CN102206270A - 石房蛤毒素人工抗原和抗体及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种石房蛤毒素人工抗原和抗体及其制备方法和应用，是采用碳化二亚胺法，将石房蛤毒素STX上的氨基与载体蛋白卵清白蛋白OVA上的羧基相连，采用梯度法透析后得到高纯度的石房蛤毒素免疫抗原STX-OVA。将获得的人工抗原去制备石房蛤毒素的多克隆抗体，而制备的多克隆抗体可用于制备石房蛤毒素的酶联免疫检测试剂盒。本发明成功合成了石房蛤毒素人工抗原STX-OVA和STX-BSA，将制备的免疫抗原免疫BALB/c小鼠，可得到效价高、特异性强的多克隆抗体，利用建立的酶联免疫分析方法制备的试剂盒可用于石房蛤毒素的快速检测。

Description

石房蛤毒素人工抗原和抗体及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于免疫分析技术领域，具体涉及到一种石房蛤毒素人工抗原和抗体及其制备方法和ELISA检测试剂盒的制备和应用。

背景技术

目前，麻痹性贝类毒素(Paralytic shellfish poison，PSP)已成为世界上分布范围最广、发生频率最高、危害程度最大的一类海洋生物毒素，它通过影响钠离子通道而抑制神经的传导。而石房蛤毒素(Saxitoxin，STX)为麻痹性贝类毒素的主要成分之一，是四氢嘌呤的一种衍生物，其外部形态是呈白色、吸湿性很强的固体，溶于水，微溶于甲醇和乙醇。STX及天然衍生物所构成的PSP有很高的致死率，STX对成年人轻度中毒量为110μg，致死剂量为540～1000μg，LD₅₀为9μg/kg(小鼠，ip)。

贝类毒素的分析方法主要有小鼠生物测试法、HPLC法及免疫方法等。小鼠生物测试法是是国际上都能接受的唯一的方法。该方法在检测样本总毒性方面相当成功，但此种方法不能确知毒素的组成及含量，且重复性差，灵敏度不高。近几年发展起来的HPLC法及其联用技术，具有灵敏、高效的特点，能够提供更多的毒素信息，是PSP毒素检测的主要手段，但存在成本高，费时，需要较高的仪器设备及分析技术等缺点。而酶联免疫吸附测定技术(ELISA)具有简便、快速、灵敏、成本低廉等特点，ELISA法与传统的动物生物法及色谱方法相比较，更快速经济，可以满足大批量样品的快速筛查需要。

国内对麻痹性贝毒中的膝沟藻毒素(gonyautoxin，GTX)研究的比较多，暨南大学的向军俭制备了抗麻痹性贝毒素GTX2，3的单克隆抗体，同时也比较了间接竞争和直接竞争ELISA方法的灵敏度和检出限。但对STX的酶联免疫吸附法研究还没有开展。

发明内容

本发明的目的在于提供一种石房蛤毒素人工抗原和抗体及其制备方法和ELISA检测试剂盒的制备和应用，将制备的抗体用于石房蛤毒素的检测，以弥补现有技术的不足。

制备抗体的关键是制备人工免疫抗原，因为石房蛤毒素是一种相对分子质量只有299的小分子半抗原，没有抗原性，不能刺激动物体产生相应的抗体，需要和某种大分子的物质偶联形成完全抗原，小分子的半抗原就成为新的偶联物的抗原决定簇，这样小分子物质就具有了抗原性。而制备人工抗原要选择合适 的载体蛋白，本发明选择碳化二亚胺法，载体蛋白选用卵清白蛋白(OVA)，将石房蛤毒素上的氨基与卵清白蛋白(OVA)上的羧基相连，采用梯度法透析后得到高纯度的石房蛤毒素免疫抗原STX-OVA。同时本发明还选择用牛血清白蛋白(BSA)来制备包被抗原STX-BSA，在制备ELISA试剂盒时需要用包被抗原包被酶标板。

本发明的技术方案如下：

一、免疫抗原STX-OVA，其结构式为：

免疫抗原STX-OVA和包被抗原STX-BSA的制备方法为：

利用碳化二亚胺法，碳化二亚胺是一种化学性质非常活跃的双功能试剂，它们既可与半抗原上的羧基又可与半抗原上的氨基缩合。碳化二亚胺先于石房蛤毒素上的氨基结合，再加入载体蛋白，石房蛤毒素上的氨基与体蛋白上的羧基相连，形成酰胺键，形成新的复合物，同时碳化二亚胺从复合物上脱落。反应中加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)作为催化剂，可以加速反应的进行。反应完后梯度透析得到石房蛤毒素人工抗原。制备步骤如下：

(1)将石房蛤毒素(STX)溶于二甲基亚砜(DMSO)中配制成0.1μg/μL的STX母液；将水溶性碳化二亚胺(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和卵清白蛋白(OVA)用0.01M磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.5)分别配制成1mg/mL的工作液；

(2)取100μL STX母液，加入20μL EDC工作液和12μL NHS工作液，STX、EDC、NHS反应的摩尔比为1∶2-3∶1-2，室温震荡反应3h，获得最初反应液；

(3)载体蛋白选择卵清白蛋白(OVA)和牛血清白蛋白(BSA)，OVA作为免疫抗原载体，BSA作为包被抗原载体，用0.01M磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.5)将两种载体蛋白配成1mg/mL的工作液。

(4)STX和载体蛋白反应的最佳摩尔比为10∶1；将(2)步骤中的反应物加入到100μL的载体蛋白工作液中，4℃震荡反应12h，获得最终反应液；

(5)将上述的最终反应液转移到透析卡中，用300mL 0.01M pH7.5的PBS缓冲液和DMSO的混合液透析72h，每12h换液1次，透析采用梯度透析法，透析完后取出反应物，-20℃保存。得到免疫抗原STX-OVA和包被抗原 STX-BSA。

其中STX∶EDC∶NHS反应的最佳摩尔比为1∶3∶2，STX和卵清白蛋白反应的最佳摩尔比为10∶1。

二、石房蛤毒素多克隆抗体的制备

用STX-OVA作为抗原来制备抗体，制备步骤如下：

免疫6周龄的雌性BALB/c小鼠，首次免疫用200μL STX-OVA(含5μg STX)与等体积弗氏完全佐剂，充分乳化后制成乳浊液，腹腔注射小鼠，之后每隔两周取同量STX-OVA与等体积弗氏不完全佐剂充分乳化，腹腔注射。免疫三次后取尾血测定小鼠血清效价，若效价不高，继续免疫。待效价大于要求值后，杀死小鼠取血，取出的血室温放置30min，8000r/min离心20min，取上层血清，用蛋白A抗体离心纯化试剂盒纯化血清，-20℃保存待用。

三、石房蛤毒素多克隆抗体效价的测定

用间接竞争ELISA法测多克隆抗体的效价。

四、酶联免疫分析方法的建立

用方阵滴定法确定包被抗原、多克隆抗体和酶标二抗工作浓度，分别配制不同浓度的STX标准溶液，浓度分别为0ng/mL、1ng/mL、10ng/mL、100ng/mL、1000ng/mL、10000ng/mL。进行间接竞争ELISA测定，制作抑制曲线。

五、石房蛤毒素的ELISA试剂盒

依间接竞争ELISA原理研制而成，包括：

a、ELISA板条：每个试剂盒含4块真空包装的ELISA板，每块板含包被抗原包被的可拆卸的ELISA微孔板条，规格为8孔×12条；

b、洗涤液PBST：10倍浓缩的pH为7.4的含0.1％吐温20的0.01M PBS溶液200mL；

c、封闭液：10倍浓缩的pH为7.4的含3％牛血清白蛋白的0.01M PBS溶液200mL；

d、石房蛤毒素多克隆抗体血清5mL；

e、辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG(酶标二抗)1mL；

f、底物显色液50mL：配制方法为取50μL TMB(10mgTMB溶于1mLDMSO中)溶液+10mL底物缓冲液十10μL 30％过氧化氢，混匀；底物缓冲液的配制为称取柠檬酸19.2g加水至1000mL，为甲液；称取磷酸氢二钠71.7g，加水至1000m L，为乙液；取甲液24.3mL，乙液25.7mL，加水至100mL即为底物缓冲液；

g、终止液：2M硫酸溶液50mL；

h、石房蛤毒素标准抗原液1mL(9.65μM/L)。

本发明成功合成了石房蛤毒素人工抗原STX-OVA和STX-BSA，步骤简洁有效，完全可以用于免疫分析中。将制备的免疫抗原免疫BALB/c小鼠。可得到效价高、特异性强的多克隆抗体。建立的酶联免疫分析方法可用于贝类中石房蛤毒素的定性和半定量分析。依据建立的酶联免疫分析方法和制备的抗体等制备的石房蛤毒素的ELISA试剂盒可用于石房蛤毒素的快速检测。

具体实施方式

实施例1免疫抗原的制备

将100μg石房蛤毒素(STX)溶于1mL二甲基亚砜(DMSO)中，配成0.1μg/μL的母液；将水溶性碳化二亚胺(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、卵清白蛋白(OVA)用0.01M磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.5)配成1mg/mL的工作液；取100μL STX母液，加入20μL EDC和12μL NHS工作液，室温震荡反应3h；将上述步骤中的反应物加入到100μL OVA溶液中，4℃震荡反应12h；将上述反应物转移到透析卡中，用300mL pH7.5的PBS缓冲液和DMSO的混合液透析72h，每12h换液1次，透析采用梯度透析法，第一次透析的溶液中PBS缓冲液和DMSO的体积比为100∶4-5，第二次透析的体积比为100∶3-4，第三次透析的体积比为100∶2-3，第四次透析的体积比为100∶1-2，第五次透析的体积比为100∶0.5-1，以后透析的溶液不加DMSO。透析完后取出反应物，-20℃保存。

在制备抗原的过程中发明人对STX∶EDC∶NHS反应的不同摩尔比进行了分析，选择了1∶1-10∶1-10的范围进行分析，结果发现，当STX∶EDC∶NHS的摩尔比为1∶3∶2时，制备抗原的效率最高，STX-OVA的产率达到了80％，当EDC和NHS的配比低于最佳配比的时候，会造成反应不完全；当配比高于1∶3∶2时，又会造成原料的浪费。

实施例2包被抗原的制备

将100μg石房蛤毒素(STX)溶于1mL二甲基亚砜(DMSO)中，配成0.1μg/μL的母液；将水溶性碳化二亚胺(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、牛血清白蛋白(BSA)用0.01M磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.5)配成1mg/mL的工作液；取100μL STX母液，加入20μL EDC和12μL NHS工作液，室温震荡反应3h；将上述步骤中的反应物加入到100μL BSA溶液中，4℃震荡反应12h；将上述反应物转移到透析卡中，用300mL pH7.5的PBS缓冲液和DMSO的混合液透析72h，每12h换液1次，透析采用梯度透析法，第一次透析的溶液中PBS缓冲液和DMSO的体积比为100∶4-5，第二次透析的体积比为100∶3-4，第三 次透析的体积比为100∶2-3，第四次透析的体积比为100∶1-2，第五次透析的体积比为100∶0.5-1，以后透析的溶液不加DMSO。透析完后取出反应物，-20℃保存。

实施例3石房蛤毒素多克隆抗体的制备

选择6周龄的雌性BALB/c小鼠作为免疫动物，将免疫抗原解冻后用生理盐水稀释。首次免疫用200μL STX-OVA(含5μg STX)与等体积弗氏完全佐剂，充分乳化后制成乳浊液，腹腔注射小鼠，之后每隔两周取同量STX-OVA与等体积弗氏不完全佐剂充分乳化，腹腔注射。免疫三次后取尾血测定小鼠血清效价，若效价不高，继续免疫。待效价大于要求值后取血，室温放置30min，8000r/min离心20min，取上层血清，用蛋白A抗体离心纯化试剂盒纯化血清，-20℃保存待用。

实施例4石房蛤毒素多克隆抗体效价的测定

用间接竞争ELISA法测其效价

包被：用制备的STX-BSA偶联物作为包被抗原，用0.05M碳酸盐缓冲液(pH9.6)稀释适当浓度添加到96孔酶标板中，每孔100μL，4℃过夜；弃去残液，用PBS-T(含0.1％的Tween20)洗涤4次并拍干；

封闭：用3％的BSA溶液封闭，37℃温育1h，弃去封闭液，洗板4次拍干；

加多抗：加入适当稀释的多克隆多抗和阴性对照小鼠的血清，每孔100μL，37℃温箱中孵育1h；洗板4次并拍干；

加二抗：加入适当稀释的辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG(酶标二抗)，每孔100μL，37℃孵育1h；洗板5次并拍干；

显色：每孔加TMB底物显色溶液100μL，37℃避光显色30min；加50μL 2mol/l的H₂SO₄中止反应，450nm波长测量OD值(吸光值)。

免疫4次后小鼠的效价测定如下：

表1不同稀释倍数STX-OVA免疫多克隆多抗的OD值

以阳性血清的OD值大于阴性的2倍为参照，小鼠血清效价达到3000。间接竞争ELISA法测其效价的实验证明小鼠体内产生了抗石房蛤毒素的抗体，同时也证明了人工抗原合成成功。

实施例5建立间接竞争酶联免疫吸附方法(idc-ELISA)分析STX

96孔板的包被和封闭同实施例4中多抗的效价测定；

测定时每孔加入50μL适当稀释的多克隆多抗，再加入50μL STX标准溶液 或待测样品溶液，混匀，37℃孵育1h，洗板4次并拍干；

加入适当稀释的酶标二抗，每孔100μL，37℃孵育1h，洗板5次并拍干；

每孔加TMB底物溶液100μL，37℃显色30min，加50μL 2mol/l的H₂SO₄中止反应，450nm波长测量OD值。

实施例6方阵滴定法确定包被抗原、多克隆抗体和酶标二抗工作浓度

通过间接竞争ELISA测定，用方阵滴定法确定包被抗原、多克隆抗体和酶标二抗工作浓度。依据OD450nm值在1.0左右选择三者的最佳工作浓度。以1、2、3μg/mL 3个质量浓度的STX包被酶标板。首先确定包被抗原的浓度，多抗的工作浓度选择1∶200、1∶400、1∶800、1∶1600、1∶3200，二抗浓度选择在1∶3000。

结果如表2：

从上表可见，包被抗原的浓度为2μg/mL时酶标孔的OD值最大，故实验采用2μg/mL为包被抗原的工作浓度。

确定了包被抗原的最佳浓度后，再确定多抗和二抗的工作浓度，二抗的工作浓度选择为1∶200、1∶400、1∶800、1∶1000、1∶3000、1∶5000、1∶8000。结果如表3：

从上表可见，选择OD值在1.0左右的组合，即多抗的稀释比为1∶800，酶标二抗稀释比1∶1000

实施例7间接竞争ELISA抑制曲线的制作

分别配制不同浓度的STX标准溶液，浓度分别为0ng/mL、1ng/mL、10 ng/mL、100ng/mL、1000ng/mL、10000ng/mL。按照实施例4确定的反应最佳工作浓度进行间接竞争ELISA测定，制作抑制曲线。其中无STX时的OD450值为B₀，各相应质量浓度的STX的OD450值为B，抑制率(B₀-B)/B₀与1gC_STX成线性回归关系，从而可计算出回归曲线的方程与相关系数。从而可计算出抑制曲线的方程与相关系数。将待测样品按照间接竞争ELISA方法测其OD值，带入抑制曲线中，可以算出样品中的STX的含量。结果如表4

STX间接竞争ELISA抑制曲线结果

线性回归直线方程为y＝0.1366x-0.0151，R²＝0.9901。以产生半数抑制时的毒素浓度(IC50)表示该方法的灵敏度，抑制率到达50％时，该方法的灵敏度在5.0μg/mL左右。检出范围按照抑制率的20％-80％确定，由得出的公式算出抑制率在20％时STX浓度大约在37ng/mL左右，抑制率为80％时STX浓度大约在926μg/mL，检出范围大约在37ng/mL-1000μg/mL之间。

实施例8制备含包被抗原包被的ELISA微孔板条

将实施例2中获得的包被抗原用0.05M碳酸盐缓冲液(pH9.6)稀释成2μg/mL，加到96孔酶标板中，每孔100μL，4℃过夜；弃去残液，用洗涤液PBS-T(含0.1％的Tween20)洗涤4次并拍干；用含3％BSA的PBS溶液封闭，37℃温育1h，弃去封闭液，洗板4次拍干。

实施例9底物显色液的配制

底物显色液50mL：配制方法为取50μL TMB(10mgTMB溶于1mLDMSO中)溶液+10mL底物缓冲液十10μL 30％过氧化氢，混匀；底物缓冲液的配制为称取柠檬酸19.2g加水至1000mL，为甲液；称取磷酸氢二钠71.7g，加水至1000mL，为乙液；取甲液24.3mL，乙液25.7mL，加水至100mL即为底物缓冲液。

实施例10石房蛤毒素ELISA检测试剂盒的制备

利用前述实施例中的包被抗原、多克隆抗体等物质，以间接竞争ELISA实验结果为依据，制备石房蛤毒素ELISA检测试剂盒。包括：

a、ELISA板条：每个试剂盒含4块真空包装的ELISA板，每块板含包被抗原包被的可拆卸的ELISA微孔板条，规格为8孔×12条；

b、洗涤液PBS-T：10倍浓缩的pH为7.4的含0.1％(体积分数)吐温20的PBS溶液200mL；

d、石房蛤毒素多克隆抗体血清5mL；

e、辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG(酶标二抗)1m L(市售)；

f、底物显色液50mL；

g、终止液：2M硫酸溶液10mL；

h、石房蛤毒素标准抗原液1mL(9.65μM/L)；

g、稀释液：0.01M pH为7.4的PBS溶液500mL。

样品检测的基本步骤为：

1用稀释液将多克隆抗体血清、酶标二抗、石房蛤毒素标准抗原液稀释到使用的浓度。

2测定时ELISA酶标孔每孔加入50μL稀释的多克隆抗体，再加入系列浓度的50μL石房蛤毒素标准溶液或待测样品溶液，混匀，37℃孵育1h，洗板4次并拍干；

3加入稀释的酶标二抗，每孔100μL，37℃孵育1h，洗板5次并拍干；

4每孔加底物显色液100μL，37℃显色30min，加50μL 2M的H₂SO₄中止反应，450nm波长测量OD值。

Claims (9)

1.一种石房蛤毒素人工抗原，为石房蛤毒素人工抗原STX-OVA，其结构式为：

2.如权利要求1所述的石房蛤毒素人工抗原的制备方法，其特征在于是将石房蛤毒素上的氨基与卵清白蛋白OVA上的羧基相连得到石房蛤毒素人工抗原，包括以下步骤：

(1)将石房蛤毒素STX溶于二甲基亚砜DMSO中，配成0.1μg/μL的STX母液；将水溶性碳化二亚胺EDC和N-羟基琥珀酰亚胺NHS用0.01M pH7.5磷酸盐缓冲液PBS，分别配制成1mg/mL相应工作液；

(2)取100μL STX母液，加入20μL EDC工作液和12μL NHS工作液，室温震荡反应3h制成最初反应液；

(3)用0.01M pH7.5的PBS缓冲液将卵清白蛋白配成1mg/mL的卵清白蛋白工作液；

(4)将步骤(2)中的最初反应液加入到100μL卵清白蛋白工作液中，震荡反应12h获得最终反应液；

(5)将上述的最终反应液转移到透析卡中，用300mL 0.01M pH7.5的PBS缓冲液和DMSO的混合液透析72h，每12h换液1次，透析完后取出反应物即制得石房蛤毒素人工抗原。

3.如权利要求2所述的石房蛤毒素人工抗原的制备方法，其特征在于STX∶EDC∶NHS反应的摩尔比为1∶3∶2。

4.如权利要求2所述的石房蛤毒素人工抗原的制备方法，其特征在于上述的透析是采用梯度透析法，第一次透析的溶液中PBS缓冲液和DMSO的体积比为100∶4-5，第二次透析的体积比为100∶3-4，第三次透析的体积比为100∶2-3，第四次透析的体积比为100∶1-2，第五次透析的体积比为100∶0.5-1，以后透析的溶液不加DMSO。

5.权利要求1所述的石房蛤毒素人工抗原用于制备石房蛤毒素抗体。

6.如权利要求5所述的石房蛤毒素抗体，其特征在于是用石房蛤毒素人工抗原STX-OVA作为免疫抗原免疫小鼠，分离纯化血清得到的石房蛤毒素多克隆抗体。

7.权利要求6所述的石房蛤毒素抗体的制备步骤如下：用STX-OVA免疫6周龄的雌性BALB/c小鼠，首次免疫用200μL STX-OVA与等体积弗氏完全佐剂，充分乳化后制成乳浊液，腹腔注射小鼠，之后每隔两周取同量STX-OVA与等体积弗氏不完全佐剂充分乳化，腹腔注射；免疫三次后取尾血测定小鼠血清效价，若效价不高，继续免疫；待效价大于要求值后取血，室温放置30min，8000r/min离心20min，取上层血清，用蛋白A抗体离心纯化试剂盒纯化血清，得到石房蛤毒素多克隆抗体。

8.权利要求6所述的石房蛤毒素多克隆抗体应用于制备石房蛤毒素的酶联免疫检测试剂盒。

9.如权利要求8所述的检测石房蛤毒素的ELISA试剂盒，其特征在于：所述试剂盒依间接竞争ELISA原理研制而成，包括：

a、ELISA板条：每个试剂盒含4块真空包装的ELISA板，每块板含包被抗原包被的可拆卸的ELISA微孔板条，规格为8孔×12条；

b、洗涤液PBS-T：10倍浓缩的pH为7.4的含0.1％体积分数的吐温20的PBS溶液200mL；

c、纯化的石房蛤毒素多克隆抗体血清5mL；

d、辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG酶标二抗1mL；

e、底物显色液50mL：配制方法为取50μL TMB溶液+10mL底物缓冲液十10μL 30％过氧化氢，混匀；底物缓冲液的配制为称取柠檬酸19.2g加水至1000mL，为甲液；称取磷酸氢二钠71.7g，加水至1000m L，为乙液；取甲液24.3mL，乙液25.7mL，加水至100mL即为底物缓冲液；

f、终止液：2M硫酸溶液10mL；

g、石房蛤毒素标准抗原液1mL，浓度为9.65μM/L；

h、稀释液：0.01M pH为7.5的PBS溶液500mL。