CN100549163C - 制备无饲养细胞、无异源的人胚胎干细胞的方法以及使用该方法制备的干细胞培养物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及使用无饲养细胞、无异源的培养体系来建立并繁殖人胚胎干细胞系的方法，并涉及存在于无异源污染物和饲养细胞的培养物中的、能够维持未分化、具有多能性和可增殖状态的干细胞。

Description

制备无饲养细胞、无异源的人胚胎干细胞的方法以及使用该方法制备的干细胞培养物
发明领域及背景技术
本发明涉及使用无饲养细胞(如饲养细胞层，也称作饲养层)、无异源(xeno-free)的培养体系来制备人胚胎干细胞系的方法，另外还涉及在该无异源污染物和饲养细胞的培养物中，能够维持其未分化、具有多能性和可增殖状态的干细胞。
胚胎干细胞(ESCs)是全能性的，其具有分化为任意类型的细胞并生成任意类型的组织、器官或部分躯体包括完整有机体的能力。同样，人们预期如果能够根据需要而获得常态人ESCs克隆并且能够控制其分化，则将提供一种强有力的工具，将对生物医学、工业和科学研究领域产生根本性的推动作用。ESCs潜在的用途非常广泛，包括药物的发现和测试、用于移殖的细胞、组织和器官的产生、生物分子的制备、化合物的毒性和/或致畸性测试、以及促进有关发育和其它生物进程的研究。例如，目前预期一些疾病，包括Parkinson’s病(帕金森病)、心肌梗塞、幼年型糖尿病和白血病，均能够通过治疗性移殖ESCs或ESC衍生细胞而加以治疗(Gearhart J.Science 1998，282：1061；Rossant和Nagy，Nature Biotech.1999，17：23)。
然而，在开发利用人ESCs的实践中仍然存在着非常大的障碍。
为了使人ESC处于一种未分化状态，必须补充能够维持细胞增殖、抑制ES细胞分化并保持细胞多能性的因子到ES培养物中。
另外，如果用于细胞置换和组织再生治疗时，人ESCs必须在一种完全无动物成分的环境中并且在特定的能够使ES培养物进行完全繁殖的培养条件下进行培养。
现有的ES培养方法主要是基于使用饲养细胞层，该细胞层能够分泌干细胞增殖所需的因子，同时又抑制干细胞的分化。无饲养细胞体系也已经应用于ES细胞培养，上述体系使用了添加血清、细胞因子、和生长因子的基质，使用该基质代替饲养细胞层。
基于饲养层的培养
小鼠饲养层-最常用的培养ES细胞的方法是基于小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)作为饲养细胞层，其中添加了含有血清或白血病抑制因子(LIF)的组织培养基，上述因子能够维持ES细胞的增殖和其多能性[Thomson JA，Itskovitz-Eldor J，Shapiro SS，Waknitz MA，SwiergielJJ，Marshall VS，Jones JM.(1998).Embryonic stem cell lines derivedfrom human blastocysts.Science 282：1145-7；Reubinoff BE，Pera MF，Fong C，Trounson A，Bongso A.(2000).Embryonic stem cell lines fromhuman blastocysts：somatic differentiation in vitro.Nat.Biotechnol.18：399-404].MEF来自于12-13天的小鼠胚胎，在条件培养基中添加了胎牛血清。在这样的条件下，小鼠ES细胞能够在培养物中作为多能性干细胞被维持，保留其表型和功能特性.然而，与鼠ES细胞不同，所添加的外源LIF不能防止人ES细胞的分化(Thomson等，1998，Science 282：1145-7；Reubinoff等，2000，Nat.Biotechnol.18：399-404)。此外，使用饲养细胞极大提升了生产成本，并且不能实现人ES细胞的规模化培养。另外，饲养细胞是代谢失活的，以防止其使干细胞过分生长，因此对于人ES的每次分离培养，均需要补充新鲜的饲养细胞。因为现在从大规模制备的胚胎细胞中还不能有效地分离出饲养细胞组分，因此由饲养细胞层制备的ES培养物还不能适用于人类的治疗。
还可以在无血清的条件下以MEF培养ES细胞，其中使用了添加基本成纤维细胞生长因子(bFGF)的血清替代品[Amit M，CarpenterMK，Inokuma MS，Chiu CP，Harris CP，Waknitz MA，Itskovitz-EldorJ，Thomson JA.(2000).Clonally derived human embryonic stem celllines maintain pluripotency and proliferative potential for prolongedperiods of culture.Dev.Biol.227：271-8]。在上述条件下，ES细胞的克隆效率比胎牛血清条件下高出4倍。另外，在使用血清替代品的条件下，在6个月的培养时间之后，根据其形成含有全部三个胚胎原基层的畸胎瘤的能力，显示出ES细胞仍然保持了其多能性。虽然上述体系使用了明确的培养条件，但是培养物中小鼠细胞的存在使人培养物暴露于病原体之下，这限制了其在细胞治疗中的应用。
以人胚胎成纤维细胞或成人法洛皮欧(fallopian)上皮细胞作为饲养细胞层-可以使用人胚胎成纤维细胞或成人法洛皮欧上皮细胞来生长和维持人ES细胞。当在上述人饲养细胞上生长时，人ES细胞显示出正常的染色体组型，表现出碱性磷酸酶活性，表达了Oct-4和其它胚胎细胞表面标记物，包括SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、和GCTM-2，能够在体内形成畸胎瘤，并保留所有关键性的形态学特性[RichardsM，Fong CY，Chan WK，Wong PC，Bongso A.(2000).Human feederssupport prolonged undifferentiated growth of human inner cell massesand embryonic stem cells.Nat.Biotechnol.20：933-6]。然而，使用人胚胎成纤维细胞或成人法洛皮欧管上皮细胞作为饲养细胞的一个主要的缺点是：上述两个细胞系的传代能力是有限的，只有8-10次，因而对延长ES的生长时间的能力造成了制约。为了使培养时间延长，必须在来源于几个受试者的人饲养细胞上生长ES细胞，这增大了培养条件的可变性。
包皮饲养层-使用人包皮饲养层也能培养人ES细胞，此项技术公开在美国专利申请号10/368,045中。来自包皮的饲养细胞层由一种完全无动物成分的环境组成，适用于培养人ES细胞。另外，包皮细胞可以在培养物中从其衍出出来后传代42次，从而为ES细胞提供了一个相对恒定的环境。在上述条件下，发现人ES细胞在功能上不同于替代方案所生长的细胞(如MEF方案)。在分化之后，ES细胞在体外能够表达与全部三个胚胎原基层相关的基因，并且在体内能够形成畸胎瘤，该畸胎瘤包括了由全部三个胚原基层所生成的组织。另外，不同于人法洛皮欧上皮细胞或人胚胎成纤维细胞，在包皮饲养层上培养的人ES细胞在培养中处于多能性和未分化状态的时间能够维持至少87次传代。然而，尽管包皮细胞能够在培养中保持很长的时间(即42次传代)，但是包皮培养体系不能很明确地确定下来，这是因为不同批次之间存在差异。另外，基于人饲养层的培养体系仍然需要饲养层和hES细胞的同时生长。因此发展了无饲养细胞的培养体系。
无饲养细胞培养
在存在培养基的条件下，干细胞可以在固相表面生长，如细胞外基质(如MatrigelRTM或层粘连蛋白)。基于饲养细胞的培养需要饲养细胞和干细胞的同时生长，并由此可能导致出现混合细胞群体，与此不同，在无饲养细胞体系中生长干细胞，能够很容易地从表面分离干细胞。使干细胞生长的培养基中包含能够有效抑制分化和促进其生长的因子，如MEF条件培养基和bFGF。然而，通常所使用的无饲养细胞培养体系使用了一种动物来源的基质(如MatrigelRTM)，其中添加小鼠或牛血清，或添加MEF条件培养基[Xu C，等(2001).Feedercells-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells.NatBiothchnol.19：971-4]，这其中存在动物病原体交叉传染给人ES细胞的危险，因此给进一步的临床应用造成了困难。
美国专利申请号10/368,045公开的进一步的技术方案中，可以在添加了包皮来源的条件培养基的基质表面培养干细胞。然而，上述条件培养基尽管是无动物成分体系，但在培养物组成上仍没有完全清楚限定。
在培养人胚胎干细胞方面，近期的一些研究给出了更加明确的培养物组成，其中利用了Matrigel或层粘连蛋白表面和生长因子混合物。然而，根据美国专利申请号20030017589的记载，在上述条件下，仅有50-70％的细胞表现出未分化细胞形态。另外，上述干细胞还表现出相对短的倍增时间，为19个小时，这提示干细胞转变为肿瘤源性(参见Amit等，2000，Dev.Biol.227：271-8)。
因此非常有必要提供一种能够使人ES细胞保持其增殖性、多能性和未分化状态的无饲养细胞、无异源的培养体系，以避免前面所述的各种不足，这将是非常有益的。
发明概述
根据本发明的一个方面，提供了一种建立不含饲养细胞、能够维持未分化、多能性和增殖状态的人胚胎干细胞系的方法，该方法包含：(a)获取人胚胎干细胞，和(b)在不含饲养细胞、包括基质和添加了TGFβ1、bFGF和/或LIF的组织培养基的培养条件下，培养人胚胎干细胞，从而获得无饲养细胞的人胚胎干细胞系。
根据所描述的优选的实施方式的进一步的特征，该方法进一步包含在所述培养条件下，从步骤(b)得到的人胚胎干细胞系中克隆细胞。
根据本发明的另一个方面，提供了一种在不含饲养细胞的培养条件下，繁殖处于未分化、多能性和增殖状态的人胚胎干细胞系的方法，该方法包含在基质上和添加了TGFβ1、bFGF和/或LIF的组织培养基中，培养人胚胎干细胞系的细胞，从而使人胚胎干细胞系的细胞保持未分化、多能性和增殖的状态。
根据本发明的另外一个方面，还提供一种建立无饲养细胞、能够维持未分化、多能性和增殖状态的人胚胎干细胞系的方法，该方法包含：(a)获取人胚胎干细胞，和(b)在不含饲养层细胞、包括纤连蛋白基质和添加了TGFβ1、bFGF和/或LIF的组织培养基的培养条件下，培养人胚胎干细胞，从而获得无饲养细胞的人胚胎干细胞系。
根据本发明的另外一个方面，提供了一种在不含饲养细胞的培养条件下，繁殖处于未分化、多能性和增殖状态的人胚胎干细胞系的方法，该方法包含在纤连蛋白基质上和添加了TGFβ1、bFGF和/或LIF的组织培养基中，培养人胚胎干细胞系的细胞，从而使人胚胎干细胞系的细胞保持一种未分化、多能性和增殖的状态。
根据本发明的另外一个方面，提供了一种建立无异源、无饲养细胞的，能够维持未分化、多能性和增殖状态的物种胚胎干细胞系的方法，该方法包含：(a)获取胚胎干细胞，和(b)在不含饲养细胞和异源污染物、包括来源于物种的基质和组织培养基的培养条件下，培养胚胎干细胞，从而获得无异源、无饲养细胞的该物种的胚胎干细胞系。
根据本发明的另外一个方面，提供了一种在不含饲养细胞和异源污染物的培养条件下，繁殖处于未分化、多能性和增殖状态的物种胚胎干细胞系的方法，该方法包含在来源于物种的基质上和组织培养基中，培养该物种的胚胎干细胞系的细胞，从而使该物种的胚胎干细胞系的细胞保持未分化、多能性和增殖的状态。
根据本发明的另外一个方面，提供了一种细胞培养物，其包含存在于培养基中的未分化、具有多能性和可增殖的人胚胎干细胞，其中该细胞培养物基本上不含异源污染物和/或饲养细胞污染物。
根据本发明的又一个方面，提供了一种无异源、无饲养细胞的培养体系，其包含基质和组织培养基，所选出的上述无异源、无饲养细胞的培养体系能够使其中所培养的人胚胎干细胞保持增殖、多能性和未分化状态。
根据本发明的又一个方面，提供了一种治疗需要细胞置换和/或组织再生的个体的方法，该方法包含给所述个体施用无异源污染物和无饲养细胞污染物的人胚胎干细胞制品。
根据优选的实施方式的其他特点，该方法进一步包含在施用前制备所述人胚胎干细胞制品，所述制备是通过下述步骤实现的：(a)获取人胚胎干细胞，和(b)在不含饲养细胞和异源污染物、包括来源于人的纤连蛋白基质和添加了TGFβ1、bFGF和/或LIF的组织培养基的培养条件下，培养人胚胎干细胞，从而制备出人胚胎干细胞制品。
根据本发明的又一方面，提供了一种在不含饲养细胞的培养条件下，使人胚胎干细胞保持未分化、多能性和增殖状态的方法，所述方法包含在包括基质和添加了至少一种生长因子的组织培养基的培养条件下，培养所述人胚胎干细胞，其中所选择的生长因子的浓度范围能够使干细胞维持至少56次传代，倍增时间为至少25小时。
根据优选的实施方式的进一步的特征，所述基质是纤连蛋白基质。
根据又一优选实施方式的进一步的特征，所述纤连蛋白选自牛纤连蛋白、重组牛纤连蛋白、人纤连蛋白、重组人纤连蛋白、小鼠纤连蛋白、重组小鼠纤连蛋白、和合成纤连蛋白。
根据优选的实施方式的进一步的特征，所述培养条件中基本上不含有异源污染物，同时所述基质选自人血浆纤连蛋白基质、重组人血浆纤连蛋白基质、人细胞纤连蛋白基质、重组人细胞纤连蛋白基质、人工合成纤连蛋白基质。
根据优选的实施方式的进一步的特征是：所述人胚胎干细胞系包含至少85％的未分化人胚胎干细胞。
根据优选的实施方式的进一步的特征是：所述人胚胎干细胞系的所述细胞所维持的倍增时间至少为25小时。
根据优选的实施方式的进一步的特征，：所述组织培养基进一步包括血清和/或血清替代品。
根据优选的实施方式的进一步的特征，：所述血清和/或血清替代品的浓度至少是10％。
根据优选的实施方式的进一步的特征，：所述血清和/或血清替代品的浓度是15％。
根据优选的实施方式的进一步的特征，：所述TGFβ1的浓度至少是0.06ng/ml。
根据优选的实施方式的进一步的特征，：所述TGFβ1的浓度是0.12ng/ml。
根据优选的实施方式的进一步的特征，：所述bFGF的浓度至少是2ng/ml。
根据优选的实施方式的进一步的特征，：所述bFGF的浓度是4ng/ml。
根据优选的实施方式的进一步的特征，：所述LIF的浓度至少是500u/ml。
根据优选的实施方式的进一步的特征，：所述LIF的浓度是1000u/ml。
根据优选的实施方式的进一步的特征，：所述基质是物种来源的纤连蛋白基质。
根据优选的实施方式的进一步的特征，：所述无饲养细胞的培养条件中基本上不含异源污染物。
根据优选的实施方式的进一步的特征，：所述物种胚胎干细胞系的细胞所维持的倍增时间至少是20个小时。
根据优选的实施方式的进一步的特征，：所述组织培养基包括来源于物种的血清和/或血清替代品。
根据优选的实施方式的进一步的特征，：来源于物种的血清的浓度至少是5％。
根据优选的实施方式的进一步的特征，：所述组织培养基进一步包括至少一种生长因子。
根据优选的实施方式的进一步的特征，：所述的至少一种生长因子选自TGFβ1、bFGF、LIF。
根据优选的实施方式的进一步的特征，：所述组织培养基是来源于物种的条件培养基。
根据优选的实施方式的进一步的特征，：所述人胚胎干细胞能够保持未分化、多能性和增殖状态至少38次传代。
根据优选的实施方式的进一步的特征，：所述TGFβ1的浓度范围是0.06-0.24ng/ml。
根据优选的实施方式的进一步的特征，：所述bFGF的浓度范围是2-8ng/ml。
根据优选的实施方式的进一步的特征，：所述LIF的浓度范围是500-2000u/ml。
根据优选的实施方式的进一步的特征，：所述培养条件包括浓度为15％的血清替代品、浓度为0.12ng/ml的TGFβ1、浓度为1000u/ml的LIF、和浓度为4ng/ml的bFGF。
本发明提供了一种利用无饲养细胞、无异源的培养体系来建立和繁殖人胚胎干细胞系的方法，并提供了存在于无异源污染物和饲养细胞的培养物中的、能够保持未分化、多能性和增殖状态的干细胞，从而成功地克服了现有已知技术方案的不足。
除非另有说明，本申请所使用的所有科技术语的含义均等同于本发明所属技术领域普通技术人员的一般理解。下面对实施本发明所适用的方法和材料进行详细描述，不过与上述方法和材料类似或等价的方法和材料同样适用于实施或检验本发明。如果存在歧义，则以本专利说明书包括定义为准。另外，下述的材料、方法和实施例仅是对本发明的说明，而不是限定本发明。
附图简述
参考后面的附图并给合实施例对本发明进行描述。下面详细参考附图，应当强调的是附图所显示出了各种细节仅作为例子，用于解释本发明所优选的实施方式，并为了有助于在原理上和概念上更容易地理解本发明。从这点上来说，附图不需要显示出本发明更为详细的结构细节，其只要能够满足对本发明的基本理解就可以了，带有附图的本说明书能够使本领域技术人员很显然地得出本发明所包含的几种实施方式。
关于附图：
附图1a-d是显微照片，显示在无饲养细胞体系中，在来源于牛纤连蛋白基质上生长的ES细胞克隆和ES单细胞。明亮区域显示在存在血清替代品和各种生长因子组合的条件下，在纤连蛋白上生长的各种ES细胞系。附图1a显示在存在TGFβ1、LIF和bFGF(TLF)的培养条件下生长的I-6ES细胞系，进行31次传代后的情况(尺寸条代表100μm)。附图1b显示在存在TLF的培养条件下生长的I-3ES细胞系，进行21次传代后的情况(尺寸条代表50μm)；附图1c显示在存在TLF的培养条件下生长的I-6ES细胞系，进行31次传代后的情况(尺寸条代表50μm))；附图1d显示TGFβ1和bFGF(TF)条件下生长的I-3ES细胞系，进行20次传代后的情况(尺寸条代表38μm)。记录细胞之间的间隔(附图1a-c)和人ES细胞典型的高核/细胞质比。
附图1e-h是免疫组织化学显微照片，显示在无饲养细胞的体系中，在来源于牛的纤连蛋白基质上生长的人I-3和I-6ES细胞系，其表面标记物的表达情况，该标记物的表达是未分化细胞的典型特征。荧光图象分别显示：在存在TF的条件下生长传代17次并用抗-SSEA4抗体标记的人ES细胞(I-3细胞系)(附图1e，尺寸条代表50μm)；在存在TLF的条件下生长传代38次并用抗-SSEA4抗体标记的I-3ES细胞(附图1f，尺寸条代表6μm)；在存在TLF的条件下生长传代30次并用抗-TRA-60抗体标记的I-6ES细胞(附图1g，尺寸条代表6μm)；在存在TF的条件下生长传代21次并用抗-TRA-81抗体标记的I-3ES细胞(附图1h，尺寸条代表6μm)。获取荧光图象既可以使用倒置荧光显微镜(附图1e)，也可以使用共聚焦显微镜(附图1f-h)。
附图2a-c显示在无饲养细胞的培养体系下，在牛来源的纤连蛋白基质上生长的hES细胞在体外的分化情况。显示无饲养细胞培养体系中生长的细胞所衍生出的EBs组织切片。附图2a是24小时时的简单EB，来源于在TF中生长传代28次后的I-3细胞系(尺寸条代表100μm)；附图2b是14天的EB，其来源于在TF中生长传代28次后的I-3细胞系(尺寸条代表50μm)；附图2c是14天的EB，其来源于在TLF中生长传代30次的I-3细胞系(尺寸条代表25μm)。注意EB的外部保护上皮(附图2b，箭头)和由柱形上皮组成的被间充质组织包围的球状结构(附图2c)。
附图2d-f显示在本发明的无饲养细胞体系中，在不同条件培养基下在牛来源的纤连蛋白基质上生长的ES细胞所形成的14天的Ebs的细胞中，中胚层和外胚层代表性标记物的表达情况。用不同的抗体探针对来源于各种ES细胞系的EB细胞进行荧光免疫染色。附图2d显示在TLF中生长传代22次的I-6细胞系，对其进行免疫染色使用的是抗神经特异性微管蛋白的抗体(尺寸条代表6μm)。附图2e显示在TLF中生长传代30次的I-3细胞系，对其免疫染色使用的是抗平滑肌肌动蛋白的抗体(尺寸条代表6μm)。附图2f显示在TF中生长传代28次的I-3细胞系，对其免疫染色使用的是抗CD-31的抗体(尺寸条代表6μm)。
附图3显示了用RT-PCR确定I-3或I-6ES细胞和由其形成的胚胎样小体(EBs)的分化阶段，其中I-3和I-6ES细胞是在无饲养细胞体系中在来源于牛的纤连蛋白基质上生长的。从I-3、I-6ES细胞或由其形成的EBs中提取RNA样品，然后对该样品进行RT-PCR反应。泳道1显示在TF中生长传代19次的I-3ES细胞；泳道2显示在TLF中生长传代20次的I-3ES细胞；泳道3显示在TLF中生长传代23次的I-3ES细胞所衍生出的14天的EBs；泳道4显示在TF中生长传代28次的I-3ES细胞所衍生出的14天的EBs；泳道5显示在TLF中生长传代30次的I-3ES细胞所衍生出的14天的EBs；泳道6显示在TLF中生长传代29次的I-3ES细胞所衍生出的14天的EBs；泳道7显示在TLF中生长传代22次的I-6ES细胞所衍生出的14天的EBs。在不存在RNA的情况下验证上述反应的特异性(附图3，泳道8)。注意泳道3-6的EBs样品来自于四种不同批次的I-3ES细胞。
附图4a-c显示I-3和I-6ES细胞系在无饲养细胞的含TLF的体系中在牛来源的纤连蛋白基质上分别生长传代26次和19次后，所衍生出的畸胎瘤的组织切片。畸胎瘤切片包括有髓神经(附图4a)、透明软骨的细节(附图4b)和杯形细胞中富含的分泌性上皮(附图4c)。尺寸条代表25μm。
附图5a-c是形态学显微照片，显示在无饲养细胞的体系中在人来源的纤连蛋白基质上生长的ES细胞的集落。显示的是在存在血清替代品和TF生长因子组合的条件下在人细胞纤连蛋白上生长传代22次的I-3ES细胞系的亮区图像。
附图5d-f是免疫组织化学显微照片，显示在无饲养细胞体系中，在人来源的纤连蛋白基质上生长的人I-3和H-9ES细胞系，其表面标记物的表达情况，该标记物的表达是未分化细胞特有的。荧光图象分别显示：在存在TF的条件下，在人细胞纤连蛋白上培养传代16次，并用抗-TRA-1-60抗体(附图5d)或抗-TRA-1-81抗体(附图5e)标记的人I-3ES细胞系；在存在TLF的条件下，在人血浆纤连蛋白上培养传代10次，并用抗-SSEA4抗体标记的人H-9ES细胞系(附图5f).
附图6a-c显示在无异源、无饲养细胞的条件下，在人纤连蛋白基质上生长的hES细胞在体外的分化情况。图象显示在不同培养条件下生长的I-3ES细胞所衍生出的14天时的EBs。附图6a是在存在TLF生长因子条件下，在人细胞纤连蛋白基质上生长传代17次；附图6b是在存在TF生长因子条件下，在人细胞纤连蛋白基质上生长传代17次；附图6c是在存在TLF生长因子条件下，在人血浆纤连蛋白基质上生长传代16次。
附图7显示通过RT-PCR确定I-3ES细胞和由其形成的胚胎样小体(EBs)的分化阶段，其中I-3ES细胞是在无饲养细胞体系中在来源于人的纤连蛋白基质上生长的。从I-3ES细胞或由其形成的EBs中提取RNA样品，然后对该样品进行RT-PCR反应。泳道1显示在TF中生长传代22次的I-3ES细胞；泳道2显示在TLF中生长传代18次的I-3ES细胞；泳道3显示在TLF中生长传代17次的I-3ES细胞；泳道4显示在TF中生长传代17次的I-3ES细胞所衍生出的14天的EBs；泳道5显示在TLF中生长传代17次的I-3ES细胞所衍生出的14天的EBs；泳道6显示在TLF中生长传代16次的I-3ES细胞所衍生出的14天的EBs。在不存在RNA的情况下验证上述反应的特异性(附图7，泳道7)。
附图8a-c显示I-3(附图8a)、I-6(附图8b)和H-9(附图8c)hES细胞系在不同培养条件下的生长速度。显示了I-3、I-6和I-9hES细胞系在如下培养条件下的生长速度，分别是：在存在TLF(分别是附图8a、b和c的粉红曲线)或TF生长因子组合(分别是附图8a、b和c的黑色曲线)的条件下，在牛纤连蛋白基质上培养；在存在TF生长因子组合的条件下，在人纤连蛋白基质上(分别是附图8a、b和c的亮蓝色曲线)，或在MEFs饲养细胞上培养(分别是附图8a、b和c的暗蓝色曲线)。
附图8d是柱状图，显示不同的培养条件维持未分化hES细胞生长的能力。人ES细胞是在如下的培养条件下培养的：小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)；牛纤连蛋白，在存在TGFβ、LIF和bFGF(TLF BF)条件下；人纤连蛋白，在存在TGFβ、LIF和bFGF(TLF BF)条件下；牛纤连蛋白，在存在TGFβ和bFGF(TF BF)条件下；人纤连蛋白，在存在TGFβ和bFGF(TF BF)条件下；牛纤连蛋白，在存在LIF和TGFβ(LT)条件下；牛纤连蛋白，在存在LIF和bFGF(LF)条件下；牛纤连蛋白，在单独存在TGFβ(T)条件下；和牛纤连蛋白，在单独存在bFGF(F)的条件下。以两天的增长测定未分化细胞的百分率。
附图9a-f显示在无饲养细胞体系中在不同的培养条件下生长的人ES细胞和人ES细胞集落。显示的是在无饲养细胞体系中生长的各种ES细胞系的亮区图像。附图9a显示在存在TLF条件下，在包皮基质上生长传代5次的I-6细胞系(尺寸条表示75μm)；附图9b显示在存在MEF条件培养基的条件下，在MatrigelRTM上生长传代12次的I-3.2细胞系(尺寸条表示50μm)；附图9c显示在存在TLF条件下，在MEF基质上生长传代几次的I-6细胞系(尺寸条表示75μm)；附图9d显示在存在TF条件下，在纤连蛋白上生长传代21次的I-3细胞系(尺寸条表示50μm)；附图9e显示在存在TLF条件下，在MatrigelRTM上生长传代12次的I-6细胞系(尺寸条表示75μm)；附图9f显示在存在TF条件下，在纤连蛋白上生长传代20次的I-3细胞系(尺寸条表示38μm)。
附图10a-f显示在纤连蛋白(附图10a和b)、MEF基质(附图10c、e和f)或MatrigelRTM(附图10d)上生长的I-6和I-3ES细胞系在SCID-beige小鼠中所形成的畸胎瘤的组织切片。用苏木精和曙红对畸胎瘤切片进行染色，包括类似肠的上皮，包括杯形细胞(附图10a)、成熟软骨组织(附图10b和c)、胚胎肌管(附图10d)、分层的表皮(附图10e)和有髓神经(附图10f)。尺寸条表示40μm。
优选实施方式的说明
本发明涉及使用无饲养细胞、无异源的培养条件来建立和繁殖人胚胎干细胞系的方法。本发明进一步涉及不含异源污染物、能够在培养中维持其未分化、多能性和可增殖状态，并由此高度适用于人类治疗用途的人胚胎干细胞系。
参考附图和随后的说明，将能够更好地理解本发明所提供制备不含饲养细胞和异源污染物的人胚胎干细胞系的方法的原理和操作过程。
在对本发明的实施方式进行详细说明之前，应当指出本发明在应用方面并不局限于本申请下面的详细说明或作为举例的实施例的细节。本发明还可以具有其它的实施方式，可以通过各种途径来实施和实现本发明。另外，还应当理解，本申请所使用的措辞和术语仅用于描述本发明，而不是对本发明的限制。
为了使人ES细胞维持其未分化的状态，ES培养物必须为细胞提供使其维持细胞增殖、抑制ES细胞分化、并保持多能性的条件。典型的培养条件是通过使用饲养细胞层而获得的，其中该细胞层能够分泌干细胞增殖所需的因子、并同时抑制干细胞分化。
为了克服与使用饲养细胞层相关的局限性，如饲养细胞污染、不确定的培养体系，人们发展了更加确定的无饲养细胞培养体系。在无饲养细胞的培养体系中使用了基质和培养基，ES细胞附着在基质上，培养基为ES细胞提供细胞增殖所需的细胞因子和生长因子并同时抑制细胞分化。
常用的基质包括从Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)小鼠肉瘤中提取的基底膜产品(如MatrigelRTM)、或牛纤连蛋白/层粘连蛋白。这样的基质通常添加小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)条件培养基，或添加了牛血清和生长因子的人工合成条件培养基。
先前使用无饲养细胞的培养体系来培养人ES细胞的尝试中，使用了添加新鲜培养基和生长因子混合物的MatrigelRTM或层粘连蛋白基质(美国专利申请号20030017589)。可是，上述无饲养细胞基质是来源于动物的组织，因而有可能使人ES细胞暴露于动物性病原体之下。另外，上述试验中联合使用了六种不同的生长因子，其浓度非常高，有可能对所培养的细胞造成不可逆转的损害。事实上，根据美国专利申请号20030017589的描述，ES细胞的倍增时间大约为19个小时，这提示了肿瘤源性表型。此外，在上述培养条件下，在无饲养细胞的培养体系中经过14次传代后，表现出未分化细胞形态的细胞仅为50-70％。
这样的培养条件对于研究目的可能是适用的，但如果是应用于人类的细胞置换治疗或组织再生，则必须在非常明确的基本上不含动物成分的条件下培养人ES细胞。
在实现本发明的过程中，发明人设计出了不含异源污染物、同时还能使人干细胞在培养中维持至少38次传代的无饲养细胞的培养条件。正如下面实施例部分所描述的，在上述条件下干细胞系保持了所有ES细胞的特性，包括多能性、不死亡、未分化的增殖能力和正常的核型。因此，本发明的无饲养细胞培养体系首次提供了一种完全无动物成分的培养环境，其能够使人ES细胞处于增殖状态同时又保持ES多能性的时间至少维持38次传代。另外，在上述条件下培养的ES细胞，其中有超过85％的细胞表现出未分化细胞形态，其倍增时间在30-35小时之间。
因此，根据本发明，提供了一种建立能够维持其未分化、多能性和增殖状态，并基本上不含异源污染物的人胚胎干细胞系的方法。
在此所使用的短语“干细胞系”指的是这样的细胞，其能够分化为具有特殊、专门功能的其它类型的细胞(即“完全分化”的细胞)，或能够维持未分化状态的细胞，下文称为“多能性干细胞”。
本发明的干细胞可以是来自任意年龄个体骨髓组织或新生个体脐带血的造血干细胞，还可以是来自妊娠后所形成的胚胎组织(如胚泡)的胚胎干细胞(ES)，或者是胚胎生殖细胞(EG)。干细胞的衍生和制备方法将在后面加以描述。本发明优选的干细胞是人胚胎干细胞。
根据本发明的一个方面，实施该方法的过程是：获取人胚胎干细胞，然后在无饲养细胞、包括基质和含有生长因子的组织培养基的培养条件下，培养人胚胎干细胞，从而建立起人胚胎干细胞系。
根据本发明的上述方面，培养过程是：将干细胞平铺到基质上，细胞的密度应当是能够有利于细胞生存和增殖、同时限制其分化的密度。典型的，所采用的铺板密度在约15,000细胞/cm2和约200,000细胞/cm2之间。
可以理解，虽然一般采用干细胞的单细胞悬浮液接种，但也可以采用小的细胞簇。对于后者，使用酶消化细胞簇，使细胞簇断开(参见下面实施例部分的实施例1)，在干细胞完全分散之前终止酶解，然后用洗液管将细胞捣碎，形成细胞团(即10-200个细胞)。但是，需要进行检测以避免产生巨大的、能够导致细胞分化的细胞簇。
可以使用公知的细胞培养方法来获得本发明的干细胞。例如，可以从人胚泡分离出人胚胎干细胞。典型的，人胚泡获自人体内植入前胚胎或获自体外受精(IVF)胚胎。可选择的，可以将单细胞的人胚胎扩展到胚泡阶段。为了分离人ES细胞，去掉胚泡上的透明带，并利用免疫外科手术方法分离内细胞团(inner cell mass，ICM)，其中将滋养外胚层细胞裂解，并用微量吸管将其从完整ICM中去除。然后将TCM平铺到含有能够使之长出生长晕的合适条件培养基的组织培养瓶中。9-15天之后，采用物理分离方法或酶降解的方法，将ICM衍生的生长晕分离成细胞团，然后再将细胞平铺到新鲜的组织培养基上。用微量吸管挑选出表现为未分化形态的克隆，采用物理方法将其分离为细胞团，然后再进行平板培养。将所得到的ES细胞每1-2周进行一次例行分离。要想获得更加详细的制备人ES细胞的方法，请参见下述文献，Thomson等，[美国专利号5,843,780；Science 282：1145，1998；Curr.Top.Dev.Biol.38：133，1998；Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：7844，1995]；Bongso等，[Hum Reprod 4：706，1989]；Gardner等，[Fertil.Steril.69：84，1998]。
可以理解，根据本发明的上述方面，还可以使用商品化干细胞。可以从NIH人胚胎干细胞登记处购买人ES细胞(http://escr.nih.gov)。商品化的胚胎干细胞系实例包括但不限于BG01、BG02、BG03、BG04、CY12、CY30、CY92、CY10、TE03和TE32。
本发明使用的干细胞还可以衍生自人胚胎生殖(EG)细胞。使用本领域技术人员公知的实验室技术，从来自人妊娠约8-11周胎儿的原生殖细胞制备人EG细胞。分离生殖嵴，将其切成小块，然后使用机械分裂方法将其分解为细胞。然后在含有合适条件培养基的组织培养瓶中使EG细胞生长。在培养上述细胞时，每天更换条件培养基，直到出现与EG细胞一致的细胞形态，一般要经过7-30天或1-4次传代。更加详细的制备人EG细胞的方法，参见下述文献，Shamblott等，[Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：13726，1998]，和美国专利号6,090,622。
正如上面所提到的，优选使用无饲养细胞体系培养干细胞，该无饲养细胞体系包括的是基质，而不是饲养细胞层。在此所使用的术语“基质”指的是能够代替饲养细胞实现细胞附着功能的任意基质。典型的，这样的基质包含可以使干细胞附着的细胞外成分，从而提供合适的培养基层(substrate)。
特别适用于本发明使用的是来自基底膜的细胞外基质成分，或形成粘着分子受体-配体偶联部分的细胞外基质成分。
Figure C20038010968800171
一种商品化的基质(Becton Dickinson，USA)，是适于本发明使用的一个实例。是来自Engelbreth-Holm-Swarm瘤细胞的一种可溶性产品，在室温下成为凝胶状，形成一种重构基底膜；
Figure C20038010968800173
还是一种生长因子减少的产品。适用于本发明的其它细胞外基质成分和成分混合物包括：层粘连蛋白、纤连蛋白、蛋白聚糖、触觉蛋白(eatactin)、硫酸乙酰肝素等，单独使用一种或联合使用几种。本发明优选的基质是来源于纤连蛋白的基质。
当需要完全不含动物成分的培养条件时，优选人来源的基质或使用重组技术人工合成的基质。例如，这样的基质包括人来源的纤连蛋白、重组纤连蛋白、人来源的层粘连蛋白、包皮成纤维细胞基质或人工合成的纤连蛋白基质。人来源的纤连蛋白可以是血浆纤连蛋白，或是细胞纤连蛋白，上述两种纤连蛋白均可以从Sigma，St，Louis，MO，USA购买。人来源的层粘连蛋白和包皮成纤维细胞基质也可以从上述公司购买。人工合成纤连蛋白基质同样也可以从上述公司购买。
基质蛋白的重组合成可以使用表达载体来进行。将编码基质蛋白(如人血浆纤连蛋白)的多核苷酸片段连接到市售的、适于转化哺乳动物细胞如HeLa细胞，并适于指导该酶在转化细胞中表达的表达载体上。可以理解，可以通过常规的重组技术修饰上述市售载体系统，以取代、复制或突变现有的启动子或增强子，和/或导入其它附加的多核苷酸序列，如编码额外选择标记的序列、或编码报告多肽的序列，等等。
合适的哺乳动物表达载体包括，但不限于，购自Invitrogen公司的pcDNA3、pcDNA3.1(+/-)、pZeoSV2(+-)、pSecTag2、pDisplay、pEF/myc/cyto、pCMV/myc/cyto、pCR3.1，购自Promega公司的pCI，购自Strategene公司的pBK-CMV，购自Clontech公司的pTRES，以及它们的衍生物。
根据本发明优选的实施方式，培养基包括细胞增殖所需的细胞因子和生长因子[如碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和白血病抑制因子(LIF)]，以及抑制干细胞分化的因子，如转化生长因子β1(TGFβ1)。
上述培养基可以是添加了血清、血清替代品和/或生长因子的人工合成组织培养基，如KoDMEM(Gibco-Invitrogen Corporationproducts，Grand Island，NY，USA)。
血清可以是任意来源的血清，包括胎牛血清、山羊血清或人血清。为了给人ES细胞培养提供一种不含动物成分的环境，优选使用人血清或血清替代品TM(Gibco-Invitrogen Corporation，Grand Island，NYUSA)。
血清替代品TM包括白蛋白或白蛋白替代品、氨基酸、维生素、铁传递蛋白或铁传递蛋白替代品、抗氧化剂、胰岛素或胰岛素替代品、胶原前体和微量元素(国际专利公开号：WO 98/30679，Price，P.J.等)。为了提供不含动物成分的培养条件，白蛋白或白蛋白替代品优选是人来源的，和/或是重组的蛋白。
培养基、血清、和血清替代品可以购自任意提供组织培养产品的供应商，包括Gibco-Invitrogen Corporation(Grand Island，NY USA)、Sigma(St.Louis MO，USA)和ATCC(Manassas，VA USA)。
本发明所使用的血清或血清替代品的浓度范围为1％-40％，更优选为5％-35％，最优选为10％-30％。
根据本发明的优选实施方式，血清替代品的浓度为15％(参见实施例部分的实施例1和4)。
本发明中的生长因子，在使用时可以是任意的组合，可以以任意的浓度提供给干细胞，只要适于ES细胞增殖同时又抑制ES细胞分化。
根据本发明，合适的生长因子包括，但不限于转化生长因子β1(TGFβ1)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和人重组白血病抑制因子(LIF)、睫状神经营养因子(CNTF)、重组人制癌蛋白M、白介素6(IL-6)Flt-3配体、干细胞因子(SCF)等。上述生长因子可以购自任意提供组织培养试剂的供应商，如Gibco Invitrogen CorporationProducts，USA；R&D Systems Inc.Minneapolis，MN，USA和ChemiconInternational Inc.，Temecula，CA，USA。
正如下面实施例部分中的实施例1所示，当在存在添加了20％血清替代品的培养基的条件下，在牛纤连蛋白上培养ES细胞时，TGFβ1和bFGF(TF)的生长因子组合，以及TGFβ1、LIF和bFGF(TTF)的生长因子组合均能够使人ES细胞分别至少维持53次和56次传代。
因此，根据本发明优选实施方式，当使用无饲养细胞体系培养ES细胞时，所添加的生长因子包括TGFβ1、bFGF和/或LIF。
在无饲养细胞的培养体系中，TGFβ1的浓度范围为0.06-0.24ng/ml，更优选为0.10-0.20ng/ml，最优选为0.12ng/ml；LIF的浓度范围为500-2000u/ml，更优选为750-1500u/ml，最优选为1000u/ml；bFGF的浓度范围为2-8ng/ml，更优选为3-6ng/ml，最优选为4ng/ml。
虽然优选程度低一些，但是可选择的，可以使用一种条件培养基代替添加血清或血清替代品的条件培养基，来培养hES细胞。
调控培养基是一种带有单层细胞培养物(即饲养细胞)的生长条件培养基，其中的单层细胞是在一定培养时间后出现的。条件培养基中包括生长因子和细胞因子，其是由培养物中的单层细胞分泌的。
可以从多种在培养物中形成单层的细胞中收集得到条件培养基。实例包括MEF条件培养基、包皮条件培养基、人胚胎成纤维细胞条件培养基、人法洛皮欧上皮细胞条件培养基等。
特别适用的条件培养基是来源于人细胞的条件培养基，如包皮条件培养基，其是在适于生成条件培养基的条件下，在生长条件培养基中培养人包皮细胞而获得的。
上述生长条件培养基可以是任意适于培养饲养细胞的条件培养基。在生长条件培养基中可以添加营养因子，如氨基酸(如L-谷氨酸)、抗氧化剂(如β-巯基乙醇)，和有利于干细胞在未分化状态下生长的生长因子。其它文献描述了加入有效浓度的血清和血清替代品的技术方案(美国专利申请号10/368,045)。
在生长条件培养基中将饲养细胞培养足够的时间，以富集足够量的分泌因子，以维持干细胞在未分化状态下的增殖。典型的，条件培养基是在37℃培养4-24小时来进行调控的。但是，可以通过评估条件培养基对干细胞生长和分化的影响，来确定培养时间。
根据最终需要得到的条件培养基的量和用途，来选择用于调控该条件培养基的培养仪器。大规模生产时优选使用专门的设备。FureyGenetic Eng，News(2000)，20：10中综述了连续性细胞培养系统。
在条件培养基中富集了足够的因子之后，将生长条件培养基(即条件培养基)与饲养细胞分离，并收集生长条件培养基。应当意识到，如果上述饲养细胞能够保持其条件培养基的能力，则上述饲养细胞还可以重复用于另外的培养阶段，用来调控其它批次的条件培养基。
优选的，在使用前先将条件培养基灭菌(如使用20μm的过滤器过滤)。本发明的条件培养基可以直接应用于干细胞，或进行萃取，将其中的作用因子进行浓缩，如使用盐滤过。在使用前，优选将条件培养基在-80℃冷冻贮存。
根据本发明的方法，在无饲养细胞的培养条件下培养干细胞，从而建立人胚胎干细胞系。
建立起来的人胚胎干细胞系的特征在于未分化的干细胞。根据本发明，未分化的干细胞系包含至少50％、至少60％、更优选至少70％、更加优选至少80％、最优选至少85％的未分化的干细胞。
如下面实施例部分中实施例1和4所述，未分化干细胞具有独特的形态，本领域技术人员能够很容易地将其与胚胎或成体来源的分化细胞区分开来。典型的，未分化干细胞具有很高的核/质比，明显的核仁，和紧密的、不容易辨认细胞接合处的细胞集落。在下文中将进一步描述未分化干细胞所具有的其它特征。
当根据本发明的教导培养干细胞时，需要监测干细胞的生长情况，以确定干细胞的分化状态。可以采用几种方法，包括如形态学检测，来确定按本发明所述培养的细胞的细胞分化情况。
根据本发明的优选实施方式，培养条件为干细胞提供了一种完全无异源、无饲养细胞的环境，能够使干细胞无限维持增殖和未分化的状态。因此上述培养条件包括人来源(或重组)的基质和添加了TGFβ1、LIF和bFGF生长因子的培养基。
正如实施例部分的实施例4和5所示，本发明人阐明了可以在人来源的、添加人血清或血清替代品的纤连蛋白基质上，培养ES细胞，从而产生出具有多能性、而且不含动物病原体或任何其它污染物的干细胞培养物。根据本发明的教导在上述条件下生产出的ES细胞系，能够维持其增殖和未分化状态至少38次传代。
在培养步骤中，进一步监测干细胞的分化状态。可以通过检测已知的、指示是否分化的细胞或组织特异性标记，来确定细胞是否发生了分化。例如灵长目动物ES细胞可以表达阶段特异性胚胎抗原(SSEA)4、肿瘤排异抗原(TRA)-1-60和TRA-1-81。
正如实施例部分的实施例2和4所示，在添加了无异源培养基和选定的生长因子的上述无饲养细胞的培养条件下，生长出的ES细胞表达了SSEA4、TRA-1-60和TRA-1-81细胞表面标记物，这些标记物是未分化细胞中常见的。
可以使用本领域公知的免疫技术来检测组织/细胞特异性标记物[Thomson JA等，(1998)，Science 282：1145-7]。实例包括但不限于，对于与膜结合的标记物采用的流式细胞术、对于细胞外和细胞内标记物采用的免疫组织化学的方法、对于分泌的分子标记物则采用酶联免疫分析的方法。
确定ES细胞的分化还可以通过测定碱性磷酸酶的活性来实现。用4％的低聚甲醛将细胞固定，使用Vector Red substrate试剂盒按照制造商的说明(Vector Laboratories，Burlingame，Califomia，U SA)进行显色未检测未分化人ES细胞的碱性磷酸酶活性。
如上所述，本发明的干细胞系能够维持其多能性至少38次传代。上述多能性可以通过胚胎样小体(EBs)的形成进行体外监测，以及通过畸胎瘤的形成，来进行体内监测。
从饲养层或无饲养细胞的培养体系中取出ES细胞后，形成胚胎样小体。取出ES细胞的过程可以通过用IV型胶原蛋白酶处理有限的时间来实现。从培养表面分离下来后，将细胞转移到包含添加了血清和氨基酸的培养基的组织培养板上。正如实施例部分的实施例3和5所示，在悬浮培养14天后，根据本发明教导生产出来的ES细胞分化成包含胚胎中胚层、外胚层和内胚层细胞的EBs，因此清楚地表明本发明的ES细胞系在本发明所使用的无饲养细胞的培养条件下保持了其多能性。
通过测定Oct-4表达水平的降低和其它标记物，如α-甲胎蛋白、NF-68kDa、α-carhiac和白蛋白表达水平的升高，可以监测EB细胞的分化水平。用于监测特定基因表达水平的方法是本领域公知的，包括RT-PCR、RNA原位杂交、Western bolt分析和免疫组织化学。
也可以采用将细胞注射入SCID小鼠的方法，验证ES细胞系的多能性[Evans MJ和Kaufman M(1993).Pluripotential cells growndirectly from normal mouse embryos.Cancer Surv.2：185-208]，其中上述鼠在注射入ES干细胞后，形成畸胎瘤。使用4％的低聚甲醛固定畸胎瘤，对其三个胚层(即内胚层、中胚层和外胚层)进行组织学检测。
正如实施例部分的实施例3所示，在添加了本发明所选择的生长因子组合(即TF和TLF组合)的、基于纤连蛋白的无饲养细胞培养体系中培养的ES细胞，形成了功能性畸胎瘤，这表明ES细胞具有能够在体内进行分化的多能性。
另外除了监测分化状态以外，还经常要对干细胞的核型进行监测，目的是为了验证细胞学整倍性(cytological euploidity)，其中所有的染色体都存在，并且在培养期间没有发生可检测的改变。可以采用标准的吉姆萨(Giemsa)染色方法来检测所培养的干细胞的核型，并将染色结果与所公开的相应物种的核型进行对比。
根据本发明方法所培养的干细胞，在分别添加了TF或TLF组合生长因子的纤连蛋白基质上生长传代30次和32次之后，仍然保持了其正常的核型(参见实施例部分的实施例2)。
根据本发明方法生产的ES细胞培养物，具有多能性并且能够维持其可增殖和未分化的状态至少38次传代，这使得上述ES细胞培养物能够极好地用于单细胞克隆。
因此，上述方法还可以进一步包括另外一个步骤，即培养来自上述在本发明培养条件下培养的人胚胎干细胞系的单个细胞，从而建立衍生自单个细胞的ES培养物，其中上述培养条件优选不含异源和饲养细胞。
单细胞克隆的方法在本领域是公知的(如参见美国专利号6,548,655，Amit等，2000，Dev.Biol.227：271-8)。典型的，上述方法包括从细胞培养物中挑选细胞群，将细胞群分离成单细胞，然后在促进细胞增殖、同时抑制细胞分化的条件下，将单细胞进行独立培养。一旦成功，单细胞克隆可以在合适的培养条件下扩展为ES细胞系。
因为本发明的ES细胞系是不含异源和饲养污染物的，因此能够用于人类细胞治疗和组织再生。
因此，根据本发明的另外一个方面，提供了一种治疗需要细胞置换和/或组织再生的个体的方法，该方法包含给所述个体施用不含异源和饲养污染物的hES干细胞产品。
优选的，上述方法进一步包含使用上文所述方法制备hES细胞产品的步骤。
在此所使用“治疗需要细胞置换和/或组织再生的个体”指的是治疗患有需要细胞置换和组织再生的疾病的个体，所述疾病如神经系统疾病、肌性疾病、心血管疾病、血液性疾病、皮肤疾病、肝病等。
短语“治疗”指的是在患有或诊断患有疾病、病症或疾病状态的个体中，抑制或阻止个体所患疾病、病症或疾病状态的发展，和/或使个体所患疾病、病症或疾病状态减轻、缓解或减退。本领域技术人员应当了解用于评估疾病、病症或疾病状态发展的各种方法和分析手段，类似的，也应当了解用于评估疾病、病症或疾病状态减轻、缓解或减退的各种方法和分析手段。
在此所使用的“施用”指的是通过任意合适的途径为个体提供人ES细胞产品的方法，如口服、舌下、静脉内、皮下、经皮、肌内、皮内、鞘内、腹膜内、脾内、肝内、胰腺内、心脏内、硬膜外、眼内、颅内、吸入、直肠、阴道内等施用途径。
本文所生产的干细胞可以直接施用(即未分化产品)，或者是在部分或完全分化后施用。所培养的人ES细胞可以分化为限制的发育谱系细胞，或终末分化细胞。可以使未分化的人ES细胞在形成胚样小体的悬浮培养液中过度生成，来启动干细胞的分化，或者将ES细胞在促使其以特定方式分化的条件下进行平板培养，也能启动干细胞分化。这样的条件包括向条件培养基中去掉或加入营养物质、生长因子或细胞因子，改变氧压，或改变培养表面的基层。
在治疗各种疾病时，未分化干细胞或分化干细胞均可以使用。例如少突神经胶质细胞谱系的部分分化ES细胞可以用于治疗髓鞘质疾病(Repair of myelin disease：Strategies and progress in animal models.Molecular Medicine Today.1997.554-561页)，软骨细胞谱系或间充质细胞谱系的部分分化ES细胞可以用于治疗骨和软骨缺陷(美国专利号4,642,120)，上皮谱系的部分分化ES细胞可以用于创伤或烧伤的皮肤再生(美国专利号5,716,411)。
除了用于细胞置换治疗，本发明的ES细胞系还可以被用于制备相对不含饲养细胞cDNA污染物的cDNA文库。使用标准技术从ES细胞中制备mRNA，逆转录形成cDNA。使用本领域已知技术，从上述cDNA制品去除来自胚胎成纤维细胞的核苷酸和其它具有不理想的特异性的细胞的核苷酸，从而产生去除的cDNA文库。
本发明的ES细胞系可以用于筛选能够影响干细胞特性的要素(如小分子药物、肽、多核苷酸等)或条件(如培养条件或操作方法)。例如，可以将影响生长的物质、毒素或潜在的分化因子加入到培养质中进行检测。
通过下面的实施例，本领域普通技术人员将更加了解本发明的其它方面、优点和新颖的特征，但实施例不是对本发明的限制。另外，上文所描述的本发明各种不同的实施方式和方面，以及在权利要求书部分所要求保护的技术方案均能在下面的实施例中找到试验上的支持。
实施例
现在参考下面的实施例，其与前面的描述一起，以非限制性的方式解释了本发明。
通常本发明所使用的术语和本发明所采用的实验方法包括分子的、生物化学、微生物学和重组DNA技术。上述技术详细记载在相关文献中。参见，如“Molecular Cloning：A laboratory Manual”Sambrook等，(1989)；“Current Protocols in Molecular Biology”I-III卷，Ausubel，R.M.，ed.(1994)；Ausubel等，“Current Protocols inMolecular Biology”，John Wiley和Sons、Baltimore、Maryland(1989)；Perbal，“A Practical Guide to Molecular Cloning”，John Wiley &Sons，New York(1988)；Watson等，“Recombinant DNA”，ScientificAmerican Books，New York；Birren等(eds)“Genome Analysis：ALaboratory Manual Series”，1-4卷，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，New York(1998)；记载在美国专利号4666828、4683202、4801531、5192659和5272057中的方法；“Cell Biology：A LaboratoryHandbook”，I-III卷，Cellis，J.E.，ed.(1994)；“Culture of AnimalCells-A Manual of Basic Technique”，Freshney，Wiley-Liss，N.Y.(1994)，第三版；“Current Protocols in Immunology”I-III卷，ColiganJ.E.，ed.(1994)；Stites等(eds)，“Basic and Clinical Immunology”(第8版)，Appleton & Lange，Norwalk，CT(1994)；Mishell和Shiigi(eds)，“Selected Methods in Cellular Immunology”，W.H.Freeman和Co.，New York(1980)；下列专利和科技文献详细记载了免疫分析方法，参见如，美国专利号3791932、3839153、3850752、3850578、3853987、3867517、3879262、3901654、3935074、3984533、3996345、4034074、4098876、4879219、5011771和5281521；“Oligonucleotide Synthesis”Gait，M.J.，ed。(1984)；“Nucleic Acid Hybridization”Hames，B.D.，和Higgins S.J.，eds(1985)；“Transcription and Translation”Hames，B.D.，和Higgins S.J.，eds.(1984)；“Animal Cell Culture”Freshney，R.I.，ed.(1986)；“Immobilized Cells and Enzymes”IRL Press，(1986)；“A Practical Guide to Molecular Cloning”Perbal，B.，(1984)和“Methods in Enzymology”Vol.1-317，Academic Press；“PCRProtocols：A Guide To Methods And Application”，Academic Press，SanDiego，CA(1990)；Marshak等，“Strategies for Protein Purification andCharacterization-A Laboratory Course Manual”CSHL Press(1996)；“Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells：A PracticalApproach”Robertson EJ，ed.(1987)Oxford：IRL Press；“Manipulatingthe Mouse Embryo”Nagy A等，(2003)Cold Spring Harbor LabPress，第三版；Thomson，J.A.，Marshall，V.S.(1998)Primate embryonicstem cells.Current Topics in Developmental Biology 38，133-165；Marshall，V.S.，Waknitz，M.A.，Thomson，J.A.(2001)Isolation andmaintenance of primate embryonic stem cells.Methods in MolecularBiology 158，11-18，上述所有文献在此以引用的方式包括在本文中，如同在本文中完整地叙述了一样。另外在本文中还提供了一些其它一般性的参考文献。相信上述文献中的操作过程是本领域公知的，列出上述文献是为了方便读者阅读。其中所包含的所有信息在此全部以引用的方式包括在本文中。
实施例1
添加无异源条件培养基的无饲养细胞培养体系适于ES细胞系的生长
将人ES细胞转移到基于纤连蛋白的培养体系中，其中培养体系中存在血清替代品和所选择的生长因子，其为ES细胞培养提供了一种无饲养细胞而且成分非常明确的环境。
材料和试验方法
ES细胞培养-将人ES细胞系I-6、I-3[Amit，M.& Itskovitz-Eldor，J.Derivation and spontaneous differentiation of human embryonic stemcells，J Anat.200，225-232(2002)]和H-9[Thomson，J.A.，等，Embryonicstem cell lines derived from human blastocysts.Science 282，1145-7(1998)]用小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)分别培养46、39和25次传代，其中培养基的组成为85％的Ko-DMEM，添加15％的血清替代品(SR)、2mM的L-谷氨酰胺、0.1mM的巯基乙醇、1％的非必需氨基酸储备液和4ng/ml的bFGF(上述各成分均购自Gibco Incitrogencorporation products，USA)。然后将ES细胞转移到覆有牛来源纤连蛋白的平板上(50μg/10cm2，Biological Industries，Beth Haemek，Israel)，含有20％的SR、80％的培养基和下列生长因子组合中的一种：“T”-0.12ng/ml的TGFβ1(R&D Systems Inc.Minneapolis，MN，USA)、“TF”-0.12ng/ml的TGFβ1和4ng/ml的bFGF(Gibco Invitrogen公司的产品，USA)、“LF”-1000u/ml的白血病抑制因子(LIF，购自CHEMICON International，Inc.，Temecula，CA，USA)和4ng/ml的bFGF；或“TLF”-0.12ng/ml的TGFβ1、1000u/ml的LIF和4ng/ml的bFGF。每4到6天用1mg/ml的IV型胶原蛋白酶(Gibco Invitrogen公司的产品，USA)处理30分钟，将附着的细胞分离下来，然后将上述细胞重新铺板到含有新鲜条件培养基的瓶中。按照冷冻方案，是将细胞在液氮中冷冻，所使用的冷冻溶液的组成为：10％的DMSO(购自Sigma，St Louis，MO，USA)、10％的人血清(购自CHEMICONInternational，Inc.，Temecula，CA，USA)或15％的SR、和80％的Ko-DMEM(Gibco-Invitrogen公司的产品，USA)。
形态学评估-在倒置显微镜下(活细胞)使用相差(Olympus，IX70，Japan)对ES细胞进行检测。
试验结果
无饲养细胞的培养体系中hES细胞的增殖能力-将I-3、I-6和H-9ES细胞系的ES细胞转移到包被有纤连蛋白的平板上，培养基中含有血清替代品，并添加了上文“方法”中所述的经选择的生长因子。当培养基中只添加bFGF或添加LIF与bFGF(LF)时，细胞连续增殖几代，然后开始分化。另外，当ES培养基中只添加TGFβ1时，虽然ES细胞保持在未分化阶段的时间超过了10次传代，但其增殖情况很差，到第15次传代时，已经缓慢消失。另一方面，当ES培养基中添加TGFβ1和bFGF(TF)或添加TGFβ1、LIF和bFGF(TLF)时，所培养的细胞持续增殖，并保持正常的hES细胞的特性，类似于在MEF上生长的hES细胞。然而，用TF组合培养的细胞，每次传代时分裂为一个板，而用TLF组合培养的细胞，分裂为2-3个板，这与用MEF培养ES细胞的情形类似，这表明在存在TLF组合的情况下增殖速度较快。因此，添加TLF生长因子组合的无饲养细胞的培养体系能够维持hES细胞的正常生长，其倍增时间至少为25个小时，这与在MEF上生长的ES细胞类似。
无饲养细胞培养体系中的ES集落和细胞的形态学特征-在无饲养细胞培养体系中生长的ES集落的形态学特征与在MEF上生长的ES集落的形态学特征没有明显的区别，即使是在添加TLF生长因子组合的培养基中培养超过56次传代(224天以上)和在添加TF生长因子组合的培养基中培养超过53次传代(212天以上)之后(结果未示出)。另外，在本发明无饲养细胞体系中的纤连蛋白上传代后的第四天，hES细胞培养物仍然含有85-90％的未分化细胞，而且其倍增时间为30-35小时，这与在MEF上生长的hES细胞的倍增时间相一致。
在更高放大倍数下观察，发现在无饲养细胞培养体系下生长的hES细胞小而圆，具有较高的核/质比，可以明显看到含有1到3个核仁，细胞之间的间隔也是很典型的(附图1a-d)。
在无饲养细胞的培养体系下生长的ES细胞的生存率相似于在MEF上生长的ES细胞的生存率-在ES贮存方面，在存在15％的SR和10％的DMSO的条件下，将在无饲养细胞培养体系下生长的ES细胞进行冷冻贮存。当将冷冻的ES细胞进行融化并重新铺板时，它们所表现出的生存率相似于在MEF上生长的ES细胞。
因此，上述结果表明TF和TLF生长因子组合适用于hES培养，其中的TF组合次于TLF组合，因为其增殖能力较低。此外，在无饲养细胞培养体系下生长的ES细胞所表现出的形态学特征和生存率与在MEF上生长的ES细胞相似。
实施例2
添加无异源条件培养基的无饲养细胞培养体系能够维持具有一致表型的ES细胞的生长。
使用代表未分化细胞的细胞表面标记物，来评估在添加无异源条件培养基的无饲养细胞培养体系下生长的hES细胞的表型特征。
材料和试验方法
核型分析-用秋水仙酰胺(KaryoMax秋水仙酰胺溶液，购自Invitrogen，Grand island，NY，USA)阻遏细胞中期的ES细胞，然后根据标准方法用低渗溶液将核膜裂解(International System forHuman Cytogenetic Nomenclature，ISCN)。根据制造商的说明书形成染色体的G带(Giemsa(吉姆萨)，购自Merck公司)。对于每个样品，至少分析20个细胞的核型，并根据ISCN进行报告。
免疫组织化学-用4％的低聚甲醛将细胞固定20分钟，在含有2％正常山羊血清的PBS溶液中封闭15分钟(Biological Industries，BethHaemek，Israel)，并在4℃以1∶50的稀释比例与SSEA1、SSEA3、SSEA4(Hybridoma bank，Iowa，USA)、TRA-60、TRA-81小鼠抗-人抗体一起温育过夜，上述抗体由英国Sheffield大学的Prof.P Andrews提供。然后将细胞用PBS冲洗，之后以1∶100的稀释比例与缀合有荧光染料Cys 3(Chemicon International，Temecula CA，USA)的驴抗-小鼠IgG抗体一起温育。在倒置荧光显微镜(CARL Zeiss，Germany)或共焦显微镜(Bio-Rad laboratories，Hertfordshire，England)下观察上述细胞。
试验结果
基于纤连蛋白的、添加无异源培养基的无饲养细胞培养体系下培养的ES细胞，其核型与其它基于饲养细胞的方案所培养的ES细胞是一致的-在基于纤连蛋白、添加无异源培养基的无饲养细胞培养体系中连续培养之后，对hES细胞进行核型分析。对在无饲养细胞培养体系下培养的9种不同的、分别代表上述两种条件培养基条件即TF和TLF的培养物，以及三个处于不同阶段(6到32次传代)的hES细胞系(I-3、I-6和H-9)进行了核型分析。该分析结果显示在140个检测细胞中有136个细胞具有正常的核型，其中在TF条件培养基条件下上述所检测的细胞是传代30次的细胞，在TLF条件培养基条件下所检测的细胞是传代32次的细胞。在同一组的四个细胞中发现了不正常核型47，XXX。这四个细胞，培养了几乎有1年的时间，处于第70次传代，其中在其衍生之后的20次传代是在添加了TLF的无饲养细胞培养体系下进行的。正如先前所报道的[Amit.M.等，Clonally derived humanembryonic stem cell lines maintain pluripotency and proliferativepotential for prolonged periods of culture.Dev Biol 227：271-8(2000)]，ES细胞在MEF上培养8个月后，有可能发生染色体不稳定的情况。考虑到这一点，上述结果表明本发明的无饲养细胞培养体系能够使hES细胞维持正常和稳定的核型。
在添加无异源条件培养基的无饲养细胞培养体系下培养的人ES细胞，表达了胚胎表面标记物-为了进一步说明基于纤连蛋白的无饲养细胞培养体系能够维持人ES细胞正常生长的能力，对人ES细胞进行了IHC分析，期间使用了胚胎表面标记物抗体，包括TRA-1-60、SSEA4、TRA-1-81、SSEA3和SSEA1。在分别添加了TF和TLF生长因子的培养条件下，在分别进行17次和38次传代后，人I-3、I-6ES细胞表达了高水平的阶段特异性胚胎抗原4(SSEA4)、肿瘤排异抗原(TRA)-1-60和TRA-1-81(附图1e-h)。上述标记物是未分化ES细胞的典型特征[Thomson JA等，(1998)，Embryonic stem cell linesderived from human blastocysts.Science 281：1145-7；Thomson JA等，(1996)，Pluripotent cell lines derived from common marmoset(Callithrix jacchus)blastocysts.Biol Reprod 55：254-9；Thomson JA等，(1995)，Isolation of a primate embryonic stem cell line.Proc NatlAcad Sci USA 92：7844-8]。需要注意的是，阶段特异性胚胎抗原3(SSEA3)的表达仅仅是中等程度的，另外没有检测到阶段特异性胚胎抗原1(SSEA1)的表达，SSEA1是小鼠ES细胞特有的一种标记物(结果未示出)。
上述结果表明添加TF或TIF生长因子的无饲养细胞培养体系能够使人ES细胞维持其未分化的状态，甚至于是在很长的培养阶段之后。
实施例3
添加无异源条件培养基的无饲养细胞培养体系能够维持功能化ES细胞的生长
对在添加了血清替代品和无异源生长因子的基于纤连蛋白的无饲养细胞培养体系下生长的人ES细胞，检测其在体外形成胚样小体和在体内形成畸胎瘤的能力。
材料和试验方法
由人ES细胞形成胚样小体(EBs)-在无饲养细胞体系上生长的人ES细胞，使用IV型胶原蛋白酶(1mg/ml)将其从6孔培养板(40-60cm2)上分离下来，并用1000μl的Gilson吸管尖部将其进一步分散成为小片(clamps)。之后，将分散后的细胞在58m面Petri培养皿(Greiner，Germany)上培养，培养基的组成为：80％的Ko-DMEM，添加20％的肽牛血清(FBSd，HyClone，Utah，USA)、1mM的L-谷氨酰胺、0.1mM的β-巯基乙醇、和1％的非必需氨基酸储备液。除非另有说明，否则所有的上述试剂均购自美国Gibco Invitrogen公司。悬浮培养14天后，检测所形成的EBs。
畸胎瘤的形成-将在6孔板(60cm2)的6个孔中培养的ES细胞混合，注射入4周龄雄性SCID-beige鼠(Harlan，Jerusalem Israel)的后腿肌肉中。在注射至少12周后，用甲醛固定所形成的畸胎瘤，并进行组织学检测。
反转录酶偶联的PCR(RT-PCR)-使用Tri-Reagent试剂盒(Sigma-Aldrich Corp.，St Louis，MO，USA)，根据制造商的说明，提取在无饲养细胞培养体系下生长传代17-25次的未分化人ES细胞的总RNA，或在无饲养细胞条件下生长的ES细胞形成的14天大EBs的总RNA。使用MMLV RT-Rnase H-minus(Promega Corp.，Madison，WI，USA)，根据制造商的说明，以1μg的总RNA为模板合成cDNA。所使用的PCR引物和反应条件列于下面的表1中。所有的PCR反应过程均包括起始的链变性步骤，条件是94℃，变性5分钟。使用2％的琼脂糖凝胶电泳将PCR产物进行大小分级。
表1：PCR引物和反应条件
  基因产物(登记号) SEQ ID NOs. 正向(F)和反向(R)引物(5′→3′) 反应条件   大小(bp)
Oct-4(S81255)   SEQ ID VO：1SEQ ID NO：2   F：GAGAACAATGAGAACCTTCAGGAR：TTCTGGCGCCGGTTACAGAACCA   30个循环，退火温度60℃，1.5mM的MgCl<sub>2</sub> 219
  白蛋白(AF542069)   SEQ ID NO：3SEQ ID NO：4   F：TGCTTGAATGTGCTGATGACAGGGR：AAGGCAAGTCAGCAGCCATCTCAT   35个循环，退火温度60℃，1.5mM的MgCl<sub>2</sub>   302
  a-甲胎蛋白(BC027881)   SEQ ID NO：5SEQ ID NO：6   F：GCTGGATTGTCTGCAGGATGGGGAAR：TCCCCTGAAGAAAATTGGTTAAAAT   30个循环，退火温度60℃，1.5mM的MgCl<sub>2</sub> 216
  NF-68KD(AY156690)   SEQ ID NO：7SEQ ID NO：8   F：GAGTGAAATGGCACGATACCTAR：TTTCCTCTCCTTCTTCACCTTC   30个循环，退火温度60℃，2mM的MgCl<sub>2</sub>   473
  a-心肌肌动蛋白(NM_005159) SEQ ID NO：9SEQ ID NO：10 F：GGAGTTATGGTGGGTATGGGTCR：AGTGGTGACAAAGGAGTAGCCA 35个循环，退火温度65℃，2mM的MgCl<sub>2</sub> 486
  LIF-受体(NM_002310)   SEQ ID NO：11SEQ ID NO：12   F：CAAAAGAGTGTCTGTGAGR：CCATGTATTTACATTGGC   35个循环，退火温度61℃，1.5mM的MgCl<sub>2</sub>   459
  b-肌动蛋白(NM_001101)   SEQ ID NO：13SEQ ID NO：14   F：ATCTGGCACCACACCTTCTACAATGAGCTGCGR：CGTCATACTCCTGCTTGCTGATCCACATCTGC   35个循环，退火温度62℃，1.5mM的MgCl<sub>2</sub>   838
试验结果
ES细胞在从无饲养细胞培养体系中分离下来后，在体外自主分化为胚原基层(germlayer)细胞类型-为了验证在基于纤连蛋白的无饲养细胞培养体系下培养的人ES细胞与基于饲养细胞的饲养方案培养的人ES细胞在功能上和表型上是一致的，将在含有TLF的无饲养细胞培养体系下生长传代22-30次的ES细胞，和在含有TF的体系下生长传代28次的ES细胞分离下来，进行悬浮培养。结果是，hES细胞所形成的胚样小体(EBs)与在MEFs上生长的ES细胞所形成的胚样小体很相似(附图2a-c)。利用IHC方法，使用不同的胚胎细胞标记物进一步检测分离的EBs的功能。正如附图2d-f所显示的，Ebs表达起源于外胚层的中性特异性(neutral specific)微管蛋白，平滑肌肌动蛋白以及起源于中胚层CD-31标记物。
使用RT-PCR进一步验证EBs中的与ES一致性的基因表达。在EBs中，干细胞分化为三个胚胎原基层的代表性细胞，三个胚胎原基层即中胚层、内胚层和外胚层。正如附图3所显示的，在无饲养细胞、添加了TLF或TF的培养体系下生长的未分化细胞表达了高水平的Oct4(附图3)，其中Oct 4是多能性胚胎干细胞和多能性胚胎生殖细胞的标记物[Pesce M，和Scholer HR.Oct-4：gatekeeper in the beginnings ofmammalian development(2001).Stem Cells 19：271-8]，而获自14天EBs的细胞表达与细胞分化相关的基因，包括与胚胎外胚层有关的神经丝(NF-68kD)、与胚胎中胚层有关的α-心肌肌动蛋白、和代表胚胎内胚层的α-甲胎蛋白和白蛋白。在EBs样品中Oct-4表达量降低，这与先前的报道，即当全能性细胞分化为体细胞谱系后，Oct-4的表达量降低相一致([Thomaon JA等，(1998).Embryonic stem cell linesderived from human blastocysts.Science 282：1145-7，Reuinoff BE等，(2000).Embryonic stem cell lines from human blastocysts：somaticdifferentiation in vitro.Nat.Biotechnol.18：399-404]。根据先前其它文献的报道[Schuldiner M等，Effect of eight-growth factors on thedifferentiation of cell derived from human ES cells.Proc Natl Acad SciUSA 97：11307-12(2000)；Amit M等，Human feeder layers for humanembryonic stem cells.Biol.Reprod.68：2150-2156(2003)；Kehat I等，Human embryonic stem cells can differentiate into myocytes withstructural and functional properties of cardiomyocytes，J Clin Invest108：407-14(2001)]，ES细胞培养物可能存在一定程度的背景分化。事实上，本发明的未分化ES细胞也表达了一些细胞特异性基因，如白蛋白和α-心肌肌动蛋白(附图3)。
因此，上述结果表明，在本发明的无饲养细胞培养体系下生长的人ES细胞能够形成功能性的EBs，其中EBs中的细胞已经是分化为各种体细胞谱系的细胞。
在无饲养细胞培养体系下培养的人ES细胞在体内分化为胚胎原基层-为了进一步证实本发明的无饲养细胞培养体系支持人ES细胞分化为胚胎原基层的能力，进一步检测了ES细胞在体内形成畸胎瘤的能力。在存在TLF的条件下分别传代26次和19次的I-3和I-6细胞，在注射入SCID Beige小鼠后，能够形成畸胎瘤。每个畸胎瘤均包含代表三个胚胎原基层的组织，包括起源于外胚层的有髓神经(附图4a)、源于中胚层的透明软骨细节(附图4b)和与中胚层相关的富含杯形细胞的分泌性上皮(附图4c)。
综上所述，在本发明无饲养细胞培养体系下生长的人ES细胞在功能上与在基于饲养的培养体系下生长的细胞没有差别。分化之后，ES细胞在体外表达了与所有三个胚胎原基层相关的基因，在体内形成了畸胎瘤，其中所形成的畸胎瘤包括了来自所有三个胚层的组织。不同于其它无饲养细胞的方案，本发明的培养体系包含一种成分明确、无异源并适于人ES细胞繁殖的培养基。
实施例4
完全无异源的无饲养细胞培养体系适于表型一致的人ES细胞的生长
因为无动物成分的环境对于将来人ES细胞的任何临床应用来说都是至关重要的，因此本发明提供了一种完全无异源、无饲养细胞的培养体系，该体系使用了人来源的纤连蛋白作为培养hES细胞的基质，并添加了无异源的条件培养基和生长因子。
试验结果
无异源、无饲养细胞的培养体系能够维持人ES细胞的生长-为了给hES细胞的培养提供一个完全无动物成分且成分明确的环境，在无饲养细胞培养体系中使用了人来源的纤连蛋白。按照上述实施例1材料与试验方法部分所描述的，所采用的培养基包括血清替代品(15％)，并添加了T、LF、TF和TLF的生长因子组合。发现人血浆纤连蛋白(即来自人血浆的纤连蛋白，购自Sigma，ST.Louis，MO，USA)和细胞纤连蛋白(即来自人包皮成纤维细胞的纤连蛋白，购自Sigma，St.Louis，MO，USA)在存在TF和TLF生长因子组合的条件下，能维持hES细胞在未分化状态下生长传代至少38次(约110倍增)。另外，在本发明无饲养细胞体系中的纤连蛋白上，传代后的第四天，hES细胞培养物仍然含有85-90％的未分化细胞，而且其倍增时间为30-35小时，这与在MEF上生长的hES细胞的倍增时间相一致，这表明上述无异源培养体系能够使hES细胞正常地生长繁殖。
上述结果表明添加无异源培养体系的人来源的纤连蛋白能够维持长寿命、多能性和未分化人ES细胞培养物的生长。
在无异源、无饲养细胞培养体系下生长的人ES细胞所具有的表型与在牛来源的纤连蛋白无饲养细胞培养体系下生长的ES细胞没有差别-在添加了血清替代品和TF生长因子的人细胞纤连蛋白培养体系下生长传代22次的细胞仍然保持了未分化细胞的形态。ES细胞小而圆，具有较高的核/质比，可以明显看到含有1到3个核仁，细胞之间的间隔也是很典型的(附图5a-c)。
另外，发现在无异源、无饲养细胞培养体系下生长的人ES细胞在传代32次后，仍然具有正常的核型(结果未示出)。
此外，正如进一步的HIC试验所显示的，在完全无异源、无饲养细胞体系下培养的传代16次的人ES细胞表达了所有特征性胚胎表面标记物，包括TRA-1-60、SSEA4、TRA-1-81(附图5d-f)。
因此，上述结果表明本发明的完全无异源、无饲养细胞的培养体系能够维持人ES细胞的表型一致性，所培养出的人ES细胞具有高度可增殖的特性，具有正常稳定的核型，并能够表达所有典型性胚胎表面标记物。
因此上述结果提示本发明的无异源、无饲养细胞的培养体系能够用于衍生和培养人ES细胞。
实施例5
在完全无异源、无饲养细胞培养体系下生长的人ES细胞在功能上与在其它培养体系下生长的ES细胞没有明显的差别
在添加了血清替代品和无异源生长因子的基于人纤连蛋白的无饲养细胞培养体系下生长的人ES细胞，检测了其在体外形成胚样小体的能力。
ES细胞在从无饲养细胞培养体系中分离出来后，在体外自主分化为胚原基层细胞类型-为了验证在无异源、无饲养细胞培养体系下培养的人ES细胞与基于饲养的方案所培养的人ES细胞在功能上和表型上是一致的，从无饲养细胞的培养物中分离ES细胞，其中培养物是分别在人细胞纤连蛋白和血浆纤连蛋白基质上生长传代17次和16次的培养物。结果是，hES细胞所形成的胚样小体(EBs)与在MEFs上生长的ES细胞所形成的胚样小体相似(附图6a-c)。
使用RT-PCR进一步验证EBs中的ES一致性的基因表达。在EBs中，干细胞分化为典型的三个胚胎原基层的细胞，三个胚胎原基层即中胚层、内胚层和外胚层。正如附图7所显示的，在无异源、无饲养细胞、添加了TLF或TF的培养体系下生长的未分化细胞表达了高水平的Oct 4和LIF受体(附图7)，而获自14天大的EBs的细胞表达与细胞分化相关的基因，包括与胚胎外胚层相关的神经丝(NF-68kD)、与胚胎中胚层相关的α-心肌肌动蛋白、和代表胚胎内胚层的α-甲胎蛋白和白蛋白。
因此，上述结果表明在本发明完全无异源、无饲养细胞的培养体系下生长的人ES细胞能够形成功能性的EBs，其中EBs中的细胞已经分化为各种体细胞谱系。
实施例6
无饲养细胞培养体系支持正常的生长速度和高比例的未分化人胚胎干细胞
为了进一步描述无饲养细胞培养体系繁殖人胚胎干细胞的能力，对在不同培养条件下培养的hES细胞的生长速度和未分化干细胞所占的比例进行了检测。
无饲养细胞培养体系能够使人ES细胞维持正常的生长速度，而且其中的未分化人ES细胞的比例很高，这与其它基于饲养的培养体系类似-为了检测本发明的无饲养细胞培养体系维持hES生长的能力，检测了在无饲养细胞培养体系下的干细胞的生长速度和其中未分化干细胞所占的比例。正如附图8a-c所显示的，当在存在TLF生长因子组合的情况下，在牛来源的纤连蛋白基质上培养hES细胞时，I-3(附图8a，粉色曲线)、I-6(附图8b，粉色曲线)和H-9(附图8c，粉色曲线)hES细胞系的生长速度类似与在MEFs上培养的hES细胞。此外，当在仅存在TF生长因子组合的情况下，在来源于人的纤连蛋白基质上培养hES细胞时，I-3(附图8a，亮蓝色曲线)、I-6(附图8b，亮蓝色曲线)和H-9(附图8c，亮蓝色曲线)hES细胞系的生长速度类似于在MEFs上培养的hES细胞。然而，当在存在TF生长因子组合的情况下，在牛来源的纤连蛋白基质上培养上述细胞时，I-3(附图8a，黑色曲线)、I-6(附图8b，黑色曲线)和H-9(附图8c，黑色曲线)hES细胞系的生长速度则低于在MEFs上培养的hES细胞系。因此，添加TLF生长因子组合的牛纤连蛋白基质和仅添加TF生长因子组合的人纤连蛋白基质能够使所培养的hES细胞维持较高的正常生长速度，与在MEFs上培养的情形类似。
本发明无饲养细胞培养体系所培养的人ES细胞，其中未分化细胞所占的比例维持较高水平-为了进一步描述本发明的无饲养细胞体系繁殖未分化hES细胞系的能力，分别测定了在培养4天、6天和10天时，未分化细胞所占的比例。正如附图8d所显示的，在存在TF或TLF生长因子组合的情况下，无论是在人来源的纤连蛋白基质上，还是在牛来源的纤连蛋白基质上培养hES细胞时，未分化细胞所占的比例一直很高(85-90％)，甚至是在培养6天以后。另外，当在存在LT、LF、T或F生长因子组合的情况下，在牛纤连蛋白基质上培养hES细胞时，未分化细胞在培养4天后所占的比例是77-85％，在培养6天后则下降到60-75％。因此，上述结果表明采用纤连蛋白基质和TF或TLF生长因子的本发明无饲养细胞培养体系能够使未分化细胞所占的比例维持较高的水平，这类似于在MEFs上培养的情形。
实施例7
TLF和TF生长因子组合适用于在其它的无饲养细胞培养体系下维持ES细胞
为了进一步证实TLF和TF生长因子组合补充其它的无饲养细胞体系的能力，本发明使用了另外的基质。
试验结果
将起初在MEF上培养的人ES细胞转移到如下的无饲养细胞的培养体系中：MatrigelRTM、自制的MEFs基质和自制的包皮成纤维细胞基质，均添加了血清替代品和所选择的生长因子组合。通过使用TLF或TF生长因子组合，hES细胞能够成功地在MatrigelRTM、MEFs基质和包皮成纤维细胞基质上生长(附图9a-f)。在采用MatrigelRTM或采用MEFs基质的情况下，细胞在未分化阶段能够传代超过30次(超过120天)，能够形成EBs和畸胎瘤(附图10c-f)。然而，上述基质既不是无动物成分的，而且成分也不是明确的，其中纤连蛋白为有利的选择。
在添加了SR和TF和TLF生长因子的包皮成纤维细胞基质上生长ES细胞的情况下，细胞在未分化阶段传代超过5次(超过20天)，其保持了典型的ES细胞形态特征(附图9a)。尽管该基质是一种无动物成分、无饲养细胞的培养体系，但包皮成纤维细胞基质比起纤连蛋白基质来说仍然是一种成分不明确的体系。
因此，上述结果表明无异源、成分明确、由血清替代品和TLF或TF组合生长因子组成的培养基适用于在多种类型的无饲养细胞培养体系中维持和繁殖hES细胞。
应当理解的是，本发明所具有的某些特征，为了描述清楚，尽管分别记载在不同的实施方式中，但上述特征也可以组合到一个实施方式中。反过来讲，本发明的各个特征，为了简洁，尽管只记载在一个实施方式中，但也可以将其分解，或分解后进行任意合适的组合。
上面结合特定的实施方式对本发明作出了详细的描述，对于本领域技术人员来说，在此基础上作出的任意改变、修改、和变化都是显而易见的。相应的，所有上述改变、修改和变化均包含在所附权利要求的精神和宽范围之内。本说明书所提及的所有出版物、专利和专利申请在此均以引用的方式将其全部内容引入到说明书中，如同每一个具体的出版物、专利或专利申请被明确地、分别地表明以引用的方式包括在本文中一样。另外，本申请中对任何文献的引证或列出不应当被解释为申请人承认这些文献是本发明的现有技术。
序列表
<110>Technion Research & Development Foundation Ltd.
<120>制备无饲养细胞、无异源的人胚胎干细胞的方法以及使用该方法制备的干细胞培养物
<130>CPCH0562119P
<160>14
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>单链DNA寡核苷酸
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Claims (7)

1.一种无异源、无饲养细胞的培养体系，其包含基质和组织培养基，其中所述无异源、无饲养细胞的培养体系能够维持人胚胎干细胞在未分化、具有多能性和可增殖状态，其中所述基质是来源于人的纤连蛋白或人包皮成纤维细胞基质，所述组织培养基包括TGFβ1、bFGF和血清替代品或人血清，其中所述TGFβ1的浓度是0.06-0.24ng/ml，所述bFGF的浓度是2-8ng/ml，以及所述血清替代品或人血清的浓度是10-30％。
2.权利要求1的培养体系，其中所述来源于人的纤连蛋白选自人血浆纤连蛋白、重组人血浆纤连蛋白、人细胞纤连蛋白、重组人细胞纤连蛋白和合成纤连蛋白。
3.权利要求1的培养体系，其中所述血清替代品的浓度是15％。
4.权利要求1的培养体系，其中所述组织培养基进一步包括浓度介于500-2000u/ml的LIF。
5.权利要求1的培养体系，其中所述TGFβ1的浓度是0.12ng/ml。
6.权利要求1的培养体系，其中所述bFGF的浓度是4ng/ml。
7.权利要求4的培养体系，其中所述LIF的浓度是1000u/ml。
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