CN101819319B - 使用菲涅尔双棱镜产生多层光片的荧光显微方法及装置 - Google Patents

Abstract

本发明提出了一种使用菲涅尔双棱镜产生多层光片的荧光显微方法及装置。装置包括平行光束、光片产生系统、样品池和图像采集系统。光片产生系统包括菲涅尔双棱镜，或由菲涅尔双棱镜、望远镜系统和相移玻璃片组成的系统；样品池放置在菲涅尔双棱镜后方，或相移玻璃片后方。由于平行光束经过菲涅尔双棱镜后会发生折射，在棱镜后的光束重叠区内会产生干涉场，从而得到多层光片光场。本发明解决了现有单层光显微技术照明不均匀、样品内穿透深度不大、图像采集速率慢的技术问题，所得到的多层光片光场具有很大的穿透深度，可应用于活体生物样品的荧光显微成像，且图像采集速率快。

Description

使用菲涅尔双棱镜产生多层光片的荧光显微方法及装置

技术领域

本发明涉及一种荧光显微方法及装置。

背景技术

在生命科学研究中，为了从微观上研究活体的生命活动，要求显微像成装置具有高时间和空间分辨率以及三维成像能力。活体光学显微成像近年来成为生物医学光学研究中最为活跃的领域之一。

荧光显微成像因其操作简便且直观而成为活体成像研究的一种理想方法。利用这种成像技术，可以实时观察荧光标记的基因及细胞在活体动物体内的活动及反应。荧光显微主要包括普通的宽视场(wide-field)荧光显微，激光共聚焦荧光显微以及多光子荧光显微。普通的宽视场荧光显微具有成像速度快，结构简单的优点，它使用白光源加滤光片作为激发光，并利用聚光镜或显微物镜本身将激发光聚集到样品上，样品被均匀照明，可使用目镜观察或CCD相机拍摄荧光图像，但由于整个样品都被激发并且没有光阑的限制，样品的离焦部分会带来很大的背景噪声，因此该技术不具有三维层析成像能力。激光共聚焦荧光显微技术采用点扫描技术将样品分解成二维或三维空间上的很多点，用高度聚焦的激光束逐点逐行扫描成像，激发出的荧光经过探测针孔滤波后被光电倍增管探测收集，并将信号输送到计算机，通过软件重新组合生成一个整体平面的或立体的像。由于只有在焦平面上的光才能穿过探测针孔，焦平面以外区域射来的光线不能通过针孔，所以激光共聚焦荧光显微技术可以实现高分辨率三维层析成像。多光子荧光显微与激光共聚焦显微在结构上非常类似，也是通过光束扫描实现三维成像，它利用的是荧光染料的多光子吸收特性，由于这种非线性光学效应只有在激光焦点处才能激发荧光，所以不需要探测针孔。多光子荧光显微的优点是它通常使用近红外波长的激光，因此在生物组织内具有比较大的穿透深度。但由于激光共聚焦显微和多光子荧光显微都采用点扫描的成像方式，因此成像速度比使用CCD相机的普通的宽视场荧光显微要慢很多，不能适用于某些要求高速实时观察的活体光学显微成像。另外，当荧光染料被过度激发后会失效，这就是光漂白效应(photobleaching)，激光共聚焦荧光显微和多光子荧光显微具有很强的光漂白效应，在共聚焦荧光显微中，探测针孔会挡住离焦部分的荧光信号而只让焦点处的荧光信号通过并被探测器接收，大部分的荧光信号不会被探测但是依然会对样品产生漂白作用(这种情况在3D成像时尤为明显)。多光子荧光显微利用荧光染料的多光子吸收发射荧光，这是一种非线性光学效应，需要很高的激光能量，因此对样品的光漂白作用会更加明显。这样一来，逐点扫描完整个样品有可能会产生严重的光漂白效应，而且有可能对活体生物组织带来损伤。

单层光显微(light sheet microscopy)这项最近才被提出的新技术能对毫米量级的活体样品进行实时荧光成像。如图1所示，单层光显微也是一种宽视场荧光显微技术，使用CCD采集图像，具有普通宽视场荧光显微成像速度快的优点，区别是它使用柱面透镜对平行光束聚焦，在柱面透镜的焦平面附近会产生一个近似于光片(light sheet)的光场分布。如果用来照射样品，只有位于光片内的荧光染料才能被激发，样品的其他部分没有被激发，因此也不会带来背景噪声。如果将这个光片在样品中垂直移动，并利用CCD相机同步采集激发的荧光图像，最后再通过软件重组，就可以得到整个样品的三维图像。单层光显微技术具备普通宽视场荧光显微技术不具备的三维层析成像能力，并且这种光片激发的照明方式更加合理地利用了激发光，也大大减弱了荧光漂白效应。该技术已经成功用于观察细小生物体和胚胎组织。有资料表明，在对胚胎组织的3D成像中，单层光片显微需要光能是共聚焦显微需要激光能量的1/10³，是多光子显微需要的激光能量的1/106。2008年，欧洲分子生物实验室(EMBL)的Stelzer小组使用单层光显微技术观察斑马鱼胚胎在24小时内的发育状况，并获得了数千个细胞的整体图像。

但是单层光显微技术也有其明显缺点，如图2(a)所示，由于采用柱面透镜聚焦，在柱面镜的焦平面处的光场分布并不是严格意义上的光片，它有一定的发散角，发散角的大小与柱面镜的焦距成反比。从图2(b)还可以看出，光片内的光强度分布也是不均匀的。另外，由于样品散射等原因，这个光片光场在样品内不会有很深的穿透距离，所以当样品比较大或者散射比较强的时候，就需要旋转样品从而得到不同角度的图像，最后再利用软件进行图像拼接，这样一来会减慢系统的图像采集速率。

发明内容

本发明提出了一种使用菲涅尔双棱镜产生多层光片的荧光显微方法及装置，解决了现有单层光显微技术照明不均匀、样品内穿透深度不大、图像采集速率慢的技术问题。

本发明的技术解决方案为：

第一种使用菲涅尔双棱镜产生多层光片的荧光显微方法，包括以下步骤：

步骤1]将一平行光束沿菲涅尔双棱镜的底面垂直入射，在菲涅尔双棱镜后方形成多层光片光场；

步骤2]经荧光染料标记的样品放置于多层光片光场中；

步骤3]上下移动显微物镜，CCD相机通过显微物镜采集样品不同深度的一系列二维切面图像并存储在计算机中。

第二种使用菲涅尔双棱镜产生多层光片的荧光显微方法，包括以下步骤：

步骤1]将一平行光束沿菲涅尔双棱镜的底面垂直入射，在菲涅尔双棱镜后方放置透镜L₁和透镜L₂，透镜L₁和透镜L₂组成望远镜系统，在透镜L₂后方形成多层光片光场；

步骤2]经荧光染料标记的样品放置于多层光片光场中；

步骤3]上下移动显微物镜，CCD相机通过显微物镜采集样品不同深度的一系列二维切面图像并存储在计算机中。

第三种使用菲涅尔双棱镜产生多层光片的荧光显微方法，包括以下步骤：

步骤1]将一平行光束沿菲涅尔双棱镜的底面垂直入射，在菲涅尔双棱镜后方放置透镜L₁和透镜L₂，透镜L₁和透镜L₂组成望远镜系统，在透镜L₂后方形成多层光片光场；

步骤2]经荧光染料标记的样品放置于多层光片光场中；

步骤3]改变望远镜系统的扩束比来改变多层光片的间距，上下移动显微物镜，CCD相机通过显微物镜采集样品不同深度的一系列二维切面图像并存储在计算机中。

第四种使用菲涅尔双棱镜产生多层光片的荧光显微方法，包括以下步骤：

步骤1]将一平行光束沿菲涅尔双棱镜的底面垂直入射，在菲涅尔双棱镜后方放置透镜L₁和透镜L₂，透镜L₁和透镜L₂组成望远镜系统，在透镜L₂后方放置一玻璃片，在玻璃片后方形成多层光片光场；

步骤2]经荧光染料标记的样品放置于多层光片光场中；

步骤31]上下移动显微物镜，CCD相机通过显微物镜采集样品不同深度的一系列二维切面图像并存储在计算机中；

步骤32]调节玻璃片与水平面之间的夹角，从而改变半个波长的相位差，再次上下移动显微物镜，CCD相机通过显微物镜采集样品不同深度的另一组二维切面图像并存储在计算机中；

步骤33]将两次获得的二维切面图像数据叠加处理，得到样品完整的三维荧光图像信息。

第五种使用菲涅尔双棱镜产生多层光片的荧光显微方法，包括以下步骤：

步骤1]将一平行光束沿菲涅尔双棱镜的底面垂直入射，在菲涅尔双棱镜后方放置透镜L₁和透镜L₂，透镜L₁和透镜L₂组成望远镜系统，在透镜L₂后方放置一玻璃片，在玻璃片后方形成多层光片光场；

步骤2]经荧光染料标记的样品放置于多层光片光场中；

步骤31]改变望远镜系统的扩束比来改变多层光片的间距，上下移动显微物镜，CCD相机通过显微物镜采集样品不同深度的一系列二维切面图像并存储在计算机中；

步骤32]调节玻璃片与水平面之间的夹角，从而改变半个波长的相位差，再次上下移动显微物镜，CCD相机通过显微物镜采集样品不同深度的另一组二维切面图像并存储在计算机中；

步骤33]将两次获得的二维切面图像数据叠加处理，得到样品完整的三维荧光图像信息。

一种使用菲涅尔双棱镜产生多层光片的荧光显微装置，包括平行光束、光片产生系统、样品池和图像采集系统，其特殊之处是：所述光片产生系统包括菲涅尔双棱镜，所述菲涅尔双棱镜的底面朝向平行光束，所述样品池放置在菲涅尔双棱镜后方的干涉区域。

上述荧光显微装置还可包括放置在菲涅尔双棱镜和样品池之间的透镜L₁和透镜L₂，所述透镜L₁和透镜L₂构成望远镜系统。

上述荧光显微装置还可包括放置在透镜L₂和样品池之间的玻璃片。

上述图像采集系统包括计算机以及依次设置在样品池上方的显微物镜、滤光片和CCD相机。

本发明的技术效果为：

1、本发明平行光束经过菲涅尔双棱镜后会发生折射，在棱镜后的光束重叠区内会产生干涉场，利用干涉极大从而得到多层光片光场。

2、由于本发明光场是通过两平行光束干涉形成，所以光片内的光强度是均匀分布的。并且强度是干涉前光强度的4倍。

3、本发明只要在两束光的干涉区域都会存在干涉极大，这样产生的光场就具有类似于贝塞尔光场的非衍射特性。当样品位于干涉光场内部时，不会由于样品的阻挡而使得样品后方的干涉极大消失，因此具有很大的穿透深度。

4、本发明具有很大的穿透深度，所以不需要像单层光片显微那样通过旋转样品和图像拼接来得到完整的三维图，图像采集速率快。

附图说明

图1为单层光片显微技术(light sheet microscopy)原理示意图；

图2为单层光片光场的强度分布示意图；

图3为使用菲涅尔双棱镜产生多层光片的原理示意图；

图4为多层光片光场的强度分布示意图；

图5为本发明原理图；

图6为使用菲涅尔双棱镜产生多层光片的荧光显微光路示意图；

图7为光片光场激发下中华大鼠卵巢(CHO)细胞的荧光图像；

图8为果蝇复眼的自发荧光显微三维图像最大值投影图像；

附图标记如下：1-激光器，2-扩束准直器，3-菲涅尔双棱镜，4-透镜L₁，5-透镜L₂，6-玻璃片，7-载物台，8-样品池，9-显微物镜，10-滤光片，11-CCD相机，12-计算机，13-平行光束，14-光阑，15-柱面透镜，16-适配镜。

具体实施方式

本发明提出了一种使用菲涅尔双棱镜产生多层光片的荧光显微装置，包括平行光束、光片产生系统、样品池和图像采集系统，光片产生系统包括菲涅尔双棱镜，菲涅尔双棱镜的底面朝向平行光束，样品池放置在菲涅尔双棱镜后方的干涉区域。在菲涅尔双棱镜和样品池之间还可放置透镜L₁和透镜L₂，透镜L₁和透镜L₂构成望远镜系统。为了实现光片移动的功能，还可在透镜L₂和样品池之间放置一个可转动的玻璃片。图像采集系统包括计算机以及依次设置在样品池上方的显微物镜、滤光片和CCD相机。

本发明还提出了一种使用菲涅尔双棱镜产生多层光片的荧光显微方法，包括以下步骤：

步骤1]将一平行光束沿菲涅尔双棱镜的底面垂直入射，在菲涅尔双棱镜后方形成多层光片光场；

步骤2]经荧光染料标记的样品放置于多层光片光场中；

步骤3]上下移动显微物镜，CCD相机通过显微物镜采集样品不同深度的一系列二维切面图像并存储在计算机中。

因为多层光片光场紧靠菲涅尔双棱镜，为了不影响显微物镜的调节和避免显微物镜和菲涅尔双棱镜相碰，可在菲涅尔双棱镜后方放置透镜L₁和透镜L₂，透镜L₁和透镜L₂组成望远镜系统，则多层光片光场形成于透镜L₂后方，这样极大地增加了系统的工作距离，方便了样品台及显微物镜等部件的放置。

在透镜L₂后放置一个玻璃片，玻璃片不会改变光束的角度但是会给参与干涉的两光束之间产生一个相位差。调节玻璃片与水平面之间的夹角，从而改变半个波长的相位差，此时再次上下移动显微物镜，CCD相机通过显微物镜采集样品不同深度的另一组二维切面图像并存储在计算机中；将两次获得的二维切面图像数据叠加处理，就可得到样品完整的三维荧光图像信息。

如果改变望远镜系统的扩束比来改变多层光片的间距，就可以改变光片的数量，从而改变二维切面图像采样的数量，这样就可以改变采集三维图像的轴向分辩率。

本发明原理：

如图3所示，平行光束经过菲涅尔双棱镜后会发生折射，在棱镜后的光束重叠区内会产生干涉场，干涉场的三维强度分布如图4所示，这就是要得到的多层光片光场(干涉极大)。由于光场是通过两平行光束干涉形成，可以证明光片内的光强度是均匀分布的，并且强度是干涉前光强度的4倍。本发明还有一个优点是，只要在两束光的干涉区域都会存在干涉极大，这样产生的光场就具有类似于贝塞尔光场的非衍射特性。当样品位于干涉光场内部时，不会由于样品的阻挡而使得样品后方的干涉极大消失，因此具有很大的穿透深度。不需要像单层光片显微那样通过旋转样品和图像拼接来得到完整的三维图。

干涉区的长度

$Z_{\max }=\frac{w_0}{\mathrm{\θ}}=\frac{w_0}{(n-1)\mathrm{\γ}}---\left(1\right)$

光片的间距

$\mathrm{\Δ}=\frac{\mathrm{\λ}}{2\sin \left((n-1)\mathrm{\γ}\right)}---\left(2\right)$

其中w₀是入射平行光束的半径，n是棱镜材料的折射率，是棱镜的底角，是激光波长。

由于实验中待测样品必须位于干涉区内，而干涉区的长度有限并且紧靠着菲涅尔双棱镜，所以实验中往往没有足够的空间来放置样品台，并且由公式(2)可以看出，一旦菲涅尔双棱镜的底角和激光波长固定，那么光片之间的间距Δ也就固定了，而在实际试验中常常需要改变光片间距。为此，在菲涅尔双棱镜后放置了一对透镜L₁和L₂来解决这个问题。如图5所示，L₁和L₂组成一个望远镜系统，利用几何光学原理可以得到：

$\frac{{\tan \mathrm{\θ}}_2}{{\tan \mathrm{\θ}}_1}=\frac{f_1}{f_2}---\left(3\right)$

从公式(3)可以看出，通过改变望远镜系统的扩束比f₂/f₁，可以改变两光束的夹角2₂，从而改变多层光片的间距。

利用图5中的几何关系还可以得到：

$Z_{\max }=\frac{h-(f_1+f_2)({\tan \mathrm{\θ}}_1+h/f_1)}{\tan \left({-\mathrm{\θ}}_2\right)}$

$Z_{\min }=\frac{h-(f_1+f_2)({\tan \mathrm{\θ}}_1+h/f_1)}{\tan \left({-\mathrm{\θ}}_2\right)}-\frac{f_2{w}_0}{f_1\tan \left({-\mathrm{\θ}}_2\right)}$

$\tan (-{\mathrm{\θ}}_2)={\tan \mathrm{\θ}}_1+\frac{h}{f_1}+\frac{h-(f_1+f_2)({\tan \mathrm{\θ}}_1+h/f_1)}{f_2}$

h＝w₀-d₁tanθ₁

θ₁＝(n-1)γ           (4)

其中，Z_max是光束干涉区最远端距离透镜L₂的距离；Z_min是光束干涉区最前端距离透镜L₂的距离；θ₁是入射平行光束通过菲涅尔双棱镜后的发散角；θ₂是从透镜L₂出射光线的发散角；f₁是透镜L₁的焦距；f₂是透镜L₂的焦距；d₁是菲涅尔双棱镜和透镜L₁之间的距离；h是光束入射到透镜L₁上的半径。

实施例：实验中选用底角＝5°的菲涅尔双棱镜，材料折射率n＝1.5，激光波长＝532nm，通过公式(2)可以得到光片的间距Δ＝6m，而显微物镜的景深通常小于6m，因此各光片之间没有串扰。入射激光束的半径w₀＝2mm，透镜L₁的焦距f₁＝75mm，透镜L₂的焦距f₂＝75mm，d₁＝5mm，带入公式(4)可得到Z_max＝141mm，Z_min＝107mm，这样极大地增加了系统的工作距离，方便了样品台及显微物镜等部件的放置。

在透镜L2后放置一个厚度为t的玻璃片，玻璃片不会改变光束的角度但是会给参与干涉的两光束之间产生一个相位差：

$\mathrm{\δ}=\frac{2\mathrm{\π}}{\mathrm{\λ}}(\frac{\mathrm{nt}}{\cos (\mathrm{\β}+{\mathrm{\θ}}_2)}-\frac{\mathrm{nt}}{\cos (\mathrm{\β}-{\mathrm{\θ}}_2)})---\left(5\right)$

通过旋转玻璃片倾角，可以改变两束干涉光的相位差，从而可以上下移动多层光片的空间位置，实现光片移动的功能。

本发明的工作方式：

本发明的具体实验光路如图6所示，探测光路与激发光路独立并且相互垂直。经荧光染料标记的样品放置于图中的阴影区内，通过双光束干涉可以在样品内产生多层光片光场，该光片光场会在样品内不同深度激发出荧光，上下移动显微物镜9可以得到样品不同深度的一系列二维切面图像，通过CCD相机11采集图像存入计算机12，并通过软件可以重新组合出样品的三维层析图像。如果考虑到光片之间的间距是光片厚度的2倍，其实这时只得到了一半的样品三维信息。通过转动玻璃片6，改变半个波长的相位差，可以使原来的干涉极小值位置变成干涉极大值，这样原来没有被光片光场激发的地方就可以被激发。这时再移动显微物镜9可以得到另一组二维切面图像，通过软件与前一组数据叠加，就可以得到样品完整的三维荧光图像信息。

本发明应用于活体生物样品的荧光成像：

图7是本发明装置对经过荧光染料碘化丙啶(Propidium iodide)标记的活体中华大鼠卵巢(CHO)细胞。实验中使用20X显微物镜，NA＝0.6，标尺20微米，激光器为倍频的YAG激光器，波长532nm。可以清楚地观察到被染色的细胞核以及染色体。由于使用光片照明方式，几乎没有背景噪声的干扰，图像对比度很高，CCD曝光时间0.05秒。本发明完全适用于活体生物体的成像研究。

另外，还使用本发明装置拍摄了果蝇复眼的自发荧光显微图像，果蝇复眼在532nm激光激发下可发出强烈的自发荧光，实验中拍摄了30张不同深度的二维荧光图像，并使用ImageJ软件进行了三维重建，图8是三维图像最大值投影图像的实验结果。实验中使用20X显微物镜，NA＝0.6，标尺20微米，激光器为倍频的YAG激光器，波长532nm。

Claims (5)

1.一种使用菲涅尔双棱镜产生多层光片的荧光显微方法，其特征在于：其包括以下步骤：

步骤1]将一平行光束(13)沿菲涅尔双棱镜(3)的底面垂直入射，在菲涅尔双棱镜(3)后方放置透镜L₁(4)和透镜L₂(5)，透镜L₁(4)和透镜L₂(5)组成望远镜系统，在透镜L₂(5)后方放置一玻璃片(6)，在玻璃片(6)后方形成多层光片光场；

步骤2]经荧光染料标记的样品放置于多层光片光场中；

步骤3]具体步骤如下：

步骤31]上下移动显微物镜(9)，CCD相机(11)通过显微物镜(9)采集样品不同深度的一系列二维切面图像并存储在计算机(12)中；

步骤32]调节玻璃片(6)与水平面之间的夹角，从而改变平行光束(13)半个波长的相位差，再次上下移动显微物镜(9)，CCD相机(11)通过显微物镜(9)采集样品不同深度的另一组二维切面图像并存储在计算机(12)中；

步骤33]将两次获得的二维切面图像数据叠加处理，得到样品完整的三维荧光图像信息。

2.一种使用菲涅尔双棱镜产生多层光片的荧光显微方法，其特征在于：

步骤1]将一平行光束(13)沿菲涅尔双棱镜(3)的底面垂直入射，在菲涅尔双棱镜(3)后方放置透镜L₁(4)和透镜L₂(5)，透镜L₁(4)和透镜L₂(5)组成望远镜系统，在透镜L₂(5)后方放置一玻璃片(6)，在玻璃片(6)后方形成多层光片光场；

步骤2]经荧光染料标记的样品放置于多层光片光场中；

步骤3]具体步骤如下：

步骤31]改变望远镜系统的扩束比来改变多层光片的间距，上下移动显微物镜(9)，CCD相机(11)通过显微物镜(9)采集样品不同深度的一系列二维切面图像并存储在计算机(12)中；

步骤32]调节玻璃片(6)与水平面之间的夹角，从而改变平行光束(13)半个波长的相位差，再次上下移动显微物镜(9)，CCD相机通(11)过显微物镜(9)采集样品不同深度的另一组二维切面图像并存储在计算机(12)中；

步骤33]将两次获得的二维切面图像数据叠加处理，得到样品完整的三维荧光图像信息。

3.一种使用菲涅尔双棱镜产生多层光片的荧光显微装置，包括平行光束(13)、光片产生系统、样品池(8)和图像采集系统，其特征在于：所述光片产生系统包括菲涅尔双棱镜(3)，所述菲涅尔双棱镜(3)的底面朝向平行光束(13)，所述样品池(8)放置在菲涅尔双棱镜(3)后方的干涉区域，所述荧光显微装置包括放置在菲涅尔双棱镜(3)和样品池(8)之间的透镜L₁(4)和透镜L₂(5)，所述透镜L₁(4)和透镜L₂(5)构成望远镜系统。

4.根据权利要求3所述的使用菲涅尔双棱镜产生多层光片的荧光显微装置，其特征在于：所述荧光显微装置包括放置在透镜L₂(5)和样品池(8)之间的玻璃片(6)。

5.根据权利要求4所述的使用菲涅尔双棱镜产生多层光片的荧光显微装置，其特征在于：所述图像采集系统包括计算机(12)以及依次设置在样品池(8)上方的显微物镜(9)、滤光片(10)和CCD相机(11)。

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