CN102105156A - 连接有治疗活性剂和血管生成靶向部分的聚合物的新型缀合物及其在治疗血管生成相关疾病中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了包括连接有血管生成靶向部分和治疗活性剂如抗癌药或抗血管生成剂的聚合物的缀合物及其制备方法。本发明还公开了含有这些缀合物的药物组合物及其在治疗血管生成相关医学状况例如癌症和癌症转移中的用途。

Description

连接有治疗活性剂和血管生成靶向部分的聚合物的新型缀合物及其在治疗血管生成相关疾病中的用途
发明领域和背景
本发明在一些实施方案中涉及新型化学缀合物及其在治疗和诊断中的用途，更尤其，但不仅仅涉及连接有血管生成靶向部分和抗血管生成剂的聚合物的新型缀合物及其在监测和治疗与血管生成有关的医学状况中的用途。
血管生成是包括从先前存在的血管萌发新血管的生物学过程，并且在疾病发生和进展中起着重要的作用。血管生成是其中内皮细胞充当血管扩张的结构单元的复杂过程。该过程牵涉到在细胞、生长因子和细胞外膜（ECM）组分之间的广泛相互作用。它通过促血管生成和抗血管生成分子之间的精密平衡来调节。
病理性血管生成已经在几种疾病中被证明，包括动脉粥样硬化、癌症、高血压、类风湿性关节炎、糖尿病和糖尿病相关并发症，例如糖尿病性视网膜病。肿瘤生长和转移尤其取决于血管生成的程度。肿瘤血管生成是穿透到癌瘤中以便供给营养物和氧并除去废物的血管网络的增殖，因此导致肿瘤生长。肿瘤血管生成包括致癌基因的激素刺激和激活，血管生成生长因子的表达，血浆蛋白的外渗，临时ECM的沉积，ECM的降解，以及内皮毛细血管的迁移、增殖和伸长。
进一步的血管扩张的抑制因此是活跃的癌症治疗研究的焦点。已经开发了许多药物，其以该多步肿瘤血管生成过程中的不同步骤为靶的。然而，大多数这些药物表明是抑制细胞生长的，而非细胞毒性的，因此没有在治疗的第一阶段中大幅度削减肿瘤体积。
目前有八种批准的具有公认的抗血管形成性质的抗癌治疗剂。中断肿瘤血管生成和生长中所牵涉的关键性的细胞信号传导途径的这些药剂可以分为两个主要类别：(1)针对特异性促血管生成因子和/或它们的受体的单克隆抗体；(贝伐单抗，爱必妥，帕尼单抗，赫赛汀)和(2)多种促血管生成生长因子受体的小分子酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)(特罗凯，多吉美，索坦，易瑞沙)。mTOR (雷帕霉素的哺乳动物靶的)的抑制剂代表了抗血管生成治疗的第三个较小的类别，其具有一种目前批准的药剂(驮瑞塞尔)。另外，至少两种其它批准的血管生成剂可间接地通过未完全了解的机制抑制血管生成(万珂，沙利度胺/ Celgene)。
第一个FDA批准的血管生成抑制剂，贝伐单抗(阿瓦斯汀，Genentech)，血管内皮细胞生长因子的单克隆抗体(VEGF)，最近已被批准与标准的常用化疗联合用于转移性结肠癌治疗。
阻断血管生成的最大的一类药物是以VEGF受体(VEGFR)为靶点的多靶向酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)。这些药物如舒尼替尼 (索坦，Pfizer)、索拉非尼(多吉美，Bayer/Onyx Pharmaceuticals)和厄罗替尼(特罗凯，Gennentech/OSI/Roche)具有攻击多个靶点、适于口服给药和成本有效性的优点。虽然这些药物显示出有前景的功效，但它们的使用受到缺乏靶专一性的限制，这导致了出乎意外的毒性 [Cabebe等人, Curr Treat Options Oncol 2007; 8:15-27]。
肿瘤内皮细胞是长期药物敏感的，且可以按照“抗血管生成给药方案”用细胞毒性药物处理。该给药方案包括以密集间隔以充分低于最大耐受剂量（MTD）的低剂量化疗给药达延长时间（“节律给药”）。结果，应该避免急性毒性，该药物可以长时间给药，最后将癌症转化为慢性易控制的疾病。
微管干扰剂紫杉醇(PTX)是作为单一疗法和在联合治疗中使用的临床上公认的且高度有效的抗肿瘤药物，主要用于治疗前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌和非小细胞肺癌，并且它是治疗转移性乳腺癌的药物选择。它还显示了抗血管生成和促凋亡性质 [Oldham等人, 2000 Int. J Oncol. 16:125-132]。然而，由于该药物的疏水性，增溶剂如Cremophor EL或乙醇是其给药所需要的。PTX引起严重的不良副作用例如中性粒细胞减少、神经病以及在cremophor EL中溶解时引起超敏反应。另外，仅仅少量的该药物定位在肿瘤上，该药物是外排泵尤其P-糖蛋白的底物，导致多重耐药性。
水溶性的共聚物如甲基丙烯酸羟丙酯(HPMA)和PGA是能够特异性输送到肿瘤组织中的生物相容性、非免疫原性和无毒的载体(Satchi-Fainaro等人，Nat Med 2004; 10:255-261) 。这些大分子不通过正常血管扩散，而是选择性在肿瘤部位积累，因为其具有增强渗透性和保留(EPR)效应。在许多实性肿瘤中对于大分子药剂和脂质观察到了通过高渗透型新血管系统的被动扩散和在肿瘤间质组织中局部化的这种现象。
已经提出了抗癌症药物与共聚物如HPMA或PGA缀合，以便限制药物通过血脑屏障和延长循环半衰期，因此通过以比游离药物更长的循环时间使细胞暴露于缀合的药物而抑制肿瘤内皮和上皮细胞生长。
美国专利No. 6,884,817教导了包括缀合于水溶性聚氨基酸或可溶性金属螯合剂的化疗药物和/或抗血管生成药物的组合物。所教导的组合物提供了水溶性紫杉烷类（taxoids），其克服了与药物本身的不溶解性有关的缺陷，此外改进了药物至肿瘤组织的输送和影响缀合药物的控制释放。根据美国专利No. 6,884,817的教导，与单独的抗肿瘤药紫杉醇相比，示例性的这种抗癌药物紫杉醇和聚谷氨酸的缀合物显示出优异的抗肿瘤活性与减低的毒性水平。
缀合物紫杉醇-聚谷氨酸 OPAXIO™ (paclitaxel poliglumex, CT-2103) (以前称为XYOTAXTM) 在III期试验中显示了有前景的结果，目前正在就市场批准进行评价。
具有公开号 2008/0279778的美国专利申请No. 12/117,678也教导了用于药物靶向、稳定化和成像应用的与许多药物缀合的聚谷氨酸聚合物。紫杉醇的HPMA共聚物缀合物也已经由Meerum Terwogt等人进行了描述。[Anticancer drugs 2001; 12:315-323]。该缀合物目的在于改进药物溶解度并提供紫杉醇的控制释放。在该缀合物中，该紫杉醇通过酯键连接于HPMA共聚物，因此，通过酯键的非组织特异性水解或酶促（酯酶）降解而由该聚合物释放，从而诱发了通常观察到的紫杉醇的毒性。
WO 03/086382教导了水溶性聚合物和抗血管生成剂TNP-470的缀合物以及它们作为抗肿瘤剂的用途，尤其它们作为TNP-470进入肿瘤血管的载体的用途和它们对TNP-470的神经毒性的影响。根据WO 03/086382的教导，示例性的这种缀合物HPMA-(TNP-470)缀合物（caplostatin）与单独的TNP-470相比显示出优异的抗肿瘤活性与减低的毒性水平。
WO 03/086178教导了一种方法，通过给药有效量的抗血管生成化合物或经由稳定紧密连接的复合物和增加与基膜接触而能够增加细胞-细胞接触的化合物，减轻或抑制与血管渗透性过高有关的病症。WO 03/086178所教导的化合物是内皮抑素，凝血栓蛋白，血管生长抑素，肿瘤抑素（tumastatin），抑制蛋白（arrestin），重组EPO，以及聚合物缀合的TNP-470。根据WO 03/086178的教导，示例性的这种缀合物，在体外和体内，HPMA-(TNP-470)抑制了血管内皮细胞生长因子(VEGF)诱导的血管渗透性过高且抑制内皮细胞介导的血管生成。
整联蛋白是牵涉到细胞粘附机制的一类受体。这些受体的功能的改变导致许多病理表现的发生，例如有缺陷的胚胎发生，血液凝固，骨质疏松症，急性肾衰竭，视网膜病和癌症，尤其是转移。自20世纪八十年代以来充分认识到，整联蛋白在细胞基质相互作用并因此在血管生成中起着重要作用。
整联蛋白是组成19个α和8个β亚基的不同家族的异源二聚体跨膜糖蛋白。在血管生成和肿瘤侵袭性中具有充分界定的牵连的整联蛋白是αvβ3。αvβ3整联蛋白是由其成熟的对应物分化为新形成的毛细血管的分子标记物。该整联蛋白在各种恶性肿瘤中表达。αvβ3介导的细胞基质相互作用的抑制导致了活化内皮细胞的凋亡和血管形成的破坏。相反，αvβ3在静止的内皮细胞中不强烈表达，因此用αvβ3拮抗剂处理不影响业已存在的血管 [Brooks等人, Science 1994; 264:569-571]。
αvβ3整联蛋白因此在内皮细胞的粘附、运动、生长和分化中起着重要作用。αvβ3整联蛋白已知结合RGD序列(Arg-Gly-Asp)，该序列构成不同的蛋白如层粘连蛋白、纤连蛋白和玻璃粘连蛋白的识别域。该RGD序列代表几种细胞外基质蛋白中的最小氨基酸域，其已经被证明是跨膜整联蛋白家族的结合部位 [Bazzoni等人, 1999, Current Opinion in Cell Biology; (11) 第573-581页]。的确可以表明，该短序列的甚至单一氨基酸的替换导致对整联蛋白的结合活性的失去。整联蛋白介导内皮细胞与形成毛细血管的基膜的基质下（submatrix）蛋白的连接。虽然所有内皮细胞使用整联蛋白锚固于管腔外基质下，但αvβ3 整联蛋白仅仅在血管生成过程中存在于内皮细胞的管腔表面上。因此，以该整联蛋白为靶点的药剂实际上以血管生成中牵涉的内皮细胞为靶点。
该αvβ3整联蛋白在增殖内皮细胞例如生长肿瘤中存在的内皮细胞以及各种来源的一些肿瘤细胞上过度表达。内皮αvβ3 整联蛋白受体在侵袭性乳腺癌和恶性胶质瘤中的表达是不良预后的标记。
已经证明，含有RGD的肽，不论是从噬菌体肽文库分离或生物化学合成，均能与细胞外基质蛋白竞争结合整联蛋白 [Haubner等人, 1997, Angew. Chem. Int. Ed. Engl.; (36) 第1374-1389页]。肿瘤诱导的血管生成能够体内通过用含有RGD氨基酸序列的小肽拮抗αvβ3整联蛋白来靶向。
此外已经发现，含有RGD的肽的底物特异性由RGD序列在不同基质蛋白中的不同构象而导致。例如，双环肽E-[c(RGDfK)2] 是结合于整联蛋白αvβ3的基于配体的血管靶向药剂。
由生长因子可诱导的即早基因编码，Cyr61 (亦称CCN1)是支持细胞粘附和诱导粘附信号传导的半胱氨酸富集的基质细胞蛋白。此外，Cyr61刺激内皮细胞迁移和增强培养物中的生长因子诱导的DNA合成，因此在体内诱导血管生成。从机理上看，Cyr61起着整联蛋白受体的不含RGD的配体的作用。αvβ3，Cyr61整联蛋白受体的功能阻断对于Cyr61-过度表达乳腺癌细胞是特异性细胞毒的，且特异性αvβ3-RGD 拟肽药物防止αvβ3结合于其配体Cyr61。
Cyr61在乳腺癌中的恶性表型的维持和增强中起着关键的作用。Cyr61在约30 %的侵袭性的乳腺癌中过度表达，而正常乳腺组织中的Cyr61表达水平是可忽略的。最近表明，Cyr61过度表达能够使得人乳腺癌细胞高度耐紫杉醇。具有Cyr61/αvβ3相互作用的药理学干预在Cyr61 过度表达体（overexpressors）中完全恢复紫杉醇功效，因此暗示以前未被识别的Cyr61/αvβ3-驱动的细胞信号传导积极地调节乳腺癌细胞生长和化学敏感性。
Chen等人报告[J. Med. Chem. 2005; 48:1098-1106]了在转移性乳腺癌细胞系中与双环RGD (E[RGDyK]2) 缀合的紫杉醇(PTX) 的合成和抗肿瘤活性。
Mitra等人报告[Journal of Controled Release 2006; 28: 175-183] 单-(RGDfK)和双环化(RGD4C)αvβ3结合肽的N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺 (HPMA) 共聚物基缀合物的生物分布和肿瘤靶向性能。
WO 2006/012355教导了在血管生成部位包括内皮细胞的化学部分靶向细胞表面蛋白的用于治疗实体性肿瘤的抗血管生成聚合物缀合物(APC)。在该申请中教导的化学部分可以是细胞表面受体例如整联蛋白的配体如RGD4C或RGDfK。由WO 2006/012355所教导的聚合物缀合物可以进一步包括至少一条侧链，其包括能够螯合药用放射性标记的螯合剂。示例性的这种缀合物HPMA共聚物-RGD4C-99mTc 缀合物的闪烁图像和生物分布指示特异性体内肿瘤靶向以及缀合物在肿瘤部位的延长保留。用包括β粒子发射物90Y的另一示例性缀合物HPMA共聚物-RGD4C治疗携带DU145人前列腺癌异种移植物的SCID小鼠与对照相比导致了肿瘤体积的明显减小 (也由Mitra等人在 [Nuclear Medicine and Biology 2006; 33:43-52]中报告)。
Wan等人 [2003 Proc. Int'l Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. Vol 30: 491-492] 教导使用HPMA-共聚物-阿霉素-RGD缀合物靶向内皮细胞。
发明内容
本发明人已经设计和成功制备和试验了包括连接有血管生成靶向部分和治疗活性剂如抗癌药或抗血管生成剂的聚合物骨架的缀合物。这些缀合物显示出作为治疗与血管生成有关的医学状况如癌症和癌症转移的药剂的有效活性。
根据本发明的实施方案的一个方面，提供了包括连接有治疗活性剂和血管生成靶向部分的聚合物骨架的缀合物，该血管生成靶向部分包括至少一个含有Arg-Gly-Asp (RGD)的部分，且该治疗活性剂选自紫杉醇和TNP-470。
根据本发明的一些实施方案，该聚合物骨架由聚谷氨酸(PGA)衍生而来。
根据本发明的一些实施方案，该聚合物骨架由选自葡聚糖，水溶性聚氨基酸，聚乙二醇(PEG)，聚谷氨酸(PGA)，聚乳酸(PLA)，聚乳酸-共-乙醇酸(PLGA)，聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯) (PLA/PLGA)，聚(羟烷基甲基丙烯酰胺)，聚甘油，聚酰胺胺 (PAMAM)和聚乙烯亚胺(PEI)中的聚合物衍生而来。
根据本发明的实施方案的一个方面，提供了包括连接有治疗活性剂和血管生成靶向部分的聚合物骨架的缀合物，该血管生成靶向部分包括至少一个含有Arg-Gly-Asp (RGD)的部分，且该治疗活性剂选自抗血管生成剂和抗癌药。
根据本发明的一些实施方案，该含RGD的部分是寡肽。
根据本发明的一些实施方案，该寡肽选自环状寡肽和线性寡肽。
根据本发明的一些实施方案，该血管生成靶向部分包括至少两个含有RGD的部分，该部分是相同的或不同的。
根据本发明的一些实施方案，该环状寡肽是c[ Arg-Gly-Asp-Phe-Lys]。
根据本发明的一些实施方案，该聚合物骨架由选自葡聚糖，水溶性聚氨基酸，聚乙二醇(PEG)，聚谷氨酸(PGA)，聚乳酸(PLA)，聚乳酸-共-乙醇酸(PLGA)，聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯) (PLA/PLGA)，聚(羟烷基甲基丙烯酰胺)，聚甘油，聚酰胺胺 (PAMAM)和聚乙烯亚胺(PEI)中的聚合物衍生而来。
根据本发明的一些实施方案，治疗活性剂和靶向部分的至少一种经由连接基连接于聚合物骨架。
根据本发明的一些实施方案，该连接基是可生物降解的连接基。
根据本发明的一些实施方案，该可生物降解的连接基选自pH 敏感性连接基和酶可分裂的连接基。
根据本发明的一些实施方案，该可生物降解的连接基是酶可分裂的连接基。
根据本发明的一些实施方案，该酶可分裂的连接基通过在肿瘤组织中过度表达的酶来分裂。
根据本发明的一些实施方案，该连接基包括-[ Gly-Phe-Leu-Gly]-部分。
根据本发明的一些实施方案，该连接基包括-[Gly-Pro-Leu-Gly-Ile-Ala-Gly-Gln]-。
根据本发明的一些实施方案，治疗活性剂和血管生成靶向部分的至少一种经由间隔基连接于聚合物骨架和/或连接基。
根据本发明的一些实施方案，该抗血管生成剂是紫杉醇，且该血管生成靶向部分包括c[ Arg-Gly-Asp-Phe-Lys]部分。
根据本发明的一些实施方案，该抗血管生成剂是紫杉醇，且该血管生成靶向部分包括两个c[ Arg-Gly-Asp-Phe-Lys]部分。
根据本发明的一些实施方案，该缀合物具有以下结构：
Figure 492626DEST_PATH_IMAGE001
其中：
x 是整数，该整数的值应使得x/(x+y+w) 再乘以100是在0.01-99.9的范围内；
y 是整数，该整数的值应使得y/(x+y+w)再乘以100是在0.01-99.9的范围内；以及
w 是整数，该整数的值应使得w/(x+y+w) 再乘以100是在0.01-99.9的范围内。
根据本发明的一些实施方案，该缀合物具有以下结构：
Figure 409767DEST_PATH_IMAGE002
其中：
x是整数，该整数的值应使得x/ (x+y+w)再乘以100是在70-99.9的范围内；
y是整数，该整数的值应使得y/ (x+y+w)再乘以100是在0.01-15的范围内；以及
w是整数，该整数的值应使得w/(x+y+w)再乘以100是在0.01-15的范围内。
根据本发明的一些实施方案，该缀合物具有在10 nm至 100 nm范围内的流体动力学直径。
根据本发明的一些实施方案，治疗活性剂在聚合物中的加载量是大于1 mol %。
根据本发明的一些实施方案，血管生成靶向部分在聚合物中的加载量是大于1 mol %。
根据本发明的一些实施方案，该缀合物此外包括连接于其上的标记剂。
根据本发明的实施方案的一个方面，提供了药物组合物，其包括作为活性成分的如本文所述的缀合物和药用载体。
根据本发明的一些实施方案，该组合物包装在包装材料中，并且在包装材料中或包装材料上在印刷物中标识用于治疗与血管生成有关的医学状况。
根据本发明的一些实施方案，该缀合物包括标记剂，该组合物包装在包装材料中，并且在包装材料中或包装材料上在印刷物中标识用于监测与血管生成有关的医学状况。
根据本发明的一些实施方案，该状况选自动脉粥样硬化、癌症、高血压、类风湿性关节炎、糖尿病和糖尿病相关并发症。
根据本发明的实施方案的一个方面，提供了在需要的受试者中治疗与血管生成有关的医学状况的方法，该方法包括将治疗有效量的如本文所述的缀合物给药于受试者。
根据本发明的实施方案的一个方面，提供了在患者体内监测血管生成的水平的方法，该方法包括：
将连接有如本文所述的标记剂的缀合物给药于患者；以及使用成像技术监测该缀合物在体内或身体一部分内的分布。
根据一些实施方案，该状况选自动脉粥样硬化、癌症、高血压、类风湿性关节炎、糖尿病和糖尿病相关并发症。
根据本发明的实施方案的一个方面，提供了如本文所述的缀合物作为药物的用途。
根据本发明的实施方案的一个方面，提供了如本文所述的缀合物在制备治疗与血管生成有关的医学状况的药物中的用途。
根据本发明的实施方案的一个方面，提供了如本文所述的具有标记剂的缀合物作为诊断剂的用途。
根据本发明的实施方案的一个方面，提供了如本文所述的具有标记剂的缀合物在制备监测与血管生成有关的医学状况的诊断剂中的用途。
根据本发明的实施方案的一个方面，提供了合成如本文所述的缀合物的方法，该方法包括：
(a) 将该聚合物的多种单体单元共聚合，至少一种单体单元用第一反应性基团终端，且至少一种单体单元用第二反应性基团终端，从而获得包括多种骨架单元的共聚物，至少一种骨架单元具有第一反应性基团，且至少一种骨架单元具有第二反应性基团，第一反应性基团能够与血管生成靶向部分反应，第二反应性基团能够与治疗活性剂反应；
(b) 让该共聚物与该血管生成靶向部分或其衍生物经由第一反应性基团反应，从而获得血管生成靶向部分连接于聚合物骨架的共聚物；以及
(c) 进一步让该共聚物与该治疗活性剂或其衍生物经由第二反应性基团反应，从而获得治疗活性剂连接于聚合物骨架的共聚物，
从而获得权利要求1的缀合物。
根据本发明的一些实施方案，(b)在(c)之后、与(c)同时或在(c)之前进行。
根据本发明的一些实施方案，由第一或第二反应性基团终端的至少一种单体单元进一步包括将反应性基团连接于单体单元的连接基。
除非另有规定，否则这里所使用的全部技术术语和/或科学术语具有由本发明所属领域中的普通技术人员通常理解的意义。虽然以下描述了示例性的方法和/或原料，但类似或等同于本文所述的方法和原料能够用于实施或测试本发明的实施方案。在冲突的情况下，专利说明书，包括定义在内，属于主导地位。另外，该原料、方法和实施例仅仅是说明性的，未必是限制性的。
附图说明
本发明的一些实施方案在这里仅仅作为例子参考附图和图像来进行描述。现在详细参考具体附图，要强调的是，所示细节是示例性的，用于举例说明本发明的实施方案。在这方面，结合附图的说明使得本领域技术人员清楚如何可以实施本发明的实施方案。
在附图中：
图1提供了基于聚谷氨酸的缀合物的通式，根据本发明的一些实施方案，其中聚谷氨酸聚合物骨架通过可降解的连接基缀合于治疗活性剂和缀合于血管生成靶向部分。A是–O-或–N-键，且R 是能够通过酶如组织蛋白酶 B或MMP (即Phe-Lys, Phe-Val-Gly-Leu-Ile-Gly)裂解的肽连接基或pH不稳定连接基 (即酯或缩醛)。由此衍生出聚合物骨架的PGA聚合物的平均MW是152 g/mol。
图2A-G 提供了聚谷氨酸 (PGA; 图2A)；紫杉醇 (PTX; 图2B)；具有191.7g/mol的平均分子量的PGA-PTX缀合物(图2C)；具有181.59 g/mol的平均分子量的PGA-c(RADfk) 缀合物(图3D)；PGA-E-c(RGDfk)2 缀合物 (图2E)；PGA-PTX-c(RGDfk) 缀合物 (图2F)和PGA-c(RGDfk)缀合物(图2G)的2-D化学结构。
图3A-B提供了根据本发明的一些实施方案的PGA-PTX-E-c(RGDfk)2 缀合物的2-D 化学结构，其中由此衍生出聚合物骨架的PGA聚合物的平均分子量是 256.53 g/mol(图3A)；以及根据本发明的一些实施方案的PGA-PTX-c(RADfk) 缀合物的2-D化学结构，其中由此衍生出聚合物骨架的PGA聚合物的分子量是 221.54 g/mol (图3B)。
图4A-D 提供了说明用于产生连接有NH2(CH2)2NH2 部分 (图4A)的抗血管生成剂TNP-470的任选合成途径的路线，以及根据本发明的一些实施方案的PGA-(TNP-470) 缀合物(图4B)、PGA-(TNP-470)-c(RADfk)缀合物(图4C)和PGA-(TNP-470)-E-[c(RGDfk)2](图4D) 缀合物的2-D化学结构。
图5提供了根据本发明的一些实施方案的缀合了PTX和c(RGDfk)2 [PEG-PTX-E-[c(RGDfk)2的聚乙二醇聚合物的2-D化学结构。
图6 提供了说明根据本发明的一些实施方案的HPMA共聚物-E-[c(RGDfk)2]-紫杉醇缀合物的合成的路线。
图7 提供了说明根据本发明的一些实施方案缀合物—基于聚谷氨酸的聚合物缀合物[PGA-PTX-E-c(RGDfk)2]的合成的路线。
图8 提供了说明聚谷氨酸聚合物和c(RGDfk)2缀合物 [PGA-E-c(RGDfk)2]的合成的路线。
图9A-C 提供了根据本发明的一些实施方案的两种合成缀合物 [PGA-PTX-E-c(RGDfk)2] (图9A和9B)和合成缀合物[PGA-PTX-c(RGDfk)] (图9C)的流体动力学直径的柱形图。缀合物的流体动力学直径使用激光散射显微镜检查法用纳米粒子追踪分析（NTA）技术来评价。具有5.5 mol %的PTX加载量和 3.9 mol %的-E-c(RGDfk)2加载量的缀合物 [PGA-PTX-E-c(RGDfk)2] 的平均流体动力学直径在图9A中示出。具有2.6 mol %的PTX 加载量和5 mol %的-E-c(RGDfk)2加载量的缀合物[PGA-PTX-E-c(RGDfk)2] 的平均流体动力学直径在图9B中示出。具有2.1 mol %的PTX 加载量和5 mol %的-c(RGDfk)加载量的缀合物 [PGA-PTX-c(RGDfk)]的平均流体动力学直径在图9C中示出。
图10A-B 提供了在组织蛋白酶B或水解条件的存在下各种基于PGA的缀合物的紫杉醇释放分布动力学。在图10A中提供了用组织蛋白酶B孵育的PGA和PTX的缀合物 (PGA-PTX; 实心菱形)、PGA-PTX-c(RADfk)缀合物 (实心方形)、PGA-PTX-E-[c(RGDfk)2]缀合物 (实心三角形)和PGA-PTX-[c(RGDfk)]缀合物 (叉形)的紫杉醇释放百分率作为时间的函数的对比曲线。图10B是用组织蛋白酶B孵育的具有2.6 % mol PTX和5 mol % E-[c(RGDfk)2]的加载量的PGA-PTX-E-[c(RGDfk)2] 缀合物(实心三角形)和具有 5.5 % mol PTX和3.9 mol % E-[c(RGDfk)2]的加载量的PGA-PTX-E-[c(RGDfk)2]缀合物 (实心菱形)的紫杉醇释放百分率作为时间的函数的对比曲线。
图11A-C提供示出了αvβ3整联蛋白的细胞表达及其与根据本发明的实施方案的缀合物的相互作用的数据。HUVEC, U87 人恶性胶质瘤细胞和PANC02 鼠胰腺肿瘤细胞先后用抗-αvβ3和荧光素标记的第二抗体进行免疫染色，并使用FACS扫描αvβ3 存在 (参见图11A)。用作对照的是不用任何抗体孵育的细胞。结果的 分析表明，仅仅HUVEC以及U87细胞而非 PANC02细胞表达了αvβ3 整联蛋白。荧光探针Oregon Green-cadaverine (OG)缀合于PGA-c(RADfk)和PGA-E-[c(RGDfk)2] ，获得(PGA-c(RADfk)-OG 或PGA-E-[c(RGDfk)2]–OG) ，且它们与αvβ3 的粘附通过用人脐静脉内皮细胞 (HUVEC)孵育，随后使用ImageStream 100成像流式细胞仪 (Merkel Technologies Ltd.) 测定荧光的变化来评价 (参见图11B)。图11C 提供了在用PGA-c(RADfk)-OG (右图)或PGA-E-[c(RGDfk)2]–OG (左图) 孵育15分钟之后的细胞的图像，表明了与无活性的含RAD的缀合物相比含[c(RGDfk)2]部分的缀合物的更高的细胞摄取率。
图12A-C 提供了对比曲线，其证明，当缀合于根据本发明的一些实施方案的PGA-c(RGDfk)2 聚合物时，紫杉醇保留了其对于HUVEC (图12A)、U87 人恶性胶质瘤细胞(图12B)和PANC02 鼠胰腺肿瘤细胞 (图12C)的增殖的抗血管生成效果。以下物质的结果作为随紫杉醇浓度而变的细胞生长(相对于对照组)的百分率提供：单独的聚谷氨酸聚合物 (PGA, 橙色实心方形)；单独的紫杉醇(PTX，浅蓝色空心方形)； 缀合于紫杉醇的聚谷氨酸聚合物(PGA-PTX；紫色实心方形)； 缀合于紫杉醇和非活性环肽RAD的聚谷氨酸聚合物(PGA-PTX-c(RADfk); 深蓝色空心圆)；游离的非活性的环肽RAD(c(RADfk)；粉红色实心菱形)； 缀合于双环的含RGD的肽的聚谷氨酸聚合物(PGA-E-[c(RGDfk)2]；绿色实心三角形)；游离紫杉醇+ 游离非活性肽RAD (PTX + c(RADfk)；蓝色空心菱形)；缀合于紫杉醇和双环RGD肽的聚谷氨酸聚合物，根据本发明的一些实施方案的缀合物(PGA-PTX-E-[c(RGDfk)2]；绿色实心圆)；游离双环RGD肽 (E-[c(RGDfk)2]；红色实心三角形)；缀合于无活性环状肽RAD 的聚谷氨酸聚合物(PGA-c(RADfk); 深蓝色实心菱形)和缀合于双环的含RGD的肽的紫杉醇 (PTX-E-[c(RGDfk)2]; 绿色空心实心三角形)；实线和虚线表示有生长因子(实线)或没有生长因子(虚线)存在下的细胞增殖。数据表示平均值 ± SD。用于本实验的PGA-PTX-E-[c(RGDfk)2] 缀合物是所合成的第一缀合物 (即，具有5.5 mol % PTX和 3.9 mol % E-[c(RGDfk)2] 加载量)。
图13A-B 提供了证明根据本发明的一些实施方案的具有5 mol % E-[c(RGDfk)2]和2.6 mol% PTX加载量的PGA-PTX-E-[c(RGDfk)2] 缀合物对HUVEC 的抗增殖效果 (图13A)和PGA-PTX-c(RGDfk) 缀合物 (图13B)的抗增殖效果。以下物质的结果作为随紫杉醇浓度而变的细胞生长(相对于对照组)的百分率提供：单独的聚谷氨酸聚合物 (PGA, 橙色实心方形)；单独的紫杉醇 (PTX, 浅蓝色空心方形)；缀合于紫杉醇的聚谷氨酸聚合物 (PGA-PTX; 紫色实心方形)；缀合于紫杉醇和无活性环肽 c(RADfk)的聚谷氨酸聚合物 (PGA-PTX-c(RADfk); 深蓝色空心圆)；无活性环肽 c(RADfk) (c(RADfk); 粉红色实心菱形)；缀合于双环 RGD肽的聚谷氨酸聚合物 (PGA-RGD; 绿色实心三角形)；游离紫杉醇+ 游离无活性肽 c(RADfk) (PTX + c(RADfk); 蓝色空心菱形)；缀合于紫杉醇和双环RGD肽 (在图13A中)或单环RGD (在图13B中)的聚谷氨酸聚合物 (PGA-PTX-RGD; 绿色实心圆)；单独的双环RGD肽 (c(RGDfk)2; 红色实心三角形)；缀合于非活性环肽 c(RADfk)的聚谷氨酸聚合物 (PGA-c(RADfk)；深蓝色实心菱形)和缀合于双环RGD肽的紫杉醇 (PTX-E-c(RGDfk)2; 绿色空心实心三角形)；实线和虚线表示在生长因子的存在下（实线）或不存在（虚线）生长因子的情况下的细胞的增殖。数据表示平均值 ± SD。
图14提供了柱形图，其显示了根据本发明的一些实施方案的PGA-PTX-E-[c(RGDfk)2] 缀合物 对于HUVEC 向血管内皮细胞生长因子 (VEGF) 趋化物迁移的能力以及形成毛细血管样管状结构的能力的效果。提供了与未处理细胞（仅仅用VEGF）相比的以下物质抑制HUVEC 毛细血管样管状结构的抑制百分率：单独的聚谷氨酸聚合物 (PGA)；单独的紫杉醇 (PTX)；非活性环肽c(RADfk) (c(RADfk))；单独的双环RGD肽 (E-[c(RGDfk)2])；缀合于紫杉醇和非活性环肽 c(RADfk)的聚谷氨酸聚合物(PGA-PTX-c(RADfk))；缀合于双环RGD肽的聚谷氨酸聚合物(PGA-E-[c(RGDfk)2])；缀合于紫杉醇的聚谷氨酸(PGA-PTX)；游离紫杉醇与游离非活性环肽 c(RADfk)的组合(PTX + c(RADfk))；游离紫杉醇与游离双环 RGD肽的组合(PTX + E-[c(RGDfk)2])；缀合于非活性环肽c(RADfk)的聚谷氨酸聚合物(PGA-c(RADfk))和缀合于紫杉醇和双环RGD肽的聚谷氨酸聚合物，根据本发明的一些实施方案的缀合物 (PGA-PTX-E-[c(RGDfk)2])。还示出了未接触VEGF的细胞的迁移百分率 (无VEGF)。数据表示平均值±SD。
图15提供了柱形图，其证明，根据本发明的一些实施方案的PGA-紫杉醇-E-[c(RGDfk)2]和PGA-紫杉醇-[cRGDfk]两种缀合物阻止HUVEC 附着于纤维蛋白原包被的板上。将在处理之后的HUVEC附着的百分率定量和标准化至对照细胞（即不用任何化合物孵育；仅仅标记为细胞）的附着百分率。将附着的细胞固定并染色。示出了所进行的三个实验：第一个实验使用具有5.5 mol% PTX和3.9 mol% 的E-[c(RGDfk)2加载量的缀合物PGA-紫杉醇-E-[c(RGDfk)2] (深灰色)；第二个实验使用具有2.6 mol % PTX和5 mol % 的E-[c(RGDfk)2 加载量的缀合物PGA-紫杉醇-E-[c(RGDfk)2] (浅灰色)；以及第三个实验使用具有2.1 mol % PTX和5 mol %的c(RGDfk) 加载量的缀合物PGA-紫杉醇-c(RGDfk) (白色)。细胞用以下试验化合物孵育：非活性环肽 c(RADfk) (c(RADfk))；单独的单环RGD肽(E-[c(RGDfk)])；单独的聚谷氨酸聚合物(PGA)；缀合于紫杉醇的聚谷氨酸 (PGA-PTX)；缀合于非活性环肽c(RADfk) 的聚谷氨酸聚合物(PGA-c(RADfk))；缀合于双环RGD 肽的聚谷氨酸聚合物(PGA-E-[c(RGDfk)x] ，其中在前两个实验中，x=2且在第三个实验中，x=1)；单独的紫杉醇 (PTX)；游离紫杉醇与游离非活性环肽c(RADfk)的组合 (PTX + c(RADfk))；游离紫杉醇与游离双环RGD 肽的组合 (PTX + E-[c(RGDfk)x]，其中在前两个实验中，x=2 ，在第三个实验中x=1)；缀合于紫杉醇和非活性环肽 c(RADfk) 的聚谷氨酸聚合物 (PGA-PTX-c(RADfk))；以及缀合于紫杉醇和双环RGD肽的聚谷氨酸聚合物 (PGA-PTX-[c(RGDfk)x]，其中在前两个实验中，x=2 ，在第三个实验中，x=1)。当x=2时，该c(RGDfk)部分进一步包括两个环状RGDfk部分所连接的谷氨酸残基 (-E-)。作为对照，示出了不用任何化合物孵育的细胞（仅仅细胞）。还示出了在没有纤维蛋白原包被的板上接种的对照细胞（无纤维蛋白原）。使用Nikon TE2000E 倒置显微镜和NIH图像软件进行定量。*用c(RGDfk)2 的处理为20 µM 浓度，而紫杉醇为5 nM，因为在更高剂量下的紫杉醇 对细胞是毒性的。数据表示平均值± SD。
图16A-B提供了图像 (FIG. 16A)和柱形图 (图16B)，其证明，缀合物 PGA-紫杉醇-c(RGDfk)2 抑制了HUVEC的毛细血管样管形成。HUVEC (5 ×104 细胞/100 μl) 用以下物质攻击：单独的聚谷氨酸聚合物(PGA)；单独的紫杉醇(PTX)；单独的双环RGD肽 (E-[c(RGDfk)2])；非活性环肽c(RADfk) (c(RADfk))；缀合于紫杉醇 (PGA-PTX)的聚谷氨酸；缀合于双环RGD肽的聚谷氨酸聚合物 (PGA-E-[c(RGDfk)2])；缀合于非活性环肽 c(RADfk) 的聚谷氨酸聚合物 (PGA-c(RADfk))；游离紫杉醇与游离双环RGD肽的组合 (PTX + E-[c(RGDfk)2])；游离紫杉醇与游离非活性环肽c(RADfk)的组合 (PTX + c(RADfk))；缀合于紫杉醇和非活性环肽 c(RADfk) 的聚谷氨酸聚合物 (PGA-PTX-c(RADfk)) 和缀合于紫杉醇和双环RGD肽的聚谷氨酸聚合物 (PGA-PTX-[c(RGDfk)2])。然后将细胞染色，测定 HUVEC毛细血管样管状结构被不同化合物抑制的百分率。使用Nikon TE2000E倒置显微镜和NIH图像软件进行定量分析。数据表示平均值± SD。
图17A-B 提供了数据，表明了缀合物在肿瘤组织中的体内选择性积累。荧光探针Oregon Green-cadaverine (OG)缀合于PGA、PGA-E-[c(RGDfk)2]和PGA-c(RADfk)。SCID雄性用2x106 mCherry-标记的 U87 人骨肉瘤或用 5x106 mCherry-标记的 MG-63 人骨肉瘤s.c.接种，并且用PGA-E-[c(RGDfk)2]-OG (50 μM-RGD)或PGA-c(RADfk)-OG (50 μM-RGD-等效剂量)或作为对照的PGA (n= 3 小鼠/组)静脉注射。注射后1小时，切除肿瘤，切成薄片，在Zeiss Meta LSM 510共焦成像系统下检查。图17A中示出了治疗小鼠的肿瘤切片的荧光图像，表明仅仅PGA-E-[c(RGDfk)2] 能够在肿瘤组织中积累。图17B提供了如由FACS检测到的在处理小鼠的匀浆肿瘤的 mCherry-标记的-MG-63 细胞中的PGA-PTX-E-[c(RGDfk)2]-OG、PGA-PTX-c(RADfk)-OG和PGA-PTX-OG的积累的对比曲线。该结果显示了与PGA-PTX-c(RADfk)-OG和PGA-PTX-OG相比PGA-PTX-E-[c(RGDfk)2]-OG优先积累。
本发明具体实施方式的描述
本发明在一些实施方案中涉及新型化学缀合物和及其在治疗和诊断中的用途，更尤其，但不仅仅涉及连接有血管生成靶向部分和抗血管生成剂的聚合物的新型缀合物及其在监测和治疗与血管生成有关的医学状况中的用途。
参考以下附图和所附说明，可以更好地理解根据本发明的缀合物的原理和操作、组合物、用途、方法和工艺。
在详细说明本发明的至少一个实施方案之前，应该理解的是，本发明在其应用上不限于在以下说明中阐述或由实施例举例说明的细节。本发明能够具有其它实施方案，或者能够以不同方式实施。还有，应该理解的是，本文所使用的措辞和术语用于说明的目的，不应被视为限制。
术语“血管生成”描述了包括新血管从业已存在的血管萌发的生物学过程，且在疾病发生和进展中起着关键的作用 [Folkman J. N Engl J Med 1995, 333:1757-1763]。血管生成是其中内皮细胞充当血管扩张的结构单元的复杂过程。它通过促血管生成和抗血管生成分子之间的精密平衡来调节。
病理性血管生成已经在几种疾病中被证明，包括癌症、高血压、类风湿性关节炎和糖尿病性视网膜病。肿瘤生长和转移尤其取决于血管生成的程度。
进一步的血管扩张的抑制因此是活跃的癌症治疗研究的焦点。已经开发了许多药物，其以该多步肿瘤血管生成过程中的不同步骤为靶的。然而，大多数这些药物表明是抑制细胞生长的，而非细胞毒性的，因此在治疗的第一阶段中没有大幅度削减肿瘤体积。
在治疗与血管生成有关的医学状况的新型药剂的探索中，本发明人已经设计和成功地制备和试验了新型生物相容性聚合物的缀合物，其具有可用作抗癌药和/或抗血管生成剂的治疗活性剂和连接于治疗活性剂的作为血管生成靶向部分的至少一个含Arg-Gly-Asp (RGD)的部分。
如在以下实施例部分中所证明的，这些新型缀合物抑制血管生成和血管生成相关过程，因此抑制了细胞形成毛细血管样管状结构和粘附到纤维蛋白原包被的板上的内皮细胞增殖、迁移能力(参见图12-16)。此外体内实验表明根据本发明的一些实施方案的示例性缀合物（表示为PGA-PTX-E-[c(RGDfk)2]）在小鼠骨肉瘤肿瘤细胞中的积累增强 (图 17)。
这些缀合物可以因此有利地被用于治疗以过度血管生成为特征的医学状况。
因此，根据本发明的实施方案的一个方面，提供了包括连接有治疗活性剂和血管生成靶向部分的聚合物骨架的聚合物缀合物，该血管生成靶向部分包括至少一个含Arg-Gly-Asp (RGD)的部分，且该治疗活性剂是抗血管生成剂和/或抗癌药。
在本发明的一些实施方案中，这里所述的缀合物包括含有许多骨架单元的聚合物骨架，从而这些骨架单元的一部分连接有治疗活性剂，这些骨架单元的另一部分连接有血管生成靶向部分。不连接于另一部分的聚合物骨架内的这些骨架单元在这里称之为“游离”或“非官能化”骨架单元。
因为在这里所述的缀合物中的聚合物骨架由连接有治疗活性剂的一些骨架单元、连接有靶向部分的一些骨架单元和任选的一些游离骨架单元组成，因此这些缀合物为共聚物。
短语“治疗活性剂”描述了当给药于受试者时显示了有益的药理学效应，因此能够用于治疗从该药理学效应受益的状况的化合物。
这里所使用的术语“受试者”（在这里可供选择地称为“患者”）是指已经为治疗、观察或实验的对象的动物，优选哺乳动物，最优选人。
这里所使用的短语“抗癌药”描述了直接或间接杀死癌细胞或直接或间接抑制、停止或减少癌细胞增殖的任何治疗剂。抗癌药包括导致细胞死亡的药物和抑制细胞生长、增殖和/或分化的药物。在一些实施方案中，该抗癌药对于某些类型的癌细胞是选择性有毒的，但不影响或很少影响正常细胞。在一些实施方案中，该抗癌药是细胞毒性药物。
在这里使用的的短语“细胞毒性药物”描述了介导细胞死亡的化合物。细胞死亡调节可以通过由例如、但不限于凋亡、新陈代谢抑制或DNA合成、干预细胞骨架组织、DNA的去稳定或化学修饰等机制来显示出。这里所使用的短语“细胞毒性药物”包括任何适合的化疗剂，包括小的有机分子、肽、低聚核苷酸等以及放射治疗剂，例如放射性碘131I和β粒子发射物90Y。这些药剂可以例如用作抗增殖剂或作为诱导凋亡的促凋亡剂。
示例性的细胞毒性药物包括、但不限于蒽环类抗生素例如阿霉素和柔红霉素，紫杉烷类例如Taxol™，多西他赛，长春花生物碱如长春新碱和长春花碱，5-氟尿嘧啶（5-FU），甲酰四氢叶酸，依立替康，伊达比星，丝裂霉素C，奥沙利铂，雷替曲塞，它莫西芬和顺铂，卡铂，氨甲喋呤、放线菌素D、米托蒽醌或硫酸博来霉素或光神霉素。
该药剂还可以是在低氧细胞条件下活化的生物还原药物的成员。
一些抗癌药用作如上所述的血管生成抑制剂。
短语“抗血管生成剂”在这里可互换地称为“抗血管生成剂”或“血管生成抑制剂”，描述了具有(a)抑制内皮细胞增殖或迁移，(b)杀死增殖内皮细胞和/或(c)抑制新血管在组织中形成的能力的药剂。
如在上文所述的，一些抗血管生成剂可用于治疗癌症，由此还可以称为抗癌药。
在一些实施方案中，该抗血管生成剂是紫杉醇。
紫杉醇的化学结构如图2B所示。该微管干扰剂紫杉醇是通常用于治疗晚期转移性乳腺癌的药物。然而，它是神经毒性的，引起血液学毒性，许多乳腺肿瘤产生对其的耐药。最近已经表明，超小剂量的紫杉醇抑制血管生成。然而，紫杉醇在水溶液中溶解性低，当前使用赋型剂Cremophor EL或乙醇来增溶其商品形式，引起超敏反应。
如在以下实施例部分中所证明的，对根据本发明的一些实施方案的以其中紫杉醇已知显示出抗血管生成活性的浓度包括紫杉醇的缀合物测试了其抗血管生成活性。具体而言，已经表明，为其中两个含RGD的环肽和紫杉醇缀合于聚合物骨架 (PGA-E-c(RGDfk)2-PTX)的聚谷氨酸共聚物的缀合物，显示出抗血管生成活性，即抑制内皮细胞增殖、迁移、细胞形成毛细血管样管状结构的能力和在纤维蛋白原包被板上的附着 (参见图12-16)。已经表明，为连接于一个含RGD的环肽和紫杉醇的聚谷氨酸聚合物的另一缀合物 (PGA-c(RGDfk)-PTX) 也显示出抗血管生成活性 (参见图13B和15)。这些结果论证了这里所述的缀合物抑制血管生成和因此用作有效的抗血管生成剂的能力。
在一些实施方案中，该抗血管生成剂是TNP-470。
TNP-470是烟曲霉素的低分子量合成类似物，其能够体外选择性抑制内皮生长。在临床试验中，发现该药物在许多患有转移性癌症的患者中减慢肿瘤生长，当与普通化疗联合使用时显示出有前景的功效。然而，在肿瘤退化所需的剂量下，许多TNP-470治疗的患者遭受了神经毒性。由于它的剂量限制的神经毒性，对于使用TNP-470本身没有进行进一步的临床研究。在图4D中提供了根据本发明的一些实施方案的含有TNP-470的缀合物(PGA-TNP-470-[c(RGDfk)2])的代表性化学结构。
适用于本发明的实施方案的其它抗血管生成剂包括，但不限于，紫杉醇，2-甲氧雌甾二醇，普啉司他，巴马司他，BAY 12-9566，羧胺三唑，CC-1088，乙酸美沙芬，二甲基氧杂蒽酮乙酸，内皮抑素，IM-862，马立马司他，基质金属蛋白酶，青霉胺， PTK787/ZK 222584, RPI.4610, 角鲨胺乳酸酯, SU5416, 沙利度胺，考布他汀，它莫西芬， COL-3, 新伐司他， BMS-275291, SU6668, 抗VEGF 抗体, Medi-522 (Vitaxin II), CAI, 白介素-12, IM862, 阿米洛利, Angiostatin
Figure 2553DEST_PATH_IMAGE003
Protein, 血管他丁 K1-3, 血管他丁 K1-5, 卡托普利， DL-α-二氟甲基鸟氨酸, DL-α-二氟甲基鸟氨酸 HCl, His-TagEndostatin™Protein, Endostar™, 烟曲霉素， 除莠霉素 A, 4-hydroxyphenylretinamide，胡桃醌，层粘连蛋白，层粘连蛋白六肽，层粘连蛋白五肽，薰草菌素 A，甲羟基孕酮，安宫黄体酮，二甲胺四环素，二甲胺四环素HCl，胎盘核糖核酸酶抑制剂，苏拉明，苏拉明钠盐，人血小板凝血栓蛋白，中性粒细胞，针对特异性促血管生成因子和/或它们的受体的单克隆抗体 (例如阿瓦斯汀，爱必妥，帕尼单抗，赫赛汀)；多种促血管生成生长因子受体的小分子酪氨酸激酶抑制剂(例如特罗凯，多吉美，索坦，易瑞沙)；mTOR的抑制剂(雷帕霉素的哺乳动物靶点) (例如驮瑞塞尔)；干扰素α，β和γ；IL-12；基质金属蛋白酶(MMP)抑制剂(例如COL3，马立马司他，巴马司他)；EMD121974 (Cilengitide)； ZD6474, SU11248, Vitaxin; Squalamin; COX-2抑制剂; PDGFR 抑制剂 (例如Gleevec); NM3和2-ME2。
在一些实施方案中，该抗血管生成剂选自紫杉醇，针对特定的促血管生成因子和/或它们的受体的单克隆抗体(例如阿瓦斯汀，爱必妥，vectibix，赫赛汀)；多种促血管生成生长因子受体的小分子酪氨酸激酶抑制剂(例如特罗凯，多吉美，索坦，易瑞沙)；mTOR的抑制剂 (雷帕霉素的哺乳动物靶点) (例如驮瑞塞尔)；干扰素α，β和γ；IL-12；基质金属蛋白酶(MMP)抑制剂(例如COL3，马立马司他，巴马司他)；EMD121974 (西仑吉肽)；Vitaxin； Squalamin； COX-2抑制剂；PDGFR抑制剂(例如，Gleevec)；NM3；2-ME2和二膦酸盐 (例如，Zoledronate)。
在这里使用的术语“COX-2抑制剂”是指优先于COX-1而相对抑制酶COX-2的非甾体药物。优选的COX-2抑制剂的实例包括，但不限于，塞来昔布，帕瑞昔布，罗非考昔，伐地考昔，美洛昔康和依托考昔。
短语“血管生成靶向部分”描述了能够结合于哺乳动物中的部位的化学部分，在该部位发生了新血管形成，例如肿瘤细胞新血管形成。短语“新血管形成”是指包括两个独特的过程：血管发生(vasculogenesis)，血管的重新组装，以及血管生成(angiogenesis)，从业已存在的血管形成新毛细血管萌芽。
这里所述的血管生成靶向部分由能够选择性结合于出现新血管形成的哺乳动物中的部位的化合物衍生而来，因此可以用于将这里所述的缀合物输送到预定位置。
在一些实施方案中，该靶向部分能够结合于血管生成相关的整联蛋白。在一些实施方案中，该靶向部分靶向αvβ3整联蛋白受体。
整联蛋白是牵涉到细胞粘附机制的一类受体。整联蛋白是组成19个α和8个β亚基的不同家族的异源二聚体跨膜糖蛋白。在血管生成和肿瘤侵袭性中具有充分界定的牵连的整联蛋白是αvβ3[Stromblad and Cheresh, Chem Biol 1996;3:881-885]。αvβ3整联蛋白在增殖内皮细胞例如生长肿瘤中存在的内皮细胞以及各种来源的一些肿瘤细胞上过度表达。该RGD序列代表几种细胞外基质蛋白中的最小氨基酸域，其已经被证明是跨膜整联蛋白家族的结合部位 [Bazzoni等人 1999, Current Opinion in Cell Biology; (11) 第573-581页]。
相应地，在一些实施方案中，该血管生成靶向部分包括至少一个Arg-Gly-Asp (RGD)部分，或其拟肽，并且可以任选此外包括其它氨基酸，氨基酸衍生物，或其它化学基团(例如，亚烷基链)。
在一些实施方案中，该含RGD的部分是寡肽。该寡肽可以是环状寡肽(包括例如单环、双环和三环寡肽)或线性寡肽，并且可以包括除Arg-Gly-Asp氨基酸序列之外的1-10个氨基酸。
此外已经发现，含有RGD的部分的底物特异性由RGD序列在不同基质蛋白中的不同构象而导致。
在一个实施方案中，该寡肽是为 c[Arg-Gly-Asp-Phe-Lys]的环肽。
在一些实施方案中，该血管生成靶向部分包括两个或更多个含Arg-Gly-Asp的部分，该部分可以是相同的或不同的。适用于本发明的实施方案的示例性含Arg-Gly-Asp的部分包括、但不限于c(RGDfk)、RGD4C和其它含RGD的环肽，例如在Haubner等人 [J. Am. Chem. Soc. 1996, 118, 7881-7891] 和Capello等人 [J. Nucl. Med. 2004, 45(10), 1716-20]和WO 97/06791和美国专利No. 5,773,412中所述的那些。示例性的有效RGD环肽是Arg-Gly-Asp (RGD) 环状五肽，其中将两个氨基酸如D-酪氨酸和赖氨酸添加到RGD 中，且将五肽转化为环状五肽。
在一些实施方案中，该含RGD的部分可以包括相互连接或间隔一个或更多个氨基酸或如本文所定义的任何其它间隔基的两个或更多个-Arg-Gly-Asp-部分。
如在以下实施例部分中所证明的，与非活性RAD部分的PGA缀合物或单独的PGA相比，缀合于PGA聚合物骨架的含RGD的部分c(RGDfk)2 以更大的程度结合于表达αvβ3整联蛋白的细胞 (参见图 11B和11C)，从而证明RGD部分在缀合物与细胞的相互作用和后续内化到细胞内中起着重要作用。
在一些实施方案中，抗血管生成剂是紫杉醇，且血管生成靶向部分包括为 c[Arg-Gly-Asp-Phe-Lys]的环状寡肽。
在一些实施方案中，抗血管生成剂是紫杉醇，且血管生成靶向部分包括各自为c[Arg-Gly-Asp-Phe-Lys]的两个环状寡肽。这种缀合物在这里被称为含有双环含RGD的部分的缀合物。
在这里，短语“加载到聚合物上”或简单地“加载”用来描述连接于这里所述的缀合物的聚合物骨架上的药剂的量，且如以下所定义的，在这里用该药剂在缀合物中的mol%来表示。
在这里使用的术语“mol %”描述了每1mol聚合物缀合物的所连接的部分的摩尔数乘以100。
因此，例如，血管生成靶向部分的1 mol %加载量描述了由100个骨架单元组成的聚合物缀合物，从而1个骨架单元连接有靶向部分，而另外99个骨架单元是游离的或者连接有其它药剂。
既定缀合物和既定用途的治疗活性剂和血管生成靶向部分的最佳加载度凭经验根据缀合物的所需性质(例如水溶性，治疗效力，药物动力学性质，毒性和剂量要求)以及任选根据能够在选择合成途径中连接于聚合物骨架的缀合的部分的量来确定。
该%加载量能够通过本领域技术人员公知的方法来测定，它们的一些在以下实施例部分的材料和方法项下有描述。
在一些实施方案中，聚合物中的治疗活性剂的加载量大于1 mol %。
在一些实施方案中，缀合物中的治疗活性剂的加载量是1 mol %-99 mol %，1 mol %-50 mol %，1 mol %-20 mol %，1 mol %-10 mol %，或1 mol %-5 mol %。
在一些实施方案中，聚合物中的血管生成靶向部分的加载量大于1 mol %。
在一些实施方案中，缀合物中的血管生成靶向部分的加载量是1 mol %-99 mol %，1 mol %-50 mol %，1 mol %-20 mol %，1 mol %-10 mol %，或1 mol %-5 mol %。
如在以下实施例部分中所举例的，合成具有不同治疗活性剂和血管生成靶向部分的%加载量(参见表1)，并测定它们的抗血管生成活性。具体而言，示出了具有3.9 mol % E-[c(RGDfk)2]和5.5 mol % PTX加载量的PGA-PTX-E-[c(RGDfk)2] 缀合物（参见图12和14-16）以及具有 5 mol % E-[c(RGDfk)2]和2.6 mol % PTX 加载量的 PGA-PTX-E-[c(RGDfk)2] 缀合物的抗血管生成活性（参见图13A和15）。
如在以下实施例部分中所进一步证明的，含Arg-Gly-Asp (RGD)的部分，例如E-[(cRGDfk)2]，具有固有的抗血管生成特性，即抑制内皮细胞向趋化物VEGFR迁移和附着到纤维蛋白原包被的板上(参见图14和15)。没有发现含Arg-Gly-Asp (RGD)的部分对紫杉醇的抗血管生成活性的拮抗活性，如由针对HUVEC的抗增殖活性所评价的，反而，E-[(cRGDfk)2]和紫杉醇的抗增殖活性在细胞一起接触该两种药物时是相加性的（参见图12）。
Cyr61 (亦称CCN1)是支持细胞粘附和诱导粘附信号传导的半胱氨酸富集的基质细胞蛋白。此外，Cyr61刺激内皮细胞迁移和增强培养物中的生长因子诱导的DNA合成，因此在体内诱导血管生成。从机理上看，Cyr61起着整联蛋白受体的不含RGD的配体的作用。αvβ3，Cyr61 整联蛋白受体的功能阻断, 对于Cyr61-过度表达乳腺癌细胞是特异性细胞毒的，且特异性αvβ3-RGD 拟肽药物防止αvβ3 结合于其配体Cyr61。最近表明，Cyr61过度表达能够使得人乳腺癌细胞高度耐紫杉醇。
在一些实施方案中，这里所述的缀合物起αvβ3的特异性拮抗剂的作用， 并因此抑制Cyr61-整联蛋白受体信号转导级联，因此用于抑制Cyr-61依赖性癌细胞生长和化学抗性。
在一些实施方案中，这里所述的聚合物缀合物由聚合物骨架组成，所述聚合物骨架由彼此以共价键连接的多个骨架单元形成，其中该多个骨架单元的至少一部分连接有本文所述的治疗活性剂，且该多个骨架单元的至少另一部分连接有血管生成靶向部分（如本文所述的含有RGD的部分）。
连接有治疗活性剂的那些骨架单元和连接有血管生成靶向部分的那些骨架单元能够随机地在聚合物骨架内分散。
该聚合物骨架可以此外包括下文所述的非官能化骨架单元，所述单元没有连接治疗活性剂和血管生成靶向部分。
在一些实施方案中，所述缀合物的聚合物骨架构成了连接血管生成靶向部分和治疗活性剂的聚合物（或共聚物）。
适用于本实施方案的聚合物是生物相容性、非免疫原性和无毒的。该聚合物用作能够特异性输送到肿瘤组织中的载体。如上所述，特异性输送归因于上述增强的渗透性和保留（EPR）效应。此外，与聚合物的缀合限制药物通过血脑屏障和将延长药物的循环半衰期，因此通过以比游离药物更长的时间在循环中使细胞暴露于缀合的药物而抑制肿瘤内皮和上皮细胞生长。另外，聚合物-药物缀合物可以用作持续释放的药物贮库，获得了药物与肿瘤细胞的延长接触。最后，水溶性聚合物(例如，水溶性聚氨基酸)可用来稳定药物，以及增溶否则不溶性的化合物，例如TNP-470和紫杉醇。
在这里使用的术语“聚合物”描述了由彼此以共价键连接的许多重复结构单元（骨架单元）组成的有机物质。在这里使用的术语“聚合物”包括有机和无机聚合物，此外包括均聚物、共聚物或它们的混合物（掺合物）的一种或更多种。在这里所使用的术语“均聚物”描述了由一种类型的单体单元组成的聚合物，因此由同种的骨架单元组成。在这里所使用的术语“共聚物”描述了由一种以上类型的单体单元组成的聚合物，因此由异种的骨架单元组成。该异种的骨架单元可以通过其侧基来彼此区分。
该聚合物包括由相应的单体单元聚合所形成的骨架单元，从而治疗活性剂和血管生成靶向部分连接于这些骨架单元的至少一部分上。一些或全部的这些骨架单元典型地在缀合之前官能化，以便具有用于连接抗血管生成剂和 骨 靶向部分的反应性基团。非官能化和/或没有参与治疗活性剂和血管生成靶向部分的缀合的骨架单元在这里称为“游离”骨架单元。
聚合物可以是生物稳定的聚合物、可生物降解的聚合物或它们的组合。术语“生物稳定”描述了体内不降解，即，不是可生物降解的化合物。
术语“可生物降解的”描述了能够在生理和/或环境条件下分解为分解产物的物质。这种生理和/或环境条件包括例如水解(经由水解分裂的分解)、酶促催化(酶促降解)和机械相互作用。该术语典型地是指在使得50重量%的物质在短于一年的时间内分解的这些条件下分解的物质。
该聚合物可以是水溶性的或水不溶性的。在一些实施方案中，该聚合物在室温下是水溶性的。
该聚合物此外可以是带电聚合物或不带电的聚合物。带电聚合物可以是阳离子聚合物，具有带正电荷的基团和在生理pH下的正净电荷；或阴离子聚合物，具有带负电荷的基团和在生理pH下的负净电荷。不带电的聚合物可以具有带正电荷的基团和带负电荷的基团，在生理pH下具有中性净电荷，或者可以是不带电的。
在一些实施方案中，聚合物具有100 Da至 800 kDa的平均分子量。在一些实施方案中，聚合物具有低于100 Da或低于60 kDa的平均分子量。在一些实施方案中，聚合物的平均分子量范围是10 kDa至40 kDa。
如本文所述的，分子量高于10 kDa的聚合物典型地显示出EPR效应，分子量为100 kDa和更高的聚合物具有在血浆中的较长半衰期和低效的的肾清除率。因此，聚合物缀合物的分子量可以在考虑血浆中的半衰期、肾清除率和缀合物在肿瘤中的积聚的同时来确定。
在本发明的实施方案中使用的聚合物可以是合成聚合物或天然存在的聚合物。在一些实施方案中，聚合物是合成聚合物。
这里所述的聚合物的聚合物骨架例如可以由聚丙烯酸酯类，聚乙烯基类，聚酰胺类，聚氨酯类，聚亚胺类，多糖，多肽，聚羧酸酯和它们的混合物衍生而来。
适用于本实施方案的示例性的聚合物包括，但不限于，葡聚糖，水溶性聚氨基酸，聚乙二醇(PEG)，聚谷氨酸(PGA)，聚乳酸(PLA)，聚乳酸-共-乙醇酸(PLGA)，聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯) (PLA/PLGA)，聚(羟烷基甲基丙烯酰胺)，聚甘油，聚酰胺胺 (PAMAM)以及聚乙烯亚胺(PEI)。
在一些实施方案中，该聚合物骨架由聚(羟烷基甲基丙烯酰胺)或它的共聚物衍生而来。这种聚合物骨架包括甲基丙烯酰胺骨架单元。
聚(羟烷基甲基丙烯酰胺) (HPMA)聚合物是已经被广泛表征为生物相容性、非免疫原性和无毒的一类水溶性的合成聚合物载体。HPMA聚合物相比于其它水溶性聚合物的一个优点是，它们可以通过相对简单的化学改性来修改，以便调节它们各自的药物和靶向部分含量。此外，这些聚合物的分子量和电荷可以控制，以便允许肾清除和从身体排泄，或者在允许肿瘤靶向的同时改变生物分布。
根据一些实施方案，该聚合物是聚谷氨酸(PGA)。
PGA的化学结构如图2A所示。PGA含有大量的侧链羧酸官能团，其可以容易地用于药物连接。PGA可以容易地被溶酶体酶如组织蛋白酶B降解为其无毒的基本成分，L-谷氨酸，D-谷氨酸和D,L-谷氨酸。据报告，谷氨酸钠防止由紫杉醇诱发的神经病的临床表现，因此使得可以耐受更高剂量的紫杉醇。
在这里使用的聚谷氨酸或聚谷氨酸聚合物包括聚(L-谷氨酸)，聚(D-谷氨酸)，聚(D,L-谷氨酸)，聚(L-γ谷氨酸)，聚(D-γ谷氨酸)和聚(D,L-γ谷氨酸)。
在一些实施方案中，该聚谷氨酸包括至少50 %的作为谷氨酸的其骨架单元，且任选包括60、70、80、90或100 %的作为谷氨酸的其骨架单元。该聚谷氨酸能够被天然或化学改性氨基酸，优选亲水性氨基酸取代，前提是当缀合于治疗活性剂和血管生成靶向部分时，相对于非缀合的治疗剂，该取代的聚谷氨酸聚合物骨架改进了水溶性和/或改进了功效，并且优选是非免疫原性的。聚谷氨酸聚合物骨架的至多 50 %的骨架单元可以被取代。
其中该聚合物骨架通过可降解的连接基缀合了治疗活性剂且进一步缀合了血管生成靶向部分的基于聚谷氨酸的缀合物的代表性通式在图1中示出。
根据一些实施方案，该聚合物是聚乙二醇(PEG)。
PEG是独特的聚醚二醇，通常由环氧乙烷的水性阴离子聚合来制备，但可以使用其它聚合引发剂。这些聚合物是两亲性的，并溶于有机溶剂和水中；它也是无毒的和通过肾脏和肝脏途径的组合来清除。此外，PEG具有任何已知聚合物的最低的蛋白或细胞吸收的水平，因此对于药物缀合是有利的。根据本发明的实施方案的基于PEG的缀合物的结构如图 5所示。
应该理解的是，如本文所述的聚合物描述了由同种或异种的非官能化单体单元形成的聚合物，且构成聚合物缀合物的聚合物骨架通过包括相同的单体单元对应于这种聚合物，而这些单体单元的一些如本文所述是官能化的。因此，该聚合物缀合物的聚合物骨架类似于本文所述的聚合物的骨架，且与该聚合物不同的是具有连接于其中的一些骨架单元的上述药剂。
如上所述，由于EPR效应，肿瘤血管系统具有增强的摄取大分子和具有高分子量和大的流体动力学直径的胶体药物载体的能力。因此，如本文所述的具有足够大的流体动力学直径的缀合物是有益的。这里所使用的措辞“足够大的”来描述具有与其它组织相比导致在肿瘤组织中积聚的缀合物的比率增加的流体动力学直径的缀合物。最适比率的确定明显是在本领域技术人员的能力范围内。例如，该比率可以是1.1、2、3、4、5等。在一些实施方案中，该流体动力学直径在10 nm到200 nm的范围内。在一些实施方案中，该流体动力学直径在10 nm到100 nm的范围内。在一些实施方案中，该流体动力学直径在20 nm到50 nm的范围内。在又一个实施方案中，该流体动力学直径是40 nm。在又一个实施方案中，该流体动力学直径是30 nm。该流体动力学直径能够如在以下实施例部分的材料和方法项下所述那样测定。在图9中示出了其中紫杉醇和双环含RGD的肽缀合于聚合物骨架的聚谷氨酸共聚物(PGA-PTX-E-[c(RGDfk)2])以及其中紫杉醇和单环含RGD的肽缀合于聚合物骨架的聚谷氨酸共聚物(PGA-PTX-c[RGDfk]) 的纳米级颗粒的流体动力学直径。
在本文所述的每一种缀合物中，治疗活性剂和血管生成靶向部分可以各自直接或间接地通过连接基部分（在这里也称为连接基或连接基团）连接于聚合物骨架中的骨架单元的相应部分，由此，在一些实施方案中，如下所述，直接或间接连接设计为在所需身体部位特有的条件下可分裂（例如通过某些酶或pH)。
因此，根据一些实施方案，治疗活性剂和靶向部分的至少一种经由连接基连接于聚合物。在一些实施方案中，治疗活性剂和该靶向部分的每一个经由连接基连接于聚合物。将治疗活性剂连接于聚合物的连接基和将血管生成靶向部分连接于聚合物的连接基可以是相同或不同的。
这里所述的连接基是指用于将血管生成靶向部分和/或治疗活性剂偶联于聚合物骨架，但没有不利地影响血管生成靶向部分的靶向功能或者血管生成靶向部分和/或治疗活性剂的治疗效应的化学部分。
在一些实施方案中，该连接基是可生物降解的连接基。
在这里使用的短语“可生物降解的连接基”描述了当暴露于生理条件时能够降解或分裂的连接基。这种生理条件例如可以是pH、某种酶等。
在一些实施方案中，该连接基能够被预选择的细胞酶分裂，所述酶例如是成骨细胞、破骨细胞中存在的酶、癌细胞或增殖的内皮细胞的溶酶体。或者，可酸解的连接基可以包括酯或酰胺连接基，例如可以是顺式-aconityl连接基。这种连接基进一步增强这里所述的缀合物的治疗活性和减低毒性，通过使抗血管生成药物和/或阿仑膦酸盐仅仅在该所需身体部位释放。
根据本发明的一些实施方案，该可生物降解的连接基是pH 敏感性连接基和酶可分裂的连接基。
pH敏感性连接基包括只有当经受某个pH条件如酸性pH（例如低于7）、中性pH（6.5-7）或碱性pH（高于7）时分裂或降解的化学部分。
这种连接基例如可以设计来在酸性或碱性条件下进行水解，因此，在身体内，该缀合物保持完整无损，不释放连接于聚合物的药剂，直到它到达pH分别为酸性或碱性的生理环境。
示例性的pH 敏感性连接基包括，但不限于腙键，酯(包括原酸酯)键，例如顺式aconityl残基的酰胺键，三苯甲基，缩醛，酮缩醇，丙氨酸酯，Gly-酯和-[ Gly-Phe-Gly ]-部分。
在一些实施方案中，该可生物降解的连接基是酶可分裂的连接基。这种连接基典型地被设计成包括化学部分，典型但不仅仅是由预选择的酶所识别的氨基酸序列。这种氨基酸序列在本领域中常常被称为“识别基序”。包括这种连接基的缀合物一般在没有预选择的酶的存在下在其环境中保持基本完整，因此在与该酶接触之前不会分裂或降解以释放所连接的药剂。
在一些实施方案中，该酶可分裂的连接基通过在肿瘤组织中过度表达的酶来分裂。包括这种连接基的缀合物例如确保，大量的缀合的治疗活性剂仅仅在肿瘤组织中从缀合物中释放，因此减少了与药物的非选择性给药有关的副作用，进一步提高了药物在肿瘤部位的浓度。
适用于这些实施方案的示例性的酶包括，但不限于组织蛋白酶B，组织蛋白酶K，组织蛋白酶D，组织蛋白酶H，组织蛋白酶L，豆荚蛋白，MMP-2和MMP-9。
适合的连接基包括，但不限于，烷基链；任选被一个或更多个取代基取代且其中一个或更多个碳原子任选被氮、氧和/或硫杂原子插入的烷基链。
其它适合的连接基包括氨基酸和/或寡肽。
这种烷基链和/或寡肽可以任选被官能化，以便允许它们以共价键连接于所连接的部分（例如，聚合物骨架和靶向部分，聚合物和治疗活性剂）。这种官能化可以包括如以下详细描述的引入或产生参与这种共价键合的反应性基团。
在一些实施方案中，该连接基是可生物降解的寡肽，其含有例如2到10个氨基酸残基。
在一些实施方案中，该连接基是组织蛋白酶B-可分裂的连接基。
组织蛋白酶B是在上皮和内皮肿瘤细胞中过度表达的溶酶体酶。具有组织蛋白酶B可分裂的位点的适合连接基包括氨基酸序列，例如、但不限于是–[Cit-Val]-、–[Arg]-、–[Arg-Arg]-、-[Phe-Lys]-、[Gly-Phe-Leu-Gly]、-[Gly-Phe-Ala-Leu]-和–[Ala-Leu-Ala-Leu]-、-[Gly-Leu-Gly]-、-[Gly-Phe-Gly]-、-[Gly-Phe-Leu-Gly-Phe-Lys]-和它们的组合。
在一些实施方案中，该连接基包括氨基酸序列-[Gly-Leu-Gly]-、-[Gly-Phe-Gly]-、-[Gly-Leu-Phe-Gly]-、-[Gly-Phe-Leu-Gly]-、–[Phe-Lys]-和-[Gly-Phe-Leu-Gly-Phe-Lys]-。在一些实施方案中，该连接基由这些氨基酸序列或及其组合组成。
如上所述，PGA可以容易地被组织蛋白酶B降解为其无毒的基本成分，L-谷氨酸、D-谷氨酸和D,L-谷氨酸。
如在以下实施例部分中所证明的，组织蛋白酶B由药物与PGA聚合物的缀合物释放该抗血管生成剂紫杉醇(参见图10)。
基质金属蛋白酶(MMP)，尤其MMP-2和MMP-9，已经确定为恶性肿瘤进展的重要蛋白酶类。具有MMP-2和MMP-9可分裂部位的适合连接基包括、但不限于-[Gly-Pro-Gln-Gly-IIe-Ala-Gly-Gln]-、-[Gly-Pro-Leu-Gly-Ile-Ala-Gly-Gln]-、-[Gly-Pro-Gln-Gly-IIe-Trp-Gly-Gln]-和它们的组合。
在一些实施方案中，该连接基包括-[Gly-Phe-Leu-Gly]-。
在一些实施方案中，该连接基包括-[Gly-Pro-Leu-Gly-Ile-Ala-Gly-Gln]-。
含有预选择的氨基酸序列(识别基序)的寡肽连接基还可以被设计成识别基序在连接基内重复几次，从而增强连接的药物的选择性释放。相同或不同的酶的各种识别基序也能在连接基内引入。类似地，该连接基可以包括多个pH敏感性键或部分。包括这种多个可分裂的部位的连接基能够增强治疗活性剂在所需身体部位上的选择性释放，从而减小不良副作用，并进而在其显示活性时增强所释放的药物在身体部位上的相对浓度。
在血管生成靶向部分和/或治疗活性剂直接键合于聚合物骨架的情况下，连接这些部分的键也可以是可生物降解的，例如酶可分裂的键或pH敏感性键。这种键可以在将聚合物骨架、血管生成靶向部分和/或治疗活性剂官能化时形成，以便包括如这里所定义的相容的反应性基团，用于形成需要的键。
该肽连接基还可包括用于增加连接基的长度的肽序列。较长的肽可能是有利的，由于可接近性提高，从而连接基和分裂酶的空间相互作用更有效。
在一些实施方案中，该血管生成靶向部分经由间隔基连接于聚合物骨架或连接基。在一些实施方案中，该治疗活性剂经由间隔基连接于聚合物骨架或连接基。该间隔基可以是相同的或不同的。
这里所使用的术语“间隔基”描述了以共价键连接于聚合物骨架和连接基，或者血管生成靶向部分/治疗活性剂，并在其间插入的化学部分，从而在聚合物骨架和/或血管生成靶向部分/治疗活性剂之间形成桥样结构。或者，该间隔基可以以共价键连接并插入到连接基和治疗活性剂和/或血管生成靶向部分之间。
因此，根据本发明的一些实施方案，治疗活性剂和血管生成靶向部分的至少一种经由间隔基连接于聚合物骨架和/或连接基。
适合的间隔基包括，但不限于亚烷基链，其任选被一个或更多个取代基取代且任选插入一个或更多个氮、氧和/或硫杂原子。
其它适合的间隔基包括氨基酸和氨基酸序列，任选被一个或更多个反应性基团官能化，以便连接于聚合物骨架/血管生成靶向部分/治疗活性剂/连接基。
在一些实施方案中，该间隔基具有化学式 G-(CH2)n-K，其中n 是1-10的整数；且G和K各自是反应性基团，例如NH、O或S。在一些实施方案中，G和K各自是 NH，且n是2。
示例性间隔基是-[NH-(CH2)mNH2]-，其中“m”表示1-10的整数。优选地，m是2。图4B、4C和4D示出了其中将抗血管生成剂（即TNP470）连接于聚谷氨酸聚合物单元的间隔基是-[NH-(CH2)2NH2]- 的缀合物。
在一些实施方案中，该间隔基是氨基酸序列，任选惰性氨基酸序列(即，没有影响缀合物的亲和性或选择性)。这种间隔基能够用于延长或官能化连接基。
在一些实施方案中，该间隔基是谷氨酸残基(-E-)。例如，其中将血管生成靶向部分连接于聚谷氨酸聚合物骨架的间隔基是谷氨酸残基(-E-)的缀合物，如图 4D所示。
在一些情况下，基于位阻考虑（减小进行连接的聚合物的部位的位阻）或化学反应性考虑（将相容性反应性基团加到进行连接的聚合物的部位），间隔基用于能使血管生成靶向部分和/或治疗活性剂更有效和更简单连接于聚合物骨架或连接基。在某些情况下，该间隔基可以有助于所得缀合物的性能。例如，该间隔基可以减小酶可分裂的间隔基的位阻，因此对酶相互作用更敏感。
有时候，该间隔基通过改变连接了间隔基的治疗活性剂和/或血管生成靶向部分的溶解度（即更高疏水性或更高亲水性）而能够使缀合物的合成更有效和更简单。
在一些实施方案中，该间隔基是可降解的间隔基，其能够进行降解反应，以便释放所连接的药剂。在一些实施方案中，如本文所定义的，该间隔基是可生物降解的。
在一些实施方案中，该间隔基是用于将两个或更多个部分连接于聚合物骨架中的骨架单元的多价部分。示例性的这种间隔基是谷氨酸残基，其例如用于将两个环状的含RGD的部分连接于聚合物骨架。
间隔基还可以用于将其它药剂（例如如下文所述的标记剂）连接于缀合物。
该间隔基可以在长度和组成上改变，取决于位阻考虑，且可用来将血管生成靶向部分和/或治疗活性剂与聚合物骨架隔开。
如上所述，治疗活性剂和血管生成靶向部分的最佳加载度凭经验根据缀合物的所需性能（例如水溶性、治疗效力、药物动力学性质、毒性和剂量要求）和合成考虑（例如能够在所利用的合成模式中缀合于聚合物骨架的缀合的部分的量）来确定。
缀合了治疗活性剂的聚合物骨架内的骨架单元的数目在这里被定义为“y”，缀合了血管生成靶向部分的聚合物骨架内的骨架单元的数目在这里被定义为“w”，而聚合物骨架中的游离骨架单元（其不键合于其它部分）的数目在这里被定义为“x”。
根据一些实施方案，在这里描述的缀合物可以用通式I表示：
Figure 274452DEST_PATH_IMAGE004
其中：
x是整数，该整数的值应使得x/ (x+y+w)再乘以100是在0.01-99.9的范围内；
y是整数，该整数的值应使得y/ (x+y+w)再乘以100是在0.01-99.9的范围内；
w是整数，该整数的值应使得w/(x+y+w)再乘以100是在0.01-99.9的范围内。
A1、A2和A3 各自是以共价键相互连接且形成聚合物骨架的骨架单元，其中：
B是如本文所述的治疗活性剂；
D是如本文所述的血管生成靶向部分；
L1和L2 各自独立地是如本文所述的连接基或不存在；
使得[A2-L1-B]是连接有抗血管生成剂的骨架单元；以及
[A3-L2-D] 是连接有骨靶向部分的骨架单元；
其中，[A1]、[A2-L1-B]和 [A3-L2-D] 的每一个是连接于[A1]、 [A2-L1-B]和[A3-L2-D]之一的末端骨架单元，或者连接于[A1]、[A2-L1-B]和[A3-L2-D]的至少两个，且A1、A2和/或A3 相互连接，从而形成聚合物骨架。
在其中聚合物缀合物由HPMA衍生而来的一些实施方案中，A1是羟丙基甲基丙烯酰胺单元；且A2和A3 是甲基丙烯酰胺单元。
在其中聚合物缀合物由PGA衍生而来的一些实施方案中，A1是谷氨酸单元。
根据一些实施方案，本文所述的缀合物可以用通式II表示：
Figure 96914DEST_PATH_IMAGE005
其中B、D、L1、L2和 w、x、y如本文所定义。
根据一些实施方案，本文所述的缀合物可以用通式III表示：
Figure 176997DEST_PATH_IMAGE006
其中B、D、L1、L2 和w、x、y如本文所定义。
在一些实施方案中，该缀合物具有结构：
Figure 438214DEST_PATH_IMAGE007
其中w、x和y 如本文所定义。
在一些实施方案中，该缀合物具有结构：
Figure 107093DEST_PATH_IMAGE008
其中w、x和y 如本文所定义。
根据本发明的一些实施方案，x是整数，该整数的值应使得x/(x+y+w)再乘以100是在70-99.9的范围内；y是整数，该整数的值应使得y/(x+y+w)再乘以100是在0.01-15的范围内；以及w是整数，该整数的值应使得w/(x+y+w)再乘以100是在0.01-15的范围内。
例如，x/(x+y+w)再乘以100可以是71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或99.9；y/(x+y+w) 再乘以100可以是0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15；以及w/(x+y+w)再乘以100 可以是0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15。
根据本发明的一些实施方案，这里所述的缀合物进一步包括连接于其上的标记剂。
在一些实施方案中，该标记剂连接于未连接有治疗活性剂或靶向部分的一部分骨架单元。任选，该标记剂连接于连接基、间隔基或治疗活性剂或靶向部分的任何一个。标记剂与缀合物的连接能够利用这些缀合物来监测与血管生成有关的医学状况，例如监测由这里所述的缀合物显示出的治疗效应。
在这里使用的短语“标记剂”描述了可检测部分或探针。适用于这些实施方案的示例性的标记剂包括，但不限于，荧光剂，放射性试剂，磁性剂，发色团，生物发光剂，化学发光剂，磷光剂和重金属簇。
该短语“放射性试剂”描述了通过发射电离粒子和辐射而损耗能量衰变的物质(即放射性核素或放射性同位素)。当该物质衰变时，它的存在可以通过检测由其发射的辐射来测定。对于这些目的而言，特别有用的放射性衰变类型是正电子发射。示例性的放射性试剂 包括99mTc、18F、131I和 125I。
术语“磁性剂”描述了被吸引到外加磁场的物质。这些物质通常被用作造影剂，以便在磁共振成像（MRI）中改进内部身体结构的可视性。用于对比度增强的最常用的化合物是基于钆的。MRI造影剂改变存在它们的组织和体腔的松弛时间，这取决于图像加权，可以获得更高或更低的信号。
在这里使用的术语“发色团”描述了当连接于另一分子时使得后者着色，因此当进行各种分光光度测定时可见的化学部分。
术语“生物发光剂”描述了通过生化过程发光的物质。
术语“化学发光剂”描述了作为化学反应结果发光的物质。
短语“荧光剂”是指在暴露于外源的辐射的过程中在特定波长下发光的化合物。
短语“磷光剂”是指通过磷的缓慢氧化、不用明显的热或外部激发而发光的化合物。
重金属簇例如可以是所使用的金原子簇，例如用于在电子显微镜检查技术中标记。
这里所述的每一种缀合物可以进一步包括缀合于其上的其它部分。这种其它部分可以缀合于聚合物骨架内和整个聚合物骨架中的骨架单元，或者连接于聚合物骨架的一端或两端。
这种其它部分可以是如本文所述的标记剂，或者其它靶向部分或其它治疗活性剂，它们可以改进所形成的缀合物的性能。这种其它部分进一步可以是改善所形成的缀合物的溶解度、生物利用率和/或任何其它所需特征的部分。
如上所述，这里所述的缀合物包括具有肿瘤靶向特征的聚合物（由于EPR效应）、血管生成靶向部分和抗癌药/抗血管生成剂。因此，这里所述的缀合物被导向至以血管生成为特征的身体部位和/或癌症组织。如以上进一步描述的，这里所述的缀合物能够抑制血管生成以及细胞增殖，因此能够用于治疗以病理性过度血管生成为特征的疾病状况，其中血管生成和/或细胞增殖的抑制是有益的。
病理性血管生成已经在几种疾病中被证明，例如癌症、高血压、类风湿性关节炎和糖尿病性视网膜病。肿瘤生长和转移尤其取决于血管生成的程度。肿瘤血管生成是穿透到癌瘤中以便供给营养物和氧并除去废物的血管网络的增殖，因此导致肿瘤生长。肿瘤血管生成包括致癌基因的激素刺激和激活，血管生成生长因子的表达，血浆蛋白的外渗，临时细胞外基质（ECM）的沉积，ECM的降解，以及内皮毛细血管的迁移、增殖和伸长。进一步的血管扩张的抑制因此是活跃的癌症治疗研究的焦点。
如在以下实施例部分中所证明的，这里所述的缀合物能够显示出抗血管生成活性。
因此，根据本发明的实施方案的另一个方面，提供了在需要的受试者中治疗与血管生成有关的医学状况的方法。该方法通过将治疗有效量的这里所述的任何缀合物给药于受试者来进行。
因此，根据本发明的一些实施方案的另一个方面，提供了如本文所述的缀合物作为药物的用途。在一些实施方案中，该药物用于治疗与血管生成有关的医学状况。
根据本发明的一些实施方案的另一个方面，这里所述的缀合物被确定用于治疗与血管生成有关的医学状况。
在这里使用的术语“方法”是指用于完成既定任务的方式、手段、技术和工序，包括但不限于化学、药理、生物、生物化学和医学领域专业人员已知或容易由已知方式、手段、技术和工序中开发的那些方式、手段、技术和工序。
在这里使用的术语“治疗”包括消除、充分地抑制、减慢或逆转状况的进展，充分改善状况的临床或审美症状，或者充分防止状况的临床或审美症状的出现。
应理解的是，本发明的缀合物与其它药物联合给药，包括其它抗癌药和抗血管生成药物。此类联合在本领域中是已知的。
当可治疗的状况是癌症时，该术语将包括肿瘤生长或转移的任何抑制，或者抑制、减慢或消除肿瘤生长或转移的任何尝试。该方法包括通过细胞死亡的非凋亡机制以及凋亡机制杀死癌细胞。
在这里要指出的是，通过经由本文所述的方法靶向治疗活性剂，由于缀合物对过度血管生成部位的选择性，治疗活性剂的毒性被显著减小。因此，除了在临床循证疾病中任选与其它药物联合使用这里所述的缀合物以外，这些缀合物可以潜在地用作具有残留休眠癌的复发风险的个体的长期预防药。用于治疗处于癌症复发风险的无症状个体的无毒的靶向缀合物的使用可以导致癌症治疗的重要模式变化，以代替通常癌症在临床上明显之后才开始治疗的当前方法。
术语“癌细胞”描述了显示了不受控制的生长（分裂超过正常极限）的一组细胞。
短语“治疗有效量”描述了当给药于需要这种治疗或预防的受试者时足以进行治疗的化合物的量。如在这里使用的该短语描述了足以减少或防止血管生成(即，抑制组织中新血管形成) 和/或细胞增殖和/或杀死组织中业已存在的癌细胞的缀合物的量。
与血管生成有关并可通过这里所述的缀合物治疗的医学状况包括，但不限于，动脉粥样硬化，癌症，高血压，类风湿性关节炎，糖尿病和糖尿病相关并发症例如糖尿病性视网膜病和黄斑变性(MD)。术语“癌症”和“肿瘤”在本文可互换地用于描述一类疾病，其中一组细胞显示了失去控制的生长（分裂超过正常极限）。术语“癌症”包括恶性和良性肿瘤以及从原发肿瘤或继发肿瘤演变而来的疾病状况。术语“恶性肿瘤”描述了其生长非自限的，能够侵入到相邻组织中，并且能够蔓延到远处组织（转移）的肿瘤。术语“良性肿瘤”描述了非恶性的肿瘤（即不以无限制的侵袭性方式生长，不侵入周围组织，并且不转移）。术语“原发肿瘤”描述了位于其首先发生的初始部位的肿瘤。术语“继发肿瘤”描述了从其初始（原发）生长部位散布到接近或远离原发部位的另一部位的肿瘤。
由本文所述的缀合物治疗的癌症包括、但不限于实体癌，包括癌（carcinomas），以及非实体癌，包括血液学恶性肿瘤。癌包括但不限于腺癌和上皮癌。血液学恶性肿瘤包括白血病，淋巴瘤和多发性骨髓瘤。以下是能用本文所述的缀合物治疗的癌症的非限制性例子：卵巢癌，胰腺癌，脑癌，结肠癌，直肠癌，结肠直肠癌，黑色素瘤，肺癌，乳腺癌，肾癌和前列腺癌。
术语“癌症转移”描述了已经从原发肿瘤“脱离”、“漏出”或“泄漏”，进入淋巴管和/或血管，通过淋巴系统和/或血流循环，在身体其它部位的正常组织内定居和增殖，从而产生继发肿瘤的癌症细胞。
术语“动脉粥样硬化”描述了动脉的硬化，并且当动脉的正常内壁劣化、动脉壁增厚以及脂肪和斑块沉积时发生，引起动脉变窄（或甚至阻断）。动脉粥样硬化是心脏病发作、心脏病和中风的主要原因。基本上，斑块在动脉壁上形成是重要的，以致其开始阻断血流。当生命器官如心或肺失去富含氧的血液时，动脉粥样硬化变成威胁生命的状况。动脉粥样硬化的其它并发症是移动并在身体其它部位卡住的斑块形成和血块的脱离。
术语“糖尿病（diabetes）”与术语“糖尿症（diabetes mellitus）”可互换地使用，描述了一种多发病因学的代谢失调，特征在于由胰岛素分泌、胰岛素作用或二者的缺陷导致的具有碳水化合物、脂肪和蛋白质代谢扰乱的慢性高血糖。糖尿病的效应包括各种器官的长期损害、功能障碍和衰竭。目前，糖尿病区分为I型和II型。大部分I型糖尿病患者具有作为基础原因的胰腺β细胞的自身免疫破坏，绝对需要胰岛素疗法，不治疗将发生酮症酸中毒。在II型中，具有相对的胰岛素缺陷和胰岛素抵抗。在血糖控制与微血管并发症（即视网膜病，肾病和神经病）的发生和进展之间的原因关联是充分确定的。由于微血管受累，任何组织可以受糖尿病影响。
术语“糖尿病”包括主要由血管损害（血管病）引起的糖尿病相关并发症。示例性的糖尿病并发症包括，但不限于糖尿病性视网膜病(视网膜损害)，其可以最后导致失明；糖尿病性神经病变，其特征在于异常和减弱的感觉，通常以脚开始的“手套长袜样”分布，但可能有其它神经，以后常常是手指和手；糖尿病性肾病，以肾损害为特征，其可以导致慢性肾衰竭；和糖尿病性心脏病，其特征在于心脏损害，导致心脏舒张功能障碍和最后心力衰竭。
术语“高血压”描述了其中血压慢性升高的医学状况。在目前的用法上，没有修饰词的措辞“高血压”正常是指全身性动脉高压。高血压可以分为基本（原发）或继发。基本性高血压是指，不能够发现特定的医学原因来解释患者的状况。大约95 %的高血压是基本性高血压。继发性高血压是指，高血压是其它状况如肾脏疾病或肿瘤(肾上腺腺瘤或嗜铬细胞瘤)的结果（继发于其它疾病）。持续的高血压是中风、心脏病发作、心力衰竭和动脉瘤的危险因素之一，并且是慢性肾衰竭的主要原因。
术语“类风湿性关节炎”描述了可以影响许多组织和器官的慢性、全身性炎症性疾病，但主要攻击关节，产生炎症性滑膜炎，这常常发展为关节软骨的破坏和关节僵硬。类风湿性关节炎还可以产生在肺、心包、胸膜和巩膜的扩散炎症，以及结节状的损害，最通常在皮肤下的皮下组织中。虽然类风湿性关节炎的原因是不知道的，但是自身免疫在其慢性和进展中起着关键的作用。
由于本文所述的缀合物被靶向至以血管生成为特征的身体部位的能力，该缀合物可以进一步用于检测患者体内的血管生成的水平。根据本发明的这些实施方案的方法通过将如这里所述的具有连接于聚合物的标记剂的本文所述的任何缀合物给药于受试者，并且使用成像技术来监测缀合物在身体内或身体一部分内的分布来进行。
例如，肿瘤部位的血管生成的水平可以用作肿瘤大小以及肿瘤细胞中的代谢活动的水平的衡量标准。
其中血管生成的水平通过这里所述的缀合物来监测可能有益的疾病状况的其它实例可以是动脉粥样硬化，高血压，类风湿性关节炎，糖尿病和糖尿病相关并发症。
因此，根据本发明的一些实施方案的另一个方面，提供了具有这里所述的标记剂的这里所述的任何缀合物作为诊断剂和/或用于制备监测与血管生成有关的医学状况的诊断剂的用途。
根据本发明的一些实施方案的另一个方面，包括标记剂的这里所述的每一种缀合物被确定用作诊断剂，用于监测与血管生成有关的医学状况。
适合的成像技术包括但不限于正电子发射断层摄影术(PET)，γ-闪烁扫描术，磁共振成像(MRI)，功能磁共振成像( FMRI)，脑磁波描记法(MEG)，单光子发射计算机化断层摄影术(SPECT)，计算机轴向断层摄影术(CAT)扫描，超声波，荧光检查和普通X射线成像。适当的成像技术的选择取决于标记剂的性质，并且是现有技术。例如，如果该标记剂包括Gd离子，那么该适当的成像技术是MRI；如果该标记剂包括放射性核素，适当的成像技术是γ-闪烁扫描术；如果该标记剂包括超声波剂，超声波是该适当的成像技术，等等。
以上所述的缀合物可以直接或作为其药用盐、对映异构体、非对映异构体、溶剂化物、水合物或前药在本发明的这个和其它方面给药或另外利用。
短语“药用盐”是指母体化合物的带电物质和其抗衡离子，其通常用于改变母体化合物的溶解度特性和/或减小母体化合物对生物体的任何明显的刺激，同时不废除给药化合物的生物活性和性质。化合物的中性形式优选通过让盐与碱或酸接触并以常用方式分离母体化合物来再生。化合物的母体形式与各种盐形式不同之处在于某些物理性能，例如在极性溶剂中的溶解性，但对于本发明来说在其它方面该盐等同于该化合物的母体形式。短语“药用盐”意欲包括用相对无毒的酸或碱制备的活性化合物的盐，取决于存在于这里所述的化合物上的特定取代基。当本发明的缀合物含有相对酸性的官能度时，碱加成盐能够通过让中性（即非电离的）形式的这种缀合物与足够量的所需碱（纯净或在适合的惰性溶剂中）接触来获得。药用碱加成盐的实例包括钠盐、钾盐、钙盐、铵盐、有机氨基盐或镁盐，或类似盐。当本发明的缀合物含有相对碱性的官能度时，酸加成盐能够通过让中性形式的这种缀合物与足够量的所需酸（纯净或在适合的惰性溶剂中）接触来获得。药用酸加成盐的实例包括由无机酸如盐酸、氢溴酸、硝酸、碳酸、一氢碳酸、磷酸、一氢磷酸、二氢磷酸、硫酸、一氢硫酸、氢碘酸或亚磷酸等衍生的盐，以及由相对无毒的有机酸如乙酸、丙酸、异丁酸、马来酸、丙二酸、苯甲酸、琥珀酸、辛二酸、富马酸、乳酸、扁桃酸、邻苯二甲酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、柠檬酸、酒石酸、甲磺酸等衍生的盐。还包括氨基酸的盐如精氨酸盐等，以及有机酸盐如葡糖醛酸或半乳糖醛酸等的盐 (例如参见Berge等人, "Pharmaceutical Salts", Journal of Pharmaceutical Science, 1977, 66, 1-19)。本发明的某些特定的缀合物含有允许缀合物转化为碱或酸加成盐的碱性和酸性官能度。
缀合物的中性形式优选通过让盐与碱或酸接触并以常用方式分离母体缀合物来再生。缀合物的母体形式与各种盐形式不同之处在于某些物理性能，例如在极性溶剂中的溶解性，但对于本发明来说在其它方面该盐等同于该缀合物的母体形式。
术语“前药”是指药剂，其在体内转化为活性化合物(活性母体药物)。前药典型地用于促进母体药物的给药。该前药还可以具有与药物组合物中的母体药物相比改进的溶解度。前药还常常用于获得活性化合物在体内的持续释放。
这里所述的缀合物可以具有不对称碳原子(光学中心)或双键；外消旋物、非对映异构体、几何异构体和单一异构体是在本发明范围内。
在这里使用的术语“对映异构体”描述了仅仅通过彼此的完全反转/反射（镜像）相对于其对应物可重合的的化合物的立体异构体。对映异构体据说具有手型性，因为它们彼此就像右手和左手一样。对映异构体具有相同的化学及物理特性，除了当存在于本身具有手型性的环境如所有生物系统中时以外。
在这里描述的缀合物能够以非溶剂化形式以及溶剂化形式（包括水合形式）存在。通常，溶剂化形式等同于非溶剂化形式，并且包括在本发明范围内。本发明的某些缀合物可以多种结晶或无定形形式存在。通常，所有物理形式对于本发明所考虑的用途来说是等同的，并且被确定为在本发明的范围内。
术语“溶剂化物”是指可变化学计量的复合物(例如二-，三-，四-，五-，六-等)，其由溶质(这里所述的缀合物)和溶剂形成，由此，该溶剂不干涉该溶质的生物活性。适合的溶剂包括例如乙醇、乙酸等等。
术语“水合物”是指如上文所定义的溶剂化物，其中溶剂是水。
根据本发明的实施方案的另一个方面，提供了药物组合物，其包括作为活性成分的如本文所述的任何缀合物和药用载体。
因此，在这里所述的任何方法和用途中，这里所述的任何缀合物能够直接或作为与药用载体混合的药物组合物的一部分提供给个体。
在这里使用的“药物组合物”是指这里所述的一种或更多种缀合物(活性成分)或其生理上可接受的盐或前药与其它化学组分的制剂，所述其它化学组分包括但不限于生理适合的载体，赋型剂，润滑剂，缓冲剂，抗菌剂，增量剂(例如甘露糖醇)，抗氧化剂(例如，抗坏血酸或亚硫酸氢钠)，抗炎剂，抗病毒剂，化疗剂，抗组胺剂等。药物组合物的目的是促进化合物向受试者的给药。术语“活性成分”是指产生生物效应的化合物。
术语“生理上可接受的载体”和“药用载体”可互换地使用，是指不引起对生物体的显著刺激并且不废除所给药的化合物的生物活性和性质的载体或稀释剂。
在这里，术语“赋型剂”指加入到药物组合物中以进一步促进药物给药的惰性物质。赋型剂的非限制性实例包括碳酸钙，磷酸钙，各种类型的糖和淀粉，纤维素衍生物，明胶，植物油和聚乙二醇。
药物配制和给药的技术可以在“Remington’s Pharmaceutical Sciences” Mack Publishing Co., Easton, PA, 最新版中找到，该文献在此处通过援引并入。
根据本发明使用的药物组合物因此可以按惯用方式使用一种或更多种包括赋型剂和助剂的药用载体（其促进将化合物加工成能够药物学上使用的制剂）来配制。适当的制剂取决于所选择的给药途径。该剂量可以根据所使用的剂型和所利用的给药途径来改变。确切的制剂、给药途径和剂量可以由各个医生根据患者的状况来选择 (参见例如Fingl等人, 1975, “The Pharmacological Basis of Therapeutics”, 第1章第1页)。
该药物组合物可以配制用于按一种或更多种途径来给药，根据是否选择局部或全身治疗或给药以及所要治疗的区域。给药可以通过口服，吸入，胃肠外，例如通过静脉滴注法或腹膜内、皮下、肌内或静脉注射，或者局部给药（包括经眼、经阴道、经直肠、鼻内）来进行。用于局部给药的制剂可包括但不限于洗液，软膏，凝胶，霜剂，栓剂，滴剂，液体、喷雾剂和粉末。常用的药物载体、水、粉末或油基、增稠剂等可能是必需的或所希望的。
口服给药用组合物包括粉末或颗粒、在水或非水介质中的悬浮液或溶液、袋、药丸、小胶囊、胶囊或片剂。增稠剂、稀释剂、香料、分散助剂、乳化剂或粘结剂可能是所希望的。
用于胃肠外给药的制剂可以包括但不限于无菌溶液，其还可以含有缓冲剂、稀释剂和其它适合的添加剂。缓释组合物被考虑用于治疗。
所要给药的组合物的量当然将取决于所要治疗的受试者、痛苦的严重度、给药方式、开处方医生的判断等。
该药物组合物可以进一步包括其它药物学活性剂或非活性剂，例如，但不限于杀菌剂，抗氧化剂，缓冲剂，增量剂，表面活性剂，抗炎剂，抗病毒药剂，化疗剂和抗组胺药。
根据本发明的一个实施方案，上述组合物包装在包装材料中，并且在包装材料中或包装材料上在印刷物中标识用于治疗与血管生成有关的医学状况。
根据本发明的另一个实施方案，该组合物包装在包装材料中，并且在包装材料中或包装材料上在印刷物中标识用于监测与血管生成有关的医学状况。
如果需要，本发明的组合物可以存在于包装或分配器设备如FDA批准的药盒中，其可以含有一个或更多个含有活性成分的单位剂型。该包装例如可以包括金属或塑料薄膜，如泡罩包装。该包装或分配器装置可附有给药说明。该包装或分配器还可以容纳由管理药物制造、使用或销售的政府机构指定的形式的与容器有关的注意事项，该注意事项反映了由机构批准的组合物或人或兽医给药的形式。这种注意事项例如可以是用于处方药物的由美国食品与药物管理局批准的标记或批准的产品插入物。
在将本发明付诸实施的时候，本发明人已经设计和成功地实施用于将治疗活性剂、血管生成靶向部分和任选的标记剂缀合于聚合物上的新型方法。有人指出合成这种聚合物缀合物受到由以下因素施加的各种限制：所要缀合的部分的不同溶解度、缀合物的最佳性能所要求的复杂的所需结构特征、反应剂的不相容性等。因此，设计克服这些限制且被用来获得显示出至少合理的性能的缀合物的方法是高度有利的。
根据本发明的实施方案的另一个方面，提供了制备如本文所述的缀合物的方法。该方法如下进行：
(a) 将形成聚合物骨架的多种单体单元共聚合，至少一种单体单元用第一反应性基团终端，且至少一种单体单元用第二反应性基团终端，因此获得包括多种骨架单元的共聚物，至少一种骨架单元具有第一反应性基团，且至少一种骨架单元具有第二反应性基团，所述第一反应性基团能够与血管生成靶向部分反应，且第二反应性基团能够与治疗活性剂反应；
(b) 让该共聚物与该血管生成靶向部分或其衍生物经由第一反应性基团反应，从而获得血管生成靶向部分连接于聚合物骨架的共聚物；以及
(c) 进一步让该共聚物与该治疗活性剂或其衍生物经由第二反应性基团反应，从而获得治疗活性剂连接于聚合物骨架的共聚物，
从而获得缀合物。
在一些实施方案中，(b)在(c)之后、与(c)同时或在(c)之前进行。因此，该方法可以如下进行，首先让治疗活性剂与官能化聚合物骨架反应，从而获得连接有治疗活性剂的聚合物骨架，然后让血管生成靶向部分与官能化聚合物骨架反应，从而获得该缀合物。
共聚合能够通过使用本领域中已知的任何聚合方法来进行。
在一些实施方案中，用第一反应性基团终端的至少一种单体单元包括多个第一单体单元。
在一些实施方案中，用第二反应性基团终端的至少一种单体单元包括多个第二单体单元。
这里所述的用反应性基团终端的单体单元在这里也称为官能化单体或官能化单体单元。
由共聚合形成的共聚物在这里也称为官能化共聚物或官能化聚合物骨架。
在一些实施方案中，该共聚合可以在形成聚合物骨架且非官能化的单体单元的存在下进行。
第一和第二反应性基团的每一个可以在各自的缀合之前进行保护。在此情况下，该方法进一步包括在该各自缀合之前将反应性基团去保护。
这允许进行例如治疗活性剂与包括可生物降解的连接基的那些骨架单元的区域受控的缀合。
在这里使用的“反应性基团”描述了能够与另一基团反应以形成化学键（通常是共价键）的化学基团。任选地，形成了离子键或配位键。
反应性基团如果与想要连接的药剂或部分的反应性基团化学上相容则照此称谓。例如，羧基是适合于缀合用胺基终端的药剂或部分的反应性基团，反之亦然。
其它的示例性的反应性基团包括，但不限于，羟基，硝基，卤素，卤代烷基，羧酸酯，硫醇，硫代羧酸酯等。
反应性基团能够固有地存在于聚合物的单体单元和/或血管生成靶向部分和治疗活性剂中，或者通过化学改性其上的化学基团或通过将用所需反应性基团终端的间隔基或连接基连接于这些化学基团上来产生。
如上所述，这里所述的缀合物被设计成在所需身体部位（即广泛血管生成的部位）中释放治疗活性剂和血管生成靶向部分。因此，该治疗活性剂和血管生成靶向部分经由直接连接连接于聚合物，或经由间接连接通过连接基连接于聚合物，从而，在一些实施方案中，该直接/间接连接基被设计成在所需身体部位特有的条件下可分裂(例如通过某些酶或pH)。
例如，当聚合物是聚谷氨酸(PGA)时，该方法可以包括将治疗活性剂和血管生成靶向部分直接连接于谷氨酸氨基酸的羧基。
或者，该方法可以包括使用这里所述的连接基，由此该连接基在共聚合之前连接于单体单元，以便获得其中一部分骨架单元连接有连接基的聚合物骨架。另外，或者，该连接基可以连接于官能化聚合物骨架中的反应性基团。任选，该连接基可以首先连接于治疗活性剂和/或血管生成靶向部分，然后连接于官能化聚合物骨架中的各反应性基团。连接治疗活性剂的连接基和连接血管生成靶向部分的连接基可以是相同或不同的。
因此，在一些实施方案中，这里所述的方法应使得至少一种(a)的单体单元包括这里所述的连接基，其中该连接基用反应性基团终端，且其中血管生成靶向部分经由该连接基连接于聚合物。
在一些实施方案中，这里所述的方法应使得至少一种(a)的单体单元包括这里所述的连接基，其中该连接基用反应性基团终端，且其中治疗活性剂经由该连接基连接于聚合物。优选地，这里所述的方法应使得血管生成靶向部分也经由这里所述的连接基连接于聚合物。
任选地，该方法可以包括将这里所述的间隔基连接于聚合物的骨架单元，然后连接于治疗活性剂和/或血管生成靶向部分。或者，该间隔基可以首先连接于治疗活性剂和/或血管生成靶向部分，然后连接于聚合物。
因此，在聚合物是PGA的情况下，该方法例如可以通过将间隔基(例如NH2(CH2)2NH2) 连接于治疗活性剂和/或血管生成靶向部分，随后将所连接的间隔基连接于谷氨酸氨基酸的羧酸基团（例如通过将间隔基的胺基连接于PGA的羧基，从而获得酰胺键）来进行。
应该领会的是，如以上详细所述的，用于将治疗活性剂和/或血管生成靶向部分连接于聚合物的间隔基和连接基被设计成允许平稳而有效地缀合各个部分并提供所得缀合物的最佳性能。
在聚合物和/或治疗活性剂和/或血管生成靶向部分此外包括连接基的情况下，该合成方法可以包括将间隔基连接于连接基部分，而非直接连接于包含该连接基的聚合物/药剂/部分。
通常，通过已经存在于天然分子和/或聚合物的骨架单元中或者能够通过合成有机化学中公知的工序引入而不改变药剂的活性的官能团，该治疗活性剂或血管生成靶向部分可以连接于聚合物的单体单元或共聚物的骨架单元。例如，血管生成靶向部分和治疗活性剂可以经由肽连接基的末端羧基和位于血管生成靶向部分和/或治疗活性剂的胺基之间的酰胺键连接于聚合物。
在一些实施方案中，该方法此外包括将如这里定义的标记剂连接于所形成的缀合物。该标记剂可以连接于共聚前的官能化单体单元的任一个或所形成的共聚物。
在一些实施方案中，该标记剂与血管生成靶向部分一起连接于共聚物上。或者，它在连接于血管生成靶向部分和/或治疗活性剂之前或之后连接。
在一些实施方案中，该方法包括将用第三反应性基团终端的单体单元与本文所述的官能化和非官能化单体单元一起共聚合，第三反应性基团用于缀合如本文所述的标记剂或任何其它附加部分。
因此，在本发明的任意实施方案中所述的每一种缀合物可以此外包括缀合的其它部分。这种其它部分可以缀合于聚合物骨架内和整个聚合物骨架中的单体单元，或者连接于聚合物骨架的一端或两端。
这种其它部分可以是如本文所述的标记剂，或者其它靶向部分或其它治疗活性剂，它们可以改进所形成的缀合物的性能。这种其它部分进一步可以是改善所形成的缀合物的溶解度、生物利用率和/或任何其它所需特征的部分。
这里所使用的措辞“大约”表示±10%。
措辞“包括”、“包含”、“含有”、“具有”以及它们的同根词表示“包括但不限于”。
措辞“由...组成”表示“包括并限于”。
措辞“基本上由……组成”是指该组合物、方法或结构可以包括其它成分、步骤和/或部件，只要该其它成分、步骤和/或部件不显著改变所要求的组合物、方法或结构的基本和新型特征。
在这里使用的单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指示物，除非文中另有明确规定。例如，措辞“化合物”或“至少一种化合物”可以包括许多化合物，包括它们的混合物。
在整个本申请中，本发明的各种实施方案可以范围形式存在。应该理解的是，范围形式的说明仅仅为了方便和简明起见，而不应被视为对本发明的范围的硬性的限制。因此，范围的说明应该被认为已经具体地公开了所有可能的子范围以及该范围内的单个数值。例如，例如1-6的范围的说明应该被认为已经具体地公开了例如1-3，1-4，1-5，2-4，2-6，3-6等子范围以及在该范围内的例如1，2，3，4，5和6的单个数值。不论范围的宽度，这均适用。
在本文指定数值范围时，这意味着包括在该指定范围内的任何列举的数值（分数或整数）。短语“在第一指定数值和第二指定数值之间的范围”和“从第一指定数值到第二指定数值的范围”这里可互换地使用，意图包括第一指定数值和第二指定数值以及在它们之间的所有分数和整数。
应该领会到，本发明的某些特征，为了清楚起见，在不同的实施方案的上下文中进行了描述，但还可能在单个实施方案中组合地提供。相反地，为了简便起见在单个实施方案的上下文中描述的本发明的各种特征，也可以独立地或以任何适合的子组合提供，或者如果适当的话在本发明的所述任何其它实施方案中提供。在各种实施方案中所述的某些特征不应被视为这些实施方案的必需特征，除非该实施方案没有这些要素不会起作用。
如上所述和在以下权利要求部分中所要求的本发明的各种实施方案和方面可以在以下实施例中找到实验支持。
实施例
现在参考以下实施例，其与以上说明一起按非限制方式举例说明本发明。
材料和方法
概述：
需要无水条件的全部反应在氩气或氮气氛围中进行。
化学品和溶剂是分析试剂等级或用标准技术提纯。
薄层色谱法(TLC)：硅胶板 Merck 60 F254; 化合物通过UV光和/或通过用磷钼酸溶液 (20wt%乙醇溶液)或茚三酮 (10 wt% 乙醇溶液)处理来观察，随后加热。
尺寸排阻色谱法 (SEC): Shephadex G25树脂，洗脱剂H2O。SEC 分析使用Viscotek TDATM 三重检测器系统进行，具有串联的两根TSK-gel柱 (G3000 PWXL和G2500 PWXL) 和保护柱 (PWXL Guardcol)。使用0.8 ml/min的流速和流动相0.1 M PBS缓冲液。使用Viscotek Instrument 软件进行数据分析。HPLC使用具有Lichrospher® 100 C18 (150 x 3.9 mm)柱的 Merck Hitachi L-2130 HPLC 泵和L-2200 自动取样器以及作为流动相的在0.1 % TFA水溶液中的不同乙腈梯度来进行。用 Jasco V-530 UV/Vis分光光度计记录紫外光谱。
快速色谱法 (FC): 硅胶Merck 60 (粒度0.040-0.063 mm), 洗脱剂在括号内给出。
1H NMR: Bruker AMX 200 或 400仪器。化学位移用相对于TMS (δ=0 ppm) 的δ 和耦合常数 J （Hz）表示。光谱在作为溶剂的CDCl3中在室温下记录。
400 Mesh copper grid SPI Supplies, West Chester, PA.
所有化学试剂，包括N,N-二异丙基碳二亚胺 (DIC)、1-羟基苯并三唑 (HOBt)、二异丙基乙胺 (DIEA)、N-羟基琥珀酰亚胺(OHSuc)、N,N´-二甲基氨基吡啶 (DMAP)和无水二甲基甲酰胺(DMF)，从Sigma-Aldrich Química S.A. (Madrid, Spain) 购买，并不用进一步提纯而直接使用。
所有溶剂为HPLC等级，由Merck (西班牙巴塞罗那)获得，紫杉醇从Petrus Chemicals and Materials Ltd (Israel)购买。E-[c(RGDfk)2]和c(RADfk)从Peptides International, Louisville, KY, USA购买。c(RGDfk) 从Matthias Barz和Dr. R. Zentel教授 (University of Mainz, Germany)处获得。纤连蛋白从Biological Industries Ltd (Beit Haemek, Israel)购买。纤维蛋白原购自Sigma-Aldrich (Israel)。荧光染料Oregon green cadaverine 购自Molecular Probes。所有其它的试剂是一般实验室等级的，从Merck处购买，除非另有说明。
抗-ERK1/2 MAPK、P-ERK1/2 MAPK、AKT和P-AKTSer473抗体从Cell Signaling Technology Ltd处购买。Bax、抗分裂的PARP、半胱天冬酶-3和半胱天冬酶-9 从Cell Signaling Technology Ltd处购买。
道德规范声明：
所有动物试验根据Tel Aviv University , Sackler School of Medicine指南以及the Institutional Animal Care and Use Committee批准的规程来进行。体重和肿瘤尺寸一周三次进行测定。
细胞培养：
U87 人恶性胶质瘤 和MG-63-Ras人骨肉瘤细胞从美国典型微生物菌种保藏中心（the American Type Culture Collection） 获得(ATCC # HTB-14)。MG-63-Ras 细胞如前所述用活化ras转染(MG-63-Ras) [Segal等人，2009 PLoS ONE, 4:e5233,]，以便产生体内快速生长的肿瘤细胞系。mCherry-标记的MG-63-Ras 人骨肉瘤细胞系和mCherry-标记的U87 人恶性胶质瘤通过如前所述的 pQC-mCherry 逆转录病毒载体[Segal等人, 2009, PloS ONE 4:e5233]来感染来获得。该受感染细胞被选择用于使用嘌呤霉素的mCherry的稳定表达。
PANC02鼠胰腺肿瘤细胞由Corbett等人，Cancer Res. 1984 44:717-726建立，在达尔伯克氏改良伊格尔培养基(DMEM)中培养，该培养基补充有10 %胎牛血清(FBS)，100 mg/ml青霉素，100 U/ml链霉素，12.5 U/ml制霉菌素，2 mM L-谷氨酰胺，1mM丙酮酸钠和MEM-EAGLE非必需氨基酸(Biological Industries，Israel)。
人脐静脉内皮细胞(HUVEC)从瑞士的Lonza购买。细胞在内皮细胞生长培养基-2 (EGM-2) (Cambrex,USA)中培养。MCF7/Cyr61细胞在补充了10%胎牛血清（FBS）的达尔伯克氏改良伊格尔培养基(DMEM)中培养。
所有细胞在37℃; 5 % CO2下培养。
MCF-7/Cyr61细胞系的萤光素酶感染：
为了产生稳定的表达萤光素酶的MCF-7/Cyr61细胞系(过度表达蛋白CYR61并具有紫杉醇抗性)，MCF7/Cyr61细胞用携带萤火虫萤光素酶基因的pBabe逆转录病毒载体转染，并使用Biospace Photon Imager按照总动物成像系统中的生物发光进行体外和体内试验。为了对比，不表达CYR61和因此不具有紫杉醇抗性的对照MCF-7细胞也用萤火虫萤光素酶基因或mCherry转染。
Western印迹：
为了评价蛋白的表达水平，细胞用磷酸盐缓冲盐水(含有0.25 mM EDTA的PBS）收获，并溶解在补充有蛋白酶抑制剂（CompleteTM 溶液，Boehringer-Manheim）和2 mM Na3VO4的20 mM Tris、150 mm NaCl、1% Triton X-100，pH 7.5中。将细胞碎片造粒，蛋白浓度在使用BCA试剂（Pierce）的上清液中测定。蛋白通过SDS-PAGE分离，转移到硝酸纤维素薄膜上，并用相关的第一抗体免疫印迹分析2小时。在Tris缓冲盐水吐温（TBS-T）洗涤之后，添加过氧化物酶缀合的IgG（Jackson），膜再次用TBS-T洗涤，通过West Pico Chemiluminescent Substrate（Pierce）检测免疫活性带。
流式细胞术分析：
为了评价细胞培养物中的凋亡的水平，在用根据本发明的实施方案的代表性缀合物—PGA共聚物-c(RGDfk)2-紫杉醇和HPMA共聚物-c(RGDfk)2-紫杉醇的不同处理之后，收获细胞，用甲醇固定，再悬浮于PBS中。添加荧光标记物碘化丙啶(50μg/ml)用于核染色，细胞在荧光活化细胞分类器(FACS装置，Inter-departmental Facilities，Faculty of Medicine Tel Aviv University)中分析。
细胞增殖试验：
这里所述的缀合物的抗血管生成和抗增殖活性通过缀合物对HUVEC、U87和PANC02细胞的增殖的效应来评价。
将HUVEC平板接种到24孔板(1×104 细胞/孔)中的补充有5 %胎牛血清(FBS)的内皮细胞基础培养基2 (EBM-2；Cambrex，USA)中。在24小时的孵育(37℃；5% CO2)之后，培养基用内皮细胞生长培养基-2 (EGM-2；Cambrex, USA)替换。将U87和PANC02细胞平板接种到96孔板(2×103细胞/孔)的补充有5%FBS的DMEM中，并孵育24小时（37℃；5%CO2）。在24小时的孵育之后，培养基用含有10%FBS的DMEM替换。细胞用试验化合物在系列浓度下攻击72小时。在孵育之后，通过库尔特计数器对HUVEC的数目计数，并分别用XTT对U87和PANC02细胞计数 。
α v β 3 表达检测：
HUVEC、U87和Panc02用含有2.5 mM EDTA的PBS收获，随后将细胞再悬浮于无血清培养基(HUVEC用EBM-2，U87和Panc02用DMEM) 中，并孵育30分钟。将细胞分离，进一步再悬浮于含有Mg2+和Ca2+的PBS中。细胞然后与第一抗体MAB1976-抗αvβ3整联蛋白 (Chemicon, 1:20) 在室温和温和的振动下一起孵育30分钟。用作对照的是不用任何抗体孵育的细胞。然后，将细胞洗涤，再悬浮在具有第二抗体抗小鼠-FITC (Jackson，1:50)的PBS中，在室温和温和的振动下避光孵育30分钟。细胞(1×105)通过荧光-激活细胞分类器(FACS)收集，再使用WinMDI软件进行统计分析。
α v β 3 与荧光标记的缀合物的相互作用：
通过将游离羧基将荧光探针，Oregon Green-cadaverine(OG)，缀合于PGA缀合物（参见实施例5的合成描述），以便研究细胞摄取和运输。
将HUVEC平板接种到6mm板(5×105 细胞/板)的补充有5% FBS的EBM-2 (Cambrex，USA)中。在24小时的孵育(37℃; 5 % CO2)之后，细胞用在EGM-2培养基中稀释的PGA-OG、PGA-c(RADfk)-OG或PGA-E-[c(RGDfk)2]–OG攻击5、10、15、30或60分钟。细胞然后在PBS (X3)中洗涤，用含有2.5 mM EDTA的PBS收获，用ImageStream 100 成像流式细胞仪(Amnis)分析。分析使用 IDEAS 软件进行。
毛细血管状管形成试验：
该缀合物的抗血管生成活性通过缀合物对HUVEC细胞形成毛细血管状管状结构的能力的效应来评价。
24孔板的表面用Matrigel基质(50μl/孔) (BD Biosciences，USA)冰冻包被，然后在37℃下聚合30分钟。HUVEC (3×104细胞) 用试验化合物攻击，并在包被板上在完全EGM-2培养基的存在下接种。在8小时的孵育(37℃；5% CO2)之后，孔使用与Nikon DS5冷却CCD摄像机结合的Nikon TE2000E倒置显微镜通过4X物镜、明视野技术进行成像。在管形成试验过程中，内皮细胞定向地迁移，以排列、分支和形成多角网络（即，管状结构）。毛细血管样管状结构的程度与化合物的抗血管生成活性成反比。
迁移试验：
缀合物的抗血管生成活性通过检查缀合物对HUVEC向血管内皮细胞生长因子（VEGF）迁移的能力的效应来评价。
细胞迁移试验通过用试验化合物攻击2小时的10 µg/ml纤连蛋白HUVEC (15×104 细胞/100 µl) 包被的改良8 µm Boyden chambersTranswells® (Costar Inc., USA) 来进行，该试验化合物加入到transwells的上室中。在孵育之后，在下室中存在或不存在VEGF(20 ng/ml)的情况下，让细胞迁移到该室的下侧达4小时。然后将细胞固定，再染色 (Hema 3 Stain System; Fisher Diagnostics, USA)。被染色的迁移细胞使用与Nikon DS5冷却CCD摄像机结合的Nikon TE2000E倒置显微镜通过10X物镜、明视野照明来成像。每一膜的捕捉图像的迁移细胞使用NIH图像软件计数。迁移标准化为不用任何化合物孵育的HUVEC向VEGF迁移的百分率。迁移的程度与化合物的抗血管生成活性成反比。
内皮细胞粘附试验：
在缀合之后缀合物中的E-[c(RGDfk)2]和E-c(RGDfk)部分抑制内皮细胞附着到细胞基质的能力使用粘附试验进行评价。平底96孔培养皿(Nunc，Denmark)用0.5μg/孔的纤维蛋白原在4℃下包被过夜。在用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤三次之后，孔用1% 牛血清白蛋白（BSA）在37℃下封闭1小时，再次用PBS洗涤三次。HUVEC 在含有2.5 mMEDTA的磷酸盐缓冲盐水 (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 4.3 mM Na2HPO4, 1.4 mM KH2PO4, pH 7.3) 中收获，再悬浮于EBM-2 无血清培养基(Clonetics)中。将HUVEC在室温下用试验化合物孵育30分钟。将所处理的HUVEC以 5x104 细胞/孔的密度平板接种，并在37℃下附着1小时。在孵育后，未附着的细胞通过用PBS冲洗孔来除去。附着的细胞用3.7 %甲醛固定，用0.5 %结晶紫染色，使用与Nikon DS5冷却CCD摄像机结合的Nikon TE2000E倒置显微镜通过4X物镜、明视野技术来成像。附着的细胞的数目用NIH ImageJ处理和分析软件来定量。非特异性结合通过未用任何试验化合物孵育的HUVEC细胞与BSA包被的板的粘附来测定。
合成缀合物中的游离紫杉醇和游离肽的 % 的测定：
为了测定合成缀合物中的游离紫杉醇 (PTX)和游离肽 [c(RGDfk)2或c(RGDfk)或对照游离c(RADfk)]含量，制备缀合物的水溶液(1 mg/ml)，并将每一缀合物溶液的等份试样 (100 μl)加入到聚丙烯管内，随后添加水至1ml的体积。然后，添加5 ml的比率4:1的CHCl3和2-丙醇，等份试样通过涡动(3×10秒)来彻底地提取。小心地除去上部水层，溶剂在N2下蒸发。将干燥残留物溶解在200 μl的HPLC等级甲醇中。
对于游离化合物(PTX或肽) (在该情况下，将1mg/ml化合物溶液的200 μl等份试样加入到聚丙烯管内)进行类似的操作程序。添加1 ml的MeOH以再溶解产物，从而获得200 μg/ml 备料，由此制备系列浓度 (2-100 μg/ml)。
或者，缀合物溶液以及游离化合物溶液的等份试样通过具有C18 Porous 50树脂的预制备RP柱使用MeOH:AcCN的混合物作为洗脱剂来提纯。然后在N2(g)下蒸发溶剂。将干燥残留物溶解在200 μl 的HPLC 等级甲醇中。
缀合物中的药物的游离量通过HPLC使用Lichrospher® C18 (150 x 3.9 mm)柱测定。使用在0.1%TFA水溶液中的乙腈梯度，流速1 ml/min (同时测定PTX和肽，使用在28分钟内从10%到90%的乙腈的梯度)。PTX的保留时间为r.t. = 16.9 分钟，E-[c(RGDfk)2]的保留时间为 r.t. = 8.0分钟，c(RADfk) 的保留时间为r.t. = 5.3 分钟，而c(RGDfk)的保留时间为r.t. = 5.7 分钟(λ = 220 nm)。
PGA缀合物流体动力学直径和粒度分布的定量评价：
PGA缀合物的平均流体动力学直径使用含有设计成通过500μl样品室发射精细聚焦光束的固态单模激光二极管(< 20 mW, 655 nm) 的实时粒子分析器 (NanoSight LM20™)来评价。将试验的缀合物溶于PBS中至9.9 mg/ml的最终浓度。然后，通过注射器将样品注入到室内，用30秒钟使之平衡至装置温度（23℃）。通过设备CCD摄像机，以每秒30帧（fps）在640×480分辨率下观察颗粒动力学60秒钟。在布朗运动下颗粒采取的经时路径使用纳米粒子追踪分析(NTA)软件进行分析。单独地测定各个颗粒的扩散系数和因此球形等效流体动力学半径，产生粒度分布曲线。每一样品按照一式三份测定三次，结果表示平均直径。
在组织蛋白酶 B 的存在下从 PGA 共聚物 -E--c(RGDfk)2- 紫杉醇缀合物释放 PTX ：
组织蛋白酶B分裂的能力和因此从PGA共聚物-E-c(RGDfk)2-PTX释放PTX的能力如下评价：
在pH 6和37℃的温度下，将组织蛋白酶B (5U)持续添加到含有3mg试验缀合物和20mM乙酸钠、2mM EDTA和5mM DTT的1 ml溶液中。含有游离PGA聚合物和游离PTX的溶液用作对照。在各时间点采集样品等份部分(100 μl)，直到72小时，在液氮中冷冻和储存，直至通过HPLC (用Porous50树脂)和/或凝胶渗透色谱法 (GPC; 50 μl 等份试样的直接分析)分析。在单独的缓冲液中孵育的PGA聚合物(不添加组织蛋白酶B)用作评价非酶促水解分裂的附加对照。从试验化合物释放的游离PTX的量通过HPLC (λ = 220 nm)来评价。在所有情况下使用强力霉素用作内部标准。另外，还进行释放化合物的LC-MS分析，以便测定所释放的主要代谢物。缀合物的MW通过用PBS缓冲液将含有缀合物的溶液的50 μl等份试样稀释至200μl的最终体积并且将该等份试样进行GPC分析（Viscotek TDA检测器）来测定。
缀合物在血浆中的稳定性：
血浆中的稳定性通过在从Wistar大鼠新鲜提取的血浆中将每一缀合物(3 mg/ml)在37℃下孵育24小时来评价。在各时点，收集100μl的样本。15 μl 的强力霉素在MeOH中的0.2 mg/ml溶液用作内部标准，并且将135 μl的含有2 % ZnSO4的MeCN:MeOH 50:50 的混合物添加到各样本中，以便沉淀血清蛋白。将样本在14000 rpm下离心5分钟，将150 μl的上清通过HPLC如上所述进行分析。在血清的存在下从缀合物中释放的PTX的量被测得是可忽略的。
α v β 3 与 E-[c(RGDfk)2] 的体内相互作用：
雄性SCID 用2X106 mCherry-标记的U87人骨肉瘤或用5 X106 mCherry-标记的 MG-63人骨肉瘤s.c.接种。携带平均体积175 mm3 U87 人骨肉瘤肿瘤的小鼠静脉注射PGA-E-[c(RGDfk)2]-OG (50μM-RGD)或PGA-c(RADfk)-OG (50 μM-RGD-等效剂量) (n= 3 只小鼠/组)。注射后1小时，切除肿瘤，切成薄片，在Zeiss Meta LSM 510共焦成像系统下检查。
携带600 mm3 MG-63 人骨肉瘤肿瘤的小鼠静脉注射PGA-PTX-E-[c(RGDfk)2]-OG (50μM-RGD)、PGA-PTX-OG或PGA-PTX-c(RADfk)-OG (50μM-RGD-等效剂量) (n= 3 只小鼠/组)。在注射之后30分钟和60分钟时，切除肿瘤，用冷PBS洗涤几次，用3.5 %多聚甲醛在RT下固定15分钟，然后再次用PBS洗涤。
然后将肿瘤匀质化，用ImageStream 100 (amnis)分析。分析使用IDEAS软件进行。
共焦显微镜检查法：
OG标记的PGA-E-[c(RGDfk)2] 缀合物的细胞共定位利用具有40油浸物镜的Zeiss Meta LSM 510 共焦成像系统进行监测。所有图像使用多轨通道获取来取得，以防止荧光染料之间的发射干扰。单一XY、XZ 平面图像以 1024 X 1024分辨率获取。
统计方法：
数据作为平均值± SD表示。统计显著性使用不成对的t检验来测定。P < 0.05 被认为具有统计显著性。所有统计检验是两侧的。
实施例 1
HPMA 共聚物 -E-c(RGDfk)2- 紫杉醇的合成
图6中示出了HPMA共聚物-c(RGDfk)2-紫杉醇 (化合物2)的一般合成法。
如图6所示，HPMA-c(RDGfk)2-紫杉醇缀合物按照两步合成法如下制备：肽连接基Gly-Phe-Leu-Gly是组织蛋白酶 B-可分裂的连接基。组织蛋白酶B是在上皮和内皮肿瘤细胞中过度表达的溶酶体酶。首先，通过使用赖氨酸的氨基的非特异性氨解进行c(RDGfk)2与HPMA共聚物-Gly-Phe-Leu-Gly的缀合。接着，通过酯键进行紫杉醇与聚合物的缀合。使用HPMA共聚物-Gly-Phe-Leu-Gly (GFLG 10 mol%)-对-硝基酚(ONp)作为多价聚合物前体，因此，允许最大10 mol %的官能化。为了保持最大5 mol %的适当的紫杉醇加载量，考虑c(RDGfk)2 加载量。
HPMA-E-c(RDGfk)2的合成(化合物1)：
在氮气氛围中，将HPMA共聚物-Gly-Phe-Leu-Gly-ONp溶解在无水二甲基甲酰胺(DMF)中。通过氨解将 c(RDGfk)2缀合于DMF中的该HPMA共聚物-Gly-Phe-Leu-Gly-ONp上，然后一起混合。然后一起添加无水DMF中的c(RDGfk)2 .TFA与TEA。使该反应在室温下进行8小时。TLC用来监测反应。此后在高度真空下除去溶剂，缀合物通过尺寸排阻色谱法（SEC）、Sephadex LH-20使用甲醇作为流动相来提纯。为了进一步提纯，将缀合物再溶解在最低量的水中，渗析，并冻干，以高纯度百分率获得了所需化合物1。使用紫外光谱法来测定缀合物的肽含量。为了表征缀合物上的c(RDGfk)2 加载量，在DMF RT=25℃和266nm的最大吸收下制作校准曲线。
HPMA-共聚物-E-c(RDGfk)2-紫杉醇 (化合物2)的合成：
将紫杉醇溶解在DMF中，再添加到溶于DMF中的HPMA-c(RDGfk)2 缀合物中。将缀合物再提纯，冻干，并通过HPLC分析在254nm下表征。
类似地制备缀合物 HPMA共聚物-TNP-470-RGD4C。
实施例 2
PGA 共聚物 -E-c(RGDfk)2- 紫杉醇缀合物的合成和表征
PGA- 共聚物 -E-c(RGDfk)2- 紫杉醇缀合物的合成：
图7中示出了PGA-E-[c(RGDfK)2]-紫杉醇 (化合物4) 的一般合成。酯连接基是水解不稳定的，预计在溶酶体酸性pH下发生PTX释放。按两个步骤制备PGA-E-[c(RDGfk)2]-紫杉醇缀合物：首先，将PTX缀合于PGA聚合物，随后将-E-[c(RDGfk)2] 肽缀合于PTX-缀合的聚合物。在谷氨酸单体单元的羧基和PTX以及[c(RDGfk)2]之间的酯连接基是水解不稳定的，在溶酶体酸性pH下裂解，因此释放PTX和–E-[c(RDGfk)2]。在谷氨酸单体单元之间的肽连接是水解不稳定的连接基，其也容易发生组织蛋白酶B-分裂。通过谷氨酸(-E-) 肽连接基将该E-[c(RGDfK)2] 肽缀合于含有PTX的聚合物。
使用PGA作为多价聚合物前体。起始PGA经由谷氨酸的N-羧酸酐（NCA）聚合来合成。使用过渡金属大分子引发剂来克服普通NCA聚合的公知的限制，例如制约MW控制和阻止明确的嵌段共聚物形成的副反应的存在。合成方法如前所述进行 [Curtin等人, 1999, Journal of the American Chemical Society 121: 7427-7428]。
紫杉醇缀合物 ( 化合物 3) 的合成：
通过碳化二亚胺连接将PTX缀合于PGA (Mw 18,200, Mw/Mn 1.4)。使该反应在室温下进行24小时。薄层色谱法 (TLC, 硅石) 显示了游离PTX完全转化 (Rf=0.6) 为PTX-聚合物缀合物 (化合物3) (Rf=0, CH2Cl2/MeOH=90:10)。使该反应在室温下进行24小时，不用产物分离。
PGA-共聚物-E-c(RGDfk)2-紫杉醇(化合物4)的合成：
在PTX缀合反应完成之后，将N-羟基琥珀酰亚胺(OHSuc)添加到反应混合物中，以便活化谷氨酸单体的剩余羧基，用于后续缀合E-[c(RGDfK)2]肽。该羧基活化是重要的，以便避免副反应(即经由其天冬氨酸的羧基在两种E-[c(RGDfK)2]化合物之间的交联)。让反应进行24小时，然后通过将反应混合物倒入CHCl3中来停止。收集所得沉淀，用丙酮和MeOH洗涤，以便除去未反应的OHSuc。进一步收集沉淀，并在真空下干燥。保持CHCl3以通过间接测量由HPLC测定总药物加载量（PTX）。将固体中间产物再溶于无水DMF中，再使用DMAP作为碱催化剂通过-E-肽间隔基用PGA缀合E-[c(RGDfK)2]肽。让反应在室温下进行72小时，然后通过将反应混合物倒入CHCl3中来停止。薄层色谱法(TLC, 硅石) 显示了游离E-[c(RGDfK)2] (Rf=0.3)完全转化为聚合物缀合的E-[c(RGDfK)2] (Rf=0, AcOH/MeOH=1:99)。收集所得沉淀，在真空中干燥，如此获得所需化合物4。保持CHCl3 以通过间接测量由HPLC测定E-[c(RGDfK)2] 的总药物加载量。
PGA-PTX-E-[c(RGDfK)2] 缀合物的钠盐通过将产物溶解在1.0 M NaHCO3 中，随后用SEC (Sephadex G25)提纯以便除去低分子量污染物和过量盐来获得。提纯级分的冷冻干燥获得了作为白色粉末的所需产物(70 %-80 %收率)。
PGA与单个c(RGDfk)部分的缀合物的合成：
还类似地合成PGA-RGDfk (MW 200.37 g/mol) 和缀合物PGA-PTX-RGDfk (MW 216.53 g/mol)，且在表1中提供了药物加载量的%。PGA-PTX-RGDfk缀合物和缀合物PGA-RGDfk的化学结构分别在图2F和2G中提供。
“对照”缀合物的合成：
为了在下述实验中用作对照化合物，还合成了其它缀合物：PGA-PTX、PGA-c(RADfk)、PGA-E-[c(RGDfk)2]和PGA-PTX-c(RADfk)。分别在图2C、2D和2E中提供了PGA-PTX、PGA-c(RADfk)和PGA-E-[c(RGDfk)2] 缀合物的化学结构式。在图3B中提供了PGA-PTX-c(RADfk)缀合物的化学结构。
实施例 3
PGA-E-[c(RDGfk)2] ( 化合物 5) 的合成
如上所述，PGA-E-[c(RGDfk)2] 是在下述实验中用作对照的缀合物，该实验比较游离 [c(RGDfk)2]和缀合的[c(RGDfk)2] 肽的活性。图8中示出了PGA-E-[c(RGDfk)2] (化合物5)的一般合成。
在氮气氛围中将PGA溶于无水二甲基甲酰胺(DMF)中，谷氨酸羧酸使用OHSuc活化。使该反应进行24小时。将所得PGA-OSuc产物通过在CHCl3中沉淀来分离，再用丙酮和甲醇洗涤。
如下所示，然后通过琥珀酰亚胺基-活化的酯将E-[c(RGDfK)2] 缀合于DMF中的PGA上：将E-[c(RGDfK)2]加入到PGA-OSuc中，让反应在DMF中在室温下进行48小时。反应通过将反应混合物倒入CHCl3中来停止。薄层色谱法（TLC，硅石）显示了游离E-[c(RGDfK)2] (Rf=0.3)完全转化为聚合物缀合的 E-[c(RGDfK)2] (Rf=0, AcOH/MeOH=1:99)。收集所得沉淀物，并在真空下干燥，这样获得了所需化合物 5。
缀合物的钠盐通过将产物溶解在1.0 M NaHCO3中，随后使用水作为流动相通过SEC(Sephadex G25)来提纯，以便除去低分子量污染物和过量盐来获得。提纯级分的冻干获得了作为白色粉末的所需产物 (70 %-80 % 收率)。
实施例 4
缀合物的药物加载、流体动力学直径和酶分裂的表征
PTX 和含有 RGD 或 RAD 的部分加载量的测定：
为了保持适当的紫杉醇加载量，考虑最大5 mol % E-[c(RGDfK)2] 加载量。这些聚合物缀合物中的总PTX含量通过 UV (λ= 227 nm和230 nm, 在MeOH中在RT下进行的校准曲线)和HPLC (间接分析，反应残留物中的PTX含量，λ= 220nm，35-80 %乙腈，25分钟，r.t. = 10.8分钟)来测定。
这些聚合物缀合物中的总E-[c(RGDfK)2]肽、E-c(RGDfK)肽或对照无活性肽、–c(RADfk)含量通过UV (λ= 254 nm和260 nm, 在RT下在MeOH中制作的校准曲线)、HPLC (反应残留物中的肽含量的间接分析，流速1 ml/分钟，使用在0.1 % TFA 水溶液中的5-75 %乙腈的乙腈梯度，25分钟，λ= 220nm, r.t. = 7.9分钟)和氨基酸分析 (简要地，将 3 mg 所合成的每一种缀合物用 5N HCl在160 ºC 下水解4小时，然后将样品冻干，送至Parc Cientific Barcelona (西班牙巴塞罗那) ，用于通过 LC-MS分析)来测定。
表1中提供了合成缀合物中的PTX和肽的加载量%。合成 PTX和E-[c(RGDfK)2]加载量%不同的两种PGA-PTX-E-[c(RGDfK)2]缀合物。PTX是在2.6-5. mol % 官能化的范围内，且E-[c(RGDfK)2] 肽的%加载量是在3.9-5.7 mol % 官能化 (第一缀合物具有5-4.7 mol % E-[c(RGDfk)2]和2.6 mol % PTX 加载量，而第二缀合物具有3.9 mol % E-[c(RGDfk)2] 和5.5 mol % PTX加载量) 的范围内，游离药物含量总是低于总药物的1.5 wt %。
表 1
Figure 910576DEST_PATH_IMAGE009
缀合物的流体动力学直径和多分散性：
纳米级PGA-PTX-E-[c(RGDfk)2] 颗粒的多分散群体的流体动力学直径和粒度分布使用激光散射显微镜检查通过纳米粒子追踪分析（NTA）技术 (NanoSight LM20™, Salisbury, UK)来评价。具有5.5 mol %的PTX加载量和3.9 mol %的-E-c(RGDfk)2加载量的缀合物[PGA-PTX-E-c(RGDfk)2] （即第二缀合物）的平均流体动力学直径为大约30 nm (参见图 9A)。具有2.6 mol %的PTX加载量和5 mol %的-E-c(RGDfk)2 的加载量的缀合物 [PGA-PTX-E-c(RGDfk)2] (即第一缀合物)的平均流体动力学直径是约 40 nm (参见图9B)。具有2.3 mol %的PTX加载量和5 mol %的-E-c(RGDfk)加载量的缀合物[PGA-PTX-E-c(RGDfk)]的平均流体动力学直径是约35 nm (参见图 9C)。
通过尺寸排阻色谱法（SEC）分析溶液中的PGA缀合物和对照非缀合的PGA的平均分子量(Mw)、多分散性(Mw/Mn)和特性。两种技术显示，与对照非缀合物的PGA相比，PGA缀合物具有更紧凑的构象结构和更大的沉降系数（S）。根据SEC，PGA的MW被测得为17700 Da (MW/Mn = 1.3) ，PGA-PTX-c(RGDfk)2缀合物（第二缀合物）测得为48600 Da (MW/Mn = 1.4) ，而PGA-E-[c(RGDfk)2]缀合物测得为35700 Da (Mw/Mn = 1.4)。
通过组织蛋白酶 B 从 PGA 共聚物 -E-c(RGD)2- 紫杉醇缀合物释放 PTX ：
测试本发明的缀合物在预选择细胞酶如溶酶体酶组织蛋白酶B的存在下释放PTX的能力。结果在图10中提供，并表明，所合成的缀合物在酶促实验中显示出时间依赖和药物加载量依赖的药物释放动力学。重要的是提到，在所有情况下，从该聚合物释放的主要代谢物是PTX，通过LC/MS实验使用MALDI-TOF作为MS检测法测定。PGA-PTX-E-[c(RGDfk)2] (具有3.9 mol % E-[c(RGDfk)2]，5.5 mol % PTX 加载量) 与包括PGA-PTX-E-c(RGDfk)的所有其它缀合物相比显示了稍微更快的释放动力学(图2A)。有趣的是，与具有较低PTX加载量 (2.6 mol%)和较高 E-[c(RGDfk)2] 含量(5 mol%)的所合成的第一缀合物相比，携带较大PTX加载量(5.5 mol%) 和较低E-[c(RGDfk)2]含量 (3.9 mol%)的第二缀合物在48小时后具有更大的PTX释放。这些差别能够归因于在这些聚合物缀合物在溶液中形成单分子型胶束时所采用的不同构象。为了在水解条件下和在血浆存在下的稳定性研究，在所分析的缀合物中观察到了不明显的PTX释放(数据未示出)。
实施例 5
荧光标记缀合物的合成
通过游离羧基将荧光探针Oregon Green-cadaverine (OG)缀合于各种PGA缀合物，即合成PGA-OG、PGA-c(RADfk)-OG和PGA-E-[c(RGDfk)2]–OG，以便研究细胞摄取和运输。将缀合物溶解在最小量的无水DMF中，然后添加N,N’-二异丙基碳化二亚胺 (DIC)和1’-羟基苯并三唑(HOBT)，使用1.5:1.5:1的DIC/HOBT/COOH 基摩尔比。最后，以1:100的OG/COOH基摩尔比添加Oregon Green-cadaverine (OG)的DMF溶液。反应通过TLC来监测，用MeOH洗脱，随后真空蒸发DMF。将残留物溶于NaHCO3 (NaHCO3和COOH基的1.5:1摩尔比) 的水溶液中，并加载到PD10柱中，用水洗脱，收集1 ml-2 μl的每一级分的级分。将 498 μl 的MeOH加入到每一级分中，以便测定荧光，并鉴定含有PGA-OG缀合物的级分，以定量缀合的OG的量。OG加载量为 0.7-0.9 mol %。
实施例 6
HPMA 共聚物 -c(RGDfk)2- 紫杉醇缀合物的抗血管生成活性
与游离紫杉醇和c(RGDfk)2相比，对当缀合于HPMA共聚物时紫杉醇(PTX)和环状含RGD的肽c(RGDfk)2 抑制内皮细胞和肿瘤细胞增殖、向趋化物血管内皮生长因子（VEGF）迁移和粘附于纤维蛋白原基质的能力进行体外试验。
细胞增殖试验：
将人脐静脉内皮细胞(HUVEC)或MCF7或MCF7/Cyr61乳腺癌细胞接种到涂胶板上。在24小时孵育之后，细胞用系列浓度的PTX或c(RGDfk)2或HPMA 共聚物-c(RGDfk)2-PTX在生长因子的存在下攻击。在72小时使用Beckman库尔特计数器对细胞进行计数。
迁移试验：
进行迁移试验，以便评价游离PTX或c(RGDfk)2或HPMA共聚物-c(RGDfk)2-PTX 对乳腺肿瘤细胞、MCF7或MCF7/Cyr61或HUVEC在使用血管内皮细胞生长因子（VEGF）作为迁移刺激剂的transwell系统的下室中通过内皮细胞单层迁移的能力的效果。这模仿它们在体内穿过内皮和转移的能力。
如上所述进行HUVEC的细胞迁移试验。简要地说，HUVEC、MCF7或MCF7/Cyr61 (5×104细胞/100 μl)用游离PTX、c(RGDfk)2或HPMA共聚物-c(RGDfk)2-PTX攻击，然后平板接种到transwell的上室中达2小时孵育期。在孵育之后，让细胞在有或无VEGF的存在下在下室中迁移到室的下侧。然后将细胞固定，染色，测定每一个膜的迁移细胞的数目。将迁移标准化为百分率迁移，其中100%表示未用任何化合物孵育的细胞的VEGF依赖的迁移。
内皮细胞粘附试验：
测定c(RDGfk)2、c(RDGfk)2-紫杉醇和HPMA共聚物-c(RGDfk)2-紫杉醇缀合物抑制内皮细胞对纤维蛋白原包被的基质的粘附的能力。胰蛋白酶化HUVEC用试验缀合物孵育，以及用无活性c(RADfk)2或c(RADfk)2-紫杉醇作为对照进行孵育。然后将处理过的HUVECs平板接种到纤维蛋白原包被的96孔培养平板上，使之附着。然后将附着的细胞固定，染色，使用Nikon TE2000E倒置显微镜和NIH图像软件测定它们的数目。
实施例 7
PGA- 缀合的 c(RGDfk)2 与α v β 3 整联蛋白受体的结合
在HUVEC、U87 恶性胶质瘤和PANC02 细胞上的αvβ3整联蛋白表达使用αvβ3整联蛋白免疫染色和FACS来测定。αvβ3 整联蛋白在 HUVEC和U87恶性胶质瘤细胞中高度表达，但PANC02细胞缺乏 (参见图11A)。
使用amnis ImageStream 100 成像流式细胞仪和荧光探针Oregon Green-cadaverine (OG)，PGA-OG、PGA-c(RADfk)-OG和PGA-E-[c(RGDfk)2]–OG与缀合物的αvβ3 整联蛋白受体的相互作用在HUVEC中进行评价。早在用缀合物细胞孵育之后的10分钟，观察到了PGA-E-[c(RGDfk)2]-OG的缀合物-细胞粘附，这进一步继续增强，从而表明缀合物的细胞内在化。PGA-c(RADfk)-OG 稍迟在15分钟时开始粘附于细胞表面上(参见图11B和11C)。相反，不包括RGD部分的缀合物(PGA-c(RADfk)-OG)以低得多的程度结合于细胞（参见图11B），从而证明了RGD部分在缀合物与细胞的相互作用和随后缀合物内在化到细胞中的作用，很可能经由αvβ3 整联蛋白受体。
实施例 8
PGA- 共聚物 -E-[c(RGDfk)2]- 紫杉醇缀合物的抗血管生成活性
细胞增殖试验
为了评价根据本发明的实施方案的代表性缀合物c(RGDfk)2和PGA-E-[c(RGDfk)2]-PTX是否类似于PTX而具有抗血管生成性能，进行HUVEC 增殖、毛细血管样管形成和迁移试验。环肽 c(RADfk) 用作–E-[c(RGDfk)2]的阴性对照， 因为该肽具有低的与整联蛋白受体结合的低亲和性。PGA-E-[c(RGDfk)2]–PTX缀合物的活性 与单独的聚谷氨酸聚合物（PGA）、单独的紫杉醇（PTX）、PGA-PTX的缀合物、PGA与阴性对照含RAD的肽的缀合物 (PGA-c(RADfk))和PGA与双环含RGD的肽的缀合物 (PGA-E-c(RGDfk)2)的活性进行比较。图2中提供了这些缀合物的化学结构。PGA-E-[c(RGDfk)2]-PTX缀合物的活性也与仅仅含RGD的肽用阴性对照RAD肽替换的类似缀合物比较（这两种缀合物的化学结构在图3中提供）。对试验缀合物测定的IC50 值在表2中提供。表2 提供了所进行的5个实验的数据，其中，在每一个实验中，各化合物的IC50 （在左栏中列出）与使用特定细胞系的特定缀合物（如在上部第一排和第二排中所示）的IC50比较。当该缀合物包括仅仅一个RGD部分时，它与包括仅仅一个RGD部分的对照化合物（即，表2中的x等于1）比较。当该缀合物包括两个RGD部分时，它与也包括两个RGD部分的对照化合物（即，表2中的x等于2）比较。
HUVEC的增殖类似地在其中超过50%的细胞在低于0.2nM和高于17nM的浓度下被抑制的PTX等效浓度下被PGA-PTX、PGA-PTX-E-[c(RGDfk)2]和PGA-PTX-c(RADfk)缀合物 抑制（参见图12A）。游离PTX本身以及与 E-[c(RGDfk)2]或c(RADfk)结合更有效地抑制了HUVEC增殖，显示了约0.01 nM PTX的IC50值。E-[c(RGDfK)2] 肽单独或与PGA缀合本身抑制了HUVEC增殖，但仅仅在高浓度下。c(RADfk)肽或PGA 即使在这些高浓度下也没有显示效果 (关于 IC50值，参见表2)。
对于U87细胞，表达αvβ3 的另一细胞类型，增殖抑制非常类似于HUVEC的抑制。游离PTX,或其与E-[c(RGDfk)2] 或c(RADfk)的组合在等效剂量下具有类似的效应，显示出约0.01 nM PTX的IC50，就像其对于 HUVEC一样。而且，PGA-PTX、PGA-PTX-E-[c(RGDfk)2]和PGA-PTX-c(RADfk)缀合物在等效剂量下具有确切的类似钟形效应，如在HUVEC所见到的，其中超过50 %的细胞在低于约0.055nM和高于70nM PTX的浓度下被抑制 (图12B)。
对于不表达αvβ3 的PANC02细胞见到了不同的抑制模式。游离PTX或其与E-[c(RGDfk)2]或c(RADfk) 的组合在等效剂量下以约200nM PTX的IC50 抑制细胞增殖。与HUVEC和U87细胞相反，PGA-PTX-E-[c(RGDfk)2]缀合物具有更显著的效果，IC50 为约650 nM PTX，PGA-PTX和PGA-PTX-c(RADfk) 具有约2000 nM PTX的IC50(图12C)。对于这些细胞，没有观察到缀合物抑制的钟形模式。
这些结果表明，抗血管生成剂紫杉醇在与血管生成靶向部分c(RGDfk)2一起缀合于PGA聚合物时保持了其抗增殖活性。
表 2
Figure 664905DEST_PATH_IMAGE010
具有5 mol % E-[c(RGDfk)2] 和2.6 mol % PTX 加载量的PGA-PTX-E-[c(RGDfk)2] 缀合物 (参见图 13A)以及PGA-PTX-E-c(RGDfk)缀合物 (参见图13B)获得了类似的HUVEC增殖结果，其中二者显示了类似的钟形效果，分别具有～0.2和20 nM PTX的IC50。
实施例 9
PGA- 共聚物 -E-[c(RGDfk)2]- 紫杉醇缀合物的抗血管生成活性
迁移试验
接着，测试PGA-E-[c(RGDfk)2]-PTX缀合物对HUVEC向VEGF迁移的能力的效果。PGA-E-[c(RGDfk)2]-PTX缀合物 (5 mol % E-[c(RGDfk)2], 2.6 mol % PTX加载量，即，合成的第二缀合物) XXX （请确认）-在100 nM PTX的等效浓度下，对HUVEC向VEGF迁移的抑制达大约40 % (参见图14)。单独的PTX、 PTX和–E-[c(RGDfk)2]或c(RADfk) 和 PGA-PTX缀合物的组合具有约55%的更大抑制效果。PGA 用作对照，其对HUVEC向VEGF 迁移的能力没有抑制效果，而 –E-[c(RGDfk)2]和c(RADfk)具有约30%的抑制效果。
这些结果表明，抗血管生成剂紫杉醇以及c(RGDfk)2 肽均抑制了内皮细胞迁移，但c(RGDfk)2 肽以更低的程度抑制。而且，当与 c(RGDfk)2 一起缀合于PGA时，紫杉醇抑制能力保持。
实施例 10
PGA- 共聚物 -E-[c(RGDfk)2]- 紫杉醇缀合物的抗血管生成活性
内皮细胞粘附试验
血管生成的主要阶段之一包括内皮细胞粘附于细胞外基质，并通过整联蛋白受体介导。因此，相互作用并抑制整联蛋白受体的活性的药物抑制了内皮细胞粘附，因此，用作抗血管生成剂。αvβ3整联蛋白已知结合RGD序列(Arg-Gly-Asp)，该序列构成了不同的蛋白例如层粘连蛋白、纤连蛋白和玻璃粘连蛋白的识别域。肿瘤诱导的血管生成能够在体内通过用含有RGD氨基酸序列的小肽拮抗αvβ3整联蛋白来靶向。
因此，进行内皮细胞粘附试验，以便体外评价环状含RGD的肽–E-[c(RGDfk)2] 或c(RGDfk)在缀合于PTX和PGA时的靶向特异性 (即，与整联蛋白受体结合的能力)。
图15中提供了在用试验化合物之一孵育时所观测到的HUVEC与纤维蛋白原包被的板的细胞粘附的百分率的柱形图。结果被标准化为没有添加化合物时的细胞粘附的百分率。所有携带RGD的PGA-PTX缀合物在50 µM RGD的等效浓度下能够抑制HUVEC与纤维蛋白原的粘附达～60 %。PGA-PTX-c(RADfk) 缀合物用作每一种RGD缀合物的对照。当PGA-PTX-c(RADfk)缀合物与双环的携带RGD的缀合物比较时，用类似量的PTX，其具有～20%的较小抑制效果。当其与单环的携带RGD的缀合物比较时，用类似量的PTX，其与PGA-PTX-E-c(RGDfk) 一样好地抑制了HUVEC粘附(～50%)。与PGA一样，游离PTX以及所有它们的组合对内皮细胞粘附具有可忽略的效应。游离肽E-[c(RGDfK)2] 或E-c(RGDfk) 和c(RADfK) 用作对照。如所预计的，RGD肽模拟物在50 µM下完全废除了HUVEC粘附，而在相同浓度下，c(RADfK) 肽对细胞的粘附没有效应。
第一PGA-PTX-E-[c(RGDfk)2] 缀合物 (具有3.9 mol % E-[c(RGDfk)2]和5.5 mol % PTX的加载量) 比所合成的第二PGA-PTX-E-[c(RGDfk)2]缀合物(具有5 mol % E-[c(RGDfk)2]和 2.6 mol % PTX的加载量)更有效。两种缀合物比单环RGDfk肽缀合物PGA-PTX-E-c(RGDfk)更有效地抑制粘附。
这些结果显示，环肽 E-[c(RGDfk)2]和c(RGDfk)在与PTX一起缀合于PGA聚合物时保持了结合αvβ3整联蛋白和抑制内皮细胞粘附的能力。
实施例 11
PGA- 共聚物 -E-[c(RGDfk)2]- 紫杉醇缀合物的抗血管生成活性
活体外内皮细胞的毛细血管状管形成
已表明，缀合的PTX和[c(RGDfk)2] 通过抑制HUVEC的增殖、粘附和迁移而具有抗血管生成潜力，检验PGA-E-[c(RGDfk)2]-PTX缀合物对HUVEC在Matrigel上形成毛细血管样管状结构的能力的效果（参见图16）。本试验的目的在于模仿作为血管生成级联中的重要步骤的内皮细胞形成三维血管结构的能力。PGA-E-[c(RGDfk)2]-PTX缀合物 (5 mol % E-[c(RGDfk)2]，2.6 mol % PTX加载量，即所合成的第二缀合物)、作为对照的PGA-c(RADfk)-PTX缀合物以及PTX和E-[c(RGDfk)2]的组合分别在 10 nM和19 nM的等效浓度下对HUVEC的管状结构的形成的抑制达约40 % (参见图16B)。单独的PTX 具有约50%的更高的抑制效果，而用作对照的PGA对HUVEC形成管状结构的能力没有抑制效果。
这些结果表明，紫杉醇在与 E-[c(RGDfk)2]一起缀合于PGA聚合物时保持了其对内皮细胞形成毛细血管样管状结构的能力的抑制效果。
实施例 12
α v β 3 的特异性拮抗
Cyr61 (亦称CCN1)是支持细胞粘附和诱导粘附信号传导的半胱氨酸富集的基质细胞蛋白。此外，Cyr61刺激内皮细胞迁移和增强培养物中的生长因子诱导的DNA合成，因此在体内诱导血管生成。从机理上看，Cyr61起着整联蛋白受体的不含RGD的配体的作用。αvβ3，Cyr61整联蛋白受体的功能阻断对于Cyr61-过度表达乳腺癌细胞是特异性细胞毒的，且特异性αvβ3-RGD 拟肽药物防止αvβ3结合于其配体Cyr61。
HPMA 共聚物-c(RGDfk)2-紫杉醇缀合物、PGA共聚物-E-c(RGDfk)2-紫杉醇和聚合物PGA共聚物-E-c(RGDfk)-紫杉醇缀合物用作αvβ3的特异性拮抗剂和因此抑制 Cyr61-整联蛋白受体信号转导级联的能力在CYR61-过度表达和对照MCF-7细胞中进行评价。
PI-3’K和ERK1/ERK2 级联的下调：
由由Cyr61-驱动的αvβ3 信号传导所支配的一些表型变化，象增强的内皮细胞存活和增殖一样，取决于磷脂酰肌醇3’-激酶 (PI-3’K/AKT)和ERK1/ERK2 MAPK级联的活化。这些途径最近被发现在Cyr61过表达MCF-7细胞中是未调节的。基于这些发现，相同的细胞系用来分析缀合物作为αvβ3拮抗剂的效力。在用缀合物处理之前和之后由Cyr61-过度表达的 MCF-7细胞制备蛋白提取物，PI-3’K/ AKT和ERK1/ERK2 MAPK 激活的水平通过Western印迹来监测。
凋亡水平的提高：
αvβ3的功能阻断协同地增强了Cyr61-过度表达的乳腺癌细胞中的紫杉醇诱导的凋亡。因此，在用缀合物处理之前和之后通过流式细胞术分析Cyr61-过度表达的细胞和对照MCF-7细胞的凋亡水平。细胞提取物也通过不同凋亡蛋白如Bax、分裂的PARP和几种半胱天冬酶的表达水平的Western印迹来分析。
p53积聚：
紫杉醇诱导的凋亡包括肿瘤抑制蛋白p53的剂量依赖性和时间依赖性积聚。由于Cyr61过度表达导致的αvβ3超活化损害了紫杉醇诱导的p53的积聚。使用western印迹技术，评价p53蛋白在存在/不存在缀合物的情况下在CYR61过度表达的MCF-7细胞的细胞提取物中的水平。
实施例 13
缀合物在携带乳腺肿瘤的小鼠中的抗肿瘤活性的评价
紫杉醇已经成功地在动物模型和临床上用于治疗乳腺癌。在乳房脂肪垫中携带MCF或MCF/Cyr61-萤光素酶乳腺癌细胞的SCID 小鼠用游离紫杉醇、紫杉醇-c(RDGfk)2缀合物、HPMA共聚物-c(RGDfk)2-紫杉醇缀合物、PGA共聚物-E-c(RGDfk)-紫杉醇或PGA共聚物-E-c(RGDfk)2-紫杉醇按以下方式处理：动物用试验药物之一在紫杉醇的等效剂量 (5mg/kg ，每周一次)下处理。用盐水、HPMA共聚物、PGA或c(RDGfk)2处理的动物用作对照。每日监测所述动物的一般健康、重量减轻和肿瘤进展。每周一次，小鼠在静脉注射萤光素酶之后使用Biospace Photon Imager成像，以便跟踪肿瘤进展。所有的处理在三个时间点进行评价： (i) 增生性阶段（肿瘤细胞接种之后10天）时的早期处理，以便在实体性肿瘤的初始形成之前阻断血管生成切换（预防试验）， (ii) 在携带小的（无症状）实体性肿瘤（肿瘤细胞接种之后15-30天）的小鼠的处理，以便确定是否能够抑制它们膨胀性生长和进展到有害阶段（干预试验），以及 (iii) 具有显著的肿瘤负担和接近死亡的小鼠（在肿瘤细胞接种之后约45天）的处理，用于确定这些缀合物是否能够诱导肿瘤退化（退化试验）。在结束之后，通过验尸检验动物；将肿瘤切开，通过以下技术进行分析：a) 免疫组织化学： 增殖用PCNA ，凋亡用TUNEL，血管密度定量用CD-31；b) 血管生成生长因子(VEGF, bFGF, TGF-β)的ELISA，用于评价治疗对这些血管生成因子和预后标记物的效应(R&D的试剂盒)；c) FACS分析和Western印迹，用于测定治疗前和治疗后的αvβ3 表达和磷酸化改变。
实施例 14
PGA-PTX-E-[c(RGDfk)2] 缀合物在携带人骨肉瘤肿瘤的小鼠中的抗肿瘤活性的评价
携带RGD的缀合物的体内评价用两种方法进行：首先，从用PGA-E-[c(RGDfk)2]-OG处理的小鼠切除的mCherry 标记的肿瘤的共焦显微镜检查揭示，缀合物在肿瘤部位高度积聚，与PGA-c(RADfk)-OG或PGA-OG 缀合物相反 (参见图17A)。其次，来自用PGA-PTX-OG 不同缀合物处理的匀质化肿瘤的mCherry-标记的MG63 细胞通过ImageStrim进行FACS分选。结果显示，与PGA-PTX-c(RADfk)-OG和PGA-PTX-OG比较，PGA-PTX-E-[c(RGDfk)2]-OG 与肿瘤细胞有效地相互作用 (参见图17B)。
虽然已经结合具体实施方案描述了本发明，但显然的是，许多备选方案、改良和变化对于本领域技术人员来说是显而易见的。因此，本发明意图是包括落在所附权利要求的主旨和宽广范围内的全部的此类备选方案、改良和变化。
本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请在这里通过引用全文并入到本说明书中，就好像各个出版物、专利或专利申请被特定和分别地指明通过引用并入到这里。另外，本申请中任何参考文献的引用或标识不应被认为是这种参考文献可作为本发明的现有技术获得的承认。就所使用的部分标题来说，它们不应被认为是必然限制性的。

Claims (42)

1.一种缀合物，其包括连接有治疗活性剂和血管生成靶向部分的聚合物骨架，所述血管生成靶向部分包括至少一个含Arg-Gly-Asp (RGD)的部分，且所述治疗活性剂选自紫杉醇和TNP-470。
2.根据权利要求1所述的缀合物，其中所述聚合物骨架由聚谷氨酸(PGA)衍生而来。
3.根据权利要求1所述的缀合物，其中所述聚合物骨架由选自葡聚糖，水溶性聚氨基酸，聚乙二醇(PEG)，聚谷氨酸(PGA)，聚乳酸(PLA)，聚乳酸-共-乙醇酸(PLGA)，聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯) (PLA/PLGA)，聚(羟烷基甲基丙烯酰胺)，聚甘油，聚酰胺胺 (PAMAM)和聚乙烯亚胺(PEI)中的聚合物衍生而来。
4.一种缀合物，其包括连接有治疗活性剂和血管生成靶向部分的聚合物骨架，所述血管生成靶向部分包括至少一个含Arg-Gly-Asp (RGD)的部分，且所述治疗活性剂选自抗血管生成剂和抗癌药。
5.根据权利要求1-4的任一项所述的缀合物，其中所述含RGD的部分是寡肽。
6.根据权利要求5所述的缀合物，其中所述寡肽选自环状寡肽和线性寡肽。
7.根据权利要求1-6的任一项所述的缀合物，其中所述血管生成靶向部分包括至少两个含RGD的部分，所述部分是相同的或不同的。
8.根据权利要求6所述的缀合物，其中所述环状寡肽是c[Arg-Gly-Asp-Phe-Lys]。
9.根据权利要求4所述的缀合物，其中所述聚合物骨架由选自葡聚糖，水溶性聚氨基酸，聚乙二醇(PEG)，聚谷氨酸(PGA)，聚乳酸(PLA)，聚乳酸-共-乙醇酸(PLGA)，聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯) (PLA/PLGA)，聚(羟烷基甲基丙烯酰胺)，聚甘油，聚酰胺胺 (PAMAM)和聚乙烯亚胺(PEI)中的聚合物衍生而来。
10.根据权利要求1-9的任一项所述的缀合物，其中所述治疗活性剂和所述靶向部分的至少一种经由连接基连接于所述聚合物骨架。
11.根据权利要求10所述的缀合物，其中所述连接基是可生物降解的连接基。
12.根据权利要求11所述的缀合物，其中所述可生物降解的连接基选自pH 敏感性连接基和酶可分裂的连接基。
13.根据权利要求11所述的缀合物，其中所述可生物降解的连接基是酶可分裂的连接基。
14.根据权利要求13所述的缀合物，其中所述酶可分裂的连接基通过在肿瘤组织中过度表达的酶来分裂。
15.根据权利要求13所述的缀合物，其中所述连接基包括-[Gly-Phe-Leu-Gly]-部分。
16.根据权利要求13所述的缀合物，其中所述连接基包括-[Gly-Pro-Leu-Gly-Ile-Ala-Gly-Gln]-。
17.根据权利要求1-16的任一项所述的缀合物，其中所述治疗活性剂和所述血管生成靶向部分的至少一种经由间隔基连接于所述聚合物骨架和/或所述连接基。
18.根据权利要求1-16的任一项所述的缀合物，其中所述抗血管生成剂是紫杉醇，且所述血管生成靶向部分包括c[Arg-Gly-Asp-Phe-Lys]部分。
19.根据权利要求1-16的任一项所述的缀合物，其中所述抗血管生成剂是紫杉醇，且所述血管生成靶向部分包括两个c[Arg-Gly-Asp-Phe-Lys] 部分，
其中：
x是整数，该整数的值应使得x/ (x+y+w)×100在0.01-99.9的范围内；
y是整数，该整数的值应使得y/ (x+y+w)×100在0.01-99.9的范围内；
w是整数，该整数的值应使得w/(x+y+w)×100在0.01-99.9的范围内。
20.根据权利要求1-19的任一项所述的缀合物，其具有以下结构式：
Figure 864304DEST_PATH_IMAGE001
其中：
x是整数，该整数的值应使得x/ (x+y+w)再乘以100在0.01-99.9的范围内；
y是整数，该整数的值应使得y/ (x+y+w)再乘以100在0.01-99.9的范围内；以及
w是整数，该整数的值应使得w/(x+y+w)再乘以100在0.01-99.9的范围内。
21.根据权利要求20所述的缀合物，其具有以下结构式：
Figure 387690DEST_PATH_IMAGE002
其中：
x是整数，该整数的值应使得x/ (x+y+w)再乘以100是在70-99.9的范围内；
y是整数，该整数的值应使得y/ (x+y+w)再乘以100是在0.01-15的范围内；以及
w是整数，该整数的值应使得w/(x+y+w)再乘以100是在0.01-15的范围内。
22.根据权利要求20和21的任一项所述的缀合物，其具有10 nm至 100 nm范围内的流体动力学直径。
23.根据权利要求1-22的任一项所述的缀合物，其中所述治疗活性剂在所述聚合物中的加载量高于1 mol %。
24.根据权利要求1-23的任一项所述的缀合物，其中所述血管生成靶向部分在所述聚合物中的所述加载量高于1 mol %。
25.根据权利要求1-24的任一项所述的缀合物，进一步包括连接于其上的标记剂。
26.一种药物组合物，其包括根据权利要求1-25的任一项所述的缀合物作为活性成分和药用载体。
27.根据权利要求26所述的药物组合物，其在包装材料中包装，且在所述包装材料中或在所述包装材料上在印刷物中标识用于治疗与血管生成有关的医学状况。
28.根据权利要求27所述的药物组合物，其中所述缀合物包括标记剂，该组合物在包装材料中包装，且在所述包装材料中或在所述包装材料上在印刷物中标识用于监测与血管生成有关的医学状况。
29.根据权利要求27和28的任一项所述的药物组合物，其中所述状况选自动脉粥样硬化、癌症、高血压、类风湿性关节炎、糖尿病和糖尿病相关并发症。
30.一种在需要的受试者中治疗与血管生成有关的医学状况的方法，该方法包括将治疗有效量的根据权利要求1-25的任一项所述的缀合物给药于受试者。
31.一种监测患者体内的血管生成的水平的方法，该方法包括：
将根据权利要求25所述的缀合物给药于患者；和
使用成像技术来监测缀合物在体内或身体一部分中的分布。
32.根据权利要求30所述的方法，其中所述状况选自动脉粥样硬化、癌症、高血压、类风湿性关节炎、糖尿病和糖尿病相关并发症。
33.根据权利要求1-25的任一项所述的缀合物作为药物的用途。
34.根据权利要求1-25的任一项所述的缀合物在制备治疗与血管生成有关的医学状况的药物中的用途。
35.根据权利要求 25所述的缀合物作为诊断剂的用途。
36.根据权利要求25所述的缀合物在制备监测与血管生成有关的医学状况的诊断剂中的用途。
37.根据权利要求1-25的任一项所述的缀合物，标识用于治疗与血管生成有关的医学状况。
38.根据权利要求25所述的缀合物，标识用于监测与血管生成有关的医学状况。
39.根据权利要求34和36的任一项所述的化合物或用途，其中所述状况选自动脉粥样硬化、癌症、高血压、类风湿性关节炎、糖尿病和糖尿病相关并发症。
40.一种合成根据权利要求1-24的任一项所述的缀合物的方法，该方法包括：
(a) 将所述聚合物的多种单体单元共聚合，至少一种所述单体单元用第一反应性基团终端，且至少一种所述单体单元用第二反应性基团终端，从而获得包括多个骨架单元的共聚物，至少一个骨架单元具有所述第一反应性基团，且至少一个骨架单元具有所述第二反应性基团，所述第一反应性基团能够与所述血管生成靶向部分反应，所述第二反应性基团能够与所述治疗活性剂反应；
(b) 让所述共聚物与所述血管生成靶向部分或其衍生物经由所述第一反应性基团反应，从而获得所述血管生成靶向部分连接于聚合物骨架的共聚物；以及
(c) 进一步让所述共聚物与所述治疗活性剂或其衍生物经由所述第二反应性基团反应，从而获得所述治疗活性剂连接于聚合物骨架的共聚物，
从而获得权利要求1的缀合物。
41.根据权利要求40所述的方法，其中(b)在(c)之后、与(c)同时或在(c)之前进行。
42.根据权利要求40和41的任一项所述的方法，其中用所述第一反应性基团或所述第二反应性基团终端的至少一种所述单体单元进一步包括将所述反应性基团连接于所述单体单元的连接基。
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