BRPI0607639B1 - Moléculas de anticorpo humano ou fragmento de ligação a antígeno das mesmas que se ligam e neutralizam tgf-beta1, 2 e 3, uso das mesmas e composição farmacêutica - Google Patents

Abstract

MEMBRO DE LIGAÇÃO ESPECIFICO ISOLADO O QUAL SE LIGA A E NEUTRALIZA TGF(Beta)1, TGF(Beta)2 E TGF(Beta)3, USO DO MESMO, ANTICORPO, COMPOSIÇÃO, USO DA MESMA, ACIDO NUCLEICO ISOLADO, CÉLULA HOSPEDEIRA, MÉTODOS DE PRODUÇÃO DE UM MEMBRO DE LIGAÇÃO ESPECIFICO E QUE SE LIGA ESPECIFICAMENTE AO TGF(Beta)1, TGF(Beta)2 E TGF(Beta)3, PARA INIBIR A PRODUÇÃO DE FIBRONECTINA MEDIADA PELO TGF (Beta)1, 2 OU 3, VEGF MEDIADA POR TGF(Beta)1, 2 OU 3 E A ATIVIDADE DA TGF(Beta)1, 2 OU 3 INDUZIDA POR ClCLOSPORINA, PARA MODULAR A PROLIFERAÇÃO CELULAR, E PARA AUMENTAR A ATIVIDADE DE CÉLULAS NK. A presente invenção refere-se a moléculas de anticorpo, particularmente a moléculas de anticorpo que se ligam ao Fator Transformador de Crescimento beta (TGF(Beta)) e aos seus usos. Mais particularmente, a invenção se refere a moléculas de anticorpo que se ligam e preferivelmente neutralizam TGF(Beta)1, TGF(Beta)2 e TGF(Beta)3, chamadas moléculas de anticorpo "pan-especificas", e aos usos de tais moléculas de anticorpo. Modalidades preferidas na presente invenção são moléculas de anticorpo, seja anticorpo inteiro (Por exemplo, IgG, tal como IgG1 ou IgG4) ou fragmentos de anticorpo (por exemplo, scFv, Fab, dAb).

Description

CAMPO TÉCNICO

[1] A presente invenção refere-se às moléculas de anticorpo, particularmente moléculas de anticorpo que se ligam ao Fator Transformador de Crescimento beta (TGFβ) e seus usos. Mais particularmente, a invenção se refere às moléculas de anticorpo que se ligam e preferivelmente neutralizam o TGFβ1, TGFβ2 e o TGFβ3, chamadas de moléculas de anticorpo pan-específicas, e aos usos de tais moléculas de anticorpo.

ANTECEDENTES

[2] TGFβ foi primeiramente identificado em 1981 (Roberts et al., 1981). Em seres humanos, existem três isoformas: TGFβ1, TGFβ2 e TGFβ3 (Números de Acesso Swiss Prot P01137, P08112 e P10600, respectivamente) os quais, no seu estado biologicamente ativo, são homodímeros de 25 KDa compreendendo dois monômeros de 112 aminoácidos juntos por uma ponte dissulfeto intercadeia. O TGFβ1 difere do TGFβ2 por 27, e do TGFβ3 por 22, alterações de aminoácidos principalmente conservativas. Essas diferenças foram mapeadas na estrutura 3D do TGFβ determinado por cristalografia de raio X (Schlu- negger et al., 1992; Peer et al., 1996) e as regiões de ligação do receptor foram definidas (Griffith et al., 1996; Qian et al., 1996).

[3] TGFβs humanos são muito semelhantes aos TGFβs de camundongo: TGFβ1 humano tem somente uma diferença de aminoá- cido do TGFβ1 de camundongo, o TGFβ2 humano tem somente três diferenças de aminoácidos do TGFβ2 de camundongo e o TGFβ3 humano é idêntico ao TGFβ3 de camundongo. Como resultado, a produ- ção de anticorpos para os TGFβs humanos em camundongos, incluindo camundongos transgênicos, pode ser difícil.

[4] TFGβs são citocinas multifuncionais que estão envolvidas na proliferação e diferenciação celular, no desenvolvimento embrionário, na formação de matriz extracelular, no desenvolvimento ósseo, na cicatrização de feridas, na hematopoiese e nas respostas imunes e inflamatórias (Border et al., 1995a). A desregulação das TGFβs leva a processos patológicos que,em seres humanos, foram implicados em numerosas condições, por exemplo, defeitos de nascença, câncer, inflamatório crônico, doenças auto-imunes e fibróticas (Border et al., 1994; Border et al., 1995b).

[5] Foram feitos estudos em muitos modelos de animais fibróti- cos (Border et al., 1995b; Border et al., 1994), usando anticorpos neu- tralizadores como antagonistas, por exemplo, glomerulonefrite (Border et al., 1990), cicatrização neural (Logan et al., 1994), cicatrização dér- mica (Shah et al., 1994) e fibrose pulmonar (Giri et al., 1993). Todas as doenças representadas por esses modelos representam uma necessidade não-atendida por novos produtos terapêuticos (Bonewald, 1999; Jackson, 1998). Entretanto, os anticorpos usados nesses e em outros estudos com animais foram suscitados em animais e seus benefícios terapêuticos em seres humanos podem ser limitados devido aos seus potenciais para induzir as respostas imunogênicas e às suas rápidas depurações farmacocinéticas (Vaughan et al., 1998). Os anticorpos humanos são mais desejáveis para o tratamento de doenças mediadas pelo TGF-β.

[6] Uma variedade de fragmentos de anticorpos são conheci dos por serem capazes de se ligar especificamente a uma proteína alvo e com boa afinidade. Por exemplo, fragmentos de anticorpos compreendendo somente os domínios variáveis de cadeia pesada (VH) e a variável de cadeia leve (VL) unidos por um ligante peptídico curto, conhecido como Fv de cadeia única (scFv) foram usados exten-sivamente. Anticorpos humanos neutralizando TGFβl (CAT-192) ou TGFβ2 (CAT-152 ou Trabio®) foram anteriormente gerados (EP 0 945 464, EP 0 853 661, Thompson et al. 1999). Entretanto, a maioria dos anticorpos TGFβ disponíveis na técnica são não-humanos. Além disso, antes dessa invenção, os únicos anticorpos monoclonais pan- específicos contra o TGFβ eram os de roedores.

[7] Anticorpos policlonais que se ligam à TGFβ1 humano e ao TGFβ2 humano contra os epitopos tanto neutralizantes quanto não- neutralizantes foram suscitados em coelhos (Danielpour et al.1989b; Roberts et al., 1990), galinhas (R&D Systems, Minneapolis) e perus (Danielpour et al., 1989c). Peptídeos representando seqüências de TGFβ parciais também foram usadas como imunógenos para suscitar anti-soro policlonal neutralizante em coelhos (Border et al., 1990; Flanders et al., 1988). Tais anticorpos não-humanos, policlonais não são adequados para o uso humano terapêutico.

[8] 1D11.16 é um anticorpo anti-TGFβ pan-específico de muri- no que neutraliza o TGFβ1, o TGFβ2 e o TGFβ3 de humanos e camundongos em uma ampla faixa de ensaios in vitro (Dasch et al., 1989; Dasch et al., 1996; Folha de produtos da R & D System para o MAB1835) e é eficaz em estudos de princípios de prova em modelos de animais de fibrose (Ling et al., 2003; Miyajima et al., 2000; Schneider et al., 1999; Khanna et al., 1999; Shenkar et al., 1994). Entretanto, uma vez que 1D11.16 é um anticorpo monoclonal de murino (Dasch et al., 1989; Dasch et al., 1996), ele é instável para uso terapêutico em seres humanos.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[9] Figura 1 mostra a neutralização (% de inibição) do TGFβ1 (a), do TGFβ2 (b) ou do TGFβ3 (c) (10 pM) - produção de fibronectina induzida a partir das células NHLF pela IgG4 da linhagem germinativa PET1073G12 (quadrados fechados) e da 1D11.16 (círculos abertos). Os triângulos fechados representam uma IgG4 irrelevante testada na concentração mais elevada (100 nM). Os dados são apresentados como médias ± a média SE de n experimentos efetuados em duplicata. Para valores de IC50 ver a Tabela 2.

[10] Figura 2 mostra a neutralização (% de inibição) do TGFβl (a), do TGFβ2 (b) ou do TGFβ3 (c) (10 pM) - produção de fibronectina induzida a partir das células NHLF pela IgG4 da linhagem germinativa PET1074B9 (quadrados fechados) e da 1D11.16 (círculos abertos). O triângulo fechado representa uma IgG4 irrelevante testada na concentração mais elevada (100 nM). Os dados são mostrados como médias ± média SE de n experimentos efetuados em duplicatas. Para valores de IC50 ver a Tabela 2.

[11] Figura 3 mostra a neutralização (% de inibição) do TGFβ1 (a), do TGFβ2 (b) ou do TGFβ3 (c) (10 pM) - produção de fibronectina induzida a partir das células NHLF pela IgG4 da linhagem germinativa PET1287A10 (quadrados fechados) e da 1D11.16 (círculos abertos). O triângulo fechado representa uma IgG4 irrelevante testada na concentração mais elevada (100 nM). Os dados são mostrados como médias ± média SE de n experimentos efetuados em duplicatas. Para valores de IC50 ver a Tabela 2.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[12] Em vários aspectos da invenção é fornecida a substância em questão das modalidades incluídas abaixo. Aspectos adicionais e modalidades da invenção são reveladas aqui na descrição.

[13] A presente invenção fornece membros de ligação específi ca para o TGFβ, particularmente para o TGFβ humano. Membros de ligação específicos que são direcionados ao TGFβ1, ao TGFβ2 e ao TGFβ3 são particularmente fornecidos. Modalidades preferidas na presente invenção são moléculas de anticorpo, seja de anticorpo intei- ro (por exemplo, IgG, tal como IgG1 ou IgG4) ou fragmentos de anticorpos (por exemplo, scFv, Fab, dAb). Regiões de ligação a antígeno de anticorpos e sítios de ligação a antígenos dos anticorpos são fornecidos, assim como os domínios VH e VL de anticorpos contendo tais regiões. Nos domínios VH e VL são fornecidas regiões determinantes de complementaridade, CDRs, as quais podem ser fornecidas com diferentes regiões de estruturas diferentes, FR’s, para formar domínios VH ou VL conforme o caso possa ser. Um sítio de ligação a antígeno pode consistir em um domínio VH de anticorpo e/ou de um domínio VL ou suas porções de ligação a antígeno.

[14] Em um aspecto, a presente invenção fornece um membro de ligação específico para a TGFβ humana, compreendendo um sítio de ligação a antígeno de um anticorpo, um conjunto de HCDR, um conjunto de LCDR, ou ambos e/ou um domínio VH, um domínio VL de anticorpo humano ou ambos.

[15] O conjunto de HCDR1, HCDR2 e HCDR3 pode ter seqüên- cias selecionadas dos seguintes grupos: HCDR1 SEQ ID NO: 3, HCDR2 SEQ ID NO: 4, HCDR3 SEQ ID NO: 5 (referidas aqui como o "conjunto PET1073G12 de HCDRs"); HCDR1 SEQ ID NO: 13, HCDR2 SEQ ID NO: 14, HCDR3 SEQ ID NO: 15 (referidas aqui como o "conjunto PET1074B9 de HCDRs"); HCDR1 SEQ ID NO: 23, HCDR2 SEQ ID NO: 24, HCDR3 SEQ ID NO: 25 (referidas aqui como o "conjunto PET1287A10 de HCDRs").

[16] O conjunto de LCDR1, LCDR2 e LCDR3 podem ter se- qüências selecionadas a partir dos seguintes grupo: LCDR1 SEQ ID NO: 8, LCDR2 SEQ ID NO: 9, LCDR3 SEQ ID NO: 10 (referidas aqui como o "conjunto PET1073G12 de LCDRs"); LCDR1 SEQ ID NO: 18, LCDR2 SEQ ID NO: 19, LCDR3 SEQ ID NO: 20 (referidas aqui como o "conjunto PET1074B9 de LCDRs"); LCDR1 SEQ ID NO: 28, LCDR2 SEQ ID NO: 29, LCDR3 SEQ ID NO: 30 (referidas aqui como o "con- junto PET1287A10 de LCDRs").

[17] O conjunto PET1073G12 de HCDRs juntamente com o con junto PET1073G12 de LCDRS é aqui referido como o conjunto PET1073G12 de CDRs.

[18] O conjunto PET1074B9 de HCDRs juntamente com o con junto PET1074B9 de LCDRS é aqui referido como o conjunto PET1074B9 de CDRs.

[19] O conjunto PET1287A10 de HCDRs juntamente com o con junto PET1287A10 de LCDRS é aqui referido como o conjunto PET1287A10 de CDRs.

[20] Um domínio VH compreendendo um conjunto de HCDRs conforme aqui revelados também é fornecido pela presente invenção, uma vez que é separadamente um domínio VL compreendendo um conjunto de LCDRs conforme aqui descrito. Preferivelmente tal domínio VH é emparelhado com tal domínio VL, e mais preferivelmente os pareamentos de domínios VH e VL são os mesmos que nos clones conforme aqui estabelecido.

[21] Ainda fornecido pela presente invenção está um domínio VH compreendendo um conjunto de HCDRs HCDR1, HCDR2 e HCDR3, em que o conjunto de HCDRs corresponde àquele para o PET1073G12, PET1074B9 ou PET1287A10 com uma ou duas substituições de aminoácidos.

[22] Ainda fornecido pela presente invenção é um domínio VL compreendendo um conjunto de LCDRs LCDR1, LCDR2 e LCDR3 em que o conjunto de CDRs corresponde àquele para o PET1073G12, PET1074B9 ou PET1287A10 com uma ou duas substituições de ami- noácidos.

[23] Um membro de ligação específico compreendendo um sítio de ligação a antígeno de um anticorpo em tal domínio VH e/ou VL também é fornecido pela presente invenção.

[24] Seguindo a direção da química computacional na aplicação de técnicas de análise de dados multivariados para as relações de es- trutura/propriedade-atividade (Wold, et al. Multivariate data analysis in chemistry. Chemometrics -Mathematics and Statistics in Chemistry (Ed.: B. Kowalski), D. Reidel Publishing Company, Dordrecht, Holland, 1984 (ISBN 90-277-1846-6)), relações quantitativas de atividade- propriedade dos anticorpos podem ser derivadas usando técnicas matemáticas bem-conhecidas, tais como regressão estatística, reconhecimento e classificação de padrões (Norman et al. Applied Regression Analysis. Wiley-Interscience; 3a edição (Abril de 1998) ISBN: 0471170828; Abraham Kandel, Eric Backer. Computer-Assisted Reasoning in Cluster Analysis. Prentice Hall PTR; (11 de maio de 1995), ISBN: 0133418847; Wojtek Krzanowski. Principles of Multivariate Analysis: A User's Perspective (Oxford Statistical Science Series, No 22 (Paper)). Oxford University Press; (Dezembro de 2000), ISBN: 0198507089; Ian H. Witten, Eibe Frank. Data Mining: Practical Machine Learning Tools and Techniques with Java Implementations. Morgan Kaufmann; (11 de outubro de 1999), ISBN: 1558605525; David G. T. Denison (Editor), Christopher C. Holmes, Bani K. Mallick, Adrian F. M. Smith. Bayesian Methods for Nonlinear Classification and Regression (Wiley Series in Probability and Statistics). John Wiley & Sons; (July 2002), ISBN: 0471490369; Arup K. Ghose, Vellarkad N. Viswa- nadhan. Combinatorial Library Design and Evaluation Principles, Soft-ware, Tools, and Applications in Drug Discovery. ISBN: 0-8247-04878). As propriedades dos anticorpos podem ser derivadas a partir de modelos empíricos e teóricos (por exemplo, análise de prováveis resíduos de contato ou de propriedade físico-química calculada) de estruturas e essas propriedades podem ser consideradas individualmente ou em combinação.

[25] A análise dos anticorpos de estrutura atômica conhecida elucidou relações entre a seqüência e a estrutura tridimensional de sítios de ligação a anticorpos (Chovia C. et al. Journal Molecular Biology (1992) 227, 799-817; Al-Lazikani, et al. Journal Molecular Biology (1997) 273(4), 927-948). Essas relações implicam que, exceto para a terceira região nos domínios VH (alça), as alças do sítio têm uma de uma pequena quantidade de conformações de cadeia principal: estruturas canônicas. A estrutura canônica formada em uma alça particular foi demonstrada como sendo determinada por seu tamanho e pela presença de certos resíduos em sítios chave tanto na alça quanto nas regiões estruturais (Chothia et al. and Al-Lazikani et al., supra).

[26] Esse estudo de relação seqüência-estrutura pode ser usa do para a previsão daqueles resíduos em um anticorpo de seqüência conhecida, mas de uma estrutura tridimensional desconhecida, os quais são importantes na manutenção da estrutura tridimensional de suas alças de CDR e, dessa forma, na manutenção da especificidade de ligação. Essas previsões podem ser confirmadas por comparação das previsões com a produção dos experimentos de otimização. Em uma tentativa estrutural, um modelo teórico pode ser criado da molécula de anticorpo (Chothia, et al. Science, 223,755-758 (1986)) usando qualquer pacote livremente disponível ou comercial, tal como WAM (Whitelegg, N.R.u. e Rees, A.R (2000) Prot. Eng., 12, 815-824). Um pacote de programas de computador de análise e de visualização de proteínas, tal como o Insight II (Accelerys, Inc.) ou o Deep View (Guex, N. e Peitsch, M.C. Electrophoresis (1997) 18, 2714-2723) podem, dessa forma, ser usados para avaliar possíveis substituições em cada posição na CRD e na FR. Essa informação pode, dessa forma, ser usada para fazer substituições plausíveis de ter um efeito mínimo ou benéfico na atividade.

[27] As técnicas necessárias para fazer substituições nas se- qüências de aminoácidos das CDRs, dos domínios de VH ou VL dos anticorpos e dos membros de ligação específicos geralmente estão disponíveis na técnica. Seqüências variantes podem ser feitas, com substituições que podem ou não ser previstas para ter um efeito mínimo ou benéfico na atividade, e testadas quanto à capacidade de se ligar e/ou neutralizar o TGFβ e/ou quanto a qualquer outra propriedade desejada. Isso é discutido adicionalmente abaixo.

[28] Conforme já notado, a presente invenção fornece membros de ligação específicos compreendendo um conjunto definido de CDRs, particularmente o conjunto de CDRs de PET1073G12, PET1074B9 e PET1287A10, e os conjuntos de CDR de PET1073G12, PET1074B9 ou PET1287A10 com uma ou duas substituições no conjunto de CDRs.

[29] O conjunto relevante de CDRs é fornecido nas regiões es truturais do anticorpo ou outras estruturas de proteína, por exemplo, fibronectina ou citocromo B. Preferivelmente, regiões de estrutura de anticorpo são empregadas.

[30] Em uma modalidade preferida, a cadeia pesada utiliza um gene da família VH1 humana. Em várias modalidades, a seqüência de aminoácidos estrutura de cadeia pesada contém 1 - 12, preferivelmente 3 - 12 e mais preferivelmente 3 - 8 diferenças de aminoácidos em comparação com a seqüência de aminoácidos da linhagem germinati- va do gene da família VH1 humana. Em algumas modalidades, a se- qüência da estrutura da cadeia pesada é a seqüência da linhagem germinativa. Em modalidades particularmente preferidas, a região da estrutura do anticorpo pode ser a DP-10 humana (VH 1 - 69) ou a DP- 88 humana (VH 1-e) da família VH1. Preferivelmente, modalidades utilizando um gene DP-10 humano têm um aminoácido que não é da linhagem germinativa nos resíduos 27, 78 e 94. Em algumas modalidades, o resíduo 27 é a tirosina, o resíduo 78 é a treonina e o resíduo 94 é a serina ou a leucina. Em algumas modalidades, a cadeia leve utiliza um gene da família VK3 humana com 1 - 5, preferivelmente 1 - 4, mais preferivelmente 1 - 3 diferenças de aminoácidos em comparação com a seqüência de aminoácidos da linhagem germinativa. Em algumas modalidades, a seqüência da estrutura da cadeia leve é a seqüência de gene da família VK3 humana. Em modalidades particularmente preferidas, a região da estrutura para a cadeia leve pode ser a DPK-22 humana (A27). Em algumas tais modalidades, o resíduo 2 é um ami- noácido de linhagem não-germinativa. Em algumas modalidades, o resíduo 2 é a treonina.

[31] Em uma modalidade altamente preferida, um domínio VH é fornecido com a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, essa seqüência sendo nomeada "domínio VH PET1073G12" ou SEQ ID NO: 12, essa seqüência sendo nomeada "domínio VH PET1074B9", ou SEQ ID NO: 22, essa seqüência sendo nomeada "domínio VH PET1287A10".

[32] Em uma outra modalidade altamente preferida, um domínio VL é fornecido com a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7, essa sendo nomeada de "domínio VL PET1073G12", ou SEQ ID NO: 17, essa sendo nomeada de "domínio VL PET1074B9", ou SEQ ID NO: 27, essa sendo nomeada "domínio VL PET1287A10". Uma modalidade altamente preferida de acordo com a presente invenção é composta do domínio VH PET1073G12, SEQ ID NO: 2, e do domínio VL PET1073G12, da SEQ ID NO: 7. Outra modalidade altamente preferida fornecida de acordo com a presente invenção é composta do domínio VH PET1074B9, SEQ ID NO: 12, e do domínio VL PET1074B9, SEQ ID NO: 17. Outra modalidade altamente preferida fornecida de acordo com a presente invenção é composta do domínio VH PET1287A10, SEQ ID NO: 22, e do domínio VL PET1287A10, SEQ ID NO: 27. Esses ou qualquer outro sítio de ligação a antígeno fornecido de acordo com a presente invenção pode ser fornecido em qualquer formato de molécula de anticorpo desejado, por exemplo, scFv, Fab, IgG1, IgG4, dAb etc., conforme é discutido adicionalmente aqui em outras partes.

[33] Em uma outra modalidade altamente preferida, a presente invenção fornece uma molécula de anticorpo IgG4 compreendendo o domínio VH PET1073G12, PET1074B9 ou PET1287A10, preferivelmente também compreendendo o domínio VL PET1073G12, PET1074B9 ou PET1287A10 correspondente.

[34] Outras moléculas de anticorpo ou IgG4 compreendendo o domínio VH PET1073G12, PET1074B9 ou PET1287A10, e/ou o domínio VL PET1073G12, PET1074B9 ou PET1287A10, são fornecidas pela presente invenção como são outras moléculas de anticorpo compreendendo o conjunto PET1073G12, PET1074B9 ou PET1287A10 de HCDRs em um domínio VH de anticorpo, e/ou o conjunto PET1073G12, PET1074B9 ou PET1287A10 de LCDRs em um domínio VL de anticorpo.

[35] É conveniente comentar aqui que "e/ou" onde aqui utiliza dos é para ser tomado como uma descoberta específica de cada uma das duas características ou componentes especificados com ou sem o outro. Por exemplo, "A e/ou B" é para ser tomado como uma descoberta específica de cada um de (i) A, (ii) B e (iii) A e B, exatamente como se cada um fosse demonstrado aqui individualmente.

[36] Conforme notado, em certas modalidades da presente in venção fornece um membro de ligação específico o qual se liga a todas as três isoformas do TGFβ humano e o qual compreende o domínio VH e/ou VL do PET1073G12, PET1074B9 ou PET1287A10 ou porções de ligação a antígeno desses domínios.

[37] Em algumas modalidades, um domínio VH é emparelhado com um domínio VL para fornecer um sítio de ligação a antígeno. Em uma modalidade preferida, o domínio VH PET1073G12 (SEQ ID NO: 2) é emparelhado com o domínio VL PET1073G12 (SEQ ID NO: 7), de forma que um sítio de ligação a antígeno é formado compreendendo ambos os domínios VH e VL de PET1073G12. Em uma modalidade preferida, o domínio VH PET1074B9 (SEQ ID NO: 12) é emparelhado com o domínio VL PET1074B9 (SEQ ID NO: 17), de forma que um sítio de ligação a antígeno é formado compreendendo ambos os domínios VH e VL do PET1074B9. Em uma modalidade preferida, o domínio VH PET1287A10 (SEQ ID NO: 22) é emparelhado com o domínio VL PET1287A10 (SEQ ID NO: 27), de forma que um sítio de ligação a antígeno do anticorpo é formado compreendendo ambos os domínios VH e VL do PET1287A10. Em outras modalidades, o VH do PET1073G12, PET1074B9 ou PET1287A10 é emparelhado com um domínio VL diferente do VL PET1073G12, PET1074B9 ou PET1287A10 correspondente. A promiscuidade das cadeias leves é bem-estabelecida na técnica.

[38] Semelhantemente, qualquer conjunto de HCDRs aqui des crito pode ser fornecido em um domínio VH que seja usado como um membro de ligação específico sozinho ou em combinação com um domínio VL. Um domínio VH pode ser fornecido com um conjunto de HCDRs conforme aqui descrito, e se tal domínio VH estiver emparelhado com um domínio VL, então o domínio VL pode ser fornecido com um conjunto de LCDRs aqui revelados. Um emparelhamento de um conjunto de HCDRs e um conjunto de LCDRs pode ser conforme aqui descrito para os anticorpos PET1073G12, PET1074B9 and PET1287A10. As regiões de estrutura dos domínios VH e/ou VL podem ser estruturas de linhagens germinativas. Regiões de estrutura do domínio de cadeia pesada podem ser selecionadas da família VH-1, e uma estrutura VH-1 é uma estrutura DP-10 ou DP-88. Regiões de estrutura da cadeia leve podem ser selecionadas da família VK3, e uma estrutura preferida é a DPK-22.

[39] Uma ou mais CDRs podem ser tomadas a partir de um do mínio VH ou VL do qual a seqüência é aqui descrita e incorporada em uma estrutura adequada. Isso é discutido adicionalmente aqui. O mesmo se aplica para outras CDRs e conjuntos de CDRs de anticorpos conforme obtidos usando métodos aqui descritos.

[40] Um domínio VH de anticorpo, um domínio VL de anticorpo, um conjunto de HCDRs, um conjunto de LCDRs, um conjunto de CDRs, um ou mais HCDRs, por exemplo, um HCDR3, e/ou um ou mais LCR’s, por exemplo, um LCDR3, pode ser empregado em qualquer aspecto e modalidade da presente invenção conforme aqui descrito para outras moléculas, por exemplo, métodos de mutação e seleção de sítios de ligação a antígeno com potência aumentada.

[41] Variantes dos domínios VL e VH e CDRs da presente in venção, incluindo aquelas para as quais seqüências de aminoácidos são aqui estabelecidas, e as quais podem ser empregadas em membros de ligação específicos para o TGFβ podem ser obtidas através de métodos de alteração ou mutação de seqüência e varredura. Tais métodos também são fornecidos pela presente invenção.

[42] Variantes de seqüência de aminoácidos de domínio variável de qualquer um dos domínios VH e VL cujas seqüências são especificamente aqui reveladas podem ser empregadas de acordo com a presente invenção, conforme discutido. Variantes particulares podem incluir uma ou mais alterações de seqüências de aminoácidos (adição, anulação, substituição e/ou inserção de um resíduo de aminoácido), podem ser menores do que cerca de 20 alterações, menores do que cerca de 15 alterações, menores do que cerca de 10 alterações ou menores do que cerca de 5 alterações, 4, 3, 2 ou 1. Alterações podem ser feitas em uma ou mais regiões estruturais e/ou em uma ou mais CDRs.

[43] De acordo com outros aspectos da presente invenção, é fornecido um membro de ligação específico humano, humanizado, quimérico ou sintético que compete ou compete de forma cruzada pela ligação ao antígeno com qualquer membro de ligação específico que se liga tanto ao antígeno quanto compreende uma região de ligação a antígeno do anticorpo específico, domínio VH e/ou VL aqui descrito, conjunto de CDRs ou HCDR3 aqui descrito, ou uma variante de qualquer um desses. A competição entre os membros de ligação pode ser facilmente avaliada in vitro, por exemplo, usando ELISA e/ou pela marcação de uma molécula repórter específica a um membro de ligação o qual possa ser detectado na presença de outro(s) membro(s) de ligação não-marcado(s), para capacitar a identificação dos membros de ligação específicos os quais se ligam ao mesmo epitopo ou a um epitopo sobreponível. A competição cruzada entre os membros de ligação pode ser prontamente avaliada correndo o ensaio reverso, por exemplo, pela reversão dos membros de ligação marcados e não- marcados para identificar pares que bloqueiem a ligação em ambas as direções.

[44] Dessa forma, um outro aspecto da presente invenção for nece um membro de ligação específico compreendendo um sítio de ligação a antígeno de um anticorpo o qual compete ou compete de forma cruzada com uma molécula de anticorpo PET1073G12, PET1074B9 ou PET1287A10, particularmente com um scFv e/ou IgG4 do PET1073G12, PET1074B9 ou PET1287A10, para ligação ao TGFβ. Em várias modalidades, o anticorpo é um anticorpo humano, humanizado, quimérico ou sintético. Em outros aspectos, a presente invenção fornece um membro de ligação específico compreendendo um sítio de ligação a antígeno de um anticorpo humano, humanizado, quimérico ou sintético o qual compete ou compete de forma cruzada com um sítio de ligação a antígeno da presente invenção pela ligação ao TGFβ, em que o sítio de ligação a antígeno do anticorpo humano, humaniza- do, quimérico ou sintético é composto de um domínio VH e de um domínio VL, e em que os domínios VH e VL compreendem um conjunto de CDRs conforme aqui descrito.

[45] Dada a informação aqui descrita, vários métodos estão dis poníveis na técnica para obter anticorpos humanos, humanizados, quiméricos ou sintéticos contra o TGFβ, e os quais podem competir ou competir de forma cruzada com uma molécula de anticorpo PET1073G12, PET1074B9 ou PET1287A10, uma molécula de anticorpo com um conjunto de CDRs de PET1073G12, PET1074B9 ou PET1287A10, uma molécula de anticorpo com um conjunto de HCDRs PET1073G12, PET1074B9 ou PET1287A10 ou uma molécula de anticorpo com um conjunto de LCDRs PET1073G12, PET1074B9 ou PET1287A10, para ligação ao TGFβ.

[46] Em um outro aspecto, a presente invenção fornece um mé todo de obtenção de um ou mais membros de ligação específicos capazes de se ligar ao TGFβ1, TGFβ2 e ao TGFβ3, o método incluindo colocar em contato uma biblioteca de membros de ligação específicos de acordo com a invenção e os referidos TGFβs, e a seleção de um ou mais membros de ligação específicos da biblioteca capazes de se ligar a todos os referidos TGFβs.

[47] A biblioteca pode ser apresentada na superfície das partí culas bacteriófagas, cada partícula contendo um ácido nucléico que codifica o domínio variável VH do anticorpo apresentado na sua superfície, e também opcionalmente um domínio VL apresentado, caso presente.

[48] Após a seleção dos membros de ligação específicos capa zes de se ligar ao antígeno e apresentados nas partículas de bacterió- fagos, o ácido nucléico pode ser tomado a partir de uma partícula bac- teriófaga apresentando um membro de ligação específico selecionado. Tal ácido nucléico pode ser usado na produção subseqüente de um membro de ligação específico ou de um domínio variável VH de anticorpo (e opcionalmente um domínio variável VL de anticorpo) pela expressão a partir de um ácido nucléico com a seqüência do ácido nu- cléico tomada de uma partícula bacteriófaga apresentando um membro de ligação específico selecionado.

[49] Um domínio VH de anticorpo com a seqüência de aminoá- cidos de um domínio VH de anticorpo de um referido membro de ligação específico selecionado pode ser fornecido na forma isolada, assim como pode ser um membro de ligação específico compreendendo tal domínio VH. A capacidade de se ligar a todas as três isoformas do TGFβ pode ser adicionalmente testada, também a capacidade de competir ou competir de forma cruzada com PET1073G12, PET1074B9 ou PET1287A10 (por exemplo, no formato scFv e/ou no formato IgG, por exemplo, da IgG4) pela ligação a todas as três isoformas humanas do TGFβ. A capacidade de neutralizar o TGFβ pode ser testada, conforme discutido adicionalmente abaixo.

[50] Um membro de ligação específico de acordo com a presen te invenção pode se ligar ao TGFβ1, TGFβ2 e/ou ao TGFβ3 com a afinidade de uma molécula de anticorpo PET1073G12, PET1074B9 ou PET1287A10, por exemplo, scFv, ou preferivelmente IgG4, ou com uma afinidade que seja maior do que uma das moléculas acima. Um membro de ligação específico de acordo com a presente invenção pode neutralizar o TGFβ1, o TGFβ2 e/ou o TGFβ3 com a potência de uma molécula de anticorpo PET1073G12, PET1074B9 ou PET1287A10, por exemplo, scFv, ou preferivelmente IgG4 PET1073G12, PET1074B9 ou PET1287A10, ou com uma potência que seja maior do que uma das moléculas acima.

[51] Um membro de ligação específico de acordo com a presen te invenção pode neutralizar TGFβ de ocorrência natural com a potência de uma molécula de anticorpo PET1073G12, PET1074B9 ou PET1287A10, por exemplo, scFv, ou preferivelmente IgG4, ou com uma potência que seja maior do que uma das moléculas acima. A afinidade de ligação e a potência de neutralização de diferentes membros de ligação específica podem ser comparadas sob condições apropriadas.

[52] Uma modalidade preferida da presente invenção compre ende preferivelmente anticorpos humanos, humanizados, quiméricos ou sintéticos que neutralizam TGFβ de ocorrência natural com uma potência que seja igual a ou maior do que a potência de um sítio de ligação de antígeno formado pelo domínio VH PET1073G12, PET1074B9 ou PET1287A10 e o correspondente domínio VL PET1073G12, PET1074B9 ou PET1287A10.

[53] Além das seqüências de anticorpo, um membro de ligação específico de acordo com a presente invenção pode compreender outros aminoácidos, por exemplo, formando um peptídeo ou polipeptí- deo, tal como um domínio dobrado, ou para conceder à molécula outra característica funcional além da capacidade de se ligar a antígeno. Membros de ligação específica da invenção podem carregar um marcador detectável, ou podem ser conjugados a uma toxina ou a uma porção alvejada da enzima (por exemplo, através de uma ligação ou ligante peptídico).

[54] Em outros aspectos, a invenção fornece um ácido nucléico isolado o qual compreende uma seqüência de acordo com um membro de ligação específico, domínio VH e/ou domínio VL ou CDR de acordo com a presente invenção, e métodos de preparo de um membro de ligação específico, um domínio VH e/ou um domínio VL ou um CDR da invenção, cujos métodos compreendem a expressão do referido ácido nucléico sob condições para fazer a produção do referido membro de ligação específico, domínio VH e/ou domínio VL, ou CDR e a sua recuperação.

[55] Membros de ligação específicos de acordo com a invenção podem ser usados em um método de tratamento ou diagnóstico do corpo humano ou animal, tal como um método de tratamento (o qual pode incluir o tratamento profilático) de uma doença ou distúrbio em um paciente humano, o qual compreende a administração a um referido paciente de uma quantidade eficaz de um membro de ligação específico da invenção. As condições tratáveis de acordo com a presente invenção incluem qualquer uma das quais o TGFβ desempenha um papel, especialmente o tratamento da doença fibrótica, a modulação da cicatrização de feridas e o tratamento de câncer.

[56] Mais particularmente, os membros de ligação específicos da invenção são úteis para inibir a atividade de qualquer uma ou de todas as três isoformas do TGFβ humano in vitro ou in vivo. Tais atividades incluem, mas não estão limitadas, à sinalização mediada por TGFβ, à deposição da matriz extracelular (ECM), à inibição da proliferação de células endoteliais e epiteliais, à promoção da proliferação do músculo liso, à indução da expressão de colágeno do tipo III, à indução do TGFβ, à fibronectina, ao VEGF e à expressão da IL-11, à ligação do Peptídeo Associado à Latência, à imunossupressão induzida por tumor, à promoção da angiogênese, à ativação dos miofibroblas- tos, à promoção da metástase e à inibição da atividade das células NK.

[57] Membros de ligação específicos da invenção também são úteis para tratar doenças e condições que resultam direta ou indiretamente da atividade do TGFβ. Devido aos membros de ligação específicos da invenção serem pan-específicos, isto é, eles se ligam e inibem a atividade de todas as três isoformas do TGFβ, eles são particularmente vantajosos para tratar condições e doenças que envolvem duas ou mais isoformas de TGFβ (tais como infecções e tumores) e condições severas, onde a inibição de alvos múltiplos é desejável.

[58] Membros de ligação específicos são úteis para tratar doen ças e condições incluindo, mas sem se limitar, a doenças fibróticas (tais como glomerulonefrite, cicatrização neural, cicatrização dérmica, fibrose pulmonar, fibrose do pulmão, fibrose induzida por radiação, fibrose hepática, mielofibrose), queimaduras, doenças imunomediadas, doenças inflamatórias (incluindo artrite reumatóide), rejeição de transplante, câncer, contratura de Dupuytren’s e úlceras gástricas. Eles também são úteis para tratar, prevenir e reduzir o risco de ocorrência de insuficiências renais, incluindo, mas sem se limitar, a: nefropatia diabética (tipo I e tipo II), nefropatia de radiação, nefropatia obstrutiva, esclerose sistêmica difusa, fibrose pulmonar, rejeito de aloenxerto, doença renal hereditária (por exemplo, doença do rim policística, rim esponjoso medular, rim em ferradura), glomerulonefrite, nefroesclerose, nefrocalcinose, lupos eritematoso sistêmico, síndrome de Sjogren, doença de Berger, hipertensão sistêmica ou glomerular, nefropatia túbu- lo-intersticial, acidose tubular renal, tuberculose renal e enfarte renal. Particularmente, eles são úteis quando combinados com antagonistas do sistema renina-angiotensina-aldosterona incluindo, mas sem se limitar, a: inibidores da renina, inibidores da enzima conversora de an- giotensina (ACE), antagonistas do receptor de Ang II (também conhecidos como "bloqueadores do receptor de Ang II) e antagonistas da aldosterona. Métodos para uso dos membros de ligação específica da presente invenção juntamente com tais antagonistas são estabelecidos no PCT/US04/13677, os conteúdos do qual são aqui incorporados por referência.

[59] Membros de ligação específicos da invenção também são úteis para tratar doenças e condições associadas com a deposição da ECM, as referidas doenças e condições incluindo esclerose sistêmica, adesões pós-operatórias, cicatrização quelóide e hipertrófica, vitreorre- tinopatia proliferativa, cirurgia de drenagem de glaucoma, injúria da córnea, catarata, doença de Peyronie, síndrome da angústia respiratória aguda, cirrose hepática, cicatrização de enfarte pós-miocardial, restenose pós-angioplastia, cicatrização depois de hemorragia pós- aracnóide, esclerose múltipla, fibrose após a laminectomia, fibrose após o tendão e outros reparos, cicatrização devido à remoção de tatuagem, cirrose biliar (incluindo colangite esclerosante), pericardite, pleurisia, traqueostomia, injúria do SCN penetrante, síndrome miálgica eosinofílica, restenose vascular, doença veno-oclusiva, pancreatite e artropatia psoriática.

[60] Membros de ligação específicos da invenção são ainda úteis em condições onde a promoção da reepitelialização é benéfica. Tais condições incluem, mas não estão limitadas, a doenças da pele, tais como úlceras venosas, úlceras isquêmicas (dores de compressão), úlceras diabéticas, sítios de enxerto, sítios doadores de enxerto, abrasões e queimaduras, doenças do epitélio bronquial, tais como asma, ARDS, doenças epitélio intestinal, tais como mucosite associada com o tratamento citotóxico, úlceras esofageais (doença reflexa), úlceras estomacais, lesões intestinais grandes e intestinais pequenas (doença do intestino inflamatória).

[61] Ainda outros usos de membros de ligação específicos da invenção estão em condições nas quais a proliferação das células en- doteliais é desejável, por exemplo, na estabilização das placas ateros- cleróticas, na promoção da cura das anastomose vasculares ou em condições nas quais a inibição da proliferação das células do músculo liso é desejável, tais como na doença arterial, na restenose e na asma.

[62] Membros de ligação específicos da invenção também são úteis para aumentar a resposta imune às infecções mediadas por ma- crófagos, tais como aquelas causadas por Leishmania spp., Trypano- sorna cruzi, Mycobacterium tuberculosis e Mycobacterium leprae, assim como o protozoário Toxoplasma gondii, os fungos Histoplasma capsula- tum, Candida albicans, Candida parapsilosis e Cryptococcus neoformans, e Rickettsia, por exemplo, R. prowazekii, R. coronii, e R. tsutsu- gamushi. Eles também são úteis para reduzir imunossupressões causadas, por exemplo, por tumores, AIDS ou doenças granulomatosas.

[63] Membros de ligação específicos da invenção ainda são úteis no tratamento das doenças hiperproliferativas, tais como cânceres, incluindo, mas sem se limitar, a cânceres de mama, de próstata, de ovário, de estômago, renais, pancreáticos, colo-retais, de pele, de pulmão, cervical e de bexiga, glioma, mesotelioma, assim como várias leucemias e sarcomas, tal como Sarcoma de Kaposi, e particularmente são úteis para tratar ou prevenir recorrências de metástases de tais tumores. Particularmente, membros de ligação específicos antagonistas da invenção são úteis para inibir metástases mediadas por ciclos- porina.

[64] Será, claramente, percebido que no contexto da terapia de câncer, "tratamento" inclui qualquer intervenção médica resultante na lentificação do crescimento tumoral ou na redução nas metástases tu- morais, assim como na remissão parcial do câncer para prolongar a expectativa de vida de um paciente.

[65] Um outro aspecto da presente invenção fornece ácido nu- cléico, geralmente isolado, que codifica um domínio variável VH e/ou um domínio variável VL de anticorpo aqui descrito.

[66] Outro aspecto da presente invenção fornece ácido nucléico, geralmente isolado, que codifica uma seqüência HCDR ou LCDR aqui descrita, especialmente uma HCDR selecionada dentre as SEQ ID NOS: 3, 4, 5, 13, 14, 15, 23, 24 e 25 ou uma CDR VL selecionada das SEQ ID NOS: 8, 9, 10, 18, 19, 20, 28, 29, 30, mais preferivelmente HCDR3 PET1073G12, PET1074B9 ou PET1287A10 (SEQ ID NO: 5, 15 ou 25, respectivamente). Ácidos nucléicos que codificam o conjunto PET1073G12, PET1074B9 ou PET1287A10 de CDRs, ácidos nucléicos que codificam o conjunto PET1073G12, PET1074B9 ou PET1287A10 de HCDRs e ácidos nucléicos que codificam o conjunto PET1073G12, PET1074B9 ou PET1287A10 de LCDRs também são fornecidos pela presente invenção, assim como são os ácidos nucléicos que codificam CDRs, HCDRs e LCDRs individuais e conjuntos dos CDRs, HCDRs e LCDRs de PET1073G12, PET1074B9 ou PET1287A10.

[67] Um outro aspecto fornece ainda um método para a produ ção de um domínio variável VH de anticorpo, o método incluindo a causa de uma expressão do ácido nucléico codificante. Tal método pode compreender o cultivo de células hospedeiras sob condições para a produção do referido domínio variável VH do anticorpo ou fazendo com que o referido domínio VH do anticorpo seja expresso in vivo.

[68] Métodos análogos para a produção de domínios variáveis VL e membros de ligação específicos compreendendo um domínio VH e/ou VL são fornecidos como aspectos adicionais da presente invenção.

[69] Um método para a produção pode compreender uma etapa de isolamento e/ou purificação do produto.

[70] Um método para a produção pode compreender a formulação do produto em uma composição, incluindo pelo menos um componente adicional, tal como um excipiente farmaceuticamente aceitável.

[71] Esses e outros aspectos da invenção estão descritos em detalhes adicionais abaixo.

DESCRIÇÃO DETALHADA TERMINOLOGIA Membro de ligação específico

[72] Isso descreve um membro de um par de moléculas os quais têm especificidade de ligação um com o outro. Os membros de um par de ligação específico podem ser naturalmente derivados ou produzidos sinteticamente completa ou parcialmente. Um membro do par de moléculas tem uma área na sua superfície, ou uma cavidade, a qual se liga especificamente a uma área da superfície de, ou uma cavidade no outro membro do par de moléculas. Dessa forma, os membros do par têm a propriedade de se ligar especificamente um ao outro. A presente invenção diz respeito com os membros de ligação específicos que se ligam a um antígeno alvo.

Específico

[73] Isso pode ser usado para se referir à situação na qual um membro de ligação específico não irá apresentar qualquer ligação significativa às moléculas diferente do(s) seu(s) padrão/padrões de ligação específico(s) de um dado animal. Por exemplo, um membro de ligação específico, específico para o TGFβ humano não terá ligação significativa com outras moléculas humanas que não sejam TGFβ, entretanto, ele pode reagir de forma cruzada com o TGF-β de outras espécies.

[74] Um membro de ligação específico de ligação a antígeno compreende um sítio de ligação a antígeno. Por exemplo, um membro de ligação específico pode ser uma molécula de anticorpo. Um sítio de ligação a antígeno também pode ser fornecido através da disposição dos CDRs em estruturas de proteína que não sejam anticorpo, tais como fibronectina ou citocromo B, etc. Koide et al., (1998) Journal of Molecular Biology, 284:1141-1151; Nygren et al. (1997) Current Opinion in Structural Biology, Vol. 7:463-469). Estruturas para sítios de ligação novos projetados em proteínas foram revisados em detalhes por Nygren et al., supra. Estruturas de proteína para imitadores de anticorpos estão reveladas na WO 00/34784, a qual descreve proteínas (imitadoras de anticorpos) que incluem um domínio de fibronetcina do tipo III com pelo menos um alça aleatorizada. Uma estrutura adequada na qual se enxerta um ou mais CDRs, por exemplo, um conjunto de HCDRs, pode ser fornecida por qualquer membro de domínio da su- perfamília do gene da imunoglobulina. A estrutura pode ser uma prote- ína humana ou não-humana.

[75] Uma vantagem de uma estrutura protéica diferente de anti corpo é que ela pode fornecer um sítio de ligação a antígeno em uma região de estrutura conservada que seja menor e/ou mais fácil de produzir do que pelo menos algumas moléculas de anticorpo. O pequeno tamanho de um membro de ligação específico pode conferir propriedades fisiológicas úteis, tais como uma capacidade de entrar nas células, penetrar profundamente em tecidos ou alcançar alvos em outras estruturas, ou se ligar em cavidades de proteína do antígeno alvo.

[76] O uso de sítios de ligação a antígeno em estruturas de pro teína diferentes de anticorpo está revisado em Wess, 2004. São típicas proteínas com uma estrutura estável e uma ou mais alças variáveis, nos quais a seqüência de aminoácidos da alça ou alças é especificamente ou aleatoriamente modificada para criar um sítio de ligação a antígeno com especificidade pela ligação do antígeno alvo. Tais proteínas incluem os domínios de ligação à IgG da proteína A de S. aureus, transferrina, tetranectina, fibronectina, (por exemplo, domínio de fibronectina do tipo III) e lipocalinas. Outras tentativas incluem "Micro- corpos" sintéticos (Selecore GmbH), os quais são baseados em ciclo- tídeos - pequenas proteínas com ligações dissulfeto intramoleculares.

[77] Além das seqüências de anticorpo e/ou de um sítio de liga ção a antígeno, um membro de ligação específico de acordo com a presente invenção pode compreender outros aminoácidos, por exemplo, formando um peptídeo ou polipeptídeo, tal como um domínio dobrado, ou para conceder à molécula outra característica funcional além da capacidade de se ligar a antígeno. Membros de ligação específicos da invenção podem carregar um marcador detectável, ou podem estar conjugados com uma toxina ou uma porção alvejante ou enzima (por exemplo, através de um ligante ou ligação peptídica). Por exemplo, um membro de ligação específico pode compreender um sítio catalítico (por exemplo, em um domínio enzimático) assim como um sítio de ligação a antígeno, em que o sítio de ligação a antígeno se liga ao antígeno e, dessa forma, alveja o sítio catalítico do antígeno. O sítio catalítico pode inibir a função biológica do antígeno, por exemplo, por clivagem.

[78] Embora, conforme notado, CDRs possam ser carregados por estruturas tais como de fibronectina ou citocromo B (Haan & Maggos, 2004 BioCentury, 12(5): A1-A6; Koide et al., supra; Nygren et al., supra), a estrutura para carregar um CDR ou um conjunto de CDRs da invenção será geralmente de uma seqüência de cadeia pesada ou leve de anticorpo ou uma porção substancial sua na qual o CR ou conjunto de CDRs está localizado em um local correspondente à CDR ou ao conjunto de CDRs de domínios variáveis de anticorpo VH e VL de ocorrência natural codificados por genes de imunoglobulina rearranjados. As estruturas e locais dos domínios variáveis de imunoglobulina podem ser determinados por referência a Kabat, et al., 1987, e suas atualizações, agora disponíveis na internet (http://immuno.bme.nwu.edu ou encontrando "Kabat" usando qualquer ferramenta de busca).

Molécula de anticorpo

[79] Isso descreve uma imunoglobulina, seja ela natural ou par cial ou completamente produzida de forma sintética. O termo também cobre qualquer polipeptídeo ou proteína compreendendo um domínio de ligação a antígeno de um anticorpo. Fragmentos de anticorpo os quais compreendem um domínio de ligação a antígeno são moléculas tais como Fab, scFv, Fv, dAb, Fd e diacorpos.

[80] No genoma de uma célula de linhagem germinativa huma na, a informação genética para as cadeias polipeptídicas do anticorpo está contida em segmentes de gene múltiplos no local disperso ao longo de diferentes cromossomos. Cadeias pesadas humanas (VH) são codificadas no cromossomo 14, as cadeias leves capa (VK) no cromossomo 2 e as cadeias leves lambda (VÀ) no cromossomo 22. Durante o desenvolvimento dos linfócitos B (células produtoras de anticorpos), os segmentos de gene nesses locais são montados por re- combinação, levando à formação dos genes de cadeia pesada ou leve do anticorpo completos (Tonegawa S. Nature, 302, 575-81, 1983). As regiões constantes do anticorpo (VH, V6 e VÀ) são muito idênticas pela população humana, mas existe uma diversidade considerável nos domínios variáveis. Tal diversidade capacita o desenvolvimento de muitos bilhões de diferentes anticorpos, cada um com uma especificidade para um diferente antígeno alvo.

[81] A diversidade nas regiões variáveis dos anticorpos é gera da de diversas formas. Primeiramente, no nível genético, existe uma diversidade considerável nas seqüências de gene da linhagem germi- nativa variável do anticorpo. Aproximadamente 50 diferentes linhagens germinativas de VH (Tomlinson I.M. et al, J. Mol. Biol., 227, 776-798, 1992 ), 35 diferentes linhagens germinativas de VK (Tomlinson I.M. et al EMBO J, 14, 4628-38, 1995) e 30 diferentes linhagens germinativas de Và (Williams S.C. & Winter G. Eur. J. Immunol, 23, 1456-61, 1993; Kawasaki K. et al Genome Res, 7, 250-61, 1997) foram descritas. Anticorpos são gerados a partir de diferentes combinações dessas se- qüências de gene de linhagem germinativa) Diversidade adicional é, então, introduzida em domínios variáveis de anticorpo por processos tais como a hipermutação e a recombinação somática (Tonegawa S. Nature, 302, 575-81, 1983).

[82] Embora exista uma diversidade considerável nas seqüên- cias de genes da linhagem germinativa variável do anticorpo, é possível agrupar as seqüências em famílias baseando-se na homologia se- qüencial. As 50 diferentes seqüências de genes VH podem ser agrupadas em 7 famílias, as 35 seqüências VK em 6 famílias e as 30 famílias Và em 10 famílias. Os grupos variam de tamanho de um membro (VH6 e Vk4) até 21 membros (VH3) e os membros de cada conjunto compartilham um alto grau de homologia de seqüência.

[83] Anticorpos podem ser alinhados com os bancos de dados da seqüência da linhagem germinativa VH e VL para determinar seu emparelhamento da linhagem germinativa mais próximo e para identificar quaisquer alterações de aminoácidos introduzidas pela hipermu- tação somática. A pesquisa mostrou que o sistema imune humano utiliza algumas linhagens germinativas (por exemplo, VH3 DP47) em preferência a outra (por exemplo, VH2) durante uma resposta imune (Knappik A. et al J. Mol. Biol, 296, 57-86, 2000). Entretanto, as populações de anticorpos isolados por exposição de fago tipicamente utilizam uma ampla faixa de genes de linhagens germinativas, mesmo quando isolados contra um único antígeno (Edwards B. et al J. Mol Biol, 334, 103-118, 2003).

[84] É possível tomar anticorpos monoclonais e outros e usar técnicas de tecnologia de DNA recombinante para produzir outros anticorpos ou moléculas quiméricas, as quais retêm a especificidade do anticorpo original. Tais técnicas podem envolver a junção de DNA que codifica uma região variável de imunoglobulina para uma região constante, ou a introdução das regiões determinantes de complementaridade (CDRs), de um anticorpo na região constante mais as regiões de estrutura, de uma diferente imunoglobulina. Ver, por exemplo, EP-A- 184187, GB 2188638A ou EP-A-239400, e um amplo corpo de literatura subseqüente. Um hibridoma ou outra célula produtora de um anticorpo pode ser submetida à mutação genética ou a outras alterações, as quais podem ou não alterar a especificidade de ligação dos anticorpos produzidos.

[85] Uma vez que os anticorpos podem ser modificados em uma variedade de formas, o termo "molécula de anticorpo" deve ser construído como cobrindo qualquer membro ou substância de ligação específica com um sítio de ligação a antígeno de um anticorpo com a es- pecificidade requerida. Dessa forma, esse termo cobre fragmentos de anticorpo e derivados, incluindo qualquer polipeptídeo compreendendo um domínio de ligação a antígeno, seja natural ou completa ou parcialmente sintético. Moléculas quiméricas compreendendo um domínio de ligação a antígeno de um anticorpo, ou equivalente, fundido com outro polipeptídeo são, conseqüentemente, incluídos. A clonagem e a expressão dos anticorpos quiméricos são descritas na EP-A-0120694 e na EP-A-0125023, e um amplo corpo de literatura subseqüente.

[86] Outras técnicas disponíveis na técnica da engenharia de anticorpos tornou possível isolar os anticorpos humanos e humanizados. Por exemplo, hibridomas humanos podem ser feitos conforme descrito por Kontermann et al. (Kontermann R and Dubel Stefan; Antibody Engineering, Springer-Verlag New York, LLC; 2001, ISBN: 3540413545). A exposição de fago, outra técnica estabelecida para gerar membros de ligação específica, foi descrita em detalhes em muitas publicações tais como Kontermann et al., supra, e W0 92/01047 (discutida adicionalmente abaixo). Camundongos transgênicos nos quais os genes de anticorpo de camundongo são inativados e funcionalmente substituídos com genes de anticorpo humanos enquanto deixam intactos outros componentes do sistema imune de camundongos, podem ser usados para isolar anticorpos humanos para antígenos humanos (Mendez et al., 1997). Anticorpos humanos, sejam monoclo- nais ou policlonais, também podem ser feitos em outros animais trans- gênicos tais como cabras, vacas, ovelhas, coelhos, etc.

[87] Moléculas de anticorpo sintéticas podem ser criadas pela expressão de genes gerados através de oligonucleotídeos sintetizados e montados em vetores de expressão adequados, por exemplo conforme descrito por Knappik et al., supra ou Krebs et al., Journal of Immunological Methods 254 2001 67-84.

[88] Foi mostrado que fragmentos de um anticorpo inteiro po- dem efetuar a função de antígenos ligantes. Exemplos de fragmentos ligantes são (i) o fragmento Fab consistindo nos domínios VL, CL, VH e CHI; (ii) o fragmento Fd consistindo nos domínios VH e CHI; (iii) o fragmento Fv consistindo nos domínios VL e VH de um único anticorpo; (iv) o fragmento dAB (Ward, E.S. et al., Nature 341, 544-546 (1989), McCafferty et al. (1990) Nature, 348, 552-554), o qual consiste em um domínio VH; (v) regiões CDR isoladas; (vi) fragmentos F(ab’)2, um fragmento bivalente compreendendo dois fragmentos Fab ligados (vii) moléculas Fv de cadeia única (scFv), em que um domínio VH e um domínio VL estão ligados por um ligante peptídico o qual permite que os dois domínios se associem para formar um sítio de ligação de antígeno (Bird et al., Science, 242, 423-426, 1988; Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci EUA 85, 5879-5883; 1998 viii) dímeros Fv de cadeia única biespecíficos (PCT/US92/09665) e (ix) "diacorpos", fragmentos multivalentes ou multiespecíficos construídos por fusão de gene (WO/13804); F. Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 90 64446448, 1993). Moléculas de Fv, scFv ou diacorpos podem ser estabilizadas pela incorporação de pontes dissulfeto ligando os domínios VH e VL (Y. Reiter et al., Nature Biotech, 14, 1239-1245, 1996). Minicor- pos compreendendo um scFV junto com um domínio CH3 também podem ser feitos (S. Hu et al., Cancer Res., 56, 3055-3061, 1996).

[89] Um dAB (domínio de anticorpo) é um pequeno fragmento de ligação a antígeno monomérico, a saber, a região variável de uma cadeia pesada ou leve de anticorpo (Holt et al., 2003). VH dABs ocorrem naturalmente em camelídeos (por exemplo, camelo, lhama) e podem ser produzidos pela imunização de um camelídeo com um antí- geno alvo, pelo isolamento de células B antígeno-específicas e pela clonagem de forma direta dos genes dAb a partir de células B individuais. dABs também são produzidos em cultura celular. Seu pequeno tamanho, boa solubilidade e estabilidade de temperatura as tornam particularmente fisiologicamente úteis e adequadas para a seleção e maturação de afinidade. Um membro de ligação específico da presente invenção pode ser um dAb compreendendo um domínio VH ou VL substancialmente conforme estabelecido aqui, ou um domínio VH ou VL compreendendo um conjunto de CDRs substancialmente conforme estabelecido aqui.

[90] Onde os anticorpos biespecíficos são para serem usados, esses podem ser anticorpos biespecíficos convencionais, os quais podem ser produzidos de uma variedade de formas (Holliger, P. e Winter G. Current Opinion Biotechnol. 4, 446-449 (1993)), por exemplo, preparados quimicamente ou a partir de hibridomas híbridos, ou podem ser qualquer um dos fragmentos de anticorpos biespecíficos mencionados acima. Exemplos de anticorpos biespecíficos incluem aqueles da tecnologia BiTE®, na qual os domínios de ligação de dois anticorpos com diferente especificidade podem ser usados e diretamente ligados através de peptídeo flexíveis curtos. Isso combina dois anticorpos em uma única cadeia polipeptídica curta. Diacorpos e scFv podem ser construídos sem uma região Fc, usando somente domínios variáveis, reduzindo potencialmente os efeitos da reação anti-idiotípica.

[91] Diacorpos biespecíficos, ao contrário de anticorpos inteiros biespecíficos, também podem ser particularmente úteis porque eles podem ser prontamente construídos e expressos em E. coli. Diacorpos (e muitos outros polipeptídeos, tais como fragmentos de anticorpos) de especificidades de ligação apropriadas podem ser prontamente selecionados usando a exposição de fago (W094/13804) das bibliotecas. Se um braço do diacorpo é para ser mantido constante, por exemplo, com uma especificidade contra TGFβ, então uma biblioteca pode ser feita onde o outro braço é variado e um anticorpo de especificidade apropriada é selecionado. Anticorpos inteiros biespecíficos podem ser feitos por engenharia de saliências em buracos (C. E. B. Ridgeway et al., Protein Eng., 9, 616-621, 1996).

Sítio de ligação a antígeno

[92] Esse descreve a parte de um membro de ligação específi co, tal como uma molécula de anticorpo, que entra em contato e é complementar a parte ou todo o outro membro no par de ligação, isto é, o antígeno. Em uma molécula de anticorpo, o sítio de ligação a antí- geno pode ser referido como o sítio de ligação a antígeno do anticorpo, e compreende a parte do anticorpo que se liga especificamente a e é complementar a toda ou parte do antígeno alvo. Onde um antígeno é grande, um anticorpo pode somente se ligar a uma parte particular do antígeno, cuja parte é nomeada um epitopo.

Domínio de ligação a antígeno

[93] Um domínio de ligação a antígeno é uma porção de um membro de ligação específico que compreende um sítio de ligação a antígeno e que se liga ao antígeno alvo. Em algumas modalidades, um domínio de ligação a antígeno pode ser fornecido por um ou mais domínios variáveis de anticorpo (por exemplo, um chamado fragmento de anticorpo Fd consistindo em um domínio VH) ou porções de ligação a antígeno da mesmas. Em algumas modalidades, um domínio de ligação a antígeno compreende uma região variável de cadeia leve de anticorpo (VL) e uma região variável de cadeia pesada de anticorpo (VH).

[94] Membros de ligação específicos podem ser glicosilados, seja naturalmente ou por sistemas de várias células eucarióticas (por exemplo, células CHO ou NS0 (ECACC 85110503), ou eles podem ser (por exemplo, se produzidos pela expressão em uma célula procarióti- ca) não-glicosilados. A glicosilação também pode ser intencionalmente alterada, por exemplo pela inibição da fucosilação, para aumentar a atividade da ADCC do anticorpo resultante. Concordantemente, qualquer um dos membros de ligação específicos da invenção pode ser expresso de forma a minimizar ou eliminar a fucosilação.

[95] Em algumas modalidades, o domínio CDR ou VH ou VL da invenção será ou idêntico ou altamente similar às regiões especificadas das quais a seqüência é estabelecida aqui. É contemplado que de 1 a 5, preferivelmente de 1 a 4 ou 1 ou 2, ou 3 ou 4, substituições de aminoácidos podem ser feitas nos domínios CDR e/ou VH ou VL. Domínios VH ou VL e CDRs são conjuntos de CDRs que são altamente similares àqueles para os quais são aqui dadas seqüências são englobados por aspectos da presente invenção, uma vez que são aqueles com seqüências que são substancialmente conforme estabelecidas aqui.

[96] A estrutura para carregar uma CDR ou um conjunto de CDRs da invenção será geralmente de uma seqüência de cadeia pesada ou leve de um anticorpo ou uma porção substancial sua na qual a CDR ou conjunto de CDRs está localizada em um local correspondente à CDR ou conjunto de CDRs de domínios variáveis de anticorpo VH e VL de ocorrência natural codificados por genes de imunoglobuli- na rearranjados. As estruturas e locais dos domínios variáveis de imu- noglobulina podem ser determinados por referência a Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest. 4a edição. US Department of Health and Human Services. 1987, e suas atualizações, agora disponíveis na Internet (http://immuno.bme.nwu.edu ou encontrando "Kabat" usando qualquer ferramenta de busca). CDRs são definidas de acordo com Kabat et al.

[97] CDRs também podem ser carregadas por outras estruturas, tais como fibronectina ou citocromo B.

[98] Preferivelmente, uma seqüência de aminoácidos CDR substancialmente conforme aqui estabelecida é carregada como um CDR em um domínio humano variável ou em uma porção substancial sua. As seqüências de HCDR3 substancialmente conforme estabelecidas aqui representam modalidades preferidas da presente invenção e é preferível que cada uma dessas seja executada como uma HCDR3 em um domínio variável de cadeia pesada humana ou uma porção substancial sua.

[99] Domínios variáveis empregados na invenção podem ser obtidos ou derivados do domínio variável humano rearranjado ou de linhagem germinativa, ou podem ser um domínio variável sintético baseado em consenso ou seqüências eficazes de domínios variáveis humanos conhecidos. Uma seqüência da CDR da invenção (por exemplo, CDR3) pode ser introduzida em um repertório de domínios variáveis sem uma CDR (por exemplo, CDR3), usando tecnologia do DNA recombinante. Estruturas de linhagens germinativas preferidas já foram aqui identificadas.

[100] Por exemplo, Marks et al. (Bio/Technology, 1992, 10:779 783) descreve métodos nos quais iniciadores de consenso direcionados em ou adjacentes à extremidade 5’ da área do domínio variável são usados em conjunto com iniciadores de consenso para a terceira região estrutural de genes VH humanos para fornecer um repertório de domínios variáveis VK sem uma CDR2. Marks et al.descreve ainda como esse repertório pode ser combinado com uma CDR2 de um anticorpo particular. Usando técnicas análogas, as seqüências derivadas da CDR3 da presente invenção podem ser misturadas com repertórios dos domínios VH e VL sem uma CDR3, e os domínios VH ou VL completos misturados combinados com um domínio VL ou VH cognato para fornecer membros de ligação específicos da invenção. O repertório pode dessa forma, ser mostrado em um sistema hospedeiro adequado tal como o sistema de exibição de fagos da WO92/01047 ou qualquer um de um corpo amplo subseqüente da literatura, incluindo Kay, B.K., Winter, J., and McCafferty, J. (1996) Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual, San Diego: Academic Press, de forma que membros de ligação específicos adequados possam ser selecio- nados. Um repertório pode consistir em 104 membros individuais a montante, por exemplo, de 106 até 108 ou 1010 membros. Outros sistemas hospedeiros adequados incluem exibição de levedura, exibição de bactérias, exibição de T7, exibição de ribossoma, exibição covalente e assim por diante.

[101] Técnicas combinatoriais ou de mistura análogas também são reveladas por Stemmer (Nature, 1994, 370:389-391), o qual descreve a técnica em relação a um gene da β-lactamase, mas observa que a tentativa pode ser usada para a geração de anticorpos.

[102] Uma outra alternativa é gerar novas regiões VH ou VL car regando seqüências derivadas de CDR da invenção usando mutagê- nese aleatória de um ou mais genes VH e/ou VL selecionados para gerar mutações no domínio variável inteiro. Tal técnica é descrita por Gram et al. (1992, Proc. Natl. Acad. Sci., EUA, 89:3576-3580), que usou PCR propenso a erro. Em modalidades preferidas, uma ou duas substituições de aminoácidos são feitas em um conjunto de HCDRs e/ou LCDRs.

[103] Outro método o qual pode ser usado é direcionar mutagê- nese para as regiões de CDR dos genes VH ou VL. Tais técnicas são reveladas por Barbas et al., (1994, Proc. Natl. Acad. Sci., EUA, 91:3809-3813) e Schier et al. (1996, J. Mol. Biol. 263:551-567).

[104] Todas as técnicas descritas acima são conhecidas como tais na técnica e nelas mesmas não formam parte da presente invenção. Dada a descrição aqui fornecida, a pessoa versada será capaz de usar tais técnicas para fornecer membros de ligação específicos da invenção usando metodologia rotineira na técnica.

[105] Um outro aspecto da invenção fornece um método de ob tenção de um sítio de ligação a antígeno de um anticorpo específico para o antígeno do TGFβ, o método compreendendo o fornecimento através de adição, anulação, substituição ou inserção de um ou mais aminoácidos na seqüência de aminoácidos de um domínio VH estabelecido aqui, o qual é uma variante da seqüência de aminoácidos do domínio VH, opcionalmente combinando o domínio VH fornecido deste modo com um ou mais domínios VL, e testando o domínio VH ou a combinação ou combinações VH/VL para identificar um membro de ligação específico ou um domínio de ligação a antígeno específico para TGFβ e opcionalmente com uma ou mais propriedades preferidas, preferivelmente a capacidade de neutralizar a atividade do TGFβ. O referido domínio VL pode ter uma seqüência de aminoácidos a qual seja substancialmente conforme estabelecido aqui.

[106] Um método análogo pode ser empregado no qual uma ou mais variantes da seqüência de um domínio VL aqui descrito são combinadas com um ou mais domínios VH.

[107] Em uma modalidade preferida, o domínio VH PET1073G12, PET1074B9 ou PET1287A10 pode ser submetido à mutação para fornecer uma ou mais variantes da seqüência de aminoácidos do domínio VH, as quais podem ser combinadas com um ou mais domínios VL.

[108] Um outro aspecto da invenção fornece um método de pre paro de um membro de ligação específico específico para todas as três isoformas de TGFβ humano, cujo método compreende:

[109] fornecer um repertório de partida de ácidos nucléicos que codificam um domínio VH, o qual ou inclui uma CDR3 para ser substituída ou não têm uma região codificadora da CDR3;

[110] a combinação do referido repertório com um ácido nucléico doador que codifica uma seqüência de aminoácidos substancialmente conforme estabelecida aqui para uma HCDR3, de forma que o referido ácido nucléico doador seja inserido na região CDR3 no repertório, de forma a fornecer um repertório de produto de ácidos nucléicos que codificam um domínio VH;

[111] a expressão dos ácidos nucléicos do referido repertório de produto;

[112] a seleção de um membro de ligação específico específico para pelo menos uma isoforma do TGFβ; e

[113] a recuperação do referido membro de ligação específico ou ácido nucléico que o codifica.

[114] O método pode ainda compreender as etapas de executar ensaios de ligação e ensaios de neutralização com cada uma das três isoformas do TGFβ para identificar membros de ligação específicos que se liguem a ou neutralizem todas as três isoformas.

[115] Novamente, um método análogo pode ser empregado no qual uma LCDR3 da invenção seja combinada com um repertório de ácidos nucléicos que codificam um domínio VL, o qual ou inclui uma CDR3 a ser substituída ou não têm uma região codificadora de CDR3.

[116] Semelhantemente, uma ou mais, ou todas as três CDRs podem ser enxertadas em um repertório de domínios VH ou VL, os quais são, a seguir, varridos para um membro de ligação específico ou membros de ligação específicos para todas as isoformas do TGFβ humano.

[117] O domínio VH pode ter uma seqüência de linhagem germi- nativa, e em modalidades preferidas é DP-10 ou DP-88. Uma seqüên- cia de domínio VL pode ter uma seqüência de linhagem germinativa, e em modalidades preferidas é DPK-22.

[118] Em uma modalidade preferida, um ou mais de PET1073G12, PET1074B9 ou PET1287A10 HCDR1, HCDR2 e HCDR3, ou o conjunto PET1073G12, PET1074B9 ou PET1287A10 de HCDRs podem ser empregados, e/ou um ou mais de PET1073G12, PET1074B9 ou PET1287A10 LCDR1, LCDR2 e LCDR3 , ou o conjunto de PET1073G12, PET1074B9 ou PET1287A10 de LCDRs.

[119] Uma porção substancial de um domínio variável de imuno- globulina irá compreender pelo menos as três regiões CDR, juntamen- te com suas regiões de estrutura interpostas. Preferivelmente, a porção também incluirá pelo menos cerca de 50% de alguma ou de ambas das primeira e quarta regiões de estrutura, os 50% sendo os 50% C-terminais da primeira região de estrutura e os 50% N-terminais da quarta região de estrutura. Resíduos adicionais na extremidade N- terminal ou na C-terminal da parte substancial do domínio variável podem ser aqueles normalmente associados com regiões de domínio variável de ocorrência natural. Por exemplo, a construção de membros de ligação específicos da presente invenção feitos por tecnologias de DNA recombinante pode resultar na introdução dos resíduos N- ou C- terminais codificados por ligantes introduzidos para facilitar a clonagem ou outras etapas de manipulação. Outras etapas de manipulação incluem a introdução de ligantes para juntar domínios variáveis da invenção para seqüências de proteína adicionais, incluindo cadeias pe-sadas de imunoglobulina, outros domínios variáveis (por exemplo na produção de diacorpos) ou marcadores de proteínas, conforme discutido em maiores detalhes aqui em outros lugares.

[120] Embora em um primeiro aspecto da invenção membros de ligação específicos compreendendo um par de domínios VH e VL sejam preferidos, domínios de ligação individuais baseados ou nas se- qüências de domínio VH ou VL formam outros aspectos da invenção. É sabido que domínios de imunoglobulina individuais, especialmente domínios VH, são capazes de se ligar a antígenos alvo de uma forma específica.

[121] No caso de qualquer um dos domínios de ligação específi cos individuais, esses domínios podem ser usados para procurar por domínios complementares capazes de formar um membro de ligação específico de dois domínios capazes de se ligar às três isoformas do TGFβ humano.

[122] Isso pode ser conseguido por métodos de triagem de exibi- ção de fago usando a chamada tentativa combinatorial dual hierárquica conforme descrito na WO92/01047, na qual uma colônia individual contendo ou um clone de cadeia H ou L é usada para infectar uma biblioteca completa de clones que codificam a outra cadeia (L ou H) e o membro de ligação específico de duas cadeias resultante é selecionado de acordo com técnicas de exibição de fago tais como aquelas descritas naquela referência. Essa técnica é também conhecida em Marks et al., ibid.

[123] Membros de ligação específica da presente invenção po dem ainda compreender regiões constantes de anticorpo ou suas partes. Por exemplo, um domínio VL pode estar ligado na sua extremidade C-terminal a domínios constantes da cadeia leve do anticorpo, incluindo cadeias CK ou CÀ humanas, preferivelmente cadeias CK. Semelhantemente, um membro de ligação específico baseado em um domínio VH pode estar ligado na sua extremidade C-terminal a toda ou parte (por exemplo, um domínio CH1) de uma cadeia pesada de imuno- globulina derivada de um isotipo de anticorpo, por exemplo, IgG, IgA, IgE e IgM e qualquer uma das subclasses de isotipo, particularmente IgG1 e IgG4. IgG4 é preferida. IgG4 é preferida por algumas aplicações porque ela não se liga completamente e não cria funções efeto- ras. Onde é desejada a função efetora, IgG1 é preferida. A função efe- tora também pode ser aumentada pela manipulação do estado de gli- cosilação do anticorpo, tal como pelo decréscimo do conteúdo de fucose, por métodos os quais são conhecidos na técnica. A cadeia pesada pode ou não ter um resíduo de lisina C-terminal. Qualquer variante da região constante sintética ou outra que tenha essas propriedades e estabilize regiões variáveis também é preferida para uso em modalidades da presente invenção.

[124] Também na invenção estão preparações heterogêneas dos membros de ligação específicos ou de seus fragmentos de ligação a antígeno aqui revelados. Por exemplo, tais preparações podem ser misturas de anticorpos com cadeias pesadas de comprimento completo sem a lisina C-terminal, com vários graus de glicosilação, com ami- noácidos derivatizados, tais como ciclização de um ácido glutâmico N- terminal para formar um resíduo de ácido piroglutâmico e/ou com formas desamidadas da cadeia pesada e ou leve.

[125] Membros de ligação específicos da invenção podem ser marcados com um marcador detectável ou funcional. Marcadores de- tectáveis incluem radiomarcadores tais como 131I ou 99TC, os quais podem estar ligados a anticorpos da invenção usando química convencional conhecida na técnica da visualização de anticorpos. Marcadores também incluem marcadores de enzimas, tais como peroxidase de rábano silvestre. Marcadores ainda incluem porções químicas, tais como biotina, as quais podem ser detectadas através da ligação a uma porção detectável cognata específica, por exemplo, avidina marcada.

[126] Membros de ligação específicos da presente invenção são projetados para serem usados nos métodos de diagnose ou no tratamento em indivíduos humanos ou animais, preferivelmente em seres humanos.

[127] Em algumas modalidades, membros de ligação específica da invenção inibem a ligação do TGFβl, 2 e/ou 3 a um receptor de TGFβ da superfície celular ou a um complexo receptor, incluindo, mas sem se limitar, a um complexo compreendendo o receptor da seri- na/treonina quinase do tipo I ou do tipo II e proteoglicana beta-glicana (receptor de TGFβ do tipo III). Concordantemente, a invenção compreende um método para inibir a ligação do TGFβ a um receptor de TGFβ da superfície celular ou a um complexo receptor compreendendo a etapa de colocar em contato o TGFβ com um membro de ligação específico da invenção e de detectar a inibição da ligação ao receptor ou ao complexo receptor. Em várias modalidades, a inibição da ligação do TGFβ ao seu(s) receptor(es) pode ser indicada pela fosforilação reduzida do receptor de TGFβ do tipo I, pela ativação reduzida do receptor de TGFβ do tipo I, pela fosforilação reduzida de e/ou pela ativação das proteínas R-SMAD, particularmente SMAD2 e SMAD3, pela transloca- ção reduzida das referidas proteínas SMAD para o núcleo, pela ligação da proteína SMAD reduzida ao DNA e/ou pela modulação da expressão de um gene cuja expressão na referida célula ou tipo celular é conhecida por ser mediada pela sinalização do TGFβ. Outros ensaios são estabelecidos nos exemplos.

[128] Concordantemente, outros aspectos da invenção fornecem métodos de tratamento compreendendo a administração de um membro de ligação específico conforme fornecido, composições farmacêuticas compreendendo um membro de ligação específico e o uso de tal membro de ligação específico na fabricação de um medicamento para administração, por exemplo em um método de fazer um medicamento ou composição farmacêutica compreendendo a formulação do membro de ligação específico com um excipiente farmaceuticamente aceitável.

[129] Membros de ligação específicas da invenção podem ser administrados por injeção (por exemplo, subcutânea, intravenosa, in- tracavidade (por exemplo, após a resseção do tumor), intralesional, intraperitoneal ou intramuscular), por inalação, ou topicamente (por exemplo, intraocular, intranasal, retal, em ferimentos ou na pele) ou oralmente. A via de administração pode ser determinada pelas características físico-químicas do produto, por considerações especiais para a doença, por dose ou intervalo de dose ou pelo requerimento de otimizar a eficácia ou de minimizar os efeitos colaterais.

[130] É considerado que o tratamento anti-TGFβ não será restrito à administração por profissionais da saúde. Conseqüentemente, a injeção subcutânea, especialmente usando um dispositivo livre de agulha pode ser apropriada.

[131] De acordo com a presente invenção, composições forneci das podem ser administradas a indivíduos necessitados disso. A ad-ministração está preferivelmente em uma "quantidade terapeuticamen- te eficaz", isso sendo suficiente para mostrar benefício a um paciente. Tal benefício pode ser pelo menos a melhora de pelo menos um sintoma de uma doença ou distúrbio particular. A quantidade eficaz administrada, e a taxa e curso de tempo da administração, irá depender da natureza e severidade da doença a ser tratada.

[132] A prescrição do tratamento, por exemplo, decisões de do sagem, etc., pode ser determinada baseando-se em estudos pré- clínicos e clínicos, o projeto do qual está bem dentro do nível dos versados na técnica.

[133] A dose precisa irá depender de uma quantidade de fatores, incluindo se o anticorpo é para o diagnóstico ou para o tratamento, o tamanho e local da área a ser tratada, a natureza precisa do anticorpo (por exemplo, anticorpo inteiro, fragmento ou diacorpo), e da natureza de qualquer marcador detectável ou outra molécula ligada ao anticorpo. Uma dose de anticorpo típica estará na faixa de 100 μg até 1 mg para aplicações sistêmicas, e de 1 μg até 1 mg para aplicações tópicas. Tipicamente, o anticorpo será um anticorpo inteiro, preferivelmente o isotipo IgG4. Essa é uma dose para um único tratamento de um paciente adulto, a qual pode ser proporcionalmente ajustada para crianças ou crianças nos primeiros anos de vida, e também ajustada para outros formatos de anticorpo na proporção para o peso molecular e a atividade. Tratamentos podem ser repetidos diariamente, duas vezes por semana, semanalmente, mensalmente ou em outros intervalos, no discernimento do clínico. Em modalidades preferidas da presente invenção, o tratamento é periódico, e o período entre as administrações é de cerca de duas semanas ou mais, preferivelmente de cerca de três semanas ou mais, mais preferivelmente de cerca de quatro semanas ou mais, ou de cerca de uma vez por mês.

[134] Membros de ligação específica da presente invenção serão usualmente administrados na forma de uma composição farmacêutica, a qual pode compreender pelo menos um componente além do membro de ligação específico.

[135] Conseqüentemente, composições farmacêuticas de acordo com a presente invenção, e para uso de acordo com a presente invenção, podem compreender, além do ingrediente ativo, um excipiente, veículo, tampão, estabilizante ou outros materiais farmaceuticamente aceitáveis bem-conhecidos pelos indivíduos versados na técnica. Tais materiais devem ser não-tóxicos e não devem interferir com a eficácia do ingrediente ativo. Tais materiais poderiam incluir, por exemplo qualquer um e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes de retardo de absorção e isotônicos e similares que sejam fisiologicamente compatíveis. Alguns exemplos de veículos farmaceuticamente aceitáveis são água, solução salina, solução salina tamponada com fosfato, dextrose, glice- rol, etanol e similares, assim como suas combinações. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, poliálcoois tais como manitol, sorbitol ou cloreto de sódio na composição. Exemplos adicionais de substâncias farmaceuticamente aceitáveis são agentes umidificantes ou quantidades menores de substâncias auxiliares, tais como agentes umidificantes ou emulsificantes, conservantes ou tampões, os quais aumentam a vida de prateleira ou a eficácia do anticorpo. A natureza precisa do veículo ou outro material irá depender da via de administração, a qual pode ser oral, tópica, por inalação ou por injeção, por exemplo, intravenosa. Em uma modalidade preferida, o anticorpo é administrado por infusão ou injeção intravenosa. Em outra modalidade preferida, o anticorpo é administrado por injeção intramuscular ou subcutânea.

[136] Composições farmacêuticas para administração oral podem estar na forma de comprimido, cápsula, pó ou líquida, por exemplo, com um diluente inerte ou com um veículo comestível assimilável. Um comprimido pode compreender um veículo sólido tal como gelatina ou um adjuvante. Composições farmacêuticas líquidas compreendem um veículo líquido tal como água, petróleo, óleos animais ou vegetais, óleo mineral ou óleo sintético. Solução salina fisiológica, solução de dextrose ou outro sacarídeo ou glicóis, tais como etilenoglicol, propile- noglicol ou polietilenoglicol podem ser incluídas. O membro de ligação específico (e outros ingredientes, caso desejado) também pode ser englobado em uma cápsula de gelatina de camada dura ou mole, comprimido em comprimidos ou incorporado diretamente na dieta do indivíduo. Para administração terapêutica oral, o ingrediente ativo pode ser incorporado com excipientes e usado na forma de comprimidos ingeríveis, comprimidos bucais, trociscos, cápsulas, elixires, suspensões, xaropes, wafers, e similares. Para administrar um composto da invenção por outra via que não seja a administração parenteral, pode ser necessário revestir o composto com, ou co-administrar o composto com um material para prevenir a sua inativação.

[137] Para injeção intravenosa, ou injeção no sítio de aflição, o in grediente ativo estará na forma de uma solução aquosa parenteralmente aceitável, a qual é livre de pirogênio e tem um pK, isotonicidade e estabilidade adequados. Aqueles indivíduos versados na técnica são bem- capazes de preparar soluções adequadas usando, por exemplo, veículos isotônicos tais como Injeção de Cloreto de Sódio, Injeção de Ringer, Injeção de Ringer Lactado. Conservantes, estabilizantes, tampões, antioxi- dantes e/ou outros aditivos podem ser incluídos, conforme necessário.

[138] Uma composição pode ser administrada sozinha ou junta mente com outros tratamentos, seja simultânea ou seqüencialmente dependente da condição a ser tratada.

[139] Membros de ligação específicos da presente invenção po dem ser formulados nas formas líquida, semi-sólida ou sólida, tais como soluções líquidas (por exemplo, soluções injetáveis ou infusíveis), dispersões ou suspensões, comprimidos, pílulas, pós, lipossomas e supositórios. A forma preferida depende do modo tencionado de administração, da aplicação terapêutica, das propriedades físico-químicas da molécula e da via de distribuição. As formulações podem incluir ex- cipientes, ou combinações de excipientes, por exemplo: açúcares, aminoácidos e tensoativos. Formulações líquidas podem incluir uma ampla faixa de concentrações de anticorpo e de pH. Formulações sólidas podem ser produzidas por liofilização, atomização ou secagem por tecnologia de fluido supercrítico, por exemplo.

[140] Composições terapêuticas tipicamente devem ser estéreis e estáveis sob as condições de produção e estocagem. A composição pode ser formulada como uma solução, microemulsão, dispersão, li- possoma ou outra estrutura ordenada adequada para alta concentração de fármaco. Soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas pela incorporação do membro de ligação específico na quantidade requerida em um solvente apropriado com um ou uma combinação de ingredientes enumerados acima, conforme requerido, seguido pela esterilização filtrante. Geralmente, dispersões são preparadas pela incorporação do composto ativo em um veículo estéril que contém um meio de dispersão básico e os outros ingredientes requeridos a partir daqueles enumerados acima. No caso de pós estéreis para o preparo de soluções injetáveis estéreis, os métodos preferidos de preparação são secagem a vácuo e liofilização, que produzem um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente desejado adicional a partir de uma solução previamente filtrada estéril sua. A fluidez própria de uma solução pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento tal como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula requerido no caso de dispersão e pelo uso de tensoativos. A absorção prolongada de composições injetáveis pode ser efetuada pela inclusão na composição de um agente que retarde a absorção, por exemplo, sais de mo- noestearato e gelatina.

[141] Em certas modalidades, o composto ativo das composições de anticorpo pode ser preparado com um veículo que irá proteger o anticorpo contra a rápida liberação, tal como uma formulação de liberação controlada, incluindo implantes, remendos transdérmicos e sistemas de distribuição microencapsulados. Polímeros biodegradáveis, biocompatíveis podem ser usados, tais como vinilacetato de etileno, polianidridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres e ácido poli- lático. Muitos métodos para a preparação de tais formulações são patenteados ou geralmente conhecidos pelos indivíduos versados na técnica. Ver, por exemplo, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems (J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978).

[142] A presente invenção fornece um método compreendendo a causa ou a permissão da ligação de um membro de ligação específico conforme fornecido aqui para o TGFβ. Conforme notado, tal ligação pode ocorrer in vivo, por exemplo, após a administração de um membro de ligação específico, ou de um ácido nucléico que codifica um membro de ligação específico, a um paciente ou ela pode ocorrer in vitro, por exemplo no ELISA, Western blotting, imunocitoquímica, imu- noprecipitação, cromatografia de afinidade ou ensaios baseados em células, ou em métodos terapêuticos baseados em ex vivo (por exemplo, métodos nos quais células ou fluidos corporais entram em contato ex vivo com um membro de ligação específico de acordo com a invenção e, a seguir, é administrado a um paciente.

[143] A quantidade de ligação de um membro de ligação especí fico ao TGFβ pode ser determinada. A quantificação pode ser relacio- nada com a quantidade de antígeno em uma amostra de teste, a qual pode ser de interesse diagnóstico.

[144] Um kit compreendendo um membro de ligação específico ou molécula de anticorpo de acordo com qualquer aspecto da modalidade da presente invenção também é fornecido como um aspecto da presente invenção. Em um kit da invenção, o membro de ligação específico ou molécula de anticorpo de ser marcado para permitir a sua reatividade em uma amostra a ser determinada, por exemplo, conforme descrito adicionalmente abaixo. Os componentes de um kit são geralmente estéreis e em frascos fechados ou outros recipientes. Kits podem ser empregados em análise diagnóstica ou outros métodos para os quais moléculas de anticorpo são úteis. Um kit pode conter instruções para uso dos componentes em um método, por exemplo, um método de acordo com a presente invenção. Materiais auxiliares para ajudar na ou possibilitar a execução de tal método podem ser incluídos em um kit da invenção.

[145] A reatividade dos anticorpos em uma amostra pode ser de terminada por quaisquer formas apropriadas. O radioimunoensaio (RIA) é uma possibilidade. O antígeno radioativo marcado é misturado com antígeno não-marcado (a amostra de teste) e deixado e ligar ao anticorpo. A ligação ao antígeno é fisicamente separada a partir de antígeno não-ligado e a quantidade de antígeno radioativo ligado ao anticorpo determinado. Quanto mais antígeno houver na amostra do teste, menos antígeno radioativo se ligará ao anticorpo. Um ensaio de ligação competitivo também pode ser usado com antígeno não- radioativo, usando um antígeno ou um análogo ligado a uma molécula repórter. A molécula repórter pode ser um fluorcromo, fósforo ou corante de laser com absorção espectralmente isolada ou características de emissão. Fluorcromos adequados incluem fluoresceína, rodamina, ficoeritrina e Vermelho Texas. Corantes cromogênicos adequados in- cluem diaminobenzidina.

[146] Outros repórteres incluem partículas coloidais macromole- culares ou material particulado, tais como contas de látex que sejam coloridas, magnéticas ou paramagnéticas, e agentes biologicamente ou quimicamente ativos que possam direta ou indiretamente causar sinais detectáveis para serem visualmente observados, eletronicamente detectados ou registrados de outra forma. Essas moléculas podem ser enzimas as quais catalisam reações que desenvolvem ou causam alterações nas propriedades elétricas, por exemplo. Elas podem ser molecularmente excitáveis, tais como transições eletrônicas entre estados de energia em absorções ou emissões espectrais características. Elas podem incluir entidades químicas usadas juntamente com biossensores. Biotina/avidina ou biotina/estreptavidina e sistemas de detecção da fosfatase alcalina podem ser empregados. Os sinais gerados por conjugados anticorpo-repórter individuais podem ser usados para derivar dados absolutos ou relativos quantificáveis da ligação do anticorpo relevante em amostras (normal e teste).

[147] A presente invenção também fornece o uso de um membro de ligação específico conforme acima para medir os níveis de antígeno em um ensaio de competição, a saber, um método de medição do nível de antígeno em uma amostra pelo emprego de um membro de ligação específico conforme fornecido pela presente invenção em um ensaio de competição. Isso pode ser onde a separação física do antí- geno ligado do não-ligado não é requerida. A ligação de uma molécula repórter ao membro de ligação específico de forma que ocorra uma alteração física ou ótica na ligação é uma possibilidade. A molécula repórter pode gerar direta ou indiretamente sinais detectáveis, e preferivelmente mensuráveis. A ligação das moléculas repórteres pode ser direta ou indiretamente, covalentemente, por exemplo, através de uma ligação peptídica ou não-covalentemente. A ligação através de uma ligação peptídica pode ser como um resultado da expressão recombi- nante de um anticorpo que codifica um gene de fusão e uma molécula repórter.

[148] A presente invenção também proporciona a medição de níveis de antígeno diretamente, pelo emprego de um membro de ligação específico de acordo com a invenção, por exemplo, em um sistema de biossensor.

[149] O modo de determinação da ligação não é uma caracterís tica da presente invenção e os indivíduos versados na técnica são capazes de escolher um modo adequado de acordo com as suas preferências e conhecimentos gerais.

[150] Conforme notado, em vários aspectos e modalidades, a presente invenção se estende a um membro de ligação específico humano, humanizado, quimérico ou sintético o qual compete pela ligação ao TGFβ (TGFβl, 2 e/ou 3) com qualquer membro de ligação específico aqui definido, por exemplo, IgG4 de PET1037GR, PET1074B9 ou PET1287A10. A competição ou a competição cruzada entre os membros de ligação pode ser avaliada facilmente in vitro, por exemplo, pela marcação de uma molécula repórter específica com um membro de ligação, o qual pode ser detectado na presença de outro(s) mem- bro(s) de ligação não-marcado(s), para capacitar a identificação dos mesmos membros de ligação específicos os quais se ligam ao mesmo epitopo ou a um epitopo sobreponível

[151] A competição pode ser determinada, por exemplo, usando ELISA, no qual TGFβ é imobilizado a uma placa e a um primeiro membro de ligação marcado (o membro de ligação de referência) juntamente com um ou mais outros membros de ligação não-marcados é adicionado à placa. A presença de um membro de ligação não-marcado que compete com o membro de ligação marcado é observado por um decréscimo no sinal emitido pelo membro de ligação marcado.

[152] No teste para a competição um fragmento peptídico do an- tígeno pode ser empregado, especialmente um peptídeo incluindo um epitopo de interesse. Um peptídeo com a seqüência de epitopo, mais um ou mais aminoácidos em qualquer extremidade pode ser usado. Tal peptídeo pode ser dito como "consistindo essencialmente" na se- qüência especificada. Os membros de ligação específicos de acordo com a presente invenção podem ser tais que sua ligação pelo antíge- no seja inibida por um peptídeo com ou incluindo a dada seqüência. Na testagem disso, um peptídeo com qualquer seqüência mais um ou mais aminoácidos pode ser usado.

[153] Membros de ligação específicos os quais se ligam a um peptídeo específico podem ser isolados, por exemplo, a partir de uma biblioteca de exibição de fagos pela concentração por agitação com o(s) peptídeo(s).

[154] A presente invenção fornece ainda um ácido nucléico isola do que codifica um membro de ligação específico da presente invenção. O ácido nucléico pode incluir DNA e/ou RNA. Em um aspecto preferido, a presente invenção fornece um ácido nucléico o qual codifica uma CDR ou um conjunto de CDRs ou sítio de ligação a antígeno de anticorpo ou domínio VH ou domínio VL ou molécula de anticorpo, por exemplo, scFv ou IgG4, da invenção conforme definido acima.

[155] A presente invenção também fornece constructos na forma de plasmídeos, vetores, cassetes de transcrição ou expressão, os quais compreendem pelo menos um polinucleotídeo como acima.

[156] A presente invenção também fornece uma célula hospedei ra recombinante a qual compreende um ou mais constructos conforme acima. Um ácido nucléico que codifica qualquer CDR ou conjunto de CDRs ou domínio VH ou domínio VL ou sítio de ligação a antígeno ou molécula de anticorpo, por exemplo, scFv ou IgG4 conforme fornecido, forma por si só um aspecto da presente invenção, como faz o método de produção do produto codificado, cujo método compreende a expressão do ácido nucléico codificante para isso. A expressão pode ser convenientemente alcançada pelo cultivo sob condições apropriadas de células hospedeiras recombinantes contendo o ácido nucléico. Após a produção pela expressão de um domínio VH ou VL, ou um membro de ligação específico pode ser isolado e/ou purificado usando qualquer técnica adequada, a seguir usado conforme apropriado.

[157] Membros de ligação específicos, domínios VH e/ou VL e vetores e moléculas de ácido nucléico codifcantes de acordo com a presente invenção podem ser fornecidas isoladas e/ou purificadas, por exemplo, a partir de seu ambiente natural, na forma substancialmente pura ou homogênea, no caso de um ácido nucléico, livre ou substancialmente livre de ácido nucléico ou de genes de origem diferente da seqüência codificante de um polipeptídeo com a função requerida. O ácido nucléico de acordo com a presente invenção pode compreender DNA ou RNA e pode ser completa ou parcialmente sintético. Referência a uma seqüência de nucleotídeos conforme aqui estabelecida engloba uma molécula de DNA com a seqüência especificada, e engloba uma molécula de RNA com a seqüência especificada na qual U é substituído por T, a não ser que o contexto exija uma outra coisa.

[158] Sistemas para a clonagem e expressão de um polipeptídeo em uma variedade de diferentes células hospedeiras são bem- conhecidos. Células hospedeiras adequadas incluem bactérias, células de mamíferos, células vegetais, células de inseto, fungos, leveduras e plantas e animais transgênicos. Linhagens de células de mamíferos disponíveis na técnica para a expressão de um polipeptídeo hete- rólogo incluem células de ovário de hâmster chinês (CHO), células HeLa, células de rim de hâmster filhote, células de melanoma de camundongo NS0, células de mieloma de rato YB2/0, células de rim embrionário humano, células da retina embrionária humana e muitas ou- tras. Um hospedeiro bacteriano comum e preferido é a E. coli.

[159] A expressão dos anticorpos e dos fragmentos de anticorpo nas células procarióticas, tais como E. coli, é bem-estabelecida na técnica. Para uma revisão, ver, por exemplo, Plückthun, A. Bio/Technology 9: 545-551 (1991). A expressão em células eucarióti- cas em cultura é também disponível para os indivíduos versados na técnica como uma opção para a produção de um membro de ligação específico, por exemplo, Chadd HE e Chamow SM (2001) 110 Current Opinion in Biotechnology 12: 188-194, Andersen DC and Krummen L (2002) Current Opinion in Biotechnology 13: 117, Larrick JW and Thomas DW (2001) Current Opinion in Biotechnology 12:411-418.

[160] Vetores adequados podem ser escolhidos ou construídos, contendo seqüências regulatórias apropriadas, incluindo seqüências de promotoras, seqüências terminadoras, seqüências de poliadenila- ção, seqüências intensificadoras, genes marcadores e outras seqüên- cias conforme apropriado. Vetores podem ser plasmídeos, virais, por exemplo, ‘fago, ou fagemídeos, ou adenovirais, AAV, lentivirais, etc. conforme apropriado. Para maiores detalhes ver, por exemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a edição, Sambrook and Russell, 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Muitas técnicas e protocolos conhecidos para a manipulação do ácido nucléico, por exemplo no preparo de constructos de ácido nucléico, mutagênese, seqüencia- mento, introdução de DNA em células e expressão gênica, e análise de proteínas, estão descritas em detalhes no Current Protocols in Molecular Biology, Segunda Edição, Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons, 1986, Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons, 4a edição 1999. As descobertas de Sambro- ok et al. e Ausubel et al. (ambas)são aqui incorporadas por referência.

[161] Dessa forma, um outro aspecto da presente invenção for- nece uma célula hospedeira contendo ácido nucléico conforme aqui descrito. Tal célula hospedeira pode estar in vitro e pode estar em cultura. Tal célula hospedeira pode estar in vivo. A presença in vivo da célula hospedeira pode permitir a expressão intracelular dos membros de ligação específicos da presente invenção como "intracorpos" ou anticorpos intracelulares. Intracorpos podem ser usados para a terapia gênica (Marasco WA (1997) Gene Therapy, 4(1): 11).

[162] Ainda um outro aspecto fornece um método compreenden do a introdução de tal ácido nucléico em uma célula hospedeira. A introdução pode empregar qualquer técnica disponível. Para células eu- carióticas, técnicas adequadas podem incluir a transfecção de fosfato de cálcio, DEAE-Dextrano, eletroporação, transfecção mediada por lipossomo e transdução usando retrovírus ou outros vírus, por exemplo, vaccinia ou, para células de inseto, baculovírus. A introdução de ácido nucléico na célula hospedeira, particularmente em uma célula eucariótica pode usar um sistema baseado em viral ou em plasmídeo. O sistema de plasmídeo pode ser mantido epissomalmente ou pode ser incorporado na célula hospedeira ou em um cromossomo artificial (Csonka E et al. (2000) Journal of Cell Science, 113: 3207-3216; Van- derbyl S et al. (2002) Molecular Therapy, 5(5: 10. A incorporação pode ser por integração aleatorizada ou alvejada de uma ou mais cópias em um único ou em múltiplos locais. Para células bacterianas, técnicas adequadas podem incluir a transformação com cloreto de cálcio, ele- troporação e transfecção usando bacteriófagos.

[163] A introdução pode ser seguida pela causa ou permissão da expressão do ácido nucléico, por exemplo, pelo cultivo de células hospedeiras sob condições para a expressão do gene.

[164] Em uma modalidade, o ácido nucléico da invenção está in tegrado no genoma (por exemplo, cromossomo) da célula hospedeira. A integração pode ser promovida pela inclusão das seqüências as quais promovem a recombinação com o genoma, de acordo com técnicas padronizadas.

[165] A presente invenção também fornece um método o qual compreende o uso de um constructo conforme estabelecido acima em um sistema de expressão para exprimir um membro de ligação específico ou polipeptídeo conforme acima.

[166] As moléculas de ácido nucléico da presente invenção po dem ser administradas a um paciente necessitado disso através de terapia gênica. A terapia pode ser ou in vivo ou ex vivo. Em uma modalidade preferida, as moléculas de ácido nucléico que codificam tanto uma cadeia leve quanto um cadeia pesada são administradas a um paciente. Em uma modalidade mais preferida, as moléculas de ácido nucléico são administradas de forma que elas sejam estavelmente integradas nos cromossomos das células B porque essas células são especializadas para produzir anticorpos. Em uma modalidade preferida, as células B precursoras são transfectadas ou infectadas ex vivo e retransplantadas em um paciente necessitado disso. Em outra modalidade, as células B precursoras ou outras células são infectadas in vivo usando um vírus conhecido por infectar o tipo celular de interesse. Ve-tores típicos usados para a terapia gênica incluem lipossomas, plas- mídeos e vetores virais. Vetores virais exemplares são retrovírus, ade- novírus e vírus adenoassociados. Depois da infecção ou in vivo ou ex vivo, os níveis de expressão de anticorpo podem ser monitorados tomando uma amostra do paciente tratado e usando qualquer imunoen- saio conhecido na técnica ou aqui discutido. Métodos de uso de um anticorpo anti-TGFβ em uma terapia gênica são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, a Patente Americana 5.824.655 (Border), a qual é aqui incorporada por referência na sua totalidade.

[167] Em uma modalidade preferida, o método da terapia gênica compreende as etapas de administração de uma molécula de ácido nucléica isolado que codifica uma cadeia pesada ou uma porção de ligação a antígeno da mesma de um anticorpo anti-TGFβ e expressando a molécula de ácido nucléico. Em outra modalidade, o método da terapia gênica compreende as etapas de administrar uma molécula de ácido nucléico isolada que codifica a cadeia leve ou uma porção de ligação a antígeno da mesma de um anticorpo anti-TGFβ e a expres-são da molécula do ácido nucléico. Em um método mais preferido, o método da terapia gênica compreende as etapas de administração de uma molécula de ácido nucléico isolada que codifica a cadeia pesada ou uma porção de ligação a antígeno da mesma e uma molécula de ácido nucléico isolada que codifica a cadeia leve ou a porção de ligação a antígeno da mesma de um anticorpo anti-TGFβ da invenção e a expressão das moléculas de ácido nucléico.

[168] A correção da dose pelas espécies geralmente requer um ajuste para somente o peso corporal, se o agente ativo é um anticorpo agindo em ou próximo do sistema vascular. Doses eficazes dos anticorpos da invenção foram de 0,5 - 5 mg/Kg em ratos e camundongos no ajuste agudo. Conseqüentemente, para dosagem por longos períodos, 0,3 - 10 mg/Kg administrados na metade da vida (estimada como sendo na região de 21 dias em seres humanos) é considerada plausível. Doses preferidas são suficientes quanto à eficácia, mas baixas o suficiente para facilitar a administração ótima. Por exemplo, uma dose de menos de 50 mg facilita a administração subcutânea. A administração intravenosa é preferível em testes clínicos iniciais e pode ser usada como a via de distribuição para doenças severas se a dose for alta e se o intervalo de dosagem for longo. A injeção subcutânea é geralmente mais conveniente do que a distribuição intravenosa, porque ela permite a auto-administração. Entretanto, a injeção subcutânea tem o potencial de aumentar qualquer resposta imune ao produto. A administração local para a doença localizada pode minimizar a quantidade de produto necessária e maximizar a concentração no local de ação. Uma vantagem de segurança significativa (janela terapêutica) pode ser conferida por administração local, evitando quaisquer efeitos colaterais crônicos que possam se desenvolver a partir da administração sistêmica crônica.

[169] Outros aspectos e modalidades da presente invenção serão aparentes para os indivíduos versados na técnica à luz da presente descoberta, incluindo a seguinte exemplificação experimental. Todos os documentos referidos em qualquer lugar nesse relatório descritivo são incorporados por referência.

EXEMPLO 1 Geração de ScFvs anti-TGFβ Bibliotecas de anticorpo ScFv virgem

[170] Uma grande biblioteca de anticorpo humano de cadeia indi vidual Fv (scFv) derivada dos linfócitos do baço a partir de 20 doadores e clonados em um vetor fagemida (Hutchings et al., 2001) foi usada para seleções.

Bibliotecas de seleção guiadas de ScFv

[171] Uma biblioteca VL VH-humana 1D11.16 foi construída e usada para selecionar anticorpos quiméricos de camundongo-humano com as propriedades de ligação desejadas. As cadeias leves humanas desses anticorpos quiméricos foram, a seguir, clonadas em bibliotecas aceptoras VH (1D11 CDR3) - VL humanas e VH-VL humanas. Essas bibliotecas foram triadas para anticorpos humanos com as propriedades de ligação desejadas.

Seleção de bibliotecas de fago ScFv

[172] TGFβ1 e TGFβ2 humano recombinante foram fornecidos por Genzyme Corp. (Framingham, MA) e o TGFβ3 foi comprado da R&D Systems.

[173] ScFvs, os quais reconheceram o TGFβ foram isolados das bibliotecas de seleção guiadas de scFv após uma série de ciclos de seleção repetidos no TGFβ humano recombinante, essencialmente conforme descrito em Vaughan et al. (1996). Resumidamente, após a incubação com a biblioteca, o antígeno imobilizado, o qual foi pré- acoplado com contas paramagnéticas, e fago ligado foram recuperados por separação magnética, enquanto que os fagos não-ligados foram removidos por lavagem. O fago ligado foi, a seguir, resgatado conforme descrito por Vaughan et al. (1996) e o processo de seleção foi repetido.

[174] As seleções foram efetuadas usando TGFβ1, TGFβ2 ou TGFβ3 acoplado com amina Dynabeads M-270 (Dynal) de acordo com as recomendações do fabricante. Alternativamente, as seleções usaram TGFβ1 ou TGFβ2 biotinilado preparado usando o reagente específico de amina primária succinimidil-6-(biotinanido)hexanoato seguindo as instruções do fabricante (EZ link NHS LC Biotin, Pierce).

[175] Os produtos das seleções foram testados como prepara ções periplásmicas em varreduras de alta produção baseando-se em ensaios de competição os quais mediram a capacidade dos scFvs presentes na preparação periplásmica de competir com 1D11.16 ou com o receptor solúvel do TGFβ humano recombinante II-Fc quimaera (sRII, R&D Systems) para ligação ao TGFβ.

[176] Amostras que competiram com 1D11.16 ou sRII nas varre duras de alta produtividade foram submetidas ao seqüenciamento de DNA conforme descrito em Vaughan et al. (1996) e em Osbourn et al. (1996). Os clones foram expressos e purificados como scFvs ou como IgGs e avaliados quanto à sua capacidade de neutralizar TGFβs nos ensaios de MLEC e /ou de NHLF conforme descrito nos Exemplos 4 e 5, respectivamente. Preparações de scFv purificadas foram preparadas conforme descrito no Exemplo 3 da WO 01/66754. As concentrações de proteínas de preparações scFv purificadas foram determina- das usando o método BCA (Pierce). Preparações de IgG purificadas foram preparadas conforme descrito abaixo no Exemplo 3.

EXEMPLO 2 Otimização de scFvs anti-TGFβ

[177] A ligação de ScFvs e a neutralização do TGFβ foram gera das conforme descrito no Exemplo 1. As potências de neutralização desses anticorpos foram aumentadas no TGFβ1 e/ou no TGFβ2 e/ou no TGFβ3 usando mutagênese de DNA e/ou técnicas combinatoriais. Anticorpos com potências significativamente aumentadas no TGFβ1 e/ou no TGFβ2 e/ou no TGFβ3 foram geradas pela seleção e varredura das bibliotecas de anticorpo de fago essencialmente conforme descrito no Exemplo 1. Os scFvs gerados foram comparados com 1D11.16 no ensaio de proliferação MLEC.

[178] Linhagens germinativas particulares foram descobertas como sendo altamente representadas dentre a população de alta potência, scFvs neutralizantes de TGF-β. Essas foram DP-10/1-69 e DP- 88/1-e (ambos os membros da família de linhagem germinativa VH1) para a cadeia pesada, e DPK22/A27 (família VK3) para a cadeia leve. Essas linhagens germinativas aparentam fornecer um esqueleto estrutural particularmente adequado para anticorpos pan-neutralizantes de TGFβ de alta potência. Isso não foi previsto, uma vez que o segmento do gene 1D11.16 VH está mais próximo da linhagem germinativa humana DP-7 e o segmento do gene 1D11.16 VL está mais próximo da linhagem germinativa humana L16.

[179] scFvs PET1073G12, PET1074B9 e PET1287A10 mostra ram potências se aproximando ou excedendo aquelas do 1D11.16 em todas as três isoformas TGFβ no ensaio de proliferação MLEC.

[180] As seqüências de aminoácidos derivadas dos segmentos de gene VH e VL de PET1073G12, PET1074B9 e PET1287A10 foram alinhadas com as seqüências da linhagem germinativa humana co- nhecida no banco de dados VBASE (Tomlinson et al., 1997) e a linhagem germinativa humana mais próxima foi identificada pela similaridade de seqüência. O gene da linhagem germinativa humana mais próximo para o segmento de gene VH do PET1073G12 and PET1074B9 foi identificado como DP-10/1-69 (família da linhagem germinativa VH1) e o gene da linhagem germinativa humana mais próximo para o segmento do gene VH do PET1287A10 foi identificado como DP-88/1- e (família de linhagem germinativa VH1). O gene da linhagem germi- nativa humano mais próximo para o segmento do gene VL do PET1073G12, PET1074B9 e PET1287A10 foi identificado como DPK22/A27 (família da linhagem germinativa VK3). Mutagênese direcionada a sítio foi usada para alterar os resíduos da estrutura que diferiram da linhagem germinativa em relação ao resíduo da linhagem ger- minativa, com a condição de que tais alterações não produziram uma perda de potência no ensaio de proliferação MLEC de mais de três vezes no anticorpo resultante em qualquer isoforma de TGFβ. Se tal perda de potência for observada, o aminoácido de estrutura de linhagem não-germinativa foi mantido no anticorpo final.

[181] No PET1073G12 de linhagem germinativa e no PET1074B9 de linhagem germinativa, todos os resíduos da estrutura são de linhagem germinativa, exceto para dois resíduos no VH e um resíduo no VL. As seqüências de aminoácidos para o PET1073G12 de linhagem germinativa estão descritos na SEQ ID NO: 2 para o VH e na SEQ ID NO: 7 para o VL. As seqüências de aminoácidos para o PET1074B9 de linhagem germinativa estão descritas na SEQ ID NO: 12 para o VH e na SEQ ID NO: 17 para o VL.

[182] No PET1287A10 de linhagem germinativa todos os resí duos da estrutura VH e VL são de linhagem germinativa. As seqüên- cias de aminoácidos para o PET1287A10 estão descritas na SEQ ID NO: 22 para o VH e na SEQ ID NO: 27 para o VL.

EXEMPLO 3 Produção de IgG4s

[183] Os scFvs de linhagem germinativa PET1073G12, PET1074B9 e PET1287A10 foram convertidos do formato scFv para o formato IgG4 pela subclonagem de seus domínios VH e VL em vetores expressando cadeias pesadas e leves de anticorpo inteiro, respectivamente. O segmento de gene VH foi amplificado do vetor expressando scFv pCantab6 e clonado no vetor pEU8.1(+) contendo os domínios constantes da cadeia pesada y4 humana e os elementos regulatórios para expressar a cadeia pesada inteira em células de mamíferos. Semelhantemente, o segmento de gene VL foi amplificado a partir do vetor expressando scFv pCantab6 e clonado no vetor pEU3.1(-) contendo os domínios constantes de cadeia pesada x leve e os elementos regulatórios para expressar a cadeia leve inteira em células de mamíferos. Os vetores pEU3.l(-) e pEU8.1 (+) foram baseados nos vetores descritos por Persic et al.(1987) e foram modificados para introduzir a seqüência oriP para aumentar os rendimentos do anticorpo produzido (Shen. et al., 1995; Langle-Rouault et al., 1998). Após a clonagem, os domínios VH e VL de todos os três anticorpos foram seqüenciados para confirmar que nenhuma mutação foi introduzida durante o procedimento de clonagem.

[184] Os vetores para a expressão das cadeias pesada e leve do PET1073G12, PET1074B9 e PET1287A10 foram transfectados em células EBNA-293 (Invitrogen). Após a expressão gênica e a secreção no sobrenadante celular, as IgG4s de PET1073G12, PET1074B9 e PET1287A10 foram purificadas por cromatografia de afinidade da proteína A (Amersham). As preparações de anticorpo purificadas foram filtradas de forma estéril e estocadas a 4°C em solução salina tampo- nada com fosfato (PBS) antes da avaliação. A concentração de IgG foi determinada espectrofotometricamente usando um coeficiente de ex- tinção baseado na seqüência de aminoácidos da IgG conforme descrito em Mach et al. (1992). As IgGs purificadas foram analisadas por SEC-HPLC usando uma coluna Biosep-SEC-S2000 (Phenomenex) para averiguar a agregação ou degradação da proteína. Anticorpos inteiros de IgG4 humana reformatados foram comparados com o anticorpo 1D11.16 nos ensaios baseados em células MLEC e NHLF conforme descrito nos Exemplos 4 e 5, respectivamente.

EXEMPLO 4 Potência de neutralização de anticorpos anti-TGFβ no ensaio de proliferação MLEC dependente de TGFβ

[185] A potência de neutralização das preparações de anticorpos purificados contra a bioatividade de TGFβ humano foi avaliada usando o ensaio de proliferação de Célula Epitelial de Pulmão de Marta (MLEC).

[186] O ensaio de proliferação de MLEC é baseado em um en saio descrito por Danielpour et al. (1989a). Esse ensaio funciona no princípio de que quando TGFβ1, TGFβ2 e TGFβ3 é adicionado às células epiteliais de pulmão de marta, isso causa uma inibição da proliferação celular induzida por soro. Anticorpos foram testados quanto à neutralização do TGFβ1, TGFβ2 e TGFβ3 resultante da restauração da proliferação celular. A proliferação foi medida pela absorção de [3H]- timidina. A potência do anticorpo foi definida como a concentração do anticorpo que neutralizou uma única concentração de TGFβ1, TGFβ2 ou TGFβ3 em um nível de 50% (IC50) em nM.

Protocolo de Ensaio de Proliferação da MLEC Plaqueamento da MLEC

[187] A linhagem MLEC foi obtida da American Type Culture Collection (Cat. N° CCL-64). As células cresceram em Meio Essencial Mínimo (MEM, Gibco) contendo FBS 10% (Gibco), 1% de penicili- na/estreptomicina (Gibco) e 1% de solução de aminoácidos não- essenciais MEM (Gibco). As células confluentes de frascos T-175 foram dissociadas do frasco, giradas para baixo, lavadas e ressuspen- sas em meio de ensaio MLEC que foi feito de MEM contendo FBS 1%, penicilina/estreptomicina 1% e solução de aminoácidos não-essenciais MEM 1%. Uma alíquota das células foi, a seguir, marcada com azul triptano, contada em um hemocitômetro e o estoque celular foi diluído para 1,75 x 105 células por mL usando meio de ensaio. 100 μL dessa suspensão foi adicionada a cada cavidade de uma cultura de tecidos de placa de 96 cavidades de fundo plano e incubada por 3 a 5 horas.

Preparo de soluções de TGFβ/anticorpo

[188] Soluções funcionantes de TGFβ1, TGFβ2 ou TGFβ3 a 6 ng/mL (6 vezes a concentração de ensaio final) e anticorpos (incluindo controles tais como 1D11.16) em 3 vezes a concentração de ensaio máximo final foram preparadas em meio de ensaio MLEC. A concentração final do TGFβ no ensaio (1 ng/mL ou 40 pM) correspondeu à concentração que induziu aproximadamente 80% de inibição de proliferação celular em comparação com o controle sem TGFβ (isto é, valor de EC80).

Estabelecimento da placa de diluição

[189] Amostras dos anticorpos de teste e de controle foram titula das em etapas de diluição de 3 vezes em meio de ensaio MLEC e incubadas na presença e ausência de TGFβ1, TGFβ2 ou TGFβ3. Todos os controles relevantes foram incluídos em cada experimento: a testagem do anticorpo 1D11.16 e/ou da referência conforme apropriado e a efetuação das titulações de TGFβ1, TGFβ2 ou TGFβ3. As placas completas foram deixadas em um incubador de cultivo der tecido umidifi- cado por 1 hora ± 15 minutos.

Adição de soluções de TGFβ/anticorpo às células plaqueadas

[190] Depois dos tempos de incubação apropriados, 100 μL de cada cavidade das placas de diluição foram transferidos para a MLEC plaqueada e as placas voltaram para a incubadora por 44 ± 2 horas.

Adição de [3H]-timidina

[191] 25 μL de 10 μCi/mL de [3H]-timidina (diluída em PBS) foi adicionada a cada uma das placas (0,25 μCi/cavidade). As placas foram, a seguir, retornadas para o incubador por 4 horas ± 30 minutos.

Coleta das células

[192] 100 μL de tripsina-EDTA (0,25%, Gibco) foi adicionado a cada cavidade, as placas foram incubadas por 10 minutos na incubadora e as células foram coletadas usando um coletor de células de 96 cavidades Tomtec ou Packard.

Acúmulo e Análise de dados

[193] Os dados das células coletadas foram lidos usando um leitor de placas beta (TopCount, Packard). Os dados foram analisados para obter a IC50 e os valores de desvio padrão. Os valores da IC50 foram obtidos pelo uso do programa de computador Prism 2.0 (GraphPad). Resultados

[194] IgG4s de linhagem germinativa de PET1073G12, PET1074B9 e FET1287A10 foram testadas ao longo do 1D11.16 no ensaio de proliferação da MLEC. IgG4s foram produzidas conforme descrito no Exemplo 3. As médias aritméticas das IC50s ± o desvio padrão (onde IC50 é a concentração do anticorpo necessária para neutralizar 40 pM de TGFβ1, TGFβ2 ou TGFβ3 por 50%) estão mostradas na Tabela 1. Tabela 1

[195] Neutralização dos efeitos antiproliferativos de TGFβ1, TGFβ2 e TGFβ3 em MLEC usado PET1073G12, PET10774B9 ou IgG4s linhagem germinal PET1287A10, ou 1D11.16. O número total de pontos de dados para cada média é indicado pelo número n, e representa uma titulação independente de cada anticorpo. Valores n° IC50 não puderam ser determinados em virtude do anticorpo que foi muito potente na faixa de concentração testada e uma curva de resposta completa não obtida.

[196] Os dados da IC50 média para as IgG4s de PET1073G12 e PET1287A10 mostram que esses anticorpos têm potências semelhantes ou aproximadas daquelas do 1D11.16 no TFβ1, TGFβ2 e no TGFβ3.

[197] Os dados da IC50 média sugerem que a IgG4 do PET1074B9 é significativamente mais potente no TGFβ1 (embora uma curva resposta de dose completa não tenha sido obtida no ensaio da MLEC). Como uma forma de comparação, 1D11.16 apresentou 12% de neutralização no TGFβ1 em uma concentração de 91 pM e PET1074B9 apresentou 78% de neutralizaç ão em uma concentração similar de 92 pM. Além disso, PET1074B9 também foi testado ao longo do 1D11.16 em um ensaio de produção de fibronectina (NHLF) ensaio de fibroblasto de pulmão humano normal (Exemplo 5). Os resultados obtidos no ensaio NHLF confirmam aqueles obtidos no ensaio do MLEC: PET1074B9 tem potências semelhantes àquelas do 1D11.16 no TGFβ2 e no TGFβ3 e PET1074B9 é mais potente do que o 1D11.16 no TGFβ1.

EXEMPLO 5 Neutralização da potência dos anticorpos anti-TGFβ no ensaio de células NHLF dependente de TGFβ3

[198] A potência de neutralização das preparações de anticorpos purificados contra a bioatividade do TGFβ humano foi avaliada usando o ensaio de produção de fibronectina de Fibroblasto de Pulmão Humano Normal (NHLF). Esse ensaio mede a capacidade dos anticorpos de neutralizar a produção da glicoproteína da matriz extracelular (ECM), fibronectina. TGFβs são potentes estimulantes da produção de fibronectina em fibroblastos cultivados (Ignotz and Massaoue, 1986) exercendo seus efeitos através da ativação da via da c-Jun N-terminal quinase (Hocevar et al., 1999).

Protocolo de Ensaio de Células NHLF

[199] As células NHLF foram obtidas a partir da Clonetics® e fo ram mantidas em meio de crescimento de fibroblasto completo - 2 )FGM-2) em uma atmosfera umidificada contendo 5% de CO2 a 37°C. A 90 - 100% de confluência, os fibroblastos foram plaqueados (1,5 x 105/cavidade, formato de 24 cavidades) em 1,5 mL de meio FGM-2 e deixados se ligar por 24 horas a 37°C. As células foram lavadas com meio basal de fibroblasto livre de soro (FBM) e o soro foi privado de um dia para o outro em 1,5 mL de FMB suplementado com insulina humana (100 μg/mL), gentamicina/fungizona (50 μg/mL) e ácido as- córbico (50 μg/mL) e incubado por 24 horas a 37°C. Todos os experimentos oram efetuados em células entre a passagem três a seis.

Preparo de TGFβ e de soluções de anticorpo

[200] Soluções funcionantes de TGFβ1, TGFβ2 ou TGFβ3 a 25 ng/mL (1 nM) e anticorpos (incluindo controles tais como 1D11.16) foram preparados em meio de ensaio. A concentração final do TGFβ no ensaio (250 pg/mL ou 10 pM) correspondeu à concentração que induziu aproximadamente 80% do estímulo da produção de fibronectina em comparação com o controle sem TGFβ (isto é, valor da EC50). Estabelecimento da Placa de Diluição

[201] Amostras de anticorpos de teste e de controle foram diluí das em série em etapas de diluição de 10 vezes em meio de ensaio e pré-incubados na presença e ausência de TGFβ1, TGFβ2 ou TGFβ3 por 30 minutos. Células NHLF foram incubadas em 2 mL/cavidade de meio de ensaio por 48 horas a 37°C. Depois de 48 horas uma alíquota de 0,5 mL do sobrenadante do meio de cultura foi tomada para análise de fibronectina por ELISA.

ELISA da fibronectina humana

[202] Amostras de sobrenadante NHLF frescas ou congeladas ( 20°C) foram analisadas usando um kit de ELISA de antígeno da fibro- nectina humana Technoclone® compreendendo um anticorpo monoclonal de captura antifibronectina (clone 6FN) e um anticorpo secundário antifibronectina monoclonal conjugado HRP. A metodologia foi como se segue:

[203] Placas de 96 cavidades Nunc-Immuno® Maxisorp® foram revestidas (1 μg/cavidade) com um anticorpo de captura anti- fibronectina em tampão de revestimento (Na2CO3 12 mM, NaHCO3 35 mM, timerosal 0,01% (p/v) em água destilada, pH 9,6) por 16 horas a 4°C. O anticorpo de captura foi removido e cada cavidade foi bloqueada com 100 μL de tampão de diluição (1% de BSA (p/v) em PBS) por 1 hora a 37°C. Depois de lavar três vezes com tampão de lavagem (250 μg/cavidade de Tween 20 0,5% (v/v) em PBS), padrões e amostras de fibronectina de plasma humano foram adicionadas à placa e incubadas por 1 hora a 37°C. A placa foi, a seguir, lavada três vezes e incubada com um anticorpo secundário HRP anti-fibronectina (100 μg/cavidade em tampão de diluição) por 30 minutos a 37°C. A placa foi lavada três vezes com tampão de lavagem e 100 μg/cavidade de substrato de te- trametilbenzidina (TMB) foi adicionado à placa. Depois da incubação da placa em temperatura ambiente por 20 minutos, a reação foi interrompida com 100 μg de ácido sulfúrico 2 M/cavidade. A absorvância a 450 nm foi, a seguir, medida usando um leitor de placa Dynex MRX.

Análise de dados

[204] Os dados estão apresentados como uma porcentagem da resposta de controle da isoforma de TGFβ sob teste (100%). Os valores da pIC50 da média geométrica e os limites de 95% de intervalo de confiança foram estimados usando um ajuste de curva logística de quatro parâmetros (Prisma 2, GraphPad Software, São Diego, EUA). quando um ajuste de quatro parâmetros falhou, um ajuste de três ou dois parâmetros foi efetuado mantendo os valores do topo e de baixo da curva constantes.

Resultados

[205] IgG4s de linhagens germinativas PET1073G12, PET1074B9 e PET1287A10 purificadas foram testadas ao longo do 1D11.16 no ensaio de produção de fibronectina NHLF. IgG4s foram produzidas conforme descrito no Exemplo 3. As médias aritméticas das IC50s ± o desvio padrão (onde IC50 é a concentração do anticorpo necessária para neutralizar 10 pM de TGFβ1, TGFβ2 ou TGFβ3 por 50%) estão mostradas na Tabela 2. Tabela 2

[206] Potências de IgG4s de linhagem germinal PET1073G12, PET1074B9 e PET1287A10 ou 1D1116 no ensaio NHLF.

[207] O número total de pontos de dados para cada média é indi cado pelo número n, e representa uma titulação independente de cada anticorpo.

EXEMPLO 6 Potência no Ensaio de Indução da IL-11

[208] Avaliou-se a potência de neutralização das preparações do anticorpo purificado contra a bioatividade do TGFβ humano usando um ensaio de indução de IL-11 da célula A549 (células de carcinoma epi- telial de pulmão humano).

[209] Manteve-se células A549 (ATCC, N° Parte: CCL-185) em meio de crescimento/ensaio (435 mL de DMEM, 50 mL de soro bovino fetal (FBS), 5 mL de penicilina/estreptomicina, 5 mL de aminoácidos não-essenciais de meio Eagle modificado, 5 mL de L-glutamina 100X; todos da Gibco/Invitrogen). Em aproximadamente 90% de confluência, plaqueou-se as células em 100 μL de meio de crescimento/ensaio e se deixou as células se ligarem por 24 horas a 37°C, 5% de CO2.

Preparação do TGFβ e das soluções de anticorpos

[210] Preparou-se soluções funcionantes de TGFβ1 (1,8 ng/mL), TGFβ2 (4,2 ng/mL) ou TGFβ3 (4,2 ng/mL) e anticorpos (incluindo controles) em meio de crescimento/ensaio.

Estabelecimento da placa de diluição

[211] Diluiu-se serialmente amostras de anticorpos de teste e de controle em etapas de diluição de 5 vezes (TGFβ2 ou TGFβ3) ou de 10 vezes (TGFβ1) em meio de crescimento/ensaio e pré-incubou-se na presença e ausência de TGFβ1, TGFβ2 ou TGFβ3 a 37°C por 75 minutos. Incubou-se as células A549 em meio de ensaio de 200 μL/cavidade por 18 - 24 horas a 37°C. Depois de 18 - 24 horas, uma alíquota de 100 μL de sobrenadante de meio de cultura foi tomado para análise de IL-11 por ELISA.

Exemplo 7

[212] Para determinar a eficácia biológica de um anticorpo mono clonal de TGF-β pan-neutralizante humano para tratar doença renal crônica e outras indicações clínicas caracterizadas por fibrose patogênica, estudou-se o efeito do anticorpo em um modelo de obstrução ureteral unilateral (UUO).

[213] Ratos Sprague Dawley adultos (Taconic Farms, German- town, NY) pesando de 250 - 280 gramas (cerca de 6 semanas) foram alojados em um ambiente com ar, temperatura e luz controlados. Os ratos sofrendo de UUO receberam uma pequena incisão abdominal central ventral para expor o rim esquerdo e a uretra superior. Ligou-se a uretra no nível do pólo inferior do rim com sutura de seda e uma segunda vez a cerca de 0,2 cm abaixo da primeira. Ratos falsamente operados receberam o mesmo protocolo cirúrgico, mas sem a ligação ureteral.

[214] Os ratos obstruídos foram tratados com PBS, um anticorpo monoclonal pan-neutralizante de murino (1D11), um anticorpo de controle emparelhado com isotipo (13C4) ou um anticorpo monoclonal de TGF-β pan-neutralizante humano da invenção, como se segue. Administrou-se os anticorpos aos ratos intraperitonealmente, começando no dia da ligação ureteral por um período de 3 semanas. 13C4 e 1D11 foram administrados a 5 mg/Kg (3 vezes/semana) e o anticorpo pan- neutralizante humano foi dado aos ratos a 5 mg/Kg (a cada 5 dias). No fim das 3 semanas, sacrificou-se os ratos, perfundimos os rins com PBS por 3 minutos e coletamos os rins perfundidos para análise de mRNA, determinação do conteúdo de colágeno e exame histológico.

[215] Para avaliar a extensão da fibrose tecidual, determinou-se o conteúdo de colágeno tecidual total por análise bioquímica da hidroxi- prolina em extratos hidrolisados de acordo com Kivirikko et al. Esse ensaio é baseado na observação de que essencialmente toda a hidro- xiprolina em tecidos animais é encontrada no colágeno.

[216] Também efetuou-se um ensaio de colágeno Sircol para o conteúdo de colágeno total. O ensaio de colágeno Sircol mede a quantidade dos colágenos solúveis em ácido total/pepsina baseando-se na ligação específica do corante vermelho sírio com a cadeia lateral do colágeno tecidual.

[217] Os ratos UUO tratados com o anticorpo monoclonal pan- neutralizante humano mostrou uma redução de 43,4% no conteúdo de hidroxiprolina (1,98±0,26 μg/mg de tecido seco) quando comparado com o conjunto tratado com PBS (3,5±0,3 μg/mg de tecido seco, p < 0,05). A redução na fibrose renal foi ainda suportada pela redução no colágeno solubilizado total nos rins afetados, conforme determinado por um ensaio baseado em corante vermelho Sírio (falsos: 18,5±2,6, PBS: 69,3±3,8, e anticorpo monoclonal pan-neutralizante humano: 35,6±5.2 μg/100 mg de tecido, p < 0,05 vs. PBS).

[218] Também avaliaou-se a capacidade de um anticorpo mono clonal anti-TGF-β pan-neutralizante humano reduzir a fibrose tecidual por exame imunoistoquímico.

[219] Em animais de controle, a obstrução ureteral da arquitetura tubular por três semanas causou a ruptura ampla da arquitetura tubular renal com distenção acentuada, atrofia celular e necrose/apoptose, inflamação tecidual e expansão túbulo-intersticial com fibrose evidente. Houve pouca evidência de dano glomerular. Os ratos tratados com 1D11 ou com o anticorpo monoclonal pan-neutralizante humano, por outro lado, apresentou a conservação da arquitetura renal conforme julgado pela dilatação tubular e desorganização atenuada, infiltrados inflamatórios reduzidos (celularidade) e expansão túbulo-intersticial diminuída e fibrose.

[220] Também mediu-se o efeito do tratamento com um anticorpo monoclonal anti-TGF-β pan-neutralizante humano na expressão do gene regulado por TGF-β.

[221] mRNA de TGF-β1 foi significativamente reduzido nos ani mais UUO tratados com anticorpo monoclonal pan-neutralizante humano em comparação ou com animais tratados com anticorpo de controle 13C4 ou tratados com PBS. Um decréscimo significativo nos níveis de mRNA para o colágeno do tipo III também foi visto nos rins obstruídos tratados com os anticorpos anti-TGF-β humanos e de muri- nos em comparação com aqueles tratados com PBS ou 13C4, indicando um decréscimo na síntese de colágeno.

[222] Ainda confirmou-se a eficácia de um anticorpo monoclonal anti-TGF-β pan-neutralizante humano para reduzir a síntese de TGF-β auto-induzida pela medição da proteína TGF-β1 renal total.

[223] Em comparação com animais operados de controle negati vo, rins obstruídos exibiram um aumento acentuado no TGF-β1 do tecido total. Ratos obstruídos dosados com um anticorpo monoclonal pan-neutralizante humano, entretanto, apresentaram uma redução de 75% de níveis de TGF-β1 teciduais, significativamente abaixo dos níveis registrados para ambos os conjuntos de controle. Por comparação, o anticorpo de murino 1D11 reduziu os níveis de TGF-β1 tecidu- ais por 45%, em comparação com os conjuntos de controle.

[224] Os resultados acima descritos demonstram que a neutrali zação do TGF-β com um anticorpo monoclonal de anti-TGF-β pan- neutralizante humano interrompeu eficazmente a alça de regulação autócrina do TGF-β concomitante com a prevenção da produção de TGF-β1 e a expressão de mRNA de colágeno.

[225] Ainda determinou-se o efeito de um anticorpo monoclonal anti-TGF-β pan-neutralizante humano na expressão da actina do músculo liso (α-SMA) como um indicador indireto da inibição do TGF-β. A expressão da actina do músculo liso é um indicador dos miofibroblas- tos ativados, os quais estão associados com a fibrose tecidual e produzem tecido conjuntivo fibroso. TGF-β é um importante indutor da ativação e da transformação fenotípica dos fibroblastos estromais e das células epiteliais residentes em células miofibroblásticas.

[226] Detectou-se a proteína α-SMA por análise de Western blot padrão.

[227] Quando comparados com animais falsamente operados, os ratos com os rins obstruídos apresentaram uma supra-regulação dra- mática na proteína a-SMA conforme medido por western blotting dos homogenatos teciduais (dados não apresentados). Os ratos obstruídos com um anticorpo monoclonal anti-TGF-β pan-neutralizante humano apresentou uma redução significativa (75% em comparação com os controles de PBS) na expressão de a-SMA mensurável.

[228] Esses resultados demonstram a eficácia de um anticorpo monoclonal anti-TGF-β pan-neutralizante humano na redução da deposição de colágeno nos rins fibróticos, indicando claramente que o anticorpo é um potente inibidor da produção e deposição de colágeno renal nesse modelo de dano renal severo e de fibrose túbulo- intersticial. Devido ao processo da fibrose tecidual em órgãos tais como no pulmão, o fígado ou o rim possuírem mecanismos ou vias comuns, o trabalhador versado irá perceber que o anticorpo é útil no tratamento das doenças renais crônicas, assim como de outras indicações clínicas caracterizadas por fibrose patogênica.

[229] Segue uma descrição de certas reivindicações preferidas da invenção:

Claims (4)

1. Molécula de anticorpo humano ou fragmento de ligação a antígeno da mesma, caracterizada pelo fato de que se liga a e neutraliza TGFβ1, TGFβ2 e TGFβ3 humano, e compreende uma região variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, e uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, e em que a região constante de cadeia pesada é uma região constante de cadeia pesada de IgG4 humana.

2. Molécula de anticorpo humano de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende uma região constante da cadeia leve kappa humana.

3. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende uma molécula de anticorpo humano ou fragmento de ligação a antígeno como definida na reivindicação 1 ou 2 e um veículo farmaceuticamente aceitável.

4. Uso de uma molécula de anticorpo humano ou fragmento de ligação a antígeno como definida na reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de ser para a fabricação de um medicamento para o tratamento de uma doença fibrótica, em que a doença fibrótica é selecionada de fibrose renal, fibrose pulmonar ou fibrose do pulmão.

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