CN100571785C - Annexin A3与癌症的铂类化疗药物耐药性的相关性 - Google Patents

Abstract

本发明涉及annexin A3与癌症的铂类化疗药物耐药性的相关性，涉及通过改变细胞中的annexin A3表达而提高/降低癌症的铂类化疗药物耐药性的方法、还涉及用于检测和/或预后癌症对铂类化疗药物的耐药性的检测或诊断方法，以及可以用于这些方法中的药剂、包含该药剂的药物组合物和所述药剂用于制备药物的用途及所述药剂的筛选方法。此外，本发明还涉及用于治疗癌症患者的方法。在本发明中，所述癌症是能够用铂类化疗药物治疗的癌症，更优选所述癌症是卵巢癌。

Description

Annexin A3与癌症的铂类化疗药物耐药性的相关性

技术领域

本发明一般地涉及化疗药物耐药性领域，更具体地本发明涉及annexin A3与癌症的铂类化疗药物耐药性的相关性，涉及通过改变细胞中的annexin A3表达而提高/降低癌症的铂类化疗药物耐药性的方法、以及可以用于该方法中改变细胞中的annexin A3表达的药剂、包含该药剂的药物组合物和所述药剂用于制备改变癌症耐药性的药物的用途及所述药剂的筛选方法。此外，本发明还涉及用于检测和/或预后癌症对铂类化疗药物的耐药性的检测或诊断方法、药剂、药物组合物及试剂盒。本发明还涉及用于治疗癌症患者的方法。在本发明中，所述癌症是能够用铂类化疗药物治疗的癌症，更优选所述癌症是卵巢癌。

背景技术

卵巢癌是妇科肿瘤首位致死性疾病，晚期患者的5年生存率始终徘徊在15％-20％，肿瘤细胞对于化疗药物产生耐药性是造成这一状况的主要原因之一。铂类与DNA结合形成交叉键，从而破坏DNA的功能不能再复制，高浓度时也能抑制RNA及蛋白质的合成，是目前最常用的治疗卵巢癌的一线化疗药物，也是治疗其它实体肿瘤包括乳腺癌、肺癌、睾丸肿瘤、头颈癌、骨肉瘤、黑色素瘤、食管癌等的常用药物。在铂类治疗这些实体肿瘤时，均出现了耐药现象，即治疗初期对于肿瘤控制良好而治疗后期便出现复发或治疗初期就无反应。临床就卵巢癌对于铂类药物耐药已有明确的认识和定义，然而，有关顺铂耐药机制的阐明却远远不足。虽然目前从基因水平对于肿瘤耐药机制的认识已经相当深入，如MDR-1，LRP-1，MRP-1，GST-pi等已成为众所周知的耐药相关基因。但多数研究的结果表明，多种耐药相关基因在卵巢癌中的表达并不能良好地预测肿瘤的耐药和预后，mRNA的丰度与其相应的蛋白水平具有不一致性可能是主要原因之一。DNA是遗传信息的承载者，蛋白质才是功能的执行者。因此，需要在蛋白质水平进行高通量的技术来进一步探讨耐药机制，蛋白质组学技术为耐药基因的功能研究提供了可能性。

蛋白质组学技术是近年发展起来的一种新兴技术，已经广泛应用于基础研究的各个领域，总体上看，蛋白质组学研究主要包含以下几个方面：1.表达蛋白质组学；2.功能蛋白质组学；3.结构蛋白质组学。目前蛋白质组学技术在卵巢肿瘤的应用主要集中于恶性肿瘤的早期诊断和筛选肿瘤标志物方面，而至今尚无关于卵巢癌耐药标志物的研究。从临床组织入手直接研究铂类耐药机制，存在异质性、影响因素复杂、实验技术水平有限、阳性结果易丢失等诸多困难。因此，以细胞系为研究对象，逐步延伸到临床，提供了一种科学的研究思路。

Annexin家族(I～XIII)是一群依赖Ca²⁺的磷脂结合蛋白，具有非EF手型Ca²⁺结合位点，在调节细胞生长和细胞信号转导途径中起到一定的作用。Annexin A3是annexin家族中唯一具有酶活性的成员，具有抑制磷脂酶A2和抗凝的功能，它还可以切断inositol1，2-cyclic phosphate形成inositol 1-phosphate，在控制细胞增殖方面发挥作用[Ross TS，et al.J Biol Chem.1991，266(14)：9086-9092.]。虽然它广泛存在于动植物的各个组织器官，但在分化的最后阶段annexin A3却在中性粒细胞中优势表达。在未受到刺激中性粒细胞中，它分布在胞浆，并且含量高达胞浆总蛋白的1％[Ernst JD，et al.J Clin Invest，1990，85(4)：1065-1071.]。在一定Ca²⁺浓度下，annexin A3能够结合到囊泡的磷脂酰丝氨酸上，介导吞噬体与溶酶体的融合和颗粒消失等膜与膜之间的作用。另外，它能够促进从人中性粒细胞中分离的特异性颗粒的集聚[Le Cabec V，et al.Biochem J，1994，303(Pt 2)：481-487.]。最近，有研究证明annexin A3是一种新的促血管生成因子，它可以通过激活HIF-1导致VEGF的增加，为抗肿瘤生长和血管生成提供了新的作用靶标[Park JE，et al.Biochem Biophys Res Commun.2005，337(4)：1283-1287.]。至今，annexin A3与肿瘤化疗耐药的相关性尚无研究报道。

为了克服耐药相关基因在癌症中的表达并不能良好地预测肿瘤的耐药和预后，基础研究与临床治疗相分离的缺点，本申请的发明人在蛋白质水平首次鉴定了蛋白annexin A3与癌症(尤其是卵巢癌)的铂类化疗药物耐药性相关，并在临床进一步得到验证，由此使得可以通过检测annexin A3的表达量预测临床癌症患者的化疗耐药，及早发现耐药，改变治疗方案，提高5年生存率，并使得可以通过改变耐药的临床癌症患者肿瘤的annexin A3的表达量来改变铂类药物对此类患者的治疗效果。此外，本发明中提出的正、反义annexin A3的真核表达质粒和表达annexin A3融合蛋白的真核表达质粒构建，为研究annexin A3的功能提供了有利的工具。再者，本发明还提供了卵巢癌耐顺铂细胞系SKOV3/CDDP-P的诱导方法，模拟临床治疗卵巢癌的剂量和方式，为进一步研究临床耐药提供了良好的细胞模型。

发明内容

因此，本发明一方面涉及，调节癌症的铂类化疗药物耐药性的方法，包括改变癌症细胞中annexin A3的表达，其中优选地，所述癌症是卵巢癌，所述铂类化疗药物是顺铂或卡铂。本发明的此方法可以用于体外调节癌细胞的耐药性或者可以用于体内调节癌症患者的耐药性。

在本发明此方法的一个实施方案中，通过提高癌细胞中的annexin A3表达而提高癌细胞对铂类化疗药物的耐受性，优选地，通过在癌细胞中表达annexin A3基因而提高细胞中的annexin A3表达，再优选地其中通过使用表达正义annexin A3基因的质粒来提高所述细胞中的annexin A3的含量。

因此，本发明也涉及编码annexin A3蛋白的多核苷酸，包含该多核苷酸的DNA构建体及表达载体，并涉及它们在制备提高癌症的铂类化疗药物耐药性的药物中的用途。在本发明中，annexin A3蛋白不仅包括天然的annexin A3蛋白也包括人工合成(例如通过遗传工程的方法)的annexin A3蛋白，例如含有annexin A3的融合蛋白。

在本发明此方法的另一实施方案中，通过减少和/或抑制癌细胞中的annexin A3表达而降低癌症对铂类化疗药物的耐受性，优选地，通过在癌细胞中表达annexin A3的反义核酸和/或特异于annexin A3的核酶而减少和/或抑制细胞中的annexin A3表达，再优选地其中通过使用表达反义annexin A3的DNA构建体或表达载体来降低细胞中的annexin A3的含量。

因此，本发明也涉及减少和/或抑制癌细胞中的annexin A3表达的药剂，例如抑制annexin A3表达的反义核苷酸和特异切割annexinA3mRNA的核酶；本发明还涉及这些药剂在制备降低癌症的铂类化疗药物耐药性的药物中的用途。一个实施方案中，根据本发明的反义核苷酸，其包含能够特异结合annexin A3多核苷酸序列或其互补序列的任何序列的全部或部分的核苷酸序列，优选地所述反义核苷酸含有与annexin A3多核苷酸的一或多个部分互补、更优选地基本上互补、甚至更优选地完全互补的序列区域，更优选地，所述反义核苷酸包含与全长annexin A3多核苷酸完全互补的DNA序列，优选地，所述反义核苷酸是DNA或者RNA或者其衍生物，最优选地，所述反义核苷酸包含在能够表达其的表达质粒，优选真核表达质粒中。一个实施方案中，根据本发明的能够特异切割annexin A3mRNA的核酶具有与一或多个annexin A3RNA区域互补的特异底物结合位点，并且它在该底物结合位点中或周围具有赋予该分子RNA切割活性的核苷酸序列，优选地所述核酶选自：锤头型核酶、发夹型核酶、丁型肝炎病毒型核酶、I型内含子型核酶或RNaseP RNA型核酶或链孢霉属VS RNA型核酶。

本发明另一方面涉及，通过前述的本发明改变癌症耐药性的方法改变了对铂类化疗药物的耐受性的癌症细胞，优选地，所述细胞包含表达正义annexin A3或反义annexin A3的表达载体，优选地，所述载体是质粒。

本发明再一方面涉及，一种筛选能够改变癌症对铂类化疗药物的耐药性的药剂的方法，其中所述癌症优选是卵巢癌，所述铂类化疗药物优选是顺铂或卡铂，所述方法包括步骤：提供候选药剂；使所述候选药剂与癌细胞接触；检测所述癌细胞中的annexin A3的表达；将所检测到的表达量与预定阈值比较。相应地，本发明也涉及也通过本发明的筛选方法获得的药剂。

本发明的一个方面涉及，一种检测癌细胞对铂类化疗药物的耐药性的方法，其中所述癌症优选是卵巢癌，所述铂类化疗药物优选是顺铂或卡铂，所述方法包括检测癌细胞中的annexin A3的表达量，和将所得表达量与预定阈值进行比较，由此指示卵巢癌细胞对铂类化疗药物的耐药性。

本发明的又一方面涉及，一种预测或预后铂类化疗药物在癌症患者中的治疗效果，即，诊断癌症患者的铂类化疗药物耐药性的方法，其中所述癌症优选是卵巢癌，所述铂类化疗药物优选是顺铂、卡铂，所述方法包括检测癌症患者的肿瘤组织中的annexin A3的表达量，和将所得的量与预定阈值进行比较，由此预测或预后向所述患者施用铂类化疗药物的治疗效果，即，预测患者的铂类化疗药物耐药性。

在本发明的上述方法中，用于检测annexin A3表达量的步骤通过检测annexin A3的mRNA水平或蛋白质水平；其中，优选地，在蛋白质水平上的检测，通过抗体或寡核苷酸适配体来实现，优选利用抗体；而在mRNA水平上的检测，优选通过Northern印迹或PCR方法来实现。

相应地，本发明也涉及能够检测annexin A3表达的药剂。在一个实施方案中，所述检测药剂是annexin A3的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体可以是单克隆抗体或者多克隆抗体，优选其是中和抗体。在另一实施方案中，所述检测药剂是特异结合annexin A3蛋白质的寡核苷酸适配体，优选地所述寡核苷酸适配体是DNA，优选地，所述寡核苷酸适配体连接或标记了其它功能基团或分子，例如巯基、氨基、放射性同位素、荧光素、生物素、或酶等。在再一实施方案中，所述检测药剂是特异于annexin A3基因的核酸探针或引物或其组合。

本发明还涉及前述能够检测annexin A3表达的药剂在制备用于检测癌细胞的铂类化疗药物耐药性或诊断癌症患者的铂类化疗药物耐药性的检测或诊断试剂盒中的用途。就本发明的此用途，所述药剂优选为annexin A3蛋白质的抗体，优选单克隆抗体；或者所述药剂检测细胞中annexin A3基因的mRNA水平表达量，优选是特异于annexin A3基因的杂交探针或引物。

本发明再一方面涉及治疗癌症患者的方法，包括步骤：a)通过本发明改变癌症的铂类化疗药物耐药性的方法，降低患者对铂类化疗药物的耐受性；和b)向所述患者施用铂类化疗药物，任选地，在步骤(a)之前检测癌症患者的铂类化疗药物耐受性以确定耐药性患者。

本发明又一方面涉及治疗癌症患者的方法，所述方法包括：根据本发明确定患者的铂类化疗药物耐药性，和调整患者的铂类化疗药物给药方案。在本发明此方面，所述调整包括替换紫杉醇类化疗药物、加大或减少紫杉醇类化疗药物的给药频率和/或给药量，等。

本发明的其它方面还涉及药物组合物，其包含前述能够改变本发明的癌症耐药性的药剂或前述能够检测annexin A3表达的药剂。在本发明的一些实施方案中，所述药物组合物包含表达annexin A3的DNA、annexin A3的反义核苷酸、核酶、抗体和寡核苷酸适配体中的一个或任何组合。在一些实施方案中，本发明药物组合物用于诊断和/或改变癌症的铂类化疗药物耐药性，其中所述癌症是卵巢癌。

本发明最后一方面涉及一种建立铂类化疗药物耐药性癌症细胞株的方法，包括：以大剂量铂类化疗药物冲击来诱导癌症细胞。

在本发明的所有方面，如果适用的话，优选的是，所述癌症是能够用铂类化疗药物治疗的癌症，如卵巢癌、乳腺癌、肺癌、睾丸肿瘤、头颈癌、骨肉瘤、黑色素瘤、食管癌等，优选卵巢癌，在一个实施方案中，优选卵巢上皮癌，包括内膜样癌、浆乳癌、腺癌、移行细胞癌、子宫内膜癌、透明细胞癌，在另一实施方案中，优选人浆液性卵巢癌。

在本发明的所有方面，如果适用的话，优选的是，所述铂类化疗药物是顺铂、卡铂、草酸铂、奈达铂、乐铂等，更优选是顺铂和卡铂。

附图简述

图1.CDDP大剂量冲击诱导法示意图

图2.CDDP小剂量间歇诱导法示意图

图3.CDDP对SKOV3、SKOV3/CDDP-P和SKOV3/CDDP-80的剂量反应曲线

图4.细胞形态学光镜观察(×200)

a.SKOV3；b.SKOV3/CDDP-P；c.SKOV3/CDDP-80；d，e，f为a，b，c生长至对数生长期的细胞形态

图5.a.从左至右依次为扫描电镜下SKOV3、SKOV3/CDDP-P和SKOV3/CDDP-80的细胞形态(×1600)

SKOV3细胞成梭形，细胞表面微绒毛丰富，长而纤细，分布均匀，CDDP-P和CDDP-80均可见细胞表面微绒毛较稀疏，分布欠均匀。CDDP-80形态变化显著，细胞自胞核向两侧延伸，面积较大。

b，c.从左至右依次为透射电镜下SKOV3、SKOV3/CDDP-P和SKOV3/CDDP-80的细胞形态(b，×8000；c，×22000)

可见SKOV3胞浆内含有大量线粒体，CDDP-P和CDDP-80细胞核大形态不规则，畸形核可见，核膜凹陷明显，有核袋和核突。染色质分布不均，有的凝结成块，胞浆内线粒体减少，具有大量囊泡样结构。这些囊泡样结构部分是空泡，部分可见颗粒样物。

图6.SKOV3、SKOV3/CDDP-P和SKOV3/CDDP-80的生长曲线

图7.RT-PCR测定MDR1、MRP1、LRP1、GST-pi mRNA的表达

^*P＜0.01与SKOV3相比较

^**P＜0.01与SKOV3和SKOV3/CDDP-80相比较

图8.不同细胞系中MDR1、MRP1、LRP1、GST-pi mRNA的表达统计图

^*P＜0.01与SKOV3相比较

^**P＜0.01与SKOV3和SKOV3/CDDP-80相比较

图9Western blot法测定MDR1、MRP1、LRP1、GST-pi蛋白的表达

图10.四种耐药细胞系的所有差异表达蛋白质点

图11.六种细胞系2-DE图谱中蛋白质点25(箭头处)的表达，经MALDI-TOF-MS鉴定为annexin A3

图12.MALDI-TOF-MS鉴定蛋白质点25(annexin A3)的肽质指纹图谱

图13.六种细胞系2-DE图谱中蛋白质点67(箭头处)的表达，经MALDI-TOF-MS鉴定为destrin

图14.六种细胞系2-DE图谱中蛋白质点7(箭头处)的表达，经MALDI-TOF-MS鉴定为IDHc

图15.六种细胞系2-DE图谱中蛋白质点54(箭头处)的表达，经MALDI-TOF-MS鉴定为GSTO1-1

图16.六种细胞系2-DE图谱中蛋白质点34(箭头处)的表达，经MALDI-TOF-MS鉴定为cofilin 1

图17.定量PCR法检测五种差异表达蛋白在六种细胞系中mRNA的表达

图18.Western blot法检测四种差异表达蛋白在六种细胞系中的表达

图19.pcDNA 3.1/myc-His(-)B质粒图谱

图20.pcDB-sense anx3和pcDB-antisense anx3质粒构建流程示意图

图21.pcDNA 3.1(+)质粒图谱

图22.pcDNA3.1-anx3质粒构建流程示意图

图23.pEGFP-N1质粒图谱

图24.pEGFP-N1-anx3质粒构建流程示意图

图25.细胞总RNA电泳图，可见28、16S、5S条带

图26.RT-PCR法扩增annexin A3(anx 3)

lane 1以SKOV3细胞cDNA为模板可见在1000bp处可见一亮条带

图27.PCR法和酶切法鉴定T重组质粒

lane 1：以pcDB-sense anx3质粒为模板，1000bp处可见扩增出预期条带

lane 2：EcoR I单酶切可切出目的条带

lane 3：未行酶切的T重组质粒

图28.重组T质粒(pGEM-T-anx3)经测序后在Genebank中的比对结果

图29.PCR法和酶切法鉴定pcDB-sense anx3和pcDB-antisense anx3质粒

lane 1：未加上游引物的阴性对照

lane 2：pcDB-sense anx3质粒为模板，1000bp处可见扩增出预期条带

lane 3：pcDB-antisense anx3质粒为模板，1000bp处可见扩增出预期条带

lane 4：未行酶切的pcDB-antisense anx3质粒

lane 5：EcoR I单酶切的pcDB-sense anx3质粒，可切出目的条带

lane 6：EcoR I单酶切的pcDB-antisense anx3质粒，可切出目的条带

图30.pcDB-antisense anx3质粒经测序后在Genebank中的比对结果

图31.a.PCR法鉴定pcDNA3.1-anx3质粒

lane 1：以pcDNA 3.1-anx3质粒为模板，1300bp处可见扩增出预期条带

b.酶切法鉴定pcDNA3.1-anx3质粒

lane 1：EcoR I单酶切可切出目的条带

图32.pcDNA3.1-anx3质粒经测序后在Genebank中的比对结果

图33.PCR法鉴定pEGFP-N1-anx3质粒

lane 1：pEGFP-N1-anx3质粒为模板，1000bp处可见扩增出预期条带

图34.酶切法鉴定pEGFP-N1-anx3质粒

lane 1：BamH I单酶切未见目的条带

lane 2：Xho I、BamH I双酶切可见目的条带

图35.pEGFP-N1-anx3质粒经测序后在Genebank中的比对结果

图36.pEGFP-N1-anx3质粒分别转染A2780，SKOV3细胞，荧光显微镜下观察的转染效率(转染后24h)

a，c：pEGFP-N1-anx3质粒对于SKOV3细胞的转染情况。载体pEGFP-N1-anx3质粒转染SKOV3细胞的转染效率约为20-25％(×200)；

b，d：pEGFP-N1-anx3质粒对于A2780细胞的转染情况。载体pEGFP-N1-anx3转染A2780细胞24后的转染效率约为45-55％(×200)

图37.SKOV3、A2780细胞在筛选稳定转染过程中的集落形态

图38.稳定转染细胞克隆的western blot鉴定结果

正义annexin A3质粒转染敏感细胞系SKOV3、A2780，反义annexin A3质粒转染耐药细胞系SKOV3/CDDP、SKOV3/CBP、A2780/CDDP和A2780/CBP

a.annexin A3；b.beta-actin；C.未经转染的细胞对照；M.转染相应空质粒的细胞对照；1-7为转染相应annexin A3正义或反义质粒的细胞克隆

图39.Annexin A3免疫组化染色结果(×200)

a.annexin A3染色阴性

b.annexin A3染色阳性，阳性部分为细胞核

c，d.annexin A3染色阳性，阳性部分为细胞浆

具体实施方式

本说明书就以下几个方面对本发明作进一步详细阐述。

Annexin A3蛋白及其编码核苷酸

本发明所指的annexin A3或annexin A3蛋白质包括annexin A3的同源物、等位变体、功能等同物，特别是保守变体，优选指人annexinA3蛋白质。annexin A3蛋白质保守变体包括与本文公开的annexin A3蛋白质相比具有一个或者多个(例如1-20个，1-10个，1-5个)氨基酸的插入、缺失、和/或添加的蛋白质。在本发明中，“多肽”和“蛋白质”可以互换使用，可以表示任何长度的多肽。

本领域技术人员将明了，多核苷酸可以是单链的(编码链或反义链)或双链的，而且可以是DNA  (基因组DNA、cDNA或合成的DNA)或RNA分子。RNA分子包括含有内含子并以一对一形式与DNA分子对应的HnRNA分子，和不含内含子的mRNA分子。

多核苷酸可以含有天然序列(即编码annexin A3蛋白质或其部分的内源性序列)或可以含有该序列的变体、或生物学或功能等同物。多核苷酸变体可以含有一或多个替代、添加、缺失和/或插入，优选地，这些改变是保守性的或者这些改变产生的多核苷酸变体保持编码本发明蛋白质的能力。

当进行多核苷酸或多肽序列比较时，如果在按下述方法进行最大匹配比对后，两个序列中的核苷酸或氨基酸序列相同，则认为这两个序列是“一致的”。

适合于确定序列一致性和序列相似性百分数的算法的一个优选例子是BLAST和BLAST 2.0算法，它们分别描述在Altschul等(1977)Nucl.Acid.Res.25：3389-3402和Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403-410。采用例如本文所述参数，BLAST和BLAST 2.0可以用于确定本发明的多核苷酸和多肽的序列一致性百分数。执行BLAST分析的软件可以通过国立生物技术信息中心为公众所获得。

因此，本发明包括与本文所公开序列基本一致的多核苷酸和多肽序列，例如当采用本文所述方法(例如采用标准参数的BLAST分析，描述如下)时，与本发明多核苷酸或多肽序列相比含有至少50％序列一致性、优选至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的序列一致性的那些序列。本领域技术人员将明了，考虑密码子简并性、氨基酸相似性、读框的定位等，可以对这些值进行适当调整以确定两个核苷酸序列编码的蛋白质的相应一致性。

在其它实施方案中，本发明提供含有与本文所公开的一或多个序列一致或互补的各种长度连续序列段的分离多核苷酸和多肽。例如，本发明提供含有本文所公开的一或多个序列的至少约15、20、30、40、50、75、100、150、200、300、400、500或1000或更多个连续核苷酸、以及含有之间的所有居中长度的连续核苷酸的多核苷酸。易于明了的是，“居中长度”在本文中是指这些引用值之间的任何长度，例如16、17、18、19等；21、22、23等；30、31、32等；50、51、51、53等；100、101、102、103等；150、151、152、153等；包括200-500、500-1,000等之间的所有整数。

本发明的多核苷酸、或其片段，无论其本身的编码序列有多长，均可以和其它DNA序列，如启动子、多腺苷酸化信号、额外的限制性酶位点、多克隆位点、其它的编码区段等组合，以致它们的整个长度可能出现相当大的变化。因此，预期可以采用几乎任何长度的核苷酸片段，其总长度优选被限制在易于在期望的重组DNA程序中进行操作和应用的范围内。例如，预期总长度约10,000、约5000、约3000、约2,000、约1,000、约500、约200、约100、约50个碱基对等(包括所有的居中长度)的示例性DNA区段在本发明的许多实施方案中是有用的。

在其它实施方案中，本发明涉及在中等严紧条件(优选高严紧条件)下与本文提供的多核苷酸、或其片段、或其互补序列能够杂交的多核苷酸。在分子生物学领域中杂交技术是熟知的。

典型地，“杂交条件”根据测量杂交时所用条件的“严紧性”程度来分类。严紧性程度可以以例如核酸结合复合物或探针的解链温度(Tm)为依据。例如，“最大严紧性”典型地发生在约Tm-5℃(低于探针Tm 5℃)；“高等严紧性”发生在Tm以下约5-10℃；“中等严紧性”发生在探针Tm以下约10-20℃；“低严紧性”发生在Tm以下约20-25℃。作为替代，或者进一步地，杂交条件可以以杂交的盐或离子强度条件和/或一或多次的严紧性洗涤为依据。例如，6×SSC＝极低严紧性；3×SSC＝低至中等严紧性；1×SSC＝中等严紧性；0.5×SSC＝高等严紧性。从功能上说，可以采用最大严紧性条件确定与杂交探针严紧同一或近严紧同一的核酸序列；而采用高等严紧性条件确定与该探针有约80％或更多序列同一性的核酸序列。

对于要求高选择性的应用，典型地期望采用相对严紧的条件来形成杂交体，例如，选择相对低的盐和/或高温度条件。Sambrook等(Sambrook，J.等(1989)分子克隆，实验室手册，Cold Spring HarborPress，Plainview，N.Y.)提供了包括中等严紧性和高等严紧性在内的杂交条件。

为便于说明，用于检测本发明的多核苷酸与其它多核苷酸杂交的合适的中度严紧条件包括：用5×SSC、0.5％SDS、1.0mM EDTA(pH 8.0)溶液预洗；在50-65℃下在5×S SC中杂交过夜；随后用含0.1％SDS的2×、0.5×和0.2×SSC在65℃下各洗涤两次20分钟。本领域技术人员应当理解，能容易地操作杂交严紧性，如改变杂交溶液的含盐量和/或杂交温度。例如，在另一个实施方案中，合适的高度严紧杂交条件包括上述条件，不同之处在于杂交温度升高到例如60-65℃或65-70℃。

本发明的多核苷酸和多肽可以按照本领域已知的方法制备。参见例如常见实验室手册。

表达的改变

本发明一方面涉及通过改变癌细胞中的annexin A3表达，来调节癌症的铂类化疗药物耐药性。

在此方面，所述表达的改变包括上调和/或激活表达并由此增加癌症的铂类化疗药物耐药性，也包括下调和/或抑制表达，由此降低癌症的铂类化疗药物的耐药性。本发明对癌症的耐药性的调节可以发生在体外施用于癌细胞上以例如获得耐药性细胞株或降低原耐药性细胞的耐药性。本发明对癌症的耐药性的调节也可以发生在体内以患有所述癌症的患者为施用对象，以改变优选降低患者的铂类化疗药物耐药性。

这里所用的“表达的上调”或者“表达的激活”是指增加基因表达的水平和/或活性基因产物的水平和/或基因产物活性的水平。例如，可以通过在癌细胞中表达外源annexin A3、增强癌细胞的内源annexinA3表达等方式实现。在本发明中，外源annexin A3指通过遗传工程技术引入的annexin A3；而内源annexin A3指细胞中原有的annexinA3。本领域技术人员已知的任何能够增加目的基因表达的水平和/或活性基因产物的水平和/或基因产物活性的水平的方法均适用于本发明此方面，由此也包括在本发明范围内。

这里所用的“表达的下调”或者“表达的抑制”是指降低基因表达的水平和/或活性基因产物的水平和/或基因产物活性的水平。如Angell和Baulcombe(1998-WO9836083)，Lowe等，(1989-WO9853083)，Lederer等，(1999-WO9915682)或者Wang等(1999-WO9953050)所述，通过，例如以相对于启动子序列的有义方向(如果引起共抑制)或者反义方向添加编码序列或其部分，和通过，例如插入诱变(例如T-DNA插入或转座子插入)或通过基因沉默策略可以完成表达的降低。目的在于沉默基因表达的基因构建体可以有以相对于启动子序列有义和/或反义方向包含的所述基因的核苷酸序列(或其一个或多个部分)。另一个下调基因表达的方法包括核酶的应用。

可以通过向细胞、组织、器官或生物体施用或使之暴露于所述本发明化合物或药剂由此实现调节，包括降低活性基因产物或基因产物活性的水平。

免疫调节是具有下调活性基因产物和/或基因产物活性水平能力的另一种技术的例子，包括施用或暴露所述基因产物的抗体于其中要调节所述基因产物的水平和/或基因产物活性的细胞、组织、器官或生物体，或在这种细胞、组织、器官或生物体中表达所述基因产物的抗体。这种抗体包括单链抗体、IgG抗体及其片段。

还可以通过向细胞、组织、器官或生物体施用或使之暴露于所述基因产物或其活性的激动剂/拮抗剂实现调节，包括增强/降低活性基因产物或基因产物活性的水平。这种激动剂/拮抗剂包括按照所述本发明鉴定的蛋白质和化学化合物。

在本发明上下文中设想了annexin A3基因表达的上调/下调。本发明还包括annexin A3活性水平的上调/下调。

此外，可以考虑通过重组来使基因沉默。

“重组酶”意指位点特异性重组酶或转座酶。“重组位点”意指位点特异性重组位点或转座子边界序列。“位点特异性重组事件”意指由一般由3个元件：一对DNA序列(位点特异性重组序列或位点)和特异性酶(位点特异性重组酶)组成的系统催化的事件。位点特异性重组酶根据位点特异性重组序列的方向，仅催化两个位点特异性重组序列间的重组反应。在位点特异性重组酶存在的情况下，当位点特异性重组序列以相互相反方向定向(即，反向重复)时，间插在两个位点特异性重组位点之间的序列将倒置。如果位点特异性序列以相互相同的方向定向(即，同向重复)，那么一旦与位点特异性重组酶相互作用，任何间插序列将缺失。因此，如果位点特异性重组序列做为同向重复在整合进入真核生物基因组中的外源DNA两个末端存在，那么所述序列的这种整合随后可以被位点特异性重组序列与相应的位点特异性重组酶的相互作用所逆转。

可以利用大量不同的位点特异性重组酶系统，包括但不限于噬菌体P1的Cre/lox系统，酵母的FLP/FRT系统，噬菌体Mu的Gin重组酶，大肠杆菌(E.coli)的Pin重组酶，志贺氏菌属(Shigella)的PinB，PinD和PinF，和pSR1质粒的R/RS系统。重组酶通常都是整合酶、解离酶或翻转酶(flippases)。而且，双特异性重组酶可以与对应双特异性重组酶的两个不同位点特异性重组位点的同向重复或不同向重复(indirect repeats)联合使用(WO99/25840)。两个优选的位点特异性重组酶系统是噬菌体P1Cre/lox和酵母FLP/FRT系统。在这些系统中，重组酶(Cre或FLP)与其各自位点特异性重组序列(分别是lox或FRT)相互作用以倒置或切除间插序列。

尽管位点特异性重组序列必须与待切除或待倒置的DNA的末端连接，但是编码位点特异性重组酶的基因可以定位在其它地方。例如，重组酶基因可以已经存在真核生物DNA中或者可以由后来引入的DNA片段提供，该DNA片段可以通过交换或通过异体授粉或直接引入细胞中。做为可替代方案，例如，可以通过显微注射或粒子轰击将基本纯化的重组酶蛋白质直接引入真核细胞。典型地，位点特异性重组酶编码区将可操作地连接调节序列，该调节序列能够使位点特异性重组酶在真核生物细胞中表达。

在实施本发明时，优选地，例如通过细胞中重组酶蛋白质的表达，该蛋白质接触遗传因子的整合位点，并促进其中重组事件，在原始整合位点完整地切除遗传因子或者可替代地留下“足迹”，通常约20个核苷酸长或更长，来诱导遗传因子运动。可以通过标准核酸杂交和/或扩增技术以检测可动遗传因子或包含其的基因构建体的存在鉴定根据本发明方法产生的这些宿主和宿主部分。做为可替代方案，在可动遗传因子已经切除的转化的宿主细胞、组织和宿主的情况下，可以用这种技术检测切除事件后留下的宿主基因组中足迹。如这里所用术语“足迹”应该理解为指这里所述可动遗传因子或含该因子的基因构建体的任何衍生物，通过先前所述基因构建体转化的细胞基因组中可动遗传因子的切除、缺失或其它去除可以产生它。通常地，足迹包含至少用于促进切除的转座子或重组位点的单拷贝。然而，足迹可以包含来源于基因构建体的其它序列，例如，如果使用，来源于左边界序列、右边界序列、复制起点、重组酶编码序列或转座酶编码序列的核苷酸序列，或其它载体来源的核苷酸序列。因此，根据所用基因构建体重组基因座或转座子的核苷酸序列，如，例如与lox位点或frt位点对应或互补的核苷酸序列，可鉴定足迹。

本发明还涉及通过使用反义技术在体外和体内抑制annexin A3。可利用反义技术通过三链螺旋形成或者通过反义DNA或RNA来控制基因表达，这两种方法都基于多核苷酸与DNA或RNA的结合。例如，将编码本发明多肽的多核苷酸的5’编码部分用于设计长度为大约10-40碱基对的反义RNA核苷酸。设计与基因中参与转录的区域互补的DNA核苷酸(三链螺旋参阅Lee等人，Nucl.Acids Res.，6：3073，1979；Cooney等人，Science，241：456，1988；和Dervan等人，Science，251：1360，1991)，由此防止annexin A3的转录和生成。反义RNA核苷酸与mRNA在体内发生杂交，并阻断mRNA分子翻译成annexin A3蛋白(反义参与Okano，J.Neurochem.，56：560，1991；《Oligodeoxynucleotidesas Antisense Inhibitors of Gene Expression》(寡核苷酸作为基因表达的反义抑制剂)，CRC出版社，Boca Raton，FL，1988)。

或者，可以通过本领域的流程将上文所述核苷酸投递至细胞，使得反义RNA或DNA能够在体内表达，从而以上文所述方式抑制annexinA3的生成。

反义核苷酸

遗传信息流的最终结果是蛋白质的合成。DNA通过聚合酶转录为信使RNA，然后在核糖体上经翻译产生折叠的功能性蛋白质。因此，沿该路径有几个在其上可以实现蛋白质合成抑制的步骤。编码本文所述多肽的天然DNA区段，和所有这样的哺乳动物DNA链一样，具有通过氢键结合在一起的两条链：有义链和反义链。除了DNA中的胸苷被尿苷所替代外，编码多肽的信使RNA具有与有义DNA链相同的核苷酸序列。因此，合成的反义核苷酸序列将与mRNA结合，并抑制由该mRNA编码的蛋白质的表达。

因此，使反义核苷酸靶向mRNA是关闭蛋白质合成的一个机制，并由此成为一种有力的定向治疗方法。例如，多聚半乳糖醛酸酶和2型毒蝇碱性乙酰胆碱受体的合成受到指向它们各自mRNA序列的反义核苷酸的抑制(美国专利5,739,119和美国专利5,759,829，两份文献特此完整地并入本文作为参考)。而且，采用细胞周期核蛋白、广谱抗药基因(MDG1)、ICAM-1、E-选择蛋白、STK-1、纹状体GABA_A受体和人EGF(Jaskulski等，1988；Vasanthakumar和Ahmed，1989；Peris等，1998；美国专利5,801,154；美国专利5,789,573；美国专利5,718,709和美国专利5,610,288，所有文献特此完整地并入本文作为参考)也显示了反义抑制的例子。

因此，在示例性实施方案中，本发明提供含有能够特异结合本文所述多核苷酸序列或其互补序列的任何序列的全部或部分的核苷酸序列。在一个实施方案中，该反义核苷酸含有DNA或其衍生物。在另一实施方案中，该核苷酸含有RNA或其衍生物。在第三个实施方案中，该核苷酸是含有硫代磷酸酯修饰的主链的修饰DNA。在第四种实施方案中，该核苷酸序列含有肽核酸或其衍生物。在所有的情况下，优选的组合物含有与本文所公开多核苷酸的一个或多个部分互补、更优选地基本上互补、甚至更优选地完全互补的序列区域。所述一个或多个部分可以是约10、15、20、30、40、50、75、100、150、200、300、400、500或1000或更多个连续核苷酸、以及具有它们之间的所有居中长度的连续核苷酸。易于明了的是，“居中长度”在本文中是指这些引用值之间的任何长度，例如16、17、18、19等；21、22、23等；30、31、32等；50、51、51、53等；100、101、102、103等；150、151、152、153等；包括200-500、500-1,000等之间的所有整数。因此，本领域技术人员将理解，本发明的核苷酸可以具有少至约10个、多至约1000个或者更多个核苷酸。

特异于指定基因序列的反义组合物的选择是基于对所选靶序列(例如，示例性实例中的人序列)的分析、和对二级结构、Tm、结合能、相对稳定性的测定来进行的，并且反义组合物还基于它们相对缺乏形成二聚体、发夹、或其它将降低或妨碍与宿主细胞中靶mRNA特异结合的二级结构的能力来选择。

mRNA中高度优选的靶区域是那些位于或靠近AUG翻译起始密码子的区域，和那些基本上与该mRNA的5’区域互补的序列。对这些二级结构的分析和对靶位点选择的考虑是采用第4版OLIGO引物分析软件(Rychlik，1997)和BLASTN 2.0.5算法软件(Altschul等，1997)来实现的。

本发明人还考虑采用通过称作MPG(27个残基)的短肽载体进行的反义递送方法。MPG肽含有一个来源于HIV gp41融合序列的疏水域和一个来源于SV40T抗原细胞核定位序列的亲水域(Morris等，1997)。已经阐明，几个MPG肽分子即可包被反义核苷酸，而且它们能够在不足1小时内以相对高的效率(90％)被递送至培养的哺乳动物细胞中。而且，与MPG的相互作用极大地增加了该核苷酸对抗核酸酶的稳定性和跨越质膜的能力(Morris等，1997)。

核酶

尽管蛋白质传统上一直被用于核酸的催化反应，但另一类大分子已表现出在此方面是有用的。核酶是以位点特异性方式切割核酸的RNA-蛋白质复合物。核酶具有特异的催化域，该催化域具有内切核酸酶活性(Kim和Cech，1987；Gerlach等，1987；Forster和Symons，1987)。例如，很多核酶以高度的特异性加速磷酸酯转移反应，常常仅切割寡核苷酸底物的几个磷酸酯中的一个(Cech等，1981；Michel和Westhof，1990；Reinhold-Hurek和Shub，1992)。该特异性被归因于如下必要条件，即该底物在化学反应前通过特异碱基配对相互作用与核酶的内部引导序列(“IGS”)结合。

起初，核酶的催化反应是作为涉及核酸的序列特异性切割/连接反应的部分被观察到的(Joyce，1989；Cech等1981)。例如，美国专利5,354,855(特此并入本文作为参考)报道，某些核酶能够起到内切核酸酶的作用，而且其序列特异性高于已知的核糖核酸酶的序列特异性，并接近于DNA限制性酶的序列特异性。因此，序列特异性核酶介导的基因表达抑制可能尤其适于治疗应用(Scanlon等，1991；Sarver等，1990)。近来，有报道称，核酶在其所应用的某些细胞系中引发遗传改变；这些改变的基因包括癌基因H-ras、c-fos和HIV的基因。该工作的大部分涉及到基于特异核酶切割特异突变密码子进行的靶mRNA修饰。

目前已知天然存在的酶性RNA的6种基本变体。每一种均能在生理条件下反式催化RNA磷酸二酯键的水解(因此能够切割其它RNA分子)。一般，酶性核酸通过首先与靶RNA的结合来作用。该结合通过酶性核酸的靶结合部分来进行，该部分与该分子中进行靶RNA切割的酶性部分紧靠在一起。因此，该酶性核酸通过互补碱基配对首先识别，然后结合靶RNA，一旦与正确位点结合后，通过酶学作用切开该靶RNA。对该靶RNA的策略性切割将破坏其指导所编码蛋白合成的能力。在酶性核酸对其RNA靶标实现结合和切割后，它将从该RNA上被释放出来以寻找另一靶标，并能重复结合和切割新的靶标。

核酶的酶学性质优于许多技术，例如反义技术(在该技术中核酸分子简单地与核酸靶标结合以阻断其翻译)，因为实现治疗性处理所必需的核酶浓度比所需的反义寡核苷酸浓度低。此优点反映了核酶通过酶学方式起作用的能力。因此，单一一个核酶分子能够切割许多靶RNA分子。此外，核酶还是一种高度特异的抑制剂，其抑制特异性不仅依赖于与靶RNA结合的碱基配对机制，还依赖于对靶RNA实行切割的机制。靠近切割位点的单个碱基错配、或碱基替代可以完全地消除核酶的催化活性。在反义分子中的相似错配并不妨碍其作用(Woolf等，1992)。因此，核酶作用的特异性比与相同RNA位点结合的反义寡核苷酸的作用特异性高。

在锤头、发夹、丁型肝炎病毒、I型内含子或RNaseP RNA(与RNA引导序列相关)或链孢霉属(Neurospora)VS RNA的基序中可以形成酶性核酸分子。锤头基序的例子描述于Rossi等(1992)。发夹基序的例子描述于Hampel等(欧洲专利申请公开文本EP 0360257)、Hampel和Tritz(1989)、Hampel等(1990)和美国专利5,631,359(特此并入本文作为参考)。丁型肝炎病毒基序的例子描述于Perrotta和Been(1992)；RNaseP基序的例子描述于Guerrier-Takada等(1983)；链孢霉属VS RNA的核酶基序描述于Collins(Saville和Collins，1990；Saville和Collins，1991；Collins和Olive，1993)；I型内含子的例子描述于美国专利4,987,071(特此并入本文作为参考)。对于本发明的酶性核酸分子重要的仅是，该分子具有与一或多个靶基因RNA区域互补的特异底物结合位点，并且它在该底物结合位点中或周围具有赋予该分子RNA切割活性的核苷酸序列。因此，无需将该核酶的结构限定于本文所提及的具体基序。

在某些实施方案中，制备对目的靶标(例如本文所公开的其中一个序列)的RNA表现出高度特异性的酶性切割剂可能是重要的。该酶性核酸分子优选定向于靶mRNA的高度保守序列区。根据需要可以向特定细胞递送外来的这些酶性核酸分子。或者，可以从递送至特定细胞的DNA或RNA载体表达核酶。

小的酶性核酸基序(例如锤头或发夹结构的基序)也可以用于外来递送。这些分子的简单结构增加了该酶性核酸侵入mRNA结构的靶区的能力。或者，可以在细胞中从真核启动子表达催化性RNA分子(例如Scanlon等，1991；Kashani-Sabet等，1992；Dropulic等，1992；Weerasinghe等，1991；Ojwang等，1992；Chen等，1992；Sarver等，1990)。本领域技术人员明了，任何核酶都可以在真核细胞中从适合的DNA载体上表达。这些核酶的活性可以通过它们借助于第二种核酶自初级转录本中释放而得以提高(国际专利申请公开文本WO93/23569，和国际专利申请公开文本WO 94/02595，两者均籍此并入本文作为参考；Ohkawa等，1992；Taira等，1991；和Ventura等，1993)。

可以将核酶直接加入靶细胞中，或可以使其与阳离子脂质、脂类复合物混合、或包装在脂质体中、或以其它方式递送至靶细胞中。该RNA或RNA复合物可以通过注射、气雾剂吸入、输注泵或支架，以掺入或不掺入生物聚合物中的形式，离体或体内局部施用给相关组织。

核酶可按国际专利申请公开文本WO 93/23569和WO 94/02595(均引入本文作为参考)所述设计，并按所述合成用于体外和体内实验。也可优化这些核酶便于递送。尽管提供了具体实例，但本领域技术人员将知晓，必要时可采用其它物种的等同RNA靶标。

可以通过计算机折叠(Jaeger等，1989)单独地对锤头或发夹核酶进行分析，以评价该核酶序列是否折叠成适当的二级结构。将在结合臂和催化核心之间具有不利分子间相互作用的那些核酶排除在考虑之外。可以选择不同的结合臂长度以优化活性。一般，每条臂上至少5个左右的碱基能够结合靶RNA，或以其它方式与靶RNA相互作用。

可以将具有锤头或发夹基序的核酶设计成与mRNA信息中的各位点退火，并且可以对其进行化学合成。所用的合成方法同Usman等(1987)和Scaringe等(1990)所述的用于正常RNA合成的程序，并且采用通常的核酸保护和偶联基团，例如5’末端采用二甲氧基三苯甲基，而3’末端采用亚磷酰胺。典型地，平均的逐步偶联产量大于98％。发夹核酶可以分两部分合成，然后退火以重新构建活性核酶(Chowrira和Burke，1992)。可以对核酶进行广泛的修饰，以便通过采用核酸酶抗性基团如2’-氨基、2’-C-烯丙基、2’-氟、2’-o-甲基、2’-H增加稳定性(综述参见例如Usman和Cedergren，1992)。核酶可以采用一般方法通过凝胶电泳或通过高压液相层析获得纯化，并重悬在水中。

核酶的活性可以通过改变核酶结合臂的长度、或化学合成修饰的核酶来优化，所述修饰有防止该核酶受到血清核糖核酸酶降解的修饰(见例如国际专利申请公开文本WO 92/07065；Perrault等，1990；Pieken等，1991；Usman和Cedergren，1992；国际专利申请公开文本WO 93/15187；国际专利申请公开文本WO 91/03162；欧洲专利申请公开文本92110298.4；美国专利5,334,711；和国际专利申请公开文本WO 94/13688，它们描述了能够对酶性RNA分子的糖部分进行的各种化学修饰)，增强核酶在细胞中的效力的修饰、以及为了缩短RNA合成时间和减少化学必要条件而进行的茎区II碱基的清除。

Sullivan等(国际专利申请公开文本WO 94/02595)描述了递送酶性RNA分子的一般方法。核酶可以通过熟悉本领域的人员已知的多种方法施用给细胞。这些方法包括但不限于包装在脂质体内、离子电渗疗法、或掺入其它载体(如水凝胶、环化糊精、生物可降解微型囊(nanocapsule)、和生物粘着微球体)中。对于一些情况，可以在有或没有上述载体的情况下直接将核酶离体递送给细胞或组织。或者，可以通过直接吸入、直接注射、或利用导管、输注泵或支架，进行RNA/载体组合的局部递送。其它递送途径包括，但不限于，血管内、肌肉内、皮下或关节注射，气雾剂吸入，口服(片剂或丸剂形式)，局部的、系统的、眼、腹膜内和/或鞘内递送。关于核酶递送和施用的更为详细的描述参见国际专利申请公开文本WO 94/02595和国际专利申请公开文本WO 93/23569，所有文献均特此并入本文作为参考。

在细胞内积聚高浓度核酶的另一方法是将该核酶编码序列掺入DNA表达载体中。核酶序列的转录由针对真核RNA聚合酶I(pol I)、RNA聚合酶II(pol II)或RNA聚合酶III(pol III)的启动子驱动。从pol II或pol III启动子获得转录本将在所有细胞中以高水平表达；在指定细胞类型中指定的pol II启动子的水平将取决于附近存在的基因调节序列(增加子、沉默子等)的性质。也可以采用原核RNA聚合酶启动子，只要在适当的细胞中有该原核RNA聚合酶表达即可(Elroy-Stein和Moss，1990；Gao和Huang，1993；Lieber等，1993；Zhou等，1990)。从这些启动子表达的核酶可以在哺乳动物细胞中发挥功能(例如Kashani-Saber等，1992；Ojwang等，1992；Chen等，1992；Yu等，1993；L’Huillier等，1992；Lisziewicz等，1993)。可以将这些转录单位掺入多种用于导入哺乳动物细胞的载体中，这些载体包括，但不限于，质粒DNA载体、病毒DNA载体(例如腺病毒或腺相关病毒载体)、或病毒RNA载体(例如逆转录病毒、无名森林病毒、新培斯病毒载体)。

核酶可以用作诊断工具检查患病细胞中的遗传漂变(geneticdrift)和突变。它们还可以用于评价靶RNA分子的水平。核酶活性和靶RNA结构间的紧密关系使得可以在改变了靶RNA碱基配对和三维结构的该分子任何区域中检测到突变。通过采用多种核酶，可以给在体外、以及细胞和组织内对RNA的结构和功能重要的核苷酸改变进行作图。可以采用核酶对靶RNA的切割抑制基因表达和(基本上)确定疾病进程中指定基因产物的作用。以此方式，可以将其它遗传靶标确定为该疾病的重要中介体。这些研究将通过提供综合治疗(例如靶向不同基因的多种核酶、与已知小分子抑制剂偶联的核酶、或联合核酶和/或其它化学或生物分子进行的间歇疗法)的可能性导致对该疾病进程的更好治疗。核酶的其它体外应用是本领域熟知的，包括检测与I L-5相关疾病有关的mRNA的存在。该RNA通过采用标准方法在以核酶进行处理后测定切割产物的存在来检测。

结合剂

本发明还提供特异地与annexin A3蛋白质结合的药剂，例如抗体和其抗原结合片段。在本文中，如果抗体或其抗原结合片段与annexinA3蛋白质的反应(在例如ELISA中)处于可检测到的水平，而在相似条件下与无关蛋白质的反应不能被检测到时，则被认为与annexin A3蛋白质“特异结合”。本文所用“结合”是指两个独立分子之间的非共价联接以致形成复合物。结合能力可以通过例如测定形成该复合物的结合常数来评价。结合常数是当用各成分的浓度乘积除该复合物的浓度时获得的值。一般地，在本发明的上下文中，当形成复合物的结合常数大于约10³L/mol时，两个化合物被认为是“相结合的”。该结合常数可以采用本领域熟知的方法测定。

采用本文提供的代表性测定方法，结合剂还能够区分癌症患者/癌细胞是否具有耐受铂类化疗药物的耐受性。换言之，与annexin A3蛋白质结合的抗体或其它结合剂将在至少约20％耐药性患者/癌细胞中产生指示耐药性存在的信号，而将在至少约90％敏感患者/癌细胞中产生指示耐药性不存在的信号。为了确定结合剂是否满足此要求，可以按本文所述方法测定在来自(用标准临床检验确定的)耐药和敏感的患者的生物样品(例如肿瘤活检组织)中或在耐药或敏感癌细胞中是否存在与该结合剂结合的多肽。很明显，分析的耐药性和敏感样品的数量应当具有统计学显著性。每个结合剂都应满足以上标准；然而，本领域普通技术人员将知道，可以联合使用多个结合剂以提高灵敏度。

满足以上要求的任何药剂都可以是结合剂。例如，结合剂可以是含有或不含有肽成分的核糖体、RNA分子或多肽。在一个优选实施方案中，结合剂是抗体或其抗原结合片段。抗体的制备可以采用本领域普通技术人员已知的多种技术中的任意一种。见例如Harlow和Lane，抗体：实验室手册(Antibodies：A Laboratory Manual)，Cold SpringHarbor Laboratory，1988。一般地，可以通过细胞培养技术制备抗体，这些技术包括按本文所述制备单克隆抗体，或通过用抗体基因转染适合的细菌或哺乳动物细胞宿主，以便使得可以产生重组抗体。在一项技术中，首先给多种哺乳动物(例如小鼠、大鼠、家兔、绵羊或山羊)中的任一种注射含有本发明多肽的免疫原。在该步骤中，可以将本发明的多肽不经修饰用作免疫原。或者，尤其是对于相对短的多肽，如果将该多肽与载体蛋白质，例如牛血清白蛋白或匙孔血蓝蛋白，连接在一起，则可以引起极佳的免疫应答。给该动物宿主注射该免疫原，并优选地根据预先确定的时间表掺入一或多次加强免疫，然后定期采取该动物的血液。然后可以从抗血清中，通过例如采用与适合固相支持物偶联的该多肽进行亲和层析，纯化对该多肽具有特异性的多克隆抗体。

对目的抗原多肽具有特异性的单克隆抗体可以采用例如Kohler和Milstein的技术(Eur.J.Immunol.6：511-519，1976)，及其改良方法来制备。简而言之，这些方法涉及制备能够产生具有期望特异性(即与目的多肽的反应性)的抗体的永生化细胞系。可以从例如获自按上述方法免疫的动物的脾细胞制备这些细胞系。然后通过例如和骨髓瘤细胞融合伴侣，优选与该免疫动物同基因的骨髓瘤细胞，融合，使该脾细胞永生化。可以采用多种融合技术。例如，可以将该脾细胞和骨髓瘤细胞与非离子去污剂混合几分钟，然后以低密度铺在支持杂种细胞而不支持骨髓瘤细胞生长的选择培养基上。优选的筛选技术采用了HAT(次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸苷)筛选。在足够长的时间之后，通常为约1-2周，可观察到杂种集落。选择单集落，并测试其培养物上清液与本发明多肽的结合活性。优选具有高反应性和特异性的杂交瘤。

可以从培养的杂交瘤集落的上清液中分离单克隆抗体。此外，还可以采用各种技术增加产量，例如将该杂交瘤细胞系注射入适合的脊椎动物宿主例如小鼠的腹腔内。然后可以从腹水或血液中收获单克隆抗体。可以通过常规技术例如层析、凝胶过滤、沉淀和抽提从这些抗体中除去杂质。本发明多肽可以用于纯化方法的例如亲和层析步骤中。

在某些实施方案中，可能优选采用抗体的抗原结合片段。这些片段包括Fab片段，它们可以采用标准技术制备。简而言之，可以通过在A蛋白珠柱上通过亲和层析从兔血清中纯化免疫球蛋白(Harlow和Lane，抗体：实验室手册，Cold Spring Harbor Laboratory，1988)，然后通过木瓜蛋白酶消化产生Fab和Fc片段。该Fab和Fc片段可以在A蛋白珠柱上通过亲和层析分离。

可以将本发明的单克隆抗体与一或多种治疗剂偶联在一起。在此方面适合的治疗剂包括放射性核素、分化诱导剂、药物、毒素和它们的衍生物。优选的放射性核素包括⁹⁰Y、¹²³I、¹²⁵I、¹³¹I、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、²¹¹At和²¹²Bi。优选的药物包括氨甲蝶呤、及嘧啶和嘌呤的类似物。优选的分化诱导剂包括佛波酯和丁酸。优选的毒素包括篦麻毒素、相思豆毒素、白喉毒素、霍乱毒素、gelonin、假单孢菌外毒素、志贺氏菌毒素和美洲商陆抗病毒蛋白。

寡核苷酸适配体

SELEX技术是近年来发展起来的研究核酸结构、功能及进化等的一种新的组合化学技术，它不仅在基础研究、生物筛选等方面有很好的应用，而且在临床诊断方面也显示广阔的前景(Brody EN&Gold L，J.Biotechnol.，2000，75：5-13)。筛选出的寡核苷酸适配子(aptamer)可高亲和力和高特异性地识别不同的分子。它的亲和力和特异性可与抗体相媲美，被认为是“挑战”抗体地位的一种新型试剂，在疾病的诊断和治疗中发挥越来越重要的作用。SELEX技术一般需要数轮或数十轮才能得到其相应配基。最近，Santa-ColomaTA等报道了用靶标切换技术制备的高特异性“polyclonal oligobody(多克隆寡核苷酸适配体)”、“monoclonal oligobody(单克隆寡核苷酸适配体)”或“synthetic oligobody(合成寡核苷酸适配体)”(BianchiniM et al，J.Immunol.methods，2001，252：191-197)可特异性地识别相应的蛋白质，应用于蛋白质印迹、免疫组化、免疫共沉淀等分析实验中。

调节铂化疗药物耐药性的药剂的筛选

本发明此筛选方法中将获得的或鉴定的化合物可以是能结合本发明任何核酸、肽或蛋白质的化合物。将鉴定的其它目的化合物是调节基因或本发明蛋白质表达的化合物，这样通过所述化合物的作用增加或降低所述基因或蛋白质的表达。做为替代方案，该化合物可以通过增加或降低任何本发明蛋白质的活性发挥它的作用。

例如在样品，例如来源于动物的细胞提取物中可以包含所述一种化合物或所述多种化合物。而且，所述化合物可以是本领域已知的，但是迄今为止不知道其具有抑制或激活annexin A3相互作用蛋白质的能力。反应混合物可以是无细胞提取物或可以包含细胞或组织培养物。用于本发明方法的适合设备是本领域技术人员已知的，并且，一般地，在Alberts等，Molecular Biology of the Cell，第3版(1994)，特别是17章中进行了描述。多种化合物可以，例如添加到反应混合物、细胞培养基中或者注射进入细胞中。

如果在本发明方法中鉴定了含有化合物或多种化合物的样品，那么可以从鉴定含有能起拮抗剂/激动剂作用的化合物的原始样品分离化合物，或者如果，例如原始样品由多种不同化合物组成，人们可以进一步细分原始样品，以降低每个样品的不同物质的数量，并且利用原始样品的细分部分重复该方法。根据样品的复杂性，可以进行上述步骤几次，优选地，直到根据本发明方法鉴定的样品仅仅含有有限数量或仅仅含有一种物质为止。优选地，所述样品含有具有类似化学和/或物理特性的物质，最优选所述物质相同。优选地，根据上述方法鉴定的化合物或其衍生物被进一步制成适于给动物给药的形式。

作为本发明方法的候选药剂，可以利用适合的计算机程序可以进行本发明蛋白质结构基序的折叠模拟和计算机再设计(Olszewski，Proteins 25(1996)，286-299；Hoffman，Comput.Appl.Biosci.1(1995)，675-679)或者可以通过化合物组合文库筛选获得。蛋白质折叠的计算机模拟可以用于详细肽和蛋白质模型的构象和能量分析(Monge，J.Mol.Biol.247(1995)，995-1012；Renouf，Adv.Exp.Med.Biol.376(1995)，37-45)。特别地，通过计算机辅助检索互补肽序列，适合的程序可以用于annexin A3/磷酸化annexin A3、其配体或其它相互作用蛋白质的相互作用位点的鉴定(Fassina，Immunomethods 5(1994)，114-120)。而且，在背景技术中，例如在Berry，Biochem.Soc.Trans.22(1994)，1033-1036；Wodak，Ann，N.Y.Acac.Sci.501(1987)，1-13；Pabo，Biochemistry 25(1986)，5987-5991中描述了用于蛋白质和肽设计的适合的计算机系统。从上述计算机分析获得的结果可以用于例如本发明蛋白质或其片段的肽模拟物的制备。这种蛋白质天然氨基酸序列的假肽类似物可以非常有效地模拟亲本蛋白质(Benkirane，J.Biol.Chem.271(1996)，33218-33224)。例如，在蛋白质或其片段中容易得到的非手性Ω-氨基酸残基的掺入将引起脂肪族链聚亚甲基单元对氨基键的置换，因此提供了构建肽模拟物的方便策略(Banerjee，Biopolymers 39(1996)，769-777)。在现有技术中还描述了其它系统中的小肽激素的超活性肽模拟类似物(Zhang，Biochem.Biophys.Res.Commun.224(1996)，327-331)。也可以通过连续胺烷基化合成肽模拟物组合文库，和检测由此得到化合物，例如它们的结合，激酶抑制和/或免疫特性鉴定本发明蛋白质适合的肽模拟物。在现有技术，例如在Ostresh，Methods inEnzymology 267(1996)，220-234和Dorner，Bioorg.Med.Chem.4(1996)，709-715中描述了肽模拟物组合文库产生的方法和用途。而且，可以利用本发明蛋白质的三维和/或晶体结构设计生物活性肽模拟物抑制剂(Rose，Biochemistry 35(1996)，12933-12944；Ruterber，Bioorg.Med.Chem.4(1996)，1545-1558)。

本发明相应地也提供调节本发明耐药性的药剂、以及包含所述药剂的药物组合物和所述药剂在制备调节本发明所述耐药性中的用途。

耐药性的检测和诊断

一般地，可以基于癌细胞株或从患者获得的肿瘤活检组织中annexin A3蛋白质的含量和/或编码这些蛋白质的多核苷酸的含量，检测所述癌细胞和患者是否具有铂类化疗药物耐药性。一般本文提供的结合剂可以检测生物样品中与该药剂结合的抗原的水平。多核苷酸引物和探针可以用于检测编码肿瘤蛋白质的mRNA的水平，该水平也指示了耐药性的存在与否。

对于采用结合剂检测样品中的多肽标志而言，有多种本领域普通技术人员已知的测定形式可以使用。见例如Harlow和Lane，抗体：实验室手册，Cold Spring Harbor Laboratory，1988。一般地，癌细胞株和癌症患者的铂化疗药物耐药性可以通过以下步骤确定：(a)用结合剂接触癌细胞株或从患者获得的肿瘤样品；(b)检测样品中与该结合剂结合的多肽的水平；和(c)将该多肽水平与预先确定的截断值进行比较。

在一个优选的实施方案中，该测定涉及采用固定在固相支持物上的结合剂结合该多肽，并从样品剩余物中分离该多肽。然后采用含有报道基团并特异与该结合剂/多肽复合物结合的检测试剂检测该结合的多肽。这些检测试剂可以含有例如，与该多肽特异结合的结合剂、或与该结合剂特异结合的抗体或其它药剂，例如抗免疫球蛋白、G蛋白、A蛋白或凝集素。或者，可以利用竞争测定法，在该方法中用报道基团标记多肽，并在固定化结合剂与样品一起孵育后，允许该多肽和该结合剂结合。该样品中的成分对该标记多肽与该结合剂结合的抑制程度指示了该样品与该固定化结合剂的反应性。适合用于这些测定方法的多肽包括以上所述的全长annexin A3蛋白质和其与该结合剂结合的部分。

正如以上指出的，还可以，或者作为替代方案可以，基于癌细胞样品中编码annexin A3蛋白质的mRNA的水平检测耐药性。例如，可以在基于聚合酶链式反应的测定中采用至少两个寡核苷酸引物扩增来源于样品的肿瘤cDNA的部分，其中该寡核苷酸引物中的至少一个对编码该annexin A3蛋白质的多核苷酸是特异的(即可以与之杂交)。然后采用本领域熟知的技术，例如凝胶电泳，分离并检测该扩增的cDNA。相似地，可以在杂交测定(hybridization assay)中采用特异与编码annexin A3蛋白质的多核苷酸杂交的寡核苷酸探针，检测生物样品中是否存在编码该肿瘤蛋白质的多核苷酸。

本发明还提供用于任一种以上检测和诊断方法的试剂盒。这些试剂盒典型地含有进行诊断测定所必需的两种或多种成分。这些成分可以是化合物、试剂、容器和/或设备。例如，试剂盒中的一个容器可含有特异与annexin A3蛋白质结合的单克隆抗体或其片段，或者该试剂盒中的一个容器可含有特异于annexin A3编码序列的核酸探针或引物。

癌症治疗

在本发明的其它方面，涉及基于本发明人首次发现的annexin A3与癌症的铂化疗药物耐药性的相关性，治疗癌症。在这些方法中，典型地通过本发明的诊断方法鉴定患者的耐药性，然后根据耐药性结果确定患者的铂类化疗药物施用方案。在一个实施方案中，本发明的治疗方法包括对确定为具备耐药性的患者通过本发明的调节耐药性的方法降低其耐药性后，再施用铂类化疗药物。另一实施方案中，本发明的治疗方法包括根据确定的耐药性结果，调整铂类化疗药物的给药量、给药频率等。再一实施方案中，本发明治疗方法包括根据确定的耐药性结果，替代铂类化疗药物用于该患者的治疗中。本文所用“患者”是指任何恒温动物，如哺乳动物，优选人类。

药物组合物

在其它实施方案中，本发明涉及本文所公开的一或多种多核苷酸、多肽、反义寡核苷酸、核酶、寡核苷酸适配体和/或抗体在可药用载体或者赋形剂中的制剂，用于单独或联合一或多种其它形式的诊断/治疗方法施用给细胞或动物。一个实施方案中，本发明药物组合物可以用于诊断本发明患者的铂化疗药物耐药性并预测/预后所述化疗药物的治疗效果。另一实施方案中，本发明药物组合物可以用于调整本发明患者的铂化疗药物耐药性，在此情况下，优选地，本发明药物组合物以靶向患者肿瘤细胞并导致肿瘤细胞中annexin A3表达改变(优选下调)的方式实现对患者耐药性的调整。

可药用赋形剂和载体溶液的配制是本领域技术人员熟知的。同样，对于在各种治疗方案中使用本文所述具体组合物的适合给药和治疗方案(包括例如口服、非肠道途径、静脉内、鼻内、和肌内给药和药物配制)的研制也是本领域技术人员熟知的。

本文所述治疗组合物的施用途径和频率及剂量将因人而异，而且可以由临床医师确定。一般地，可以通过注射(例如皮内、肌内、静脉内或皮下)、鼻腔途径(例如通过吸入)或口服，施用这些药物组合物。一般地，适当的剂量和治疗方案提供足以获得治疗益处的活性成分量，其可以通过确定与未治疗患者相比经治疗的患者出现改善的临床效果来监测或确定。

以下通过实施例进一步对本发明进行举例说明。但是应当理解，这些实施例不以任何方式对本发明的范围构成限制。

实施例

在本申请的研究中，本申请发明人首次利用蛋白质组学技术研究耐药与敏感细胞之间蛋白质表达谱的差异，进而寻找可能的耐药标志物。

首先建立了大剂量冲击法和小剂量间歇法诱导的卵巢癌细胞系SKOV3耐受顺铂的细胞系，通过对两种细胞系的生物学特性的检测，发现相同的药物不同的诱导方式对于耐药基因的表达具有不同的影响，小剂量间歇法更易产生耐药。并且为研究铂类耐药机制建立了良好的细胞模型。

其次，以两种卵巢癌敏感细胞系SKOV3和A2780，四种耐药细胞系SKOV3/CDDP、SKOV3/CBP、A2780/CDDP、A2780/CBP为研究对象，通过双向凝胶电泳建立了各自的蛋白质表达谱，统计分析差异表达的蛋白质，进行质谱鉴定。蛋白质annexin A3、destrin、IDHc、GSTO1-1和cofilin 1在三种以上耐药细胞中差异表达。其中，首次发现annexin A3在耐药细胞中表达均显著上调，同时已经通过RT-PCR和western blot两种方法同时验证了此结果。

为了解annexin A 3与耐药性的关系，利用基因工程技术，以pcDNA3.1/myc-His(-)B为载体，构建表达反义annexin A3的真核表达质粒，以pcDNA3.1(+)为载体，构建表达正义annexin A3的真核表达质粒，并以pEGFP-N1为载体，构建表达annexin A3融合蛋白的真核表达质粒，通过脂质体介导质粒DNA转染各细胞系。通过pEGFP-N1-annexin A3分别转染SKOV3和A2780细胞系，检测SKOV3和A2780的转染效率分别为20-25％和45-55％。稳定转染后敏感细胞系在转染正义annexin A3质粒后耐药指数上升2～4倍，耐药细胞系在转染反义annexin A3质粒后耐药指数下降2倍左右，证明了annexinA3的上调或下调与耐药性有关。

为了在临床验证annexin A3与铂类耐药的相关性，分别收集临床卵巢癌治疗中采用铂类为主化疗敏感及耐药病人的手术病例，对石蜡切片进行annexin A3的免疫组化试验。双盲法显微镜下阅片和评价，采用等级资料的秩和检验统计化疗敏感及耐药患者的annexin A3表达量，U值＝139，P值＝0.035＜0.05，说明化疗敏感者与耐药者的annexinA3表达量之间存在显著性差异，化疗耐药者的annexin A3表达量高于敏感者，验证了annexin A3是一种卵巢癌铂类耐药相关蛋白。

实施例一上皮性卵巢癌耐药细胞系的建立和鉴定

(一)实验方法

一)细胞系与细胞培养

人浆液性卵巢癌SKOV3细胞系购于中国医学科学院基础医学细胞中心。细胞在含10％胎牛血清的DMEM(HG)(美国Gibco公司)培养液中贴壁生长，置于37℃、5％CO₂饱和湿度培养箱中培养，0.25％胰蛋白酶消化传代。

二)耐药细胞系的建立

1.大剂量冲击诱导法命名为SKOV3/CDDP-P细胞。在培养基中加入100μmol/L CDDP(顺铂，FH科鼎有限公司)2h后，弃含药培养基，加不含药物培养基，置于37℃、5％CO₂饱和湿度培养箱中继续培养，待细胞生长至对数生长期(密度至70％-80％)，重复剂量冲击。100μmol/L冲击20次，200μmol/L冲击10次。给药间隔时间由最初的4周逐渐变为4～5d。具体给药时间和间隔见图1。

2.小剂量间歇诱导法命名为SKOV3/CDDP-80。在培养基中加入10μmol/L的CDDP，置于37℃、5％CO₂饱和湿度培养箱中培养48h，弃含药培养基，加不含药物培养基，置于37℃、5％CO₂饱和湿度培养箱中继续培养，待细胞生长至对数生长期，重复剂量诱导。剂量为10、20、40和80μmol/L各10次递增。给药间隔时间由最初的6周逐渐变为1～2周。具体给药时间和间隔见图2。

细胞诱导成功后，将细胞在无药物的培养基中培养2个月，再进行各项实验。

三)药物敏感试验

取指数生长期细胞，胰酶消化后制成单细胞悬液，按2000个细胞/孔/100μl，每种细胞按每个浓度设6个平行孔，对照孔12个，不加药物，其中6个孔为阴性对照(加入细胞、不加药物)，6个孔为空白对照(只加培养基)。37℃、5％CO₂培养24小时后加入CDPP，以3-5倍稀释成7个梯度，CDDP最高浓度200μg/ml，继续培养72小时，加入5mg/ml MTT(四甲基偶氮唑盐，美国Sigma公司)20μl，37℃、5％CO₂继续培养4小时，控净培养基，加100μl裂解液(含20％SDS，50％N-N二甲基甲酰胺，pH 4.7)，过夜，全自动酶标仪以540nm测定吸光值(OD值)，可求算每种药物浓度吸光值的平均值，计算细胞存活率及抑制率，根据药物浓度和抑制率，使用SPSS11.5软件计算IC50(抑制50％细胞生长的药物浓度)及耐药指数(RI)。

抑制率(inhibition rate)＝[(OD对照-OD实验)/OD对照]×100％

RI＝耐药细胞系的IC50/敏感细胞系的IC50

四)形态学观察

1.倒置显微镜

将5×10⁴/ml单细胞悬液接种至内铺小玻片的24孔培养板内，置于37℃、5％CO₂孵箱内培养72小时后用PBS洗2遍，甲醛固定10分钟，瑞式-姬姆萨染色2小时，再用PBS洗2遍，室温晾干，中性树胶封片，光镜下观察、拍照。瑞式-姬姆萨染色液配方：

磷酸氢二钠(1/15M)     6ml

磷酸二氢钾(1/15M)     4ml

瑞氏染色液(Sigma)     120μl

MAY染色液(Sigma)      120μl

姬姆萨染色液(Sigma)   500μl

2.细胞内超微结构观察

(1)对数期生长的细胞(细胞总数≥1×10⁶)，弃培养基，PBS洗涤2次；

(2)加入PBS10ml，送至军事医学科学院(北京海淀区太平路27号)仪器检测中心电镜室进行细胞切片；

(3)细胞长至对数生长期，PBS洗两遍，用细胞刷将细胞刮下，1000g离心10分钟，3％戊二醛(1/15M PBS pH7.4)，4℃下固定2小时，4℃下1/15M PBS+0.19M蔗糖缓冲液漂洗15分钟。乙醇4℃下梯度脱水(50％乙醇、70％乙醇、90％乙醇、90％乙醇+90％丙酮、90％丙酮、100％丙酮各10分钟)，100％丙酮在室温下脱水10分钟。100％丙酮∶包埋剂(1∶1)室温浸透30分钟，纯包埋剂浸透过夜。进行包埋：聚合时间为35℃，12小时：45℃，12小时；60℃，24小时。ULTRACUTE/S型切片机(美国RMC公司)进行超薄切片，醋酸铀染液避光染色10分钟，柠檬酸铅染色10分钟。

(4)电压75kV，EM400T电镜(荷兰Philips公司)观察，选择×8000、×22000电镜照相。

五)细胞群体倍增时间测定

取对数生长期的非耐药和耐药细胞，24孔培养板中每孔接种5000个细胞，37℃，5％CO₂培养。每天取3孔细胞进行计数，连续观察7d。绘制生长曲线，计算群体倍增时间。

六)细胞周期分析

取对数生长期的非耐药和耐药细胞各1×10⁶，制成单细胞悬液，离心收取细胞，冷PBS(PH7.4)洗涤两次，去上清，加入含70％冷乙醇、3％血清的PBS固定(-20℃)过夜，2000g离心去上清，冷PBS洗涤两次并以0.5～1ml PBS重悬(内含200μg/ml RNA酶A)，混匀后，37℃水浴30分钟，加入400μl碘化丙啶(浓度50μg/ml，Sigma)，4℃避光染色30分钟，以FACSCalibur(美国BD公司)流式细胞仪测定10000个细胞的DNA含量。

七)RT-PCR

1.细胞RNA的提取：取对数生长期的细胞约5×10⁶，以0.25％胰酶消化，PBS吹打，洗脱至10ml离心管中，800rpm离心10分钟，PBS洗两遍，转移细胞至新的Eppendorf管中，离心，弃上清。加500μlTRIzol(Sigma)混合后，吹打混匀，再加500μl TRIzol，震摇30秒，室温下放置5分钟，加200μl氯仿，颠倒混匀15秒，并在室温下放置2分钟，4℃12000g离心15分，离心后取上层水相，转移至新的Eppendorf管中，以500μl异丙醇沉淀RNA，混匀，4℃12000g离心10分，倒掉上清，沉淀用70％乙醇洗涤，4℃8000g离心10分钟，吸去上清，短暂干燥15分，加入20μl无RNA酶的水。

2.逆转录(日本TaKaRa公司逆转录试剂盒)：在50μl反应体积中，加入7μl RNA，10mM dNTP 5μl，25mM氯化镁10μl，2.5pmo l/μl的oligo dT 1μl，10×RT Buffer 5μl，40U/ml的RNasin 0.5μl，5U/ml的AMV 1μl，RNase Free dH₂O 20.5μl，混匀后离心数秒，42℃水浴60分，98℃5分钟灭活AMV。

3.PCR反应，反应体系(总体积20ul)：

Taq MasterMix buffer(美国

Invitrogen公司)                    10ul

上游引物                0.5ul

下游引物                0.5ul

逆转录产物              1ul

H₂O                     8ul

各引物(表1)反应条件为95℃预变性2min进入循环，95℃变性20s，58℃退火1min，72℃延伸50s，35个循环后72℃延伸10min。1.5％琼脂糖分离PCR产物。电泳结束后、把琼脂糖凝胶置JS-380自动凝胶图像分析仪(上海培清科技有限公司)的暗箱中，用gelscan系统扫描。使用QCapturePro软件分析扫描结果。以β-actin为内参，进行半定量比较。

八)Western blot

1.细胞的裂解：

取对数生长期的非耐药和耐药细胞，胰酶消化，1500rpm离心5分钟，弃去上清，加入无菌PBS(pH7.4)重悬，进行细胞计数，1500rpm离心5分钟，弃上清，用冷PBS洗细胞两次，吸净上清。约10⁶个细胞加laemmli裂解液(美国Bio-Rad公司)，在裂解细胞时，其它细胞处于冰水浴。加入裂解液后，99℃煮沸10分，10000g、4℃离心10分钟，取出后冰水浴。取出测定蛋白浓度的样品后，将剩余的样品每100μl加入2-ME(2-巯基乙醇)5μl，10000g、4℃离心10分钟，-20℃保存。

2.BCA法测定蛋白浓度

取BCA蛋白质定量试剂盒(Pierce)A液、B液以50∶1(v∶v)混合，取上述样品加入500μl AB混合液中，混匀，空白对照为2μl裂解液加入到500μl AB混合液，37℃水浴30分钟，以空白对照调零，在Smartspec^TMplus spectrophotometer(Bio-Rad)测562nm波长的OD值。使用Excel绘制标准曲线，求算样品浓度。

3.SDS-PAGE电泳

配制Tris-甘氨酸电泳缓冲液：25mmol/L Tris，250mmol/L甘氨酸，0.1％SDS。制备10％分离胶5ml∶去离子水1.9ml，30％丙烯酰胺溶液1.7ml，1.5％Tris 1.3ml(pH 8.8)，10％SDS 0.05ml，10％过硫酸胺0.05ml，TEMED 0.002ml。上述胶于30分钟后凝固。配5％积层胶2ml∶去离子水1.4ml，30％丙烯酰胺溶液0.33ml，1.0％Tris 0.25ml(pH6.8)，10％SDS 0.02ml，10％过硫酸胺0.02ml，TEMED 0.002ml。上述胶于30分钟后凝固。取30μg各细胞蛋白上样，80-100v，电泳2小时。

4.电转移

配制转移缓冲液：48mM Tris HCl，39mM甘氨酸，0.037％SDS，20％甲醇。戴手套剪两张与凝胶大小一致的滤纸和一张PVDF膜(Pierce)。将上述滤纸和滤膜用转移缓冲液浸泡10分钟，按滤纸、滤膜、凝胶、滤纸叠放，注意不能有气泡。右下角标记。80v、冰水浴电转移2小时。

5.免疫印迹

配制10×TBST：200mMTris HCl，1.5mM NaCl，使用前加0.05％Tween-20。将PVDF膜取下，TBST摇洗5分钟后，在含5％脱脂奶粉的TBST中封闭1小时。TBST摇洗三次(15分钟)，加入封闭液配制的一抗，4℃轻摇过夜。以TBST摇洗三次(15分钟)，加入封闭液配制的二抗(HRP标记)，轻摇1小时。TBST摇洗三次。将化学发光底物液ECL(Pierce)A、B液按体积1∶1混合，将PVDF膜作用5分钟，于暗室曝光显色。

九)统计学分析

实验数据使用SPSS11.5统计软件处理，经t检验进行统计分析。

(二)实验结果

一)耐药指数

SKOV3对CDDP的IC50为(6.67±2.58)μmol/L，RI为1。

采用大剂量冲击诱导法和小剂量间歇诱导法对SKOV3细胞进行体外诱导，历时16个月获得两种耐药细胞系，在无药物培养基中培养4个月耐药性稳定。SKOV3/CDDP-P对CDDP的IC50为(27.24±18.60)μmol/L，RI为4.12±2.01；SKOV3/CDDP-80对CDDP的IC50为(76.07±3.85)μmol/L，RI为11.50±3.15。小剂量间歇诱导法的耐药指数高于大剂量冲击诱导法(P＜0.05)(图3)，小剂量间歇诱导比大剂量冲击诱导更易产生耐药。

二)细胞形态观察

1.光镜下：SKOV3细胞及其它诱导的耐药细胞系成贴壁生长，光镜下SKOV3细胞成梭形，上皮样生长，边界清楚，折光性好(图4a)。药物诱导后大部分细胞死亡，细胞形态变长，边界模糊，大小不一。其中，SKOV3/CDDP-80细胞变化更明显，很大一部分细胞成神经元细胞样生长，伸出伪足，核畸形多见，细胞质颗粒增多(图4b，c)。待至对数生长期，细胞形态逐渐恢复，SKOV3/CDDP-P细胞形态与SKOV 3细胞差别不明显，而SKOV3/CDDP-80细胞仍呈多形性，边界不清(图4d，e，f)。

2.扫描电镜下，正常SKOV3细胞成梭形，细胞表面微绒毛丰富，长而纤细，分布均匀，细胞核大而圆，向细胞表面隆起。CDDP-P和CDDP-80均可见细胞表面微绒毛较稀疏，分布欠均匀。CDDP-P形态变化不大，而CDDP-80形态变化显著，细胞自胞核向两侧延伸，面积较大(图5a)。透射电镜下，可见SKOV3细胞核浆比例倒置，胞核较大，含1～2个核仁，核膜完整光滑，核内染色质成团块状聚集，胞浆内含有大量线粒体。CDDP-P和CDDP-80细胞核大形态不规则，畸形核可见，核膜凹陷明显，有核袋和核突。染色质分布不均，有的凝结成块，胞浆内线粒体减少，具有大量囊泡样结构。这些囊泡样结构部分是空泡，部分可见颗粒样物(图5b，c)。

三)生长曲线和细胞群体倍增时间

第2天，各细胞均处于滞留期，细胞数无明显增加。自2～3d起，SKOV3细胞进入对数生长期，明显高于SKOV3/CDDP-P和SKOV3/CDDP-80(图6)。SKOV3、SKOV3/CDDP-P和SKOV3/CDDP-80群体倍增时间(GDT)分别为27.49±4.21h、47.26±4.64h和57.48±6.17h。SKOV3/CDDP-P和SKOV3/CDDP-80细胞的GDT明显高于SKOV3细胞(P＜0.01，P＜0.001)。而SKOV3/CDDP-80细胞生长最缓慢，与SKOV3/CDDP-P细胞具有明显差异(P＜0.01)。

四)细胞周期分布

SKOV3/CDDP-P和SKOV3/CDDP-80的G₀/G₁期均明显延长(P＜0.01)，S期及G₂/M期均缩短(P＜0.05，P＜0.01)。SKOV3/CDDP-80与SKOV3/CDDP-P相比，各期虽无明显差异，但G₀/G₁期具有延长的趋势(表2)。

五)耐药相关基因的表达

RT-PCR方法测定多药耐药蛋白(multiple drug resistanceprotein，MDR1)、多药耐药相关蛋白1(multi-drug resistanceassociated protein 1，MRP1)、肺耐药蛋白(lung resistanceprotein 1，LRP1)和谷胱甘肽S转移酶pi(glutathioneS-transferase pi，GST-pi)mRNA的表达。SKOV3不表达MDR1，表达MRP1、LRP1、GST-pi。SKOV3/CDDP-P之MDR1上调(P＜0.01)，MRP1和LRP1均下调(P＜0.01)，GST-pi无明显改变。SKOV3/CDDP-80之MDR1上调(P＜0.01)，MRP1、LRP1、GST-pi无明显改变(图7、8、9)。相同的药物不同的诱导方式对于耐药基因的表达具有不同的影响，提示药物剂量对于耐药过程的产生具有不同的机制，同时说明药物的剂量对于耐药病例的产生具有一定的影响。

(三)结论

本研究为了阐明不同诱导方式建立的耐药细胞系之间存在的差异，为临床研究提供更理想的耐药模型，选用人卵巢浆液性乳头状囊腺癌SKOV 3细胞系为实验对象，CDDP为诱导药物，使用大剂量冲击法和小剂量间歇诱导法历时16个月建立了两种耐药细胞系-SKOV3/CDDP-P和SKOV3/CDDP-80，可见SKOV3对于CDDP产生耐药性是一个缓慢的过程。同时，小剂量间歇诱导比大剂量冲击诱导更易产生耐药的结果提示，临床化疗药物的剂量对于耐药病例的产生具有一定的影响。本实验建立的耐药细胞系，在4个月的常规培养过程中，耐药指标未发生改变，耐药性非常稳定。相同的药物不同的诱导方式对于耐药基因的表达具有不同的影响，提示药物剂量对于耐药过程的产生具有不同的机制。

实施例二上皮性卵巢癌铂类耐药相关蛋白质的筛选和验证

(一)实验方法

一)细胞和细胞培养：人浆液性卵巢癌细胞系SKOV 3购于中国医学科学院基础医学细胞中心。SKOV3/CDDP系本室采用大剂量顺铂冲击法诱导成耐药细胞系(具体诱导方法见第一部分。由于大剂量冲击诱导法与临床化疗方法较类似，在后面的研究中均以SKOV3/CDDP-P为研究对象，并命名为SKOV3/CDDP)。人上皮性卵巢癌细胞系A2780，A2780/CDDP，A2780/CBP和SKOV3/CBP由李力教授(广西医科大学附属肿瘤医院妇瘤科)提供。所有细胞在含10％胎牛血清的DMEM(HG)培养液中贴壁生长，置于37℃、5％CO₂饱和湿度培养箱中培养。

二)药物敏感试验：具体实验步骤见第一部分。

三)双向凝胶电泳

1.细胞总蛋白质的制备：待细胞培养至对数生长期，胰酶消化，置离心管中离心，冷PBS洗两次，离心去上清，收集细胞1×10⁶悬于50ul裂解液中(2M硫脲，EDTA 1mM，7mol/Lurea，4％CHAPS，40mmol/L Tris，65mmol/L DTT)，吹打混匀，震摇15秒，快速冻融3个循环，超声至透明，加入适量cocktail蛋白酶抑制剂(德国Roche公司)，20ug/ml DNase I，5ug/ml RNaseA(Sigma)，冰浴30分钟，13000g、4℃离心30分钟，取上清至另一Ep管中，用Bradford法(Bio-Rad)测定蛋白质的浓度，样品分装储存于-70℃备用。

2.第一相固相pH梯度等电聚焦电泳：细胞总蛋白质提取物(1mg)与水化液(8mol/Lurea+4％CHAPS+20mmol/L DTT+0.5％IPG bufferpH3-10NL+痕量溴酚蓝)充分混合，总体积350u l，加入IPGstrip持胶槽，将IPG干胶条pH 3-10(180mm×3mm×0.5mm)(英国AmershamBiosciences公司)去保护摸胶面朝下，轻轻置入持胶槽中，驱除气泡，覆盖一层DryStrip Cover Fluid(Amersham Pharmacia，#17-1335-01)，盖好持胶槽盖子，置于IPGphor等电聚焦仪(AmershamBiosciences)的电极板上，水化和聚焦在20℃自动进行，总电压时间积为6-8万Vh，其中水化重泡胀4h，在30V低电压进行6h，然后经过500V1h、1000V1.5h、5000V1h、最后稳定在8000V下进行。

3.平衡：等电聚焦结束后，迅速取出带样品的IPG胶条分别于20ml平衡液A(50mmol/L Tris-HCl pH＝8.8+6mol/L urea+30％甘油+2％SDS+0.3％DTT)和20ml平衡液B(50mmol/L Tris-HClpH＝8.8+6mol/L urea+30％甘油+2％SDS+1.85％碘乙酰胺+痕量溴酚蓝)中各平衡15分钟。

4.第二相垂直板SDS-PAGE电泳：将平衡后IPG的胶条移至1.5mm厚的连续胶(13％均匀分离胶)的浓缩胶上端，并在其一端的外侧加上SDS标准蛋白质，排净气泡后用0.5％琼脂糖封固，15℃循环水冷却，先用40mA/2块胶恒流电泳40分钟，再用60mA/2块胶恒流电泳直至溴酚蓝到达玻璃板下缘停止电泳。

四)考马斯亮兰染色：

1.取出凝胶板，置于固定液(40％乙醇，10％冰醋酸，50％双蒸水)中，震摇30分钟。

2.弃固定液，置于染色液(一片R-350(Amersham Pharmacia)溶于10％醋酸1600mL中)中热染10分钟。

3.置于脱色液(10％冰醋酸)中震摇过夜。

五)凝胶图像分析：显色的凝胶通过Imagescanner扫描仪(Amersham Biosciences)以及Labscan5扫描软(AmershamBiosciences)件获取图像。蛋白质的量被定义为构成这个斑点的所有像素值的总和。为了较准确反映蛋白质斑点量的变化，将每个点的含量表示为相对百分含量(％Vol)，也就是一个蛋白质斑点的像素值占整个凝胶内所有蛋白质斑点像素值的百分数。用ImageMaster2D Platinum分析软件(Amersham Biosciences)对图像进行背景削减、斑点检测、匹配、量化获取斑点位置坐标等分析。所有数据分析在SPSS 11.5软件上进行。

六)质谱样品的制备：

1.脱色

将电泳及染色后凝胶中的蛋白带用干净的解剖刀切下，并将胶带切成1-2mm³大小的胶粒置于Eppendorf管中。在Eppendorf管中加入超纯水清洗几次后，用含50％乙腈(ACN)的50mM的碳酸氢铵(NH₄HCO₃)脱色液30μl浸泡胶粒。振荡20分钟，弃去溶液，重复2-3次至胶中的蓝色褪尽。

2.酶解

将脱色后的胶粒真空离心干燥30分钟使其完全脱水，体积缩小，加入3-10μL胰酶液(0.01μg/μl)，置于4℃冰箱中20-30分钟。从冰箱取出样品，仔细观察样品中的酶量，若胶粒完全泡涨后酶液仍有剩余，需将多余的酶液吸出，补充5-10μl 25mM NH₄HCO₃溶液作为保温反应的缓冲液。用Parafilm封口膜将样品管封闭后超声1-2分钟，置于37℃水浴保温过夜。

3.肽提取

取出步骤2的样品，离心吸出上清液置于新的Eppendorf管中(可将此上清液取出2μl直接做质辅助激光解吸离子飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS))。

在胶中加5％TFA约5-100μl，刚好盖住胶粒。用封口膜将管口密封后超声1-2分钟，于37℃水浴中保温1小时，离心后吸出上清夜。注意不要将胶粒吸到枪头中或带出来造成样品损失。

在胶中加5％三氟乙酸(TFA)∶乙腈1∶1混合液5-100μl，用封口膜将管口密封后超声1-2分钟，于37℃水浴中保温1小时，离心后吸出上清液。

加入适量ACN于室温放置一会，待胶粒脱水变白，吸取，合并上清液。

4.干燥

将上述4步提取的上清液冰冻干燥。

七)肽质量指纹谱鉴定蛋白质：在干燥后的肽混合物内加入2μl-7μl 0.5％TFA，混匀后，取0.5μl-1μl溶液和等体积饱和基质溶液(将α-氰基-4-羟基肉桂酸(德国Bruker公司)溶于含0.1％TFA的50％ACN溶液中)混合，然后加至不锈钢靶上，室温干燥后装靶测定。20kV、阳离子模式下在Bruker reflex III型MALDI-TOF-MS质谱仪(Bruker)上获取数据。质谱峰的质量准确度以胰酶的自切峰为内标进行校正。

八)数据库查询：

通过Mascot软件在SwissProt和NCBInr数据库中进行查寻。查询条件：肽质量指纹图中的肽片段质量不限，酶选择胰酶，可变修饰选择脲甲基化和氧化作用，肽片段分子量最大容许误差控制在±100ppm，每个肽允许有1个不完全裂解位点，物种来源选择人类，离子选择阳离子和单一同位素的，被选择的片段信号均应较强，为基线宽度的1倍以上。

九)定量PCR：

取对数生长期的细胞，提取细胞总RNA，逆转录合成cDNA，进行定量PCR反应。引物由Invitrogen公司合成(见表3)。优化的荧光实时定量PCR体系为10μl，包括1μl引物，1μl模板cDNA、5μl DyNAmo PCR Master Mix(芬兰Finnzyme s公司)，3μl无RNA酶水。PCR条件设置如下：95℃灭活2分钟，95℃变性30s、52℃退火50s、72℃延伸40s，共35个循环，循环结束后72℃最后延伸7分钟。使用Opticon Monitor 3software软件(Bio-Rad)分析PCR过程各检测样本的C_T(Threshold cycle)值，本实验使用相对定量的方法，使用ΔΔC_T法进行计算比较。每次实验均重复3次，取其均值。

十)Western blot：具体实验步骤见第一部分。

十一)统计学方法

利用单因素方差分析和t检验检测样本中差异表达的蛋白质点，统计学分析在SPSS 11.5中进行。

(二)实验结果

一)耐药细胞系

六种细胞对顺铂或卡铂的IC50和RI见表4，四种耐药细胞的耐药性质比较稳定，在常规培养基中培养过程中，检测RI无明显改变。因此我们的实验对象是稳定的，增加实验结果的可信度和可重复性。

二)人卵巢癌细胞系及其耐药细胞系的双向凝胶电泳图谱

对每种细胞的蛋白质样品分别进行二维凝胶电泳分离，每个细胞样品至少重复3块凝胶，考染后每块凝胶能检测到约1800个蛋白质斑点。一种细胞样本凝胶的匹配率可达到95％以上，一种细胞系及其亚系之间凝胶匹配率为90％，不同的细胞系之间凝胶匹配率可达80％～85％。将每一种耐药细胞样品的所有重复凝胶相互对应蛋白质斑点的相对体积求平均值，表达量相差2倍以上即被视为差异点。耐药与其对应敏感细胞样品进行比较，确定了在不同细胞系中与铂类耐药相关的差异蛋白质斑点。这些点主要分布在等电点5～9、分子量14.0kDa～70.0kDa的范围内。

三)肽质量指纹谱鉴定蛋白质

通过软件分析分别获得了人卵巢癌耐药细胞系SKOV3/CDDP、SKOV3/CBP、A2780/CDDP和A2780/CBP与其亲本细胞的差异表达的62个蛋白质点(P＜0.05)(图10)，利用MALDI-TOF-MS成功的鉴定了57个蛋白质点。为了保证匹配结果的准确性，将不同凝胶上的匹配的蛋白质点同时进行质谱鉴定，结果显示它们是相同的蛋白质。在四种耐药细胞的蛋白质表达谱中，我们发现每种耐药细胞均有12～16种差异表达蛋白质，共计36种蛋白质，其中超过1/3的差异蛋白质属于酶类。究其功能囊括了多个方面的代谢，如能量代谢、核苷酸代谢、氧化还原作用、细胞骨架相关蛋白、蛋白质脂肪代谢、信号转导等等。

四)SKOV3/CDDP与SKOV3细胞的差异表达蛋白质

在SKOV3的耐药亚系SKOV3/CDDP中，发现有14个蛋白质点差异表达(P＜0.05)。其中，9个蛋白质点表达上调，5个蛋白质点表达下调(表5)。在这些差异表达蛋白质点中，有些蛋白质如热休克蛋白家族(点21和28)已经被证实与耐药有关，在耐药标本中表达上调了7倍。Annexin A3(点25)表达量升高4倍，而villin 2(点1)和IDHc(点7)的表达较亲本细胞分别降低了7倍和9倍。

五)SKOV3/CBP与SKOV3细胞的差异表达蛋白质

SKOV3/CBP与SKOV3相比较，共有16个蛋白质点差异表达(P＜0.05)(表6)。在SKOV3/CBP中，一些蛋白质显示出与SKOV3/CDDP的不同表达差异。Stomatin(EPB72)-like 2(点4)在SKOV3/CDDP中下调，而在SKOV3/CBP中却高表达.热休克70kDa蛋白1A和热休克蛋白27也表现出与SKOV3/CDDP相反的表达趋势。stathmin 1(点18)和phosphoglycerate mutase 1(点14)的表达上调了四倍，IDHc(spot 7)下调了3倍。与SKOV3/CDDP相比，annexin A3(点25)仅上调了3倍。在过去的研究中，annexin A1(点9)的上调与耐药相关，而在SKOV3/CBP中annexin A1呈下调。在这16个差异表达蛋白质中，蛋白点的强度改变均在2～4倍之间。

六)A2780/CDDP与A2780细胞的差异表达蛋白质

由于A2780和SKOV3均属上皮性卵巢癌，A2780细胞的蛋白质表达图谱与SKOV3相似。在A2780的耐受顺铂细胞A2780/CDDP中，有15个差异表达蛋白质点(P＜0.05)(表7)。其中，仅有4个蛋白质点低表达，在A2780中，annexin A3(点25)低表达，而在A2780/CDDP中annexin A3的表达升高了20倍。GSTO1-1(点54)和splicing factor，arginine\/serine-rich 3(点33)分别上调了5倍和6倍。

七)A2780/CBP与A2780细胞的差异表达蛋白质

虽然A2780/CBP和SKOV3/CBP均是在卡铂的诱导下建立起来的，但它们在差异蛋白质的表达上不甚相同。在A2780/CBP中，发现12个蛋白质点差异表达(P＜0.05)(表8)，其中共有5个蛋白质点下调，而且均下调2～3倍。Phosphoribosyltransferase(点32)和UMP-CMPK(点31)分别上调了3倍和4倍，在SKOV3/CBP中，ECH1 protein(点47)and stathmin 1(spot 18)轻微上调，而在A2780/CBP中下调。Cofilin 1(点34)的表达亦呈相反的趋势，在A2780/CBP中显著上调(10倍)，而在SKOV 3/CBP中却下调。然而，dUTP pyrophosphatase(点56)表达却均下降。

在四种耐药细胞各自的差异表达蛋白中，我们发现5种蛋白质在三种以上耐药细胞中均差异表达(表9)。其中，annexin A3(图11、12)和destrin在耐药标本中表达均上调，其中以annexin A3上调最显著(3～20倍)(图13)，NADP-dependent isocitratedehydrogenase 1(IDHc)在四种耐药细胞中均下调(图14)。Glutathione transferase omega 1(GSTO1-1)除了在SKOV3/CBP中表达无改变外，在SKOV3/CDDP、A2780/CDDP和A2780/CBP中表达均上调(图15)。而cofilin 1却表现出截然相反的性质，在SKOV3的两种耐药细胞中表达下调，在A2780的耐药细胞中却皆上调(图16)。

八)定量PCR法检测mRNA的表达

为了验证五种蛋白质在SKOV3和A2780细胞以及它们各自的耐药亚系中的表达情况，在RNA水平进行检测。结果(图17)显示，SKOV3和A2780细胞均低表达annexin A3，而它们的顺铂和卡铂耐药细胞的annexin A3水平均明显上调(P＜0.01)。Destrin在SKOV3/CDDP、SKOV3/CBP和A2780/CDDP细胞中上调(P＜0.01，P＜0.05)。Cofilin1仅仅在SKOV3/CBP中上调(P＜0.05)，A2780/CDDP中下调(P＜0.01)。而GSTO1-1仅在顺铂诱导的耐药细胞中表达上调(P＜0.01)。除了A2780/CDDP外，IDHc在其它三种耐药细胞中均下调(P＜0.01，P＜0.05)。

九)Western blot检测annexin A3的表达

进一步对四种差异表达蛋白annexin A3、destrin、cofilin 1和GSTO1-1进行western blot验证(未购到IDHc抗体)。结果可以看出，western blot结果(图18)与双向凝胶电泳(2-DE)结果完全一致。提示此五种蛋白质在耐药性质的形成中起到一定的作用，并且在耐药细胞中这些蛋白质的上调或下调可能发生在不同的水平(RNA水平或蛋白质水平或兼而有之)。

(三)结论

在我们的研究中，四种耐药细胞在培养过程中检测耐药指数均无明显改变。因此我们的实验对象是稳定的，增加实验结果的可信度和可重复性，为研究铂类耐药机制建立了良好的细胞模型。在四种耐药细胞的蛋白质表达谱中，每种耐药细胞均有12～16种差异表达蛋白质，共计36种蛋白质，其中超过1/3的差异蛋白质属于酶类。究其功能囊括了多个方面的代谢，如能量代谢、核苷酸代谢、氧化还原作用、细胞骨架相关蛋白、蛋白质脂肪代谢、信号转导等等。在这些差异表达蛋白质中，我们发现了5种蛋白质在三个以上样本中均有显著变化，分别为annexin A3、destrin、IDHc、GSTO1-1和cofilin 1，其中以annexin A3变化最显著(3～20倍)，提示此五种蛋白质在耐药性质的形成中起到一定的作用，并且在耐药细胞中这些蛋白质的上调或下调可能发生在不同的水平(RNA水平或蛋白质水平或兼而有之)。

实施例三候选耐药相关蛋白annexin A3的功能鉴定

Annexin A3进行了铂类耐药相关研究，由于annexin A3的定量PCR、westen blot结果均与2-DE结果一致，并且最具明显的上调趋势(3～20倍)，因此选择annexin A3作为进行功能研究的耐药相关候选蛋白。

(一)实验方法

一)质粒的构建

1.构建含有annexin A3(anx 3)目的基因正反义序列的质粒(pcDB-sense anx3和pcDB-antisense anx3)

(1)引物设计：根据Genbank中已知的人anx 3序列(gi：4826642)设计mRNA翻译区全长引物。Sense 5′-gaattcCATCATGGCATCTATCTGGGTT-3′，Antisense 5′-gaattcGTCATCTCCACCACAGA-3′，PCR扩增产物长度为984bp，斜体为酶切位点，在两侧均加入酶切位点EcoR I，合成T7引物TAATACGACTCACTATAGGG，引物由Invitrogen公司合成。

(2)提取总RNA和逆转录具体步骤见第一部分

(3)PCR扩增：以cDNA为模板，反应体积25μl，成分如下：Pfu 10×Rxn buffer(美国Promega公司)2.5μl，10mM dNTP 2μl，去离子水19μl，anx3上下游引物(见引物设计部分)各0.5μl，pUC-anx3质粒0.3μl，Pfu DNA polymerase(Promega)0.2μl，放置入PCR仪，95℃变性1.5min后进入循环，95℃变性1min，50℃退火1分钟，72℃延伸1.5min，35个循环后72℃延伸10min。

配制电泳液：0.04mol/L Tris-乙酸，0.001mol/L EDTA；制备1.0％的含0.5ug/ml EB的琼脂糖电泳胶，取25μl反应产物加入梳子孔，在120V电压条件下电泳20分钟，电泳后将凝胶放入JS-380自动凝胶图像分析仪，照相。

(4)DNA凝胶回收：按照天为时代科技有限公司的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒说明书进行。

1)用一干净刀片将单一的DNA条带从琼脂糖凝胶上切下，尽量切除多余凝胶，称取其重量。

2)加3倍体积溶液PN。

3)50℃水浴10min，期间不断翻转离心管，至完全胶溶。

4)将上步所得溶液加入一个吸附柱中，13000转离心60s，倒掉收集管中的废液。

5)加入漂洗液800μl PW，13000转，60s，弃掉废液。

6)加入漂洗液500μl PW，13000转，60s，弃掉废液。

7)将离心吸附柱放回收集管，13000转离心2min，尽量除去漂洗液。

8)取出吸附柱放入一个干净的离心管中，在吸附膜中间位置加入20μl洗膜缓冲液EB，室温放置2min，13000转离心60s，将离心得到的溶液重新加回离心吸附柱中，13000转离心60s。

测量浓度：取出1μl上述溶液至99μl的去离子水中，以100μl去离子水调零，使用紫外分光光度计测量260nm的OD值，按1OD＝50μg/ml DNA计算。OD260/OD280的比值应在1.7-1.9之间。

(5)加尾反应：按照Pr omega公司的pGEM-T载体所附方法说明书进行。反应体系25μl：Taq 10×buffer 2.5μl，10mM dNTP 5μl，25mM Mgcl₂ 5μl，Taq DNA polymerase(TaKaRa)0.5μl，PCR产物12μl，放置入PCR仪，72℃反应30分钟。

(6)溶液回收

将反应溶液用DNA Fragment Purification Kit Ver.2.0(TaKaRa)回收。

1)向上述反应液中加入100μl DB Buffer，然后均匀混合。

2)将试剂盒中的Spin Column安置于Collection Tube上。

3)将上述操作1的溶液转移至Spin Column中，12000转离心1分钟，倒掉收集管中的废液。

4)将500μl的Rinse A加入Spin Column中，12000转离心30s，弃掉废液。

5)将700μl的Rinse B加入Spin Column中，12000转离心30s，弃掉废液。

6)重复操作步骤5。

7)将Spin Column放入一个干净1.5ml的离心管中，在SpinColumn膜中间位置加入20μl Elution Buffer，室温放置1min，12000转离心1分钟洗脱DNA。

(7)与T载体连接反应：反应体系10μl：10×T₄ DNA Ligasebuffer 1μl，T₄ DNA Ligase(TaKaRa)1μl，去离子水2μl，已加A尾的PCR产物5μl，pGEM-T载体(Promega)1μl，混匀后置4℃过夜。

(8)大肠杆菌感受态细胞的制备

1)将原菌液(-80℃储存)取出100μl加至5ml LB细菌培养基中，37℃，200rpm/min振荡培养过夜。

2)取50μl上步菌液转接到一个含有5ml LB培养液离心管中，37℃，220rpm/min振荡培养3小时。每隔20-30分钟测量OD600值来监测培养物的生长情况，使活细胞数不应超过10⁸/ml。

3)将培养物转移至一个无菌的、用冰预冷的离心管中，冰上放置10分钟。

4)4℃，4000rpm，离心10分钟，弃净上清。

5)用600μl预冷的0.1M的氯化钙重悬细菌，置于冰浴30分。

6)4℃，4000rpm，离心10分钟，弃净上清。

7)每50ml初始培养物用2ml预冷的0.1M的氯化钙重悬细菌，然后分装成50μl一份，置4℃储存12-24小时使用。也可置-80℃长期保存。

(9)转化感受态细胞：

1)新鲜制备的200μl感受态细胞，置于冰上，完全解冰后轻轻地将细胞均匀悬浮。

2)加入10μl质粒DNA，轻轻混匀。

3)冰上放置30分钟。

4)42℃水浴热激90秒。

5)冰上放置2分钟。

6)加150μl LB培养液，37℃100rpm/min振荡培养45分钟复苏。

7)将150μl已转化的感受态细胞转移到含抗生素(Amp⁺)的琼脂糖培养基上，在涂之前加上20μl x-gal(20mg/ml)和4μl异丙基-β-D半乳糖溶液(200mg/ml)。均匀涂布，将平板置于室温直至液体被吸收。

8)将平皿倒置，37℃培养12-16小时。

平板37℃培养过夜后，可见数个蓝白斑，挑取白斑加入到含有90μg/ml Amp的5ml LB中，200rpm/min，37℃过夜。

(10)质粒DNA的提取(具体步骤参见天为科技有限公司质粒DNA的提取试剂盒说明书)

1)将过夜培养的3ml细菌，高速离心1分钟(4℃，4000rpm，离心10min)，彻底去除上清。

2)加入200μl溶液P1，用枪头或振荡器充分悬浮细菌。

3)加入200μl溶液P2，温和上下颠倒6-8次使细菌裂解，室温放置小于5分钟至溶液变成澄清。

4)加入200μl溶液PIII，温和上下颠倒6-8次，充分混匀，此时会出现白色沉淀，12000rpm，10分钟，离心。

5)将上清转入一个新的离心管中，加入200μl去内毒素树脂液SW(用前需充分混匀，使树脂悬浮)，室温放置10min，期间混合上下翻转离心管树次。

6)将所得溶液与树脂转入过滤柱CS中，12000rpm离心2min，弃去过滤柱CS，收集离心后得到的溶液。

7)在上述溶液中加入700μl结合液PB，充分混匀后，分两次加入吸附柱CB中，12000rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液。8.加入300μl结合液PB，12000rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液。

8)加入700μl漂洗液PW，(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心30秒，倒掉废液。

9)重复上步操作2次，倒掉废液。

10)12000rpm离心2min，尽量除去漂洗液。

11)取出吸附柱CB，放入一个干净的离心管中，加100μl洗脱缓冲液EB，室温放置1min，12000rpm离心1min，将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，12000rpm离心1min。

(12)Anx3重组T载体的酶切及PCR鉴定

取菌液为模板行PCR，反应体系20μl：2×Hot-start TaqMasterMix(天为时代科技有限公司)10μl，前述anx3上下游引物各0.5μl，去离子水8.5μl，菌液0.5μl，放置入PCR仪，95℃变性5min后进入循环，95℃变性1min，50℃退火1分钟，72℃延伸1.5min，30个循环后72℃延伸10min。

挑选出来的阳性克隆经抽提质粒后，利用限制性内切酶EcoR I(TaKaRa)进行酶切鉴定，反应体系20μl：EcoR I 1μl，10×H Buffer2μl，DNA 10μl，灭菌水7μl。37℃水浴1.5h。

将酶切及PCR鉴定均阳性的克隆，进一步进行DNA测序(北京奥科生物科技有限公司)。

(13)真核表达载体的构建

采用EcoR I酶切pcDNA 3.1/myc-His(-)B质粒(Invitrogen)(图19)，酶切体系30μl：EcoR I 2μl，10×H Buffer 3μl，DNA24μl，灭菌水1μl，37℃水浴3.5h，以琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(天为时代科技有限公司)回收产物。为防止自连，线性化载体进行去磷酸化反应，反应体系如下：线形化载体15μl，10×小牛肠碱性磷酸酶buffer 2μl，小牛肠碱性磷酸酶(Promega)3μl，37℃作用30mi n。之后按DNA Fragment Purification Kit Ver.2.0(TaKaRa)回收纯化去磷酸化的线性化载体。

采用EcoR I酶切Anx 3重组T载体，酶切体系30μl：EcoR I 2μl，10×H Buffer 3μl，DNA18μl，灭菌水7μl，37℃水浴1.5h，以琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(天为时代科技有限公司)回收目的片段。

(14)连接反应：反应体系10μl：10×T₄DNA Ligase buffer1μl，T₄ DNA Ligase(TaKaRa)1μl，酶切去磷酸化的pcDNA3.1/myc-His(-)B质粒4μl，目的片段4μl，混匀后置16℃过夜。

(15)转化感受态细胞：10μl连接反应产物加入200μl感受态细胞中，步骤同前，

平板(Amp⁺)，挑取菌落加入到含有90μg/ml Amp的5ml LB中，200rpm/mi n，37℃过夜。和重组质粒的酶切及PCR鉴定实验步骤。

(16)Anx3重组真核表达载体载体的酶切及PCR鉴定

取菌液为模板行PCR，反应体系20μl，分别加入T7、anx3下游引物混合物和T7、anx3上游引物(见引物设计部分)混合物来鉴定正向和反向连接，具体步骤同上。

挑选出来的正反向克隆经抽提质粒(提取质粒见前)后，利用限制性内切酶EcoR I进行酶切鉴定。

将酶切及PCR鉴定均阳性的克隆，进一步进行DNA测序。

构建pcDB-sense anx3和pcDB-antisense anx3的主要流程见图20。

2.构建含有annexin A3(anx3)目的基因正义序列的质粒(pcDNA3.1-anx3)

将pUC19-anx3质粒(法国Céline Raguenes-Nicol教授馈赠，I.C.G.M.，U332I.N.S.E.R.M.，Paris，France)和pcDNA3.1(+)质粒(Invitrogen)(图21)采用EcoR I单酶切。

20μl体系  10×K Buffer 2μl

           EcoR I 1μl

           pUC19-anx3或pcDNA3.1(+)质粒10μl

           去离子水补足至7μl

作用3h，添加2μl 10×Loading Buffer(TaKaRa)终止反应。DNA凝胶回收产物，线性pcDNA 3.1(+)质粒进行去磷酸化处理，溶液产物回收用于连接。

10μl体系    10×T₄DNA Ligase buffer 1μl

             T₄DNA Ligase(TaKaRa)1μl

             线性pEGFP-N1质粒4μl

             目的片段4μl

混匀后置16℃过夜。连接产物进行转化，挑选菌落，扩增，鉴定，具体实验步骤同前。

构建pcDNA3.1-anx3的主要流程见图22。

3.构建表达annexin A3融合蛋白的质粒(pEGFP-N1-anx3)

将上步pcDB-sense anx3和pEGFP-N1载体质粒(美国Clontech公司)(图23)采用双酶切，分别为Xho I和BamH I(TaKaRa)。

20μl体系    10×K Buffer 2μl

BamH I 1μl

Xho I 1μl

pcDB-sense anx316μl

20μl体系    10×K Buffer 2μl

BamH I  1μl

Xho I  1μl

pEGFP-N1  10μl

去离子水补足20μl

作用3h，添加2μl 10×Loading Buffer终止反应。DNA凝胶回收产物用于连接。

10μl体系   10×T₄DNA Ligase buffer 1μl

            T₄ DNA Ligase(TaKaRa) 1μl

线性pEGFP-N1质粒4μl

目的片段4μl

混匀后置16℃过夜。连接产物进行转化，挑选菌落，扩增，鉴定，具体实验步骤同前。

构建pEGFP-N1-anx3的主要流程见图24。

二)细胞转染

1.提取质粒(Qiagen质粒提取试剂盒)

(1)将5mL含Apm的LB液体培养基加入到两支试管中，分别接入含正义和反义基因的质粒的大肠杆菌，37℃，200rpm/min振荡培养过夜。将过夜培养的3ml细菌，4℃，4000rpm，离心10min，彻底去除上清。

(2)加入300μl Buffer P1，用枪头或振荡器充分悬浮细菌。

(3)加入300μl Buffer P2，温和上下颠倒4-6次使细菌裂解，室温放置小于5分至溶液变成澄清。

(4)加入300μl已预冷的Buffer P3，立即温和上下颠倒4-6次，冰浴5min。

(5)再次混匀，4000rpm，离心10min。

(6)准备好QIAGEN-tip20，将1ml Buffer QBT加入柱子中，让其因重力自然流过。

(7)将第五步的上清夜加入QIAGEN-tip20，自然流过。

(8)将1ml Buffer QC加入QIAGEN-tip20，共4次。

(9)用0.8ml的Buffer QF稀释DNA，加入QF时，用一干净的离心管接住QIAGEN-tip20的下口，收集流出液。

(10)将0.56ml异丙醇加入到上步离心管中，立即12000rpm，离心30分钟。

(11)小心弃净上清，加入1ml 70％乙醇，12000rpm，离心10分钟，小心倒掉乙醇，室温凉干5min。用20μl TE(pH 8.0)溶解沉淀。

2.转染敏感和耐药细胞

(1)将对数生长期的细胞消化传代后，以0.5×10⁶/ml的密度接种于24孔板(500μL)，置于37℃、5％CO₂孵箱内培养24小时后取出，确定细胞密度为90％～95％汇合。

(2)将0.8μg质粒加入到50μL Opti-

I Reduced Serum((Invitrogen))中，温和混匀。

(3)在使用前轻轻混匀Lipofactamine^TM2000((Invitrogen))，然后在50μL Opti-

I Reduced Serum中加入Lipofactamine^TM20002.0μL，混匀后室温孵育5min。

(4)上步液体孵育5min后，将其与已经稀释的质粒混合，混匀后室温孵育20min。

(5)细胞在转染前换成无抗生素的培养基，然后加入上步100μL混合物，轻轻混匀。4-6h后换成常规培养基。

(6)分别在转染后12、16、24、48、72h观察荧光强度及细胞转染情况，摄像，计算转染效率。

3.筛选稳定表达目的基因的单细胞克隆

细胞转染步骤同前1-5步，转染24～48h以1∶10的比例传代至六孔板，24h后加入G418，终浓度为800μg/ml，混匀。含G418培养基筛选3周。

显微镜下利用纸片法挑取克隆(单个，孤立，约500-1000个细胞构成，细胞形态均一)，接种到24孔板内，培养基内一直采用G418维持浓度200μg/ml。

待细胞在24孔板内生长至对数生长期，0.25％胰酶消化细胞，接种至6孔板继续以G418维持浓度200μg/ml培养。

待细胞在6孔板内生长至对数生长期，收集细胞，western blot进行鉴定(具体步骤见实验第一部分)，挑取阳性克隆，冻存细胞。并留取适量细胞继续培养，进行后续实验。

4.稳定转染后细胞的耐药性的测定

经western blot鉴定后，分别挑选annexin A3蛋白表达量最高和无annexin A3蛋白表达的细胞克隆各2～3个，常规细胞培养。收集对数生长期的细胞，进行IC50和RI的测定(具体步骤见实验第一部分)。

(二)结果

一)正反义质粒pcDB-sense anx3和pcDB-antisense anx3的构建、筛选和鉴定

1.总RNA完整性与纯度鉴定：

RNA的提取产物在1％琼脂糖凝胶电泳，紫外透射仪下28s、18s、5s三条RNA带清晰可见(图25)，由强变弱，表明RNA没有降解。紫外分光光度仪测定OD值及最高吸收峰，OD_260nm值为0.626，OD_280nm为0.337，OD_260nm/OD_280nm值为1.8562，表明RNA纯度较高。

2.RT-PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果：图26所示，在DNA marker1000bp附近有一明亮条带，与预期目的片段大小一致，为984bp目的片段。

3.T载体克隆(pGEM-T-anx3)鉴定：取菌液为模板行PCR，可见在DNA marker 1000bp附近有一明亮条带图27，与预期目的片段大小一致。T载体克隆后挑选阳性菌落，利用限制性内切酶EcoRI进行酶切。重组T载体长约3kb，酶切后产生984bp目的片段及3kb载体片段。酶切鉴定电泳结果如图27。进行测序后，序列与Genbank中已知的人anx3序列完全相符，证实为anx3基因cDNA片段。

4.正反义anx3真核表达载体鉴定：

pcDB-sense anx3和pcDB-antisense anx3重组质粒转化大肠杆菌后，筛选阳性菌，取菌液为模板行PCR，可见在DNA marker 1000bp处有一条清晰的扩增条带图29，与预期目的片段大小一致。菌落提取质粒DNA，EcoR I进行酶切鉴定，含插入片段的重组质粒长约6.5kb，酶切产生984bp目的片段及5.5kb载体片段，酶切结果见图29，与理论计算完全一致。用通用引物双向测序进一步验证，序列拼接后与GenBank内anx3基因cDNA比较，序列100％相符(图30)。结果表明，anx3基因cDNA片段分别以正向和反向插入pcDNA3.1/myc-His(-)B载体，成功构建正、反义真核表达载体pcDB-sense anx3和pcDB-antisenseanx3。下面是Annexin A3的核苷酸序列：

ATGGCATCTATCTGGGTTGGACACCGAGGAACAGTAAGAGATTATCCAGACTTTAGCC CATCAGTGGATGCTGAAGCTATTCAGAAAGCAATCAGAGGAATTGGAACTGATGAGAAAATGCTCATCAGCATTCTGACTGAGAGGTCAAATGCACAGCGGCAGCTGATTGTTAAGGAATATCAAGCAGCATATGGAAAGGAGCTGAAAGATGACTTGAAGGGTGATCTCTCTGGCCACTTTGAGCATCTCATGGTGGCCCTAGTGACTCCACCAGCAGTCTTTGATGCAAAGCAGCTAAAGAAATCCATGAAGGGCGCGGGAACAAACGAAGATGCCTTGATTGAAATCTTAACTACCAGGACAAGCAGGCAAATGAAGGATATCTCTCAAGCCTATTATACAGTATACAAGAAGAGTCTTGGAGATGACATTAGTTCCGAAACATCTGGTGACTTCCGGAAAGCTCTGTTGACTTTGGCAGATGGCAGAAGAGATGAAAGTCTGAAAGTGGATGAGCATCTGGCCAAACAAGATGCCCAGATTCTCTATAAAGCTGGTGAGAACAGATGGGGCACGGATGAAGACAAATTCACTGAGATCCTGTGTTTAAGGAGCTTTCCTCAATTAAAACTAACATTTGATGAATACAGAAATATCAGCCAAAAGGACATTGTGGACAGCATAAAAGGAGAATTATCTGGGCATTTTGAAGACTTACTGTTGGCCATAGTTAATTGTGTGAGGAACACGCCGGCCTTTTTAGCCGAAAGACTGCATCGAGCCTTGAAGGGTATTGGAACTGATGAGTTTACTCTGAACCGAATAATGGTGTCCAGATCAGAAATTGACCTTTTGGACATTCGAACAGAGTTCAAGAAGCATTATGGCTATTCCCTATATTCAGCAATTAAATCGGATACTTCTGGAGACTATGAAATCACACTCTTAAAAATCTGTGGTGGAGATGACTGA

(SEQ ID NO：1)

其氨基酸序列见SEQ ID NO：2

二)正义质粒pcDNA3.1-anx3的构建、筛选和鉴定

将pUC19-anx3质粒和pcDNA 3.1(+)质粒分别采用EcoR I单酶切。酶切后在1.3kb处出现条带，与预期的1339bp长度相符。将此片段回收后与线性pcDNA3.1(+)质粒相连接，经PCR鉴定，条带符合目的cDNA长度(图31a)。酶切鉴定可见含插入片段的重组质粒长约6.7kb，EcoR I单酶切产生1339bp目的片段及5.4kb载体片段(图31b)。用通用引物双向测序进一步验证，序列拼接后与GenBank内anx3基因cDNA比较，序列100％相符(图32)。结果表明，anx 3基因cDNA片段以正向插入pcDNA3.1(+)载体，成功构建正义真核表达载体pcDNA3.1-anx3。

三)pEGFP-N1-anx3的构建、筛选和鉴定

将pcDB-sense anx3采用Xho I和BamH I双酶切，在1kb处出现明亮条带，为984bp的目的片段。与线性pEGFP-N1质粒连接后，约为5.7kb。PCR鉴定，可扩增出984bp的特异片段(图33)。Xho I和BamH I双酶切鉴定可见产生984bp目的片段及4.7kb载体片段(图34)。用通用引物双向测序进一步验证，序列拼接后与GenBank内anx3基因cDNA比较，序列100％正向相符(图35)。结果表明成功构建正义真核表达质粒pEGFP-N1-anx3。

四)转染效率

本实验通过脂质体介导质粒DNA的方法转染各细胞系，分别在瞬时转染后12、16、24、48、72h观察荧光强度，发现在24h的时间点，荧光强度最强。在显微镜下计算转染效率，SKOV3细胞系及其耐药细胞亚系的转染效率为20％-25％，而A2780细胞系及其耐药细胞亚系的转染效率为45％-55％，明显高于SKOV3组(图36)。

五)阳性克隆的筛选

将正义annexin A3质粒转染敏感细胞系SKOV3、A2780，反义annexin A3质粒转染耐药细胞系SKOV3/CDDP、SKOV3/CBP、A2780/CDDP和A2780/CBP。同时均以相应的空质粒作为对照。G418筛选稳定克隆，以未经处理的正常细胞作为对照，在含800μg/ml G418培养基中培养约8-9天，正常细胞对照已全部死亡，继续加压至3w，单个细胞已增殖成为500-1000个细胞的克隆(图37)，使用纸片法将阳性克隆依次挑至24、6孔板扩增，利用western blot鉴定目的克隆。如图38所示，与未经任何转染的正常细胞相比，转染空质粒的细胞中annexin A3的表达未见差异。在转染正义质粒的细胞中，annexinA3表达明显上调，转染反义质粒的细胞中已检测不到annexin A3的表达。其中，挑选表达量最高和最低的细胞克隆作为后续实验的对象。表10列出对所挑选阳性细胞克隆的命名。

六)稳定转染后细胞的耐药性的测定

筛选鉴定阳性克隆后进行耐药性的检测。结果(表11)显示，与转染空质粒相比，敏感细胞系在转染正义annexin A3质粒后耐药指数上升约2.0～3.7倍，以SA4细胞为著，耐药细胞系在转染反义annexinA3质粒后耐药指数下降约1.2～2.2倍。其中，大部分细胞在转染后，无论是对顺铂还是卡铂的耐药性都发生了显著变化。虽然SBm对CDDP和ADC 6对CBP的耐药指数仅仅下降了1.2～1.4倍，但经t检验分析存在统计学差异。提示annexin A3的表达与耐药性成正相关，annexinA3高表达时，细胞耐药性增加；annexin A3表达受到抑制时，细胞耐药性减弱，说明annexin A3与上皮性卵巢癌对铂类耐药的形成密切相关。

(三)结论

利用基因工程技术将正义annexin A3质粒转染敏感细胞系SKOV3、A2780，反义annexin A3质粒转染耐药细胞系SKOV3/CDDP、SKOV3/CBP、A2780/CDDP和A2780/CBP。G418筛选稳定克隆，利用western blot鉴定目的克隆，扩增后进行耐药指数的检测。结果显示，与转染空质粒相比，敏感细胞系在转染正义annexin A3质粒后耐药指数上升2～4倍，耐药细胞系在转染反义annexin A3质粒后耐药指数下降2倍左右。结果说明annexin A3与上皮性卵巢癌对铂类耐药密切相关，可能涉及铂类耐药机制的形成。

实施例四耐药相关蛋白annexin A3在上皮性卵巢癌组织中表达的研究

(一)实验方法

一)卵巢癌标本收集：分别收集卵巢癌铂类为主化疗敏感组和卵巢癌化疗耐药组病人的肿瘤组织标本。严格规范入选标准，匹配研究样本。2002年11月至2005年1月期间，收集在中国医学科学院中国协和医科大学北京协和医院妇产科行卵巢癌肿瘤细胞减灭术，术后病理证实为上皮性卵巢癌的患者标本42例。入组标准：

1.病理诊断的原发性卵巢上皮癌。

2.卵巢癌化疗敏感组：经过满意的肿瘤细胞减灭术和规范化疗后达到临床完全缓解(CR)，持续时间＞6个月。

3.卵巢癌化疗耐药组：经过满意的肿瘤细胞减灭术和规范化疗后达到完全缓解(CR)，持续时间＜6个月；化疗期间肿瘤的最好疗效为PR、SD或PD者。

共收集卵巢癌化疗敏感组织标本21例和耐药组织标本21例，石蜡包埋形式保存，由北京协和医院病理科协助提供。相应患者的临床资料见表12，13。

协和医院病案室查阅化疗敏感和耐药共42例患者的病历，按病理号找出全部的术中标本切片，经病理科大夫阅片后，挑选卵巢癌组织较大，无坏死及出血，以肿瘤实质为主的切片，并寻找相应的癌组织蜡块用于免疫组化。

二)免疫组织化学染色

1.将石蜡包埋肿瘤组织进行连续切片，厚度约4um。切下石蜡薄片后，顺次经30％酒精，50℃水浸泡片刻，使其充分展开。转移至载玻片上，75℃烤片45min。

2.顺次二甲苯脱石蜡(15min×3)。系列浓度乙醇(100％，95％，80％)顺次浸泡片刻，蒸馏水冲洗2遍，PBS浸泡15-30min。

3.事先对组织抗原进行各种方法的修复，选择效果最好的抗原修复方法。经试验后AnnexinA3采用微波修复。

4.3％过氧化氢封闭10min。

5.加入一抗，将切片放入湿盒中，室温下孵育75min，PBS冲洗5min×3次。

6.全自动免疫组化染色仪加入二抗，将切片放入湿盒中，室温下孵育45min，PBS洗5min×3次。

7.DAB显色1-5min，光镜控制。PBS，蒸馏水冲洗。

8.苏木素复染：苏木苏中浸泡1min，蒸馏水冲洗，盐酸酒精消化片刻，淡氨水中浸泡1min，蒸馏水冲洗。

9.系列浓度乙醇(80％，95％，100％)顺次浸泡片刻，二甲苯顺次浸泡片刻(×2)。

10.中性树脂胶封片。

三)阅片，判定标准及阴阳性对照

所有切片均由病理科专科医生在不知道任何临床资料的情况下进行阅片。

判定标准：以细胞浆棕色为染色阳性。根据着色肿瘤细胞占全部肿瘤细胞的百分比，＜5％为(-)，5～25％为(+)，25～50％为(++)，50％～75％为(+++)，＞75％为(++++)，随机选取10个视野，平均值作为最终结果。

阳性对照：annexinA3以肝细胞作为阳性对照，阳性部位为细胞浆。

阴性对照：用免疫前的兔血清取代一抗。

四)统计学分析

使用SPSS11.5软件进行如下统计分析：

采用等级资料的秩和检验评价化疗敏感及耐药患者的annexin A3表达量是否存在显著性差异。

(二)结果

卵巢癌化疗敏感组平均年龄50.29岁，化疗耐药组平均年龄55.29岁，两组间年龄无统计学差异(P＝0.265)。两组间卵巢癌期别无统计学差异(P＝0.141)。

Annexin A3主要在细胞浆表达，部分表达在细胞核，见图39。采用等级资料的秩和检验比较化疗敏感组和耐药组患者的统计结果表明，U值＝139，P值＝0.035＜0.05，说明化疗敏感者与耐药者的annexinA3表达量之间存在显著性差异，化疗耐药者的annexin A3表达量高于敏感者，见表14，15。临床结果说明annexin A3与上皮性卵巢癌对铂类耐药的形成密切相关。

(三)结论

通过对21例化疗敏感患者与21例耐药患者的卵巢癌组织免疫组化染色研究，结果显示，两组的annexin A3表达存在显著性差异(P＝0.035)，提示annexin A3是一种铂类耐药相关蛋白，有望成为预测铂类耐药和卵巢癌预后的标记物，并且可能成为逆转临床耐药的新靶标。

表1.RT-PCR引物、产物长度、退火温度

名称	序列	产物(bp)	退火温度(℃)
				β-actin	ACACTGTGCCCATCTACGAGGAGGGGCCGGACTCGTCATACT	621	58
MDR-1	CCCATCATTGCAATAGCAGGGTTCAAACTTCTGCTCCTGA	157	58
				MRP-1	ACCAAGACGTATCAGGTGGCCTGTCAGGTTCCAGCTCCTC	428	58
LRP-1	ACAACTACTGCGTGATTCTCGGGTCTTGACATCCTGCACATA	350	58
				GST-pi	GGTGGTGACCGTGGAGACTCATGGATCAGCAGCAAG	397	58

表2.SKOV3及耐药细胞的细胞周期分布

^*P＜0.05，^**P＜0.01，与SKOV3相比较

细胞周期	SKOV3	SKOV3/CDDP-P	SKOV3/CDDP-80
				G<sub>0</sub>/G<sub>1</sub>(％)	46.15±3.26	60.74±2.36<sup>**</sup>	65.41±3.88<sup>**</sup>
S  (％)	40.30±2.68	27.76±1.69<sup>*</sup>	26.74±1.93<sup>**</sup>
				G<sub>2</sub>/M(％)	13.55±0.59	11.50±0.70<sup>*</sup>	7.85±1.57<sup>*</sup>

表3.实时定量PCR的引物序列、片段长度和退火温度

名称	序列	产物(bp)	退火温度(℃)	SEQ ID NO：
					annexin A3	TGAAGGGTATTGGAACTGATGTGAGAAGAAGTAAGGTGGAGC	254	52	34
destrin	GTAAATGCTCCACACCAGAAGGCATCATACAAAGCATAGCGA	199	52	56
					cofilin 1	TATGAGACCAAGGAGAGCAAGCTTGACCTCCTCGTAGCAGTT	148	52	78
GSTO1-1	AAGCATACCCAGGGAAGAAGCTGCCATCCACAGTTTCAGTTT	334	52	910
					IDHc	AGAGCAAAGCTTGATAACAATGAAAAATGTAAACCTGTAGAC	284	52	1112
beta-actin	AAACTACCTTCAACTCCATCAAACTAAGTCATAGTCCGCCTA	319	52	1314

表4.六种细胞系的IC50和RI值，“-”：IC50值未测

表5.SKOV3/CDDP与SKOV3细胞的差异表达蛋白质

表6.SKOV3/CBP与SKOV3细胞的差异表达蛋白质

表7.A2780/CDDP与A2780细胞的差异表达蛋白质

表8.A2780/CBP与A2780细胞的差异表达蛋白质

表9.MALDI-TOF-MS鉴定的三种以上耐药细胞共有的差异表达蛋白质

表10.对western blot鉴定后挑选的目的克隆的命名

细胞系	转染质粒	命名	细胞系	转染质粒	命名
						SKOV3	pcDNA3.1(+)	Sm	A2780	pcDNA3.1(+)	Am
SKOV3	pcDNA3.1-anx3	SA4	A2780	pcDNA3.1-anx3	AA4
						SKOV3/CDDP	pcDNA3.1(+)	SDm	A2780/CDDP	pcDNA3.1(+)	ADm
SKOV3/CDDP	pcDB-antisenseanx3	SDR6	A2780/CDDP	pcDB-antisenseanx3	ADR6
						SKOV3/CBP	pcDNA3.1(+)	SBm	A2780/CBP	pcDNA3.1(+)	ABm
SKOV3/CBP	pcDB-antisenseanx3	SBR6	A2780/CBP	pcDB-antisenseanx3	ABR6

表11.稳定转染后目的克隆耐药性的检测

表12.21例卵巢癌化疗敏感患者临床资料

编号	年龄	组织类型	分期
				S1	57	透明细胞癌	III c
S2	63	透明细胞癌	III c
				S3	56	浆乳癌	III c
S4	50	浆乳癌	II c
				S5	40	浆乳癌	III c
S6	49	浆乳癌	III c
				S7	42	浆乳癌	III c
S8	46	浆乳癌	III c
				S9	53	浆乳癌	III c
S10	67	浆乳癌	III b
				S11	57	浆乳癌	III c
S12	49	浆乳癌	IV
				S13	48	浆乳癌	II a
S14	47	浆乳低	III c
				S15	62	内膜样癌	III c
S16	39	内膜样癌	II c
				S17	44	内膜样癌	III c
S18	49	内膜样癌	II c
				S19	58	内膜样癌	III c
S20	42	内膜样癌	III c
				S21	38	粘液性癌	III c

表13.21例卵巢癌化疗耐药患者临床资料

编号	年龄	组织类型	分期
				R1	64	透明细胞癌	III c
R2	61	透明细胞癌	III c
				R3	51	透明细胞癌	IV
R4	63	浆乳癌	III c
				R5	48	浆乳癌	III c
R6	52	浆乳癌	III c
				R7	52	浆乳癌	II c
R8	52	浆乳癌	III c
				R9	61	浆乳癌	III c
R10	54	浆乳癌	III c
				R11	65	浆乳癌	III c
R12	75	浆乳癌	III c
				R13	51	浆乳癌	III c
R14	42	浆乳癌	III b
				R15	51	浆乳癌	III c
R16	59	移行细胞癌	III c
				R17	52	移行细胞癌	III c
R18	55	移行细胞癌	III c
				R19	54	内膜样癌	III c
R20	53	内膜样癌	III c
				R21	52	粘液性癌	III c

表14.42例卵巢癌化疗敏感及耐药组织标本的染色结果

编号	Annexin A3	编号	Annexin A3
				S1	4+	R1	4+
S2	3+	R2	4+
				S3	3+	R3	3+
S4	2+	R4	3+
				S5	2+	R5	3+
S6	2+	R6	3+
				S7	2+	R7	3+
S8	1+	R8	2+
				S9	1+	R9	2+
S10	1+	R10	2+
				S11	1+	R11	2+
S12	1+	R12	2+
				S13	1+	R13	2+
S14	1+	R14	1+
				S15	-	R15	1+
S16	-	R16	1+
				S17	-	R17	1+
S18	-	R18	1+
				S19	-	R19	1+
S20	-	R20	-
				S21	-	R21	-

表15.Annexin A3在卵巢癌化疗敏感及耐药组织中的表达结果比较

Annexin A3表达量	敏感(例)	耐药(例)
			-	7	2
1+	7	6
			2+	4	6
3+	2	5
			4+	1	2
总计	21	21

序列表

<110>中国医学科学院北京协和医院

<120>Annexin A3与癌症的铂类化疗药物耐药性的相关性

<130>IDC060070

<160>14

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>972

<212>DNA

<213>人

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(972)

<400>1

atg gca tct atc tgg gtt gga cac cga gga aca gta aga gat tat cca     48

Met Ala Ser Ile Trp Val Gly His Arg Gly Thr Val Arg Asp Tyr Pro

1               5                    10                   15

gac ttt agc cca tca gtg gat gct gaa gct att cag aaa gca atc aga     96

Asp Phe Ser Pro Ser Val Asp Ala Glu Ala Ile Gln Lys Ala Ile Arg

             20                  25                   30

gga att gga act gat gag aaa atg ctc atc agc att ctg act gag agg    144

Gly Ile Gly Thr Asp Glu Lys Met Leu Ile Ser Ile Leu Thr Glu Arg

         35                   40                  45

tca aat gca cag cgg cag ctg att gtt aag gaa tat caa gca gca tat    192

Ser Asn Ala Gln Arg Gln Leu Ile Val Lys Glu Tyr Gln Ala Ala Tyr

    50                   55                   60

gga aag gag ctg aaa gat gac ttg aag ggt gat ctc tct ggc cac ttt    240

Gly Lys Glu Leu Lys Asp Asp Leu Lys Gly Asp Leu Ser Gly His Phe

65                   70                   75                  80

gag cat ctc atg gtg gcc cta gtg act cca cca gca gtc ttt gat gca    288

Glu His Leu Met Val Ala Leu Val Thr Pro Pro Ala Val Phe Asp Ala

                 85                   90                  95

aag cag cta aag aaa tcc atg aag ggc gcg gga aca aac gaa gat gcc    336

Lys Gln Leu Lys Lys Ser Met Lys Gly Ala Gly Thr Asn Glu Asp Ala

            100                  105                  110

ttg att gaa atc tta act acc agg aca agc agg caa atg aag gat atc    384

Leu Ile Glu Ile Leu Thr Thr Arg Thr Ser Arg Gln Met Lys Asp Ile

        115                  120                  125

tct caa gcc tat tat aca gta tac aag aag agt ctt gga gat gac att    432

Ser Gln Ala Tyr Tyr Thr Val Tyr Lys Lys Ser Leu Gly Asp Asp Ile

    130                  135                  140

agt tcc gaa aca tct ggt gac ttc cgg aaa gct ctg ttg act ttg gca    480

Ser Ser Glu Thr Ser Gly Asp Phe Arg Lys Ala Leu Leu Thr Leu Ala

145                  150                 155                  160

gat ggc aga aga gat gaa agt ctg aaa gtg gat gag cat ctg gcc aaa    528

Asp Gly Arg Arg Asp Glu Ser Leu Lys Val Asp Glu His Leu Ala Lys

                 165                 170                  175

caa gat gcc cag att ctc tat aaa gct ggt gag aac aga tgg ggc acg    576

Gln Asp Ala Gln Ile Leu Tyr Lys Ala Gly Glu Asn Arg Trp Gly Thr

            180                  185                  190

gat gaa gac aaa ttc act gag atc ctg tgt tta agg agc ttt cct caa    624

Asp Glu Asp Lys Phe Thr Glu Ile Leu Cys Leu Arg Ser Phe Pro Gln

        195                  200                  205

tta aaa cta aca ttt gat gaa tac aga aat atc agc caa aag gac att    672

Leu Lys Leu Thr Phe Asp Glu Tyr Arg Asn Ile Ser Gln Lys Asp Ile

    210                  215                  220

gtg gac agc ata aaa gga gaa tta tct ggg cat ttt gaa gac tta ctg    720

Val Asp Ser Ile Lys Gly Glu Leu Ser Gly His Phe Glu Asp Leu Leu

225                 230                  235                  240

ttg gcc ata gtt aat tgt gtg agg aac acg ccg gcc ttt tta gcc gaa    768

Leu Ala Ile Val Asn Cys Val Arg Asn Thr Pro Ala Phe Leu Ala Glu

                245                   250                 255

aga ctg cat cga gcc ttg aag ggt att gga act gat gag ttt act ctg    816

Arg Leu His Arg Ala Leu Lys Gly Ile Gly Thr Asp Glu Phe Thr Leu

            260                  265                  270

aac cga ata atg gtg tcc aga tca gaa att gac ctt ttg gac att cga    864

Asn Arg Ile Met Val Ser Arg Ser Glu Ile Asp Leu Leu Asp Ile Arg

        275                  280                  285

aca gag ttc aag aag cat tat ggc tat tcc cta tat tca gca att aaa    912

Thr Glu Phe Lys Lys His Tyr Gly Tyr Ser Leu Tyr Ser Ala Ile Lys

    290                  295                 300

tcg gat act tct gga gac tat gaa atc aca ctc tta aaa atc tgt ggt    960

Ser Asp Thr Ser Gly Asp Tyr Glu Ile Thr Leu Leu Lys Ile Cys Gly

305                  310                 315                  320

gga gat  gac tga                                                   972

Gly Asp Asp

<210>2

<211>323

<212>PRT

<213>人

<400>2

Met Ala Ser Ile Trp Val Gly His Arg Gly Thr Val Arg Asp Tyr Pro

1                5                    10                  15

Asp Phe Ser Pro Ser Val Asp Ala Glu Ala Ile Gln Lys Ala Ile Arg

            20                   25                   30

Gly Ile Gly Thr Asp Glu Lys Met Leu Ile Ser Ile Leu Thr Glu Arg

         35                  40                   45

Ser Asn Ala Gln Arg Gln Leu Ile Val Lys Glu Tyr Gln Ala Ala Tyr

    50                   55                   60

Gly Lys Glu Leu Lys Asp Asp Leu Lys Gly Asp Leu Ser Gly His Phe

65                   70                  75                   80

Glu His Leu Met Val Ala Leu Val Thr Pro Pro Ala Val Phe Asp Ala

                 85                  90                   95

Lys Gln Leu Lys Lys Ser Met Lys Gly Ala Gly Thr Asn Glu Asp Ala

            100                  105                  110

Leu Ile Glu Ile Leu Thr Thr Arg Thr Ser Arg Gln Met Lys Asp Ile

        115                  120                  125

Ser Gln Ala Tyr Tyr Thr Val Tyr Lys Lys Ser Leu Gly Asp Asp Ile

    130                  135                  140

Ser Ser Glu Thr Ser Gly Asp Phe Arg Lys Ala Leu Leu Thr Leu Ala

145                 150                  155                  160

Asp Gly Arg Arg Asp Glu Ser Leu Lys Val Asp Glu His Leu Ala Lys

                165                  170                  175

Gln Asp Ala Gln Ile Leu Tyr Lys Ala Gly Glu Asn Arg Trp Gly Thr

            180                  185                  190

Asp Glu Asp Lys Phe Thr Glu Ile Leu Cys Leu Arg Ser Phe Pro Gln

        195                  200                  205

Leu Lys Leu Thr Phe Asp Glu Tyr Arg Asn Ile Ser Gln Lys Asp Ile

    210                  215                  220

Val Asp Ser Ile Lys Gly Glu Leu Ser Gly His Phe Glu Asp Leu Leu

225                 230                  235                  240

Leu Ala Ile Val Asn Cys Val Arg Asn Thr Pro Ala Phe Leu Ala Glu

                 245                 250                  255

Arg Leu His Arg Ala Leu Lys Gly Ile Gly Thr Asp Glu Phe Thr Leu

            260                  265                  270

Asn Arg Ile Met Val Ser Arg Ser Glu Ile Asp Leu Leu Asp Ile Arg

        275                  280                  285

Thr Glu Phe Lys Lys His Tyr Gly Tyr Ser Leu Tyr Ser Ala Ile Lys

    290                  295                  300

Ser Asp Thr Ser Gly Asp Tyr Glu Ile Thr Leu Leu Lys Ile Cys Gly

305                  310                  315                 320

Gly Asp Asp

<210>3

<211>21

<212>DNA

<213>引物

<400>3

tgaagggtat  tggaactgat  g                                        21

<210>4

<211>21

<212>DNA

<213>引物

<400>4

tgagaagaag taaggtggag c    21

<210>5

<211>21

<212>DNA

<213>引物

<400>5

gtaaatgctc cacaccagaa g    21

<210>6

<211>21

<212>DNA

<213>引物

<400>6

gcatcataca aagcatagcg a    21

<210>7

<211>21

<212>DNA

<213>物

<400>7

tatgagacca aggagagcaa g    21

<210>8

<211>21

<212>DNA

<213>引物

<400>8

cttgacctcc tcgtagcagt t    21

<210>9

<211>21

<212>DNA

<213>引物

<400>9

aagcataccc agggaagaag c    21

<210>10

<211>21

<212>DNA

<213>引物

<400>10

tgccatccac agtttcagtt t    21

<210>11

<211>21

<212>DNA

<213>物

<400>11

agagcaaagc ttgataacaa t    21

<210>12

<211>21

<212>DNA

<213>物

<400>12

gaaaaatgta aacctgtaga c    21

<210>13

<211>21

<212>DNA

<213>物

<400>13

aaactacctt caactccatc a    21

<210>14

<211>21

<212>DNA

<213>引物

<400>14

aactaagtca tagtccgcct a    21

Claims (7)

1.能够减少和/或抑制癌细胞中的annexin A3表达的药剂在制备降低癌症的铂类化疗药物耐药性的药物中的用途，其中所述癌症是卵巢癌。

2.权利要求1的用途，其中所述药剂选自：抑制annexin A3表达的反义核苷酸或特异切割annexin A3 mRNA的核酶。

3.能够检测annexin A3表达的药剂在制备检测试剂盒中的用途，其中所述试剂盒用于预测铂类化疗药物在癌症患者中的治疗效果，即，预测患者的铂类化疗药物耐药性，所述癌症是卵巢癌。

4.能够检测annexin A3表达的药剂在制备用于检测癌细胞的铂类化疗药物耐药性或诊断癌症患者的铂类化疗药物耐药性的检测或诊断试剂盒中的用途，其中所述癌症是卵巢癌。

5.权利要求3或4的用途，其中所述药剂选自：特异结合annexinA3的抗体或其抗原结合片段、特异结合annexin A3蛋白质的寡核苷酸适配体、或特异于annexin A3基因的核酸探针或引物。

6.权利要求1的用途、权利要求3的用途、或权利要求4的用途，其中所述癌症是上皮样卵巢癌。

7.权利要求1的用途、权利要求3的用途、或权利要求4的用途，其中所述铂类化疗药物是顺铂或卡铂。

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