CN102216450B - 培养细胞、增殖和纯化病毒的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供新的无血清细胞培养基和培养MDCK细胞的方法。具体而言，非致瘤性MDCK细胞。本发明还提供不需细胞培养基交换步骤的产生流感病毒(例如，特别是冷适应和/或温度敏感性和/或减毒流感病毒)的方法。所述新的培养基和方法可用于在细胞培养物中培养达到高效价的流感病毒。本发明还提供活病毒总回收率高的纯化流感病毒的纯化方法，使宿主细胞DNA(HCD)、宿主细胞蛋白质(HCP)和非特异性内切核酸酶(例如Benzonase)的水平低于管理机构要求的规格。所述免疫原性组合物可用于主动免疫接种对象或产生用于各种应用包括被动免疫接种和诊断免疫鉴定的抗体。

Description

培养细胞、增殖和纯化病毒的方法
1.对在联邦资助研究与开发下作出的发明的权利声明
本文所述的一项或多项发明在卫生与公众服务部(Health and HumanServices)授予的合约号HHS0100200600010C的政府支持下完成。因此，政府可享有本发明的某些权利。
2.发明领域
本发明涉及新的细胞培养基和培养细胞，具体为非致瘤性MDCK细胞的方法。本发明还涉及在细胞培养物中产生病毒(例如，流感病毒、RSV)的方法。本发明还提供从生物反应器中培养的贴壁细胞纯化细胞相关病毒以供开发疫苗的方法。
3.发明背景
接种疫苗是预防由病毒感染引起的疾病的最重要的公共卫生措施。疫苗的有效应用依赖于能够从稳定和易于培养的来源迅速产生大量疫苗材料(例如病毒)。疫苗的迅速开发和有丰富的疫苗可用对于抵御多种人类和动物疾病至关重要。疫苗生产的延迟及其产量不足可导致疾病爆发方面的问题。例如，近期的研究显示对产生针对大流行流感的疫苗所需的交付时间长的担忧是有原因的。参见例如，Wood，J.M.，2001，Philos.Trans.R.Soc.Lond.B.Biol.Sci.，356：1953。因此，近期生产疫苗的努力集中于在细胞培养物中培养用于疫苗的病毒。
3.1流感病毒
具体而言，采用马丁-达比狗肾(MDCK)细胞已受到多个研究组的推行。参见例如，U.S.6,455,298、U.S.2005/0118140、U.S.2005/0118698、U.S.6,825,306、WO2005/113758和Radaeva，I.F.等Vopr.Virusol.(2005)50：43-6。然而，多个现存MDCK细胞系具有一种或多种缺陷，包括致瘤性、细胞培养中需要动物血清以及适用于疫苗的流感病毒产率低。此外，已开发的用于从这些细胞系生产疫苗材料的多种细胞培养方法常需要大量操作，包括培养基交换步骤和使用大量病毒接种。此外，由于不断出现(或重现)不同流感毒株，各季根据流行的流感毒株产生新的流感疫苗。不幸的是，一些流感疫苗毒株更难以生长达到高产率。各批次细胞培养物衍生材料的产率不仅决定生产能力，还影响制备产物的成本，因此希望提高病毒产率(即峰病毒效价)。
近期已开发了可培养疫苗毒株达到非常高效价的新的无血清培养基和非致瘤性细胞系和在一次性生物反应器中生产病毒材料的方法(参见U.S.2006/0188977和2007年9月14日提交的U.S.S.N.11/855,769)。本发明拓展了该研究并提供了新的细胞培养基和在生物反应器中从MDCK细胞，具体为非致瘤性细胞系生产大量疫苗材料而不需进行培养基交换的高再现性有效可升级方法，以及高度纯化减毒活疫苗生产的可靠下游纯化方法。本发明提供的方法可靠，需要最小量的操作，并可节约成本。
3.2呼吸道合胞病毒(RSV)
人呼吸道合胞病毒(RSV)是造成婴儿和儿童中严重下呼吸道感染(LRTI)的主要原因，引起相当大的发病率和死亡率。七个主要市场(美国、日本、法国、德国、意大利、西班牙、英国)中每年总共有1800万人感染，包括300万成人和约400,000早产婴儿。仅在美国，每年估计有70,000-125,000个住院治疗病例由RSV LRTI造成。人群中存在两种抗原性不同的RSV亚群A和B。RSV还被视作免疫应答受损成人和老年人中的重要感染因子。由于天然感染诱导的对RSV再感染的抗性不完整，RSV可在儿童时期和生命期中进行多次感染。RSV免疫预防的目的是诱导足够的抗性以预防可能与RSV感染相关的严重疾病。目前开发RSV疫苗的策略主要围绕给予纯化的病毒抗原或开发鼻内给予的减毒活RSV。然而，迄今为止尚未出现获批准的RSV疫苗。
病毒基因组RNA采用裸RNA形式时不具有感染性。RSV的RNA基因组由主要核壳体(N)蛋白紧密包壳，与磷蛋白(P)和大(L)聚合酶亚基相关联。这些蛋白质形成核蛋白核心，被视作感染性的最小单位(Brown等，1967，J.Virol.1：368-373)。
尽管经过数十年的研究，但尚未开发出市售的安全有效的RSV疫苗以供预防与RSV感染相关的严重发病率和致死率。福尔马林灭活病毒疫苗无法提供针对RSV感染的保护作用，并实际上导致婴儿在随后感染野生型病毒期间症状加剧(Kapikian等，1969，Am.J.Epidemiol.89：405-21；Chin等，1969，Am.J.Epidemiol.89：449-63)。自那以后的努力集中在通过重组方法、化学诱变和将野生型RSV冷传代为温度敏感性突变体来开发活的减毒突变体(Gharpure等，1969，J.Virol.3：414-21；Crowe等，1994，Vaccine 12：691-9)。然而，目前仍难以从病毒的细胞相关蛋白质纯化符合管理指南的减毒活病毒以便用于RSV感染的有效预防性治疗。
与流感病毒类似，RSV在稳定细胞系中生长，其中所述病毒与宿主细胞紧密相关联，使得难以在保持感染性最小单位的同时从细胞相关联蛋白质纯化所述病毒。RSV脆弱(例如具有剪切敏感性)更增加了复杂性。所述病毒主要跟宿主细胞相关联和脆弱等因素使得难以从宿主细胞提取物(例如，DNA和蛋白质)纯化所述病毒而产生临床上可接受的包含减毒活病毒的免疫原性组合物。正是部分由于这些原因造成尚未出现市售RSV疫苗。因此，需要可用于纯化RSV和其它细胞相关病毒的纯化方法以供制备和配制免疫原性组合物。
4.发明内容
本发明提供在生物反应器，包括单用途生物反应器和标准可重复使用生物反应器(例如，不锈钢和玻璃容器生物反应器)中生产大量疫苗材料的无血清细胞培养基和高重复性有效可升级方法。
在一个方面，本发明提供富集无血清细胞培养基，其支持MDCK细胞(例如非致瘤性MDCK细胞)增殖达到高细胞密度并不需培养基交换步骤以获得高病毒效价。
具体而言，本发明提供在MDCK细胞中复制流感病毒(例如，冷适应和/或稳定敏感性和/或减毒)达到高效价，例如至少约7.4、至少约7.6、至少约7.8、至少约8.0、至少约9.0或至少约10.0的log10TCID50/mL和/或log10FFU/mL，而在感染前不进行培养基交换步骤的方法。
在另一个方面，本发明提供在微载体上增殖非致瘤性细胞的改进方法，包括珠粒对珠粒转移方法。在另一个方面，本发明的富集无血清细胞培养基保持用于初始接种的非致瘤性MDCK细胞的非致瘤性特征。在其它方面，本发明的富集无血清细胞培养基用于建立和维持非致瘤性MDCK细胞系。
在其它方面，本发明提供从在细胞培养物(例如，MDCK、Vero细胞培养物)中培养的贴壁细胞纯化细胞相关活病毒(例如，流感病毒、RSV)产生至少30％的总病毒回收率的方法，其中所述纯化病毒在每7.0±0.5log10FFU的病毒中包含少于0.1ng HCD、少于0.3μg HCP和少于0.0050ng非特异性核酸酶。
5.附图简要说明
图1是培养第0天到第4天的4x2L生物反应器中活细胞密度(VCD)和细胞活力(V％)的曲线图。采用表7详示的种子反应器(Seed Reactor)(SR)工艺条件培养所述生物反应器。未提供SR4的2dps数据。
图2显示对3x2L种子反应器(SR)实验1、3和4在B2B胰蛋白酶消化期间在0-40分钟之间的中间取样时间所摄的照片(放大10X所摄)。生物反应器中的胰蛋白酶消化根据珠粒对珠粒转移方案进行。
图3是12x2L最终生产反应器(FPR)中活细胞密度(VCD)和细胞活力(V％)的曲线图。在5dps(约120hps)感染实验3的生物反应器(FPR3.X.X)，在4dps感染其它实验的生物反应器。未提供实验4的感染后VCD和细胞活力数据。
图4显示对所有实验的12x2L最终生产反应器在4dps所摄的照片(放大100x所摄)。
图5显示对所有实验的9x2L最终生产反应器(FPR)在3dps所摄的照片(放大100x所摄)。
图6显示对所有实验中起初在4x2L种子反应器中培养、然后于感染后在12x2L最终生产反应器(FPR)中培养的细胞而言，冷适应(ca)A/Uruguay(A/U)、ca A/South Dakota(A/S)和ca B/Florida(B/F)病毒效价随时间变化的曲线图。注：各数据点表示三次重复试验的平均值。未记录检测界限以下的病毒效价(＜6.4log10FFU/mL或如果稀释，＜2.4log10FFU/mL)。
图7显示采用67％培养基交换过程(67％MX)相对无培养基交换过程(0％MX)产生的毒株的随时间变化的病毒产生曲线。毒株caA/Wisconsin/67/05和ca A/Uruguay的曲线图分别见图8A的左图和右图所示，ca A/South Dakota和ca B/Florida的曲线图分别见图8B的左图和右图所示。
图8显示珠粒对珠粒转移过程的流程图。图A所示过程利用两个洗涤步骤，各采用包含螯合剂(EDTA)和终浓度刚达到0.05X以便在约30分钟内实现细胞脱离的蛋白酶(TrypLETM)的缓冲盐溶液(DPBS)。图B所示过程利用2-3个洗涤步骤，采用缓冲盐溶液(DPBS)，之后与终浓度刚达到约0.5mM可在缺乏任何蛋白酶的情况下在约60分钟内实现细胞脱离的螯合剂(EDTA)温育。
图9显示用于直流过滤(DFF1)过滤器器材(图A，上部)、GE医疗保健公司(GE Healthcare)的Uniflux滑道(skid)管道器材(图A，下部)、GE医疗保健公司的AKTA过程滑道管道器材(图B，上部)和直流过滤2(DIFF2)过滤器器材(图B，下部)的过滤器和管道器材的图片。
图10在图A中显示初始纯化方法1a连同改进的纯化方法1b的示意图。其它改动在图B所示的示意图中详示。各方法的细节见实施例3和4提供。
图11显示TFF 1轮次#8的流量痕迹曲线。
图12显示BPG 100和BPG 200 CS柱压力流特征。
图13显示轮次#9的CS柱洗脱色谱。
图14显示TFF2 8XDF方法轮次#8的流量痕迹曲线。
图15显示以下细胞在约432小时的培养过程中每毫升(mL)的活细胞(实心符号/实线)和活力百分比(空心符号/虚线)的曲线图：缺乏蛋白酶的情况下连续分离和增殖的细胞(菱形和正方形)、采用EDTA/蛋白酶混合物连续分离和增殖的细胞(三角形)以及采用标准蛋白酶方法独立分离和增殖的细胞(圆形)。
图16表示获自以下细胞各代的ca A/Wisconsin/67/07(上部)，caB/Malaysia/2506/04(下部)的效价的曲线图：在缺乏蛋白酶的情况下依次分离和增殖的细胞(菱形和正方形)、采用EDTA/蛋白酶混合物依次分离和增殖的细胞(三角形)以及采用标准蛋白酶方法独立分离和增殖的细胞(空心正方形)。所述曲线图显示采用无蛋白酶和EDTA/蛋白酶方法分离和增殖的细胞可获得至少8.0log10FFU/mL的效价。
图17显示三个生产模拟试验(图A和图B，顶部)的每mL活细胞(实心符号/实线)和活力百分比(空心符号/虚线)的曲线图。包括于各曲线图的是种子反应器、采用ATF的模拟生产反应器试验和不采用ATF的对照生产试验。图B(下部)还显示在两个生产模拟试验过程中获得的caB/Malaysia/2506/04的效价的曲线图，表明采用ATF和不采用ATF进行的试验的效价相当。
图18显示从采用ATF工艺的生物反应器移出的液体的照片，表明它们不含微载体。左图显示在微载体灭菌过程中采用ATF洗涤移出的微载体，右图显示在MDCK细胞培养的66％培养基交换步骤过程中采用ATF移出的培养基。
图19显示用1M NaCl洗脱的测试树脂A-D柱试验的洗脱色谱(分别为图A-D)。这些色谱表明，测试树脂A和B看来显示具有较小早期峰(见图B中的箭头)的多个独立的洗脱峰，而测试树脂C和D显示具有峰肩和非均相特征(见图D中的箭头)的单峰。
图20显示采用2M NaCl洗脱的测试树脂C和D柱试验的洗脱色谱(分别为图A和B)，显示采用2M NaCl洗脱的洗脱峰更尖锐。
图21显示ca A/Wisconsin、ca A/Solomon Islands和ca B/Malaysia的测试树脂C柱试验的洗脱色谱，分别为图A、B和C，表明所述峰特征类似并保持一致。
图22显示柱试验的洗脱色谱。图A和B分别显示ca A/Wisconsin和ca B/Malaysia的测试树脂D柱的洗脱，表明所述峰特征类似并保持一致。图C显示XK-50柱规格下的测试树脂D的洗脱峰色谱。
图23显示来自A)未处理细胞和用B)0.5mM EDTA、C)1mM EDTA、D)2mM EDTA、E)5mM EDTA和F)10mM EDTA处理60分钟的细胞的细胞培养物图片。
图24显示来自用2mM EDTA预处理、之后用0.0125X TrypLE(图A和D)、0.025X TrypLE(图B和E)和0.05X TrypLE(图C和F)处理的细胞的细胞培养物图片。图片为加入TrypLE 0分钟时(图A、B和C)和加入TrypLE60分钟后(图D、E和F)所摄。
6.发明详述
本发明提供在生物反应器中从贴壁细胞(例如，MDCK细胞，具体为非致瘤性细胞系或Vero细胞)生产大量病毒(例如，流感病毒或RSV)或病毒抗原以供预防、诊断、免疫治疗或治疗应用的高再现性有效可升级方法。具体而言，本发明提供生产达到高效价的冷适应和/或温度敏感性和/或减毒流感或呼吸道合胞病毒而不需任何培养基交换的可靠方法。
此外，本发明提供支持MDCK细胞(例如非致瘤性MDCK细胞)培养和支持包括但不限于流感病毒(例如，冷适应和/或温度敏感性和/或减毒流感病毒)的病毒复制达到高效价而不需任何培养基交换的培养基。
此外，本发明还提供从MDCK细胞(例如非致瘤性MDCK细胞)制备疫苗材料(例如流感病毒)的方法，以及利用MDCK细胞中产生的疫苗材料预防流感感染的方法。任何细胞相关病毒(例如流感病毒和RSV)均可通过本文所述方法纯化和/或包含于本文所述免疫原性组合物中。本文所用的“细胞相关病毒”指根据本领域技术人员已知的任何技术测定发现约60％或更多的病毒效价与病毒感染贴壁细胞相关的病毒。本发明的方法特别可用于生产冷适应/温度敏感性/减毒(ca/ts/att)流感毒株(例如FluMist
Figure BPA00001373558000071
中的毒株)和RSV(例如，rA2cp248/404/1030ΔSH)。
可在非致瘤性MDCK细胞和/或Vero细胞中生长的病毒包括但不限于负链RNA病毒，其包括但不限于：流感病毒、RSV、副流感病毒1、2和3以及人肺炎后病毒(metapneumovirus)；以及其它病毒，包括DNA病毒，逆转录病毒，正链RNA病毒，负链RNA病毒，双链RNA病毒，包括但不限于：乳多空病毒、水泡性口炎病毒、牛痘病毒、柯萨奇病毒、呼肠孤病毒、微小病毒、腺病毒、脊髓灰质炎病毒、麻疹病毒、狂犬病毒和疱疹病毒。
6.1定义
本文所用的致瘤性具有本领域技术人员赋予该术语的一般含义。在一个实施方式中，致瘤性由成年裸小鼠模型确定(例如，Stiles等，1976，CancerRes，36：1353和以下实施例5)。致瘤性也可通过其它试验，例如通过注射到鸡胚和/或局部施用于尿囊绒膜进行测试(Leighton等，1970，Cancer，26：1024)。
术语“重组”表示通过人为干涉人工或合成(非天然)地改变所述材料(例如，核酸或蛋白质)。所述改变可在其天然环境或状态中或从其天然环境或状态取出的材料上进行。具体而言，在提到病毒例如流感病毒时，在所述病毒通过重组核酸表达产生时，其即为重组的。重组病毒还可将一个或多个突变引入基因组。在重组病毒包含来自多于一种的亲本病毒毒株的组分时，其也可以是重配病毒。
指病毒时，术语“重配株”表示所述病毒包括来自多于一种亲本病毒毒株或来源的遗传和/或多肽组分。例如，7:1重配株包括7个来自第一亲本病毒的病毒基因组区段(或基因区段)和1个来自第二亲本病毒的，例如编码血凝素或神经氨酸酶的互补病毒基因组区段。6:2重配株包括6个来自第一亲本病毒的基因组区段，通常为6个内部基因，以及2个来自不同亲本病毒的互补区段，例如血凝素和神经氨酸酶。
除非另外说明，本文所用的术语“约”指不超过该术语修饰数值上下10％的数值。例如，术语“约5μg/kg”指4.5μg/kg到5.5μg/kg的范围。再例如，“约1小时”指54分钟到66分钟的范围。
术语“温度敏感性”、“冷适应”和“减毒”为本领域熟知。例如，术语“温度敏感性”(“ts”)表示，就流感毒株A而言，所述病毒在较高温度例如39℃下，相对于较低温度例如33℃显示效价降低100倍或更多，就流感毒株B而言，所述病毒在较高温度例如37℃下相对于较低温度例如33℃显示效价降低100倍或更多。例如，术语“冷适应”(“ca”)表示所述病毒在较低温度例如25℃的生长速率比其在较高温度例如33℃的生长速率高100倍以内。例如，术语“减毒”(“att”)表示所述病毒在白鼬的上呼吸道复制但在肺组织中却检测不到，且并不在动物中引起流感样疾病。应理解，具有中间表型的病毒，即显示效价在39℃(A株病毒)或37℃(B株病毒)降低小于100倍、显示在25℃的生长比其在33℃的生长高100倍以上(例如，200倍以内、500倍、1000倍、小于10,000倍)和/或肺部生长相对在白鼬上呼吸道的生长降低(即部分减毒)和/或动物中流感样疾病减少的病毒，也是本发明所包括的可用病毒。生长表示由效价、蚀斑大小或形态学特征、颗粒密度或本领域技术人员已知的其它度量表示的病毒量。
6.2细胞
本文所述的细胞相关病毒可在能使所述病毒生长达到允许使用病毒的效价的任何贴壁细胞中增殖。在一个实施方式中，所述贴壁细胞能使细胞相关病毒生长达到与从相应野生型病毒测定的效价相当的效价。在一个具体实施方式中，本文所述细胞相关病毒在易受所述病毒感染的细胞中增殖。
在一个实施方式中，本文所述细胞相关病毒在哺乳动物细胞中增殖。本文所述细胞相关病毒可于其中增殖的代表性哺乳动物细胞包括但不限于：Vero细胞、CHO细胞、Hep-2细胞、MBCK细胞、MDCK细胞、MRC-5细胞、HeLa细胞和LLC-MK2细胞。在一个具体实施方式中，包括呼吸道合胞病毒的本文所述细胞相关病毒在Vero细胞中增殖。在另一个具体实施方式中，包括流感病毒的细胞相关病毒在MDCK细胞中增殖。
6.2.1MDCK细胞
已知MDCK细胞支持包括但不限于各种病毒的大量病毒的分离和复制，所述各种病毒包括但不限于：正粘病毒、副粘病毒、弹状病毒和黄病毒(flavovirus)。具体而言，MDCK细胞广泛用于生产流感病毒。然而，如上所述，一些MDCK细胞系具有致瘤性。如果致瘤性是管理当局关心的问题，本发明提供增殖非致瘤性MDCK细胞的方法和将其用于生产流感病毒的应用。因此，在一个实施方式中，本发明的方法利用非致瘤性MDCK细胞。在另一个实施方式中，本发明的方法利用MDCK细胞，而不考虑致瘤性。
可用于本发明方法的非致瘤性MDCK细胞系包括但不限于2005年1月5日保藏于美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)(弗吉尼亚州马纳萨斯大学大道10801(10801 University Boulevard，Manassas，Va.)，20110-2209)的ATCC保藏号为PTA-6500和PTA-6503(分别表示MDCK-S和MDCK-SF103)的细胞系，以及2006年10月5日保藏的ATCC保藏号为PTA-7909和PTA-7910(分别表示亚克隆1-A和1-B)的细胞系。
可利用的其它MDCK细胞包括但不限于保藏于美国典型培养物保藏中心的ATCC保藏号为PTA-6501和PTA-6502(分别表示MDCK-SF101和MDCK-SF102)的细胞，ATCC保藏号为CRL-12042(表示MDCK.5F1)的细胞和ATCC保藏号为ATCC CCL34、CRL-2286和CRL-2285的细胞。
在一个具体实施方式中，用于本发明方法的非致瘤性MDCK细胞在成年裸小鼠模型中具有非致瘤性(参见Stiles等)。在另一个具体实施方式中，用于本发明方法的非致瘤性MDCK细胞在注射到鸡胚和/或局部施用于尿囊绒膜时具有非致瘤性(参见Leighton等)。在另一个实施方式中，用于本发明方法的非致瘤性MDCK细胞在成年裸小鼠模型中具有非致瘤性但在注射到鸡胚和/或局部施用于尿囊绒膜时并非如此。在另一个实施方式中，用于本发明方法的非致瘤性MDCK细胞在成年裸小鼠模型中以及在注射到鸡胚和/或局部施用于尿囊绒膜时具有非致瘤性。在另一个实施方式中，用于本发明的非致瘤性MDCK细胞在至少20次传代后、至少30次传代后、至少40次传代后、至少50次传代后、至少60次传代后、至少70次传代后、至少80次传代后、至少90次传代后或至少100次传代后具有非致瘤性。在其它实施方式中，用于本发明的非致瘤性MDCK细胞在本发明的无血清培养基(例如，MediV SFM 105+TE、MediV SFM 109和MediV SFM110)中进行至少20次传代后、至少30次传代后、至少40次传代后、至少50次传代后、至少60次传代后、至少70次传代后、至少80次传代后、至少90次传代后或至少100次传代后具有非致瘤性。
致瘤性可通过本领域技术人员已知的大量方法定量分析。常用的一种方法是测定“TD50”值，其定义为在50％测试动物中诱导肿瘤所需的细胞数量(参见例如，Hill R.“用于肿瘤细胞的TD50鉴定(The TD50 assay for tumorcells)”刊于《细胞克隆(Cell clones)》，Potten C，Hendry J，编，伦敦：丘吉尔-列温斯顿出版社(London：Churchill Livingstone)，1985.第223页)。在一个实施方式中，用于本发明方法的非致瘤性MDCK细胞的TD50值在约1010到约101之间、在约108到约103之间或在约107到约104之间。在一个具体实施方式中，用于本发明方法的非致瘤性MDCK细胞的TD50值大于约1010、大于约109、大于约108、大于约107、大于约106、大于约105、大于约104、大于约103、大于约102或大于约101。在一个具体实施方式中，用于本发明方法的非致瘤性MDCK细胞的TD50值为107或更大。
还考虑到用于本发明方法的非致瘤性MDCK细胞也具有非致癌性。确定细胞是否具有致癌性的方法通常包括将细胞裂解物和/或DNA接种到新生啮齿动物中并评价随时间进行的任何肿瘤形成(参见例如，Nowinski和Hays，1978，J.Virol.，27：13-8；Peeper等，2002，Nat Cell Biol.，4：148-53；联邦法规条文(Code of Federal Regulation)(CFR)，“致癌性”，第40项，第8卷，第1章，第798.330部分，第160-164页)。例如，将来自至少107个细胞等效物的细胞裂解物和/或DNA注射到通常小于4天龄的新生啮齿动物(例如，仓鼠、裸小鼠、大鼠)中，然后对其监测最多达5个月或更长时间。致癌性试验通过商业测试公司(例如，B-R公司(BioReliance)，参见方案#001031和#001030)以常规方式进行。在一个实施方式中，来自至少105、至少106或至少107个用于本发明方法的非致瘤性MDCK细胞的细胞裂解物和/或DNA在注射到新生啮齿动物中时在2个月、3个月、4个月、5个月、6个月或更长时间内不诱导肿瘤形成。在另一个实施方式中，来自用于本发明方法的非致瘤性MDCK细胞的0.01mg、0.02mg、0.03mg、0.04mg、0.05mg、0.06mg、0.07mg、0.08mg、0.09mg、0.10mg或更多DNA在注射到新生啮齿动物中时在2个月、3个月、4个月、5个月、6个月或更长时间内不诱导肿瘤形成。
考虑到用于本发明方法的MDCK细胞(例如非致瘤性MDCK细胞)支持包括但不限于：正粘病毒(包括甲型和/或乙型流感毒株)、副粘病毒(包括RSV A和/或B、人肺炎后病毒和副流感病毒1、2和/或3)、弹状病毒和黄病毒的病毒复制。
在一个具体实施方式中，用于本发明方法的MDCK细胞(例如非致瘤性MDCK细胞)支持冷适应、温度敏感性、减毒流感病毒如FluMist(Belshe等，1998，N Engl J Med 338：1405；Nichol等，1999，JAMA 282：137；Jackson等，1999，Vaccine，17：1905)中发现的病毒和/或包含这些病毒骨架(例如，其余基因区段)或包含具有冷适应、减毒和温度敏感性特征中一种或多种的流感病毒的骨架(例如一种或多种vRNA区段)的重配病毒的复制。
细胞支持病毒复制的能力的一个指示是获自感染细胞培养物的感染病毒的产率。病毒产率可通过设计用来测定病毒感染和/或生长的大量试验来确定。例如，病毒产率可通过根据测定感染病毒体的中值组织培养感染剂量(TCID50)试验和检测细胞培养物单层中感染细胞内病毒抗原的荧光聚焦试验(FFA)方法确定样品中存在的病毒浓度来定量分析。TCID50值常以log10TCID50/mL形式报道，FFA值常以log10FFU/mL(荧光聚焦单位/mL)形式报道。可用于生产流感病毒的方法包括但不限于专利公开WO08/105931中公开的方法(具体参见实施例12)。
在一个具体实施方式中，用于本发明方法的MDCK细胞(例如非致瘤性MDCK细胞)支持流感病毒(例如ca/ts毒株)复制达到的log10TCID50/mL和/或log10FFU/mL为至少约7.6、至少约7.8、至少约8.0、至少约8.2、至少约8.4、至少约8.6、至少约8.8、至少约9.0、至少约9.2、至少约9.4、至少约9.6、至少约9.8、至少约10.0。在另一个具体实施方式中，用于本发明方法的MDCK细胞支持流感病毒(例如ca/ts毒株)复制达到的log10TCID50/mL和/或log10FFU/mL为至少约7.6、至少7.8、至少8.0、至少8.2、至少8.4、至少8.6、至少8.8、至少9.0、至少9.2、至少9.4、至少9.6、至少9.8、至少10.0。在某些具体实施方式中，用于本发明方法的MDCK细胞具有非致瘤性。
疫苗和相关生物产品顾问委员会(Vaccines and Related BiologicalProducts Advisory Committee)每年向生物制品评估和研究中心(Centers forBiologics Evaluation and Research)(CBER)或世界卫生组织(WHO)和欧洲药品评估机构(European Medicines Evaluation Agency)(EMEA)推荐用于制备用于年度疫苗接种以抵御流行性流感的疫苗毒株的野生型流感病毒，并由FDA或疾病控制和预防中心(Centers for Disease Control andPrevention)(CDC)将其提供给制造商。然后可将这些毒株用于生产重配疫苗毒株，其通常将野生型病毒的NA和/或HA基因与来自具有某些所需特征的供体病毒(常称为主供体病毒或MDV)的其余基因区段结合。例如，MDV毒株可为冷适应和/或温度敏感性和/或减毒毒株，和/或具有高生长速率。以下紧接着的实施方式涉及冷适应和/或温度敏感性和/或减毒形式的不同流感毒株(例如，由一个或多个卫生组织推荐的野生型毒株)。这样的冷适应和/或温度敏感性和/或减毒流感毒株可通过获得包含来自感兴趣毒株的HA和NA基因区段以及来自合适的冷适应和/或温度敏感性和/或减毒流感毒株如在FluMist
Figure BPA00001373558000131
中发现的冷适应、温度敏感性、减毒流感病毒(caA/Ann Arbor/6/60 and ca B/Ann Arbor/1/66)的其余基因区段(本文也称为“冷适应温度敏感性减毒骨架”)的重组和/或重配流感病毒来制备。本文所用的重组和/或重配病毒包含来自野生型流感病毒毒株的HA和NA基因区段和来自冷适应和/或温度敏感性和/或减毒流感病毒的其余基因区段。也可在野生型毒株名称前的一个或多个标识“ca”、“att”、“ts”指代重配和/或重组病毒，例如，包含来自A/New Caledonia/20/99的HA和NA基因区段和来自冷适应温度敏感性减毒流感病毒(例如/Ann Arbor/6/60)的其余区段的重组和/或重排列病毒可简单称为“ca A/New Caledonia/20/99”。
在某些实施方式中，用于本发明方法的MDCK细胞(例如非致瘤性MDCK细胞)支持每年由包括但不限于CBER、WHO、EMEA、FDA和CDC的一个或多个卫生组织推荐和/或提供的冷适应和/或温度敏感性和/或减毒形式(例如重配)的至少一种流感毒株(例如，甲型流感毒株、乙型流感毒株)复制达到log10TCID50/mL和/或log10FFU/mL至少约7.6、至少约7.8、至少约8.0、至少约8.2、至少约8.4、至少约8.6、至少约8.8、至少约9.0、至少约9.2、至少约9.4、至少约9.6、至少约9.8、至少约10.0。在另一个具体实施方式中，用于本发明方法的MDCK细胞(例如非致瘤性MDCK细胞)支持每年由包括但不限于CBER、WHO、EMEA、FDA和CDC的一个或多个卫生组织推荐和/或提供的冷适应和/或温度敏感性和/或减毒形式(例如重配)的至少一种流感毒株(例如，甲型流感毒株、乙型流感毒株)复制达到log10TCID50/mL和/或log10FFU/mL至少约7.6、至少7.8、至少8.0、至少8.2、至少8.4、至少8.6、至少8.8、至少9.0、至少9.2、至少9.4、至少9.6、至少9.8、至少10.0。在某些具体实施方式中，用于本发明方法的MDCK细胞具有非致瘤性。
在某些其它实施方式中，用于本发明方法的MDCK细胞(例如非致瘤性MDCK细胞)支持冷适应和/或温度敏感性和/或减毒形式的至少一种甲型流感毒株复制。考虑到所述甲型流感毒株可属于任何亚型(例如，H1N1、H3N2、H7N7、H5N1、H9N2、H1N2、H2N2)。目前在甲型流感病毒中已鉴定出至少16种不同的HA亚型和9种不同的NA亚型。因此，所述甲型流感毒株可包含目前已知或将来鉴定的HA和NA亚型的任何组合，和/或可以是重配株。在某些具体实施方式中，用于本发明方法的MDCK细胞具有非致瘤性。
在某些其它实施方式中，用于本发明方法的MDCK细胞(例如非致瘤性MDCK细胞)支持冷适应和/或温度敏感性和/或减毒形式的至少一种流感毒株B的复制。目前未根据血凝素和神经氨酸酶蛋白将乙型流感病毒分为亚型，而是通过谱系进行分类。目前将乙型流感病毒毒株分为B/Yamagata和B/Victoria两个谱系，它们具有大量亚谱系。因此，所述乙型流感毒株可来自目前已知或将来鉴定的任何谱系和/或亚谱系，和/或可以是重配株。在某些具体实施方式中，用于本发明方法的MDCK细胞具有非致瘤性。
6.3细胞培养基和培养方法
本发明提供在生物反应器，包括单用途生物反应器和标准可重复使用生物反应器(例如，不锈钢和玻璃容器生物反应器)中生产大量疫苗材料的无血清细胞培养基和高再现性有效可升级方法。具体而言，本发明提供使流感病毒(例如，泠适应和/或稳定敏感性和/或减毒的)复制达到高效价的方法，例如log10TCID50/mL和/或log10FFU/mL至少约7.4、至少约7.6、至少约7.8、至少约8.0、至少约9.0或至少约10.0。在一个方面，本发明提供富集无血清细胞培养基，其支持MDCK细胞(例如非致瘤性MDCK细胞)增殖达到高细胞密度并不需培养基交换步骤以获得高病毒效价。除去培养基交换步骤提供若干优点，如过程时间和培养基使用量减少。此外，其减少制备过程中所需的操作数量，从而降低污染可能性。在另一个方面，本发明提供在微载体上增殖非致瘤性细胞的改进方法，包括珠粒对珠粒转移方法。在另一个方面，本发明的富集无血清细胞培养基保持非致瘤性MDCK细胞的非致瘤性特征。
6.3.1富集无血清培养基
本领域技术人员应理解，用于增殖细胞的细胞培养基可影响一种或多种细胞特征，包括但不限于：非致瘤性、非致癌性、以贴壁细胞形式生长、以非贴壁细胞形式生长、具有上皮样形态学特征、在培养时支持各种病毒复制和支持流感病毒复制达到本文所述高效价。为降低被外来物质(例如，支原体、病毒和朊病毒)污染的风险，应最大程度减少或甚至去除在组织培养应用中将血清或动物提取物用于生产治疗(例如疫苗)材料。此外，最大程度减少细胞培养过程中所需操作数量可显著降低污染的可能性。因此，本发明提供可用于采用分批培养方法增殖MDCK细胞(例如非致瘤性MDCK细胞)和生产疫苗材料的富集无血清培养基。具体而言，本发明的富集无血清培养基(本文也称为“本发明的无血清培养基”和“本发明的培养基”)可用于不采用培养基交换或补充的分批培养方法。因此，开发和使用本发明的无血清培养基可克服基于细胞培养生产疫苗材料(例如流感病毒)中最具挑战性的操作问题之一，即需要培养基交换/补充。
在一个实施方式中，本发明的无血清培养基支持非致瘤性MDCK细胞的增殖，其中所述细胞在培养基中增殖后(即传代后)保持非致瘤性。在一个具体实施方式中，所述MDCK细胞在本发明的无血清培养基中进行至少20次传代后、至少30次传代后、至少40次传代后、至少50次传代后、至少60次传代后、至少70次传代后、至少80次传代后、至少90次传代后或至少100次传代后具有非致瘤性。
在另一个实施方式中，本发明的无血清培养基支持MDCK细胞(例如非致瘤性MDCK细胞)增殖达到高密度。在一个具体实施方式中，本发明的无血清培养基支持MDCK细胞增殖达到的密度为至少5x105个细胞/mL、至少6x105个细胞/mL、至少7x105个细胞/mL、至少8x105个细胞/mL、至少9x105个细胞/mL、至少1x106个细胞/mL、至少1.2x106个细胞/mL、至少1.4x106个细胞/mL、至少1.6x106个细胞/mL、至少1.8x106个细胞/mL、至少2.0x106个细胞/mL、至少2.5x106个细胞/mL、至少5x106个细胞/mL、至少7.5x106个细胞/mL或至少1x107个细胞/mL。在另一个具体实施方式中，本发明的无血清培养基支持非致瘤性MDCK细胞增殖。
在另一个实施方式中，本发明的无血清培养基支持MDCK细胞(例如非致瘤性MDCK细胞)增殖达到高密度和随后流感病毒复制达到高效价而不需培养基交换步骤。在一个具体实施方式中，本发明的无血清培养基支持MDCK细胞增殖达到高密度和随后流感病毒(例如ca/ts毒株)复制达到log10TCID50/mL和/或log10FFU/mL为至少约6.0、至少约6.2、至少约6.4、至少约6.6、至少约6.8、至少约7.0、至少约7.2、至少约7.4、至少约7.6、至少约7.8、至少约8.0、至少约8.2、至少约8.4、至少约8.6、至少约8.8、至少约9.0、至少约9.2、至少约9.4、至少约9.6、至少约9.8、至少约10.0而不需培养基交换步骤。在其它具体实施方式中，本发明的无血清培养基支持非致瘤性MDCK细胞增殖达到高密度和随后的流感病毒，包括但不限于上述流感病毒复制。
在一个实施方式中，本发明的无血清培养基包含植物水解产物。植物水解产物包括但不限于来自以下一种或多种植物的水解产物：玉米、棉籽、豌豆、大豆、麦芽、马铃薯和小麦。植物水解产物可通过酶水解产生，通常包含肽、游离氨基酸和生长因子的混合物。植物水解产物易于从多个商业来源包括例如马可开发公司(Marcor Development)、海克隆公司(HyClone)和有机技术公司(Organo Technie)获得。还考虑到也可采用酵母水解产物代替植物水解产物或与之结合。酵母水解产物易于从多个商业来源包括例如西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)、USB公司、吉布可(Gibco)/BRL公司和其它公司获得。在某些实施方式中，除植物或酵母水解产物以外可采用合成水解产物，或采用合成水解产物代替植物或酵母水解产物。在某些实施方式中，本发明的无血清培养基包含的植物水解产物的终浓度为约0.1g/L到约5.0g/L之间、约0.5g/L到约4.5g/L之间、约1.0g/L到约4.0g/L之间、约1.5g/L到约3.5g/L之间或约2.0g/L到约3.0g/L之间。在一个具体实施方式中，本发明的无血清培养基包含终浓度为2.5g/L的植物水解产物。在另一个具体实施方式中，本发明的无血清培养基包含终浓度为2.5g/L的小麦水解产物。
在另一个实施方式中，本发明的无血清培养基包含液体补充物。可用于补充培养基的液体包括但不限于化学成分确定的动物和植物来源的液体补充物以及合成来源的液体。可存在于液体补充物中的液体包括但不限于：胆固醇、饱和和/或不饱和脂肪酸(例如，花生四烯酸、亚油酸、亚麻酸、肉豆蔻酸、油酸、棕榈酸和硬脂酸)。胆固醇可以0.10mg/ml-0.40mg/ml的浓度存在于液体补充物的100X储备液中。脂肪酸可以1μg/ml-20μg/ml的浓度存在于液体补充物的100X储备液中。适用于培养基制剂的液体易于从多个商业来源包括例如海克隆公司、吉布可/BRL公司和西格玛-奥德里奇公司获得。在某些实施方式中，本发明的无血清培养基包含的化学成分确定的液体浓缩物的终浓度在约0.1X到约2X之间、约0.2X到约1.8X之间、约0.3X到约1.7X之间、约0.4X到约1.6X之间、约0.5X到约1.5X之间、约0.6X到约1.4X之间、约0.7X到约1.3X之间或约0.8X到约1.2X之间。在一个具体实施方式中，本发明的无血清培养基包含终浓度为1X的化学成分确定的液体浓缩物(CDCL)溶液。在另一个具体实施方式中，本发明的无血清培养基包含终浓度为1X的化学成分确定的液体浓缩物(CDCL)溶液(表5)。
在另一个实施方式中，本发明的无血清培养基包含痕量元素。可采用的痕量元素包括但不限于：CuSO4·5H2O、ZnSO4·7H2O、亚硒酸·2Na、柠檬酸铁、MnSO4·H2O、Na2SiO3·9H2O、钼酸-铵盐、NH4VO3、NiSO4·6H2O、SnCl2(无水)、AlCl3·6H2O、AgNO3、Ba(C2H3O2)2、KBr、CdCl2、CoCl2·6H2O、CrCl3(无水)、NaF、GeO2、KI、RbCl、ZrOCl2·8H2O。痕量元素的浓缩储备溶液易于从多个商业来源包括例如细胞生长公司(Cell Grow)(参见目录号99-182、99-175和99-176)获得。在某些实施方式中，本发明的无血清培养基包含的痕量元素溶液A、B和C(表4)的终浓度在约0.1X到约2X之间、约0.2X到约1.8X之间、约0.3X到约1.7X之间、约0.4X到约1.6X之间、约0.5X到约1.5X之间、约0.6X到约1.4X之间、约0.7X到约1.3X之间或约0.8X到约1.2X之间。在一个具体实施方式中，本发明的无血清培养基包含终浓度为1X的痕量元素溶液A、B和C(表4)。
在另一个实施方式中，本发明的无血清培养基包含一种或多种激素、生长因子和/或其它生物分子。激素包括但不限于：三碘甲腺原氨酸(triiodothyronine)、胰岛素和皮质醇。生长因子包括但不限于：表皮生长因子(EGF)、胰岛素生长因子(IGF)、转化生长因子(TGF)和成纤维细胞生长因子(FGF)。在一个具体实施方式中，本发明的无血清培养基包含表皮生长因子(EGF)。其它生物分子包括细胞因子(例如，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素、白介素、TNF)、趋化因子(例如，调解活化正常T细胞表达和分泌的趋化因子(Rantes)、嗜伊红粒细胞趋化蛋白、巨噬细胞炎性蛋白(MIP))和前列腺素(例如，前列腺素E1和E2)。在一个实施方式中，本发明的无血清培养基包含的生长因子的终浓度为约0.0001到约0.05mg/L之间、约0.0005到约0.025mg/L之间、约0.001到约0.01mg/L之间、约0.002到约0.008mg/L之间或约0.003mg/L到约0.006mg/L之间。在一个具体实施方式中，本发明的无血清培养基包含终浓度为0.005mg/L的EGF。在一个实施方式中，本发明的无血清培养基包含的三碘甲腺原氨酸的终浓度在约1x10-12M到约10x10-12M之间、约2x10-12M到约9x10-12M之间、约3x10-12M到约7x10-12M之间或约4x10-12M到约6x10-12M之间。在一个具体实施方式中，本发明的无血清培养基包含终浓度为5x10-12M的三碘甲腺原氨酸。在一个实施方式中，本发明的无血清培养基包含的胰岛素的终浓度在约1mg/L到约10mg/L之间、约2.0mg/L到约8.0mg/L之间或约3mg/L到约6mg/L之间。在一个具体实施方式中，本发明的无血清培养基包含终浓度为5mg/L的胰岛素。在某些实施方式中，本发明的无血清培养基包含的前列腺素的终浓度在约0.001mg/L到约0.05mg/L之间、约0.005mg/L到约0.045mg/L之间、约0.01mg/L到约0.04mg/L之间、约0.015mg/L到约0.035mg/L之间或约0.02mg/L到约0.03mg/L之间。在一个具体实施方式中，本发明的无血清培养基包含终浓度为0.025mg/L的前列腺素。在另一个具体实施方式中，本发明的无血清培养基包含终浓度为0.025mg/L的前列腺素E1。
在另一个实施方式中，本发明的无血清培养基用一种或多种选自下组的培养基组分强化：腐胺、氨基酸、维生素、脂肪酸和核苷。在具体实施方式中，本发明的无血清培养基用一种或多种培养基组分强化，使所述培养基组分的浓度比在常规用于增殖细胞的培养基例如杜尔伯科改良伊格尔培养基/汉氏F12培养基(DMEM/F12)中通常发现的浓度高约1倍、约2倍、约3倍、约4倍或约5倍或更多。DMEM/F12的标准组成在以下表1中提供作为参考。在一个具体实施方式中，本发明的无血清培养基用腐胺强化。在另一个实施方式中，本发明的无血清培养基用腐胺强化，使腐胺的浓度比在DMEM/F12中通常发现的浓度高约5倍或更多。
可强化的脂肪酸包括：不饱和脂肪酸，包括但不限于亚油酸和α-亚麻酸(也称为必需脂肪酸)以及肉豆蔻脑酸、棕榈油酸、油酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、芥酸、二十二碳六烯酸；饱和脂肪酸，包括但不限于丁酸、己酸、辛酸、癸酸、十二烷酸、十四烷酸、十六烷酸、十八烷酸、二十烷酸、二十二烷酸、二十四烷酸；以及含硫脂肪酸，包括硫辛酸。在某些实施方式中，本发明的无血清培养基用除由上述液体补充物提供的脂肪酸以外的额外脂肪酸强化。在一个具体实施方式中，本发明的无血清培养基用亚油酸和亚麻酸强化。在另一个实施方式中，本发明的无血清培养基用亚油酸和亚麻酸强化，使亚油酸和亚麻酸的浓度比在DMEM/F12中通常发现的浓度高约5倍或更多。
可强化的氨基酸包括20种标准氨基酸(丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸)以及胱氨酸和非标准氨基酸。在某些实施方式中，强化通常称为“必需氨基酸”的非致瘤性MDCK细胞不合成的一种或多种氨基酸。例如，通常将8种氨基酸视作人类必需：苯丙氨酸、缬氨酸、苏氨酸、色氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸和赖氨酸。在一个具体实施方式中，本发明的无血清培养基用胱氨酸和除谷氨酰胺以外的所有标准氨基酸强化(配制DMEM/F12通常不用谷氨酰胺，将其单独加入)，使胱氨酸和标准氨基酸的浓度比在DMEM/F12中通常发现的浓度高约5倍或更多。在某些具体实施方式中，本发明的无血清培养基包含的谷氨酰胺的浓度在约146mg/L到约1022mg/L之间、约292mg/L到约876mg/L之间或约438mg/L到约730mg/L之间。在另一个具体实施方式中，本发明的无血清培养基包含终浓度为584mg/L的谷氨酰胺。
可强化的维生素包括但不限于：抗坏血酸(维生素A)、d-生物素(维生素B7和维生素H)、D-泛酸钙、胆钙化甾醇(维生素D3)、氯化胆碱、氰钴胺素(维生素B12)、麦角钙化固醇(维生素D2)、叶酸(维生素B9)、甲基萘醌类(维生素K2)、肌醇、烟酰胺(维生素B3)、对氨基苯甲酸、泛酸(维生素B5)、叶绿醌(维生素K1)、吡哆醇(维生素B6)、视黄醇(维生素A)、核黄素(维生素B2)、α-生育酚(维生素E)和硫胺素(维生素B1)。在一个具体实施方式中，本发明的无血清培养基用d-生物素、D-泛酸钙、氯化胆碱、氰钴胺素、叶酸、肌醇、烟酰胺、吡哆醇、核黄素和硫胺素进行强化，使所述维生素的浓度比DMEM/F12中通常发现的浓度高约5倍或更多。
可强化的核苷包括但不限于：胞苷、尿苷、腺苷、鸟苷、胸苷和次黄嘌呤。在一个具体实施方式中，本发明的无血清培养基用次黄嘌呤和胸苷强化，使次黄嘌呤和胸苷的浓度比在DMEM/F12中通常发现的浓度高约5倍或更多。
可加入细胞培养基的其它组分包括但不限于：碳酸氢钠、碳源(例如葡萄糖)和铁结合试剂。在一个实施方式中，本发明的无血清培养基包含的碳酸氢钠的终浓度在约1200mg/L到约7200mg/L之间、约2400mg/L到约6000mg/L之间或约3600mg/L到约4800mg/L之间。在一个具体实施方式中，本发明的无血清培养基包含终浓度为4400mg/L的碳酸氢钠。在一个实施方式中，本发明的无血清培养基包含葡萄糖作为碳源。在另一个实施方式中，本发明的无血清培养基包含的葡萄糖的终浓度在约1g/L到约10g/L之间、约2g/L到约10g/L之间、约3g/L到约8g/L之间、约4g/L到约6g/L之间或约4.5g/L到约9g/L之间。在一个具体实施方式中，本发明的无血清培养基包含终浓度为4.5g/L的葡萄糖。特别考虑到可将额外的葡萄糖加入到用于增殖非致瘤性MDCK细胞达到高密度和随后复制流感病毒的本发明无血清培养基中以避免碳源的耗尽。因此，在某些实施方式中，本发明的无血清培养基包含额外加入的1-5g/L葡萄糖以使葡萄糖终浓度在约5.5g/L到约10g/L之间。
可利用的铁结合试剂包括蛋白质如运铁蛋白和化合物如托酚酮(参见例如，美国专利5,045,454、5,118,513、6,593,140和PCT公开号WO01/16294)。在一个实施方式中，本发明的无血清培养基包含托酚酮(2-羟基-2，4，6-环庚三烯-1)和代替运铁蛋白的铁源(例如，柠檬酸铁铵、硫酸铁铵)。例如，托酚酮或托酚酮衍生物相对培养基中存在的铁将以过量摩尔浓度存在，摩尔比在约5∶1到约1∶1之间。在某些实施方式中，本发明的无血清培养基包含的托酚酮或托酚酮衍生物相对培养基中存在的铁的摩尔浓度过量，摩尔比为约5∶1、约3∶1、约2∶1、约1.75∶1、约1.5∶1或约1.25∶1。在一个具体实施方式中，本发明的无血清培养基包含终浓度为0.25mg/L的托酚酮和终浓度为0.20mg/L的柠檬酸铁铵(FAC)(参见例如表3)。
向培养基制剂加入上述组分可改变重量摩尔渗透压浓度。因此，在某些实施方式中，减少在DMEM/F12中通常发现的一种或多种组分的量以保持所需的重量摩尔渗透压浓度。在一个实施方式中，降低本发明无血清培养基中的氯化钠(NaCl)浓度。在另一个实施方式中，本发明无血清培养基中的NaCl浓度约为DMEM/F12中通常发现浓度的约10％到约90％之间、约20％到约80％之间、约30％到约70％之间或约40％到约60％之间。在一个具体实施方式中，本发明无血清培养基中的NaCl终浓度为DMEM/F12中通常发现的50％。在另一个具体实施方式中，本发明无血清培养基中的NaCl终浓度为3500mg/L。
在某些实施方式中，最大程度减少或甚至消除本发明无血清培养基中存在的动物来源组分的数量。例如，可利用市售的非动物来源的重组蛋白如胰岛素和运铁蛋白(例如，分别为生物工业公司(Biological Industries)目录号01-818-1和密理博公司(Millipore)目录号9701)代替动物来源的蛋白质。在一个具体实施方式中，用非动物来源的产物代替所有动物来源组分，可能是化学成分确定的液体混合物组分的胆固醇例外。为最大程度降低通常与动物来源产物相关的风险，胆固醇可来自与包括但不限于朊病毒的偶然因素无关地区的绵羊羊毛。
在一个具体实施方式中，本发明的无血清培养基包含表3中列出的MediV SFM 110培养基的所有组分，终浓度如表所示。在另一个具体实施方式中，本发明的无血清培养基基本由表3中列出的MediV SFM 110培养基的所有组分组成，终浓度如表所示。在另一个具体实施方式中，本发明的无血清培养基是由表3中列出组分组成的MediV SFM 110培养基。
表1 DMEM/F12培养基配方
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6.3.2珠粒对珠粒转移
在一个实施方式中，非致瘤性MDCK细胞在其所附着表面以贴壁细胞形式培养。组织培养细胞可在其上生长的附着表面包括但不限于：表面改性聚苯乙烯塑料、蛋白质包被表面(例如纤连蛋白和/或胶原蛋白包被的玻璃/塑料)以及大量市售微载体(例如，DEAE-葡聚糖微载体珠粒，如多马塞尔公司(Dormacell)、P-L公司(Pfeifer&Langen)；超珠粒公司(Superbead)、流体实验室(Flow Laboratories)的珠粒；苯乙烯共聚物-三甲胺珠粒，如希力克斯公司(Hillex)、索罗希尔公司(SoloHill)、安阿伯公司(Ann Arbor)、赛托代克斯(Cytodex)1和赛托代克斯3、GE医疗保健生命科学公司(GEHealthcare Life Science)的珠粒)。微载体珠粒是为每体积细胞培养物的贴壁细胞生长提供大表面积的小球(直径范围为100-200微米)。例如，一升培养基可包括超过2000万个微载体珠粒，提供大于8000平方厘米的生长表面。通过用于培养非致瘤性MDCK细胞的方法确定选择的附着表面。
在一个实施方式中，所用微载体的浓度在约1到约4g/L之间。在另一实施方式中，所用微载体的浓度在约2到约3g/L之间。在某些实施方式中，以约0.5到约2×105个细胞/mL的接种密度用待培养的MDCK细胞接种培养容器(例如生物反应器)。在一个具体实施方式中，所述接种密度在约0.7到约1.8×105个细胞/mL之间、在约0.8到约1.6×105个细胞/mL之间、在约0.9到约1.4×105个细胞/mL之间或在约1.0到约1.2×105个细胞/mL之间。或者可以每个微载体为基准计算所述接种密度。因此，在某些实施方式中，以约10到约40个细胞/微载体、约12到约38个细胞/微载体、约14到约36个细胞/微载体、约16到约34个细胞/微载体、约18到约32个细胞/微载体或约20到约30个细胞/微载体的接种密度用待培养的MDCK细胞接种培养容器(例如生物反应器)。
在传代培养贴壁细胞(即增殖细胞、扩增细胞培养物)的过程中，必须将所述细胞从汇合支持表面(例如，烧瓶表面、微载体等)转移到新的支持表面上。可利用多种方法实现这样的细胞转移。例如，采用包括胰蛋白酶、TrypLE和胶原酶在内的蛋白酶从烧瓶或微载体移出细胞，如果需要的话洗涤细胞，然后将细胞加入包含增殖培养基的较大烧瓶或较大体积微载体中稀释。该过程通常称为“分割”培养物，可以原始培养物和最终培养物的比率进行定量分析。例如，1:8的分割比表示将1份原始培养物(例如10mL)加入到7份新鲜培养基(例如70mL)中以形成80mL。或者根据所需接种密度和最终培养物的体积确定原始培养基中的细胞数量和计算稀释度。优选将非动物来源的蛋白酶如TrypLE(加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司(Invitrogen，Carlsbad，CA))用于这样的应用。或者，在微载体培养物中，可在细胞脱离之后向培养物中加入新鲜培养基和/或微载体珠粒。在一些实施方式中，在加入新鲜培养基和/或微载体之前、期间或之后，将蛋白酶处理的培养物转移到较大培养容器中。
在一个具体实施方式中，用蛋白酶(例如TrypLE)处理在微载体上以贴壁细胞形式生长的MDCK细胞(例如非致瘤性MDCK细胞)的细胞培养物。根据需要使所述蛋白酶失活(例如通过加入蛋白酶抑制剂，如利马豆胰蛋白酶抑制剂)，然后可向培养物中加入新鲜培养基和/或微载体珠粒。在一些实施方式中，在加入新鲜培养基和/或微载体之前、期间或之后，将蛋白酶处理的培养物转移到较大培养容器中。
在珠粒对珠粒转移方法中使用蛋白酶可导致细胞扩散差和细胞计数低。因此，本发明还提供最大程度减少或甚至消除所需蛋白酶用量以促进珠粒对珠粒转移的实现珠粒对珠粒转移的方法，包括但不限于第8.3节实施例中示例的方法，其也用于第8.1节的实施例。具体而言，发明人已确定，通过用螯合剂进行预处理，具体为在高于细胞增殖所用pH的pH进行预处理可将从微载体释放细胞所需的蛋白酶量减少至少20倍。
在一些实施方式中，通过在加入蛋白酶(例如TrypLE)之前用螯合剂预处理细胞来促进珠粒对珠粒转移。在其它实施方式中，通过在高于细胞增殖所用pH的pH加入螯合剂(例如EDTA)并进行温育来促进珠粒对珠粒转移。在一个具体实施方式中，在加入蛋白酶之前在高于细胞增殖期间所用pH的pH用螯合剂(例如EDTA)处理在微载体上以贴壁细胞形式生长的非致瘤性MDCK细胞的细胞培养物。在某些实施方式中，根据需要监测和调整pH以促进细胞从微载体基材脱离。在细胞脱离之后向培养物中加入新鲜培养基和/或微载体珠粒。在一些实施方式中，在加入新鲜培养基和/或微载体之前、期间或之后，将含或不含原始微载体的培养物转移到较大培养容器中。
在某些实施方式中，在脱离细胞之前用洗涤介质(例如缓冲盐溶液)洗涤所述细胞。可用于洗涤细胞的介质包括但不限于：Hepes缓冲溶液、磷酸盐缓冲盐水、杜尔伯科磷酸盐缓冲盐水、汉克斯(Hank’s)平衡盐溶液和厄尔(Earle’s)平衡盐溶液。洗涤细胞的过程包括用新鲜洗涤介质(即缓冲盐溶液)替换一部分或全部培养基/介质(生长培养基和/或洗涤介质)。可多次重复进行所述过程。通常，使微载体珠粒沉降一段时间(例如10-40分钟)，从容器中移出生长培养基。任选地，可利用交互低剪切切向流装置从细胞培养物中移出培养基，参见例如U.S.6,544,424。在某些实施方式中，在洗涤步骤中移出约50％到约90％的培养基/介质(生长培养基和/或洗涤介质)。在某些实施方式中，用体积小于、等于或大于移出培养基/介质体积的洗涤介质(即缓冲盐溶液)替换所述培养基/介质。在一个实施方式中，加入洗涤介质使所得细胞培养物的体积在所述细胞培养物原始工作体积的约25％到约100％之间。在一个具体实施方式中，加入细胞培养物原始工作体积约40％到约60％的洗涤介质。在另一个具体实施方式中，加入细胞培养物原始工作体积约90％到约100％的洗涤介质。在某些实施方式中，将细胞洗涤两次或更多次。
在某些实施方式中，所述洗涤介质包含螯合剂。可利用的螯合剂包括但不限于：乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、亚乙基双(氧亚乙基三次氨基)四乙酸(EGTA)。在一个具体实施方式中，所述螯合剂是EDTA。在某些实施方式中，所述洗涤介质包含浓度在约0.25mM到约0.75mM之间的螯合剂。在某些其它实施方式中，所述洗涤介质包含浓度在约0.4mM到约0.6mM之间的螯合剂。在一个具体实施方式中，所述洗涤介质包含浓度为约0.5mM的螯合剂。
在一个实施方式中，包含螯合剂的洗涤介质的pH在约7.6到约8.4之间。在一个具体实施方式中，包含螯合剂的洗涤介质的pH在约7.8到约8.2之间。在另一个具体实施方式中，包含螯合剂的洗涤介质的pH在约7.9到约8.1之间。向细胞培养物中加入包含螯合剂的洗涤介质可改变洗涤介质中所得细胞培养物的pH。因此，在某些实施方式中，在将洗涤介质加入到细胞培养物中之后，根据需要将用包含螯合剂的洗涤介质洗涤的细胞培养物的pH调整到约7.6到约8.4之间。在一个具体实施方式中，在将洗涤介质加入到细胞培养物中之后，根据需要将用包含螯合剂的洗涤介质洗涤的细胞培养物的pH调整到约7.8到约8.2之间。在另一个具体实施方式中，在将洗涤介质加入到细胞培养物中之后，根据需要将用包含螯合剂的洗涤介质洗涤的细胞培养物的pH调整到约7.9到约8.1之间。
在某些实施方式中，在加入包含螯合剂的洗涤介质之后和加入另外洗涤步骤和/或加入蛋白酶之前，搅拌细胞培养物。可采用本领域已知手段，包括但不限于搅动、振荡、旋转等搅拌培养物。搅拌的速率和持续时间通过培养物体积、洗涤介质的组分和细胞培养物中的细胞类型确定。在某些实施方式中，以与细胞增殖所用速率类似的速率搅拌细胞培养物。在其它实施方式中，以高于细胞增殖所用速率的速率搅拌细胞培养物。在采用较高搅拌速率时，所述速率的增长在约10％到约90％之间、在约20％到约80％之间、在约30％到约70％之间或在约40％到约65％之间。在一个具体实施方式中，所用搅拌速率在约40％到约65％之间。在一些实施方式中，在加入蛋白酶之前，将细胞培养物与螯合剂温育，充分搅拌以避免大多数微载体沉降到培养容器底部。在某些实施方式中，将细胞培养物搅拌约5分钟到约60分钟。在一个具体实施方式中，将细胞培养物搅拌约20分钟到约40分钟。
在某些实施方式中，在洗涤过程中但在任何搅拌后将蛋白酶(例如，丝氨酸蛋白酶)加入到细胞培养物中。在一个具体实施方式中，将细胞洗涤两次或更多次，在最后一次洗涤过程中在任何搅拌后加入蛋白酶。在本发明的某些方面，所述蛋白酶是丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶或天冬酰胺蛋白酶。在一个具体实施方式中，所述蛋白酶是丝氨酸蛋白酶(例如，胰蛋白酶、TrypLE等)。在另一个实施方式中，采用美国专利申请第11/455,818号中描述的来自灰色链霉菌(Streptomyces griseus)的蛋白酶。胰蛋白酶可来自动物来源，或更优选来自重组来源。为在这些条件下实现脱离而加入的蛋白酶量比细胞未经螯合剂预处理时所需的量至少少5倍，其由培养物体积和蛋白酶浓度确定。例如，以10X储备液提供的市售TrypLETM Express通常以约1X的终浓度使用(参见例如英杰公司TrypLE精选物新闻(InvitrogenTM TrypLE Select Product News))以解离高度贴壁细胞如MDCK细胞。如本文所示(参见第8.3节)，细胞从微载体脱离所需的TrypLETM终浓度是0.05X，降低了20倍。因此，在某些实施方式中，向细胞培养物中加入的蛋白酶终浓度在约0.1X到约0.0125X之间、约0.1X到约0.0125X之间、约0.1X到约0.025X之间、约0.1X到约0.05X之间、约0.1X到约0.075X之间、约0.075X到约0.0125X之间、约0.05X到约0.0125X之间、约0.025X到约0.0125X之间或约0.075X到约0.025X、约0.5X、约0.1X、约0.09X、约0.08X、约0.07X、约0.06X、约0.05X、约0.04X或约0.02X之间，其中1X表示在相同解离条件下使未经螯合剂预处理的细胞脱离所需的蛋白酶终浓度。还应理解，1X还表示蛋白酶浓缩储备液(例如，以10X储备液提供的蛋白酶)稀释之后的最终工作浓度，该工作储备液还可稀释以获得低于1X的浓度。
大规模制造中的可再现珠粒对珠粒转移通常采用多个洗涤步骤，例如以确保蛋白酶预处理的细胞培养物包含最小量的蛋白酶抑制剂或如上所述以最大程度减少和/或消除对蛋白酶的需求。然而，就大规模商业过程而言，实施这些洗涤步骤可能成本昂贵，可引起污染导致生产运行失败、制备过程不可靠和生产力降低。因此，本发明提供通过消除珠粒对珠粒转移过程中的细胞培养物洗涤步骤来克服这些缺点的新方法。实现减少或甚至消除对洗涤步骤需求的珠粒对珠粒转移的方法包括但不限于第8.5节实施例中示例的方法。具体而言，发明人已确定，在进行蛋白酶处理之前用螯合剂(例如EDTA)进行预处理无需移出生长培养基和洗涤细胞。此外，通过补充含额外培养基组分(例如，二价阳离子和/或痕量元素)的新鲜培养基，不需在蛋白酶处理后洗涤细胞。
在一些实施方式中，通过在加入蛋白酶(例如TrypLE)之前直接向细胞培养物加入螯合剂(即不洗涤细胞)来促进珠粒对珠粒转移。可用于上述方法的螯合剂如上所述。在一个实施方式中，所述螯合剂能螯合二价阳离子(例如，Ca2+和Mg2+)。在一个具体实施方式中，所述螯合剂是EDTA。在一些实施方式中，向细胞培养物中加入的螯合剂的终浓度在0.5mM到5mM之间、约0.5mM到约4mM之间、约0.5mM到约3mM之间、约0.5mM到约2mM之间、约0.5mM到约1.5mM之间、约0.5mM到约1mM之间、约1mM到约5mM之间、约1.5mM到约5mM之间、约2.0mM到约5mM之间、约3.0mM到约5mM之间、约4.0mM到约5mM之间或约1mM到约2mM之间。在一个具体实施方式中，向细胞培养物中加入终浓度为约2mM的螯合剂。加入螯合剂之后，然后可在加入蛋白酶之前将细胞培养物温育一段时间。在一些实施方式中，在加入蛋白酶之前将细胞培养物与螯合剂温育约0分钟到约120分钟、约0分钟到约90分钟、约0分钟到约60分钟、约0分钟到约30分钟、约30分钟到约120分钟、约60分钟到约120分钟、约90分钟到约120分钟、约30分钟到约90分钟或约60分钟。在某些实施方式中，在加入螯合剂之后且加入蛋白酶之前，搅拌细胞培养物。搅拌的手段、速率和持续时间如上所述，可由本领域技术人员不经过度实验进行优化。在一个具体实施方式中，在加入蛋白酶之前，将细胞培养物与螯合剂温育，充分搅拌以避免大多数微载体沉降到培养容器底部。
在加入蛋白酶之前，可将经螯合的细胞培养物的pH调整到例如蛋白酶的最适宜pH。在一个具体实施方式中，将pH调整到约7.8到约8.2之间。可在螯合剂预处理之后采用的蛋白酶如上所述。在一些实施方式中，在螯合剂预处理之后向细胞培养物加入的蛋白酶终浓度在约0.1X到约0.0125X之间、约0.1X到约0.0125X之间、约0.1X到约0.025X之间、约0.1X到约0.05X之间、约0.1X到约0.075X之间、约0.075X到约0.0125X之间、约0.05X到约0.0125X之间、约0.025X到约0.0125X之间或约0.075X到约0.025X之间。在其它实施方式中，在螯合剂预处理之后向细胞培养物加入的蛋白酶终浓度是约0.09X、约0.08X、约0.07X、约0.06X、约0.05X、约0.04X或约0.02X，其中1X表示蛋白酶浓缩储备液(例如以10X储备液提供的蛋白酶)稀释之后的最终工作浓度。蛋白酶处理的持续时间可通过监测细胞脱离确定，并可根据所用蛋白酶浓度变化。监测细胞脱离的方法为本领域已知，包括显微镜检测细胞培养物。一旦细胞脱离，可根据需要使蛋白酶失活(例如通过加入蛋白酶抑制剂，如利马豆胰蛋白酶抑制剂)，然后可向培养物中加入新鲜培养基和/或微载体珠粒。在一些实施方式中，在加入新鲜培养基和/或微载体之前、期间或之后，将蛋白酶处理的培养物转移到较大培养容器中。
为促进蛋白酶处理之后的再附着和细胞生长，用一种或多种培养基组分补充加入到细胞培养物中的新鲜培养基，所述培养基组分包括但不限于CaCl2、MgCl2、MgSO4、痕量元素A、B和C。也可向培养物加入额外的微载体珠粒。CaCl2、MgCl2和MgSO4的示例性浓度见表25所示，其中90％或更多的细胞再附着到微载体上。CaCl2、MgCl2、MgSO4、痕量元素A、B和C的示例性浓度如表26所示，其中接种4天后的细胞计数为至少1.0E6个细胞/mL。在某些实施方式中，向培养基补充约1.25mM到约1.5mMCaCl2、约0.1mM到约0.2mM MgCl2和约0.1mM到约0.8mM MgSO4。在其它实施方式中，还向培养基补充约2X的痕量元素A、B和C。在一些实施方式中，在加入新鲜的补充培养基和/或微载体之前、期间或之后，将含或不含原始微载体的培养物转移到较大培养容器中。
在一个实施方式中，在培养系统中以贴壁细胞形式培养MDCK细胞。可用来培养MDCK细胞的培养系统包括例如，分批培养系统和由于营养物在起始培养基消耗而加入额外营养物(例如，碳源、氨基酸等)以促进细胞生长达到高密度的补料分批培养系统。或者或任选地，可采用灌注培养系统(例如，采用细胞滞留系统，如离心、过滤、旋转过滤器(spin filter)等)促进培养基交换和/或消耗营养物的补充。在一个具体实施方式中，采用本发明的无血清培养基(例如MediV SFM 110)在无培养基交换/补充(例如，补料或灌注)的分批培养系统中以贴壁细胞形式培养非致瘤性MDCK细胞。关于以贴壁细胞形式培养MDCK细胞(例如非致瘤性MDCK细胞)的其它指导可参见例如，美国专利申请公开第2003/0108860、2005/0118140号和PCT公开WO 2008/105931。可用于培养MDCK细胞的常用培养系统包括搅拌容器生物反应器。
6.3.3流感病毒培养条件
本发明提供在如上所述无血清培养基制剂中培养MDCK细胞(例如非致瘤性MDCK细胞)和其它动物细胞的方法。特别考虑到其它培养条件可在保持MDCK细胞的性质中发挥作用，所述MDCK细胞的性质包括非致瘤性、非致癌性、以贴壁细胞形式生长、以非贴壁细胞形式生长、具有上皮样形态学特征、支持各种病毒复制和支持流感病毒(例如，冷适应和/或温度敏感性和/或减毒)生长达到高效价，例如，至少约7.8、至少约8.0或至少约9.0的log10TCID50/mL和/或log10FFU/mL。这些培养条件包括但不限于：附着表面的选择、细胞密度、温度、CO2浓度、培养方法、搅拌速率、溶氧含量和pH。
特别考虑到可以多种方式改变培养条件以优化MDCK细胞(例如非致瘤性MDCK细胞)的生长。这样的改变还可引起病毒材料(例如病毒)产量增加，如例如美国专利申请公开第2005/0118698号所述。或者可改变培养条件以优化不考虑细胞生长从MDCK细胞生产疫苗材料。这些培养条件包括但不限于：附着表面、细胞密度、温度、CO2浓度、培养方法、溶氧含量和pH。
在一个实施方式中，培养MDCK细胞(例如非致瘤性MDCK细胞)的CO2浓度为至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％或至少20％。
在一个实施方式中，在培养MDCK细胞的过程中优选调节溶氧(DO)浓度(pO2值)，使其处于5％-100％(根据空气饱和度)或10％-60％的范围。在一个具体实施方式中，溶氧(DO)浓度(pO2值)为至少10％、至少20％、至少30％、至少50％或至少60％。在一个具体实施方式中，DO浓度保持在50％。在一个具体实施方式中，DO下降到50％，然后保持在该水平。保持DO水平的方法包括例如用纯氧喷淋。
由于搅拌细胞培养物通常可引起发泡，特别是喷淋可引起发泡，在某些实施方式中，向细胞培养物加入防泡剂以减少发泡。可用于哺乳动物细胞培养的防泡剂易于从多个商业来源包括例如，英杰公司、道康宁公司(DowCorning)、西格玛公司和其它公司获得。具体的防泡剂包括但不限于防泡乳剂C(Antifoam C Emulsion)和FoamAwayTM。在一个具体实施方式中，向培养物加入的防泡乳剂C在约10ppm到约1000ppm之间、约25ppm到约750ppm之间、约50ppm到约500ppm之间、约75ppm到约250ppm之间或约50ppm到约150ppm之间。在某些实施方式中，两天一次、一天一次或每隔一天一次向细胞培养物加入防泡剂。在其它实施方式中，在加入MDCK细胞之前向细胞培养基加入防泡剂。
在另一个实施方式中，在培养过程中调节用于培养非致瘤性MDCK细胞的培养基的pH，使其处于pH 6.4-pH 8.0或pH 6.8-pH 7.4的范围。在一个具体实施方式中，培养基的pH为约6.4、约6.6、约6.8、约7.0、约7.2、约7.4、约7.6、约7.8或至少8.0。在一个具体实施方式中，培养基的pH为约7.4。
在另一个实施方式中，在25℃-39℃的温度于本发明的无血清培养基中培养MDCK细胞。特别考虑到培养温度可根据所需方法改变。例如，非致瘤性MDCK细胞可在37±2℃生长以便增殖细胞，可在较低温度(例如，25℃-35℃)生产疫苗材料(例如病毒)。在另一个实施方式中，在低于30℃、低于31℃、低于32℃、低于33℃或低于34℃的温度培养细胞以便生产疫苗材料。在另一个实施方式中，在30℃、31℃、32℃、33℃或34℃的温度培养细胞以便生产疫苗材料。在一个具体实施方式中，在33±2℃的温度培养细胞以便生产疫苗材料。
在某些实施方式中，在搅拌容器生物反应器(例如，塑料的单用途生物反应器、玻璃或不锈钢的可重复使用生物反应器)中于本发明的无血清培养基中培养MDCK细胞，监测和/或控制选自下组的一个或多个参数：温度、搅拌速率、pH、溶氧(DO)、O2和CO2流速。在一个实施方式中，温度保持在约30℃到约42℃之间、约33℃到约39℃之间或约35℃到约38℃之间。在一个具体实施方式中，温度保持在约36℃到约38℃之间在一个实施方式中，搅拌速率保持在约100到200rpm之间。在一个具体实施方式中，采用单用途生物反应器，搅拌速率保持在约80到约120rpm之间或约90到约100rpm之间。在另一个具体实施方式中，采用可重复使用生物反应器，搅拌速率保持在约150到约200rpm之间或约160到约180rpm之间。通过本领域已知手段控制搅拌速率。所用生物反应器的类型和尺寸以及所用搅拌桨的类型和数量可能需要调整搅拌速率以最大程度增加细胞生长和/或最大程度减少细胞损伤。
在另一个实施方式中，MDCK细胞的pH保持在约6.4到8.0之间。在一个具体实施方式中，起始培养物的pH在约6.8到约7.6之间，培养物的pH在培养过程中保持在约7.0到约7.5之间。初始pH可低于或高于所需范围，可使pH升高或降低到所需水平(例如7.4)并保持。在一个具体实施方式中，pH保持在约7.4。可根据需要通过喷淋CO2和/或加入酸(例如HCl)或碱(例如，NaOH、NaHCO3、Na2CO3)来控制pH。
在另一个实施方式中，DO的可接受范围在约100到约35％之间。在一个具体实施方式中，MDCK细胞培养物的DO保持在约35％到约50％之间或保持在约50％。在另一个实施方式中，DO不应降至低于约35％。在某些实施方式中，初始DO可为100％，可使DO下降到预定水平(例如50％)并保持。通过例如喷淋O2保持DO。在某些实施方式中，O2流速保持在小于约2.0L/分钟。在某些实施方式中，CO2流速保持在小于约0.4L/分钟。在其它实施方式中，保持恒定的总流速(例如40mL/分钟)，提供N2气体以保持流速。因此，可从用于保持DO和pH的O2和CO2气体计算N2气体的供给量。
可在非致瘤性MDCK细胞的培养过程中很容易地操作培养基中葡萄糖、谷氨酰胺、乳酸、其它培养基组分的含量以及pH和pO2值和其它参数如搅拌，以优化细胞密度和/或病毒产量。
6.3.4呼吸道合胞病毒培养条件
在一个具体实施方式中，在用本文所述细胞相关病毒感染之前培养细胞以达到一定的活细胞总计数。例如，可在约37℃在补充有4mM L-谷氨酰胺和1％CDLC的VP-SFM中培养Vero细胞，测定活细胞总计数和细胞活力。在一个具体实施方式中，在达到一定平均活细胞计数时，用细胞相关病毒感染细胞。例如，可在用本文所述细胞相关病毒如RSV感染细胞之前达到约1.5x108个细胞/组织培养容器或更多的平均活细胞计数。在一个实施方式中，采用例如Vi-细胞计数仪测定，在用本文所述细胞相关病毒感染细胞之前达到约1x106个细胞/组织培养容器到约1x1014个细胞/组织培养容器的平均活细胞计数。在另一个实施方式中，采用例如Vi-细胞计数仪测定，在用本文所述细胞相关病毒感染细胞之前达到约1x106个细胞/组织培养容器、约5x106个细胞/组织培养容器、约1x107个细胞/组织培养容器或约5x107个细胞/组织培养容器的平均活细胞计数。在另一个实施方式中，采用例如Vi-细胞计数仪测定，在用本文所述细胞相关病毒感染细胞之前达到约1x108个细胞/组织培养容器、约5x108个细胞/组织培养容器、约1x109个细胞/组织培养容器、约5x109个细胞/组织培养容器或约1x1010个细胞/组织培养容器的平均存活细胞计数。
采用确定对所选细胞最佳的感染复数(MOI)感染细胞。在一个具体实施方式中，采用约0.0001到约1或约0.0005到0.005的MOI感染本文所述细胞。在另一个实施方式中，采用约0.0001、约0.0005或约0.00075的MOI感染本文所述细胞。在另一个实施方式中，采用约0.001、约0.005、约0.0075或约0.01的MOI感染本文所述细胞。在另一个实施方式中，采用约0.05、约0.075、约0.1或约0.5的MOI感染本文所述细胞。在一个具体实施方式中，采用MOI为约0.01的rA2cp248/404/1030ΔSH感染Vero细胞。
可将细胞相关病毒感染的细胞在适合所选细胞系和获得病毒效价最佳结果的培养基和条件(例如，温度、CO2条件和pH)下温育一段时间。例如，可将用RSV如rA2cp248/404/1030ΔSH感染的Vero细胞在补充有4mML-谷氨酰胺的SF4MegaVir培养基(加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司)中培育，并在约30℃无CO2培育约10天，然后收获病毒。在一些实施方式中，将RSV感染细胞(例如，RSV感染的Vero细胞)温育约8-14天，然后收获病毒。在具体实施方式中，将RSV感染细胞温育约8天，优选约9天、约10天、约11天或约12天，然后收获病毒。
可在本领域技术人员已知的任何组织培育容器中培养本文所述细胞相关病毒感染细胞。在一些实施方式中，在T-75烧瓶或T-225烧瓶中培养细胞相关病毒感染细胞。在其它实施方式中，在1升、2升、3升、4升或5升组织培养容器中培养细胞相关病毒感染细胞。在一个具体实施方式中，在至少40个500ml工作体积的滚瓶中培养细胞相关病毒感染细胞。在一个具体实施方式中，在4升组织培养容器如滚瓶中培养细胞相关病毒感染细胞。在其它实施方式中，在10升、15升、20升或25升组织培养容器中培养细胞相关病毒感染细胞。在其它实施方式中，在50升、75升或100升组织培养容器中培养细胞相关病毒感染细胞。在其它实施方式中，在250升、500升或1000升组织培养容器中培养细胞相关病毒感染细胞。可采用的组织培养容器包括烧瓶、滚瓶、生物反应器和本领域技术人员已知的任何其它组织培养容器。
6.4疫苗材料的生产
本发明提供采用MDCK细胞(例如非致瘤性MDCK细胞)产生病毒的在细胞培养物中生产病毒的可靠方法。具体而言，本发明提供生产流感病毒达到高效价而不需培养基交换或补充的方法。
在一个实施方式中，生产流感病毒的方法包括以下步骤：
(a)在无血清培养基中增殖MDCK细胞，同时保持选自下组的一种或多种培养条件：约100到200rpm的搅拌速率、约6.0到约7.8的pH、约33℃到约42℃的温度和约35％到约100％的溶氧(DO)；
(b)用流感病毒感染增殖MDCK细胞而不交换培养基；和
(c)在允许流感病毒复制的条件下温育感染的增殖MDCK细胞。
本文描述了可通过本发明方法产生的流感病毒(参见例如，第6.2和6.7节)，其包括但不限于在减毒、温度敏感性、冷适应(ca/ts/att)主供体病毒的背景下引入所选凝血素和/或神经氨酸酶抗原的重配病毒。例如，病毒可包含例如温度敏感性(ts)、冷适应(ca)或减毒(att)(例如，A/Ann Arbor/6/60、B/Ann Arbor/1/66、PR8、B/Leningrad/14/17/55、B/14/5/1、B/USSR/60/69、B/Leningrad/179/86、B/Leningrad/14/55、B/England/2608/76等)中一种或多种的主供体病毒的主链(或一个或多个vRNA区段)。在卵或细胞系中生产重配流感疫苗毒株的方法包括例如，Kilbourne，E.D.于《疫苗(Vaccines)》(第2版)，Plotkin和Mortimer编，WB桑德斯公司出版(WB Saunders Co.)(1988)中公开的方法以及在PCT申请PCT专利公开号WO 05/062820和WO03/091401，在美国专利号6,951,754、6,887,699、6,649,372、6,544,785、6,001,634、5,854,037、5,824,536、5,840,520、5,820,871、5,786,199和5,166,057，美国专利申请公开号20060019350、20050158342、20050037487、20050266026、20050186563、20050221489、20050032043、20040142003、20030035814和20020164770中公开的方法。可通过本发明方法产生的其它流感病毒包括可表达异源基因产物的重组流感病毒，参见例如，美国专利公开号2004/0241139和2004/0253273。在某些实施方式中，所述方法用来产生冷适应和/或温度敏感性和/或减毒流感病毒。
在一个具体实施方式中，产生的流感病毒达到至少约8.0的峰病毒效价log10TCID50/mL和/或log10FFU/mL。在其它实施方式中，产生的流感病毒达到至少至少约8.1、至少8.2、至少8.3、至少8.4、至少8.5、至少8.6、至少8.7、至少8.8、至少8.9或至少9.0的峰病毒效价log10TCID50/mL和/或log10FFU/mL。
在某些实施方式中，MDCK细胞以贴壁细胞形式增殖。在一个具体实施方式中，所述MDCK细胞是非致瘤性MDCK细胞，以贴壁细胞形式增殖。在另一个具体实施方式中，所述MDCK细胞选自ATTCC保藏号PTA-6500、PTA-6501、PTA-6502、PTA-6503、PTA-7909或PTA-7910，以贴壁细胞形式增殖。可用于增殖贴壁细胞的生物反应器和方法如上所述(参见第6.3.2和6.3.3节)。在其它实施方式中，MDCK细胞以非贴壁细胞形式增殖。增殖非贴壁MDCK细胞的方法为本领域已知，参见例如美国专利第6,455,298号。其它培养条件，例如温度、搅拌速率、pH、pO2、CO2浓度和细胞接种密度如上详述(参见第6.3.2和6.3.3节)。
在一个具体实施方式中，所述MDCK细胞以贴壁细胞形式在搅拌容器生物反应器中增殖。在所述方法的某些实施方式中，如上所述在培养过程中调节培养细胞的培养基的温度、搅拌速率、pH、pO2值、CO2浓度和其它参数(参见第6.3.2和6.3.3节)。在某些实施方式中，所述MDCK细胞增殖达到约5x105到约3x106的细胞密度。或者或任选地，使所述MDCK细胞增殖一段固定时间。初始接种密度、倍增时间和所需最终细胞密度将确定增殖时间段。在这样的实施方式中，所述细胞可例如增殖1-10天、2-8天或3-7天。在一些实施方式中，MDCK细胞增殖约3到约5天。
在某些实施方式中，所述无血清培养基是如本文所述的富集无血清培养基(参见第6.3.1节)。在一个实施方式中，所述无血清培养基包含植物水解产物、液体补充物、痕量元素，并用一种或多种选自下组的培养基组分强化：腐胺、氨基酸、维生素、脂肪酸和核苷。在另一个实施方式中，所述无血清培养基包含表3列出的MediV SFM110培养基的所有组分。在一个具体实施方式中，所述无血清培养基主要由表3中列出的MediV SFM110培养基的所有组分组成。在另一个具体实施方式中，所述无血清培养基由表3中列出的组分以所示终浓度组成。在某些实施方式中，所述无血清培养基包含终浓度为约4.5g/L的葡萄糖。在其它实施方式中，所述无血清培养基包含终浓度为约9.0g/L的葡萄糖。
可用来感染细胞(步骤(b))的流感病毒包括但不限于本文所述的流感病毒(参见例如第6.2和6.7节)。为感染细胞加入的病毒量(本文称为“病毒输入量”)可测定为每个细胞加入的病毒数量(也通常称为感染复数或MOI)。在一些实施方式中，采用约0.00001FFU/细胞到约10FFU/细胞、约0.00001FFU/细胞到约1FFU/细胞、约0.00001FFU/细胞到约0.1FFU/细胞或约0.00001FFU/细胞到约0.001FFU/细胞的病毒输入量实施用病毒感染细胞。在一个实施方式中，采用约0.00001FFU/细胞到约0.0001FFU/细胞或约0.00002FFU/细胞到约0.0002FFU/细胞的病毒输入量实施用病毒感染细胞。在一个具体实施方式中，采用约0.00001FFU/细胞到约0.00005FFU/细胞的病毒输入量实施用病毒感染细胞。在另一个具体实施方式中，采用约0.0001FFU/细胞到约0.0005FFU/细胞的病毒输入量实施用病毒感染细胞。可采用下式确定加入的病毒量：
病毒量(μL)＝总细胞数x病毒输入量(FFU/细胞)/10病毒FFA效价(FFU/mL)×1000。
或者通过培养物中的病毒终浓度确定用于感染细胞的病毒量(即病毒输入量)。例如，可加入终浓度为约1x103FFU/mL到约0.001x103FFU/mL或约0.1x103FFU/mL到约0.01x103FFU/mL的病毒。可采用下式确定为达到所需终浓度加入的病毒量：
病毒量(μL)＝培养基体积(mL)x终浓度(FFU/mL)/10病毒FFA效价(FFU/mL)×1000。
可任选加入蛋白酶，其可引起对血凝素前体蛋白[HA0]的切割并由此吸附细胞上的病毒。可根据本发明在用流感病毒感染细胞之前不久、同时或之后不久加入蛋白酶。如果在感染同时加入，所述蛋白酶可直接向待感染的细胞培养物加入或例如以浓缩物形式连同病毒接种物加入。在本发明的某些方面，所述蛋白酶是丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶或天冬酰胺蛋白酶。在一个实施方式中，采用胰蛋白酶。在一个具体实施方式中，采用TPCK处理的胰蛋白酶。在一个实施方式中，向细胞培养物加入胰蛋白酶直到达到1-5000mU/ml、5-1000mU/ml或100-500mU/ml的终浓度。在一个替代实施方式中，向细胞培养物加入胰蛋白酶直到在培养基中达到1-200μg/ml、5-50μg/ml或5-30μg/ml的终浓度。
所述蛋白酶可来自动物来源，或更优选来自重组来源。适用的重组蛋白酶易于从多个商业来源包括例如英杰公司(TrypLETM)、西格玛-奥德里奇公司(TrypZeanTM)以储备溶液形式(例如1X-100X)获得。在某些实施方式中，所用重组蛋白酶的终浓度在约0.01X到约1X之间、约0.02X到约0.8X之间、约0.03X到约0.7X之间、约0.04X到约0.6X之间、约0.05X到约0.5X之间、约0.06X到约0.4X之间、约0.07X到约0.3X之间或约0.8X到约0.2X之间。在一个特定实施方式中，所用重组蛋白酶的终浓度在约0.02X到约0.06X之间。在另一个实施方式中，所述蛋白酶是重组胰蛋白酶样蛋白酶，包括但不限于TrypLETM(英杰公司)。在另一个实施方式中，如美国专利申请第11/455,818号所述，蛋白酶来自灰色链霉菌。
感染之后，进一步培养受感染的细胞培养物以复制病毒，具体而言，直到可检测到最大致细胞病变效应或最大病毒或抗原量。在一个实施方式中，感染之后，在30℃到37℃之间的温度培养细胞。在某些实施方式中，用病毒感染之后，在低于39℃、低于38℃、低于37℃、低于36℃、低于35℃、低于34℃、低于33℃、低于32℃、低于31℃或低于30℃的温度培养细胞。在33℃以下的温度，具体为上述温度范围培养感染细胞引起某些流感病毒例如乙型毒株的高产率生产(参见例如美国专利公开2006/0153872)。此外，考虑在35℃以下的温度培养感染细胞以便生产温度敏感性、冷适应(ts/ca)流感病毒。考虑ts/ca病毒也可被减毒(att)。在另一个实施方式中，在低于30℃、低于31℃、低于32℃、低于33℃或低于34℃的温度培养细胞以便生产ts/ca流感毒株。在一个具体实施方式中，在31℃的温度培养细胞以便生产乙型流感病毒毒株。在另一个实施方式中，感染之后，在31±2℃的温度培养细胞。
在某些实施方式中，感染之后将细胞温育(步骤(c))充足时间，如2-10天或任选3-7天以产生合适产率的病毒。在所述方法的一个实施方式中，感染之后将细胞温育(步骤(c))温育2天、3天、4天、5天、6天或7天。在其它实施方式中，感染之后将细胞温育(步骤(c))40-96个小时。在一个具体实施方式中，感染之后将细胞温育(步骤(c))48-72个小时。
在所述方法的某些实施方式中，用病毒感染(步骤(b))之后，可例如温育细胞，如上所述维持搅拌速率、pH、pO2值、CO2浓度和其它参数(参见第6.3.2和6.3.3节)。
在某些实施方式中，所述方法还包括步骤(c)后收获包含复制病毒的培养基(即已培养感染细胞的培养基)的步骤。收获的包含复制病毒的培养基在本文也称为“病毒收获物”。
在一个实施方式中，在收获包含复制病毒的培养基之前，使用于增殖MDCK细胞的任何微载体沉降。或者或任选地，可利用交互低剪切切向流(ATF)装置收获包含复制病毒的培养基，参见例如U.S.6,544,424。采用ATF装置可减少或甚至消除收获前微载体沉降所需时间。在另一个实施方式中，用合适的缓冲液稳定病毒收获物。
在一个具体实施方式中，通过加入包括但不限于蔗糖磷酸盐(SP)缓冲液的浓缩缓冲液稳定病毒收获物，可加入所述浓缩缓冲液在稳定病毒收获物中达到约218mM蔗糖、11mM pH 7.0-7.4磷酸盐缓冲液的终浓度。
在另一个具体实施方式中，将收获包含复制病毒的培养基的步骤与复制病毒的纯化结合。例如，可采用交互切向流(ATF)收获包含复制病毒的培养基，收获的材料可直接进行以下详述的一个或多个纯化步骤。
6.5疫苗材料的纯化
本发明提供纯化病毒，具体为在细胞培养物中复制供临床应用的活病毒的可靠方法。本发明的纯化方法可用于从哺乳动物细胞培养物纯化病毒，所述哺乳动物细胞包括但不限于：人二倍体肺成纤维细胞系(例如，MRC-5和WI-38)、人成视网膜细胞瘤细胞系、人肾细胞系(例如，PER.C6和293)、胎儿猕猴肺细胞系(例如FRhL2)、非洲绿猴肾细胞系(例如Vero)和狗肾细胞系(例如MDCK)。本发明的纯化方法提供的病毒，具体为活病毒的总回收率高，使宿主细胞DNA(HCD)、宿主细胞蛋白质(HCP)和非特异性内切核酸酶(例如Benzonase)的水平低于管理机构要求的规格。
减少病毒制备物的HCD量对意图临床用于动物(包括人)的病毒特别重要。此外，考虑到任何残留HCD的大小均应小于癌基因的平均大小(1925个碱基对)以降低致癌可能性。因此，在一个方面，本发明提供将任何残留HCD的量和大小降低到可注射疫苗可接受的水平(WHO推荐胃肠道外给予疫苗为每剂量10ng；Griffiths，1999，《发育生物学标准(Dev Biol Stand)》瑞士巴塞尔卡格公司出版(Basel，Karger)，第98卷，第153-157页)以下的纯化流感病毒或RSV的方法。
在某些实施方式中，所述纯化病毒包含少于约10ng HCD/剂量、少于约9ng HCD/剂量、少于约8ng HCD/剂量、少于约7ng HCD/剂量、少于约6ng HCD/剂量、少于约5ng HCD/剂量、少于约4ng HCD/剂量、少于约3ng HCD/剂量、少于约2ng HCD/剂量、少于约1ng HCD/剂量、少于约0.8ng HCD/剂量、少于约0.6ng HCD/剂量、少于约0.4ng HCD/剂量或少于约0.2ng HCD/剂量。在一个具体实施方式中，所述纯化病毒包含少于约1ng HCD/剂量、少于约0.8ng HCD/剂量、少于约0.6ng HCD/剂量、少于约0.4ng HCD/剂量或少于约0.2ng HCD/剂量。
在其它实施方式中，所述纯化病毒是流感病毒，包含少于约10ngHCD/7.0±0.5log10FFU、少于约9ng HCD/7.0±0.5log10FFU、少于约8ngHCD/7.0±0.5log10FFU、少于约7ng HCD/7.0±0.5log10FFU、少于约6ngHCD/7.0±0.5log10FFU、少于约5ng HCD/7.0±0.5log10FFU、少于约4ngHCD/7.0±0.5log10FFU、少于约3ng HCD/7.0±0.5log10FFU、少于约2ngHCD/7.0±0.5log10FFU、少于约1ng HCD/7.0±0.5log10FFU、少于约0.8ngHCD/7.0±0.5log10FFU、少于约0.6ng HCD/7.0±0.5log10FFU、少于约0.4ngHCD/7.0±0.5log10FFU或少于约0.2ng HCD/7.0±0.5log10FFU。在一个具体实施方式中，所述纯化病毒包含少于约1ng HCD/7.0±0.5log10FFU、少于约0.8ng HCD/7.0±0.5log10FFU、少于约0.6ng HCD/7.0±0.5log10FFU、少于约0.4ng HCD/7.0±0.5log10FFU或少于约0.2ng HCD/7.0±0.5log10FFU。
在一个实施方式中，采用PicoGreen试验测定HCD量。在另一个实施方式中，采用实时聚合酶链反应(rtPCR)测定HCD量。可采用第8.6节提供的实施例中示例的方法进行这些鉴定试验。
在某些实施方式中，纯化病毒中存在的至少约50％、至少约60％、至少约70％或至少约80％的HCD长度少于约1000个碱基对(bp)。在一个具体实施方式中，纯化病毒中存在的至少约80％的HCD长度少于约1000bp。在另一个具体实施方式中，纯化病毒中存在的约90％的HCD长度少于约1000bp。在其它实施方式中，纯化病毒中存在的至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％或至少约80％的HCD长度少于约500bp。在一个具体实施方式中，纯化病毒中存在的至少约60％的HCD长度少于约500bp。
在一些实施方式中，所述纯化病毒包含少于约10μg HCP/剂量、少于约9μg HCP/剂量、少于约8μg HCP/剂量、少于约7μg HCP/剂量、少于约6μg HCP/剂量、少于约5μg HCP/剂量、少于约4μg HCP/剂量、少于约3μgHCP/剂量、少于约2μg HCP/剂量、少于约1μg HCP/剂量、少于约0.8μgHCP/剂量、少于约0.6μg HCP/剂量、少于约0.4μg HCP/剂量或少于约0.2μgHCP/剂量。在一个具体实施方式中，所述纯化病毒包含少于约1ng HCP/剂量、少于约0.8μg HCP/剂量、少于约0.6μg HCP/剂量、少于约0.4μg HCP/剂量或少于约0.2μg HCP/剂量。
在其它实施方式中，所述纯化病毒是流感病毒，包含少于约10μgHCP/7.0±0.5log10FFU、少于约9μg HCP/7.0±0.5log10FFU、少于约8μgHCP/7.0±0.5log10FFU、少于约7μg HCP/7.0±0.5log10FFU、少于约6μgHCP/7.0±0.5log10FFU、少于约5μg HCP/7.0±0.5log10FFU、少于约4μgHCP/7.0±0.5log10FFU、少于约3μg HCP/7.0±0.5log10FFU、少于约2μgHCP/7.0±0.5log10FFU、少于约1μg HCP/7.0±0.5log10FFU、少于约0.8μgHCP/7.0±0.5log10FFU、少于约0.6μg HCP/7.0±0.5log10FFU、少于约0.4μgHCP/7.0±0.5log10FFU或少于约0.2μg HCP/7.0±0.5log10FFU。在一个具体实施方式中，所述纯化病毒包含约1ng HCP/7.0±0.5log10FFU、少于约0.8μgHCP/7.0±0.5log10FFU、少于约0.6μg HCP/7.0±0.5log10FFU、少于约0.4μgHCP/7.0±0.5log10FFU或少于约0.2μg HCP/7.0±0.5log10FFU。
在一个实施方式中，采用HCP的抗体检测通过酶联免疫吸附鉴定(ELISA)测定HCP量。可采用第8.6节提供的实施例中示例的方法进行该鉴定试验。
制备用于疫苗组合物的灭活/裂解病毒颗粒的方法为本领域熟知，已使用了40余年。然而，这些方法引入了苛刻的步骤，如用甲醛去污剂处理，其通常不可用于制备完整的病毒颗粒，特别是减毒的活病毒。因此，本发明提供采用足以从病毒收获物分离HCD和HCP的膜和条件来纯化完整的活病毒(例如流感病毒或RSV)的方法。本发明的方法提供高活病毒总回收率。在一个实施方式中，纯化病毒的总回收率为至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％或至少70％。监测纯化活病毒回收率的方法包括为测定病毒感染和/或生长设计的鉴定试验。例如，可采用聚焦荧光鉴定和中值组织培养感染性量(TCID50)鉴定监测纯化活流感病毒的回收率。在某些实施方式中，本发明的纯化病毒的方法提供至少30％的病毒总回收率，其中所述纯化病毒在每7.0±0.5log10FFU病毒中包含少于0.1ng HCD、少于0.3μg HCP和少于0.0050ng非特异性核酸酶。
病毒收获物的纯化包括多个步骤，可根据所述病毒和纯化条件进行优化。在某些实施方式中，所述纯化方法可以单独或组合形式包括以下任何一个步骤：a)澄清病毒收获物；b)浓缩和/或缓冲液交换；c)通过色谱纯化和d)无菌过滤。这些步骤可包括其它步骤，如用非特异性内切核酸酶处理和稳定病毒收获物或病毒载荷。这些步骤可在纯化过程中多次进行，以最大程度提高病毒回收率，同时如上所述充分去除HCP和HCD。
可用于澄清病毒收获物的方法包括但不限于离心、透析和膜过滤，其包括但不限于，如液体直接流过过滤介质的单程死端直流过滤(DFF)和液体沿膜表面切向流动的交叉流或切向流过滤(TFF)这样的方法。可运行TFF系统以保持恒定的滤液流量速率(Filtrate Flux rate)(常简称为“流量(Flux)”，可测定为每小时每平方米膜的渗透液升数(LMH))或保持恒定的跨膜压力(缩写为“TMP”，可测定为每平方英寸的磅数(psi))。然而，可调节恒定的流量和TMP以防止膜积垢。用于过滤应用的膜可从商业来源获得。
本领域中普遍接受四种类型的膜，由其从载体液体去除的材料大小限定。按孔径最小到最大排列，它们是反渗透膜、纳米过滤膜、超滤膜和微滤膜。用上述膜进行过滤通过采用具有特定孔径的膜将分子根据其分子量进行分离。例如，采用孔径小于0.001微米的反渗透膜的分离用来分离分子量小于200道尔顿的分子。采用孔径为0.001-0.008微米(包括端值)的纳米过滤膜的过滤用来分离分子量为200道尔顿到15千道尔顿(kDa)(包括端值)的分子。采用孔径为0.005-0.1微米(包括端值)的超滤膜的过滤用来分离分子量为5kDa-300kDa(包括端值)的分子。采用孔径为0.05-3.0微米(包括端值)的微滤膜的过滤用来分离分子量为100kDa-3000kDa和更大的分子。因此，膜过滤可通过利用具有由膜孔径决定的特定分子量截留值(MWCO)的膜根据尺寸排阻分离感兴趣的分子(例如病毒)与其它细胞组分。MWCO也称为标称分子量界限(NMWL)或标称分子量截留值(NMWCO)，是膜过滤的千道尔顿大小名称。将MWCO定义为90％被膜截留的分子的分子量。因为例如，分子量相同的分子可具有显著不同的形状，所以MWCO不是精确的度量，但其仍为一种有用的度量并常为过滤器制造商所用。所用膜可采用平坦薄片或螺旋环绕式构造。也可根据过滤方法的类型采用空心纤维。可采用任何数量的潜在膜材料，包括但不限于：再生纤维素、聚醚砜(可经或可不经改性以改变其固有的疏水性)、聚偏氟乙烯(PVDF)、陶瓷和金属氧化物聚集体以及聚碳酸酯、聚丙烯、聚乙烯和PTFE(TEFLON
Figure BPA00001373558000441
)。考虑到可在分离中采用过滤方法和膜类型的组合，并根据处理材料的体积和/或浓度调整包含分离膜的过滤器、柱等的容量。
可用于浓缩和/或缓冲液交换的方法包括但不限于透析、超滤(UF)和膜渗滤(DF)。TFF可同时包括可用于浓缩的UF和可用于交换缓冲液的DF。此外，采用UF和/或DF可引起分级过程的额外纯化，其通过膜洗涤可以是污染物的较小分子，将感兴趣的较大分子留在渗余物中。因此，包括UF和/或DF的TFF可用来浓缩和/或交换缓冲液和/或进行纯化。用于过滤应用的膜的选择如上所述。根据本发明，DF可以是不连续或连续的DF。在不连续DF中，溶液浓缩，损失的体积被新的缓冲液替换。在连续DF中，通过流入新的缓冲溶液保持溶液体积，同时移出旧的缓冲溶液。
在某些实施方式中，澄清病毒浓缩约2X、约3X、约4X、约5X、约6X、约7X、约8X、约9X、约10X或更多，其中“X”等于加入操作/最终滞留物体积的总起始体积。在一个具体实施方式中，所述澄清病毒浓缩约3X到约5X之间。在另一个具体实施方式中，所述澄清病毒浓缩约4X，其中“X”等于加入操作/最终渗余物体积的总起始体积。在某些实施方式中，所述澄清病毒浓缩约10X或更多，以增加所有随后纯化步骤的加载量。在某些实施方式中，浓缩之后，通过DF交换约1体积倍数(diavolume)、约2体积倍数、约3体积倍数、约4体积倍数、约5体积倍数、约6体积倍数、约7体积倍数、约8体积倍数、约9体积倍数、约10体积倍数或更多体积倍数的缓冲液，其中体积倍数是在DF/渗余物体积中引入操作的总缓冲液体积。在一个具体实施方式中，交换约4体积倍数到约6体积倍数的缓冲液，其中体积倍数是在DF/渗余物体积中引入操作的总缓冲液体积。在另一个具体实施方式中，交换约5体积倍数的缓冲液，其中体积倍数是在DF/渗余物体积中引入操作的总缓冲液体积。
在某些实施方式中，在交换所需体积的缓冲液之后收集包含病毒(例如，流感病毒、RSV)的渗余物。在收集渗余物之后，一些病毒可与膜保持弱结合。因此，在一些实施方式中，用向收集的滞留物加入的额外交换缓冲液漂洗所述膜。所述收集的渗余物在本文也称为“条件病毒载荷”或“#XUF #XDF”，其中“#”表示UF和DF过程分别交换的缓冲液的浓缩倍数或体积倍数的数量。在一个具体实施方式中，将具有500kDa MWCO的膜用于浓缩和缓冲液交换。在一些实施方式中，可在过程后清洁所述膜并重复使用。在其它实施方式中，将新膜用于各批次澄清病毒。在另一个具体实施方式中，浓缩澄清收获物，如第8.6和8.6.3节提供的实施例所示交换缓冲液。
可用于纯化病毒(例如，流感病毒或RSV)的色谱类型包括但不限于亲和色谱以及离子交换色谱和/或羟基磷灰石色谱。在某些实施方式中，采用离子交换色谱。在一个实施方式中，采用阳离子交换色谱。在另一个实施方式中，在高pH进行阳离子交换色谱。在一个实施方式中，采用阴离子交换色谱。在一个具体实施方式中，采用强季铵(Q)阴离子交换剂(例如，CaptoTM Q，GE医疗保健公司)。在另一个实施方式中，在低pH进行阴离子交换色谱。可用于离子交换色谱的阴离子介质包括但不限于阴离子膜吸附剂(例如，Sartobind
Figure BPA00001373558000451
Q15、D15)和阳离子膜吸附剂(例如，Sartobind
Figure BPA00001373558000452
S15和C15)。在另一个实施方式中，采用阴性色谱，其中通过阴离子或阳离子交换结合杂质，随后从所述杂质如宿主细胞蛋白质和/或核酸分离或纯化病毒。考虑到可在分批过程中或采用柱过程进行所述色谱。在某些实施方式中，条件病毒载荷通过柱色谱纯化。
可用于有效去除污染性HCD的方法包括连同纯化过程的其它步骤，用非特异性内切核酸酶(例如Benzonase)进行处理。然而，就用于动物(包括人)临床应用的病毒而言，希望最终纯化病毒中非特异性内切核酸酶的量达到最小。因此，在另一个方面，本发明提供将方法中所用的任何残留非特异性内切核酸酶量降低到可注射疫苗的可接受水平以下的纯化病毒的方法。
在一个实施方式中，所述纯化病毒每剂量包含少于约0.0060ng、少于约0.0055ng、少于约0.0050ng、少于约0.0045ng、少于约0.0040ng、少于约0.0035ng、少于约0.0030ng、少于约0.0025ng、少于约0.0020ng、少于约0.0015ng、少于约0.0010ng或更少的非特异性内切核酸酶。在一个具体实施方式中，所述纯化病毒每剂量包含少于约0.0040ng、少于约0.0035ng、少于约0.0030ng、少于约0.0025ng的非特异性内切核酸酶。
在其它实施方式中，所述纯化病毒是流感病毒或RSV，每7.0±0.5log10FFU包含少于约0.0060ng、少于约0.0055ng、少于约0.0050ng、少于约0.0045ng、少于约0.0040ng、少于约0.0035ng、少于约0.0030ng、少于约0.0025ng、少于约0.0020ng、少于约0.0015ng、少于约0.0010ng或更少的非特异性内切核酸酶。在一个具体实施方式中，所述纯化病毒是流感病毒或RSV，每7.0±0.5log10FFU包含少于约0.0040ng、少于约0.0035ng、少于约0.0030ng、少于约0.0025ng的非特异性内切核酸酶。在另一个具体实施方式中，所述纯化病毒是RSV，每5±0.5log10FFU包含少于约0.0040ng、少于约0.0035ng、少于约0.0030ng、少于约0.0025ng的非特异性内切核酸酶。在另一个具体实施方式中，所述非特异性内切核酸酶是Benzonase。
无菌性对用于动物(包括人)临床应用的那些病毒和/或病毒组分特别重要。因此，本发明的纯化病毒(例如，流感病毒或RSV)方法包括灭菌，可作为末端过滤步骤(例如RSV)或采用已知的灭菌方法(例如流感病毒)进行。可用于疫苗组分(例如，病毒、递送装置等)灭菌的方法包括但不限于：辐射、过滤、化学处理和其它合适的方案。在一个实施方式中，通过过滤对配制病毒批量灭菌。可用于灭菌的过滤方法包括但不限于如上所述的单程死端直流过滤(DFF)和切向流过滤(TFF)。然而，由于RSV的脆弱性质，该病毒不可采用灭菌级过滤器灭菌。因此，在一个实施方式中，RSV在本文所述纯化过程中作为末端过滤步骤的一部分进行灭菌。
本文提供纯化用于配制疫苗的流感病毒和RSV的特定方法。
6.5.1流感病毒的纯化
在某些实施方式中，待纯化的病毒是流感病毒(例如，冷适应和/或温度敏感性和/或减毒)。
在一个实施方式中，从细胞培养物纯化病毒的方法包括以下步骤：
(a)澄清病毒收获物；
(b)在步骤(a)之后进行浓缩和/或缓冲液交换；
(c)在步骤(b)之后通过色谱进行纯化；
(d)在步骤(c)之后进行浓缩和/或缓冲液交换；和
(e)在步骤(d)之后灭菌。
在一个实施方式中，所述病毒是流感病毒。在一个具体实施方式中，所述流感病毒是冷适应和/或温度敏感性和/或减毒流感病毒。
在一个具体实施方式中，步骤(a)、(b)、(d)和(e)通过膜过滤进行。在另一个具体实施方式中，步骤(b)和(d)通过切向流过滤进行。在另一个具体实施方式中，步骤(a)和(e)通过直流过滤进行。在另一个具体实施方式中，步骤(b)同时包括超滤浓缩和通过渗滤进行缓冲液交换。在另一个具体实施方式中，步骤(d)仅包括浓缩。纯化病毒方法的其它实施方式如下详述。
在一个具体实施方式中，步骤(c)通过亲和柱色谱进行。在另一个具体实施方式中，步骤(c)还包括非特异性核酸酶处理。
如上所述，可在收获后稳定获自细胞培养物的病毒(例如通过加入蔗糖磷酸盐(SP))。因此，本发明的纯化方法包括澄清稳定的病毒收获物。或者可结合收获和澄清步骤。例如，可采用ATF收获细胞培养物复制病毒，并直接将病毒收获物泵入用于澄清所述病毒的介质和/或装置中。
例如，可先通过在例如1000-2000xg离心一段足以去除细胞碎片和其它大颗粒物的时间，例如10-30分钟来澄清来自感染培养物的粗培养基。或者，通过孔径限定范围大到足以允许病毒通过而截留完整细胞和其它大颗粒物的半透膜过滤所述培养基。
在一个实施方式中，采用孔径大到足以使病毒通过但小到足以截留完整细胞和细胞碎片的MF膜通过DFF和/或TFF澄清病毒收获物。在一个实施方式中，采用孔径为约1.2微米或更小的至少一个膜通过DFF和/或TFF澄清病毒收获物。在一个具体实施方式中，采用孔径在约1.2微米到约0.45微米之间的至少一个膜通过DFF澄清病毒收获物。在另一个具体实施方式中，采用孔径为1.2微米的第一膜和孔径为0.45微米的第二膜通过DFF澄清病毒收获物。在某些实施方式中，采用聚丙烯和/或PVDF膜。在另一个具体实施方式中，如第8.6节中提供的实施例所示通过DFF澄清病毒收获物。在另一个具体实施方式中，将细胞培养物复制病毒的收获与DFF步骤结合。例如，收获细胞培养物复制病毒，并将其直接用于DFF介质和装置。结合收获和澄清步骤减少操作数量，消除对收获罐的需求，并减少总处理时间。
在一个实施方式中，浓缩澄清收获物和/或交换缓冲液。在一个实施方式中，通过UF和DF进行浓缩和/或缓冲液交换。在另一个实施方式中，将TFF同时用于UF和DF。在另一个具体实施方式中，将细胞培养物复制病毒的收获与结合TFF步骤的DFF步骤结合。结合收获、澄清和浓缩/缓冲液交换步骤减少操作数量并减少总处理时间。在某些实施方式中，运行TFF以保持恒定的滤液流量速率。在其它实施方式中，运行TFF以保持恒定的TMP。在某些实施方式中，先通过UF浓缩澄清病毒，然后通过DF交换缓冲液。在某些实施方式中，澄清病毒浓缩约2X、约3X、约4X、约5X、约6X、约7X、约8X、约9X、约10X或更多，其中“X”等于加入操作/最终渗余物体积的总起始体积。在一个具体实施方式中，所述澄清病毒浓缩约3X到约5X之间。在另一个具体实施方式中，所述澄清病毒浓缩约4X，其中“X”等于加入操作/最终渗余物体积的总起始体积。在某些实施方式中，所述澄清病毒浓缩约10X或更多，以增加所有随后纯化步骤的加载。在某些实施方式中，浓缩之后，通过DF交换约1体积倍数(diavolume)、约2体积倍数、约3体积倍数、约4体积倍数、约5体积倍数、约6体积倍数、约7体积倍数、约8体积倍数、约9体积倍数、约10体积倍数或更多体积倍数的缓冲液，其中体积倍数是在DF/渗余物体积中引入操作的总缓冲液体积。在一个具体实施方式中，交换约4体积倍数到约6体积倍数的缓冲液，其中体积倍数是在DF/渗余物体积中引入操作的总缓冲液体积。在另一个具体实施方式中，交换约5体积倍数的缓冲液，其中体积倍数是在DF/渗余物体积中引入操作的总缓冲液体积。考虑到所述交换缓冲液可能与病毒收获物中存在的缓冲液相同或不同。在一个实施方式中，所述交换缓冲液是中性pH的SP缓冲液。在一个具体实施方式中，所述交换缓冲液包含(一种或多种组分的变化在10％以内)218mM蔗糖、11mM pH 7.0-7.4磷酸盐缓冲液。在一个具体实施方式中，所述交换缓冲液由(一种或多种组分的变化在10％以内)218mM蔗糖、11mM pH 7.0-7.4磷酸盐缓冲液组成。在某些实施方式中，在交换所需体积的缓冲液之后收集包含病毒(例如流感病毒)的渗余物。在收集渗余物之后，一些病毒可与膜保持弱结合。因此，在一些实施方式中，用向收集的渗余物加入的额外交换缓冲液漂洗所述膜。所述收集的渗余物在本文也称为“条件病毒载荷”或“#XUF #XDF”，其中“#”表示UF和DF过程分别交换的缓冲液的浓缩倍数或体积倍数的数量。在一个具体实施方式中，将具有500kDa MWCO的膜用于浓缩和缓冲液交换。在一些实施方式中，可在过程后清洁所述膜并重复使用。在其它实施方式中，将新膜用于各批次澄清病毒。在另一个具体实施方式中，浓缩澄清收获物，如第8.6和8.6.3节提供的实施例所示交换缓冲液。
在某些实施方式中，条件病毒载荷通过色谱纯化。在某些实施方式中，条件病毒载荷通过柱色谱纯化。在一些实施方式中，条件病毒载荷通过亲和色谱纯化。可利用具有类似分离性质的各种亲和色谱介质，例如，可利用多种亲和色谱介质浓缩和纯化多种病毒和病毒蛋白质，包括但不限于N(对氨基苯基)草氨酸琼脂糖、CellufineTM硫酸酯。可用于评价亲和配体性能的方法见实施例8.7所示。在一个具体实施方式中，将CellufineTM硫酸酯(奇索公司(Chisso Corp.))亲和介质用于亲和色谱。在另一个实施方式中，将FluSelectTM用于亲和色谱。在另一个实施方式中，亲和介质的结合配体包含硫酸酯部分。在某些实施方式中，将条件病毒载荷直接加载到亲和介质上。在某些实施方式中，可使未结合材料通过亲和介质以促进其它病毒结合。
在一个实施方式中，向每毫升亲和介质加载约109.0到约1011、约109.2到约109.8或约109.4到约109.6个病毒颗粒。在另一个实施方式中，向每毫升亲和介质加载至少约109.0、至少约109.1、至少约109.2、至少约109.3、至少约109.4、至少约109.5、至少约109.6、至少约109.7、至少约109.8、至少约109.9、至少约1010、至少约1010.2、至少约1010.4、至少约1010.6、至少约1010.8或至少约1011个病毒颗粒。在某些实施方式中，所述病毒颗粒是活病毒。确定样品中活病毒数量的方法如本文所述。
在另一个实施方式中，向每毫升亲和介质加载约9.0log10FFU到约11log10FFU、约9.2log10FFU到约9.8log10FFU、约9.4log10FFU到约9.6log10FFU的病毒。在另一个实施方式中，向每毫升亲和介质加载至少约9.0log10FFU、至少约9.1log10FFU、至少约9.2log10FFU、至少约9.3log10FFU、至少约9.4log10FFU、至少约9.5log10FFU、至少约9.6log10FFU、至少约9.7log10FFU、至少约9.8log10FFU、至少约9.9log10FFU、至少约10log10FFU、至少约10.1log10FFU、至少约10.2log10FFU、至少约10.3log10FFU、至少约10.4log10FFU、至少约10.5log10FFU、至少约10.6log10FFU、至少约10.7log10FFU、至少约10.8log10FFU、至少约10.9log10FFU或至少约11log10FFU的病毒。在一个具体实施方式中，采用CellufineTM硫酸酯(奇索公司)亲和介质，向每毫升CellufineTM硫酸酯加载9.2log10FFU到9.8log10FFU的病毒。在另一个具体实施方式中，采用CellufineTM硫酸酯(奇索公司)亲和介质，向每毫升CellufineTM硫酸酯加载9.4log10FFU到9.6log10FFU的病毒。在另一个具体实施方式中，采用CellufineTM硫酸酯(奇索公司)亲和介质，向每毫升CellufineTM硫酸酯加载至少约9.4log10FFU、至少约9.5log10FFU、至少约9.6log10FFU或至少约9.7log10FFU的病毒。
在一个实施方式中，用其中病毒与亲和介质保持结合的充足体积的缓冲液(例如SP缓冲液)洗涤亲和介质，以从亲和介质去除未结合和弱结合的污染物。在某些实施方式中，所述洗涤缓冲液包含(一种或多种组分的变化在10％以内)218mM蔗糖、11mM pH 7.0-7.4磷酸盐缓冲液。在另一个具体实施方式中，所述洗涤缓冲液由(一种或多种组分的变化在10％以内)218mM蔗糖、11mM pH 7.0-7.4磷酸盐缓冲液组成。在某些实施方式中，洗涤之后采用充足体积的缓冲液从亲和介质洗脱病毒并收集所述病毒，其中所述病毒不与亲和树脂结合，以洗脱所述病毒而不释放与柱结合的任何污染物。在某些实施方式中，所述洗脱缓冲液包含盐。可用于从亲和柱洗脱病毒(例如流感病毒)的盐包括氯化钠、氯化钾、氯化铵、氯化镁和氯化钙。通常向所述树脂施用0到1.0M浓度范围的梯度或步骤的洗脱缓冲液。用作洗脱缓冲液中盐的阳离子和阴离子的有效性与霍夫梅斯特系列(Hofmeister series)系列相关联，其中常用阳离子的置换顺序为：Ca2+＞Mg2+＞Na+＞K+＞NH4 +，常用阴离子的置换有效性顺序为：PO4 3-＞SO4 2-＞COO-＞Cl-。在一个实施方式中，所述洗脱缓冲液包含(变化在10％以内)终浓度为1M的氯化钠。在另一个实施方式中，所述洗脱缓冲液包含(一种或多种组分的变化在10％以内)1M氯化钠、218mM蔗糖和11mM pH7.0-7.4磷酸盐缓冲液。收集的洗脱病毒在本文也称为“纯化病毒洗出液”。可通过监测紫外(UV)吸光度，特别是通过监测280纳米的吸光度来监测病毒洗脱。在一些实施方式中，通过柱色谱纯化条件病毒载荷，其中监测病毒洗脱并收集包含病毒的特定组分。在希望最大程度减小洗脱病毒体积时可采用这样的方法。在另一个具体实施方式中，如第8.6节中提供的实施例所示通过色谱纯化条件病毒载荷。
在某些实施方式中，纯化病毒(例如流感病毒)的方法包括非特异性内切核酸酶(例如Benzonase
Figure BPA00001373558000511
)处理。在某些实施方式中，所述非特异性内切核酸酶处理在病毒纯化的早期进行。在一个实施方式中，非特异性内切核酸酶处理在步骤(a)之后但在步骤(b)之前进行。在另一个实施方式中，非特异性内切核酸酶处理在步骤(b)之后但在步骤(c)之前进行。或者在步骤(c)中用非特异性内切核酸酶处理病毒。该方法的优点见第8.6节提供的实施例所示。在一个具体实施方式中，条件病毒载荷与亲和介质结合，然后与包含非特异性内切核酸酶的缓冲液接触。在一些实施方式中，缓冲液中存在的非特异性内切核酸酶的浓度在约10U/mL和约100U/mL之间。在其它实施方式中，缓冲液中存在的非特异性内切核酸酶的浓度在约40U/mL到约60U/mL之间。在一个实施方式中，所述非特异性内切核酸酶存在于包含蔗糖的缓冲液中。在一个具体实施方式中，所述非特异性内切核酸酶存在于包含218mM蔗糖、11mM pH 7.0-7.4磷酸盐缓冲液的缓冲液中。在另一个具体实施方式中，由(一种或多种组分的变化在10％以内)218mM蔗糖、11mM pH 7.0-7.4磷酸盐缓冲液组成的缓冲液中存在的特异性内切核酸酶的终浓度在约40U/mL到约60U/mL之间。在某些实施方式中，调整加载和洗涤条件以确保结合的病毒将与非特异性内切核酸酶接触约10分钟到约120分钟。在一个实施方式中，调整加载和洗涤条件以确保结合的病毒将与非特异性内切核酸酶接触约40分钟到约80分钟。在其它实施方式中，调整加载和洗涤条件以确保结合的病毒与非特异性内切核酸酶接触至少10分钟、至少20分钟、至少30分钟、至少40分钟、至少50分钟、至少60分钟、至少70分钟、至少80分钟、至少90分钟、至少100分钟、至少110分钟或至少120分钟。在本发明的某些方面，可调整与非特异性内切核酸酶的接触时间、非特异性内切核酸酶的浓度和包含非特异性内切核酸酶的缓冲液体积。例如，为最大程度减少切割DNA污染物所需的时间，可增大非特异性内切核酸酶的浓度，或者，为最大程度减少所用非特异性内切核酸酶的量，可增加接触时间。非特异性内切核酸酶处理之后，优选用其中病毒与亲和介质保持结合的充足体积的缓冲液(例如SP缓冲液)洗涤亲和介质，以去除任何残留的消化DNA污染物。因此，在某些实施方式中，在非特异性内切核酸酶处理之前和/或之后如上所述洗涤亲和树脂。在另一个具体实施方式中，所述非特异性内切核酸酶是Benzonase
Figure BPA00001373558000521
。在另一个具体实施方式中，在如第8.6节提供的实施例所示进行亲和色谱纯化的同时用Benzonase
Figure BPA00001373558000522
处理条件病毒载荷。
在一个实施方式中，所述纯化流感病毒每7.0±0.5log10FFU包含少于约0.0060ng、少于约0.0055ng、少于约0.0050ng、少于约0.0045ng、少于约0.0040ng、少于约0.0035ng、少于约0.0030ng、少于约0.0025ng、少于约0.0020ng、少于约0.0015ng、少于约0.0010ng或更少的非特异性内切核酸酶。在一个具体实施方式中，所述纯化流感病毒每7.0±0.5log10FFU包含少于约0.0040ng、少于约0.0035ng、少于约0.0030ng或少于约0.0025ng的非特异性内切核酸酶。在另一个具体实施方式中，所述非特异性内切核酸酶是Benzonase
Figure BPA00001373558000531
。在本发明的某些方面，色谱纯化之后，浓缩纯化病毒洗出液和/或交换缓冲液。可用于浓缩和/或缓冲液交换的方法如上所述。在某些实施方式中，采用DF交换纯化病毒洗出液的缓冲液。在一个实施方式中，通过DF交换大于约5体积倍数的缓冲液，其中体积倍数是在DF/渗余物体积中引入操作的总缓冲液体积。交换大于约5体积倍数的优点见第8.6节提供的实施例中详述。在另一个实施方式中，通过DF交换约6体积倍数、约7体积倍数、约8体积倍数、约9体积倍数、约10体积倍数或更多体积倍数的缓冲液，其中体积倍数是在DF/渗余物体积中引入操作的总缓冲液体积。在一个具体实施方式中，通过DF交换约8体积倍数或更多体积倍数的缓冲液，其中体积倍数是在DF/渗余物物体积中引入操作的总缓冲液体积。在一个具体实施方式中，所述交换缓冲液包含(一种或多种组分的变化在10％以内)200mM蔗糖、100mM pH 7.0-7.4磷酸盐缓冲液。在另一个具体实施方式中，所述交换缓冲液由(一种或多种组分的变化在10％以内)200mM蔗糖、100mM pH 7.0-7.4磷酸盐缓冲液组成。在某些实施方式中，在交换所需体积的缓冲液之后收集包含病毒的渗余物。在收集渗余物之后，一些病毒可与膜保持弱结合。因此，在一些实施方式中，用向收集的渗余物加入的额外交换缓冲液漂洗所述膜。收集的渗余物在本文也称为“配制病毒批量”或“#XDF”，其中“#”表示在DF过程中分别交换的缓冲液体积倍数的数量。在一个具体实施方式中，将具有500kDa MWCO的膜用于浓缩和/或缓冲液交换。在一些实施方式中，可在过程后清洁所述膜并重复使用。在其它实施方式中，将新膜用于各批次纯化病毒洗出液。在另一个具体实施方式中，如第8.6节中提供的实施例所示交换纯化病毒洗出液的缓冲液。在其它实施方式中，如上所述通过UF浓缩澄清病毒并通过DF交换缓冲液。包括UF步骤将减小所得配制病毒批量的体积。在某些实施方式中，所述病毒洗出液浓缩约2X、约3X、约4X、约5X或更多，其中“X”等于加入操作/最终渗余物体积的总起始体积。在其它实施方式中，所述病毒洗出液浓缩在2X和4X之间。在一个具体实施方式中，将所述病毒洗出液浓缩约2X，然后如上所述通过DF交换缓冲液。在一个具体实施方式中，浓缩纯化病毒洗出液的缓冲液，并如第8.6.3节中提供的实施例所示交换缓冲液。
在一个实施方式中，通过DFF和/或TFF对配制病毒批量灭菌。在另一个实施方式中，采用孔径大到足以使病毒通过但小到足以截留其它污染物的MF膜对配制病毒批量灭菌。在一个实施方式中，采用孔径为约0.45微米的至少一个膜通过DFF和/或TFF对配制病毒批量灭菌。在某些实施方式中，采用聚丙烯和/或PVDF膜。在一个实施方式中，在灭菌前向配制病毒批量加入其它组分。在某些实施方式中，在灭菌前向配制病毒批量加入选自下组的至少一种组分：氨基酸赋形剂(例如，谷氨酸、精氨酸)、蛋白质水解产物(例如，胶原、明胶)、螯合剂(例如EDTA)和防腐剂。在一个具体实施方式中，在灭菌前向配制病毒批量加入谷氨酸、精氨酸和明胶。在另一个具体实施方式中，以1∶9的体积/体积(v/v)比向纯化病毒批量加入cGAG(200mM蔗糖、100mM磷酸盐、12.1％重量/体积(w/v)精氨酸、10％明胶和54mM或0.9％谷氨酸)。在另一个具体实施方式中，在灭菌前分别以5.4mM或0.09％、1.21w/v和1w/v的终浓度(变化在10％以内)向配制病毒批量加入谷氨酸钠、精氨酸和明胶。在另一个具体实施方式中，如第8.6节中提供的实施例所示通过DFF对配制病毒批量灭菌。
在一个具体实施方式中，从细胞培养物纯化流感病毒的方法包括以下步骤：
(a)采用孔径在约1.2微米到约0.45微米之间的至少一个膜通过直流过滤(DFF)澄清病毒收获物；
(b)在步骤(a)之后，采用具有500kDa分子量截留值(MWCO)的膜通过切向流超滤(UF)浓缩，并通过渗滤(DF)进行缓冲液交换；
(c)在步骤(b)之后通过亲和柱色谱进行纯化；
(d)在步骤(c)之后采用具有500kDa分子量截留值(MWCO)的膜通过DF进行缓冲液交换；和
(e)在步骤(d)之后采用孔径在约0.45微米到约0.22微米之间的至少一个膜通过DFF进行灭菌，
其中纯化病毒的总回收率为至少30％，且纯化病毒在每7.0±0.5log10FFU病毒中包含少于0.1ng HCD和少于0.3μg HCP。
在某些实施方式中，步骤(c)还包括非特异性核酸酶处理。
可引入从细胞培养物纯化病毒具体为流感病毒的方法的其它参数见以下第8.6节提供的实施例中所示。
6.5.2RSV的纯化
在一个具体实施方式中，待纯化的病毒是呼吸道合胞病毒(RSV)(例如rA2cp248/404/1030ΔSH)。
在一个实施方式中，从细胞培养物纯化病毒的方法包括以下步骤：
(a)澄清病毒收获物；
(b)在步骤(a)之后进行稳定和/或缓冲液交换；
(c)在步骤(b)之后进行浓缩和/或缓冲液交换；
(d)在步骤(c)之后通过色谱进行纯化；和
(e)在步骤(d)之后末端灭菌。
在一个具体实施方式中，步骤(a)包括多个过滤步骤。在另一个具体实施方式中，步骤(a)还包括非特异性核酸酶处理。在另一个具体实施方式中，步骤(a)和(c)通过直流过滤进行。在另一个具体实施方式中，步骤(c)通过切向流过滤进行。在另一个具体实施方式中，步骤(c)同时包括切向流过滤浓缩和渗滤缓冲液交换。在一个具体实施方式中，步骤(d)通过离子交换色谱(例如阳离子交换)进行。在另一个实施方式中，步骤(c)仅包括浓缩。纯化病毒(例如RSV)方法的其它实施方式如下详述。
本发明的纯化方法包括澄清病毒收获物。可先通过在例如1000-2000xg离心一段足以去除细胞碎片和其它大颗粒物的时间，例如10-30分钟来澄清来自感染培养物的粗培养基。或者，通过孔径限定范围大到足以允许病毒通过而截留完整细胞和其它大颗粒物的一系列半透膜过滤包含病毒的上清液。纯化过程中的该澄清步骤可包括非特异性内切核酸酶(例如Benzonase)处理以降解细胞宿主DNA，其中所述病毒收获物：a)通过直流过滤(DFF)进行过滤，b)用非特异性内切核酸酶处理和c)再次通过DFF进行过滤。
在一个实施方式中，采用孔径大到足以使病毒通过但小到足以截留完整细胞和细胞碎片的MF膜通过DFF和/或TFF澄清病毒收获物。在某些实施方式中，通过DFF结合非特异性内切核酸酶处理来澄清病毒收获物。在一个具体实施方式中，采用孔径为约10微米或更小的至少一个膜过滤病毒收获物，之后用非特异性内切核酸酶处理，然后采用孔径为约3.0微米或更小的至少一个膜再次过滤。在一个具体实施方式中，采用孔径在约5.0微米到约1.0微米之间的至少一个膜进行澄清过程中的第一过滤步骤。在一个具体实施方式中，采用孔径在约3.0微米到约0.45微米之间的至少一个膜进行澄清过程中的第二过滤步骤。在某些实施方式中，所述第一或第二过滤步骤以单独或组合形式采用双膜过滤器，其中叠置不同大小的两个过滤器以防止孔径较小的过滤器堵塞。在一个实施方式中，该双过滤器大小为约3/0.8微米，其中3微米过滤器作为预过滤器去除较大细胞碎片。在另一个具体实施方式中，采用孔径为约3.0微米的第一膜和孔径为约3/0.8或约0.65微米的第二膜通过DFF澄清病毒收获物。
在某些实施方式中，纯化病毒(例如RSV)的方法包括非特异性内切核酸酶(例如Benzonase
Figure BPA00001373558000561
)处理以降解宿主细胞DNA(HCD)。在某些实施方式中，所述非特异性内切核酸酶处理在病毒纯化的早期进行。在一个实施方式中，在步骤(a)中用非特异性内切核酸酶处理病毒。在一个具体实施方式中，将过滤的病毒收获物与包含非特异性内切核酸酶的缓冲液混合。在一些实施方式中，缓冲液中存在的非特异性内切核酸酶的浓度在约5U/mL和约100U/mL之间。在其它实施方式中，缓冲液中存在的非特异性内切核酸酶的浓度在约40U/mL和约60U/mL之间。在一个具体实施方式中，存在的非特异性内切核酸酶为约50U/ml。在一个实施方式中，所述非特异性内切核酸酶存在于包含约1.0mM到约10mM MgCl2的缓冲液中。在一个具体实施方式中，所述缓冲液包含50U/ml非特异性内切核酸酶和5mM MgCl2。在另一个具体实施方式中，存在的MgCl2为2mM。
在澄清过程的第一过滤步骤之后，将非特异性内切核酸酶与过滤的病毒收获物温育约1小时到约4小时。在一个具体实施方式中，将非特异性内切核酸酶与病毒收获物温育约3小时。在其它实施方式中，调整温育非特异性内切核酸酶的条件以确保病毒与非特异性内切核酸酶接触至少10分钟、至少20分钟、至少30分钟、至少40分钟、至少50分钟、至少60分钟、至少70分钟、至少80分钟、至少90分钟、至少100分钟、至少110分钟、至少120分钟、至少150分钟、至少180分钟、至少210分钟或至少240分钟。在本发明的某些方面，可调整与非特异性内切核酸酶的接触时间、非特异性内切核酸酶的浓度和包含非特异性内切核酸酶的缓冲液体积。例如，为最大程度减少切割DNA污染物的时间，可增大非特异性内切核酸酶的浓度，或者，为最大程度减少所用非特异性内切核酸酶的量，可增加接触时间。在一个具体实施方式中，所述非特异性内切核酸酶是Benzonase。在非特异性内切核酸酶处理之后，再次过滤经处理的过滤病毒收获物，以去除任何残留消化的DNA污染物和剩余的宿主细胞碎片。
在某些实施方式中，通过加入蔗糖磷酸盐(SP)、tris蔗糖(TS)或蔗糖磷酸盐谷氨酸(SPG)缓冲液稳定经Benzonase处理的澄清病毒收获物。这些缓冲液还可包含盐，如氯化钠或氯化钾。在一个实施方式中，TS缓冲液包含约2.5mM到约75mM pH 7.2TrisCl和约250mM到约150mM蔗糖。在一个具体实施方式中，稳定缓冲液包含50mM pH 7.2TrisCl和218mM蔗糖。TS缓冲液还可以单独或组合形式包含NaCl、KCl、KH2PO4或K2HPO4。在一个实施方式中，NaCl或KCl的浓度为约125mM到约175mM。在一个具体实施方式中，稳定缓冲液包含5mM pH 7.2TrisCl、175mM蔗糖和150mM NaCl或150mM KCl。在另一个具体实施方式中，稳定缓冲液包含36mM pH 7.2TrisCl、214mM蔗糖和150mM NaCl或KCl。在一个实施方式中，存在的KH2PO4或K2HPO4为约10mM到约2.5mM。在一个具体实施方式中，稳定缓冲液包含5mM pH 7.2TrisCl、175mM蔗糖、150mM NaCl和5mM KH2PO4。在另一个实施方式中，稳定缓冲液是SPG，其中所述缓冲液包含218mM蔗糖、3.8mM KH2PO4、7.2mM K2HPO4和5mM谷氨酸钠。本领域技术人员应理解，可根据病毒、病毒收获物和纯化条件改变稳定缓冲液的浓度，以获得稳定病毒收获物的最高产率。
在某些实施方式中，浓缩澄清收获物和/或交换缓冲液。在一个实施方式中，通过UF和DF进行浓缩和/或缓冲液交换。在另一个实施方式中，将TFF同时用于UF和DF。在某些实施方式中，运行TFF以保持恒定的滤液流量速率。在其它实施方式中，运行TFF以保持恒定的TMP。在一个具体实施方式中，采用500kDa中空纤维筒(GE医疗保健公司)进行UF步骤，其中采用15psi的运行TMP和12000秒-1的剪切速率将病毒收获物浓缩5倍。可根据病毒和纯化条件改变这些参数，以最大程度提高最终疫苗制剂的最终病毒产率。
在某些实施方式中，先通过UF浓缩澄清病毒，然后通过DF交换缓冲液。考虑到所述交换缓冲液可能与病毒收获物中存在的缓冲液相同或不同。此外，根据其它缓冲液交换步骤，所述交换缓冲液可与最终的配制缓冲液相同或不同。在一个实施方式中，所述交换缓冲液是具有中性pH的SP、TS或蔗糖柠檬酸盐缓冲液。在一个具体实施方式中，所述交换缓冲液包含约7-25％w/v蔗糖，因此提供约100mM到约800mM的由低到高的蔗糖范围。在一个实施方式中，所述交换缓冲液包含浓度为约1mM到约150mM的NaCl或KCl。在另一个实施方式中，所述交换缓冲液包含浓度为约2.5mM到约10mM的TrisCl。在另一个实施方式中，所述交换缓冲液包含浓度为约5.0mM到约50mM的柠檬酸钠或柠檬酸钾。在一个实施方式中，所述交换缓冲液包含浓度为约50mM到约150mM的磷酸钾。具体交换缓冲液的例子包括但不限于：5mM TrisCl；7-25％w/v蔗糖；1mM到150mMNaCl；20mM柠檬酸钠或柠檬酸钾、7-25％w/v蔗糖、150mM NaCl或KCl；和100mM磷酸钾、7-25％w/v蔗糖、150mM KCl。在一个具体实施方式中，所述交换缓冲液包含25％w/v蔗糖、约100mM磷酸钾缓冲液和约150mM KCl，pH 7.2。在另一个具体实施方式中，所述交换缓冲液包含25％w/v蔗糖、约5mM TrisCl和约150mM NaCl，pH 7.2。可根据病毒和纯化条件改变交换缓冲液组分，以最大程度提高色谱步骤和最终过滤步骤的病毒产率。
在某些实施方式中，如上所述通过色谱进一步纯化稳定病毒收获物。在一些实施方式中，采用离子交换色谱(例如，阴离子或阳离子)。在一个具体实施方式中，在通过UF减小体积和通过渗滤经处理的澄清病毒收获物进行缓冲液交换之后，通过离子交换色谱进一步纯化所述病毒。在一个实施方式中采用阴性色谱进行该色谱步骤或精制步骤(polishing step)。在该实施方式中，衍生化表面(例如聚合珠粒)以结合HCD或HCP而排除结合病毒颗粒，由此允许病毒经过表面。该概念也可应用于其它表面，使包含病毒颗粒的缓冲液可通过或经过衍生化表面。所述完整的色谱过程不含添加剂，易于放大规模以便在用于疫苗制剂的病毒大规模生产中应用。考虑到可在分批过程中或采用柱过程进行所述色谱。在某些实施方式中，条件病毒载荷通过柱色谱纯化。
在色谱步骤(如果进行)或缓冲液交换之后，浓缩的病毒收获物经历灭菌步骤。在一个实施方式中，所述灭菌步骤是末端过滤步骤。在一个实施方式中，所述末端过滤是采用孔径为3微米或更小的至少一个膜的DFF。在一个具体实施方式中，所述过滤器是双3/0.8微米膜。在另一个具体实施方式中，所述过滤器为约1mM或更小。在一个方面，所述过滤器为0.8、0.65或0.45微米。
在一个具体实施方式中，从病毒感染细胞纯化呼吸道合胞病毒的方法包括以下步骤：
a.澄清病毒收获物，包括：
i.采用孔径在约10微米到约3微米之间的至少一个澄清过滤器通过直流过滤(DFF)过滤病毒收获物；
ii.用非特异性内切核酸酶处理病毒收获物；
iii.采用孔径在约3微米到约0.45微米之间的至少一个澄清过滤器通过DFF过滤病毒收获物；
b.用蔗糖、磷酸盐或含盐(NaCl或KCl)的Tris缓冲液稳定澄清病毒收获物；
c.采用分子量截留值(MWCO)为500kDa-0.1μm的中空纤维筒通过切向流过滤(TFF)浓缩稳定病毒收获物并通过渗滤(DF)进行缓冲液交换；
d.采用孔径在约0.8微米到约0.45微米之间的至少一个澄清过滤器通过DFF过滤浓缩的病毒收获物；
其中呼吸道合胞病毒从病毒感染细胞纯化，其最终病毒感染性效价为至少5.7log10FFU/mL。
在另一个具体实施方式中，所述纯化方法在浓缩病毒收获物和缓冲液交换之后包括阳离子交换色谱纯化步骤。
6.6疫苗组合物及其使用方法
本发明还涉及通过本发明方法可获得的病毒(例如，流感病毒或RSV)。这些病毒可通过已知方法配制，以提供给予人或动物的疫苗。所述病毒可采用完整病毒颗粒(例如减毒活病毒)或灭活/裂解病毒(例如用甲醛去污剂处理)的形式。任选地，可通过本领域技术人员已知的方法从病毒分离指定的病毒组分(例如蛋白质)，并将其用于制备疫苗。产生和配制用于疫苗组合物的灭活/裂解病毒颗粒的方法为本领域熟知，已使用了40余年。
6.6.1流感病毒疫苗
完整病毒颗粒(例如减毒活病毒)制剂可包括缓冲液、氨基酸赋形剂(例如，谷氨酸、精氨酸)、蛋白质水解产物(例如，胶原、明胶)、螯合剂(例如EDTA)和防腐剂。可用于这样制剂的缓冲液可包含200mM蔗糖和pH 7.0-7.4的磷酸盐或组氨酸缓冲液。在某些实施方式中，所述完整病毒颗粒制剂包含氨基酸赋形剂，如谷氨酸和精氨酸。在某些其它实施方式中，所述完整病毒颗粒制剂包含稳定蛋白质水解产物，如胶原或明胶(例如，猪、鱼、鸟的明胶)。在一些实施方式中，所述完整病毒颗粒制剂可包含液体形式的活病毒，其稳定性足以能在整个流感疫苗接种季节(例如，在北半球通常从约9月到3月)“实际”储存(例如，在冷冻于2-8℃、4℃、5℃等时进行出售和商业化)。因此，需要所述病毒/疫苗组合物保持其效力或在储存期间的效力损失速率可接受。在其它实施方式中，液体形式的此类溶液/疫苗在约2℃到约8℃，例如冰箱温度下稳定性。例如，配制冰箱稳定性减毒流感疫苗的方法和组合物见PCT专利公开第WO/2006/041819号所述，另参见PCT专利公开WO/2005/014862。
因此，在某些实施方式中，本发明提供一种冰箱稳定性疫苗制剂，其包含以下终浓度的一种或多种以下组分(一种或多种组分的变化在10％以内)：1-5％精氨酸、1-4％明胶、5-10％蔗糖(任选溶于磷酸盐缓冲液)、0.01-0.1％谷氨酸(谷氨酸钠、一水合物)、10-150mM磷酸钾和80-150mM组氨酸。
在一个具体实施方式中，所述疫苗制剂包含一种或多种以下组分(一种或多种组分的变化在10％以内)：1-2％精氨酸、2％明胶、7-10％蔗糖(任选溶于磷酸盐缓冲液)和100mM组氨酸。在另一个具体实施方式中，所述疫苗制剂包含一种或多种以下组分(一种或多种组分的变化在10％以内)：0.01-0.1％谷氨酸(谷氨酸钠、一水合物)、1-2％精氨酸、1％明胶和7-10％溶于磷酸盐缓冲液的蔗糖。
在其它某些实施方式中，本发明提供冰箱稳定性疫苗制剂，其在最终制剂中包含一种或多种以下组分：蔗糖6-8％重量/体积(w/v)；精氨酸一氢氯化物1-2％w/v；谷氨酸钠一水合物0.05-0.1％w/v；猪A型(或其它来源如鱼或鸟)明胶水解产物0.5-2％w/v；磷酸氢二钾1-2％；和磷酸二氢钾0.25-1％w/v。
在一个具体实施方式中，所述疫苗制剂包含一种或多种以下组分：蔗糖6.84％重量/体积(w/v)；精氨酸一氢氯化物1.21％w/v；谷氨酸钠一水合物0.094％w/v；猪A型(或其它来源)明胶水解产物1％w/v；磷酸氢二钾1.13％；和磷酸二氢钾0.48％w/v。在另一个具体实施方式中，所述疫苗制剂包含所有以下组分：蔗糖6.84％重量/体积(w/v)；精氨酸一氢氯化物1.21％w/v；谷氨酸钠一水合物0.094％w/v；猪A型(或其它来源)明胶水解产物1％w/v；磷酸氢二钾1.13％；和磷酸二氢钾0.48％w/v。
在另一个具体实施方式中，所述疫苗制剂包含所有以下组分(一种或多种组分的变化在10％以内)：蔗糖6.84％重量/体积(w/v)；精氨酸一氢氯化物1.21％w/v；谷氨酸钠一水合物0.094％w/v；猪A型(或其它来源)明胶水解产物1％w/v；磷酸氢二钾1.13％；和磷酸二氢钾0.48％w/v。在另一个具体实施方式中，所述疫苗制剂包含所有以下组分(一种或多种组分的变化在10％以内)：蔗糖6.84％重量/体积(w/v)；精氨酸一氢氯化物1.21％w/v；猪A型(或其它来源)明胶水解产物1％w/v。在这样的实施方式中，制剂溶于缓冲液中(例如，磷酸钾缓冲液(pH 7.0-7.2))。在另一个具体实施方式中，疫苗制剂包含所有以下组分(一种或多种组分的变化在20％以内)：蔗糖6.84％重量/体积(w/v)；精氨酸一氢氯化物1.21％w/v；谷氨酸钠一水合物0.094％w/v；猪A型(或其它来源)明胶水解产物1％w/v；磷酸氢二钾1.13％；和磷酸二氢钾0.48％w/v。
在另一个具体实施方式中，所述疫苗制剂包含所有以下组分(一种或多种组分的变动在30％以内)：蔗糖6.84％重量/体积(w/v)；精氨酸一氢氯化物1.21％w/v；谷氨酸钠一水合物0.094％w/v；猪A型(或其它来源)明胶水解产物1％w/v；磷酸氢二钾1.13％；和磷酸二氢钾0.48％w/v。在另一个具体实施方式中，所述疫苗制剂包含所有以下组分(一种或多种组分的变动在40％以内)：蔗糖6.84％重量/体积(w/v)；精氨酸一氢氯化物1.21％w/v；谷氨酸钠一水合物0.094％w/v；猪A型(或其它来源)明胶水解产物1％w/v；磷酸氢二钾1.13％；和磷酸二氢钾0.48％w/v。
在另一个具体实施方式中，所述疫苗制剂包含所有以下组分(一种或多种组分的变动在1％以内)：蔗糖6.84％重量/体积(w/v)；精氨酸一氢氯化物1.21％w/v；谷氨酸钠一水合物0.094％w/v；猪A型(或其它来源)明胶水解产物1％w/v；磷酸氢二钾1.13％；和磷酸二氢钾0.48％w/v。在另一个具体实施方式中，所述疫苗制剂包含所有以下组分(一种或多种组分的变动在3％以内)：蔗糖6.84％重量/体积(w/v)；精氨酸一氢氯化物1.21％w/v；谷氨酸钠一水合物0.094％w/v；猪A型(或其它来源)明胶水解产物1％w/v；磷酸氢二钾1.13％；和磷酸二氢钾0.48％w/v。在一个具体实施方式中，所述疫苗制剂可包含例如磷酸钾(例如，至少50mM、至少100mM、至少200mM或至少250mM)作为缓冲液或组氨酸(例如，至少50mM、至少100mM、至少200mM或至少250mM)。
可任选利用喷雾干燥延长疫苗制剂的储存时间，所述喷雾干燥是一种将制剂液体原料在干燥加热气体流作用下喷成细小液滴的雾状物的快速干燥方法。所述细小液滴的蒸发形成由溶解溶质组成的干燥粉末(参见例如美国专利公开第2004/0042972号)。
通常，可采用合适的载体或赋形剂预防性给予病毒或病毒组分，以刺激对一种或多种病毒毒株的特异性免疫应答。所述载体或赋形剂通常是药学上可接受的载体或赋形剂，如无菌水、水性盐水溶液、水性缓冲盐水溶液、水性右旋糖溶液、水性甘油溶液、乙醇或其组合。根据本领域确立的方案实现确保无菌性、pH、等渗性和稳定性的这类溶液的制备。通常选择载体或赋形剂以最大程度减少过敏性和其它不希望出现的作用，并适用于具体的给药途径，例如，皮下、肌内、鼻内等。
用于病毒或其组分预防性给药的制剂还任选包含增强对流感病毒抗原免疫应答的一种或多种佐剂。合适的佐剂包括：皂苷、矿物质凝胶如氢氧化铝、表面活性物质如溶血卵磷脂、普流罗尼克多元醇(pluronic polyol)、聚阴离子、肽、油或烃乳剂、卡介苗(BCG)、短小棒状杆菌(corynebacteriumparvum)以及合成佐剂QS-21和MF59。
通常给予的疫苗制剂的量足以刺激对一种或多种流感病毒毒株的特异性免疫应答。优选给予所述病毒引发保护性免疫应答。引发针对一种或多种病毒毒株的保护性免疫应答的剂量和方法为本领域技术人员已知。例如，给予每剂量提供的灭活流感病毒的范围是约1-1000HID50(人感染剂量)，即约105-108pfu(蚀斑形成单位)。或者不含佐剂给予约10-50μg，例如约15μg HA，含佐剂则给予的剂量较小。通常根据例如，年龄、身体状况、体重、性别、饮食、给药时间和其它临床因素在该范围内调整剂量。例如采用针和注射器或无针注射装置通过皮下或肌内注射全身给予所述预防性疫苗制剂。或者通过滴剂、大颗粒气溶胶(大于约10微米)或喷雾向上呼吸道鼻内给予所述疫苗制剂。尽管任何以上递送途径均可形成保护性全身免疫应答，但鼻内给药能提供在流感病毒进入部位引发粘膜免疫的额外益处。就鼻内给药而言，常优选减毒活病毒疫苗，例如，减毒、冷适应和/或温度敏感性重组或重配流感病毒。尽管优选用单剂量刺激保护性免疫应答，但可通过相同或不同途径给予额外的剂量以达到所需预防性作用。这些方法可适用于任何病毒，包括但不限于：正粘病毒(包括流感毒株A和B)、副粘病毒(包括RSV、人肺炎后病毒和副流感病毒)、弹状病毒和黄病毒。
6.6.2RSV疫苗
在一个实施方式中，本文提供在对象中引发免疫应答的方法，包括给予有此需要的对象有效量的本文所述包含减毒纯化活病毒(例如RSV)的免疫原性组合物。在一些实施方式中，所述减毒病毒是嵌合病毒。
在一个具体实施方式中，本文提供在哺乳动物(例如人)中引发免疫应答的方法，包括给予有此需要的哺乳动物有效量的本文所述包含减毒RSV的免疫原性组合物。在一个具体实施方式中，所述减毒RSV是rA2cp248/404/1030ΔSH。
本文所述包含减毒纯化活病毒的免疫原性组合物可用于对象的活性免疫接种。在一个实施方式中，本文提供预防病毒感染的方法，包括给予对象有效量的本文所述包含减毒纯化活病毒的免疫原性组合物，即疫苗。在一些实施方式中，减毒活病毒是嵌合病毒。
在一个具体实施方式中，本文提供预防RSV感染的方法，包括向哺乳动物(例如人)给予有效量的本文所述包含减毒纯化活RSV的免疫原性组合物，即疫苗。在一个具体实施方式中，减毒活RSV是rA2cp248/404/1030ΔSH。
本文所述包含减毒纯化活病毒的免疫原性组合物可用于抑制病毒感染。在一个实施方式中，本文提供抑制病毒感染的方法，包括给予有此需要的对象有效量的本文所述包含减毒纯化活病毒的免疫原性组合物。在一些实施方式中，所述减毒病毒是嵌合病毒。在一个具体实施方式中，本文提供抑制RSV感染的方法，包括向哺乳动物(例如人)给予有效量的本文所述包含减毒纯化活RSV的免疫原性组合物。在一个具体实施方式中，所述减毒RSV是rA2cp248/404/1030ΔSH。
本文所述包含减毒纯化活病毒的免疫原性组合物可用于在对象中诱导引起病毒效价降低的免疫应答。在一个实施方式中，本文提供降低对象中病毒效价的方法，包括给予本文所述包含减毒活细胞相关病毒的免疫原性组合物。在一些实施方式中，所述减毒病毒是嵌合病毒。在一个具体实施方式中，本文提供降低RSV效价的方法，包括向哺乳动物(例如人)给予有效量的本文所述包含减毒活RSV的免疫原性组合物。在一个具体实施方式中，所述减毒RSV是rA2cp248/404/1030ΔSH。
在一些实施方式中，本文所述有效量的免疫原性组合物使病毒刺激对象中的病毒效价相对于未处理对象降低约2倍，优选约5倍或更多、约10倍或更多、约20倍或更多。在某些实施方式中，相对于未处理对象，本文所述有效量的免疫原性组合物降低随后用细胞相关病毒感染对象中与细胞相关病毒感染相关的一种或多种症状的持续时间和/或严重程度。在一些实施方式中，相对于未处理对象，本文所述有效量的免疫原性组合物提高随后用纯化病毒感染对象的存活率。
可将本文所述包含减毒纯化活病毒的免疫原性组合物给予未经免疫的对象，即未曾并目前未受感兴趣的病毒感染的对象。在一个实施方式中，可将本文所述包含减毒活细胞相关病毒的免疫原性组合物给予具有产生病毒感染风险的未经免疫对象。在一个具体实施方式中，可将本文所述包含减毒活RSV的免疫原性组合物给予具有产生RSV感染风险的未经免疫对象。在一个具体实施方式中，所述减毒RSV是rA2cp248/404/1030ΔSH。
可将本文所述包含减毒纯化活病毒的免疫原性组合物给予之前受感兴趣病毒的不同群、亚群或毒株感染的对象。在一个实施方式中，将免疫原性组合物给予之前受与感兴趣病毒不同的病毒群、亚群或毒株感染并具有产生感兴趣病毒感染风险的对象。
在一个实施方式中，将本文所述包含减毒活RSV(例如rA2cp248/404/1030ΔSH)的免疫原性组合物给予人婴儿或人早产婴儿。在另一个实施方式中，将本文所述包含减毒活RSV(例如rA2cp248/404/1030ΔSH)的免疫原性组合物给予患囊性纤维化、支气管肺发育异常、先天性心脏病、先天性免疫缺陷或获得性免疫缺陷的人。在另一个实施方式中，将本文所述包含减毒活RSV(例如rA2cp248/404/1030ΔSH)的免疫原性组合物给予人幼童。在另一个实施方式中，将本文所述包含减毒活RSV(例如rA2cp248/404/1030ΔSH)的免疫原性组合物给予人儿童。在另一个实施方式中，将本文所述包含减毒活RSV(例如rA2cp248/404/1030ΔSH)的免疫原性组合物给予人学龄儿童。
在一个具体实施方式中，将本文所述包含减毒活RSV(例如rA2cp248/404/1030ΔSH)的免疫原性组合物给予1-24月龄的人。在另一个实施方式中，将本文所述包含减毒活RSV(例如rA2cp248/404/1030ΔSH)的免疫原性组合物给予1-3月龄的人。在另一个实施方式中，将本文所述包含减毒活RSV(例如rA2cp248/404/1030ΔSH)的免疫原性组合物给予6-24月龄的人。
在另一个实施方式中，将本文所述包含减毒活RSV(例如rA2cp248/404/1030ΔSH)的免疫原性组合物给予经历过骨髓移植的人。在另一个实施方式中，将本文所述包含减毒活RSV(例如rA2cp248/404/1030ΔSH)的免疫原性组合物给予老年人。在另一个实施方式中，将本文所述包含减毒活RSV(例如rA2cp248/404/1030ΔSH)的免疫原性组合物给予疗养院的人。在另一个实施方式中，将本文所述包含减毒活RSV(例如rA2cp248/404/1030ΔSH)的免疫原性组合物给予在群居房(即15个或更多个人对象居住的住所)居住的人。
在一个具体实施方式中，将包含减毒活RSV(例如rA2cp248/404/1030ΔSH)的免疫原性组合物在RSV季节，在北半球通常为11月到4月之前给予人对象(在一个具体实施方式中，所述人对象是人婴儿、人早产婴儿或人幼童)。在另一个具体实施方式中，将包含减毒活RSV(例如rA2cp248/404/1030ΔSH)的免疫原性组合物在RSV季节，在北半球通常为11月到4月期间给予人对象(在一个具体实施方式中，所述人对象是人婴儿、人早产婴儿或人幼童)。在另一个具体实施方式中，将包含减毒活RSV(例如rA2cp248/404/1030ΔSH)的免疫原性组合物在RSV季节，在北半球通常为11月到4月之前和其期间给予人对象(在一个具体实施方式中，所述人对象是人婴儿、人早产婴儿或人幼童)。
在某些实施方式中，本文所述包含减毒纯化活病毒的免疫原性组合物不产生对病毒感染的完全保护作用，但相对于未处理对象在受到所述病毒刺激时产生较低病毒效价。在某些实施方式中，给予本文所述包含减毒纯化活病毒的免疫原性组合物相对于未处理对象在受到所述病毒刺激时引起病毒效价降低0.5倍、1倍、2倍、4倍、6倍、8倍、15倍、25倍、50倍或更多。在一些实施方式中，给予本文所述包含减毒活病毒的免疫原性组合物相对于未处理对象在受到所述病毒刺激时引起病毒效价降低10％，优选25％、50％、75％或更多。病毒效价降低的益处包括但不限于：病毒感染症状的严重程度降低、病毒感染的症状减少和病毒感染的时间长度减少。
可将本文所述包含减毒活嵌合细胞相关病毒的免疫原性组合物用于诱导对非病毒抗原的免疫应答。可将本文所述包含减毒活嵌合细胞相关病毒的免疫原性组合物用于向对象递送感兴趣的蛋白质、多肽或肽以预防和/或治疗疾病。
可采用多种方法引入本文所述免疫原性组合物例如疫苗制剂，这些方法包括但不限于：鼻内、气管内、口服、肺部、皮内、腹膜内和胃肠道外(例如，肌内、静脉内和皮下)途径。在一些实施方式中，通过病毒感染的天然途径给予本文所述包含减毒活细胞相关病毒的免疫原性组合物。在一个具体实施方式中，鼻内给予本文所述包含减毒活RSV(例如rA2cp248/404/1030ΔSH)的免疫原性组合物。
在免疫接种步骤中，所用免疫原性组合物的量和接种方案由本领域医师确定，参考所述对象的免疫应答和抗体效价进行给予。在一个具体实施方式中，给予人婴儿、人早产婴儿或人幼童一剂量的包含减毒活RSV(例如rA2cp248/404/1030ΔSH)的免疫原性组合物，其中所述剂量的免疫原性组合物包含约125-200FFU减毒RSV。在另一个实施方式中，给予人婴儿、人早产婴儿或人幼童一剂量的包含减毒活RSV(例如rA2cp248/404/1030ΔSH)的免疫原性组合物，其中所述剂量的免疫原性组合物包含约125FFU、约150FFU、约175FFU或约200FFU减毒RSV。
在一些实施方式中，给予人婴儿、人早产婴儿或人幼童2-6剂量的包含约125-200FFU减毒活RSV(例如rA2cp248/404/1030ΔSH)的免疫原性组合物。在一些实施方式中，所述各剂量的免疫原性组合物间隔1-6个月或2-12个月给予。在一个具体实施方式中，间隔2个月给予人婴儿、人早产婴儿或人幼童3剂量的包含约125-200FFU减毒活RSV(例如rA2cp248/404/1030ΔSH)的免疫原性组合物。例如，给予小于1月龄的婴儿第一剂量的包含150FFU减毒活RSV(例如rA2cp248/404/1030ΔSH)的免疫原性组合物，给予约2月龄的人婴儿第二剂量的包含150FFU减毒活RSV(例如rA2cp248/404/1030ΔSH)的免疫原性组合物，给予约4月龄的人婴儿第三剂量的包含150FFU减毒活RSV(例如rA2cp248/404/1030ΔSH)的免疫原性组合物。
6.7病毒
细胞相关病毒可以是天然产生的病毒、诱变产生的病毒(例如通过接触紫外辐射、诱变剂和/或传代发生突变的病毒)、重配(就具有分区段基因组的细胞相关病毒而言)和/或遗传工程改造病毒。细胞相关RNA病毒的非限制性例子包括呼吸道合胞病毒(RSV)、麻疹病毒、流感病毒、人泡沫病毒、逆转录病毒如HTLV、慢病毒如HIV和SIV、以及呼肠孤病毒。或者，细胞相关病毒是DNA病毒，如疱疹病毒。细胞相关DNA病毒的非限制性病毒包括疱疹病毒、EBV、CMV和马瑞克病(Marek’s disease)病毒。在某些实施方式中，通过本文所述方法纯化和/或包含于本文所述免疫原性组合物中的细胞相关病毒具有复制缺陷性。在一个具体实施方式中，病毒基因组复制和/或合成必需的一种或多种功能在复制缺陷性细胞相关病毒中具有缺陷。在另一个实施方式中，病毒颗粒装配必需的一种或多种功能在复制缺陷性细胞相关病毒中具有缺陷。在另一个实施方式中，病毒基因组复制或合成以及病毒颗粒装配必需的一种或多种功能在复制缺陷性细胞相关病毒中具有缺陷。
在一个具体实施方式中，通过本文所述方法纯化和/或包含于本文所述免疫原性组合物中的细胞相关病毒是减毒病毒。在一个具体实施方式中，细胞相关病毒是减毒活病毒。相对于野生型细胞相关病毒，减毒细胞相关病毒可能例如，复制其病毒基因组的能力降低、在所希望宿主中复制的能力降低、装配感染病毒颗粒的能力降低和/或感染宿主细胞的能力降低。可通过本领域技术人员已知的任何方法测试细胞相关病毒的减毒作用。参见例如，2004年4月23日提交的美国专利申请序列号10/831,780(2005年1月27日以美国专利申请公开号2005/0019891公开)，具体在标题为“重组病毒的减毒(Attenuation of Recombinant Viruses)”的第5.7节。在一些实施方式中，采用众所周知的诱变技术，如病毒冷传代或接触紫外辐射和/或诱变剂产生减毒病毒。在其它实施方式中，所述减毒病毒是遗传工程改造病毒。
细胞相关病毒可以是嵌合病毒。在一个具体实施方式中，所述嵌合病毒是复制缺陷性病毒。在一个具体实施方式中，所述嵌合病毒是减毒病毒。
6.7.1流感病毒
本文的培养基、方法、过程和组合物可特别用于疫苗用流感病毒的生产和纯化。流感病毒由包含分区段单链RNA基因组的内部核糖核蛋白核心和由基质蛋白衬里的外部脂蛋白包膜组成。甲型流感病毒和乙型流感病毒各包含8个区段的单链负义RNA。甲型流感病毒基因组编码11种多肽。区段1-3编码3种多肽，组成RNA依赖性RNA聚合酶。区段1编码聚合酶复合体蛋白PB2。其余聚合酶蛋白PB1和PA分别由区段2和区段3编码。此外，一些流感病毒毒株的区段1编码一种小蛋白质PB1-F2，其由PB1编码区域内的另起读框产生。区段4编码参与感染期间细胞附着和进入的血凝素(HA)表面糖蛋白。区段5编码核壳体核蛋白(NP)多肽，其为与病毒RNA相关的主要结构组分。区段6编码神经氨酸酶(NA)包膜糖蛋白。区段7编码称为M1和M2的两种基质蛋白，其从差别剪接的mRNA翻译得到。区段8编码NS1和NS2两种非结构蛋白，其从选择性剪接的mRNA变体翻译得到。
乙型流感病毒的8个基因组区段编码11种蛋白质。3个最大的基因编码RNA聚合酶组分PB1、PB2和PA。区段4编码HA蛋白。区段5编码NP。区段6编码NA蛋白和NB蛋白。NB和NA两种蛋白均从双顺反子mRNA的重叠阅读框翻译得到。乙型流感病毒的区段7也编码两种蛋白质：M1和M2。最小的区段编码两种产物，即从全长RNA翻译得到的NS1和从剪接mRNA变体翻译得到的NS2。
产生重配病毒以便在也称为主供体病毒(MDV)的获准主毒株的背景中引入从临床分离物选择的血凝素和/或神经氨酸酶抗原。例如，FluMist利用获准的冷适应、减毒的温度敏感性MDV毒株(例如，caA/AnnArbor/6/60和ca B/Ann Arbor/1/66)。可用作主供体病毒的其它毒株包括但不限于：ca A/AnnArbor/6/60、ca B/Ann Arbor/1/66、caA/Leningrad/134/17/57、A/PuertoRico/8/34(PR8)、ca B/Ann Arbor/1/94、B/Leningrad/14/17/55、B/USSR/60/69和B/Leningrad/179/86。
有多种方法可用于产生重配病毒，包括基于卵的方法和最近的细胞培养方法。参见例如，PCT专利公开WO 03/091401、WO 05/062820，美国专利第6,544,785、6,649,372、6,951,75号，以及美国专利公开第11/455,818、11/455,734和11/501,067号。考虑到本发明的培养基和方法可用于生产流感病毒，其包括但不限于本文公开的流感病毒毒株和包含主供体病毒基因的重配病毒(例如，ca A/AnnArbor/6/60、ca B/AnnArbor/1/66、PR8等)。还考虑到本发明的培养基和方法可用于生产流感病毒，其包括具有一种或多种以下表型的重配病毒：温度敏感性、冷适应、减毒。重配株可通过经典重配技术，例如通过共感染方法或任选通过质粒拯救技术产生(参见例如，PCT专利公开WO 03/091401和WO 05/062820；美国专利号6,544,785、6,649,372、6,951,754、6,887,699、6,001,634、5,854,037、5,824,536、5,840,520、5,820,871、5,786,199和5,166,057；美国专利申请公开号20060019350、20050158342、20050037487、20050266026、20050186563、20050221489、20050032043、20040142003、20030035814和20020164770；以及Neumann等(1999)“完全从克隆cDNA产生流感病毒A(Generation of influenza Avirus entirely from cloned cDNAs.)”Proc Natl Acad Sci USA 96：9345-9350；Fodor等(1999)“从重组DNA拯救流感病毒A(Rescue of influenza A virusfrom recombinant DNA.)”J.Virol 73：9679-9682；Hoffmann等(2000)“从8个质粒产生流感病毒A的DNA转染系统(A DNA transfection system forgeneration of influenza A virus from eight plasmids)”Proc Natl Acad Sci USA97：6108-6113；WO 01/83794；Hoffmann和Webster(2000)，“从8个质粒产生流感病毒A的单向RNA聚合酶I-聚合酶II转录系统(Unidirectional RNApolymerase I-polymerase II transcription system for the generation of influenzaA virus from eight plasmids)”，81：2843-2847；和Hoffmann等(2002)，“从8个质粒拯救流感病毒B(Rescue of influenza B viruses from 8 plasmids)”，99(17)：11411-11416)。近来，已通过MDCK细胞中的质粒拯救产生了重配株(参见例如，PCT专利公开WO 2007/124327；Wang和Duke；2007年10月23日，J.Virol.，4：102)。
6.7.2呼吸道合胞病毒
本文的培养基、方法和组合物可特别用于疫苗用RSV的生产和纯化。RSV的任何群、亚群或毒株(例如，A群或B群)均可通过本文所述方法纯化和/或包含于本文所述的免疫原性组合物中。参见例如，Sato等，2005，Journal of Clinical Microbiology 43：36-40对RSV群和亚群的讨论。在一个实施方式中，所述RSV属于A群。在另一个实施方式中，所述RSV属于B群。
通过本文所述方法纯化和/或包含于本文所述免疫原性组合物中的RSV可以是天然产生的RSV毒株、诱变产生的RSV(例如通过接触紫外辐射、诱变剂和/或传代发生突变的病毒)和/或遗传工程改造RSV。在一个实施方式中，RSV基因组在一个或多个病毒基因，如F、G、NS1、NS2、M1(开放阅读框(“ORF”)1)、M2(ORF2)、SH2、N、P或L基因中包含一个或多个突变。在一些实施方式中，向RSV基因组引入取代、缺失和/或插入的组合。在一些实施方式中，RSV基因组在一个或多个病毒基因，如F、G、NS1、NS2、M1(ORF1)、M2(ORF2)、SH2、N、P或L基因中包含一个或多个错义突变。在一些实施方式中，RSV基因组在一个或多个病毒基因，如NS1、NS2、M1(ORF1)、M2(ORF2)、SH2、N、P或L基因中的所有或一部分中包含一个或多个缺失。
在一个实施方式中，可通过本文所述方法纯化和/或包含于本文所述免疫原性组合物中的RSV具有复制缺陷性。在一个具体实施方式中，可通过本文所述方法纯化和/或包含于本文所述免疫原性组合物中的RSV是减毒的。可引入RSV基因组以使所述病毒减毒的突变的非限制性例子参见例如，2004年4月23日提交的美国专利申请序列号10/831,780(2005年1月27日以美国专利申请公开号2005/0019891公开)和2006年3月24日提交的美国专利申请序列号11/389,618(2006年7月20日以美国专利申请公开号2006/0160130公开)。减毒RSV包括但不限于：冷传代(cp)突变株(例如，在例如Kim等.，1971，Pediatrics 48：745-755描述的cpRSV，其通过引用全文纳入本文)、温度敏感性(ts)突变株(例如，在例如Crowe等，1993，Vaccine11：1395-1404；Crowe等，1995，Vaccine 13：847-855；Mills等，1971，JImmunol.107：123-130；和Pringle等，Vaccine 1993 11：473-478中描述的RSV ts-1、RSV ts-2、ts1A、ts19A和ts1C)、冷传代温度敏感性(cpts)突变株(例如，cpts248/404、cpts248/255、cpts 248/955和cpts 530/1009，参见例如，Karron等，1997，J Infect Dis.176：1428-1436)和遗传工程改造突变株(例如，在例如Karron等，J.of Infect.Diseases 191：1093-1140；Whitehead等，1999，J.Virol.73：3438-3442；和Collins等，2005，Proc.Am.Thorac.Soc.2：166-173中描述的rA2cp248/404ΔSH、rA2cp248/404/1030ΔSH、rΔNS1、rΔM2-2和r248ΔNS2)。
在一个具体实施方式中，可通过本文所述方法纯化和/或包含于本文所述免疫原性组合物中的RSV是rA2cp248/404/1030ΔSH。该减毒RSV包含形成其温度敏感性和减毒性质的多个减毒遗传元件，包括：(i)使冷适应RSV减毒的N、F和L蛋白中的一组5个错义突变；(ii)降低限制性温度、形成温度敏感性表型并使病毒减毒的L蛋白中的独立错义突变248和1030修饰；(iii)一起形成额外温度敏感性的M2基因的基因起始转录信号中核苷酸取代和L蛋白中一个错义突变的组合404修饰；和(iv)形成减毒表型的整个SH基因的一个缺失ΔSH。参见以下表2中引入RSV基因组的氨基酸取代的位置。
表2引入RSV基因组的氨基酸取代
Figure BPA00001373558000731
*相对于野生型RSV A2的氨基酸取代
在一些实施方式中，改造可通过本文所述方法纯化和/或包含于本文所述免疫原性组合物中的RSV以表达一种或多种异源序列(即所述RSV是嵌合病毒)。可将异源序列引入例如，F、G、NS1、NS2、M1(ORF1)、M2(ORF2)、N、P、SH2和/或L编码序列。可改造RSV来表达的异源序列的非限制性例子包括：抗原(例如，病毒抗原、细菌抗原、肿瘤抗原(如Robbins和Kawakawi，1996，Curr.Opin.Immunol.8：628-636描述的抗原)、真菌抗原和寄生虫抗原)、标记或标签(例如，flag标签和His标签)、嵌合蛋白质(例如，来自两种不同RSV毒株的RSV G蛋白的杂合体)以及具有所需生物性质或活性的蛋白质、多肽或肽(例如，细胞因子，如干扰素(IFN)-α、IFN-β、IFN-γ、IL-2、IL-7、IL-9、IL-15和IL-22)。在一个具体实施方式中，所述嵌合RSV是减毒的。就嵌合RSV的非限制性例子而言，参见例如，2004年4月23日提交的美国专利申请序列号10/831,780(2005年1月27日以美国专利申请公开号2005/0019891公开)和2006年3月24日提交的美国专利申请序列号11/389,618(2006年7月20日以美国专利申请公开号2006/0160130公开)。
在一个实施方式中，改造RSV以表达来自属于不同于RSV载体的RSV群、亚群或毒株的病毒的一种或多种病毒抗原。例如但不构成限制，所述RSV载体可来自B群RSV，所述异源序列可来自A群RSV。
在另一个实施方式中，改造RSV以表达获自或来自非RSV病毒的一种或多种病毒抗原。病毒抗原的非限制性例子包括来自以下的抗原：腺病毒科(例如，乳腺病毒和禽腺病毒)、疱疹病毒科(例如，单纯疱疹病毒1、单纯疱疹病毒2、单纯疱疹病毒5、单纯疱疹病毒6、非洲淋巴细胞瘤病毒、HHV6-HHV8和巨细胞病毒)、光滑病毒科(例如，光滑病毒、肠细菌噬菌体MS2、异轻小噬菌体)、痘病毒科(例如，脊椎动物痘病毒亚科、副痘病毒、禽痘病毒、山羊痘病毒、兔痘病毒、猪痘病毒、软疣痘病毒和昆虫痘病毒亚科)、乳多孔病毒科(例如，多瘤病毒和乳头瘤病毒)、副粘病毒科(例如，副粘病毒、副流感病毒1、麻疹病毒属(例如麻疹病毒)、腮腺炎病毒属(例如流行性腮腺炎病毒)、肺病毒亚科(例如，肺病毒、人呼吸道合胞病毒)、人呼吸道合胞病毒和肺炎后病毒(例如，禽肺病毒和人肺炎后病毒)、小核糖核酸病毒科(例如，肠道病毒、鼻病毒、肝病毒(例如人甲型肝炎病毒)、心病毒和口蹄疫病毒)、呼肠孤病毒科(例如，正呼肠孤病毒、环状病毒、轮状病毒、质型多角体病毒、斐济病毒、植物呼肠病毒和水稻病毒)、逆转录病毒科(例如，哺乳动物B型逆转录病毒、哺乳动物C型逆转录病毒、禽C型逆转录病毒、D型逆转录病毒群、BLV-HTLV逆转录病毒、慢病毒(例如，人免疫缺陷病毒1和人免疫缺陷病毒2(例如HIV gp160)、泡沫病毒)、黄病毒科(例如丙型肝炎病毒、登革热病毒、西尼罗病毒)、肝DNA病毒科(例如乙型肝炎病毒)、披膜病毒科(例如α病毒属(例如辛德毕斯病毒)和风疹病毒属(例如风疹病毒))、弹状病毒科(例如，水疱病毒、狂犬病病毒、短暂热病毒、质型弹状病毒和核型弹状病毒)、沙粒病毒科(例如，沙粒病毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒、伊派病毒和拉沙病毒)和冠状病毒科(例如冠状病毒和环状病毒)。在一个具体实施方式中，所述病毒抗原来自产生呼吸疾病的病毒，如流感病毒抗原(例如，血凝素H5和H7)、肺炎后病毒抗原、副流感病毒抗原、新城疫病毒抗原、仙台病毒抗原和传染性喉气管炎病毒抗原(ILV)。在某些实施方式中，所述病毒抗原来自1型人副流感病毒、2型人副流感病毒、3型人副流感病毒或仙台病毒。在另一个实施方式中，所述病毒抗原是HIV gp120、HIV nef、流感病毒神经氨酸酶、流感病毒血凝素、HTLV tax、单纯疱疹病毒糖蛋白(例如，gB、gC、gD和gE)、乙型肝炎表面抗原、丙型肝炎病毒E蛋白或冠状病毒突起蛋白。
在另一个实施方式中，改造RSV以表达一种或多种细菌抗原(例如，细菌外被蛋白或细菌相关保护性抗原)。细菌抗原的非限制性例子包括来自以下的抗原：水螺菌科(Aquaspirillum)、固氮螺菌科(Azospirillum)、固氮菌科(Azotobacteraceae)、类杆菌科(Bacteroidaceae)、巴尔通体(Bartonella)、蛭弧菌科(Bdellovibrio)、弯曲杆菌(Campylobacter)、衣原体(Chlamydia)(例如，肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae))、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)(例如，柠檬酸菌(Citrobacter)、爱德华菌(Edwardsiella)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、欧文菌(Erwinia)、大肠杆菌(Escherichia coli)、哈夫尼菌(Hafnia)、克雷伯菌(Klebsiella)、摩根菌(Morganella)、普通变形杆菌(Proteus vulgaris)、普罗威登斯菌(Providencia)、沙门菌(Salmonella)、粘质沙雷菌(Serratia marcescens)和弗氏志贺菌(Shigella flexneri))、加特纳菌科(Gardinella)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、盐杆菌科(Halobacteriaceae)、螺杆菌科(Helicobacter)、军团菌科(Legionallaceae)、李斯特菌(Listeria)、甲基球菌科(Methylococcaceae)、分枝杆菌(mycobacteria)(例如结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis))、奈瑟球菌科(Neisseriaceae)、海洋螺菌科(Oceanospirillum)、巴斯德菌科(Pasteurellaceae)、肺炎球菌(Pneumococcus)、假单胞菌(Pseudomonas)、根瘤菌科(Rhizobiaceae)、螺菌科(Spirillum)、螺状菌科(Spirosomaceae)、葡萄球菌属(Staphylococcus)(例如甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和致热葡萄球菌(Staphylococcus pyrogenes))、链球菌属(Streptococcus)(例如，肠炎链球菌(Streptococcus enteritidis)、粪链球菌(Streptococcus fasciae)和肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae))、蝙蝠弧菌螺杆菌科(Vampirovibr Helicobacter)、耶尔森菌科(Yersinia)、炭疽杆菌(Bacillus antracis)和蝙蝠弧菌科(Vampirovibrio)。在一个具体实施方式中，所述细菌抗原来自引起呼吸疾病或与其相关的细菌，如肺炎球菌、流感嗜血杆菌、链球菌属和肺炎衣原体。
在另一个实施方式中，改造RSV以表达获自或来自致病性真菌的一种或多种真菌抗原。真菌抗原的非限制性例子包括来自以下的抗原：新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)；皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)；皮炎艾里欧菌(Aiellomyces dermatitidis)；夹膜组织胞浆菌(Histoplasmacapsulatum)；粗球孢子菌(Coccidioides immitis)；念珠菌属(Candida)，包括白色念珠菌(C.albicans)、热带念珠菌(C.tropicalis)、近平滑念珠菌(C.parapsilosis)、季也蒙假丝酵母(C.guilliermondii)和克鲁斯念珠菌(C.krusei)；曲霉属(Aspergillus)，包括烟曲霉(A.fumigatus)、黄曲霉(A.flavus)和黑曲霉(A.niger)；根霉属(Rhizopus)；根毛酶属(Rhizomucor)；小克银汉霉(Cunninghammella)；囊托霉属(Apophysomyces)，包括瓶囊托霉(A.saksenaea)、毛囊托霉(A.mucor)和犁头囊托霉(A.absidia)；申克孢子丝菌(Sporothrix schenckii)；巴西副球孢子菌(Paracoccidioides brasiliensis)；波氏假性阿利什利菌(Pseudallescheria boydii)；光滑球拟酵母菌(Torulopsisglabrata)；毛癣菌属(Trichophyton)；小孢子菌属(Microsporum)和皮肤癣菌属(Dermatophyre)的抗原。在一个具体实施方式中，所述真菌抗原来自引起呼吸疾病或与其相关的致病性真菌。
在另一个实施方式中，改造RSV以表达一种或多种寄生虫抗原。寄生虫抗原的非限制性例子包括来自以下的抗原：顶复亚门成员，例如，巴贝虫属(Babesia)、弓形虫(Toxoplasma)、疟原虫属(Plasmodium)、艾美虫属(Eimeria)、等孢球虫属(Isospora)、鸟类弓形球虫属(Atoxoplasma)、隐等孢球虫属(Cystoisospora)、哈蒙德虫属(Hammondia)、贝斯尼虫属(Besniotia)、肉孢子虫属(Sarcocystis)、弗伦克虫属(Frenkelia)、变形血原虫属(Haemoproteus)、住白细胞虫属(Leucocytozoon)、泰勒虫属(Theileria)、帕金虫属(Perkinsus)和簇虫属(Gregarina)；卡氏肺孢子虫(Pneumocystis carinii)；微孢子门成员，例如，微粒子虫属(Nosema)、肠类微孢子虫属(Enterocytozoon)、脑类微孢子虫属(Encephalitozoon)、间隔孢子虫属(Septata)、马拉泽虫属(Mrazekia)、钝孢子虫属(Amblyospora)、阿米森虫属(Ameson)、格留虫属(Glugea)、具褶孢虫属(Pleistophora)和微孢子虫属(Microsporidium)；囊孢子虫亚门成员，例如，单孢子虫属(Haplosporidium)，以及以下各种，包括：恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、间日疟原虫(P.vivax)、卵形疟原虫(P.ovale)、三日疟原虫(P.malaria)；刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)；墨西哥利什曼原虫(Leishmania mexicana)、热带利什曼原虫(L.tropica)、硕大利什曼原虫(L.major)、埃塞俄比亚利什曼原虫(L.aethiopica)、杜氏利什曼原虫(L.donovani)；克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)、布氏锥虫(T.brucei)；曼氏血吸虫(Schistosoma mansoni)、埃及血吸虫(S.haematobium)、日本血吸虫(S.japonium)；旋毛形线虫(Trichinella spiralis)；班氏丝虫(Wuchereria bancrofti)；马来丝虫(Brugia malayli)；溶组织内阿米巴(Entamoeba histolytica)；蛲虫(Enterobius vermiculoarus)；猪带绦虫(Taeniasolium)、牛带绦虫(T.saginata)；阴道毛滴虫(Trichomonas vaginatis)、人毛滴虫(T.hominis)、口腔毛滴虫(T.tenax)；蓝氏贾第鞭毛虫(Giardia lamblia)；微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)；卡氏肺孢子虫(Pneumocytiscarinii)；牛巴贝虫(Babesia bovis)、分歧巴贝虫(B.divergens)、田鼠巴贝虫(B.microti)；贝氏等孢球虫(Isospora belli)、人等孢球虫(I.hominis)；脆弱双核阿米巴(Dientamoeba fragilis)；旋盘尾丝虫(Onchocerca volvulus)；似蚓蛔线虫(Ascaris lumbricoides)；美洲钩虫(Necator americanis)；十二指肠钩虫(Ancylostoma duodenale)；粪类圆线虫(Strongyloides stercoralis)；菲律宾毛细线虫(Capillaria philippinensis)；广州管圆线虫(Angiostrongyluscantonensis)；微小膜壳绦虫(Hymenolepis nana)；阔节裂头绦虫(Diphyllobothrium latum)；细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus)、多房棘球绦虫(E.multilocularis)；卫氏并殖吸虫(Paragonimus westermani)、卡里并殖吸虫(P.caliensis)；华支睾吸虫(Chlonorchis sinensis)；猫肝吸虫(Opisthorchis felineas)、泰国肝吸虫(O.Viverini)；肝片吸虫(Fasciolahepatica)；疥螨(Sarcoptes scabiei)；人虱(Pediculus humanus)；阴虱(Phthirluspubis)和人肤皮蝇(Dermatobia hominis)。
7.具体实施方式
1.一种在细胞培养物中产生流感病毒达到至少约8.0的log10TCID50/mL和/或至少约8.0的log10FFU/mL的方法，包括：
(a)在无血清培养基中增殖MDCK细胞，同时保持选自下组的一种或多种培养条件：在约100到200rpm之间的搅拌速率、在约6.0到约7.8之间的pH、在约33℃到约42℃之间的温度和在约35％到约100％之间的溶氧(DO)；
(b)用流感病毒感染增殖的MDCK细胞而不交换培养基；和
(c)在允许流感病毒复制的条件下温育感染的增殖MDCK细胞。
2.如实施方式1所述的方法，其中所述培养基是MediV SFM 110。
3.如实施方式1或2所述的方法，其中所述MediV SFM 110包含9g/L葡萄糖。
4.如以上实施方式中任何一个所述的方法，其中所述MDCK细胞在微载体上以贴壁细胞形式增殖。
5.如实施方式4所述的方法，其中所述微载体的浓度在1-3g/L之间。
6.如实施方式4或5所述的方法，其中将所述MDCK细胞以10-40个细胞/微载体的密度接种到微载体上，并增殖2-5天。
7.如以上实施方式中任何一个所述的方法，其中所述搅拌速率保持在约100到200rpm之间，所述pH保持在约6.0到约7.8之间，所述温度保持在约33℃到约42℃之间，所述溶氧(DO)保持在约35％到约100％之间。
8.如以上实施方式中任何一个所述的方法，其中在150rpm-200rpm的搅拌速率下增殖所述MDCK细胞。
9.如以上实施方式中任何一个所述的方法，其中在7.0-7.8的pH下增殖所述MDCK细胞。
10.如实施方式9所述的方法，其中所述pH是7.4±0.2。
11.如以上实施方式中任何一个所述的方法，其中在37±2℃的温度下增殖所述MDCK细胞。
12.如以上实施方式中任何一个所述的方法，其中所述MDCK细胞是保藏为ATCC登录号PTA-7909或PTA-7910的细胞。
13.如以上实施方式中任何一个所述的方法，其中所述MDCK细胞增殖达到5x105-3x106个细胞/mL的细胞密度。
14.如以上实施方式中任何一个所述的方法，其中采用0.01x103FFU/mL-0.1x103FFU/mL的病毒输入量进行步骤(b)。
15.如实施方式14所述的方法，其中采用0.01x103FFU/mL-0.05FFU/mL的病毒输入量进行步骤(b)。
16.如以上实施方式中任何一个所述的方法，其中采用0.00001FFU/细胞-0.0001FFU/细胞的病毒输入量进行步骤(b)。
17.如实施方式16所述的方法，其中采用0.00001FFU/细胞-0.00005FFU/细胞的病毒输入量进行步骤(b)。
18.如以上实施方式中任何一个所述的方法，其中所述流感病毒是冷适应的。
19.如实施方式18所述的方法，其中所述流感病毒也是减毒和温度敏感性的。
20.如以上实施方式中任何一个所述的方法，其中所述流感病毒是甲型流感病毒。
21.如以上实施方式中任何一个所述的方法，其中所述流感病毒是乙型流感病毒。
22.如实施方式20所述的方法，其中所述甲型流感病毒包含流感病毒毒株ca A/Ann Arbor/6/60的一个或多个基因区段。
23.如实施方式21所述的方法，其中所述乙型流感病毒包含流感病毒毒株ca B/Ann Arbor/1/66的一个或多个基因区段。
24.如以上实施方式中任何一个所述的方法，其中在步骤(c)的流感病毒复制过程中在30℃到35℃之间温育所述MDCK细胞。
25.如实施方式24所述的方法，其中在步骤(c)的流感病毒复制过程中在33±2℃温育所述MDCK细胞。
26.如以上实施方式中任何一个所述的方法，其中在步骤(c)的流感病毒复制过程中在150rpm-200rpm的搅拌速率下温育所述MDCK细胞。
27.如以上实施方式中任何一个所述的方法，其中在步骤(c)的流感病毒复制过程中在约7.0到约7.8之间的pH下温育所述MDCK细胞。
28.如实施方式27所述的方法，其中所述pH是7.4±0.2。
29.如以上实施方式中任何一个所述的方法，其中步骤(c)期间存在蛋白酶。
30.如实施方式29所述的方法，其中所述蛋白酶是丝氨酸蛋白酶。
31.如实施方式29或30所述的方法，其中所述蛋白酶是重组动物游离蛋白酶。
32.如实施方式31所述的方法，其中所述蛋白酶存在的终浓度是0.03X。
33.如以上实施方式中任何一个所述的方法，还包括在感染后收获培养基的步骤。
34.如实施方式33所述的方法，其中在感染48小时到72小时后收获所述培养基。
35.一种在生长于微载体上的细胞培养物中实现珠粒对珠粒转移细胞的方法，包括：
(a)第一洗涤步骤，用包含螯合剂的洗涤介质替换全部或一部分生长培养基；
(b)在洗涤介质中搅拌或不搅拌温育细胞培养物；
(c)向洗涤介质中的细胞培养物加入蛋白酶；
(d)将细胞培养物与蛋白酶搅拌或不搅拌温育；和
(e)转移到新的生长容器中。
36.如实施方式35所述的方法，还包括步骤(b)和(c)之间用包含螯合剂的洗涤介质进行的第二洗涤步骤。
37.如实施方式35或36所述的方法，其中在步骤(d)之后加入新鲜生长培养基和/或额外微载体。
38.如实施方式35到37中任何一个所述的方法，其中在步骤(e)之前、期间或之后加入所述新鲜培养基和/或额外微载体。
39.如实施方式35到38中任何一个所述的方法，其中所述螯合剂的浓度在0.4mM到0.6mM之间。
40.如实施方式35到39中任何一个所述的方法，其中所述洗涤介质的pH在7.8到8.2之间。
41.如实施方式35到40中任何一个所述的方法，其中所述蛋白酶是重组动物游离蛋白酶。
42.如实施方式41所述的方法，其中加入所述蛋白酶的终浓度在0.04X到0.06X之间。
43.如实施方式35到42中任何一个所述的方法，其中在步骤(b)中搅拌所述细胞培养物。
44.如实施方式35到43中任何一个所述的方法，其中在步骤(d)中搅拌所述细胞培养物。
45.如实施方式43或44所述的方法，其中在175rpm-275rpm搅拌所述细胞培养物。
46.如实施方式45所述的方法，其中在230±25rpm搅拌所述细胞培养物。
47.如实施方式35到46中任何一个所述的方法，其中在步骤(b)和(d)中将所述细胞培养物温育15-60分钟。
48.如实施方式35到47中任何一个所述的方法，其中在步骤(d)之后加入蛋白酶抑制剂。
49.一种在生长于微载体上的细胞培养物中实现珠粒对珠粒转移细胞的方法，包括：
(a)在不洗涤细胞的情况下向细胞培养物加入螯合剂；
(b)在螯合剂的存在下搅拌或不搅拌温育细胞培养物；
(c)在螯合剂的存在下向细胞培养物中加入蛋白酶；
(d)将细胞培养物与蛋白酶搅拌或不搅拌温育；和
(e)加入额外的新鲜培养基，用一种或多种培养基组分补充细胞培养物。
50.如实施方式49所述的方法，其中所述一种或多种培养基组分选自下组：CaCl2、MgCl2、MgSO4、痕量元素A、痕量元素B和痕量元素C。
51.如实施方式49或50所述的方法，其中所述一种或多种培养基组分是1.25mM-1.5mM CaCl2、0.1mM-0.2mM MgCl2、0.1-0.8mM MgSO4、2X痕量元素A、2X痕量元素B和2X痕量元素C。
52.如实施方式49到51中任何一个所述的方法，其中在步骤(e)之前、期间或之后将细胞培养物转移到新的生长容器中。
53.如实施方式49到52中任何一个所述的方法，其中所述螯合剂的浓度在0.5mM到5mM之间。
54.如实施方式53所述的方法，其中所述螯合剂的浓度是约2mM。
55.如实施方式49到54中任何一个所述的方法，其中在步骤(c)之前或期间根据需要将细胞培养物的pH调整到7.8-8.2。
56.如实施方式49到55中任何一个所述的方法，其中所述蛋白酶是重组动物游离蛋白酶。
57.如实施方式49到56中任何一个所述的方法，其中加入所述蛋白酶的终浓度在0.04X到0.06X之间。
58.如实施方式49到57中任何一个所述的方法，其中在步骤(b)中搅拌所述细胞培养物。
59.如实施方式49到58中任何一个所述的方法，其中在步骤(d)中搅拌所述细胞培养物。
60.如实施方式58或59所述的方法，其中在175rpm-275rpm搅拌所述细胞培养物。
61.如实施方式49到60中任何一个所述的方法，其中在步骤(b)和(d)中将所述细胞培养物温育15-90分钟。
62.如实施方式49到61中任何一个所述的方法，其中在步骤(d)之后加入蛋白酶抑制剂。
63.一种从细胞培养物纯化流感病毒的方法，包括：
(a)采用孔径在约1.2微米到约0.45微米之间的至少一个膜通过直流过滤(DFF)澄清病毒收获物；
(b)在步骤(a)之后，采用具有500kDa分子量截留值(MWCO)的膜通过切向流超滤(UF)浓缩，并通过渗滤(DF)进行缓冲液交换；
(c)在步骤(b)之后通过亲和柱色谱进行纯化；
(d)在步骤(c)之后采用具有500kDa分子量截留值(MWCO)的膜进行UF浓缩和/或DF缓冲液交换；和
(e)在步骤(d)之后采用孔径在约0.45微米到约0.22微米之间的至少一个膜通过DFF进行灭菌，
其中纯化病毒的总回收率为至少30％，且纯化病毒在每7.0±0.5log10FFU病毒中包含少于0.1ng HCD和少于0.3μg HCP。
64.如实施方式63所述的方法，其中在步骤(a)之前向病毒收获物加入终浓度为(变化在10％以内)218mM蔗糖、11mM pH 7.0-7.4磷酸盐缓冲液的蔗糖和磷酸盐缓冲液。
65.如实施方式63或64所述的方法，其中结合步骤(a)和(b)。
66.如实施方式63到65中任何一个所述的方法，其中在约10psi到约20psi的跨膜压力(TMP)下进行步骤(b)。
67.如实施方式63到66中任何一个所述的方法，其中在约35升/(米×小时)(LMH)到约50LMH的流量速率下进行步骤(b)。
68.如实施方式63到67中任何一个所述的方法，其中在约12,000秒-1到约16,000秒-1的剪切速率下进行步骤(b)。
69.如实施方式63到68中任何一个所述的方法，其中步骤(b)产生5X浓缩，且交换至少5体积倍数的缓冲液。
70.如实施方式63到69中任何一个所述的方法，其中步骤(b)中的交换缓冲液包含(变化在10％以内)218mM蔗糖、11mM pH 7.0-7.4磷酸盐缓冲液。
71.如实施方式63到70中任何一个所述的方法，其中通过DF的缓冲液交换在步骤(d)中进行。
72.如实施方式63到70中任何一个所述的方法，其中通过UF的浓缩和通过DF的缓冲液交换在步骤(d)中进行。
73.如实施方式63到70中任何一个或实施方式72所述的方法，其中步骤(d)产生至少2X浓缩。
74.如实施方式63到73中任何一个所述的方法，其中步骤(d)中交换至少8体积倍数的缓冲液。
75.如实施方式63到74中任何一个所述的方法，其中步骤(d)中的交换缓冲液包含(变化在10％以内)200mM蔗糖、100mM pH 7.0-7.4磷酸盐缓冲液。
76.如实施方式63到75中任何一个所述的方法，其中向每毫升亲和介质加载8.0log10FFU-11log10FFU流感病毒。
77.如实施方式76所述的方法，其中向每毫升亲和介质加载9.0log10FFU-10.0log10FFU流感病毒。
78.如实施方式76所述的方法，其中向每毫升亲和介质加载9.2log10FFU-9.8log10FFU流感病毒。
79.如实施方式63到78中任何一个所述的方法，其中在加载病毒之后用包含(变化在10％以内)218mM蔗糖、11mM pH 7.0-7.4磷酸盐缓冲液的缓冲液洗涤所述亲和介质。
80.如实施方式63到79中任何一个所述的方法，其中步骤(c)还包括接触包含非特异性内切核酸酶的缓冲液。
81.如实施方式80所述的方法，其中接触包含非特异性核酸酶的缓冲液的时间长度在30分钟到90分钟之间。
82.如实施方式81所述的方法，其中接触包含非特异性核酸酶的缓冲液的时间长度是50±10分钟。
83.如实施方式80到82中任何一个所述的方法，其中所述非特异性内切核酸酶是BenzonaseTM。
84.如实施方式80到83中任何一个所述的方法，其中包含非特异性内切核酸酶的缓冲液包含(变化在10％以内)218mM蔗糖、11mM pH7.0-7.4磷酸盐缓冲液和终浓度在40U/mL到60U/mL之间的非特异性内切核酸酶。
85.如实施方式80到84中任何一个所述的方法，其中在用包含非特异性内切核酸酶的缓冲液处理之后，用包含(变化在10％以内)218mM蔗糖、11mM pH 7.0-7.4磷酸盐缓冲液的缓冲液洗涤所述亲和介质。
86.如实施方式80到85中任何一个所述的方法，其中所述纯化病毒在每7.0±0.5log10FFU病毒中包含少于0.0050ng非特异性内切核酸酶。
87.如实施方式63到86中任何一个所述的方法，其中所述亲和介质选自CellufineTM硫酸酯或FluSelectTM。
88.如实施方式63到87中任何一个所述的方法，其中用包含(变化在10％以内)1M氯化钠、218mM蔗糖和11mM pH 7.0-7.4磷酸盐缓冲液的缓冲液从亲和介质洗脱流感病毒。
89.通过实施方式1到34或63到88中任何一个所述的方法产生的流感病毒。
90.每7.0±0.5log10FFU病毒中包含少于0.1ng HCD和少于0.3μg HCP的纯化流感病毒，其中所述流感病毒从哺乳动物细胞培养物纯化得到。
91.如实施方式90所述的纯化流感病毒，其中所述哺乳动物细胞选自下组：人二倍体肺成纤维细胞、人成视网膜细胞瘤细胞、人肾细胞、胎儿猕猴肺细胞、非洲绿猴肾细胞和狗肾细胞。
92.如实施方式90所述的纯化流感病毒，其中所述哺乳动物细胞是MDCK细胞。
93.如实施方式90所述的纯化流感病毒，其中所述哺乳动物细胞是VERO细胞培养物。
94.包含实施方式89到93中任何一个所述流感病毒的多肽的免疫原性组合物。
8.实施例
参照以下实施例描述本发明。提供这些实施例的目的仅用于说明，不应认为本发明仅限于这些实施例，而应认为本发明包括由本文提供内容显而易见的任何和所有变化形式。当然，应理解，对所用具体设备和试剂、大小、制造商等的具体列举或描述不应视作对本发明的限制，除非特别说明如此。还应理解，可很容易地替换性能类似的其它设备和试剂。
8.1培养基和细胞培养方法
已对可用于增殖MDCK细胞，具体为非致瘤性MDCK细胞达到高密度的无血清培养基制剂(例如，MediV SFM 107、MediV SFM 105)进行了描述(参见例如，FL410US和G-FL414US)。然而，采用这些无血清培养基制剂对适应无血清培养基的非致瘤性MDCK细胞(例如，ATCC登录号PTA-7909或PTA-7910)进行的研究表明，尽管可不交换培养基获得重配流感病毒的合理峰病毒效价(通常测定为log10FFU/mL)，但所述峰效价仍低于交换培养基获得的效价，其中在细胞增殖之后且在感染之前(或同时)去除一部分(约67％)生长培养基并用感染介质替换。此外，需要额外的蛋白酶(TrypLE)获得这些峰效价。为克服需要培养基交换和/或需要额外蛋白酶的缺点，开发了强化培养基MediV SFM 110。MediV SFM 110包含5X浓度的维生素、亚油酸、硫辛酸、核苷、腐胺和存在于之前描述的培养基中几乎所有的氨基酸(参见表3)。相对于用MediV SFM 105+TE(数据未显示)获得的细胞密度，使用MediV SFM 110不提高细胞密度。然而，采用MediV SFM 110，0％和67％的培养基交换显示类似的病毒效价。
采用无培养基交换(MX)方法和通过4个种子反应器的珠粒对珠粒转移(参见以下第8.2节提供的实施例)制备并在MediV SFM 110培养基中培养的细胞进行了12个轮次的实验，其效果如下所述。产生2L规模的包含来自野生型毒株A/Uruguay/716/2007、A/South Dakota/6/2007和B/Florida/4/2006的HA和NA的三个冷适应(ca)、温度敏感性(ts)、减毒(att)重配流感病毒毒株(用标识“ca”在前的野生型毒株名称表示)，所有三个毒株均产生效价为至少8.4log10FFU/mL的病毒。采用1x DPBS洗涤并采用TrypLE精选物和EDTA在pH 8.0胰蛋白酶消化进行珠粒对珠粒转移之后，观察到种子反应器中的细胞正确脱离和最终生产反应器(FPR)中的细胞附着。在感染之后，对这些细胞进行周期性取样以确定最佳收获时间。发现所有病毒类型在感染3天后(dpi)观察到峰病毒效价。对这些毒株各进行4个轮次实验，以证实结果的再现性且数据彼此一致。ca A/Uruguay/716/2007在感染3天后(dpi)产生8.7±0.05log10FFU/mL的最高效价，而ca A/SouthDakota/6/2007和ca B/Florida/4/2006的峰效价在3dpi分别为8.8±0.0log10FFU/mL和8.45±0.25log10FFU/mL。
这些轮次数据的再现性表示无培养基交换方法是一种可靠的方法。因此，所述强化培养基在不交换或加入培养基或组分的情况下保持了生产力。因此，所述强化培养基的开发和使用克服了基于细胞培养的流感疫苗生产中最具挑战性的操作问题之一，即需要培养基交换/补充。
8.1.1材料和方法
材料，试剂和设备：可替换性能类似的其它材料、设备和试剂。
1.杜尔伯科改良伊格尔培养基(DMEM)/汉氏F12培养基(纽约州格兰德岛的吉布可公司(Gibco，Grand Island，NY)，目录号ME080012)
2.MilliQ或WFI水
3.MediV SFM 110基料粉末(纽约州格兰德岛的吉布可公司，目录号ME080045)
4.葡萄糖(加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司(Invitrogen，Carlsbad，California)，目录号15023-021)
5.亚硒酸钠(密苏里州圣路易斯的西格玛公司(Sigma，St.Louis，MO)，目录号6607-31)
6.L-谷氨酰胺(纽约州格兰德岛的吉布可公司，目录号25030-081)
7.CD脂类(纽约州格兰德岛的吉布可公司，目录号11905-031)
8.小麦蛋白胨(法国拉库尔纳沃的有机技术公司(Organotechnie，SAS，La Courneuve，France)，目录号19559)
9.胰岛素(佐治亚州诺克罗斯的血清公司(Serological，Norcross，GA)，目录号4506)
10.T3(密苏里州圣路易斯的西格玛公司，目录号T5516)
11.皮质醇(纽约州菲利普斯堡的马林克罗特公司(Mallinckrodt，Phillipsburg，NY)，目录号8830(-05))
12.前列腺素E1(密苏里州圣路易斯的西格玛公司，目录号P7527)
13.EGF(密苏里州圣路易斯的西格玛公司，目录号E9644)
14.柠檬酸铁铵(新泽西州菲利普斯堡的J-T贝克公司(J T Baker，Phillipsburg，NJ)，目录号1980-01)
15.托酚酮(密苏里州圣路易斯的西格玛公司，目录号T89702-5G)
16.痕量元素A(弗吉尼亚州马纳萨斯的赛尔格罗/密迪亚泰克公司(Cellgro/Mediatech，Manassas，VA)，目录号99-182-cl)
17.痕量元素B(弗吉尼亚州马纳萨斯的赛尔格罗/密迪亚泰克公司，目录号99-175-cl)
18.痕量元素C(弗吉尼亚州马纳萨斯的赛尔格罗/密迪亚泰克公司，目录号99-176-cl)
19.碳酸氢钠(加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司，目录号91425/87-5067)
20.杜尔伯科磷酸盐缓冲盐水(DPBS)pH 7.4(加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司，目录号14190-367)
21.EDTA-DPBS溶液包(吉布可公司，目录号14190-367)
22.0.5M EDTA pH8(纽约州格兰德岛的吉布可公司，目录号15575-038)
23.0.2μm斯特里杯(steri cup)过滤器(马萨诸塞州贝尔福德的密理博公司(Millipore，Bedford，MA)，目录号SCGPU05RE)
24.TrypLE精选物(纽约州格兰德岛的吉布可公司，目录号12563)
25.利马豆抑制剂(新泽西州雷克伍德的沃辛顿公司(Worthington，Lakewood，NJ)，目录号LS002829)
26.Cytodex 3(新泽西州皮斯卡特维的阿莫山生物科学公司(AmershamBiosciences，Piscataway，NJ)，目录号17-0485-03)
27.蔗糖磷酸盐(犹他州洛根的海克隆公司(Hyclone，Logan，UT)，目录号SH3A1578-01)
28.10-20L无菌包(堪萨斯州来尼克谢的SAFC生物科学公司(SAFCBiosciences JRH，Lenexa，Kansas)，1329B)
29.滚瓶(纽约州康宁的康宁公司(Corning，Corning，NY)，目录号3907)
30.NaOH 1M溶液(德国达姆施塔特的EMD公司(EMD，Darmstadt，Germany)，目录号1071)
31.0.2μm无菌过滤器(纽约州康宁的康宁公司，目录号430320、430767)
32.1mL、5mL、10mL、25mL、50mL移液器(加利福尼亚州布里斯贝恩的VWR公司(VWR，Brisbane，CA)，目录号分别为53284-700、53283-704、708、710)
33.5mL吸入移液器(加利福尼亚州布里斯贝恩的VWR公司，目录号53392-044)
34.1.8mL艾本多夫(Eppendorf)管(佛罗里达州奥卡拉的美国科学公司(USA Scientific，Ocala FL)，目录号1415-5510)
35.微量移液器尖头(加利福尼亚州圣迭戈的技术分子生物产品公司(Art Molecular Bioproducts，San Diego CA)，目录号20E、200E和1000E)
36.蔗糖磷酸盐，10x(犹他州洛根的海克隆公司，目录号SH3A1578-01)
37.阿普利康控制器装置(加利福尼亚州福斯特城的阿普利康生物技术公司(Applikon Biotechnology，Foster City，CA)，模型：ADI 1010，ADI1025)
38.3L玻璃容器和封头板(加利福尼亚州福斯特城的生物技术公司(Biotechnology，Foster City，CA))
39.2.5”A310叶轮(纽约州罗切斯特的莱特宁公司(Lightnin，Rochester，NY))
40.60mm船用叶轮(加利福尼亚州福斯特城的阿普利康生物技术公司)
41.45mm船用叶轮(加利福尼亚州福斯特城的阿普利康生物技术公司)
42.蠕动泵(马萨诸塞州威明顿的WMB泵公司(Watson Marlow BredelPump，Wilmington，MA)，模型520S/R)
43.生物安全柜(缅因州桑福德的贝克公司(The Baker Company，Sanford，ME)，SG-600)
44.滚瓶培养箱(新泽西州维因兰的贝尔科生物技术公司(BellcoBiotechnology，Vineland，NJ)，模型7630-80589)
45.水浴(宾夕法尼亚州西切斯特的B-G公司，PB-1400)
46.Nucleocounter细胞计数仪(新泽西州艾迪森的新布兰斯维克科学公司(New Brunswick Scientific，Edison，NJ)，M 1293-0000)
47.Bioprofile 400参数分析仪(马萨诸塞州沃森姆的诺瓦生物医学公司(Nova Biomedical，Waltham，MA)，Bioprofile 400)
48.显微镜(纽约州桑恩伍德的蔡司公司(Zeiss，Thornwood，NY)，Axiovert 25)
49.数码相机(纽约州梅尔维尔的尼康公司(Nikon，Melville，NY)，模型E5400)
50.微量移液器(马萨诸塞州波士顿的实验室系统公司(Labsystem，Boston，MA)，模型号P2-20，P100，P200，P1000)
51.辅助移液器(宾夕法尼亚州布鲁马尔的德罗蒙德公司(Drummond，Broomall，PA)，目录号4-000-100)
51.CO2振荡烧瓶培养箱(马里兰州劳瑞尔的ATR生物技术公司(ATRBiotech，Laurel，MD)，模型AJ118)
细胞来源：采用含痕量元素A、B和C的MediV SFM105或MediVSFM1094在滚瓶中培养来自过程开发库(Process Development Bank(PDB))的无血清MDCK克隆ID 9B9-1E4细胞(ATCC登录号PTA-7910，参见WO 08/105931)。含痕量元素A、B和C的MediV SFM 105的组成和MediVSFM 109培养基类似，除MediV SFM 105由液体制成而MediV SFM109由粉末制成以外。根据SOP D02005，除不进行2x DPBS洗涤以外，通常在接种后每3-4天对细胞进行传代。
病毒种：该过程用2008/2009 FluMist
Figure BPA00001373558000911
季节性毒株：caA/Uruguay/716/2007(批次#nb3903pg94，141900675A)、ca A/South caDakota/6/2007(批次#141900666)和ca B/Florida/4/2006(141900641A)进行。所有这些种均在卵中产生。采用质粒拯救方法已获得类似的种病毒结果(参见例如，Wang和Duke；2007年10月23日，J.Virol.，4：102；Hoffmann等，2000，PNAS，97(11)：6108-13；和Hoffmann等，2002，PNAS，99(17)：11411-6)。
培养基：就这些轮次而言，在滚瓶和种子反应器(SR)轮次中所有常规细胞传代分别采用含1X痕量元素A、B和C以及总浓度4.5g/L的D-葡萄糖的MediV SFM 105或含总浓度4.5或9.0g/L的葡萄糖的MediV SFM 109。将含总浓度9.0g/L的D-葡萄糖的MediV SFM 110培养基用于最终生产反应器(FPR)轮次。根据接种条件和预计，可将D-葡萄糖浓度调节到约4.5到约9.0g/L之间。各培养基的组成见表3详示。
表3 MediV SFM培养基制剂
Figure BPA00001373558000912
Figure BPA00001373558000921
Figure BPA00001373558000931
a未在DMEM/F12中发现的组分以斜体显示
b在DMEM/F12中发现并在MediV SFM 110中强化的组分
c在MediV SFM 110中为保持重量摩尔渗透压浓度而降低的浓度
d痕量元素A、B和C
e葡萄糖存在的终浓度为至少4.5g/L，可最高补充到终浓度为约9.0g/L
表4 1000X痕量元素溶液A、B和C
Figure BPA00001373558000941
表5 100X化学成分确定液体(CDCL)溶液
Figure BPA00001373558000942
生物反应器条件和方法：就所有实验而言，采用来自种子反应器(SR)的1:8分割组分接种FPR，用2008/2009季节性病毒ca A/Uruguay、ca A/SouthDakota和ca B/Florida的重配株进行感染。在相同的条件下操作若干FPR，以确保过程的可靠性和捕获可变性。进行第一批3个实验以平行比较培养基交换(MX)和无培养基交换(No-MX)过程，各实验各采用一种2008/2009病毒。就第一批3个实验各自而言，在相同的条件下一式两份进行2x2LFPR，其中在感染时不进行培养基交换，用相同的病毒毒株感染反应器以捕获过程可变性。因此，用来自SR的1:8分割细胞培养物接种总共6x2L生物反应器，用所有三种2008/2009季节性病毒毒株进行无培养基交换过程的感染。
进行最后两个实验以产生08/09毒株的无培养基交换过程效果的更多数据。就第4个实验而言，从1x2L SR接种3x2L FPR，用所有三种季节性病毒重配株类型进行感染。实验5采用相同的条件重复实验4。重复实验以捕获过程可变性，从而获得无培养基交换过程的效果。
各实验中用于感染的病毒毒株和用于接种FPR的细胞来源见表6所示。
表6用于最终生产反应器(FPR)感染的病毒毒株和细胞来源
种子反应器(SR)：就所有实验而言，在含痕量元素A、B和C的MediVSFM 105培养基(MediV SFM 105+TE)或MediV SFM 109中采用2g/LCytodex 3微载体以2L或5L的规模在种子反应器中培养细胞。含痕量元素A、B和C的MediV SFM 105的组成和MediV SFM 109培养基几乎相同，除MediV SFM 105由液体制成而MediV SFM109由粉末制成并包含较少亚硒酸钠以外。葡萄糖和谷氨酰胺的浓度分别是9.0g/L和4mM。实验1-3中以1.35x105个细胞/mL接种容器，实验4和5以1.8x105个细胞/mL接种。采用具有0.02vvm恒定总流速的纯氧和N2的组合使SR中的溶氧(D.O.)保持在50％。对所有SR同时采用CO2和1N NaOH双重控制pH。实验1和实验2的SR工作体积分别是2L和5L。二者均配有一个船用叶轮，在175RPM进行搅拌。实验3和4的SR工作体积是2L。二者均配有2个莱特宁(Lightnin)叶轮，在175RPM进行搅拌。对所述研究范围忽略叶轮和工作体积对细胞生长和代谢的影响。就第一批3个实验而言，以22.5个细胞/MC接种SR。为达到更好的细胞生长，以30个细胞/MC接种实验4和5的SR。描述各FPR和其各自SR的实验设计在表6中列出，各SR的过程条件见表7所示。接种4天后，关闭SR的搅拌器、气流、D.O.和温度控制以使微载体沉降，基本如以下第8.2节提供的实施例所述，洗涤细胞，加入10x TrypLE在pH 8对生物反应器的一半工作体积进行胰蛋白酶消化。采用如表8所示的B2B转移方案对SR组分进行胰蛋白酶消化。
最终生产反应器(FPR)：然后将种子反应器的内含物泵入种子瓶中，采用125mL该细胞接种物以1:8分割比接种FPR。在含9.0g/L葡萄糖浓度的MediV SFM 110中培养FPR中的细胞。2L FPR玻璃容器配有2个莱特宁叶轮，在175RPM进行搅拌。用0.02vvm的总流动策略将D.O.控制在50％空气饱和度，其中保持40mL/分钟的恒定总流速，从O2和CO2气体计算N2气体供应(N2＝40-O2-CO2)。对所有FPR同时采用CO2和1N NaOH双重支持pH控制。生长和感染期间的温度分别控制在37℃和33℃。用于FPR的病毒毒株列于表6，生长和感染期间的FPR过程条件列于表9。
表7种子反应器(SR)过程条件
Figure BPA00001373558000961
Figure BPA00001373558000971
表8 采用珠粒对珠粒方案的胰蛋白酶消化条件
Figure BPA00001373558000972
表9 最终生产反应器(FPR)过程条件
Figure BPA00001373558000973
Figure BPA00001373558000981
#珠粒对珠粒转移过程中的细胞含量浓缩2X。因此，珠粒对珠粒转移后的125mL相当于珠粒对珠粒之前的250mL。
分析步骤：每天对容器进行取样。采用Nucleocounter细胞计数仪计数细胞，采用显微镜在10x放大下拍摄照片以检测细胞形态学特征。采用诺瓦Bioprofile 400参数分析仪每天监测pH、pO2、pCO2以及葡萄糖、乳酸、谷氨酰胺和铵的浓度。当在线和离线值的差异高于0.03pH单位时，进行生物反应器的pH重校准。用10x蔗糖磷酸盐(SP)稳定感染样品，并在-80℃冷冻直至用于分析。基本如下所述，通过采用聚焦荧光鉴定(FFA)测定病毒感染性分析病毒复制的进程。
聚焦荧光鉴定(FFA)：在96孔板中用MEM/EBSS+1X非必需氨基酸+2mM谷氨酰胺+PEN(青霉素)/Strep(链霉素)(VGM)在36±1℃、5±2％CO2培养MDCK细胞，直至汇合(约4天)。然后去除VGM，用新鲜VGM洗涤细胞，之后用采用VGM连续稀释(例如，10-1、10-2...10-7)的100μL病毒接种物(例如，ca A/Uruguay、ca A/South Dakota和ca B/Florida)进行感染，在33±1℃、5±2％CO2温育约19-20个小时。一式三份地将各病毒稀释物接种到细胞。在33±1℃、5±2％CO2温育约19-20个小时之后，根据以下方案用抗流感病毒抗体对细胞进行免疫染色，以确定样品的病毒效价。从各板去除包含病毒的细胞培养基，用200μl/孔DPBS洗涤所述板，之后用100μL冷的4％低聚甲醛在室温固定15±3分钟。然后用250μl/孔的1X磷酸盐缓冲盐水+0.05％吐温20(TPBS)洗涤两次板，之后用对A毒株或B毒株具有特异性的一抗温育细胞。用含0.1％皂苷、1％BSA和0.1％叠氮化钠的1X PBS(SBSA)将所述一抗稀释到所需稀释度。在37±1℃温育60±5分钟之后，去除一抗，用250μL TPBS洗涤三次细胞，向孔中加入用SBSA制备到所需稀释度的偶联荧光染料的二抗(例如，用FITC标记的兔抗绵羊)。在37±1℃温育60±5分钟之后，去除二抗，如上所述洗涤两次板，并用纳米水洗涤两次，之后用纸巾吸干干燥。然后在室温避光开盖将所述板空气干燥至少10分钟。采用倒置荧光显微镜在100x总放大率下观察荧光信号。可采用成像软件如SPOT程序拍摄图片。通常检测各孔的中间条带，计数所有焦点，并仅计数具有8-12个焦点计数的孔。计算各孔的log10FFU/mL，并计算三个孔的平均值和标准偏差。
8.1.2结果和讨论
第一批3个实验和最后2个实验分别以22.5和30个细胞/微载体(MC)接种种子生物反应器的细胞。图1是对所有实验所有SR的活细胞密度(VCD)和细胞活力(V％)作图。在4dps，种子反应器的细胞密度的范围是0.94-1.14百万个细胞/mL。细胞密度差异可能是22.5和30个细胞/MC的接种细胞浓度差异造成的。以22.5和30个细胞/MC接种的SR中接种4天后的细胞密度分别是0.95±0.01和1.12±0.024百万个细胞/mL。所有生物反应器的细胞活力均在90％以上。培养4天后，在种子反应器中采用1x0.5mM EDTA-DPBS洗涤和10x TrypLE精选物进行珠粒对珠粒转移以对细胞进行胰蛋白酶消化。胰蛋白酶消化持续30+/-10分钟，间歇取样以在显微镜下观察细胞脱离。胰蛋白酶消化30-40分钟之后，约90％的细胞与MC脱离，在图2中可见单个细胞。在所有实验中采用胰蛋白酶消化细胞以1:8的分割比接种最终生物反应器。所有FPR的细胞生长见图3所示。由于实验2中所有FPR在4dps的VCD均小于0.6x106个细胞/mL，且这些FPR中的细胞培养物经历了较长的延迟期，因此在5dps而不是4dps接种这些细胞。此外，未提供实验4中FPR的感染后VCD数据。最后，尽管小于0.5x106个细胞/mL的VCD较低，在实验5中仍在4dps感染FPR。FPR细胞生长期过程中的活力在90％以上。
所有FPR在感染时间的细胞密度记录于表10。可看到活细胞密度具有很大差异。其变化范围是0.44-1.12x106个细胞/mL。该差异与细胞计数误差相关。SR和FPR的平均VCD记录于表11。SR和FPR在4dps的平均VCD分别是约1.12x106个细胞/mL和0.73x106个细胞/mL。
表10所有FPR在感染时的活细胞密度(单位：x106个细胞/mL)
Figure BPA00001373558000991
表11所有SR和FPR的平均活细胞密度
Figure BPA00001373558001002
胰蛋白酶消化之后，FPR中的细胞在0dps附着到微载体珠粒，然后开始在微载体珠粒表面增殖。在4dps时，大多数微载体被细胞覆盖，仅有一些珠粒保持空闲状态(无细胞覆盖珠粒)。所有实验中的细胞形态学特征均类似。显示3dps和4dpi典型细胞形态学特征的照片分别见图4和图5所示。
在4或5dps，分别用ca A/Uruguay、ca A/South Dakota和ca B/Florida感染实验1、2和3中的FPR。在感染之前，向细胞培养基加入0.03x的10xTrypLE精选物。在实验4和5中，用三种季节性毒株ca A/Uruguay、caA/South Dakota和ca B/Florida中的一种感染各FPR。图6显示在感染后68-74小时(hpi)达到峰病毒效价。此外，所述病毒效价之后一致保持高水平直到92hpi。
各病毒毒株类型的平均病毒效价总结于表12。ca A/Uruguay、caA/South Dakota和ca B/Florida的平均病毒效价分别为8.7、8.8和8.45log10FFU/mL。这与作67％培养基交换时观察到这些病毒的情况一致或更高。
采用67％培养基交换过程(基本如国际专利公开WO 08/105931所述，参见实施例12)相对无培养基交换过程(基本如上所述进行)，进行另外的实验以比较四种毒株(ca A/Wisconsin/67/05、A ca A/Uruguay、ca A/SouthDakota和ca B/Florida)产生的病毒效价。对各方法和毒株进行至少两个轮次实验。从图7可看出，各毒株在67％培养基交换和无培养基交换过程之间的峰病毒效价相当。
表12FPR各病毒毒株的平均峰病毒效价
Figure BPA00001373558001011
培养基交换是目前基于细胞培养的流感疫苗制备方法中的一个主要操作步骤。已为去除感染之前的培养基交换付出了大量努力，因为不进行培养基交换可降低微生物污染的可能性并可实施更多的操作友好性方法。通过无培养基交换的一系列12个生物反应器轮次，收集过程效果数据，更具体为细胞脱离/附着、细胞生长和病毒效价以评价新疫苗生产方法的可变性和采用新珠粒对珠粒转移方案用直接从SR取出的细胞接种FPR的可行性。不进行感染前的培养基交换，将三种病毒毒株，即ca A/Uruguay、ca A/SouthDakota和ca B/Florida各生产4次。已证实4dps时SR中的VCD可达到最高1x106个细胞/mL，且采用1x DPBS、TrypLE精选物和EDTA可成功完成的B2B转移，其中胰蛋白酶消化30-40分钟后种子反应器中发生有效(＞90％)细胞解离。FPR中的细胞在微载体珠粒表面增殖，并在感染时达到约0.73x106个细胞/mL的平均VCD。所有无MX过程的FPR轮次中caA/Uruguay、ca A/South Dakota和ca B/Florida的峰病毒效价在3dpi时分别是8.7±0.05、8.8±0.0和8.45±0.25log10FFU/mL。这与通常观察到的进行67％培养基交换的病毒毒株情况一致或更好(参见图8)。所有病毒类型的峰病毒效价均大于8.4log10FFU/mL。这些结果清楚地表明，本文所述的B2B转移和无MX方法是非常可靠的方法。它们最大程度减少对昂贵培养基试剂的使用并可降低污染可能性。
8.2交互切向流(ATF)方法
为促进生物反应器中的原位流体交换，我们开发了采用ATF的基于细胞培养的制备过程以：a)原位洗涤微载体；b)在培养容器中交换细胞培养基；和c)从细胞培养产生的生物制剂、疫苗和其它材料中分离生产细胞并以更加有效和受控的方式收获批量产物。如图18所示，微载体灭菌或培养基交换之后的废料包中不存在微载体。此外，如表13所示，在病毒收获过程中采用结合直流过滤的ATF不会引起收获物或最终纯化产物中的宿主细胞蛋白质或宿主细胞DNA增加。
表13ATF产生材料中的宿主DNA和蛋白质
Figure BPA00001373558001021
该例子描述了用于采用ATF的若干生产模拟轮次和不采用ATF的对照轮次的方法和参数。可用于所述方法的代表性设备和试剂见表14和表15详示。当然，也可任选用性能类似的其它设备和试剂代替，且除非明确说明，对具体品牌或类型的设备和试剂的特别提及不应理解为构成限制。ATF系统提供分级混合物或悬浮细胞、分子和其它颗粒有效手段。所述ATF过程为产生快速低剪切切向流提供手段。ATF系统提供限制所述过程的手段。由于整个过程封闭，可将ATF系统用于微载体珠粒洗涤之前和之后的灭菌、感染前培养基交换和收获过程。
过滤系统由可接受用于分级较大颗粒如微载体的中空纤维过滤模块或筛选模块的外壳组合件组成。所述外壳位于一端的过程容器或生物反应器和另一端的隔膜泵之间。所述容器用作待过滤组分的储存容器。滤液泵用来受控去除经过滤的物流。未过滤的材料存留在系统中。ATF是在过程容器和隔膜泵之间来回脉动的可逆液体流。所述泵被分隔为具有柔韧隔膜的两个隔室。一个泵室作为通过筛选模块对准过程容器的液体储存库。第二个泵室是与泵流控制系统对准的空气室。通常，向空气室中受控加入压缩空气相对于过程容器增大隔室中的压力。这使空气室膨胀，在通过筛选模块驱使液体组分从泵进入过程容器的过程中反而降低液体室中的体积。通过筛选模块腔的流体在一个方向上产生切向流。相反地，采用略微加压容器或通过将空气室与排气装置或真空连接，空气室中的压力相对于过程容器减小，液体流会从容器进入所述泵的液体室，在另一个方向上产生切向流。重复所述循环。
表14 材料和试剂
Figure BPA00001373558001031
表15 设备列表
Figure BPA00001373558001032
接种前准备：ATF可用于从生物反应器中去除和/或交换流体的任何过程。例如，ATF系统可用于在容器灭菌前的水合微载体珠粒之后去除DPBS洗涤溶液，和/或在高压灭菌步骤之后，ATF系统可用于去除DPBS洗涤溶液并用完全生长培养基替换。表16显示在生产模拟轮次1-3的流体交换过程中采用的ATF控制设定。
1.制备Cytodex 3微载体，称量所需量的Cytodex 3(2L生物反应器4g，5L生物反应器10g)，将其转移到清洁的无菌生物反应器中，每克珠粒用50-100mL 1X PBS水合不少于3小时或过夜，用新鲜PBS洗涤。洗涤步骤可采用表16详示设定用ATF进行。
2.将管道和过滤器与所有空闲封头板口连接。
3.在校准之前过夜连接DO探测器，以实现极化(注意：至少6小时)。
4.根据制造商的说明校准pH和DO探测器并将其与组装的生物反应器连接，确保探测器尖头浸入到反应器容器中已存在的DPBS内。如果需要，向反应器容器加入更多的DPBS。
5.在液体循环中于121℃、15psi对整个装置高压灭菌30分钟。
6.一旦高压灭菌完成，冷却，连接DO探测器、pH探测器和搅拌器发动机。
7.将1N NaOH等分到小补料瓶中，连接碱管线(base line)并预先放入各自反应器容器中。
8.每天在接种之前分批处理培养基
a.在37℃水浴中预热所需量的细胞生长培养基(CGM)MediV 105SFM。
b.从排放口将DPBS从生物反应器中排出。或者采用ATF系统以排出DPBS洗涤溶液并采用表16详示设定用CGM替换。
c.用新鲜的温CGM洗涤一次珠粒，步骤如下：
i)在排出DPBS之后加入所需体积的CGM。
ii)开启搅拌控制到120rpm，持续10分钟。
iii)关闭搅拌以使珠粒沉降并排出上清液。
d.向生物反应器加入所需体积的CGM。
9.开启通气、温度控制和搅拌器。细胞扩增的设定点如下：pH＝7.4，温度＝37℃，DO＝50％空气饱和度，搅拌器＝约135到约175rpm(通常快于较小生物反应器)。
10.加入葡萄糖达到9g/L终浓度。
11.提取样品，通过NOVA测定，进行DO校准和pH修正(如果需要)。
12.开启生物反应器控制器，在40-320mL/分钟的流速运行(就2-16L工作体积而言)。
表16 ATF控制设定
Figure BPA00001373558001051
Figure BPA00001373558001061
接种和生长：计算每个滚瓶或种子反应器的平均活细胞，将适当量的细胞转移到含新鲜温培养基的玻璃补料瓶。可对珠粒对珠粒转移采用1:8分割，或可采用约1x105到约1.5x105的接种密度。应注意，可采用以下实施例8.3或8.4所述的任何珠粒对珠粒转移方法分割细胞。图17所示数据产生于采用EDTA/胰蛋白酶方案分割的细胞(第8.3节提供的实施例)。接种之后，每天提取样品进行Nova接种后测定和细胞核计数。一旦细胞核计数在培养后3-4天达到所需细胞密度，进行病毒感染。细胞扩增的设定点如下：pH＝7.4，温度＝37℃，DO＝50％空气饱和度，搅拌器＝约135到约175rpm(就2-16L工作体积而言)。
感染：如下所述在感染前移出约66％CGM，并用完全感染培养基(CIM，DMEM/F-12，45％葡萄糖，200mM L-谷氨酰胺，1∶330稀释的10XTrypLE)替换：关闭所有控制回路，使微载体珠粒沉降。从生物反应器移出相当于66％的所需量培养基，用新鲜的温CIM替换。调整设定点，重新开启控制回路。感染的设定点如下：pH＝7.4，温度＝33℃，DO＝50％空气饱和度，搅拌器＝约135到约175rpm(就2-16L工作体积而言)。表16显示在生产模拟轮次1-3的培养基交换过程中采用的ATF控制设定。采用表16所示控制设定，采用带搅拌的ATF系统并不使微载体珠粒沉降，从生物反应器中移出相当于66％的所需量培养基，用等体积的新鲜温CIM替换。一旦达到设定点，加入所需量病毒。如果需要，在感染前进行细胞核计数，计算感染生物反应器所需的病毒量，例如，对季节性毒株可采用20-200MOI(FFU/mL)或对大流行毒株可采用2000MOI(FFU/mL)。或者根据反应器的工作体积加入浓度(FFU/mL)已知的设定量病毒。参见例如WO08/105931(特别是实施例12)。
收获：在所需时间(通常在感染后48-72小时)关闭控制回路，使微载体珠粒沉降。将合适的无菌包容器连接到生物反应器出口，通过蠕动泵或ATF装置移出病毒收获物。在采用蠕动泵时，必须小心操作以免纳入微载体珠粒。一旦收获完成，可向所述包加入10X SP缓冲液(2.18M蔗糖和110mM磷酸钾，pH 7)达到1X终浓度。在采用ATF时，可如以下第8.6.3节提供的实施例所述将收获步骤与直流过滤步骤直接结合。表16显示在生产模拟轮次1-4的收获过程中采用的ATF控制设定。
8.3采用低浓度蛋白酶的快速珠粒对珠粒转移方法
该实施例描述采用DPBS/0.5mM EDTA pH8洗涤溶液和低浓度蛋白酶(例如，0.05X TrypLE)在旋转烧瓶、振荡烧瓶或搅拌罐生物反应器中进行MDCK细胞快速有效的珠粒对珠粒转移的方法和参数。过程流的整体视图见图8A提供。可用于所述方法的代表性设备和试剂见表17、表18和表19详示。当然，也可任选用性能类似的其它设备和试剂代替，且除非明确说明，对具体品牌或类型的设备和试剂的特别提及不应理解为构成限制。
在上述12个轮次中采用该方法。根据所述，通过采用EDTA的1x DPBS洗涤和TrypLE精选物在pH 8的胰蛋白酶消化的珠粒对珠粒转移方案观察到种子反应器中正确的细胞脱离和FPR中的细胞附着。因此，所述珠粒对珠粒转移方法是快速、有效和可靠的。
表17 设备列表
Figure BPA00001373558001071
表18 材料和试剂
Figure BPA00001373558001072
Figure BPA00001373558001081
表19 DPBS/0.5mM EDTA-pH8洗涤溶液的制备
Figure BPA00001373558001082
从10X DPBS粉末制备1X液体培养基DPBS：将粉末培养基加入室温水中，温和搅拌。(勿加热水)。漂洗容器内部以去除所有痕量粉末。用水稀释到所需体积。搅拌直至溶解。(勿过度混合)。将培养基pH调整到7.8±0.1(最终工作pH是8.0)。pH单位在过滤后通常会上升0.1-0.3。在调整pH之后，将容器保持封闭，直至过滤培养基。立即采用0.1微米膜灭菌。
0.5M EDTA储液的制备：向800mL去离子水加入186.1gEDTA(二钠二水合物)。在搅拌时加入约20g NaOH片或10N NaOH，使pH达到8.0。注：缓慢加入最后几克以避免使pH过头。EDTA在pH大约为8时溶解。用去离子水将体积调整到1L。用0.1微米过滤器过滤。等分为较小体积(每瓶200mL)并在室温储存。
DPBS/0.5M EDTA储液的制备：每升DPBS加入1mL 0.5M pH 8的EDTA储液。如果必要，将培养基pH调整到7.8±0.1(最终工作pH为8.0)。注：pH单位在过滤后通常会上升0.1-0.3。用0.1微米过滤器过滤。
1X DPBS/0.5mM EDTA-rH8.0洗涤步骤：如果适用，停止搅拌、pH、DO、温度控制。使微载体珠粒沉降15±5分钟。通过出口移出80±10％用过的生长培养基。参见表20。注：该方案可采用交互切向流(ATF)完成。用等体积的1X DPBS/0.5mM EDTA-pH8.0洗涤溶液替换到培养容器中。参见表20。以原始设定开始搅拌，将细胞洗涤25±5分钟。停止搅拌，使微载体珠粒沉降15±5分钟。通过出口移出80±10％洗涤溶液。参见表21。注：该方案可采用ATF完成。向容器加入1X DPBS/0.5mM EDTA-pH8.0洗涤溶液，最多达到工作培养基体积的50％。参见表20。将搅拌器速率设定到所需rpm。参见表21。开启搅拌器、pH、DO和温度控制。将pH设定调整到8.0。参见表21。
表20 DPBS/0.5mM EDTA-pH8.0洗涤体积和搅拌速率
Figure BPA00001373558001091
表21 1X DPBS/0.5mM EDTA pH8.0洗涤体积、搅拌速率、pH、温度和DO设定
Figure BPA00001373558001092
细胞脱离方案：在培养基pH达到8±0.1时，通过注射口或通过培养基口加入计算体积的10X TrypLE达到0.05X的终浓度。参见表22。注：也可相对于所需工作体积对10X TrypLE进行1∶200稀释。通过取样口每15±2分钟提取样品等份，直至完全脱离。注：细胞脱离应在＜60分钟内完成。向培养容器的原始工作体积中加入基础培养基。停止除搅拌器和pH控制以外的所有控制回路。
珠粒对珠粒方案：将所需体积的脱离细胞转移到最终生产反应器中。参见表23。
表22 10X TrypLE体积
                      生物反应器工作体积
                  2L    5L      10L    15L
10X TrypLE(mL)    5     12.5    25     37.5
表23 向最终生产反应器的珠粒对珠粒方法转移
Figure BPA00001373558001101
8.4无蛋白酶的珠粒对珠粒转移方法和ATF的使用
生产疫苗、重组蛋白质和其它生物治疗剂的一个主要挑战是可再现地将贴壁生产细胞从培养容器上脱离，然后重新使其附着到新的培养容器上，该过程通常称为细胞传代培养。该任务对大规模制备中基于微载体的生产变得特别困难。为确保细胞正确传代，通常使用胰蛋白酶或胰蛋白酶样试剂(例如TrypLE)。然而，胰蛋白酶消化过程可能难以控制，且胰蛋白酶过度消化或胰蛋白酶消化不足可对制备过程的可靠性产生负面影响，甚至降低生产力。我们在本文中描述了一种不采用胰蛋白酶或胰蛋白酶样试剂使哺乳动物细胞、特别是高度贴壁MDCK细胞连续传代的新方法。该方法利用EDTA代替胰蛋白酶或胰蛋白酶样试剂。该方法还可与交互切向流装置(ATF)结合，以促进生物反应器中的原位流体交换。
采用新开发的无蛋白酶方法，我们成功地将MDCK细胞连续传代超过5次，一致达到了高细胞活力((＞90％)和高细胞密度(＞1X106个细胞/mL)(参见图15)。我们还采用通过该方法制备的细胞生产高效价病毒，包括若干不同亚型的冷适应减毒活流感病毒。组成季节性疫苗的三种代表性病毒毒株(A/H1、A/H3和B毒株)各自的病毒效价至少为8log10FFU/mL。该方法可同时用于疫苗和基于细胞培养的生物学(单克隆抗体、重组蛋白质等)大规模和小规模生产。
该实施例描述了通过洗涤细胞和将细胞与pH 8EDTA在缺乏任何蛋白酶的情况下在旋转烧瓶、振荡烧瓶或搅拌罐生物反应器中温育进行MDCK细胞快速有效的珠粒对珠粒转移的方法和参数。可用于所述方法的代表性设备和试剂见以上表17、表18和表19详示。当然，也可任选用性能类似的其它设备和试剂代替，且除非明确说明，对具体品牌或类型的设备和试剂的特别提及不应理解为构成限制。
1X DPBS/0.5mM EDTA-pH8.0洗涤和温育步骤：如果适用，停止搅拌、pH、DO、温度控制。1)使微载体珠粒沉降，通常15±5分钟足够，移出约70-80％或更多用过的生长培养基。注：该方案可采用交互切向流(ATF)完成。2)用所需体积的1X DPBS洗涤溶液替换到培养容器中。通常建议采用等体积的洗涤缓冲液以便有效洗涤。3)根据需要重复步骤(1)和(2)，通常建议总共洗涤三次。4)根据需要移出洗涤溶液以留下所需体积(例如约原始体积的50％)。注：该方案可采用ATF完成。5)加入0.5mM EDTA-pH 8.0达到0.5mM的终浓度。6)如果适用，开启搅拌以及pH、DO和温度控制。根据工作体积和/或叶轮，搅拌通常在100-250rpm之间。对几百毫升或更少的小规模转移采用100rpm。另参见例如表21的可用于较大工作体积的搅拌器速率。7)搅拌温育60±10分钟。可提取样品等份以检测完全细胞脱离。表24详示了用于小规模珠粒对珠粒转移的条件。
一旦细胞脱离，所述细胞即可进行分割。通常，将生长(培养基)加入到所需工作体积(例如原始体积)，将所需体积的脱离细胞转移到新容器。或者将额外的生长培养基和/或微载体加入到原始容器中。就放大过程而言，发现可用1:5到1:8分割，表23提供若干最终工作体积的1:8分割详细内容。任选地，原始烧瓶用生长培养基漂洗并与转移材料结合，在进行放大时应考虑该体积以避免过度稀释细胞。8)不进行任何搅拌，在合适的温度(本文采用37℃)将新烧瓶温育40-60分钟。9)如果适用于细胞生长，开启搅拌以及pH、DO和温度控制。10)根据需要重复步骤(1)-(9)进行连续增殖和感染放大。
采用基本如表24详示的无蛋白酶方法(来自商业或内部制备的EDTA)或基本如第8.2节提供的实施例详述的ETDA/TrypLE将平行培养物连续增殖超过5代。就对照细胞而言，对新细胞进行胰蛋白酶消化(洗涤细胞，使其与1X TrypLE温育15-20分钟，加入新鲜生长培养基，在1000rpm将细胞离心10分钟，重悬于新鲜生长培养基中)，用于接种旋转烧瓶以比较各代的细胞生长/活力和效价。培养过程中细胞计数和活力随时间变化的图见图15所示。从图中可看出，仅采用EDTA(无蛋白酶)和采用ETDA/TrypLE增殖的培养物的细胞计数和活力相当。此外，通常可见这两种方法产生密度高于对照方法的培养物。还可采用平行培养物各代的细胞产生流感病毒。无论采用何种增殖方法，获得的ca A/Wisconsin/67/07和caB/Malaysia/2506/04的病毒效价(分别为图16的上图和下图)类似。
表24 无蛋白酶珠粒对珠粒转移条件
8.5无洗涤快速珠粒对珠粒转移方法
生长培养基中二价阳离子的存在可抑制用来使细胞与微载体脱离的蛋白酶的作用。如上所述，EDTA可用来螯合这些阳离子，促进细胞脱离。进行一系列实验检测EDTA浓度对细胞形态学特征和脱离的影响。图23A显示未处理细胞。它们具有平坦形态，紧密附着到微载体上。图23B-F显示在与用量增加的EDTA(分别为0.5、1、2、5和10mM)接触60分钟之后看到的形态学特征变化。用0.5和1mM处理时可见一些变圆的变化。用2mM和更大浓度处理引起进一步的变圆变化和脱离。在最高浓度的EDTA下，几乎所有细胞与微载体脱离。基于这些观察，1-2mM EDTA可促进细胞变圆。
进行第二系列实验以检测在1或2mM EDTA存在下TrypLE浓度的影响。在用1或2mM EDTA进行预处理之后，向细胞培养物加入终浓度为0.0125X、0.025X和0.05X的TrypLE，监测脱离。图24显示随时间采用不同浓度的TrypLE，用2mM EDTA预处理的细胞看到的分离。在加入TrypLE的0时间，细胞显示变圆的形态学特征(图24A、B和C分别为0.0125X、0.025X和0.05X TrypLE)，很少发生脱离。在加入TrypLE 60分钟后，所有培养物均显示一些脱离。在较低TrypLE浓度(0.0125X和0.025X)，并非所有细胞发生脱离，观察到一些结块现象(分别为图24E和E)。在0.05XTrypLE，几乎所有细胞发生脱离，观察到的结块现象很少(图24F)。然而，在这些细胞转移到补充有新鲜生长培养基的新生产容器中时，它们无法再附着到旧的和新的微载体上，可能是由新鲜生长培养基中二价阳离子的螯合造成。
检测向生长培养基加入CaCl2、MgCl2、MgSO4以及痕量元素A、B和C的基质克服螯合对附着和生长的影响的能力。表25显示向MediV 105SFM生长培养基加入CaCl2、MgCl2、MgSO4浓度的基质的情况下接种4天后细胞再附着和扩散的百分比。表26显示向MediV 105SFM生长培养基加入CaCl2、MgCl2、MgSO4以及痕量元素A、B和C浓度的基质的情况下接种4天后的细胞计数。如表26所示，在用1.5mM CaCl2、0.15mM MgCl2、0.4mM MgSO4以及2X的痕量元素A、B和C补充MediV 105SFM时，MDCK细胞在珠粒对珠粒转移4天后达到超过1E6个细胞/mL和90％以上的细胞活力。根据这些研究，可进行另外的实验以进一步优化这些因素，例如，以确定其它细胞类型(例如VERO细胞)的最佳生长条件和/或使该方法在任何规模的病毒生产下均可靠。
EDTA浓度研究：将培养于850cm2滚瓶的MDCK细胞以1.8.x105个细胞/mL的密度接种到2L种子生物反应器(MediV 105SFM，2g微载体/L)中。将种子反应器如下设定：pH 7.4，CO2和1N NaOH控制；50％空气饱和度，20mL/分钟恒定空气；温度37℃；搅拌175rpm。在第4天，在完全汇合时(1.2-1.6E6个细胞/mL)，将25mL微载体培养物转移到6x100mL烧瓶中，然后将EDTA加入到各烧瓶中以产生0.5、1、2、5、10、20mM的不同终浓度。随后将烧瓶在轨道振荡器中于37℃、5％CO2、200rpm温育1小时。在温育期间对所有烧瓶进行周期性显微镜检测，以检测不同EDTA浓度下细胞形状变圆(收拢)的程度。
结合优化浓度EDTA的TrypLE精选物浓度：根据TR#348将培养于850cm2滚瓶的MDCK细胞以1.8.x105个细胞/mL的密度接种到2x2L种反应器(MediV 105SFM，2g微载体/L)中。使所述种子反应器以上述相同生物反应器参数运行4天。在第4天，向一个生物反应器加入1mM EDTA，向另一个加入2mM EDTA。将二者在175rpm搅拌1小时。然后，将两个生物反应器的pH调整到8，之后将细胞悬浮液从各生物反应器转移到3x500mL振荡烧瓶中。从各组培养物，将10X TrypLE精选物加入各烧瓶中以形成0.05X、0.025X和0.0125X的终浓度，在轨道振荡器中于37℃、5％CO2、150rpm温育30分钟。在温育期间，从各组周期性提取样品进行显微镜检测，以检测细胞从微载体脱离的程度。根据显微镜观察，在≥90％的细胞从微载体脱离时，加入等体积的利马豆胰蛋白酶抑制剂(LBTI)以停止胰蛋白酶的活性。
表25无洗涤细胞脱离后向MediV 105SFM加入CaCl2、MgCl2和MgSO4
  烧瓶   CaCl2(mM)   MgCl2(mM)   MgSO4(mM)   第4天的细胞再附着％
  1   1   0.15   0.1   75％
  2   1   0.2   0.8   80％
  3   1.5   0.2   0.2   85％
  4   1.5   0.2   0.1   90％
  5   1.5   0.15   0.2   75％
  6   1.5   0.15   0.8   90％
  7   1   0.1   0.4   60％
  8   1.25   0.15   0.45   80％
  9   1.25   0.15   0.45   95％
  10   1   0.15   0.4   30％
  11   1   0.15   0.2   30％
  12   1   0.2   0.4   25％
  13   1   0.15   0.8   30％
  14   1   0.1   0.8   55％
  15   1.5   0.1   0.4   75％
  16   1.5   0.1   0.2   80％
  17   1   0.1   0.2   40％
  18   1.5   0.1   0.8   75％
  19   1   0.2   0.1   60％
  20   1.5   0.15   0.4   80％
  21   1   0.1   0.1   65％
  22   1.5   0.2   0.4   85％
  23   1.5   0.1   0.1   80％
  24   1.5   0.15   0.1   85％
  25   1   0.2   0.2   75％
  26   1.5   0.2   0.8   60％
表26无洗涤细胞脱离后向MediV 105SFM加入CaCl2、MgCl2、MgSO4以及痕量元素A、B和C
Figure BPA00001373558001151
8.6细胞培养物产生的流感病毒的纯化过程
产生于细胞培养物中的流感病毒的可靠大规模纯化方法的发展需要加强开发。开发的早期方法中将病毒收获物(感染后60-65小时)泵入包内，向病毒收获物(VH)包加入1/10稀释的10X蔗糖磷酸盐(SP)缓冲液以便稳定病毒。首先在32℃，用含2mM MgCl2的50单位/mL Benzonase对稳定的病毒收获物(SVH)处理3小时，以去除MDCK宿主细胞DNA，通过加入5mM EDTA停止该反应。Benzonase是一种改造的重组内切核酸酶，其在镁离子的存在下将DNA降解为寡核苷酸。然后通过1.2μm聚丙烯(PP)和0.45μm PVDF囊式过滤器澄清Benzonase处理的病毒收获物。通过在500kDa分子量截留值的中空纤维筒上用SP缓冲液进行5倍(5X)超滤和5倍渗滤使澄清的VH达到要求。病毒颗粒会被截留在渗余物侧，而宿主细胞蛋白质(HCP)、宿主细胞DNA(HCD)和Benzonase会被渗滤到中空纤维的渗透物侧。采用Cellufine硫酸酯(CS)色谱柱纯化经浓缩和渗滤的病毒，以进一步去除HCD、HCP和Benzonase杂质。CS是结合柱上病毒的亲和树脂，采用SP高盐缓冲液洗脱结合的病毒。在500kDa分子量截留值的中空纤维筒上通过5体积倍数的SP100(200mM蔗糖和100mM磷酸钾，pH 7.2)缓冲液对从柱洗出液纯化的病毒进行渗滤，以去除高盐洗脱缓冲液并配制纯化病毒。然后通过加入1/9稀释的cGAG稳定经渗滤的病毒产物，并采用0.22μm过滤器无菌过滤以产生最终的批量产物。
对初始方法进行充分的改动，改善可升级性、过程效率和最终产物的质量。对所述方法的改动基于对回收率和杂质(HCD、HCP和Benzonase)水平的评价，实施到原始建立的方法中。总共实施5个方法步骤，以解决可升级性和改善过程效率和最终产物的质量。首先，将采用2000FFU/mL病毒输入量感染的细胞的病毒收获改为感染后48小时，该时间与峰病毒效价对应。第二，将HCD去除步骤从分批模式Benzonase处理改为柱上Benzonase处理。这两个步骤一起通过显著降低起始材料和最终批量的HCD水平来改善最终产物的质量。第三，将CS树脂的加载浓度从9.0log10FFU/mL增大到9.5log10FFU/mL，这使生产柱的大小从4L减小到1.4L并改善过程效率。第四，将第二缓冲液交换体积从5体积倍数增大到8体积倍数以增强Benzonase清除。第五，将最终过滤器流量减少一半到平均25L/m2，以避免在CTM轮次的最终过滤过程中发生任何堵塞。最终的方法(以下详述)提供产生平均总回收率为43.4％的过程，其中含0.72ng/剂量(通过PicoGreen测定)和0.1ng/剂量(通过PCR测定)HCD、0.21μg/剂量HCP和0.0035ng/剂量Benzonase，以上各物质均在管理机构要求的规格以下。图10提供初始和改进纯化方法的概览。
8.6.1材料和方法
材料，试剂和设备：可很容易地替换性能类似的其它材料、设备和试剂。
1.1.2μm Polygard CN Opticap XL5过滤器(马萨诸塞州比莱瑞卡的密理博公司(Millipore Corporation，Billerica，MA)，目录号KN12A05HH1)
2.0.45μm Durapore Opticap XL4过滤器(马萨诸塞州比莱瑞卡的密理博公司，目录号KPHLA04HH3)
3.50L包(犹他州洛根的海克隆公司，目录号SH30712.04)
4.10L包(犹他州洛根的海克隆公司，目录号SH30712.12)
5.空心纤维，500KD，4800cm2(瑞典厄普萨拉的GE医疗保健公司(GE Healthcare，Uppsala，Sweden)，目录号UFP-500-C-6A)
6.空心纤维，500KD，290cm2(瑞典厄普萨拉的GE医疗保健公司，目录号UFP-500-C-3X2MA)
7.Cellufine硫酸酯树脂(日本东京的奇索公司(Chisso Corporation，Tokyo，Japan)，目录号19847)
8.凸缘O环(瑞典厄普萨拉的GE医疗保健公司，目录号18-8494-01)
9.接头O环(瑞典厄普萨拉的GE医疗保健公司，目录号18-8475-01)
10.床层支座，23μm，端片(瑞典厄普萨拉的GE医疗保健公司，目录号18-9252-01)
11.床层支座，23μm，接头(瑞典厄普萨拉的GE医疗保健公司，目录号18-1103-08)
12.25mm内径垫片，EPDM(瑞典厄普萨拉的GE医疗保健公司，目录号18-0019-27)
13.4口2向阀(瑞典厄普萨拉的GE医疗保健公司，目录号18-5757-01)
14.Sartopore2 300过滤器囊，0.45μm/0.22μm，300cm2(马萨诸塞州萨托里斯公司(Satorius，MA)，目录号5441307H5--00--B)
15.Sartopore2 150过滤器囊，0.45μm/0.22μm，150cm2(马萨诸塞州萨托里斯公司，目录号5441307H4--00--B)
16.1L PETG瓶(纽约州罗切斯特的纳尔金公司(Nalgene，Rochester，NYU)，目录号2019-1000)
17.2L PETG瓶(纽约州罗切斯特的纳尔金公司，目录号2019-2000)
18.MasterFlex铂处理硅氧烷管L/S 24号(伊利诺斯州维农山的科尔帕尔默公司(Cole Parmer，Vernon Hills，IL)，目录号96410-24)
19.MasterFlex铂处理硅氧烷管L/S 36号(伊利诺斯州维农山的科尔帕尔默公司，目录号96410-36)
20.1X蔗糖磷酸盐缓冲液(犹他州洛根的海克隆公司，目录号SH3A1577)-218mM蔗糖和11mM磷酸钾，pH 7缓冲液
21.1XSP/1M NaCl缓冲液(犹他州洛根的海克隆公司，目录号SH3A2034)
22.SP100缓冲液(犹他州洛根的海克隆公司，目录号SH3A1796)-200mM蔗糖和100mM磷酸钾，pH 7.2缓冲液
23.cGAG缓冲液(犹他州洛根的海克隆公司，目录号SH3A1795)
24.Benzonase(德国达姆施塔特的EMD公司，目录号1.01697.0002)
25.1M MgCl2(密苏里州圣路易斯的西格玛公司，目录号M1028，批次#085K8920)
26.Quant-iT PicoGreen双链DNA试剂盒(俄勒冈州尤金的英杰公司(Invitrogen，Eugene，Oregon)，目录号P11496，批次#22987)
27.0.5N NaOH，从10N NaOH稀释得到(宾夕法尼亚州西切斯特的VMR公司(VWR，West Chester，Pennsylvania)，目录号VW3247-7)
28.蠕动泵(马萨诸塞州威明顿的WM公司(Watson Marlow Inc.，Wilmington，MA)，模型520U、520S和520Di)
29.波混合器(瑞典厄普萨拉的GE医疗保健公司，目录号：混合器20/50EH)
30.AKTA过程色谱滑道(瑞典厄普萨拉的GE医疗保健公司，目录号28409334)
31.Uniflux10过滤滑道(瑞典厄普萨拉的GE医疗保健公司，目录号28920799)
32.BPG 100色谱柱(瑞典厄普萨拉的GE医疗保健公司，目录号18-1103-01)
33.BPG 200色谱柱(瑞典厄普萨拉的GE医疗保健公司，目录号18-1103-11)
34.Flexstand(瑞典厄普萨拉的GE医疗保健公司，目录号56-4107-54)
表27 来自单用生物反应器的病毒收获物批次(67％培养基交换)
  毒株(所有均为ca重配株)   细胞培养物批次#  纯化批次轮次#   感染后收获时间
  A/New Caledonia/20/99   Sub 08012007-PP  1   60-65小时
  A/Wisconsin67/05   Sub 05012007-PD  2   60-65小时
  A/Wisconsin67/05   Sub 15012007-PP  3   60-65小时
  A/New Caledonia/20/99   Sub 19012007-PD  4   60-65小时
  B/Malaysia2506/04   Sub 22012007-PP  5   60-65小时
  B/Malaysia2506/04   Sub 26012007-PD  6   60-65小时
  A/New Caledonia/20/99   Sub 05022007-PP  7   60-65小时
  A/Wisconsin67/05   Sub 16022007-PD  8   48小时
  B/Malaysia2506/04   Sub 26022007-PP  9   48小时
细胞培养病毒收获(VH)：MDCK细胞生长和病毒生产的详细内容见国际专利申请公开WO 08/105931(特别参见实施例12)。所有病毒生产轮次均在包括约67％培养基交换过程的单用生物反应器(SUB)中进行，采用2000FFU/mL的病毒输入量感染细胞。在感染MDCK细胞约60-65小时(轮次1-7)或48小时(轮次8-9)后收获病毒。在病毒收获(VH)前使SUB中的微载体沉降不少于45分钟。将约18L病毒以约0.2L/分钟泵入50L包，将2L 10X SP缓冲液泵入相同包以便稳定病毒收获物(SVH)。混合后，提取SVH阶段的样品以便通过FFA测试感染性和进行HCD和HCP试验。
采用以下过程直接结合病毒收获步骤和直流过滤步骤。向生物反应器中加入合适体积的10X SP缓冲液以获得包含约1X SP终浓度的稳定病毒收获物(SVH)，可使微载体沉降并采用ATF将病毒收获与DFF和TFF步骤结合在一起。例如，在一项ATF/DFF/TFF结合研究中，通过样品进料泵直接将SVH从生物反应器泵入ATF系统。然后ATF渗透物通过管线内DFF囊最终到达Uniflux过程罐(process tank)。ATF系统的操作见ATF操作手册详述。对于10L和20L生物反应器，生物反应器高度和排出压力(headpressure)的特定压力和排气循环下的ATF系统设定点分别为3L/分钟和1.8L/分钟。设定Uniflux样品进料泵的流速(ATF渗透物流速)以匹配每个实验的特定TFF渗透流量。5XUF5XDF过程见以下所述。如下所述进一步纯化所有5XUF5XDF材料，直至CS色谱步骤。
直流过滤1(DFF1)：准备过滤器器材，在病毒收获前一天进行高压灭菌。显示1.2μm Polygard CN聚丙烯过滤器囊和0.45μm Durapore PVDF过滤器囊的过滤器器材图见图9A上图详示。通过封闭器材组合件以1.5升/分钟(LPM)抽吸约20L SVH，在SVH通过过滤器时对其进行灌注。1.2μmPolygard CN聚丙烯过滤器囊的总膜表面积为1800cm2，0.45μm DuraporePVDF过滤器囊的总膜表面积为1900cm2。在1.5LPM的过滤流速下，1.2μm和0.45μm过滤器的流量分别为每小时每平方米面积500升(LMH)和474LMH。1.2μm和0.45μm过滤器的实际加载量分别为111和105L/m2。将澄清滤液作为DFF1收集在20L包中。对DFF1滤液取样并通过FFA测试感染性并测试残留的HCD和HCP。
切向流过滤1、5X超滤(UF)/5X膜渗滤(DF)(TFF1)：准备Uniflux滑道的管道器材，在病毒收获前一天高压灭菌。所有管道器材图见图9A下图详示。采用以下操作参数通过Uniflux滑道进行TFF1步骤。Uniflux滑道是一种设计为操作中空纤维筒的自动化膜分离过滤系统。采用腔径为0.5mm、总膜表面积为4,800cm2、通道长度为60cm的500kDa分子量截留值(MWCO)中空纤维。该方法产生41.7L/m2膜表面积的最终DFF1加载量，处于之前评价的TFF1过程的40-150L/m2的最佳范围内。就轮次1-6而言，过程后清洁同一中空纤维筒并重复使用。就轮次7-9而言，准备新的中空纤维用于各轮次。在进行各轮次之前，通过用去离子(DI)水漂洗90分钟去除甘油防腐剂、用0.5N NaOH消毒1小时并用1X SP缓冲液平衡至pH 7.0来准备新的中空纤维筒。整个5XUF/5XDF过程采用程序设置为16000秒-1恒定剪切速率和20psi恒定TMP的Uniflux滑道操作。
通过Uniflux滑道处理全部体积的DFF1。首先将约5L的DFF1泵入Uniflux过程罐。渗透物管线初始封闭以建立8.6L/分钟的再循环(渗余物)流速，其相当于16,000秒-1的剪切速率。再循环5分钟后，开始5XUF过程。开放渗透物管线以使小于500kDa的杂质如HCP和DNA通过膜，而渗余物控制阀逐渐关闭以达到1.4巴(20.3psi)的跨膜压力(TMP)设定点。将剩余DFF1滤液连续泵入过程罐，以保持5±0.1L的恒定罐水平，直至将全部体积的DFF 1进料到罐中。所有DFF1材料进料之后，关闭进料泵，渗余物继续浓缩直至最终渗余物体积达到4L或收集到16L渗透物。通过用5X体积倍数的1X SP缓冲液(20L)进行缓冲液交换对所述4L渗余物(5XUF)进行渗滤，以上述相同的剪切速率和TMP操作所述过程。开放渗滤缓冲液管线，再次开启进料泵以泵入1X SP缓冲液。5XDF过程在收集到20L渗滤渗透物之后结束。在5XDF结束时，完全开放渗余物控制阀并再次关闭渗透物管线，以使系统再循环而清除所述过程中弱结合于中空纤维膜表面上的任何可回收病毒。排出包含浓缩和渗滤病毒产物的渗余物，并将其收集在10L产物包中。就最后两个纯化轮次(8和9)而言，在渗余物收集之后引入另外的缓冲液漂洗步骤。将约1.5L 1X SP泵入过程罐中，在渗透物管线关闭状态下再循环5分钟。也将该缓冲液漂洗物收集到同一10L产物包中，将所述包标记为5XUF 5XDF TFF1产物，总体积为约5.5L。对所述TFF1产物取样以通过FFA测试感染性、HCD和HCP。在各过程轮次之后用0.5N NaOH以8.6L/分钟的再循环流速将中空纤维筒和Uniflux系统清洁1小时。
BPG 100/200Cellufine硫酸酯(CS)柱填充和柱评价：将CS树脂以约50％浆液储存在20％乙醇中。采用1∶1的压缩比计算填充BPG 100或BPG200柱所需的树脂量。将BPG100和BPG200柱均填充到17.5cm的目标床层高度或分别填充到1.37L和5.50L的目标床层体积。通过用1X SP缓冲液进行两次缓冲液交换，之后用1X SP/1M NaCl缓冲液进行一次缓冲液交换来制备计算的树脂量。
根据制造商的说明，组装BPG 100和BPG 200柱。准备空柱，使用前用0.5N NaOH消毒并用DI水漂洗。采用AKTA过程滑道，用1X SP缓冲液将CS树脂以500cm(厘米)/小时流动填充到BPG 100柱，以产生15-20cm(目标17.5cm)的柱床层高度。AKTA过程是一种自动化液体色谱系统。
沿空柱侧壁倾倒1X SP/1M NaCl缓冲液制备的树脂浆液，用注射瓶中的水将壁上剩余的任何残留树脂漂洗下来。使树脂沉降到液体水平以下至少10cm的树脂床层高度。不破坏树脂床层将顶部接头插入柱中，然后用止动螺钉/螺母固定。在柱入口处安装4口2向阀(4-2阀)。将四个不同端口进行如下连接：
1-AKTA过程系统柱入口
2-柱人工冲洗(连接到废料或再循环管线)
3-针刺测试连接器(采用凹形路厄锁紧套口注射高盐溶液进行HETP测试)
4-BPG 100/200柱入口
然后将BPG100底部出口连接到AKTA系统柱出口。在降低柱接头之前，检查4-2阀、端口3和4的连接。缓慢将顶部接头降低进入树脂床层，从4-2阀的端口3冲洗出小体积缓冲液。这确保用缓冲液冲洗顶部接头的入口。
然后转换4-2阀以连接端口1和2。将1X SP缓冲液与AKTA系统入口连接，首先以500cm/小时开启流体以通过柱冲洗端口(4-2阀上的端口)在该点绕过柱。在流速在流量计上达到500cm/小时时，迅速调整4-2阀使端口1和4连接。在树脂床层达到目标床层高度时，较近的接头低于树脂床层。重复这些步骤直至树脂床高度无变化和接头到达树脂床层。将接头进一步降低1-3mm以压缩树脂床层，从而避免接头和树脂床层之间出现任何顶部空间。
在填充评价之前，用1X SP平衡CS柱以建立稳定的传导率基线。采用针刺测试连接器(4-2阀上的端口3-4)通过注射2％柱体积(CV)的1XSP/1M NaCl评价柱填充。用1X SP以50cm/小时的流速(4-2阀上的端口1-4)平衡柱。传导率峰值出现在约1/2CV。将Unicorn软件上所得的传导率峰值用来评价柱板高度(HETP)和峰不对称性。一旦达到所需柱HETP，使用前对柱进行消毒并将其储存在0.5N NaOH中。
Cellufine硫酸酯色谱(CS)：准备AKTA过程滑道的管道器材，在病毒收获前一天进行高压灭菌。所有管道器材图见图9B上图详示。通过程序化方法将整个色谱过程自动化。
在各轮次之前用1X SP人工平衡AKTA过程滑道的所有流体通道。在过程开始时，首先用3个柱体积(CV)的1X SP以150cm/小时的线性流速平衡柱。然后将全部体积的5XUF 5XDF TFF1加载到柱上，收集作为流通物的未结合材料。加载之后，用1CV的1X SP以150cm/小时洗涤柱，之后用含50U/mL Benzonase和2mM MgCl2(1X SPB)的2.5CV 1X SP以50cm/小时进行柱上Benzonase处理。减小的线性流速和计算的1X SPB洗涤体积允许柱树脂与Benzonase有50分钟的接触时间。然后用1CV 1X SP以50cm/小时洗涤柱以替换最后1CV 1X SPB柱上Benzonase处理，并用另外1CV 1X SP以150cm/小时洗涤。用3CV 1X SP/1M NaCl缓冲液从柱上洗脱结合的病毒。将CS洗出液收集在10L包中，洗脱峰的收集基于紫外吸光度(采用5mm通道长度紫外流式细胞从50mAU到50mAU(0.1O.D.到0.1O.D.)读出的A280)。来自BPG 100柱的CS洗脱体积为约0.6-0.9L。在各过程轮次之后用0.5N NaOH对柱和AKTA过程系统消毒。对柱加载物、流通物、洗涤物和洗出液取样通过FFA测试感染性、Benzonase、HCD和HCP。
切向流过滤2，8XDF(TFF2)：根据制造商的说明进行Flexstand的设置和使用。采用腔径为0.5mm、通道长度为60cm、总膜表面积为290cm2的500kDa MWCO中空纤维。在上述该大小的膜面积和CS洗脱体积的情况下，最终加载量在20-50L/m2膜表面积的范围中，其为之前评价的TFF2过程的最佳范围。在病毒收获前一天在Flexstand上设置新的中空纤维。用DI水将所述中空纤维漂洗90分钟以去除甘油防腐剂，用0.5N NaOH消毒1小时并用SP 100缓冲液平衡直至pH达到7.2。
通过Flexstand系统处理全部体积的CS洗出液。最初封闭渗透物管线以允许CS洗出液以0.5L/分钟的流速再循环，从而产生16,000秒-1的剪切速率。再循环5分钟后，开放渗透物管线开始渗滤。同时抽吸SP100缓冲液通过渗滤管线，渗余物控制阀逐渐获得20-21psi的跨膜压力(TMP)。通过控制SP100渗滤管线的泵流速使整个过程中渗余物储存库的体积保持恒定，与CS洗脱体积相等(在0.4-0.8L的范围内)。在轮次8之前，用5X体积倍数的SP 100缓冲液对CS洗出液进行渗滤。纯化轮次8-9的CS洗出液与8X体积倍数的SP100缓冲液进行缓冲液交换。在渗滤结束时，渗余物阀完全开放并再次关闭渗透物管线，以在产品回收前使系统再循环5分钟。将渗滤产物排出到10L产物包中。对所述渗滤产物取样以通过FFA测试感染性、Benzonase、HCD和HCP。用0.5N NaOH以0.5L/分钟的再循环流速将中空纤维筒和系统清洁1小时。
直流过滤2(DFF2)：准备过滤器器材，在病毒收获前一天进行高压灭菌。过滤器器材图见图9B下图详示。轮次1-5所用0.22μm聚醚砜膜囊的总表面积为150cm2，轮次6-9所用的为300cm2。最终无菌过滤DFF2步骤在生物安全柜中进行。
向8XDF产物加入1∶9(v/v)稀释的浓缩的谷氨酸精氨酸明胶(cGAG)，以形成纯化病毒的最终制剂。300cm2囊通过封闭器材组合件以约0.38LPM抽吸配制的病毒，采用最终产物灌注过滤器。将滤液收集在无菌的2L瓶中作为最终批量产物。在0.38LPM的过滤流速下，300cm2过滤器的流量为760LMH。对膜面积的配制批量加载量在20-150L/m2的范围内。对0.22μm过滤最终批量产物取样以通过FFA测试感染性、Benzonase、HCD和HCP水平。将最终批量产物等分为若干1、10和100mL等份，快速冷冻并储存于-80℃。
样品分析和计算：将所有用于分析的样品快速冷冻并储存在-80℃。基本如下所述进行HCP试验。基本如上所述采用PicoGreen和PCR方法进行HCD试验。通过补骨脂内酯-生物素(印迹)直接标记方法和在琼脂糖凝胶中直接染色进行HCD筛份分析。基本如下所述进行Benzonase定量分析试验。以ng或μg/剂量计算的所有数值基于7log10FFU/剂量(一个剂量也常称为107FFU)的效价。
残余宿主DNA测定：采用微孔形式的实时PCR方法定量分析残余的MDCK宿主细胞DNA。该试验的靶是狗细胞色素氧化酶亚基I(Cox I)基因内的独特序列。采用一组优化的寡核苷酸引物，从模板产生MDCK Cox I特异性PCR产物，通过SYBR
Figure BPA00001373558001241
绿色染料检测。微孔形式能容纳很宽动态范围(1000到0.1ng/ml)的DNA校准器。各试验包括合适的阳性和阴性对照。采用DNA提取试剂盒获得测试样品DNA。从标准曲线计算0.1ng/ml量化下限以上的样品DNA量。根据掺加物的对照回收率，准确率在75-125％以内。报道的结果是产生50-150％掺加物回收率值的样品提取重复实验的平均DNA量。可采用市售试剂盒，如Quant-iT PicoGreen试剂盒(俄勒冈州尤金的英杰公司，目录号P11496)按照试剂盒中所述方案进行这些分析。
残余宿主细胞蛋白质测定：通过酶联免疫吸附测定(ELISA)采用针对HCP(来自未感染MDCK培养物)产生的生物素化兔一抗和链霉抗生物素-辣根过氧化物酶(HRPO)偶联物测定残余的宿主细胞(MDCK)蛋白质(HCP)。将针对MDCK细胞裂解物的抗体吸附到聚苯乙烯微板上。加入含牛血清白蛋白的封闭溶液以使过量的结合位点饱和。在向包被板加入测试物样品的稀释物时，如果MDCK HCP存在，就会与包被抗体结合。向板中加入在兔中针对MDCK裂解物产生的生物素标记一抗，之后加入辣根过氧化物酶(HRPO)标记的链霉抗生物素偶联物。最终加入HRPO底物，用ELISA板读数仪测定形成的有色末端产物的强度。形成的颜色强度与测试物中存在的MDCK HCP的量成比例。从已知蛋白质浓度的MDCK细胞裂解物校准器产生标准曲线。从标准曲线确定MDCK细胞裂解物的蛋白质浓度。
残余Benzonase测定：通过Benzonase切割鲱精DNA的能力确定其活性。将一式两份的测试物与Benzonase标准曲线比较，其中用分光光度计在260nm测定读数。计算百分比掺加物回收率(Benzonase活性)以确定净Benzonase U/ml。就可定量的活性而言，掺加物参照标准的净Benzonase活性应在1.1-1.9U/ml之间，相关系数应≥0.995，未掺加样品稀释物中的活性应≥0.7U/ml，百分比掺加物回收率应在80-120％之间。
8.6.2结果和讨论
所有SUB轮次均显示在8.0-8.6log10FFU/mL范围内的收获物效价。用来评价各纯化轮次效果的回收率、HCD和HCP结果总结于表28、表29和表30中。以下部分将总结和讨论为改善过程效率和最终产物质量进行的变动。初始和最终纯化方案的过程发展总结于图10中，其显示从早期纯化轮次到最后纯化轮次的主要变动。
Figure BPA00001373558001271
Figure BPA00001373558001281
Figure BPA00001373558001291
Figure BPA00001373558001301
Figure BPA00001373558001321
SVH-从SVH Benzonase处理到柱上Benzonase处理的变化：在初始过程中，在SVH步骤进行Benzonase处理以去除宿主细胞DNA。该过程步骤包括在进行DFF1步骤前在32℃将20L SVH与50U/mL Benzonase混合3小时。在纯化轮次1-4中，向SVH步骤加入Benzonase，而在纯化轮次5-9中，从SVH步骤去除Benzonase处理，采用含50U/mL Benzonase的色谱缓冲液和50分钟树脂接触时间在CS色谱步骤期间作为柱上Benzonase处理过程进行。如表29所示，在纯化轮次2-4中，以ng/剂量表示的HCD水平在SVH和DFF1之间无显著降低；然而，在纯化轮次5-9中，HCD水平在Benzonase柱上CS色谱步骤之后明显降低。发现相对于纯化轮次1-4(3.25-40.49ng/剂量)，通过PCR和PicoGreen分析的纯化轮次5-9的最终批量产物的HCD水平大大降低(0.84-1.42ng/剂量)。该变化不仅通过将最终批量HCD降低到小于或等于1ng/剂量的水平来改善最终产物的质量，而且通过减少Benzonase处理时间和所需Benzonase总量来提高过程效率。柱上Benzonase处理的影响将在CS色谱部分进一步讨论。
DFF1：如表28所述，除轮次4(52.7％)以外，DFF1步骤显示出良好的回收率(78.3-154.6％)。DFF1步骤去除细胞和细胞碎片，并通常显示效价无损失。该步骤还去除一定量的HCD(表29)但不去除HCP(表30)。用来过滤20L SVH的两种过滤器(1.2和0.45μm)的膜面积基于两种过滤器的容量，之前由缩小Vmax/Pmax研究分别采用2.6和1.5的安全因子测定。就1.5LPM的过滤流速而言，1.2μm和0.45μm过滤器的流量分别为500LMH和474LMH。1.2μm和0.45μm过滤器的实际SVH加载量分别为111和105L/m2。
TFF1-为改善TFF1步骤回收率的设置和回收方法的变化：第一批6个纯化轮次显示出各轮次在TFF1步骤的效力回收率从107.2％到30.3％逐渐损失(表28)。就纯化轮次1-6而言，用0.5N NaOH清洁TFF1中空纤维筒，并在过程后重复使用。尚未了解中空纤维筒的清洁效率是否足够在各轮次后完全去除凝胶层，这可导致病毒回收率在该过程步骤后降低。为产生更为一致的步骤回收率，对以纯化轮次7开始的现有方案实施三种主要变动。第一，各轮次采用新的中空纤维以消除中空纤维未充分清洁的可能性。第二，在收集TFF1产物之前，使浓缩的渗余物在渗余物阀开放和渗透物阀关闭的情况下在中空纤维筒中再循环5分钟。这可去除在浓缩和渗滤过程中膜表面可能形成的任何潜在凝胶层，能够实现回收。第三，以相同的再循环流速和时间(5分钟)进行额外的缓冲液漂洗步骤以回收中空纤维筒中的残余病毒，连同产物一起回收缓冲液漂洗物。实施这些变动之后，纯化轮次7-9中TFF1的步骤回收率保持一致的高水平，约为75-80％(表28)。图11显示在16000秒-1的剪切速率和20psi的恒定TMP下(纯化轮次8)进行的TFF1过程的典型流量曲线。流量随病毒溶液浓缩度增大(5XUF)而减小，其在渗滤步骤开始时继续减小但在渗滤步骤接近结束时(5XDF)略微增大。流量在所有纯化轮次中处于70-100LMH的范围内，显示与病毒效价和DFF1滤液的混浊度相关。流量在渗滤步骤结束时的略微增大可能由5XDF结束时额外去除HCP和HCD杂质造成。如表30所示，大部分(80-90％)HCP杂质在第一TFF(TFF1)步骤去除，因为小于500kDa的任何HCP均应在渗透物中去除。病毒收获物缓冲液交换为1X SP的完成见于5XDF过程结束时传导率曲线从12.5mS/cm降低到1mS/cm(图11)。
CS柱上Benzonase处理以提高HCD的去除：采用床层高度为10cm、病毒加载浓度为约9.0log10FFU/mL树脂的小规模CS柱设计初始实验。由于过程得到了改进，每毫升树脂的病毒加载浓度、线性流速和柱床层高度均得到线性放大。在9.0log10FFU/mL树脂的加载效价下，需要4L床层体积的CS以处理收获20L收获效价为8.3log10FFU/mL的稳定病毒收获物。在轮次1-5的进展中，将4L CS树脂填充到BPG 200柱(20cm内径(i.d.))达到12.5cm的床层高度。在以200cm/小时填充BPG 200柱时，背压超过了2.5巴压力的推荐填充压力。(图12)。进行的动态结合容量研究显示，CS树脂在上述填充条件下实际上可结合最多为约9.7log10FFU/mL树脂。同样地，在9.5log10FFU/mL树脂的病毒加载量下，仅需要1.3L CS树脂以处理20L收获效价为8.3log10FFU/mL的稳定病毒收获物。
用1.3L CS树脂填充的BPG 200柱形成4.5cm的最终柱床层高度。与床层高度为15-20cm(用于大规模过程的典型高度)的填充柱相比，柱床层高度的显著降低造成分辨率较低。从纯化轮次6开始，将BPG 100柱填充到17.5cm+/-2.5cm的目标床层高度以形成1.4L的CS柱体积。就BPG100柱而言，采用500cm/小时的填充流速，所得填充压力不超过树脂的推荐填充压力极限，其不同于BPG 200柱的填充压力(图12)。
比较纯化轮次6-9(BPG 100)与纯化轮次2-5(BPG 200)，在实际加载量从8.4-8.9log10FFU/mL树脂(BPG 200柱)增大到9-9.3log10FFU/mL树脂(BPG 100柱)时，CS洗出液步骤回收率类似，平均值分别为54％和59％(表28)。就采用柱上Benzonase处理进行的HCD去除的柱性能而言，纯化轮次6-9(BPG 100)显示与纯化轮次5(BPG 200)中CS洗出液HCD水平(1.2ng/剂量)相当的CS洗出液HCD水平(0.3-1.5ng/剂量)(表29)。尽管柱性能类似，但通过减小CS洗出液和缓冲液制备物体积来减小柱大小改善过程效率在向用于大规模制备时是非常重要的。图13显示从CS BPG100柱(轮次9)洗脱的单个病毒峰的典型色谱。
如表31所示，柱上Benzonase处理(轮次5-9)的总HCD清除效果好于分批模式Benzonase处理(轮次2-4)。Benzonase处理病毒纯化后的剩余HCD百分比处于0.15-3.4％的范围(轮次2-4)，而柱上Benzonase处理病毒纯化后的剩余HCD百分比处于0.02-0.15％的范围(轮次5-9)。CS步骤的柱上Benzonase处理显示的总HCD去除率高于SVH步骤的分批模式Benzonase处理，由此产生最终批量的较低DNA水平。
采用柱上Benzonase处理相比分批模式Benzonase处理具有若干优点。首先，通过将两个过程步骤结合为一个步骤并用CS柱上步骤的1小时Benzonase处理代替SVH步骤的3小时Benzonase处理可提高过程效率。第二，可减少纯化过程所需的Benzonase总量。分批模式Benzonase处理需要100万单位的Benzonase用于20L病毒收获物，而柱上Benzonase处理仅需要20万单位的Benzonase。因此，柱上Benzonase处理将所需Benzonase总量减少了5倍。
TFF2-增大TFF2渗滤体积以提高Benzonase清除：如表28所示，所有9个纯化轮次的TFF2步骤回收率均一致达到64％以上(64-150.8％)。在轮次3中，CS洗脱体积是3.2L。采用290cm2中空纤维，加载到中空纤维膜上的CS洗出液增加到110L/m2，总过程时间为6小时。在接下来的两个连续轮次中采用1400cm2中空纤维膜，以避免过程时间长并将加载浓度保持在小规模研究建立的约20-50L/m2。然而，从轮次6开始，柱大小从4L变为1.4L，洗脱体积也减小到不超过0.9L。该洗出液体积的降低与柱大小成正比。在轮次6-9中，采用290cm2中空纤维筒将CS洗出液加载浓度保持在20-50L/m2。图14显示在16000秒-1剪切速率和21psi恒定TMP下进行的纯化轮次8的TFF2过程的典型流量痕迹曲线。TFF2流量在整个渗滤过程中具有适度的稳定性，表明所述操作条件未造成任何积垢。所有纯化轮次的流量均处于80-110LMH的范围。
TFF2缓冲液交换体积也从5体积倍数增大到8体积倍数以增强Benzonase清除。如表32所示，在所述过程变为柱上Benzonase处理步骤(轮次5)时，CS洗出液的Benzonase水平＞75ng/mL，表明Benzonase与CS柱结合并与病毒产物共洗脱。还通过在1X SPB后评价1CV到4CV的流通样品证实Benzonase与CS柱的结合。流通样品显示具有低Benzonase水平(表32)。因此，纯化轮次8和9的TFF2缓冲液交换体积从5体积倍数增大到8体积倍数，以提高Benzonase清除达到检测界限(LOD)以下的水平。因此，通过将渗滤从5XDF增加到8XDF使Benzonase水平再降低4-5倍。该变化使最终批量中的Benzonase水平降低到LOD以下，达到小于0.1ng/剂量(表32)。
DFF2-增大最终批量最终无菌过滤的过滤器大小：如表28所示，采用150cm2和300cm2 0.22μm最终过滤器的平均步骤回收率分别为88.3-111.1％和65.8-108％。选择300cm2过滤器作为最终过滤器大小以避免在CTM实施轮次的最终无菌过滤过程中出现任何加料流堵塞。用于过滤0.6-1L最终批量的膜面积基于之前建立的20-150L/m2范围加载量的小规模研究。300cm2过滤器的过滤流速为0.38LPM，所述过滤器的流量为760LMH。所述过滤器的实际加载量为20-33L/m2，处于小规模研究确定的范围内。
上游(SUB)过程收获时间从3dpi变为2dpi：从纯化轮次8开始，病毒收获时间从3dpi(60-65小时收获)变为2dpi(48小时收获)。在采用0.001-0.003FFU/细胞的病毒输入量时，在48小时dpi观察到峰病毒效价。如纯化轮次8和9的SVH步骤所示，收获时间的变动引起起始HCD和HCP水平降低(表29和表30)。该变动还引起最终批量产物中HCD和HCP杂质水平变低(表29和表30)，因此改善了最终产物的质量。
实施的纯化过程产生良好的病毒回收率和纯度：完整的实施过程见纯化轮次8和9所示。这两个轮次的平均总效价回收率为43.4％，平均HCD杂质水平为0.72ng/剂量(通过PicoGreen测定)和0.1ng/剂量(通过PCR测定)，HCP杂质水平为0.21μg/剂量，Benzonase杂质水平为0.0035ng/剂量，这些数值均处于纯化批量规格以下。
总体而言，对初始纯化过程进行若干变动以改善过程效率和最终产物质量，包括：1)将病毒收获从3dpi变为2dpi，以在SVH中形成较低HCD和HCP杂质水平，2)将HCD处理步骤从SVH的分批模式Benzonase处理变为CS柱上Benzonase处理，以改善总HCD降解和去除，3)将CS树脂的目标加载浓度从9.0log10FFA/mL增加到9.5log10FFA/mL，其使柱大小从4L减小到1.4L，4)将TFF2的最终制剂缓冲液交换体积从5体积倍数增大到8体积倍数，以改善Benzonase去除，和5)将最终无菌过滤加载量减少一半达到25L/m2的平均值以避免在CTM轮次的最终过滤过程中出现任何堵塞。
最终纯化过程见图10所示，所有纯化轮次的数据总结于表33。基于改进纯化过程的平均总病毒回收率为43.4％，Benzonase的平均杂质水平为0.0035ng/剂量，HCD为0.72ng/剂量(PicoGreen)和0.1ng/剂量(PCR)，HCP为0.19μg/剂量。这些杂质水平处于规格以下。通过DNA大小分析采用直接标记方法(补骨脂内酯-生物素)印迹和直接染色方法(琼脂糖凝胶)分析纯化轮次6-9的最终批量。这些分析中的主要信号显示DNA大小分布≤500bp(未显示数据)。
8.6.3细胞培养物产生的流感病毒的改良纯化方法
可对第8.6节提供的实施例描述的可靠大规模纯化过程进行的其它改动列于图10b并详述于下。具体而言，可结合收获、澄清和TFF1步骤以避免对收获罐的需求、降低操作数量和改进总处理时间。就较平稳的结合操作而言，可将TFF1操作从恒定TMP变为恒定流量。或者或此外，采用较低TMP(低于20psi，例如处于约10psi(12000秒-1)到约14.5psi(16000秒-1)之间)。可向TFF2步骤加入2X UF步骤以减小批量体积。任选在TFF1中采用10XUF以可能使所有随后纯化步骤的加载量加倍。
表34总结了若干纯化轮次的参数变化、回收率和HCD。这些轮次基本如上所述采用产生于无培养基交换的MediV SFM 110的病毒(参见第8.1节提供的实施例)。除以下说明以外，基本如1b过程(参见第8.6节提供的实施例)所述进行所有纯化轮次。通过结合收获、DFF和TFF1步骤进行轮次#25、#27和#30。就这些轮次而言，在恒定流量(50LMH，剪切速率为12000秒-1)下运行TFF1。不结合收获、DFF和TFF1步骤进行轮次#24、#26和#31。就这些轮次而言，在较低TMP(10psi，剪切速率为16,000秒-1)下运行TFF1。对CS步骤分割条件病毒载荷，在2mM MgCl2或10mMMgCl2下处理。DNA分析显示增大MgCl2浓度不会降低DNA大小(未显示数据)。然而，在一种情况中，产率降低(参见表34)。
表35总结了采用培养基交换在MediV SFM 105中产生的病毒的若干纯化轮次的参数变化、回收率和HCD。这些轮次采用基本如国际专利申请公开WO 08/105931(特别参见实施例12)所述产生的病毒。除以下说明以外，基本如1b过程(参见第8.6节提供的实施例)所述进行所有纯化轮次。通过结合收获、DFF和TFF1步骤进行轮次#40、#41和#42。就这些轮次而言，在恒定流量(35LMH，剪切速率为12,000秒-1)或恒定TMP(10psi，剪切速率为12,000秒-1)下运行TFF1。以小规模进行恒定流量的轮次，并仅处理至CS步骤。不结合收获、DFF和TFF1步骤进行轮次#43。
这些研究一起表明，来自MediV SFM 110(无MX)和MediV SFM 105(含MX)过程的材料显示类似的流量/TMP特征。采用较低剪切(12,000秒-1)、较低TMP(10psi)和较低流量(35LMH)确实会产生较长步骤TFF过程时间，但在实施收获、DFF和TFF步骤的结合时，总过程时间可变短。可看到这些纯化轮次的最终HCD浓度在0.01-0.6ng/剂量之间，与上述1b过程获得的浓度相当。总产率通常在30％以上。
表34 无MX其它参数变化的HCD和产率小结
Figure BPA00001373558001391
表35 含MX其它参数变化的HCD和产率小结
Figure BPA00001373558001392
*以小规模进行恒定流量轮次，并仅处理至CS柱步骤
**#40由于在周五收获而在TFF1后保持度过周末
8.7流感病毒纯化树脂的评价
Cellufine硫酸酯(CS)是结合病毒和来自采用高盐蔗糖磷酸盐(SP)缓冲液的柱的病毒洗出物的亲和凝胶。如上所述，可在制备适用于临床试验的疫苗材料过程中将Cellufine硫酸酯凝胶用于柱色谱步骤以进一步去除宿主细胞DNA(HCD)、宿主细胞蛋白质(HCP)杂质和在用于降解宿主细胞DNA的柱洗涤步骤(柱上Benzonase处理)引入的Benzonase
Figure BPA00001373558001402
污染物。由caB/Malaysia/2506/04病毒毒株的动态结合容量研究(未显示数据)测定的CS凝胶结合容量为9.72log10FFU/mL凝胶。根据凝胶的结合容量，计算的基于400L和1600L三价疫苗细胞培养过程的柱体积分别为25L(40cmx20cm)和100L(80cmx20cm)。考虑到CS柱加载前在第一直流过滤(DFF1)和切向流过滤(TFF1)步骤损失20-30％总感染颗粒，各过程规模各自的目标柱大小能够纯化病毒收获物效价最高达到8.7log10FFU/mL，不超过CS凝胶的容量。然而，鉴定到病毒结合容量更高的替代性色谱凝胶会使总生产能力增加而不需任何额外纯化放大。
以下实施例详细描述对采用基本如上所述(参见第8.6节提供的实施例)纯化过程的6个额外亲和树脂(用树脂A-F表示)的评价。简言之，采用ca B/Malaysia 2506/04作为模式毒株，通过1.2μm聚丙烯(PP)和0.45μm聚偏二氟乙烯(PVDF)囊式过滤器澄清蔗糖-磷酸盐(SP)缓冲液稳定的病毒收获物(VH)。采用500kDa分子量截留值的中空纤维筒，用蔗糖-磷酸盐(SP)缓冲液进行5倍(5X)超滤(UF)和5倍(5X)渗滤(DF)使澄清的VH达到要求。然后在测试色谱柱上纯化经浓缩和渗滤的病毒以进一步去除宿主细胞DNA(HCD)、宿主细胞蛋白质(HCP)杂质和用于降解宿主细胞DNA在柱洗涤步骤(柱上Benzonase处理)中引入的Benzonase污染物。还在性能最高新树脂和当前使用的CS凝胶之间进行直接比较。简言之，采用不同的病毒收获物批次评价测试树脂C和D相比Cellufine硫酸酯的纯化性能。评价包括步骤产率、结合容量和杂质水平(例如，HCD、HCP和Benzonase
Figure BPA00001373558001412
)。采用该类型评价可有效评价新树脂的性能。
8.7.1材料和方法
材料，试剂和设备：可替换性能类似的其它材料、设备和试剂。
1.在感染后48-68小时收获用于这些研究的病毒收获物批次(caB/Malaysia 2506/04、ca A/Wisconsin 67/05、ca A/Solomon Islands 03/06、caA/Wisconsin67/05、ca A/South Dakota/6/2007)，收获效价在8.7-8.9log10FFU/mL之间。通过切向流过滤(TFF1)用5X超滤(UF)和5X渗滤(DF)材料基本如以上第8.6节详述对澄清病毒收获物进行处理，随柱加载的最终效价为8.6-9.4log10FFU/mL。
2.Quant-iT PicoGreen双链DNA试剂盒(俄勒冈州尤金的英杰公司，目录号P11496)
3.1X SP缓冲液，pH 7.0(犹他州洛根的海克隆公司，目录号SH3A1577.03)，或用6.5mM磷酸氢二钾、4.5mM磷酸二氢钾和218mM蔗糖制备。就1L 1X SP而言，将6.5mL 1M磷酸氢二钾溶液、4.5mL 1M磷酸二氢钾溶液、74.62g蔗糖混合并溶解于H2O中使最终体积达到1L。如果需要，用1N H3PO4或1N KOH将pH调整到7.0。
4.用9.5mM磷酸氢二钾、1.5mM磷酸二氢钾、218mM蔗糖和1M NaCl制备1X SP，1M NaCl缓冲液。就1L 1X SP而言，将9.5mL 1M磷酸氢二钾溶液、1.5mL 1M磷酸二氢钾溶液、74.62g蔗糖和58.44g氯化钠(NaCl)混合并溶解于H2O中使最终体积达到1L。如果需要，用1N H3PO4或1NKOH将pH调整到7.0。
5.1X SPB溶液包含2mM MgCl2和50U/mL Benzonase。为制备50mL 1XSPB，向49.9mL 1X SP中加入100μL 1M MgCl2和7.65μL Benzonase(327U/mL)。
6.磷酸氢二钾K2HPO4(密苏里州圣路易斯的西格玛公司，目录号P3786)
7.磷酸二氢钾KH2PO4(密苏里州圣路易斯的西格玛公司，目录号P5379)
8.将1M K2HPO4磷酸氢二钾(174.18g)溶解于H2O中使最终体积达到1L。
9.将1M KH2PO4磷酸二氢钾(136.09g)溶解于H2O中使最终体积达到1L。
10.蔗糖(新泽西州吉布斯镇EMD公司(EMD，Gibbstown，New Jersey)，目录号1.07653.9012)
11.NaCl(新泽西州吉布斯镇EMD公司，目录号7760)
12.1M MgCl2(密苏里州圣路易斯的西格玛公司，目录号M1028)
13.Benzonase
Figure BPA00001373558001421
(德国达姆施塔特的EMD公司，目录号1.07653.9012，353U/μl)
14.0.5N NaOH，从10N NaOH稀释得到(宾夕法尼亚州西切斯特的VMR公司，目录号VW3247-7)
15.0.22μM过滤器(马萨诸塞州比莱瑞卡的密理博公司，目录号SCGPU11RE)
16.二醇类改性聚对苯二甲酸乙二酯(PETG)瓶(纽约州罗切斯特的纳尔金公司)：1L(目录号2019-1000)、2L(目录号2019-2000)、125mL(目录号2019-0125)、250mL(目录号2019-0250)
17.锥形管(纽约州康宁的康宁公司)：15mL(目录号430052)，50mL(目录号630829)
18.1.2μm Polygard CN Opticap XL5过滤器(马萨诸塞州比莱瑞卡的密理博公司，目录号KN12A05HH1)
19.0.45μm Durapore Opticap XL4过滤器(马萨诸塞州比莱瑞卡的密理博公司，目录号KPHLA04HH3)
20.20L包(犹他州洛根的海克隆公司，目录号SH30712.03)
21.50L包(犹他州洛根的海克隆公司，目录号SH30712.04)
22.空心纤维，500KD，4800cm2(瑞典厄普萨拉的GE医疗保健公司，模型号UFP-500-C-6A)
23.空心纤维，500KD，1,400cm2(瑞典厄普萨拉的GE医疗保健公司，模型号UFP-500-C-3x2MA)
24.Omnifit柱(0.66cmx20cm和1cmx20cm)(剑桥克德汉姆弄的生化阀公司(Bio-Chem Valve Inc.Coldhams Lane，Cambridge))
25.XK-16柱16mmx20cm(瑞典厄普萨拉的GE医疗保健公司)
26.Akta探测器(瑞典厄普萨拉的GE医疗保健公司)
27.SpectraMax GEMINI EM微板读数仪(加利福尼亚州萨尼维尔的分子装置公司(Molecular Devices，Sunnyvale，California))
28.热Orion pH计(马萨诸塞州沃森姆的热科学公司(Thermo Scientific，Waltham，Massachusetts))
29.CDM210传导率计(法国里昂辐射计分析公司(RadiometerAnalytical，Lyon，France))
测试树脂的制备：在20％乙醇中储存树脂。将所需量(例如42mL)的50％树脂浆液吸移到50mL锥形管中，在1000rpm旋转10分钟。去除液体，用21mL填充缓冲液(1X SP+1M NaCl，pH 7.0)重悬树脂。将树脂与填充缓冲液的交换重复三次。
XK-16(16mmx10cm)测试或CS树脂柱的制备：在填充前将空柱的所有部分用水清洁并干燥。根据制造商的说明组装柱。将柱接头插入柱底部，将接头管与30mL注射器连接。将柱垂直放置并用架子夹紧。将10mL填充缓冲液填注到柱中，牵拉底部注射器直至柱中剩余2cm缓冲液。将制备的测试树脂倾倒入柱中而不引入气泡，使其通过重力沉降。树脂沉降之后，用填充缓冲液填注柱。将顶部接头小心插入到柱中而不引入气泡。然后将柱与AKTA探测器系统连接，并以500cm/小时(16.7mL/分钟)用填充缓冲液填充约20分钟直至柱床层高度不发生改变。调整顶部接头使其下降1-2mm进入凝胶顶部。最终填充柱的床层高度是10cm，等于20mL柱体积。采用填充时等于5.8mL凝胶的较小大小的Omnifit柱(0.66cmx17cm)进行测试树脂和CS凝胶的动态结合容量研究。用1N NaOH对填充的测试树脂柱消毒1小时，用1X SP pH 7.0缓冲液重新平衡。用0.5N NaOH对填充的CS柱消毒1小时，用1X SP pH 7.0缓冲液重新平衡。
用于测试树脂和Cellufine硫酸酯柱的5X超滤和5X渗滤(5X UF/5XDF)条件化病毒载荷的制备：通过1800cm2 1.2μm预过滤器囊和1900cm20.45μm过滤器囊以1.5L/分钟的流速过滤来自15L生物反应器或30LSUB生物反应器的15或20L的1X SP稳定病毒收获物(MDCK细胞生长和病毒生产的详细内容见国际专利申请公开WO 08/105931所述，特别参见实施例12)，并将其收集在20L海克隆包中。然后基本如以上改进过程所述(参见第8.6节提供的实施例)，采用Flexstand系统通过1X SP缓冲液的5倍超滤(5X UF)和5倍渗滤(5X DF)采用切向流过滤(TFF1)纯化直流过滤(DFF1)滤液。对大多数批次采用1400cm2或4800cm2500kDa分子量截留值的中空纤维筒在16000秒-1的恒定剪切速率和20psi的TMP下进行TFF1步骤。ca B/Malaysia病毒收获物批次#1在12000秒-1的恒定剪切速率和14.5psi的TMP下进行，ca B/Malaysia病毒收获物批次#2在12000秒-1的恒定剪切速率和70LMH的恒定流量下进行。将5X UF/5X DF病毒溶液等分为100mL/瓶。所有瓶子置于干冰中冷冻并储存在-80℃作为测试树脂和CS柱加载材料。
测试树脂和Cellufine硫酸酯柱运行条件：测试树脂柱(16mmx10cm)运行的操作参数与以上详述的BPG 100柱基本相同。简言之，首先用3个柱体积(CV)的1X SP平衡柱，将所需量的5X UF/5X DF病毒溶液以150cm/小时的流速(1.6cmx10cm XK-16柱为5mL/分钟，0.66cmx17cm Omnifit柱为0.85mL/分钟)加载到柱上。在1CV 1X SP缓冲液洗涤之后，将1X SPB以50cm/小时(1.6cmx10cm XK-16柱为85mL 1X SPB以1.7mL/分钟，0.66cmx17cm Omnifit柱为15mL 1X SPB以0.3mL/分钟)加载到柱上，以便进行接触时间为50分钟的柱上Benzonase处理。然后用第一1CV 1XSP以50cm/小时和第二1CV of 1X SP以150cm/小时的线性流速洗涤柱。用3CV包含1M NaCl、pH 7.0缓冲液的1X SP以150cm/小时的线性流速洗脱结合的病毒。在A280nm收集从20mAU到20mAU(0.1O.D.到0.1O.D.)的洗脱峰。收集测试树脂加载物、流通物、Benzonase洗涤物和洗出液的组分。将所有样品等分，冷冻于干冰中，并储存在-80℃，以便通过FFA(荧光聚焦试验)进行感染性分析和通过PicoGreen试验进行DNA分析。
测试树脂柱纯化评价：用ca B/Malaysia病毒毒株5XUF/5XDF TFF1材料以9.0log10FFU/mL的加载浓度单独加载填充的测试树脂柱(16mmx10cm)。为避免加载小体积，在加载前用1X SP缓冲液将5XUF/5XDF病毒加载物溶液预稀释2.5倍，使效价从9.4log10FFU/mL稀释到9.0log10FFU/mL。将50mL病毒溶液以9.4log10FFU/mL凝胶加载到各柱轮次的目标上。根据加载病毒效价乘以加载体积然后除以CS柱体积进行计算，log(10^(9.0FFU/mL)x50mL/20mL柱体积)＝9.4log10FFU/mL凝胶。收集各轮次的病毒加载物、流通物、Benzonase洗涤物和洗出液组分。将所有样品等分，冷冻于干冰中，并储存在-80℃，以便通过FFA进行感染性分析和进行HCD、HCP和Benzonase定量分析。
测试树脂柱结合容量研究：用ca B/Malaysia病毒毒株5XUF/5XDFTFF1材料以9.0log10FFU/mL的加载浓度加载测试树脂柱(16mmx10cm)。在加载前用1X SP缓冲液预稀释5XUF/5XDF病毒加载物溶液，使效价从9.4log10FFU/mL稀释到9.0log10FFU/mL。进行9.4、9.9、10.2和10.5log10FFU/mL凝胶的4种不同总病毒加载量以评价测试树脂的结合容量。收集各轮次的病毒加载物、流通物和洗出液样品，基本如上所述(参见第8.1节提供的实施例)通过荧光聚焦试验(FFA)分析感染性效价，并基本按照试剂盒中描述的方案采用Quant-iT PicoGreen试剂盒进行宿主细胞DNA(HCD)分析。以HCD(ng/mL)/(10^(CS洗出液效价log10FFU/mL-7.0log10FFU/剂量))＝HCD(ng/剂量)计算以ng/107效价剂量表示的柱洗出液HCD水平。同样基本如上所述(参见第8.6节提供的实施例)确定宿主细胞蛋白质(HCP)和BenzonaseTM水平。
Cellufine硫酸酯和测试树脂的动态结合容量研究：采用ca B/Malaysia和ca A/Wisconsin毒株不同批次的TFF1(5X UF/5X DF)材料进行柱动态结合容量研究，以研究批次材料相比CS凝胶对测试树脂的性能和结合容量的影响。将TFF1(5X UF/5X DF)病毒溶液以150cm/小时加载到CS和测试树脂柱上。病毒加载量的目标为10.5-10.7log10FFU/mL凝胶。根据加载病毒效价乘以加载体积然后除以CS柱体积进行计算，log(10^(TFF1加载效价(log10FFU/mL))x加载体积(mL)/柱体积(mL))＝以log10FFU/mL凝胶表示的目标量。将1个柱体积(CV)的流通物收集在各组分管中。通过FFA鉴定流通物组分的效价。通过将流通体积对流通物中的病毒效价浓度相对于加载效价浓度的百分比作图表示CS凝胶的突破曲线。将动态结合容量测定为直至达到流通物中加载病毒浓度10％时可结合凝胶的最大病毒量。然后采用10％病毒突破的体积(X)计算凝胶的结合容量(Y)，即加载病毒效价乘以10％突破体积然后除以柱体积，log(10^(加载效价(log10FFU/mL))x(mL)/柱体积(mL))＝Y log10FFU/mL凝胶。
加载范围研究：采用三个不同批次的ca B/Malaysia TFF1(5X UF/5XDF)材料进行加载范围研究，以比较批次材料相比CS凝胶对测试树脂C和D性能的影响。各单独批次和各柱凝胶的目标加载范围列于表34中。收集各轮次的柱加载量、流通物和柱洗出液，采用FFA和HCD试验分析。
纯化步骤产率：如下计算柱纯化步骤产率：将病毒效价乘以洗脱体积然后除以加载病毒效价和加载体积，10^(CS洗出液效价FFU/mL)x洗脱体积/(10^(CS加载效价FFU/mL)x加载体积)。
表36 Cellufine硫酸酯和测试树脂C和D柱的加载范围研究
Figure BPA00001373558001461
8.7.2结果和讨论
就测试树脂A-D上的纯化轮次而言，用ca B/Malaysia病毒毒株5XUF/5XDF TFF1材料以9.0log10FFU/mL的加载浓度加载各柱。各轮次病毒加载的目标量是9.4log10FFU/mL凝胶。采用3个柱体积(CV)的含1M NaCl的SP缓冲液从柱洗脱病毒。测试树脂A-D柱轮次的洗脱色谱分别见图19的A-D所示。如图19所示，测试树脂A和B看来显示分离的多个洗脱峰，而测试树脂C和D显示具有峰肩和非均相特征的单个峰。
表37总结了比较步骤产率、柱洗脱杂质HCD、HCP和Benzonase污染物水平的4个纯化轮次的结果。与测试树脂A和B相比，测试树脂C和D具有较高的步骤产率(103.5％和76.5％)，而测试树脂B产生的步骤产率最低(14.5％)。就杂质HCD水平而言，与测试树脂A和B相比(0.14和0.67ng/剂量)，用测试树脂C和D纯化的ca B/Malaysia具有较高的HCD水平(0.07和0.08ng/剂量)。用测试树脂C(0.27ng/剂量)和测试树脂D(0.21ng/剂量)纯化的ca B/Malaysia的HCP水平与测试树脂A(0.26ng/剂量)相似，但低于测试树脂B(0.87ng/剂量)。用测试树脂C和D纯化的ca B/Malaysia的Benzonase水平(0.25和0.31ng/剂量)低于测试树脂A和B(1.78和2.60ng/剂量)。
表37测试树脂步骤产率、HCD、HCP和Benzonase水平的比较
表38中，4个测试树脂轮次流通物的病毒效价显示非常低(相对于测试树脂C的加载量，为总感染颗粒的2.2％)或为检测界限(LOD)，表明病毒大多数以9.4log10FFU/mL凝胶的加载量与凝胶结合。测试树脂C在流通物中具有较高量的病毒表明测试树脂C与其它三种测试树脂相比可能具有较低的结合容量。这4个轮次的Benzonase洗涤组分也显示检测不到或极低百分比的病毒(测试树脂C为1.2％，测试树脂D为0.9％)。用树脂进行的4个纯化轮次的初始筛选结果表明，测试树脂C和D相对于其它两种凝胶在步骤产率以及洗出液杂质和污染物水平方面的性能较佳。
表38 测试树脂流通物和Benzonase洗涤组分的比较
Figure BPA00001373558001482
LOD-检测界限
加载量为9.4log10FFU/mL凝胶的测试树脂A-D的筛选结果显示病毒大多数发生结合，因此选择加载水平为9.4、9.9、10.2和10.5log10FFU/mL凝胶的较高病毒加载量评价这些树脂的结合容量。此外，还评价测试树脂E和F。还评价这些加载水平下对步骤产率和HCD杂质水平的影响。结合容量研究结果总结于下。表39列出了测试树脂C和D的结合容量结果。表40列出了测试树脂A、B、E和F的结合容量结果。
表39 测试树脂C和D的结合容量研究(1M或2M NaCl洗脱)
Figure BPA00001373558001491
LOD-检测界限
表40测试树脂A、B、E和F的结合容量研究(1M NaCl洗脱)
Figure BPA00001373558001492
LOD-检测界限
表39中，分别将测试树脂C和D在9.4log10FFU/mL凝胶加载量的轮次结果与SP缓冲液1M NaCl和2M NaCl洗脱比较。进行2M NaCl洗脱以评价测试树脂C和D洗脱峰相对于用1M NaCl洗脱观察到的峰是否会产生单个峰。如图20所示，对于两种凝胶，采用2M NaCl洗脱的洗脱峰变尖，无非均相特征(比较图19B和20A以及图19D和20B)。如表39所示，考虑到基于测试树脂C 103.5-90.2％的效价和测试树脂D 76.5-59.7％的效价的回收率，2M NaCl洗脱对测试树脂C和D的步骤产率无显著影响。在用2M NaCl洗脱时，两种凝胶洗出液以ng/剂量表示的HCD水平均略微升高，测试树脂C从0.07升高到0.2ng/剂量，测试树脂D从0.08升高到0.11ng/剂量。就较高病毒加载量时对HCD水平影响的评价而言，由于加载量从9.4log10FFU/mL凝胶增加到9.9log10FFU/mL凝胶，测试树脂C的洗出液HCD水平从0.2ng/剂量升高到1.26ng/剂量，但步骤产率不受影响(90.2％相对94.4％)。使加载量进一步增加到10.2log10FFU/mL凝胶显示流通物组分中病毒突破量增加(14.4％)，由此引起测试树脂C的产率降低(79.4％)和洗出液HCD水平升高(2.19ng/剂量)。由于尚未评价各凝胶的突破曲线，在相应病毒加载量的流通物中出现不超过2％病毒时评价结合容量。因此，测试树脂C的结合容量估计为9.9log10FFU/mL凝胶。如表39所示，就测试树脂D而言，病毒加载量从9.5log10FFU/mL凝胶增加到10.2log10FFU/mL凝胶引起HCD水平从0.11ng/剂量增加到0.98ng/剂量，但对步骤产率没有显著影响(59.7％到79.7％)。这是因为即使在加载量为10.2log10FFU/mL凝胶时流通物中检测到小百分比的病毒(1.4％)。因此，测试树脂D的结合容量估计为10.2log10FFU/mL凝胶。
总体而言，估计测试树脂C和D的结合容量分别为9.9和10.2log10FFU/mL凝胶。在该组采用ca B/Malaysia毒株进行的研究中，测试树脂D的结合容量比测试树脂C高约两倍。在病毒加载量增加时，测试树脂C和D的洗出液HCD水平也均升高。比较在10.2log10FFU/mL凝胶的相同加载水平下的凝胶，测试树脂C的每剂量HCD水平(2.19ng/剂量)高于测试树脂D(0.98ng/剂量)，因此在较高病毒加载量下测试树脂C对HCD水平的影响比测试树脂D更为明显。就步骤产率而言，比较各种病毒加载量，测试树脂C产生的步骤产率略高于测试树脂D。
初始筛选结果表明，在9.4log10FFU/mL凝胶的加载量下进行研究时，与测试树脂A和B相比，测试树脂C和D产生较好的纯化结果。为评价测试树脂A和B以及其它两种测试树脂(E和F)是否可产生比测试树脂C和D更高的结合容量，对测试树脂A、B、E和F进行结合容量研究，并评价步骤产率。结果总结在表40中。在该组纯化轮次中，用SP缓冲液1M NaCl洗脱结合的病毒，该缓冲液是用于第8.6节提供的实施例所述的CS色谱步骤的洗脱缓冲液条件。
如表40所示，测试树脂E的估计结合容量在9.9到10.2log10FFU/mL凝胶之间，因为在这两个加载量范围时，流通物中的病毒百分比从无法检测的水平增加到8.3％。就测试树脂A而言，估计结合容量在10.2到10.5log10FFU/mL凝胶之间，因为在这两个加载量范围时，流通物中的病毒百分比从无法检测的水平增加到6.3％。估计测试树脂B和E的结合容量均为至少≥9.9log10FFU/mL凝胶，因为未在更高加载范围进行轮次。
在较高病毒加载量下评价对HCD水平的影响时，在病毒加载量从9.4log10FFU/mL凝胶增加到9.9log10FFU/mL凝胶时，测试树脂A、B、E和F的HCD水平均升高。在加载量增加到最高10.2和10.5log10FFU/mL凝胶时，观察到测试树脂A和E更高的HCD水平。测试树脂C和D在相同的病毒加载量(9.9log10FFU/mL凝胶)下，在若干测试树脂的洗脱组分中观察到较高的HCD水平(测试树脂A为3.43ng/剂量，测试树脂B为2.9ng/剂量，测试树脂E为5.31ng/剂量，测试树脂F为1.24ng/剂量)(表40)。因此，在较高病毒加载量下对测试树脂A、B、E和F的HCD水平的影响比测试树脂C和D更为显著。
在病毒加载量从9.4log10FFU/mL凝胶增加到10.2log10FFU/mL凝胶时，测试树脂E的步骤产率从82％降低到47.8％(表40)。就测试树脂A而言，在病毒加载量从9.4log10FFU/mL凝胶增加到10.5log10FFU/mL凝胶时，步骤产率也降低(69.4％到51.5％)。与采用相同病毒加载量(9.9log10FFU/mL凝胶)的测试树脂E和A(52.0％和61.5％)相比，测试树脂B和F均显示相对较低的步骤产率(11.7％和34.9％)。在病毒加载量为9.4log10FFU/mL凝胶时观察到相同的趋势，与测试树脂B相比(14.5％)，测试树脂E(82％)和测试树脂A(69.4％)的步骤产率较高。比较这些测试树脂，测试树脂C和D在不同病毒加载范围下产生的步骤产率高于测试树脂A、B、E和F。采用不同病毒毒株和收获批次进一步评价测试树脂C和D，以与现有的CS凝胶进行性能比较。
采用测试树脂C评价其它病毒毒株的纯化。图21A和B分别显示采用测试树脂C柱的ca A/Wisconsin和ca A/Solomon Islands的纯化轮次的洗脱峰色谱。峰特征与ca B/Malaysia毒株的纯化轮次相当类似和一致。表41列出了ca B/Malaysia、ca A/Solomon Islands和ca A/Wisconsin毒株纯化的步骤产率和洗出液中的HCD水平。在9.4-10.0FFU/mL凝胶的加载条件下在流通物中观察到结合在柱上的所有病毒和相对于加载量少于1％的总感染病毒颗粒。三个毒株步骤产率的范围在78.9-112.5％，所有三个毒株的步骤产率相对相当，与之前测试树脂C凝胶的高产率相当。在9.8log10FFU/mL凝胶的加载量下，宿主细胞DNA水平仍较低，然而，在采用高病毒加载量(10log10FFU/mL凝胶)时，洗出液中的DNA水平升高到1.34ng/剂量。在采用测试树脂C与之前研究中的ca B/Malaysia毒株的结合容量研究中观察到HCD水平的类似升高。所述结果表明测试树脂在纯化不同毒株时产生类似的性能。
表41采用测试树脂C柱的ca B/Malaysia、ca A/Wisconsin和A/Solomon Islands毒株的纯化结果小结
Figure BPA00001373558001531
采用测试树脂D凝胶评价ca A/Wisconsin和ca B/Malaysia毒株的纯化。图22A和B显示病毒洗脱的洗脱峰色谱。两个毒株的峰洗脱特征类似，该步骤的纯化回收率高，两个毒株洗出液组分的HCD水平在预期范围内(＜2ng/剂量)。
表42采用测试树脂D柱的ca B/Malaysia和ca A/Wisconsin毒株的纯化结果小结
LOD-检测界限
用ca B/Malaysia和ca A/Wisconsin的TFF1(5XUF 5XDF)材料和总目标病毒加载量为10.5-10.7log10FFU/mL凝胶的三个不同批次的caB/Malaysia进行动态结合容量研究。在A280nm曲线的开始阶段，病毒加载量相对平坦。在达到某个加载体积之后，A280显著增加并逐渐达到平台期，表明柱已超过柱容量，由此实现病毒突破。通过用各流通物组分的病毒效价除以加载效价再乘以100来计算流通物中的病毒百分比。通过用流通物中的病毒浓度百分比相对加载体积作图来绘制突破曲线。凝胶的动态结合容量定义为在流通物组分相对于加载浓度达到10％病毒浓度突破时的每毫升凝胶结合容量。
就CS柱而言，在加载18mL病毒时，5％病毒出现在流通物组分中。在达到10％突破的结合容量时，加载约19mL病毒溶液。这代表9.8log10FFU/mL凝胶的加载量(log10(10^(9.3)x19mL/5.8mL)＝9.8log10FFU/mL凝胶)。因此，确定ca B/Malaysia/2506/04批次#2的CS凝胶动态结合容量为9.72log10FFU/mL凝胶。类似地，在将27mL病毒加载到测试树脂C柱上和将24mL病毒加载到测试树脂D柱上时，10％病毒出现在流通物组分中。确定采用相同批次ca B/Malaysia的测试树脂C和D的动态结合容量分别为9.96和9.92log10FFU/mL凝胶。采用若干批次ca B/Malaysia毒株的测试树脂C、D和CS柱的动态结合容量总结于表43。如表43所示，动态结合容量不同，并显示依赖于加载材料中的HCD和HCP水平。CS以及测试树脂C和D柱的动态结合容量受加载材料HCD水平的影响；加载材料的HCD水平越高，凝胶的动态结合容量越低。凝胶的动态结合容量显示受加载材料HCP水平的影响较小。假设一些宿主细胞DNA与病毒结合，因此妨碍病毒与凝胶表面配体的动力学结合，导致DNA水平较高的病毒批次观察到的结合容量较低。在表43所示的4个批次中，CS凝胶的动态结合容量在9.7-10.4log10FFU/mL凝胶之间变化，测试树脂C的结合容量在9.9-10.7log10FFU/mL树脂之间变化，测试树脂D的结合容量在9.9到10.7以上log10FFU/mL凝胶之间变化。总体而言，与CS凝胶相比，测试树脂C和D凝胶的动态结合容量在评价条件下较高(约2倍)。测试树脂D凝胶的动态结合容量在一些批次中有时较高，至少与测试树脂C凝胶相当。
表43 不同批次病毒的动态结合容量总结
log10FFU/mL凝胶
在将CS的动态结合容量与测试树脂C和D比较之后，对采用相同加载条件的CS和测试树脂采用三个批次的ca B/Malaysia进行独立的轮次以评价步骤产率并去除HCD。根据所述批次的动态结合容量，选择各批次的目标加载效价范围进行研究。表44总结了ca B/Malaysia毒株批次1的CS、测试树脂C和测试树脂D柱纯化在各种病毒加载范围下的纯化步骤产率和HCD水平。估计测试树脂C和D的结合容量分别为9.9和10.2log10FFU/mL凝胶。测试树脂D的结合容量在这些研究中比测试树脂C高约两倍。采用相同批次材料的CS结合容量为9.7log10FFU/mL凝胶。测试树脂C和D的结合容量均高于CS(2和4倍)。在病毒加载量增加时，测试树脂C和D的洗出液HCD水平也均升高。在10.2log10FFU/mL凝胶的相同加载水平比较凝胶，测试树脂C的每剂量HCD水平(2.19ng/剂量)高于测试树脂D(0.98ng/剂量)。因此，病毒加载量增加时测试树脂D和CS凝胶的洗出液HCD水平升高类似。然而，就测试树脂C凝胶而言，HCD水平的升高与CS凝胶相比更为明显。与测试树脂D相比，测试树脂C的各种病毒加载量的步骤产率相当或略微。与CS柱相比，测试树脂C和D柱在以较高病毒加载条件进行病毒纯化时产生较高的步骤产率。总体而言，与CS和测试树脂C相比，测试树脂D具有较高的结合容量和较好的纯化性能。
表44采用ca B/Malaysia批次1的CS与测试树脂C和D的比较
Figure BPA00001373558001551
LOD-检测界限
Figure BPA00001373558001552
log10FFU/mL凝胶
表45总结了采用CS、测试树脂C和测试树脂D柱纯化ca B/Malaysia批次2在各种病毒加载范围下的纯化步骤产率和HCD水平。测试树脂C和D以及CS的结合容量分别为9.96、9.92和9.80log10FFU/mL凝胶。测试树脂C和D的结合容量略高于CS凝胶。在病毒加载量接近于动态结合容量9.8-9.9log10FFU/mL凝胶时，所有三种凝胶的步骤产率相当，处于47.5％-62.8％。在较高病毒加载量10.1log10FFU/mL凝胶下，CS的步骤产率显著降低到25.2％，测试树脂C的步骤产率降低到50.2％，而测试树脂D产率保持在63.2％的类似水平。在加载量增加到10.4log10FFU/mL凝胶时，CS的步骤产率进一步降低到12.6％，而测试树脂C和D的产率分别降低到49.8和39.5％。测试树脂C和D的步骤产率显著高于CS凝胶。
表45采用ca B/Malaysia批次2的CS与测试树脂C和D的比较
Figure BPA00001373558001561
Figure BPA00001373558001562
log10FFU/mL凝胶
在病毒加载量增加时，CS、测试树脂C和D凝胶的洗出液HCD水平也均升高。在9.8-10.4log10FFU/mL凝胶的相同病毒加载量下比较凝胶，测试树脂C的每剂量HCD水平(0.97、2.51、2.93ng/剂量)高于CS(0.5、1.91、2.43ng/剂量)，测试树脂D的HCD值最低(LOD、1.67、1.21ng/剂量)。采用测试树脂C纯化的病毒中HCD水平的升高大于CS凝胶。测试树脂D和CS凝胶的洗出液HCD水平的升高类似，虽然测试树脂D更小些。总体而言，与CS和测试树脂C相比，测试树脂D具有较高的结合容量和较好的纯化性能(步骤产率和HCD水平)，特别是在较高病毒加载条件下评价时。
在测试树脂C和D以及CS柱对之前两个批次ca B/Malaysia进行的总体纯化性能评价之后，选择测试树脂D进行纯化研究以进一步采用B/Malaysia批次#3比较CS凝胶。结果总结在表46中。就该批次而言，CS和测试树脂D的动态结合容量相当，CS为10.2log10FFU/mL凝胶，测试树脂D为10.1log10FFU/mL凝胶。在比较各种病毒加载量下的性能时，CS和测试树脂D凝胶的HCD水平相当(均少于1.1ng/剂量)。就步骤产率而言，特别在10.2和10.5log10FFU/mL凝胶的较高病毒加载量下，测试树脂D产生的步骤产率(52.8和65.8％)好于CS凝胶(46.2和55.2％)。
表46采用ca B/Malaysia批次#3的CS和Flu4的比较
Figure BPA00001373558001571
log10FFU/mL凝胶
为评价纯化的可升级性，将测试树脂D填充到XK-50柱(5cmx17cm)以放大约25倍。如柱加载材料的方法所述，在SP稳定、DFF1和TFF1(5XUF和5X DF)之后处理10L生物反应器病毒收获物TVCC-2批次#32 caA/South Dakota毒株。将TFF1(5XUF 5XDF)材料分别加载到测试树脂D和CS XK-50柱(5cmx17cm)上。包括加载和洗涤线性流速、柱上Benzonase处理和洗脱步骤在内的柱运作条件和操作参数与方法部分所述的TVCC-1过程(20L规模)和小规模运作相同。图22C显示XK-50柱规模下测试树脂D的洗脱峰色谱。洗脱峰显示在洗脱开始阶段的小前峰，之后是主单个峰，无小规模洗脱色谱中观察到的洗脱峰的多重特征(图22A和B)。表47总结了测试树脂D和CS柱轮次的纯化步骤产率和洗出液HCD水平。在10.0log10FFU/mL凝胶的总病毒效价下，测试树脂D的试验升级纯化轮次产生相当的步骤产率(75.6％)和低HCD水平(0.15ng/剂量)，显示出测试树脂D凝胶的可升级性。这些结果在与CS XK-50柱轮次比较时显示，测试树脂D柱洗出液的HCD水平比CS柱洗出液低两倍。
表47采用ca A/South Dakota的CS和FluSelect 4XK-50柱纯化的比较
Figure BPA00001373558001582
log10FFU/mL凝胶
总共筛选6个测试树脂并进行病毒纯化评价。评价包括对步骤产率、结合容量和杂质水平的评价。测试树脂C和D相对于其它4种测试树脂具有较好的结合容量、较高的步骤产率和较低的杂质HCD水平。测试树脂B和F的步骤产率太低，不考虑用于商业规模的制备。测试树脂A和E的结合容量略高于测试树脂C和D或与测试树脂C和D相当；然而在较高病毒加载量下，步骤产率没有测试树脂C和D高，杂质HCD增加到高得多的水平。比较测试树脂C和D，在加载较高量病毒时，虽然观察到测试树脂C的步骤产率较好，测试树脂D显示具有较高的结合容量和对HCD水平的较小影响。这表明测试树脂C和D是可考虑用于商业规模纯化的色谱凝胶。相比Cellufine硫酸酯凝胶，对测试树脂C和D的包括结合容量、步骤产率和柱洗出液中宿主细胞DNA水平在内的进一步性能评价显示，测试树脂D优于测试树脂C，因此将其选作CS的替代物用于进一步放大评价。根据对4个不同病毒批次的评价，测试树脂C和D的动态结合容量高出约2倍(在一些批次中)或至少与Cellufine硫酸酯相当。与测试树脂C相比，测试树脂D具有类似或较高的结合容量。就步骤产率和宿主细胞DNA水平而言，测试树脂D的产率在较高病毒加载量条件下与测试树脂C相比类似，但通常高于CS。病毒加载增加时，测试树脂D和CS凝胶的洗出液HCD水平的升高类似，但测试树脂C对洗出液HCD水平升高的影响更为明显。受评价的所有批次中测试树脂D洗出液的HCD水平均与CS相当。最后，测试树脂D XK-50柱轮次的试验放大评价显示纯化产率和洗出液中的低宿主DNA水平，表明具有可升级性和用作基于细胞培养的Flu方法制备的替代性色谱凝胶的潜能。
8.8RSV纯化
过滤器和筒
1)8μm Sartopure PP2标称过滤器
2)3μm Sartopure PP2标称过滤器
3)0.65μm Sartopure PP2标称过滤器
4)3.0/0.8μm Sartoclean CA膜过滤器
5)0.45μm Millipak 100PVDF过滤器
6)UF/DF中空纤维筒，500Kda膜孔径，腔内径可为0.5mm或1.0mm，通道长度可在30-60cm变化
化学品
1)蔗糖
2)Tris.Cl
3)KCl
4)KH2PO4
5)K2HPO4
6)NaCl
7)KCl
8)EDTA
9)海藻糖
10)SFM4MegaVir
11)柠檬酸钠
12)柠檬酸钾
13)Benzonase
14)NaOH
15)NaOCl
设备
1)包括加热单元的波混合器(波生物技术公司(Wave Biotech)，模型#20/50EH)
2)10L Stedim包(目录号FBP10381)
3)酸坛
4)移液器
5)瓶(250mL，1L纳尔金)
6)GE Flex Stand
7)泵(WB公司520S，620Di)
8)天平(萨托瑞斯公司(Sartorius)，模型#EB60EDE-1；萨托瑞斯公司，模型#CP4202S)
RSV纯化方法描述流程图
Figure BPA00001373558001601
Figure BPA00001373558001611
方法
1)在Vero细胞中培养RSV(例如rA2cp248/404/1030ΔSH)病毒。现有的生产平台采用10L生物反应器。病毒收获物(VH)包含SFM4MegaVir感染培养基(海克隆公司)。
2)将病毒收获病毒合并在10L Stedim包中，通过8或3μm过滤器在15psi的进料压力下过滤，加载量对于3μm过滤器的有效过滤面积(EFA)为4-5mL VH/cm2，8μm过滤器的EFA为27mL VH/cm2。收集滤液并置于10L Stedim包中称重。
3)用50U/mL Benzonase在32±3℃将澄清病毒收获物处理3小时。在30转/分钟(rpm)以3°的角度摇动收获物。
4)通过0.65μm萨托瑞斯公司的Sartopure PP2过滤器过滤澄清的Benzonase处理的VH，加载量为16-18mL澄清的Benzonase处理的VH/cm2过滤器EFA。
a.然后用包含36mM TrisCl、214mM蔗糖和150mM NaCl或KCl的稳定缓冲液稳定0.65μm滤液。
5)将稳定滤液储存过夜(16±3小时)并用作超滤(浓缩)步骤的原材料。
6)采用GE医疗保健公司的腔内径为0.5-1mm的500kDa中空纤维筒进行超滤步骤。加载在筒上的稳定0.65μm滤液为10mL/cm2膜面积。采用15psi的操作跨膜压力(TMP)和12000秒-1的剪切速率将原料浓缩5倍。
7)用渗滤缓冲液对浓缩材料进行渗滤(根据浓缩物体积进行8-10倍缓冲液交换)。交换缓冲液包含Tris(5mM)、蔗糖(25％w/v)、NaCl(150mM)，pH 7.2。
8)使渗滤材料以4-5mL/cm2的加载量通过终端过滤器(0.45μmMillipak过滤器)。滤液为最终批量物(药物物质)，将其等分到瓶中。在甲醇干冰浴中或采用控制速率冰箱快速冷冻所有RSV病毒药物物质等份。
尽管已经出于清楚和理解的目的在某种程度上详细地描述了本发明，但是本领域技术人员通过阅读本说明书可清楚地了解，可在不背离本发明真实范围的情况下进行各种形式和细节的变化。例如，上述所有的技术和设备都可以各种组合联用。本申请中提到的所有公开出版物、专利、专利申请或其它文献均通过引用全文纳入本文中用于所有目的，具有与所述各单独的公开出版物、专利、专利申请或其它文献均独立地通过引用纳入本文用于所有目的一样的相同程度。此外，以下美国临时专利申请：2006年9月16日提交的60/845,121、2006年12月22日提交的60/871,721、2007年5月9日提交的60/917,008、2007年7月25日提交的60/951,813、2008年9月24日提交的61/099,749、2008年10月13日提交的61/104,933、2008年12月15日提交的61/122,456、2009年6月17日提交的61/187721和2007年9月14日提交的美国专利申请11/855,769均通过引用全文纳入本文。

Claims (16)

1.一种在细胞培养物中产生流感病毒达到log10TCID50/mL至少8.0和/或log10FFU/mL至少8.0的方法，包括：
(a)在无血清培养基MediV SFM109或MediV SFM110中于微载体上增殖贴壁MDCK细胞，同时保持选自下组的一种或多种培养条件：在100到200rpm之间的搅拌速率、在6.0到7.8之间的pH、在33℃到42℃之间的温度和在35%到100%之间的溶氧(DO)；
(b)用流感病毒感染增殖MDCK细胞而不交换培养基；和
(c)在允许流感病毒复制的条件下温育感染的增殖MDCK细胞；
其中MediV SFM109和MediV SFM110如下配制：
Figure FDA0000406046030000011
Figure FDA0000406046030000021
Figure FDA0000406046030000031
其中葡萄糖以至少4.5g/L的终浓度存在并可补充至终浓度最高达9.0g/L。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微载体的浓度在1-3g/L之间，且所述MDCK细胞以10-40个细胞/微载体的密度接种到所述微载体上并增殖2-5天。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述MDCK细胞来自保藏为ATCC登录号PTA-7909或PTA-7910的细胞系。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述MDCK细胞增殖达到5x105-3x106个细胞/mL的细胞密度。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，采用0.01x103FFU/mL-0.05FFU/mL的病毒输入量实施步骤(b)。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，采用0.00001FFU/细胞-0.00005FFU/细胞的病毒输入量实施步骤(b)。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述流感病毒包含流感毒株ca A/Ann Arbor/6/60或流感毒株ca B/Ann Arbor/1/66的一个或多个基因区段。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(c)的流感病毒复制过程中在33±2℃温育所述MDCK细胞。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述MDCK细胞在150rpm-200rpm之间的搅拌速率下温育。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述MDCK细胞在7.0到7.8之间的pH下温育。
11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(c)的流感病毒复制过程中存在蛋白酶。
12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括在感染48小时到72小时之后收获培养基的步骤。
13.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述MDCK细胞在无血清培养基MediV SFM109中增殖。
14.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述MDCK细胞在无血清培养基MediV SFM110中增殖。
15.一种细胞培养组合物，其含有无血清培养基，所述无血清培养基是MediV SFM109，其如下配制：
Figure FDA0000406046030000041
Figure FDA0000406046030000061
Figure FDA0000406046030000071
其中葡萄糖以至少4.5g/L的终浓度存在并可补充至终浓度最高达9.0g/L。
16.一种细胞培养组合物，其含有无血清培养基，所述无血清培养基是MediV SFM110，其如下配制：
Figure FDA0000406046030000072
Figure FDA0000406046030000091
其中葡萄糖以至少4.5g/L的终浓度存在并可补充至终浓度最高达9.0g/L。
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