CN101779623B

CN101779623B - 一种卵母细胞/胚胎玻璃化冷冻保存方法及其冷冻载体

Info

Publication number: CN101779623B
Application number: CN2010101227917A
Authority: CN
Inventors: 朱士恩; 李俊杰; 王彦平; 侯云鹏
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2010-03-11
Filing date: 2010-03-11
Publication date: 2012-02-22
Anticipated expiration: 2030-03-11
Also published as: CN101779623A

Abstract

本发明涉及一种人体、动物或其局部的保存方法及其冷冻载体，尤其涉及一种卵母细胞/胚胎玻璃化冷冻保存方法及其冷冻载体。所述方法包括：冷冻液配制步骤、解冻液配制步骤、冷冻步骤和解冻步骤，其特征在于，所述冷冻步骤和解冻步骤中所用的冷冻载体为冷冻网，所述冷冻网包括：网体和网柄。本发明提供了一种操作简单、速度快、效率高的卵母细胞或胚胎玻璃化冷冻方法及其冷冻载体。

Description

一种卵母细胞/胚胎玻璃化冷冻保存方法及其冷冻载体

技术领域

本发明涉及一种人体、动物或其局部的保存方法及其冷冻载体，尤其涉及一种卵母细胞/胚胎玻璃化冷冻保存方法及其冷冻载体。

背景技术

自从Rall等(1985)发明胚胎玻璃化冷冻保存方法以来，使冷冻勿需借助冷冻仪，可在室温下进行操作，程序得到极大地简化。后经许多研究者的改进，目前卵母细胞/胚胎的玻璃化冷冻方法仅需1分钟左右即可完成一个程序。在此过程中，许多研究者创造性地发明了许多冷冻的承载物体，并被命名为多种方法。如今常用的主要有以下几种方法：尼龙环玻璃化法(Cryoloop)、开放式拉管法(OPS，Open Pulled Straw)、微细玻璃管法(GMP)、微滴法(Microdrops)、半细管法(hemi-straw)。

尼龙环玻璃化法(Cryoloop)是将卵母细胞/胚胎在低浓度冷冻液中处理，然后将卵母细胞/胚胎移到附有玻璃化液的尼龙环液膜(直径0.5-0.7mm)上，将环投入浸在液氮中的冷冻管内，具有降温速度快、冷冻损伤小的优点。但该方法一次冷冻卵母细胞/胚胎数量有限，且需要特殊的冷冻管固定装置才易于长期保存。

OPS法是丹麦人Vajta.G于1996年发明的一种快速降温的玻璃化冷冻保存方法，它使用拉得很细的薄壁塑料细管，利用毛细管的虹吸现象将极微量冷冻液滴连同卵母细胞/胚胎一起吸入毛细管内后直接投入液氮。该方法的优点是具有快速的升温和降温速率，从而减少冷冻损伤，操作更加简便，可迅速装管和解冻以及去除保护剂；卵母细胞/胚胎处于OPS管中，在少量的高浓度保护液中冻存，有利于减轻冷冻保护剂对卵母细胞/胚胎的毒性。但由于细管重量较轻冷冻时易漂浮在液氮面；另外细管管壁较薄，在液氮中极易断裂而造成卵母细胞/胚胎丢失，不利于卵母细胞/胚胎的长期保存。

微细玻璃管(GMP)法是由Kong等(2000)发明，它是将外径为1.00mm(内径0.8mm)的毛细玻璃管拉制成外径大约为0.3mm的玻璃细管(GMP)作为冷冻工具。其冷冻过程与OPS法相似，也是利用虹吸效应将卵母细胞/胚胎以及冷冻液装入GMP管中，然后直接投入液氮保存，解冻过程也与OPS法相同。该法的优点是GMP的直径比OPS的小，冷冻时吸入的冷冻液的量也少；又因其重量较大，能够克服OPS在冷冻时漂浮在液氮面上的欠缺。但该法最高冷却速率限制在20000℃/min左右，易造成卵母细胞/胚胎损伤；GMP在冷冻中容易断裂，造成卵母细胞/胚胎丢失；另外GMP的直径和体积很小，限制了一次冷冻卵母细胞/胚胎的数量；而且GMP的虹吸效果十分显著，这也增加了操作的难度。

微滴法(Microdrops)首先由landa等(1990)发明。在微滴法冷冻过程中，卵母细胞/胚胎在冷冻液中短时间平衡后，将含有卵母细胞/胚胎的冷冻小滴(体积约为6μL)，直接滴入液氮。然后用经液氮冷却过的镊子将颗粒集中到冷冻小瓶，置液氮罐中保存。解冻时，只需将冷冻颗粒直接投入一定的解冻液中，然后对卵母细胞/胚胎进行回收，并脱出抗冻保护剂。该法的优点是降温速度快，操作简便。但由于微滴法小滴在贮存过程中无法进行标识，不利于卵母细胞/胚胎的长期贮存。

vavdcrvorst等(2001)首先报道了半细管玻璃化冷冻法(hemi-straw)，该法是将0.25mL的细管末端用解剖刀切去大约1cm长，使其成为一个开口的末端，这样可以将含有卵母细胞/胚胎的冷冻液直接移入细管开口末端的内表面，移入液体的体积要尽可能小(1.0μL)。然后直接将细管垂直地投入液氮，而后移入放置在液氮中贴有标签的0.5mL冷冻管中保存。该法的优点是半细管使冷冻液直接与液氮接触极大地提高了冷冻速度，而且具有易于贮存的优点；缺点是操作较难，需要有操作熟练的技术人员，不太适用于初学者。

发明内容

本发明的目的是开发一种操作简单、速度快、效率高的卵母细胞或胚胎玻璃化冷冻方法及其冷冻载体。

为了达到上述目的，本发明提供了如下技术方案：

一种卵母细胞/胚胎玻璃化冷冻保存方法，包括：冷冻液配制步骤、解冻液配制步骤、冷冻步骤和解冻步骤，其特征在于，所述冷冻步骤和解冻步骤中所用的冷冻载体为冷冻网。

所述冷冻液配制步骤包括：配制冷冻预处理液：以PBS为基础液，加入乙二醇，配制成按体积比为5％～10％的乙二醇冷冻预处理液；和配置冷冻保存液：以PBS为基础液，加入聚蔗糖、蔗糖和乙二醇，配制成聚蔗糖按体积比为30％、蔗糖浓度为0.5mol/L、乙二醇按体积比为30％～40％的EFS30～40冷冻保存液。

所述冷冻保存液还包括：EDFS30～40、GFS30～50、EDT30～40或其他玻璃化冷冻液。

所述解冻液配置步骤为：以PBS为基础液，加入蔗糖，配制成0.3～0.5mol/L的蔗糖溶液。

所述冷冻步骤为：在室温20～25℃条件下，将卵母细胞/胚胎移入5％～10％的乙二醇冷冻预处理液中平衡30～60秒，然后移入EFS30～40玻璃化冷冻保存液中平衡25～30秒，经反复洗涤卵母细胞/胚胎，随后将含有卵母细胞/胚胎的玻璃化小液滴移到冷冻网上直接投入液氮冷冻保存。

所述解冻步骤为：将冷冻网由液氮中取出后直接浸入0.3～0.5mol/L的蔗糖溶液中，将回收后的卵母细胞/胚胎移入新鲜的蔗糖液滴中平衡5～10分钟后，再移入操作液中备用。

所述冷冻网包括：网体和网柄。

所述网体的孔径为40-100μm。

所述网体由金属、尼龙或其他材料制成；所述网柄由金属、塑料或其他材料制成。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：(1)成本低、操作简单，制作冷冻网的材料为细铜丝和塑料细管，材料来源广，价格低；操作过程中可在室温(20-25℃)下操作，避免了传统冷冻法中使用程序冷冻仪的高额费用及繁琐程序；(2)冷冻速度快、效率高，冷冻液可直接与液氮接触，减小了卵母细胞/胚胎的冷冻损伤；传统的OPS法、微细玻璃管法、尼龙环玻璃化法一次冷冻的卵母细胞或胚胎的数量较少，而本方法克服了此问题，并且冷冻效果与其他方法没有差异；(3)坚固耐用、可重复利用、便于贮存，卵母细胞或胚胎的承载物为特制的铜网，不会发生像OPS或GMP法中出现的因细管断裂而造成的丢失现象，并且卵母细胞/胚胎解冻后将铜网洗净可重复利用，可以节约成本；另外可在柄部对卵母细胞/胚胎的类别、数量加以标识，便于长期贮存。

附图说明：

图1为本发明所用冷冻网的示意图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行进一步阐述。

(1)EFS30～40玻璃化冷冻保存溶液、冷冻预处理液及解冻液。

①EFS30～40玻璃化冷冻保存溶液：以PBS为基础液，加入聚蔗糖、蔗糖和乙二醇，配制成聚蔗糖按体积比为30％、蔗糖浓度为0.5mol/L、乙二醇按体积比为30％～40％的EFS30～40冷冻保存液。

②冷冻预处理液为5％～10％的乙二醇(Ethylene glycol：EG)：以PBS为基础液，加入乙二醇，配制成按体积比为5％～10％的乙二醇冷冻预处理液。

③解冻液为0.3～0.5mol/L的蔗糖(Sucrose)溶液：以PBS为基础液配制成0.3～0.5mol/L的蔗糖溶液，作为解冻液。

(2)冷冻：在室温(20～25℃)条件下，将卵母细胞/胚胎移入5％～10％的乙二醇冷冻预处理液中平衡30～60秒，然后移入EFS30～40玻璃化冷冻保存液中平衡25～30秒，此时反复吹吸卵母细胞/胚胎，以促使预处理液和玻璃化冷冻保存溶液充分的渗入到卵母细胞/胚胎内部，随后将含有卵母细胞/胚胎的玻璃化小液滴移到冷冻网上直接投入液氮冷冻保存。

(3)解冻：将冷冻网由液氮中取出后直接浸入0.3～0.5mol/L的蔗糖溶液中，将回收后的卵母细胞/胚胎移入新鲜的蔗糖液滴中平衡5～10分钟后，再移入操作液中备用。

上述的EFS30～40可以用EDFS30～40、GFS30～50或EDT30～40代替，当然也可以选用其他玻璃化冷冻液。

本发明的核心在于提供了一种新型的冷冻载体——冷冻网并用于卵母细胞/胚胎的玻璃化冷冻保存和解冻。我们采用细铜丝和塑料细管制成孔径为40-100μm的铜网，如图1所示的冷冻网(Cryonet)，其包括网体和网柄两个部分，其材质可以都是铜，网柄的材质也可以是塑料，网体的材质也可以是尼龙，以提高胚胎和卵母细胞玻璃化冷冻保存效果。用本方法对427枚MII期小鼠卵母细胞进行玻璃化冷冻保存，回收413枚，回收率96.7％(413/427)；可用399枚，可用率96.6％(399/413)，解冻后对215枚卵母细胞进行IVF，卵裂178枚，卵裂率82.8％(178/215)，获囊胚93枚，囊胚率43.3％(93/215)。与OPS法冷冻相比，卵裂率(81.3％，52/64)和囊胚率(46.9％，30/64)均差异不显著。用本方法对小鼠的早期囊胚进行玻璃化冷冻保存，胚胎回收率96.0％(72/75)，可用68枚，可用率94.4％(68/72)，对6只小鼠进行移植，共有2只妊娠产仔。证明这种冷冻解冻方法是简便可行的。

最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围之中。

Claims

1.一种卵母细胞/胚胎玻璃化冷冻保存方法，包括：

冷冻液配制步骤、解冻液配制步骤、冷冻步骤和解冻步骤，其特征在于，所述冷冻液配制步骤包括：

冷冻预处理液配制：以PBS为基础液，加入乙二醇，配制成按体积比为5％～10％的乙二醇冷冻预处理液；

冷冻保存液配制：以PBS为基础液，加入聚蔗糖、蔗糖和乙二醇，配制成聚蔗糖按体积比为30％、蔗糖浓度为0.5mol/L、乙二醇按体积比为30％～40％的EFS30～40冷冻保存液；

所述解冻液配制步骤为：以PBS为基础液，加入蔗糖，配制成0.3～0.5mol/L的蔗糖溶液；

所述冷冻步骤为：在室温20～25℃条件下，将卵母细胞/胚胎移入5％～10％的乙二醇冷冻预处理液中平衡30～60秒，然后移入EFS30～40玻璃化冷冻保存液中平衡25～30秒，经反复洗涤卵母细胞/胚胎，随后将含有卵母细胞/胚胎的玻璃化小液滴移到冷冻网上直接投入液氮冷冻保存；

所述解冻步骤为：将冷冻网由液氮中取出后直接浸入0.3～0.5mol/L的蔗糖溶液中，将回收后的卵母细胞/胚胎移入新鲜的蔗糖液滴中平衡5～10分钟后，再移入操作液中备用；

其中，所述冷冻步骤和解冻步骤中所用的冷冻载体为冷冻网，冷冻网包括网体和网柄，网体的孔径为40-100μm。

2.如权利要求1所述的保存方法，其特征在于，

3.如权利要求1或2所述的保存方法，其特征在于，制作冷冻网的材料为细铜丝和塑料细管。