CN101115836A - 用基质金属蛋白酶拮抗剂抑制her2脱落 - Google Patents

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Abstract

本申请描述了使用基质金属蛋白酶(MMP)尤其是MMP－15的拮抗剂来抑制HER2脱落。

Description

用基质金属蛋白酶拮抗剂抑制HER2脱落
此非临时申请，依据35 USC §119要求2005年2月9日提交的临时申请60/651,348的优先权，在此收入其完整公开内容作为参考。
发明领域
本发明关注使用基质金属蛋白酶(MMP)尤其是MMP-15的拮抗剂来抑制HER2脱落。
发明背景
受体酪氨酸激酶的HER家族是细胞生长、分化和存活的重要介质。该受体家族包括四个截然不同的成员，包括表皮生长因子受体(EGFR、ErbB1或HER1)、HER2(ErbB2或p185neu)、HER3(ErbB3)和HER4(ErbB4或tyro2)。
由erbB1基因编码的EGFR已经在原因上与人恶性肿瘤联系起来。具体而言，在乳腺癌、膀胱癌、肺癌、头癌、颈癌和胃癌以及成胶质细胞瘤中观察到EGFR表达升高。EGFR受体表达升高常常与同一肿瘤细胞的EGFR配体转化生长因子α(TGF-α)的产量升高有关，通过自分泌刺激途径导致受体活化。Baselga and Mendelsohn，Pharmac.Ther.64：127-154(1994)。针对EGFR或其配体TGF-α和EGF的单克隆抗体已经作为此类恶性肿瘤治疗中的治疗剂进行了评估。参见例如Baselga and Mendelsohn，见上文；Masui et al.，Cancer Research 44：1002-1007(1984)；Wu et al.，J.Clin.Invest.95：1897-1905(1995)。
HER家族的第二个成员p185neu最初鉴定为来自化学处理大鼠的成神经细胞瘤的转化基因的产物。neu原癌基因的活化形式源自所编码蛋白质跨膜区中的点突变(缬氨酸变成谷氨酸)。在乳腺癌和卵巢癌中观察到neu的人同系物的扩增，而且这与不良预后有关(Slamon et al.，Science 235：177-182(1987)；Slamon et al.，Science 244：707-712(1989)；美国专利第4,968,603号)。迄今为止，对于人肿瘤尚无与neu原癌基因中类似的点突变的报道。在其它癌中也已观察到HER2的过表达(频繁但不均一，原因在于基因扩增)，包括胃、子宫内膜、唾液腺、肺、肾、结肠、甲状腺、胰和膀胱的癌。参见King et al.，Science 229：974(1985)；Yokota et al.，Lancet 1：765-767(1986)；Fukushige et al.，Mol.Cell Biol.6：955-958(1986)；Guerin et al.，Oncogene Res.3：21-31(1988)；Cohen et al.，Oncogene 4：81-88(1989)；Yonemura et al.，Cancer Res.51：1034(1991)；Borst et al.，Gynecol.Oncol.38：364(1990)；Weiner et al.，Cancer Res.50：421-425(1990)；Kern et al.，Cancer Res.50：5184(1990)；Park et al.，Cancer Res.49：6605(1989)；Zhau et al.，Mol.Carcinog.3：254-257(1990)；Aasland et al.，Br.J.Cancer 57：358-363(1988)；Williams et al.，Pathobiology 59：46-52(1991)；McCann et al.，Cancer 65：88-92(1990)等等。HER2可在前列腺癌中过表达(Gu et al.，Cancer Lett.99：185-9(1996)；Ross etal.，Hum.Pathol.28：827-33(1997)；Ross et al.，Cancer 79：2162-70(1997)；Sadasivan et al.，J.Urol.150：126-31(1993))。
针对大鼠p185neu和人HER2蛋白质产物的抗体已有记载。
Drebin及其同事制备了针对大鼠neu基因产物p185neu的抗体。参见例如Drebin et al.，Cell 41：695-706(1985)；Myers et al.，Meth.Enzym.198：277-290(1991)；WO 94/22478。Drebin et al.，Oncogene 2：273-277(1988)报道了与p185neu的两个不同区域有反应性的抗体混合物对植入裸鼠的neu转化的NIH-3T3细胞产生协同抗肿瘤作用。还可参见1998年10月20日公告的美国专利第5,824,311号。
Hudziak et al.，Mol.Cell.Biol.9(3)：1165-1172(1989)描述了一组HER2抗体的生成，并使用人乳腺肿瘤细胞系SK-BR-3进行了表征。将SK-BR-3细胞暴露于抗体后72小时通过细胞单层的结晶紫染色测定了相对细胞增殖。利用此测定法，用称作4D5的抗体获得了最大抑制，它抑制细胞增殖达56％。该组其它抗体在此测定法中以较低程度降低细胞增殖。还发现抗体4D5使过表达HER2的乳腺肿瘤细胞系对TNF-α的细胞毒性作用敏感化。还可参见1997年10月14日公告的美国专利第5,677,171号。Hudziak等人的文章中所讨论的HER2抗体在下列文献中进行了进一步表征：Fendly et al.，CancerResearch 50：1550-1558(1990)；Kotts et al.，In Vitro 26(3)：59A(1990)；Sarup etal.，Growth Regulation 1：72-82(1991)；Shepard et al.，J.Clin.Immunol.11(3)：117-127(1991)；Kumar et al.，Mol.Cell.Biol.11(2)：979-986(1991)；Lewis etal.，Cancer Immunol.Immunother.37：255-263(1993)；Pietras et al.，Oncogene 9：1829-1838(1994)；Vitetta et al.，Cancer Research 54：5301-5309(1994)；Sliwkowski et al.，J.Biol.Chem.269(20)：14661-14665(1994)；Scott et al.，J.Biol.Chem.266：14300-5(1991)；D′souza et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.91：7202-7206(1994)；Lewis et al.，Cancer Research 56：1457-1465(1996)；Schaefer et al.，Oncogene 15：1385-1394(1997)。
鼠HER2抗体4D5的重组人源化型式(huMAb4D5-8、rhuMAb HER2、Trastuzumab或HERCEPTIN；美国专利第5,821,337号)在临床上对患有HER2过表达的转移性乳腺癌并已接受大量现有抗癌疗法的患者起作用(Baselga et al.，J.Clin.Oncol.14：737-744(1996))。Trastuzumab在1998年9月25日得到了美国食品和药品管理局的销售许可，可用于治疗其肿瘤过表达HER2蛋白质的转移性乳腺癌患者。
下列文献中记载了具有各种特性的其它HER2抗体：Tagliabue et al.，Int.J.Cancer 47：933-937(1991)；McKenzie et al.，Oncogene 4：543-548(1989)；Maier et al.，Cancer Res.51：5361-5369(1991)；Bacus et al.，MolecularCarcinogenesis 3：350-362(1990)；Stancovski et al.，PNAS(USA)88：8691-8695(1991)；Bacus et al.，Cancer Research 52：2580-2589(1992)；Xu et al.，Int.J.Cancer 53：401-408(1993)；WO 94/00136；Kasprzyk et al.，Cancer Research 52：2771-2776(1992)；Hancock et al.，Cancer Res.51：4575-4580(1991)；Shawveret al.，Cancer Res.54：1367-1373(1994)；Arteaga et al.，Cancer Res.54：3758-3765(1994)；Harwerth et al.，J.Biol.Chem.267：15160-15167(1992)；美国专利第5,783,186号；Klapper et al.，Oncogene 14：2099-2109(1997)。
同源性筛选使得HER受体家族的两个其它成员得以鉴定：HER3(美国专利第5,183,884和5,480,968号以及Kraus et al.，PNAS(USA)86：9193-9197(1989))和HER4(欧洲专利申请第599,274号；Plowman et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：1746-1750(1993)；Plowman et al.，Nature 366：473-475(1993))。这两种受体都在至少有些乳腺癌细胞系中展示出表达升高。
HER受体在细胞中通常以多种组合发现，而且认为异二聚化增加了对各种HER配体的细胞应答的多样性(Earp et al.，Breast Cancer Research andTreatment 35：115-132(1995))。EGFR结合6种不同配体：表皮生长因子(EGF)、转化生长因子α(TGF-α)、双调蛋白、肝素结合表皮生长因子(HB-EGF)、betacellulin和epiregulin(Groenen et al.，Growrh Factors 11：235-257(1994))。由单一基因的可变剪接产生的调蛋白蛋白质家族是HER3和HER4的配体。调蛋白家族包括α、β和γ调蛋白(Holmes et al.，Science256：1205-1210(1992)；美国专利第5,641,869号；Schaefer et al.，Oncogene 15：1385-1394(1997))；neu分化因子(NDF)；神经胶质生长因子(GGF)；乙酰胆碱受体诱导活性(ARIA)；及感觉和运动神经元衍生因子(SMDF)。有关综述参见Groenen et al.，Growth Factors 11：235-257(1994)；Lemke，G.，Molec.&Cell.Neurosci.7：247-262(1996)；Lee et al.，Pharm.Rev.47：51-85(1995)。最近鉴定了另外三种HER配体：神经调节蛋白-2(NRG-2)，据报道它结合HER3或HER4(Chang et al.，Nature 387：509-512(1997)；Carraway et al.，Nature 387：512-516(1997))；神经调节蛋白-3，它结合HER4(Zhang et al.，PNAS(USA)94(18)：9562-7(1997))；和神经调节蛋白-4，它结合HER4(Harari et al.，Oncogene 18：2681-89(1999))。HB-EGF、betacellulin和epiregulin也结合HER4。
尽管EGF和TGFα不结合HER2，但是EGF刺激EGFR和HER2形成异二聚体，它活化EGFR并导致异二聚体中HER2的转磷酸作用。二聚化作用和/或转磷酸作用似乎活化HER2酪氨酸激酶。参见Earp et al.，见上文。同样，当HER3与HER2共表达时，形成有活性的信号复合物，而针对HER2的抗体能够破坏此复合物(Sliwkowski et al.，J.Biol.Chem.269(20)：14661-14665(1994))。另外，在与HER2共表达时，HER3对调蛋白(HRG)的亲和力升高到更高的亲和力状态。关于HER2-HER3蛋白质复合物还可参见Levi et al.，Journal of Neuroscience 15：1329-1340(1995)；Morrissey et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：1431-1435(1995)；Lewis et al.，Cancer Res.56：1457-1465(1996)。HER4，与HER3类似，与HER2形成有活性的信号复合物(Carraway and Cantley，Cell 78：5-8(1994))。
图4中描绘了HER信号网络。
涉及HER抗体的专利出版物包括：US 5,677,171；US 5,720,937；US5,720,954；US 5,725,856；US 5,770,195；US 5,772,997；US 6,165,464；US6,387,371；US 6,399,063；US 2002/0192211 A1；US 6,015,567；US 6,333,169；US 4,968,603；US 5,821,337；US 6,054,297；US 6,407,213；US 6,719,971；US 6,800,738；US 2004/0236078 A1；US 5,648,237；US 6,267,958；US6,685,940；US 6,821,515；WO 98/17797；US 6,127,526；US 6,333,398；US6,797,814；US 6,339,142；US 6,417,335；US 6,489,447；WO 99/31140；US2003/0147884 A1；US 2003/0170234 A1；US 2005/0002928 A1；US 6,573,043；US 2003/0152987 A1；WO 99/48527；US 2002/0141993 A1；WO 01/00245；US 2003/0086924；US 2004/0013667 A1；WO 00/69460；WO 01/00238；WO01/15730；US 6,627,196 B1；US 6,632,979 B1；WO 01/00244；US 2002/0090662A1；WO 01/89566；US 2002/0064785；US 2003/0134344；WO 04/24866；US 2004/0082047；US 2003/0175845 A1；WO 03/087131；US 2003/0228663；WO 2004/008099 A2；US 2004/0106161；WO 2004/048525；US 2004/0258685A1；US 5,985,553；US 5,747,261；US 4,935,341；US 5,401,638；US 5,604,107；WO 87/07646；WO 89/10412；WO 91/05264；EP 412,116 B1；EP 494,135 B1；US 5,824,311；EP 444,181 B1；EP 1,006,194 A2；US 2002/0155527 A1；WO91/02062；US 5,571,894；US 5,939,531；EP 502,812 B1；WO 93/03741；EP554,441 B1；EP 656,367 A1；US 5,288,477；US 5,514,554；US 5,587,458；WO 93/12220；WO 93/16185；US 5,877,305；WO 93/21319；WO 93/21232；US 5,856,089；WO 94/22478；US 5,910,486；US 6,028,059；WO 96/07321；US 5,804,396；US 5,846,749；EP 711,565；WO 96/16673；US 5,783,404；US5,977,322；US 6,512,097；WO 97/00271；US 6,270,765；US 6,395,272；US5,837,243；WO 96/40789；US 5,783,186；US 6,458,356；WO 97/20858；WO97/38731；US 6,214,388；US 5,925,519；WO 98/02463；US 5,922,845；WO98/18489；WO 98/33914；US 5,994,071；WO 98/45479；US 6,358,682 B1；US 2003/0059790；WO 99/55367；WO 01/20033；US 2002/0076695 A1；WO00/78347；WO 01/09187；WO 01/21192；WO 01/32155；WO 01/53354；WO01/56604；WO 01/76630；WO02/05791；WO 02/11677；US 6,582,919；US2002/0192652 A1；US 2003/0211530 A1；WO 02/44413；US 2002/0142328；US 6,602,670 B2；WO 02/45653；WO 02/055106；US 2003/0152572；US2003/0165840；WO 02/087619；WO 03/006509；WO03/012072；WO03/028638；US 2003/0068318；WO 03/041736；EP 1,357,132；US2003/0202973；US 2004/0138160；US 5,705,157；US 6,123,939；EP 616,812 B1；US 2003/0103973；US 2003/0108545；US 6,403,630 B1；WO 00/61145；WO00/61185；US 6,333,348 B1；WO 01/05425；WO 01/64246；US 2003/0022918；US 2002/0051785 A1；US 6,767,541；WO 01/76586；US 2003/0144252；WO01/87336；US 2002/0031515 A1；WO 01/87334；WO 02/05791；WO 02/09754；US 2003/0157097；US 2002/0076408；WO 02/055106；WO 02/070008；WO02/089842；和WO 03/86467。
HER2胞外结构域(ECD)通过蛋白水解从培养的乳腺癌细胞脱落(Petchet al.，Mol.Cell.Biol.10：2973-2982(1990)；Scott et al.，Mol.Cell.Biol.13：2247-2257(1993)；Lee and Maihle，Oncogene 16：3243-3252(1998))，而且在有些癌症患者的血清中有找到(Leitzel et al.，J.Clin.Oncol.10：1436-1443(1992))。HER2 ECD可能是转移性乳腺癌的血清标志物(Leitzel et al.，J.Clin.Oncol.10：1436-1443(1992))，而且可能使得过表达HER2的肿瘤逃脱免疫学控制(Baselga et al.，J.Clin.Oncol.14：737-744(1997)；Brodowicz et al.，Int.J.Cancer 73：875-879(1997))。脱落HER2 ECD血清水平代表患有过表达HER2的转移性乳腺癌的患者中不良临床结果的独立标志物(Ali et aj.，Clin.Chem.48：1314-1320(2002)；Molina et al.，Clin.Cancer Res.8：347-353(2002))。
截短的HER2胞外结构域还是通过使用内含子内的聚腺苷酸化信号产生的2.3kb可变转录物的产物(Scott et al.，Mol.Cell.Biol.13：2247-2257(1993))。可变转录物首先在胃癌细胞系MKN7中得到鉴定(Yamamoto et al.，Nature 319：230-234(1986)；Scott et al.，Mol.Cell.Biol.13：2247-2257(1993))，截短的受体位于核周细胞质内，而非由这些肿瘤细胞分泌(Scott etal.，Mol.Cell.Biol.13：2247-2257(1993))。
还鉴定到了HER2的另一种可变剪接产物，称为“herstatin”(Doherty etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.96：10869-10874(1999)；Azios et al.，Oncogene 20：5199-5209(2001)；Justman and Clinton，J.Biol.Chem.277：20618-20624(2002))。该蛋白质的组成是来自胞外结构域的亚结构域I和II，随后是由内含子8编码的独特C-末端序列。
下面的观察结果提出了可能解释过表达HER2的肿瘤中的不良临床结果的另一种机制，即在有些过表达HER2的肿瘤细胞中，受体受到未知金属蛋白酶加工以产生截短的膜相关受体(有时称为“stub”，也称为p95)、和可溶性胞外结构域(也称为ECD、ECD105或p105)。
与其它HER受体一样，胞外配体结合结构域的丧失使得HER2胞内膜相关结构域成为组成性活性酪氨酸激酶。因此推定HER2 ECD的加工产生可将生长和存活信号直接投递至癌细胞的组成性活性受体。参见美国专利第6,541,214号(Clinton)和美国专利申请第2004/0247602A1号(Friedman et al.)。
Saez et al.，Clin.Cancer Res.12(2)：424-431(January，2006)报道了其肿瘤表达高水平p95的患者具有比没有此类肿瘤的患者显著更差的结果。p95水平现在只能通过Western印迹来测定。
发明概述
第一个方面，本发明关注用于抑制HER2脱落的方法，包括用有效抑制HER2脱落的量的基质金属蛋白酶(MMP)拮抗剂处理表达HER2的细胞。
另外，本发明提供了用于在哺乳动物中降低HER2胞外结构域(ECD)血清水平的方法，包括对哺乳动物施用在哺乳动物中有效降低HER2 ECD血清水平的量的基质金属蛋白酶(MMP)拮抗剂。
还有一个方面，提供了用于在哺乳动物中治疗癌症的方法，包括对哺乳动物施用有效治疗癌症的量的基质金属蛋白酶(MMP)拮抗剂。
同样，本发明关注用于在哺乳动物中治疗HER抑制剂抗性癌症的方法，包括对哺乳动物施用有效治疗癌症的量的基质金属蛋白酶(MMP)拮抗剂。
还有一个方面，本发明涉及用于降低细胞中p95 HER2水平的方法，包括将细胞暴露于有效降低p95 HER2水平的量的基质金属蛋白酶(MMP)拮抗剂。
本发明还关注诊断(或预后)方法，包括评估来自癌症患者的样品中的MMP-15(MT2-MMP)，其中升高的MMP-15水平或活性表明该患者具有升高的p95 HER2和/或脱落HER2血清水平，和/或将具有不良临床结果。优选的是，在该方法中评估MMP-15水平(蛋白质或核酸)并用于鉴定具有较差预后的患者或将具有较差临床结果的患者。任选的是，患者的癌症进一步展示出HER表达、扩增或活化，最优选HER2过表达或扩增。
附图简述
图1提供了全长HER2蛋白质结构的示意图及其胞外结构域的结构域I-IV(分别是SEQ ID NO.1-4)的氨基酸序列。
图2A和2B分别显示了trastuzumab轻链(图2A；SEQ ID No.5)和重链(图2B；SEQ ID No.6)的氨基酸序列。
图3A和3B显示了pertuzumab轻链(图3A；SEQ ID NO.7)和重链(图3B；SEQ ID NO.8)的氨基酸序列。CDR以粗体显示。轻链和重链的计算的分子量是23,526.22Da和49,216.56Da(半胱氨酸为还原形式)。碳水化合物模块(moiety)附着于重链的Asn 299。
图4描绘了HER信号网络。
图5图示了与非过表达的乳腺癌细胞系(MCF-7)相比，trastuzumab对来自过表达HER2的乳腺癌细胞系(SKBR3，MT474)的HER2 ECD脱落的抑制。
图6图示了MMTVHER2转基因肿瘤(f2:1282肿瘤，trastuzumab敏感的；和Fo5肿瘤，trastuzumab抵抗的)中p95 HER2和脱落的HER2 ECD水平的差异。
图7描绘了用于鉴定HER2脱落酶的策略。
图8图示了证实脱落酶具有金属蛋白酶特性的实验。
图9显示了MMTV-HER2肿瘤和细胞系中的MMP表达。MMP-15是用于解释trastuzumab敏感的f2:1282肿瘤和trastuzumab抵抗的Fo5肿瘤之间的差异的候选物。
图10反映了flag-HER2与MMP-15之间的相互作用。
图11显示了flagHER2-f2:1282和flagHER2-Fo5与MMP-15之间的相互作用。f2:1282与Fo5之间的差异不能由MMP-15突变体的差异结合来解释。
图12图示了在MMTVHER2转基因小鼠中发现的体细胞突变。所示序列是：脱落酶位点(SEQ ID NO.23)、野生型(WT)(SEQ ID NO.24)、剪接(SEQID NO.25)、Fo5(SEQ ID NO.26)和f2:3078.10(SEQ ID NO.27)。
图13描绘了体外脱落酶测定法的结果。gDHER29(DIV)-IgG是MMP-15、MMP-16、MMP-19和MMP-25的催化结构域的底物。蛋白酶消化的序列是MMP-15(SEQ ID NO.28)、MMP-16(SEQ ID NO.29)、MMP-19(SEQ ID NO.30)、MMP-25(SEQ ID NO.31)、所有其它(SEQ ID NO.32)；及用于HER2 ECDC-末端位点的(SEQ ID NO.33)。
图14图示了证实MMP-15不修剪其它HER受体的实验结果。证实跨膜结构域附近的序列变异的序列是HER2(SEQ ID NO.34)、EGFR(SEQ ID NO.35)、HER3(SEQ ID NO.36)、HER4(Jma)(SEQ ID NO.37)和HER4(Jmb)(SEQ ID NO.38)。
图15显示了MMP-15“全长”修剪HER2(+)-IgG。
图16展示了表明p95HER2组成性磷酸化但必须与HER3异二聚化以活化Akt的实验。
图17显示了MMP-15 RNA抑制剂(RNAi)在SKBR3和BT474细胞中降低HER2 ECD脱落和p95 HER2水平。
图18图示了SKBR3细胞中trastuzumab介导的生长抑制如何独立于对HER2脱落的抑制。
图19展示了Fo5异种移植肿瘤中对金属蛋白酶活性的抑制降低HER2脱落和抑制p95 HER2水平。
图20描绘了基质金属蛋白酶(MMP)家族的成员。MMP家族成员依照结构域结构分组。此图中所使用的缩写是：PRE，前结构域(pre-domain)；PRO，原结构域(pro-domain)；CAT，催化结构域；H，铰链；HEM，血红素结合蛋白结构域；F，弗林蛋白酶(furin)切割共有结构域；FN，纤连蛋白样结构域；GPI，糖磷脂酰肌醇锚；TM，跨膜结构域；Ig，免疫球蛋白样结构域；CA，半胱氨酸队列(array)；CL，胶原样结构域。
优选实施方案的详述
I.定义
术语“基质金属蛋白酶”或“MMP”在本文中指作为基质金属蛋白酶(MMP)超家族成员的蛋白质，其活性依赖Zn或Ca。MMP在本文中包括前蛋白原、成熟蛋白质及其变异形式。具有各种结构域的MMP的例子参见例如本文中的图20。MMP的综述有Wagenaar-Miller et al.，Cancer andMetastasis Reviews 23：119-135(2004)。
“膜束缚的MMP(membrane-tethered MMP)”或“MT-MMP”在本文中指如上定义的MMP，其中所述MMP能够经跨膜(TM)结构域或糖磷脂酰肌醇(GPI)锚附着于细胞膜。跨膜结构域锚定的MT-MMP的例子在本文中包括MT1-MMP(MMP-14)、MT2-MMP(MMP-15)、MT3-MMP(MMP-16)、MT5-MMP(MMP-24)。通过GPI锚锚定的MT-MMP的例子包括MT4-MMP(MMP-17)和MT6-MMP(MMP-25)。MMP-15是本文中优选的MT-MMP。
“MT2-MMP”和“MMP-15”在本文中同义，描述NCB1数据库中的前蛋白原NP_002415、包含其第132-699位氨基酸的成熟蛋白质、及其变异形式。MMP-15的已知底物包括胶原、纤连蛋白、CD44和补体。MMP-15在有些癌中上调，此蛋白酶的过表达增强肿瘤侵入和肿瘤细胞生长。
“MMP拮抗剂”指一定程度上结合和/或干扰至少一种MMP的蛋白水解活性的药剂。优选的是，MMP拮抗剂选择性结合或抑制MMP但不显著结合或抑制其它蛋白酶，诸如ADAM(解联蛋白(disintegrin)和金属蛋白酶)家族的蛋白酶。MMP拮抗剂的例子在本文中包括结合MMP的抗体、小分子抑制剂、模拟MMP底物的假肽、结合MMP的催化性锌的非肽分子、分离的MMP的天然组织抑制剂(TIMP)、核酸抑制剂诸如RNA或反义抑制剂、等。
“MT-MMP拮抗剂”指一定程度上结合和/或干扰至少一种MT-MMP的蛋白水解活性的药剂。优选的是，MT-MMP拮抗剂选择性结合或抑制MT-MMP但不显著结合或抑制其它蛋白酶(包括不是膜束缚的其它MMP)。MT-MMP拮抗剂的例子包括结合MT-MMP的抗体、小分子抑制剂、模拟MT-MMP底物的假肽、结合MT-MMP的催化性锌的非肽分子、MT-MMP的分离的天然组织抑制剂、MT-MMP核酸抑制剂诸如RNA或反义抑制剂、等。
“MMP-15拮抗剂”指一定程度上结合和/或干扰MMP-15的蛋白水解活性的药剂。优选的是，MMP-15拮抗剂选择性结合或抑制MMP-15但不显著结合或抑制其它蛋白酶(包括MMP-15以外的MMP)。MMP-15拮抗剂的例子包括结合MMP-15的抗体、小分子抑制剂、模拟MMP-15底物的假肽、结合MMP-15的催化性锌的非肽分子、MMP-15的分离的天然组织抑制剂、MMP-15核酸抑制剂诸如RNA或反义抑制剂、等。
“MMP水平升高”指生物学样品诸如肿瘤样品中MMP的量超过MMP的正常量，例如同一组织类型的正常或非肿瘤样品中的量。此类MMP(例如MMP-15)的正常量包括没有或检测不到的MMP-15的量。MMP水平升高可以多种方式测定，包括那些测量MMP蛋白质或MMP核酸的方式。
“HER受体”是属于HER受体家族的受体蛋白质酪氨酸激酶，包括EGFR、HER2、HER3和HER4受体。HER受体包括天然序列HER受体及其变体。优选的是，HER受体是天然序列人HER受体。
“全长”HER受体包含胞外结构域，它可结合HER配体和/或与另一HER受体分子二聚化；亲脂性跨膜结构域；胞内酪氨酸激酶结构域；和羧基末端信号结构域，它包含可磷酸化的几个酪氨酸残基。
术语“ErbB1”、“HER1”、“表皮生长因子受体”和“EGFR”在本文中可互换使用，指例如Carpenter et al.，Ann.Rev.Biochem.56：881-914(1987)中公开的EGFR，包括其变异形式(例如如Humphrey et al.，PNAS(USA)87：4207-4211(1990)中的删除突变体EGFR)。
表述“ErbB2”和“HER2”在本文中可互换使用，指例如Semba et al.，PNAS(USA)82：6497-6501(1985)和Yamamoto et al.，Nature 319：230-234(1986)中记载的人HER2蛋白(Genebank编号X03363)及其变异形式，诸如可变剪接形式(Siegel et al.，EMBO J.18(8)：2149-2164(1990))。
在本文中，“HER2胞外结构域”或“HER2 ECD”指HER2在细胞外的结构域，或是锚定在细胞膜上，或是在循环中，包括其片段。在一个实施方案中，HER2的胞外结构域可包含4个结构域：“结构域I”(大约第1-195位氨基酸残基；SEQ ID NO：1)、“结构域II”(大约第196-319位氨基酸残基；SEQ ID NO：2)、“结构域III”(大约第320-488位氨基酸残基；SEQ ID NO：3)和“结构域IV”(大约第489-630位氨基酸残基；SEQ ID NO：4)(残基编号不包括信号肽)。参见Garrett et al.，Mol.Cell.11：495-505(2003)；Cho etal.，Nature 421：756-760(2003)；Franklin et al.，Cancer Cell 5：317-328(2004)；Plowman et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.90：1746-1750(1993)，以及本文中的图1。
在本文中，“HER2脱落”指从表达HER2的细胞的细胞表面释放HER2的可溶性胞外结构域(ECD)片段。此类脱落可能是由细胞表面HER2的蛋白水解切割引起的，导致ECD片段从细胞表面释放，或者可溶性ECD或其片段可以由不同转录物编码。
“脱落HER2血清水平”指哺乳动物的血清或循环中存在的HER2 ECD的量。此类水平可通过多种技术评估，包括下列文献中所记载的：Ali et al.，Clin.Chem.48：1314-1320(2002)；Molina et al.，Clin.Cancer Res.8：347-353(2002)；1990年6月12日授权的美国专利第4,933,294号；1991年4月18日公开的WO 91/05264；1995年3月28日授权的美国专利第5,401,638号；Siaset al.，J.Immunol.Methods 132：73-80(1990)。
在本文中，“脱落HER2血清水平升高”指哺乳动物(例如人)血清中脱落HER2或HER2 ECD的量超过正常哺乳动物(例如人)血清中存在的量。HER2 ECD血清水平升高可能与晚期乳腺癌患者对内分泌疗法和化疗的预后不良和响应降低有关。
表述“p95 HER2”在本文中指NH2末端截短的HER2蛋白质。通常，p95是膜结合的残留(stub)片段，可能是由蛋白酶或脱落酶切割全长HER2产生的(Yuan et al.，Protein Expression and Putification 29：217-222(2003))。p95可具有约95,000的分子量且可磷酸化(Molina et al.，Cancer Research4744-4749(2001))。p95已经在有些乳腺癌样品中找到(Christianson et al.，Cancer Res.15：5123-5129(1998))。
“p95水平升高”指癌细胞中的p95水平超过正常水平，例如与该癌细胞同一组织类型的正常或非癌细胞中的水平。此类p95水平升高可能导致组成性信号(constitutive signaling)和结节性转移(nodal metastasis)(Molina et al.，Clin.Cancer Research 8：347-353(2002)；Christianson et al.，Cancer Res.15：5123-5129(1998))。
“评估”标志物，诸如MMP-15，指其诊断性和/或预后性分析，包括分析标志物的存在与否、测量其量、和/或分析其活性(例如活性升高)。
具有“不良临床结果”的癌症患者指具有不良预后的癌症患者，他不大可能响应癌症疗法，诸如化疗或使用HER2抗体诸如trastuzumab的疗法。临床结果可通过标准手段测量，诸如存活，包括没有疾病的存活等。
“ErbB3”和“HER3”指例如美国专利第5,183,884和5,480,968号以及Kraus et al.，PNAS(USA)86：9193-9197(1989)中公开的受体多肽，包括其变异形式。
术语“ErbB4”和“HER4”在本文中指例如欧洲专利申请第599,274号；Plowman et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：1746-1750(1993)；Plowman etal.，Nature 366：473-475(1993)中公开的受体多肽，包括其变异形式，诸如1999年4月22日出版的WO 99/19488中公开的同种型(isoform)。
“HER配体”指结合和/或活化HER受体的多肽。本文中特别感兴趣的HER配体是天然序列人HER配体，诸如表皮生长因子(EGF)(Savage et al.，J.Biol.Chem.247：7612-7621(1972))；转化生长因子α(TGF-α)(Marquardt et al.，Science 223：1079-1082(1984))；双调蛋白，又称为施旺细胞瘤(schwannoma)或角质形成细胞自分泌生长因子(Shoyab et al.，Science 243：1074-1076(1989)；Kimura et al.，Nature 348：257-260(1990)；Cook et al.，Mol.Cell.Biol.11：2547-2557(1991))；betacellulin(Shing et al.，Science 259：1604-1607(1993)；Sasada et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.190：1173(1993))；肝素结合表皮生长因子(HB-EGF)(Higashiyama et al.，Science 251：936-939(1991))；epiregulin(Toyoda et al.，J.Biol.Chem.270：7495-7500(1995)；Komurasaki etal.，Oncogene 15：2841-2848(1997))；α调蛋白(见下文)；神经调节蛋白-2(NRG-2)(Carraway et al.，Nature 387：512-516(1997))；神经调节蛋白-3(NRG-3)(Zhang et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.94：9562-9567(1997))；神经调节蛋白-4(NRG-4)(Harari et al.，Oncogene 18：2681-89(1999))；和cripto(CR-1)(Kannan et al.，J.Biol.Chem.272(6)：3330-3335(1997))。结合EGFR的HER配体包括EGF、TGF-α、双调蛋白、betacellulin、HB-EGF和epiregulin。结合HER3的HER配体包括调蛋白。能够结合HER4的HER配体包括betacellulin、epiregulin、HB-EGF、NRG-2、NRG-3、NRG-4和调蛋白。
“调蛋白”(HRG)在用于本文时指由调蛋白基因编码的多肽，如美国专利第5,641,869号或Marchionni et al.，Nature 362：312-318(1993)中所公开的。调蛋白的例子包括调蛋白-α、调蛋白-β1、调蛋白-β2和调蛋白-β3(Holmeset al.，Science 256：1205-1210(1992)；美国专利第5,641,869号)；neu分化因子(NDF)(Peles et al.，Cell 69：205-216(1992))；乙酰胆碱受体诱导活性(ARIA)(Falls et al.，Cell 72：801-815(1993))；神经胶质生长因子(GGF)(Marchionniet al.，Nature 362：312-318(1993))；感觉和运动神经元衍生因子(SMDF)(Hoet al.，J.Biol.Chem.270：14523-14532(1995))；γ-调蛋白(Schaefer et al.，Oncogene 15：1385-1394(1997))。
“HER二聚体”在本文中指包含至少两个HER受体的非共价结合二聚体。在表达两种或多种HER受体的细胞暴露于HER配体时可形成此类复合物，可通过免疫沉淀分离并通过SDS-PAGE，如例如Sliwkowski et al.，J.Biol.Chem.269(20)：14661-14665(1994)中所述的进行分析。此类HER二聚体的例子包括EGFR-HER2、HER2-HER3和HER3-HER4异二聚体。此外，HER二聚体可包含与不同HER受体诸如HER3、HER4或EGFR结合的两个或多个HER2受体。其它蛋白质，诸如细胞因子受体亚基(例如gp130)可与二聚体结合。
“展示出HER表达、扩增或活化”的细胞、癌或生物学样品是在诊断测试中表达(包括过表达)HER，具有扩增的HER基因，和/或以其它方式展现出HER受体活化或磷酸化的细胞、癌或生物学样品。此类活化可直接(例如通过测量HER磷酸化)或间接(例如通过基因表达制谱或通过检测HER异二聚体)测定。
“HER2受体过表达或扩增”的癌或肿瘤细胞是与同一组织类型的非癌细胞相比，具有显著更高水平的HER2蛋白质或基因的癌症。这样的过表达可以是由基因扩增或者转录或翻译增加引起的。可在诊断或预后测定法中通过评估细胞表面上存在的HER2蛋白质水平的升高(例如通过免疫组化测定法；IHC)来确定HER2的过表达或扩增。或者/另外，可测量细胞中的HER2核酸水平，例如通过荧光原位杂交(FISH；参见1998年10月公开的WO98/45479)、Southern印迹或聚合酶链式反应(PCR)技术，诸如定量实时PCR(qRT-PCR)。还可通过测量生物学流体诸如血清中的脱落HER2来研究HER2过表达或扩增(参见例如1990年6月12日公告的美国专利第4,933,294号；1991年4月18日公开的WO 91/05264；1995年3月28日公告的美国专利第5,401,638号；Sias et al.，J.Immunol.Methods 132：73-80(1990))。除了上述测定法之外，熟练从业人员还可利用多种体内测定法。例如，可将患者体内细胞暴露于任选用可检测标记物例如放射性同位素标记的抗体，并且可评估抗体与患者体内细胞的结合，例如通过放射活性外部扫描或通过分析取自事先已暴露于所述抗体的患者的活检。
相反，“HER受体不过表达或扩增”的癌或肿瘤细胞是与同一组织类型的非癌细胞相比，没有高于正常水平的HER受体蛋白质或基因的癌症。抑制HER二聚化的抗体，诸如pertuzumab，可用于治疗HER2受体不过表达或扩增的癌。
“HER抑制剂”指干扰HER活化或功能的药剂。HER抑制剂的例子包括HER抗体(例如EGFR、HER2、HER3或HER4抗体)；HER二聚化抑制剂；EGFR靶向药物；小分子HER拮抗剂；HER酪氨酸激酶抑制剂；HER2和EGFR双重酪氨酸激酶抑制剂，诸如lapatinib/GW572016；反义分子(参见例如WO 2004/87207)；和/或结合下游信号分子诸如MAPK或Akt或干扰其功能的药剂。优选的是，HER抑制剂是结合HER受体的抗体或小分子。HER抑制剂的具体例子包括trastuzumab、pertuzumab、cetuximab、ABX-EGF、EMD7200、gefitinib、erlotinib、CP724714、CI1033、GW572016、IMC-11F8和TAK165。
“HER二聚化抑制剂”指抑制HER二聚体形成的药剂。优选的是，HER二聚化抑制剂是抗体，例如在HER2的异二聚体结合位点结合HER2的抗体。本文中最优选的二聚化抑制剂是Pertuzumab或单克隆抗体2C4(MAb 2C4)。HER二聚化抑制剂的其它例子包括结合EGFR并抑制其与一种或多种其它HER受体二聚化的抗体(例如EGFR单克隆抗体806，MAb 806，它结合活化的或“未束缚的(untethered)”EGFR；参见Johns et al.，J.Biol.Chem.279(29)：30375-30384(2004))；结合HER3并抑制其与一种或多种其它HER受体二聚化的抗体；结合HER4并抑制其与一种或多种其它HER受体二聚化的抗体；肽二聚化抑制剂(美国专利第6,417,168号)；反义二聚化抑制剂；等。
“HER抗体”指结合HER受体的抗体。任选的是，HER抗体还干扰HER活化或功能。优选的是，HER抗体结合HER2受体。本文中特别感兴趣的HER2抗体是trastuzumab和pertuzumab。EGFR抗体的例子包括cetuximab、ABX0303、EMD7200和IMC-11F5。
“HER活化”指任何一种或多种HER受体的活化或磷酸化。通常，HER活化导致信号转导(例如由HER受体胞内激酶结构域引起的，磷酸化HER受体或底物多肽中的酪氨酸残基)。HER活化可由结合包含目的HER受体的HER二聚体的HER配体介导。结合HER二聚体的HER配体可活化二聚体中一种或多种HER受体的激酶结构域，由此导致一种或多种HER受体中酪氨酸残基的磷酸化和/或其它底物多肽，诸如Akt或MAPK胞内激酶中酪氨酸残基的磷酸化。
“磷酸化”指向蛋白质，诸如HER受体或其底物添加一个或多个磷酸基团。
“抑制HER二聚化”的抗体指抑制或干扰HER二聚体形成的抗体。优选的是，这样的抗体在HER的异二聚体结合位点结合HER2。本文中最优选的二聚化抑制性抗体是pertuzumab或MAb 2C4。抑制HER二聚化的抗体的其它例子包括结合EGFR并抑制其与一种或多种其它HER受体二聚化的抗体(例如EGFR单克隆抗体806，MAb 806，它结合活化的或“未束缚的(untethered)”EGFR；参见Johns et al.，J.Biol.Chem.279(29)：30375-30384(2004))；结合HER3并抑制其与一种或多种其它HER受体二聚化的抗体；及结合HER4并抑制其与一种或多种其它HER受体二聚化的抗体。
HER2上的“异二聚体结合位点”指形成二聚体时，与EGFR、HER3或HER4胞外结构域中某区域接触或形成介面的HER2胞外结构域中的区域。已发现所述区域在HER2的结构域II中。Franklin et al.，Cancer Cell 5：317-328(2004)。
HER2抗体可以是像trastuzumab那样“抑制HER2胞外域切割”的抗体(Molina et al.，Cancer Res.61：4744-4749(2001))，或者可以是像pertuzumab那样不显著抑制HER2胞外域切割(ectodomain)的抗体。
“结合HER2的异二聚体结合位点的”HER2抗体结合结构域II中的残基(且任选还结合HER2的胞外结构域以外的其它结构域，诸如结构域I和III中的残基)，且至少在一定程度上可在空间上阻碍HER2-EGFR、HER2-HER3或HER2-HER4异二聚体的形成。Franklin et al.，Cancer Cell 5：317-328(2004)表征了存放在RCSB蛋白质数据库(ID Code IS78)的HER2-Pertuzumab晶体结构，举例说明了结合HER2的异二聚体结合位点的例示性抗体。
“结合HER2的结构域II的”抗体结合结构域II中的残基和任选HER2的其它结构域，诸如结构域I和III中的残基。优选的是，结合结构域II的抗体结合HER2的结构域I、II和III之间的连接处。
“天然序列”多肽指与衍生自自然界的多肽(例如HER受体或HER配体)具有相同氨基酸序列的多肽。此类天然序列多肽可以从自然界分离，或者可通过重组或合成手段生成。如此，天然序列多肽可具有天然存在人多肽、鼠多肽、或来自任何其它哺乳类物种的多肽的氨基酸序列。
术语“抗体”在本文中以最广义使用，明确覆盖完整的单克隆抗体、多克隆抗体、由至少两种完整抗体形成的多特异性抗体(例如双特异性抗体)、及抗体片段，只要它们展现出期望的生物学活性。
术语“单克隆抗体”在用于本文时指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成群体的各个抗体相同和/或结合相同表位，除了生产单克隆抗体的过程中可能产生的可能变体外，而此类变体通常以极小量存在。此类单克隆抗体典型的包括包含结合靶物的多肽序列的抗体，其中结合靶物的多肽序列是通过包括从多种多肽序列中选择结合靶物的单一多肽在内的过程得到的。例如，选择过程可以是从多种克隆诸如杂交瘤克隆、噬菌体克隆或重组DNA克隆的集合中选择独特克隆。应当理解，选择的结合靶物的序列可进一步改变，例如提高对靶物的亲和力、将结合靶物的序列人源化、提高其在细胞培养物中产量、降低其在体内的免疫原性、创建多特异性抗体等，而且包含改变后的结合靶物的序列的抗体也是本发明的单克隆抗体。与典型的包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物不同，单克隆抗体制备物的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。在它们的特异性外，单克隆抗体制备物的优势在于它们未受到其它免疫球蛋白的污染。修饰语“单克隆”指示抗体从基本上同质的抗体群获得的特征，不应解释为要求通过任何特定方法来生成抗体。例如，将依照本发明使用的单克隆抗体可通过多种技术来生成，包括例如杂交瘤法(例如Kohler et al.，Nature 256：495(1975)；Harlow etal.，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，2nded.1988；Hammerling et al.，in：Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas，563-681，Elsevier，N.Y，1981)、重组DNA法(参见例如美国专利第4,816,567号)、噬菌体展示技术(参见例如Clackson et al.，Nature 352：624-628(1991)；Marks et al.，J.Mol.Biol.222：581-597(1991)；Sidhu et al.，J.Mol.Biol.338(2)：299-310(2004)；Lee et al.，J.Mol.Biol.340(5)：1073-1093(2004)；Fellouse，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 101(34)：12467-12472(2004)；Lee et al.，J.Immunol.Methods 284(1-2)：119-132(2004))、及用于在具有部分或整个人免疫球蛋白基因座或编码人免疫球蛋白序列的基因的动物中生成人或人样抗体的技术(参见例如WO 1998/24893；WO 1996/34096；WO 1996/33735；WO1991/10741；Jakobovits et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：2551(1993)；Jakobovits et al.，Nature 362：255-258(1993)；Bruggemann et al.，Year inImmuno.7：33(1993)；美国专利第5,545,806号；第5,569,825号；第5,591,669号(都授予GenPharm)；美国专利第5,545,807号；WO 1997/17852；美国专利第5,545,807号；第5,545,806号；第5,569,825号；第5,625,126号；第5,633,425号；第5,661,016号；Marks et al.，Bio/Technology 10：779-783(1992)；Lonberg et al.，Nature 368：856-859(1994)；Morrison，Nature 368：812-813(1994)；Fishwild et al.，Nature Biotechnology 14：845-851(1996)；Neuberger，Nature Biotechnology 14：826(1996)；Lonberg and Huszar，Intern.Rev.Immunol.13：65-93(1995))。
单克隆抗体在本文中明确包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们展现出期望生物学活性(美国专利第4,816,567号；Morrison et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA81：6851-6855(1984))。本文中感兴趣的嵌合抗体包括包含衍生自非人灵长类(例如旧大陆猴类(Old World Monkey)、猿等)的可变区抗原结合序列和人恒定区序列的“灵长类化”抗体。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选包含其抗原结合区。抗体片段的例子包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子；及由抗体片段形成的多特异性抗体。
“完整抗体”在本文中指包含两个抗原结合区及Fc区的抗体。优选的是，完整抗体具有一项或多项效应器功能。
根据其重链恒定区氨基酸序列，完整抗体可归入不同的“类”。完整抗体有五种主要的类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中有些可进一步分为“亚类”(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。将与抗体的不同类对应的重链恒定区分别称作α、δ、ε、γ和μ。不同类的免疫球蛋白的亚基结构和三维构造是众所周知的。
抗体“效应器功能”指那些可归于抗体Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)的生物学活性。抗体效应器功能的例子包括：Clq结合；补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体；BCR)下调；等。
“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”和“ADCC”指由细胞介导的反应，其中表达Fc受体(FcR)的非特异性细胞毒性细胞(例如天然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)识别靶细胞上结合的抗体，随后引起靶细胞溶解。介导ADCC的主要细胞，NK细胞，只表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。Ravetch and Kinet，Annu.Rev.Immunol.9：457-92(1991)第464页表3总结了造血细胞上的FcR表达。为了评估目的分子的ADCC活性，可进行体外ADCC测定法，诸如美国专利第5,500,362或5,821,337号中所记载的。可用于此类测定法的效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。或者/另外，可在体内评估目的分子的ADCC活性，例如在动物模型中，诸如Clynes et al.，PNAS(USA)95：652-656(1998)中所披露的。
“人效应细胞”指表达一种或多种FcR并行使效应器功能的白细胞。优选的是，该细胞至少表达FcγRIII并行使ADCC效应器功能。介导ADCC的人白细胞的例子包括外周血单个核细胞(PBMC)、天然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和嗜中性粒细胞，优选PBMC和NK细胞。效应细胞可以从其天然来源分离，例如血液或PBMC，如本文中所描述的。
术语“Fc受体”或“FcR”用于描述结合抗体Fc区的受体。优选的FcR是天然序列人FcR。此外，优选的FcR是结合IgG抗体的FcR(γ受体)，包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体，包括这些受体的等位变体和可变剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“活化受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)，它们具有相似的氨基酸序列，区别主要在于其胞质结构域。活化受体FcγRIIA在其胞质结构域中包含免疫受体基于酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其胞质结构域中包含免疫受体基于酪氨酸的抑制基序(ITIM)(参见综述
Figure A20068000447200221
，Annu.Rev.Immunol.15：203-234(1997))。FcR的综述参见Ravetch and Kinet，Annu.Rev.Immunol.9：457-492(1991)；Capel et al.，Immunomethods 4：25-34(1994)；de Haas et al.，J.Lab.Clin.Med.126：330-41(1995)。术语“FcR”在本文中涵盖其它FcR，包括那些未来将会鉴定的。该术语还包括新生儿受体，FcRn，它负责将母体IgG转移给胎儿(Guyer et al.，J.Immunol.117：587(1976)和Kim et al.，J.Immunol.24：249(1994))及调控免疫球蛋白的动态平衡。
“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”指在存在补体时分子溶解靶物的能力。补体激活途径是由补体系统第一组分(Clq)结合与关联抗原复合的分子(例如抗体)起始的。为了评估补体激活，可进行CDC测定法，例如如Gazzano-Santoro et al.，J.Immunol.Methods 202：163(1996)中所记载的。
“天然抗体”指通常由两条相同的轻链(L)和两条相同的重链(H)构成的约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白。每条轻链通过一个共价二硫键与重链连接，而二硫键的数目在不同免疫球蛋白同种型的重链间有变化。每条重链和轻链还具有间隔规律的链内二硫键。每条重链在一端具有可变区(VH)，接着是多个恒定区(CH)。每条轻链在一端具有可变区(VL)，而另一端是恒定区(CL)。轻链的恒定区与重链的第一恒定区排列在一起，而轻链的可变区与重链的可变区排列在一起。认为特定的氨基酸残基在轻链和重链可变区之间形成界面。
术语“可变的”指可变区中的某些部分在抗体序列间差异广泛且用于每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性的事实。然而，变异性并非均匀分布于抗体的整个可变区。它集中于轻链和重链可变区中称作高变区的三个区段。可变区中更加高度保守的部分称作框架区(FR)。天然重链和轻链的可变区各自包含四个FR，它们大多采取β-折叠片构象，通过形成环状连接且在有些情况中形成β-折叠片结构一部分的三个高变区连接。每条链中的高变区通过FR非常接近的保持在一起，并与另一条链的高变区一起促成抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat等人，《Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest》，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD，1991)。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但展现出多种效应器功能，诸如抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)中抗体的参与。
术语“高变区”在用于本文时指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。高变区通常包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(例如轻链可变区中的残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)及重链可变区中的残基31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)；Kabat等人，《Sequences of Proteins ofImmunological Interest》，第5版，Public Health Service，National Institutes ofHealth，Bethesda，MD，1991)和/或那些来自“高变环”的残基(例如轻链可变区中的残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)及重链可变区中的残基26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia and Lesk，J.Mol.Biol.196：901-917(1987))。“框架区”或“FR”残基指可变区中除本文中所定义的高变区残基外的那些残基。
用木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段，称作“Fab”片段，各自具有一个抗原结合位点，和一个残余“Fc”片段，其名称反映了它易于结晶的能力。胃蛋白酶处理产生一个F(ab′)2片段，它具有两个抗原结合位点且仍能够交联抗原。
“Fv”是包含完整抗原识别和抗原结合位点的最小抗体片段。此区由紧密、非共价结合的一个重链可变区和一个轻链可变区的二聚体组成。正是在这种构造中，各可变区的三个高变区相互作用而在VH-VL二聚体表面上确定了一个抗原结合位点。六个高变区共同赋予抗体以抗原结合特异性。然而，即使是单个可变区(或只包含对抗原特异的三个高变区的半个Fv)也具有识别和结合抗原的能力，只是亲和力低于完整结合位点。
Fab片段还包含轻链的恒定区和重链的第一恒定区(CH1)。Fab′片段与Fab片段的不同之处在于重链CH1结构域的羧基末端增加了少数残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab′-SH是本文中对其中恒定区半胱氨酸残基携带至少一个游离硫醇基的Fab′的称谓。F(ab′)2抗体片段最初是作为在Fab′片段之间有铰链半胱氨酸的成对Fab′片段生成的。还知道抗体片段的其它化学偶联。
根据其恒定区氨基酸序列，来自任何脊椎动物物种的抗体“轻链”可归入两种截然不同类型中的一种，称作卡帕(κ)和拉姆达(λ)。
“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于一条多肽链上。优选的是，Fv多肽在VH和VL结构域之间还包含多肽接头，使得scFv能够形成结合抗原的期望结构。关于scFv的综述参见Plückthun，在《The Pharmacology of Monoclonal Antibodies》中，第113卷，Rosenburg和Moore编，Springer-Verlag，New York，第269-315页，1994。HER2抗体scFv片段记载于WO93/16185；美国专利第5,571,894号；和美国专利第5,587,458号。
术语“双抗体”指具有两个抗原结合位点的小型抗体片段，该片段在同一条多肽链(VH-VL)中包含相连的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)。通过使用过短的接头使得同一条链上的两个结构域之间不能配对，迫使结构域与另一条链的互补结构域配对，产生两个抗原结合位点。双抗体更完整的记载于例如EP 404,097；WO 93/11161；Hollinger et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：6444-6448(1993)。
非人(例如啮齿类)抗体的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗体。在极大程度上，人源化抗体指人免疫球蛋白(受体抗体)中的高变区残基用具有期望特异性、亲和力和能力的非人物种(供体抗体)诸如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类的高变区残基替换的免疫球蛋白。在有些情况中，将人免疫球蛋白的框架区(FR)残基用相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含在受体抗体或供体抗体中没有找到的残基。进行这些修饰是为了进一步改进抗体的性能。一般而言，人源化抗体将包含至少一个、通常两个基本上整个如下可变区，其中整个或基本上整个高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环，且整个或基本上整个FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗体任选还将包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定区。更多细节参见Jones et al.，Nature 321：522-525(1986)；Riechmann et al.，Nature 332：323-329(1988)；Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596(1992)。
人源化HER2抗体包括huMAb4D5-1、huMAb4D5-2、huMAb4D5-3、huMAb4D5-4、huMAb4D5-5、huMAb4D5-6、huMAb4D5-7和huMAb4D5-8或Trastuzumab(HERCEPTIN)，如美国专利第5,821,337号表3中所述，明确收入本文作为参考；人源化520C9(WO 93/21319)；及人源化2C4抗体，诸如pertuzumab，如本文所述。
为了本发明的目的，“trastuzumab”、“HERCEPTIN”和“huMAb4D5-8”指包含分别在SEQ ID No.5和6中的轻链和重链氨基酸序列的抗体。
在本文中，“pertuzumab”和“OMNITARGTM”指包含分别在SEQ ID No.7和8中的轻链和重链氨基酸序列的抗体。
“裸抗体”指未偶联异源分子，诸如细胞毒性模块(moiety)或放射性标记物的抗体。
“分离的”抗体指已经鉴定且与/由其天然环境的一种成分分开和/或回收的抗体。其天然环境的污染性成分指会干扰该抗体的诊断或治疗用途的物质，可包括酶、激素、和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在优选的实施方案中，将抗体纯化至(1)根据Lowry法的测定，抗体重量超过95％，最优选重量超过99％，(2)足以通过使用转杯式测序仪获得至少15个残基的N-末端或内部氨基酸序列的程度，或(3)根据使用考马斯蓝或优选银染色的还原性或非还原性条件下的SDS-PAGE，达到同质。既然抗体天然环境的至少一种成分不会存在，那么分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体。然而，分离的抗体通常将通过至少一个纯化步骤来制备。
“亲和力成熟的”抗体指在其一个或多个高变区中具有导致抗体对抗原的亲和力与没有这些改变的亲本抗体相比有所改进的一处或多处改变的抗体。优选的亲和力成熟的抗体将具有纳摩尔或甚至皮摩尔水平的对靶抗原的亲和力。亲和力成熟的抗体可通过本领域已知流程生成。Marks et al.，Bio/Technology 10：779-783(1992)记载了通过VH和VL结构域改组的亲和力成熟。下列文献记载了CDR和/或框架残基的随机诱变：Barbas et al.，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 91：3809-3813(1994)；Schier et al.，Gene 169：147-155(1995)；Yelton et al.，J.Immunol.155：1994-2004(1995)；Jackson et al.，J.Immunol.154(7)：3310-9(1995)；Hawkins et al.，J.Mol.Biol.226：889-896(1992)。
术语“主要种类抗体”在本文中指组合物中作为数量上主要抗体分子的抗体结构。
“氨基酸序列变体”抗体在本文中指具有与主要种类抗体不同的氨基酸序列的抗体。通常，氨基酸序列变体将与主要种类抗体具有至少约70％的同源性，而且优选的是，它们将是与主要种类抗体至少约80％，更优选至少约90％同源。氨基酸序列变体在主要种类抗体氨基酸序列内部或邻近的某些位置具有替代、删除和/或添加。
“糖基化变体”抗体在本文中指附着有一种或多种碳水化合物模块且所述碳水化合物与附着于主要种类抗体的一种或多种碳水化合物模块不同的抗体。
“脱酰胺”抗体指其中一个或多个天冬酰胺残基衍生成例如天冬氨酸、琥珀酰亚胺或异天冬氨酸的抗体。
术语“癌症”和“癌性”指的是或描述哺乳动物中特征通常为细胞生长不受调节的生理状况。癌症的例子包括但不限于癌、淋巴瘤、母细胞瘤(包括髓母细胞瘤和视网膜母细胞瘤)、肉瘤(包括脂肪肉瘤和滑膜细胞肉瘤)、神经内分泌肿瘤(包括类癌肿瘤(carcinoid tumor)、胃泌素瘤和胰岛细胞癌)、间皮瘤、施旺细胞瘤(包括听神经瘤)、脑膜瘤、腺癌、黑素瘤、及白血病或淋巴样恶性肿瘤。此类癌症的更具体例子包括鳞状细胞癌(例如上皮鳞状细胞癌)、肺癌包括小细胞肺癌(SCLC)、非小细胞肺癌(NSCLC)、肺的腺癌和肺的鳞癌、腹膜癌症、肝细胞癌症、胃癌症包括胃肠癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌(liver cancer)、膀胱癌、肝瘤(hepatoma)、乳腺癌(包括转移性乳腺癌)、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌(hepatic carcinoma)、肛门癌、阴茎癌、睾丸癌、食道癌、胆管肿瘤、以及头和颈癌。
具有“HER抑制剂抗性癌症”的哺乳动物指在接受基于HER抑制剂的疗法时病情仍有发展的哺乳动物(即患者“对HER抑制剂有抗性”)，或是在基于HER抑制剂的治疗方案完成后12个月内(例如6个月内)病情有发展的哺乳动物。基于HER抑制剂的疗法包括使用裸露的(naked)或偶联的HER抑制剂的疗法，其中作为单一药剂或与其它抗肿瘤药联合施用HER抑制剂。HER抑制剂可以是trastuzumab、pertuzumab、cetuximab、ABX-EGF、EMD7200、gefitinib、erlotinib、CP724714、CI1033、GW572016、IMC-11F8或TAK165，优选trastuzumab。
为了治疗的目的，“哺乳动物”指归入哺乳类的任何动物，包括人，家畜和牲畜，及动物园、运动或宠物动物，诸如犬、马、猫、牛等。优选的是，哺乳动物指人。
“肿瘤样品”在本文中指衍生自患者肿瘤或包含来自患者肿瘤的肿瘤细胞的样品。肿瘤样品的例子在本文中包括但不限于肿瘤活检、循环中的肿瘤细胞、循环中的血浆蛋白质、腹水、衍生自肿瘤或展现出肿瘤样特性的原代细胞培养物或细胞系，以及保存的肿瘤样品，诸如福尔马林固定的、石蜡包埋的肿瘤样品或冷冻的肿瘤样品。
“固定的”肿瘤样品指已经使用固定剂以组织学方法保存的样品。
“福尔马林固定的”肿瘤样品指使用甲醛作为固定剂保存的样品。
“包埋的”肿瘤样品指用坚固的且通常是硬的介质诸如石蜡、蜡、火棉或树脂包围的样品。包埋使得有可能切出薄片供显微镜检查或生成组织微阵列(TMA)。
“石蜡包埋的”肿瘤样品指用衍生自石油的固体碳氢化合物的纯化混合物包围的样品。
在本文中，“冷冻的”肿瘤样品指正在或曾经冷冻的肿瘤样品。
“生长抑制剂”在用于本文时指在体外或在体内抑制细胞，尤其是表达HER的癌细胞生长的化合物或组合物。如此，生长抑制剂可以是显著降低处于S期的表达HER的细胞百分比的药剂。生长抑制剂的例子包括阻断细胞周期行进(处于S期以外的位置)的药剂，诸如诱导G1停滞和M期停滞的药剂。经典的M期阻断剂包括长春碱类(vincas)(长春新碱(vincristine)和长春碱(vinblastine))、紫杉烷类(taxanes)、和拓扑异构酶II抑制剂诸如多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、柔红霉素(daunorubicin)、依托泊苷(etoposide)和博来霉素(bleomycin)。那些阻滞G1的药剂也溢出进入S期停滞，例如DNA烷化剂类诸如他莫昔芬(tamoxifen)、泼尼松(prednisone)、达卡巴嗪(dacarbazine)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、顺铂(cisplatin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)和ara-C。更多信息可参见《TheMolecular Basis of Cancer》，Mendelsohn和Israel编，第1章，题为“Cell cycleregulation，oncogenes，and antineoplastic drugs”，Murakami等人，WBSaunders，Philadelphia，1995，尤其是第13页。
“生长抑制性”抗体的例子是那些结合HER2并抑制过表达HER2的癌细胞生长的抗体。优选的生长抑制性HER2抗体在约0.5-30μg/ml的抗体浓度对细胞培养中SK-BR-3乳腺肿瘤细胞的生长抑制大于20％，优选大于50％(例如约50％至约100％)，其中生长抑制是在SK-BR-3细胞暴露于抗体后6天测定的(参见1997年10月14日公告的美国专利第5,677,171号)。该专利及下文中更详细的描述了SK-BR-3细胞生长抑制测定法。优选的生长抑制性抗体是鼠单克隆抗体4D5的人源化变体，例如trastuzumab。
“诱导凋亡”的抗体指根据膜联蛋白V结合、DNA断裂、细胞收缩、内质网膨胀、细胞破裂、和/或膜囊(称作凋亡小体)形成的测定，诱导程序性细胞死亡的抗体。所述细胞通常是过表达HER2受体的细胞。优选的是，所述细胞是肿瘤细胞，例如乳房、卵巢、胃、子宫内膜、唾液腺、肺、肾、结肠、甲状腺、胰或膀胱细胞。在体外，所述细胞可以是SK-BR-3、BT474、Calu 3细胞、MDA-MB-453、MDA-MB-361或SKOV3细胞。有多种方法可用于评估与凋亡有关的细胞事件。例如，可通过膜联蛋白结合来测量磷脂酰丝氨酸(PS)易位；可通过DNA梯化(laddering)来评估DNA断裂；可通过亚二倍体细胞的任何增加来评估伴随着DNA断裂的核/染色质浓缩。优选的是，诱导凋亡的抗体是在使用BT474细胞的膜联蛋白结合测定法(见下文)中，相对于未处理细胞，导致约2至50倍，优选约5至50倍，最优选约10至50倍的诱导膜联蛋白结合的抗体。诱导凋亡的HER2抗体的例子有7C2和7F3。
“表位2C4”指HER2的胞外结构域中抗体2C4所结合的区域。为了筛选结合2C4表位的抗体，可进行常规的交叉阻断测定法，诸如《Antibodies，A Laboratory Manual》，Cold Spring Harbor Laboratory，Ed Harlow和DavidLane，1988中所记载的。优选的是，所述抗体将2C4对HER2的结合阻断约50％或更多。或者，可进行表位作图以评估抗体是否结合HER2的2C4表位。表位2C4包含来自HER2胞外结构域中结构域II的残基。2C4和Pertuzumab在结构域I、II和III的连接处结合HER2的胞外结构域。Franklinet al.，Cancer Cell 5：317-328(2004)。
“表位4D5”指HER2的胞外结构域中抗体4D5(ATCC CRL 10463)和Trastuzumab所结合的区域。此表位接近HER2的跨膜结构域，且在HER2的结构域IV内。为了筛选结合4D5表位的抗体，可进行常规的交叉阻断测定法，诸如《Antibodies，A Laboratory Manual》，Cold Spring Harbor Laboratory，Ed Harlow和David Lane，1988中所记载的。或者，可进行表位作图以评估抗体是否结合HER2的4D5表位(例如HER2 ECD的大约第529位(含该位点)残基至大约第625位(含该位点)残基区域内的任何一个或多个残基，该残基编号包括信号肽)。
“表位7C2/7F3”指HER2的胞外结构域的结构域I内N末端处7C2和/或7F3抗体(各自保藏于ATCC，见下文)所结合的区域。为了筛选结合7C2/7F3表位的抗体，可进行常规的交叉阻断测定法，诸如《Antibodies，ALaboratory Manual》，Cold Spring Harbor Laboratory，Ed Harlow和David Lane，1988中所记载的。或者，可进行表位作图以确定抗体是否结合HER2上的7C2/7F3表位(例如HER2 ECD的大约第22位残基至大约第53位残基区域内的任何一个或多个残基，残基编号包括信号肽)。
“处理”和“治疗”(treatment)指治疗性处理和预防性措施二者。需要治疗的受试者包括那些早就患有疾病的以及要预防疾病的。因此，本文中待治疗的患者可能已经诊断为患有疾病或者可能有患上疾病的倾向性或易感性。
术语“有效量”指在患者中有效治疗癌症的药物量。有效量的药物可减少癌细胞的数目；缩小肿瘤的大小；抑制(即一定程度的减缓和优选阻止)癌细胞浸润到周围器官中；抑制(即一定程度的减缓和优选阻止)肿瘤转移；一定程度的抑制肿瘤生长；和/或一定程度的减轻一种或多种与癌症有关的症状。药物可一定程度上阻止现有癌细胞生长和/或杀死现有癌细胞，它可以是抑制细胞的和/或毒害细胞的(细胞毒性的)药物。有效量可延长无进展存活(progression free survival)，导致客观响应(包括部分响应，PR或完全响应，CR)，增加总体存活时间，和/或改善癌症的一种或多种症状。
“完全响应(complete response)”或“完全消退”指癌症的所有症状响应治疗而消失。这并不总是意味着癌症得到治愈。
“部分响应”指一处或多处肿瘤或损伤的大小或癌症在身体中的范围响应治疗而缩小。
术语“细胞毒剂”在用于本文时指抑制或阻止细胞的功能和/或引起细胞破坏的物质。该术语意图包括放射性同位素(例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32和Lu的放射性同位素)、化疗剂、和毒素诸如小分子毒素或者细菌、真菌、植物或动物起源的酶活毒素，包括其片段和/或变体。
“化疗剂”指可用于治疗癌症的化学化合物。化疗剂的例子包括烷化剂类(alkylating agents)，诸如塞替派(thiotepa)和CYTOXAN环磷酰胺(cyclophosphamide)；磺酸烷基酯类(alkyl sulfonates)，诸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶类(aziridines)，诸如苯佐替派(benzodepa)、卡波醌(carboquone)、美妥替派(meturedepa)和乌瑞替派(uredepa)；乙撑亚胺类(ethylenimines)和甲基蜜胺类(methylamelamines)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撑磷酰胺(triethylenephosphoramide)、三乙撑硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine)；TLK 286(TELCYTATM)；番荔枝内酯类(acetogenin)(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；δ-9-四氢大麻酚(tetrahydrocannabinol)(屈大麻酚(dronabinol)，MARINOL)；β-拉帕醌(lapachone)；拉帕醇(lapachol)；秋水仙素类(colchicines)；白桦脂酸(betulinic acid)；喜树碱(camptothecin)(包括合成类似物托泊替康(topotecan)(HYCAMTIN)、CPT-11(伊立替康(irinotecan)，CAMPTOSAR)、乙酰喜树碱、东莨菪亭(scopoletin)和9-氨基喜树碱)；苔藓抑素(bryostatin)；callystatin；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；鬼臼毒素(podophyllotoxin)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；替尼泊苷(teniposide)；隐藻素类(cryptophycins)(特别是隐藻素1和隐藻素8)；多拉司他汀(dolastatin)；duocarmycin(包括合成类似物，KW-2189和CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；pancratistatin；sarcodictyin；海绵抑素(spongistatin)；氮芥类(nitrogen mustards)，诸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亚硝脲类(nitrosoureas)，诸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimustine)；二膦酸盐类(bisphosphonates)，诸如氯膦酸盐(clodronate)；抗生素类，诸如烯二炔类(enediyne)抗生素(例如加利车霉素(calicheamicin)，尤其是加利车霉素γ1I和加利车霉素ωIl(参见例如Agnew，Chem.Intl.Ed.Engl.33：183-186(1994))和蒽环类抗生素(anthracyclines)诸如annamycin、AD 32、alcarubicin、柔红霉素(daunorubicin)、右雷佐生(dexrazoxane)、DX-52-1、表柔比星(epirubicin)、GPX-100、伊达比星(idarubicin)、KRN5500、美诺立尔(menogaril)、dynemicin包括dynemicin A、埃斯波霉素(esperamicin)、新制癌素(neocarzinostatin)发色团和相关色蛋白烯二炔类抗生素发色团、阿克拉霉素(aclacinomycin)、放线菌素(actinomycin)、氨茴霉素(anthramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素C(cactinomycin)、carabicin、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放线菌素D(dactinomycin)、地托比星(detorubicin)、6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸、ADRIAMYCIN多柔比星(doxorubicin)(包括吗啉代多柔比星、氰基吗啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星、多柔比星脂质体和脱氧多柔比星)、依索比星(esorubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素类(mitomycins)诸如丝裂霉素C、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、potfiromycin、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)和佐柔比星(zorubicin)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸(denopterin)、蝶酰三谷氨酸(pteropterin)和三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤(mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)和硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物，诸如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)和氟尿苷(floxuridine)；雄激素类，诸如卡鲁睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、表硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)和睾内酯(testolactone)；抗肾上腺类，诸如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)和曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，诸如亚叶酸(folinic acid)(leucovorin)；醋葡醛内酯(aceglatone)；抗叶酸(盐/酯)抗瘤剂，诸如ALIMTA、LY231514培美曲塞(pemetrexed)、二氢叶酸还原酶抑制剂诸如甲氨喋呤(methotrexate)、抗代谢物类，诸如5-氟尿嘧啶(5-FU)及其前药诸如LIFT、S-1和卡培他滨(capecitabine)，及胸苷酸合酶抑制剂和甘氨酰胺核糖核苷酸甲酰基转移酶抑制剂诸如雷替曲塞(raltitrexed)(TOMUDEXTM，TDX)；二氢嘧啶脱氢酶抑制剂诸如恩尿嘧啶(eniluracil)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defosfamide)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；elfornithine；依利醋铵(elliptinium acetate)；埃坡霉素(epothilone)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟脲(hydroxyurea)；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidamine)；美登木素生物碱类(maytansinoids)，诸如美登素(maytansine)和安丝菌素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；2-乙基酰肼(ethylhydrazide)；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK多糖复合物(JHS Natural Products，Eugene，OR)；雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西索菲兰(sizofiran)；螺旋锗(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2，2′，2″-三氯三乙胺；单端孢菌素类(trichothecenes)(尤其是T-2毒素、疣孢菌素(verrucarin)A、杆孢菌素(roridin)A和蛇行菌素(anguidin))；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)(ELDISINE，FILDESIN)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞苷(arabinoside)(“Ara-C”)；环磷酰胺(cyclophosphamide)；塞替派(thiotepa)；类紫杉醇类(taxoids)和紫杉烷类(taxanes)，例如TAXOL紫杉醇(paclitaxel)(Bristol-Myers Squibb Oncology,Princeton，N.J.)、ABRAXANETM不含克列莫佛(Cremophor)，清蛋白改造的纳米颗粒剂型紫杉醇(American Pharmaceutical Partners，Schaumberg，Illinois)和TAXOTERE多西他塞(docetaxel)(-Poulenc Rorer，Antony,France)；苯丁酸氮芥(chlorambucil)；抗代谢物化疗剂，诸如吉西他滨(gemcitabine)(GEMZAR)；5-氟尿嘧啶(5-FU)、卡培他滨(capecitabine)(XELODATM)、6-巯基嘌呤、甲氨喋呤(methotrexate)、6-硫乌嘌呤(thioguanine)、培美曲塞(pemetrexed)、雷替曲塞(raltitrexed)、阿糖胞苷(arabinosylcytosine ARA-C cytarabine)(CYTOSAR-U)、达卡巴嗪(dacarbazine)(DTIC-DOME)、azocytosine、deoxycytosine、pyridmidene、氟达拉滨(fludarabine)(FLUDARA)、克拉屈滨(cladrabine)、和2-脱氧-D-葡萄糖；6-硫鸟嘌呤(thioguanine)；巯基嘌呤(mercaptopurine)；基于铂的化疗剂，诸如卡铂(carboplatin)、顺铂(cisplatin)或奥沙利铂(oxaliplatin)；长春碱(vinblastine)(VELBAN)；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺(ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱(vincristine)(ONCOVIN)；长春花生物碱类(vinca alkaloid)；长春瑞滨(vinorelbine)(NAVELBINE)；能灭瘤(novantrone)；依达曲沙(edatrexate)；道诺霉素(daunomycin)；氨基蝶呤(aminopterin)；希罗达(xeloda)；伊本膦酸盐(ibandronate)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类维A酸(retinoids)，诸如视黄酸(retinoic acid)；任何上述物质的药学可接受盐、酸或衍生物；以及两种或多种上述物质的组合，诸如CHOP(环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松龙联合疗法的缩写)和FOLFOX(奥沙利铂(ELOXATINTM)联合5-FU和亚叶酸的治疗方案的缩写)。
该定义还包括作用为调节或抑制激素对肿瘤作用的抗激素剂，诸如抗雌激素类和选择性雌激素受体调节剂类(SERM)，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)(包括NOLVADEX他莫昔芬)、雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、那洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮(onapristone)和FARESTON托瑞米芬(toremifene)；抑制在肾上腺中调节雌激素生成的芳香酶的芳香酶抑制剂，诸如例如4(5)-咪唑、氨鲁米特(aminoglutethimide)、MEGASE醋酸甲地孕酮(megestrolacetate)、AROMASIN依西美坦(exemestane)、福美坦(formestane)、法倔唑(fadrozole)、RIVISOR伏罗唑(vorozole)、FEMARA来曲唑(letrozole)和ARIMIDEX阿那曲唑(anastrozole)；抗雄激素类，诸如氟他米特(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、比卡米特(bicalutamide)、亮丙瑞林(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin)；以及曲沙他滨(troxacitabine)(1，3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸，特别是那些抑制涉及粘着细胞增殖的信号途经中的基因表达的，诸如例如PKC-α、Raf、H-Ras和表皮生长因子受体(EGF-R)；疫苗，诸如基因疗法疫苗，例如ALLOVECTIN疫苗、LEUVECTIN疫苗和VAXID疫苗；PROLEUKINrIL-2；LURTOTECAN拓扑异构酶1抑制剂；ABARELIXrmRH；及任何上述物质的药学可接受盐、酸或衍生物。
“抗血管发生剂”指阻断或一定程度的干扰血管发育的化合物。抗血管发生因子可以是例如结合涉及促进血管发生的生长因子或生长因子受体的小分子或抗体。在本文中优选的抗血管发生因子是结合血管内皮生长因子(VEGF)的抗体，诸如bevacizumab(AVASTIN)。
术语“细胞因子”是由一种细胞群释放，作为细胞间介质作用于另一细胞的蛋白质的通称。此类细胞因子的例子有淋巴因子、单核因子和传统的多肽激素。细胞因子中包括生长激素，诸如人生长激素、N-甲硫氨酰人生长激素和牛生长激素；甲状旁腺素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松驰素；松驰素原；糖蛋白激素类，诸如促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)和促黄体激素(LH)；肝生长因子；成纤维细胞生长因子；促乳素；胎盘催乳激素；肿瘤坏死因子-α和-β；穆勒氏(Mullerian)抑制性物质；小鼠促性腺激素相关肽；抑制素；激活素；血管内皮生长因子；整联蛋白；血小板生成素(TPO)；神经生长因子，诸如NGF-β；血小板衍生生长因子；转化生长因子(TGF)，诸如TGF-α和TGF-β；胰岛素样生长因子-I和-II；红细胞生成素(EPO)；骨诱导因子(osteoinductive factor)；干扰素，诸如干扰素-α、-β和-γ；集落刺激因子(CSF)，诸如巨噬细胞CSF(M-CSF)、粒细胞-巨噬细胞CSF(GM-CSF)和粒细胞CSF(G-CSF)；白介素(IL)，诸如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12；肿瘤坏死因子，诸如TNF-α或TNF-β；及其它多肽因子，包括LIF和kit配体(KL)。在用于本文时，术语细胞因子包括来自天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白质及天然序列细胞因子的生物学活性等效物。
在用于本文时，术语“EGFR靶向药物”指结合EGFR并任选抑制EGFR活化的治疗剂。此类药剂的例子包括结合EGFR的抗体和小分子。结合EGFR的抗体的例子包括MAb 579(ATCC CRL HB 8506)、MAb 455(ATCC CRLHB 8507)、MAb 225(ATCC CRL 8508)、MAb 528(ATCC CRL 8509)(参见美国专利第4,943,533号，Mendelsohn等人)及其变体，诸如嵌合化225(C225或Cetuximab；ERBUTIX)和重构人225(H225)(参见WO 96/40210，Imclone Systems Inc.)；IMC-11F8，完全人的EGFR靶向抗体(Imclone)；结合II型突变体EGFR的抗体(美国专利第5,212,290号)；结合EGFR的人源化和嵌合抗体，如美国专利第5,891,996号中所述；及结合EGFR的人抗体，诸如ABX-EGF(参见WO 98/50433，Abgenix)；EMD 55900(Stragliotto et al.，Eur.J.Cancer 32A：636-640(1996))；EMD7200(matuzumab)，针对EGFR、与EGF和TGF-α都竞争EGFR结合的人源化EGFR抗体；及mAb 806或人源化mAb 806(Johns et al.，J.Biol.Chem.279(29)：30375-30384(2004))。抗EGFR抗体可偶联细胞毒剂，如此产生免疫偶联物(参见例如EP 659,439 A2，Merck Patent GmbH)。结合EGFR的小分子的例子包括ZD1839或Gefitinib(IRESSATM；Astra Zeneca)；CP-358774或Erlotinib(TARCEVATM；Genentech/OSI)；和AG1478、AG1571(SU 5271；Sugen)；EMD-7200。
“酪氨酸激酶抑制剂”指抑制酪氨酸激酶诸如HER受体的酪氨酸激酶活性的分子。此类抑制剂的例子包括上一段中提到的EGFR靶向药物；小分子HER2酪氨酸激酶抑制剂，诸如可从Takeda购买的TAK165；CP-724,714，ErbB2受体酪氨酸激酶的口服选择性抑制剂(Pfizer and OSI)；优先结合EGFR但抑制HER2和EGFR二者过表达细胞的双重HER抑制剂，诸如EKB-569(可从Wyeth购买)；GW572016(可从Glaxo购买)，一种口服HER2和EGFR酪氨酸激酶抑制剂；PKI-166(可从Novartis购买)；泛HER(pan-HER)抑制剂，诸如canertinib(CI-1033；Pharmacia)；Raf-1抑制剂，诸如可从ISISPharmaceuticals购买、抑制Raf-1信号传导的反义剂ISIS-5132；非HER靶向TK抑制剂，诸如可从Glaxo购买的Imatinib mesylate(GLEEVACTM)；MAPK胞外调控激酶I抑制剂CI-1040(可从Pharmacia购买)；喹唑啉类，诸如PD 153035，4-(3-氯苯胺基)喹唑啉；吡啶并嘧啶类；嘧啶并嘧啶类；吡咯并嘧啶类，诸如CGP 59326、CGP 60261和CGP 62706；吡唑并嘧啶类，4-(苯氨基)-7H-吡咯[2，3-d]嘧啶；姜黄素(二阿魏酰甲烷，4，5-双(4-氟苯胺基)-酞亚胺)；含硝基噻吩模块的tyrphostines；PD-0183805(Warner-Lambert)；反义分子(例如那些结合HER编码核酸的)；喹喔啉类(美国专利第5,804,396号)；tryphostins(美国专利第5,804,396号)；ZD6474(Astra Zeneca)；PTK-787(Novartis/Schering AG)；泛HER抑制剂，诸如CI-1033(Pfizer)；Affinitac(ISIS 3521；Isis/Lilly)；Imatinib mesylate(Gleevac；Novartis)；PKI 166(Novartis)；GW2016(Glaxo SmithKline)；CI-1033(Pfizer)；EKB-569(Wyeth)；Semaxinib(Sugen)；ZD6474(AstraZeneca)；PTK-787(Novartis/Schering AG)；INC-1C11(Imclone)；或如任何下列专利出版物中所记载的：美国专利第5,804,396号；WO 99/09016(American Cyanimid)；WO 98/43960(American Cyanamid)；WO 97/38983(Warner Lambert)；WO99/06378(Warner Lambert)；WO 99/06396(Warner Lambert)；WO 96/30347(Pfizer，Inc.)；WO 96/33978(Zeneca)；WO 96/3397(Zeneca)；WO 96/33980(Zeneca)。
II.抑制HER2脱落
本申请关注用于抑制HER2脱落的方法，包括用有效抑制HER2脱落的量的基质金属蛋白酶(MMP)拮抗剂处理表达HER2的细胞或将表达HER2的细胞暴露于有效抑制HER2脱落的量的基质金属蛋白酶(MMP)拮抗剂。优选的是，所述MMP拮抗剂是膜束缚MMP(MT-MMP)拮抗剂，诸如MT1-MMP(MMP-14)、MT2-MMP(MMP-15)、MT3-MMP(MMP-16)、MT5-MMP(MMP-24)、MT4-MMP(MMP-17)或MT6-MMP(MMP-25)。最优选的是，所述MT-MMP是MMP-15，而且希望，所述拮抗剂选择性或优先结合MMP-15但不显著结合其它蛋白酶或MMP-15以外的MMP，和/或所述拮抗剂干扰MMP-15蛋白水解功能但不显著干扰其它蛋白酶或MMP-15以外的MMP的功能。
在优选的实施方案中，所处理的细胞展示出HER和/或MMP表达、扩增或活化。例如，所述细胞展示出HER2和/或MMP-15过表达或扩增。
MMP拮抗剂的活性可通过将其与其它抗肿瘤药物、HER抑制剂或HER2抗体(诸如trastuzumab或pertuzumab)联合而增强。可以与MMP拮抗剂联合的HER抑制剂的例子包括trastuzumab、pertuzumab、cetuximab、ABX-EGF、EMD7200、gefitinib、erlotinib、CP724714、CI1033、GW572016、IMC-11F8和TAK165。
本发明还关注用于在哺乳动物中降低HER2胞外结构域(ECD)血清水平的方法，包括对哺乳动物施用在哺乳动物中有效降低HER2 ECD血清水平的量的基质金属蛋白酶(MMP)拮抗剂。所述哺乳动物任选具有升高的MMP水平。
本发明还提供了用于在哺乳动物中治疗癌症的方法，包括对哺乳动物施用有效治疗癌症的量的基质金属蛋白酶(MMP)拮抗剂。所述癌可展示出HER和/或MMP表达、扩增或活化。例如，所述癌可展示出HER2或MMP-15过表达或扩增。在一个实施方案中，所治疗的哺乳动物具有升高的脱落HER2血清水平或升高的p95 HER2水平。
本发明还涉及用于在哺乳动物中治疗HER抑制剂抗性癌症的方法，包括对哺乳动物施用有效治疗癌症的量的基质金属蛋白酶(MMP)拮抗剂。例如，所述哺乳动物可对HER2抗体，诸如trastuzumab有抗性。
还提供了用于降低细胞中p95 HER2水平的方法，包括将细胞暴露于有效降低p95 HER2水平的量的基质金属蛋白酶(MMP)拮抗剂。
可使用多种MMP拮抗剂，优选的是，所述MMP拮抗剂是小分子抑制剂或抗体。下文描述了用于生成抗体的方法。
III.抗体的生产
下文描述了用于生成依照本发明使用的抗体的例示性技术。用于生成抗体的抗原可以是例如可溶形式的抗原或其包含期望表位的部分。或者，在其细胞表面表达抗原的细胞(例如经转化而过表达HER2的NIH-3T3细胞；或癌细胞系，诸如SK-BR-3细胞，参见Stancovski et al.，PNAS(USA)88：8691-8695(1991))可用于生成抗体。可用于生成抗体的其它形式抗原对于本领域技术人员是显而易见的。
(i)多克隆抗体
多克隆抗体优选通过在动物中多次皮下(sc)或腹膜内(ip)注射相关抗原和佐剂来生成。使用双功能或衍生化试剂，例如马来酰亚胺苯甲酰磺基琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基偶联)、N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl2或R1N＝C＝NR，其中R和R1是不同的烃基，将相关抗原与在待免疫物种中有免疫原性的蛋白质偶联可能是有用的，例如匙孔血蓝蛋白、血清清蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂。
通过将例如100μg或5μg蛋白质或偶联物(分别用于兔或小鼠)与3倍体积的弗氏完全佐剂混和并将该溶液皮内注射于多个部位，将动物针对抗原、免疫原性偶联物或衍生物进行免疫。一个月后，通过多个部位的皮下注射，用弗氏完全佐剂中初始量1/5-1/10的肽或偶联物对动物进行加强免疫。7-14天后，采集动物的血液，并测定血清的抗体滴度。对动物进行加强免疫，直到滴度达到稳定(plateau)。优选的是，将动物用相同抗原但与不同蛋白质和/或通过不同交联剂偶联得到的偶联物进行加强免疫。偶联物还可在重组细胞培养中作为蛋白质融合物来制备。同样，适当使用凝聚剂诸如明矾来增强免疫应答。
(ii)单克隆抗体
本领域有多种方法可用于制备本文中的单克隆抗体。例如，单克隆抗体可使用最初由Kohler et al.，Nature 256：495(1975)描述的杂交瘤方法、通过重组DNA方法(美国专利第4,816,567号)来制备。
在杂交瘤方法中，如上所述免疫小鼠或其它适宜的宿主动物，诸如仓鼠，以引发生成或能够生成如下抗体的淋巴细胞，所述抗体将特异性结合用于免疫的蛋白质。或者，可以在体外免疫淋巴细胞。然后，使用合适的融合剂诸如聚乙二醇将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，以形成杂交瘤细胞(Goding，《Monoclonal Antibodies：Principles and Practice》，第59-103页，AcademicPress，1986)。
将如此制备的杂交瘤细胞在合适的培养基中接种和培养，所述培养基优选含有抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞生长或存活的一种或多种物质。例如，若亲本骨髓瘤细胞缺乏酶次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，则用于杂交瘤的培养基典型的将含有次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷(HAT培养基)，这些物质阻止HGPRT缺陷细胞生长。
优选的骨髓瘤细胞是那些高效融合、支持所选抗体生成细胞稳定的高水平生成抗体、并对诸如HAT培养基等培养基敏感的。在这些细胞中，优选的骨髓瘤细胞系是鼠骨髓瘤系，诸如那些可从索尔克研究所细胞分配中心(Salk Institute Cell Distribution Center，San Diego，California，USA)获得的MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤及可从美国典型培养物保藏中心(AmericanType Culture Collection，Rockville，Maryland，USA)获得的SP-2或X63-Ag8-653细胞衍生的。人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系用于生成人单克隆抗体也已有记载(Kozbor，J.Immunol.133：3001(1984)；Brodeur等人，《Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications》，第51-63页，Marcel Dekker，Inc.，New York，1987)。
可对杂交瘤细胞正在其中生长的培养基测定针对抗原的单克隆抗体的生成。优选的是，通过免疫沉淀或通过体外结合测定法，诸如放射性免疫测定法(RIA)或酶联免疫吸附测定法(ELISA)，测定由杂交瘤细胞生成的单克隆抗体的结合特异性。
单克隆抗体的结合亲和力可通过例如Munson et al.，Anal.Biochem.107：220(1980)的Scatchard分析来测定。
在鉴定得到生成具有期望特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后，所述克隆可通过有限稀释流程进行亚克隆，并通过标准方法进行培养(Goding，《Monoclonal Antibodies：Principles and Practice》，第59-103页，Academic Press，1986)。适于这一目的的培养基包括例如D-MEM或RPMI-1640培养基。另外，杂交瘤细胞可在动物中作为腹水瘤进行体内培养。
可通过常规抗体纯化流程，诸如例如蛋白A-Sepharose、羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析，将亚克隆分泌的单克隆抗体与培养基、腹水或血清适当分开。
编码单克隆抗体的DNA易于使用常规流程分离和测序(例如通过使用能够特异性结合编码鼠抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)。以杂交瘤细胞作为此类DNA的优选来源。一旦分离，可将DNA置于表达载体中，然后将该表达载体转染到不另外生成抗体蛋白质的宿主细胞中，诸如大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞，以在重组宿主细胞中获得单克隆抗体的合成。关于编码抗体的DNA在细菌中的重组表达的综述性论文包括Skerra et al.，Curr.Opinion in Immunol.5：256-262(1993)及Plückthun，Immunol.Revs.130：151-188(1992)。
在另一个实施方案中，可从使用McCafferty et al.，Nature 348：552-554(1990)所述技术构建的噬菌体抗体库中分离单克隆抗体或抗体片段。Clackson et al.，Nature 352：624-628(1991)及Marks et al.，J.Mol.Biol.222：581-597(1991)分别描述了使用噬菌体文库分离鼠和人抗体。后续出版物记载了通过链改组(Marks et al.，Bio/Technology 10：779-783(1992))，以及组合感染和体内重组作为构建非常大的噬菌体文库的策略(Waterhouse et al.，Nuc.Acids Res.21：2265-2266(1993))，生成高亲和力(nM范围)的人抗体。如此，这些技术是用于分离单克隆抗体的传统单克隆抗体杂交瘤技术的可行替代方法。
还可以修饰DNA，例如通过替代即用人重链和轻链恒定区的编码序列代替同源鼠序列(美国专利第4,816,567号；Morrison et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6851(1984))，或通过将非免疫球蛋白多肽的整个或部分编码序列与免疫球蛋白编码序列共价接合。
典型的，用此类非免疫球蛋白多肽替代抗体的恒定区，或者用它们替代抗体的一个抗原结合位点的可变区，以产生嵌合二价抗体，它包含对一种抗原具有特异性的一个抗原结合位点和对不同抗原具有特异性的另一个抗原结合位点。
(iii)人源化抗体
本领域已经记载了用于将非人抗体人源化的方法。优选的是，人源化抗体具有一个或多个从非人来源引入的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基常常称作“输入”残基，它们典型的取自“输入”可变区。人源化可基本上遵循Winter及其同事的方法进行(Jones et al.，Nature 321：522-525(1986)；Riechmann et al.，Nature 332：323-327(1988)；Verhoeyen et al.，Science 239：1534-1536(1988))，通过用高变区序列替代相应的人抗体序列。因此，此类“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利第4,816,567号)，其中本质上少于整个人可变区用来自非人物种的相应序列替代。在实践中，人源化抗体典型的是其中一些高变区残基和可能的一些FR残基用来自啮齿类抗体中类似位点的残基替代的人抗体。
用于构建人源化抗体的人可变区的选择，包括轻链和重链二者，对于降低抗原性非常重要。依照所谓的“最适”(best-fit)方法，用啮齿类抗体的可变区序列对已知的人可变区序列的整个文库进行筛选。然后选择与啮齿类最接近的人序列作为人源化抗体的人框架区(FR)(Sims et al.，J.Immunol.151：2296(1993)；Chothia et al.，J.Mol.Biol.196：901(1987))。另一种方法使用由特定轻链或重链亚组的所有人抗体的共有序列衍生的特定框架区。同一框架可用于数种不同的人源化抗体(Carter et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：4285(1992)；Presta et al.，J.Immunol.151：2623(1993))。
更为重要的是，抗体在人源化后保持对抗原的高亲和力及其它有利的生物学特性。为了实现这一目标，依照一种优选的方法，通过使用亲本和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性人源化产物的方法来制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型通常是可获得的，且为本领域熟练技术人员所熟悉。可获得图解和显示所选候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构的计算机程序。检查这些显示图像容许分析残基在候选免疫球蛋白序列行使功能中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。这样，可从受体和输入序列中选出FR残基并进行组合，从而获得期望抗体特征，诸如对靶抗原的亲和力提高。一般而言，高变区残基直接且最实质的涉及对抗原结合的影响。
(iv)人抗体
作为人源化的替代方法，可生成人抗体。例如，现在有可能生成在缺乏内源免疫球蛋白生成的情况下能够在免疫时生成人抗体完整全集的转基因动物(例如小鼠)。例如，已经记载了嵌合和种系突变小鼠中抗体重链连接区(JH)基因的纯合删除导致内源抗体生成的完全抑制。在此类种系突变小鼠中转移大量人种系免疫球蛋白基因将导致在抗原攻击时生成人抗体。参见例如Jakobovits et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：2551(1993)；Jakobovits et al.，Nature 362：255-258(1993)；Bruggermann et al.，Year in Immuno.7：33(1993)；及美国专利第5,591,669号、第5,589,369号和第5,545,807号。
或者，噬菌体展示技术(McCafferty et al.，Nature 348：552-553(1990))可用于在体外从来自未免疫供体的免疫球蛋白可变区(V)基因全集生成人抗体和抗体片段。依照这种技术，将抗体V结构域基因以符合读码框的方式克隆到丝状噬菌体诸如M13或fd的主要或次要外壳蛋白基因中，并在噬菌体颗粒表面上展示为功能性抗体片段。因为丝状噬菌体颗粒包含噬菌体基因组的单链DNA拷贝，以抗体的功能特性为基础进行的选择也导致编码展示那些特性的抗体的基因的选择。如此，噬菌体模拟B细胞的一些特性。噬菌体展示可以多种形式进行；有关综述参见例如Johnson，Kevin S.and Chiswell，David J.，Current Opinion in Structural Biology 3：564-571(1993)。V基因区段的数种来源可用于噬菌体展示。Clackson et al.，Nature 352：624-628(1991)从衍生自经免疫小鼠脾的小型V基因随机组合文库中分离得到大量不同的抗恶唑酮抗体。可本质上遵循Marks et al.，J.Mol.Biol.222：581-597(1991)或Griffith et al.，EMBO J.12：725-734(1993)所述技术，由未免疫人供体构建V基因全集和分离针对大量不同抗原(包括自身抗原)的抗体。还可参见美国专利第5,565,332号和第5,573,905号。
如上所述，还可通过体外激活B细胞来生成人抗体(参见美国专利第5,567,610号和第5,229,275号)。
1998年6月30日公告的美国专利第5,772,997号和1997年1月3日公开的WO 97/00271中记载了人HER2抗体。
(v)抗体片段
已经开发了用于生成包含一个或多个抗原结合区的抗体片段的多种技术。传统上，通过蛋白水解消化完整抗体来衍生这些片段(参见例如Morimotoet al.，Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24：107-117(1992)；Brennan et al.，Science 229：81(1985))。然而，现在可直接由重组宿主细胞生成这些片段。例如，可从上文讨论的噬菌体抗体库中分离抗体片段。或者，可直接从大肠杆菌回收Fab′-SH片段并化学偶联以形成F(ab′)2片段(Carter etal.，Bio/Technology 10：163-167(1992))。依照另一种方法，可直接从重组宿主细胞培养物分离F(ab′)2片段。用于生成抗体片段的其它技术对熟练从业人员将是显而易见的。在其它实施方案中，选择的抗体是单链Fv片段(scFv)。参见WO 93/16185；美国专利第5,571,894号；美国专利第5,587,458号。抗体片段还可以是“线性抗体”，例如如美国专利第5,641,870号中所述。此类线性抗体片段可以是单特异性的或双特异性的。
(vi)双特异性抗体
双特异性抗体指具有对至少两种不同表位的结合特异性的抗体。例示性的双特异性抗体可结合HER2蛋白质的两种不同表位。其它此类抗体可将HER2结合位点与EGFR、HER3和/或HER4的结合位点组合在一起。或者，可将HER2臂与结合白细胞上触发分子诸如T细胞受体分子(例如CD2或CD3)或IgG的Fc受体(FcγR)，诸如FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)的臂组合在一起，使得细胞防御机制聚焦于HER2表达细胞。双特异性抗体还可用于将细胞毒剂定位于表达HER2的细胞。这些抗体拥有HER2结合臂和结合细胞毒剂(例如肥皂草毒蛋白、抗干扰素-α、长春花生物碱类、蓖麻毒蛋白A链、甲氨蝶呤或放射性同位素半抗原)的臂。可将双特异性抗体制备成全长抗体或抗体片段(例如F(ab′)2双特异性抗体)。
WO 96/16673记载了一种双特异性HER2/FcγRIII抗体，美国专利第5,837,234号公开了一种双特异性HER2/FcγRI抗体IDM1(Osidem)。WO98/02463显示了一种双特异性HER2/Fca抗体。美国专利第5,821,337号教导了一种双特异性HER2/CD3抗体。MDX-210是一种双特异性HER2-FcγRIII抗体。
用于构建双特异性抗体的方法是本领域知道的。全长双特异性抗体的传统生成基于两对免疫球蛋白重链-轻链的共表达，其中两种链具有不同的特异性(Millstein et al.，Nature 305：537-539(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分配，这些杂交瘤(四源杂交瘤(quadroma))生成10种不同抗体分子的潜在混合物，其中只有一种具有正确的双特异性结构。通常通过亲和层析步骤进行的正确分子的纯化相当麻烦且产物产量低。WO 93/08829及Traunecker et al.，EMBO J.10：3655-3659(1991)中公开了类似的流程。
依照一种不同的方法，将具有期望结合特异性(抗体-抗原结合位点)的抗体可变区与免疫球蛋白恒定区序列融合。融合优选使用包含至少部分铰链、CH2和CH3区的免疫球蛋白重链恒定区。优选的是，在至少一种融合物中，第一重链恒定区(CH1)包含轻链结合所必需的位点。将编码免疫球蛋白重链融合物和，如果需要，免疫球蛋白轻链的DNA插入分开的表达载体，并共转染到合适的宿主生物体中。在用于构建的三种多肽链比例不等时提供最佳产量的实施方案中，这为调整三种多肽片段的相互比例提供了极大的灵活性。然而，在至少两种多肽链以相同比率表达导致高产量时或在该比率没有特别意义时，有可能将两种或所有三种多肽链的编码序列插入同一个表达载体。
在该方法的一个优选实施方案中，双特异性抗体由一个臂上具有第一结合特异性的杂合免疫球蛋白重链，和另一个臂上的杂合免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)构成。由于免疫球蛋白轻链仅在半个双特异性分子中的存在提供了分离的便利途径，因此发现这种不对称结构便于将期望的双特异性复合物与不想要的免疫球蛋白链组合分开。该方法公开于WO94/04690。关于生成双特异性抗体的进一步详情参见例如Suresh et al.，Methods in Enzymology 121：210(1986)。
依照美国专利第5,731,168号中记载的另一种方法，可改造一对抗体分子之间的界面，以将从重组细胞培养物回收的异二聚体的百分比最大化。优选的界面包含至少部分抗体恒定区CH3结构域。在该方法中，将第一抗体分子界面的一个或多个小氨基酸侧链用较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)替换。通过将大氨基酸侧链用较小氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替换，在第二抗体分子的界面上产生针对大侧链的相同或相似大小的补偿性“空腔”。这提供了较之其它不想要的终产物诸如同二聚体提高异二聚体产量的机制。
双特异性抗体包括交联或“异源偶联”抗体。例如，异源偶联物中的一种抗体可与亲合素偶联，另一种抗体与生物素偶联。例如，此类抗体建议用于将免疫系统细胞靶向不想要的细胞(美国专利第4,676,980号)，及用于治疗HIV感染(WO 91/00360、WO 92/200373和EP 03089)。可使用任何便利的交联方法来制备异源偶联抗体。合适的交联剂是本领域众所周知的，并且连同许多交联技术一起公开于美国专利第4,676,980号。
文献中还记载了由抗体片段生成双特异性抗体的技术。例如，可使用化学连接来制备双特异性抗体。Brennan et al.，Science 229：81(1985)记载了通过蛋白水解切割完整抗体以生成F(ab′)2片段的流程。将这些片段在存在二硫醇络合剂亚砷酸钠的情况下还原，以稳定邻近的二硫醇并防止分子间二硫键的形成。然后将产生的Fab’片段转变为硫代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。然后将Fab′-TNB衍生物之一通过巯基乙胺的还原重新恢复成Fab′-硫醇，并与等摩尔量的另一种Fab′-TNB衍生物混合，以形成双特异性抗体。产生的双特异性抗体可用作酶的选择性固定化试剂。
最新的进展便于从大肠杆菌中直接回收Fab′-SH片段，这些片段可化学偶联以形成双特异性抗体。Shalaby et al.，J.Exp.Med.175：217-225(1992)记载了生成完全人源化的双特异性抗体F(ab′)2分子。每个Fab′片段由大肠杆菌分开分泌，并在体外进行定向化学偶联以形成双特异性抗体。如此形成的双特异性抗体能够结合过表达HER2受体的细胞和正常人T细胞，以及触发人细胞毒性淋巴细胞针对人乳腺肿瘤靶物的溶解活性。
还记载了从重组细胞培养物直接制备和分离双特异性抗体片段的多种技术。例如，已使用亮氨酸拉链生成双特异性抗体。Kostelny et al.，J.Immunol.148(5)：1547-1553(1992)。将来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽通过基因融合与两种不同抗体的Fab′部分连接。抗体同二聚体在铰链区还原而形成单体，然后重新氧化而形成抗体异二聚体。这种方法也可用于生成抗体同二聚体。由Hollinger et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993)描述的“双抗体”技术提供了构建双特异性抗体片段的替代机制。该片段包含通过接头相连的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述接头太短使得同一条链上的两个结构域之间不能配对。因此，迫使一个片段上的VH和VL结构域与另一个片段上的互补VL和VH结构域配对，由此形成两个抗原结合位点。还报道了通过使用单链Fv(sFv)二聚体构建双特异性抗体片段的另一种策略。参见Gruber et al.，J.Immunol.152：5368(1994)。
设想了具有超过两个效价的抗体。例如，可制备三特异性抗体。Tutt et al.，J.Immunol.147：60(1991)。
(vii)其它氨基酸序列修饰
设想了本文所述抗体的氨基酸序列修饰。例如，可能希望改进抗体的结合亲和力和/或其它生物学特性。通过将适宜的核苷酸改变引入抗体核酸或者通过肽合成来制备抗体的氨基酸序列变体。此类修饰包括例如抗体氨基酸序列内的残基删除和/或插入和/或替代。只要最终的构建物具有期望特性，可进行删除、插入和替代的任意组合以获得最终的构建物。氨基酸变化还可改变抗体的翻译后加工，诸如改变糖基化位点的数目或位置。
可用于鉴定抗体中作为优选诱变位置的某些残基或区域的一种方法称作“丙氨酸扫描诱变”，如Cunningham and Wells，Science 244：1081-1085(1989)所述。这里，鉴定了一个残基或一组靶残基(例如带电荷的残基，诸如精氨酸、天冬氨酸、组氨酸、赖氨酸和谷氨酸)，并用中性或带负电荷的氨基酸(最优选丙氨酸或聚丙氨酸)替代，以影响氨基酸与抗原的相互作用。然后通过在或对替代位点引入更多或其它变体，推敲那些对替代展现出功能敏感性的氨基酸位置。如此，虽然引入氨基酸序列变异的位点是预先决定的，但是突变本身的性质不需要预先决定。例如，为了分析在给定位点处的突变的后果，在靶密码子或区域进行丙氨酸扫描或随机诱变，并对所表达的抗体变体筛选期望活性。
氨基酸序列插入包括氨基和/或羧基末端的融合，长度范围从一个残基至包含上百个或更多残基的多肽，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的例子包括具有N-末端甲硫氨酰残基的抗体或与细胞毒性多肽融合的抗体。抗体分子的其它插入变体包括在抗体的N-或C-末端融合酶(例如用于ADEPT)或提高抗体血清半衰期的多肽。
另一类变体是氨基酸替代变体。这些变体在抗体分子中有至少一个氨基酸残基用不同残基替换。最感兴趣进行替代诱变的位点包括高变区，但也设想了FR改变。
任何不涉及保持抗体正确构象的半胱氨酸残基也可替代，通常用丝氨酸，以改进分子的氧化稳定性和防止异常交联。相反，可向抗体中添加半胱氨酸键以改善其稳定性(特别是当抗体是抗体片段诸如Fv片段时)。
特别优选的一类替代变体涉及替代亲本抗体(例如人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基。通常，选择用于进一步开发的所得变体相对于产生它们的亲本抗体将具有改进的生物学特性。产生此类替代变体的一种便利方法涉及使用噬菌体展示的亲和力成熟。简单的说，将数个高变区位点(例如6-7个位点)突变，在每个位点产生所有可能的氨基酸替代。如此产生的抗体变体以单价形式展示在丝状噬菌体颗粒上，作为与每个颗粒内包装的M13基因III产物的融合物。然后如本文所公开的对噬菌体展示的变体筛选其生物学活性(例如结合亲和力)。为了鉴定用于修饰的候选高变区位点，可进行丙氨酸扫描诱变以鉴定对抗原结合具有重要贡献的高变区残基。或者/另外，分析抗原-抗体复合物的晶体结构，以鉴定抗体和人HER2之间的接触点可能是有益的。此类接触残基及邻近残基是依照本文详述的技术进行替代的候选位点。一旦产生此类变体，如本文所述对该组变体进行筛选，可选择在一种或多种相关测定法中具有优良特性的抗体用于进一步的开发。
抗体的另一类氨基酸变体改变了抗体的原始糖基化模式。改变意味着删除在抗体中发现的一个或多个碳水化合物模块，和/或添加抗体中不存在的一个或多个糖基化位点。
抗体的糖基化典型的或是N-连接的或是O-连接的。N-连接指碳水化合物模块附着于天冬酰胺残基的侧链。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X是除脯氨酸外的任何氨基酸)是将碳水化合物模块酶促附着于天冬酰胺侧链的识别序列。如此，多肽中这两种三肽序列任一的存在产生了潜在的糖基化位点。O-连接的糖基化指将糖类N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一附着于羟基氨基酸，最常见的是丝氨酸或苏氨酸，但也可使用5-羟脯氨酸或5-羟赖氨酸。
向抗体中添加糖基化位点可通过改变氨基酸序列使其包含一个或多个上述三肽序列而便利的完成(用于N-连接的糖基化位点)。所述改变还可通过向原始抗体的序列中添加或替代一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基来进行(用于O-连接的糖基化位点)。
若抗体包含Fc区，则可改变附着其上的碳水化合物。例如，美国专利申请US 2003/0157108 A1(Presta，L.)中记载了有缺乏岩藻糖的成熟碳水化合物结构附着于抗体Fc区的抗体。还可参见US 2004/0093621 A1(KyowaHakko Kogyo Co.，Ltd.)。WO 03/011878(Jean-Mairet等人)和美国专利第6,602,684号(Umana等人)中提到了在附着于抗体Fc区的碳水化合物中有等分N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)的抗体。WO 97/30087(Patel等人)中报告了在附着于抗体Fc区的寡糖中有至少一个半乳糖残基的抗体。关于有更改碳水化合物附着于其Fc区的抗体还可参见WO 98/58964(Raju，S.)和WO 99/22764(Raju，S.)。
可能希望在效应器功能方面修饰本发明的抗体，例如增强抗体的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)。这可通过在抗体Fc区中引入一个或多个氨基酸替代来实现。或者/另外，可在Fc区中引入半胱氨酸残基，从而容许在该区中形成链间二硫键。如此产生的同二聚体抗体可具有改进的内在化能力和/或提高的补体介导的细胞杀伤和抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)。参见Caron et al.，J.Exp.Med.176：1191-1195(1992)和Shopes，B.，J.Immunol.148：2918-2922(1992)。具有增强的抗肿瘤活性的同二聚体抗体还可使用如Wolff et al.，Cancer Research 53：2560-2565(1993)中记载的异双功能交联剂来制备。或者，抗体可改造成具有双重Fc区，由此可具有增强的补体溶解和ADCC能力。参见Stevenson et al.，Anti-Cancer Drug Design 3：219-230(1989)。
WO 00/42072(Presta，L.)记载了在存在人效应细胞时具有改进的ADCC功能的抗体，其中所述抗体在其Fc区中包含氨基酸替代。优选的是，具有改进的ADCC的抗体在Fc区的位置298、333和/或334包含替代。优选的是，改变的Fc区是在这些位置中的一个、两个或三个处包含替代或由其组成的人IgG1 Fc区。
WO 99/51642、美国专利第6,194,551 B1号、美国专利第6,242,195 B1号、美国专利第6,528,624 B1号和美国专利第6,538,124号(Idusogie等人)中记载了具有改变的Clq结合和/和补体依赖性细胞毒性(CDC)的抗体。所述抗体在其Fc区的氨基酸位置270、322、326、327、329、313、333和/或334(如Kabat中那样使用Fc区残基的Eu编号)中的一个或多个处包含氨基酸替代。
为了延长抗体的血清半衰期，可如例如美国专利第5,739,277号中所述将补救受体结合表位掺入抗体(尤其是抗体片段)。在用于本文时，术语“补救受体结合表位”指IgG分子(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的Fc区中负责延长IgG分子体内血清半衰期的表位。
WO 00/42072(Presta，L)和US 2005/0014934 A1(Hinton et al.)中记载了具有改进的对新生儿Fc受体(FcRn)的结合和延长的半衰期的抗体。这些抗体包含其中具有一处或多处改进Fc区对FcRn结合的替代的Fc区。例如，Fc区可在其一个或多个下列位置具有替代：238、250、256、265、272、286、303、305、307、311、312、314、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424、428或434(如Kabat中那样使用Fc区残基的Eu编号)。优选的具有改进的FcRn结合的含Fc区抗体变体在其Fc区的位置307、380和434中的一个、两个或三个处包含氨基酸替代。
还设想了具有三个或更多(优选四个)功能性抗原结合位点的工程改造抗体(美国申请号US 2002/0004587 A1，Miller等人)。
编码抗体氨基酸序列变体的核酸分子可通过本领域知道的多种方法制备。这些方法包括但不限于从天然来源分离(在天然存在氨基酸序列变体的情况中)，或者通过对早期制备的变体或非变体型式的抗体进行寡核苷酸介导的(或定点)诱变、PCR诱变和盒式诱变来制备。
(viii)免疫偶联物
本发明还涉及包含偶联有细胞毒剂的抗体的免疫偶联物，所述细胞毒剂诸如化疗剂、毒素(例如小分子毒素或者细菌、真菌、植物或动物起源的酶活毒素，包括其片段和/或变体)或放射性同位素(即放射偶联物)。
上文已经描述了可用于生成此类免疫偶联物的化疗剂。本文还设想了抗体与一种或多种小分子毒素的偶联物，诸如加利车霉素、美登素(美国专利第5,208,020号)、单端孢菌毒素和CC1065。
在本发明的一个优选实施方案中，将抗体与一个或多个美登素分子偶联(例如每个抗体分子偶联约1个至约10个美登素分子)。例如，可将美登素转变为May-SS-Me，后者可还原为May-SH3并与经修饰抗体反应(Chari etal.，Cancer Research 52：127-131(1992))以生成美登木素生物碱-抗体免疫偶联物。
另一种感兴趣的免疫偶联物包含偶联有一个或多个加利车霉素分子的抗体。加利车霉素抗生素家族能够在亚皮摩尔浓度产生双链DNA断裂。可使用的加利车霉素的结构类似物包括但不限于γ1 I、α2 I、α3 I、N-乙酰基-γ1 I、PSAG和θI 1(Hinman et al.，Cancer Research 53：3336-3342(1993)和Lode et al.，Cancer Research 58：2925-2928(1998))。还可参见美国专利第5,714,586号；第5,712,374号；第5,264,586号和第5,773,001号，明确收入本文作为参考。
可使用的酶活毒素及其片段包括白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单孢菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒素(modeccin)A链、α-帚曲毒素(sarcin)、油桐(Aleurites fordii)毒蛋白、香石竹(dianthin)毒蛋白、美洲商陆(Phytolaca Americana)毒蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(momordicacharantia)抑制物、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制物、白树毒素(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依诺霉素(enomycin)和单端孢菌毒素(tricothecenes)。参见例如1993年10月28日公开的WO 93/21232。
本发明还设想了抗体与具有核酸水解活性的化合物(例如核糖核酸酶或DNA内切核酸酶诸如脱氧核糖核酸酶；DNA酶)之间形成的免疫偶联物。
有多种放射性同位素可用于生成放射偶联的HER2抗体。例子包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32和Lu的放射性同位素。
可使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备抗体和细胞毒剂的偶联物，诸如N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二巯基)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚氨基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己胺-1-羧酸酯、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酸酯(诸如盐酸己二酰亚胺二甲酯)、活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对重氮苯甲酰基)己二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2，6-二异氰酸酯)、和双活性氟化合物(诸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)的双功能衍生物。例如，可如Vitetta et al.，Science 238：1098(1987)中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核素与抗体偶联的例示性螯合剂。参见WO 94/11026。接头可以是便于在细胞中释放细胞毒性药物的“可切割接头”。例如，可使用酸不稳定接头、肽酶敏感接头、二甲基接头或含二硫化物接头(Chari et al.，CancerResearch 52：127-131(1992))。
或者，可例如通过重组技术或肽合成来制备包含抗体和细胞毒剂的融合蛋白。
本文还设想了其它免疫偶联物。例如，可将抗体与多种非蛋白质性质聚合物中的一种连接，例如聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧化烯、或聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物。还可将抗体包载于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中(例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)、在胶状药物传递系统中(例如脂质体、清蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)、或在粗滴乳状液中。此类技术公开于《Remington′sPharmaceutical Sciences》，第16版，Osol，A.编，1980。
本文公开的抗体还可配制成免疫脂质体。可通过本领域知道的方法来制备包含抗体的脂质体，诸如Epstein et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：3688(1985)；Hwang et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4030(1980)；美国专利第4,485,045号和第4,544,545号；1997年10月23日公开的WO 97/38731中所记载的。美国专利第5,013,556号中公开了循环时间延长的脂质体。
特别有用的脂质体可用含有磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG衍生化磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物通过反相蒸发法生成。将脂质体挤过具有限定孔径的滤器，以产生具有期望直径的脂质体。可如Martin et al.，J.Biol.Chem.257：286-288(1982)中所记载的，将本发明抗体的Fab’片段经二硫化物交换反应与脂质体偶联。任选在脂质体中包含化疗剂。参见Gabizon et al.，J.National Cancer Inst.81(19)：1484(1989)。
IV.药用配制剂
通过将具有期望纯度的MMP拮抗剂与任选的药学可接受的载体、赋形剂或稳定剂(《Remington′s Pharmaceutical Sciences》，第16版，Osol，A.编，1980)混合，以冻干剂型或水溶液的形式，制备依照本发明使用的MMP拮抗剂的治疗用配制剂供贮存。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度对接受者是无毒的，包括缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯化己烷双胺；苯扎氯铵、苯索氯铵；酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖类，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐反荷离子，诸如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。WO97/04801中记载了冻干抗体配制剂，在此明确收入作为参考。
本文中的配制剂还可含有超过一种所治疗具体适应症所必需的活性化合物，优选那些活性互补且彼此没有不利影响的。下文治疗方法部分中描述了可与MMP拮抗剂联合的各种药物。合适的是，所述分子以对于预定目的有效的量组合。
活性成分还可包载于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中(例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)、在胶状药物投递系统中(例如脂质体、清蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)、或在粗滴乳状液中。此类技术公开于例如《Remington′sPharmaceutical Sciences》，第16版，Osol，A.编，1980。
可制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适例子包括含有抗体的固体疏水性聚合物半透性基质，该基质是定型产品的形式，例如薄膜或微胶囊。持续释放基质的例子包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利第3,773,919号)、L-谷氨酸和L-谷氨酸γ乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯共聚物、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物诸如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的可注射微球体)及聚-D-(-)-3-羟基丁酸。
用于体内施用的配制剂必须是无菌的。这可容易的通过使用无菌滤膜过滤来实现。
V.治疗
上文定义部分列出了可用MMP拮抗剂治疗的各种癌症的例子。MMP拮抗剂的施用将导致癌症的体征或症状的改善。
依照已知方法对人类患者施用MMP拮抗剂，诸如静脉内施用，例如推注(bolus)或一段时间的连续输注，通过肌肉内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服、局部或吸入路径。
对于疾病的预防或治疗，MMP拮抗剂的剂量将取决于如上定义的待治疗癌症的类型、癌症的严重程度和进程、施用抗体是为了预防还是治疗目的、先前的疗法、患者的临床史和对抗体的响应、及主治医师的判断。
虽然MMP拮抗剂可以是施用的唯一抗肿瘤药物，但是任选用MMP拮抗剂与一种或多种其它抗肿瘤剂的组合来治疗患者。
联合施用包括使用分开的配制剂(separate formulations)或单一的药用配制剂(single pharmaceutical formulation)的共施用(coadministration)或同时施用(concurrent administration)，以及任一次序的连续施用，其中优选有一段时间所有两种(或所有)活性剂同时发挥其生物学活性。如此，可在施用MMP拮抗剂之前或之后施用其它抗肿瘤剂。在此实施方案中，至少一次MMP拮抗剂的施用和至少一次其它抗肿瘤剂的施用之间的计时优选为约1个月或更短，最优选约2周或更短。或者，以单一的配制剂或分开的配制剂同时对患者施用MMP拮抗剂和其它抗肿瘤剂。MMP拮抗剂和其它抗肿瘤剂的联合治疗可对患者产生协同的、或者大于累加的治疗效益。
可与MMP拮抗剂联合的第二抗肿瘤剂的例子包括：一种或多种化疗剂；HER抑制剂(例如trastuzumab、pertuzumab、cetuximab、ABX-EGF、EMD7200、gefitinib、erlotinib、CP724714、CI1033、GW572016、IMC-11F8、TAKl65等)；Raf和/或ras抑制剂(参见例如WO 2003/86467)；生长抑制性HER2抗体，诸如trastuzumab；HER二聚化抑制剂，诸如Pertuzumab；诱导过表达HER2的细胞凋亡的HER2抗体，诸如7C2、7F3、或其人源化变体；针对肿瘤相关抗原诸如EGFR、HER3、HER4的抗体；抗激素化合物，例如抗雌激素化合物诸如他莫昔芬，或芳香酶抑制剂；心脏保护剂(以预防或减轻与治疗有关的任何心肌功能障碍)；细胞因子；EGFR靶向药物(诸如TARCEVA、IRESSA或Cetuximab)；抗血管发生剂(尤其是Genentech以商标AVASTINTM销售的bevacizumab)；酪氨酸激酶抑制剂；COX抑制剂(例如COX-1或COX-2抑制剂)；非类固醇抗炎药，Celecoxib(CELEBREX)；法呢基转移酶抑制剂(例如可从Johnson and Johnson购买的Tipifarnib/ZARNESTRA R115777或可从Schering-Plough购买的Lonafarnib SCH66336)；结合癌胚蛋白CA 125的抗体，诸如Oregovomab(MoAb B43.13)；HER2疫苗(诸如Pharmexia的HER2 Auto Vac疫苗，或Dendreon的APC8024蛋白质疫苗，或GSK/Corixa的HER2肽疫苗)；盐酸多柔比星脂质体注射液(DOXIL)；拓扑异构酶I抑制剂，诸如托泊替康；紫杉烷；HER2和EGFR双重酪氨酸激酶抑制剂，诸如lapatinib/GW572016；TLK286(TELCYTA)；EMD-7200；降体温药物，诸如醋氨酚(acetaminophen)、苯海拉明(diphenhydramine)或麦啶(meperidine)；造血生长因子；等。
任何上述共施用药剂的合适剂量就是那些目前所使用的剂量，而且可由于该药剂与MMP拮抗剂的联合作用(协同作用)而降低。
在上述治疗方案之外，还可对患者进行手术去除癌细胞和/或放疗。
在对患者施用蛋白质MMP拮抗剂之外，本申请设想了通过基因疗法来施用MMP拮抗剂。参见例如1996年3月14日公布的WO 96/07321，它关注使用基因疗法来生成胞内抗体。
有两种主要方法使核酸(任选包含在载体中)进入患者的细胞，即体内和回体(ex vivo)。对于体内投递，通常在需要抗体的部位将核酸直接注射到患者体内。对于回体治疗，采集患者的细胞，将核酸导入这些分离的细胞，并将经过修饰的细胞或是直接施用于患者，或是例如装入多孔膜内并植入患者体内(参见例如美国专利第4,892,538号和第5,283,187号)。有多种技术可用于将核酸导入可存活细胞。这些技术根据是将核酸转移至体外培养细胞还是目的宿主的体内细胞而有所变化。适于在体外将核酸转移到哺乳动物细胞中的技术包括使用脂质体、电穿孔、显微注射、细胞融合、DEAE-右旋糖苷、磷酸钙沉淀法等。常用于回体投递基因的载体是逆转录病毒。
目前优选的体内核酸转移技术包括用病毒载体(诸如腺病毒、I型单纯疱疹病毒或腺伴随病毒)和基于脂质的系统(可用于脂质介导的基因转移的脂质有例如DOTMA、DOPE和DC-Chol)进行的转染。在有些情况中，希望与靶向靶细胞的试剂一起提供核酸源，诸如对细胞表面膜蛋白或靶细胞特异的抗体、靶细胞上受体的配体等。在采用脂质体时，与胞吞作用相关细胞表面膜蛋白结合的蛋白质可用于靶向和/或促进摄入，例如对特定细胞类型具有向性的衣壳蛋白或其片段、在循环中进行内在化的蛋白质的抗体、和靶向细胞内定位和增加细胞内半衰期的蛋白质。例如Wu et al.，J.Biol.Chem.262：4429-4432(1987)；Wagner et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：3410-3414(1990)中记载了受体介导的胞吞技术。关于目前已知的基因标记和基因治疗方案的综述参见Anderson et al.，Science 256：808-813(1992)。还可参见WO93/25673及其引用的参考文献。
VI.材料保藏
以下杂交瘤细胞系已保藏于美国典型培养物保藏中心(American TypeCulture Collection，10801 University Boulevard，Manassas，VA 20110-2209USA)(ATCC)：
抗体名称    ATCC编号         保藏日期
7C2         ATCC HB-12215    1996年10月17日
7F3         ATCC HB-12216    1996年10月17日
4D5    ATCC CRL 10463   1990年5月24日
2C4    ATCC HB-12697    1999年4月8日
下文非限制性实施例例示了本发明的进一步详情。在此明确收入说明书中所有引文的公开内容作为参考。
实施例
下文实施例研究了基质金属蛋白酶(MMP)在HER2脱落中的作用。
材料和方法
细胞培养和转染
此项研究中所使用的所有细胞系来自美国典型培养物保藏中心(ATCC，Manassas，VA)。BT 474、MCF-7和SKBR-3细胞在补充有10％热灭活FBS和2mM L-谷氨酰胺的高葡萄糖DMEM∶Ham氏F12(50∶50)中维持。Cos-7细胞在补充有10％热灭活FBS和2mM L-谷氨酰胺的高葡萄糖DMEM中维持。细胞系在供应有5％CO2的增湿培养箱中于37℃维持。BT 474和SKBR-3细胞使用试剂盒V依照制造商的说明书(AMAXATM)所述电穿孔法所述瞬时转染。Cos-7细胞使用LIPOFECTAMINETM 2000(Invitrogen)依照制造商的建议如所述转染。
Fo5和f2:1282小鼠异种移植肿瘤系
Fo5和f2:1282系先前已有记载(Finkle et al.，Clin.Cancer Res.10：2499-2511(2004))。这些系衍生自来自MMTV HER2转基因小鼠的原发性肿瘤并在FVB小鼠的乳房脂肪垫中传代。
GM6001注射
将Fo5肿瘤移植到FVB小鼠中并在启动研究前让其生长至平均大小400-600mm3。GM6001(3-[N-羟基羰酰基]-[2R]-异丁基丙酰基-L-色氨酸甲酰胺，3-[N-hydroxycarbomyl]-[2R]-isobutylpropionyl-L-tryptophanmethylamide)来自Calbiochem，在4％羧甲基纤维素/0.9％PBS的浆液中重建，并以100mg/kg体重通过腹膜内注射每天施用一次，持续3天。第三天的注射后24小时，将动物处死并通过心脏穿刺收集血清。在第0天和第4天测量肿瘤大小。取出肿瘤并瞬间冻结，供进一步分析。
RNA制备和AFFYMETRIXTM阵列
使用RNAEASYTM试剂盒(Qiagen，Chatsworth，CA)从瞬间冻结的肿瘤样品分离总RNA。通过DNA酶I处理(Roche Molecular Biochemicals)除去残余的基因组DNA。如先前所述(Jin，H et al.，Circulation 103：736-742(2001))进行和分析微阵列实验。将样品与AFFYMETRIXTM小鼠基因组单一阵列(MOE430P)和已知基因阵列(MOE430A)(AFFYMETRIXTM，Inc.，Santa Clara，CA)杂交。对于三份Fo5和三份f2:1282肿瘤样品，进行一式三份的实验。进行Mann-Whitney成对比较，认为那些一致性超过80％的表达具有2倍增量的基因是显著的。使用GeneLogic Bioexpress数据库(GeneLogic，Gaithersburg，MD)，即来自细胞系和组织的AFFYMETRIXTM微阵列分析的基因表达数据集合，检查蛋白酶的表达，所述蛋白酶是从Fo5-f2:1282肿瘤差异筛选SKBR-3和BT 474细胞系中的表达鉴定的。
HER2 ECD ELISA
通过心脏穿刺收集来自携带Fo5或f2:1282异种移植肿瘤的小鼠的血清，并使用先前记载的HER2 ELISA(Finkle et al.，Clin.Cancer Res.10：2499-2511(2004))检测HER2 ECD水平。将血清用测定缓冲液(PBS/0.5％BSA，0.05％TWEEN 20/10ppm PROCLIN 300/0.2％ BGG/0.25％ CHAPS/0.15MNaCl/5mM EDTA(pH 7.4))1∶50稀释，接着进行1∶2连续稀释。遵循先前记载的流程(Sias et al.，J.Immunol.Meth.109：219-27(1990))，用山羊抗HER2多克隆抗体(Genentech)将脱落的HER2捕捉到NUNC Maxisorp板上，并用偶联有生物素的兔抗HER2多克隆抗体(Genentech)及后续AMDEXTM-链霉亲合素-辣根过氧化物酶抗体(Amersham Pharmacia Biotech)检测。对于细胞培养实验，如所述处理细胞，收集条件培养液，并用测定缓冲液1∶2连续稀释。从标准曲线的四参数拟合测定血清或条件培养液中脱落的HER2的浓度，其中使用纯化的重组HER2 ECD蛋白质(Genentech)作为标准品。
DNA构建物和蛋白质纯化
使用origen克隆作为模板，通过PCR将人MMP-15克隆到pRK5中。使用如下引物通过PCR产生C-末端V5His标记的全长型式：
5’-GCCGAAGCTTGCCACCATGGGCAGCGACCCGAGCGCG-3’
(SEQ ID NO.9)和
5’-GCTGTCTAGAGTTCACCGTCCGTGCCAGTGCCACCTCCTCC-3’
(SEQ ID NO.10)，
并克隆到pcDNA3.1V5His中。
使用如下引物通过PCR产生缺少跨膜结构域的可溶性型式MMP-15：
5’-GCCGAAGCTTGCCACCATGGGCAGCGACCCGAGCGCG-3’
(SEQ ID NO.11)和
5’-GCTGTCTAGAGACCCACTCCTGCAGCGAGCG-3’(SEQ ID NO.12)。
通过定点诱变用丙氨酸残基替代成熟蛋白质第260位氨基酸处的谷氨酰胺，产生MMP-15的无催化活性突变体(catalytically dead mutant)。
使用如下引物通过PCR产生pRK5.gDHER2-Fc(pRK5.gDHER2-IgG)：
5’-CGAGTCGACCTCGAGGCCAGCCCTCTGACGTCC-3’
(SEQ ID NO.13)和
5’-GGCACGCGTCGTCAGAGGGCTGGCTCTCTG-3’(SEQ ID NO.14)，
并克隆到经过XhoI-Mlu消化的pRK5.gDHER2-Fc中(Fitzpatrick et al.，FEBBSLett.431(1)：102-6(1998))。这导入了HER2的推定切割位点，该位点是从分离自SKBR-3条件培养液的纯化的HER2 ECD鉴定的(Yuan et al.，ProteinExpression and Purification 29：217-222(2003))。
还使用如下PCR产生只包含HER2的结构域IV的截短型式gDHER2-Fc：
5’-GGCCTCGAGGGCCTGGCCTGCCACCAG-3’(SEQ ID NO.15)和
5’-GGCACGCGTCGTCAGAGGGCTGGCTCTCTG-3’(SEQ ID NO.16)。
pRK5.HER3-Fc和pRK5.HER4-Fc先前已有记载(Fitzpatrick et al.，FEBBS Lett.431(1)：102-6(1998))。将FLAG表位(Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys；(SEQ ID NO.17))导入pRK5的N-末端。如先前所述将HER-Fc融合蛋白转染到293细胞中并从无血清的条件培养液纯化(Fitzpatrick et al.，FEBBS Lett.431(1)：102-6(1998))。可溶性MMP-15V5His和sMMP-15V5His(E260A)蛋白质由瞬时转染的293细胞条件培养液产生，并使用Ni-NTA琼脂糖依照制造商(Qiagen)的建议纯化。
MMP-15的shRNA敲低(knockdown)
评估几种不同shRNA在导入细胞时降低MMP-15蛋白质水平的能力。发现，针对人MMP-15最有效的shRNA识别bp5’-CCACCATCTGACCTTTAGCTT-3’(SEQ ID NO.18)，对应于nt 1396-1414(GENBANKTM编号NM_002428)。作为包含形成shRNA的内部发夹的如下寡聚物，将针对MMP-15的RNAi导入pSIREN载体(BD Biosciences)的BamHI-EcoRI位点：
5’-GATCCGCCACCATCTGACCTTTAGCTTCAAGAGAGCTAAAGGTCAGATGGTGGTTTTTTGCTAGCG-3’(SEQ ID NO.19)和
5’-AATTCGCTAGCAAAAAACCACCATCTGACCTTTAGCTCTCTTGAAGCTAAAGGTCAGATGGTGGCG-3’(SEQ ID NO.20)。
针对MMP-25的shRNA购自OPENBIOSYSTEMSTM。使用AMAXATM试剂盒V遵循制造商的建议，单独将pSIREN shRNA构建物或载体瞬时转染到SKBR-3和BT 474细胞中。48小时后，收集条件培养液并通过HER2 ELISA测定脱落HER2，使用2x样品缓冲液在板上直接裂解细胞。使用兔多克隆抗MMP-15抗体(Labvision目录号RB-1546-P)或小鼠单克隆抗HER2抗体Ab-15(Labvision目录号MS-599-P0)通过Western印迹检测MMP-15、全长HER2和p95 HER2蛋白质。
体外HER2切割测定
使用纯化的gDHER2-Fc融合蛋白作为底物，在体外测定候选蛋白酶切割HER2 ECD的能力。MT1-MMP(MMP-14)、MT2-MMP(MMP-15)、MT3-MMP(MMP-16)、MT4-MMP(MMP-19)和MT5-MMP(MMP-25)的纯化的催化结构域购自R&D systems。将纯化的MMP蛋白质与gDHER2-Fc或所述其它HER-Fc蛋白质在测定缓冲液(100mM Tris(pH＝7.4)，100mM NaCl，2.5μM ZnCl2，10mM CaCl2，0.001％Brij35)中以1∶100的酶∶底物比例混合，并于37℃温育20分钟。加入等体积的2x样品缓冲液(Invitrogen)终止反应，并在加载到4-20％Tris-甘氨酸梯度凝胶(Invitrogen)上之前煮沸5分钟。使用GEL CODE BLUETM染色剂(Pierce目录号24592)遵循制造商的建议通过染色显现蛋白质。使用自动化蛋白质测序仪通过自动化Edman降解法(Kishiyama，A.，Anal.Chem.72(21)：5431-6(2000))，通过N-末端蛋白质测序测定MMP切割位点。
免疫沉淀测定法和Western印迹
使用LIPOFECTAMINETM 2000，将Cos-7细胞用pRK5.Flag-HER2和pcDNA3.MMP-15构建物共转染，或者单独用pcDNA3.1载体转染。让细胞恢复48小时。将转染细胞用PBS漂洗，并在裂解缓冲液(1％TRITON X-100TM，50mM Tris(pH＝7.4)，150mM NaCl，1mM PMSF，10μg/ml亮抑酶肽(leupeptin)，10U/ml抑酶肽(aprotinin)，2mM Na2VO4)中裂解。通过离心除去裂解物中的不溶性物质，使用BCA蛋白质测定试剂盒(Pierce目录号23229)测定总蛋白质水平。将200μg总细胞蛋白质加到裂解缓冲液中至终体积1ml，使用抗FlagM2-琼脂糖(Sigma)或与蛋白A/G琼脂糖复合的多克隆抗MMP-15抗体免疫沉淀Flag-HER2。将免疫复合物用裂解缓冲液清洗2次，并重悬于SDS样品缓冲液中煮沸。将样品在4-12％Tris-甘氨酸梯度凝胶(Invitrogen)上分开并转移至硝酸纤维素膜。如所述将印迹在5％BSA/TBST中封闭，并用针对MMP-15或HER2的抗体及后续的偶联有过氧化物酶的抗小鼠或兔二抗探查。通过增强型化学发光(ECL，Amersham Pharmacia Biotech)使印迹显影。
将Fo5和f2:1282肿瘤重悬于含蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液，并使用POLYTRON TISSUEMIZERTM(PT2100)在冰上匀浆。通过离心除去肿瘤裂解物中的不溶性物质，使用BCA蛋白质测定试剂盒测定总蛋白质水平。使用与蛋白A/G sepharaose复合的小鼠单克隆抗体Ab-15(Labvision目录号MS-599-P0)，从来自至少三份独立肿瘤裂解物的1mg总蛋白质于4℃免疫沉淀HER2过夜。通过离心使复合物成团，用裂解缓冲液清洗两次，重悬于SDS样品缓冲液并煮沸。将样品在4-12％Tris-甘氨酸凝胶上分开并转移至硝酸纤维素膜。用检测磷酸化HER2的小鼠单克隆抗体Ab-18(Labvision目录号MS-1072-P)或Ab-15(Labvsion目录号MS-599-P0)探查印迹。使用检测MMP-14的兔多克隆Ab-1(Labvision目录号RB-1544-P)、检测MMP-15的兔多克隆Ab-1(Labvision目录号RB-1546-P)或检测MMP-25的兔多克隆Ab-1(Oncogene Research Products目录号PC499)，通过来自50ug肿瘤裂解物或者来自50ug BT 474或MCF-7或SKBR-3细胞裂解物的Western印迹，评估MMP-14、MMP-15和MMP-25的表达。
通过50μg细胞裂解物的Western印迹测定活化的MAPK(Cell SignalingTechnology目录号9101)、PhosphoAkt Ser473(Cell Signaling Technology目录号9271)、总Akt(Cell Signaling Technology目录号9272)、总Erk(CellSignaling Technology目录号9102)或phosphoHER3(Cell Signaling Technology目录号4791)。
增殖测定
将细胞以104细胞/孔的密度一式四份接种到96孔板(Nunc)中并让其贴壁过夜。如所示处理细胞，或者如所示转染。温育3天后，向每个孔中加入25μl Alamar blue试剂(Trek Diagnostic Systems，目录号00-100)，继续温育3小时。在荧光计中依照制造商的建议对板读数，激发波长530nm，发射波长590nm。如先前所述测定相对于未刺激或对照转染细胞的增殖(Lewis et al.，Cancer Res.56(6)：1457-65(1996))。
结果
HER2的ECD通过蛋白水解从培养的乳腺癌细胞上脱落，并在转移性乳腺癌患者的血清中检测到，在这种情况中它与不良临床预后有关(Molina etal.，Cancer Res.61：4744-4749(2001))。然而，HER2脱落的生物学作用尚不清楚。本文中的实验是为了鉴定HER2脱落酶(sheddase)而进行的。
HER2脱落酶的鉴定可能也是重要的，因为先前证实trastuzumab在乳腺癌细胞系中抑制脱落(Molina et al.，Cancer Res.61：4744-4749(2001))。与先前报道的结果一致，trastuzumab在10μg/ml的浓度在乳腺癌细胞系BT 474和SKBR-3细胞中将脱落降低超过60％(图5，左图)，并且在这些细胞系中将细胞增殖降低50％(图5，右图)。
使用衍生自MMTVHER2转基因小鼠(Finkle et al.，Clin.Cancer Res.10：2499-2511(2004))的乳腺肿瘤的动物模型系统来鉴定HER2脱落酶。此动物模型系统可重现地将不同水平的HER2脱落到血清中，并且对trastuzumab展现出不同的敏感性(图6，右图)。血清HER2水平的这种差异还与从三份独立Fo5肿瘤细胞裂解物免疫沉淀的蛋白质片段的存在很有关联，该蛋白质片段表观分子量为95kD，与p95 HER2的大小一致(图6，左下图)。此片段在Fo5肿瘤细胞裂解物中组成性磷酸化，表明此片段在这些肿瘤中可能具有生物学活性。HER2脱落酶水平的升高可能有助于此系的trastuzumab抗性，因为trastuzumab的表位将通过蛋白水解切割而丧失(Cho et al.，Nature 421：756-760(2003))。
因为Fo5肿瘤系脱落更高水平的HER2且具有高水平的p95 HER2片段，所以通过差异表达分析这种方法来鉴定在Fo5肿瘤中相对于f2:1282肿瘤上调的转录物。从来自平均肿瘤大小300-600mm3的Fo5肿瘤或f2:1282肿瘤的3份个别肿瘤样品制备RNA。将来自每份独立肿瘤样品的RNA一式三份与AFFYMETRIXTM小鼠基因组单一阵列芯片(MOE430P)和已知基因阵列(MOE430A)杂交。进行Mann-Whitney成对比较，在Fo5肿瘤样品中鉴定出638种上调的转录物。因为BT 474和SKBR-3细胞系也将HER2 ECD脱落到条件培养液中(图5，左图)，所以还使用Genelogic Bioexpress数据库将此表与在两种细胞系中都表达的转录物进行比较。图7图示了用于鉴定HER2脱落酶的方法。
为了减少候选基因的数目，使用通用金属蛋白酶抑制剂GM6001来评估MMP活性是否在调控HER2脱落中发挥作用。根据HER2 ECD ELISA的测定(图8，左图)，GM6001确实在SKBR-3细胞中剂量依赖性地抑制HER2脱落，其立体异构体则不然。此结果与先前发表的报告一致，即通用金属蛋白酶抑制剂BB-94在乳腺癌细胞系中抑制HER2 ECD脱落(Codony-Servat etal.，Cancer Res.59：1196-1201(1999))。Timp-1、Timp-2和Timp-3是调控金属蛋白酶活性的天然存在的肽(Overall and Lopez-Otin，Nature ReviewsCancer 2：657-672(2002))。以1μg/ml的浓度向SKBR-3细胞的条件培养液中添加纯化的Timp-1、Timp-2或Timp-3降低了HER2 ECD的水平(图8，右图)。然而，Timp-2降低HER2 ECD脱落最有效(图8，右图)。已知Timp-2有效抑制金属蛋白酶的MT-MMP亚家族(Overall and Lopez-Otin，NatureReviews Cancer 2：657-672(2002))。这些资料说明在SKBR-3和BT 474细胞中导致HER2脱落的蛋白酶是金属蛋白酶，显著减少了从生物信息学筛选鉴定的候选物的数目。
根据GENELOGICTM数据库，MT-MMP家族的几个成员在SKBR-3和BT 474细胞中表达。根据AFFYMETRIXTM微阵列数据，MT1-MMP和MT2-MMP也都在Fo5肿瘤中表达。为了确定这些转录物是否表达，将Fo5和f2:1282肿瘤及乳腺癌细胞系裂解物用针对这些MT-MMP的多克隆抗体进行免疫印迹，所述抗体识别人和小鼠二者的蛋白质(图9)。所有细胞系都表达MMP-14、MMP-15和MMP-25，但水平不同。虽然MMP-14在f2:1282和Fo5肿瘤细胞裂解物中都表达，但是MMP-15在Fo5肿瘤裂解物中大量表达。此结果与表明Fo5肿瘤中MMP-15的mRNA表达水平高2倍的Mann-Whitney比较一致。为了验证MMP-15在肿瘤的上皮细胞而非周围的基质细胞中表达，将Fo5和f2:1282肿瘤进行切片并用抗HER2抗体(Dako)或抗MMP-15抗体(Ab-1)染色。f2:1282和Fo5肿瘤都表达人HER2，但是MMP-15在Fo5肿瘤中的表达比f2:1282肿瘤的量更大。
传统上认为MT-MMP成员的底物是胞外基质蛋白质。建立了生化测定法以对从微阵列数据鉴定的候选物测试其体外切割全长HER2。此测定法使用纯化的重组融合蛋白作为候选蛋白酶的底物，所述融合蛋白由N-末端gD表位标记的HER2 ECD与人IgG的重链Fc以符合读码框的方式组成。这些研究中使用了几种不同的蛋白质。gDHER2(+)-IgG包含HER2 ECD的氨基酸第2-656位(GenBank编号AAA75493)，gDHER2(-)-IgG包含HER2 ECD的氨基酸第2-626位。gDHER2(+)-IgG重组蛋白包含先前已知证明包含推定HER2脱落酶位点(PA/EQR/ASP；SEQ ID NO.23)的近膜序列，而gDHER2(-)-IgG蛋白缺少此序列(Yuan et al.，Protein Expression andPurification 29：217-222(2003))。此测定法中还使用了截短型式的gDHER2(+)-IgG，即gDHER2(DIV)-IgG，它只有以符合读码框的方式融合的HER2的结构域IV(DIV)和人Fc。将MMP-14、MMP-15、MMP-16、MMP-19和MMP-25的纯化的催化结构域(catalytic domains)与gDHER2(DIV)-IgG于37℃温育20分钟。除MMP-14以外的所有MT-MMP有效切割gDHER2(DIV)-IgG底物(图13，左图)。切下切割后的蛋白质产物，进行N-端测序以鉴定切割位点。所有四种MT-MMP都在已发表的序列位点附近切割HER2(Yuan et al.，Protein Expression and Purification 29：217-222(2003))(图13，右图)。
具有序列PINCTHSCVDLDDKGCPAEQRASPASPLTSIV(SEQ ID NO.21)的HER2-Fc融合蛋白是这四种MMP在体外的底物(图14)。此资料说明HER2是MMP-15的底物。
MT-MMP底物识别可能受到血红素结合蛋白结构域(hemopexin domain)的影响(Overall and Lopez-Otin，Nature Reviews Cancer 2：657-672(2002))。在293细胞中瞬时表达具有C-末端V5 His表位的可溶性形式的MMP-15，并通过亲和层析从293条件培养液纯化。如图15所示，此可溶性形式的MMP-15在体外脱落酶测定法中也能切割gDHER2(+)-IgG。
为了确定MMP-15和HER2是否能在膜中结合，使用瞬时转染的Cos-7细胞进行免疫共沉淀测定法。将pRK5.FlagHER2与载体、pcDNA3.MMP-15V5His、pcDNA3.sMMP-15V5His或pcDNA3.MMP-15(E260A)共转染。用抗FLAG树脂免疫沉淀FlagHER2。图10显示了可溶性MMP-15和无催化活性(E260A)突变体都能与Flag-HER2结合。这与MMP-15可切割膜中的HER2的想法一致，因为野生型型式的蛋白酶，pcDNA3.MMP-15V5His，将切除FlagHER2 ECD，HER2-MMP-15复合物将不会免疫共沉淀。
从来自MMTVHER2转基因动物的乳腺肿瘤中已经鉴定出了体细胞点突变和删除及剪接变体(Siegel et al.，EMBO J.18：2149-2164(1999)；Finkle etal.，Clin.Cancer Res.10：2499-2511(2004))。这些突变最频繁的存在于HER2跨膜结构域附近的胞外结构域。Fo5肿瘤系有与HER2切割位点邻近的五个氨基酸删除，DLDDK(SEQ ID NO.22)，f2:1282肿瘤系有单一点突变，R变成C(C for R)(图12)。这些突变不影响MMP-15结合(图11)。然而，有可能的是DLDDK(SEQ ID NO.22)删除临近HER2 MMP切割位点可能影响该蛋白酶的酶活性。
RNA抑制(RNAi)是一种能下调目标转录物和蛋白质水平的方法。为了检验MMP-15在SKBR-3和BT 474细胞中的生物学作用，使用抗MMP-15RNAi构建物。在导入SKBR-3或BT 474细胞时，此shRNAi表达质粒在两种细胞类型中都降低MMP-15的内源蛋白质水平(图17，左上图)。此shRNA的转染还在两种细胞类型中都降低p95 HER2的量(图17，左下图)。这些细胞中MMP-15蛋白质的丢失在两种系中都显著降低HER2 ECD脱落(图17，右图)。然而，在将针对MMP-25的shRNAi导入任一细胞系时，没有观察到HER2 ECD脱落的显著降低(图17，右图)。这些实验强烈说明MMP-15的丢失显著影响HER2 ECD脱落。
通过RNAi降低MMP-15蛋白质水平还对SKBR-3和BT 474细胞的生长速率有影响(图18，左图)。针对MMP-25的shRNAi也再现这种效果。这说明在BT 474和SKBR-3细胞中降低HER2 ECD脱落还下调p95 HER2的量，由此降低细胞生长速率。在将gD标记的p95 HER2构建物导入这些细胞系时，在两种细胞系中都检测到相对于对照转染细胞的细胞生长速率的升高(图18，左图)。在以独立于配体的方式导入Cos-7细胞时，此构建物被组成性磷酸化并活化MAPK(图16)。然而，此构建物必须仍与HER3或EGFR异二聚化以活化Akt信号途径，与先前发表的研究一致(Xia et al.，Oncogene 23：646-653(2004))。gDp95HER2在SKBR-3细胞中的过表达不显著抑制这些细胞中trastuzumab介导的生长抑制(图18，右图)。
使用药理学方法来确定在Fo5肿瘤中MMP活性是否在调控HER2脱落和p95 HER2水平中发挥作用。每天一次给携带平均大小400-600mm3的Fo5肿瘤的FVB小鼠腹膜内注射GM6001或对照媒介物(control vehicle)，持续3天。第4天，收集血清并通过ELISA测定HER2 ECD，收集肿瘤并称重。从肿瘤细胞裂解物免疫沉淀HER2并通过Western印迹测定p95 HER2水平。用GM6001处理的动物显示出与对照动物相比p95 HER2量的显著降低(图19，右图)。在用媒介和GM6001处理的动物中血清HER2 ECD水平都降低(图19，左图)，然而，在用GM6001处理的动物中观察到更大降低。
总结
以上实验证明基质金属蛋白酶MMP-15在体外在与来自SKBR3细胞的纯化的脱落ECD一致的位点切割HER2，并且与全长HER2相互作用。降低此MMP的水平与HER2受体脱落的降低极好关联，并且在SKBR3和BT474细胞系中降低基础增殖水平。trastuzumab似乎通过间接调控MMP-15活性而抑制HER2受体脱落，但不与MMP-15竞争底物结合和切割。用MMP拮抗剂，诸如MMP-15拮抗剂，降低HER2脱落代表了用于治疗癌症的治疗方法，包括trastuzumab抗性癌症。
序列表
<110>健泰科生物技术公司(GENENTECH，INC.)
     Kendall D.Carey，Ralph H.Schwall，Mark X.Sliwkowski
<120>用基质金属蛋白酶拮抗剂抑制HER2脱落
<130>P2195R1
<150>US 60/651,348
<151>2005-02-09
<160>38
<210>1
<211>195
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>1
Thr Gln Val Cys Thr Gly Thr Asp Met Lys Leu Arg Leu Pro Ala
  1               5                  10                  15
Ser Pro Glu Thr His Leu Asp Met Leu Arg His Leu Tyr Gln Gly
                 20                  25                  30
Cys Gln Val Val Gln Gly Asn Leu Glu Leu Thr Tyr Leu Pro Thr
                 35                  40                  45
Asn Ala Ser Leu Ser Phe Leu Gln Asp Ile Gln Glu Val Gln Gly
                 50                  55                  60
Tyr Val Leu Ile Ala His Asn Gln Val Arg Gln Val Pro Leu Gln
                 65                  70                  75
Arg Leu Arg Ile Val Arg Gly Thr Gln Leu Phe Glu Asp Asn Tyr
                 80                  85                  90
Ala Leu Ala Val Leu Asp Asn Gly Asp Pro Leu Asn Asn Thr Thr
                 95                 100                 105
Pro Val Thr Gly Ala Ser Pro Gly Gly Leu Arg Glu Leu Gln Leu
                110                 115                 120
Arg Ser Leu Thr Glu Ile Leu Lys Gly Gly Val Leu Ile Gln Arg
                125                 130                 135
Asn Pro Gln Leu Cys Tyr Gln Asp Thr Ile Leu Trp Lys Asp Ile
                140                 145                 150
Phe His Lys Asn Asn Gln Leu Ala Leu Thr Leu Ile Asp Thr Asn
                155                 160                 165
Arg Ser Arg Ala Cys His Pro Cys Ser Pro Met Cys Lys Gly Ser
                170                 175                 180
Arg Cys Trp Gly Glu Ser Ser Glu Asp Cys Gln Ser Leu Thr Arg
                185                 190                 195
<210>2
<211>124
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
Thr Val Cys Ala Gly Gly Cys Ala Arg Cys Lys Gly Pro Leu Pro
  1               5                  10                  15
Thr Asp Cys Cys His Glu Gln Cys Ala Ala Gly Cys Thr Gly Pro
                 20                  25                  30
Lys His Ser Asp Cys Leu Ala Cys Leu His Phe Asn His Ser Gly
                 35                  40                  45
Ile Cys Glu Leu His Cys Pro Ala Leu Val Thr Tyr Asn Thr Asp
                 50                  55                  60
Thr Phe Glu Ser Met Pro Asn Pro Glu Gly Arg Tyr Thr Phe Gly
                 65                  70                  75
Ala Ser Cys Val Thr Ala Cys Pro Tyr Asn Tyr Leu Ser Thr Asp
                 80                  85                  90
Val Gly Ser Cys Thr Leu Val Cys Pro Leu His Asn Gln Glu Val
                95                  100                 105
Thr Ala Glu Asp Gly Thr Gln Arg Cys Glu Lys Cys Ser Lys Pro
                110                 115                 120
Cys Ala Arg Val
<210>3
<211>169
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>3
Cys Tyr Gly Leu Gly Met Glu His Leu Arg Glu Val Arg Ala Val
  1               5                  10                  15
Thr Ser Ala Asn Ile Gln Glu Phe Ala Gly Cys Lys Lys Ile Phe
                 20                  25                  30
Gly Ser Leu Ala Phe Leu Pro Glu Ser Phe Asp Gly Asp Pro Ala
                 35                  40                  45
Ser Asn Thr Ala Pro Leu Gln Pro Glu Gln Leu Gln Val Phe Glu
                 50                  55                  60
Thr Leu Glu Glu Ile Thr Gly Tyr Leu Tyr Ile Ser Ala Trp Pro
                 65                  70                  75
Asp Ser Leu Pro Asp Leu Ser Val Phe Gln Asn Leu Gln Val Ile
                 80                  85                  90
Arg Gly Arg Ile Leu His Asn Gly Ala Tyr Ser Leu Thr Leu Gln
                 95                 100                 105
Gly Leu Gly Ile Ser Trp Leu Gly Leu Arg Ser Leu Arg Glu Leu
                110                 115                 120
Gly Ser Gly Leu Ala Leu Ile His His Asn Thr His Leu Cys Phe
                125                 130                 135
Val His Thr Val Pro Trp Asp Gln Leu Phe Arg Asn Pro His Gln
                140                 145                 150
Ala Leu Leu His Thr Ala Asn Arg Pro Glu Asp Glu Cys Val Gly
                155                 160                 165
Glu Gly Leu Ala
<210>4
<211>142
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>4
Cys His Gln Leu Cys Ala Arg Gly His Cys Trp Gly Pro Gly Pro
  1               5                  10                  15
Thr Gln Cys Val Asn Cys Ser Gln Phe Leu Arg Gly Gln Glu Cys
                 20                  25                  30
Val Glu Glu Cys Arg Val Leu Gln Gly Leu Pro Arg Glu Tyr Val
                 35                  40                  45
Asn Ala Arg His Cys Leu Pro Cys His Pro Glu Cys Gln Pro Gln
                 50                  55                  60
Asn Gly Ser Val Thr Cys Phe Gly Pro Glu Ala Asp Gln Cys Val
                 65                  70                  75
Ala Cys Ala His Tyr Lys Asp Pro Pro Phe Cys Val Ala Arg Cys
                 80                  85                  90
Pro Ser Gly Val Lys Pro Asp Leu Ser Tyr Met Pro Ile Trp Lys
                 95                 100                 105
Phe Pro Asp Glu Glu Gly Ala Cys Gln Pro Cys Pro Ile Asn Cys
                110                 115                 120
Thr His Ser Cys Val Asp Leu Asp Asp Lys Gly Cys Pro Ala Glu
                125                 130                 135
Gln Arg Ala Ser Pro Leu Thr
                140
<210>5
<211>214
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>序列是合成的
<400>5
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
  1               5                  10                  15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn
                 20                  25                  30
Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
                 35                  40                  45
Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser
                 50                  55                  60
Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
                 65                  70                  75
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
                 80                  85                  90
His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu
                 95                 100                 105
Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
                110                 115                 120
Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu
                125                 130                 135
Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val
                140                 145                 150
Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu
                155                 160                 165
Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr
                170                 175                 180
Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu
                185                 190                 195
Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn
                200                 205                 210
Arg Gly Glu Cys
<210>6
<211>449
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>序列是合成的
<400>6
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
  1               5                  10                  15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys
                 20                  25                  30
Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
                 35                  40                  45
Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr
                 50                  55                  60
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser
                 65                  70                  75
Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
                 80                  85                  90
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr
                 95                 100                 105
Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
                110                 115                120
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser
                 125                130                 135
Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys
                 140                145                 150
Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
                155                 160                 165
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser
                170                 175                 180
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
                185                 190                 195
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
                200                 205                 210
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
                215                 220                 225
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
                230                 235                 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
                245                 250                 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
                260                 265                 270
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
                275                 280                 285
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn
                290                 295                 300
Ser Thr Tyr Arg Val Val Set Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
                305                 310                 315
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Ash Lys Ala
                320                 325                 330
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
                335                 340                 345
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
                350                 355                 360
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
                365                 370                 375
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
                380                 385                 390
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
                395                 400                 405
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
                410                  415                420
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
                425                 430                  435
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
                440                 445
<210>7
<211>214
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>序列是合成的
<400>7
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
  1               5                  10                  15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser
                 20                  25                  30
Ile Gly Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
                 35                  40                  45
Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser
                 50                  55                  60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
                 65                  70                  75
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
                 80                  85                  90
Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu
                 95                 100                 105
Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
                110                 115                 120
Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu
                125                 130                 135
Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val
                140                 145                 150
Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu
                155                 160                 165
Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr
                170                 175                 180
Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu
                185                 190                 195
Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn
                200                 205                 210
Arg Gly Glu Cys
<210>8
<211>448
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>序列是合成的
<400>8
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
  1               5                  10                  15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr
                 20                  25                  30
Asp Tyr Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
                 35                  40                  45
Glu Trp Val Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr
                 50                  55                  60
Asn Gln Arg Phe Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser
                 65                  70                  75
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
                 80                  85                  90
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr
                 95                 100                 105
Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
                110                 115                 120
Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
                125                 130                 135
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp
                140                 145                 150
Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu
                155                 160                 165
Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
                170                 175                 180
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
                185                 190                 195
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
                200                 205                 210
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
                215                 220                 225
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
                230                 235                 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
                245                 250                 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
                260                 265                 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
                275                 280                 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
                290                 295                 300
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
                305                 310                 315
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
                320                 325                 330
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
                335                 340                 345
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
                350                 355                 360
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
                365                 370                 375
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
                380                 385                 390
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
                395                 400                 405
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
                410                 415                 420
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
                425                 430                 435
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
                440                 445
<210>9
<211>37
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<400>9
gccgaagctt gccaccatgg gcagcgaccc gagcgcg      37
<210>10
<211>41
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<400>10
gctgtctaga gttcaccgtc cgtgccagtg ccacctcctc c 41
<210>11
<211>37
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<400>11
gccgaagctt gccaccatgg gcagcgaccc gagcgcg      37
<210>12
<211>31
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<400>12
gctgtctaga gacccactcc tgcagcgagc g            31
<210>13
<211>33
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<400>13
cgagtcgacc tcgaggccag ccctctgacg tcc                   33
<210>14
<211>30
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<400>14
ggcacgcgtc gtcagagggc tggctctctg                       30
<210>15
<211>27
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<400>15
ggcctcgagg gcctggcctg ccaccag                          27
<210>16
<211>30
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<400>16
ggcacgcgtc gtcagagggc tggctctctg                       30
<210>17
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>序列是合成的
<400>17
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
                  5
<210>18
<211>21
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<400>18
ccaccatctg acctttagct t                                21
<210>19
<211>66
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<400>19
gatccgccac catctgacct ttagcttcaa gagagctaaa ggtcagatgg 50
tggttttttg ctagcg                                      66
<210>20
<211>66
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<400>20
aattcgctag caaaaaacca ccatctgacc tttagctctc ttgaagctaa 50
aggtcagatg gtggcg                                      66
<210>21
<211>32
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>21
Pro Ile Asn Cys Thr His Ser Cys Val Asp Leu Asp Asp Lys Gly
  1               5                  10                  15
Cys Pro Ala Glu Gln Arg Ala Ser Pro Ala Ser Pro Leu Thr Ser
                 20                  25                  30
Ile Val
<210>22
<211>5
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>22
Asp Leu Asp Asp Lys
                  5
<210>23
<211>8
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>23
Pro Ala Glu Gln Arg Ala Ser Pro
                  5
<210>24
<211>42
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>24
Glu Glu Gly Ala Cys Gln Pro Ile Asn Cys Thr His Ser Cys Val
  1               5                  10                  15
Asp Leu Asp Asp Lys Gly Cys Pro Ala Glu Gln Arg Ala Ser Pro
                 20                  25                  30
Leu Thr Ser Ile Val Ser Ala Val Val Gly Ile Leu
                 35                  40
<210>25
<211>26
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>25
Glu Glu Gly Ala Cys Gln Pro Ile Asn Cys Thr His Ser Pro Leu
  1               5                  10                  15
Thr Ser Ile Val Ser Ala Val Val Gly Ile Leu
                 20                  25
<210>26
<211>37
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>26
Glu Glu Gly Ala Cys Gln Pro Ile Asn Cys Thr His Ser Cys Val
  1               5                  10                  15
Gly Cys Pro Ala Glu Gln Arg Ala Ser Pro Leu Thr Ser Ile Val
                 20                  25                  30
Ser Ala Val Val Gly Ile Leu
                 35
<210>27
<211>33
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>27
Glu Glu Gly Ala Cys Gln Pro Ile Asn Cys Thr His Ser Cys Val
  1               5                  10                  15
Asp Leu Asp Asp Lys Gly Cys Pro Ala Glu Gln Arg Ala Val Val
                 20                  25                  30
Gly Ile Leu
<210>28
<211>16
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>28
Leu Thr Ser Ile Val Ser Thr Arg Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
  1               5                  10                  15
Pro
<210>29
<211>16
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>29
Leu Thr Ser Ile Val Ser Thr Arg Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
  1               5                  10                  15
Pro
<210>30
<211>16
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>30
Leu Thr Ser Ile Val Ser Thr Arg Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
  1               5                  10                  15
Pro
<210>3l
<211>16
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>31
Leu Thr Ser Ile Val Ser Thr Arg Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
  1               5                  10                  15
Pro
<210>32
<211>8
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>32
Lys Tyr Ala Leu Ala Asp Ala Ser
                  5
<210>33
<211>41
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>33
Cys Pro Ile Asn Cys Thr His Ser Cys Val Asp Leu Asp Asp Lys
  1               5                  10                  15
Gly Cys Pro Ala Glu Gln Arg Ala Ser Pro Leu Thr Ser Ile Val
                 20                  25                  30
Ser Ala Val Val Gly Ile Leu Leu Val Val Val
                 35                  40
<210>34
<211>27
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>34
Asp Leu Asp Asp Lys Gly Cys Pro Ala Glu Gln Arg Ala Ser Pro
  1               5                  10                  15
Leu Thr Ser Ile Val Ser Ala Val Val Gly Ile Leu
                 20                  25
<210>35
<211>9
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>35
Pro Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser
                  5
<210>36
<211>14
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>36
Cys Leu Gly Gln Thr Leu Val Leu Ile Gly Lys Thr Leu Thr
                  5                  10
<210>37
<211>18
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>37
Cys Ile Tyr Tyr Pro Trp Thr Gly His Ser Thr Leu Pro Gln His
  1               5                  10                  15
Ala Arg Thr
<210>38
<211>8
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>38
Cys Ile Gly Leu Met Asp Arg Thr
                  5

Claims (21)

1.用于抑制HER2脱落的方法，包括用有效抑制HER2脱落的量的基质金属蛋白酶(MMP)拮抗剂处理表达HER2的细胞。
2.权利要求1的方法，其中所述MMP拮抗剂是膜束缚MMP(MT-MMP)拮抗剂。
3.权利要求2的方法，其中所述MT-MMP选自MMP-15(MT2-MMP)、MMP-16(MT3-MMP)、MMP-24(MT5-MMP)、MMP-17(MT4-MMP)和MMP-25(MT6-MMP)。
4.权利要求3的方法，其中所述MT-MMP是MMP-15。
5.权利要求1的方法，其中所述细胞展示出HER2过表达、扩增或活化。
6.权利要求5的方法，其中所述细胞展示出HER2过表达或扩增。
7.权利要求1的方法，还包括用HER抑制剂处理所述细胞。
8.权利要求7的方法，其中所述HER抑制剂是HER2抗体。
9.权利要求8的方法，其中所述HER2抗体是trastuzumab或pertuzumab。
10.权利要求7的方法，其中所述HER抑制剂选自trastuzumab、pertuzumab、cetuximab、ABX-EGF、EMD7200、gefitinib、erlotinib、CP724714、CI1033、GW572016、IMC-11F8和TAK165。
11.用于在哺乳动物中降低HER2胞外结构域(ECD)血清水平的方法，包括对哺乳动物施用在哺乳动物中有效降低HER2 ECD血清水平的量的基质金属蛋白酶(MMP)拮抗剂。
12.权利要求11的方法，其中所述哺乳动物具有升高的MMP水平。
13.用于在哺乳动物中治疗癌症的方法，包括对哺乳动物施用有效治疗癌症的量的基质金属蛋白酶(MMP)拮抗剂。
14.权利要求13的方法，其中所述癌展示出HER表达、扩增或活化。
15.权利要求14的方法，其中所述癌展示出HER2过表达或扩增。
16.权利要求13的方法，其中所述哺乳动物具有升高的脱落HER2血清水平或升高的p95 HER2水平。
17.用于在哺乳动物中治疗HER抑制剂抗性癌症的方法，包括对哺乳动物施用有效治疗癌症的量的基质金属蛋白酶(MMP)拮抗剂。
18.权利要求17的方法，其中所述HER抑制剂是trastuzumab。
19.用于降低细胞中p95 HER2水平的方法，包括将细胞暴露于有效降低p95HER2水平的量的基质金属蛋白酶(MMP)拮抗剂。
20.诊断方法，包括评估来自癌症患者的样品中的MMP-15(MT2-MMP)，其中升高的MMP-15水平或活性表明该患者具有升高的p95 HER2或脱落HER2血清水平，或者将具有不良临床结果。
21.权利要求20的方法，其中升高的MMP-15水平表明该患者将具有不良临床结果。
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PB01 Publication
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