CN102659867B - 一种高含量橄榄苦苷提取物的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高含量橄榄苦苷提取物的制备方法，其目的在于克服现有制备方法存在的橄榄苦苷提取物中橄榄苦苷含量不高的问题。本发明在获得粗提液后，先经大孔吸附树脂吸附分离，再加碱性溶液溶解、萃取后经硅胶或氧化铝柱层析分离，最后干燥得高含量橄榄苦苷提取物。本发明获得的橄榄苦苷提取物中橄榄苦苷的含量高达80%-90%，油橄榄叶的利用度高。

Description

一种高含量橄榄苦苷提取物的制备方法

技术领域

本发明涉及植物提取技术领域，特别涉及一种高含量橄榄苦苷提取物的制备方法。

背景技术

橄榄苦苷(oleuroprin) 成分来源油橄榄树（英文名：Olive， 拉丁文名：Olea europaea L）的叶子。橄榄苦苷 是一种活性成份，具有强力的抗细菌和抗病毒特性、还有极强的抗氧化能力。

橄榄苦苷的功能如下：

1、它可以阻止细胞和病毒的生长，并刺激免疫系统中重要细胞的活性，以抵抗感染。

2、对皰疹、膀胱和微菌感染也极为有效。

3、它有抗氧化能力，能减轻低密度脂蛋白的氧化程度，预防冠心病，动脉粥样硬化的发生。

4、有舒缓血管平滑肌，降低血压的能力。

目前，采用现有的提取方法从油橄榄叶中提取橄榄苦苷，提取物中橄榄苦苷的含量在10%-40%，提取效果不佳，提取物中橄榄苦苷的含量较低，油橄榄叶的利用度不高。

公开号CN102228514A的发明公开了一种从油橄榄叶中提取橄榄苦苷的方法，在用水或醇水混合溶剂提取之后，将提取液浓缩之后依次经过三步分离：大孔树脂吸附并用醇水溶剂洗脱、脱色树脂吸附和有机溶剂萃取，逐步对提取液当中的橄榄苦苷进行分离纯化，最后获得高含量的橄榄苦苷提取物，橄榄苦苷的含量大于40%。虽然该方法获得的橄榄苦苷提取物中橄榄苦苷的含量有所提高，但仍不理想。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种高含量橄榄苦苷提取物的制备方法，操作简便，生产成本低，所得橄榄苦苷提取物中橄榄苦苷的含量高达80%-90%，油橄榄叶的利用度高。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种高含量橄榄苦苷提取物的制备方法，所述的制备方法步骤如下：

①将油橄榄叶粉碎，向粉碎物中加入提取溶剂提取得粗提液，提取温度40-100℃，提取时间1-2.5小时，提取2-3次；

②将粗提液浓缩至干得粗提物Ⅰ，粗提物Ⅰ加2-10倍重量的蒸馏水溶解，离心，取上清液，上DM130或D101大孔吸附树脂层析柱吸附，先用保留体积2-4倍量的蒸馏水洗脱，再用保留体积2-6倍量的甲醇水溶液或乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液，浓缩至干得粗提物Ⅱ；上DM130或D101大孔吸附树脂层析柱吸附先用蒸馏水洗脱以去除杂质，加强分离效果，提高产品纯度；保留体积为从进样开始到某组分在柱后出现浓度极大值时流出溶剂的体积；

③粗提物Ⅱ加碱性溶液溶解得混合液，所述碱性溶液用量为每千克粗提物Ⅱ加入10-30L碱性溶液，混合液用1-2倍体积的萃取溶剂萃取2-5次，收集萃取液，浓缩至干得粗提物Ⅲ；

④粗提物Ⅲ上硅胶或氧化铝柱层析，用保留体积4-6倍量的洗脱剂洗脱，所述洗脱剂为氯仿甲醇混合液或乙醇水溶液，收集洗脱液，冷冻干燥或喷雾干燥得成品。氯仿甲醇混合液是配合硅胶柱层析使用，乙醇水溶液是配合氧化铝柱层析使用。

本发明在获得粗提液后，先经大孔吸附树脂吸附分离，再加碱性溶液溶解、萃取后经硅胶或氧化铝柱层析分离，最后干燥得高含量橄榄苦苷提取物。通过这样操作，本发明获得的橄榄苦苷提取物中橄榄苦苷的含量高达80%-90%，油橄榄叶的利用度高。

步骤③粗提物Ⅱ加碱性溶液溶解，碱性条件下粗提物Ⅱ的溶解性好，所需的分散水相（即溶剂）消耗少，同时可以节省萃取溶剂的消耗量，节省了提取成本，分散水相、萃取溶剂的消耗量可节省30%-40%。而且，这样萃取操作也方便，简化了操作，为下一步更进一步的分离打好了基础，对于提高橄榄苦苷提取物中橄榄苦苷的含量有着重要的作用。

作为优选，步骤①中所述的提取溶剂为蒸馏水、甲醇水溶液、乙醇水溶液或丙酮水溶液，提取溶剂用量为每千克粉碎物加入6-20L提取溶剂。控制提取溶剂的用量及浓度等参数，以提高提取效果。

作为优选，甲醇水溶液、乙醇水溶液、丙酮水溶液的体积浓度均为30-90%。

作为优选，步骤②和步骤③中所述的浓缩至干的具体操作为：先在70-80℃水浴蒸干，再送至烘箱中，70-80℃下烘3-5小时。通过这样操作，去除残留溶剂。

作为优选，步骤②中甲醇水溶液、乙醇水溶液的体积浓度均为40%-80%。

作为优选，步骤②中上DM130或D101大孔吸附树脂层析柱吸附，洗脱流速为1ml/min-3ml/min，大孔吸附树脂的径高比为1：8或1：10。利用大孔吸附树脂进行分离和初步的纯化比较符合大规模生产的要求。使用的分离介质经济易得，且可多次反复利用，操作简单，避免了用很多其他分离介质时所要求的苛刻条件，最重要的是分离性能稳定，可重复性高。 洗脱流速和大孔吸附树脂的径高比对分离效果影响较大，控制洗脱流速为1ml/min-3ml/min和大孔吸附树脂的径高比为1：8或1：10，以达到最佳的分离纯化效果。

作为优选，步骤③中所述的碱性溶液为质量浓度0.1%-0.4%的氢氧化钠溶液、质量浓度0.1%-0.4%的氢氧化钾溶液或质量浓度1%-5%的碳酸钠溶液，所述的萃取溶剂为乙酸乙酯或正丁醇。碱性溶液的选择和浓度的控制较关键，这样能对样品（粗提物Ⅱ）最佳的适应和溶解，为进一步的分离纯化打好基础，对于提高橄榄苦苷提取物中橄榄苦苷的含量有着重要的作用。

作为优选，步骤④中所述的氯仿甲醇混合液中氯仿的体积为甲醇体积的8倍或9倍，步骤④中所述的乙醇水溶液的体积浓度为70-95%。

作为优选，步骤④中所述的硅胶柱的硅胶大小为200-300目，上样量为m_样品：m_硅胶=1:10-20。 本步骤的上样量指样品的质量与硅胶质量的比值。控制硅胶大小和上样量，以达到最佳的分离效果，橄榄苦苷的转移率高，最终产品的纯度高。

作为优选，步骤④中所述的氧化铝柱的氧化铝大小为200-300目，上样量为m_样品：m_氧化铝=1:7-10。本步骤的上样量指样品的质量与氧化铝质量的比值。氧化铝柱为中性氧化铝柱。控制氧化铝大小和上样量，以达到最佳的分离效果，橄榄苦苷的转移率高，最终产品的纯度高。

本发明的有益效果是： 操作简便，生产成本低，所得橄榄苦苷提取物中橄榄苦苷的含量高达80%-90%，油橄榄叶的利用度高。

附图说明

图1是本发明制备的橄榄苦苷提取物的HPLC检测图谱。

具体实施方式

下面通过具体实施例，并结合附图，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。

实施例1

①将5kg油橄榄叶粉碎，向粉碎物中加入30L体积浓度均90%的乙醇水溶液提取得粗提液，提取温度40℃，提取时间2.5小时，提取3次；

②将粗提液浓缩至干得粗提物Ⅰ，粗提物Ⅰ加2倍重量的蒸馏水溶解，离心，取上清液，上DM130大孔吸附树脂层析柱吸附，先用保留体积2倍量的蒸馏水洗脱，再用保留体积6倍量的体积浓度为40%的乙醇水溶液洗脱，洗脱流速为3ml/min，DM130大孔吸附树脂的径高比为1：8，收集洗脱液，洗脱液先在70℃水浴蒸干，再送至烘箱中，70℃下烘5小时得粗提物Ⅱ；

③粗提物Ⅱ加质量浓度0.1%的氢氧化钠溶液溶解得混合液，所述氢氧化钠溶液用量为每千克粗提物Ⅱ加入30L，混合液用等体积的乙酸乙酯萃取5次，收集萃取液，萃取液先在70℃水浴蒸干，再送至烘箱中，70℃下烘5小时得粗提物Ⅲ；

④粗提物Ⅲ上硅胶柱层析，硅胶柱的硅胶大小为200-300目，上样量为m_样品：m_硅胶=1:10，用保留体积4倍量的氯仿甲醇混合液（氯仿甲醇混合液中氯仿的体积为甲醇体积的8倍）洗脱，收集洗脱液，冷冻干燥得成品125.6g。

经HPLC检测，成品中橄榄苦苷的含量在80.6%。

实施例2

①将5kg油橄榄叶粉碎，向粉碎物中加入100L体积浓度均30%的甲醇水溶液提取得粗提液，提取温度100℃，提取时间1小时，提取2次；

②将粗提液浓缩至干得粗提物Ⅰ，粗提物Ⅰ加10倍重量的蒸馏水溶解，离心，取上清液，上D101大孔吸附树脂层析柱吸附，先用保留体积4倍量的蒸馏水洗脱，再用保留体积2倍量的体积浓度为80%的甲醇水溶液洗脱，洗脱流速为1ml/min，D101大孔吸附树脂的径高比为1：10，收集洗脱液，洗脱液先在80℃水浴蒸干，再送至烘箱中，80℃下烘3小时得粗提物Ⅱ；

③粗提物Ⅱ加质量浓度5%的碳酸钠溶液溶解得混合液，所述碳酸钠溶液用量为每千克粗提物Ⅱ加入10L，混合液用2倍体积的正丁醇萃取2次，收集萃取液，萃取液先在80℃水浴蒸干，再送至烘箱中，80℃下烘3小时得粗提物Ⅲ；

④粗提物Ⅲ上氧化铝柱层析，氧化铝柱的氧化铝大小为200-300目，上样量为m_样品：m_氧化铝=1:10，用保留体积6倍量的质量浓度70%的乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液，冷冻干燥得成品202.4g。

经HPLC检测，成品中橄榄苦苷的含量在85.7%。

实施例3

①将5kg油橄榄叶粉碎，向粉碎物中加入40L体积浓度均50%的丙酮水溶液提取得粗提液，提取温度60℃，提取时间2小时，提取2次；

②将粗提液浓缩至干得粗提物Ⅰ，粗提物Ⅰ加5倍重量的蒸馏水溶解，离心，取上清液，上DM130大孔吸附树脂层析柱吸附，先用保留体积3倍量的蒸馏水洗脱，再用保留体积4倍量的体积浓度为50%的乙醇水溶液洗脱，洗脱流速为2ml/min，DM130大孔吸附树脂的径高比为1：10，收集洗脱液，洗脱液先在75℃水浴蒸干，再送至烘箱中，75℃下烘4小时得粗提物Ⅱ；

③粗提物Ⅱ加质量浓度0.4%的氢氧化钾溶液溶解得混合液，所述氢氧化钾溶液用量为每千克粗提物Ⅱ加入15L，混合液用等体积的乙酸乙酯萃取2次，收集萃取液，萃取液先在75℃水浴蒸干，再送至烘箱中，75℃下烘4小时得粗提物Ⅲ；

④粗提物Ⅲ上氧化铝柱层析，氧化铝柱的氧化铝大小为200-300目，上样量为m_样品：m_氧化铝=1:7，用保留体积5倍量的质量浓度95%的乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液，冷冻干燥得成品220.8g。

经HPLC检测，成品中橄榄苦苷的含量在90.0%。

此外，本发明提及的碱性溶液：氢氧化钠溶液质量浓度可在0.1%-0.4%作出调整，氢氧化钾溶液质量浓度可在0.1%-0.4%作出调整，碳酸钠溶液质量浓度可1%-5%作出调整。

本发明成品的HPLC检测采用Agilent 1200型液相色谱仪，Thermo色谱柱-C18。液相色谱具体参数为：

流动相： 乙腈：0.1%磷酸溶液=7：3（体积比）；

柱温30度，流速0.6ml/min；

检测波长240纳米，检测图谱见附图1。

以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。

Claims (5)

1.一种高含量橄榄苦苷提取物的制备方法，其特征在于：所述的制备方法步骤如下：

①将油橄榄叶粉碎，向粉碎物中加入提取溶剂提取得粗提液，提取温度40-100℃，提取时间1-2.5小时，提取2-3次；

②将粗提液浓缩至干得粗提物Ⅰ，粗提物Ⅰ加2-10倍重量的蒸馏水溶解，离心，取上清液，上DM130或D101大孔吸附树脂层析柱吸附，先用保留体积2-4倍量的蒸馏水洗脱，再用保留体积2-6倍量的甲醇水溶液或乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液，浓缩至干得粗提物Ⅱ；

③粗提物Ⅱ加碱性溶液溶解得混合液，所述碱性溶液用量为每千克粗提物Ⅱ加入10-30L碱性溶液，混合液用1-2倍体积的萃取溶剂萃取2-5次，收集萃取液，浓缩至干得粗提物Ⅲ；

④粗提物Ⅲ上硅胶或氧化铝柱层析，用保留体积4-6倍量的洗脱剂洗脱，所述洗脱剂为氯仿甲醇混合液或乙醇水溶液，收集洗脱液，冷冻干燥或喷雾干燥得成品；

步骤①中所述的提取溶剂为蒸馏水、体积浓度30-90%的甲醇水溶液、体积浓度30-90%的乙醇水溶液或体积浓度30-90%的丙酮水溶液，提取溶剂用量为每千克粉碎物加入6-20L提取溶剂；

步骤②和步骤③中所述的浓缩至干的具体操作为：先在70-80℃水浴蒸干，再送至烘箱中，70-80℃下烘3-5小时；步骤②中上DM130或D101大孔吸附树脂层析柱吸附，洗脱流速为1ml/min-3ml/min，大孔吸附树脂的径高比为1：8或1：10；步骤③中所述的碱性溶液为质量浓度0.1%-0.4%的氢氧化钠溶液、质量浓度0.1%-0.4%的氢氧化钾溶液或质量浓度1%-5%的碳酸钠溶液，所述的萃取溶剂为乙酸乙酯或正丁醇。

2.根据权利要求1所述的一种高含量橄榄苦苷提取物的制备方法，其特征在于：步骤②中甲醇水溶液、乙醇水溶液的体积浓度均为40%-80%。

3.根据权利要求1所述的一种高含量橄榄苦苷提取物的制备方法，其特征在于：步骤④中所述的氯仿甲醇混合液中氯仿的体积为甲醇体积的8倍或9倍，步骤④中所述的乙醇水溶液的体积浓度为70-95%。

4.根据权利要求1所述的一种高含量橄榄苦苷提取物的制备方法，其特征在于：步骤④中所述的硅胶柱的硅胶大小为200-300目，上样量为m_样品：m_硅胶=1:10-20。

5.根据权利要求1所述的一种高含量橄榄苦苷提取物的制备方法，其特征在于：步骤④中所述的氧化铝柱的氧化铝大小为200-300目，上样量为m_样品：m_氧化铝=1:7-10。