CN101413034B

CN101413034B - 高通量核酸分子克隆制备分子克隆芯片的方法

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Publication number: CN101413034B
Application number: CN2008102355830A
Authority: CN
Inventors: 周东蕊; 陆祖宏
Original assignee: Southeast University
Current assignee: Southeast University
Priority date: 2008-11-21
Filing date: 2008-11-21
Publication date: 2011-02-09
Anticipated expiration: 2028-11-21
Also published as: CN101413034A

Abstract

一种高通量核酸分子克隆制备分子克隆芯片的方法，制备步骤为：a.将待克隆核酸分子模板与核酸扩增反应体系试剂混合得扩增混合物溶液；b.向上述扩增混合物溶液中加入高分子化合物；c.溶液中加入两倍其体积的油相进行乳化，得到油包水的乳浊液；d.乳浊液置于PCR仪或恒温器中，进行核酸扩增反应；e.核酸扩增反应结束后，降低乳浊液温度，形成核酸分子克隆颗粒；f.分离出核酸分子克隆颗粒；g.核酸分子克隆颗粒随机分散在固相载体上，使溶液中的核酸扩增产物固定在固相载体上，在固相载体表面上形成核酸分子克隆阵列，由此得到克隆芯片。本发明改进了制备测序模板的，既能保证测序的高通量，又能降低测序的成本。

Description

高通量核酸分子克隆制备分子克隆芯片的方法

一、技术领域

本发明属于分子生物学中分子克隆技术领域，特别涉及一种高通量克隆核酸分子的方法，并将高通量克隆的分子分别固定在固相载体上，形成高通量的分子克隆芯片。

二、背景技术

现有技术：人类基因组(测序)计划已经完成，后基因组计划已步入实施。研究基因在生命过程中的功能，也就是功能基因组学，成为全世界生命科学工作者共同的课题。功能基因组研究的目的是要认识基因组中每个核酸的生物学含义，发现疾病易感基因。功能基因组的研究途径是比较基因组学，即通过比较和分析不同表型个体之间基因组序列差异，解码基因组中每个核酸的生物学意义，发现功能基因，识别与疾病相关的分子遗传信息。进一步地，根据个体基因组信息，实现疾病的预测、预防和个体化治疗。随着功能基因组研究的发展以及人们对提高医疗健康水平的不懈追求，“个体化医疗”已开始进入人们的生活。为了真正实现“个体化医疗”这一目标，首先要对每个人的基因组进行再测序，找出不同个体在DNA序列上的差异与不同疾病、发育等的相关性。采用目前的测序技术进行大规模个体全基因组DNA的测序，即对大量的人类个体的基因组DNA(包含有30亿碱基)进行再测序，其成本仍太高。这严重地限制了功能基因组的研究进展，影响到人类基因组计划的研究成果的应用。而对于目前的基因组测序成本而言，“个体化医疗”仍然是人类的一个遥远的梦想。因此，快速、经济地对大量个体全基因组进行测序成为当今挑战科学家的一项重大课题，人们急需发展出一些快速、廉价的个体化基因信息检测技术来解决目前所存在的问题。这有利于人们更加深入地从分子层次上认识生命过程的机理，从根本上认识疾病产生的根源，在分子层次上进行疾病的预测、诊断和治疗，将会使医学临床实践产生革命性的变化。

传统的测序方法，如1998年推出的ABI 3700 DNA自动化测序仪以及ABI

3730 DNA测序仪，测序时间长花费大。主要有两个原因，首先是模板制备。传统的模板制备方法是将待测基因组分成许多片断，然后将每个片断插入克隆载体，转化大肠杆菌后平板培养，挑取克隆，扩大培养后提取质粒，然后送测序仪测序。因为在挑取大肠杆菌克隆的过程中，每次挑取的克隆都很有限，而且操作烦琐，需要投入大量的人力物力和财力。其次是测序过程。由于测序样本都是单个克隆，每台机器一次只能测序96个样本，因此要测序30亿碱基的人类基因组序列，需要耗费大量的时间及测序用药品试剂，从而导致人类基因组测序时间长、耗费大，无法实现个体化测序。有人统计，采用ABI

3730 DNA测序仪测序，平均每个碱基的成本是0.008美元，完成一个30亿碱基的测序，需要150台ABI

3730 DNA测序仪运转一年，测序成本达到二千四百万美元。

在对传统基因测序方法进行改进的过程中，美国454公司首先推出了一种新的测序方法。该方法将DNA测序成本降至目前成本的1/100倍。该技术目前已成功进入市场化运作。该方法基于焦磷酸测序与高通量模板制备两个重要技术，其中高通量模板的制备对于成本的降低及测序速度的提高起了重要的决定性作用。该公司将微球固定技术、linker-PCR与乳液PCR技术相结合，能够通过一次PCR扩增，同时将大量的待测序模板克隆出来并固定在不同的微球个体上，然后再将单个微球固定在一个凹槽内，形成高密度的微球阵列，再进行高通量并行测序。该方法虽然将测序技术往前推进了一步，但仍然存在着一些问题，如模板制备较为烦琐，条件较难控制，成本较高等。而且该技术离生物科学家们提出的一千美元人类基因组测序的目标还有相当大的差距。在改进454测序技术的过程中，Solexa公司采用桥式PCR扩增与生物芯片技术制备测序模板，虽然他们这项技术也已成功上市，但成本仍然很高。Solexa公司制备的测序模板芯片通量虽然很高，但他们的制备的模板量极少，只能通过他们的四色荧光测序法才能实现高通量测序，但四色荧光测序成本极高，因此改进测序模板制备方法，既能实现高通量测序，又能适用于价格低廉的测序方法，是本发明的目的所在。

针对目前DNA测序模板制备的需要，本发明采用乳液核酸分子扩增法将待克隆分子扩增，扩增后将乳液颗粒凝固，然后分离出克隆颗粒，并将颗粒均匀分散在固相载体上，将每一个克隆产物固定在固相载体上。该发明改进了目前分子克隆的制备技术，可用于高密度基因芯片制作及全基因组测序模板的制备，具有十分重要的应用前景和使用价值。本发明不仅可用于高通量低成本测序模板的制备，同时还可以用于SNP检测以及DNA甲基化检测技术的改进，从而使人们能够获取大量的生物分子信息。

三、发明内容

技术问题：本发明针对上述技术缺陷，提供一种高通量核酸分子克隆制备分子克隆芯片的方法。改进了制备测序模板的，既能保证测序的高通量，又能降低测序的成本。

技术方案：一种高通量核酸分子克隆制备分子克隆芯片的方法，制备步骤为：a.将待克隆核酸分子模板与核酸扩增反应体系试剂混合得扩增混合物溶液，使得每微升扩增混合物溶液中含有的核酸模板分子数量为10⁶～10⁷，所述核酸扩增反应体系试剂中的引物5’端修饰有生物素、醛基、丙烯酰胺基或氨基化学基团；b.向上述扩增混合物溶液中加入高分子化合物，所述高分子化合物能够在降低温度或加热处理后使得溶液凝固成凝胶状；c.向步骤b所得溶液中加入两倍其体积的油相进行乳化，得到油包水的乳浊液，乳液颗粒的粒径为5μm±2.5μm，所述油相的体积比组成为95％矿物油、4.5％ Span 80、0.4％ Tween 80、0.1％ Triton-X-100；d.将步骤c所得乳浊液置于PCR仪或恒温器中，进行核酸扩增反应；e.核酸扩增反应结束后，降低乳浊液温度，直至上述乳浊液中的溶液凝固成颗粒，形成核酸分子克隆颗粒；f.将步骤e所得乳浊液中的油相去除，分离出核酸分子克隆颗粒；g.将步骤f所得核酸分子克隆颗粒随机分散在固相载体上，然后升高固相载体温度，直至核酸分子克隆颗粒溶解，使溶液中的核酸扩增产物固定在固相载体上，然后清洗去除高分子化合物，在固相载体表面上形成核酸分子克隆阵列，由此得到克隆芯片。

上述被克隆模板是单双链线形或单双链环形的DNA、RNA、PNA或LNA。

上述核酸扩增反应是乳液PCR扩增、乳液RT-PCR扩增或乳液滚环扩增。

上述核酸扩增反应溶液中加入的高分子化合物是淀粉、琼脂糖或丙烯酰胺。

上述固相载体是表面修饰了一层亲合素、氨基、丙烯酰胺硅烷或醛基化学基团的玻片或硅片。

上述乳化方法为震荡器震荡法、超声乳化法或高速搅拌法。

有益效果：本发明采用了微乳液核酸扩增反应，能够将大量的模板同时平行克隆扩增出来。本发明将核酸扩增溶液，如PCR扩增反应溶、滚环扩增溶液，与一定比例的油相混合液(矿物油、Span 80、Tween、Triton-X-100)混合，在超声波破碎作用下反应溶液形成微液滴，微液滴外面包裹一层油。在Span 80、Tween和Triton-X-100这些乳化剂的作用下这种油包水的微乳浊液较为稳定。每个乳液滴的直径大小可以通过调整超声波的强度改变，超声波功率越大，液滴直径越小。该发明将核酸扩增模板无限稀释，为了保一个微液滴内只有一个模板，许多微乳液滴内没有模板。然后该微乳浊在一定的温度变化循环或一定的温度下，液滴内的模板被大量扩增，但液滴之间的扩增产物彼此又没有交叉污染，因此大量的模板同时平行得到克隆扩增。

微乳液核酸扩增反应避免了某些基因扩增的偏向性和错误的基因重组。某些扩增反应，如普通PCR扩增，扩增产物具有较大的偏向性，其中较短的片断容易扩增，GC含量低的片断较容易被扩增，因此在大量片断扩增过程中，最终的反应液中小片断和GC含量低的片断较多，而大片断与GC含量高的片断较少。另外，许多模板一起扩增的过程中容易出现重组的现象，从而出现一些错误片断出来。该发明每个液滴内不含有或只含有一个模板，在扩增过程中不会出现上述错误现象。

该发明在微乳反应液中加入了琼脂等高分子化合物，在一定条件下该高分子化合物溶液能够凝固成颗粒；不加高分子化合物的溶液，进行低温处理后也使扩增反应液微液滴凝集成冰颗粒，这些颗粒可以通过萃取等方法将颗粒与油相分开。这是该发明非常关键与重要的一点内容。由于乳液滴在去除油相后将互相融合在一起，从而将每个克隆的产物混合在了一起无法分开。该发明在形成乳液之前，溶液内加入一定量的高分子化合物，如琼脂糖，形成高分子化合物溶液，在扩增反应结束后，通过降低温度等方法(见实施例2～4，其中每一个颗粒就是一个分子的克隆。也可以在溶液中不加高分子化合物，而是通过低温处理将水溶液变成冰颗粒(见实施例2～4)，从而将每个克隆分开。

该发明在微乳反应液中加入的高分子化合物在一定条件下可以溶解成溶液，从而使溶液中的扩增产物有机会固定在固相载体上。该发明在扩增反应液中加入的高分子化合物在一定条件下溶解在水里，变成水溶液，通过改变温度或其他条件，该高分子化合物可以发生凝固，形成凝胶或其他颗粒。一旦条件发生了改变，该颗粒又重新发生溶解，重新形成溶液状态，从而可以方便核酸的固定(如低熔点琼脂糖，见实施例2～4)。

该发明采用上述分子克隆颗粒能够制备出高质量的分子克隆核酸芯片。在该发明中，扩增反应所使用的一条引物或多条引物的5’端修饰了一个基团，如生物素，而固相载体表面也修饰了一个与引物修饰基团能够通过稳定的化学键相结合的基团。当分子克隆微粒与油相分开后，采用一定的方法(见实施例2～4)将微粒分散铺于固相载体上，然后改变温度或其他条件，使微粒熔化成水溶液颗粒，溶液中的核酸分子的5’端修饰的基团与固相载体上修饰的基团发生生物或化学反应，使带有修饰基团的核酸链固定在固相载体上，从而形成高通量的分子克隆芯片，以进行下一步的测序或杂交检测。由于。由于扩增反应是在每个微乳液滴中独立进行的，扩增产物之间没有交换过程；形成颗粒后，每个颗粒之间没有液体流动，也不会出现克隆之间的产物交换；在固相载体上固定过程中，每个点之间彼此都有一段距离，因此也行不成分子克隆之间的污染。在普通的微阵列芯片中由于在一个阵列点上要固定大量的同一核酸序列的片段作为检测探针，这些核酸片段的纯度，以及在制备过程中的污染将会直接影响的该阵列点的检测质量。在美国埃菲公司用微电子光刻工艺制备的高密度的核酸微阵列芯片，由于核酸原位化学合成的产率较低，在芯片的每个阵列点上将会有较多的合成错误的核酸探针，这将在很大的程度上影响该芯片杂交的检测准确性。

该发明采用上述分子克隆颗粒能够制备出高密度而且模板量较大的分子克隆核酸芯片，而且成本较低。采用微乳液扩增方法可以将微乳液颗粒制备成直径为几微米和纳米基的微粒，然后将微粒固定在固相载体上形成直径为几微米和几百纳米的点阵。该发明是采用液态分子扩增的方法来克隆核酸分子的，液态扩增效率比固相扩增效率高，能够使模板量极大的得以增加，而且扩增成本较低。这对于低成本但需要较大量测序模板的测序方法具有重要应用价值。

该发明内容包括乳液滚环扩增反应，滚环扩增具有恒温、高效、保真性能高、扩增无偏向性报导等特点。乳液滚环扩增反应是指将滚环扩增反应溶液与一定比例的油相混合乳化，形成乳浊液，每个待扩增的模板分别在不同的乳液颗粒中发生滚环反应，同时扩增出大量的分子克隆。该项技术是基于超支滚环扩增发展起来的一项高通量克隆制备技术。超支滚环扩增是在恒温条件下进行的，而且扩增效率极高，在相同时间内扩增产物量是PCR扩增产物的十几倍甚至几十倍，而PCR的扩增反应需要一个温度循环过程，所以需要一个PCR仪这种特殊的装置，而超支滚环扩增是在恒温条件下进行，只要有一个恒温的条件即可。超支滚环扩增采用Bst酶或phi29两种酶扩增，这两种酶由于它们的扩增方式与PCR扩增不同，因此具有较高的保真性。PCR扩增技术对于不同序列的核酸模板其扩增效率有很大的偏差，这极大地影响被测序基因组的测序覆盖率。而本发明采用的超支滚环扩增方法，对于不同的模板序列该方法已被证明没有扩增的偏向性。

本发明中制备的分子克隆，能够方便地制备出相应的单链分子克隆，可用于杂交、测序等应用。因为扩增产物的一条链的5’端修饰有一个基团，该基团能与固相载体上的另一个基团发生反应而将该条链固定在固相载体上，另一条链则可以通过变性的方法将其去除。剩下的一条单链，更加容易杂交与延伸检测。目前，有些公司，如美国454公司，采用微球与乳液PCR相结合的方法进行克隆制备，由于这项技术需要把两条引物都要进行固定，所以通过PCR反应后，微球上两条链都被固定下来，这样在延伸或杂交过程中难免会产生干扰。

四、附图说明

图1为工作原理图：其中a：扩增反应液与油相乳化后的乳浊液；b：扩增溶液凝固颗粒；c：修饰了一层活性基团的固相载体；d：颗粒溶解成溶液液滴或DNA分聚集到固相载体表面；e：固定在固相载体上的单链核酸克隆分子。1：扩增反应液与油相乳化成乳浊液后，在一定条件下进行相应的乳液扩增反应；2：去除油相物质，将溶液颗粒洗脱出来；3：将溶液颗粒随机的均匀分散在固相载体上；4：在一定条件下，将反应液颗粒溶解成溶液液滴，或者将DNA聚集在固相载体表面，然后克隆核酸分子与固相载体上的活性基团发生反应，将核酸分子牢固地固定在固相载体上；5：除去反应溶液及另一条没有固定的核酸分子。

图2为大量分子克隆固定在固相载体上杂交检测结果图，每个点的大小直径在1-10微米。

五、具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

一种高通量核酸分子克隆制备分子克隆芯片的方法，制备步骤为：a.将待克隆核酸分子模板与核酸扩增反应体系试剂混合得扩增混合物溶液，使得每微升扩增混合物溶液中含有的核酸模板分子数量为10⁶～10⁷，所述核酸扩增反应体系试剂中的引物5’端修饰有生物素、醛基、丙烯酰胺基或氨基化学基团；b.向上述扩增混合物溶液中加入高分子化合物，所述高分子化合物能够在降低温度或加热处理后使得溶液凝固成凝胶状；c.向步骤b所得溶液中加入两倍其体积的油相进行乳化，得到油包水的乳浊液，乳液颗粒的粒径为5μm±2.5μm，所述油相的体积比组成为95％矿物油、4.5％ Span 80、0.4％Tween 80、0.1％ Triton-X-100；d.将步骤c所得乳浊液置于PCR仪或恒温器中，进行核酸扩增反应；e.核酸扩增反应结束后，降低乳浊液温度，直至上述乳浊液中的溶液凝固成颗粒，形成核酸分子克隆颗粒；f.将步骤e所得乳浊液中的油相去除，分离出核酸分子克隆颗粒；g.将步骤f所得核酸分子克隆颗粒随机分散在固相载体上，然后升高固相载体温度，直至核酸分子克隆颗粒溶解，使溶液中的核酸扩增产物固定在固相载体上，然后清洗去除高分子化合物，在固相载体表面上形成核酸分子克隆阵列，由此得到克隆芯片。被克隆模板是单双链线形或单双链环形的DNA、RNA、PNA或LNA。核酸扩增反应是乳液PCR扩增、乳液RT-PCR扩增或乳液滚环扩增。核酸扩增反应溶液中加入的高分子化合物是淀粉、琼脂糖或丙烯酰胺。固相载体是表面修饰了一层亲合素、氨基、丙烯酰胺硅烷或醛基化学基团的玻片或硅片。乳化方法为震荡器震荡法、超声乳化法或高速搅拌法。

实施例2 采用乳液PCR扩增与琼脂糖凝胶颗粒固定制备核酸分子克隆阵列

具体的实施方案如下：

两边接有连接子的基因组扩增模板的制备：

基因组DNA的超声波处理：选取功率1200w超声波仪，将基因组DNA随机打断成200bp-600bp大小的基因片段。

基因组DNA片段两端与通用连接子连接：将超声波获取的随机片断纯化处理，去除一些小的和破碎的片断，然后分别采用T4多聚核苷酸激酶、T4DNA聚合酶、Klenow大片段DNA聚合酶I以及Taq聚合酶处理，使随机片段产生一个TA粘性末端，然后与一个通用连接子(linkerl：5’-GTCGGAGGCCAAGGCGGCCGT 3’linker2：5’-CGCCTTGGCCTCCGACT-3’)连接，使基因组片断两端连接上两个通用的连接子。

两边接有连接子的基因组在加有琼脂糖的乳液PCR中扩增与琼脂糖颗粒的纯化：

加有琼脂的乳液PCR扩增反应：在PCR反应体系30μl中，其中5’-生物素-ACGGCCGCCTTGGCCTCCGAC-3’作为引物加入20pmol，10×的缓冲液3μl，Mg²⁺ 1.8mmol/L，dNTPs200μmol/L，有效DNA模板量约为10⁷-10⁸拷贝，TaqDNA聚合酶1U，在该溶液中加入一定量的琼脂，达到1.5％的浓度(W/V)。同时制备一定量的油相物质，其中按体积分数计含有矿物油95％，Triton-X-1000.1％，Tween 800.4％，SP 80 4.5％，然后液体溶液与油相按照1：2混合，混合后将溶液在65℃条件下振荡与超声波乳化，乳化后的乳浊液(a)中的液滴大小平均约为5微米左右。将上述乳浊液分成两管，每管内含乳浊液45微升，置于Gene Amp 2400 PCR System上进行如下PCR扩增：95℃预变性5分钟，然后95℃变性1分钟，62℃复性1分钟，72℃延伸30秒，共35个循环，最后，72℃再延伸7分钟。

琼脂糖颗粒的纯化：将上述PCR扩增反应乳浊液置于4℃半小时，然后取出后在乳浊液(a)中加入2.5倍体积的乙醚，然后5000转离心10分钟，弃去上面的溶液，回收到的就是琼脂糖颗粒(b)，大部分琼脂糖颗粒中每个琼脂颗粒都含有一个模板分子的PCR克隆产物。

基片的表面亲合素修饰：

基片清洗：选择大小合适的低荧光背景的全反射玻片作为固相载体(c)，用洗衣粉清洗玻片的表面，然后用去离子水冲洗表面。将冲洗过的玻片置于盛有去离子水的烧杯，超声清洗1-2小时。将超声洗涤后的玻片放置在含有10％NaOH溶液的封闭的容器中浸泡30分钟。最后用去离子蒸馏水再次彻底清洗、烘干备用；

玻片的醛基化处理：将上述洗涤干净的载玻片用95％(V/V)乙醇与硅烷按49：1(体积比)配成的硅烷化试剂浸泡玻片30分钟，再用95％(V/V)乙醇清洗，双蒸水洗净，然后氮气吹干玻片，然后置于110℃烘干30分钟。将已氨基化处理的玻片用95％(V/V)乙醇浸泡摇洗5分钟后，双蒸水冲洗，吹干，用5％(V/V)的戊二醛浸泡2小时，然后用PB溶液清洗玻片，除去残余的戊二醛，95％(V/V)乙醇清洗，吹干备用。将适量的1mg/ml浓度的亲合素涂于上述戊二醛处理的玻片，置潮湿的培养皿中，4℃过夜处理。最后双蒸水冲洗，吹干，备用。这时候获得的玻片上修饰了一层亲合素(c)。

琼脂糖颗粒铺片与PCR产物固定：

琼脂糖颗粒铺片与PCR产物固定：将琼脂糖颗粒内加入水，其中琼脂糖质量与水体积之比为25：3，然后均匀分散于亲合素处理的玻片上，65-80℃条件下将琼脂糖凝胶颗粒溶解成颗粒溶解成溶液液滴(d)，然后在37℃条件下PCR产物固定2小时，然后用65-80℃双蒸水将琼脂糖洗掉。玻片上固定了许多个PCR产物点。

变性电泳法去除互补自由链：将固定有PCR产物的玻片取出后，置于变性电泳液(42％(W/V)的尿素溶液，其中溶剂为0.5×TBE)中电泳15分钟，取出后使用洗液(Tris·HCL 10mM，pH7.5；KCl 50mM，EDTA 2mM，0.01％Triton X-100(W/V))冲洗2次，然后用去离子水冲洗2～4次，氮气吹干后，4℃保存待用。此时的玻片上固定了许多单链的PCR产物簇(e)。

实施例3 采用乳液滚环扩增与丙烯酰胺颗粒固定制备核酸分子克隆阵列

具体的实施方案如下：

单链环形基因组扩增模板的制备：

基因组DNA的超声波处理：选取功率为1200W超声波仪，将基因组DNA随机打断成200bp-600bp大小的基因片段。

基因组DNA片段的通用连接子连接：将超声波获取的随机片断纯化处理，去除一些小的和破碎的片断，然后分别采用T4多聚核苷酸激酶、T4DNA聚合酶、Klenow大片段DNA聚合酶I以及Taq聚合酶处理，使随机片段产生一个TA粘性末端，然后与一个通用连接子(linkerl：5＇-磷酸-CTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGTT-3＇，linker2： 5’-ACCTGCCCGGGCGGCCGCTCGAGCCCTATAGTGAGTCGTATTAGT-3’)连接，形成一个双链的环，在外切酶I和外切酶III的作用下，形成单链环。

单链环形基因组扩增模板在加有丙烯酰胺的乳液滚环反应液中扩增与丙烯酰胺颗粒的纯化：

加有丙烯酰胺的乳液滚环扩增反应：在滚环反应体系25μl中，其中5’-生物素-(T)₁₀ ACCTGCCCGGGCGGCCGCTCGA-3＇，和 5＇-ACCTGCCCGGGCGGCCGCTCGA-3＇作为引物，每条引物的终浓度为0.8μM，有效模板量约为10⁷-10⁸个单链环，Bst DNA大片段聚合酶(0.2单位/μL反应液)，1×Bst DNA大片段聚合酶缓冲液、dNTP(800μM)，并加入丙烯酰胺形成5％(W/V)的丙烯酰胺溶液。同时制备一定量的油相物质，其中按照体积比含有矿物油95％，Triton-X-100 0.1％，Tween 80 0.4％，SP 80 4.5％，然后液体溶液与油相按照1：2混合，混合后将溶液在65℃条件下振荡与超声波乳化，乳化后的乳浊液(a)中的液滴大小平均约为5微米左右。将上述乳浊液分成两管，每管内含乳浊液37.5微升，50C条件下滚环20-24小时。

丙烯酰胺颗粒的纯化：将上述滚环扩增反应乳浊液置于4℃半小时，然后取出后在乳浊液(a)中加入2.5倍体积的乙醚，然后5000转离心10分钟，弃去上面的溶液，回收到的就是丙烯酰胺颗粒(b)，大部分丙烯酰胺颗粒中都含有一个模板分子的滚环扩增克隆产物。

基片的表面亲合素修饰：

玻片的醛基化处理：将上述洗涤干净的载玻片用95％(V/V)乙醇与硅烷按49：1(V/V)配成的硅烷化试剂浸泡玻片30分钟，再用95％(V/V)乙醇清洗，双蒸水洗净，然后氮气吹干玻片，然后置于110℃烘干30分钟。将已氨基化处理的玻片用95％(V/V)乙醇浸泡摇洗5分钟后，双蒸水冲洗，吹干，用5％(V/V)的戊二醛水溶液浸泡2小时，然后用PB溶液清洗玻片，除去残余的戊二醛，95％(V/V)乙醇清洗，吹干备用。将适量的1mg/ml浓度的亲合素涂于上述戊二醛处理的玻片，置潮湿的培养皿中，4℃过夜处理。最后双蒸水冲洗，吹干，备用。这时候获得的玻片上修饰了一层亲合素(c)。

丙烯酰胺颗粒铺片与滚环扩增产物固定：

丙烯酰胺颗粒铺片与滚环产物固定：将丙烯酰胺颗粒内加入稍量的水，然后均匀分散于亲合素处理的玻片上，加电场的条件下将丙烯酰胺凝胶颗粒中的DNA分子聚集到玻片表面(d)，然后在37℃条件下PCR产物固定2小时，然后用65-80℃双蒸水将丙烯酰胺去除。玻片上固定了许多个滚环产物点。

变性电泳法去除互补自由链：将固定有滚环产物的玻片取出后，置于变性电泳液(42％(W/V)的尿素溶液，其中溶剂为0.5×TBE)中电泳15分钟，取出后使用洗液(Tris·HCl 10mM，pH7.5；KCl 50mM，EDTA 2mM，0.01％Triton X-100(W/V))冲洗2次，然后用去离子水冲洗2-4次，氮气吹干后，4℃保存待用。此时的玻片上固定了许多单链的滚环扩增产物簇(e)。

实施例4 采用乳液滚环扩增与低温冰颗粒固定制备核酸分子克隆阵列

具体的实施方案如下：

单链环形基因组扩增模板的制备：

单链环形基因组扩增模板的乳液滚环扩增与低温冰颗粒的纯化：

乳液滚环扩增反应：在滚环反应体系25μl中，其中5’-生物素-(T)₁₀ACCTGCCCGGGCGGCCGCTCGA-3＇，和5＇-ACCTGCCCGGGCGGCCGCTCGA-3＇作为引物，每条引物的终浓度为0.8μM，有效环形DNA模板量约为10⁷-10⁸个单链环，Bst DNA大片段聚合酶(0.2单位/μL反应液)，1×Bst DNA大片段聚合酶缓冲液、dNTP(800μM)，同时制备一定量的油相物质，其中按体积比矿物油95％，Triton-X-100 0.1％，Tween 80 0.4％，SP 80 4.5％，然后液体溶液与油相按照1：2混合，混合后将溶液在65℃条件下振荡与超声波乳化，乳化后的乳浊液(a)中的液滴大小平均约为5微米左右。将上述乳浊液分成两管，每管内含乳浊液37.5微升，50℃条件下滚环20-24小时。

低温冰颗粒的纯化：将上述乳浊液置于-20℃条件下1小时，然后取迅速地在乳浊液(a)中加入2.5倍体积的-20℃预冷的乙醚，然后低温12000转离心2分钟，弃去上面的溶液，回收到的就是反应液冰颗粒(b)，大部分冰颗粒中每个冰颗粒中都含有一个模板分子的滚环扩增克隆产物。

基片的表面亲合素修饰：

玻片的醛基化处理：将上述洗涤干净的载玻片用95％(V/V)乙醇与硅烷按49：1(V/V)配成的硅烷化试剂浸泡玻片30分钟，再用95％(V/V)乙醇清洗，双蒸水洗净，然后氮气吹干玻片，然后置于110℃烘干30分钟。将已氨基化处理的玻片用95％乙醇浸泡摇洗5分钟后，双蒸水冲洗，吹干，用5％(V/V)的戊二醛水溶液浸泡2小时，然后用PB溶液清洗玻片，除去残余的戊二醛，95％(V/V)乙醇清洗，吹干备用。将适量的1mg/ml浓度的亲合素涂于上述戊二醛处理的玻片，置潮湿的培养皿中，4℃过夜处理。最后双蒸水冲洗，吹干，备用。这时候获得的玻片上修饰了一层亲合素(c)。

低温颗粒铺片与滚环扩增产物固定：

低温冰颗粒铺片与滚环产物固定：将冰颗粒迅速均匀分散于亲合素处理的玻片上，37℃条件下冰颗粒溶解成反应溶液液滴(d)，然后在37℃条件下PCR产物固定2小时，然后用双蒸水将反应液洗掉。这时玻片上固定了许多个滚环产物点。

变性电泳法去除互补自由链：将固定有滚环产物的玻片取出后，置于变性电泳液(42％(W/V)的尿素溶液，其中溶剂为0.5×TBE)中电泳15分钟，取出后使用洗液(Tris·HCl 10mM，pH7.5；KCl 50mM，EDTA 2mM，0.01％ TritonX-100(W/V))冲洗2次，然后用去离子水冲洗2-4次，氮气吹干后，4℃保存待用。此时的玻片上固定了许多单链的滚环扩增产物簇(e)。

Claims

1.一种高通量核酸分子克隆制备分子克隆芯片的方法，其特征在于制备步骤为：

a.将待克隆核酸分子模板与核酸扩增反应体系试剂混合得扩增混合物溶液，使得每微升扩增混合物溶液中含有的核酸模板分子数量为10⁶～10⁷，所述核酸扩增反应体系试剂中的引物5’端修饰有生物素、醛基、丙烯酰胺基或氨基化学基团；

b.向上述扩增混合物溶液中加入高分子化合物，所述高分子化合物能够在降低温度后使得溶液凝固成凝胶状；

c.向步骤b所得溶液中加入两倍其体积的油相进行乳化，得到油包水的乳浊液，乳液颗粒的粒径为5μm±2.5μm，所述油相的体积比组成为95％矿物油、4.5％ Span 80、0.4％ Tween80、0.1％ Triton-X-100；

d.将步骤c所得乳浊液置于PCR仪或恒温器中，进行核酸扩增反应；

e.核酸扩增反应结束后，降低乳浊液温度，直至上述乳浊液中的溶液凝固成颗粒，形成核酸分子克隆颗粒；

f.将步骤e所得乳浊液中的油相去除，分离出核酸分子克隆颗粒；

g.将步骤f所得核酸分子克隆颗粒随机分散在固相载体上，然后升高固相载体温度，直至核酸分子克隆颗粒溶解，使溶液中的核酸扩增产物固定在固相载体上，然后清洗去除高分子化合物，在固相载体表面上形成核酸分子克隆阵列，由此得到克隆芯片。

2.根据权利要求1所述的高通量核酸分子克隆制备分子克隆芯片的方法，其特征在于所述被克隆模板是单双链线形或单双链环形的DNA、RNA、PNA或LNA。

3.根据权利要求1所述的高通量核酸分子克隆制备分子克隆芯片的方法，其特征在于所述核酸扩增反应是乳液PCR扩增、乳液RT-PCR扩增或乳液滚环扩增。

4.根据权利要求1所述的高通量核酸分子克隆制备分子克隆芯片的方法，其特征在于所述核酸扩增反应溶液中加入的高分子化合物是淀粉、琼脂糖或丙烯酰胺。