施方案中,所述的一种或多种生物标志物选自图1、3-60,或者如本文所公开的生物标志物。所述多种探针可以被配置用于评估特定的囊泡群体,例如来自特定细胞源的囊泡;或者用于评估多种特定的囊泡群体,其中各囊泡群体具有特定的生物印记。
所述的检测系统可以为包含用于检测囊泡的探针的低密度检测系统或高密度检测系统。例如,低密度检测系统可以包含用于检测至多1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种或10种不同的囊泡群体的探针,而高密度检测系统可以包含用于检测至少大约15种、20种、25种、50种或100种不同的囊泡群体的探针。在另一个实施方案中,低密度检测系统可以包含用于检测至多约100种、200种、300种、400种或500种不同的生物标志物的探针,而高密度检测系统可以包含用于检测至少约750种、1000种、2000种、3000种、4000种、5000种、6000种、7000种、8000种、9,000种、10,000种、15,000种、20,000种、25,000种、50,000种或100,000种不同的生物标志物的探针。在再另一个实施方案中,低密度检测系统可以包含用于检测最多达约100种、200种、300种、400种或500种不同的生物印记或生物标志物组合的探针,而高密度检测系统可以包含用于检测至少约750种、1000种、2000种、3000种、4000种、5000种、6000种、7000种、8000种、9,000种、10,000种、15,000种、20,000种、25,000种、50,000种或100,000种生物印记或生物标志物组合的探针。
所述的探针可以特异性地用于检测特定的囊泡群体,例如具有特定生物印记的囊泡以及上文所述的囊泡。此外,还提供了用于检测前列腺特异性囊泡的多种探针。多种探针可以包含用于检测一种或多种以下生物标志物的探针:CD9、PSCA、TNFR、CD63、MFG-E8、EpCAM、Rab、CD81、STEAP、PCSA、5T4、EpCAM、PSMA、CD59、CD66、CD24和B7H3。还提供了用于检测Bcl-XL、ERCC1、角蛋白15、CD81/TAPA-1、CD9、上皮特异性抗原(ESA)和肥大细胞糜蛋白酶的多种探针。
用于检测囊泡的一种或多种miRNA的多种探针可以包含用于检测一种或多种以下miRNA的探针:miR-9、miR-629、miR-141、miR-671-3p、miR-491、miR-182、miR-125a-3p、miR-324-5p、miR-148b和miR-222。在另一个实施方案中,所述多种探针包含用于检测EpCam、CD9、PCSA、CD63、CD81、PSMA、B7H3、PSCA、ICAM、STEAP和EGFR的一种或多种探针。在一些实施方案中,所述多种探针包含用于检测EpCam、CD9、PCSA、CD63、CD81、PSMA和B7H3的一种或多种探针。在其它实施方案中,所述多种探针包含用于检测EpCam、CD9、PCSA、CD63、CD81、PSMA、B7H3、PSCA、ICAM、STEAP和EGFR的一种或多种探针。在又另一个实施方案中,所述多种探针的一个亚组是针对EpCam、CD9、PCSA、CD63、CD81、PSMA、B7H3、PSCA、ICAM、STEAP和EGFR中的一种或多种的捕获剂,并且另一个亚组用于检测CD9、CD63和CD81中的一种或多种。多种探针还可包含用于检测miR-92a-2*、miR-147、miR-574-5p或其组合的一种或多种探针。多种探针还可包含用于检测miR-548c-5p、miR-362-3p、miR-422a、miR-597、miR-429、miR-200a、miR-200b或其组合的一种或多种探针。多种探针还可包含用于检测EpCam、CK和CD45的一种或多种探针。在一些实施方案中,所述一种或多种探针可以是捕获剂。在另一个实施方案中,所述探针可以是检测剂。在又另一个实施方案中,所述多种探针包含捕获剂和检测剂。
所述的探针(诸如捕获剂)可以与固定基底连接,例如阵列或珠。或者,所述的探针(诸如检测剂)是非连接的。所述的检测系统可以为基于阵列的系统、测序系统、基于PCR的系统或者基于珠的系统,例如上文所述的系统。所述的检测系统也可以为上文所述的微流体装置。
所述的检测系统可以为试剂盒的部分。或者,所述的试剂盒可以包括一种或多种探针组或者多种探针,如本文中所述。所述的试剂盒可以包括用于检测囊泡或多种囊泡(例如异质群体中的囊泡)的探针。所述的试剂盒可以包括用于检测均质的囊泡群体的探针。例如,所述的试剂盒可以包括用于检测特定细胞源囊泡群体或者具有相同的特定生物印记的囊泡群体的探针。
项目集
可以建立指导临床决策和疾病检测及管理的复用标志物的项目集,所述项目集中的生物印记的组合相对于单个生物印记或随机选择的生物印记组合表现出改善的灵敏度和特异性。在本发明的情况中,在相对于正常状态的疾病状态下,可以通过生物印记的表达展现的倍数差异来反映项目集的灵敏度。可以在与基因表达(例如具有目标状况(例如可以将标准差用作这种量度))的信号的相关性统计测量中反映的特异性。在考虑将生物印记组包含在项目集的过程中,测量中的小标准差与较高的特异性相关。此外,变异的其它量度(例如相关系数)也可以用于这种能力。
当在本发明中将生物标志物或生物印记组合时,可以应用体外诊断多元指数分析(IVDMIA)指南和规程。IVDMIA可以应用于定义为由基因、基因改变、突变、扩增、缺失、多态性或甲基化、或蛋白质、肽、多肽或RNA分子、miRNA、mRNA、snoRNA、hnRNA或可以组合的RNA的任何组合组成的2种或更多种标志物的集的生物印记,使得关于在所述组中生物印记集获得的信息提供用于作出临床相关判断(例如诊断、预后或治疗选择)的合理基础。这些生物印记集构成了本发明的各个项目集。与大多数诊断标志物相同,使用足以作出正确的医学判断的最少数量的标志物通常是理想的。这防止了在等待进一步分析的治疗延误以及不适当的时间和资源使用。优选的是,建立项目集以使得所述项目集中的生物印记的组合相对于单个生物印记或随机选择的生物印记组合而言表现出改善的灵敏度和特异性。在本发明的情况中,在相对于正常状态的疾病状态下,可以通过生物印记的表达所表现的倍数差异来反映项目集的灵敏度。特异性可反映于对基因表达的信号与(例如)目标状况的相关性统计学测量中。考虑包含在项目集中的生物印记的标志物组,可以一起用于计算值或评分的2种或多种标志物的标准差、方差、协方差、相关系数、加权平均值、算术和、平均值、乘法值、加权或平衡值或者这些值的任何数学操作(其作为整体可以显示产生更高的灵敏度、特异性、阴性预测值、阳性预测值或准确性)也可以用于这种能力中并且也在本发明的范围内。
在另一个实施方案中,可以使用模式识别方法。一个实例涉及针对各种生物标志物(或者生物印记项目集)来对比生物标志物的表达谱以归于诊断。构成生物印记项目集的各生物标志物的表达谱被固定在媒介中,例如计算机可读介质。
在一个实例中,可以建立表格,其中输入指示疾病或生理状态的信号(例如强度测量值)范围。然后,可以将实际的患者数据与表格中的值比较,从而确定患者的样品是否是正常的、良性的、患病的或者代表特定的生理状态。在更复杂的实施方案中,以数字或图形方式记录表达信号(例如荧光强度)的模式。在RNA的实例中,随后将来自生物标志物项目集(与患者样品结合使用)的表达模式与所述的表达模式相对比。然后,使用模式对比软件来确定患者的样品是否具有指示所述疾病的模式、指示给定预后的模式、指示对治疗的反应的可能性的模式或者指示特定生理状态的模式。然后,将样品的表达谱与对照细胞的项目集对比。如果所述的样品表达模式与疾病、预后或治疗相关反应的表达模式相一致,则(在不具有补充医学考虑的情况下)患者被诊断为符合与所述的这些各种不同的环境相关的状况。如果所述的样品表达模式与源自正常/对照囊泡群体的表达模式相一致,则对于这些状况,患者被诊断为是阴性的。
在另一个示例性实施方案中,建立生物标志物表达项目集的方法是通过使用优化算法,例如在建立储备项目集中广泛使用的平均方差算法。这种方法在美国申请公开No.20030194734中进行了详细的描述,其以引用方式并入本文。或者,可以使用美国专利No.7,089,168、7,415,359和美国申请公开No.20080208784、20040243354和20040088116中所述的算法、系统和方法来建模并分析所测量的DNA改变,针对效力和毒性的表型读数的mRNA、蛋白质或代谢物的变化,各文献全文均以引用方式全部并入本文。
生物印记项目集选择和对未知的表征的示例性过程总结如下:
(1)选择基线类别。
(2)针对基线类别样品,计算各种生物标志物的平均值和标准差。
(3)计算各生物标志物的(X*标准差+平均值)。这是所有其它的样品将进行比较的基线读值。X为严格性变量,较高的X值比较低的X值更严格。
(4)计算各实验样品与步骤3中计算得到的基线读数的比率。
(5)变换比率以使得低于1的比率为负值(例如,使用以10为底的对数)。(表达不足的生物标志物现在适当地具有MV优化所需的负值)。
(6)这些变换的比率作为输入值用于替代通常在软件应用中使用的价值回复(asset returns)。
(7)所述的软件绘出有效的边界,并在沿着有效边界的任何点处返回优化的项目集。
(8)选择有效边界上的所需返回值或方差。
(9)通过加和各基因的强度值与权重的积来计算各样品项目集的值,权重由项目集选择算法产生。
(10)通过将基线组的平均生物印记项目集值与Y和所述基线生物印记项目集值的标准差之积相加来计算边界值。大于该边界值的值应该被归类为实验类别。
(11)任选地,可重复该过程直到最佳预测。
此外,选择生物印记项目集还可以包括启发式规则的应用。优选的是,这种规则是基于生物学以及对用于产生临床结果的技术的理解而规划的。更优选的是,它们应用于来自优化方法的输出。例如,对于在具有特定疾病的受试者中差异表达的多种生物标志物而言,生物印记项目集选择的平均方差方法可以应用于微阵列数据。所述方法的输出为可以包括在囊泡以及疾病组织中表达的那些生物标志物的生物标志物的优化组。如果用于测试方法中的样品得自囊泡并且在疾病或生理状态的情况中差异表达的某些生物标志物在囊泡中也是差异表达的,则可以使用启发式规则,其中生物印记项目集选自排除了在囊泡中差异表达的有效边界。当然,可以在形成有效边界之前应用所述的规则(例如通过在数据预选过程中应用所述的规则)。
用于进行大规模资料组的线性和非线性特征子空间的分析、特征提取和信号解卷积来鉴定囊泡源的多重分析物谱来进行诊断、预后和治疗选择和/或确定生理状态的表征的其它统计、数学和计算机算法可以使用无监督分析方法的任何组合来实施,包括但不限于:主成分分析(PCA)以及线性和非线性独立成分分析(ICA);盲源分离、非高斯分析、天然梯度最大似然性评估;联合近似对角化;本征矩阵;高斯径向基函数、内核和多项内核分析连续漂浮前向选择。
计算机系统
可以针对分子特征来分析囊泡,例如通过测定一种或多种生物标志物(例如图1、3-60中所列的)的量、存在或不存在。所生成的数据可以用于产生生物印记,其可以通过计算机系统储存并分析,例如图65所示。此外,分析生物印记或者将生物印记与一种或多种表型相关联也可以通过计算机系统来实施(例如通过使用计算机可执行逻辑)。
计算机系统(例如图65中所示)可以用于在分析后传送数据和结果。因此,图65为示出了代表性示例逻辑设备的简图,通过该设备可分析来自囊泡的结果并报告或产生所述分析。图65示出了计算机系统(或数字装置)800以接收或储存由囊泡产生的数据、分析所述数据以产生一种或多种生物印记和产生一种或多种生物印记(或表型表征)的报告。此外,所述的计算机系统还可以对所产生的生物印记实施比较和分析,并传送所得的结果。或者,所述的计算机系统可以接受囊泡分析的原始数据(例如通过网络传送数据),并进行分析。
计算机系统800可以理解为能够从介质811和/或网络端口805读取指令的逻辑设备,其可以任选地与具有固定介质812的服务器809连接。图65中所示的系统包括CPU 801、磁盘驱动器803、任选的输入装置诸如键盘815和/或鼠标816,以及任选的监视器807。与本地或远和位置的服务器809的数据通信可以通过所示的通信媒介来实现。所述的通信媒介可以包括传送和/或接收数据的任何手段。例如,通信媒介可以为网络连接、无线连接或互联网连接。这种连接可以在万维网上提供通信。可以想象,关于本发明的数据可以在这些网络或连接上进行传送,以便被某方822所接收和/或审阅。接收方822可以是但不限于个体、医疗保健提供者或者医疗保健管理者。因此,有关测试结果的信息和数据可以这个世界的任何地方产生并被传送至不同地点。例如,当在不同的建筑物、城市、州、国家、大陆或海外进行分析时,测试结果的信息和数据可根据上文所述生成并形成为可传送的形式。因此,可传送形式的测试结果可被输入美国以到达接收方822。因此,本发明还涵盖了用于产生针对来自个体的一种或多种样品的诊断的可传送形式的信息。所述方法包括的步骤有:(1)根据本发明的方法由所述样品确定诊断、预后或治疗诊断等等;以及(2)将所述确定步骤的结果体现为可传送形式。所述可传送形式是所述生产方法的产物。在一个实施方案中,计算机可读介质包括适用于传送生物样品分析的结果(例如生物印记)的介质。所述的媒介可以包括涉及囊泡的结果(例如受试者的生物印记),其中所述的结果是使用本文所述的方法得到的。
囊泡的体外采集
此外,用于分析和确定表型的囊泡还可以来自离体采集。可以对细胞进行培养,由培养物中的目标细胞释放的囊泡可以是自发得到或者可以进行刺激从而将囊泡释放到培养基中。(例如参见Zitvogel等1998.Nat.Med.4:594–600;Chaput等2004.J.Immunol.172:2137–214631:2892–2900;Escudier等2005.J.Transl.Med.3:10;Morse等2005,J.Transl.Med.3:9;Peche等2006.Am.J.Transplant.6:1541–1550;Kim等2005.J.Immunol.174:6440–6448,所有这些文献全文以引用方式并入本文)。可以在细胞系或组织样品生长至80%汇合后,在新鲜的DMEM中培养72小时。随后可以刺激囊泡生成(例如参见Dressel等2003.Cancer Res.63:8212-8220所述的黑色素瘤细胞的热休克处理,其全文以引用方式并入本文)。然后,可以收获上清液,并按照本文所述制备囊泡。
在一个实例中,离体产生的囊泡可以由目标细胞源或细胞系培养得到,囊泡可以由细胞培养基分离得到并随后使用磁性标记物、荧光部分、放射性同位素、酶、化学反光探针、金属颗粒、非金属胶状颗粒、聚合物染料颗粒、颜料分子、颜料颗粒、电化学活性的物质、半导体纳米晶体或其它纳米颗粒(包括在体内作为用于成像分析的标记物而被再次引入的量子点或金颗粒)进行标记。可以通过建立针对具有目标特征的给定细胞源(例如肺癌细胞或具有已知的EGFR突变的细胞系的培养物,其中所述的突变赋予了对吉非替尼的抗性或易感性)的培养条件;然后将所述的细胞培养物暴露于吉非替尼;分离由所述的培养物产生的囊泡和随后在发现阵列上分析这些囊泡以寻找于囊泡外侧表达的新型抗原或结合剂(该抗原或结合剂可以用作生物印记以捕获该种类的囊泡)使用离体培养的囊泡替代地鉴定新型的生物印记。此外,有可能分离在这些囊泡中发现的任何其它生物标志物或生物印记以用于发现可以具有临床诊断、预后或治疗相关的提示的新型印记(包括但不限于核酸、蛋白质、脂质或它们的组合)。
也可以首先从目标组织中分离目标细胞并进行培养。例如,可以使用无菌设备和塑料器具由患者的头皮上单独地拔下处于生长阶段(毛发生长初期)的人类毛发的毛囊,注意不要损伤毛囊。可以将各样品转移到装有用于组织培养的无菌PBS的皮氏培养皿中。可以将分离的人类毛发生长初期的毛发毛囊小心地转移至装有1ml William’s E培养基的24孔平板的单个孔中。可以将毛囊以自由浮动的方式保持在37℃、5%CO2和95%空气的气氛中的加湿孵育箱中。可每3天更换培养基,注意不要损伤毛囊。然后,收集细胞,并由培养基中离心。然后,可以使用之前所描述的方法,使用对所述的细胞源特异性的囊泡具有特异性的抗原或细胞结合伴体来分离囊泡。然后可以通过本领域的技术人员所知的方法来分离和鉴定生物标志物和生物印记。
还可以在微重力或失重条件下或者在自由下落的环境下培养目标细胞。例如,NASA生物反应器技术可以使所述的细胞以快得多的速率及大得多的数量生长。然后,可以使用之前所述的方法,使用对所述的细胞源特异性的囊泡具有特异性的抗原或细胞结合伴体来分离囊泡。
旋转壁容器或RWVersus为一类由NASA开发并用于NASA的生物反应器,其被设计为在模仿了微重力的静态环境下生长细胞的悬浮培养物。(例如参见美国专利No.5,026,650;5,153,131;5,153,133;5,437,998;5,665,594;5,702,941;7,351,584,5,523,228,5,104,802,6,117,674;Martin等,Trends in biotechnology 2004;22;80-86,Li等,BiochemicalEngineering Journal 2004;18;97-104,Ashammakhi等,Journal NanoscienceNanotechnology 2006;9-10:2693-2711,Zhang等,International Journal of Medicine2007;4:623-638,Cowger,N L等,Biotechnol.Bioeng 64:14-26,1999,Spaulding,G F等,J.Cell.Biochem.51:249-251,1993,Goodwin,T J等,Proc.Soc.Exp.Biol.Med.202:181-192,1993;Freed,LE等,In Vitro Cell.Dev.Biol.33:381-385,1997,Clejan,S.等,Biotechnol.Bioeng.50:587-597,1996).Khaoustov,VI等,In Vitro Cell.Dev.Biol.35:501-509.1999,各文献全文均以引用方式并入本文)。
或者,可以按照在美国专利No.6,911,201以及美国申请公开No.20050181504、20050180958、20050176143和20050176137中一般地描述的方法,在固定相活塞流生物反应器中培养已经分离的目标细胞或细胞源特异性的囊泡,各文献全文均以引用方式并入本文。或者,还可以按照在美国专利No.5,486,359中一般描述的方法来分离和培养目标细胞或细胞源特异性的囊泡。
如美国专利No.5,486,359(其全文以引用的方式并入本文中)一般地描述的,一个实施方案可以包括以下步骤:提供包含目标细胞或细胞源特异性囊泡的组织样本;将来自该组织样本的细胞或囊泡加入到培养基中,其在进行培养时允许仅目标细胞或细胞源特异性的囊泡选择性地粘附到基底表面上;培养样本-培养基混合物;并由基底表面上除去未粘附的物质。