CN102869762A - 重新接种中空纤维生物反应器系统中生长的贴壁细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及直接重新接种收集的在中空纤维生物反应器中生长的贴壁细胞的方法。本发明还公开了一种用于将贴壁细胞直接重新接种在中空纤维生物反应器中的收集培养基。

Description

重新接种中空纤维生物反应器系统中生长的贴壁细胞的方法
优先权
本专利申请要求于2010年5月5日提交的临时专利申请61/331,660的优先权，且本专利申请是于2008年3月5日提交的美国专利申请12/042,763的部分接续申请。
背景技术
在多种处理和治疗中，干细胞的使用正受到越来越多的关注。干细胞可被用于修复或替代受损或有缺陷的组织，且具有治疗大范围疾病的广泛的临床应用。
细胞扩增系统可用于使干细胞以及其它类型的细胞(贴壁细胞和非贴壁细胞)生长。在细胞将要生长和分裂前，贴壁细胞需要贴附的表面。而非贴壁细胞在悬浮液中漂浮的同时进行生长和分裂。
细胞扩增系统为生长的细胞提供营养物且移除代谢物，以及供应有助于细胞生长的生理化学环境。细胞扩增系统在本领域是已知的。
生物反应器或细胞生长腔体作为细胞扩增系统的组件在为扩增的细胞提供最优化环境中起到重要作用。在本领域中已知很多类型的生物反应器。生物反应器装置包括培养瓶、转瓶(roller bottle)、振荡瓶(shaker flask)、搅拌槽式反应器(stirred-tank reactor)、气升式反应器(air-lift reactor)和中空纤维生物反应器。
一旦生物反应器中扩增的细胞达到细胞覆盖或期望的细胞数量，则需要收集细胞，且如果期望进一步的细胞生长，则需要将细胞重新接种在相同或不同的生物反应器中。
不管使用何种类型的生物反应器装置，为了收集贴壁细胞，必须首先从细胞生长的表面上移除细胞。为了从生长表面移除贴壁细胞，初始清洗细胞以移除抑制胰蛋白酶的离子(镁、钙)。然后将胰蛋白酶添加至经清洗的细胞以使细胞从表面松落。一旦细胞被松落，则从膜表面移除它们，且通过清洗被移除的细胞或使它们旋转沉淀为细胞团、移除周围的流体且将它们悬浮在新的生长培养基中进行处理以移除胰蛋白酶。
该程序容易在细胞生长在平板上的开放系统(诸如培养瓶)中进行，其中该程序在层流净化罩中进行。但是在使用中空纤维生物反应器的封闭系统中，该系统对大气是封闭的。没有简单的方法来添加流体或从系统中移除流体，且包含在细胞生长所需的生长培养基中的离子由于通过中空纤维的超滤而从细胞生长空间中丢失。因此细胞存活在被稀释的培养基(来自从细胞初始清洗进入系统的添加的流体)、胰蛋白酶(来自用于使细胞从膜松落的胰蛋白酶)、且由于超滤培养基中没有离子(例如钙和镁)围绕的环境中。
这些因素可造成被直接重新接种在中空纤维生物反应器中的收集的贴壁细胞的细胞生长不足。
因此，需要开发新的重新接种的方案以在使用中空纤维生物反应器的细胞扩增系统中使用。
发明内容
本发明涉及用于直接重新接种收集的在中空纤维生物反应器中生长的贴壁细胞的方法，所述中空纤维生物反应器具有内毛细管空间(intracapillary space)和外毛细管空间(extracapillary space)，其中细胞生长空间是内毛细管空间或外毛细管空间中的一种。该方法包括以下步骤：从所述细胞生长空间移除生长培养基；清洗所述细胞以从所述细胞生长空间移除残留的生长培养基；通过将胰蛋白酶添加至所述细胞生长空间，使所述细胞从中空纤维生物反应器的中空纤维上松落；从所述细胞生长空间移除细胞和所有胰蛋白酶；使来自被移除的细胞中的胰蛋白酶失活；以及，将被移除的细胞和胰蛋白酶直接重新接种在中空纤维生物反应器的细胞生长空间中。
本发明还要求了一种制造收集培养基的方法，所述方法通过使用Chvh+0v回路＝cfvh+ccvc计算培养基中需要的离子和蛋白质的量，且将计算出的量的离子和蛋白质加入培养基中，以在将贴壁细胞直接重新接种在中空纤维生物反应器中使用。
附图说明
图1为在本发明中有用的中空纤维生物反应器的示例图。
图2示出了可被本发明使用的细胞扩增系统的示例图。
图3是在根据本发明完整重新接种的程序之前、过程中及之后的代谢浓度的示图。
具体实施方式
本申请大体涉及用于收集和/或重新接种来自封闭细胞扩增系统的中空纤维细胞生长腔体/生物反应器的贴壁细胞(尤其为间充质干细胞)的无菌方法。封闭系统指该系统没有直接暴露于大气。
从细胞扩增系统收集扩增的细胞包括从生物反应器中移除所有扩增的细胞。重新接种收集到的细胞包括：将所有被移除的细胞重新装载在相同或不同的生物反应器中以用于进一步扩增；或，将收集到的细胞的一部分重新装载在相同或不同的生物反应器中，同时保留被移除细胞的剩余部分用于随后的应用。
现在参考图1，在正面立视图中示出了可被本发明使用的中空纤维细胞生长腔体100的实例。细胞生长腔体100具有纵向轴LA-LA，且包括细胞生长腔体的壳体104。在至少一个实施方式中，细胞生长腔体的壳体104包括四个开孔(opening)或端口(port)：IC入口108、IC出口120、EC入口128和EC出口132。应注意在附图中，相同的元件由相同的标记表示。箭头示出了流体流过生物反应器100(图1)和细胞扩增系统200(图2)的方向。
多个中空纤维116被配置在细胞生长腔体的壳体104内。用于制造中空纤维116的材料可以是能够被制成中空纤维的任何生物相容的聚合材料。术语“中空纤维”、“中空纤维毛细管”和“毛细管”可互换使用。多个中空纤维被称为膜。
中空纤维116的末端可通过连接材料(本文中还被称为“灌封料(potting)”或“灌封材料”)被灌封至细胞生长腔体的壳体104的末端。灌封料可为用于粘合中空纤维116的任何适当的材料，但条件是不阻塞培养基(和如果期望的细胞)进入中空纤维的流动。示例性的灌封材料包括(但并不限于)聚氨酯或其它适当的粘合或粘附组分。端盖112和124被分别配置在传质装置(mass transferdevice)的每一端。
第一循环路径202(见图2)中的细胞生长培养基通过在细胞生长腔体100的第一纵向末端112处的IC入口108穿入细胞生长腔体100，进入且穿过中空纤维116的毛细管内侧(在各实施方式中被称为毛细管内(“IC”)侧或“IC空间”)，且通过位于细胞生长腔体100的第二纵向末端124的IC出口120穿出细胞生长腔体100。在IC入口108和IC出口120之间的流体路径限定了细胞生长腔体100的IC部分126。
第二循环路径204(见图2)中的流体通过EC入口128流入细胞生长腔体100，与中空纤维116的毛细管外侧或外部(被称为“EC侧”或“EC空间”)接触，且经由EC出口132离开细胞生长腔体100。EC入口128和EC出口132之间的流体路径包括细胞生长腔体100的EC部分136。经由EC入口128进入细胞生长腔体的流体与中空纤维116的外部接触。
小分子(例如离子、水、氧气、乳酸盐等)可通过中空纤维从IC空间扩散至EC空间，或从EC空间扩散至IC空间。大分子量的分子(诸如生长因子)通常太大而不能穿过中空纤维膜，因此留在中空纤维的IC空间中。可根据需要替换培养基。培养基还可通过气体转移组件/氧合器232进行循环以根据需要交换气体。
在不背离本发明的精神和范围的情况下，细胞通常被容纳在第一循环路径202中的中空纤维的IC空间内，但还可被容纳在第二循环路径204中的EC空间内。不管细胞生长在IC空间还是生长在EC空间中，细胞均生长在细胞生长空间中。
用于制造中空纤维膜的材料可为能够被制成中空纤维的任何生物相容的聚合材料。
图2示出了可被本发明使用的细胞扩增系统的一个实施方式的示例图。
第一流体流动路径206与细胞生长腔体100流体相联以形成第一流体循环路径202。培养基与细胞生长腔体100中的中空纤维内部接触。流体通过IC入口108流入细胞生长腔体100，穿过细胞生长腔体100中的中空纤维，且经由IC出口120流出。压力计210测量离开细胞生长腔体100的培养基的压力。培养基流过IC循环泵212，其中IC循环泵212可被用于控制IC环路202中培养基的流动速率。然后培养基流过阀门214。如本领域的技术人员应理解的，可在不同位置放置额外的阀门和/或其它装置以沿流体路径的各部分分离和/或测量培养基的特性。因此要理解示出的示例为细胞扩增系统的不同元件的多种可能配置中的一种，且对已示出的示例的改变处于一个或多个本发明的范围内。
对于IC环路，可在运行过程中从样品蛇形管218获得培养基的样品。布置在第一流体循环路径202中的压力/温度计220能实现检测运行过程中培养基的压力和温度。然后培养基返回IC入口108以完成流体循环路径202。可将在细胞生长腔体100中生长/扩增的细胞从细胞生长腔体100中冲洗出来以进入收集袋299，或为了进一步生长使在上述细胞在中空纤维内重新分布。下面将对此作更详细的描述。
第二流体循环路径204包括第二流体流动路径284，其中第二流体流动路径284与环路中的细胞生长腔体100流体相联。第二流体循环路径204中的流体经由EC入口128进入细胞生长腔体100，且经由EC出口132离开细胞生长腔体100。
布置在第二流体循环路径204中的压力/温度计224允许在培养基进入细胞生长腔体100的EC空间之前测量培养基的压力和温度。压力计226允许在培养基离开细胞生长腔体100之后测量第二流体循环路径204中的培养基的压力。对于EC环路，可在运行过程中从样品端口230或样品蛇形管(未示出)获得培养基的样品。
在离开细胞生长腔体100的EC出口132后，第二流体循环路径204中的流体流过EC循环泵228至气体转移组件232。第二流体流动路径222经由气体转移组件入口234和出口236与气体转移组件232流体相联。在运行中，流体培养基经由入口234流入气体转移组件232，且经由出口236流出气体转移组件232。气体转移组件232将气体加入细胞扩增系统的培养基中或从细胞扩增系统的培养基中移除过量的气体(气泡)。在不同实施方式中，第二流体循环路径204中的培养基与进入气体转移组件232的气体处于平衡状态。气体转移组件232可为本领域已知的任何适当尺寸的组件。空气或气体经由过滤器238流入气体转移组件232，或经由过滤器240流出气体转移组件232。过滤器238和240降低或防止气体转移组件232和相关联的培养基的污染。在起动顺序(priming sequence)部分的过程中从系统200排出的空气或气体可经由气体转移组件232排入大气中。
在所示出的构造中，第一流体循环路径202和第二流体循环路径204中的流体培养基以相同的方向(并流构造(cocurrent configuration))流过细胞生长腔体100。细胞扩增系统200还可配置为以不同方向(逆流构造)流动。
细胞(来自袋状物262)和IC流体培养基(来自袋状物246)可经由第一流体流动路径206被导入第一流体循环路径202。流体容器244(例如试剂)和246(例如IC培养基)可分别经由阀门248和250各自与第一流体流入路径242流体相联，或分别经由阀门270和276与第二流体流入路径274流体相联。为了起动不同的流入路径，提供了第一和第二无菌可密封的输入起动路径208和209。空气移除腔体256与第一循环路径202流体相联。空气移除腔体256可包含一个或多个超声传感器以检测空气移除腔体256内某些测量位置处的流体缺乏或空气。例如，可在接近空气移除腔体256的底部和/或顶部位置处使用超声传感器以检测在这些位置处的空气或流体。在起动顺序部分的过程中从细胞扩增系统200排出的空气或气体可经由管路258排入空气阀门260外的大气，其中管路258与空气移除腔体256流体相联。
流体容器262(例如细胞流入袋(或盐水起动流体))经由阀门264与第一流体循环路径202流体相联。可将EC培养基(来自袋状物268)或清洗液(来自袋状物266)加入第一或第二流体流动路径中。
流体容器266可与阀门270流体相联，其中阀门270经由分配阀门272和第一流体流入路径242与第一流体循环路径202流体相联。可选择地，通过开启阀门270且关闭分配阀门272，流体容器266可经由第二流体流入路径274和第二流体流动路径284与第二流体循环路径204流体相联。同样地，流体容器268与阀门276流体相联，其中阀门276经由第一流体流入路径242与第一流体循环路径202流体相联。可选择地，通过开启阀门276且关闭分配阀门272，流体容器268可与第二流体流入路径274流体相联。
在IC环路中，流体最初由IC流入泵254推进。在EC环路中，流体最初由EC流入泵278推进。空气检测器280(诸如超声传感器)也可与第二流体流动路径284相联。
在至少一个实施方式中，第一和第二流体循环路径202和204连接至废物管路288。当开启阀门290时，IC培养基可流过废物管路288，到达废物袋286。同样地，当开启阀门292时，EC培养基可流过废物管路288，到达废物袋286。
可经由细胞收集路径296收集细胞。这里，通过泵送包含细胞的IC培养基穿过细胞收集路径296和阀门298至细胞收集袋299，可收集来自细胞生长腔体100的细胞。
细胞扩增系统200的各组件被容纳或置放在培养器300内，其中培养器使细胞和培养基维持在期望的温度。
如本领域技术人员认可的，任何数量的流体容器(例如培养基袋)可以任何组合与细胞扩增系统流体相联。
用于系统(IC侧和EC侧)的细胞生长培养基通常为完全培养基，这意味着培养基包含至少一定百分比的蛋白质。在细胞生长培养基中常用的蛋白质的实例包括人血小板裂解液、人血浆、胎牛血清(FBS)和/或胎牛血清(FCS)。术语细胞生长培养基和完全培养基可互换使用。基础培养基是没有蛋白质源的细胞生长培养基。用于本发明的基础培养基的实例为α-MEM，但是没有蛋白质的任何常用的培养基均可在本发明中使用。
如果期望重新接种/重新装载生物反应器用于进一步的细胞扩增，或收集扩增的细胞用于最终的临床应用，则必须启始从膜移除细胞的细胞收集方案。依赖于期望细胞的最终数量，可完全或部分重新接种生物反应器。重新接种生物反应器的目的为从膜表面释放细胞，且将它们重新装载在相同或不同的生物反应器中用于继续扩增。
但是，如果在经过收集程序后被冲洗出生物反应器的细胞被直接重新接种在相同或不同的生物反应器中，则这些细胞不生长。直接重新接种意味着从生物反应器移除的细胞在重新接种前不经过任何额外的程序。这被示于下面的表1中。
在本实验中，IC环路202和EC环路204中的培养基与PBS交换以从系统的IC环路和EC环路移除完全培养基以及镁离子和钙离子。将胰蛋白酶溶液从袋状物244(或246、266或268)导入第一流体循环路径202。在停留一段时间以允许胰蛋白酶使细胞从IC膜分离后，将完全培养基从袋状物246(或244、266或268)重新导入第一流体循环路径202以使胰蛋白酶失活，且将细胞推出生物反应器的IC侧，穿过管状管路296，进入细胞收集袋299。从细胞收集袋299直接获得细胞，且将这些细胞直接装载在新的生物反应器中，或在装载到新的反应器中之前将这些细胞离心下来且在100ml基础培养基中进行清洗。
如在表1中可看出：在将细胞产物装载在新的生物反应器中之前使该细胞产物经过清洗步骤以替代流体，则装载有该细胞产物的生物反应器中的生长好很多。
Figure BDA00002313902300081
表1
如从表中可看出：与将细胞直接装载在中空纤维生物反应器中相比，在将收集的细胞重新接种在中空纤维生物反应器中之前清洗收集的细胞显示出更好的细胞生长。但是清洗步骤为可出现扩增细胞被污染之处，且该步骤是细胞扩增过程中的额外步骤。允许直接重新接种收集的细胞而没有额外的清洗步骤的程序将是有利的。
因此，作为清洗细胞的替代方式，在连接至细胞扩增系统200之前可将蛋白质源(诸如FBS)(作为一个实例，而并不意于进行限制)添加至收集袋299(使得收集袋中蛋白质的浓度为100％)。在收集的细胞流入袋状物中之前，还可以1～100％之间的任何浓度将蛋白质添加至基础培养基(以制成完全培养基)。在收集袋中额外浓度的蛋白质可通过收集的细胞(另有胰蛋白酶，另有用于将细胞推出生物反应器的培养基)稀释以帮助细胞建立更加正常的环境，这样该细胞可被直接重新接种。
在另一实施方式中，在开始收集程序之前，来自任意袋状物244、246、266或268的完全培养基或单独的蛋白质可经由泵212或254被泵入收集袋299。以比含上述细胞的培养基穿过生物反应器的IC侧移动更快的速率将完全培养基或蛋白质泵入收集袋299中，以便到收集到的细胞到达收集袋的时候，该收集袋已被完全培养基或蛋白质装满。
还可将完全培养基或单独的蛋白质直接添加到管状管路296中，其中管状管路296将细胞运载出生物反应器且运载至收集袋299中。在该实施方式中，可在沿管路的任意点处将蛋白质或完全培养基从袋状物310直接泵入管路296中。将上述细胞从端口120清洗出生物反应器100，且进入管路296。这些细胞将与管状管路296中的蛋白质源或完全培养基混合，且立即处于有助于细胞生长的环境中。因此这些细胞可被直接重新接种。
在所述的实施方式中，当暴露于蛋白质源时，悬浮收集到的细胞的培养基中包含的胰蛋白酶将被立即中和，且可将这些细胞直接重新接种在新的或相同的生物反应器中，而不需要额外的清洗步骤。这些程序还使得细胞在紧接收集程序之后更加容易存活，因为在本发明之前(如之前所实践的)，由于在收集程序的过程中将所有蛋白质从细胞环境中移除，细胞在无蛋白质的环境中存活一段时间。蛋白质的缺乏不利于细胞生长。
为了补偿作为在封闭的中空纤维系统中收集细胞的结果而出现的细胞环境中离子的缺乏，开发了新的收集培养基。使用该收集培养基以直接重新接种从中空纤维生物反应器收集的贴壁细胞(诸如间充质干细胞)的优点在于：收集培养基具有足够的代谢物以补偿细胞环境中离子的缺乏，且使细胞在重新接种后能够随即开始生长。
下面的表2将基础培养基中的离子浓度与新的收集培养基的离子浓度进行对比。在该实施例中，使用的基础培养基为α-MEM。如在表中可看出：基础培养基和收集培养基的成分相同，但收集培养基具有更高浓度的钙、镁和葡萄糖以补偿在收集程序的过程中通过中空纤维的那些代谢物的损失。
代谢物 基础培养基 收集培养基
氯化钙 1.4mM 3.9mM
无水D-葡萄糖 5.3mM 9.91mM
硫酸镁 0.81mM 2.24mM
表2
如下制备上面实施例中的收集培养基：
1、将7.41g无水D-葡萄糖(Sigma#G5767)和3.37g二水氯化钙(Sigma#G3306)添加至终体积50ml的α-MEM(Lonza#12-169-F)。混合至溶解。在单独的试管中，将3.25g七水硫酸镁(Sigma#M1880)添加至终体积50ml的α-MEM。混合至溶解。
2、将上述50ml葡萄糖/钙溶液添加至额外的3060ml α-MEM、50ml100×glutamax(Gibco#35050)和800ml FBS(Gibco#12662-029)。在添加葡萄糖/钙溶液后添加50ml镁溶液。在4℃下储存。
表3示出了在收集培养基中收集且直接重新接种的细胞能够在贴附至膜后随即开始生长。示出的数据是完整的重新接种的程序。
表3
图3为示出在完整重新接种程序之前、过程中和之后IC培养基中代谢物浓度的示图。在重新接种程序之前，生长培养基中的钙浓度接近基线，其中基线指在基础α-MEM培养基中测得的钙的量。葡萄糖和乳酸盐的浓度分别低于和高于基线，这反映了生长的间充质干细胞的代谢活性。在上述程序的胰蛋白酶/EDTA(乙二胺四乙酸)洗出步骤之前，钙低于检测极限。由于培养基与PBS交换，葡萄糖和乳酸盐的水平也显著降低。因为胰蛋白酶/EDTA包含葡萄糖，所以葡萄糖水平高于乳酸盐。在胰蛋白酶/EDTA洗出过程中随着将基础培养基冲洗进系统中，由于基础培养基包含葡萄糖但不包含乳酸盐，葡萄糖水平开始升高，且乳酸盐水平降至低于检测极限。在洗出之后，钙和葡萄糖的水平返回至基线。在重新接种程序完成后，乳酸盐水平也返回至基线。
在本实施例中，使用的基础培养基是α-MEM。但是本领域的技术人员应知道可将额外量的钙、镁和葡萄糖添加至任何期望的基础培养基。
如果使用除α-MEM之外的其它培养基，可使用下面的等式计算所需离子和蛋白质的额外的量，以将任何基础培养基制成用于中空纤维系统的收集培养基。
Chvh+0v回路＝cfvh+ccvc
其中，
ch＝收集培养基的初始浓度
vh＝从系统移除的收集培养基的体积
0＝蛋白质(因为系统中没有)
Ca++和Mg++也为0(因为系统中没有)
cf＝期望的收集培养基的浓度(最终)
vh＝添加至系统的收集培养基的体积
cc＝最终的混合浓度(cICvIC+cECvEC)
vc＝IC环路的最终体积
虽然本发明的说明书已包括一个或多个实施方式以及某些变化和改变的描述，但在本领域技术人员技术和知识范围内的其它变化和改变也在本发明的范围内。本发明旨于获得包括允许范围的可选择实施方式的权利，包括要求权利的替代、可互换和/或等同的结构、功能、范围或步骤，而不管本文是否公开了替代、可互换和/或等同的结构、功能、范围或步骤，且本发明并不旨于公开用于任何可专利的主题。

Claims (9)

1.一种用于直接重新接种收集到的在中空纤维生物反应器中的生长培养基中生长的贴壁细胞的方法，所述中空纤维生物反应器具有内毛细管空间和外毛细管空间，其中细胞生长空间是所述内毛细管空间或所述外毛细管空间中的一个，所述方法包括以下步骤：
从所述细胞生长空间移除所述生长培养基；
清洗所述细胞以从所述细胞生长空间移除残留的生长培养基；
通过将胰蛋白酶添加至所述细胞生长空间，使所述细胞从所述细胞生长空间松落；
从所述细胞生长空间移除所述细胞和所有的胰蛋白酶；
使来自被移除的所述细胞中的胰蛋白酶失活；以及
将被移除的所述细胞和胰蛋白酶直接重新接种到中空纤维生物反应器的所述细胞生长空间中。
2.根据权利要求1所述的方法，其中移除所述细胞和所有的胰蛋白酶的步骤进一步包括以下步骤：
推动流体从不是所述细胞生长空间的所述内毛细管空间或所述外毛细管空间中的一个穿过所述中空纤维流至所述细胞生长空间。
3.根据权利要求1所述的方法，其中使所述胰蛋白酶失活的步骤进一步包括以下步骤：
将蛋白质添加至被移除的所述细胞和胰蛋白酶。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述添加蛋白质的步骤进一步包括以下步骤：
在添加被移除的所述细胞和胰蛋白酶之前，将蛋白质添加至细胞收集袋。
5.根据权利要求1所述的方法，其中使所述胰蛋白酶失活的步骤进一步包括以下步骤：
将完全培养基添加至被移除的所述细胞和胰蛋白酶。
6.根据权利要求3所述的方法，其中所述添加蛋白质的步骤进一步包括以下步骤：
当从所述细胞生长空间移除所述细胞和胰蛋白酶时，将蛋白质直接添加至被移除的所述细胞和胰蛋白酶。
7.一种用于收集在中空纤维生物反应器中生长的细胞的培养基，包括：
基础培养基；
蛋白质；
3.9mM氯化钙；
9.91mM无水D-葡萄糖；以及
2.24mM硫化镁。
8.根据权利要求7所述的培养基，其中所述基础培养基是α-MEM。
9.一种用于制造收集培养基的方法，包括以下步骤：
使用Chvh+0v回路＝cfvh+ccvc计算在所述培养基中需要的离子和蛋白质的量；以及
将计算出的量的所述离子和蛋白质添加至所述培养基。
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