CN101951946B - 结合间皮素的人抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供以高亲和性特异性结合间皮素的分离的单克隆抗体，特别是人单克隆抗体。优选地，所述抗体结合人间皮素。在某些实施方案中，所述抗体能够内化入表达间皮素的细胞或能够介导抗原依赖性细胞毒性。本发明进一步提供可以抑制间皮素结合卵巢癌抗原CA125的抗间皮素抗体。也提供编码本发明抗体的核酸分子、表达载体、宿主细胞以及表达本发明抗体的方法。也提供抗体-配偶体分子连接物、双特异性分子和包含本发明抗体的药物组合物。本发明还提供检测间皮素的方法以及使用本发明的抗间皮素抗体治疗诸如间皮瘤、胰腺癌和卵巢癌的癌症的方法。

Description

结合间皮素的人抗体及其应用
相关申请的交叉引用
本申请要求2007年10月1日提交的美国临时申请60/976,626、2007年11月30日提交的美国临时申请60/991,692和2008年7月1日提交的美国临时申请61/077,397在35USC.§119(e)下的权益；其公开内容通过引用而并入本文。
发明背景
间皮素(mesothelin)是存在于腹膜、胸膜和心包体腔间皮衬里(mesothelial lining)的细胞表面上的糖蛋白。其最初从人胰腺癌细胞系HPC-Y5纯化得到并且显示具有强化巨核细胞的能力，从而命名为巨核细胞强化因子(MPF)(Yamaguchi等(1994)J.Biol.Chem.269：805-808)。间皮素cDNA克隆自HPC-Y5细胞系制备的文库(Kojima等(1995)J.Biol.Chem.270：21984-21990)。cDNA也使用识别间皮瘤的单克隆抗体K1进行克隆(Chang和Pastan(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：136-40)。结构上，间皮素作为60kDa前体多肽表达在细胞表面上，所述多肽通过蛋白水解而加工成31kDa脱落组分(shed component)(相应于MPF)和40kDa膜结合组分(membrane bound component)(Hassan等(2004)Clin.Cancer.Res.10：3937-3942)。
除表达在正常间皮细胞上之外，间皮素还过量表达在几种人肿瘤中，包括所有间皮瘤、许多卵巢癌和胰腺癌以及一些胃癌、肺癌和子宫内膜癌。例如，间皮素表达于所有卵巢癌的约70％、乳头状浆液性腺癌的约82％、所有胰腺癌的约83％和所有胰腺导管腺癌的约86％。
已经制备了这样的突变小鼠，其中间皮素基因通过同源重组而破坏(Bera，T.K.和Pastan，I.(2000)Mol.Cell.Biol.20：2902-2906)。没有检测到解剖学、血液学或生殖异常，这表明至少在那些小鼠中，间皮素功能对于生长或生殖不是必需的。
间皮素特异性地与CA125(也称为MUC-16)相互作用，所述CA125为存在于肿瘤细胞表面上的粘蛋白样糖蛋白，先前已被鉴定为卵巢癌抗原。进一步，CA125对膜结合间皮素的结合介导异型细胞粘附并且CA125和间皮素共表达在晚期卵巢腺癌中(Rump，A.等(2004)J.Biol.Chem.279：9190-9198)。间皮素在腹膜衬里中的表达与卵巢癌转移形成的优选位点有关，而间皮素-CA125结合被认为促进卵巢肿瘤的腹膜转移(Gubbels，J.A.等(2006)Mol.Cancer 5：50)。
鉴于上述，感兴趣的是调控间皮素活性的另外的试剂。
概述
本公开提供分离的单克隆抗体，具体而言，提供人单克隆抗体，其特异性结合间皮素并且具有期望的性质，如高亲和性结合人间皮素、被表达间皮素的细胞内化、抑制间皮素结合CA125和/或介导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。本发明抗体可以用于，例如，检测间皮素或抑制表达间皮素的细胞，如表达间皮素的肿瘤细胞的生长。
在一个方面，本发明涉及分离的人单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体结合人间皮素并且展示至少一种下列性质：
(a)以1×10-8M或更小的KD结合人间皮素；
(b)被表达间皮素的细胞内化；
(c)抑制间皮素结合卵巢癌抗原CA125；
(d)对表达间皮素的细胞显示ADCC；和
(e)当连接于细胞毒素时抑制体内表达间皮素的细胞的生长。
优选地，该抗体显示性质(a)、(b)、(c)、(d)和(e)的至少两种。更优选地，该抗体显示性质(a)、(b)、(c)、(d)和(e)的至少三种。更优选地，该抗体显示性质(a)、(b)、(c)、(d)和(e)的四种。甚至更优选地，该抗体显示所有五种性质(a)、(b)、(c)、(d)和(e)。在另一个优选的实施方案中，该抗体以5×10-9M或更小的KD结合间皮素。在又一个优选的实施方案中，当该抗体缀合至细胞毒素时其抑制体内表达间皮素的肿瘤细胞的生长。
在另一个方面中，本发明涉及分离的人单克隆抗体或其抗原结合部分，其中该抗体交叉竞争结合至人间皮素上的表位，该表位被参考抗体识别，所述参考抗体具有：
(a)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列，以及轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列；
(b)包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列的VL；
(c)包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列的VL。
上述参考抗体在下文分别被称为参考抗体(a)、(b)和(c)。
在优选的实施方案中，参考抗体包含VH，其包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列，以及VL，其包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列。在另一个优选的实施方案中，参考抗体包含VH，其包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列，以及VL，其包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列。在又一个优选的实施方案中，参考抗体包含VH，其包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列，以及VL，其包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列。
在另一个方面中，本发明涉及分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含VH，所述VH是人VH 3-33基因或人VH 3-7基因的产物或源自人VH 3-33基因或人VH 3-7基因，其中所述抗体特异性结合人间皮素。在另一个方面中，本发明涉及分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含VL，所述VL是人VK L6基因或人VK A27基因的产物或源自人VK L6基因或人VK A27基因，其中所述抗体特异性结合人间皮素。在优选的实施方案中，本发明提供分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含：
(a)VH，其是人VH 3-33基因的产物或源自人VH 3-33基因，以及VL，其是人VK L6基因的产物或源自人VK L6基因；或
(b)VH，其是人VH 3-7基因的产物或源自人VH 3-7基因，以及VL，其是人VK A27基因的产物或源自人VK A27基因；
其中所述抗体特异性结合人间皮素。
特别优选的抗体或其抗原结合部分(“实施方案A”)包含：
(a)重链可变区CDR1，其包含SEQ ID NO：1；
(b)重链可变区CDR2，其包含SEQ ID NO：4；
(c)重链可变区CDR3，其包含SEQ ID NO：7；
(d)轻链可变区CDR1，其包含SEQ ID NO：10；
(e)轻链可变区CDR2，其包含SEQ ID NO：13；以及
(f)轻链可变区CDR3，其包含SEQ ID NO：16。
另一个特别优选的抗体或其抗原结合部分(“实施方案B”)包含：
(a)重链可变区CDR1，其包含SEQ ID NO：2；
(b)重链可变区CDR2，其包含SEQ ID NO：5；
(c)重链可变区CDR3，其包含SEQ ID NO：8；
(d)轻链可变区CDR1，其包含SEQ ID NO：11；
(e)轻链可变区CDR2，其包含SEQ ID NO：14，以及
(f)轻链可变区CDR3，其包含SEQ ID NO：17。
另一个特别优选的抗体或其抗原结合部分(“实施方案C”)包含：
(a)重链可变区CDR1，其包含SEQ ID NO：3；
(b)重链可变区CDR2，其包含SEQ ID NO：6；
(c)重链可变区CDR3，其包含SEQ ID NO：9；
(d)轻链可变区CDR1，其包含SEQ ID NO：12；
(e)轻链可变区CDR2，其包含SEQ ID NO：15；以及
(f)轻链可变区CDR3，其包含SEQ ID NO：18。
在另一个方面中，本发明涉及分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含(a)VH，其包含选自SEQ ID NO：19-21的氨基酸序列；以及(b)VL，其包含选自SEQ ID NO：22-24的氨基酸序列；其中所述抗体特异性结合人间皮素。
优选的组合包含：(a)VH，其包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列；以及(b)VL，其包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列。
另一个优选的组合包含：(a)VH，其包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列；以及(b)VL，其包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列。
另一个优选的组合包含：(a)VH，其包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列；以及(b)VL，其包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列。
本公开的抗体可以具有，例如，IgG1或IgG4同种型。备选地，它们可以是抗体片段，如Fab、Fab’或Fab’2片段，或者是单链抗体。
本公开还提供连接到配偶体分子的免疫连接物，其包含本公开的抗体或其抗原结合部分。在特别优选的实施方案中，本发明提供连接到化合物细胞毒素A的免疫连接物，其包含本公开的抗体或其抗原结合部分，所述化合物细胞毒素A在下文中鉴定以及论述于WO 2008/083312——其公开内容通过引用并入本文。本发明提供下列优选的免疫连接物，其包含连接到本发明抗体的细胞毒素A，其中所述抗体(i)与参考抗体(a)、(b)或(c)交叉竞争结合至人间皮素的表位；(ii)依照实施方案A；(iii)依照实施方案B；或(iv)依照实施方案C。某些此类抗体-配偶体分子连接物能够被内化入表达间皮素的细胞并且能够调节ADCC。
在一个方面，这些抗体-配偶体分子连接物经由化学接头连接。在一些实施方案中，接头是肽基接头并且在本文中描述为(L4)p-F-(L1)m。其它接头包括肼和二硫化物接头并且在在本文中分别描述为(L4)p-H-(L1)m或(L4)p-J-(L1)m。除了附着到所述配偶体的接头之外，本发明还提供可切割连接臂，其适于附着到基本上任何分子种类。
本公开还提供双特异性分子，其包含本公开的抗体或其抗原结合部分，所述抗体或其抗原结合部分连接到具有不同于所述抗体或其抗原结合部分的结合特异性的第二功能部分。
还提供组合物，其包含本公开的抗体或其抗原结合部分或者免疫连接物或者双特异性分子以及药学上可接受的载体。
本公开还包括编码本公开的抗体或其抗原结合部分的核酸分子，以及包含这些核酸的表达载体和包含这些表达载体的宿主细胞。还提供使用包含这些表达载体的宿主细胞制备抗间皮素抗体的方法以及所述方法可以包括下列步骤(i)在宿主细胞中表达抗体和(ii)从宿主细胞中分离抗体。
在又一个方面中，本发明涉及制备抗间皮素抗体的方法。所述方法包括：
(a)提供：(i)VH抗体序列，其包含选自SEQ ID NO：1-3的CDR1序列、选自SEQ ID NO：4-6的CDR2序列和/或选自SEQ ID NO：7-9的CDR3序列；和/或(ii)VL抗体序列，其包含选自SEQ ID NO：10-12的CDR1序列、选自SEQ ID NO：13-15的CDR2序列和/或选自SEQ ID NO：16-18的CDR3序列；
(b)改变VH抗体序列和/或VL抗体序列中至少一个氨基酸残基，以产生至少一种改变的抗体序列；以及
(c)将改变的抗体序列表达为蛋白质。
在另一个方面中，本发明涉及抑制表达间皮素的肿瘤细胞生长的方法，其包括使肿瘤细胞与本公开的抗体-配偶体分子连接物接触，以便抑制肿瘤细胞生长。优选地，表达间皮素的肿瘤细胞是间皮瘤细胞、胰腺肿瘤细胞、卵巢肿瘤细胞、胃肿瘤细胞、肺肿瘤细胞或子宫内膜肿瘤细胞。在其它实施方案中，表达间皮素的肿瘤细胞来自选自下列的癌：间皮瘤、乳头状浆液性卵巢腺癌、透明细胞卵巢癌、混合Mullerian卵巢癌、子宫内膜样粘液性卵巢癌、胰腺癌、胰腺导管腺癌、子宫浆液性癌、肺腺癌、肝外胆管癌、胃腺癌、食管腺癌、结肠直肠腺癌和乳腺癌。
在另一个方面中，本发明涉及治疗受试者癌症的方法。所述方法包括给予受试者本公开的抗体-配偶体分子连接物，以便在受试者中治疗癌症。治疗的特别优选的癌症是间皮瘤、胰腺癌、卵巢癌、胃癌、肺癌和子宫内膜癌。在其它实施方案中，待被治疗的癌症选自间皮瘤、乳头状浆液性卵巢腺癌、透明细胞卵巢癌、混合Mullerian卵巢癌、子宫内膜样粘液性卵巢癌、胰腺癌、胰腺导管腺癌、子宫浆液性癌、肺腺癌、肝外胆管癌、胃腺癌、食管腺癌、结肠直肠腺癌和乳腺癌。
附图简述
图1A显示3C10人单克隆抗体VH的核苷酸序列(SEQ ID NO：25)和氨基酸序列(SEQ ID NO：19)。描述了CDR1区(SEQ ID NO：1)、CDR2区(SEQ ID NO：4)和CDR3区(SEQ ID NO：7)。
图1B显示3C10人单克隆抗体VL的核苷酸序列(SEQ ID NO：28)和氨基酸序列(SEQ ID NO：22)。描述了CDR1区(SEQ ID NO：10)、CDR2区(SEQ ID NO：13)和CDR3区(SEQ ID NO：16)。
图2A显示6A4人单克隆抗体VH的核苷酸序列(SEQ ID NO：26)和氨基酸序列(SEQ ID NO：20)。描述了CDR1区(SEQ ID NO：2)、CDR2区(SEQ ID NO：5)和CDR3区(SEQ ID NO：8)。
图2B显示6A4人单克隆抗体VL的核苷酸序列(SEQ ID NO：29)和氨基酸序列(SEQ ID NO：23)。描述了CDR1区(SEQ ID NO：11)、CDR2区(SEQ ID NO：14)和CDR3区(SEQ ID NO：17)。
图3A显示7B1人单克隆抗体VH的核苷酸序列(SEQ ID NO：27)和氨基酸序列(SEQ ID NO：21)。描述了CDR1区(SEQ ID NO：3)、CDR2区(SEQ ID NO：6)和CDR3区(SEQ ID NO：9)。
图3B显示7B1人单克隆抗体VL的核苷酸序列(SEQ ID NO：30)和氨基酸序列(SEQ ID NO：24)。描述了CDR1区(SEQ ID NO：12)、CDR2区(SEQ ID NO：15)和CDR3区(SEQ ID NO：18)。
图4显示3C10(SEQ ID NO：19)和6A4(SEQ ID NO：20)的VH氨基酸序列与人种系VH 3-33氨基酸序列(SEQ ID NO：31)的比对。
图5显示3C10(SEQ ID NO：22)和6A4(SEQ ID NO：23)的VL氨基酸序列与人种系Vk L6氨基酸序列(SEQ ID NO：33)的比对。
图6显示7B1的VH氨基酸序列(SEQ ID NO：21)与人种系VH 3-7氨基酸序列(SEQ ID NO：32)的比对。
图7显示7B1的VL氨基酸序列(SEQ ID NO：24)与人种系Vk A27氨基酸序列(SEQ ID NO：34)的比对。
图8显示OVCAR3卵巢癌细胞粘附测定的结果。
图9A和9B显示使用NCI-H226(肺间皮瘤)异种移植小鼠模型进行体内研究的结果。
图10A和10B显示使用HPAC(人胰腺癌)异种移植小鼠模型体内进行研究的结果。
图11是显示在卵巢癌小鼠异种移植模型中本发明免疫连接物减小卵巢癌肿瘤体积的图。
图12显示本发明非岩藻糖基化的抗体对卵巢癌细胞(OVCAR3细胞，图12a)和NSCLC细胞(H226细胞，图12b)的ADCC。
发明详述
本公开涉及分离的单克隆抗体，具体而言涉及人单克隆抗体，其结合人间皮素并且具有期望的性质。在某些实施方案中，本公开的抗体源自特定的重链和轻链种系序列和/或包含特定的结构特征，如含有特定氨基酸序列的CDR区。本公开提供分离的抗体、制备这些抗体的方法、抗体-配偶体分子连接物和包含这些抗体的双特异性分子以及含有这些抗体、抗体-配偶体分子连接物或双特异性分子的药物组合物。还提供变体或备选物，如同源抗体、具有保守修饰的抗体、改造和修饰的抗体、抗体片段和抗体模拟物，每个进一步描述在下文中。本公开还涉及使用抗体以例如检测间皮素蛋白的方法，以及使用本发明的抗间皮素抗体抑制表达间皮素的细胞如肿瘤细胞生长的方法。因此，本公开还提供使用本公开的抗间皮素抗体治疗各种类型癌症的方法，所述癌症例如，卵巢癌、胰腺癌、胃癌、肺癌、子宫内膜癌和间皮瘤。优选地，抗体、连接物、双特异性分子、备选物或变体具有这些性质中的一种或更多种：结合人间皮素、被表达间皮素的细胞内化、抑制间皮素结合CA125、介导针对表达间皮素的细胞的ADCC和抑制体内表达间皮素的肿瘤细胞的生长。抗体可以是人的(优选)、人源化的或嵌合的。
按本公开可以被更容易理解的顺序，首先定义某些术语。另外的定义在整个详述中阐明。
术语“间皮素”包括变体、同种型、同源物、直系同源物和旁系同源物。例如在某些情况下，对人间皮素蛋白特异性的抗体可以与来自非人物种的间皮素蛋白交叉反应。在其它实施方案中，抗体可以对人间皮素蛋白是完全特异的并且不显示物种交叉反应性或其它类型的交叉反应性，或与来自某些其它物种但不是所有其它物种的间皮素交叉反应(例如，与灵长类间皮素交叉反应而不与小鼠间皮素交叉反应)。术语“人间皮素”指人序列间皮素，如具有Genbank登录号NP_005814的人间皮素的全氨基酸序列。术语“小鼠间皮素”指小鼠序列间皮素，如具有Genbank登录号NP_061345的小鼠间皮素的全氨基酸序列。间皮素的N端部分也被称为巨核细胞强化因子(MPF)。人间皮素序列可以由于具有例如保守突变或在非保守区中的突变而不同于Genbank登录号NP_005814的人间皮素，并且该间皮素具有与Genbank登录号NP_005814的人间皮素基本上相同的生物功能，如结合CA125。
具体的人间皮素序列在氨基酸序列上通常至少90％同一于Genbank登录号NP_005814的人间皮素并且含有当与其它物种(例如，鼠)的间皮素氨基酸序列比较时将氨基酸序列鉴定为人源的氨基酸残基。在某些情况下，人间皮素在氨基酸序列上可以至少95％或甚至至少96％、97％、98％或99％同一于Genbank登录号NP_005814的间皮素。在某些实施方案中，人间皮素序列将显示不超过10个氨基酸不同于Genbank登录号NP_005814的间皮素序列。在某些实施方案中，人间皮素可以显示不超过5个或甚至不超过4个、3个、2个或1个氨基酸不同于Genbank登录号NP_005814的间皮素序列。同一性百分比可以如本文所述进行测定。
术语“CA125”指卵巢癌抗原或卵巢癌肿瘤标志物，也称为MUC-16。术语“人CA125”指人序列CA125，如具有Genbank登录号NP_078966的人CA125的全氨基酸序列。人CA125序列可以由于具有例如保守突变或在非保守区中的突变而不同于Genbank登录号NP_078966的人CA125。具体的人CA125序列在氨基酸序列上通常至少90％同一于Genbank登录号NP_078966的人CA125并且含有当与其它物种(例如，鼠)的间皮素氨基酸序列比较时将氨基酸序列鉴定为人源的氨基酸残基。在某些情况下，人CA125在氨基酸序列上可以至少95％，或甚至至少96％、97％、98％或99％同一于Genbank登录号NP_078966的CA125。在某些实施方案中，人CA125序列显示不超过10个氨基酸不同于Genbank登录号NP_078966的CA125序列。在某些实施方案中，人CA125可以显示不超过5个或甚至不超过4个、3个、2个或1个氨基酸不同于Genbank登录号NP_078966的CA125序列。同一性百分比可以如本文所述进行测定。
术语“免疫应答”是指例如，淋巴细胞、抗原呈递细胞、吞噬细胞、粒细胞、以及由上述细胞或肝脏产生的可溶性大分子(包括抗体、细胞因子、以及补体)的作用，这些作用导致对侵入性病原体、被病原体感染的细胞或组织、癌细胞，或者，在自身免疫及病理炎症情况下，正常的人类细胞或组织的选择性损害、破坏或将它们从人体清除。
“信号转导途径”是指在多种信号传导分子之间的生物化学关系，这些分子在将信号从细胞的一部分传递到细胞的另一部分中发挥作用。短语“细胞表面受体”包括能够接受信号并将这种信号传递穿过细胞的原生质膜的分子及分子的复合体。“细胞表面受体”的实例是人间皮素。
术语“抗体”包括整个抗体及它们的任何抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或它们的单链。“抗体”指包括通过二硫键互相连接的至少两条重链(H链)及两条轻链(L链)的糖蛋白，或其抗原结合部分。每一条重链都包括重链可变区(在此缩写为VH)以及重链恒定区。该重链恒定区包括三个结构域，CH1、CH2以及CH3。每一条轻链都包括轻链可变区(在此缩写为VL)及轻链恒定区。该轻链恒定区包括一个结构域，CL。VH和VL可以进一步被细分为多个高可变性区域，被称为互补决定区(CDR)，其间散布有更为保守的被称为构架区(FR)的多个区域。每个VH以及VL均由3个CDR及4个FR构成，按照以下顺序从氨基端至羧基端排布：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链及轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合域。这些抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主的组织或因子的结合，这些宿主的组织或因子包括免疫系统的不同细胞(例如效应细胞)及经典补体系统的第一成分(Clq)。
在此所使用的术语“抗体片段”以及抗体的“抗原结合部分”(或简称为“抗体部分”)是指保留特异性结合抗原(例如间皮素)的能力的抗体的一个或多个片段。已经发现抗体的抗原结合功能可以由全长抗体的片段来实现。术语抗体的“抗原结合部分”中所涵盖的结合片段的实例包括：(i)Fab片段，由VL、VH、CL及CH1结构域构成的单价片段组成；(ii)F(ab′)2片段，为包括在铰链区由二硫桥连接的两个Fab片段的一个二价片段；(iii)Fab’片段，它实质上是带有铰链区部分的Fab(见，FUNDAMENTALIMMUNOLOGY(Paul ed.，3rd ed.1993)；(iv)由VH及CH1结构域构成的Fd片段；(v)由抗体的一个单臂的VL及VH结构域构成的Fv片段；(vi)dAb片段(Ward et al.，(1989)Nature 341：544-546)，它由VH结构域构成；(vii)分离的互补决定区(CDR)；以及(viii)纳米抗体(nanobody)，含有一个单一可变结构域及两个恒定结构域的重链可变区。此外，虽然Fv片段的两个结构域，VL与VH，是由单独的基因编码的，但是可以使用重组方法由合成接头将它们连接起来，该接头使它们成为单一蛋白链，其中VL及VH区域配对形成单价分子(被称为单链Fv(scFv)；参见例如Bird etal.(1988)Science 242：423-426；及Huston et al.(1988)Science242：423-426；及Huston et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：5879-5883)(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883)。术语抗体的“抗原结合部分”也旨在涵盖此类单链抗体。这些抗体片段可通过本领域技术人员已知的常规方法获得，并且对于这些片段进行的有用性的筛选与筛选完整抗体的方式相同。
“分离的抗体”，指抗体，它基本上没有具有不同抗原特异性的其他抗体(例如，特异性结合间皮素的分离的抗体基本上没有特异性结合其他抗原的抗体)。然而，特异性结合间皮素的分离的抗体对于其他抗原，例如来自其他物种的间皮素分子，可以具有交叉反应性。此外，分离的抗体可以基本上没有其他细胞材料和/或化学物。
术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”是指由单一分子组分的抗体分子形成的制剂。单克隆抗体组合物显示了针对某一特定表位的单一结合特异性及亲和力。
术语“人抗体”意指包括具有可变区的抗体，在这些可变区中，构架区及CDR区均源自人类种系免疫蛋白序列。此外，如果该抗体包括恒定区，则该恒定区也源自人类种系免疫球蛋白序列。本公开的人抗体可以包括不是由人类种系免疫球蛋白序列所编码的氨基酸残基(例如，在体外由随机诱变或位点特异性诱变引入的突变或在体内由体细胞突变引入的突变)。然而，术语“人抗体”并非意指包括以下抗体：其中源自另一个哺乳动物物种(例如小鼠)的种系的CDR序列被移植到人类构架区序列上。
术语“人单克隆抗体”是指显示出单一结合特异性的抗体，这些抗体具有多个可变区，其中构架和CDR区均源自人类种系免疫球蛋白序列。在一个实施方案中，人单克隆抗体由杂交瘤产生，该杂交瘤包括由转基因非人类的动物(例如转基因小鼠)获到的B细胞，所述动物具有包括融合至无限增殖化细胞的人类重链转基因及轻链转基因的基因组。
此处使用的术语“重组人抗体”包括通过重组方法制备、表达、产生或分离的所有人抗体，例如(a)从动物(例如小鼠)中分离的抗体，该动物对于人类免疫球蛋白基因是转基因的或转染色体的，或从由其制备出的杂交瘤分离的抗体(以下将进一步说明)；(b)从经转化以表达人抗体的宿主细胞(例如转染瘤)中分离的抗体，(c)从重组的组合人抗体文库中分离的抗体，以及(d)通过任何其他方法来制备、表达、产生或分离的抗体，这些方法包括将人类免疫球蛋白基因序列剪接到其他DNA序列。这种重组人抗体具有可变区，其中构架区及CDR区均源自于人类种系免疫球蛋白序列。然而，在某些实施方案中，这种重组人抗体也可经受体外诱变(或者，在使用对于人类Ig序列转基因的动物时，经受体内体细胞诱变)，并且接着，重组抗体的VH和VL区域的氨基酸序列为这样的序列：其尽管衍生于人类种系VH和VL序列并与其相关，但是并不天然存在于体内人抗体种系所有组成成分之中。
术语“同种型”是指由重链恒定区基因编码的抗体种类(例如IgM或IgG1)。
短语“识别抗原的抗体”与“对抗原特异的抗体”此处可以与术语“特异性结合抗原的抗体”互换使用。
术语“人抗体衍生物”是指人抗体的任何经修饰的形式，例如，该抗体与另一种试剂或抗体的偶联物。
术语“人源化抗体”意指以下抗体，其中源自另一个哺乳动物物种(如小鼠)的种系的CDR序列被移植到人类构架序列上。可以在人类构架序列中进行额外的构架区修饰。
术语“嵌合抗体”意指以下抗体，其中可变区序列源自一个物种而恒定区序列源自另一个物种，例如一种抗体，其中可变区序列源自小鼠抗体而恒定区序列源自人抗体。
术语“抗体模拟物”表示能够模拟抗体的结合抗原的能力的分子，但是它们不局限于天然抗体结构。此类抗体模拟物的实例包括但不限于亲和体(Affibody)、经设计的锚蛋白重复蛋白(DARPin)、抗运载蛋白(Anticalin)、Avimer、以及万能抗体(Versabody)，所有这些在下文中进一步描述。
术语“配偶体分子”指实体，它缀合至抗体-配偶体分子缀合物中的抗体上。配偶体分子的实例包括药物、毒素、标记分子、蛋白质以及治疗剂。
如本文所用，“特异性结合人间皮素”的抗体意图指这样的抗体，其以1×10-7M或更小，更优选5×10-8M或更小，更优选3×10-8M或更小，更优选1×10-8M或更小，甚至更优选5×10-9M或更小的KD结合人间皮素。
此处使用的术语“基本上不结合”一种蛋白质或细胞是指不结合或不以高亲和力结合蛋白质或细胞，即，以1×10-6M或更大，更优选为1×10-5M或更大，更优选为1×10-4M或更大，更优选为1×10-3M或更大，甚至更优选为1×10-2M或更大的KD结合蛋白质或细胞。
此处使用的术语“Kassoc”或“Ka”旨在表示特定的抗体-抗原相互作用的结合速率，而此处使用的术语“Kdis”或“Kd”旨在表示特定的抗体-抗原相互作用的解离速率。此处使用的术语“KD”旨在表示解离常数，它是由Kd与Ka之比(即Kd/Ka)得到，并被表示为摩尔浓度(M)。抗体的KD值可以使用本领域成熟的方法进行确定。确定抗体的KD的一种优选方法是通过使用表面等离振子共振，优选使用诸如系统的生物传感器系统。
术语IgG抗体的“高亲和性”指抗体对于靶抗原具有1×10-7M或更小、更优选5×10-8M或更小、甚至更优选1×10-8M或更小、甚至更优选5×10-9或更小并且甚至更优选1×10-9M或更小的KD。然而，“高亲和性”结合对于其它抗体同种型可以不同。例如，IgM同种型的“高亲和性”结合指抗体具有10-6M或更小、更优选10-7M或更小、甚至更优选10-8M或更小的KD。
术语“受试者”包括任何人类或非人类动物。术语“非人类动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物及非哺乳动物，例如非人灵长类动物、绵羊、犬、猫、马、奶牛、鸡、两栖动物、爬行动物等等。
除非另作说明，术语“烷基”，就其本身或作为另一个取代基的部分，是指直链或支链的或环状烃基、或它们的组合，它可以是完全饱和的、单不饱和的、或多不饱和的，并且能包括二价以及多价原子弹，具有所指定的碳原子数目(即C1-C10是指1至10个碳原子)。饱和烃基的实例包括但不限于以下基团，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基、环己基、(环己基)甲基、环丙基甲基、以及(例如)正戊基、正己基、正庚基、正辛基的同系物或异构体、以及类似物。不饱和烷基基团是具有一个或多个双键或三键的基团。不饱和烷基基团的实例包括但不限于乙烯基、2-丙烯基、丁烯基、2-异戊烯基、2-(丁二烯基)、2，4-戊二烯基、3-(1，4-戊二烯基)、乙炔基、1-丙炔基以及3-丙炔基、3-丁炔基，以及更高级同系物以及异构体。除非另有说明，术语“烷基”还意在包括那些以下详细说明的烷基衍生物，如“杂烷基”。限于烃基基团的烷基基团被称为“同烷基”。
术语“亚烷基”其本身或作为另一个取代基的部分是指衍生自烷烃的二价基团，例如但不局限于-CH2CH2CH2CH2-，并且进一步包括那些如下说明为“杂亚烷基”的基团。典型地，烷基(或亚烷基)基团将具有1到24个碳原子，其中具有10个或更少的碳原子的那些基团在本发明中是优选的。“低级烷基”或“低级亚烷基”是较短链的烷基或亚烷基基团，一般具有八个或更少的碳原子。
除非另作说明，术语“杂烷基”就其本身或与另一个术语组合，是指稳定的直链或支链、或环状烃基、或它们的组合，由所说明的数目的碳原子以及至少一个杂原子组成，该杂原子选自：O、N、Si、以及S，并且其中氮、碳、以及硫原子会可任选地被氧化，并且氮杂原子会可任选地被季铵化。一个或多个杂原子O、N、S、及Si可位于杂烷基基团的任何内部位置，或可位于该烷基团附着于该分子的其余部分的位置。实例包括但不限于：-CH2CH2OCH3、-CH2CH2NHCH3、-CH2CH2N(CH3)2、-CH2SCH2CH3、-CH2CH2S(O)CH3、-CH2CH2S(O)2CH3、-CH＝CHOCH3、-Si(CH3)3、-CH2CH＝NOCH3和-CH＝CHN(CH3)2。多达两个杂原子可以是连续的，例如-CH2NHOCH3和-CH2OSi(CH3)3。类似地，术语“杂亚烷基”就其本身或作为另一个取代基的部分是指衍生自杂烷基的二价基，例如但不限于-CH2-CH2-S-CH2-CH2-以及-CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-。对于杂亚烷基基团，杂原子也可占据链末端的任一端或两端(例如，亚烷氧基、亚烷二氧基、亚烷基氨基、亚烷基二氨基、等等)。术语“杂烷基”与“杂亚烷基”包括聚(乙二醇)及其衍生物(参见例如，Shearwater Polymers Catalog，2001)。此外，对于亚烷基以及杂亚烷基连接基团，书写连接基团的分子式的方向并不表示连接基团的方向。例如，式-C(O)2R’-代表-C(O)2R’-以及-R’C(O)2-。
与术语“烷基”或“杂烷基”组合使用的术语“低级”是指具有1到6个碳原子的部分。
术语“烷氧基”、“烷氨基”、“烷基磺酰基”、以及“烷硫基”(或硫代烷氧基)都是以它们的常规意义使用，并分别指通过氧原子、氨基基团、SO2基团、或硫原子附着于该分子的其余部分的那些烷基基团。术语“芳香磺酰基”是指通过SO2基团附着于该分子其余部分的芳基基团，且术语“巯基”是指SH基团。
一般而言，“酰基取代基”也选自以上所给出的组。在此使用的术语“酰基取代基”指附着于羰基碳并满足其化合价的基团，该羰基碳直接或间接地附着于本发明的此合物的多环核上。
除非另作说明，术语“环烷基”与“杂环烷基”，就它们本身或与其他术语组合，分别表示环型的取代或未取代的“烷基”以及取代或未取代的“杂烷基”。另外，对于杂环烷基，杂原子可占据杂环附着于分子的其余部分的位置。环烷基的实例包括但不限于环戊基、环己基、1-环己烯基、3-环己烯基、环庚基、等等。杂环烷基的实例包括但不限于1-(1，2，5，6-四氢吡啶基)、1-哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、4-吗啉基、3-吗啉基、四氢呋喃-2-基、四氢呋喃-3-基、四氢噻吩-2-基、四氢噻吩-3-基、1-哌嗪基、2-哌嗪基、等等。环结构的杂原子以及碳原子可任选地被氧化。
除非另作说明，术语“卤”或“卤素”，就它们自身或作为另一个取代基的部分，是指氟、氯、溴、或碘原子。此外，术语如“卤烷基”是指包括单卤烷基以及多卤烷基。例如，术语“卤(C1-C4)烷基”旨在包括但不限于三氟甲基、2，2，2-三氟乙基、4-氯代丁基、3-溴丙基、等等。
除非另作说明，术语“芳基”是指取代或未取代的多不饱和的芳香烃取代基，它可以是单一的环或多环(优选地从1至3个环)，这些环稠合在一起或以共价键相连接。术语“杂芳基”指芳基基团(或环)，这些芳基基团含有一至四个选自N、O、以及S的杂原子，其中氮、碳、以及硫原子可任选地被氧化，并且氮原子可任选地被季铵化的。杂芳基可以通过杂原子附着于该分子的其余部分。芳基以及杂芳基基团的非限制性实例包括苯基、1-萘基、2-萘基、4-联苯基、1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、吡嗪基、2-噁唑基、4-噁唑基、2-苯基-4-噁唑基、5-噁唑基、3-异噁唑基、4-异噁唑基、5-异噁唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-苯并噻唑基、嘌呤基、2-苯并咪唑基、5-吲哚基、1-异喹啉基、5-异喹啉基、2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、3-喹啉基、以及6-喹啉基。以上提到的每一个芳基以及杂芳基环状体系的取代基选自以下说明的可接受的取代基的组。“芳基”以及“杂芳基”也包括环体系，其中一个或多个非芳香族环体系被稠合、或者以其他方式结合至芳基或杂芳基体系上。
简言之，术语“芳基”当与其他术语(如芳氧基、芳硫基、芳烷基)组合使用时，包括以上定义的芳基环以及杂芳基环。因此，术语“芳烷基”意在包括那些基团，其中芳基基团附着于烷基基团(例如，苯甲基、苯乙基、吡啶基甲基、等等)；包括那些烷基基团，其中一个碳原子(例如，亚甲基基团)已被(例如)一个氧原子取代(如苯氧基甲基、2-吡啶基氧基甲基、3-(1-萘氧基)丙基、等等)。
以上术语(如“烷基”、“杂烷基”、“芳基”、以及“杂芳基”)各自均包括指定基团的取代以及未取代的形式。以下提供每个类型基团的优选取代基。
烷基、以及杂烷基的取代基(包括那些经常提到的如亚烷基、链烯基、杂亚烷基、杂烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、环烯基、以及杂环烯基)一般分别称为“烷基取代基”以及“杂烷基取代基”，并且它们可以是一个或多个基团，这些基团选自但不限于：-OR’、＝O、＝NR’、＝NOR’、-NR’R”、-SR’、-卤素、-SiR’R”R’”、-OC(＝O)R’、-C(＝O)R’、-CO2R’、-CONR’R”、-OC(＝O)NR’R”、-NR”C(＝O)R’、-NR’C(＝O)NR”R’”、-NR”C(＝O)2R’、-NRC(NR’R”R’”)＝NR”“、-NRC(NR’R”)＝NR’”、-S(O)R’、-S(O)2R’、-S(O)2NR’R”、-NRSO2R’、-CN和-NO2，数量在从0到(2m’+1)的范围内，其中m’是这种基团的碳原子的总数。R’、R”、R’”以及R””各自均优选地独立地指氢、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基，例如取代有1至3个卤素的芳基、取代或未取代的烷基、烷氧基或硫代烷氧基基团、或芳烷基基团。当本发明的化合物包括多于一个R基团时，例如，当这些基团中多于一个基团存在时，这些R基团各自均独立地选为R’、R”、R’”以及R””基团。当R’和R”附着于相同的氮原子时，它们可与氮原子组合成5、6、或7元环。例如，-NR’R”旨在包括，但不局限于，1-吡咯烷基以及4-吗啉基。从以上取代基的讨论中，本领域中的技术人员会明白术语“烷基”旨在包括结合到非氢基团的基团上的碳原子的基团，例如卤烷基(如-CF3和-CH2CF3)以及酰基(例如，-C(＝O)CH3、-C(＝O)CF3、-C(＝O)CH2OCH3等)。
类似于对烷基基团所说明的取代基，芳基取代基以及杂芳基取代基通常分别被称为“芳基取代基”以及“杂芳基取代基”，并且是不同的并选自，例如：卤素、-OR’、＝O、＝NR’、＝N-OR’、-NR’R”、-SR’、-卤素、-SiR’R”R’”、-OC(＝O)R’、-C(＝O)R’、-CO2R’、-C(＝O)NR’R”、-OC(＝O)NR’R”、-NR”C(＝O)R’、-NR’C(＝O)NR”R’”、-NR”CO2R’、-NRC(NR’R”)＝NR’”、-S(＝O)R’、-S(＝O)2R’、-S(＝O)2NR’R”、-NRSO2R’、-CN和-NO2、-R’、-N3、-CH(Ph)2、氟代(C1-C4)烷氧基和氟代(C1-C4)烷基，并且其数目从0到芳香环状体系上开放化合价的总数的范围内；并且其中R’、R”、R’”以及R””优选独立地选自氢、(C1-C8)烷基以及杂烷基、未取代的芳基以及杂芳基、(未取代的芳基)-(C1-C4)烷基、以及(未取代的芳基)氧基-(C1-C4)烷基。当本发明的化合物包括多于一个R基团时，例如，当这些基团中多于一个基团存在时这些R基团各自均被独立地选为R’、R”、R’”以及R””基团。
任选地，在该芳基或杂芳基环的相邻原子上的两个芳基取代基可被具有式为-T-C(O)-(CRR’)q-U-的取代基取代，其中，T和U独立为-NR-、-O-、-CRR’-或单键；且q是从0到3的整数。备选地，在该芳基或杂芳基环的相邻原子上的两个取代基可任选被具有式-A-(CH2)r-B-的取代基取代，其中，A和B独立地为-CRR’-、-O-、-NR-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2NR’-或单键；且r是从1到4的整数。如此形成的新环的单键之一可任选被双键代替。备选地，在该芳基或杂芳基环的相邻原子的取代基上的两个取代基可任选地被具有式为-(CRR’)s-X-(CR”R’”)d-的取代基取代，其中s和d独立地是从0至3的整数，并且X是-O-、-NR’-、-S-、-S(＝O)-、-S(＝O)2-或-S(＝O)2NR’-。优选地，取代基R、R’、R”以及R’”独立地选自氢或取代或未取代的(C1-C6)烷基。
此处使用的术语“二磷酸酯”包括但不局限于包含两个磷酸酯基团的磷酸的酯。术语“三磷酸酯”包括但不局限于包含三个磷酸酯基团的磷酸的酯。
此处使用的术语“杂原子”包括氧(O)、氮(N)、硫(S)、以及硅(Si)。
除非上下文另有说明，符号“R”是一个通用缩写，它代表取代基，该取代基选自：取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、以及取代或未取代的杂环基基团。
在以下各分部中进一步详细地说明了本发明的不同方面。
具有特定功能性质的抗间皮素抗体
本公开的抗体的特征在于特定的功能特征或性质。例如，它们特异性结合人间皮素，如在细胞表面上表达的人间皮素。优选地，本公开的抗体以高亲和性结合人间皮素，例如以1×10-7M或更小的KD，更优选以5×10-8M或更小的KD，甚至更优选以1×10-8M或更小的KD结合。本公开的抗间皮素抗体结合人间皮素并且优选显示下列性质中的一种或更多种：
(a)以1×10-8M或更小的KD结合人间皮素；
(b)被表达间皮素的细胞内化；
(c)抑制间皮素结合卵巢癌抗原CA125；
(d)对表达间皮素的细胞显示抗体依赖性细胞毒性(ADCC)；以及
(e)当连接到细胞毒素时抑制体内表达间皮素的细胞生长。
优选地，本公开的抗体以5×10-8M或更小的KD结合间皮素蛋白，以3×10-8M或更小的KD结合间皮素蛋白，以1×10-8M或更小的KD结合间皮素蛋白，以7×10-9M或更小的KD结合间皮素蛋白，以6×10-9M或更小的KD结合间皮素蛋白或以5×10-9M或更小的KD结合间皮素蛋白。抗体对间皮素的结合亲和性可以通过例如，标准BIACORE分析进行评价。(参见例如，实施例3B)。
本发明的优选抗体是人单克隆抗体。另外或备选地，抗体可以是，例如，嵌合或人源化单克隆抗体。
单克隆抗体3C10、6A4和7B1
本公开的优选抗体是人单克隆抗体3C10、6A4和7B1，如实施例1和2中所述分离和结构表征。3C10、6A4和7B1的VH氨基酸序列分别显示在SEQ ID NO：19、20和21中。3C10、6A4和7B1的VL氨基酸序列分别显示在SEQ ID NO：22、23和24中。
在另一个方面中，本公开提供这样的抗体：其包含3C10、6A4或7B1的重链和轻链CDR1、CDR2和CDR3，或其组合。3C10、6A4和7B1的VHCDR1的氨基酸序列分别显示在SEQ ID NO：1-3中。3C10、6A4和7B1的VHCDR2的氨基酸序列分别显示在SEQ ID NO：4-6中。3C10、6A4和7B1的VHCDR3的氨基酸序列分别显示在SEQ ID NO：7-9中。3C10、6A4和7B1的VLCDR1的氨基酸序列分别显示在SEQ ID NO：10-12中。3C10、6A4和7B1的VLCDR2的氨基酸序列显示在SEQ ID NO：13-15中。3C10、6A4和7B1的VLCDR3的氨基酸序列分别显示在SEQ ID NO：16-18中。使用Kabat系统描绘CDR区(Kabat，E.A.，等(1991)Sequences of Proteinsof Immunological Interest，Fifth Edition，US Department of Health andHuman Services，NIH Publication No.91-3242，下文称为“Kabat‘242”)。
如果这些抗体中每一种均可以结合人间皮素以及主要由CDR1、CDR2和CDR3区提供抗原-结合特异性，则VHCDR1、CDR2和CDR3序列以及VLCDR1、CDR2和CDR3序列可以“混合和配对”(即，尽管每种抗体必须含有VHCDR1、CDR2和CDR3以及VLCDR1、CDR2和CDR3，来自不同抗体的CDR也可以混合和配对)，以产生本公开的其它抗间皮素结合分子。优选地，当VHCDR序列被混合和配对时，特定VH序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列被结构上类似的CDR序列(一个或多个)替代。同样，当VLCDR序列被混合和配对时，特定VL序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列优选被结构上类似的CDR序列(一个或多个)替代。对本领域技术人员而言，容易显而易见的是，新VH和VL序列可以这样产生：通过用与本文公开的单克隆抗体3C10、6A4和7B1的CDR序列结构上类似的序列取代一个或更多个VH和/或VLCDR区序列。
因此，在另一个方面中，本公开提供分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含
(a)包含选自SEQ ID NO：1-3的氨基酸序列的重链可变区CDR1；
(b)包含选自SEQ ID NO：4-6的氨基酸序列的重链可变区CDR2；
(c)包含选自SEQ ID NO：7-9的氨基酸序列的重链可变区CDR3；
(d)包含选自SEQ ID NO：10-12的氨基酸序列的轻链可变区CDR1；
(e)包含选自SEQ ID NO：13-15的氨基酸序列的轻链可变区CDR2；以及
(f)包含选自SEQ ID NO：16-18的氨基酸序列的轻链可变区CDR3；
其中所述抗体特异性结合人间皮素。
在一个优选的实施方案中，抗体依照实施方案A。在另一个优选的实施方案中，抗体依照实施方案B。在又一个优选的实施方案中，抗体依照实施方案C。
在本领域中公知，CDR3结构域，独立于CDR1和/或CDR2结构域，其单独可以决定抗体对同源抗原的结合特异性，以及基于共同的CDR3序列可以预测可产生具有相同结合特异性的多个抗体。
因此，本公开提供单克隆抗体，其包含源自人或非人动物的抗体的一个或更多个重链和/或轻链CDR3结构域，其中所述单克隆抗体能够特异性结合人间皮素。在某些方面中，本公开提供单克隆抗体，其包含非人抗体如小鼠或大鼠抗体的一个或更多个重链和/或轻链CDR3结构域，其中所述单克隆抗体能够特异性结合间皮素。在一些实施方案中，包含非人抗体的一个或更多个重链和/或轻链CDR3结构域的这类发明抗体(a)能够与相应的亲代非人抗体竞争结合；(b)保留相应的亲代非人抗体的功能特征；(c)结合与相应的亲代非人抗体相同的表位；和/或(d)具有类似于相应的亲代非人抗体的结合亲和性。
在其它方面中，本公开提供单克隆抗体，其包含来自人抗体的一个或更多个重链和/或轻链CDR3结构域，所述人抗体诸如从非人动物获得的人抗体，其中所述人抗体能够特异性结合人间皮素。在其它方面中，本公开提供单克隆抗体，其包含第一人抗体一个或更多个重链和/或轻链CDR3结构域，所述第一人抗体诸如从非人动物获得的人抗体，其中第一人抗体能够特异性结合人间皮素以及其中第一人抗体的CDR3结构域替代缺乏间皮素结合特异性的人抗体中的CDR3结构域，以产生能够特异性结合人间皮素的第二人抗体。在一些实施方案中，包含第一人抗体的一个或更多个重链和/或轻链CDR3结构域的本发明抗体(a)能够与相应的亲代第一人抗体竞争结合；(b)保留相应的亲代第一人抗体的功能特征；(c)结合与相应的亲代第一人抗体相同的表位；和/或(d)具有类似于相应的亲代第一人抗体的结合亲和性。
具有特定种系序列的抗体
在某些实施方案中，本公开的抗体包含特定种系重链免疫球蛋白基因的VH和/或特定种系轻链免疫球蛋白基因的VL。
例如，在优选的实施方案中，本公开提供分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含是人VH 3-33基因或人VH 3-7基因产物或源自人VH 3-33基因或人VH 3-7基因的VH，其中所述抗体特异性结合人间皮素。在另一个优选的实施方案中，本公开提供分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含是人VK L6基因或人VK A27基因产物或源自人VK L6基因或人VKA27基因的VL，其中所述抗体特异性结合人间皮素。在又一个优选的实施方案中，本公开提供分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体包含是人VH 3-33基因产物或源自人VH 3-33基因的VH并且包含是人VKL6基因产物或源自人VK L6基因的VL，其中所述抗体特异性结合人间皮素。在又一个优选的实施方案中，本公开提供分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体包含是人VH 3-7基因产物或源自人VH 3-7基因的VH并且包含是人VK A27基因产物或源自人VK A27基因的VL，其中所述抗体特异性结合人间皮素。
这些抗体也可以具有一种或更多种上面详细描述的功能特征，如高亲和性结合人间皮素，被表达间皮素的细胞内化，抑制间皮素结合CA125，调节针对表达间皮素的细胞的ADCC的能力和/或当连接至细胞毒素时抑制体内表达间皮素的肿瘤细胞的肿瘤生长。
分别具有VH 3-33和VK L6的VH和VL的抗体实例是3C10和6A4抗体。分别具有VH 3-7和VK A27的VH和VL的抗体实例是7B1抗体。
如本文所用，人抗体包含重链或轻链可变区，所述重链或轻链可变区是特定种系序列的“产物”或“源自”特定种系序列——如果抗体的可变区从使用人种系免疫球蛋白基因的系统获得的话。这些系统包括用感兴趣的抗原免疫携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠或用感兴趣的抗原筛选在噬菌体上展示的人免疫球蛋白基因文库。是人种系免疫球蛋白序列的“产物”或“源自”人种系免疫球蛋白序列的人抗体可以这样鉴定：比较人抗体氨基酸序列与人种系免疫球蛋白氨基酸序列并且选择序列最接近(即，最大同一性％)人抗体序列的人种系免疫球蛋白序列。一种“产自”或“源自”特定的人类种系免疫球蛋白序列的人抗体，与该种系序列相比，可以含有氨基酸差异，因为例如，自然产生的体细胞突变或故意引入定点突变。然而，经选择的人抗体典型地与由人类种系免疫球蛋白基因所编码的氨基酸序列在氨基酸序列上具有至少90％的同一性，而且与其他物种的种系免疫球蛋白氨基酸序列(例如，鼠类种系序列)进行比较时，含有将所述人抗体鉴定为人源的氨基酸残基。在某些情况下，人抗体与该种系免疫球蛋白基因所编码的氨基酸序列在氨基酸序列上可以具有至少95％、或甚至至少96％、97％、98％、或99％的同一性。典型地，与由人类种系免疫球蛋白基因所编码的氨基酸序列相比，来自特定的人类种系序列的人抗体将展示不超过10个氨基酸差异。在某些情况下，与由该种系免疫球蛋白基因所编码的氨基酸序列相比，所述人抗体可以展示不超过5个，或甚至不超过4个、3个、2个，或1个氨基酸差异。
同源抗体
在又一个实施方案中，本公开的抗体包括一些重链可变区及轻链可变区，这些可变区含有与本文所述的优选抗体的氨基酸序列同源的氨基酸序列，并且其中，该抗体保留本公开的抗-间皮素抗体的所希望的功能特性。
例如，本公开提供分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含VH和VL，其中：(a)VH包含的氨基酸序列至少80％同源于选自SEQ ID NO：19-21的氨基酸序列；(b)VL包含的氨基酸序列至少80％同源于选自SEQ IDNO：22-24的氨基酸序列；以及(c)该抗体特异性结合人间皮素。
在其它实施方案中，VH和/或VL氨基酸序列可以85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源于上述序列。具有VH和VL区——所述VH和VL区与上述序列VH和VL区具有高同源性(即，80％或更大)——的抗体可以这样获得：通过编码SEQ ID NO：25-27或28-30的核酸分子的诱变(例如，定点诱变或PCR-介导的诱变)，接着使用本文描述的功能测定测试编码的改变的抗体所保留的功能(即，上述功能)。
两个氨基酸序列之间的同源性百分比等同于两个序列之间的同一性百分数。在这两个序列之间的同一性百分数是这些序列共有的相同位置的数目的函数(即，％同源性＝相同位置数/位置总数×100)，考虑到空位(gap)的数目，及每个空位的长度，它们需要被引入用于这两条序列的最优比对。正如在以下的非限制性实例中所述，使用数学算法可以完成两条序列之间的序列比较以及同一性百分数的测定。
使用E.Meyers及W.Miller(Comput.Appl.Biosci.，4：11-17(1988)的算法可以确定在两条氨基酸序列之间的同一性百分数，该算法已经结合至ALIGN程序(版本2.0)中，该算法使用了PAM120权重残基表(weightresidue table)、空位长度罚分(gap length penalty)12以及空位罚分4。此外，使用Needleman及Wunsch(J.Mol.Biol.48：444-453(1970))算法能确定在两条氨基酸序列之间的同一性百分数，该算法已结合至GCG软件包的GAP程序中(可在http://www.gcg.com获得)，该算法使用了Blossum 62矩阵或PAM250矩阵，以及空位权重16、14、12、10、8、6，或4以及长度权重1、2、3、4、5，或6。
本公开的蛋白质序列可进一步用作“查询序列”，对公共数据库进行检索，例如鉴定相关序列。这种检索可采用Altschul，et al.(1990)J.Mol.Biol.215：403-10的XBLAST程序(版本2.0)来进行。通过XBLAST程序，记分＝50，字长＝3进行BLAST蛋白质检索，以获得与本公开的抗体分子同源的氨基酸序列。为获得用于比较目的的空位比对，可利用如Altschul etal.((1997)Nucleic Acids Res.25(17)：3389-3402所述的Gapped BLAST。当利用BLAST及Gapped BLAST程序时，可使用各自的程序(例如XBLAST与NBLAST)的默认参数。参见www.ncbi.nlm.nih.gov。
具有保守修饰的抗体
在某些实施方案中，本公开的抗体包含VH，其包含CDR1、CDR2和CDR3序列，以及VL，其包含CDR1、CDR2和CDR3序列，其中这些CDR序列中的一个或更多个包含基于已知抗间皮素抗体的指定氨基酸序列、或其保守修饰，以及其中所述抗体保留本公开的抗间皮素抗体的期望功能性质。在本领域中可以理解的是，可以进行某些保守序列修饰，其不去除抗原结合。因此，本公开提供分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含含有CDR1、CDR2和CDR3序列的VH和含有CDR1、CDR2和CDR3序列的VL，其中：(a)VHCDR3序列包含选自SEQ ID NO：7-9的氨基酸序列和其保守修饰的氨基酸序列；(b)VLCDR3序列包含选自SEQ IDNO：16-18的氨基酸序列和其保守修饰的氨基酸序列；以及(c)所述抗体特异性结合人间皮素。
在优选的实施方案中，重链可变区CDR2序列包含选自SEQ ID NO：4-6的氨基酸序列和其保守修饰的氨基酸序列；以及轻链可变区CDR2序列包含选自SEQ ID NO：13-15的氨基酸序列和其保守修饰的氨基酸序列。在另一个优选的实施方案中，重链可变区CDR1序列包含选自SEQ ID NO：1-3的氨基酸序列和其保守修饰的氨基酸序列；以及轻链可变区CDR1序列包含选自SEQ ID NO：10-12的氨基酸序列和其保守修饰的氨基酸序列。
术语“保守性序列修饰”意指不会显著影响或改变含有该氨基酸序列的抗体的结合特性的氨基酸修饰。这种保守性修饰包括氨基酸的置换、添加、以及缺失。通过本领域已知的标准技术(例如位点定向诱变及PCR介导的诱变)可将修饰引入本公开的抗体中。保守性氨基酸置换是指以下的置换，其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基替换。已经在本领域中定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，具有酸性侧链的氨基酸(如天冬氨酸、谷氨酸)，具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)，具有非极性侧链的氨基酸(如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)，具有β-分支侧链的氨基酸(如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)，以及具有芳香族侧链的氨基酸(如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，本公开的抗体的CDR区中的一个或多个氨基酸残基可以被来自相同侧链家族的其他氨基酸残基替代，并且使用此处说明的功能测定对已改变的抗体的保留功能进行测试。
与抗间皮素抗体结合相同表位的抗体
在另一个实施方案中，本公开提供结合间皮素上由本公开的任何抗间皮素单克隆抗体识别的表位的抗体(即，具有与本公开的任何单克隆抗体交叉竞争结合人间皮素的能力的抗体)。在优选的实施方案中，用于交叉竞争研究的参考抗体可以是单克隆抗体3C10(其具有分别在SEQ ID NO：19和22中显示的VH和VL序列)或单克隆抗体6A4(其具有分别在SEQ ID NO：20和23中显示的VH和VL序列)或单克隆抗体7B1(其具有分别在SEQ IDNO：21和24中显示的VH和VL序列)。
这些交叉竞争的抗体可以这样鉴定：基于在标准间皮素结合测定如ELISA或BIAcore分析中它们与3C10、6A4或7B1交叉竞争的能力。在优选的实施方案中，结合人间皮素上由3C10、6A4或7B1识别的相同表位的抗体是人单克隆抗体。这些单克隆抗体可以如实施例中所述制备和分离。
改造和修饰的抗体
本发明的抗体进一步可以这样制备：使用具有一个或更多个已知抗间皮素抗体VH和/或VL序列的抗体作为起始材料，以改造与起始抗体相比具有改变性质的修饰抗体。在VH和VL之一或两者内的、在一个或更多个CDR区内的和/或在一个或更多个构架区内的一个或更多个氨基酸可以修饰。因此或备选地，在恒定区(一个或多个)内的残基可以被修饰来改变抗体的效应功能。
在某些实施方案中，可以使用CDR移植以对抗体的可变区进行工程化。抗体与靶抗原主要通过其CDR中的氨基酸残基进行相互作用。因此，CDR中的氨基酸序列在各个抗体之间比在CDR之外的序列更具有多样性。因为CDR序列负责大部分抗体-抗原相互作用，所以通过构建表达载体，表达模拟特定自然发生的抗体特性的重组抗体是可能的，所述表达载体包括来自自然发生的抗体的CDR序列，其被移植至来自具有不同特性的不同抗体的构架序列(参见，例如Riechmann，L.et al.(1998)Nature332：323-327；Jones，P.et al.(1986)Nature 321：522-525；Queen，C.et al(1989)Proc.Natl.Acad.See.U.S.A.86：10029-10033；Winter的美国专利号5,225,539，以及Queen等人的美国专利号5,530,101；5,585,089；5,693,762及6,180,370)。
因此，本公开的另一个实施方案涉及分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含含有CDR1、CDR2和CDR3序列的VH，所述CDR1、CDR2和CDR3序列分别包含选自SEQ ID NO：1-3、SEQ ID NO：4-6和SEQ IDNO：7-9的氨基酸序列，以及含有CDR1、CDR2和CDR3序列的VL，所述CDR1、CDR2和CDR3序列分别包含选自SEQ ID NO：10-12、SEQ IDNO：13-15和SEQ ID NO：16-18的氨基酸序列。因而，这些抗体含有单克隆抗体3C10、6A4或7B1的VH和VLCDR序列，也可以含有这些抗体的不同构架序列。
这些构架序列可以从包括种系抗体基因序列的公共DNA数据库或出版的文献获得。例如，人VH和VL基因的种系DNA序列可以在下列中找到：“VBase”人种系序列数据库(以www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase在Internet上获得)，以及Kabat‘242；Tomlinson，I.M.，等(1992)J.Mol.Biol.227：776-798；和Cox，J.P.L.等(1994)Eur.J.Immunol.24：827-836；其每一个通过引用并入本文。作为另一个实例，人VH和VL基因的种系DNA序列可以在Genbank数据库中找到。例如，在HCo7HuMAb小鼠中发现的下列重链种系序列以所附的Genbank登录号可以得到：1-69(NG_0010109，NT_024637和BC070333)、3-33(NG_0010109和NT_024637)和3-7(NG_0010109和NT_024637)。作为另一个实例，在HuMAb小鼠类型的HCo12小鼠中发现的下列重链种系序列以所附的Genbank登录号可以得到：1-69(NG_0010109，NT_024637和BC070333)、5-51(NG_0010109和NT_024637)、4-34(NG_0010109和NT_024637)、3-30.3(CAJ556644)以及(AJ406678)。人重链和轻链种系序列的又一个来源是可从IMGT(http://imgt.cines.fr)得到的人免疫球蛋白基因数据库。
用序列相似性检索方法中的一种方法(被称为Gapped BLAST)将抗体蛋白序列与汇编的蛋白数据库进行比较(Altschul et al.(1997)NucleicAcids Research 25：3389-3402)，这种方法对于本领域的技术人员而言是熟知的。BLAST是一种启发式算法，因为在抗体序列与数据库序列之间的在统计学上显著的比对可能包含比对字符的高得分片段对(HSP)。通过扩展或修正不能提高片段对分数的片段对被称为命中项(hit)。简言之，翻译VBASE来源的核苷酸序列(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase1/list2.php)，并且保留FR1至FR3构架区之间的区域(包括FR1至FR3构架区)。这些数据库序列具有的平均长度为98个残基。除去重复序列(它们是蛋白质全部长度上的精确匹配)。用于蛋白质的BLAST搜索，使用带有默认值的程序blastp、除低复杂性过滤(已被关闭)以外的标准参数，以及BLOSUM62的置换矩阵，针对实现序列相配的前5个命中项进行过滤。在全部六个框架中翻译核苷酸序列，并且在数据库序列的匹配片段中不具有终止密码子的框架被视为潜在的命中项。进而使用BLAST程序tblastx对此进行确认。该程序翻译了全部六个框架中的抗体序列，并且将这些翻译与在全部六个框架中被动态翻译的VBASE核苷酸序列进行比较。可以如以上说明使用类似于VBASE的方法对其他人类种系序列数据库(例如可从IMGT(http://imgt.cines.fr)获得的数据库)进行检索。
同一性是在抗体序列与蛋白质数据库之间序列的全长上精确的氨基酸匹配。这些阳性项(同一性+取代匹配)不是相同的，而是由BLOSUM62置换矩阵所引导的氨基酸置换。如果抗体序列以相同的同一性匹配数据库序列中的两条序列，则具有最大阳性的命中项将被判定为匹配的序列命中项。
可用于本公开的抗体的优选的构架序列是与所选择的本公开的抗体所用的构架序列在结构上类似的那些构架序列，例如类似于本公开的优选的单克隆抗体所使用的以下构架序列：VH 3-33(SEQ ID NO：31)或VH 3-7(SEQ ID NO：32)构架序列和/或VK L6(SEQ ID NO：33)或VK A27(SEQID NO：34)构架序列。这些VHCDR1、CDR2、和CDR3序列，以及VKCDR1、CDR2、和CDR3序列可以被移植至多个构架区上，这些构架区具有与从中衍生出该构架序列的种系免疫球蛋白基因中所发现的序列相同的序列，或者这些CDR序列可以被移植至多个构架区上，这些构架区与这些种系序列相比含有一个或多个突变。例如，已发现在某些情况下对构架区内的残基进行突变以保持或增强抗原结合能力是有益的(参见例如Queen等人的美国专利号5,530,101；5,585,089；5,693,762以及6,180,370)。
另一种类型的可变区修饰是在VH和/或VKCDR1、CDR2和/或CDR3区中对氨基酸残基进行突变，由此改善目的抗体的一种或多种结合特性(例如亲和力)。可以进行定向诱变或PCR介导的诱变来引入一种或多种突变，并且对于抗体的结合能力、或其他目的功能特性的作用可以在体内或体外试验中进行评估，如本文所述。优选地引入保守性修饰。这些突变可以是氨基酸置换、添加、或缺失，但优选是置换。此外，典型地在一个CDR区域中改变不超过一个、两个、三个、四个或五个残基。
因此，在另一个实施方案中，本公开提供分离的抗间皮素单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含：(a)VHCDR1区，其包含选自SEQ ID NO：1-3的氨基酸序列或与SEQ ID NO：1-3相比具有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列；(b)VHCDR2区，其包含选自SEQID NO：4-6的氨基酸序列或与SEQ ID NO：4-6相比具有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列；(c)VHCDR3区，其包含选自SEQ ID NO：7-9的氨基酸序列或与SEQ ID NO：7-9相比具有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列；(d)VLCDR1区，其包含选自SEQ ID NO：10-12的氨基酸序列或与SEQ ID NO：10-12相比具有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列；(e)VLCDR2区，其包含选自SEQ ID NO：13-15的氨基酸序列或与SEQ ID NO：13-15相比具有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列；以及(f) VLCDR3区，其包含选自SEQ ID NO：16-18的氨基酸序列或与SEQ ID NO：16-18相比具有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列。
本发明的改造抗体包括这些抗体：其中对VH和/或VL中构架残基进行修饰，例如以改善抗体性质。通常进行这些构架修饰，以降低抗体的免疫原性。一种方法是将一个或更多个构架残基“回复突变”成相应的种系序列。更具体而言，已经经历体细胞突变的抗体可以含有不同于所述抗体从其来源的种系序列的构架残基。这些残基可以通过比较抗体构架序列与所述抗体从其来源的种系序列来鉴定。
例如，表A显示其中构架区氨基酸位置(使用Kabat编号系统)不同于种系的区域以及该位置如何通过给出的取代而回复突变成种系：
另一种类型的构架修饰涉及对构架区内一个或多个残基，或甚至对一个或多个CDR区域内的一个或多个残基进行突变，以去除T细胞表位，由此降低该抗体的潜在免疫原性。这一方法也被称为“去免疫原化”，并且在Carr等人的US20030153043中有进一步的详细说明。
除了在构架区或CDR区域内进行的修饰之外，或作为其替代，还可以对本公开的抗体进行工程化，以在Fc区域内也包括一些修饰，典型地改变一种或多种功能特性，例如血清半衰期、补体固定(complementfixation)、Fc受体结合、和/或依赖抗原的细胞毒性作用。此外，本公开的抗体可以被化学修饰(例如，可以将一个或多个化学物部分附着至该抗体)，或被修饰以改变其糖基化作用，再次以便改变该抗体的一个或多个功能特性。以下对这些实施方案中的每一个均进行进一步详细的说明。Fc区中残基的编号是Kabat的EU索引编号。
在一个实施方案中，CH1的铰链区被修饰，以便改变(即，增加或减少)铰链区中半胱氨酸残基数，如Bodmer等的US 5,677,425中所述。这些改变可以促进轻链和重链的装配或增加或降低抗体稳定性。
在另一个实施方案中，对抗体的Fc铰链区进行突变以减小该抗体的生物半衰期。更确切地说，将一个或多个氨基酸突变引入Fc铰链片段的CH2-CH3结构域界面区域，使得相对于天然Fc铰链域的葡萄球菌A蛋白(Staphylococal protein A，SpA)的结合而言，该抗体减弱了SpA的结合。Ward等人的US6,165,745更详细地说明了这一方法。
在另一个实施方案中，对该抗体进行修饰以增大其生物半衰期。例如，如Ward的US6,277,375所述，引入以下突变中的一个或多个突变：T252L、T254S、T256F。备选地，该抗体可以在CH1或CL区域中发生变化以包括从IgG的Fc区域的CH2结构域的两个环处获得的补救受体(salvagereceptor)结合表位，如Presta等人的US5,869,046及6,121,022中所述。
在又一其它实施方案中，Fc区通过用不同的氨基酸残基置换至少一种氨基酸残基来改变，以改变其(一种或多种)效应功能。例如，氨基酸残基234、235、236、237、297、318、320和322中的一个或更多个可以用不同的氨基酸残基置换，以便抗体对于效应子配体——例如，Fc受体或补体的C1组分——具有改变的亲和性但保留亲代抗体的抗原结合能力，如在Winter等的US 5,624,821和5,648,260中所述。
在另一个实例中，氨基酸残基329、331和322中的一个或更多个可以被置换，以便抗体具有改变的C1q结合和/或降低或消除的补体依赖性细胞毒性(CDC)，如在Idusogie等的US 6,194,551中所述。
在另一个实例中，氨基酸位置231和239中的一个或更多个氨基酸残基被改变，从而改变抗体固定补体的能力。该方法进一步描述在Bodmer等的WO 94/29351中。
在另一个实例中，为了提高该抗体介导抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)的能力和/或提高该抗体对Fcγ受体的亲和性，通过在下列位置修饰一个或多个氨基酸，对Fc区域进行了修饰：238、239、248、249、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、309、312、315、320、322、324、326、327、329、330、331、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、438或439。Presta的WO 00/42072中进一步详细地说明了这一方法。此外，在人类IgG1上已做出针对FcγRI、FcγRII、FcγRIII及FcRn的结合位点的图谱，并说明了具有改善的结合的变体(参见Shields，R.L.et al.(2001)J.Biol.Chem.276：6591-6604)。在位置256、290、298、333、334及339具有的特定突变显示出改善对FcγRIII的结合。另外，下列组合突变体显示出改善FcγRIII的结合：T256A/S298A，S298A/E333A，S298A/K224A及S298A/E333A/K334A。
在再一个实施方案中，如PCT/US2008/073569(其全文并入本文作为参考)所说明，通过引入半胱氨酸残基来修饰本发明的抗体的C末端。此类修饰包括但不限于在全长重链序列的C端处或在其附近替换现有的氨基酸残基，以及将包含半胱氨酸的延长序列(extension)引入至全长重链序列的C端。在优选的实施方案中，包含半胱氨酸的延长序列包括序列半胱氨酸-丙氨酸-丙氨酸(从N端至C端)。
在优选的实施方案中，此类C末端的半胱氨酸修饰的存在为配偶体分子的缀合提供了位点，该配偶体分子为例如治疗剂或标记物分子。特别是，由于C末端半胱氨酸修饰，反应性硫羟基的存在可以被用于利用二硫化物接头或硫氢基-反应性马来酰亚胺基团来连接配偶体分子。抗体与配偶体分子以这一方式的缀合使得可以增强对所附着的特异的位点的控制。此外，通过在C末端或在其附近引入该附着点，优化了缀合，使得它减少或者消除对该抗体的功能特性的干扰，并且使得缀合物制备物的简化分析以及质量控制成为可能。
在又一实施方案中，抗体的糖基化通过消除糖基化(去糖基化)或改变糖基化的位点(一个或多个)来修饰，以增加其对其抗原的亲和性。例如，可以进行导致一个或更多个可变区构架糖基化位点消除的一个或更多个氨基酸取代。这些去糖基化可以增加抗体对抗原的亲和性。参见Co等的US5,714,350和6,350,861。改变糖基化的另外的方法描述在Hanai等的US7,214,775；Presta的US 6,737,056；Presta的US 20070020260；Dickey等的WO 2007/084926；Zhu等的WO 2006/089294；以及Ravetch等的WO2007/055916中；其中每一个通过引用全部并入。
另外地或备选地，可以制备具有改变类型的糖基化的抗体，如低岩藻糖基化的抗体，其具有减少量的岩藻糖基残基，或具有增加的二等分GlcNac结构的抗体。这些改变的糖基化模式已经被证实增加抗体的ADCC能力。这些糖类修饰可以通过例如，在具有糖基化改变机制的宿主细胞中表达抗体来完成。例如，细胞系Ms704、Ms705和Ms709缺乏岩藻糖基转移酶基因，FUT8(α(1，6)岩藻糖基转移酶)，使得在这些细胞系中表达的抗体在它们的糖类上缺乏岩藻糖。参见Yamane等的US 2004/0110704和Yamane-Ohnuki等(2004)Biotechnol Bioeng 87：614-22。作为另一个实例，Hanai等的EP 1,176,195描述了具有功能上被破坏的FUT8基因的细胞系，该FUT8基因编码岩藻糖基转移酶，使得在这种细胞系中表达的抗体显示出低岩藻糖基化。Hanai等还描述了这样的细胞系，其具有将岩藻糖添加到结合至抗体Fc区的N-乙酰葡糖胺的低酶活性。Presta的WO03/035835描述了变体CHO细胞系——Lec13细胞，其将岩藻糖连接到Asn(297)-连接的糖类的能力降低，这也导致低岩藻糖基化(也参见Shields，R.L.等.(2002)J.Biol.Chem.277：26733-26740)。Umana等的WO99/54342描述了这样的细胞系，其被改造来表达修饰糖蛋白的糖基转移酶，使得这些细胞系表达的抗体显示出抗体的二等分GlcNac结构增加以及ADCC活性增加(也参见Umana等(1999)Nat.Biotech.17：176-180)。备选地，抗体的岩藻糖残基可以使用岩藻糖苷酶切割掉(Tarentino，A.L.等(1975)Biochem.14：5516-23)。
另外地或备选地，可以制备具有改变类型的糖基化的抗体，其中所述改变涉及抗体的唾液酸化水平。这些改变描述在Dickey等的WO2007/084926和Ravetch等的WO 2007/055916中，两者通过引用而并入。例如，可以利用采用唾液酸酶的酶反应，如US 5,831,077中所述，其通过引用而并入本文。适合的酶的其它实例是神经氨酸酶和N-糖苷酶F，如Schloemer等，J.Virology，15(4)，882-893(1975)和Leibiger等，Biochem J.，338，529-538(1999)中分别所述。备选地，可以采用如通过使用唾液酸转移酶来增加唾液酸化水平的方法，如Basset等，Scandinavian Journal ofImmunology，51(3)，307-311(2000)中所述。
本发明考虑的本文抗体的另一种修饰是聚乙二醇化。抗体可以聚乙二醇化，以便，例如增加其生物(例如，血清)半衰期。为使抗体聚乙二醇化，抗体或其片段通常与聚乙二醇(PEG)衍生物，如PEG的反应性酯或醛衍生物反应。或者，聚乙二醇化通过与反应性PEG分子(或类似的反应性水溶性聚合物)的酰基化反应或烷基化反应来实施。如本文所用，术语“聚乙二醇”包括已经用于衍生化其它蛋白质的PEG的任何形式，如单(C1-C10)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇或者聚乙二醇-马来酰亚胺。待聚乙二醇化的抗体可以是去糖基化的抗体。使蛋白质聚乙二醇化的方法在本领域中是已知的并且可以应用于本发明抗体。参见例如，Nishimura等的EP 0 154 316和Ishikawa等的EP 0 401 384。
抗体片段和抗体模拟物
本发明不限于常规的抗体，并可通过抗体片段以及抗体模拟物的使用得以实施。多种抗体片段以及抗体模拟物技术现在已经被开发出来并且已在本领域广为人知。
结构域抗体(dAb)是抗体的最小功能结合单位，对应于人抗体的重链(VH)或轻链(VL)的可变区。结构域抗体的分子量大约为13kDa。Domantis已经开发了一系列全部人类VH与VL dAb的大而高功能性文库(每一文库中有超过一百亿个不同的序列)，并使用这些文库来选择对治疗靶标特异的dAb。与许多常规的抗体相比，结构域抗体在细菌、酵母、以及哺乳动物的细胞体系中的表达良好。结构域抗体及其生产方法的进一步细节可通过参见以下文献而获得：US 6,291,158；6,582,915；6,593,081；6,172,197；以及6,696,245；US 2004/0110941；EP 1433846、0368684和0616640；WO 2005/035572、2004/101790、2004/081026、2004/058821、2004/003019和2003/002609，其中每一项的全文完整并入本文作为参考。
纳米抗体(Nanobody)是源自抗体的治疗性蛋白质，它包含天然发生的重链抗体的独特结构及功能特性。这些重链抗体包含一个单一可变区(VHH)和两个恒定区(CH2与CH3)。重要的是，经克隆并分离的VHH结构域是携带原始重链抗体的全部抗原结合能力的完全稳定的多肽。纳米抗体与人抗体的VH结构域有高同源性，并且可以进一步被人源化而不会损失任何活性。重要的是，纳米抗体具有低免疫原性的潜力，这在使用纳米抗体先导化合物的灵长类动物研究中已得到证实。
纳米抗体结合了常规抗体的优点以及小分子药物的重要特征。与常规抗体一样，纳米抗体显示出高靶标特异性，对它们的靶标的高亲和力以及低固有毒性。然而，像小分子药物一样，它们能够抑制酶类并且容易接近受体裂缝(receptor cleft)。此外，纳米抗体非常稳定，可以通过注射之外的方法进行给药(例如，参见WO 2004/041867，其全文并入本文作为参考)，并且易于制造。纳米抗体的其他优点包括：由于其尺寸小而识别不常见的或隐藏的表位；由于其独特的三维的、药物形式的灵活性而以高亲和力及选择性结合进入蛋白靶标的空腔或活性位点；对半衰期的定制，以及容易并且快速的发现药物。
纳米抗体由单一基因编码，并在几乎全部的原核宿主和真核宿主中被有效生产，这些宿主例如大肠杆菌(E.coli)(参见，如，US 6,765,087，其全文并入本文作为参考)、霉菌(例如曲霉属或木霉属)、以及酵母(例如酵母属、克鲁维酵母属、汉逊酵母属、或毕赤酵母属)(参见，如，US6,838,254，其全文并入本文作为参考)。
纳米克隆方法(见，例如WO 06/079372，其全文并入本文作为参考)是一种用于产生针对所希望的靶标的纳米抗体的专有方法，它基于B细胞的自动高通量选择，并且能够在本发明的情况中使用。
迷你抗体(UniBodies)是另一种抗体片段技术，然而其基于去除IgG4抗体铰链区。缺失铰链区产生基本上是传统IgG4抗体大小一半的分子并且具有单价结合区，而不是IgG4抗体的二价结合区。像IgG4抗体一样，迷你抗体是惰性的并且不与免疫系统相互作用，这对于不期望免疫反应的疾病治疗可以是有利的。迷你抗体可以起抑制或沉默但不杀死它们所结合的细胞的功能。另外，结合到癌细胞的迷你抗体不刺激癌细胞增殖。而且，由于迷你抗体几乎都较小，所以它们以潜在的有利功效在较大的实体肿瘤上显示较好的分布。迷你抗体以类似于完整IgG4抗体的速度从体内清除并且能够对其抗原以类似的亲和性结合。迷你抗体的进一步详述可以通过参考WO 2007/059782而获得，其通过引用而全部并入。
亲和抗体(Affibody)分子是基于58个氨基酸残基蛋白结构域的亲和蛋白，所述结构域源自葡萄球菌A蛋白的三螺旋束IgG-结合结构域。该结构域已经被用作构建组合噬菌粒文库的支架，使用噬菌体展示技术可以从所述文库选择靶向期望分子的亲和抗体变体(Nord等，Nat Biotechnol 1997；15：772-7；Ronmark et al.，Eur J Biochem 2002；269：2647-55)。亲和抗体分子简单稳健的结构和低的分子量(6kDa)使得它们适用于多种应用，例如，用作受体相互作用的检测试剂和抑制剂。有关亲和抗体及其生产的进一步描述发现在US 5,831,012中，其通过引用全部并入本文。标记的亲和抗体也可以用于成像应用中，以测定同种型的丰度。
DARPin(设计的锚蛋白重复蛋白)体现了DRP(设计的重复蛋白)抗体模拟技术，其被发展来开发非抗体多肽的结合能力。重复蛋白如锚蛋白和富含亮氨酸的重复蛋白是普遍存在的结合分子，不像抗体一样，所述结合分子出现在细胞内和细胞外。它们的独特模块式结构特征在于重复结构单元(重复)，其堆叠在一起形成显示可变的和模块式靶结合表面的细长重复结构域。基于这种模块性，可以产生具有高度多样化结合特异性的多肽组合文库。该策略包括展示可变表面残基的可自相容重复的共有区设计和它们随机装配入重复结构域。
DARPin可以以非常高的收率产生于细菌表达系统中并且是已知最稳定的蛋白质之一。已经制成高度特异性、高亲和性DARPin——其结合众多种目标蛋白，包括人受体、细胞因子、激酶、人蛋白酶、病毒和膜蛋白，包括具有个位数纳摩尔浓度至兆摩尔浓度范围的亲和性的一些DARPin。
DARPin已经被用于多种应用中，包括ELISA、夹心ELISA、流式细胞分析(FACS)、免疫组织化学(IHC)、芯片应用、亲和纯化或蛋白质印迹法。DARPin不仅理想地阻断蛋白-蛋白相互作用，而且理想地抑制酶。在肿瘤上非常快速和特异性富集以及非常有利的肿瘤/血液比使得DARPin非常适于体内诊断或治疗方法。有关DARPin及其它DRP技术的另外的信息可以发现在US 2004/0132028和WO 02/20565中，两者通过引用而并入。
Anticalin是另一种抗体模拟技术，然而在这种情况下，结合的特异性源自脂笼蛋白，脂笼蛋白是一个低分子量蛋白家族，在人体组织及体液中天然地大量表达。脂笼蛋白已经得到进化，在体内进行与生理运输及化学敏感的或不溶性化合物的存储有关的多种功能。脂笼蛋白具有坚固的内部结构，包括在该蛋白的一端支持四个环的高度保守的β-桶。这些环形成了结合口袋的入口，并且在分子这一部分中的构象差异解释了在各个脂笼蛋白之间的结合特异性的不同。
尽管由保守的β-片层构架支持的超变环的整体结构让人联想起免疫球蛋白，但脂笼蛋白与抗体在大小上差异显著，它由160至180个氨基酸的单个多肽链构成，该单个多肽链略大于单个免疫球蛋白结构域。
对脂笼蛋白进行克隆，并对它们的环工程化以便产生抗运载蛋白。已经生成了在结构上多样的抗运载蛋白的文库，并且抗运载蛋白的展示允许对结合功能进行选择和筛选，随后通过在原核或真核体系中表达并产生可溶性蛋白而进一步分析。研究已经成功地证明了可以开发出对几乎任何人类靶蛋白特异的抗运载蛋白，可以将它们分离出来，并且可以获得在纳摩尔或更高范围内的结合亲和力。
抗运载蛋白还可以被编排成双靶向性蛋白(Duocalin)。使用标准的生产方法，Duocalin在易于生产的单体蛋白中结合两种单独的治疗性靶标，同时保持靶标特异性和亲和力，无论它的两个结合结构域的结构取向如何。
通过单个分子调节多个靶标在已知涉及一种以上发病因子的疾病中是特别有优势的。此外，二价或多价结合形式(例如Duocalin)通过细胞表面受体的结合及聚簇在靶定疾病中的细胞表面分子、介导信号转导通路上的激动效应或诱导增强的内化效应具有显著的潜力。此外，Duocalin的高固有稳定性与单体抗运载蛋白是相当的。
有关Anticalin的其他信息可以在US 7,250,297和WO 99/16873中找到，它们的全文均并入本文作为参考。
在本公开的上下文中有用的另一种抗体模拟技术是Avimer。Avimer是通过体外外显子改组及噬菌体展示从人类细胞外受体结构域的大家族中演化而来，产生具有结合及抑制特性的多结构域蛋白。已显示连接多种独立的结合结构域产生亲合力，并且与常规的单一表位结合蛋白相比，该结合结构域产生了经改善的亲和力及特异性。其他潜在的优点包括在大肠杆菌中简单并有效地产生多靶标特异性的分子，经改善的热稳定性以及对蛋白酶的抵抗力。已经得到了针对多种靶标的具有亚纳摩尔亲和力的Avimer。关于Avimer的其他信息可在US2006/0286603、2006/0234299、2006/0223114、2006/0177831、2006/0008844、2005/0221384、2005/0164301、2005/0089932、2005/0053973、2005/0048512、2004/0175756中找到，其全部内容均并入本文作为参考。
Versabody是另一种可用于本公开上下文的抗体模拟技术。Versabody是具有大于15％的半胱氨酸的小分子蛋白质(3至5kDa)，它形成高二硫化物密度支架，替换典型蛋白具有的疏水核。这种替换使得蛋白质更小，更亲水(聚集及非特异性结合更小)，对于蛋白酶及热具有更大的抵抗力，并且具有较低密度的T细胞表位，因为对MHC呈递的贡献最多的残基是疏水性的。这些特性中的全部四种都公知会影响免疫原性，并且预期它们一起会大幅度降低免疫原性。
鉴于Versabody的结构，这些抗体模拟物提供了多样的形式，包括多价、多特异性、多样化的半衰期机制、组织靶定模块及抗体Fc区域的缺失。此外，可以在大肠杆菌中以高产率生产Versabody，并且由于它们的亲水性和尺寸小，Versabody高度可溶，而且能够被配制成高浓度。Versabody具有特别的热稳定性，并且具有延长的保质期。有关Versabody的另外的信息发现在US 2007/0191272中，其通过引用全部并入本文。
抗体片段和模拟技术的上述描述意图不是包括全部。多种另外的技术可以用于本发明中，包括基于选择性多肽的技术，如在Qui等，NatureBiotechnology，25(8)921-929(2007)中所综述的互补决定区融合，以及基于核酸的技术，如RNA适体技术，其描述在US 5,789,157；5,864,026；5,712,375；5,763,566；6,013,443；6,376,474；6,613,526；6,114,120；6,261,774；和6,387,620中；所有这些通过引用并入本文。
抗体物理性质
本公开抗体可以由其各种物理性质表征，以检测和/或区别其不同的种类。
本公开抗体可以在轻链或重链可变区中包含一个或更多个糖基化位点。由于改变的抗原结合，这些糖基化位点可导致抗体免疫原性增加或抗体pK改变(Marshall等(1972)Annu Rev Biochem 41：673-702；Gala和Morrison(2004)J Immunol 172：5489-94；Wallick等(1988)J Exp Med168：1099-109；Spiro(2002)Glycobiology 12：43R-56R；Parekh等(1985)Nature 316：452-7；Mimura等(2000)Mol Immunol 37：697-706)。糖基化已知发生在包含N-X-S/T序列的基序处。在一些情况下，优选具有不包含可变区糖基化的抗间皮素抗体。这可以通过选择可变区不包含糖基化基序的抗体或使糖基化区中的残基突变来实现。
在优选的实施方案中，本公开抗体不包含天冬酰胺异构位点。天冬酰胺脱酰胺可以发生在N-G或D-G序列上并且导致异天冬氨酸残基产生，所述异天冬氨酸残基将扭结位点引入到多肽链中并且降低其稳定性(异天冬氨酸效应)。
每种抗体具有独特的等电点(pI)，其一般落入6和9.5之间的pH范围内。IgG1抗体的pI通常落入7-9.5的pH范围内以及IgG4抗体的pI通常落入6-8的pH范围内。推测具有正常范围外pI的抗体在体内条件下可能具有一些去折叠和不稳定性。因此，优选包含落在正常范围内的pI值的抗间皮素抗体。这可以通过选择具有正常范围内pI的抗体或使带电的表面残基突变来实现。
每种抗体将具有特征熔解温度，其中熔解温度越高表明体内整体稳定性越高(Krishnamurthy R和Manning MC(2002)Curr Pharm Biotechnol3：361-71)。一般，优选TM1(最初去折叠温度)高于60℃，优选高于65℃，甚至更优选高于70℃。抗体的熔点可以使用差示扫描量热法(Chen等(2003)Pharm Res 20：1952-60；Ghirlando等(1999)Immunol Lett 68：47-52)或圆二色性(Murray等(2002)J.Chromatogr Sci 40：343-9)来测量。
在优选的实施方案中，选择不快速降解的抗体。抗体的降解可以使用毛细管电泳(CE)和MALDI-MS(Alexander AJ and Hughes DE(1995)AnalChem 67：3626-32)来测量。
在另一个优选的实施方案中，选择具有最小聚集效应的抗体，所述聚集效应可以导致引发不必要的免疫反应和/或改变的或不利的药物代谢动力学性质。一般地，这样的抗体是可接受的，其具有的聚集为25％或更小、优选20％或更小、甚至更优选15％或更小、甚至更优选10％或更小以及甚至更优选5％或更小。聚集可以通过几种技术来测量，包括大小排阻柱(SEC)、高效液相层析(HPLC)和光散射。
改造抗体的方法
如上所论述，具有已知VH和VL序列的抗间皮素抗体可以用于产生新的抗间皮素抗体，其通过修饰它们或连接到它们的恒定区(一个或多个)进行。因此，在本公开的另一个方面中，已知的抗间皮素抗体例如，3C10、6A4或7B1的结构特征被用于产生结构上相关的抗间皮素抗体，其保留本公开抗体的至少一种功能性质，如结合人间皮素。例如，已知的抗间皮素抗体或其突变的一个或更多个CDR区可以与已知的构架区和/或其它CDR重组组合，以产生另外的、重组改造的本公开抗间皮素抗体，如上所论述。修饰的其它类型包括先前部分中描述的那些。改造方法的起始物质是本文提供的一个或更多个VH和/或VL序列，或其一个或更多个CDR区。为产生改造的抗体，不必要实际制备(即，表达为蛋白质)具有本文提供的一个或更多个VH和/或VL序列或其一个或更多个CDR区的抗体。而是，包含在序列(一个或多个)中的信息被用作起始物质来产生源自原始序列(一个或多个)的“第二代”序列(一个或多个)，然后“第二代”序列(一个或多个)作为蛋白质而制备和表达。
因此，在另一个实施方案中，本公开提供制备抗间皮素抗体的方法，其包括：
(a)提供：(i)VH抗体序列，其包含选自SEQ ID NO：1-3的CDR1序列、选自SEQ ID NO：4-6的CDR2序列和/或选自SEQ ID NO：7-9的CDR3序列；和/或(ii)VL抗体序列，其包含选自SEQ ID NO：10-12的CDR1序列、选自SEQ ID NO：13-15的CDR2序列和/或选自SEQ ID NO：16-18的CDR3序列；
(b)改变VL抗体序列和/或VL抗体序列中至少一个氨基酸残基，以产生至少一种改变的抗体序列；以及
(c)将改变的抗体序列表达为蛋白质。
标准分子生物学技术可以用于制备和表达改变的抗体序列。
在某些实施方案中，可以沿全部或部分抗间皮素抗体编码序列随机或选择性地引入突变并且可以针对结合活性和/或本文描述的其它功能性质对所形成的修饰的抗间皮素抗体进行筛选。突变方法已经描述在本领域中。例如，Short的WO 02/092780描述了使用饱和诱变、合成性连接装配或其组合来产生和筛选抗体突变的方法。备选地，Lazar等的WO 03/074679描述了使用计算筛选方法来优化抗体理化性质的方法。
编码本发明抗体的核酸分子
本公开的另一个方面涉及对本公开的抗体进行编码的核酸分子。这些核酸可以存在于整个细胞中、细胞裂解液中、或者以部分纯化或基本上纯的形式存在。当通过标准技术(包括碱/SDS处理，CsCl成带、柱层析、琼脂糖凝胶电泳以及本领域的其他熟知技术)从其他细胞成分或其他杂质(如其他细胞核酸或蛋白质)中纯化出核酸时，该核酸是“分离的”或“使之基本上是纯的”。参见F.Ausubel et al.(1987)Current Protocols inMolecular Biology，Greene Publishing and Wiley Interscience，New York。本公开的核酸可以是，例如DNA或RNA，并且可以含有或不含有内含子序列。在优选的实施方案中，核酸为cDNA分子。
使用标准的分子生物学技术可以获得本公开的核酸。对于杂交瘤表达的抗体(例如，从以下进一步说明的携带人类免疫球蛋白基因的转基因小鼠制备的杂交瘤)而言，通过标准的PCR扩增或cDNA克隆技术可以获得编码杂交瘤产生的抗体的轻链和重链的cDNA。对于从免疫球蛋白基因文库中获得的抗体(例如使用噬菌体展示技术)而言，可以从该文库回收编码该抗体的核酸。
优选的核酸分子是编码3C10、6A4或7B1单克隆抗体VH和VL序列的核酸分子。编码3C10、6A4和7B1的VH序列的DNA序列分别显示在SEQ ID NO：25-27中。编码3C10、6A4和7B1的VL序列的DNA序列分别显示在SEQ ID NO：28-30中。
一旦获得了编码VH和VL区段的DNA片段，则通过标准的重组DNA技术可以进一步操作这些DNA片段，例如将可变区基因转变成全长抗体链基因、Fab片段基因或scFv基因。在这些操作中，编码VL或VH的DNA片段被有效连接至编码另一种蛋白质(例如抗体恒定区或柔性接头)的另一条DNA片段。在此使用的术语“有效连接”意指连接两条DNA片段，使得它们编码的氨基酸序列保留在读框内。
通过将编码VH的DNA有效连接至编码重链恒定区(CH1、CH2及CH3)的DNA分子，可以将编码VH区的分离的DNA转化成全长重链基因。人类重链恒定区基因的序列在本领域中是已知的(参见Kabat‘242)，并且包含这些区域的DNA片段可以通过标准PCR扩增来获得。该重链恒定区可以是IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区，但最优选是IgGl或IgG4恒定区。对于Fab片段重链基因而言，可以将编码VH的DNA有效连接至仅对重链CH1恒定区进行编码的DNA分子。
通过将编码VL的DNA有效连接至另一个编码轻链恒定区CL的DNA分子上，可以将编码VL区的分离的DNA转化成全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。人类轻链恒定区基因序列在本领域中是已知的(参见例如Kabat，E.A.，el al.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，Fifth Edition，U.S.Department of Health and Human Services，NIHPublication No.91-3242)，并且通过标准PCR扩增可以获得包含这些区的DNA片段。在优选的实施方案中，该轻链恒定区可以为κ或λ恒定区。
为了产生scFv基因，将编码VH和VL的DNA片段有效连接至编码柔性接头的另一条片段，例如编码氨基酸序列(Gly4-Ser)3，使得VL和VH序列可表达为连续的单链蛋白，其中VH和VL区域通过柔性接头连接(参见，例如Bird et al.(1988)Science 242：423-426；Huston et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883；McCafferty et al.，(1990)Nature348：552-554)。
本公开单克隆抗体的产生
可以通过多种技术产生本公开的单克隆抗体(mAb)，该技术包括Kohler and Milstein(1975)Nature 256：495的标准体细胞杂交技术。虽然优选体细胞杂交步骤，但是原则上可以采用其他技术，例如B淋巴细胞的病毒性转化或致癌性转化。
用于制备杂交瘤的优选的动物系统是鼠类系统。在小鼠中产生杂交瘤是充分确立的程序。用于分离被免疫的脾细胞以进行融合的免疫方案和技术在本领域中是已知的。融合配偶体(例如鼠骨髓瘤细胞)和融合程序也是已知的。
基于如上所述制备的非人单克隆抗体的序列，可以制备本公开的嵌合抗体或人源化抗体。从目的非人杂交瘤可以获得对重链和轻链免疫球蛋白进行编码的DNA，并且使用标准的分子生物学技术进行工程化，以包含非鼠(例如人)免疫球蛋白序列。例如，为生成嵌合抗体，使用本领域中已知的方法可以将鼠类可变区与人类恒定区连接(参见例如Cabilly等人的美国专利号4,816,567)。为了产生人源化抗体，使用本领域已知的方法可以将鼠类CDR区插入人类构架区(参见例如Winter的美国专利号5,225,539及Queen等人的美国专利号5,530,101；5,585,089；5,693,762以及6,180,370)。
优选地，抗体是人类单克隆抗体。使用携带部分人免疫系统而不是小鼠系统的转基因小鼠或转染色体小鼠，这些转基因小鼠及转染色体小鼠包括在此分别称为HuMAb及的小鼠，并在此统称为“人类Ig小鼠”。
HuMAb型小鼠(Medarex，Inc.)含有对非重排的人重链(μ及γ)以及κ轻链免疫球蛋白序列进行编码的人类免疫球蛋白基因微基因座，并含有使内源性μ和κ链基因座失活的靶向突变(参见例如Lonberg，et al.(1994)Nature 368(6474)856-859)。因此，这些小鼠表现出小鼠IgM或κ的表达降低，并且响应于免疫应答，被导入的人类重链和轻链转基因经历了类别转换及体细胞突变，以产生高亲和力的人类IgGκ单克隆抗体(Lonberg，N.et al.(1994)，supra；Lonberg，N.(1994)Handbook ofExperimental Pharmacology 113：49-101；Lonberg，N.and Huszar，D.(1995)Intern.Rev.Immunol.13：65-93，以及Harding，F.and Lonberg，N.(1995)Ann.N.Y.Acad.Sci.764：536-546中综述)。HuMAb型小鼠的制备和用途，以及由这种小鼠携带的基因组修饰，进一步记载于Taylor，et al.(1992)Nucleic Acids Research 20：6287-6295；Chen，J.et al.(1993)International Immunology 5：647-656；Tuaillon et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：3720-3724；Choi et al.(1993)Nature Genetics4：117-123；Chen，J.et al.(1993)EMBO J.12：821-830；Tuaillon et al.(1994)J.Immunol.152：2912-2920；Taylor，L.et al.(1994)InternationalImmunology 6：579-591；以及Fishwild，D.et al.(1996)NatureBiotechnology 14：845-851，所有这些文献的内容完整并入本文作为参考。进一步参见，均为Lonberg及Kay的美国专利号5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,789,650；5,877,397；5,661,016；5,814,318；5,874,299；及5,770,429；Surani等人的美国专利号5,545,807；均为Lonberg及Kay的WO 92/03918，WO 93/12227，WO 94/25585，WO 97/13852，WO98/24884及WO 99/45962；以及Korman等人的WO 01/14424。还可以使用携带人类λ轻链基因的转基因小鼠，如Bruggemann的WO 00/26373中说明的那些转基因小鼠。例如，携带人类λ轻链转基因的小鼠可与携带人类重链转基因(如HCo7)并可任选地还携带人类κ轻链转基因(如KCo5)的小鼠进行杂交以产生同时携带人类重链转基因和轻链转基因的小鼠(见，如实施例1)。
在另一个实施方案中，本公开的人抗体可以使用携带转基因和转染色体上人免疫球蛋白序列的小鼠而产生，如携带人重链转基因和人轻链转染色体的小鼠。本文将该小鼠称为具有KM品系或类型并且详细描述在Ishida等的WO 02/43478中。
再者，备选的表达人类免疫球蛋白基因的转基因动物系统在本领域内是可以获得的，并且可以用于生产本公开的抗-间皮素抗体。例如，可以使用被称作Xenomouse(Abgenix，Inc.)的备选转基因系统；这种小鼠记载于，例如Kucherlapat等人的美国专利号5,939,598；6,075,181；6,114,598；6,150,584及6,162,963中。
此外，备选的表达人类免疫球蛋白基因的转基因动物系统在本领域内是可以获得的，并且可以用于生产本公开的抗-间皮素抗体。例如，可以使用被称作“TC小鼠”的小鼠，该小鼠同时携带人类重链转染色体和人类轻链转染色体；这种小鼠记载于Tomizuka et al.(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：722-727中。此外，在本领域中已经说明了携带人类重链转染色体和人类轻链转染色体的奶牛(例如，Kuroiwa et al.(2002)NatureBiotechnology 20：889-894和WO 2002/092812)。
本公开的人单克隆抗体也可以使用用于筛选人免疫球蛋白基因文库的噬菌体展示方法来制备。参见例如：Ladner等的US 5,223,409；5,403,484；和5,571,698；Dower等的US 5,427,908和5,580,717；McCafferty等的US5,969,108和6,172,197；以及Griffiths等的US 5,885,793；6,521,404；6,544,731；6,555,313；6,582,915和6,593,081。
使用SCID小鼠也可以制备本公开的人类单克隆抗体，其中人类免疫细胞已被重建入SCID小鼠，使得免疫时可产生人抗体反应。这种小鼠记载于Wilson等人的美国专利号5,476,996及5,698,767中。
在另一个实施方案中，可以使用如Buechler等的美国专利号6,794,132中说明的人类Ig小鼠以及噬菌体展示技术的组合来制备人类抗间皮素抗体。更确切地说，该方法首先涉及通过用一种或多种间皮素抗原对人类Ig小鼠(如HuMab或KM品系的那些)进行免疫，在这些小鼠中形成抗间皮素抗体反应，随后从该小鼠的淋巴细胞中分离编码人抗体链的核酸，并将这些核酸导入展示载体(例如噬菌体)中以提供展示包装体(display package)文库。由此，每个文库成员包含编码一种人抗体链的核酸，并且每种抗体链通过展示包装体被展示出来。然后用间皮素蛋白筛选该文库以分离出与间皮素特异性结合的文库成员。然后将所选文库成员中的核酸插入片段进行分离并通过标准方法测序以确定所选间皮素结合子的轻链和重链可变序列。通过标准的重组DNA技术可以将可变区转化成全长抗体链，这些技术例如，将可变区克隆进入携带人类重链及轻链恒定区的表达载体，使得VH区被可操作地连接至CH区，并且VL区被可操作地连接至CL区。
人Ig小鼠的免疫
当人类Ig小鼠用于产生本公开的人抗体时，用间皮素抗原和/或重组间皮素、或表达间皮素蛋白的细胞、或间皮素融合蛋白的经纯化或者富集的制品，可以对此类小鼠进行免疫，如Lonberg，N等(1994)Nature368(6474)：856-859；Fishwild，D等(1996)Nature Biotechn.14：845-851；以及WO 98/24884和WO 01/14424所述。。优选地，这些小鼠在初次输注时是6至16周龄。例如，用间皮素抗原的经纯化的或重组的制备物(5至50μg)经腹膜内和/或皮下可对人Ig小鼠进行免疫。最优选地，用于生产本公开的抗体的免疫原是间皮素融合蛋白，该融合蛋白包括间皮素蛋白的细胞外结构域，在其N-末端与非间皮素的多肽(例如His标签)相融合(见例如实施例1)。
在实施例1中说明了用于产生结合人类间皮素的全长人类单克隆抗体的详细操作。关于不同抗原的积累的经验已显示，在以下条件下HuMAbMouse型转基因小鼠会应答：当用完全弗氏佐剂中的抗原经腹膜内(IP)进行初始免疫，随后每隔一周用不完全弗氏佐剂中的抗原进行IP免疫(达到共6次)。然而，发现除弗氏佐剂之外的其他佐剂也是有效的(例如RIBI佐剂)。另外，也发现在没有佐剂的情况下整个细胞具有高度的免疫原性。在免疫过程中可以用眶后取血得到的血浆样品监测免疫应答。通过ELISA可以筛选该血浆，并且具有足够滴度的抗-间皮素人类免疫球蛋白的小鼠可用于融合。例如可以在处死并取出脾脏前的3天，通过静脉内对小鼠用抗原加强。预期对每个免疫可能需要进行2至3次融合。每种抗原通常对6至24只小鼠进行免疫。通常使用HCo7与HCo12品种。另外，HCo7与HCo12两个转基因均可以被共同培育成单一小鼠，该小鼠具有两种不同的人类重链转基因(HCo7/HCo12)。备选地或额外地，可以使用KM品系。
产生本发明人单克隆抗体的杂交瘤的产生
为了生成产生本公开的人单克隆抗体的杂交瘤，从被免疫的小鼠分离脾细胞和/或淋巴结细胞，并且与合适的无限增殖化细胞系(例如小鼠骨髓瘤细胞系)融合。针对抗原特性抗体的产生对得到的杂交瘤进行筛选。例如，通过50％的PEG可以将来自经免疫小鼠的脾淋巴细胞的单细胞悬液与六分之一数量的P3X63-Ag8.653非分泌型小鼠骨髓瘤细胞(ATCC，CRL1580)相融合。备选地，使用电融合方法，使用CytoPulse大腔细胞融合电穿孔仪(large chamber cell fusion electroporator)(CytoPulse Sciences，Inc.，Glen Burnie Maryland)，融合来自经免疫的小鼠脾淋巴细胞的单细胞悬液。将大约2×105个细胞接种于平底微量滴定板上，之后在以下选择性培养基中培育2周：该培养基含有20％胎Clone Serum、18％“653”条件培养基、5％origen(IGEN)、4mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、5mMHEPES、0.055mM的2-巯基乙醇、50单位/ml青霉素、50mg/ml链霉素、50mg/ml庆大霉素以及1X HAT(Sigma；融合后24小时加入HAT)。大约2周后，将细胞培养于以HT替换HAT的培养基中。然后由ELISA针对人类单克隆IgM与IgG抗体这些单个孔进行筛选。一旦出现杂交瘤的扩大生长，通常在10至14天后观察培养基。对分泌抗体的杂交瘤进行再接种、再筛选，并且如果对人类IgG仍是阳性，则通过有限稀释将该单克隆抗体亚克隆至少2次。然后在体外培养稳定的亚克隆以便在组织培养基中产生少量抗体用于表征。
为了纯化人类单克隆抗体，将已选择的杂交瘤培养于2升的旋瓶中用于单克隆抗体纯化。可以对上清液进行过滤并浓缩，之后用A蛋白-琼脂糖(Pharmacia，Piscataway，N.J.)进行亲和层析。通过凝胶电泳及高效液相层析检查被洗脱的IgG级分以确保纯度。将该缓冲液交换为PBS，并且通过OD280使用1.43的消光系数确定其浓度。将单克隆抗体等份，并保存于-80℃。
产生本发明单克隆抗体的转染瘤的产生
使用(例如)本领域中熟知的重组DNA技术及基因转染方法的结合，在宿主细胞转染瘤中也可以产生本公开的抗体(例如Morrison，S.(1985)Science 229：1202)。
例如，为了表达抗体，或它们的抗体片段，可以通过标准的分子生物学技术(例如，使用表达目的抗体的杂交瘤的PCR扩增或cDNA克隆)获得对部分或全长轻链和重链进行编码的DNA，并且可以将这些DNA插入至表达载体中，使得这些基因被有效连接至转录和翻译控制序列。在本文中，术语“有效连接”意指将抗体基因连接进入载体，使得载体中转录和翻译控制序列起到其调节抗体基因的转录和翻译的预期功能。对表达载体及表达控制序列进行选择以便与所使用的表达宿主细胞相容。可以将该抗体轻链基因与该抗体重链基因插入至单独的载体中，或者更典型地是将两个基因均插入至相同的表达载体中。通过标准的方法(例如，连接抗体基因片段和载体上的互补限制位点，或者如果不存在限制位点则进行平端连接)将这些抗体基因插入至该表达载体中。可以通过以下方法将本文所述的该抗体的轻链和重链可变区用于生产任何抗体同种型的全长抗体基因：将轻链和重链可变区插入至已经对希望的同种型的重链恒定区和轻链恒定区进行编码的表达载体中，使得VH区段有效连接至载体中的CH区段，并且将VK区段有效连接至载体中的CL区段。另外地或备选地，重组的表达载体可以编码一种信号肽，该信号肽有助于从宿主细胞中分泌抗体链。可以将抗体链基因克隆进入该载体，使得该信号肽符合读框地被连接至该抗体链基因的氨基末端。该信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或者是异源的信号肽(即，来自非免疫球蛋白的信号肽)。
本公开的重组表达载体除了抗体链基因之外，还携带在宿主细胞中调控抗体链基因表达的调节序列。术语“调节序列”意指包括启动子、增强子以及控制抗体链基因的转录或翻译的其他表达控制元件(例如，多聚腺苷酸化信号)。这种调控序列被描述于，例如Goeddel(Gene ExpressionTechnology.Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，CA(1990))中。本领域技术人员将会了解，表达载体的设计，包括调节序列的选择，可以依赖于以下因素，如待转化的宿主细胞的选择、希望的蛋白质的表达水平等。用于哺乳动物宿主细胞表达的优选调节序列包括指导蛋白质在哺乳动物细胞中高水平表达的病毒元件，例如来自巨细胞病毒(CMV)、猿猴病毒40(SV40)、腺病毒(例如，腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))及多瘤病毒的那些。备选地，可以使用非病毒调节序列，例如泛蛋白启动子或β-珠蛋白启动子。再者，可使用由来自不同来源的序列组成的调节元件，例如SRα启动子系统，它包含来自SV40早期启动子及人类T细胞白血病病毒I型的长末端重复序列(Takebe，Y.et al.(1988)Mol.Cell.Biol.8：466-472)。
本公开的重组表达载体除了携带抗体链基因和调节序列之外，还可以携带另外的序列，例如在宿主细胞中调节载体复制的序列(例如，复制起点)及可选择的标记基因。该可选择的标记基因有利于对其中已导入载体的宿主细胞的选择(参见例如，均为Axel等人的美国专利号4,399,216、4,634,665及5,179,017)。例如，典型地可选择的标记基因赋予已导入载体的宿主细胞对，例如G418、潮霉素或甲氨喋呤的药物抗性。优选的可选择的标记基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(在dhfr-宿主细胞中用于甲氨喋呤选择/扩增)以及neo基因(用于G418选择)。
为了轻链及重链的表达，将编码这些重链与轻链的一个或多个表达载体转染进入宿主细胞中。术语“转染”的不同形式旨在涵盖范围宽广的多种技术，这些技术一般用于将外源DNA导入原核的或真核的宿主细胞，例如电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染等等。虽然在理论上可以无论在原核宿主细胞或在真核宿主细胞中均表达本公开的抗体，但是在真核细胞中抗体的表达，并且最优选在哺乳动物宿主细胞中的表达是最优选的，因为它们比原核细胞更有可能组装并分泌正确折叠并且具有免疫活性的抗体。
用于表达本公开的重组抗体的优选的哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)(包括dhfr-CHO细胞，说明于Urlaub和Chasin，(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216-4220，使用DHFR选择标记，例如R.J.Kaufman and P.A.Sharp(1982)J.Mol.Biol.159：601-621中所说明)、NSO骨髓瘤细胞、COS细胞及SP2细胞。特别是，对于使用NSO骨髓瘤细胞而言，另一种优选的表达系统是在(Wilson的)WO 87/04462、(Bebbington的)WO 89/01036、以及(Bebbington的)EP 338,841中披露的GS基因表达系统。在编码抗体基因的重组表达载体基因被引入哺乳动物宿主细胞时，通过对宿主细胞培养一段时间可以产生抗体，所述时间足够使该抗体在该宿主细胞中得到表达，或者更优选地使该抗体分泌进入生长宿主细胞的培养基。使用标准的蛋白纯化方法可以从培养基中回收抗体。
结合抗原的抗体的表征
通过例如标准ELISA可以对本发明抗体结合人间皮素进行测试。简言之，用在PBS中的1μg/mL纯化和/或重组的间皮素蛋白(参见，例如，实施例1)包被微量滴定板，然后用在PBS中的5％牛血清白蛋白封闭。将抗体稀释液(例如，来自间皮素免疫小鼠的血浆稀释液)添加到每个孔中并且在37℃下温育1-2小时。用PBS/吐温冲洗该板，并接着与缀合至碱性磷酸酶的第二试剂(例如，对于人抗体而言，一种山羊-抗人类IgG Fc特异性的多克隆试剂)在37℃孵育1小时。冲洗后，用pNPP底物(1mg/ml)对该板进行显影，并在OD 405至650下进行分析。优选地，形成最高效价的小鼠将用于融合。
以上说明的ELISA测定还可用于筛选与间皮素蛋白免疫原显示阳性反应的杂交瘤。对以高亲合力和/或亲和力结合间皮素的杂交瘤进行亚克隆并且进一步表征。可以从每个杂交瘤(通过ELISA)选择保持亲本细胞反应性的一个克隆，用于制备5至10小瓶细胞库，保存于-140℃，并用于抗体纯化。
为了纯化抗间皮素抗体，将已选择的杂交瘤生长于两升的组织培养瓶或旋瓶中用于单克隆抗体纯化。将上清液进行过滤并浓缩，之后用A蛋白-琼脂糖(Pharmacia，Piscataway，N.J.)进行亲和层析。通过凝胶电泳及高效液相层析可以检查被洗脱的IgG级分以确保纯度。将该缓冲液交换到PBS中，并且通过OD280使用1.43消光系数确定其浓度。将单克隆抗体等分，并保存于-80℃。
为了确定已选择的抗-间皮素单克隆抗体是否结合至独特的表位，使用可商购的试剂(Pierce，Rockford，IL)可以对每种抗体进行生物素化。使用未标记的单克隆抗体及生物素化的单克隆抗体的竞争性研究可以用以上描述的经间皮素蛋白包被的ELISA板进行。使用链霉抗生物素蛋白-抗生物素蛋白-碱性磷酸酶探针可以检测生物素化的mAb结合。
为了确定纯化的抗体的同种型，可以使用对特定同种型特异的试剂进行同种型ELISA。例如，为了确定人类单克隆抗体的同种型，可以用1μg/ml的抗-人类免疫球蛋白抗体在4℃下过夜对微量滴定板的孔进行包被。用1％BSA封闭后，该板与1μg/ml或更低的测试单克隆抗体或者经纯化的同种型对照在环境温度下反应1至2小时。随后将这些孔与人类IgG1或人类IgM-特异的碱性磷酸酶缀合的探针进行反应。如以上所述对板进行显影并分析。
通过蛋白质印迹法可以测试抗间皮素人类IgG与间皮素抗原的反应性。简言之，制备间皮素抗原并对其进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳。将被分开的抗原转移至硝酸纤维素膜上，用10％胎牛血清封闭，并用待测试的单克隆抗体进行探测。使用抗人类IgG碱性磷酸酶检测人类IgG结合并用BCIP/NBT底物片进行显影(Sigma Chem.Co.，St.Louis，Mo.)。
还可以通过监测该抗体与表达间皮素蛋白的细胞的结合(例如通过流式细胞术)，来确定本公开的抗体的结合特异性。可以使用天然表达间皮素蛋白的细胞或细胞系例如OVCAR3、NCI-H226、CFPAC-1或KB细胞，或者可以用编码间皮素的表达载体转染细胞系(例如CHO细胞系)，使得间皮素在这些细胞的表面上表达。该经转染的蛋白可包含标签，如myc-标签或his-标签，优选地位于N-末端，使用针对该标签的抗体进行检测。本公开的抗体与间皮素蛋白的结合可以通过将该经转染的细胞与该抗体孵育，并且检测所结合的抗体进行确定。可将抗体与经转染蛋白上的标签的结合用作阳性对照。
双特异性分子
在另一个方面中，本公开的特征是包含本公开的抗间皮素抗体或其片段的双特异性分子，所述抗体或其片段连接到另一种功能分子，例如，另一种肽或蛋白质如另一种抗体、结合模拟物或受体的配体，所述双特异性分子结合至少两种不同的结合位点或靶分子。本公开的抗体实际上可以连接到一种以上其它功能分子，以产生结合两种以上不同结合位点和/或靶分子的多特异性分子。这些多特异性分子也意图被本文所用的术语“双特异性分子”所包括。连接可以是化学偶联、基因融合、非共价连接或其它方式。
因此，本公开还包括双特异性分子，该双特异性分子含有针对间皮素的至少一种第一结合特异性以及针对第二靶表位的第二结合特异性。在本公开的一个具体实施方案中，该第二靶表位是Fc受体，例如人类FcγRI(CD64)或人类Fcα受体(CD89)。因为，本公开包括的双特异性分子既能够结合表达FcγR或FcαR受体的效应细胞(例如单核细胞、巨噬细胞或多形核细胞(PMN))，又能够结合表达间皮素蛋白的靶细胞。这些双特异性分子将表达间皮素的细胞靶向效应细胞，并触发Fc受体介导的效应细胞活性，例如，表达间皮素的细胞的吞噬作用、ADCC、细胞因子的释放、或超氧化物阴离子的生成。
当双特异性分子是多特异性时，该分子除了包括抗-Fc结合特异性及抗-间皮素结合特异性之外，还能进一步包括第三种结合特异性。在一个实施方案中，第三结合特异性是抗增强因子(EF)部分，例如，结合至涉及细胞毒素活性的表面蛋白上并由此增强针对靶细胞的免疫应答的分子。“抗增强因子部分”可以是结合至给定分子(例如抗原或受体)的抗体、功能抗体片段、或配体，并且由此增强Fc受体或靶细胞抗原的结合决定簇的效果。“抗增强因子部分”可以结合Fc受体或靶细胞抗原。备选地，抗增强因子部分可以结合实体，该实体不同于第一及第二结合特异性结合的实体。例如，抗增强因子部分可结合细胞毒性T细胞(例如，经CD2、CD3、CD8、CD28、CD4、CD40、ICAM-1、或其他免疫细胞，导致针对该靶细胞的免疫应答的增强)。
在一个实施方案中，本公开的双特异性分子包含作为一种结合特异性的至少一种抗体、或该抗体的抗体片段，包括，Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、Fd、dAb或单链Fv。该抗体还可以是轻链或重链二聚物，或是其任何最小片段，例如Fv或单链构建体，如在Ladner等人的美国专利号4,946,778所述，其内容明确地并入本文作为参考。
在一个实施方案中，Fcγ受体的结合特异性由单克隆抗体提供，其结合并未被人类免疫球蛋白G(IgG)所阻断。在此所使用的术语“IgG受体”指位于染色体1上的8个γ链基因的任何基因。这些基因总共编码12种跨膜或可溶性受体同种型，它们被分为三类Fcγ受体：FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)、以及FcγRIII(CD16)。在一个优选的实施方案中，Fcγ受体是人类高亲合性FcγRI。人类FcγRI是一种72kDa的分子，它对单体IgG具有高亲合性(108至109M-1)。
在Fanger等人的WO 88/00052及美国专利号4,954,617中描述了某些优选的抗-Fcγ单克隆抗体的制备及表征，其中传授的内容都通过引用全部结合在此。这些抗体结合至FcγI、FcγII及FcγIII的表位上不同于受体的Fcγ结合位点的位点，并因此它们的结合基本上不会被IgG的生理水平所阻断。在本公开有用的特异性抗-FcγRI抗体是mAb 22、mAb 32、mAb 44、mAb 62及mAb 197。产生mAb 32的杂交瘤可以从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得，ATCC保藏号HB9469。在其他实施方案中，抗-Fcγ受体抗体是一种单克隆抗体22(H22)的人源化形式。H22抗体的制备及表征说明于Graziano，R.F.et al.J.(1995)Immunol 155(10)：4996-5002，及Tempest等人的WO 94/10332中。产生H22抗体的细胞系保藏于美国典型培养物保藏中心，被命名为HA022CL1，保藏号为CRL 11177。
在另外的优选实施方案中，对于Fc受体的结合特异性由结合至人类IgA受体的抗体提供，所述人类IgA受体例如是Fcα受体(FcαRI(CD89))，这种结合优选不会被人类免疫球蛋白A(IgA)所阻断。术语“IgA受体”意在包括位于染色体19上的一个α基因(FcαRI)的基因产物。已知这一基因编码几种55至110kDa的选择性剪接的跨膜同种型。FcαRI(CD89)在单核细胞/巨噬细胞、嗜酸性粒细胞及嗜中性粒细胞中组成型表达，但在非效应细胞类群中不组成型表达。FcαRI对于IgA1和IgA2都具有中等的亲合力(≈5×107M-1)，该亲合性在暴露于细胞因子例如G-CSF或GM-CSF时会增加(Morton，H.C.et al.(1996)Critical Reviews in Immunology16：423-440)。已经描述了四种FcαRI特异性的单克隆抗体，被鉴定为A3、A59、A62及A77，它们结合IgA配体结合域外侧的FcαRI(Monteiro，R.C.et al.(1992)J.Immunol.148：1764)。
在本公开的双特异性分子的使用中，FcαRI及FcγRI是优选的触发受体，因为它们：(1)主要表达于免疫效应细胞(例如单核细胞、PMN、巨噬细胞和树突细胞)；(2)表达水平高(例如5,000至100,000/细胞)；(3)是细胞毒性活性(例如ADCC、吞噬作用)的介体；以及(4)介导靶向它们的抗原(包括自身抗原)的增强的抗原呈递。
虽然人类单克隆抗体是优选的，但是可用于本公开的双特异性分子的其他抗体是鼠类抗体、嵌合抗体及人源化单克隆抗体。
使用本领域中已知的方法通过缀合组成性结合的特异性(例如，抗-FcR及抗-间皮素的结合特异性)可以制备本公开的双特异性分子。例如，可以单独地生成双特异性分子中的每一种结合特异性，并接着将它们缀合在一起。当结合特异性是蛋白质或肽时，可以使用多种偶联试剂或交联试剂来进行共价缀合。交联试剂的实例包括蛋白A、碳二亚胺、N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基-硫代乙酸酯(SATA)、5，5’-二硫双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、邻-亚苯基二马来酰亚胺(oPDM)、N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、以及4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-SMCC)(参见例如，Karpovsky et al.(1984)J.Exp.Med.160：1686；Liu，MA et al.(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：8648)。其他方法包括在Paulus(1985)Behring Ins.Mitt.No.78，118-132；Brennanet al.(1985)Science 229：81-83)，以及Glennie et al.(1987)J.Immunol.139：2367-2375)中说明的方法。优选的缀合试剂是SATA及磺基-SMCC，都可从Pierce Chemical Co.(Rockford，IL)公司购得。
当这些结合特异性是抗体时，它们可以通过两个重链之间的C末端铰链区的巯基键合相缀合。在一个特别优选的实施方案中，在缀合之前对铰链区进行修饰，使其含有奇数个巯基残基，优选地含有一个巯基残基。
备选地，两种结合特异性均可以在相同的载体中被编码并在同一宿主细胞中被表达并且组装。当双特异性分子是mAb×mAb、mAb×Fab、Fab×F(ab’)2或配体×Fab融合蛋白时，这一方法特别有用。本公开的一种双特异性分子可以是含有一个单链抗体及一个结合决定簇的单链分子，或含有两个结合决定簇的单链双特异性分子。双特异性分子可以含有至少两种单链分子。制备双特异性分子的方法说明在例如美国专利号5,260,203；5,455,030；4,881,175；5,132,405；5,091,513；5,476,786；5,013,653；5,258,498；及5,482,858中，将它们都明确并入本文作为参考。
双特异性分子与它们的特异性靶标的结合可以通过下列方法来确认，例如酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、FACS分析、生物测定(例如生长抑制)、或蛋白印迹测定。这些测定中的每一种测定通常都是通过采用对目的复合体特异的标记试剂(例如，抗体)，检测特定目的蛋白-抗体复合体的存在。例如，可以使用例如识别并且特异性结合至抗体-FcR复合体的酶联抗体或抗体片段来检测这些FcR-抗体复合体。备选地，使用多种其他免疫测定中的任何测定可以检测这些复合体。例如，该抗体可被放射性标记，并用于放射免疫测定(RIA)中(参见例如，Weintraub，B.，Principles of Radioimmunoassays，Seventh TrainingCourse on Radioligand Assay Techniques，The Endocrine Society，March，1986，将其并入本文作为参考)。可以使用例如γ计数器或闪烁计数器或通过放射自显影来检测放射性同位素。
连接物
在另一个方面中，提供抗体-配偶体分子连接物，其中配偶体分子通过化学接头(本文有时简称为“接头”)连接到本发明的抗体。配偶体分子可以是治疗剂或标记物。治疗剂可以是，例如，细胞毒素、非细胞毒性药物(例如，免疫抑制剂)、放射活性剂、另一种抗体、或酶。优选的配偶体分子是细胞毒素。标记物可以是产生可检测信号的任何标记，如放射性标记、荧光标记或催化底物的可检测修饰的酶。抗体充当靶向功能：通过结合在其中发现它的抗原的靶组织或细胞，抗体将连接物引向该靶组织或细胞。在那里，接头被切割，释放配偶体分子以行使其期望的生物功能。在一些情况下，连接物被内化在靶细胞中并且在其中发生切割。
接头
在一些实施方案中，接头是肽基接头，本文将其描述为(L4)p-F-(L1)m。其它接头包括肼和二硫化物接头，本文将它们分别描述为(L4)p-H-(L1)m和(L4)p-J-(L1)m。F、H和J分别是肽基、肼和二硫化物部分，它们是可切割的，以从抗体释放配偶体分子，而L1和L4是连接基团。F、H、J、L1和L4以及下标p和m在下文中更充分地进行限定。这些和其它接头的制备和使用描述在WO 2005/112919中，其公开内容通过引用并入本文。
抗体-配偶体连接物中肽基和其它接头的使用描述在US2006/0004081；2006/0024317；2006/0247295；6,989,452；7,087,600；and7,129,261；WO 2007/051081；2007/038658；2007/059404；和2007/089100中；其全部通过引用而并入本文。
另外的接头描述于US 6,214,345；2003/0096743；和2003/0130189；de Groot等，J.Med.Chem.42，5277(1999)；de Groot等J.Org.Chem.43，3093(2000)；de Groot等，J.Med.Chem.66，8815，(2001)；WO02/083180；Carl等，J.Med.Chem.Lett.24，479，(1981)；Dubowchik等，Bioorg & Med.Chem.Lett.8，3347(1998)，其公开内容通过引用而并入本文。
除连接抗体和配偶体分子外，接头可以赋予配偶体分子稳定性、减少其体内毒性或另外有利地影响其药物代谢动力学、生物利用度和/或药物动力学。通常优选的是，一旦连接物输送至其作用位点，接头被切割，释放配偶体分子。也优选地，接头是无痕迹的，以便一旦从配偶体分子除去(如在激活期间)，不残留接头存在的痕迹。
在另一个实施方案中，接头的特征在于其在靶细胞中或附近位点被切割的能力，如在配偶体分子的治疗作用或标记物活性的位点。这种切割在性质上可以是酶促的。该特征有助于减少配偶体分子系统性激活、降低毒性和系统性副作用。酶促切割的优选可切割基团包括肽键、酯键和二硫键，如上述F、H和J部分。在其它实施方案中，接头对pH敏感，并且通过pH改变而被切割。
一个重要方面是控制接头切割速度的能力。通常期望切割快的接头。然而，在一些实施方案中，可以优选切割更慢的接头。例如，在持续释放剂型或在具有快速释放和慢速释放组分的剂型中，提供更慢切割的接头是有用的。上述WO 2005/112919公开了肼接头，其可以设计来以非常快至非常慢的速度范围进行切割。
接头也可以用来稳定配偶体分子而在连接物循环时不降解，即在其到达靶组织或细胞之前不降解。该特征提供明显的益处，因为其延长配偶体分子的循环半衰期。接头也用来削弱配偶体分子活性，以便连接物在循环时相对温和，但在期望作用位点处激活后配偶体分子具有期望的效应——例如细胞毒性。对于治疗剂连接物，接头的该特征用来改善药剂的治疗指数。
分别除可切割肽、肼或二硫基F、H或J外，一个或更多个连接基团L1被任选引入于配偶体分子和F、H或J(视情况而定)之间。这些连接基团L1也可以描述为间隔基团并且含有至少两个官能团。根据下标m(即，L1基团存在数)的值和具体基团L1的位置，基团L1的化学官能度可以结合到配偶体分子的化学官能度、F、H或J(视情况而定)的化学官能度或另一个连接基团L1(如果存在一个以上L1)的化学官能度。间隔基团L1的合适化学官能度的实例包括羟基、巯基、羰基、羧基、氨基、酮基团、醛基团和巯基基团。
接头L1可以是取代或未取代烷基、取代或未取代芳基、取代或未取代杂芳基或者取代或未取代杂烷基。在一个实施方案中，烷基或芳基可以包含1至20个碳原子。它们也可以包含聚乙二醇部分。
示例性基团L1包括，例如6-氨基己醇、6-巯基己醇、10-羟基癸酸、甘氨酸和其它氨基酸、1，6-己二醇、β-丙氨酸、2-氨基乙醇、半胱胺(2-氨基乙硫醇)、5-氨基戊酸、6-氨基己酸、3-马来酰亚胺基苯甲酸、2-苯并呋喃酮、α-取代的2-苯并呋喃酮、羰基、缩醛胺酯、核酸、肽等。
基团L1的一个功能是提供F、H或J(视情况而定)与配偶体分子之间的空间分隔，以免后者干扰(例如，经由空间或电子效应)在F、H或J处的切割化学。基团L1也可以用来将另外的分子团和化学官能度引入到连接物中。一般地，另外的分子团和化学官能度影响连接物的血清半衰期和其它性质。因而，通过仔细选择间隔基团，可以产生具有一定范围血清半衰期的连接物。任选地，一个或更多个接头L1可以是下文描述的自消基团。
下标m选自0、1、2、3、4、5和6的整数。当多个L1基团存在时，它们可以相同或不同。
L4是提供F、H或J(视情况而定)和抗体之间空间分隔的接头部分，以免F、H或J干扰抗体结合抗原或抗体干扰在F、H或J处的切割化学。优选地，L4赋予连接物以增加的溶解性或减少的聚集性，其利用包含该部分或修饰连接物水解速率的接头进行。像L1那样，L4任选是自消基团。在一个实施方案中，L4部分是取代的烷基、未取代的烷基、取代的芳基、未取代的芳基、取代的杂烷基、或未取代的杂烷基，这些基团中的任一种可以是直链、支链、或环状的。这些取代基可以是例如低级(C1-C6)烷基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、或者二烷基氨基。在一些实施方案中，L4包括非环状部分。在另一个实施方案中，L4包括带正电或负电的氨基酸聚合物，如聚赖氨酸或聚精氨酸。L4可包括诸如聚乙二醇部分的聚合物。另外，L4接头可以包括，例如多聚体成分以及小分子部分。
在一个优选的实施方案中，L4包括聚乙二醇(PEG)部分。L4的PEG部分可以是长度为1到50个单元。优选地，PEG将具有1到12个重复单元，更优选3到12个重复单元，更优选2到6个重复单元，或甚至更优选3到5个重复单元，并且最优选4个重复单元。L4可仅仅由PEG部分组成，或也可包括其他的取代或未取代的烷基或杂烷基。将PEG作为L4部分的一部分进行组合可以用于提高复合体的水溶性。另外，该PEG部分在药物与抗体缀合时降低了聚集度。
下标p是0或1；即，L4的存在是任选的。在存在的情况下，L4具有至少两种官能团，一种官能团结合F、H或J(视情况而定)中的化学官能度，另一个官能团结合抗体。基团L4的合适化学官能度的实例包括羟基、巯基、羰基、羧基、氨基、酮基团、醛基团和巯基基团。因为抗体通常经由硫氢基(例如，来自未氧化的半胱氨酸残基、将含有硫氢基的延伸用亚氨基硫烷添加至赖氨酸残基或将二硫化物桥还原)、氨基(例如，来自赖氨酸残基)、醛基(例如，来自糖苷侧链的氧化)或羟基(例如，来自丝氨酸残基)连接，所以用于附着抗体的优选化学官能团是与上述基团起反应的那些基团，实例为马来酰亚胺、硫氢基、醛、肼、氨基脲和羧基。抗体上硫氢基和L4上马来酰亚胺基团的组合是优选的。
在一些实施方案中，L4包含
其直接附着于(AA1)c的N末端。R20是选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、以及酰基的成员。R25、R25’、R26、以及R26’各自独立地选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、以及取代或未取代的杂环烷基；并且s和t独立地是1至6的整数。优选地，R20、R25、R25’、R26、以及R26’是疏水的。在一些实施方案中，R20是H或烷基(优选未取代的低级烷基)。在一些实施方案中，R25、R25’、R26以及R26’独立地是H或烷基(优选未取代的C1-C4烷基)。在某些实施方案中，R25、R25’、R26、以及R26’均为H。在某些实施方案中，t是1并且s是1或2。
肽接头(F)
如上所述，本发明的肽基接头可以由通式：(L4)p-F-(L1)m来表示，其中F表示包含肽基部分的部分。在一个实施方案中，F部分包含任选的另外的自消接头L2和羰基，其相应于式(a)的连接物：
在该实施方案中，L1、L4、p和m如上所限定。X4是抗体，D是配偶体分子。下标o是0或1，而L2，如果存在，表示自消接头。AA1表示一种或更多种天然氨基酸和/或非天然α-氨基酸；c是1至20的整数。在一些实施方案中，c的范围是2至5或c是2或3。
在式(a)中，AA1在其氨基端直接连接到L4或当L4不存在时直接连接到X4。在一些实施方案中，当L4存在时，L4不包含直接连接到(AA1)c的N-端的羧酰基。
在另一个实施方案中，F部分包含氨基和任选的间隔基团L3，而L1不存在(即，m是0)，其相应于式(b)的连接物：
在该实施方案中，X4、D、L4、AA1、c和p如上所定义。下标o是0或1。L3，如果存在，是包含伯胺或仲胺或羧基官能团的间隔基团，L3的胺与D的侧羧基官能团形成酰胺键，或者L3的羧基与D的侧胺官能团形成酰胺键。
自消接头L2
自消接头L2是双官能化学部分，它能将两个间隔的化学部分共价连接成通常稳定的三节分子，通过酶切割的方法从该三节分子释放所述间隔的化学部分中的一个；在所述酶切割之后，从该分子的其余部分中自发切割而释放所述间隔的化学部分中的另一个。根据本发明，自消间隔基在其一端以共价键与肽部分相连，并在其另一端以共价键与药物部分的化学反应位点相连，药物部分的衍生化会抑制药理学活性，以便间隔并将肽部分与药物部分共价连接成三节分子，该分子在靶标酶不存在的情况下是稳定的，并且无药理活性，但在将间隔基部分与肽部分共价连接的键上可被此类靶标酶进行酶促切割，从而使肽部分从该三节分子中释放。反过来，该酶促切割又能够激活间隔基部分的自消性质，且引发共价连接间隔基部分与药物部分的键的自发断裂，从而实现药理学活性形式的药物的释放。参见，例如，Carl等，J.Med.Chem.，24(3)，479-480(1981)；Carl等，WO81/01145(1981)；Toki等，J.Org.Chem.67，1866-1872(2002)；Boyd等，WO2005/112919；和Boyd等，WO 2007/038658，其公开内容通过引用并入本文。
一种特别优选的自消间隔基可以由式(c)表示：
氨基苄基基团的芳环可被一个或多个“K”基团取代。“K”基团是该芳香环上的取代基，它替换了原本连接为部分环结构的四个未取代的碳原子之一的氢。“K”基团可能是单个原子，如卤素，或可能是多原子的基团，如烷基、杂烷基、氨基、硝基、羟基、烷氧基、卤烷基、以及氰基。每一个K独立地选自：取代的烷基、未取代的烷基、取代的杂烷基、未取代的杂烷基、取代的芳基、未取代的芳基、取代的杂芳基、未取代的杂芳基、取代的杂环烷基、未取代的杂环烷基、卤素、NO2、NR21R22、NR21COR22、OCONR21R22、OCOR21、以及OR21，其中R21和R22独立地选自：H、取代的烷基、未取代的烷基、取代的杂烷基、未取代的杂烷基、取代的芳基、未取代的芳基、取代的杂芳基、未取代的杂芳基、取代的杂环烷基、以及未取代的杂环烷基。示例性K取代基包括但不限于F、Cl、Br、I、NO2、OH、OCH3、NHCOCH3、N(CH3)2、NHCOCF3、以及甲基。对于“Ki”，i是0、1、2、3或4的整数。在一个优选的实施方案中，i是0。
以上显示的结构的醚氧原子与羰基相连。从NR24官能度进入芳环的线表示胺功能度可能被键合至5个碳的任何一个，其都形成环并且未被-CH2-O-基团取代。优选地，X的NR24官能度以相对于-CH2-O-的对位与芳环共价结合。R24是选自下组的成员：H、取代的烷基、未取代的烷基、取代的杂烷基、以及未取代的杂烷基。在一个具体的实施方案中，R24是H。
在一个实施方案中，本发明提供具有上式(a)的肽接头，其中F包含以下结构：
其中R24、AA1、K、i和c如上所限定。
在另一个实施方案中，上述式(a)的肽接头包含-F-(L1)m-，其包含结构：
其中R24、AA1、K、i和c如上述所限定。
在一些实施方案中，自消间隔基L1或L2包括：
其中R17、R18、以及R19各自均独立地选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、以及取代或未取代的芳基，并且w是从0到4的整数。在一些实施方案中，R17和R18独立地是H或烷基(优选未取代的C1-4烷基)。优选地，R17和R18是C1-C4烷基，如甲基或乙基。一些实施方案中，w是0。已经有实验发现，这个特定的自消间隔基成环速度相对较快。
在一些实施方案中，L1或L2包括
其中R17、R18、R19、R24和K如上述所限定。
间隔基团
间隔基团L3的特征在于它包括伯胺或仲胺或羧基官能团，并且L3基团的胺与D的侧羧基官能团形成酰胺键，或者L3的羧基与D的侧胺官能团形成酰胺键。L3可选自下组，其构成是：取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、或取代或未取代的杂环烷基。在一个优选的实施方案中，L3包含芳香族基团。更优选地，L3包括苯甲酸基团、苯胺基团、或吲哚基团。用作-L3-NH-间隔基的结构的非限制性实例包括以下结构：
其中Z是选自O、S和NR23的成员，并且其中R23是选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、以及酰基的成员。
切割包含本发明的L3的接头时，L3部分仍然附着在药物D上。因此，选择L3部分，使得它附着到D的存在不会显著地影响D的活性。在另一个实施方案中，药物D的一部分本身起L3间隔基的功能。例如，在一个实施方案中，药物D是多卡米星(duocarmycin)的衍生物，其中药物的部分起L3间隔基的作用。此类实施方案的非限制性实例包括那些实例，其中NH2-(L3)-D具有选自如下的结构：
以及
其中Z是O、S或NR23，其中R23是H、取代或未取代烷基、取代或未取代杂烷基或酰基；以及每种结构上的NH2基团与(AA1)c反应以形成-(AA1)c-NH-。
肽序列(AA1)c
基团AA1表示单氨基酸或通过酰胺键连接在一起的多个氨基酸。氨基酸可以是天然氨基酸和/或非天然α-氨基酸。它们可以呈L或D构型。在一个实施方案中，使用至少三个不同的氨基酸。在另一个实施方案中，仅使用两个氨基酸。
术语“氨基酸”指天然存在和合成的氨基酸，以及以类似于天然存在氨基酸的方式发挥功能的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在氨基酸是由遗传密码编码的那些，以及那些后来被修饰的氨基酸，例如，羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、瓜氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物指具有与天然存在氨基酸相同的基本化学结构即α碳的化合物，所述α碳连接到氢、羧基、氨基和R基团，例如，高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍盐。这些类似物具有修饰的R基团(例如，正亮氨酸)或修饰的肽骨架，但保留与天然存在氨基酸相同的基本化学结构。可以具体使用的一种氨基酸是瓜氨酸，其是精氨酸的前体并且与肝脏中尿素形成有关。氨基酸模拟物指这样的化合物：其具有不同于氨基酸一般化学结构的结构，但以类似于天然存在氨基酸的方式发挥功能。术语“非天然氨基酸”意图表示上述二十种天然存在氨基酸的“D”立体化学形式。术语非天然氨基酸可以进一步理解为，包括天然氨基酸的同系物，以及天然氨基酸的合成修饰形式。合成修饰形式包括，但不限于，具有变短或变长多达两个碳原子的亚烷基链的氨基酸、包含任选取代芳基的氨基酸以及包含卤化基团优选卤化烷基和芳基的氨基酸。当连接到本发明的接头或连接物时，氨基酸呈“氨基酸侧链”形式，其中氨基酸的羧酸基团已经置换有酮(C(O))基。因此，例如，丙氨酸侧链是-C(O)-CH(NH2)-CH3等。
肽序列(AA1)c功能上是单氨基酸(当c＝1时)或通过酰胺键连接在一起的多种氨基酸的酰胺化残基。肽序列(AA1)c优选被选择用来在生物系统中感兴趣的位置中通过酶进行酶催化切割。例如，对于靶向细胞但不被细胞内化的连接物，肽被选择来通过细胞外基质中的蛋白酶(例如附近垂死细胞释放的蛋白酶或肿瘤相关性蛋白酶)进行切割，以便所述肽在细胞外切割。对于被设计来被细胞内化的连接物，序列(AA1)c优选被选择来通过内体或溶酶体蛋白酶切割。肽中氨基酸数目范围可以从1至20；但更优选存在包含1-8个氨基酸、1-6个氨基酸或者1、2、3或4个氨基酸的(AA1)c。易于被特异性酶或酶类型切割的肽序列在本领域中是公知的。
优选地，(AA1)c含有作为蛋白酶切割位点的氨基酸序列(“切割识别序列”)。许多蛋白酶切割序列在本领域中是已知的。参见，例如，Matayoshi等Science 247：954(1990)；Dunn等Meth.Enzymol.241：254(1994)；Seidah等Meth.Enzymol.244：175(1994)；Thornberry，Meth.Enzymol.244：615(1994)；Weber等Meth.Enzymol.244：595(1994)；Smith et al.Meth.Enzymol.244：412(1994)；Bouvier等Meth.Enzymol.248：614(1995)，Hardy等，in Amyloid Protein Precursor in Development，Aging，and Alzheimer′s Disease，ed.Masters等pp.190-198(1994)。
在优选的实施方案中，肽序列(AA1)c基于其通过溶酶体蛋白酶被切割的能力来选择，溶酶体蛋白酶的非限制性实例包括组织蛋白酶B、C、D、H、L和S。优选地，肽序列(AA1)c能够被组织蛋白酶B体外切割。
在另一个实施方案中，肽序列(AA1)c基于其通过肿瘤相关性蛋白酶被切割的能力来选择，肿瘤相关性蛋白酶为例如在肿瘤细胞附近发现于胞外的蛋白酶，其实例包括甲拌磷寡肽酶(TOP)和CD10。在其它实施方案中，序列(AA1)c被设计来通过尿激酶或类胰蛋白酶选择性切割。
适合用于本发明连接物的肽序列的适合但非限制性实例包括Val-Cit、Cit-Cit、Val-Lys、Phe-Lys、Lys-Lys、Ala-Lys、Phe-Cit、Leu-Cit、Ile-Cit、Trp、Cit、Phe-Ala、Phe-N9-tosyl-Arg、Phe-N9-nitro-Arg、Phe-Phe-Lys、D-Phe-Phe-Lys、Gly-Phe-Lys、Leu-Ala-Leu、Ile-Ala-Leu、Val-Ala-Val、Ala-Leu-Ala-Leu(SEQ.ID NO：40)、β-Ala-Leu-Ala-Leu(SEQ.ID NO：41)和Gly-Phe-Leu-Gly(SEQ.IDNO：42)Val-Ala、Leu-Leu-Gly-Leu(SEQ.ID NO：43)、Leu-Asn-Ala和Lys-Leu-Val。优选的肽序列是Val-Cit和Val-Lys。
在另一个实施方案中，位于与药物部分最近的位置的氨基酸选自：Ala、Asn、Asp、Cit、Cys、Gln、Glu、Gly、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、以及Val。在又一个实施方案中，位于与药物部分最近的位置的氨基酸选自：Ala、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、以及Val。
本领域的技术人员可以容易地评价肽序列阵列，以确定它们在本发明中的应用，而不需诉诸于不适当的实验。参见例如，Zimmerman，M.，等，(1977)Analytical Biochemistry 78：47-51；Lee，D.，等，(1999)Bioorganicand Medicinal Chemistry Letters 9：1667-72；和Rano，T.A.，等，(1997)Chemistry and Biology 4：149-55。
本发明的连接物可以任选含有两个或更多个接头。这些接头可以相同或不同。例如，肽基接头可以用于将药物连接到配体以及第二肽基接头可以将诊断剂连接到该复合体。另外的接头的其它应用包括将分析剂、生物分子、靶向剂和可检测标记连接到抗体-配偶体复合体。
肼接头(H)
在另一个实施方案中，本发明的缀合物包含肼自消接头，其中该缀合物具有以下结构：
X4-(L4)p-H-(L1)m-D
其中D、L1、L4、p、m和X4如上述所限定和本文进一步所描述，以及H是包含下列结构的接头：
其中n1是从1至10的整数；n2是0、1、或2；每个R24均是独立地选自下组的成员：H、取代的烷基、未取代的烷基、取代的杂烷基、以及未取代的杂烷基；并且I或是一个键(即，主链上的碳原子与临近氮原子之间的键)、或是以下结构：
其中n3是0或1，条件是当n3是0时，n2不是0；以及n4是1、2或3。
在一个实施方案中，苯环上的取代是对位取代。在优选的实施方案中，n1是2、3、或4或n1是3。在优选的实施方案中，n2是1。在优选的实施方案中，I是一个键(即，主链上的碳原子与临近氮原子之间的键)。一方面，肼接头H可在切割时形成一个6元的自消接头，例如当n3是0并且n4是2时。另一方面，肼接头H可在切割时形成两个5元的自消接头。在其他方面，切割时，H形成一个5元的自消接头、H形成一个7元的自消接头、或H形成一个5元的自消接头以及一个6元的自消接头。切割速率受切割时形成的环大小的影响。因此，依据所希望的剪切速率，可选择剪切时形成的适宜大小的环。
另一种肼结构H具有下式：
其中q是0、1、2、3、4、5或6；以及每个R24独立地选自H、取代烷基、未取代烷基、取代杂烷基和未取代杂烷基。该肼结构也可以形成五-、六-或七-元环以及可以添加另外的组分以形成多个环。
各种肼接头的制备、切割化学和环化动力学公开在WO 2005/112919中，其公开内容通过引用而并入本文。
二硫化物接头(J)
在又一个实施方案中，接头包含可酶促切割的二硫基。在一个实施方案中，本发明提供细胞毒性抗体-配偶体化合物，其具有式(d)的结构：
其中D、L1、L4、p、m和X4如上述所限定和本文所进一步描述，以及J是二硫化物接头，其包含具有下列结构的基团：
其中每个R24独立地选自H、取代烷基、未取代烷基、取代杂烷基和未取代杂烷基；每个K独立地选自取代烷基、未取代烷基、取代杂烷基、未取代杂烷基、取代芳基、未取代芳基、取代杂芳基、未取代杂芳基、取代杂环烷基、未取代杂环烷基、卤素、NO2、NR21R22、NR21COR22、OCONR21R22、OCOR21和OR21，其中R21和R22独立地选自H、取代烷基、未取代烷基、取代杂烷基、未取代杂烷基、取代芳基、未取代芳基、取代杂芳基、未取代杂芳基、取代杂环烷基和未取代杂环烷基；i是整数0、1、2、3或4；以及d是整数0、1、2、3、4、5或6。
二硫化物接头的芳香环可以取代有一个或更多个“K”基团。“K”基团是芳香环上的取代基，其置换另外连接到作为环结构一部分的四个非取代碳之一的氢。“K”基团可以是单原子，如卤素，或可以是多原子基团，如烷基、杂烷基、氨基、硝基、羟基、烷氧基、卤烷基和氰基。示例性的K取代基独立地包括，但不限于，F、Cl、Br、I、NO2、OH、OCH3、NHCOCH3、N(CH3)2、NHCOCF3和甲基。对于“Ki”，i是整数0、1、2、3或4，在特定的实施方案中，i是0。
在优选的实施方案中，接头包含具有下式的可酶促切割的二硫基：
其中L4、X4、p和R24如上述所限定，以及d是0、1、2、3、4、5或6。在具体实施方案中，d是1或2。
更具体的二硫化物接头显示在下式中：
优选地，d是1或2以及每个K是H。
另一个二硫化物接头显示在下式中：
优选地，d是1或2以及每个K是H。
在各种实施方案中，二硫化物处于胺的邻位。在另一个具体实施方案中，a是0。在优选的实施方案中，R24独立地选自H和CH3。
诸如上述的那些二硫化物接头的制备和化学公开在WO 2005/112919中，其公开内容通过引用而并入本文。
对于细胞毒素种类、接头和将治疗剂连接至抗体的其它方法的进一步论述，还参见US 7,087,600；US 6,989,452；US 7,129,261；US 2006/0004081；US 2006/0247295；WO 02/096910；WO 2007/051081；WO 2005/112919；WO 2007/059404；WO 2008/083312；PCT申请PCT/US2008/054362；Saito等(2003)Adv.Drug Deliv.Rev.55：199-215；Trail等(2003)CancerImmunol.Immunother.52：328-337；Payne.(2003)Cancer Cell 3：207-212；Allen(2002)Nat.Rev.Cancer 2：750-763；Pastan和Kreitman(2002)Curr.Opin.Investig.Drugs 3：1089-1091；Senter和Springer(2001)Adv.DrugDeliv.Rev.53：247-264，其每一个通过引用全部并入本文。
细胞毒素作为配偶体分子
一方面，本发明的描述了缀合配偶体分子(例如细胞毒素、药物(如免疫抑制剂)或放射性毒素)的抗体。此类缀合物也被称为“免疫毒素”。细胞毒素或者细胞毒性剂包括任何对细胞有害(例如杀死细胞)的试剂。
本发明的配偶体分子的实例包括紫杉醇、松胞菌素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、吐根碱、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春碱、秋水仙素、阿霉素、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮(dihydroxy anthracindione)、米托蒽醌、光辉霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔、以及嘌呤霉素、以及其类似物或同系物。配偶体分子的实例还包括，例如抗代谢物(如甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、氮烯咪胺)、烷基化试剂(如氮芥、噻替哌、苯丁酸氮芥、美法仑、卡莫司汀(BSNU)及洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺(cyclothosphamide)、白消安、tubulysin、二溴甘露醇、链脲霉素、丝裂霉素C，及顺铂、蒽环类抗生素(如柔红比星(以前称柔红霉素)以及阿霉素)，抗生素(如更生霉素(以前称放线菌素)、博来霉素、光辉霉素，及安曲霉素(AMC))，以及抗有丝分裂剂(如长春新碱以及长春碱)。其他可与本发明的抗体缀合的配偶体优选实例包括加利车霉素、美登素、以及阿里斯达汀(auristatin)、以及其衍生物。
配偶体分子的优选实例是CC-1065和结构上相关的多卡米星的类似物和衍生物。尽管其有效和广泛的抗癌活性，CC-1065也不可以用于人，是因为其引起实验动物延迟死亡，这促进了对具有更好治疗指数的类似物或衍生物的查找。
CC-1065和多卡米星的许多类似物和衍生物在本领域中是已知的。已经综述了对许多所述化合物的结构、合成和性质的研究。参见，例如，Boger等，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.35：1438(1996)；和Boger等，Chem.Rev.97：787(1997)。其它与CC-1065类似物或衍生物有关的公开包括：US5,101,038；US 5,641,780；US 5,187,186；US 5,070,092；US 5,703,080；US5,070,092；US 5,641,780；US 5,101,038；US 5,084,468；US 5,739,350；US4,978,757，US 5,332,837和US 4,912,227；WO 96/10405；以及EP 0,537,575A1。
在特别优选的方面中，配偶体分子是CC-1065/多卡米星类似物，其具有下式(e)的结构：
其中，环体系A是选自取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、以及取代或未取代的杂环烷基中的成员。示例性的环体系包括苯基以及吡咯。
符号E和G独立地选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、杂原子、单键，或者E和G可任选地进行结合形成一个环状体系，该体系选自取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、以及取代或未取代的杂环烷基。
符号X表示选自O、S以及NR23中的成员。R23是选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、以及酰基的成员。
符号R3表示选自(＝O)、SR11、NHR11以及OR11中的成员，其中R11是H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、磺酸酯、酰基、C(O)R12R13、C(O)OR12、C(O)NR12R13、P(O)(OR12)2、C(O)CHR12R13、SR12或SiR12R13R14。符号R12、R13、以及R14独立地表示H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、以及取代或未取代的芳基，其中R12和R13与它们所附着的氮原子或碳原子一起可任选地相连接以形成一个取代或未取代的杂环烷基环状体系，该环状体系具有4到6元，可任选地包含2个或多个杂原子。
R4、R4’、R5以及R5’是独立地选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的杂环烷基、卤素、NO2、NR15R16、NC(O)R15、OC(O)NR15R16、OC(O)OR15、C(O)R15、SR15、OR15、CR15＝NR16和O(CH2)nN(CH3)2，的成员，其中，n是从1到20的整数，或者R4、R4’、R5及R5’的任何相邻的一对与它们所附着的碳原子连接在一起以形成一个有4到6元的取代或未取代的环烷基或杂环烷基环状体系。R15和R16独立地表示H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的杂环烷基、以及取代或未取代的肽基，其中R15和R16与它们所附着的氮原子一起可任选地相连接以形成一个取代或未取代的杂环烷基环状体系，该环状体系具有4到6元，可任选地包含两个或更多个杂原子。一个示例性的结构是苯胺。
如本文所述，R3、R4、R4’、R5和R5’中之一将细胞毒素结合到本发明接头或酶可切割底物，例如连接到L1或L3——如果存在的话——或连接到F、H或J。
R6是存在或不存在的单键。当R6存在时，R6和R7结合形成环丙环。R7是CH2-X1或-CH2-。当R7是-CH2-时，它是环丙烷环的一个组成部分。符号X1表示离去基团如卤素，例如Cl、Br或F。以不会违反化学价原则的方式解释R6和R7的组合。
X1可以是任何离去基团。有用的离去基团包括但不限于卤素、叠氮化物、磺基酯(如烷基磺酰基、芳基磺酰基)、氧鎓离子、高氯酸烷基酯、氨基烷烃磺酸酯、烷基氟代磺酸酯以及氟化化合物(如三氟甲磺酸盐、全氟丁基甲磺酸盐、三氟乙磺酸盐)等等。用作离去基团的具体卤素是F、Cl以及Br。
六元环中的曲线表明该环可具有一个或多个不饱和度，并且它可以是芳族的。因此，环结构(如以下所给出)、以及相关结构在式(f)的范围内：
在一个实施方案中，R11包括不自环化并且将药物连接到L1或L3(如果存在)或F、H或J的部分X5。部分X5优选可使用酶切割，以及当切割时，提供活性药物。作为实例，R11可以具有下列结构(其中右侧偶联到药物的其余部分)：
在一些实施方案中，R4、R4’、R5和R5’中至少一个将所述药物连接到L1(如果存在)或者F、H、J或X2，以及R3选自SR11、NHR11和OR11。R11选自-SO(OH)2、-PO(OH)2、-AAn、-Si(CH3)2C(CH3)3、-C(O)OPhNH(AA)m、
或任何其它糖或糖的组合
和其药学上可接受的盐，其中n是1至10范围内的任何整数，m是1至4范围内的任何整数，p是1至6范围内的任何整数以及AA是任何天然或非天然氨基酸。其中式(e)化合物经由R4、R4’、R5或R6而连接，R3优选包含可切割的保护基团，其存在阻断化合物的细胞毒活性，但通过一定的机制在意图作用位点发现的条件下可被切割，所述机制不同于将细胞毒素连接到抗体的接头的切割机制。这样，如果血浆中存在连接物的偶然切割，则保护基团削弱释放的细胞毒素的细胞毒性。例如，如果连接物具有肼或二硫化物接头，保护基团可以是酶促可切割的酰胺。或者，如果接头是通过蛋白酶可切割的肽基接头，保护基团可以是通过羧酯酶可切割的酯或氨基甲酸酯。
例如，在优选的实施方案中，D是具有结构(j)的细胞毒素：
在该结构中，R3、R6、R7、R4、R4’、R5、R5’和X如上文对于式(e)所描述。Z选自O、S和NR23，其中R23选自H、取代或未取代烷基、取代或未取代杂烷基和酰基。
R1是H、取代或未取代低级烷基、C(O)R8或CO2R8，其中R8选自NR9R10和OR9，其中R9和R10独立地选自H、取代或未取代烷基和取代或未取代杂烷基。
R1’是H、取代或未取代低级烷基或C(O)R8，其中R8选自NR9R10和OR9，其中R9和R10独立地选自H、取代或未取代烷基和取代或未取代杂烷基。
R2是H或取代或未取代低级烷基或未取代杂烷基或氰基或烷氧基；以及R2’是H或取代或未取代低级烷基或未取代杂烷基。
R3、R4、R4’、R5或R5’之一将细胞毒素连接到L1或L3——如果存在——或者F、H。
进一步的实施方案具有式：
在该结构中，A、R6、R7、X、R4、R4’、R5和R5’如上文对于式(e)所描述。Z选自O、S和NR23，其中R23选自H、取代或未取代烷基、取代或未取代杂烷基和酰基；
R34是C(＝O)R33或C1-C6烷基，其中R33选自H、取代或未取代烷基、取代或未取代芳基、取代或未取代杂芳基、取代或未取代杂环烷基、卤素、NO2、NR15R16、NC(O)R15、OC(O)NR15R16、OC(O)OR15、C(O)R15、SR15、OR15、CR15＝NR16和O(CH2)nN(CH3)2，其中n是1至20的整数。R15和R16独立地表示H、取代或未取代烷基、取代或未取代杂烷基、取代或未取代芳基、取代或未取代杂芳基、取代或未取代杂环烷基和取代或未取代肽基，其中R15和R16与连接它们的氮原子一起任选结合形成具有4至6个成员的取代或未取代杂环烷基环系，其包含两个或更多个杂原子。
优选地，A是取代或未取代苯基或取代或未取代吡咯。此外，本文对R11所描述的取代基的任何选择也可适用于R33。
标记物作为配偶体分子
当配偶体分子是标记物时，其可以是具有或产生可检测物理或化学性质的任何部分，从而表明其在特定组织或细胞中的存在。标记物(有时也称为报道基团)在免疫测定、生物医学研究和医学诊断领域中已经得到很好发展。标记物可以通过光谱学、光化学、生物化学、免疫化学、电学、光学或化学手段来检测。实例包括磁珠(例如，DYNABEADSTM)、荧光染色(例如，异硫氰酸荧光素、Texas红、罗丹明等)、放射性同位素(例如，3H、125I、35S、14C或32P)、酶(例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和通常用于ELISA的其它酶)以及比色标记(colorimetric label)如胶体金或有色玻璃或塑料珠(例如，聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶等)。
标记物优选选自放射性同位素、荧光剂、荧光剂前体、生色团、酶和其组合。适合的酶的实例是辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶和葡糖氧化酶。荧光剂包括荧光素及其衍生物、罗丹明及其衍生物、丹酰、伞形酮等。化学发光化合物包括荧光素和2，3-二氢酞嗪二酮，例如，鲁米诺。对于可以使用的各种标记或信号产生系统的阐述，参见美国专利号4,391,904。
标记物可以通过间接方法连接：配体分子(例如，生物素)被共价结合到抗体。然后配体结合到本身是内在可检测的另一个分子(例如，链霉抗生物素蛋白)或共价连接到信号系统，如可检测酶、荧光化合物或化学发光化合物。
连接物的实例
适于连接到本发明抗体的配偶体分子-接头组合的具体实例显示如下：
在上述化合物中，当下标r存在于式中时，它是0至24范围内的整数。R不论什么情况下出现时都是
上述化合物中每一种均具有马来酰亚胺基团并且易于经由其上的硫氢基连接到抗体。
连接本发明的抗体也可以通过其它种类的化学官能度实现，如上文在双特异性分子部分中所述。
药物组合物
在另一个方面中，本公开提供药物组合物，其包含与药学上可接受的载体一起配制的本公开的单克隆抗体或其抗原结合部分(一个或多个)之一或组合。
还可以在联合治疗中施用本公开的药物组合物(即，与其他试剂组合)。例如，该联合疗法可以包括本公开的抗-间皮素抗体，该抗-间皮素抗体与至少一种其他抗癌剂组合。以下对可用于联合治疗的治疗剂的实例进行了更加详尽的说明。
如此处使用的“药学上可接受的载体”包括任何及全部的生理学上相容的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂及抗真菌剂、等渗剂及吸收延缓剂等。优选地，该载体适宜于静脉内、肌内、皮下、胃肠外、脊髓或表皮给药(例如通过注射或输注)。依据给药途径，活性化合物(即抗体、免疫连接物、或双特异性分子)可用材料包被以保护该化合物免受可能导致该化合物失活的酸以及其他自然条件的作用。
本公开的药物化合物可包含一种或多种药学上可接受的盐。“药学上可接受的盐”是指一种盐，它保持了母体化合物的希望的生物活性并不会引起任何不希望的毒理学效应。这种盐的实例包括酸加成盐和碱加成盐。酸加成盐包括源自无毒无机酸的盐，例如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、磷酸等，以及源自无毒有机酸的盐，例如脂肪族单羧酸及二羧酸、苯基取代的烷醇酸、羟基烷醇酸、芳香酸、脂肪族及芳香族磺酸等。碱性加成盐包括源自碱土金属的盐，例如钠、钾、镁及钙等的盐，以及源自无毒有机胺的盐，例如N，N′-二苄基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺及普鲁卡因等。
本公开的药物组合物还可包含药学上可接受的抗氧化剂。药学上可接受的抗氧化剂的实例包括：(1)水溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基羟基茴香醚(BHA)，丁基羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯及α-生育酚等；以及(3)金属螯合剂，例如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸及磷酸等。
在本公开的药物组合物中可以采用的适宜的水性及非水性载体的实例包括水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇及聚乙二醇等)，以及它们的适宜的混合物、植物油，如橄榄油，以及可注射的有机酯，例如油酸乙酯。例如通过使用包衣材料(如卵磷脂)、通过维持分散系中所需颗粒的大小、以及通过使用表面活性剂，可以维持适当的流动性。
这些组合物还可包含佐剂，如防腐剂、润湿剂、乳化剂及分散剂。可通过灭菌程序(见上文)，以及通过加入不同的抗细菌剂及抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等)均可确保防止微生物的存在。将等渗剂(如糖及氯化钠等)包含进入这些组合物中也可能是令人希望的。另外，通过包含延迟吸收的物质(如单硬脂酸铝及明胶)可以实现可注射药物形式的延长吸收。
药学上可接受的载体包括无菌水溶液或分散液、以及用于无菌注射溶液或分散液的即时配制的无菌粉末。用于药学活性物质的这种介质及试剂的使用在本领域中是已知的。除了与活性化合物不相容的任何常规介质或试剂之外，可考虑它在本公开的多种药学组合物中使用。还可以在这些组合物中掺入辅助性活性化合物。
治疗组合物典型地必须是无菌的并且在制造及存储条件下是稳定的。该组合物可以被配制成溶液、微乳剂、脂质体、或者其他适于高药物浓度的有序结构。该载体可以是溶剂或分散介质，包含例如水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇，以及液体聚乙二醇等)，以及它们的适宜的混合物。例如，通过使用一种包衣(如卵磷脂)、通过维持分散系中所需颗粒的大小、以及通过使用表面活性剂，可维持适合的流动性。在许多情况下，优选在组合物中包含等渗试剂，例如糖、多元醇(如甘露醇、山梨醇)，或氯化钠。
通过微孔过滤即可制备出无菌注射液。总体上，通过将活性化合物掺入至无菌载体(它包含基本分散介质及上述列举的所需的其他组分)来制备分散体。对于用于制备无菌注射液的无菌粉末的情况，优选的制备方法是真空干燥及冷冻干燥(冻干)，制得该活性组分以及任何来自其预先无菌过滤的溶液的其他希望的组分的粉末。
与载体物质组合以产生单一剂型的活性组分的量值将随着正在接受治疗的受试者及具体给药方式而变化。与载体物质组合以产生单一剂型的活性组分的量一般是产生治疗效果的组合物的量。总体上讲，在100％的数量内，与药学上可接受的载体组合的活性组分的量大约是从0.01％至约99％的范围内，优选从约0.1％至约70％，最优选从约1％至约30％。
对剂量方案进行调节以提供最佳的理想的反应(如治疗反应)。例如，可给予单次大丸剂，可以随时间施用几次分份剂量，或者根据治疗情况的紧急程度所示按比例减少或增加剂量。为给药方便以及剂量统一而按剂量单位形式配制成肠胃外组合物尤为有利。此处使用的剂量单位形式指用于待治疗的受试者单一剂量的物理上不连续的单位；每个单位包含经计算能与所需的药学载体相结合产生理想的疗效的预定量的活性化合物。本公开的剂量单位形式的说明由以下因素决定并直接取决于以下因素：(a)活性化合物的独特特性及待实现的特定疗效，以及(b)配制这种用于治疗个体敏感性的活性化合物的领域中固有的局限性。
对于本发明抗体的给药，剂量为约0.0001至100mg/kg，并且更经常是0.01至5mg/kg宿主体重。例如，剂量可以是0.3mg/kg体重、1mg/kg体重、3mg/kg体重、5mg/kg体重或10mg/kg体重或者在1至10mg/kg的范围内。一种示例性治疗方案限定为每周给药一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每月一次、每三个月一次或每3至6个月一次。优选的剂量方案包括通过静脉内给药1mg/kg体重或3mg/kg体重，使用以下剂量方案之一给予抗体：(i)每4周给予6个剂量，之后每3个月给药；(ii)每三周给药；(iii)3mg/kg体重一次给药，接着每三周按1mg/kg体重给药。
在一些方法中，两种或多种具有不同的结合特异性的单克隆抗体被同时给药，这种情况下，所给予的每种抗体的剂量都在所指示的范围之内。通常在多个时间点给予抗体。单个剂量之间的间隔可以是，例如一周、一个月、每三个月或一年。间隔也可以是不规则的，如通过测量患者的针对靶抗原的抗体的血液水平所指示。在一些方法中，调整剂量使血浆抗体浓度大约是1至1000μg/ml，并且在一些方法中大约是25至300μg/ml。
备选地，抗体可以作为缓释制剂给药，在这种情况中需要以较低频率给药。剂量及频率随抗体在患者体内的半衰期而变。一般而言，人抗体的半衰期最长，其次是人源化抗体、嵌合抗体、以及非人抗体。给药的剂量及频率可根据治疗是预防性的或是治疗性的而变化。在预防性应用时，在很长的一段时间内以相对较不频繁的间隔给予相对少的剂量。一些患者在其余生中继续接受治疗。在治疗性的应用时，有时需要在相对较短的间隔内给予相对较高的剂量直至疾病缓减或终止，并且优选地直至患者显示疾病症状的部分或完全改善。之后，该患者可以接受预防性的给药方案。
为用于与细胞增殖异常有关的疾病预防和/或治疗，所施用化合物的循环浓度优选为大约0.001μM到20μM，优选大约0.01μM到5μM。
此处说明的化合物的患者口服剂量典型地是从大约1mg/天到大约10,000mg/天的范围内，更典型地从大约10mg/天到大约1,000mg/天，并且最典型地从大约50mg/天到大约500mg/天。按照患者体重所述，典型的剂量是从大约0.01到大约150mg/kg/天的范围内，更典型地从大约0.1到大约15mg/kg/天，并且最典型地从大约1到大约10mg/kg/天，例如5mg/kg/天或3mg/kg/天。
在至少一些实施方案中，患者的阻滞或抑制肿瘤生长的剂量可以是1μmol/kg/天或者更少。例如，患者的剂量可以是0.9、0.6、0.5、0.45、0.3、0.2、0.15或0.1μmol/kg或更小(指药物的摩尔)。优选地，抗体-药物缀合物当在至少5天时间内以日剂量给药时，阻止肿瘤细胞的生长。
可以改变本公开的药物组合物中的活性成分的实际剂量水平，以获得针对特定患者、组合物及给药方式而言有效实现所希望的治疗反应而对患者无毒的活性成分的量。所选的剂量水平将取决于多种药物代谢动力学因素，包括采用特定组合物或其酯、盐、或酰胺的活性，给药途径，给药时间，所用的特定化合物的排泄速率，疗程，在与所采用的特定组合物组合中使用的其他药物、化合物和/或材料，患者的年龄、性别、体重、状态、总体健康状态和病史，以及在医学领域众所周知的类似因素。
本公开的抗间皮素抗体的“治疗有效剂量”优选地导致减轻疾病症状的严重程度、延长无疾病症状时间的频率及持续时间、或防止由于该病痛产生的损害或残疾。例如，对于治疗带有肿瘤的受试者，“治疗有效剂量”优选地抑制肿瘤生长至少约20％，更优选至少约40％，甚至更优选至少约60％，并仍更优选至少约80％。化合物抑制肿瘤生长的能力可以在预测人类肿瘤功效的动物模型系统中进行评价。备选地，组合物的这一特性可通过检验该化合物的抑制细胞生长能力来评价，这种抑制作用可通过有经验的从业者已知的测定方法在体外测定。治疗性化合物的治疗有效量可减小肿瘤的大小，或者缓解受试者的症状。本领域的技术人员应能根据受试者的大小、受试者症状的严重程度、以及所选具体组合物或所选择的给药途径等因素而确定这种量值。
使用本领域已知的一种或多种方法通过一种或多种给药途径可以对本公开的组合物进行给药。如技术人员应当理解，给药途径和/或方式将随所希望的结果而变化。本公开的抗体的优选给药途径包括静脉内、肌内、皮内、腹膜内、皮下、脊髓或其他胃肠外给药途径，例如通过注射或输注。此处使用的短语“胃肠外给药”是指除了肠内及局部给药外的其他给药方式，通常通过注射，并包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下腔、脊柱内、硬膜外及胸骨内注射及输注。
备选地，本公开的抗体可经非胃肠外途径进行给药，非胃肠外途径例如局部、表皮或粘膜途径给药，例如经鼻内、口服、阴道、直肠、舌下或局部途径给药。
活性化合物可用载体制备，该载体将保护化合物免于快速释放，例如控释制剂，包括植入剂、经皮贴剂、以及微囊化递送系统。可以使用生物降解的、生物相容性的聚合物，例如乙烯-乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯、以及聚乳酸。用于制备这种制剂的许多方法已获得专利，或者是本领域技术人员所熟知的。参见，例如Sustained and ControlledRelease Drug Delivery SystemsJ.R.Robinson，ed.，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978。
治疗组合物可利用本领域中已知的医用装置进行给药。例如，本公开的治疗组合物可利用无针皮下注射装置进行给药，例如在US5,399,163、5,383,851、5,312,335、5,064,413、4,941,880、4,790,824或4,596,556中所披露的装置。在本公开中有用的熟知的植入剂与装置的实例包括：US4,487,603(用于以受控速度释放药物的一种可植入式微量输注泵)；US4,486,194(用于通过皮肤给药的一种治疗装置)；US4,447,233(用于以精确的输注速度递送药物的一种药物输注泵)；US4,447,224(用于持续药物递送的一种可变流速的可植入输注装置)；US4,439,196(一种具有多腔区室的渗透药物送递系统)；以及US4,475,196(一种渗透药物送递系统)。这些专利通过引用并入本文。许多其他这种植入剂、递送系统、以及模型是本领域技术人员已知的。
在某些实施方案中，对本公开的抗体进行配制以确保其在体内分布适宜。例如，血脑屏障(BBB)阻止了许多高亲水性化合物。为确保本公开的治疗性化合物穿过BBB(如果需要时)，(例如)可以将它们配制在脂质体中。用于制造脂质体的方法，参见，例如，US4,522,811；5,374,548；以及5,399,331。这些脂质体可能包含一个或多个部分，这些部分被选择性地输送到特定的细胞或器官中，由此增强靶标药物的递送(参见，例如V.V.Ranade J.Clin.Pharmacol.29：685，(1989))。示例性靶向部分包括叶酸盐或生物素(参见，例如Low等人的US5,416,016)；甘露糖苷(Umezawaet al.，(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.153：1038)；抗体(P.G.Bloeman et al(1995)FEBS Lett.357：140；M.Owais et al.(1995)Antimicrob.Agents Chemother.39：180)；表面活性剂蛋白A受体(Briscoeet al.(1995)Am.J.Physiol.1233：134)；p120(Schreier et al.(1994)J.Biol.Chem.269：9090)；也参见K.Keinanen；M.L.Laukkanen(1994)FEBS Lett.346：123；J.J.Killion；I.J.Fidler(1994)Immunomethods 4：273。
本发明的应用及方法
本发明的抗体，特别是人抗体、抗体组合物、抗体-配偶体分子缀合物组合物以及方法具有与诊断和治疗间皮素介导的病症相关的多种体外和体内诊断及治疗用途。例如，这些分子可在体外或离体地被施用至培养物中的细胞，或者给予人类受试者，以便治疗、预防和诊断多种病症。如在此所使用的术语“受试者”旨在包括人类及非人类动物。非人类动物包括所有脊椎动物，例如哺乳动物及非哺乳动物，例如，非人灵长类动物、绵羊、犬、猫、牛、马、鸡、两栖动物、以及爬行动物。优选的受试者包括患有由间皮素活性介导的病症的人类患者，特别是患有与间皮素异常表达相关的病症的人类患者。当与间皮素缀合的抗体-配偶体分子缀合物与另一种活性剂一起给药时，这两种物质可以顺序或者同时给药。
如果本发明抗体特异性结合间皮素，则本发明抗体可以用于特异性检测间皮素表达，而且可以用于通过免疫亲和纯化来纯化间皮素。
在一个实施方案中，本发明的组合物可以用于检测间皮素水平，所述水平然后可以与某些疾病症状关联起来。备选地，组合物可以用于抑制或阻断间皮素功能，其进而可以与某些疾病症状的预防或缓解关联起来，从而表明间皮素为疾病的介体。这可以通过使样品和对照样品与抗间皮素抗体在这样的条件下接触来实现，所述条件允许在抗体和间皮素之间形成复合体。在样品和对照中检测和比较抗体和间皮素之间形成的任何复合体。
在另一个实施方案中，可以首先测试本发明的组合物与体外治疗或诊断应用有关的结合活性。例如，本发明的组合物可以使用本领域已知的流式细胞测定来测试。
本发明的组合物在间皮素相关疾病的治疗和诊断中具有另外的应用。例如，免疫连接物可以用于体内或体外引起一种或更多种下列生物活性：抑制表达间皮素的细胞生长和/或杀死表达间皮素的细胞；在人效应细胞存在的情况下调节表达间皮素细胞的吞噬作用或ADCC，或阻断间皮素配体结合间皮素。
在具体的实施方案中，组合物用于体内治疗、预防或诊断多种间皮素相关疾病。间皮素相关疾病的实例包括卵巢癌、胰腺癌、胃癌、肺癌、子宫癌、子宫内膜癌、胆管癌、胃/食管癌、结肠直肠癌和乳腺癌以及其它癌。
本发明的组合物可以包含这样的活性剂，包括抗瘤剂，如多柔比星(阿霉素)、顺铂、博来霉素硫酸盐、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、环磷酰胺和羟基脲，它们本身仅在对患者有毒或亚毒的水平下有效。每四周一次，以100mg/kg剂量静脉内施用顺铂，以及每21天一次，以60-75mg/mL剂量静脉内施用阿霉素。本发明的人抗间皮素抗体或其抗原结合片段与化学治疗剂共同给药，提供两种抗癌剂，其通过不同的机制起作用并且对人肿瘤细胞产生细胞毒效应。这种共同给药可以解决由于耐药性的发展或肿瘤细胞抗原性的改变产生的问题，这些问题将使肿瘤细胞与抗体不起反应。
本发明的双特异性或多特异性分子也可以用于调控效应细胞上FcγR或FcγR水平，如通过使细胞表面上的受体加帽和消除。抗-Fc受体混合物也可以用于该目的。
具有补体结合位点的本发明组合物，如结合补体的IgG1、-2或-3或IgM部分，也可以在补体存在的情况下使用。在一个实施方案中，用本发明结合剂以及适当的效应细胞离体处理包含靶细胞的细胞群，可以通过添加补体或含补体的血清来加以补充。包被有本发明结合剂的靶细胞的吞噬作用可通过结合补体蛋白而提高。在另一个实施方案，包被有本发明组合物(例如，人抗体、多特异性和双特异性分子)的靶细胞也可以被补体裂解。在又一个实施方案中，本发明的组合物不激活补体。
本发明的组合物也可以与补体一起施用。因而，本公开提供组合物，其包含人抗体、多特异性或双特异性分子以及血清或补体。当补体位置很接近人抗体、多特异性或双特异性分子时，这些组合物可以是有利的。备选地，本发明的人抗体、多特异性或双特异性分子以及补体或血清可以单独给予。
包含本发明的抗体组合物和使用说明的试剂盒也在本发明的范围内。该试剂盒可以进一步包含一种或更多种另外的试剂，如免疫抑制试剂、细胞毒剂或放射性毒剂，或一种或更多种本发明另外的人抗体(例如，具有补体活性的人抗体，其结合不同于第一人抗体的间皮素抗原中的表位)。
因此，用本发明抗体组合物治疗的患者可以另外给予(在给予本发明组合物之前、同时或之后)另一种治疗剂，如细胞毒剂或放射性毒剂，其提高或增加组合物的治疗效果。
在其他的实施方案中，可额外地用调节(例如增强或抑制)Fcγ或Fcγ受体表达或活性的药剂来治疗受试者，例如用细胞因子治疗受试者。在用多特异性分子治疗过程中施用的优选的细胞因子包括粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、γ干扰素(IFN-γ)及肿瘤坏死因子(TNF)。
在一个具体的实施方案中，本发明提供了用于检测样品中间皮素抗原的存在或者测量间皮素抗原的量的方法，这些方法包括：将该样品以及对照样品与特异性地结合间皮素的人类单克隆抗体或它的抗原结合部分在该抗体或其部分与间皮素之间可形成复合体的条件下相接触。然后检测复合体的形成，其中在该样品与对照样品之间复合体形成的差异表明在该样品中存在间皮素抗原。
在其它实施方案中，本发明提供治疗受试者间皮素-介导的病症的方法，所述病症为例如，卵巢癌、胰腺癌、胃癌、肺癌、子宫癌、子宫内膜癌、胆管癌、胃/食管癌、结肠直肠癌和乳腺癌。
在又一个实施方案中，本发明的免疫连接物可用于通过将配偶体分子连接到抗体而将配偶体分子连接到表达间皮素的细胞。例如，抗间皮素抗体可以连接到下列中描述的任何毒素化合物：US 6,281,354；6,548,530；2003/0050331；2003/0064984；2003/0073852；和2004/0087497；或WO03/022806。因此，本发明还提供离体或体外定位表达间皮素的细胞的方法(例如，用可检测标记，如放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子)。备选地，免疫连接物可以用于杀死具有间皮素细胞表面受体的细胞，其通过靶向连接到结合间皮素的抗体的细胞毒素或放射性毒素而进行。
由于间皮素与某些肿瘤相关，本发明提供抑制表达间皮素的肿瘤细胞生长的方法，其包括使肿瘤细胞与本公开的抗间皮素抗体接触，以便抑制肿瘤细胞生长。在优选的实施方案中，抗体被连接到治疗剂，如细胞毒素。在特别优选的实施方案中，表达间皮素的肿瘤细胞是间皮瘤细胞，或与卵巢癌、胰腺癌、胃癌、肺癌、子宫癌、子宫内膜癌、胆管癌、胃/食管癌、结肠直肠癌和乳腺癌相关的肿瘤细胞。在其它优选的实施方案中，表达间皮素的肿瘤细胞是间皮瘤细胞、胰腺肿瘤细胞、卵巢肿瘤细胞、胃肿瘤细胞、肺肿瘤细胞或子宫内膜肿瘤细胞。在又一其它实施方案中，肿瘤细胞来自选自间皮瘤、乳头状浆液性卵巢腺癌、透明细胞卵巢癌、混合Mullerian卵巢癌、子宫内膜样粘液性卵巢癌、胰腺癌、胰腺导管腺癌、子宫浆液性癌、肺腺癌、肝外胆管癌、胃腺癌、食管腺癌、结肠直肠腺癌和乳腺癌的癌。
此外，在另一个方面中，抗间皮素抗体和其抗体药物连接物可以用于治疗受试者的癌症。因此，本发明提供治疗受试者癌症的方法，其包括给予受试者本公开的抗体，以便治疗受试者癌症。例如，在特别优选的实施方案中，抗体可以用于治疗间皮瘤、卵巢癌或胰腺癌。在其它优选的实施方案中，抗体用于治疗间皮瘤、胰腺癌、卵巢癌、胃癌、肺癌或子宫内膜癌。在又一其它实施方案中，抗体用于治疗选自间皮瘤、乳头状浆液性卵巢腺癌、透明细胞卵巢癌、混合Mullerian卵巢癌、子宫内膜样粘液性卵巢癌、胰腺癌、胰腺导管腺癌、子宫浆液性癌、肺腺癌、肝外胆管癌、胃腺癌、食管腺癌、结肠直肠腺癌和乳腺癌的癌症。
抗体可以单独使用或联合其它癌症治疗如手术和/或放射，和/或联合其它抗瘤剂，如上面论述和阐述的抗瘤剂，包括化学治疗药物和其它抗-肿瘤抗原抗体，如结合CD20、Her2、PSMA、Campath-1、EGFR等的那些抗体。
任选地，抗间皮素的抗体可以联合免疫原剂，如疫苗，其包含癌性细胞、纯化的肿瘤抗原(包括重组蛋白、肽和糖类分子)、细胞和转染有编码免疫刺激细胞因子的基因的细胞(He等(2004)J.Immunol.173：4919-28)。已经设计出许多接种肿瘤疫苗的实验策略(参见Rosenberg，S.，2000，Development of Cancer Vaccines，ASCO Educational Book Spring：60-62；Logothetis，C.，2000，ASCO Educational Book Spring：300-302；Khayat，D.2000，ASCO Educational Book Spring：414-428；Foon，K.2000，ASCOEducational Book Spring：730-738；也参见Restifo，N.and Sznol，M.，Cancer Vaccines，Ch.61，pp.3023-3043in DeVita，V.等(eds.)，1997，Cancer：Principles and Practice of Oncology.Fifth Edition)。在这些策略之一中，使用自体或同种异型肿瘤细胞来制备疫苗。已经显示，当肿瘤细胞被转导表达GM-CSF时这些细胞疫苗最有效。已经显示，对于接种肿瘤疫苗，GM-CSF是抗原呈递的有效激活剂(Dranoff等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci USA.90：3539-43)。
其它肿瘤疫苗可以包括来自与人癌症有关的病毒的蛋白质，如人乳头瘤病毒(HPV)、肝炎病毒(HBV和HCV)和卡波西疱疹肉瘤病毒(KHSV)。可以用作肿瘤疫苗的肿瘤特异性抗原的另一种形式是从肿瘤组织自身分离的纯化热休克蛋白(HSP)。这些热休克蛋白含有来自肿瘤细胞的蛋白片段并且这些HSP在递送至抗原呈递细胞以引起肿瘤免疫性方面非常有效(Suot，R & Srivastava，P(1995)Science 269：1585-1588；Tamura，Y.et al.(1997)Science 278：117-120)。
树突细胞(DC)是可以用于触发抗原特异性反应的有效抗原呈递细胞。DC可以离体产生并且载有各种蛋白质和肽抗原以及肿瘤细胞提取物(Nestle，F.等(1998)Nature Medicine 4：328-332)。也可以通过遗传手段转导DC以表达这些肿瘤抗原。为免疫目的，DC也可以直接融合到肿瘤细胞(Kugler，A.等(2000)Nature Medicine 6：332-336)。作为接种疫苗的方法，DC免疫可以有效地联合抗间皮素抗体治疗，以激活抗-肿瘤反应。
抗间皮素抗体的应用也可以联合标准癌症治疗。抗间皮素抗体治疗可以有效地联合化学治疗方案。在这些情况下，有可能降低所施用的化学治疗试剂的剂量(Mokyr，M.等(1998)Cancer Research 58：5301-5304)。其它可以与抗间皮素抗体治疗产生协同作用的联合治疗是放射、手术和激素剥夺。血管生成抑制剂也可以与抗间皮素抗体治疗联合。
抗间皮素抗体治疗也可以联合双特异性抗体来使用，所述双特异性抗体将表达Fcα或Fcγ受体的效应细胞靶向肿瘤细胞(参见，例如，US5,922,845和5,837,243)。例如抗-Fc受体/抗肿瘤抗原(例如，Her-2/neu)双特异性抗体已经用于将巨噬细胞靶向肿瘤部位。该靶向可以更有效地激活肿瘤特异性反应。备选地，抗原可以通过使用双特异性抗体直接递送到DC，所述双特异性抗体结合肿瘤抗原和树突细胞特异性细胞表面标记物。
肿瘤通过多种机制来逃避宿主免疫监视。这些机制中许多可以通过使肿瘤表达的免疫抑制蛋白失活而克服。这些包括TGF-β(Kehrl，J.等(1986)J.Exp.Med.163：1037-1050)、IL-10(Howard，M.&O′Garra，A.(1992)Immunology Today 13：198-200)和Fas配体(Hahne，M.等(1996)Science274：1363-1365)。抗这些实体的抗体可以联合抗间皮素抗体使用，以抵消免疫抑制剂的效应和帮助宿主的肿瘤免疫反应。
可以用于激活宿主免疫反应的其它抗体可以联合抗间皮素抗体使用。这些包括树突细胞表面上的分子，其激活DC功能和抗原呈递。抗-CD40抗体能够有效代替T细胞辅助细胞活性(Ridge，J.等(1998)Nature 393：474-478)以及可以联合抗间皮素抗体使用(Ito，N.等(2000)Immunobiology 201(5)527-40)。抗T细胞共刺激分子如CTLA-4(例如，美国专利号5,811,097和6,984,720)、OX-40(Weinberg，A.等(2000)Immunol 164：2160-2169)、4-1BB(Melero，I.等(1997)Nature Medicine 3：682-685(1997)、ICOS(Hutloff，A.等(1999)Nature 397：262-266)、PD-1和/或PD-L1的抗体也可以提供增加水平的T细胞激活，因此这些T细胞激活抗体也可以联合本发明的抗间皮素抗体使用。
骨髓移植目前被用于治疗各种造血来源的肿瘤。尽管移植物抗宿主病是这种治疗的结果，但可以从移植物抗肿瘤反应获得治疗益处。因此，抗间皮素抗体治疗可以联合骨髓移植作为肿瘤治疗方案的一部分来使用。
通过下列实施例对本公开进行进一步说明，这些实施例不应该被解释为进一步限制。在整个本申请中所有附图和所引用的所有参考文献、Genbank序列、专利和公开的专利申请通过引用全部明确地并入本文。
实施例1：抗间皮素蛋白的人单克隆抗体的产生
抗间皮素人单克隆抗体使用表达人抗体基因的转基因小鼠来产生，如下。
抗原
将间皮素可溶性融合蛋白用作免疫抗原。可溶性融合蛋白由其C-端处连接到His标签的间皮素40kD部分(其在天然间皮素中经由GPI-连接而是膜结合的)组成。本文将该融合蛋白称为“hu间皮素-his融合蛋白”。该融合蛋白通过标准重组DNA方法产生并且表达在转染的CHO细胞中，所述CHO细胞将可溶性融合蛋白分泌到培养上清液中。用于转染的CHO宿主细胞从Invitrogen获得(Cat#11619-012)。将分泌的可溶性融合蛋白纯化，以用作免疫原。此外，将分泌hu间皮素-his融合蛋白的转染CHO细胞的上清液用于ELISA测定中，以筛选HuMAb(下面进一步描述)。
转基因小鼠
抗人间皮素的全人单克隆抗体使用HuMab MouseTM型转基因小鼠HCo7x hu Lamda品系小鼠(“Hco7x hu小鼠”)来制备。在该品系中，内源性小鼠κ轻链基因已被纯合破坏，如Chen等(1993)EMBO J.12：811-820中所述，以及内源性小鼠重链基因已被纯合破坏，如WO 2001/09187实施例1中所述。此外，该小鼠品系携带人κ轻链转基因KCo5，如Fishwild等(1996)Nature Biotechnology 14：845-851中所述、如WO 2000/026373中所述携带大部分人λ轻链基因座的酵母人工染色体(YAC)、以及人重链转基因HCo7，如US 5,545,806、5,625,825和5,545,807中所述。
免疫小鼠
为产生抗人间皮素的全人单克隆抗体，将HCo7x hu小鼠用纯化的hu间皮素-his融合蛋白免疫。一般性免疫方案描述在Lonberg，N.等(1994)Nature 368(6474)：856-859；Fishwild，D.等(1996)Nature Biotechnology14：845-851和WO 98/24884中。在第一次输注抗原时，小鼠为3-4个月龄。纯化重组人间皮素-his抗原制备物(从表达融合蛋白的转染哺乳动物细胞中纯化10μg)用于腹膜内和皮下免疫小鼠。用RIBI佐剂(Sigma Cat#M6536)将抗原1∶1混合。
将小鼠每周免疫9次。通过眼窝后放血监测免疫反应。通过间接ELISA分析(如下所述)来筛选血浆，并且将具有抗人间皮素人IgG最大滴度的小鼠用于融合。在处死和移除脾脏前2和3天，小鼠接受最后一次强化静脉内(IV)注射和腹膜内(IP)注射可溶性抗原。
产生抗人间皮素人单克隆抗体的小鼠的选择
为选择产生高滴度抗间皮素抗体的Hco7x hu小鼠，将间接ELISA测定用于监测血清抗体滴度，如下。用300μL/孔的1％BSA/DPBS将His-标签抗体包被的微量滴定板(Novagen Cat.#71184)水化并封闭10至15分钟。在几次洗涤后，添加(50μl/孔)分泌hu间皮素-his融合蛋白(滴定获得最大信号)的CHO细胞上清液，并且温育1小时。在用DPBS/Tween将板洗涤后，将间皮素免疫的小鼠的血浆稀释液(以1∶50开始稀释，并以1∶2连续稀释11次)添加到每个孔中并且温育1小时。将板用DPBS/Tween洗涤并且与连接有辣根过氧化酶的山羊-抗-人IgG多克隆抗体(JacksonImmunoResearch Labs Cat.#115-036-098)一起温育1小时。然后添加ABTS(2，2’-连氮基-双[3-乙基苯并噻唑啉6-磺酸])底物(Sigma Cat.#S9941)并且在OD 415nm下用分光光度法来分析平板。将滴度定义为产生的OD是背景OD两倍的血清稀释度。使用Excel模板计算滴度。显示出最高的抗人间皮素抗体滴度的小鼠用于融合。如下所述进行融合并且使用两种不同的ELISA测定形式来检测杂交瘤上清液的抗人间皮素活性，也如下所述。
生产抗间皮素蛋白的人单克隆抗体的杂交瘤的产生
将从高滴度HCo7x hu小鼠分离的小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤融合配偶体，使用Cyto Pulse大室细胞融合电穿孔仪(Cyto Pulse Sciences，Inc.，GlenBurnie，MD)，用基于电场的电融合进行融合。将免疫小鼠脾淋巴细胞单细胞悬浮液融合到相等数量的不分泌P3X63Ag8.6.53(ATCC CRL 1580)的小鼠骨髓瘤细胞。在选择性DMEM培养基中将得到的细胞以2.0×104细胞/孔铺板于平底微量滴定板中，所述选择性DMEM培养基含有高葡萄糖(Cellgro#10-013-CM)和10％胎牛血清(Hyclone#SH30071.03)，并且添加有β-巯基乙醇(1000X，Gibco#21985-023)、7mM HEPES(Cellgro25-060-Cl)、另外2mM L-谷氨酰胺(Cellgro 25-005-Cl)、HAT(50X，Sigma#H-0262)、5％杂交瘤克隆因子(BioVeris#210001)、10％P388DI(ATCC#CRL TIB-63)条件培养基和青霉素-链霉素(100x，Cellgro#30-002-CI)。在约7天后，将一些含有HAT的培养基用含有HT的培养基(Cellgro#25-047-CI)代替。
在10至12天后，在直接ELISA测定中筛选各个孔，以获得含有人IgG/人κ轻链或人IgG/人λ轻链抗体的孔。在直接ELISA形式中，微量滴定板包被有山羊抗-人IgG F(ab’)2Fc片段特异性(JacksonImmunoResearch Labs，Cat.#109-006-098)，2.5μg/mL，50μl/孔，温育1小时并且用300μL/孔的1％BSA/DPBS封闭15分钟。除去封闭缓冲液并且添加融合板的上清液(50μL/孔)，温育1小时。将板用DPBS/Tween洗涤，然后与连接有辣根过氧化酶的山羊-抗-人κ轻链多克隆抗体(Bethyl Cat.#A80-115P)或连接有辣根过氧化酶的山羊-抗-人λ轻链多克隆抗体(Biosource Cat.#10904)一起温育1小时。在洗涤后，将板用ABTS底物显色并且用分光光度法在OD 415nm下分析。选择具有提高的OD＞0.75的孔，用于进一步分析。
将来自对人IgG/人κ轻链或人IgG/人λ轻链抗体阳性的孔的杂交瘤细胞转移到24-孔培养。几天后，使用间接ELISA对各个孔的细胞上清液再筛选特异性，以鉴定产生对人间皮素特异性IgG抗体的杂交瘤。用于杂交瘤二次筛选的间接ELISA方案，除了样品上清液来自hu IgG/hu κ或huIgG/huλ阳性培养基外，与上述测试Hco7x hu小鼠中血清抗体滴度所描述的方案相同。
通过连续稀释来克隆杂交瘤并且筛选两次。在克隆之前，使用过度生长的24-孔培养物上清液进行多表征测定(在下列实施例中描述)。选择十种抗体，使用体外克隆产生和纯化的抗体来证实它们的特征。选择三种抗体3C10(原克隆名：1382.210.3C10.1.6)、6A4(原克隆名：1382.210.6A4.1.6)和7B1(原克隆名：1382.210.7B1.2.18)，用于测序和进一步分析。
实施例2：抗体3C10、6A4和7B1的结构表征
编码实施例1中所述的3C10、6A4和7B1克隆表达的mAb的重链和轻链可变区的cDNA序列，使用标准DNA测序技术进行测序，并且表达的蛋白质通过标准蛋白质化学分析来表征。发现全部三种克隆均表达包含IgG1重链和κ轻链的抗体。
3C10的VH核苷酸和氨基酸序列分别显示在图1A和SEQ ID NO：25和19中。3C10的κVL核苷酸和氨基酸序列分别显示在图1B和SEQ ID NO：28和22中。
3C10重链免疫球蛋白序列与已知人种系免疫球蛋白重链序列的比较表明，3C10重链利用人种系VH 3-33的VH区段、人种系D3-10的D区段和人种系JH 4B的JH区段。使用确定CDR区的Kabat系统进一步分析3C10VH序列，绘制了重链CDR1、CDR2和CDR3区，如图1A和SEQID NO：1、4和7中分别所显示。
3C10轻链免疫球蛋白序列与已知人种系免疫球蛋白轻链序列的比较表明，3C10κ轻链利用人种系V L6的V区段和人种系JK 4的J区段。使用确定CDR区的Kabat系统进一步分析3C10V序列，绘制了轻链CDR1、CDR2和CDR3区，如图1B和SEQ ID NO：10、13和16中所分别显示。
6A4的VH核苷酸和氨基酸序列分别显示在图2A和SEQ ID NO：26和20中。6A4的VL核苷酸和氨基酸序列分别显示在图2B和SEQ ID NO：29和23中。
6A4重链免疫球蛋白序列与已知人种系免疫球蛋白重链序列的比较表明，6A4重链利用人种系VH 3-33的VH区段、人种系D3-10的D区段和人种系JH 4B的JH区段。使用确定CDR区的Kabat系统进一步分析6A4VH序列，绘制了重链CDR1、CDR2和CDR3区，如图2A和SEQ ID NO：2、5和8中所分别显示。
6A4轻链免疫球蛋白序列与已知人种系免疫球蛋白轻链序列的比较表明，6A4κ轻链利用人种系VK L6的Vk区段和人种系JK 4的J区段。使用确定CDR区的Kabat系统进一步分析6A4Vk序列，绘制了轻链CDR1、CDR2和CDR3区，如图2B和SEQ ID NO：11、14和17所分别显示。
7B1的VH核苷酸和氨基酸序列分别显示在图3A和SEQ ID NO：27和21中。7B1的VL核苷酸和氨基酸序列分别显示在图3B和SEQ ID NO：30和24中。
7B1重链免疫球蛋白序列与已知人种系免疫球蛋白重链序列的比较表明，7B1重链利用人种系VH 3-7的VH区段、人种系D3-10的D区段和人种系JH 6B的JH区段。使用确定CDR区的Kabat系统进一步分析7B1VH序列，绘制了重链CDR1、CDR2和CDR3区，如图3A和SEQ ID NO：3、6和9中所分别显示。
7B1轻链免疫球蛋白序列与已知人种系免疫球蛋白轻链序列的比较表明，7B1κ轻链利用人种系VK A27的Vk区段和人种系JK 2的J区段。使用确定CDR区的Kabat系统进一步分析7B1Vk序列，绘制了轻链CDR1、CDR2和CDR3区，如图3B和SEQ ID NO：12、15和18中所分别显示。
图4显示3C10和6A4重链可变氨基酸序列(分别为SEQ ID NO：19和20)与种系VH 3-33编码的氨基酸序列(SEQ ID NO：31)的比对。绘制了CDR1、CDR2和CDR3区。
图5显示3C10和6A4κ轻链可变氨基酸序列(分别为SEQ ID NO：22和23)与种系VK L6编码的氨基酸序列(SEQ ID NO：33)的比对。绘制了CDR1、CDR2和CDR3区。
图6显示7B1重链可变氨基酸序列(SEQ ID NO：21)与种系VH 3-7编码的氨基酸序列(SEQ ID NO：32)的比对。绘制了CDR1、CDR2和CDR3区。
图7显示7B1κ轻链可变氨基酸序列(SEQ ID NO：24)与种系VK A27编码的氨基酸序列(SEQ ID NO：34)的比对。绘制了CDR1、CDR2和CDR3区。
使用标准重组DNA技术，可以将3C10、6A4和7B1可变区转化成任何期望同种型的全长抗体。例如，编码VH和VL区的DNA可以克隆到携带重链和轻链恒定区的表达载体中，以便可变区可操作地连接到恒定区。备选地，单独的载体也可以用于表达全长重链和全长轻链。适用于产生全长抗体的表达载体的非限制性实例包括Black在US 2005/0153394中描述的pIE载体。
实施例3：间皮素单克隆抗体结合性质的表征
在该实施例中，通过流式细胞术来考察mAb 3C10、6A4和7B1对细胞表面间皮素的结合。此外，通过BIACORE分析来分析间对皮素的结合动力学。
A.流式细胞术研究
为测试抗体结合细胞表面间皮素蛋白的能力，将抗体与四种不同的表达间皮素的细胞一起温育：OVCAR3(ATCC名称HTB-161，人卵巢癌细胞系)、NCI-H226(ATCC名称CRL-5826，源自人肺的间皮瘤)、CFPAC-1(ATCC名称CRL-1918，人胰腺癌细胞系)以及KB(ATCC名称CCL-17，人口腔癌细胞系)。为了流式细胞术研究，将3C10、6A4和7B1单克隆抗体用冷1x PBS+0.1％BSA稀释至40μg/mL。为了结合反应，将50μl稀释的抗体溶液添加到50μl含有4×105个细胞的细胞悬浮液并且将混合物在冰上温育30-60分钟。然后用1x PBS+0.1％BSA洗涤细胞三次。添加R-藻红蛋白-标记的山羊抗-人IgG FγF(ab)2片段(JacksonImmunoResearch Labs，Cat.#109-116-098)的1∶50稀释液并且将混合物在冰上温育1小时，接着用冷1x PBS+0.1％BSA洗涤两次。在最终洗涤后，向每个溶液添加200μl冷1x PBS+0.1％BSA并且通过FACS进行抗体结合分析。
流式细胞术分析结果总结在下表1中，其显示了结合四种不同细胞系的EC50。结果表明，全部三种单克隆抗体均有效地结合细胞-表面人间皮素。
B.BIACORE分析
使用捕获方法，通过BIAcoreTM来考察3C10、6A4和7B1抗体结合重组可溶性间皮素his-融合蛋白。将3C10、6A4和7B1抗体每一种单独捕获在以高密度(4000RUs)包被蛋白质G(Pierce，Rockford，IL)的CM5芯片上。基于制造商推荐的标准固定方法来进行包被。在3C10、6A4或7B1纯化抗体捕获在蛋白质G上后，以25μL/mL的流速，在2分钟内将重组人间皮素His-融合蛋白的浓度系列(450、225、112.5、56和28nM)注射经过捕获的抗体。使抗原解离8分钟。将同种型对照在芯片上运行，并且将数据用于减去非特异性结合。所有分析均使用BIAcore Control软件v 4.01，在Biacore 2000或3000表面等离振子共振仪上进行。使用BiaEvaluationv4.01软件分析数据。
结果显示在下表2中。3C10、6A4和7B1的BIAcore结果证实了三种抗体均能够以高亲和性结合人间皮素这一流式细胞术结果。
为研究3C10、6A4和7B1mAb结合的表位，用BIAcore完成表位结合分析。使用标准胺偶联化学和Biacore提供的试剂盒，经由伯胺，将3C10和7B1mAb共价连接到CM5芯片(羧基甲基葡聚糖包被的芯片)。将抗体-抗原复合体的混合物流经固定的抗体。抗体浓度是起始于50和500nM之间的两倍稀释系列。间皮素浓度在22和44nM之间。在注射前，将抗体和间皮素预温育至少1小时。以6μl/分钟的流速注射抗体-抗原混合物(15uL)。具有重叠表位的抗体将在竞争中出局(随着抗体浓度增加，反应减少)，而具有不同表位的抗体将同时结合抗原(随着抗体浓度增加，反应增加)。结果是，3C10mAb结合与先前描述的小鼠抗间皮素mAb K1相同(或非常类似的)的表位。7B1mAb结合不同于3C10和K1的表位。6A4mAb能够阻断3C10和6A4结合重组间皮素。
实施例4：间皮素单克隆抗体稳定性的表征
在该实施例中，以化学解折叠和热稳定性分析来考察mAb 3C10、6A4和7B1的稳定性，如下。
通过利用荧光分光光度法测量化学变性中点来比较抗间皮素单克隆抗体稳定性。化学变性的荧光测量在装有Micromax读板器(SPEX，Edison，NJ)的SPEX Fluorolog 3.22上进行。测量在这样的抗体样品上进行：所述样品已放置在范围从0至6摩尔浓度的16种不同浓度的盐酸胍(GdHCL)PBS缓冲液溶液中平衡20小时。测量在黑色、小体积、非结合表面384-孔板(Corning，Acton，MA)中进行并且要求12μL孔体积中1μM抗体。在280nm下激发荧光并且在320和400nm之间测量发射光谱。扫描速度是每nm 1秒钟并且将狭缝设置成5nm带通。使用PBS作为缓冲液空白并自动从数据中减去。使用GraphPad Prism软件，将数据拟合至二态变性模型。结果表示成解折叠中点的GdHCl摩尔浓度，显示在下表3中。
抗间皮素单克隆抗体热稳定性通过抗体熔解温度的量热分析测定。
熔解温度(Tm)的量热测量在连接有自动取样器的VP-Capillary DSC差示扫描微量热计平台(MicroCal LLC，Northampton，MA，USA)上进行。通过以1℃/min的速度，在0.25mg/mL的浓度下，将样品从30加热到95℃，获得抗体的变性数据。将抗体样品置于pH 7.4的磷酸缓冲盐水(PBS)中。将相同的缓冲液用于参比池中，以通过比较得到摩尔热容量。使用软件Origin v7.0，基于非2-态模型对观察的温谱图进行基线校正和归一化数据分析。表示成温度(℃)的结果显示在下表4中，在所述温度下，观察到表明抗体熔解的峰。
上述结果表明，3C10、6A4和7B1抗体具有期望的化学和热稳定性性质。
实施例5：间皮素抗体的内化
在该实施例中，考察3C10、6A4和7B1抗体被表达间皮素的细胞内化的能力，如下。
在第一系列的分析中，Hum-ZAP测定用于考察抗体内化。在Hum-ZAP测定(从Advanced Targeting Systems，San Diego，CA商业购得的试剂盒)中，抗间皮素抗体与表达间皮素的细胞和连接于毒素肥皂草毒蛋白(核糖体失活蛋白)的山羊抗-人IgG抗体反应。在第一抗间皮素抗体内化后，肥皂草毒蛋白-连接的二抗也被摄入细胞中，在2-4天后导致蛋白合成抑制和最终细胞死亡。
更具体而言，将细胞在细胞培养基中稀释到5×104个细胞/mL。将50μl稀释的细胞添加到平底96孔组织培养板的每个孔中并在37℃、5％CO2培养箱中温育过夜。用培养基将抗体稀释成4μg/mL和0.4μg/mL的浓度。向培养的细胞添加25μl稀释的抗体，如此，最终抗体浓度为1μg/mL和0.1μg/mL。在添加25μl的8μg/mL Hum-zap试剂之前，将细胞和抗体温育10分钟。混合物在37℃、5％CO2下温育72小时。向每个孔添加100μlCelltiter-Glo(活力染料(viability dye))并且轻轻旋转2分钟。室温下10分钟后，在Promega Veritas Microplate Luminator上读板。
使用表达间皮素的细胞系NCI-H226、CFPAC-1和KB(实施例3中所述)作为靶细胞以及CHO细胞来进行Hum-ZAP测定，所述CHO细胞被转染而在细胞表面上表达经由GPI-连接的间皮素(CHO-间皮素)。结果定性地显示在下表5中：
N.D.＝未测定
Hum-ZAP测定结果表明，6A4抗体被所有四种细胞系内化。3C10和7B1抗体也被CHO-间皮素细胞内化。又进一步，3C10抗体被KB细胞内化，而与其它两种抗体相比，7B1抗体被KB细胞内化的程度较低。
在第二系列的分析中，使用免疫荧光测定，进一步考察NCI-H226细胞系对6A4抗体的内化。在该测定中，将NCI-H226生长到80％汇合。将粘连的细胞用细胞解离缓冲液(Cell Stripper)分开，将1.35×106个细胞转移到15ml锥形管中，用FACS缓冲液(PBS+2％胎牛血清)洗涤一次。在450μL体积的FACS缓冲液(PBS+2％胎牛血清)中，将细胞与20μg/mL的6A4抗体一起于4℃下温育30min，接着用冷FACS缓冲液洗涤。然后在FACS缓冲液中，用20μg/mL的检测抗体——连接罗丹明的山羊抗-人IgG抗体——在4℃将细胞染色30分钟，接着用冷FACS缓冲液洗涤。将该受体/抗体复合体进一步重悬浮在450μL FACS缓冲液中并且与所述细胞一起在37℃/5％CO2下温育特定的时间(0、5、10、15、30、60、120分钟，和过夜)，以允许内化。在指定的时间点，将50μL试样(相应于150,000个细胞)转移入96-孔板中并且用染色细胞表面的麦胚凝集素-Alexa Fluor488连接物(Invitrogen，Cat.#W11261)进行染色。将该细胞试样在冰上与FACS缓冲液中的10μg/mL WGA一起温育30分钟，接着用FACS缓冲液洗涤。最后，用FACS缓冲液洗涤细胞并且通过添加2％多聚甲醛进行固定，以及对于Alexa488和罗丹明，分别使用激发/发射波长495/519和554/570，通过荧光显微术对相关免疫荧光进行分析。结果表明，6A4mAb被NCI-H226细胞有效地内化。
实施例6：抗间皮素mAb对间皮素结合CA125的抑制
为测试抗间皮素抗体抑制间皮素结合CA125的能力，进行体外异型细胞粘附测定。在该测定中，考察抗体抑制OVCAR3细胞(表达CA125的卵巢癌细胞系)粘附CHO细胞的能力，所述CHO细胞被转染而在其细胞表面上表达间皮素(CHO-间皮素)。OVCAR3细胞(在实施例3中进一步描述)与CHO-间皮素细胞的粘附是通过间皮素与CA125相互作用来介导的。
为测试抗体抑制间皮素/CA125相互作用，在测定前24小时，将OVCAR细胞以4×104个细胞/200μl/孔接种于96-孔板中，以得到细胞的分汇合培养物。24小时后，除去培养基并且向孔中添加新鲜培养基，所述新鲜培养基含有1％牛血清白蛋白(BSA)加10μg/mL的抗体(3C10、7B1、6A4、同种型对照或无抗体)。将细胞在37℃、5％CO2下培养30分钟。将CHO-S(亲代细胞)和CHO-间皮素细胞与Calcein AM(6×106个细胞/mL，5μM)一起温育30分钟，用培养基洗涤，添加到OVCAR培养液中并且在37℃温育60分钟。
在温育后，将样品用PBS洗涤4次，以除去未粘附的细胞。通过添加100μl/孔PBS并且用Synergy-HT荧光读数器在494nm/517nm下读板，测量粘附的细胞。
结果阐明于图8中。结果显示，OVCAR3在不存在抗体的情况下粘附CHO-间皮素细胞，但不粘附在其细胞表面上不表达间皮素的对照CHO-S细胞。此外，3C10mAb或6A4mAb的存在与对照抗体(DT)相比，分别导致细胞粘附大约68.7％抑制或84.8％抑制。相反，7B1mAb不显示抑制间皮素与CA125相互作用的能力，这表明间皮素上7B1结合的表位(其不同于3C10和6A4表位)不阻断间皮素-CA125相互作用区。
实施例7：抗体依赖性细胞毒性
为测定抗体6A4在不存在效应细胞的情况下经过抗体依赖性细胞毒性(ADCC)杀死表达间皮素细胞的能力，使用荧光细胞毒性测定。将CHO细胞用作靶细胞，所述CHO细胞被转染来在其细胞表面(CHO-间皮素细胞)上表达间皮素的40kD膜结合部分。
如下从全血中制备人效应细胞。通过标准菲可帕可(Ficoll-paque)分离，从肝素化的全血中纯化人外周血单核细胞。将该细胞重悬浮在含有10％FBS(热灭活)和200U/mL人IL-2的RPMI1640培养基中，并且在37℃温育过夜。第二天，收集细胞并且在培养基中洗涤四次，以2×107个细胞/mL重悬浮。通过与BATDA试剂(Perkin Elmer，Wellesley，MA)以每1×106个靶细胞/mL 2.5μl BATDA于37℃温育20分钟，制备靶CHO-间皮素细胞。将靶细胞洗涤四次、离心(spun down)并且使最终体积为1×105个细胞/mL。
使用Delfia荧光发射分析，对CHO-间皮素细胞测试对人抗间皮素6A4单克隆抗体呈抗体特异性的ADCC，如下。将CHO-间皮素细胞(100μl标记的靶细胞，104个细胞/孔)与50μl效应细胞(106个细胞/孔)和50μl抗体(最终浓度10ug/mL)一起温育。在整个分析中，使用的靶细胞与效应细胞的比率为1∶100。在所有研究中，人IgG1同种型对照被用作阴性对照。将细胞以2000rpm离心并且37℃温育1小时。然后收集上清液、离心以及将20μl上清液转移到平底板，向其中添加180μl Eu溶液(Perkin Elmer，Wellesley，MA)并且在RubyStar读数器(BMG Labtech)中读数。裂解％计算如下：(样品释放-自发释放＊100)/(最大释放-自发释放)，其中自发释放是来自包含靶细胞加效应细胞的孔的荧光，而最大释放是来自包含靶细胞和已经用2％Triton-X处理的孔的荧光。
结果总结在下表6中，其以nM显示EC50。
结果证明，6A4单克隆抗体对在其细胞表面上表达间皮素的细胞系显示ADCC活性。
实施例8：抗间皮素mAb 6A4的体内肿瘤生长抑制
在该实施例中，考察6A4mAb作为裸抗体或作为细胞毒素连接物在体内抑制小鼠模型中肿瘤生长的能力。本文将6A4的细胞毒素连接物称为6A4-细胞毒素A，其由连接到细胞毒素A的6A4抗体组成。细胞毒素A细胞毒素及其制备进一步描述在WO 2008/083312中，其整个内容通过引用而明确并入本文。6A4-细胞毒素A连接物制备如下：
将抗体6A4浓缩成大约5mg/mL，缓冲液交换到100mM磷酸盐缓冲液、50mM NaCl、2mM DTPA pH 8.0中并且通过添加8至10-倍摩尔过量的2-亚氨基硫烷(2-Imminothiolane)在室温下硫醇化60分钟。在硫醇化后，将抗体缓冲液交换到50mM HEPES缓冲液，其含有5mM甘氨酸、2mM DTPA和0.5％Povidone(10K)pH 5.5。通过在324nM下测量硫代吡啶释放，用4，4”-二硫代二吡啶对硫醇化进行定量。在药物与硫醇的摩尔比3∶1下，通过添加含有药物细胞毒素A的马来酰亚胺来实现连接。在室温下温育60分钟，接着向反应混合物中添加摩尔比10∶1的N-乙基马来酰亚胺(NEM)与硫醇。在NEM存在的情况下温育后，将形成的连接物通过大小-排阻层析于Sephacryl-200柱上进行纯化，所述尺寸-排阻层析在50mM HEPES、5mM甘氨酸、100mM NaCl、pH 6.0中允许。合并含有单体抗体连接物的级分并且通过超滤来浓缩。抗体连接物浓度和取代率通过测量280和340nm处的吸光度来测定。
细胞毒素A具有下面显示的结构：
本领域的技术人员会意识到，尽管使用术语“细胞毒素”，但实际显示的结构包括适合的细胞毒素(配偶体分子)和用于将细胞毒素连接到抗体的接头部分，以及在连接物切割后，毒素以前体药物的形式释放，所述前体药物然后水解成适合的毒素(toxin proper)。因此，严格来说，本发明中连接物中的配偶体分子可以看做前体药物形式或适合的细胞毒素。
在第一系列的分析中，考察在小鼠异种移植模型中6A4和6A4-细胞毒素A对NCI-H226细胞(源自肺的间皮瘤；ATCC名称CRL-5826)生长的影响。在该异种移植模型中，以9×106个NCI-H226细胞/小鼠对SCID小鼠(CB17，来自Taconic，Germantown，NY)进行移植并且使NCI-H226细胞生长36天。在第40天——此时平均肿瘤体积是87mm3，将小鼠随机化并且用下列物质腹膜内(i.p.)处理：6A4(10mg/kg或30mg/kg)或6A4-细胞毒素A连接物(0.1μmol/kg)，以及对照：单独的载体(PBS，Q3Dx4)、同种型-匹配的人IgG1抗体(4A3)或连接到细胞毒素A细胞毒素的同种型-匹配的人IgG1抗体(iso-细胞毒素A)。
6A4抗体及其对照在第40、43、47和51天施用。6A4-细胞毒素A连接物及其对照在第40和64天施用。定期测量肿瘤体积直至第105天。图9A和9B分别显示在用单独的载体、6A4-细胞毒素A(0.1μmol/kg)、iso-细胞毒素A(0.1μmol/kg)、未连接的6A4和未连接的同种型对照(4A3)处理的小鼠的平均肿瘤体积和中间肿瘤体积。如所期望的那样，如果在本研究中采用的小鼠异种移植模型是免疫妥协的并且因此不期望引起强烈ADCC反应，用裸6A4抗体处理不显示对NCI-H226肿瘤细胞体积的影响(即，不抑制肿瘤生长)。相反，用6A4-细胞毒素A连接物处理明显抑制肿瘤生长，如图9A和9B中所说明。
在第二系列的分析中，考察在小鼠异种移植模型中6A4和6A4-细胞毒素A对HPAC细胞(人胰腺癌；ATCC名称CRL-2119)生长的影响。将HPAC个细胞(5×106个细胞/小鼠)植入CB17SCID小鼠中并且让其生长8天。在第8天——此时平均肿瘤体积为96mm3，将小鼠随机化并且用下列物质进行腹膜内(i.p.)处理：6A4(10mg/kg或30mg/kg)或6A4-细胞毒素A连接物(0.15μmol/kg)，以及对照：单独的载体(PBS，Q3Dx4)、同种型-匹配的人IgG1抗体(4A3；30mg/kg)或连接到细胞毒素A细胞毒素的同种型-匹配的人IgG1抗体(2A10-细胞毒素A；0.15μmol/kg)和未连接的6A4(8mg/kg)或等同蛋白剂量的未连接的同种型对照(2A10；8.7mg/kg，SD)。6A4抗体及其对照以Q3Dx4(每三天四次)的剂量方案施用。6A4-细胞毒素A连接物及其对照以单剂量(SD)的剂量方案施用。定期测量肿瘤体积直至第57天。
结果显示在图10A和10B的图中。图10A和10B分别显示用下列物质处理的小鼠中平均肿瘤体积和中间肿瘤体积：单独的载体、6A4-细胞毒素A(0.15μmol/kg)、同种型-匹配的连接物(2A10-细胞毒素A；0.15μmol/kg)、重量-相当的未连接的6A4(8mg/kg)、相当蛋白剂量的未连接同种型对照(2A10；8.7mg/kg)、裸6A4(10mg/kg或30mg/kg)或同种型-匹配的IgG1裸mAb(4A3；30mg/kg)。数据表明，即使不期望小鼠异种移植模型产生强烈的ADCC反应，用裸6A4抗体处理导致HPAC肿瘤细胞生长的抑制。还有，如同先前的实施例的情况，6A4-细胞毒素A连接物处理显示，非常有效地抑制HPAC肿瘤细胞生长。
在第三系列的分析中，考察在小鼠异种移植模型中6A4-细胞毒素A对源自卵巢癌的OVCAR3细胞(ATCC名称HTB-161)生长的影响。在该小鼠异种移植模型中，以每只小鼠5×106OVCAR3细胞对CB17SCID小鼠进行植入并且让OVCAR3细胞生长42天。在第42天，平均肿瘤体积为大约100mm3。用6A4-细胞毒素A连接物以0.1或0.3μmol/kg剂量腹膜内(i.p.)处理小鼠。作为对照，仅用载体(PBS，Q3Dx4)或用0.1或0.3μmol/kg连接到细胞毒素A的同种型-匹配的人IgG1抗体处理小鼠。
6A4-细胞毒素A连接物及其对照在第42、96、132和176天给予。如图11中所示，用6A4-细胞毒素A连接物处理明显抑制肿瘤生长。对于0.3μmol/kg剂量6A4-细胞毒素A，在整个该实施例中肿瘤生长得到控制，包括通过在第176天的最终剂量。采用0.1μmol/kg剂量6A4-细胞毒素A，肿瘤生长得到控制直至第150天。同种型对照对控制肿瘤无效(数据未显示)。
总之，6A4抗体的细胞毒素连接物(在0.1-0.15μmol/kg剂量下)在三种不同的异种移植小鼠模型中明显抑制体内肿瘤生长。
实施例9：非岩藻糖基化的6A4介导的ADCC
在该实施例中，显示非岩藻糖基化的6A4(6A4nf)抗体是肺癌和卵巢癌中ADCC的有效介体。Delfia荧光发射分析显示，在存在效应细胞的情况下，非岩藻糖基化的6A4经由ADCC杀死表达间皮素的H226(NSCLC)和OVCAR3(卵巢癌)细胞。首先，从全血中制备人效应细胞，如下：通过标准菲可帕可(Ficoll-paque)分离，从肝素化全血纯化人外周血单核细胞。将所述细胞重悬浮于含有10％FBS(热灭活)和200U/mL人IL-2的RPMI1640培养基中并且在37℃下温育过夜。第二天，收集细胞并且在培养基中洗涤四次，并且以2×107个细胞/mL重悬浮。
第二，通过将它们与BATDA试剂(Perkin Elmer，Wellesley，MA)温育，制备标记的H226或OVCAR3细胞。第三，将靶细胞与效应细胞和抗体混合。将100μl标记的靶细胞(104个细胞/孔)与50μl效应细胞(106个细胞/孔)和50μl抗体(最终浓度10μg/mL)温育。在整个分析中，使用的靶细胞与效应细胞比率为1∶100。将人IgG1(HuIgG1)同种型对照用作阴性对照，第四，对细胞裂解进行定量。将细胞以2000rpm离心并且37℃温育1小时。然后收集上清液，离心并且将20μl上清液转移至平底板。添加180μlEu溶液(Perkin Elmer，Wellesley，MA)并且在RubyStar读数器(BMGLabtech)中读数。裂解百分比计算如下：((样品释放-自发释放)×100)除以(最大释放-自发释放)，其中自发释放是来自含有靶细胞加效应细胞的孔的荧光，而最大释放是来自含有靶细胞和已用2％Triton-X处理的孔的荧光。使用非岩藻糖基化的6A4，对于OVCAR3细胞(图12a)和H226细胞(图12b)，观察到ADCC活性明显增加。
实施例10：非岩藻糖基化的6A4体内抑制肿瘤生长
在另一个实施例中，6A4nf联合吉西他滨明显减慢小鼠异种移植模型中H226细胞生长。以每只小鼠9×106个H226细胞对CB17SCID小鼠进行移植并且使其生长。在第23天，平均肿瘤体积为约100mm3。将小鼠随机化并且用6A4nf、80mg/kg吉西他滨、6A4nf加吉西他滨联合、载体对照或IgG1同种型对照进行腹膜内处理。以10mg/kg或30mg/kg给予6A4nf。6A4nf加吉西他滨的所有联合抑制H226生长。当联合吉西他滨以30mg/kg给予6A4nf时，达到最大抑制，并表现出剂量依赖效应。
实施例11：肿瘤细胞上的间皮素表达
使用抗体6A4的免疫组织化学被用于显示其结合人肿瘤的能力以及测定肿瘤中间皮素表达的范围。将6A4与FITC-标记的山羊抗人Fab抗体(Jackson#109-097-003)预复合，以便6A4的最终浓度为6ug/mL。然后用标准IHC方法将该复合体用于测定结合。显示6A4结合卵巢癌、胰腺癌、肺癌、间皮瘤和头颈癌。6A4结合头颈癌的另外的实例包括，来自会厌、喉、唾液腺、舌和扁桃体组织的癌症。
实施例12：6A4-细胞毒素A在猕猴中是无毒的
6A4-细胞毒素A显示在猕猴中是无毒的。这些动物显示类似于人的间皮素表达方式。还有，6A4抗体以与其结合人间皮素蛋白相同的亲和性结合猕猴间皮素蛋白。因此，猕猴适于评价6A4-细胞毒素A的目标毒性。
将6A4-细胞毒素A静脉内给予两只雄性和两只雌性猕猴。两次0.4μmol/kg剂量在第1和15天给予。观察动物行为改变、毒性病征并且抽取血液进行分析。动物不显示毒性作用的病征。
在第4、3、7、14、21和28天，抽取血液并且测量多个参数。没有观察到下列参数明显改变：白细胞、红细胞、血小板、网状细胞、嗜中性粒细胞百分率、淋巴细胞百分率、单核细胞百分率、嗜酸性粒细胞百分率、嗜碱性粒细胞百分率、未染色细胞百分率、血红蛋白、血细胞比容、mcv、mch、mchc、凝血酶原时间、apt、白蛋白、总蛋白、球蛋白、胆红素、尿素氮、肌酐、碱性磷酸酶、丙氨酸转移酶、天冬氨酸转移酶、谷氨酰转移酶、葡萄糖、胆固醇、钙、氯化物、磷、钾、钠和甘油三酯。
在第28天尸检后，在下列器官中没有观察到药物相关性改变：肾上腺、主动脉、胸骨、脑、盲肠、结肠、十二指肠、食道、眼、视神经、股骨、胆囊、心脏、回肠、空肠、肾、淋巴结、肝、淋巴结、mes(中脑)、肺、乳腺、坐骨神经、卵巢、胰腺、垂体、甲状旁腺、直肠、唾液腺、皮肤、骨骼肌、脾、胃、甲状腺、胸腺、脊髓、气管、膀胱、子宫、阴道、子宫颈、注射部位、输卵管、输尿管和淋巴集结。
序列表
<110>Medarex Inc.
     J·A·特雷特
     S·L·波格
     K·托伊
     L·杨
     C·拉奥-纳伊克
     B·陈
<120>结合间皮素的人抗体及其应用
<130>0192PC
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<141>2008-10-01
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<170>PatentIn版本3.5
<210>1
<211>5
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>1
Ile Tyr Gly Met His
1               5
<210>2
<211>5
<212>PRT
<213>智人
<400>2
Ile Tyr Gly Met His
1               5
<210>3
<211>5
<212>PRT
<213>智人
<400>3
Arg Tyr Trp Met Ser
1               5
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<211>17
<212>PRT
<213>智人
<400>4
Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser His Glu Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>5
<211>17
<212>PRT
<213>智人
<400>5
Val Leu Trp Tyr Asp Gly Ser His Glu Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
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Gly
<210>6
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<212>PRT
<213>智人
<400>6
Ser Ile Lys Gln Ala Gly Ser Glu Lys Thr Tyr Val Asp Ser Val Lys
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Gly
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<212>PRT
<213>智人
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<211>13
<212>PRT
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<212>PRT
<213>智人
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Glu Gly Ala Tyr Tyr Tyr Asp Ser Ala Ser Tyr Tyr Pro Tyr Tyr Tyr
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Tyr Tyr Ser Met Asp Val
            20
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<212>PRT
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Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala
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<210>12
<211>12
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<211>7
<212>PRT
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<212>PRT
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<211>7
<212>PRT
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<212>PRT
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Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Gln Tyr Thr
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<212>PRT
<213>智人
<400>19
Gln Val Tyr Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Ile Tyr
            20                  25                  30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser His Glu Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Leu Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Asp Gly Asp Tyr Tyr Asp Ser Gly Ser Pro Leu Asp Tyr Trp
            100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>20
<211>122
<212>PRT
<213>智人
<400>20
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Ile Thr Phe Arg Ile Tyr
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        35                  40                  45
Ala Val Leu Trp Tyr Asp Gly Ser His Glu Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
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Ala Arg Asp Gly Asp Tyr Tyr Asp Ser Gly Ser Pro Leu Asp Tyr Trp
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Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>21
<211>131
<212>PRT
<213>智人
<400>21
Glu Val His Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr
            20                  25                  30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Gln Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Ser Ile Lys Gln Ala Gly Ser Glu Lys Thr Tyr Val Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Ser
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Glu Gly Ala Tyr Tyr Tyr Asp Ser Ala Ser Tyr Tyr Pro Tyr
            100                 105                 110
Tyr Tyr Tyr Tyr Ser Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr
        115                 120                 125
Val Ser Ser
    130
<210>22
<211>107
<212>PRT
<213>智人
<400>22
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Leu
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105
<210>23
<211>107
<212>PRT
<213>智人
<400>23
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Leu
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105
<210>24
<211>108
<212>PRT
<213>智人
<400>24
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
            20                  25                  30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
        35                  40                  45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65                  70                  75                  80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Gln
                85                  90                  95
Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105
<210>25
<211>366
<212>DNA
<213>智人
<400>25
caggtgtacc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ccgggaggtc cctgagactc     60
tcctgtgcag cgtctggaat caccttcagt atctatggca tgcactgggt ccgccaggct    120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatggtatg atggaagtca tgaatactat    180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat    240
ctgctaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagatggc    300
gattattatg attcggggag tcctcttgac tactggggcc agggaaccct ggtcaccgtc    360
tcctca                                                               366
<210>26
<211>366
<212>DNA
<213>智人
<400>26
caggtgcacc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc     60
tcctgtgtag cgtctggaat caccttcagg atctatggca tgcactgggt ccgccaggct    120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt ttatggtatg atggaagtca tgaatactat    180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctatat    240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctatat attactgtgc gagagatggc    300
gattactatg attcggggag tcctcttgac tactggggcc agggaaccct ggtcaccgtc    360
tcctca                                                               366
<210>27
<211>393
<212>DNA
<213>智人
<400>27
gaggttcacc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc     60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttagt agatactgga tgagctgggt ccgccaggct    120
caagggaaag ggctggagtg ggtggccagc ataaagcaag ctggaagtga gaaaacctat    180
gtggactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtct    240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgttt attactgtgc gagggagggg    300
gcatattact atgattcggc gagttattac ccttactact actactacag tatggacgtc    360
tggggccaag ggaccacggt caccgtctcc tca                                 393
<210>28
<211>321
<212>DNA
<213>智人
<400>28
gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc     60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agctacttag cctggtacca acagaaacct    120
ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc    180
aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct    240
gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag cgtagcaact ggccgctcac tttcggcgga    300
gggaccaagg t ggagatcaa a                                             321
<210>29
<211>321
<212>DNA
<213>智人
<400>29
gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc     60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agctacttag cctggtacca acagaaacct    120
ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc    180
aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct    240
gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag cgtagcaact ggccgctcac tttcggcgga    300
gggaccaagg tggagatcaa a                                              321
<210>30
<211>318
<212>DNA
<213>智人
<400>30
gtgttgacgc agtctccagg caccctgtct ttgtctccag gggaaagagc caccctctcc     60
tgcagggcca gtcagagtgt tagcagcagc tacttagcct ggtaccagca gaaacctggc    120
caggctccca ggctcctcat ctatggtgca tccagcaggg ccactggcat cccagacagg    180
ttcagtggca gtgggtctgg gacagacttc actctcacca tcagcagact ggagcctgaa    240
gattttgcag tgtattactg tcagcagtat ggtagctcac agtacacttt tggccagggg    300
accaagctgg agatcaaa                                                  318
<210>31
<211>98
<212>PRT
<213>智人
<400>31
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg
<210>32
<211>98
<212>PRT
<213>智人
<400>32
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg
<210>33
<211>95
<212>PRT
<213>智人
<400>33
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
             20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro
                85                  90                  95
<210>34
<211>95
<212>PRT
<213>智人
<400>34
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
            20                  25                  30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
        35                  40                  45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65                  70                  75                  80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser
                85                  90                  95
<210>35
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>35
Asp Gly Asp Tyr Tyr Asp Ser Gly Ser Pro Leu
1               5                   10
<210>36
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<400>36
Asp Gly Asp Tyr Tyr Asp Ser Gly Ser Pro Leu
1               5                   10
<210>37
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>37
Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
1               5                   10
<210>38
<211>13
<212>PRT
<213>智人
<400>38
Glu Gly Ala Tyr Tyr Tyr Asp Ser Ala Ser Tyr Tyr Pro
1               5                   10
<210>39
<211>12
<212>PRT
<213>智人
<400>39
Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
1               5                   10
<210>40
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽连接物序列
<400>40
Ala Leu Ala Leu
1
<210>41
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽连接物序列
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>X＝β-丙氨酸
<400>41
Xaa Leu Ala Leu
1
<210>42
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽连接物序列
<400>42
Gly Phe Leu Gly
1
<210>43
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>肽连接物序列
<400>43
Leu Leu Gly Leu
1

Claims (8)

1.分离的人单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体结合人间皮素并且显示至少一种下列性质：
(a)以1x10-8M或更小的KD结合人间皮素；
(b)被表达间皮素的细胞的内化；
(c)抑制间皮素结合卵巢癌抗原CA125；
(d)对表达间皮素的细胞显示抗体依赖性细胞毒性(ADCC)；或
(e)当连接于细胞毒素时，在体内抑制表达间皮素的细胞的生长；
其中所述抗体包含
(a)如SEQ ID NO：2所示的重链可变区CDR1；
(b)如SEQ ID NO：5所示的重链可变区CDR2；
(c)如SEQ ID NO：8所示的重链可变区CDR3；
(d)如SEQ ID NO：11所示的轻链可变区CDR1；
(e)如SEQ ID NO：14所示的轻链可变区CDR2；和
(f)如SEQ ID NO：17所示的轻链可变区CDR3；
并且
其中其抗原结合部分是Fab片段、F(ab’)2片段、Fab’片段或Fv片段。
2.权利要求1所述的抗体，其包括：
(a)如SEQ ID NO：20的氨基酸序列所示的重链可变区；和
(b)如SEQ ID NO：23的氨基酸序列所示的轻链可变区。
3.组合物，其包含权利要求1所述的抗体或其抗原结合部分以及药学上可接受的载体。
4.抗体-配偶体分子连接物，其包含权利要求1所述的抗体或其抗原结合部分以及配偶体分子，其中所述配偶体分子是治疗剂并且所述配偶体分子通过化学接头缀合到所述抗体。
5.权利要求4的抗体-配偶体分子连接物的用途，用于制备治疗特征是表达间皮素的细胞的癌症的药物。
6.权利要求5所述的用途，其中所述癌症是间皮瘤、胰腺癌、卵巢癌、胃癌、肺癌或子宫内膜癌。
7.权利要求5所述的用途，其中所述癌症选自间皮瘤、乳头状浆液性卵巢腺癌、透明细胞卵巢癌、混合Mullerian卵巢癌、子宫内膜样粘液性卵巢癌、胰腺癌、胰腺导管腺癌、子宫浆液性癌、肺腺癌、肝外胆管癌、胃腺癌、食管腺癌、结肠直肠腺癌和乳腺癌。
8.分离的核酸分子，其编码权利要求1的分离的人单克隆抗体或其抗原结合部分。
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