CN102625932A - 细胞网络分析 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于测定个体内多个分离的细胞群体的激活状态和/或一种或更多种细胞网络的状态的方法。多个分离的细胞群体的状态和/或一种或更多种细胞网络的状态可与病状的诊断、预后、治疗的选择和调整、以及/或者监测相关。

Description

细胞网络分析
交叉引用
本申请要求2009年9月8日提交的美国临时申请第61/240,613号的优先权，所述申请以引用的方式并入本文。
发明背景
许多病状的特征在于细胞途径的失调，其导致，例如，细胞过程的异常控制，后者具有不受控的生长和增高的细胞存活率。这些失调通常由参与细胞途径的分子活性的变化所导致。例如，特定信号传导途径的改变已被描述于众多癌症。
现今通过在单一同源细胞群体中分析这些失调而对病状进行诊断。但是，不同类型的细胞与其他不同类型的细胞共存于复杂的周边环境之中，这可能会影响病状的病理学。因此，对病状的成功诊断和治疗方法的成功使用可能需要对在多种不同的细胞和细胞网络中影响所述病状病理学的细胞事件的了解。
因此，存在对病状失调的基于生物学的临床相关分析的需求，其可预测个体的疾病阶段。这一根据不同的分离的细胞群体和/或环境输入的分析将提供病状的病理学的完整描述，因此，其通过在个体患者水平上更为可靠的预后和疗法选择而对临床医生进行辅助。
发明内容
在一些实施方案中，本发明涉及测定个体状态的方法，其通过：a)使来自所述个体的第一细胞群体的第一细胞至少与第一调节剂进行接触；b)使来自所述个体的第二细胞群体的第二细胞至少与第二调节剂进行接触；c)在所述第一细胞和所述第二细胞内测定至少一种可激活元件的激活水平；d)为所述个体创建包括所述可激活元件的测定的激活水平的响应表单(response panel)；以及e)辨识所述个体的状态，其中所述辨识根据所述响应表单而进行。在一些实施方案中，本发明进一步包括根据所述响应表单而对所述第一细胞和所述第二细胞之间因果关联进行的测定，其中所述因果关联是细胞网络状态的指征。在一些实施方案中，本发明进一步包括对响应表单和/或细胞网络状态应用分类器，其中所述分类器包括一组激活水平值，并且其中所述分类器被用于测定该响应表单和/或细胞网络是否与所述个体状态相关联。在一些实施方案中，本发明的方法进一步包括根据所述响应表单产生分类数值，其中所述分类数值明确了所述个体是否与该个体的状态相关联。在一些实施方案中，所述个体的状态是病状的分类、诊断或预后。在一些实施方案中，所述病状的分类、诊断或预后中的AUC值高于0.6。在一些实施方案中，所述病状的分类、诊断或预后中的p值低于0.05。在一些实施方案中，所述病状的分类、诊断或预后中的阳性预测值(PPV)高于80％。在一些实施方案中，所述病状的分类、诊断或预后中的阴性预测值(NPV)高于80％。
在一些实施方案中，所述第一调节剂和所述第二调节剂选自生长因子、丝裂原、细胞因子、趋化因子、粘附分子调节剂、激素、小分子、多核苷酸、抗体、天然化合物、内酯、化疗剂、免疫调节剂、碳水化合物、蛋白酶、离子、活性氧物质和放射物。在一些实施方案中，所述第一调节剂与所述第二调节剂相同。在一些实施方案中，所述第一细胞的接触和所述第二细胞的接触在同一培养物中进行。在一些实施方案中，所述第一调节剂不同于所述第二调节剂。在一些实施方案中，所述第一细胞的接触和所述第二细胞的接触在分开的培养物中进行。在一些实施方案中，所述第一细胞的接触和/或所述第二细胞的接触在该第一细胞和/或第二细胞从所述个体中分离之前进行。
在一些实施方案中，所述激活水平基于选自下列的激活状态：细胞外蛋白酶暴露、新异寡聚体形成、糖基化状态、磷酸化状态、乙酰化状态、甲基化状态、生物素化状态、谷氨酰化状态、甘氨酰化状态、羟基化状态、异构化状态、异戊烯化状态、豆蔻酰化状态、脂化状态、磷酸泛酰巯基乙胺基化(phosphopantetheinylation)状态、硫酸化状态、ISG化状态、亚硝基化状态、棕榈酰化状态、SUMO化状态、泛素化状态、类泛素化状态、瓜氨酸化状态、脱酰胺基状态、二硫键形成状态、蛋白酶水解切割状态、转位状态、蛋白质周转(protein turnover)的变化、多蛋白复合物状态、氧化状态、多脂质复合物、以及细胞膜的生化变化。在一些实施方案中，所述激活状态是磷酸化状态。
在一些实施方案中，所述可激活元件选自蛋白质、碳水化合物、脂质、核酸和代谢物。在一些实施方案中，所述可激活元件是能够被磷酸化和/或去磷酸化的蛋白质。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括在所述第一细胞和/或第二细胞内测定一种或更多种细胞表面标记物、细胞内标记物或其组合的存在与否。在一些实施方案中，所述细胞表面标记物和细胞内标记物独立地选自蛋白质、碳水化合物、脂质、核酸和代谢物。在一些实施方案中，对一种或更多种细胞表面标记物或细胞内标记物存在与否的测定包括对所述细胞表面标记物或细胞内标记物的激活和非激活状态下的表位的存在与否均进行测定。在一些实施方案中，所述个体的状态基于所述可激活元件的激活水平以及基于一种或更多种细胞表面标记物、细胞内标记物或其组合的存在与否两者。
在一些实施方案中，所述激活水平通过一种方法而进行测定，该方法包括与特异于所述特定可激活元件的特定激活状态的结合元件进行结合。在一些实施方案中，所述结合元件包括抗体。在一些实施方案中，所述结合元件为可识别标记的。在一些实施方案中，所述可识别标记的结合元件是用可检测的标记物直接标记的。在一些实施方案中，所述可检测的标记物选自放射性同位素、重同位素、荧光剂、FRET标记物、酶、微粒和化学发光物。
在一些实施方案中，所述激活水平的检测步骤包括使用流式细胞仪、免疫荧光、共聚焦显微镜法、免疫组织化学、免疫电子显微镜法、核酸扩增、基因阵列、蛋白质阵列、质谱、膜片钳技术、二维凝胶电泳、差示凝胶电泳、基于微球的多元蛋白质分析(microsphere-based multiplexprotein assays)、ELISA以及无标记物细胞分析，用以在单个细胞中测定一种或更多种细胞内可激活元件的激活水平。在一些实施方案中，测定所述激活水平的步骤包括使用流式细胞仪。在一些实施方案中，所述测定步骤是定量的。在一些实施方案中，所述测定步骤是相对于对照值进行的。在一些实施方案中，所述对照值被包括在所述响应表单之内。
在一些实施方案中，所述个体的状态是病状的分类、诊断、预后。在一些实施方案中，所述病状是免疫性疾病、恶性或增殖性疾病或其组合。在一些实施方案中所述病状是恶性疾病。在一些实施方案中，所述恶性疾病是实体肿瘤或恶性血液病。
在一些实施方案中，所述恶性疾病是非B细胞系来源的。在一些实施方案中，所述非B细胞系来源的恶性疾病选自急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、非B细胞急性淋巴细胞性白血病(ALL)、非B细胞淋巴瘤、骨髓增生异常、骨髓增殖失调、骨髓纤维变性、红血球增多、血小板增多和非B细胞非典型性免疫性淋巴细胞增生(non-B cell atypical immune lymphoproliferation)。在一些实施方案中，所述非B细胞系来源的恶性疾病是AML。
在一些实施方案中，所述恶性疾病是B细胞来源的或B细胞系来源的失调。在一些实施方案中，所述恶性疾病是选自下列的B细胞来源的或B细胞系来源的失调、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、B淋巴细胞系白血病、B淋巴细胞系淋巴瘤、多发性骨髓瘤和浆细胞失调。在一些实施方案中，所述B细胞来源的或B细胞系来源的失调是CLL。
在一些实施方案中，所述个体的状态是对病理前或病理病状的治疗的预测性响应，或是对病理前或病理病状的治疗的响应。在一些实施方案中，所述方法进一步包括对病理前或病理病状的治疗响应进行预测。
在一些实施方案中，测定了所述第一和/或第二细胞中的多个细胞内可激活元件的激活水平。
在一些实施方案中，本发明提供了根据特征对来自细胞群体的活性状态数据进行分类的计算机实现的方法，所述方法包括：提供包括内存和处理器的计算机；辨识与个体相关联的活性状态数据，其中所述活性状态数据来自采样于个体的至少两种分离的细胞群体；产生分类数值，其中所述分类数值明确了该个体与对所述激活状态所使用的分类器进行响应的健康状态是否具有关联；其中所述分类器包括一组激活状态值，所述激活状态值被用于测定不同的分离的细胞群体中的细胞是否与所述状态相关联；以及将所述分类数值存储于该计算机的内存之中。在一些实施方案中，所述分类数值代表以下一种或更多种：诊断、预后和对治疗的预测性响应。
在一些实施方案中，所述激活状态数据来自于第三方，并且所述方法进一步包括：将分类数值传送给所述第三方。在一些实施方案中，所述方法进一步包括：根据可激活元件所关联的激活状态的至少第一水平，辨识所述激活状态数据是否与分离的第一细胞群体或不同的第二细胞群体相关联。在一些实施方案中，对所述激活状态数据是否与所述分离的第一细胞群体或所述不同的第二细胞群体相关联的辨识包括根据所述可激活元件所关联的激活状态的至少第一水平对所述激活状态数据进行门控(gating)。在一些实施方案中，对所述激活状态数据是否与所述分离的第一细胞群体或所述分离的第二细胞群体相关联的辨识包括根据可激活元件所关联的激活状态的至少第一水平对所述激活状态数据进行迭代分组(iteratively binning)。
在一些实施方案中，所述分离的第一细胞群体是一种稀少的细胞群体，并且所述分离的第一细胞群体被识别为根据可激活元件所关联的激活状态的至少第一水平响应于对所述激活状态数据所进行的迭代分组。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括产生所述分类器，其产生根据来自已知与所述状态相关联的多个分离的细胞群体和已知不与所述状态相关联的多个分离的细胞群体的激活状态数据。在一些实施方案中，所述激活状态数据进一步与多个时间点相关联，并且所述分类器的产生进一步包括：建立随不同时间点的数据的模型，其中所述模型代表所述异源细胞群体之间随多个时间点的通讯；根据所述模型产生一系列的描述性数值；根据所述一系列的描述性数值产生所述分类器。在一些实施方案中，所述分类器的产生包括对所述分类器的交叉验证(cross-validating)。
引用并入
本说明书中所提及的所有出版物、专利和专利申请均以引用的形式并入本文，其程度正如各出版物、专利或专利申请被具体地并且各自地以引用的形式被并入。
附图简述
本发明的新型特征在附上的权利要求中具体阐明。通过参考下文详述可获得对本发明的特征和优点的更佳了解，该详述阐明了应用本发明的原理的示例性实施方案，并且其附图为：
图1描述了免疫系统细胞通讯网络的实例。
图2显示了在经EPO、G-CSF和EPO+G-CSF处理之后淋巴细胞、nRBC1细胞、骨髓(p1)细胞和干细胞中pStat1、pStat3和pStat5的不同激活水平。
图3显示了正常样品中的不同的分离的细胞群体的动力学响应。
发明详述
本发明并入了在其他申请和文本中所公开的信息。下列专利和其他出版物全文以引用的形式并入本文：Haskell等人，Cancer Treatment，第五版，W.B.Saunders和Co.，2001；Alberts等人，The Cell，第四版，Garland Science，2002；Vogelstein和Kinzler，The Genetic Basis of HumanCancer，第二版，McGraw Hill，2002；Michael，Biochemical Pathways，John Wiley和Sons，1999；Weinberg，The Biology of Cancer，2007；Immunobiology，Janeway等人，第七版，Garland，以及Leroith和Bondy，Growth Factors And Cytokines in Health And Disease，A Multi VolumeTreatise，卷1A和1B，Growth Factors，1996。其他传统的工艺和描述可见于标准的实验室手册，例如Genome Analysis：A Laboratory ManualSeries(卷I-IV)，Using Antibodies：A Laboratory Manual，Cells：ALaboratory Manual，PCR Primer：A Laboratory Manual，以及MolecularCloning：A Laboratory Manual(均来自于Cold Spring Harbor LaboratoryPress)，Stryer，L.(1995)Biochemistry(第四版)Freeman，New York，Gait，“Oligonucleotide Synthesis：A Practical Approach”1984，IRL Press，London，Nelson和Cox(2000)，Lehninger，Principles of Biochemistry第三版，W.H.Freeman Pub.，New York，N.Y.以及Berg等人，(2002)Biochemistry，第五版，W.H.Freeman Pub.，New York，N.Y.；以及Sambrook，Fritsche和Maniatis“Molecular Cloning A laboratory Manual”第三版，Cold Spring Harbor Press(2001)，出于所有目的所有这些均全文以引用的形式并入本文。
本发明的一个实施方案涉及用于对个体的状态进行测定的方法，所述测定通过测定获自所述个体的不同的分离的细胞群体中的细胞激活水平而进行。一般情况下，个体的状态是与所述个体的健康相关的状态(本文称为“健康状态”或“疾病状态”)，然而可对任意类型的状态进行测定，只要它与来自所述个体的一个或更多个分离的细胞群体的细胞(如单细胞)的状态有关联。在一些实施方案中，本发明提供了用于测定个体状态的方法，所述测定通过使用两种或更多种分离的细胞群体而创建响应表单而进行。在一些实施方案中，个体的状态通过包括以下的方法而进行测定：a)使用至少第一调节剂接触来自所述个体的分离的第一细胞群体的第一细胞；b)使用至少第二调节剂接触来自所述个体的分离的第二细胞群体的第二细胞；d)在所述第一细胞和所述第二细胞内测定至少一种可激活元件的激活水平；e)为所述个体创建包括所述可激活元件的所述被测定的激活水平的响应表单；以及f)根据所述个体的状态而做出决策，其中所述决策基于所述响应表单。因此，本发明提供了用于通过分析多个(如两个或更多个)分离的细胞群体而对个体状态进行测定的方法。在一些实施方案中，本发明提供了一种方法以区别分离的细胞群体，所述细胞群体相关于疾病的临床结果。在一些实施方案中，本发明提供了不同的分离的细胞群体，对其分析的组合实现了对个体状态的测定。在一些实施方案中，本发明提供了不同的分离的细胞群体，对其分析的组合实现了对细胞网络状态的测定。在一些实施方案中，本发明提供了分离的细胞群体之间的因果关联的测定，其中所述因果关联是细胞网络状态的指征。在另一个实施方案中，本发明提供了一种方法以测定作为某细胞网络部分的一种或更多种细胞群体是否与一种状态相关联。
个体的状态可被关联以诊断、预后、选择或修正治疗，和/或疾病、监测失调或病状。通过对个体状态的测定，医疗人员可估测所述个体是否处于特定病状的正常范围之内或者所述个体是否具有应当监测和/或治疗的病理前或病理病状。因此，在一些实施方案中，个体的状态涉及病状的分类、诊断、预后或施用治疗剂来治疗该病状后的结果。
本发明的一个实施方案涉及病状的分类、诊断、预后或施用治疗剂来治疗该病状后的结果。本发明的另一个实施方案涉及对病状的结果的监测和预测。另一个实施方案是药物筛选，其使用本发明的某些方法以测定何种药物对于特定的病状是有用的。在一些实施方案中，分析方法涉及在实施这些方法中对不同的分离的细胞群体内的细胞信号和/或表达标记物进行的评估。细胞信号分析的一个实施方案涉及对不同的分离的细胞群体中的一种或更多种磷酸化蛋白质的分析(如，通过流式细胞仪)。随后根据不同的分离的细胞群体中的一种或更多种磷酸化蛋白质的分析而测定病状的分类、诊断、预后和/或施用治疗剂来治疗该病状后的结果。在一个实施方案中，可通过使用磷酸化蛋白质模式集类或所述不同的分离的细胞群体的生物识别标志(biosignature)而进行基于信号传导对病状的分类。
在一些实施方案中，根据对多个分离的细胞群体的特征分析而选择治疗方法。在一些实施方案中，对多个分离的细胞群体的特征分析包括对该多个细胞群体的一种或更多种可激活元件的激活状态的测定。在所述多个分离的细胞群体中进行分析的所述可激活元件可以是相同元件或不同元件。
在一些实施方案中，本发明提供了用于病状的分类、诊断、预后或施用治疗剂来治疗该病状后的结果的方法，其通过对不同的分离的细胞群体中的一种或更多种途径进行特征分析而实施。在一些实施方案中，根据在不同的分离的细胞群体中同时进行的对所述途径特征分析而选择治疗方法。在一些实施方案中，不同的分离的细胞群体中对一种或更多种途径进行的特征分析包含对细胞凋亡途径、细胞周期途径、信号传导途径或DNA损伤途径在所述不同的分离的细胞群体中是否具有功能而进行的测定，所述测定根据该途径中的一种或更多种可激活元件的激活水平而进行，其中途径在其可对处理作出响应的情况下是具有功能的。
在一些实施方案中，对病状(如癌症)中的不同的分离的细胞群体的特征分析显示了细胞网络的失调，所示细胞网络的失调是提高的增殖、提高的存活率、对细胞凋亡的逃避、对抗生长信号的失敏和其他机制的反映。在一些实施方案中，这些网络的失调可通过将多个分离的细胞群体暴露于一种或更多种调节剂而进行揭示，所述调节剂模拟了一种或更多种环境信号。图1显示了免疫系统中的多个分离的细胞群体的生物学特征是如何对病状和治疗结果的病理学进行测定的实例。例如，并非意在受限于任何理论的情况下，多个不同的细胞类型作为所述免疫系统的一部分参与，这些细胞类型包括B细胞、T细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞和嗜曙红细胞。这些细胞类型在该免疫系统中各具独特功能，并且与其他免疫细胞使用分泌因子进行通讯，所述分泌因子被称为细胞因子，包括白介素、TNF和干扰素。巨噬细胞吞噬异物(foreign body)并且是抗原呈递细胞，其使用细胞因子以刺激B和T细胞进行的特异性抗原依赖响应和其他细胞类型进行的非特异性响应。T细胞分泌多种不同的因子以协调和刺激针对特异性抗原的免疫响应，例如辅助T细胞在B细胞响应于抗原的激活中的作用。嗜曙红细胞、嗜中性粒细胞和嗜碱性粒细胞的增殖和激活也响应于细胞因子。细胞因子通讯通常是局部的，在组织内或邻近的细胞间进行。各种细胞因子各自由一组细胞所分泌并且在另外一组靶细胞内引起响应，所述靶细胞通常包括分泌所述细胞因子的细胞。
响应于组织损伤，化学信号的多因子网络起始并维持了设计用以治愈所述受损组织的宿主响应。当诸如癌症这样的病症存在于个体之中的时候，诸如组织、器官和/或微环境的体内平衡被扰乱。例如，与肿瘤形成相关的血管形成和淋巴管形成产生了血管和淋巴管的混乱管体结构，其中成瘤细胞与其他细胞类型(间叶细胞、造血细胞和淋巴样细胞)和重塑的细胞外基质相互作用。成瘤细胞产生一列细胞因子和趋化因子，其为粒细胞、肥大细胞、单核细胞/巨噬细胞、成纤维细胞和内皮细胞的丝裂原和/或化学引诱物。另外，激活的成纤维细胞和炎症浸润细胞分泌蛋白水解酶、细胞因子和趋化因子，其为成瘤细胞的丝裂原以及参与成瘤血管形成和淋巴管形成的细胞的丝裂原。这些因子可加强肿瘤生长、刺激血管形成、诱导成纤维细胞迁移和成熟并且通过与静脉或淋巴管网络的接合而实现转移扩散。因此，在个体内对多种细胞群体的激活状态数据的测定提供了该个体状态和/或所述细胞网络状态的更好描述。
在病状如类风湿性关节炎(RA)中，树突细胞、T细胞和其他免疫细胞之间的相互作用均有责任，并且细胞因子和趋化因子的局部产生可对RA的病例发生具有责任。这些细胞进一步与局部细胞(如滑膜细胞)相互作用。响应于局部炎症和促炎性细胞因子的产生，在未知事件后，树突细胞、T细胞和其他免疫细胞响应于细胞因子和趋化因子的局部产生而被吸引至所述滑膜处。在一些类风湿性关节炎的患者体内，慢性炎症导致了软骨、骨骼和韧带的破坏，这引起该关节的畸形。对所述关节的损伤可发生在该疾病的早期并且是进行性的。
所述状态的测定(例如，健康状态、疾病状态和/或显示个体的病理生理的任何状态)还可显示个体对病状治疗的响应。这样的信息实现了所述病状和/或另外治疗的现行监测。在一个实施方案中，本发明提供了在受疾病或病状治疗或曾受疾病或病状治疗的个体中对疾病关联细胞的存在或正常生理必需细胞的缺失或减少的检测。在一些实施方案中，所述状态也可显示了对治疗的预测性响应。
在一些实施方案中，个体状态的测定可被用于确认先前病状或治疗是否诱发了需监测和/或治疗的新的病理前或病理病状。例如，对多种形式癌症(例如淋巴瘤和幼儿白血病)的治疗可诱发特定的成人白血病，并且本发明的方法实现了对这样白血病的早期检测和治疗。
在一个进一步的实施方案中，个体状态可显示个体的免疫学状态并且可反映基本免疫学状态、器官或组织具体状态或疾病相关状态。
本发明还提供了用于测定个体状态的试剂盒(在下文题为“试剂盒”的部分有所详述)，所述试剂盒包含信号传导分子的一种或更多种特异性结合元件并且可进一步包含一种或更多种治疗剂。所述试剂盒可进一步包含用于对不同细胞群体进行数据分析的软件包，该软件包可包含参比特征以用于测试特征的对比。
下文的讨论描述了针对特定疾病的一些优选的实施方案。然而，应当了解所述原理也可用于多种其他疾病的分析。
介绍
细胞对环境和系统信号作出响应以调整其对于变化的需求的响应。例如，细胞对因子作出响应，诸如由其他细胞所产生或来自其环境的激素、生长因子和细胞因子。细胞还对损伤和生理变化作出响应。其结果是各个组织、器官、微环境(如小环境(niche))或细胞具有调控细胞活性的能力。另外，细胞的存在(如癌细胞)可在周边组织、器官、微环境(如小环境)或细胞中具有影响。
细胞在与周边组织、器官、微环境(如小环境)或细胞的通讯中可以是被动性的，仅仅根据所述环境需求而调整其活性水平。细胞可借助后代或诸如细胞接触、分泌或膜结合的因子这样的信号而影响周边组织、器官、微环境(如小环境)或细胞。因此，细胞与其他类型的细胞共处于复杂的周边环境之中。在组织、器官或微环境如小环境中互相之间相互作用的不同类型的细胞参与可能决定个体状态(例如，病状的发展或发挥正常功能)的网络之中。
本发明所使用的分离的细胞群体指的是一个群体的细胞，其中主要的细胞为相同的细胞类型或具有相同的特征。多年以来，对多种病状(如癌症)的研究专注于辨识包含单细胞类型的细胞的成因性细胞群体。然而，多种分离的细胞群体或多种细胞群体之间的相互作用可能导致病状的病理学。例如，对于癌细胞，该癌细胞可对环境信号(如细胞因子)具有失调的响应从而使所述细胞进行增殖而非进行凋亡。或者，所述细胞所处的环境(如，小环境、组织、器官)可异常地产生导致所述癌细胞进行失控增殖的因子。另外，所述癌细胞可产生一种或更多种影响其环境(如，小环境、组织、器官)的因子并且结果是该癌症的病理学恶化。
因此，病状的成功诊断和治疗的成功应用可能需要不同的分离的细胞群体的激活状态数据的知识，所述细胞群体可在病状(如癌症)的病理发生中起作用。对可能与网络直接或间接相互作用的不同的分离的细胞群体的激活状态数据的测定可发挥该网络状态的指标的作用。另外，其为所述网络中的不同的分离的细胞群体间的相互作用指出了方向。其对参与所述网络之中的细胞群体还提供了跨群体信息。因此，与单个分离的细胞群体分析相比，不同的分离的细胞群体的激活状态数据的测定可作为更为出色的病状指标发挥作用。
在一些实施方案中，通过分析各个群体中的多个单细胞(如，通过流式细胞仪)而测定了多个细胞群体的激活状态数据。在个体中对各个分离的细胞群体的多个单细胞进行的测量提供了多个数据点，其随后实现了对所述个体中的网络边界的测定。在单细胞水平测量受调控的网络提供了该水平上的生物解析度，其实现了对患者内克隆异质性的估测，其最终与疾病控制和结果相关。当所述个体罹患病理病状时或在所述个体对治疗有所响应或不具响应的情况下，所述网络边界和/或所述网络的状态可发生变化。因此，网络边界和/或所述网络状态的测定可被用于病状的诊断、预后或确定施用治疗剂来治疗该病状后的结果。
本发明的一个方面提供了用于测定个体状态的方法，其通过分析所述个体中的不同的分离的细胞群体而进行。在一些实施方案中，本发明提供了用于测定细胞网络状态的方法。所述细胞网络可与个体状态相关联。在一些实施方案中，对个体状态的测定涉及病状的分类、诊断、预后或施用治疗剂来治疗该病状后的结果。
样品与取样
所述方法涉及来自个体的一种或更多种样品的分析。个体或患者是任意的多细胞生物；在一些实施方案中，所述个体是动物，如哺乳动物。在一些实施方案中，所述个体是人。
所述样品可以是任意适当的类型，其可实现对不同的分离的细胞群体的分析。所述样品可以是任意适当的类型，其可实现对单一群体细胞的分析。所述样品一次性或分多次从个体中获取。多个样品可从所述个体的不同部位获取(如，血液样品、骨髓样品和/或淋巴结样品)，在不同的时间从所述个体中获取(如，对一系列样品进行取样用以监测对治疗的响应或用以检测病理病状的重现)，或其任意组合。根据样品类型、部位和取样时间的这些或其他可能的取样方式组合实现了对病理前或病理细胞存在的检测、对治疗响应的测量以及对疾病的监测。
当样品成系列地获取的时候，例如治疗后获取的一系列血液样品，所述样品可在固定的间隔下获取，在由最近一个或一批样品或所述个体其他特征所决定的间隔下获取，或在所述间隔的组合下获取。例如，样品可以在约1、2、3或4周的间隔下获取，在约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个月的间隔下获取，在约1、2、3、4、5或超过5年的间隔下获取，或在所述间隔的组合下获取。应当了解，根据个体进行取样的可行性和取样设备的可用性，间隔有可能并不精准，因此本发明涵盖了对应于计划间隔安排的近似间隔。例如，进行癌症治疗的个体可在治疗后最初六个月至一年内进行相对频繁(例如每个月或每三个月)的取样(如，通过取血)，随后如果未见异常，其后进行较不频繁的取样(如，六个月到一年)。但是，如果在任何预期间或取样期间发现任何异常或其他状况，可对取样间隔进行调整。
一般而言，最容易获取的样品是液体样品。液体样品包括正常体液和病理体液以及这些液体的吸出物。液体样品还包括器官和腔室的清洗物(灌洗和灌注)。体液包括全血、骨髓吸出物、滑液、脑脊液、唾液、汗液、泪液、精液、痰液、粘液、经血、母乳、尿液、淋巴液、羊水、胎水以及渗出物诸如心包积液、关节积液、胸腔积液和腹腔积液(腹水)。清洗物可获自多种器官、体腔、通路、管道和腺体。可被清洗的位置包括肺(支气管灌洗)、胃(胃灌洗)、胃肠道(胃肠道灌洗)、结肠(结肠灌洗)、阴道、膀胱(膀胱冲洗)、乳腺导管(乳腺清洗)、口腔、鼻腔、鼻窦和腹腔(腹腔灌注)。在一些实施方案中，所述样品是血液。
也可使用固体组织样品，单独或与液体样品结合使用均可。固体样品可通过任何本领域已知的方法获自个体，包括手术标本、活组织切片和组织刮取物，包括颊部刮取物。手术标本包括在探测性、整形、重建或治疗性手术期间获取的样品。活组织切片可通过多种方法获取，包括啮取、刷取、锥切、钻心、细胞学、吸取、内窥镜检、割除、探测性、细针吸取、切开、经皮穿刺、钻孔、立体定向和表面活组织切片检测。
样品可包括循环肿瘤细胞(CTC)。用于分离CTC的方法在本领域中是已知的。参见，例如：Toner M等人，Nature 450，1235-1239(2007年12月20日)；Lustenberger P等人，Int J Cancer.1997年10月21日，74(5)：540-4；Reviews in Clinical Laboratory Sciences，第42卷，第2集，2005年3月，155-196页；以及Biotechno，109-113页，2008International Conference on Biocomputation，Bioinformatics，andBiomedical Technologies，2008年。
在一些实施方案中，所述样品是血液样品。在一些实施方案中，所述样品是骨髓样品。在一些实施方案中，所述样品是淋巴结样品。在一些实施方案中，所述样品是脑脊液样品。在一些实施方案中，使用了血液、骨髓、脑脊液和淋巴结样品中的一种或更多种的组合。
在一个实施方案中，样品可在例行检查中获自外观健康的个体并且经分析以提供所述个体总体健康状态的评测。在另一个实施方案中，可获取样品以进行常见疾病的筛选。这样的筛选可包含对单一疾病、相关疾病类属的测试或包含对多种无关联疾病的总体筛选。筛选可每周进行、双周进行、每月进行、双月进行、每数月进行、每年进行或以数年的间隔进行，并且可取代或补充进行中的筛选方式。
在另一个实施方案中，可对具有已知发病风险升高的个体进行规律性监测用以检测特定疾病或疾病类属的出现。发病风险升高可基于家族关联、年龄、先前基因测试结果或者对致病剂的职业性、环境性或治疗性暴露。与BRCA1和BRCA2基因的先天突变相关的乳腺癌和卵巢癌是具有家族关联的疾病的实例，其中易患个体可通过基因测试而鉴别。另一个实例为腺瘤样结肠息肉基因中的先天突变的存在，其使个体易患结肠直肠癌。环境或治疗性暴露的实例包括职业性暴露于苯的个体(其具有升高的发展出多种形式的白血病的风险)，以及治疗性暴露于用于早期恶性疾病治疗的烷基化剂的个体。可对具有特定疾病的升高风险的个体针对异常分离的细胞群体出现的第一信号进行规律性监测。监测可每周进行、双周进行、每月进行、双月进行、每数月进行、每年进行或以数年的间隔进行，或在所述间隔的组合下进行。监测可取代或补充进行中的筛选方法。通过常规的监测，对疾病成因或相关细胞的存在的早期检测可带来增多的治疗可选项，包括具较低毒性的治疗或疾病控制或治愈的几率提高。
在进一步的实施方案中，可进行测试以确认或排除与疾病风险升高的可疑基因或生理异常的存在。这样的测试方法学可取代其他的确认工艺如细胞发生分析或原位组织化学荧光(FISH)。在另一个实施方案中，可进行测试以确认或排除对病理前或病理病状的诊断。
在个体具有已知的病理前或病理病状的情况下，可对来自适当部位的多个分离的细胞群体进行取样并分析以预测所述个体对可行的治疗选项的响应。在一个实施方案中，接受目的为使相关于病理前或病理病状的细胞降低数量或消除的治疗的个体可被监测以估测这些细胞随时间的减少。成因性或相关性细胞的降低可与疾病症状的消失或减弱相关联或无关联。如果未发生预期的细胞数量降低，可能需要以相同或者不同的治疗方案进行进一步治疗。
在另一个实施方案中，可对接受治疗以逆转或停止病理前病状的发展的个体进行监测以估测所述逆转速度或被停止在该病理前状态点的细胞的百分比。如果未见到预期的逆转速度或细胞未被停止在所需的病理前状态点，可以考虑使用相同或不同的治疗方案进行进一步治疗。
在一个进一步的实施方案中，可对个体的细胞进行分析以查看使用分化剂进行的治疗是否按照特异性组织谱系驱动某一细胞类型并且使之最终分化而随后失去增殖或更新能力。这样的治疗可被预防性地用于将与疾病相关的去分化细胞的数量保持于低水平，因而预防了明显疾病(overt disease)的发展。或者，可在再生医学中使用这样的治疗从而诱导或引导多潜能干细胞或多能干细胞分化降至所需的组织或器官特异性谱系，并且因而加速或改善了康复过程。
还可对个体进行监测以针对与良性预后相关的另一种分离的细胞群体的细胞的出现或数量的提高。如果观测到有利的分离的细胞群体，可采取措施以进一步提高他们的数量，例如施用生长因子。或者，还可对个体进行监测以针对与不良预后相关的另一种分离的细胞群体的细胞的出现或数量的提高。在这样的情况下，可以考虑进行更新性治疗，其包括继续进行、修改当前治疗或起始另一类型的治疗。
在这些实施方案中，根据本文的描述可从所述个体获取一种或更多种样品，并且使样品接触调节剂。在一些实施方案中，所述样品可被分成分样，其各自接触不同的调节剂。在用所述调节剂进行治疗之后，对所述样品或分样中的不同的分离的细胞群体进行分析以测定它们的激活状态。在一些实施方案中，对所述不同的分离的细胞群体中的单细胞进行了分析。可使用实现对细胞激活水平的测定的任意适当形式的分析。在一些实施方案中，所述分析包括对诸如蛋白质这样的细胞内元件的激活水平的测定。在一些实施方案中，所述分析包括对可激活元件的激活水平的测定，例如细胞内可激活元件如蛋白质，例如磷酸蛋白。根据本文所述，所述激活水平的测定的完成可通过使用激活状态特异性结合元件，例如抗体。可在一种或更多种所述不同的分离的细胞群体中检测多个可激活元件。
特定的液体样品可在使用或不使用添加稀释剂或缓冲液的情况下以其天然状态而进行分析。或者，液体样品可被进一步加工以在分析之前获得富集的或纯化的分离的细胞群体。用于体液的多种富集或纯化方法在本领域是已知的。用于从全血的血浆中分离细胞的一种常见方法是通过使用肝素化管进行离心。通过引入密度梯度可完成将淋巴细胞从红细胞中的进一步分离。本领域中已知多种密度梯度介质，包括蔗糖、葡聚糖、牛血清白蛋白(BSA)、FICOLL泛影酸钠(Pharmacia)、FICOLL甲泛影钠(Nycomed)、PERCOLL(Pharmacia)、甲泛葡胺以及重盐类如氯化铯。或者，可通过使用诸如氯化铵这样的试剂进行的裂解在离心前除去红细胞。
全血也可用滤器进行处理，所述滤器经工程改造而具有对所需细胞类型或种类进行选择的孔径。例如，根据美国专利申请第09/790,673号中进行的公开，在对红细胞进行裂解之后，稀少的病原性细胞可使用孔径介于5与10μm之间的滤器从稀释的全血中滤出。或者，根据美国专利申请第10/529,453号，可根据大小、形状、变形程度或者表面受体或表面抗原通过微流控装置将全血分解成其组成的细胞。
还可通过基于抗体或其他识别细胞表面或细胞质组成的实体的结合进行的阳性或阴性选择对精选的细胞群体进行针对全血的富集或从全血中进行分离。例如，Schmitz等人的美国专利第6,190,870号公开了通过肿瘤细胞的磁力分选而进行的肿瘤细胞从外周血中的富集，所述肿瘤细胞用针对组织特异性抗原的抗体进行磁力标记。
固体组织样品可能需要破坏该细胞外基质或组织基质以及对用于分析的单细胞的释放。多种工艺在本领域中是已知的，包括分开或组合使用的酶降解和机械力降解。利用了胶原酶和蛋白酶的酶学解离的一个实例可见于Wolters GHJ等人，An analysis of the role of collagenase andprotease in the enzymatic dissociation of the rat pancrease for islet isolation.Diabetologia 35：735-742，1992年。机械力解离的实例可见于Singh，NP.Technical Note：A rapid method for the preparation of single-cellsuspensions from solid tissues.Cytometry 31：229-232(1998年)。或者，可通过显微切割技术从固体组织中取出单细胞，所述显微切割技术包括Laser Capture Microdissection，Emmert-Buck，M.R.等人，Science，274(8)：998-1001，1996年中所公开的激光捕获显微切割技术。
在一些实施方案中，可在诸如组织断片或切片这样的组织样品内对单细胞进行分析，而无需在进行测定步骤前释放个体细胞。
可通过离心、淘析、密度梯度分离、析离、亲和性选择、盘选、FACS、使用Hypaque进行的离心、具有结合抗体的支持物(磁珠、柱体中的微珠、或其他表面)等等将所述细胞从身体样品中分离。通过使用等同于特定细胞类型的标记物的特异性抗体，可获得相对同源的细胞群体。或者可以使用异源的细胞群体。也可通过使用滤器而分离细胞。一旦获得样品，其可被直接使用、冷冻或在适当的培养基中进行短时期维持。分离一种或更多种用于根据本发明的方法使用的细胞的方法可根据本领域所广为接受的标准工艺和方案而实施。还可参见U.S.S.第61/048,886号；第61/048,920号；和第61/048,657号。根据上文的确定，还可参见来自诸如BD和BCI这样的公司的商业产品。
还可参见美国专利第7,381,535号和第7,393,656号。根据上文声明，上述专利和申请以引用的方式并入本文。
在一些实施方案中，所述细胞在收集后在适于揭示可激活元件的激活水平的培养基(如RPMI、DMEM)中进行培养，所述培养存在或不存在血清，诸如胎牛血清、牛血清、人血清、猪血清、马血清或山羊血清。当所述所述培养基中存在血清的时候其可处于介于0.0001％与30％的之间的水平。
分离的细胞群体的激活状态的测定
如果使用调节剂，在使用一种或更多种调节剂进行处理之后，一些实施方案中对所述样品进行分析以测定不同的分离的细胞群体的激活状态。这产生了不同的分离的细胞群体的激活状态数据。在一些实施方案中，分离的细胞群体的激活状态数据的测定通过将所述细胞群体接触一种或更多种调节剂并且测定所述细胞群体中的至少一种细胞的可激活元件的激活状态或激活水平而进行。适用的不同调节剂在下文题为“调节剂”的部分有所描述。通过对所述细胞中的可激活元件的相对量进行定量(如，使用抗体以对所述可激活元件进行定量)而测定所述激活水平。根据下文题为“检测”的部分的描述，可以使用实现对细胞激活水平的测定的任意适当形式的分析。可激活元件在下文题为“可激活元件”的部分有所描述。根据下文题为“结合元件”和“替代性激活状态指示物”的部分的描述，所述激活水平的测定可通过使用诸如抗体这样的激活状态特异性结合元件而完成。
细胞群体可被分成多种样品，并且在所述样品被暴露于一种或更多种调节剂之后通过测量该样品中的至少一种可激活元件测激活水平而测定所述群体的激活状态数据。在一些实施方案中，所述分析在单细胞中进行。可以使用在单细胞内实现可激活元件的激活水平的测定的任意适当分析，所述测定提供了可用于测定所述样品所来自的分离的细胞群体的激活状态数据。实例包括流式细胞仪、免疫组织化学、使用或不使用共聚焦显微镜法的免疫荧光组织化学、免疫电子显微镜法、核酸扩增、基因阵列、蛋白质阵列、质谱、膜片钳技术、二维凝胶电泳、差示凝胶电泳、基于微球的多元蛋白质分析、ELISA、电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)以及无标记物细胞分析。用于在单细胞间进行进一步区分的信息可通过本领域已知的多种方法获得，包括测定细胞外和/或细胞内标记物的存在与否、测定代谢物的存在、基因表达特征、DNA测序分析和染色体组型分析。
所述不同的分离的细胞群体的激活状态数据可被用于理解与疾病相关的分离的细胞群体之间的通讯。这些因果关联可使用本领域已知的方法进行测定，例如简单统计检验和/或分类算法。这些因果关联可使用贝叶斯网络或时间模型进行建模。或者，这些因果关联可使用无监督学习工艺进行辨识，例如主成分分析和/或聚类分析。可以使用可能影响一个或多个分离的细胞群体的激活剂和抑制剂测定因果关联。例如，在第一细胞群体中抑制可激活元件的磷酸化的抑制剂可对第二细胞群体中的第二种可激活元件具有的磷酸化具有成因效果。在一些实施方案中，分离的细胞群体之间的因果关联在本领域中是已知的。因此，在一些实施方案中，分离的细胞群体之间的因果关联的测定涉及到对本领域中先前测定的关联的使用。不同的分离的细胞群体中的激活水平之间的因果关联可以是细胞网络之间的通讯并且可被用于测定细胞网络的状态。细胞网络的状态可以关联于，例如，药物响应和疾病进展。
a.动力学激活状态数据的生成
在一些实施方案中，继治疗之后可在多个时间间隔下测量分离的细胞群体或分离的细胞亚群体的激活水平以生成“动态激活状态数据”(本文中亦称为动力学激活状态数据)。在这些实施方案种，将样品或分样(如患者样品)分成等份，其随后使用一种或更多种调节剂行处理。随后对所述不同等份用固定剂在不同时间间隔下进行处理。所述时间间隔可大幅变化并且应处于分钟(如，5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55分钟)至小时(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、6、17、18、19、20、21、22、23小时)至天(如24小时、48小时、72小时)或其任意组合的范围内。细胞还可使用不同浓度的调节剂进行处理。
在这些实施方案中，所述激活状态数据可进行分析以确认分离的细胞群体并且随后进行进一步分析以对不同的分离的细胞群体随时间对调节剂的响应进行特征分析。所述激活状态数据可进行时间建模以对所述可激活元件对调节剂的刺激的动力学响应进行特征分析。对调节的动力学响应的建模可提供对疾病的病理生理学或预后状态或对治疗的响应的更好理解。正常细胞对调节剂的动力学响应的建模的一个实例显示于图3和实施例6。另外，随时间关联于疾病状态的分离的细胞群体的调节剂诱导的激活水平可与其他样品进行比较用以对在特定时间点显示了对调节剂的异常响应的激活水平进行确认。对调节剂的异常响应可被关联于健康状态、预后状态、细胞发生状态或预测的治疗响应。在不同的时间点获得激活水平是有益处的，因为关联于不同状态的样品之间的最大差异响应可能早至用调节剂处理后5分钟后被观察到并可迟至用调节剂处理72小时后才可被观察到。
可对所述不同的分离的细胞群体的调节剂诱导响应建模以进一步理解与疾病相关的分离的细胞群体之间的通讯。例如，在第一细胞群体中抑制可激活元件在较早时间点的增高的磷酸化的抑制剂可对第二细胞群体中的第二种可激活元件较晚时间点的磷酸化具有成因效果。这些因果联系可使用贝叶斯网络或时间模型进行建模。或者，这些因果联系可使用无监督学习工艺进行辨识，例如主成分分析和/或聚类分析。不同的分离的细胞群体的激活水平间的因果关联可反映细胞网络随时间的通讯。这些通讯可提供了对药物响应、癌症进行和癌症发生的机理的深入认识。因此，这些通讯的确认和特征分析允许对可精确地预测药物响应的诊断方法、治疗方法和早期检测的开发。
在一些实施方案中，在第一时间点的激活状态数据经计算分析(如，根据下文所述通过分组和门控)以测定分离的细胞群体。所述的分离的细胞群体随后被各自随剩余时间点进行分析以辨识对调节剂具有不同响应的细胞亚群体。可对同一细胞群体内随时间的差异响应进行建模，其使用的方法如美国专利申请第61/317,817号和下文所描述的时间建模或超空间建模。这些方法可允许单个分离的细胞群体随时间的建模或多个分离的细胞群体随时间的建模。
在另一个实施方案中，所述激活状态数据经计算在所有时间点进行分析以测定分离的细胞群体。随后对分离的细胞群体建模用以测定分离的细胞群体随时间的稳定成员。通过该方式，细胞群体并非根据调节剂在单一时间点的激活水平而进行特征分析，而是根据调节剂在多个时间点的激活水平而测定。门控和分组均可被用于对细胞群体在所有时间点的激活状态数据进行初步分类。根据在多个不同时间点的被分类的细胞群体可辨识分离的细胞群体。尽管本工艺使用对分离的细胞群体的门控或半监督辨识而行之有效，本工艺对于以分离的细胞群体的无监督辨识的应用是理想的，这样的方法的例子如美国公开号第2009/0307248号中所描述的方法和下文的方法。
分离的细胞群体的计算辨识
在一些实施方案中，细胞群体的激活状态数据的测定通过将所述细胞群体接触于一种或更多种调节剂、对所述细胞群体生成激活状态数据并且使用计算工艺以根据该数据辨识一个或多个分离的细胞群体而进行。使用包括内存和硬件的计算机实现这些工艺。在一个实施方案中，用于根据原始激活状态数据生成度量的算法被存储于计算机的内存之中并且通过计算机的处理器被执行。将这些算法与同样被计算机存储和执行的门控和分组算法组合使用以辨识所述分离的细胞群体。
所述数据可使用多种度量进行分析。例如，各个可激活元件的中位荧光强度(MFI)通过所述细胞群体控门(gate)内的细胞的强度水平进行计算。所述MFI值随后通过将其与多种基线或背景值进行比较而被用于计算多种度量，基线或背景值的例子如未刺激条件、自体荧光和同位素对照。下文的度量是可被用于本文所述方法的度量实例：1)测量未刺激荧光物-抗体染色样品和未经刺激物处理或未经染色的样品之间中位荧光值的对数差异的度量(log(MFI未刺激经染色)-log(MFI门控未染 色))，2)测量经刺激荧光物-抗体染色样品和未经刺激物处理或未经染色的样品之间中位荧光值的对数差异的度量(log(MFI经刺激经染色)-log(MFI门控未染色))，3)测量所述经刺激荧光物-抗体染色样品和所述未经刺激荧光物-抗体染色样品之间变化的度量log(MFI经刺激经染色)-log(MFI未刺激经染色)，亦称为“中位荧光强度变化倍数”，4)测量等高线图的象限门控(QuadrantGate)中细胞百分比的度量，其在一个或更多个维度下测量多个细胞群体，5)测量磷阳性群体的MFI以获得阳性值超过背景的百分比的度量，以及6)对于大样本群体和亚群体分析的多重性(multimodality)和分散度量(spread metrics)应用。
在一个特定的实施方案中生成了参比荧光物数值(ERF)。所述ERF是中位荧光强度值的转换数值。该ERF值使用校准线进行计算，所述校准线通过将8峰多彩微珠(8-peak rainbow beads)的标准化组合对所有荧光通道的观察值与制造商所设定的标准化值进行拟合而测定。不同细胞样品的ERF值可以任意方式进行组合以生成不同的激活状态度量。不同的度量可包括：1)基于用调节剂(ERFm)处理的样品和未经调节剂处理的样品(ERFu)的ERF值的倍数值，log2(ERFm/ERFu)；2)基于用调节剂处理的样品(ERFm)和来自自体荧光孔的样品(ERFa)的ERF值的总磷值，log2(ERFm/EREa)；3)基于未经调节剂处理的样品(ERFu)和来自自体荧光孔的样品(ERFa)的ERF值的基础值，log2(ERFu/ERFa)；4)比较所述ERFm和ERFu值的曼-惠特尼统计Uu，其被按比例缩降为允许样本间比较的单位间隔(0，1)；5)比较所述ERFm和ERFu值的曼-惠特尼统计Uu，其被按比例缩降为允许样本间比较的单位间隔(0，1)；5)比较所述ERFa和ERFm值的曼-惠特尼统计Ua，其被按比例缩降为单位间隔(0，1)；以及6)曼-惠特尼统计U75。U75是一种线性秩统计量，其被设计用于辨识ERFm和ERFu值分布的上分位数的移位。位于或低于ERFm和ERFu值的第75％分位的ERF值被设为0分。剩余的ERFm和ERFu值根据所述Uu统计值被设为0到1之间。对于属于细胞表面标记物的可激活元件，可进一步生成下列度量：1)根据染色样品ERF值(ERF染色)和对照样品EFR值(ERF对照)的相对蛋白表达度量log2(ERF染色)-log2(ERF对照)；以及2)比较ERFm和ERFi值的曼-惠特尼统计Ui，其被按比例缩降为单位间隔(0，1)，其中所述ERFi值来自于同位素对照。
不同标记物的激活状态数据经“门控”以在所述数据中辨识分离的细胞亚群体。在门控中，激活状态数据可被用于辨识具有某种可激活元件的不同激活水平的细胞亚群体。这些分离的细胞亚群体可对应于细胞类型、细胞亚型、处于疾病或其他生理状态的细胞和/或具有任何共同特征的细胞群体。
在一些实施方案中，所述激活状态数据被显示为二维分散图，并且所述分离亚群体在该分散图中被门控或划分。根据本实施方案，所述分离的亚群体可被自动、手动或使用自动和手动门控方法的组合进行门控。在一些实施方案中，使用者可创建或手动调整该分界或“控门”以生成新的分离的亚细胞群体。门控分离的细胞亚群体的适当方法在美国专利第12/501295号中有所描述，出于于所有目的其全文以引用的方式并入本文。
在一些实施方案中，根据已知分类不同细胞类型或细胞亚型的标记物对分离的细胞群体进行门控。在一个特定的实施方案中，使用者可根据表面标记物辨识分离的细胞群体。根据CD34+CD38-或CD34+CD33-表达细胞的“干细胞群体”；记忆CD4T淋巴细胞；例如CD4+CD45RA+CD29低细胞；或基于CD33、CD45、HLA-DR、CD11b的多个白血病亚克隆以及对各个分离的群体/亚群体进行的信号传导分析。在另一个替代的实施方案中，根据诸如转录因子或其他细胞内蛋白质这样的细胞内标记物；根据功能分析(如，染料排出分析以测定药物转运体阳性细胞或荧光葡萄糖摄取)或根据其他荧光标记物，使用者可辨识分离的细胞群体/亚群体。在一些实施方案中，控门被用于在现有独立数据中辨识特定分离的群体和/或亚群体的存在。所述的现有独立数据可以是存储于计算机中的来自先前患者的数据，或是来自使用不同患者进行的独立研究的数据。
在一些实施方案中，根据将所述细胞分类成为分离的群体的激活状态数据而对所述分离的细胞群体/亚群体进行自动门控。例如，在细胞中处于“开启”或“关闭”状态的可激活元件可被用于将所述细胞群体分类成为两种分离的亚群体。在对所述分离的细胞亚群体进行自动辨识的实施方案中，可以使用不同的算法以根据所述激活状态数据辨识分类细胞亚群体。在特定的实施方案中，使用多分辨率分组算法通过区分所述激活状态数据对分离的细胞亚群体进行迭代辨识。本算法在美国公开号第2009/0307248号中有所详述，出于所有目的，其全文以引用的方式并入本文。在一个实施方案中，通过对将激活状态数据区分成为更高分辨率级别的矢量或“超平面”进行迭代辨识，所述多分辨率分组算法被用于辨识稀有或独特分离的细胞群体。使用诸如多分辨率分组算法这样的迭代算法，可对包括稀有细胞群体的高分辨率分组(bin)进行辨识。例如，可对一种或更多种标记物的激活状态数据进行迭代分组以辨识具有标记物异常高表达的少量细胞。正常情况下这些细胞会被作为“离群值”数据被舍弃或在对所述数据进行标准化的时候被舍弃。但是，多分辨率分组允许对稀有细胞群体相应的激活状态数据的辨识。
在不同的实施方案中，门控可以不同方式被用于辨识分离的细胞群体。在一个实施方案中，对个体样品或亚类别(如，试验中的患者)的激活状态数据进行的“由外而内”的比较被用于辨识分离的细胞群体。在这些实施方案中，细胞群体是同源的或经谱系门控的，其门控方式得以创建分离的细胞类别，所述细胞类别根据某些特征(如，细胞类型、表达、亚型等)而被认为是同源的。在AML患者中的样品水平的比较的一个实例是对淋巴细胞(如，CD4T细胞、CD8T细胞和/或B细胞)、单核细胞+粒细胞和白血病细胞中的信号传导特征的辨识以及将这些群体的激活状态数据与临床响应的非随机分布进行关联。这被认为是由外而内的方法，因为目的分离的细胞群体在将其特征与诸如临床结果或正常个体中的所述群体进行映射或比较之间进行了预定义。
在其他的实施方案中，在异源群体的个体细胞水平上对激活状态数据的“由内而外”的比较被用于辨识分离的细胞群体。该比较的一个实例是在特定的条件下对混合的造血细胞进行的信号传导状态映射以及随后对经计算而辨识的细胞集类与谱系特异性标记物进行的比较。这被认为是单细胞研究的由内而外的方法，因为其在分类之前并未假定特定分离的细胞群体的存在。用于分离的细胞群体的由内而外的辨识的适当方法包括上文所述的多分辨率分组算法。该方法的一个主要缺点是其创建了细胞群体，其至少在最初需要多种瞬时标记物以进行计数，并且可能不再能接触某一细胞表面表位。因此，可能难以测定这样的分离的细胞群体的生物学意义。这一非传统方法的主要优点是对分离的细胞群体的无偏跟踪，其在谱系或细胞类型之间不带有潜在的主观区别，并其具有将所述不同群体的激活状态数据用于测定个体状态的潜力。
这些工艺均利用流式细胞仪的能力以在单细胞水平产生大量多参量数据。对于关联于病状(如癌症发生或造血机能病状)的分离的细胞群体，由于关联于病状的细胞(如癌症细胞)通常被作为单个实体处理或根据先前工艺进行分类，因而存在第三种“元水平(meta-level)”的数据。这些工艺已经包括器官或组织发生来源、分化程度、增殖指数、转移扩散和有关所述患者的遗传或代谢数据。
在一些实施方案中，本发明使用了被用于映射病状信号传导空间(condition signaling space)的差异映射工艺(variance mappingtechniques)。这些方法是病状生物学研究的重要进展，因为其实现了不依赖推定正常对照(putative normal control)的病状比较。传统的差异状态分析方法(如，DNA微阵列、削减Northern印迹)一般依赖于将来自各个患者的关联于病状的细胞与正常对照进行比较，正常对照一般为邻近的并且理论上未转型的组织。或者，它们依赖于多聚类或重新集类成组群(group)并且进一步根据表型对患者样品分组。与之对比，病状状态的差异映射将病状样品首先与其自身进行比较然后与其亲本病状群体进行比较。因此，在病状中具有最大多样性的活性状态在所述差异状态分析中提供了核心参量。对于一个给定的多样病状库(pool ofdiverse conditions)，本工艺使得研究人员得以辨识造成差异病状病理(如，癌症对于化疗的响应)的分子事件，而非病状与假定正常对照之间的差异。
在一些实施方案中，当差异映射被用于对患者样品的信号传导空间进行特征化的时候，对调节剂具有信号传导响应的病状被集合成一个组群，无论其组织或细胞类型的来源。类似地，根据谱系标记物或组织来源而被认为相对类似的两种病状(如，两种肿瘤)可具有差别巨大的反映环境刺激的能力并且应为特征化成为两种不同的类别。
根据关联于分离的细胞群体的激活状态数据而对细胞网络的分类和特征分析
当关联于多个分离的细胞群体的激活状态数据已被辨识，测定激活状态数据是否在所述类别中非随机分布通常是有用的，该类别的例子如疾病状态、治疗响应、临床响应、基因突变的存在和蛋白质表达水平。与具有特定特征(如，基因突变和疾病状态)的一个或多个分离的细胞群体紧密关联的激活状态数据可被兼用于根据所述特征对细胞分类和对造成所述特征的病理生理的细胞网络通讯进一步进行特征分析和了解。对关联于细胞网络的分离的细胞群体进行匹配辨识的激活状态数据可作用于强化或补充对关联于所述细胞网络的另外分离的细胞群体进行匹配辨识的其他激活状态数据。
如果对于多种分离的细胞群体可获得激活状态数据，可使用简单统计检验辨识对分离的细胞群体进行匹配辨识的激活状态数据，例如学生t检验和X2检验。类似地，如果所述实验内的两种分离的细胞群体的激活状态数据被认为是相关的，来自线性回归的r2相关系数可被用于表述这一相关性的程度。其他方法包括皮尔森和斯皮尔曼秩相关(rankcorrelation)。在一些实施方案中，相关和统计检验算法被存储于计算机的内存之中并且被所述计算机的处理器执行。
在一些实施方案中，本发明提供了用于测定不同的分离的细胞群体的激活状态数据是否与细胞网络和/或特征相关联的方法，这些方法可潜力相互补充以提高分类的精确度。在一些实施方案中，所述分离的细胞群体的激活状态数据可被用于生成对关联于所述分离的细胞群体的一种或更多种特征的分类器，所述特征包括但不限于治疗响应、疾病状态和疾病预后。本文所述的分类器是任意类型的统计模型，其可被用于对一个样品和一类样品之间的相似性进行特征分析。正如所述术语分类器的传统用法，分类器可包括二元和多元分类器。分类器还可包括仅在一类样品(如，正常个体)内的激活水平和差异的统计模型。这些单类分类器可被应用于数据，例如来自未诊断的样品，从而生成相似性数值，该值可被用于测定所述未诊断样品是否属于该类样品(如，通过使用一种阈值相似性数值)。本领域中已知的任意适当的方法可被用于产生所述分类器。例如，简单统计检验可被用于产生分类器。可被用于产生分类器的分类算法的实例包括但不限于，线性分类器、费雪线性判别(Fisher′s linear discriminant)、ANOVA、逻辑回归、朴素贝叶斯分类器、感知器(Perceptron)、支持向量机(Support vector machines)、二次分类器、核估计法(Kernel estimation)、k紧邻算法、增强算法(Boosting)、决策树、随机森林法、类神经网络、贝叶斯网络、隐马尔可夫模型和学习向量量化。因此，在一些实施方案中，不同类型的分类算法可被用于产生所述分类器，其包括但不限于：神经网络、支持向量机(SVM)、装袋算法(bagging)、增强算法和逻辑回归。在一些实施方案中，与相同网络和/或特征相关联的不同分离的群体的激活状态数据可在产生分类器之前被汇集，所述分类器明确了与分离的细胞群体相关联的哪一激活状态数据的组合可被用于根据可激活元件对细胞进行匹配辨识和分类。
在一个特定的实施方案中，如果关联于所述分离的细胞群体的激活状态数据量较小，可采用直接的角分类器，其用于检出对不同的分离的细胞群体进行匹配辨识的激活状态数据的组合。也可通过下文所述的自举法(bootstrapping approach)对分离的细胞群体的激活状态数据的组合进行针对其稳定性的检验。在本实施方案中，角分类算法可被用与所述数据。所述角分类器是一种基于规则的算法，其用于使用一种或更多种数字变量(如，群体/节点组合)将对象分成两类(如，对于治疗的二分反应)。本方法通过对各变量设置阈值并且随后将产生的间隔(如，X＜10或Y＞50)同与(逻辑与)操作(参比)相组合而进行。这产生了一个矩形区间，其被预期涵盖先前被辨识为目标的类别的多数成员(如，治疗的响应者或无响应者)。通过在各类之中根据评定转换错误分类率(logit-transformed misclassification rate)对误差标准进行的最小化而选择阈值。所述方法假定所述二元类别(如，对治疗有响应或无响应)倾向于随所使用的变量而具有不同定位，并且在这些变量的单调转换下是无变化的。
在一些实施方案中，在分类器生成期间使用了交叉验证的计算方法以测量所述分类器的精确度并且防止所述分类器对所述数据的过度拟合。在一个特定的实施方案中，装袋算法，亦称为自举集成法，被用于对上述统计模型的结果进行交叉验证。在本实施方案中，从原始数据中迭代抽取复样本(re-sample)并将之用于对所述分类器进行验证。各个分类器，如群体/节点组合，被用于对所述复样本进行拟合并且用于对被排除于所述复样本之外的患者的类别归属关系(class membership)进行预测。对各个分类器的假阳性和假阴性分类的精确度进行测定。
在对原始数据进行迭代再取样之后，各个患者获得了根据使用其他患者进行拟合的分类器而预测的类别归属关系列单。各个患者的列单被简化成为目标类别预测的分数；所述目标类别的成员应具有接近1的分数，与其他类别的成员相区别。这样的分数群组，与所述患者的实际类别归属关系，被用于创建接收者操作特征曲线(Receiver OperatorCurve)并且被用于计算该ROC曲线下的面积(本文称为“AUC”)。
在一些实施方案中，本发明提供了用于测定诸如疾病状态、治疗响应、和/或临床响应这样的个体状态的方法，其中所述阳性预测值(PPV)高于60、70、80、90、95或99.9％。在一些实施方案中，本发明提供了用于测定诸如疾病状态、治疗响应、和/或临床响应这样的个体状态的方法，其中所述PPV等于或高于95％。在一些实施方案中，本发明提供了测定诸如疾病状态、治疗响应、和/或临床响应这样的个体状态的方法，其中所述阴性预测值(NPV)高于60、70、80、90、95或99.9％。在一些实施方案中，本发明提供了用于测定诸如疾病状态、治疗响应、和/或临床响应这样的个体状态的方法，其中所述NPV高于85％。
在一些实施方案中，本发明提供了用于预测2年复发风险的方法，其中所述PPV高于60、70、80、90、95或99.9％。在一些实施方案中，本发明提供了用于预测2年复发风险的方法，其中所述PPV等于或高于95％。在一些实施方案中，本发明提供了用于预测2年复发风险的方法，其中所述NPV高于60、70、80、90、95或99.9％。在一些实施方案中，本发明提供了用于预测2年复发风险的方法，其中所述NPV高于80％。在一些实施方案中，本发明提供了用于预测5年复发风险的方法，其中所述PPV高于60、70、80、90、95或99.9％。在一些实施方案中，本发明提供了用于预测5年复发风险的方法，其中所述PPV等于或高于95％。在一些实施方案中，本发明提供了用于预测5年复发风险的方法，其中所述NPV高于60、70、80、90、95或99.9％。在一些实施方案中，本发明提供了用于预测5年复发风险的方法，其中所述NPV高于80％。在一些实施方案中，本发明提供了用于预测10年复发风险的方法，其中所述PPV高于60、70、80、90、95或99.9％。在一些实施方案中，本发明提供了用于预测10年复发风险的方法，其中所述PPV等于或高于95％。在一些实施方案中，本发明提供了用于预测10年复发风险的方法，其中所述NPV高于60、70、80、90、95或99.9％。在一些实施方案中，本发明提供了用于预测10年复发风险的方法，其中所述NPV高于80％。
在一些实施方案中，本文所述的方法的分析中的p值低于0.05、04、0.03、0.02、0.01、0.009、0.005或0.001。在一些实施方案中，所述p值低于0.001。因此，在一些实施方案中，本发明提供了用于测定诸如疾病状态、治疗响应、和/或临床响应这样的个体状态的方法，其中所述p值低于0.05、04、0.03、0.02、0.01、0.009、0.005或0.001。在一些实施方案中，所述p值低于0.001。在一些实施方案中，本发明提供了用于测定诸如疾病状态、治疗响应、和/或临床响应这样的个体状态的方法，其中所述AUC值高于0.5、0.6、07、0.8或0.9。在一些实施方案中，本发明提供了用于测定诸如疾病状态、治疗响应、和/或临床响应这样的个体状态的方法，其中所述AUC值高于0.7。在一些实施方案中，本发明提供了用于测定诸如疾病状态、治疗响应、和/或临床响应这样的个体状态的方法，其中所述AUC值高于0.8。在一些实施方案中，本发明提供了用于测定诸如疾病状态、治疗响应、和/或临床响应这样的个体状态的方法，其中所述AUC值高于0.9。
在另一个实施方案中，随一系列时间点而对细胞网络产生的激活状态数据可被用于辨识在所述细胞网络内随时间显示独特的通讯的激活状态数据。在所述细胞网络内显示独特的通讯的激活状态数据可被用于对关联于细胞群体的其他激活状态数据进行分类以测定它们是否关联于与所述细胞网络相同的特征或测定是否存在对于细胞网络是独特的特定时间阶段或状态。例如，细胞网络中的不同的分离的细胞群体可用相同的调节剂进行处理并随一系列时间点进行次级取样，以测定对所述调节剂的刺激是独特的细胞分离的群体之间的通讯。类似地，不同的分离的细胞群体的样品可来自于疗程内的患者并被用于辨识对于所述疗程是独特的分离的细胞群体之间的通讯。
在一个实施方案中，可对所述细胞群体在不同时间点的激活状态数据进行建模以显示细胞网络中该分离的细胞群体之间随时间的动力学相互作用。所述激活状态数据可使用时间模型、贝叶斯网络或一些组合进行建模。生成贝叶斯网络的适当方法在11/338,957中有所描述，出于所有目的其全文以引用的方式并入本文。生成激活状态的时间模型的适当方法在美国专利申请第61/317,817号中有所描述，以引用的方式并入本文。可生成不同的度量以描述所述动力学相互作用，其包括：导数、积分、变化率度量、仿样(splines)、激活状态数据的状态表示以及激活状态数据的布尔表示。
在生成了描述动力学相互作用的度量和其他数值的实施方案中，这些数值和度量被用于生成分类器。如上文所述，任何适当的分类算法可被用于测定对具有相同特征的细胞网络数据进行匹配辨识的度量和数值。在一些实施方案中，所述描述值和度量将根据两个独特的数据组而生成：1)关联于一种特征的激活状态数据以及2)与一种特征无关联的激活状态数据。例如：在用调节剂进行刺激后由分离的细胞群体中生成的激活状态数据和从由未刺激的分离的细胞群体生成的激活状态数据。在这些实施方案中，所述描述值和度量将被用于生成一种二元分类器。在其他实施方案中，描述值和度量将从关联于不同特征的大量活性状态数据组中生成，并且将生成多元分类器。所产生的分类器将被用于测定细胞网络是否是所述数据组的一部分。
在一些实施方案中，上述分类器被用于对来自诸如患者这样的个体的激活状态数据进行特征分析。在这些实施方案中，与一种或更多种细胞群体的细胞网络相关联的激活状态数据来自于患者。在一些实施方案中，与来自患者的不同细胞群体相关联的激活状态数据可通过获取具有不同特征的患者样品而进行辨识。在一些实施方案中，与来自患者的不同细胞群体相关联的激活状态数据可根据可激活元件的激活状态数据进行计算辨识，所述可激活元件已知能区分分离的细胞群体。对来自被不同的分离的细胞群体的用于测定所述细胞是否具有相同特征的激活状态数据进行详细说明的分类器被应用于与所述个体相关联的激活状态数据以生成分类数值，该数值明确了所述个体(或来自该个体的细胞)与所述特征相关联的可能性。在多数实施方案中，所述分类器以数值组或可执行代码的形式被存储于计算机内存或可被计算机读取的存储介质之中，并且所述分类器的应用包含了执行代码，所述代码将该分类器应用于关联于所述个体的激活状态数据。所述分类数值可对使用者输出、转移至请求所述分类数值的实体和/或存储于计算机的内存之中。所述分类数值可以是相关于或代表了所述个体的诸如诊断、预后或对治疗的预测性响应这样的生理状态的信息。
在一些实施方案中，在正常个体或者未罹患或未被怀疑罹患病状的个体中测定了多个细胞群体的激活状态数据。所述激活状态数据可被用于创建来自样品的细胞群体中所观察到的激活水平范围的统计模型(如，回归模型，方差模型)，所述样品获自正常患者。该范围和/或模型可被用于测定来自未诊断个体的样品是否表现出正常样品中所观察到的激活状态数据范围(如，正常激活水平的范围)。这可被用于创建用于正常个体的分类器。在一些实施方案中，所述模型可被用于生成相似度数值和/或概率值，所述相似度数值显示了关联于所述未诊断个体的激活状态数据与正常激活水平范围(如，相关系数、拟合度量)的相似度，所述概率值显示了所述激活状态数据偶然地与正常激活水平相似的概率(即，概率值和/或相关置信值)。在其他的实施方案中，来自正常个体的激活状态数据可被与来自已知患有疾病的患者的激活状态数据进行结合以创建二元或多元分类器。在一些实施方案中，来自未诊断个体的激活状态数据将与正常细胞内所观察到的激活状态范围一起以图形方式显示。这使得某些人们，例如医生，得以直观地获得关联于未诊断患者的激活状态数据与来自正常个体的样品中所观察到的激活状态范围之间的相似度。对获自正常患者的样品所产生的细胞群体中观察到的激活水平范围的统计模型或特征进行创建以及它们在对个体进行分类中的应用的实例在题为“Benchmarks for Normal Cell Identification”的美国临时申请中有所描述，其提交于2010年9月8日，律师档案号为134.001，出于所有目的其全文以引用的方式并入本文。
在一些实施方案中，本发明包括了用于对可能癌化的细胞进行估测的方法。所述细胞根据本文描述被用于所述方法并且与正常细胞群体进行对比。所述对比可使用本文所述的任意算法而完成。在一些实施方案中，所述激活状态数据以图像方式显示。一般情况下，当以图形显示的时候，正常细胞具有一致的群体并且紧密成组具有狭窄边界。当癌化细胞或前癌化细胞被用于与正常细胞相同的方法(如，一种或更多种调节剂进行的处理)并且以相同图形显示之时，与该图显示的标准的差异显示出更为异源化的群体。图2和实施例5中展示了一个实例。该变化是所述细胞可能癌化的迹象，其癌化的方式是变化程度的函数。形态学变化可显示了处于从轻度到具有转移性的发展中的癌化群体。如果较之正常细胞无形状变化，则所述细胞表型中可能无变化。
异源细胞群体的存在可表示需要治疗。所述治疗的结果可通过参比该图而进行监测。在图表中更具异源性的群体向更为紧密成组的群体的变化可能表示所述细胞群体正向正常状态回归。变化的缺乏可能表示所述治疗无效并且所述细胞群体是顽固的或对治疗有抗性。其还表示不同的分离的细胞群体已经变成了所述癌化表型。返回正常的变化的缺乏是对治疗的负关联指征。这些变化可能是基因水平或基因外水平(epigenetic)的。
本发明的一个实施方案是，通过分析正常细胞群体以创建可以通过图形方式与可能癌化的细胞群体进行比较的模式或数据库，从而实施本发明所述的方法。所述分析可通过多种方法进行，但一种优选的方法是使用流式细胞仪。
在所有这些实施方案中，所述激活状态数据可在中心实验室生成并且所述分类器可在所述中心实验室被应用于所述数据。或者，所述激活状态数据可通过第三方生成并且传递至中心实验室以用于分类，例如通过安全网络进行传递。传递用于分类和分析的数据的适当方法在美国专利申请第12/688,851号中有所描述，出于于所有目的其全文以引用的方式并入本文。
方法
在一些实施方案中，本发明涉及方法和组合物，以及实现对个体状态和/或包含至少两种分离的细胞群体的细胞网络状态的测定的试剂盒。本文所述的用于任意病状的方法和组合物以及试剂盒，对于所述病状可在来自个体的样品中探知所述病状、其预后、治疗进程或其他相关特征与细胞网络状态和/或多元细胞群体的激活状态数据如一种或更多种可激活元件在该群体中的激活水平之间的关联。在一些实施方案中，本发明涉及用于对疾病治疗和预测方法进行分析、药物筛选、诊断、预后的方法和组合物以及试剂盒。在一些实施方案中，本发明涉及分析实验数据的方法。在一些实施方案中，样品中的不同的分离的细胞群体的激活状态数据被用于(例如在病症的诊断和预后中，在使用某些上文所辨识出的药剂的治疗所进行的患者选择中)监测治疗、调整治疗方案和/或进一步优化治疗剂的选择，所述治疗剂以一种或治疗剂的组合进行施用。因此，根据治疗前和治疗进程中的不同时间所获得的数据治疗方案可被个体化并且进行定制，由此提供了适用于个体的方案。在一些实施方案中，化合物被与细胞接触从而分析其对所述化合物的响应。可通过在所述细胞群体的一种或更多种细胞内定量对至少一种调节剂响应的至少一种可激活元件的激活水平而产生分离的细胞群体的激活状态数据。
本发明实现了包含两个或更多分离的细胞群体的细胞网络的状态的测定。本发明的方法提供了可用于对罹患疾病的个体的治疗的工具，其包括但不限于：用于设定风险组的方法、预测复发的升高风险的方法、预测发展次级并发症的升高风险的方法、为个体选择治疗方法的方法、预测性响应持续时间、个体对治疗的响应的方法、在个体中测定疗效的方法、以及对个体测定预后的方法。细胞网络的状态可作为预后指征发挥作用以预测病状进程，如个体中的癌症或造血机能病状将是进展迅速的还是慢性的，由此而在管理患者和评测将使用的治疗方式中对临床医生进行辅助。在另一个实施方案中，本发明向医生提供了信息以在对患者的临床管理中进行辅助，从而使所述信息可被转化成为措施，包括治疗、预后或预测。
在一些实施方案中，本文所述的方法被用于筛选可用于病状治疗的候选化合物，或被用于辨识新的药物目标。
在一些实施方案中，所述个体的状态或所述细胞网络的状态可被用于确认或排除关联于疾病的升高风险的可疑基因或生理异常的存在。这样的测试方法学可取代其他的确认工艺如细胞发生分析或原位组织化学荧光(FISH)。在另一些实施方案中，所述个体的状态或所述细胞网络的状态可被用于确认或排除前病理或病理病状的诊断。
在个体具有已知的病理前或病理病状的情况下，所述个体的状态或所述细胞网络的状态可被用于预测所述个体对可行的治疗选项的响应。在一个实施方案中，受到目的为使起因于或相关于病理前或病理病状的细胞数量降低或消除的治疗的个体可被监测以估测这些细胞随时间的减少和细胞网络状态。成因性或相关性细胞的降低可与疾病症状的消失或减弱相关联或无关联，例如，取决于所述细胞网络状态。如果未发生预期的细胞数量降低和/或细胞网络状态的改善，可能需要以相同或者不同的治疗方案进行进一步治疗。
在另一个实施方案中，可对接受治疗以逆转或停止病理前病状的发展的个体进行监测以估测所述逆转速度或被停止在该病理前状态点的细胞的百分比。如果未见到预期的逆转速度或细胞未被停止在所需的病理前状态点，可以考虑使用相同或不同的治疗方案进行进一步治疗。
在一个进一步的实施方案中，可对个体的细胞进行分析以查看使用分化剂进行的治疗是否按照特异性组织谱系驱动某一细胞类型，并且以使之最终分化而随后失去增殖或更新能力。这样的治疗可被预防性地用于将与疾病相关的去分化细胞的数量保持于低水平，因而预防了明显疾病(overt disease)的发展。或者，可在再生医学中使用这样的治疗从而诱导或引导多潜能干细胞或多能干细胞分化降至所需的组织或器官特异性谱系并且因而加速或改善了康复过程。
还可监测个体的与良性预后相关的分离的细胞群体的细胞的出现或数量的提高。如果观测到有利的分离的细胞群体，可采取措施以进一步提高他们的数量，例如施用生长因子。或者，还可对个体进行监测以针对与不良预后相关的分离的细胞群体的细胞的出现或数量的提高。在这样的情况下，可以考虑进行更新性治疗，其包含继续进行、修改当前治疗或起始另一类型的治疗。
在一些实施方案中，个体状态的测定可被用于确认先前病状或治疗是否已经诱发了需要监测和/或治疗的新的病理前或病理病状。例如，对多种形式癌症(如淋巴瘤和幼儿白血病)的治疗可诱发特定的成人白血病，并且本发明的方法实现了对这样的白血病的早期检测和治疗。
本发明提供了用于测定诸如个体疾病状态这样的特征的方法，其通过分析所述个体中的不同的分离的细胞群体而进行。在一些实施方案中，个体的疾病状态通过包括以下的方法而进行测定：使用至少第一调节剂接触来自所述个体的分离的第一细胞群体的第一细胞、使用至少第二调节剂接触来自所述个体的分离的第二细胞群体的第二细胞、在所述第一细胞和所述第二细胞内测定至少一种可激活元件的激活水平、为所述个体创建包含所述可激活元件的所述被测定的激活水平的响应表单、以及根据所述个体的疾病状态而做出决策，其中所述决策基于所述响应表单。
在一些实施方案中，根据本文的描述可从所述个体获取一种或更多种包含不同的分离的细胞群体的样品并且使其接触调节剂。在一些实施方案中，所述样品可被分成分样，其各自接触不同的调节剂。在以所述调节剂进行处理之后，对所述样品或分样中的不同的分离的细胞群体进行分析以测定它们的激活状态。在一些实施方案中，对所述不同的分离的细胞群体中的单细胞进行了分析。可使用实现对激活水平的测定的任意适当形式的分析。在一些实施方案中，所述分析包括对诸如蛋白质这样的细胞内元件的激活水平的测定。在一些实施方案中，所述分析包括对可激活元件的激活水平的测定，例如细胞内可激活元件如蛋白质，例如磷酸蛋白。根据本文所述，所述激活水平的测定的完成可通过使用激活状态特异性结合元件，例如抗体。可在一种或更多种所述不同的分离的细胞群体中检测多个可激活元件。
在一些实施方案中，本发明提供了用于测定个体的细胞网络状态的方法，其通过分析所述个体中的不同的分离的细胞群体而进行。不同的分离的细胞群体的分析实现了在参与细胞网络的不同的分离的细胞群体中测定方向性(如，向量)。所述不同的分离的细胞群体的分析可通过在该不同的分离的细胞群体中测定至少一种可激活元件响应于调节剂的激活水平而实施。在一些实施方案中，所述不同的分离的细胞群体的分析通过将各个分离的细胞群体分解成为多元样品并且在该样品中测定至少一种可激活元件响应于调节剂的激活水平而实施。
在一些实施方案中，本发明针涉及通过对来自所述个体的多个不同的分离的细胞群体使用调节剂而测定病状在个体中存在与否的方法，在所述多个分离的细胞群体中测定可激活元件的激活水平的方法，以及根据使用调节剂进行的治疗下的激活水平而测定所述病状的存在与否的方法。在一些实施方案中，各个分离的细胞群体在分开的培养物中接触不同的调节剂。在一些实施方案中，各个分离的细胞群体在同一培养物或分开的培养物中接触相同的调节剂。本文所述的与调节剂相关的术语“相同的调节剂”包括所述调节剂的活性片段或部分、与该调节剂结合相同目标的调节剂和/或与该调节剂调控相同信号传导途径的调节剂。例如，当根据本文所述用调节剂处理分离的细胞群体时，用所述相同的调节剂进行处理的另一种分离的细胞群体的处理可使用所述的活性片段或部分、与该调节剂结合相同目标的调节剂和/或与该调节剂调控相同信号传导途径的调节剂而进行。在一些实施方案中，一些分离的细胞群体在同一或分开的培养物中接触所述相同的调节剂，而其他分离的细胞群体接触不同的调节剂。在一些实施方案中，分离的细胞群体的接触在所述第一细胞与所述第二细胞从所述个体中分离之前进行，例如，当诸如化学品这样的所述调节剂是处于所述个体体内的细胞环境之中的时候进行。因此，在一些实施方案中，所述调节剂存在于所述个体体内并且所述分离的细胞群体在该个体体内的细胞环境中接触所述调节剂。
在一些实施方案中，细胞网络状态的测定包括对特异地相关于自体免疫疾病的病理发生的免疫细胞的激活状态的监测和测定。特定免疫细胞可在其处于体外或体内的治疗压力之下的时候随时间进行监测以提供指导患者管理的信息。
在一些实施方案中，本发明提供了用于测定诸如疾病状态、治疗响应、和/或临床响应这样的个体状态的方法，其中所述阳性预测值(PPV)高于60、70、80、90、95或99.9％。在一些实施方案中，本发明提供了用于测定诸如疾病状态、治疗响应、和/或临床响应这样的个体状态的方法，其中所述PPV等于或高于95％。在一些实施方案中，本发明提供了测定诸如疾病状态、治疗响应、和/或临床响应这样的个体状态的方法，其中所述阴性预测值(NPV)高于60、70、80、90、95或99.9％。在一些实施方案中，本发明提供了用于测定诸如疾病状态、治疗响应、和/或临床响应这样的个体状态的方法，其中所述NPV高于85％。
在一些实施方案中，本文所述的方法的分析中的p值低于0.05、04、0.03、0.02、0.01、0.009、0.005或0.001。在一些实施方案中，本发明提供了用于测定诸如疾病状态、治疗响应、和/或临床响应这样的个体状态的方法，其中所述AUC值高于0.5、0.6、07、0.8或0.9。
在一些实施方案中，分离的细胞群体是细胞的群体，其中每一个细胞具有相同或基本相同的细胞外标记物组或细胞外标记物范围，其被用于辨识该分离的细胞群体。所述的细胞外标记物组可以是一种细胞外标记物。例如，“干细胞群体”的特征在于CD34+CD38-或CD34+CD33-表达细胞，记忆CD4T淋巴细胞的特征在于CD4+CD45RA+CD29低细胞，并且多白血病亚克隆可根据CD33、CD45、HLA-DR、CD11b进行辨识。除细胞外标记物之外，诸如蛋白质这样的细胞内生物分子的表达水平可被单独使用或与所述细胞外标记物组合使用以辨识细胞群体。另外，另外的细胞元件，如生物分子或分子复合物，如RNA、DNA、碳水化合物、代谢物等等，可与细胞外标记物和/或在辨识本文所包含的细胞群体中的表达水平组合使用。
在一些实施方案中，影响细胞组成的状态的生物过程可被用于辨识细胞群体。实例包括生物分子的转位或其周转数的变化以及生物分子复合物的形成和解离。这样的复合物可包括，多蛋白质复合物、多脂质复合物、同二聚物或异二聚物或寡聚物，及其组合。其他的特征包括蛋白酶解切割，如将细胞暴露于细胞外蛋白酶或生物分子的细胞内蛋白酶解切割。
另外，分离的细胞群体可被进一步分解成为亚群体，其本身是根据其他因素的分离的细胞群体，如细胞外或细胞内标记物的表达水平、核抗原、酶学活性、蛋白质表达和定位、细胞周期分析、染色体分析、细胞容积和形态学特征如颗粒性以及细胞核大小或其他区别特征。例如，如果B细胞是一种预定义类别，则它们可根据诸如CD19、CD20或CD22这样的细胞表面标记物的表达进行进一步细分。
另外，分离的细胞群体可根据共有的特征而被汇总，所述共有特征可包含在一种或更多种另外的分离的细胞群体内的内含物或存在细胞外或细胞内标记物、类似的基因表达特征、核抗原、酶学活性、蛋白质表达和定位、细胞周期分析、染色体分析、细胞容积和形态学特征如颗粒性以及细胞核大小或其他区别特征。
分离的细胞亚群体的缺乏本身就是激活状态数据，其可用于了解分离的细胞群体的病理生理。例如，当需要测定分离的细胞群体总数中属于某一特定亚细胞群体的百分比时，其是有用的。
所述分离的细胞群体可根据来自于个体的经验特征进行辨识，所述经验特征显示了个体的状态，如健康状态。例如，来自临床和/或来自临床试验的血液样品可被反向分析以辨识细胞分离的群体；特定群体的激活状态数据或所述细胞群体的定量特征可被关联于所述患者的确定的已知结果。
例如，可随治疗进程从癌症患者获取血液样品。可记录多种不同的结果，从多年的病情完全好转直至死于癌症或治疗后癌症复发。在使用或未使用调节剂的情况下，可从回溯性样品中获得多个分离的细胞群体中的可激活元件的状态特征以测定所述样品中存在的分离的细胞群体、各个分离的细胞群体中的激活状态数据、各个分离的细胞群体中的细胞数量、不同的分离的细胞群体和/或亚群体中的细胞相对数量或比例等等。这些分离的细胞群体与其对于多种健康状态的预测值可一同被置于用于对其他样品进行分析的数据库中。随着获得更多的样品以及测定所关联的健康状态，所述数据库可被调整。
在一些实施方案中，所述不同的分离的细胞群体是造血细胞群体。造血细胞群体的实例包括但不限于，多潜能造血干细胞、B淋巴细胞系祖细胞或衍生细胞、T淋巴细胞系祖细胞或衍生细胞、NK细胞系祖细胞或衍生细胞、粒细胞系祖细胞或衍生细胞、单核细胞系祖细胞或衍生细胞、巨核细胞系祖细胞或衍生细胞以及红细胞系祖细胞或衍生细胞。因此，例如，在一些实施方案中，通过分析分离的B淋巴细胞衍生的细胞群体和分离的T淋巴细胞衍生的细胞群体中的可激活元件响应于调节剂的激活水平而测定了个体的状态，其中用于所述不同的分离的细胞群体的调节剂可以是相同的或不同的。
在一些实施方案中，所述不同的分离的细胞群体是分离的细胞群体的亚群体。例如，在所述分离的细胞群体是造血细胞群体的一些实施方案中，通过分析分离的初始B淋巴细胞的细胞群体和分离的记忆B淋巴细胞的细胞群体中的可激活元件响应于调节剂的激活水平而测定了个体的状态，其中用于所述不同的分离的细胞群体的调节剂可以是相同的或不同的。在另一个实例中，在一些实施方案中，通过分析CD4+T淋巴细胞群体和CD8+T淋巴细胞衍生的群体中的可激活元件响应于调节剂的激活水平而测定了个体的状态，其中用于所述不同的分离的细胞群体的调节剂可以是相同的或不同的。
在一些实施方案中，通过创建响应表单而测定个体状态或细胞网络状态，所述响应表单通过对不同的分离的细胞群体中的响应于一种或更多种调节剂的一种或更多种可激活元件进行分析而创建。在一些实施方案中，通过将不同的分离的细胞群体各自接触于至少一种调节剂并且对所述分离的细胞群体中的至少一种可激活元件的激活水平进行测定而创建响应表单。在一些实施方案中，通过将不同的分离的细胞群体分为多个样品并将所述样品接触于至少一种调节剂并且对所述样品中的至少一种可激活元件的激活水平进行测定而创建响应表单。在一些实施方案中，各个分离的细胞群体在分开的培养物中接触不同的调节剂。在一些实施方案中，各个分离的细胞群体在同一培养物或分开的培养物中接触相同的调节剂。在一些实施方案中，一些分离的细胞群体在同一或分开的培养物中接触所述相同的调节剂，而其他细胞群体接触不同的调节剂。例如，如果被分析的不同的分离的群体是初始CD4T细胞、记忆CD4T细胞、初始CD8T细胞和记忆CD8T细胞，初始CD4和记忆CD4细胞可在同一培养物中接触相同的第一调节剂，而初始CD8T细胞和记忆CD8T细胞可在分开的培养物中分别接触第二种和第三种调节剂。可针对相同可激活元件或不同可激活元件对所述不同的分离的细胞群体进行分析。所述分离的细胞群体可同时或依次进行分析。
在一些实施方案中，在各个分离的细胞群体中进行分析的可激活元件是不同的。在一些实施方案中，在各个分离的细胞群体中进行分析的可激活元件是相同的。在一些实施方案中，在所述分离的细胞群体中对多种可激活元件进行了分析，其中在所述不同的分离的细胞群体中所述可激活元件可以是相同或不同的。在一些实施方案中，在各个细胞群体中进行分析的可激活元件的数量是不同的。例如，在一些实施方案中，在一种细胞群体中仅仅对一种可激活元件进行分析，而在其他细胞群体中对多种(如，两种或更多种)可激活元件进行分析。当在分离的细胞群体中分析多种可激活元件的时候，所述可激活元件可依次进行分析或同时进行分析。
在一些实施方案中，本发明的方法提供了用于生成不同的分离的细胞群体的激活状态数据的方法，其通过在分开的培养物中将各个分离的细胞群体接触多种调节剂(本文所详述的)，对来自各个分开的培养物的分离的细胞群体中可激活元件的激活水平的提高存在与否进行测定以及根据各个分开的培养物的分离的细胞群体中可激活元件的激活水平的提高存在与否对所述分离的细胞群体进行分类来实现。在一些实施方案中，激活状态数据被用于在每个所述细胞群体中对多个途径进行特征研究。所述不同细胞群体的激活状态数据可被用于测定个体状态或细胞网络状态。
个体或细胞网络状态可被用于选择治疗方法。治疗方法包括但不限于，化疗、生物疗法、放疗、骨髓移植、外周血干细胞移植、脐带血移植、自体干细胞移植、异源干细胞移植、同源干细胞移植、手术、诱导治疗、维持治疗、观察等待以及其他疗法。
除可激活元件的激活水平之外，生物分子如蛋白质的细胞内或细胞外表达水平可单独使用或结合可激活元件的激活状态进行使用以测定个体或细胞网络状态。另外，其他的细胞元件，如生物分子或分子复合物，如RNA、DNA、碳水化合物、代谢物等等，可结合可激活状态或表达水平而被用于分析本文所包含的不同的分离的细胞群体。在一些实施方案中，也可在不同的分离的细胞群体中测量表达标记物。在一些实施方案中，本文所述的方法中还可使用表达标记物或药物转运体，如CD34、CD33、CD45、HLADR、CD11B FLT3配体、c-KIT、ABCG2、MDR1、BCRP、MRP1、LRP和下文指出的其他分子。表达标记物可使用多种不同工艺进行检测，例如使用来自流式细胞仪的数据的节点。其他常用工艺使用了表达阵列(由Affymetrix，Santa Clara CA市售)、taqman(由ABI，Foster City CA市售)、SAGE(由Genzyme，Cambridge MA市售)、测序工艺(参见来自Helicos、454、US Genomics以及ABI的商业产品)和其他常见已知分析。参见Golub等人，Science 286：531-537(1999年)。在一些实施方案中，所述表达标记物包括基于表位的标记物、RNA、mRNA、siRNA或代谢标记物。
在一些实施方案中，本发明提供了方法以实施多参量流式细胞仪技术用以在不同的分离的细胞群体中监测磷酸蛋白对多种因素的响应。在细胞中起始和调控增殖信号需要信号传导级联中的磷酸蛋白成员以及与其相互作用的激酶和磷酸酶。流式细胞仪技术在临床中是有用的，因为相对较小的样品大小，少至10,000个细胞，可产生数量可观的统计上可追踪的多维信号传导数据。(参见美国专利第7,381,535号和第7,393,656号。亦可参见Krutzik等人，2004年)。
在对个体的诸如预后或疾病状态这样的特征进行测定中可考虑其他要素。可使用为本文所述的不同的分离的细胞群体的分析提供额外的预测或诊断能力的任意要素。这些要素在本领域是众所周知的。这些要素包括个体的性别；种族；当前年龄；疾病出现时的年龄；疾病的临床阶段；基因信息(genetic result)，先前治疗数量；先前治疗类型；对先前治疗的响应；距上次治疗的时间；血细胞计数；骨髓储量；以及机能状态(performance status)、患者过去医疗史、家族病史、患者社交史以及术语为“系统回顾”的任何当前有效医疗史，以及体检的发现。其他的要素对被评估的具体病状更具特异性，例如作为确定某种白血病的指征的骨髓中胚细胞(blast)百分比。对于特定疾病和病状这些要素在本领域中是众所周知的。可与本文所述的方法共同实施的测试的实例包括但不限于，免疫表型测定、形态学、传统细胞遗传学、分子细胞遗传学、分子遗传学和HLA分型。
调节剂
在一些实施方案中，所述方法和组合物使用了调节剂。调节剂可以是激活剂、治疗化合物、抑制剂或能够影响细胞途径的化合物。调节剂还可以采取环境信号和输入的形式。调节剂可以未经特征分析或经特征分析为已知化合物。调节剂可以是来自个体的生物标本或者细胞或生理环境样品，其可为未经完整化学或生物特征分析的异源样品。调节剂标本的收集可直接在所述个体上直接进行，或被间接获取。一个示例性的实例是从所述个体取出细胞样品并随后对该样品进行培养以获得调节剂。调节剂可存在于所述个体体内，如所述个体体内的生理环境的一种化学品。
调控可在多种环境下实施。在一些实施方案中，在进行收集之后，包含分离的细胞群体的细胞被立即暴露于调节剂。在存在细胞混合群体的一些实施方案中，在进行调控之后进行了细胞的纯化。在一些实施方案中，对添加了调节剂的全血进行了收集。在一些实施方案中，在对单细胞或单细胞的纯化组分进行加工处理后对细胞进行调控。作为一个示例性的实例，对全血进行了收集并且针对淋巴细胞的富集组分进行加工处理，该组分随后被暴露于调节剂。调控还包括将细胞暴露于超过一种调节剂。例如，在一些实施方案中，包含分离的细胞群体的细胞被暴露于至少2、3、4、5、6、7、8、9、或10种调节剂。参见美国专利申请第61/048,657号，其以引用的方式并入本文。在一些实施方案中，分离的细胞群体在其还在所述个体体内的时候被暴露于调节剂。例如，所述个体被暴露于存在于生理环境中的化学品，并且因此分离的细胞群体被暴露于该化学品。
在一些实施方案中，进行收集后包含分离的细胞群体的细胞在暴露于调节剂之前被培养于适当的培养基中。在一些实施方案中所述培养基是生长培养基。在一些实施方案中，所述生长培养基是复合培养基，其可包含血清。在一些实施方案中，所述生长培养基包含血清。在一些实施方案中，所述血清选自胎牛血清、牛血清、人血清、猪血清、马血清和山羊血清。在一些实施方案中，所述血清水平介于0.0001％与30％之间。在一些实施方案中，所述生长培养基是经化学定义的培养基，其不含血清。在一些实施方案中，细胞被培养于分化培养基。
调节剂包括化学和生物学实体，以及物理或环境刺激物。调节剂可在细胞外或细胞内作用。化学和生物学调节剂包括生长因子、细胞因子、药物、免疫调节剂、离子、神经递质、粘附分子、激素、小分子、无机化合物、多核苷酸、抗体、天然化合物、血凝素、内酯、化疗剂、生物响应调节物、碳水化合物、蛋白酶和自由基。调节剂包括复合物和未限定的生物组合物，其可包含细胞或植物提取物、细胞或腺体分泌物、生理液体如血清、羊水或毒液。物理或环境刺激物包括电磁、紫外、红外、或微粒辐射、氧化还原电位以及pH、营养物的存在与否、温度变化、氧分压变化、离子浓度变化和氧化应激的使用。调节剂可以是内源性或外源性的并且根据对所述单细胞的暴露浓度和持续时间或是否与其他调节剂结合使用或依次使用而可产生不同效果。调节剂可直接作用于所述可激活元件或通过与一种或更多种中介生物分子的相互作用而间接作用。间接调控包括基因表达的改造，其中该被表达的基因产物是可激活元件或是所述可激活元件的调节剂。
在一些实施方案中所述调节剂选自生长因子、细胞因子、粘附分子、药物、激素、小分子、多核苷酸、抗体、天然化合物、内酯、化疗剂、免疫调节剂、碳水化合物、蛋白酶、离子、活性氧物质、肽和蛋白质片段，其可单独存在或存在于细胞内容物、细胞自身、病毒以及生物和非生物复合物中(如，珠粒、平板、病毒包膜、抗原呈递分子如主要组织相容性复合物)。在一些实施方案中，所述调节剂是物理刺激物如热、冷、UV照射和辐射。调节剂的实例包括但不限于，SDF-1α、IFN-α、IFN-γ、IL-10、IL-6、IL-27、G-CSF、FLT-3L、IGF-1、M-CSF、SCF、PMA、毒胡萝卜内酯、H2O2、依托泊苷、AraC、柔红霉素、十字孢碱、苄氧羰基-缬氨酰-丙氨酰-天冬氨酰氟甲基酮(ZVAD)、来那度胺、EPO、阿扎胞苷、地西他滨、IL-3、IL-4、GM-CSF、EPO、LPS、TNF-α以及CD40L。
在一些实施方案中，所述调节剂是激活剂。在一些实施方案中，所述调节剂是抑制剂。在一些实施方案中，细胞被暴露于一种或更多种调节剂。在一些实施方案中，包含分离的细胞群体的细胞被暴露于至少2、3、4、5、6、7、8、9、或10种调节剂。在一些实施方案中，包含分离的细胞群体的细胞被暴露于至少两种调节剂，其中一种调节剂是激活剂并且一种调节剂是抑制剂。在一些实施方案中，包含分离的细胞群体的细胞被暴露于至少2、3、4、5、6、7、8、9、或10种调节剂，其中至少一种所述调节剂是抑制剂。在一些实施方案中，所述不同的分离的细胞群体被暴露于相同调节剂。在一些实施方案中，所述不同的分离的细胞群体被暴露于不同调节剂。例如，在一些实施方案中，所述不同细胞群体被暴露于一种或更多种调节剂，其中该不同的分离的细胞群体间的一种或更多种调节剂是相同的。在其他的实施方案中，所述不同细胞群体被暴露于一种或更多种调节剂，其中该不同的分离的细胞群体间的一种或更多种调节剂是不同的。
在一些实施方案中，所述交联剂是分子结合实体。在一些实施方案中，所述分子结合实体是单价、二价或多价，其通过连接于固体表面或固定于纳米颗粒表面以增加该表位结合结构域的局部价态从而被制备成更高价。
在一些实施方案中，所述抑制剂是一种细胞因子或多种细胞因子的抑制剂，其在该细胞中参与细胞途径(如，信号传导级联)。在一些实施方案中，所述抑制剂是磷酸酶抑制剂。磷酸酶抑制剂的实例包括但不限于H2O2、siRNA、miRNA、斑蝥素、(-)-p-对溴四咪唑、微囊藻毒素LR、正钒酸钠、过矾酸钠、硫酸氧钒、二环过氧化(1，10-菲罗啉)钒酸钠、双(麦芽醇)氧钒(IV)、钼酸钠、Sodium Perm olybdate、酒石酸钠、咪唑、氟化钠、β-甘油磷酸、十水合焦磷酸钠、花萼海绵体诱癌素A、Discodermia calyx、bpV(phen)、mpV(pic)、DMHV、氯氰菊酯、Dephostatin、冈田酸、NIPP-1、N-(9，10-二氧-9，10-二氢-菲-2-基)-2，2-二甲基-丙酸酯、α-溴-4-羟基苯乙酮、4-羟基苯乙酰溴、α-溴-4-甲氧基苯乙酮、4-甲氧基苯乙酰溴、α-溴-4-(羧甲氧基)苯乙酮、4-(羧甲氧基)苯乙酰溴以及双(4-三氟甲基磺酰胺基苯基)-1，4-二异丙苯、氧化苯胂、二硫代氨基甲酸吡咯烷和氟化铝。在一些实施方案中，所述磷酸酶抑制剂是H2O2。
在一些实施方案中，分离的细胞群体中的可激活元件的激活水平通过将所述分离的细胞群体接触至少2、3、4、5、6、7、8、9、或10种调节剂而进行测定。在一些实施方案中，分离的细胞群体中的可激活元件的激活水平通过将所述分离的细胞群体接触至少2、3、4、5、6、7、8、9、或10种调节剂而进行测定，其中至少一种调节剂是抑制剂。在一些实施方案中，分离的细胞群体中的可激活元件的激活水平通过将所述分离的细胞群体接触抑制剂和调节剂而进行测定，其中所述调节剂可以是抑制剂或激活剂。在一些实施方案中，分离的细胞群体中的可激活元件的激活水平通过将所述分离的细胞群体接触抑制剂和激活剂而进行测定。在一些实施方案中，分离的细胞群体中的可激活元件的激活水平通过将所述分离的细胞群体接触两种或更多种调节剂而进行测定。在一些实施方案中，在不同的分离的细胞群体中测定了相同可激活元件的激活水平。在一些实施方案中，在不同的分离的细胞群体中测定了不同的可激活元件的激活水平。例如，在一些实施方案中，当不同的分离的细胞群体被暴露于一种或更多种调节剂的时候在所述不同的分离的细胞群体中测定了相同可激活元件的激活水平，其中所述不同的分离的细胞群体之间的所述一种或更多种调节剂是相同的。在一些实施方案中，当不同的分离的细胞群体被暴露于一种或更多种调节剂的时候在所述不同的分离的细胞群体中测定了相同可激活元件的激活水平，其中所述不同的分离的细胞群体之间的所述一种或更多种调节剂是不同的。在一些实施方案中，当不同的分离的细胞群体被暴露于一种或更多种调节剂的时候在所述不同的分离的细胞群体中测定了不同可激活元件的激活水平，其中所述不同的分离的细胞群体之间的所述一种或更多种调节剂是相同的。在一些实施方案中，当不同的分离的细胞群体被暴露于一种或更多种调节剂的时候在所述不同的分离的细胞群体中测定了不同可激活元件的激活水平，其中所述不同的分离的细胞群体之间的所述一种或更多种调节剂是不同的。
在一些实施方案中，当细胞群体被暴露于一种或更多种调节剂的时候通过测量可激活元件的激活水平而测定了分离的细胞群体的激活状态。细胞群体可被分成多个样品，并且在所述样品被暴露于一种或更多种调节剂之后通过测量该样品中的至少一种可激活元件测激活水平而测定所述分离的细胞群体的激活状态。在一些实施方案中，当各个细胞群体被暴露于调节剂的时候。通过在各个细胞群体中测量可激活元件的激活水平而测定了所述不同的分离的细胞群体的激活状态。所述不同细胞群体可被暴露于相同或不同的调节剂。在一些实施方案中，所述调节剂包括H2O2、PMA、SDF1α、CD40L、IGF-1、IL-7、IL-6、IL-10、IL-27、IL-4、IL-2、IL-3、毒胡萝卜内酯和/或其组合。例如，细胞群体可被暴露于下列调节剂组合的一种或更多种、全部或组合：H2O2、PMA、SDF1α、CD40L、IGF-1、IL-7、IL-6、IL-10、IL-27、IL-4、IL-2、IL-3、毒胡萝卜内酯。在一些实施方案中，根据本文所述不同的分离的细胞群体的生理状态被用于测定个体状态。
可激活元件
本发明的方法和组合物可被用于对细胞途径中的任意可激活元件的状态进行检测和特征化。单个或多个不同的途径可被特征化(依次地或同时地)，或者单个途径中或覆盖多个途径的可激活元件的亚组可被检测(亦为依次地或同时地)。
单个可激活元件的激活状态是处于或开启开或关闭的状态。作为示例性的实例，并且不期望受任何理论的限制，蛋白质中单可磷酸化位点应或者被磷酸化而处于“开启”状态，或者不被磷酸化而因此处于“关闭”状态。参见Blume-Jensen和Hunter，Nature，第411卷，2001年5月17日，355-365页。当用于属于细胞组成的一部分的可激活元件之时，术语“开启”和“关闭”在此被用于描述所述可激活元件的状态(如，被磷酸化是“开启”并且非磷酸化是“关闭”)，并非其所属于的细胞组成的整体状态。一般地，细胞具有含特定可激活元件的多种特定蛋白质或其他组成，并且该多种蛋白质或组成通常具有个体可激活元件处于开启状态的某些蛋白质或组成，以及个体可激活元件处于关闭状态的其他蛋白质或组成。由于各个可激活元件的激活状态一般通过使用识别特定激活状态的结合元件进行测量，仅仅被所述结合元件所识别的处于该特定激活状态的可激活元件将被所述结合元件所结合以产生可测量信号，所述被识别的可激活元件代表了可激活元件总数的某一部分。对应于单细胞中被激活的特定类型个体可激活元件总数的可测量信号是该细胞中的该可激活元件的“激活水平”。
特定可激活元件的激活水平可在个体细胞中有所变化，从而使在对多个细胞进行分析时所述激活水平遵循某种分布。所述分布可以是正态分布，亦称高斯分布，或其可以是另一类型的分布。不同的细胞群体可具有不同的激活水平分布，该分布可在区分所述群体中发挥作用。
在一些实施方案中，在细胞中测定一种或更多种可激活元件的激活水平的基础可以利用在不同表型中有所不同的一种或更多种特定可激活元件的激活水平的分布。见于细胞或细胞群体的一种或更多种可激活元件的确定的激活水平，或者更为典型的情况下为激活水平的范围，是该细胞或细胞群体属于某一独特表型的指征。除可激活元件的激活水平之外，其他的测量方法，诸如不包含可激活元件的生物分子的细胞水平(如表达水平)，也可被用于测定细胞的激活水平数据，应当了解这些水平也遵循某种分布，类似于可激活元件。因此，分离的细胞群体中的一种或更多种细胞的一种或更多种可激活元件的激活水平或水平，可选地结合不包含可激活元件的生物分子的一种或更多种水平，可被用于测定所述分离的细胞群体的激活水平数据。
在一些实施方案中，测定分离的细胞群体的激活状态数据的基础可利用细胞在等高线或密度图中的位置。所述等高线或密度图代表了共有某些特征的细胞数量，所述特征的例子如可激活蛋白质响应于调节剂的激活水平。例如，当涉及可激活元件响应于一种或更多种调节剂的激活水平的时候，正常个体和患有病状的患者可显示出具有响应于所述一种或更多种调节剂的升高激活水平的群体。然而，具有特定激活水平(如，特定量的可激活元件)的细胞的数量在正常个体与患有病状的个体间可能是不同的。因此，细胞的激活状态数据可根据其在所述等高线或密度图的给定区域中的位置而进行测定。
除可激活元件的激活水平之外，生物分子如蛋白质的细胞内或细胞外表达水平可单独使用或结合可激活元件的激活状态进行使用以测定细胞群体的激活状态数据。另外，其他的细胞元件，如生物分子或分子复合物，如RNA、DNA、碳水化合物、代谢物等等，可结合可激活状态或表达水平或激活状态和表达水平的任意组合而被用于测定本文所包含的细胞群体的生理状态。
在一些实施方案中，影响细胞组成的状态的其他特征可被用于测定分离的细胞群体的激活状态数据。实例包括生物分子的转位或其周转数的变化以及生物分子复合物的形成和解离。这样的复合物可包括，多蛋白质复合物、多脂质复合物、同二聚物或异二聚物或寡聚物，及其组合。其他的特征包括蛋白酶解切割，如将细胞暴露于细胞外蛋白酶或生物分子的细胞内蛋白酶解切割。
另外的元件也可被用于测定分离的细胞群体的激活状态数据，例如，细胞外或细胞内标记物的表达水平、核抗原、酶学活性、蛋白质表达和定位、细胞周期分析、染色体分析、细胞容积和形态学特征如颗粒性以及细胞核大小或其他区别特征。例如，可根据诸如CD14、CD15或CD33、CD34以及CD45细胞表面标记物的表达对髓系细胞进一步细分。
另外，细胞群体可根据相同的特征而被汇总，所述相同特征可包含在一种或更多种另外的细胞群体内的内含物或存在细胞外或细胞内标记物、类似的基因表达特征、核抗原、酶学活性、蛋白质表达和定位、细胞周期分析、染色体分析、细胞容积和形态学特征如颗粒性以及细胞核大小或其他区别特征。
在一些实施方案中，通过对细胞途径中的一种或更多种可激活元件的激活水平进行检测和特征化而测定一种或更多种细胞的激活状态数据。在一些实施方案中，来自分离的第一细胞群体的细胞的一种或更多种可激活元件的激活水平与来自分离的第二细胞群体的细胞的一种或更多种可激活元件的激活水平与病状相关联。在一些实施方案中，所述第一种分离的细胞群体和第二种分离的细胞群体是造血细胞群体。在一些实施方案中，根据本文所述来自分离的第一造血细胞细胞群体的细胞的一种或更多种可激活元件的激活水平与来自分离的第二造血细胞细胞群体的细胞的一种或更多种可激活元件的激活水平与成瘤的、自体免疫的或造血机能的病状相关联。不同的分离的造血细胞群体的实例包括但不限于，多潜能造血干细胞、B淋巴细胞系祖细胞或衍生细胞、T淋巴细胞系祖细胞或衍生细胞、NK细胞系祖细胞或衍生细胞、粒细胞系祖细胞或衍生细胞、单核细胞系祖细胞或衍生细胞、巨核细胞系祖细胞或衍生细胞以及红细胞系祖细胞或衍生细胞。
在一些实施方案中，测定了该样品中的单细胞内的一种或更多种可激活元件的激活水平。可能包含可激活元件的细胞组成包括但不限于蛋白质、碳水化合物、脂质、核酸和代谢物。所述可激活元件可能是所述细胞组成的一部分，例如蛋白质中的可经过磷酸化的氨基酸残基，或者其可能是所述细胞组成自身，例如通过转位、构象变化(由于，如pH或离子浓度变化)、蛋白酶解切割等被激活的蛋白质。被激活后，所述激活元件发生了变化，例如可激活元件的共价修饰(如分子或基团对该可激活元件的结合，例如磷酸化)或构象变化。这样的变化一般归因于包含所述可激活元件的细胞组成的特定生物、生化或物理特性的变化。包含所述可激活元件的细胞组成的状态通过该细胞组成的特定可激活元件的状态而在一定程度上被测定，尽管不一定被完全地测定。例如，蛋白质可具有多个可激活元件，并且这些元件的特定激活状态可总体地决定该蛋白质的激活状态；单一可激活元件的状态不一定是决定性的。另外的因素也可影响所述细胞组成的状态，如其他蛋白质的结合、pH、离子浓度、与其他细胞组成的相互作用等。
在一些实施方案中，测定了单细胞中的多元细胞内可激活元件的激活水平。本文使用的术语“多元”指的是两种或更多种。在一些实施方案中，至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10或多于10种细胞内可激活元件被测定。
可激活元件的激活状态可由生物分子的化学加成或修饰而造成并导致，且包括生化加工过程，诸如糖基化、磷酸化、乙酰化、甲基化、生物素化、谷氨酰化、甘氨酰化、羟基化、异构化、异戊烯化、豆蔻酰化、脂化、磷酸泛酰巯基乙胺基化、硫酸化、ISG化、亚硝基化、棕榈酰化、SUMO化、泛素化、类泛素化、瓜氨酸化、酰胺化以及二硫键形成、二硫键还原。生物分子的其他可能的化学加成或修饰包括蛋白质羰基的形成，蛋白质侧链的直接修饰如o-酪氨酸、氯代、硝基酪氨酸以及二酪氨酸，以及通过与碳水化合物和脂质衍生物之间的反应而产生的蛋白质加成物。其他修饰可以是非共价的，例如配体的结合或变构调节剂的结合。
在一些实施方案中，所述可激活元件是蛋白质。可包含可激活元件的蛋白质的实例包括但不限于，激酶、磷酸酶、脂质信号传导分子、接头/骨架蛋白、细胞因子、细胞因子调节物、泛素化酶、粘附分子、细胞骨架/收缩蛋白、G蛋白异三聚体、小分子量GTP酶、鸟嘌呤核苷酸交换因子、GTP酶激活蛋白、胱天蛋白酶、参与凋亡的蛋白质、细胞周期调控蛋白、分子伴侣、代谢酶、膜泡运输蛋白、羟化酶、异构酶、去乙酰酶、甲基化酶、去甲基化酶、肿瘤抑制子基因、蛋白酶、离子通道、分子转运体、转录因子/DNA结合因子、转录调控剂以及翻译调控剂。可激活元件、激活状态和测定可激活元件的激活水平的方法的实例在题为“Methods and compositions for detecting the activation state ofmultiple proteins in single cells”的美国公开号第20060073474号以及题为“Methods and compositions for risk stratification”的美国公开号第20050112700号中有所描述，其内容以引用的方式并入本文。同样参见U.S.S.第61/048,886号、第61/048,920号以及Shulz等人，Current Protocolsin Immunology 2007年，7：8.17 1-20页。
在一些实施方案中，可被激活的蛋白质选自，HER受体、PDGF受体、FLT3受体、Kit受体、FGF受体、Eph受体、Trk受体、IGF受体、胰岛素受体、Met受体、Ret、VEGF受体、促红细胞生成素受体、血小板生成素受体、CD114、CD116、TIE1、TIE2、FAK、Jak1、Jak2、Jak3、Tyk2、Src、Lyn、Fyn、Lck、Fgr、Yes、Csk、Abl、Btk、ZAP70、Syk、IRAK、cRaf、ARaf、BRAF、Mos、Lim激酶、ILK、Tpl、ALK、TGFβ受体、BMP受体、MEKK、ASK、MLK、DLK、PAK、Mek 1、Mek 2、MKK3/6、MKK4/7、ASK1、Cot、NIK、Bub、Myt 1、Weel、酪蛋白激酶、PDK1、SGK1、SGK2、SGK3、Akt1、Akt2、Akt3、p90Rsk、p70S6激酶、Prks、PKC、PKA、ROCK 1、ROCK 2、极光激酶、CaMK、MNK、AMPK、MELK、MARK、Chk1、Chk2、LKB-1、MAPKAPK、Pim1、Pim2、Pim3、IKK、Cdk、Jnk、Erk、IKK、GSK3α、GSK3β、Cdk、CLK、PKR、PI3-激酶1型、2型、3型、mTor、SAPK/JNK1，2，3、p38、PKR、DNA-PK、ATM、ATR、受体蛋白酪氨酸磷酸酶(RPTP)、LAR磷酸酶、CD45、非受体蛋白酪氨酸磷酸酶(NPRTP)、SHP、MAP激酶磷酸酶(MKP)、双特异性磷酸酶(DUSP)、CDC25磷酸酶、低分子量酪氨酸磷酸酶、眼缺陷蛋白(EYA)酪氨酸磷酸酶、Slingshot磷酸酶(SSH)、丝氨酸磷酸酶、PP2A、PP2B、PP2C、PP1、PP5、肌磷酸酶、PTEN、SHIP、肌管素、磷酸肌醇激酶、磷脂酶、前列腺素合成酶、5-脂氧合酶、鞘氨醇激酶、鞘磷脂酶、接头/骨架蛋白、Shc、Grb2、BLNK、LAT、PI3-激酶B细胞接头蛋白(BCAP)、SLAP、Dok、KSR、MyD88、Crk、CrkL、GAD、Nck、Grb2相关结合蛋白(GAB)、Fas相关死亡结构域蛋白(FADD)、TRADD、TRAF2、RIP、T细胞白血病、IL-2、IL-4、IL-8、IL-6、干扰素γ、干扰素α、细胞因子信号抑制蛋白(SOC)、Cbl、SCF泛素连接酶复合物、APC/C、粘附分子、整合素、免疫球蛋白样粘附分子、选择素、钙黏素、联蛋白、局部粘着斑激酶、p130CAS、胞衬蛋白、肌动蛋白、桩蛋白、肌球蛋白、肌球蛋白结合蛋白、微管蛋白、eg5/KSP、CENP、β-肾上腺能受体、毒蕈碱性受体、腺苷酸环化酶受体、小分子量GTP酶、H-Ras、K-Ras、N-Ras、Ran、Rac、Rho、Cdc42、Arf、RAB、RHEB、Vav、Tiam、Sos、Dbl、PRK、TSC1，2、Ras-GAP、Arf-GAP、Rho-GAP、胱天蛋白酶、胱天蛋白酶2、胱天蛋白酶3、胱天蛋白酶6、胱天蛋白酶7、胱天蛋白酶8、胱天蛋白酶9、Bcl-2、Mcl-1、Bcl-XL、Bcl-w、Bcl-B、Al、Bax、Bak、Bok、Bik、Bad、Bid、Bim、Bmf、Hrk、Noxa、Puma、IAP、XIAP、Smac、Cdk4、Cdk 6、Cdk 2、Cdk1、Cdk7、细胞周期蛋白D、细胞周期蛋白E、细胞周期蛋白A、细胞周期蛋白B、Rb、p16、p14Arf、p27KIP、p21CIP、分子伴侣、Hsp90、Hsp70、Hsp27、代谢酶类、乙酰辅酶A羧化酶、ATP-柠檬酸裂解酶、一氧化氮合成酶、细胞质膜微囊蛋白、内体蛋白分选转运装置(ESCRT)蛋白、膜泡蛋白分选蛋白(Vsps)、羟化酶、脯氨酸羟化酶PHD-1、2和3、天冬氨酸羟化酶FIH转移酶、Pinl脯氨酸异构酶、拓扑异构酶、去乙酰酶、组蛋白去乙酰酶、sirtuins、组蛋白乙酰化酶、CBP/P300家族、MYST家族、ATF2、DNA甲基转移酶、组蛋白H3K4去甲基酶、H3K27、JHDM2A、UTX、VHL、WT-1、p53、Hdm、PTEN、泛素蛋白酶、尿激酶型纤溶酶原激活剂(uPA)与uPA受体(uPAR)系统、组织蛋白酶、金属蛋白酶、酯酶、水解酶、分离酶、钾通道、钠通道、多药抗性蛋白、P-糖蛋白、核苷转运体、Ets、Elk、SMAD、Rel-A(p65-NFKB)、CREB、NFAT、ATF-2、AFT、Myc、Fos、Spl、Egr-1、T-bet、β-联蛋白、HIF、FOXO、E2F、SRF、TCF、Egr-1、β-联蛋白、FOXO STAT1、STAT 3、STAT 4、STAT 5、STAT6、p53、WT-1、HMGA、pS6、4EPB-1、eIF4E-结合蛋白、RNA聚合酶、起始因子、延伸因子。
在本发明的一些实施方案中，本文所述的方法被用于测定可激活元件的激活水平，例如，在细胞途径中的可激活元件。提供了方法和组合物以用于根据细胞途径中的可激活元件的激活水平来测定细胞的激活状态数据。提供了方法和组合物以用于根据各个细胞中的细胞途径的可激活元件的激活水平来测定第一种分离的细胞群体中和第二种分离的细胞群体中的细胞的激活状态数据。所述细胞可为造血细胞并且实例见于本文。
在一些实施方案中，根据可激活元件的激活水平，如细胞途径中的可激活元件，而对不同的分离的细胞群体中的细胞的激活数据进行的测定包括将所述细胞中的至少一种归类为关联于临床结果的细胞。临床结果、阶段以及患者响应的实例也见于本文。
(a)信号传导途径
在一些实施方案中，本发明的方法被用于测定信号传导途径中的可激活元件的激活水平。在一些实施方案中，根据本文所述，根据一种或更多种信号传导途径中的一种或更多种可激活元件的激活水平测定细胞的激活状态数据。信号传导途径及其成员已被广泛地描述。参见(Hunter T.Cell 2000年1月7日；100(1)：13-27页；Weinberg，2007年；以及上文引用的Blume-Jensen和Hunter，Nature，第411卷，2001年5月17日，355-365页)。示例性的信号传导途径包括下列途径及其成员：包括JAK、STAT2、3、4和5在内的JAK-STAT途径，FLT3L信号传导途径，包括Ras、Raf、MEK、ERK和elk在内的MAP激酶途径，包括PI-3-激酶、PDK1、Akt和Bad在内的PI3K/Akt途径，包括IKK、IkB和NF-κB在内的NF-κB途径以及包括卷曲受体、β-联蛋白、APC和其他辅因子与TCF在内的Wnt途径(参见Cell Signaling Technology，Inc.2002年产品目录第231-279页和此前Hunter T.的引用)。在本发明的一些实施方案中，被分析的相关联可激活元件(或被检测的信号传导蛋白质)是MAP激酶、Akt、NFkB、WNT、STAT和/或PKC信号传导途径的成员。
在一些实施方案中，本发明的方法被用于测定包括上述在内的本领域已知的信号传导途径中的信号传导蛋白的激活水平。本发明范围内的信号传导蛋白的类型的实例包括但不限于激酶、激酶底物(即磷酸化底物)、磷酸酶、磷酸酶底物、结合蛋白(如14-3-3)、受体配体和受体(细胞表面受体酪氨酸激酶和核受体)。例如，激酶和蛋白质结合结构域已被详尽描述(例见Cell Signaling Technology，Inc.，2002年目录“TheHuman Protein Kinases”和“Protein Interaction Domains”第254-279页)。
示例性的信号传导蛋白质包括但不限于激酶，HER受体、PDGF受体、Kit受体、FGF受体、Eph受体、Trk受体、IGF受体、胰岛素受体、Met受体、Ret、VEGF受体、TIE1、TIE2、FAK、Jak1、Jak2、Jak3、Tyk2、Src、Lyn、Fyn、Lck、Fgr、Yes、Csk、Abl、Btk、ZAP70、Syk、IRAK、cRaf、ARaf、BRAF、Mos、Lim激酶、ILK、Tpl、ALK、TGFβ受体、BMP受体、MEKK、ASK、MLK、DLK、PAK、Mek 1、Mek 2、MKK3/6、MKK4/7、ASK1、Cot、NIK、Bub、Myt 1、Weel、酪蛋白激酶、PDK1、SGK1、SGK2、SGK3、Akt1、Akt2、Akt3、p90Rsk、p70S6激酶、Prks、PKC、PKA、ROCK 1、ROCK 2、极光激酶、CaMK、MNK、AMPK、MELK、MARK、Chk1、Chk2、LKB-1、MAPKAPK、Pim1、Pim2、Pim3、IKK、Cdk、Jnk、Erk、IKK、GSK3α、GSK3β、Cdk、CLK、PKR、PI3-激酶1型、2型、3型、mTor、SAPK/JNK1，2，3、p38、PKR、DNA-PK、ATM、ATR、磷酸酶、受体蛋白酪氨酸磷酸酶(RPTP)、LAR磷酸酶、CD45、非受体蛋白酪氨酸磷酸酶(NPRTP)、SHP、MAP激酶磷酸酶(MKP)、双特异性磷酸酶(DUSP)、CDC25磷酸酶、低分子量酪氨酸磷酸酶、眼缺陷蛋白(EYA)酪氨酸磷酸酶、Slingshot磷酸酶(SSH)、丝氨酸磷酸酶、PP2A、PP2B、PP2C、PP1、PP5、肌磷酸酶、PTEN、SHIP、肌管素，脂质信号传导，磷酸肌醇激酶、磷脂酶、前列腺素合成酶、5-脂氧合酶、鞘氨醇激酶、鞘磷脂酶、接头/骨架蛋白、Shc、Grb2、BLNK、LAT、PI3-激酶B细胞接头蛋白(BCAP)、SLAP、Dok、KSR、MyD88、Crk、CrkL、GAD、Nck、Grb2相关结合蛋白(GAB)、Fas相关死亡结构域蛋白(FADD)、TRADD、TRAF2、RIP、T细胞白血病家族、细胞因子，IL-2、IL-4、IL-8、IL-6、干扰素γ、干扰素α，细胞因子调控物、细胞因子信号抑制蛋白(SOC)、泛素化酶、Cbl、SCF泛素连接酶复合物、APC/C、粘附分子、整合素、免疫球蛋白样粘附分子、选择素、钙黏素、联蛋白、局部粘着斑激酶、p130CAS，细胞骨架/收缩蛋白、胞衬蛋白、肌动蛋白、桩蛋白、肌球蛋白、肌球蛋白结合蛋白、微管蛋白、eg5/KSP、CENP、G蛋白异三聚体、β-肾上腺能受体、毒蕈碱性受体、腺苷酸环化酶受体、小分子量GTP酶、H-Ras、K-Ras、N-Ras、Ran、Rac、Rho、Cdc42、Arf、RAB、RHEB、鸟嘌呤核苷酸交换因子、Vav、Tiam、Sos、Dbl、PRK、TSC1，2、GTP酶激活蛋白、Ras-GAP、Arf-GAP、Rho-GAP、胱天蛋白酶、胱天蛋白酶2、胱天蛋白酶3、胱天蛋白酶6、胱天蛋白酶7、胱天蛋白酶8、胱天蛋白酶9、凋亡参与蛋白、Bcl-2、Mcl-1、Bcl-XL、Bcl-w、Bcl-B、Al、Bax、Bak、Bok、Bik、Bad、Bid、Bim、Bmf、Hrk、Noxa、Puma、IAP、XIAP、Smac、细胞周期调节蛋剂、Cdk4、Cdk 6、Cdk 2、Cdk1、Cdk 7、细胞周期蛋白D、细胞周期蛋白E、细胞周期蛋白A、细胞周期蛋白B、Rb、p16、p14Arf、p27KIP、p21CIP、分子伴侣、Hsp90、Hsp70、Hsp27、代谢酶类、乙酰辅酶A羧化酶、ATP-柠檬酸裂解酶、一氧化氮合成酶、膜泡转运蛋白、细胞质膜微囊蛋白、内体蛋白分选转运装置(ESCRT)蛋白、膜泡蛋白分选蛋白(Vsps)、羟化酶、脯氨酸羟化酶PHD-1、2和3、天冬氨酸羟化酶FIH转移酶、异构酶、Pinl脯氨酸异构酶、拓扑异构酶、去乙酰酶、组蛋白去乙酰酶、sirtuins、乙酰酶、组蛋白乙酰化酶、CBP/P300家族、MYST家族、ATF2、甲基化酶、DNA甲基转移酶、去甲基化酶、组蛋白H3K4去甲基酶、H3K27、JHDM2A、UTX、肿瘤抑制蛋白基因、VHL、WT-1、p53、Hdm、PTEN、蛋白酶、泛素蛋白酶、尿激酶型纤溶酶原激活剂(uPA)与uPA受体(uPAR)系统、组织蛋白酶、金属蛋白酶、酯酶、水解酶、分离酶、离子通道、钾通道、钠通道、分子转运体、多药抗性蛋白、P-糖蛋白、核苷转运体、转录因子/DNA结合蛋白、Ets、Elk、SMAD、Rel-A(p65-NFKB)、CREB、NFAT、ATF-2、AFT、Myc、Fos、Spl、Egr-1、T-bet、β-联蛋白、HIF、FOXO、E2F、SRF、TCF、Egr-1、β-联蛋白、FOXO STAT1、STAT 3、STAT 4、STAT 5、STAT 6、p53、WT-1、HMGA、翻译调控剂、pS6、4EPB-1、eIF4E-结合蛋白、转录调节因子、RNA聚合酶、起始因子以及延伸因子。
在一些实施方案中，所述蛋白选自PI3-激酶(p85、p110a、p110b、p110d)、Jak1、Jak2、SOC、Rac、Rho、Cdc42、Ras-GAP、Vav、Tiam、Sos、Dbl、Nck、Gab、PRK、SHP1和SHP2、SHIP1、SHIP2、sSHIP、PTEN、Shc、Grb2、PDK1、SGK、Akt1、Akt2、Akt3、TSC1，2、Rheb、mTor、4EBP-1、p70S6激酶、S6、LKB-1、AMPK、PFK、乙酰辅酶A羧化酶、DokS、Rafs、Mos、Tp12、MEK1/2、MLK3、TAK、DLK、MKK3/6、MEKK1，4、MLK3、ASK1、MKK4/7、SAPK/JNK1，2，3、p38s、Erk1/2、Syk、Btk、BLNK、LAT、ZAP70、Lck、Cbl、SLP-76、PLCyi、PLCy 2、STAT1、STAT3、STAT4、STAT5、STAT6、FAK、p130CAS、PAKs、LIMK1/2、Hsp90、Hsp70、Hsp27、SMADs、Rel-A(p65-NFKB)、CREB、组蛋白H2B、HATs、HDACs、PKR、Rb、细胞周期蛋白D、细胞周期蛋白E、细胞周期蛋白A、细胞周期蛋白B、P16、p14Arf、p27KIP、p21CIP、Cdk4、Cdk6、Cdk7、Cdk1、Cdk2、Cdk9、Cdc25、A/B/C、Abl、E2F、FADD、TRADD、TRAF2、RIP、Myd88、BAD、Bcl-2、Mcl-1、Bcl-XL、胱天蛋白酶2、胱天蛋白酶3、胱天蛋白酶6、胱天蛋白酶7、胱天蛋白酶8、胱天蛋白酶9、IAPs、Smac、胞衬蛋白、肌动蛋白、Src、Lyn、Fyn、Lck、NIK、IκB、p65(RelA)、IKKα、PKA、PKCα、PKCβ、PKCθ、PKCδ、CAMK、Elk、AFT、Myc、Egr-1、NFAT、ATF-2、Mdm2、p53、DNA-PK、Chk1、Chk2、ATM、ATR、β联蛋白、CrkL、GSK3α、GSK3β、以及FOXO。
在本发明的一些实施方案中，本文所述的方法被用于测定信号传导途径中的可激活元件的激活水平。参见U.S.S.第61/048,886号和第61/048,920，其被并入本文。提供了方法和组合物以用于根据信号传导途径中的可激活元件的状态来测定细胞的激活状态数据。提供了方法和组合物以用于根据信号传导途径中的可激活元件的状态来测定不同细胞群体中的细胞的生理状态。所述细胞是造血细胞。造血细胞的实例见于本文。
在一些实施方案中，根据信号传导途径中的可激活元件的激活水平而对不同的分离的细胞群体中的细胞的激活状态数据进行的测定包括将所述细胞群体归类为关联于临床结果的细胞。临床结果、阶段、患者响应和分类的实例见于上文。
结合元件
在本发明的一些实施方案中测定了可激活元件的激活水平。一个实施方案通过将来自细胞群体的细胞接触特异于所述可激活元件的激活水平的结合元件而实施该测定。术语“结合元件”包括任意分子，如肽、核酸、有机小分子，其对于可激活元件的一种激活状态的检测能够超过对该可激活元件的另一种激活状态的检测。结合元件和用于结合元件的标记物见于U.S.S.N./048,886；61/048,920以及61/048,657。
在一些实施方案中，所述结合元件是肽、多肽、寡肽或蛋白质。所述肽、多肽、寡肽或蛋白质可以由天然氨基酸和肽键所构成，或由合成的模拟肽结构所构成。因此本文所使用的“氨基酸”或“肽残基”包括天然和合成氨基酸。例如，高苯丙氨酸、瓜氨酸和正亮氨酸被考虑为用于本发明目的的氨基酸。所述侧链可以是(R)或(S)构型。在一些实施方案中，所述氨基酸是(S)或L-构型。在使用了非天然侧链的情况下，非氨基酸取代物可被用于，例如，防止或延迟体内降解。包含非天然氨基酸的蛋白质可被合成或在某些情况下进行重组制备，参见van Hest等人，FEBS Lett 428：(1-2)68-70页1998年5月22日以及Tang等人，Abstr.Pap Am.Chem.S218：U138第2部分1999年8月22日，两者均明确地以引用的方式并入本文。
本发明的方法可被用于在样品中检测任意特定的可激活元件，所述可激活元件具有作为抗原的可检测性并且作为抗原可与存在于所述样品中的其他可激活元件相区分。例如，本发明的激活状态特异性抗体可被用于本方法以辨识复合细胞群体的亚组或亚群体的不同信号传导级联，以及蛋白质激活(如，激酶激活)在潜在的信号传导层级中的次序。因此，在一些实施方案中，使用本发明的方法对一种更多种多肽的表达和磷酸化进行了检测和定量。在一些实施方案中，使用本发明的方法对一种更多种多肽的表达和磷酸化进行了检测和定量，所述多肽是细胞途径的细胞组分。本文所使用的术语“激活状态特异性抗体”或“激活状态抗体”或其语法上的等价物指的是特异地结合于对应和特定抗原的抗体。在优选的情况下，所述对应和特定抗体是特定形式的可激活元件。同样是优选的情况下，所述激活状态特异性抗体的结合是特定可激活元件的特定激活状态的指征。
在一些实施方案中，所述结合元件是抗体。在一些实施方案中，所述结合元件是激活状态特异性抗体。
术语“抗体”包括全长抗体和抗体片段，并且可能指的是根据下文进一步定义用于实验、治疗或其他目的的来自任意生物体的天然抗体、工程改造抗体或重组产生的抗体。正如本领域所知，抗体片段的实例如，通过对完整抗体的修饰所产生的或通过使用重组DNA技术进行从头合成的Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv、scFv或抗体的其他抗原结合亚序列。术语“抗体”包括单克隆和多克隆抗体。抗体可以是拮抗剂、激动剂、具中和能力、具抑制性或具刺激性。其可被人源化、糖基化、结合固体支持物并且具有其他变体。更多关于抗体作为结合元件的信息参见U.S.S.第61/048,886号；第61/048,920号以及第61/048,657号。
激活状态特异性抗体可被用于检测激酶活性，但是本发明提供了另外的手段用于检测激酶的激活。例如，被蛋白质激酶特异地识别并因此被磷酸化的底物是已知的。特异地结合于这些磷酸化底物但不结合于未磷酸化底物的抗体(磷酸化底物抗体)可被用于在样品中检测激活的激酶的存在。
可激活元件的激活异构型的抗原性可与可激活元件的非激活异构型的抗原性相区分或与不同的激活状态的异构型的抗原性相区分。在一些实施方案中，元件的激活异构型具有元件的非激活异构型所不具有的表位，或是相反的情况。在一些实施方案中，这种区别是由于诸如磷酸根基团这样的基团与元件的加合，或由于元件的结构变化，如通过蛋白质切割，或由于元件中在其他情况下会被诱导出的构象变化，其以作为抗原可区别的方式使所述元件呈现相同的序列。在一些实施方案中，这样的构象变化使元件的激活异构型呈递至少一种在非激活异构型中不存在的表位，或不呈递至少一种在该元件的非激活异构型中被呈递的表位。在一些实施方案中，用于区分抗体的表位围绕所述元件的活性位点为中心而分布，尽管本领域已知元件的一个区域的构象变化也可导致所述元件不同区域的改变。
已经产生了多种特异地结合于蛋白质的磷酸化异构体但不特异地结合蛋白质的非磷酸化异构体的抗体、其中多种抗体是市售的(如、参见Cell Signaling Technology、www.cellsignal.com或Becton Dickinson、www.bd.com)。已产生许多这样的抗体，其用于对可逆磷酸化的信号传导蛋白质的研究。特别地，已产生许多这样的抗体，其特异地结合于磷酸化的激活异构型蛋白质。可使用本文所述的方法进行分析的蛋白质包括但不限于激酶、HER受体、PDGF受体、FLT3受体、Kit受体、FGF受体、Eph受体、Trk受体、IGF受体、胰岛素受体、Met受体、Ret、VEGF受体、TIE1、TIE2、促红细胞生成素受体、血小板生成素受体、CD114、CD116、FAK、Jak1、Jak2、Jak3、Tyk2、Src、Lyn、Fyn、Lck、Fgr、Yes、Csk、Abl、Btk、ZAP70、Syk、IRAK、cRaf、ARaf、BRAF、Mos、Lim激酶、ILK、Tpl、ALK、TGFβ受体、BMP受体、MEKKs、ASK、MLKs、DLK、PAKs、Mek 1、Mek 2、MKK3/6、MKK4/7、ASK1、Cot、NIK、Bub、Myt 1、Weel、酪蛋白激酶、PDK1、SGK1、SGK2、SGK3、Akt1、Akt2、Akt3、p90Rsks、p70S6激酶、Prks、PKC、PKA、ROCK 1、ROCK 2、极光激酶、CaMKs、MNKs、AMPKs、MELK、MARKs、Chk1、Chk2、LKB-1、MAPKAPKs、Pim1、Pim2、Pim3、IKK、Cdk、Jnk、Erks、IKK、GSK3α、GSK3β、Cdk、CLK、PKR、PI3-激酶1型、2型、3型、mTor、SAPK/JNK1，2，3、p38s、PKR、DNA-PK、ATM、ATR、磷酸酶、受体蛋白质酪氨酸磷酸酶(RPTP)、LAR磷酸酶、CD45、非受体酪氨酸磷酸酶(NPRTP)、SHP、MAP激酶磷酸酶(MKP)、双特异性磷酸酶(DUSP)、CDC25磷酸酶、低分子量酪氨酸磷酸酶、眼缺陷蛋白(EYA)酪氨酸磷酸酶、Slingshot磷酸酶(SSH)、丝氨酸磷酸酶、PP2A、PP2B、PP2C、PP1、PPS、肌醇磷酸酶、PTEN、SHIPs、肌管素、脂质信号传导、磷酸肌醇激酶、磷脂酶、前列腺素合成酶、5-脂氧合酶、鞘氨醇激酶、鞘磷脂酶、接头/骨架蛋白、Shc、Grb2、BLNK、LAT、PI3-激酶B细胞接头蛋白(BCAP)、SLAP、Dok、KSR、MyD88、Crk、CrkL、GAD、Nck、Grb2相关结合蛋白(GAB)、Fas相关死亡结构域蛋白(FADD)、TRADD、TRAF2、RIP、T细胞白血病家族、细胞因子、IL-2、IL-4、IL-8、IL-6、干扰素γ、干扰素α、细胞因子调控物，细胞因子信号抑制蛋白(SOC)、泛素化酶、Cbl、SCF泛素连接酶复合物、APC/C、粘附分子、整合素、免疫球蛋白样粘附分子、选择素、钙黏素、联蛋白、局部粘着斑激酶、p130CAS、细胞骨架/收缩蛋白、胞衬蛋白、肌动蛋白、桩蛋白、肌球蛋白、肌球蛋白结合蛋白、微管蛋白、eg5/KSP、CENP、G蛋白异三聚体、β-肾上腺能受体、毒蕈碱性受体、腺苷酸环化酶受体、小分子量GTP酶、H-Ras、K-Ras、N-Ras、Ran、Rac、Rho、Cdc42、Arf、RAB、RHEB、鸟嘌呤核苷酸交换因子、Vav、Tiam、Sos、Dbl、PRK、TSC1，2、GTP酶激活蛋白、Ras-GAP、Arf-GAP、Rho-GAP、胱天蛋白酶、胱天蛋白酶2、胱天蛋白酶3、胱天蛋白酶6、胱天蛋白酶7、胱天蛋白酶8、胱天蛋白酶9、凋亡参与蛋白、Bcl-2、Mcl-1、Bcl-XL、Bcl-w、Bcl-B、Al、Bax、Bak、Bok、Bik、Bad、Bid、Bim、Bmf、Hrk、Noxa、Puma、IAP、XIAP、Smac、细胞周期调节蛋剂、Cdk4、Cdk 6、Cdk 2、Cdk1、Cdk 7、细胞周期蛋白D、细胞周期蛋白E、细胞周期蛋白A、细胞周期蛋白B、Rb、p16、p14Arf、p27KIP、p21CIP、分子伴侣、Hsp90、Hsp70、Hsp27、代谢酶类、乙酰辅酶A羧化酶、ATP-柠檬酸裂解酶、一氧化氮合成酶、膜泡转运蛋白、细胞质膜微囊蛋白、内体蛋白分选转运装置(ESCRT)蛋白、膜泡蛋白分选蛋白(Vsps)、羟化酶、脯氨酸羟化酶PHD-1、2和3、天冬氨酸羟化酶FIH转移酶、异构酶、Pinl脯氨酸异构酶、拓扑异构酶、去乙酰酶、组蛋白去乙酰酶、sirtuins、乙酰酶、组蛋白乙酰化酶、CBP/P300家族、MYST家族、ATF2、甲基化酶、DNA甲基转移酶、去甲基化酶、组蛋白H3K4去甲基酶、H3K27、JHDM2A、UTX、肿瘤抑制蛋白基因、VHL、WT-1、p53、Hdm、PTEN、蛋白酶、泛素蛋白酶、尿激酶型纤溶酶原激活剂(uPA)与uPA受体(uPAR)系统、组织蛋白酶、金属蛋白酶、酯酶、水解酶、分离酶、离子通道，钾通道、钠通道、分子转运体、多药抗性蛋白、P-糖蛋白、核苷转运体、转录因子/DNA结合蛋白、Ets、Elk、SMAD、Rel-A(p65-NFKB)、CREB、NFAT、ATF-2、AFT、Myc、Fos、Spl、Egr-1、T-bet、β-联蛋白、HIFs、FOXOs、E2Fs、SRFs、TCFs、Egr-1、β-FOXO STAT1、STAT 3、STAT 4、STAT 5、STAT 6、p53、WT-1、HMGA、翻译调控剂、pS6、4EPB-1、eIF4E-结合蛋白、转录调节因子、RNA聚合酶、起始因子以及延伸因子。在一些实施方案中，所述蛋白质是S6。
在一些实施方案中，使用的是活性状态抗体的表位识别片段而非完整所述抗体。在一些实施方案中，所述表位识别片段被固定。在一些实施方案中，使用了识别表位的抗原轻链。可使用编码识别表位的轻链基因产物的重组核酸通过本领域所熟知的手段来制备这样的抗体片段。
在本发明的替代性实施方案中，蛋白质结合元件的芳香族氨基酸被其他分子所取代。参见U.S.S.第61/048,886号；第61/048,920号和第61/048,657号。
在一些实施方案中，所述激活状态特异性结合元件是包含识别结构的肽，其结合于可激活蛋白质之上的靶结构。多种识别结构在本领域中被熟知并且可使用本领域已知的方法进行制备，所述方法包括噬菌体展示文库(Gururaja等人，Chem.Biol.(2000年)7：515-27页；Houimel等人，Eur.J.Immunol.(2001年)31：3535-45页；Cochran等人，J.Am.Chem.Soc.(2001年)123：625-32页；Houimel等人，Int.J.Cancer(2001年)92：748-55，各文献均已引用的方式并入本文)。另外，荧光团可被连接于这些抗体以用于本发明的方法。
本领域已知多种识别结构(例如Cochran等人，J.Am.Chem.Soc.(2001年)123：625-32页；Boer等人，Blood(2002年)100：467-73页，均明确地以引用的形式并入本文)并且可使用本领域已知的方法进行制备(例如，参见Boer等人，Blood(2002年)100：467-73页；Gualillo等人，Mol.Cell Endocrinol.(2002)190：83-9页，均明确地以引用的形式并入本文)，其包括例如，组合化学方法，其用于制备诸如多聚物这样的对可激活蛋白质的靶结构具亲和性的识别结构(例如，参见Barn等人，J.Comb.Chem.(2001年)3：534-41页；Ju等人，Biotechnol.(1999年)64：232-9页，均明确地以引用的形式并入本文)。在另一个实施方案中，激活状态特异性抗体是仅结合于磷酸化的特定可激活蛋白质的某一种异构型的蛋白质，并且其不结合于该可激活蛋白质处于未磷酸化或非磷酸化时的异构型。在另一个实施方案中，所述激活状态特异性抗体是一种蛋白质，其仅结合于可激活蛋白质处于细胞内而非细胞外时的异构型，或者与之相反的情况。在一个实施方案中，所述识别结构是抗层粘连蛋白单链抗体片段(scFV)(例如，参见Sanz等人，GeneTherapy(2002年)9：1049-53页；Tse等人，J.Mol.Biol.(2002年)317：85-94页，均明确地以引用的形式并入本文)。
在一些实施方案中，所述结合元件是核酸。术语“核酸”包括核酸类似物，例如磷酰胺(Beaucage等人，Tetrahedron 49(10)：1925(1993年)及其中引文；Letsinger，J.Org.Chem.35：3800页(1970年)；Sprinzl等人，Eur.J.Biochem.81：579页(1977年)；Letsinger等人，Nucl.AcidsRes.14：3487页(1986年)；Sawai等人，Chem.Lett.805页(1984年)，Letsinger等人，J.Am.Chem.Soc.110：4470页(1988年)；以及Pauwels等人，Chemica Scripta 26：141 91986页)、硫代磷酸酯(Mag等人，NucleicAcids Res.19：1437页(1991年)；以及美国专利第5,644,048号)、二硫代磷酸酯(Briu等人，J.Am.Chem.Soc.111：2321页(1989年))、O-甲基亚磷酰胺连接物(参见Eckstein，Oligonucleotides and Analogues：A Practical Approach，Oxford University Press)以及肽核酸骨架和连接物(参见Egholm，J.Am.Chem.Soc.114：1895页(1992年)；Meier等人，Chem.Int.Ed.Engl.31：1008页(1992年)；Nielsen，Nature，365：566页(1993年)；Carlsson等人，Nature 380：207页(1996年)，以上这些其以引用的方式并入本文)。其他核酸类似物包括具有正电骨架的类似物(Denpcy等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：6097(1995年))、非离子骨架的类似物(美国专利第5,386,023号、第5,637,684号、第5,602,240号、第5,216,141号和第4,469,863号；Kiedrowshi等人，Angew.Chem.Intl.Ed.English 30：423页(1991年)；Letsinger等人，J.Am.Chem.Soc.110：4470页(1988年)；Letsinger等人，Nucleoside & Nucleotide 13：1597页(1994年)；ASC Symposium Series 580，“CarbohydrateModifications in Antisense Research”，第2和第3章，Y.S.Sanghui和P.Dan Cook编；Mesmaeker等人，Bioorganic & Medicinal Chem.Lett.4：395页(1994年)；Jeffs等人，J.Biomolecular NMR 34：17页(1994年)；Tetrahedron Lett.37：743页(1996年))和非核糖骨架的类似物，包括美国专利第5,235,033号和第5,034,506号，以及ASC Symposium Series580，″Carbohydrate Modifications in Antisense Research″，第6和第7章，Y.S.Sanghui和P.Dan Cook编。包含一种或更多种碳环糖类的核酸也包含在核酸的定义之内(参见Jenkins等人，Chem.Soc.Rev.(1995年)169-176页)。多种核酸类似物的描述见于Rawls，C & E News，1997年6月2日，35页。所有这些文献均明确地以引用的方式并入本文。可实施所述核糖磷酸骨架的这些修饰用以辅助诸如标记物这样的另外基团的添加，或者用以提高这些分子在生理环境中的稳定性和半衰期。
在一些实施方案中，所述结合元件是有机小化合物。结合元件可合成自一系列可被化学修饰的底物。“化学修饰”在此包括传统的化学反应以及酶学反应。这些底物一般包括，但不限于，烷基基团(包括烷烃、烯烃、炔烃和杂烷基)、芳基基团(包括芳烃和杂芳烃)、醇、醚、胺、醛、酮、酸、酯、氨基化合物、环状化合物、杂环化合物(包括嘌呤、嘧啶、苯并二氮
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β-内酰胺、四环素、头孢菌素和氨水化合物)、甾体(包括雌激素、雄激素、可的松、蜕皮甾酮等等)、生物碱(包括麦角碱、长春花碱、箭毒碱、吡咯联啶生物碱和丝裂霉素)、有机金属化合物、携带杂原子的化合物、氨基酸和核苷。化学(包括酶学)反应可在这些基团上进行以形成新的底物或结合元件，其可随后被用于本发明。
在一些实施方案中，所述结合元件是碳水化合物。本文所使用的术语碳水化合物意在包括任何具有通式(CH2O)n的化合物。碳水化合物的实例是二糖、三糖和寡糖，以及多聚糖如糖原、纤维素和淀粉。
在一些实施方案中，所述结合元件是脂质。本文所使用的术语脂质在此意在包含任何水不溶的有机分子，其可溶于非极性有机溶剂。脂质的实例是诸如胆固醇这样的甾体以及诸如鞘磷脂这样的磷脂质。
在一些实施方案中，所述结合元件在对所述可激活元件进行激活之前将其分离，例如，通过质谱。
可激活元件、激活状态和测定可激活元件的激活水平的方法的实例在题为“Methods and compositions for detecting the activation state ofmultiple proteins in single cells”的美国专利申请第20060073474号以及题为“Methods and compositions for risk stratification”的美国专利申请第20050112700号中有所描述，其内容以引用的方式并入本文。
标记物
本发明的方法和组合物提供了包含标记物或标签的结合元件。标记物指的是可被直接(即，初级标记物)或间接(即，次级标记物)检测的分子，例如标记物可被可视化和/或测量或在其他情况下被辨识以获知其存在与否。结合元件和用于结合元件的标记物见于U.S.S.N./048,886；61/048,920以及61/048,657。
化合物可直接地或间接地连接于标记物或，该标记物提供可检测信号，如，放射性同位素、荧光剂、酶、抗体、颗粒物如磁性颗粒物、化学发光剂、可通过质谱检测的分子、或特异性结合分子等。特异性结合分子包括分子对，诸如生物素和链霉亲和素、地高辛和地高辛抗体等。标记物的实例包括但不限于，光学荧光物和生色染料，包括标记物，标记酶和放射性同位素。在本发明的一些实施方案中，这些标签可被连接于所述结合元件。
在一些实施方案中，一种或更多种结合元件被独特地标记。在使用两种激活状态特异性抗体的实例中，“独特地标记”指的是识别第一激活元件的一种激活状态抗体包含第一标记物，并且识别第二激活元件的第二激活状态抗体包含第二标记物，其中所述第一和第二标记物是可检测的以及可区分的，这使得第一抗体和第二抗体被独特地标记。
一般情况下，标记物分为四类：a)同位素标记物，其可为放射性同位素或重同位素；b)磁、电、热标记；c)生色的光学标记，包括发光的、含磷的和荧光染料或基团；以及d)结合分子对。标记物还可包括酶(辣根过氧化酶等)和磁性颗粒。在一些实施方案中，所述检测标记物是初级标记物。初级标记物是可以被直接检测的标记物，如荧光剂。
标记物包括光学标记，如荧光染料或基团。荧光剂可是“小分子”荧光物(fluors)或蛋白质性荧光物(如绿色荧光蛋白和其所有变体)。
在一些实施方案中，用量子点标记激活状态特异性抗体，其根据Chattopadhyay，P.K.等人，Quantum dot semiconductor nanocrystals forimmunophenotyping by polychromatic flow cytometry.Nat.Med.12，972-977页(2006年)中所公布的内容进行。量子点可通过Invitrogen市售，http://probes.invitrogen.com/products/qdot/。
经量子点标记的抗体可被单独使用或其可与结合有机荧光染料的抗体组合使用以提高有效标记物数量。随着被标记抗体数量的提高，对已知细胞群体进行细化分型的能力同时提高。另外，激活状态特异性抗体可以使用螯合或笼合(caged)镧系元素进行标记，其根据Erkki，J.等人，Lanthanide chelates as new fluorochrome labels for cytochemistry.J.Histochemistry Cytochemistry，36：1449-1451，1988年，以及题为“Salicylamide-Lanthanide Complexes for Use as Luminescent Markers”的美国专利第7,018850号中所公布的内容进行。也可使用其他检测荧光的方法，例如，量子点法(例如，参见Goldman等人，J.Am.Chem.Soc.(2002年)124：6378-82页；Pathak等人，J.Am.Chem.Soc.(2001)123：4103-4页；以及Remade等人，Proc.Natl.Sci.USA(2000)18：553-8页，各文献均以引用的形式并入本文)以及共聚焦显微镜法。
在一些实施方案中，以适用于电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)的标签对所述可激活元件进行标记，其根据Tanner等人，Spectrochimica Acta Part B：Atomic Spectroscopy，2007年3月；62(3)：188-195页中的描述进行。
或者，可使用基于FRET的检测系统，其在下文有详细讨论。FRET可用于本发明，例如，用于检测涉及成簇或多聚化的激活状态，其中两个FRET标记物的接近程度由于激活而被改变。在一些实施方案中，至少使用了两种荧光标记物，其为荧光共振能量转移对的成员。
本发明的方法和组合物也可使用标记酶。标记酶指的是当存在标记酶底物时可发生反应的酶，所述底物可产生可检测产物。用于本发明的适当的标记酶包括但不限于，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和葡萄糖氧化酶。用于这些底物的方法在该领域中是被人所熟知的。所述标记酶的存在一般通过该酶所催化的与标记酶底物的反应而被检出，该反应产生可辨识产物。这些产物可以是混浊物，如辣根过氧化物酶与四甲基联苯胺的反应，并且可具有多种颜色。产生荧光反应产物的其他标记酶底物如发光氨(来自Pierce Chemical Co.)已经被开发。用于使用标记酶底物辨识标记酶的方法在该领域中是为人所熟知的，并且有众多商业化试剂盒。使用多种标记酶的实例和方法在Savage等人，Previews 247：6-9页(1998年)，Young，J.Virol.Methods 24：227-236页(1989年)中有所描述，其全文均以引用的形式并入本文。
放射性同位素是指任何放射性分子。用于本发明的适当的放射性同位素包括但不限于14C、3H、32P、33P、35S、125I和131I。放射性同位素作为标记物的使用在本领域中为人所熟知的。
如所描述，标记物可被间接地检测，即，所述标签是一个结合分子对的成员。“结合分子对的成员”指的是第一部分和第二部分中的一个，其中所述第一部分和第二部分互相具有特异性结合亲和力。用于本发明的适当的结合分子对包括但不限于，抗原/抗体(如，地高辛/地高辛抗体、二硝基苯(DNP)/DNP抗体、丹酰-X-丹酰抗体、荧光素/荧光素抗体、荧光黄/荧光黄抗体、以及罗丹明/罗丹明抗体)、生物素/亲和素(或生物素/链霉亲和素)以及钙调素结合蛋白(CBP)/钙调素。其他的适当结合分子对包括多肽，如FLAG肽【Hopp等人，BioTechnology，6：1204-1210页(1988年)】；KT3表位肽【Martin等人，Science，255：192-194页(1992年)】；微管蛋白表位肽【Skinner等人，J.Biol.Chem.，266：15163-15166页(1991年)】以及T7基因10蛋白肽标签【Lutz-Freyermuth等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87：6393-63971990年)】以及上述各个分子的抗体。本领域的人员应当了解，结合分子对成员可根据本文所述被用于标记之外的用途。
本领域的人员应当了解，一种结合分子对的成员也可以是另一种结合分子对的成员。例如，抗原(第一部分)可结合于第一抗体(第二部分)，该抗体反过来可以是第二抗体(第一部分)的抗原。应当了解，这样的情况允许第一部分通过第二部分与第三部分的间接结合，所述第二部分是另两种部分的结合分子对成员。
本领域的人员应当了解，结合分子对的成员也可能根据上文所述包含标记物。还应当了解，这实现了一种标签通过结合包含标记物的结合分子对成员而被间接标记。如刚才所述，作为结合分子对成员的标签与标记物的连接在此被称为“间接标记”。
“表面底物结合分子”或“结合标签”即语法上的等价物指的是对特定表面底物具有结合亲和力的分子，其底物一般是结合分子对的一员，其施用于、并入或在其他情况下连接于表面。适当的表面底物结合分子和其表面底物包括但不限于多聚组氨酸(多聚His)或多聚组氨酸-甘氨酸(多聚his-gly)以及镍金属底物；谷胱甘肽S转移酶标签及其抗体底物(Pierce Chemical有售)；流感病毒HA标签多肽及其抗体12CA5底物【Field等人，Mol.Cell.Biol.，8：2159-2165页(1988年)】；c-myc标签和对其的8F9、3C7、6E10、G4、B7和9E10抗体【Evan等人，Molecular and Cellular Biology，5：3610-3616页(1985年)】；以及单纯疱疹病毒糖蛋白D(gD)标签及其抗体底物【Paborsky等人，ProteinEngineering，3(6)：547-553页(1990年)】。一般情况下，用于本发明的表面结合底物分子包括但不限于结合镍底物的多聚组氨酸结构(His标签)、结合包含抗体的表面底物的抗原、结合亲和素底物的半抗原(如生物素)以及结合包含钙调素的表面底物的CBP。
在一些实施方案中，所述可激活元件根据本文所述通过在该可激活元件中并入标记物而被标记。例如，可激活元件可在细胞中标记，其通过将该细胞与包含放射性同位素的氨基酸进行培养而进行。所述被标记可激活元件的测量可使用，例如质谱。
其他激活状态指示剂
用于本发明的其他激活状态指示剂是通过显示这些激活的结果而实现对激活的检测的指示剂。例如，底物的磷酸化可被用于检测负责该底物的磷酸化的激酶的激活。类似地，底物的切割可被用作负责此类切割的蛋白酶的指示剂。允许将这样的迹象与可检测信号进行关联的方法在本领域中是为人所熟知的，所述可检测的信号例子如上文有关结合元件描述中的标记物和标签。例如，底物的切割可导致淬灭基团的去除并且由此使可检测信号从此前被淬灭的标记物中产生。另外，结合元件可被用于被标记的可激活元件的分离，其可随后使用本领域中已知的工艺进行检测，例如，使用质谱。
检测
在对本发明的方法进行实施中，所述一种或更多种可激活元件的状态的检测可由人员承担，例如实验室中的技术员。或者，所述一种或更多种可激活元件的状态的检测可使用自动化系统进行。在任一情况下，用于根据本发明的方法的用途的一种或更多种可激活元件的状态的检测可根据本领域所广为接受的标准工艺和方案而实施。
一种或更多种可激活元件可通过任何对目的可激活元件进行检测和/或定量的方法进行检测和/或定量。这些方法包括，放射免疫分析(RIA)或酶联免疫吸附分析(ELISA)、免疫组织化学、使用或不使用共聚焦显微镜法的免疫荧光组织化学、反相分析、均相酶免疫测定，以及相关的非酶学工艺、Western印迹法、全细胞染色、免疫电子显微镜法、核酸扩增、基因阵列、蛋白质阵列、质谱、膜片钳技术、二维凝胶电泳、差示凝胶电泳、基于微球的多元蛋白质分析、无标记物细胞分析以及流式细胞仪等。美国专利第4,568,649号描述了配体检测系统，其利用了闪烁计数法。这些工艺特别地有用于蛋白质参量的修饰。可使用荧光或在其他情况下使用带标签的报告者分子获取蛋白质和其他细胞决定性因素的细胞读出值。流式细胞仪方法可用于测量细胞内参量。参见美国专利第10/898,734号以及Shulz等人，Current Protocols inImmunology，2007年，78：8.17.1-20页，其全文以引用的方式并入本文。
在一些实施方案中，本发明提供了用于测定单细胞的可激活元件的激活水平方法。所述方法可包括通过流式细胞仪技术根据至少两种可激活元件的激活水平而对细胞进行的分析。结合元件(如激活状态特异性抗体)被用于根据可激活元件的激活水平对细胞进行分析，并可根据下文所述被检测。结合元件还可被用于分离可激活元件，其可随后通过本领域已知的方法进行分析。或者，非结合元件系统可根据上文所述被用于本文所述的任意系统。
当使用本发明的方法和组合物中的荧光标记组分时，可以理解，不同类型的荧光监测系统，如细胞计数测量设备系统，可被用于实施本发明。在一些实施方案中，使用了流式细胞计数系统或用于高通量筛选的系统，如96孔或更多孔的微滴度平板。实施对荧光材料的分析的方法在本领域中为人所熟知并被描述于，例如，Lakowicz，J.R.，Principlesof Fluorescence Spectroscopy，New York：Plenum Press(1983年)；Herman，B.，Resonance energy transfer microscopy，in：FluorescenceMicroscopy of Living Cells in Culture，Part B，Methods in Cell Biology，vol.30，Taylor，D.L.和Wang，Y.-L.编，San Diego：Academic Press(1989年)，第219-243页；Turro，N.J.，Modern Molecular Photochemistry，Menlo Park：Benjamin/Cummings Publishing Col，Inc.(1978年)，第296-361页。
样品中的荧光可使用荧光光度计进行测量。一般情况下，来自激发源的具第一波长的激发辐射通过激发光学设备。所述激发光学设备导致所述激发辐射对所述样品进行激发。与之相应，所述样品中的荧光蛋白质进行发射照射，其具有不同于所述激发波长的波长。收集光学设备随后收集来自所述样品的发射光。所述仪器可包括温度控制器以在被扫描时将温度维持于特定温度。根据一个实施方案，多轴转换台对载有多种样品的微滴度平板进行移动用以定位待曝光的不同孔。所述多轴转换台、温度控制器、自动对焦功能以及与成像和数据收集相关的电子设备可通过经适当编程的数字计算机进行管理。所述计算机可将分析期间所收集的数据转换成另一种格式以用于呈现。一般情况下，可使用已知的机器人系统和组件。
也可使用其他检测荧光的方法，例如，量子点法(例如，参见Goldman等人，J.Am.Chem.Soc.(2002年)124：6378-82页；Pathak等人，J.Am.Chem.Soc.(2001)123：4103-4页；以及Remade等人，Proc.Natl.Sci.USA(2000)18：553-8页，各文献均以引用的形式并入本文)以及共聚焦显微镜法。一般情况下，流式细胞仪涉及个体细胞在激光束的光路中经过。通过光电倍增管对所述光束和任何结合于所述细胞或在其中存在的荧光分子的散射进行检测以产生可读取的输出值，如大小、粒度或荧光强度。
发明的方法的检测、分选或分离步骤可需要荧光激活细胞分选(FACS)工艺，其中FACS被用于从包含特定表面标记物的群体中选择细胞，或者所述选择步骤可需要使用磁性反应颗粒作为支持物用于目标细胞捕获和/或背景消除。多种FACS系统在本领域中是已知的并且可被用于本发明的方法(参见，例如，于1999年4月16日提交的WO99/54494；于2001年7月5日提交的美国中请书第20010006787号，其均明确地以引用的形式并入本文)。
在一些实施方案中，FACS细胞分选器(例如FACSVantageTM CellSorter，Becton Dickinson Immunocytometry Systems，San Jose，Calif.)被用于对可用作调节剂或用作参比细胞群体的细胞进行分选和收集。在一些实施方案中，所述调节剂或参比细胞首先接触经荧光标记的针对特定的元件的结合元件(如抗体)。在这样的实施方案中，在各个细胞上结合的结合元件的量通过将包含该细胞的液滴通过所述细胞分选器而进行测量。通过对包含所述阳性细胞的液滴施加电磁荷，所述细胞可从其他细胞分离开。所述阳性选定细胞可随后被收集于无菌的收集管中。这些细胞分选方法被详细描述于，例如，FACSVantageTM训练手册，特别参见3-11至3-28以及10-1至10-17章节，该手册全文以引用的形式并入本文。
在另一个实施方案中，使用基于可激活元件的某种异构型的存在的细胞磁性分离对阳性细胞进行分选。在这样的分离工艺中，进行阳性选择的细胞首先接触特异性结合元件(如，结合可激活元件某种异构型的抗体或试剂)。所述细胞随后接触可回收颗粒(如，磁性反应颗粒)，该颗粒连接于结合所述特异性元件的试剂。所述细胞-结合元件-颗粒复合物可随后与非阳性或未标记细胞进行物理分离，例如，使用磁场进行分离。当使用磁性反应颗粒之时，可使用磁场将所述阳性或经标记细胞保留于容器中，而所述阴性细胞被去除。这些以及类似分离方法被描述于，例如，Baxter Immunotherapy Isolex培训手册，其全文以引用的方式并入本文。
在一些实施方案中，提供了用于对单细胞的受体元件激活状态特征进行测定的方法。所述方法包括提供细胞群体并且通过流式细胞仪对所述细胞群体进行分析。在优选的情况下，根据至少一种可激活元件的激活水平对细胞进行分析。在一些实施方案中，根据至少两种可激活元件的激活水平对细胞进行分析。
在一些实施方案中，多种可激活元件激活状态抗体被用于对多种元件的激活水平同时进行测定。
在一些实施方案中，通过流式细胞仪根据至少两种元件的激活水平进行的细胞分析与对其他流式细胞仪可读输出值的测定相组合，如表面标记物的存在、粒度和细胞大小，从而提供多种元件的激活水平与可被流式细胞仪对单细胞进行测量的其他细胞特征之间的相关性。
应当了解的是，本发明还提供了元件簇集事件在信号传导中的次序测定。特别地，本发明使技术人员得以根据簇集水平与单细胞内多种元件的激活之间的相关性而构建元件簇集与激活层级。通过在单一时间点将细胞或细胞群体的激活水平与参照进行对比或通过所在多个时间点对比细胞以观察亚群体在其他细胞之中的显现而完成该次序测定。
应当了解的是，这些方法提供了在细胞群体中对于人为因素的和刺激性病状的不同信号传导级联所进行的辨识，所述细胞群体的例子如外周血单核细胞或初始和记忆淋巴细胞。
在必要的情况下，细胞被分散于单细胞悬液之中，例如通过用适当的蛋白酶进行的酶学消化，该蛋白酶的例子如胶原酶、分散酶等等。适当的溶液被用于分散或悬浮。这些溶液一般应是平衡盐溶液，如生理盐水、PBS、汉克平衡盐缓冲液(Hanks balanced salt solution)等，其方便地补充以胎牛血清或其他天然因子，其结合于低浓度的可接受缓冲液，该浓度一般介于5-25mM。便用的缓冲液包括HEPES1磷酸缓冲液、乳酸盐缓冲液等。所述细胞可被固定，例如，使用3％多聚甲醛而进行，并且通常经增透化，例如使用冰冷甲醇；使用含0.1％皂角苷、3％BSA的HEPES缓冲的PBS进行；通过在-200C在丙酮内浸没2分钟而进行；以及本领域已知的类似方法并且根据本文所述的方法而进行。
在一些实施方案中，一种或更多种细胞被置于96孔平板或其他市售的多孔平板的孔中。在一个替代性的实施方案中，所述反应混合物或细胞处于细胞计数测量仪器之中。可用于本发明的其他多孔平板包括但不限于，384孔平板和1536孔平板。可用于本发明的其他放置所述反应混合物和细胞的器皿对于技术人员应是很明了的。
用于对可激活元件的激活水平或活性的进行检测分析的组分或对这些激活水平或活性进行调控的组分的加入可顺序进行或在适用于所分析的活性的条件下以预定的次序或分组进行。这些条件在本文有所描述并在本领域中是已知的。另外，进一步的指导在下文提供(例如，参见实施例)。
在一些实施方案中，使用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)对可激活元件的激活水平进行测量。已被标记以特异性元件的结合元件与所述可激活元件进行结合。当所述细胞被引入所述ICP之时，其被雾化(atomized)和离子化。测量了所述细胞的元件组合物，其包括与所述可激活元件相结合的经标记的结合元件。对应于所述结合元件之上的标记物的信号的存在和强度显示了该细胞中的可激活元件的水平(Tanner等人，Spectrochimica Acta Part B：Atomic Spectroscopy，2007年3月，62(3)：188-195页)。
本领域的技术人员应当了解的是，本方法和组合物可用于除流式细胞仪分析之外的多种其他分析形式。例如，类似于DNA芯片的芯片可被用于本发明的方法。用于将核酸以预设阵列印迹于芯片之上的阵列仪和方法是已知的。另外，蛋白质芯片和用于合成的方法是已知的。这些方法和材料可经适应性调整用于将激活状态结合元件以预设阵列附着于芯片之上。在一些实施方案中，这样的芯片包含多种元件激活状态结合元件并且被用于对细胞表面存在的元件进行元件激活状态特征测定。参见美国专利第5,744,934号。在一些实施方案中，使用了微流控成像细胞计数仪(Sun等人，Cancer Res；70(15)2010年8月1日)。
在一些实施方案中，可使用共聚焦显微镜法以检测个体细胞的激活特征。共聚焦显微镜法依赖于对来自经空间滤波的个体样品点的光进行系列收集，其随后经电子处理以渲染所述样品的放大图像。共聚焦显微镜法所涉及的信号加工具有在单细胞中检测经标记的结合元件的附加能力，因此在本实施方案中所述细胞可被标记以一种或更多种结合元件。在一些实施方案中，与共聚焦显微镜法联合使用的结合元件是偶联于荧光标记物的抗体，但是诸如其他蛋白质或核酸这样的其他结合元件也是可能的。
在一些实施方案中，本发明的方法和组合物可结合“细胞内Western分析”进行使用。在这样的分析中，细胞使用标准组织培养工艺最初生长于标准的组织培养瓶中。一旦生长至最佳汇合度，除去所述生长培养基并对细胞进行清洗和胰酶消化。所述细胞可随后进行计数并且将足以转移适量细胞的体积分装进入微孔平板(例如，NuncTM 96 MicrowellTM平板)。随后在完全培养基中将所述各个孔生长至最佳汇合度，在此基础上将所述培养基置换为无血清培养基。在此时刻对照是未处理的，但是实验组孔被与调节剂进行孵育，如EGF。与所述调节剂进行孵育之后，细胞被固定并且使用针对受测激活元件的经标记抗体进行染色。一旦所述细胞经过标记，使用诸如Odyssey Imager(LiCor，Lincoln Nebr.)这样的成像仪对所述平板进行扫描，该扫描使用Odyssey Operator′s Manualv1.2中所描述的工艺进行，其全文以引用的形式并入本文。通过对所述多孔平板的扫描而获取的数据可被分析并且根据下文所述测定激活特征。
在一些实施方案中，所述测定通过高压液相色谱(HPLC)进行，如反相HPLC，并且在另一个的方面中，所述检测通过质谱进行。
这些设备可安装于无菌操作台或通风橱中，或包装入自含式系统之中，以用于细胞在多孔平板或试管中的生长和转化或用于危险操作。所述或细胞可在受控生长条件下生长，该生长条件具有温度、湿度和气体控制以用于时间系列的活细胞分析。细胞的自动化转化和自动化克隆挑取设备可辅助所需细胞的快速筛选。
流式细胞仪或毛细管电泳配备可被用于磁性和其他微珠、颗粒、细胞和生物体的个体捕获。
具备可变性的硬件和软件实现了对多种用途的设备适应性。软件程序模块实现了方法的创建、修改和运行。系统诊断模块实现了设备的调试、校正链接和运动操作。定制工具、实验器材以及液体、颗粒、细胞和生物体转移模式使得多种应用可被实施。数据库实现了方法和参量的存储。机器人和计算机界面实现了设备间的通讯。
在一些实施方案中，本发明的方法包括使用液体操作组件。所述液体操作系统可包含机器人系统，其包含任意数量的组件。另外，本文所述的任意或所有步骤可被自动化进行，因此，例如，所述系统可被完全或部分自动化。
本领域的技术人员所应了解的是，存在广泛多种的组件可被使用，其包括但不限于，一种或更多种机器人手臂；用于微平板定位的平板操作器(plate handler)；用于取下非交叉污染平板的板盖或将其复位的自动化板盖或板帽操作器；用于使用可抛式吸头进行样品分装的吸头装配器；用于样品分装的可洗式吸头装配器；96孔装样模块；经冷却的试剂架；微滴度平板微移液吸头位(可选地经冷却)；用于平板和吸头的堆叠塔；以及计算机系统。参见美国专利申请书第61/048,657号，其全文以引用的方式并入本文。
完全的机器人化或微流控系统包括自动化液体-、颗粒-、细胞-、或生物体-操作，其包括高通量的微移液(pipetting)以实施筛选应用的所有步骤。这包括液体、颗粒、细胞和生物体操作，如微移液吸头的吸取、悬浮、混合、稀释、清洗、精确体积转移、回收和抛弃；以及等体积的重复性移液以用于从单样品吸取物中进行多次递送。这些操作是无交叉污染的液体、颗粒、细胞和生物体转移。该设备实施将微平板向滤膜、薄膜和/或下级平板(daughter plates)的自动化复制，高密度转移、全平板系列稀释以及高体积操作。
在一些实施方案中，使用了对所述分析组分具有特异性的化学衍生的颗粒、平板、卡盒、试管、磁性颗粒或其他固相介质。微平板、试管或任意固相介质的结合表面包括非极性表面、高度极性表面、以经修饰葡聚糖包埋以促进共价结合、抗体包埋、亲和介质以结合融合蛋白质或肽、固定于表面的蛋白质如重组蛋白质A或G、核苷酸树脂或包衣，以及本发明可用的其他亲和性介质。
在一些实施方案中，用于多孔平板、多试管、固定器、卡盒、微管、深孔平板、微离心管、冷冻瓶、方孔平板、滤膜、芯片、光线、微珠和其他固相介质的平台或具有多种体积的平台被容纳于可升级的模块平台之中以用于额外的容积。该模块平台包括变速轨道振荡器，以及用于源样品、样品和试剂稀释物的多位工作平台、分析平板、样品和试剂储池、微移液吸头以及活动的洗涤站。在一些实施方案中，本发明的方法包括使用使用酶标仪(plate reader)。参见美国专利申请书第048,657号。
在一些实施方案中，热循环仪和热控系统被用于稳定诸如受控模块或平台这样的热交换设施的温度以提供对样品孵育在0℃到100℃之间的精确温控。
在一些实施方案中，具有单或多磁性探针、亲和探针或微量移液器的可交换的微移液接头(单通道或多通道)对所述液体、颗粒、细胞和生物体进行机器人化地操控。多孔或多管磁性分离器或平台以单样品或多样品的形式操控液体、颗粒、细胞或生物体。
在一些实施方案中，所述仪器设备应包括检测器，其可以是广泛多种的不同检测器，这取决于所述标记物和分析方法。在一些实施方案中，可用的检测器包括具有多通道荧光的显微镜；提供具备单波长和双波长终点和动力学能力的荧光、紫外和可见光分光光谱检测的、荧光共振能量转移(FRET)、发光、淬灭、双光子激发和密度再分布的酶标仪；CCD照相机以捕获和将数据和图像转化成为可定量形式；以及计算机工作站。
在一些实施方案中，所述机器人设施包含中央处理器，其通过总线与内存和一组输入/输出设备(如键盘、鼠标、显示器、打印机等)进行通讯。再一次，如下文所述，其可以添加于本发明的复合设备的CPU之上或对其替代。中央处理器、内存、输入输出设备以及总线之间的基本相互作用在本领域中是已知的。因此，根据准备运行的实验，多种不同的程序方法可存储于所述CPU内存之中。参见美国专利申请书第61/048,657号，其全文以引用的方式并入本文。
这些机器人液体操作系统可利用任意数量的不同试剂，包括缓冲液、试剂、样品、清洗液、分析组分如标记物探针等。
可通过计算机程序实施上述任何步骤，所述程序包含存储于计算机可读介质上的计算机可执行逻辑。例如，所述计算机程序可执行以下功能的数种或全部：(i)将不同的细胞群体暴露于一种或更多种调节剂、(ii)将不同的细胞群体暴露于一种或更多种结合元件、(iii)检测一种或更多种可激活元件的激活水平、以及(iv)根据所述不同群体中的一种或更多种可激活元件的激活水平作出诊断或预后。
所述计算机可执行逻辑可在任何计算机中工作，其可以示各种任意类型的通用计算机，如个人计算机、网络服务器、工作站或现今或以后开发出的其他计算机平台。在一些实施方案中，描述了包含计算机可用介质在内的计算机程序产品，所述介质包含存储于其中的所述计算机可执行逻辑(计算机软件程序，包括程序代码)。所述计算机可执行逻辑可被处理器执行，使得所述处理器得以实施本文所述的功能。在其他的实施方案中，某些功能主要在硬件使用中发挥辅助作用，例如硬件状态机的使用。对所述硬件状态机进行的用以实施本文所述的功能的辅助对于相关领域的技术人员是很明了的。
所述程序可提供测定个体状态的方法，其通过获取反映了参比细胞群体中的一种或更多种可激活元件的激活水平的数据而进行。
病状
本发明的方法可应用于个体中的任意病状，所述病状部分地或完全地涉及细胞中的变化生理状态，由该变化生理状态显示和/或由其产生。术语“生理状态”包括细胞的机械性、物理性和生物化学功能。在一些实施方案中，通过对来自不同群体(如，不同细胞网络)的细胞内细胞途径的至少一种细胞组分的特征进行测量来测定细胞的生理状态。细胞途径在本领域中为人所熟知。在一些实施方案中，所述细胞途径是信号传导途径。细胞途径在本领域中也是为人所熟知的(例如，参见HunterT.，Cell 100(1)：113-27页(2000年)；Cell Signaling Technology，Inc.，2002年目录，Pathway Diagrams第232-253页；Weinberg，The biology ofCancer，第6章，2007年；以及Blume-Jensen和Hunter，Nature，卷411，2001年5月17日，第355-365页)。涉及或特征在于改变的生理状态的病状可被容易地辨识，例如，根据本文指导通过测定来自不同细胞群体的细胞中的一种或更多种可激活元件的状态而进行。
在本发明的特定实施方案中，所述病状是肿瘤、免疫性或造血机能的病状。在一些实施方案中，所述肿瘤、免疫性或造血机能的病状选自实体瘤，诸如包括脑部在内的头部和颈部癌症、甲状腺癌、乳腺癌、肺癌、间皮瘤、生殖细胞瘤、卵巢癌、肝癌、胃癌、结肠癌、前列腺癌、胰腺癌、黑色素瘤、膀胱癌、肾癌、前列腺癌、睾丸癌、宫颈癌、子宫内膜癌、肌肉瘤、平滑肌肉瘤及其他软组织肉瘤、骨肉瘤、尤文氏肉瘤、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、肾母细胞瘤、和神经母细胞瘤，败血症、过敏性疾病和障碍，包括但不限于过敏性鼻炎、过敏性结膜炎、过敏性哮喘、过敏性湿疹、过敏性皮炎以及食物过敏，免疫缺陷、包括但不限于重症联合免疫缺陷病(SCID)、高嗜酸性粒细胞增多综合征、慢性肉芽肿病、I和II型白细胞粘附缺陷、高IgE综合征、契-东综合征、中性粒细胞增多症、嗜中性白血球低下、成形不完全、丙种球蛋白血症、高IgM综合征、DiGeorge/Velocardial面部综合征和干扰素γ-Th1途径缺陷，自体免疫性疾病和免疫功能失调疾病、包括但不限于类风湿关节炎、糖尿病、系统性红斑狼疮、Grave氏病、Graves眼病、克罗恩病、多发性硬化症、牛皮癣、系统性硬化症、甲状腺肿大和甲状腺肿(桥本氏甲状腺炎、淋巴细胞性甲状腺肿)、斑秃、自体免疫性心肌炎、硬化萎缩苔藓、自体免疫性葡萄膜炎、阿狄森氏病、萎缩性胃炎、重症肌无力、特发性血小板减少性紫癜、溶血性贫血、原发性胆汁性肝硬化、韦格纳肉芽肿、结节性多动脉炎、和发炎性肠道疾病、移植排斥反应和缘于对传染性微生物或环境抗原的过敏反应的组织破坏，以及造血机能病状，包括但不限于非霍奇金淋巴瘤淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤或其他淋巴瘤、急性或慢性白血病、红血球增多、血小板增多、多发性骨髓瘤或浆细胞疾病，如淀粉样变和Waldenstrom氏巨球蛋白血症、骨髓增生异常疾病、骨髓增生性疾病、骨髓纤维化、或非典型免疫性淋巴细胞增生。在一些实施方案中，所述肿瘤或造血机能病状是非B细胞系来源的，例如急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、非B细胞急性淋巴细胞性白血病(ALL)、非B细胞淋巴瘤、骨髓增生异常、骨髓增殖失调、骨髓纤维变性、红血球增多、血小板增多或非B细胞非典型性免疫性淋巴细胞增生、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、B淋巴细胞系白血病、B淋巴细胞系淋巴瘤、多发性骨髓瘤或浆细胞失调如淀粉样变或Waldenstrom氏巨球蛋白血症。
在一些实施方案中，所述肿瘤或造血机能病状是非B细胞系来源的。非B细胞系来源的肿瘤或造血机能病状的实例包括但不限于急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、非B细胞急性淋巴细胞性白血病(ALL)、非B细胞淋巴瘤、骨髓增生异常、骨髓增殖失调、骨髓纤维变性、红血球增多、血小板增多和非B细胞非典型性免疫性淋巴细胞增生。
在一些实施方案中，所述肿瘤或造血机能病状是B细胞来源的失调或B细胞系来源的失调。B细胞来源的或B细胞系来源的肿瘤或造血机能病状的实例包括但不限于慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、B淋巴细胞系白血病、B淋巴细胞系淋巴瘤、多发性骨髓瘤和浆细胞失调，其包括淀粉样变和Waldenstrom氏巨球蛋白血症。
本发明范围内的其他病状包括但不限于，癌症如神经胶质瘤、肺癌、结肠癌和前列腺癌。针对多种癌症已经描述了特定信号传导途径的变化，其包括前列腺癌中的PTEN的缺失以及所导致的Akt信号传导的激活(Whang Y E.Proc Natl Acad Sci USA 1998年4月28日；95(9)：5246-50页)，前列腺癌中的IGF-1的增强表达(Schaefer等人，ScienceOctober 9 1998年，282：199a)，神经胶质癌中的EGFR过表达以及所导致的ERK激活(Thomas C Y.Int J Cancer 2003年3月10日；104(1)：19-27页)，乳腺癌中的HER2的表达(Menard等人，Oncogene.2003年9月29，22(42)：6570-8页)，以及结肠癌中的APC突变和激活的Wnt信号途径(Bienz M.Curr Opin Genet Dev 1999年10月，9(5)：595-603页)。
涉及改变的生理状态的非癌症疾病也被本发明所涵盖。例如，已经表明糖尿病涉及其所基于的信号传导变化，即，对胰岛素的抗性以及对通过IRS的下游信号传导激活的失灵(Burks D J，White M F.Diabetes，2001年2月；50，Suppl 1：S140-5页)。类似地，心血管疾病已被表明涉及到心脏细胞肥大，其涉及诸如PKC家族这样的多种途径(Malhotra A.Mol Cell Biochem 2001年9月；225(1-)：97-107页)。已知诸如类风湿性关节炎这样的炎症涉及趋化因子受体以及紊乱的下游信号传导(D′Ambrosio D.J Immunol Methods 2003年2月；273(1-2)：3-13页)并且也被本发明所涵盖。移植排斥、感染(如病毒或细菌感染)以及疫苗状态响应(vaccines state responses)也被本发明所涵盖。可被本文所述的方法所测量的疫苗状态响应的实例被描述于美国临时专利申请第61/327,347号，出于所有目的其全文以引用的形式并入本文。本发明并不限于目前已知的涉及改变的细胞功能的疾病，而且包括今后被证明涉及生理变化或异常的疾病。
试剂盒
在一些实施方案中，本发明提供了试剂盒。本发明提供的试剂盒可包含一种或更多种本文所述的状态特异性结合元件，诸如磷酸化特异性抗体。试剂盒可包括其他有用于本发明的试剂，诸如调节剂、固定剂、容器、平板、缓冲液、治疗剂、说明书等。
在一些实施方案中，所述试剂盒包含一种或更多种磷酸化特异性抗体，其特异于选自下列的蛋白质：PI3-激酶(p85、p110a、p110b、p110d)、Jak1、Jak2、SOC、Rac、Rho、Cdc42、Ras-GAP、Vav、Tiam、Sos、Dbl、Nck、Gab、PRK、SHP1、and SHP2、SHIP1、SHIP2、sSHIP、PTEN、Shc、Grb2、PDK1、SGK、Akt1、Akt2、Akt3、TSC1和2、Rheb、mTor、4EBP-1、p70S6激酶、S6、LKB-1、AMPK、PFK、乙酰辅酶A羧化酶、DokS、Rafs、Mos、Tp12、MEK1/2、MLK3、TAK、DLK、MKK3/6、MEKK1、4、MLK3、ASK1、MKK4/7、SAPK/JNK1，2，3、p38s、Erk1/2、Syk、Btk、BLNK、LAT、ZAP70、Lck、Cbl、SLP-76、PLCγ1、PLCγ2、STAT1、STAT 3、STAT 4、STAT 5、STAT 6、FAK、p130CAS、PAKs、LIMK1/2、Hsp90、Hsp70、Hsp27、SMADs、Rel-A(p65-NFKB)、CREB、组蛋白H2B、HATs、HDACs、PKR、Rb、细胞周期蛋白D、细胞周期蛋白E、细胞周期蛋白A、细胞周期蛋白B、P16、p14Arf、p27KIP、p21CIP、Cdk4、Cdk6、Cdk7、Cdk1、Cdk2、Cdk9、Cdc25、A/B/C、Abl、E2F、FADD、TRADD、TRAF2、RIP、Myd88、BAD、Bcl-2、Mcl-1、Bcl-XL、胱天蛋白酶2、胱天蛋白酶3、胱天蛋白酶6、胱天蛋白酶7、胱天蛋白酶8、胱天蛋白酶9、IAP、Smac、胞衬蛋白、肌动蛋白、Src、Lyn、Fyn、Lck、NIK、IκB、p65(RelA)、IKKα、PKA、PKCα、PKCβ、PKCθ、PKCδ、CAMK、Elk、AFT、Myc、Egr-1、NFAT、ATF-2、Mdm2、p53、DNA-PK、Chk1、Chk2、ATM、ATR、β联蛋白、CrkL、GSK3α、GSK3β以及FOXO。在一些实施方案中，所述试剂盒包含一种或更多种磷酸化特异性抗体，其特异于选自下列的蛋白质：Erk、Syk、Zap70、Lck、Btk、BLNK、Cbl、PLCγ2、Akt、RelA、p38、S6。在一些实施方案中，所述试剂盒包含一种或更多种磷酸化特异性抗体，其特异于选自下列的蛋白质：Akt1、Akt2、Akt3、SAPK/JNK1，2，3、p38s、Erk1/2、Syk、ZAP70、Btk、BLNK、Lck、PLCγ、PLCγ2、STAT1、STAT3、STAT4、STAT5、STAT6、CREB、Lyn、p-S6、Cbl、NF-κB、GSK3β、CARMA/Bcl10以及Tcl-1。
本发明的状态特异性元件可被直接地或间接地偶联于固相支持物以及偶联于可检测基团。所述试剂还可包含辅助剂，诸如缓冲剂和稳定剂，如多聚糖等。在必要的情况下，所述试剂盒可进一步包含所述可检测基团所属的信号发生系统的其他成员(例如，酶底物)、用于在测试中减低背景干扰的试剂，对照试剂、实施测试的仪器等。所述试剂盒可以任何适当的形式包装，一般所有组件与用以实施该测试的打印说明页包装于同一容器内。
这样的试剂盒允许通过诸如IHC和流式细胞仪这样的敏感性细胞分析方法对可激活元件的检测，其适用于临床检测、预后以及对来自患有涉及变化的途径信号传导的患者的细胞和组织的筛选，如白血病患者。
这些试剂盒可另外包含一种或更多种治疗剂。所述试剂盒可进一步包含用于对生理状态的数据进行分析的软件包，该软件包可包含参比特征以用于测试特征的对比。
这些试剂盒还可包含信息，诸如科技文献参考、包装插页材料、临床试验结果、和/或这些资料的概要等，其表明或介绍所述组合物的活性和/或优点，并且/或者其描述了剂量、施用、副作用、药物相互作用或其他对医疗保健人员有用的信息。这些信息可基于多种研究的结果，例如，使用涉及体内模型的实验动物进行的研究和基于人类临床试验的研究。本文所述的试剂盒可向医疗保健人员供应、销售和/或推广，该医疗保健人员包括医师、护士、药剂师、处方官员(formulary officials)等。在一些实施方案中，试剂盒还可直接对消费者进行销售。
实施例
实施例1：AML患者的分析
患者样品：可对来自患者的成组新鲜样品或冻存样品进行分析。所述组由来自AML患者的外周血单核细胞(PBMC)样品或骨髓单核细胞(BMMC)样品组成。所有患者应被征询以同意进行采集以及将其样品被用于经伦理审查委员会(IRB)批准的实验目的。所有临床数据被匿名化(de-identified)以遵循健康保险便利和责任法案(HIPAA)的规定。样品纳入标准可要求在起始诱导化疗之前的时间点进行采集，根据法-美-英分类器(FAB)标准将AML分类为M0至M7(M3除外)，以及适当临床评注的可用(例如，一轮或二轮诱导化疗后的疾病响应)。诱导化疗可由至少一轮标准的基于阿糖胞苷的诱导治疗组成(即，柔红霉素60mg/m2×3天，阿糖胞苷100-200mg/m2连续灌注×7天)；在一轮诱导治疗后测量响应。标准临床和实验室标准可被用于定义患者样品中的完全响应(CR)。获自患者的不符合CR标准的白血病样品以及或者获自在诱导治疗期间死亡的患者的样品被认为对于原始分析是不完全响应(NR)。
细胞网络特征分析：细胞网络特征分析涉及在处于基线的以及受到多种调节剂扰动后的不同细胞群体中测量蛋白质水平的表达以及它们的翻译后的磷酸化修饰。可被分析的群体包括骨髓白血病细胞、B细胞、T细胞、树突细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞。也可分析诸如内皮细胞这样的其他细胞。
途径的“节点”被定义为在存在或缺乏特定治疗剂的情况下的特定蛋白质组读出值的组合。信号传导蛋白质水平以及细胞表面标记物的表达(包括细胞系标记物、膜受体和药物转运体)通过多参量流式细胞仪使用针对所述靶蛋白的荧光团偶联的抗体进行检测。使用多种调节剂的多节点(包括表面受体和转运体)可在所述两种研究中进行估测。
对于将每一患者样品归类为可估测的，最低要使用100,000个活细胞并且在目的控门中为每被门控样品500个细胞。
在PBS，10％FBS和2mM EDTA中将冻存细胞在37℃解冻、清洗并离心。所述细胞在RPMI细胞培养基，1％FBS中被重悬浮、过滤并且清洗，并且随后使用Live/Dead Fixable Aqua Viability Dye(Invitrogen，Carlsbad，CA)进行染色以区分无活力细胞。所述活力细胞被重悬浮于RPMI，1％FBS中，分装成为100,000个细胞/条件，并且在进行基于细胞的功能分析或对表型标记物染色之前在37℃静置1-2小时。各条件可包含2至5种表型标记物(如CD45、CD33)，最多达3种细胞内染色或者最多达3种另外的表面标记物。
在37℃将细胞与调节剂孵育3-15分钟，随后在37℃使用1.6％的多聚甲醛(终浓度)进行10分钟固定离心并且使用100％的冰冷甲醇进行增透化并保存于-20℃。对于功能性凋亡分析，将细胞与细胞毒性药物(即，依托泊苷、Ara-C和柔红霉素)进行24小时孵育，随后在固定和增透纸之前使用Live/Dead Fixable Aqua Viability Dye(Invitrogen，Carlsbad，CA)进行再染色以区分无活力细胞，使用FACS缓冲液(PBS，0.5％BSA，0.05％NaN3)清洗、离心并且使用偶联于荧光染料的针对表面抗原(CD33、CD45)和所述信号传导蛋白质靶的抗体(BectonDickenson-Pharmingen，San Diego，California)进行染色。
数据获取和细胞计数分析：使用FACS DIVA软件在LSR II和CANTO II流式细胞仪(BD)上获取数据。对于所有分析，根据FSC(前向角散射)、SSC(侧向角散射)和Amine Aqua Viability Dye测量来排除死亡细胞和碎片。白血病细胞被辨识为缺乏成熟淋巴细胞(CD45++、CD33-)特征的细胞以及符合与骨髓白血病细胞一致的CD45和CD33对应直角光散射特征的细胞。使用本领域已知的标记物辨识其他细胞群体。
统计分析和分层节点选择(stratifying node selection)
a)度量：
对处于目的控门的细胞强度水平的各个节点的中位荧光强度(MFI)进行计算。所述MFI值随后通过将其与多种基线或背景值(即未刺激条件、自体荧光和同位素对照)进行比较而被用于计算多种度量。在这些研究中被计算的是下列度量扫描：(1)基础MFI＝log2(MFI未调控经染色)-log2(MFI门控未染色(自发荧光))，被设计用于测量特定蛋白质在未调控条件下的基础水平；(2)变化倍数MFI＝log2(MFI经调控经染色)-log2(MFI未调控经染色)，是对处于调控条件下的蛋白质的激活状态的变化的测量；(3)总磷酸化MFI＝log2(MFI经调控经染色)-log2(MFI门控未染色(自发荧光))，处于调控条件下的蛋白质的总体水平；(4)超对照倍数MFI＝log2(MFI染色)-log2(MFI对照)，相对于对照抗体染色的表面标记物染色水平；(5)阳性细胞百分比＝具有的表面标记物染色的强度水平超过对照抗体染色的95％的细胞频度的度量。
一种另外的度量被设计用于测量响应于细胞毒性药物的细胞凋亡：(6)象限(Quadrant)＝表达高水平凋亡分子(如，经切割PARP和低水平的p-Chk2)的细胞百分比度量。
低信号传导节点被定义为具有等于I log2(倍数)I＞.15的变化倍数度量或总磷酸蛋白质信号的节点。但是，在本研究中使用将其用作排除标准并非必需。
b)重现性分析
对于每位可估测患者获取了两种或更多种冻存样品管或新鲜样品。所有的样品管均分别处理以获取所述分析重现性。对所述两个数据组之间的各个节点/度量组合进行皮尔森和斯皮尔曼秩相关计算。
c)单变量分析
分析以及跨样品比较所有的细胞群体/节点/度量组合的其区分CR和NR样品的能力。对于各个细胞群体/节点/度量组合均进行了学生t检验和Wilcoxon检验p值的计算。另外，还对受试者工作特征曲线(ROC)下的区域(Hanley和McNeil，Radiology，1982年，Hanley和McNeil，Radiology，1983年，Bewick等人，Critical Care，2004年)进行计算以获取各个节点对于某一给定度量的诊断精确度。该敏感度(CR被正确辨识的患者比例)和特异性(NR被正确辨识的患者比例)数据被以ROC曲线的形式进行作图。随机结果将产生0.5的AUC值。具有100％的特异性和选择性的(生物)标记物应产生1.0的AUC值。所述细胞群体/节点/度量组合针对患者样品之间的差别被独立地进行检验，所述患者样品对于标准诱导治疗的响应是CR对NR。对所述p值不进行用于对多检验进行校正的校正步骤。取而代之的是进行了模拟，其通过对所述临床变量进行过随机变序以估测可能偶然具有显著性的细胞群体/节点/度量组合的数量而进行。对于各个变序随机选择了九个供体(无替换)并且将之指定为CR类别，其余被指定为NR类别。通过对将各个细胞群体/节点/度量组合与所述变序临床变量进行比较而计算了学生t检验的p值。对所述过程进行重复。来自这些模拟的结果随后被用于在不同p值下对被预期偶然具有显著性的细胞群体/节点/度量组合的数量进行估测，并且与根据实际数据被发现具显著性的细胞群体/节点/度量组合的数量的经验p值进行比较。
可使用2.7.0版的统计软件包R进行所述统计分析。
d)节点间相关性
细胞群体/节点/度量组合的所有组对之间的相关性通过计算皮尔森和斯皮尔曼秩相关而获得。
e)节点组合
有潜力在组合中互相补充以改善对治疗响应的预测的精确度的节点也被进行考察。对于小量的数据组，可调整使用用于挑选组合的简明的“角分类器”手段。显现前景的组合还受到对其稳定性的检验，其通过下文所述的自举法进行。
所述角分类器是一种基于规则的算法，其用于使用一种或更多种数字变量(在本研究中定义为节点/度量组合)将对象分成两类(在本情况下是对于治疗的二分应答)。本方法通过对各变量设置阈值并且随后将产生的间隔(如，X＜10或Y＞50)同与(逻辑与)操作(参比)相组合而进行。这产生了一个矩形区间，其被预期涵盖先前被辨识为目标的类别的多数成员(在本研究中为CR或NR样品)。通过在各类之中根据评定转换错误分类率(logit-transformed misclassification rate)对误差标准进行的最小化而选择阈值。所述方法假定所述二个类别(即，对诱导治疗有响应或无响应)倾向于随所使用的变量而具有不同定位，并且在这些变量的单调转换下是无变化的。
装袋算法(bagging)，亦称为自举集成法，被用于对上述统计模型的结果进行交叉验证。自举法复样本从原始数据中抽取。各个分类器，即，细胞群体/节点/度量组合，被用于对所述复样本进行拟合并且随后用于对被排除于所述复样本之外的患者的类别归属关系进行预测。在充分重复进行所述再取样操作之后，各个患者获得了根据使用其他患者进行拟合的分类器而预测的类别归属关系列单。各个患者的列单被简化成为目标类别预测的分数；所述目标类别的成员应具有接近1的分数，不同于其他类别的成员。这样的成组分数，与所述患者的真实分类归属关系一起被用于创建ROC曲线以及计算其AUC。
实施例2：类风湿性关节炎的分析
患者样品：可对来自患者的成组新鲜样品或冻存样品进行分析。所述样品组由来自类风湿患者的淋巴结、滑膜和/或滑膜液的细胞样品组成。所有患者应被征询以同意进行采集以及将其样品被用于经伦理审查委员会(IRB)批准的实验目的。所有临床数据被匿名化(de-identified)以遵循健康保险便利和责任法案(HIPAA)的规定。
样品纳入标准可包含：(i)根据1987年ACR标准作出的类风湿性关节炎诊断，(ii)明确的骨侵蚀，(iii)发病年龄超过18岁，(iv)患者未患有牛皮癣、炎症性肠病或系统性红斑狼疮。
标准的临床和实验室标准可被用于定义能够对患者样品中的治疗响应的RA患者。获自未满足患者标准的患者的RA样品被认为是对于主分析的未完全响应者。可能的治疗的实例包括抗炎药物(NSAID)如乙酰水杨酸(阿司匹林)、萘普生(消痛灵)、布洛芬(Advil、Medipren、Motrin)和依托度酸(Lodine)；皮质甾类；羟化氯喹；柳氮磺胺吡啶(Azulfidine)；金盐如葡糖硫金(Solganal)、金硫丁二酸盐(Myochrysine)和金诺芬(瑞得)；D-青霉胺(Depen、Cuprimine)；免疫抑制药物如氨甲蝶呤(Rheumatrex、Trexall)、硫唑嘌呤(依木兰)、环磷酰胺(Cytoxan)、苯丁酸氮芥(留可然)和环孢菌素(山地明)。
可使用实施例1中所述的方法进行分析的群体包括B细胞、T细胞、树突细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞。也可分析诸如间叶细胞和内皮细胞这样的其他细胞。
尽管本发明的优选实施方案已在本文中进行演示和描述，对于本领域的技术人员而言很明显这些实施方案仅以示例性的方式进行提供。本领域的技术人员现应考虑到在不脱离本发明的情况下的大量的变型、变动和替换现应。应当了解本文所述的本发明实施方案的多种不同的替代方案可被用于实施本发明。目的在于，下列权利要求定义了本发明的范围并且这些权利要求中的方法和结构及它们的等同物因此被涵盖在内。
实施例3：跨多健康个体间的全血中细胞因子JAK/STAT信号传导的细胞和细胞内网络的特征分析：定义“正常”
造血细胞中的异常JAK/STAT信号传导已被证明参与特定的造血和免疫疾病，因此，JAK/STAT信号传导的调控是重要的研究领域。对免疫系统信号传导网络中不同细胞因子的信号传导途径特异性响应和细胞类型特异性响应可引起广泛的生物学结果，这些结果由有限组类的激酶和STAT蛋白质的组合使用而导致。尽管在揭示有关细胞因子信号途径的细胞内机制中取得了一定进展，所述生物学结果可根据所述细胞网络的组合物和激活状态而变换。通过流式细胞仪进行的单细胞网络特征分析(SCNP)允许对诸如未分离的全血这样的异质细胞网络内的细胞内信号传导网络的探索。我们应用SCNP来研究在跨健康人供体(n＝11)的全血中细胞因子诱导的JAK/STAT信号传导，用以1)测量跨多个细胞亚组的信号传导的相对分布；2)测量跨细胞因子和细胞亚组的信号传导激活和解析的动力学；3)在供体中测量其整体信号传导特征的变化程度。我们的目的在于对跨健康个体的“正常”细胞因子响应进行特征分析以作为最终描述异常状态的基础。
方法：根据实施例5中的描述，在37℃下对96孔板中的来自11位健康供体(20-65岁，7位男性，4位女性，8位高加索人种、2位非裔人种、1位东亚人种)的全血中各自分开加入低、中和高剂量的GM-CSF、IFN-α、IL-27和IL-6进行刺激。对各个剂量，在3到45分钟内以6个时间点进行刺激时程。各孔具有终浓度为90％的全血。使用荧光团标记的抗体混合物进行所述SCNP分析以在六个不同细胞群体中同时测量信号传导，所述细胞群体包括嗜中性粒细胞、CD20+B细胞、CD3+CD4+T细胞、CD3+CD4-T细胞(富集CD8)、CD3-CD20-淋巴细胞(富集NK细胞)和CD14+单核细胞。在各个定义细胞群体中以各个实验条件测量磷酸化(p)-STAT1(Y701)、p-STAT3(Y705)和p-STAT5(Y694)的中位荧光强度。
结果：该SCNP分析具有相对高通量并且提供了高内容数据，其相当于通过Western分析进行的19,000个凝胶泳道(11位供体×4种细胞因子×4终浓度×6个时间点×6中细胞亚组×3中p-读出值)。总体上，对于各个经分析细胞类型各细胞因子表现出独特的剂量依赖的信号传导特征(例如，激活/终止动力学、响应级别)，并且在某些情况下，对于相同细胞因子相同细胞亚型内的p-STAT读出值有不同的动力学。例如，IL-6诱导的信号传导仅仅见于CD4+T细胞和单核细胞中，在3分钟时出现峰值p-STAT3水平，继之以在10-15分钟时的p-STAT1和p-STAT5。另外，单核细胞内信号解析在45分钟时降至基础水平，而所述CD4+T细胞表现出持续升高的信号传导，显示出细胞类型特异性调控。与IL-6呈对比，IFN-α刺激激活了全部3种STAT蛋白质，峰值位于10分钟时，其在所有细胞亚组中具有类似的动力学。但是，在单核细胞中IFN-α信号传导解析较快并在45分钟时几乎完全，而在所有其他亚组中所述信号被维持。单核细胞中的有效信号终止也见于GM-CSF→pSTAT5，而嗜中性粒细胞维持了稳定的p-STAT5水平。IL-27在T细胞亚组、B细胞和单核细胞诱导的p-STAT1和p-STAT3峰值位于30分钟时。总体上信号传导特征在跨健康个体中具有显著的同一性。IL-6→p-STAT3在跨时间点和配体浓度下尤为一致，而p-STAT1和p-STAT5表现出较高的变化度。实施例5中提供了更多的结果。
通过观察生理条件(全血)下的细胞网络而进行的细胞信号传导分析允许对复合组织的信号传导状态的更为全面和临床相关的了解。随着众多JAK/STAT靶向小分子化合物进入临床，本研究提供了重要的参比点，用于同信号传导网络进行比较，所述信号传导网络或因病理疾病或因治疗而具有变化。
实施例4：对来自健康供体的外周血单核细胞内的IFN-α信号传导途径进行的单细胞网络特征分析(SCNP)：疾病特征、治疗原则和药物发现的关联
IFN-α的抗病毒和抗肿瘤效果已被用于治疗诸如丙型肝炎(HCV)这样的病毒感染以及多种恶性肿瘤，如毛细胞白血病和黑色素瘤。然而，IFN-α对于这些和其他适应症的广泛应用严重受限于显著的副作用，其可对患者的生活质量造成重大影响。因此，由IFN-α所调控的细胞内信号传导途径的更好了解可指导患者的选择，所述患者所患疾病对该细胞因子具有最佳响应并具可容忍的副作用。特别地，所述信号传导和转录激活(STAT)的转录因子已知在转导IFN-α信号中起关键性作用。单细胞网络特征分析(SCNP)是一种基于多参量流式细胞仪的方法，其可被用于在响应于外部添加的调节剂的个体细胞内对细胞外标记物和细胞内信号传导蛋白质进行同时测量。在此，我们使用SCNP以在来自健康供体的外周血单核细胞(PBMC)内的多细胞亚组中探索信号传导途径。
本研究被设计用于应用SCNP来在来自健康供体的PBNC中产生IFN-α介导的信号传导响应的示图，其重点在于Stat蛋白质。该数据提供了参比以用于使用来自患者样品的PBMC进行的下一步研究，在所述患者样品中IFN-α-介导的信号传导受到异常调控。
方法：通过SCNP在来自12位健康供体的PBMC样品中测量了IFN-α-介导的信号传导响应。通过固定和增透化并继之以与偶联荧光团的抗体进行孵育而对PBMC进行针对流式细胞仪的加工处理，所述抗体识别细胞外细胞系标记物和细胞内信号传导分析。根据实施例6所述，在暴露于IFN-α之后的15分钟、1、2、4小时对多种细胞群体(CD14+单核细胞、CD20+B细胞、CD4+CD3+T细胞和CD4-CD3+T细胞)中的多种磷酸化蛋白质(p-Stat1、p-Stat3、p-Stat4、p-Stat5、p-Stat6和p-p38)的水平进行测量。
结果：该数据揭示了在响应于IFN-α暴露的PBMC内不同细胞亚组中的不同磷酸化蛋白质激活模式。例如，p-Stat4的激活在T细胞亚组(CD4+和CD4-的T细胞)中被检出，但在单核细胞或B细胞中未被检出。这些细胞类型特异性激活模式可能在响应于IFN-α的不同细胞类型内对特异性功能的介导中起到关键作用。对于不同的磷酸化蛋白质观察到了由IFN-α激活的动力学上的差异。在本研究所探索的多数细胞类型中p-Stat1、p-Stat3和p-Stat5的峰值处于15分钟时，而对于多数受测细胞类型中p-Stat14、p-Stat63和p-p38的激活该峰值出现在1小时处。通过计算皮尔森相关系数而测定了该细胞亚组中的磷酸化蛋白质读出值之间的关联。例如，在B细胞和T细胞中p-Stat1和p-Stat5在15分钟时的激活是正相关的。实施例6中提供了更多的结果。
以来自健康供体的PBMC亚组的Stat转录因子为重点测量了细胞内信号传导蛋白质的激活。我们分析了IFN-α信号传导网络中的磷酸化蛋白质的激活状态之间的关联。来自健康供体的样品中的IFN-α信号传导网络提供了网络示图，其可作为参比以用于辨识IFN-α信号传导中的变化，该变化为疾病和/或治疗干预的结果。使用SCNP对来自患有诸如病毒感染或癌症这样的疾病的患者的PBMC中的IFN-α信号传导途径进行特征分析的进一步研究可允许IFN-α剂量的最优化以及患者分级生物标记物的辨识以及新型治疗剂的发现。
实施例5：正常细胞对促红细胞生成素(EPO)和粒细胞集落刺激因子(G-CSF)的响应
通过与在来自患有骨髓增生异常综合征(MDS)的患者亚类的样品中所观察到的信号传导响应进行比较而对正常细胞对EPO和G-CSF的响应进行特征分析，所述患者本文中被称为“低风险”患者。健康BMMC(来自无已知疾病诊断的患者)的15个样品和来自属于患骨髓增生异常综合征患者亚类的患者的BMMC的14个样品被用于对正常细胞响应进行特征分析。低风险患者的14个样品获自得克萨斯州MDAnderson Cancer Center。所述低风险患者根据MD Anderson CancerCenter的标准护理被诊断。健康BMMC的15个样品获自WilliamsonMedical Center以及商业来源(AllCells，Emeryville，CA)。获自WilliamsonMedical Center的样品根据进行诸如膝部或髋部置换这样的手术的患者的知情同意而采集。
所述各正常和低风险样品被各自单独分装。所述分装样品使用3IU/ml浓度的促红细胞生成素、50ng/ml浓度的G-CSF和3IU/ml浓度的促红细胞生成素以及50ng/ml浓度的G-CSF进行处理。使用流式细胞仪在用所述调节剂进行处理后15分钟之时对pStat1、pStat3和pStat5的激活水平进行测量。除被测量的Stat蛋白质外，还对多种其他元件进行测量以根据细胞类型将所述细胞分成分离的群体。这些标记物包括CD45、CD34、CD71和CD235ab。CD45被用于分离淋巴细胞、骨髓(p1)细胞和nRBC。根据CD71和CD235ab：m1、m2、m3和m4的表达，所述nRBC被进一步分成为四个不同的细胞群体。这些细胞群体对应RBC的成熟度并且在图2中显示。
在所述不同的分离的细胞群体中观察到了不同的信号传导响应。图2显示了在经EPO、G-CSF和EPO+G-CSF处理的淋巴细胞、nRBC1细胞、骨髓(p1)细胞和干细胞中pStat1、pStat3和pStat5的不同激活水平。在来自正常和低风险群体的不同样品中观察到的激活水平被成点作图。如图2所示，不同的分离的细胞群体显示了不同的诱导激活水平。尽管这在所述健康和低风险患者中均为事实，所述不同的分离的细胞群体在所述正常样品中表现出比低风险样品更狭窄的诱导激活水平范围。这些观察与患病细胞表现出比正常细胞更为广泛的不同信号传导表型的常识一致。
此外，疾病中的细胞分化被抑制或阻碍，这导致细胞表现出不同于相同类型的其他细胞的特征。
实施例6：对于不同浓度的GM-CSF、IL-27、IFN和IL-6的正常细胞响应
在正常样品(即，来自无疾病诊断的人)中对不同浓度的调节剂的动力学响应进行研究。11个正常样品由具备知情同意的Nodality Inc.雇员提供并且在位于South San Francisco，CA的Nodality Inc.进行加工处理。所述样品使用在4种不同的浓度下的4种不同的调节剂(GM-CSF、IL-27、IFN和IL-6)进行处理并且在不同的时间点测量pStat1、pStat3和pStat5的激活水平。在3、5、10、15、30和45分钟使用基于流式细胞术的单细胞网络特征分析对激活水平进行测量。所述刺激物的浓度表列于下文：
表1：刺激物浓度
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不同细胞表面标记物的激活水平也使用单细胞网络特征分析进行特征化，并且结合门控被用于将所述细胞分成分离的细胞群体。在所述门控分析中，最初使用SSC-A和FSC-A将淋巴细胞与非淋巴细胞分离。随后使用CD14和CD4将所述非淋巴细胞分成嗜中性粒细胞和CD14+细胞(单核细胞)群体。随后使用CD3和CD20将所述淋巴细胞分成CD20+(B细胞)、CD3+(T细胞)和CD20-CD3-细胞。使用CD4将所述CD3+T细胞分成CD3+CD4-和CD3+CD4+T细胞。
图3显示了正常样品中的不同的分离的细胞群体的动力学响应。图3中所包含的线图是所有供体中在其被测得时间间隔上所观察到的激活水平。上文表列的IL-6的不同浓度由实线和虚线显示。总体上，正常样品随时间显示一致于给定的样品浓度的类似激活特征。对于某些受测的Stat磷酸化蛋白质，不同浓度的调节剂IL-6产生了强烈不同的激活特征。例如，对于不同浓度的IL-6，IL-6-诱导的pStat3响应在较早时间点(5-15分钟时)出现差别但在较晚时间点趋向更为一致。这种响应一致性支持了正常细胞表现出狭窄范围的激活的观点。
不同的分离的细胞群体表现出对调控的独特响应。与CD4+T细胞和单核细胞相比，嗜中性粒细胞表现出极低的IL-6诱导的激活。在CD4+T细胞和单核细胞之间观察到了激活特征的多种差异。单核细胞所表现的IL-6诱导的pStat1活性的峰值激活处于不同于CD4+T细胞的时间点。尽管所述单核细胞和CD4+T细胞在15分钟后表现出pStat3活性的下降，但在该单核细胞中所述下降更为强烈。斜率上的差异通过使用方框而显示于图3。这一观察证实了使用描述了诸如“斜率”和线性方程这样的动力学响应的另外度量来表示对诱导的激活的动力学响应的效用。

Claims (58)

1.一种测定个体状态的方法，所述方法包括：
a)使来自所述个体的第一细胞群体的第一细胞至少与第一调节剂进行接触；
b)使来自所述个体的不同的第二细胞群体的第二细胞至少与第二调节剂进行接触；
c)在所述第一细胞和所述第二细胞内测定至少一种可激活元件的激活水平；
d)为所述个体创建包含来自所述第一细胞的所述可激活元件和来自所述第二细胞的所述可激活元件的所述测定的激活水平的响应表单；
e)根据所述响应表单确定所述第一细胞和所述第二细胞之间的因果关联，其中所述因果关联是细胞网络状态的指征；
f)对所述响应表单和/或所述细胞网络状态应用分类器，其中所述分类器包括一组激活水平值，并且其中所述分类器被用于测定所述响应表单和/或细胞网络是否与状态相关联；以及
f)辨识所述个体的状态，其中所述辨识使用所述分类器根据所述响应表单和/或细胞网络与状态之间的所述关联而进行。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法进一步包括根据所述响应表单产生分类数值，其中所述分类数值明确了所述个体是否与所述个体的状态相关联。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一调节剂和所述第二调节剂选自生长因子、丝裂原、细胞因子、趋化因子、粘附分子调节剂、激素、小分子、多核苷酸、抗体、天然化合物、内酯、化疗剂、免疫调节剂、碳水化合物、蛋白酶、离子、活性氧物质和放射物。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一调节剂与所述第二调节剂相同。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述第一细胞的所述接触与所述第二细胞的所述接触在同一培养物中进行。
6.根据权利要求1至3所述的方法，其中所述第一调节剂不同于所述第二调节剂，并且所述第一细胞的所述接触与所述第二细胞的所述接触在分开的培养物中进行。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一细胞的所述接触和/或所述第二细胞的所述接触在所述第一细胞和/或第二细胞从所述个体中分离之前进行。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述激活水平基于选自下列的激活状态：细胞外蛋白酶暴露、新异寡聚体形成、糖基化状态、磷酸化状态、乙酰化状态、甲基化状态、生物素化状态、谷氨酰化状态、甘氨酰化状态、羟基化状态、异构化状态、异戊烯化状态、豆蔻酰化状态、脂化状态、磷酸泛酰巯基乙胺基化状态、硫酸化状态、ISG化状态、亚硝基化状态、棕榈酰化状态、SUMO化状态、泛素化状态、类泛素化状态、瓜氨酸化状态、脱酰胺基状态、二硫键形成状态、蛋白酶水解切割状态、转位状态、蛋白质周转中的变化、多蛋白复合物状态、氧化状态、多脂质复合物、以及细胞膜的生化变化。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述激活状态是磷酸化状态。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述可激活元件选自蛋白质、碳水化合物、脂质、核酸和代谢物。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述可激活元件是具有磷酸化状态和/或去磷酸化状态的蛋白质。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括在所述第一细胞和/或所述第二细胞内测定一种或更多种细胞表面标记物、细胞内标记物或其组合的存在与否。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述细胞表面标记物和所述细胞内标记物独立地选自蛋白质、碳水化合物、脂质、核酸和代谢物。
14.根据权利要求12所述的方法，其中对一种或更多种细胞表面标记物或细胞内标记物存在与否的所述测定包括对所述细胞表面标记物或所述细胞内标记物的激活和非激活状态下的表位的存在与否均进行测定。
15.根据权利要求12所述的方法，其中所述个体的状态基于所述可激活元件的激活水平以及基于所述一种或更多种细胞表面标记物、细胞内标记物或其组合的存在与否两者。
16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述激活水平通过一种方法进行测定，该方法包括与特异于所述特定可激活元件的特定激活状态的结合元件相结合。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述结合元件包括抗体。
18.根据权利要求16所述的方法，其中所述结合元件为可识别标记的。
19.根据权利要求17所述的方法，其中所述可识别标记的结合元件是用可检测的标记物直接标记的。
20.根据权利要求18所述的方法，其中所述可检测的标记物选自放射性同位素、重同位素、荧光剂、FRET标记物、酶、微粒和化学发光物。
21.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述测定所述激活水平的步骤包括使用流式细胞术、免疫荧光、共聚焦显微镜法、免疫组织化学、免疫电子显微镜法、核酸扩增、基因阵列、蛋白质阵列、质谱、膜片钳技术、二维凝胶电泳、差示凝胶电泳、基于微球的多元蛋白质分析、ELISA以及无标记物细胞分析，用以在单个细胞中测定一种或更多种细胞内可激活元件的激活水平。
22.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述测定所述激活水平的步骤包括使用流式细胞术。
23.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述测定是定量的。
24.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述测定是相对于对照值的。
25.根据权利要求23所述的方法，其中所述对照值被包括在所述响应表单之中。
26.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述分类器被用于辨识所述个体的状态，并且其中所述辨识的AUC值高于0.6。
27.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述状态是病状的分类、诊断或预后。
28.根据权利要求27所述的方法，其所述病状的分类、诊断或预后中的AUC值高于0.6。
29.根据权利要求27所述的方法，其所述病状的分类、诊断或预后中的p值低于0.05。
30.根据权利要求27所述的方法，其所述病状的分类、诊断或预后中的阳性预测值(PPV)高于80％。
31.根据权利要求27所述的方法，其所述病状的分类、诊断或预后中的阴性预测值(NPV)高于80％。
32.根据权利要求27至31中任一项所述的方法，其中所述病状是免疫性疾病、炎症、移植排斥、感染、疫苗状态响应、恶性或增殖性疾病或其组合。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述病状是恶性疾病。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述恶性疾病是实体肿瘤或恶性血液病。
35.根据权利要求33所述的方法，其中所述恶性疾病是非B细胞系来源的。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述非B细胞系来源的恶性疾病选自急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、非B细胞急性淋巴细胞性白血病(ALL)、非B细胞淋巴瘤、骨髓增生异常、骨髓增殖失调、骨髓纤维变性、红血球增多、血小板增多和非B细胞非典型性免疫性淋巴细胞增生。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述非B细胞系来源的恶性疾病是AML。
38.根据权利要求33所述的方法，其中所述恶性疾病是B细胞来源的失调或B细胞系来源的失调。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述恶性疾病是选自下列的B细胞来源的失调或B细胞系来源的失调：慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、B淋巴细胞系白血病、B淋巴细胞系淋巴瘤、多发性骨髓瘤和浆细胞失调。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述B细胞来源的失调或B细胞系来源的失调是CLL。
41.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述状态是对病理前或病理病状的治疗的预测性响应，或是对病理前或病理病状的治疗响应。
42.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其进一步包括对病理前或病理病状的治疗的响应进行预测。
43.根据权利要求42所述的方法，其中对治疗响应所进行的预测的AUC值高于0.6。
44.根据权利要求42所述的方法，其中对治疗响应所进行的预测的p值低于0.05。
45.根据权利要求42所述的方法，其中对所述病状的治疗响应所进行的预测的PPV值高于80％。
46.根据权利要求42所述的方法，其中对治疗响应所进行的预测的阴性预测值(NPV)高于80％。
47.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中测定了所述第一和/或第二细胞中的多个细胞内可激活元件的激活水平。
48.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其进一步包括对所述第一细胞和所述第二细胞之间的因果关联的测定。
49.一种计算机实现的方法，其根据特征对来自细胞群体的激活状态数据进行分类，所述方法包括
提供包括内存和处理器的计算机；
对关联于个体的激活状态数据进行辨识，其中所述激活状态数据来自采样于个体的至少两种分离的细胞群体；
产生分类数值，其中所述分类数值明确了所述个体与一种健康状态是否关联，所述健康状态响应于对与所述个体关联的激活状态数据应用分类器；其中所述分类器包括一组激活状态值，所述激活状态值被用于测定不同的分离的细胞群体中的细胞是否与所述状态相关联；以及
将所述分类数据存储于所述计算机的内存内。
50.根据权利要求49所述的方法，其中所述分类数值代表以下一种或多种：诊断、预后和对治疗的预测性响应。
51.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述激活状态数据来自第三方，并且所述方法进一步包括：
将所述分类数据传送至所述第三方。
52.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其进一步包括：
根据可激活元件所关联的激活状态的至少第一水平，辨识所述激活状态数据是否与分离的第一细胞群体或不同的第二细胞群体相关联。
53.根据权利要求52所述的方法，其中对所述激活状态数据是否与所述分离的第一细胞群体或所述不同的第二细胞群体相关联的辨识包括根据所述可激活元件所关联的激活状态的至少第一水平对所述激活状态数据进行门控。
54.根据权利要求52所述的方法，其中对所述激活状态数据是否与所述分离的第一细胞群体或所述分离的第二细胞群体相关联的辨识包含根据关联于可激活元件的激活状态的至少第一水平对所述激活状态数据进行迭代分组。
55.根据权利要求54所述的方法，其中所述分离的第一细胞群体是一种稀有的细胞群体，并且所述分离的第一细胞群体被识别为根据可激活元件所关联的激活状态的至少第一水平响应于对所述激活状态数据所进行的迭代分组。
56.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其进一步包括产生所述分类器，其基于来自已知与所述状态相关联的多个分离的细胞群体和已知不与所述状态相关联的多个分离的细胞群体的激活状态数据。
57.根据权利要求56所述的方法，其中所述激活状态数据进一步与多个时间点相关联，并且所述分类器的产生进一步包括：
建立随不同时间点的数据的模型，其中所述模型代表所述异源细胞群体之间随多个时间点的通讯；
根据所述模型产生一系列的描述性数值；以及
根据所述一系列的描述性数值产生所述分类器。
58.据权利要求56所述的方法，其中分类器的产生包括所述分类器的交叉验证。
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