BR132015032486E2

BR132015032486E2 - PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR PREVENTION OF BRUCELLOSIS, ENCAPSULATED CEPA, ENCAPSULATION PROCESS AND USE

Info

Publication number: BR132015032486E2
Application number: BR132015032486-2A
Authority: BR
Inventors: Renato De Lima Santos; Teane Milagres Algusto Da Silva; Tatiane Alves da Paixão; Renee Mary Tsolis; Ana Patrícia De Carvalho Da Silva
Original assignee: Universidade Federal De Minas Gerais; Fundação De Amparo À Pesquisa Do Estado De Minas Gerais - Fapemig
Priority date: 2015-12-23
Filing date: 2015-12-23
Publication date: 2019-03-19

Abstract

composição farmacêutica para prevenção de brucelose, cepa encapsulada, processo de encapsulamento e uso a presente invenção trata de uma composição farmacêutica que compreende uma cepa mutante viva, atenuada e deficiente de um gene que codifica proteínas de um abc transportador específico de brucella ovis, denominada l abcba, aliada a um mecanismo de liberação desta cepa no hospedeiro de forma gradativa e contínua, mais excipientes e adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis. para liberação gradativa, a cepa dabcba de brucella ovis foi encapsulada em alginato. a invenção trata também da cepa áabcba de brucella ovis encapsulada, do processo de encapsulamento e do uso da composição farmacêutica descrita na prevenção de brucelose em carneiros. a cepa b. ovis dabcba encapsulada confere proteção e tem resposta celular em carneiros experimentalmente infectados com b. ovis.pharmaceutical composition for brucellosis prevention, encapsulated strain, encapsulation process and use The present invention is directed to a pharmaceutical composition comprising a live, attenuated and deficient mutant strain of a gene encoding proteins of a specific brucella ovis transporter abc called l abcba, coupled with a mechanism of gradual and continuous release of this strain into the host, plus pharmaceutically acceptable excipients and adjuvants. for gradual release, the brucella ovis dabcba strain was encapsulated in alginate. The invention also relates to the encapsulated brucella ovis aabcba strain, the encapsulation process and the use of the pharmaceutical composition described in the prevention of brucellosis in sheep. the strain b. Encapsulated ovis dabcba confers protection and cellular response in sheep experimentally infected with b. Ovis.

Description

COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA PARA PREVENÇÃO DE BRUCELOSE, CEPA ENCAPSULADA, PROCESSO DE ENCAPSULAMENTO E USOPHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR PREVENTION OF BRUCELLOSIS, ENCAPSULATED CEPA, ENCAPSULATION PROCESS AND USE

[1] O presente Certificado de Adição decorre do pedido de Patente de Invenção PI 1105977-0, depositado em 22 de dezembro de 2011, intitulado “CEPA ATENUADA DE BRUCELLA OVIS, COMPOSIÇÃO VACINAL E USO”.[1] This Certificate of Addition is derived from PI 1105977-0, filed on December 22, 2011, entitled “Attenuated CEUC by BRUCELLA OVIS, VACINAL COMPOSITION AND USE”.

[2] A presente invenção trata de uma composição farmacêutica que compreende uma cepa mutante viva, atenuada e deficiente de um gene que codifica proteínas de um ABC transportador específico de Brucella ovis, denominada AabcBA, aliada a um mecanismo de liberação desta cepa no hospedeiro de forma gradativa e contínua, mais excipíentes e adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis. Para liberação gradativa, a cepa AabcBA de Brucella ovis foi encapsulada em alginato. A invenção trata também da cepa AabcBA de Brucella ovis encapsulada, do processo de encapsulamento e do uso da composição farmacêutica descrita na prevenção de brucelose em carneiros. A cepa B. ovis AabcBA encapsulada confere proteção e tem resposta celular em carneiros experimentalmente infectados com B. ovis.[2] The present invention relates to a pharmaceutical composition comprising a live, attenuated and deficient mutant strain of a gene encoding proteins of a Brucella ovis specific transporter ABC, called AabcBA, combined with a mechanism of release of this strain into the host of gradually and continuously, plus pharmaceutically acceptable excipients and adjuvants. For gradual release, Brucella ovis strain AabcBA was encapsulated in alginate. The invention also relates to the encapsulated Brucella ovis strain AabcBA, the encapsulation process and the use of the pharmaceutical composition described in the prevention of sheep brucellosis. The encapsulated B. ovis strain AabcBA confers protection and cellular response in sheep experimentally infected with B. ovis.

[3] A brucelose é uma doença infecciosa causada por bactérias do gênero Brucella. Estas bactérias acometem animais domésticos, selvagens e o homem (FRANCO, Μ. P.; MULDER, M.; GILMAN, R. H. Human brucellosis. Lancei Infect. Diseases, v. 7, n. 12, p. 775-786, 2007), causando grandes perdas econômicas (SANTOS, R. L.; MARTINS, T. M.; BORGES, A. M.; PAIXÃO, T. A. Economic losses due to bovine brucellosis in Brazil. Pesq. Vet. Bras., v. 33, p. 759-764, 2013).[3] Brucellosis is an infectious disease caused by bacteria of the genus Brucella. These bacteria affect domesticated, wild animals and man (FRANCO, P., MULDER, M.; GILMAN, RH. Human brucellosis. Lancei Infect. Diseases, v. 7, no. 12, p. 775-786, 2007) , causing large economic losses (SANTOS, RL; MARTINS, TM; BORGES, AM; PASSION, TA Economic losses due to bovine brucellosis in Brazil. Pes V. Bras., v. 33, p. 759-764, 2013).

[4] A Brucella ovis é um bacilo Gram-negativo, não capsulado, imóvel, pertencente à família a2-Protobacteriacea (GARRITY, G. M. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, 2nd ed. Springer Press, New York, 2001), que não causa danos à saúde humana, mas que pode causar infecção crônica em ovinos (XAVIER, Μ. N.; SILVA, T. Μ. A.; COSTA, E. A.; et al. Development and evaluation of a species-specific PCR assay for the detection of Brucella ovis infection in rams. Vet. Microbiol., v. 145, p. 158-164, 2010; SILVA, A. P. C.; MACEDO, A. A.; COSTA, L. F.; et al. Brucella ovis lacking a species-specific putative ATP-binding cassete transporter is attenuated but immunogenic in rams. Vet. Microbiol., v. 167, p. 546-553, 2013). Como principais manifestações clínicas da doença estão a epididimite nos machos e abortos nas fêmeas (BLASCO, J. M. Brucella ovis. In; NIELSEN, K., DUNCAN, J. R. (Eds), Animal Brucellosis. CRC Press, Boca Raton, FL, p. 351-378, 1990; THOEN, C. O.; ENRIGHT, F.; CHEVILLE, N. F. BRUCELLA. IN: GYLES CL, THOEN CO, eds. Pathogenesis of bacterial infections in animais. Ames: lowa State University Press, pp. 236-247, 1993).[4] Brucella ovis is a motionless, unencapsulated Gram-negative bacillus of the a2-Protobacteriacea family (GARRITY, GM Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, 2nd ed. Springer Press, New York, 2001). human health, but may cause chronic infection in sheep (XAVIER, Μ. N .; SILVA, T. A. A .; COSTA, EA; et al. Development and evaluation of a species-specific PCR assay for the detection of Brucella ovis infection in rams Vet. Microbiol., V. 145, pp. 158-164, 2010; SILVA, APC; MACEDO, AA; COSTA, LF; et al., Brucella ovis lacking a species-specific putative ATP-binding cassette transporter is attenuated but immunogenic in rams (Vet. Microbiol., v. 167, pp. 546-553, 2013). The main clinical manifestations of the disease are epididymitis in males and abortions in females (BLASCO, JM Brucella ovis. In; NIELSEN, K., DUNCAN, JR (Eds), Animal Brucellosis. CRC Press, Boca Raton, FL, p. 351 -378, 1990; THOEN, CO; ENRIGHT, F.; CHEVILLE, NF BRUCELLA IN: GYLES CL, THOEN CO, eds Pathogenesis of bacterial infections in animals Ames: Lowa State University Press, pp. 236-247, 1993 ).

[5] Devido aos sérios problemas trazidos pela brucelose aos animais domésticos e aos produtores, como, por exemplo, infertilidade e subfertilidade de machos ou nascimento de cordeiros fracos, muito se tem feito para prevenção desta doença através da implantação de diversas estratégias de vacinação (NICOLETTI, P. Vaccination against Brucella. Adv. Biotechnol. Processes, v. 13; p. 147-168, 1990).[5] Due to the serious problems brought by brucellosis in domestic animals and producers such as male infertility and subfertility or birth of weak lambs, much has been done to prevent this disease through the implementation of various vaccination strategies ( NICOLETTI, P. Vaccination against Brucella (Adv. Biotechnol. Processes, v. 13; pp. 147-168, 1990).

[6] Apesar das tentativas para o desenvolvimento de vacinas eficazes e seguras (LECLERQ, S.; HARMS, J. S.; ROSINHA, G. M.; et al. Induction of a Th1-type of immune response but not protective immunity by intra museu lar DNA immunization with Brucella abortus GroEL heat-shock gene. J. Med. Microbiol., v. 51, p. 20-26, 2002), não existe nenhuma vacina específica, disponível e segura contra B. ovis. A vacina ideal contra B. ovis deve prevenir a infecção e os sinais clínicos ou, pelo menos, reduzir o risco de infecção e de transmissão (DÍAZ, A. G.; CLAUSSE, M.; PAOLICCHI, Μ. A. F.; et al. Immune response and serum bactericidal activity against Brucella ovis elicited using a short immunization schedule with the polymeric antigen BLOmp31 in rams. Vet. Immunol. Immunopatol., v. 154, p. 36-41, 2013).[6] Despite attempts to develop effective and safe vaccines (LECLERQ, S.; HARMS, JS; ROSINHA, GM; et al. Induction of a Th1-type of immune response but not protective immunity by intramuscular DNA immunization with Brucella abortus GroEL heat-shock gene (J. Med. Microbiol., v. 51, pp. 20-26, 2002), there is no specific, available and safe vaccine against B. ovis. The ideal B. ovis vaccine should prevent infection and clinical signs or at least reduce the risk of infection and transmission (DÍAZ, AG; CLAUSSE, M .; PAOLICCHI, AF. AF; et al. Immune response and bactericidal serum activity against Brucella ovis elicited using a short immunization schedule with the polymeric antigen BLOmp31 in rams (see Immunol. Immunopatol., v. 154, pp. 36-41, 2013).

[7] A Rev 1, uma cepa vacinai viva e atenuada de B, melitensis, é a vacina mais comumente utilizada contra B. melitensis, conferindo também proteção contra B. ovis (RIDLER, A. L.; WEST, D. M. Control of Brucella ovis infection in sheep. Vet. Clin. North Am. Food Anim. Pract., v. 27, n. 1, p. 61-66, 2011). Entretanto, a Rev 1 possui potencial patogênico, sendo capaz de infectar humanos e causar aborto em pequenos ruminantes, além de ser resistente a estreptomicina (BLASCO, J. Μ. A review of the use of B. melitensis Rev 1 vaccine in adult sheep and goats. Prev. Vet. Med., v. 31, p. 275-83, 1997; GRILLÓ, M. J.; BOSSERAY, N.; BLASCO, J. M. In vitro markers and biological activity in mice of seed lot strains and commercial Brucella melitensis Rev.1 and Brucella abortus B19 vaccines. Biologicals, v. 28, p. 119-27, 2000) e interferir em testes sorológicos (LANTIER, F.; FENSTERBANK, R. Kinetics of Rev,1 infection in sheep. In: PLOMMET, M.; VERGER, J. M. (Eds.), Brucella melitensis. Martinus Niijhoff, Dordrecht, pp. 247-251, 1985). Além disso, em países como o Brasil em que a B. melitensis é considerada exótica ou em países que esta bactéria já foi erradicada, a comercialização e utilização dessa vacina são proibidas (ROBINSON, A. Guidelines for coordinated human and animal brucellosis surveillance In FAO ANIMAL PRODUCTION AND HEALTH PAPER 156, 2003).[7] Rev 1, a live and attenuated vaccine strain of B melitensis, is the most commonly used vaccine against B. melitensis, also providing protection against B. ovis (RIDLER, AL; WEST, MD Control of Brucella ovis infection in sheep Vet Clin North Am Food Anim Pract, v. 27, no. 1, pp. 61-66, 2011). However, Rev 1 has pathogenic potential, is capable of infecting humans and causing miscarriage in small ruminants, and is resistant to streptomycin (BLASCO, J. Μ. A review of the use of B. melitensis Rev 1 vaccine in adult sheep and goats Prev. Vet. Med., v. 31, pp. 275-83, 1997; GRILLÓ, MJ; BOSSERAY, N.; BLASCO, JM In vitro markers and biological activity in mice of seed lot strains and commercial Brucella melitensis Rev 1 and Brucella abortus B19 vaccines Biologicals, v. 28, pp. 119-27, 2000) and interfering with serological tests (LANTIER, F.; FENSTERBANK, R. Kinetics of Rev., 1 infection in sheep. In: PLOMMET, M., VERGER, JM (Eds.), Brucella melitensis, Martinus Niijhoff, Dordrecht, pp. 247-251, 1985). Moreover, in countries such as Brazil where B. melitensis is considered exotic or in countries where this bacterium has already been eradicated, marketing and use of this vaccine are prohibited (ROBINSON, A. Guidelines for coordinated human and animal brucellosis surveillance.) ANIMAL PRODUCTION AND HEALTH PAPER 156, 2003).

[8] Camundongos têm sido utilizados como modelo de infecção para o estudo da patogenia da brucelose humana e animal (ENRIGHT F. M. The pathogenesis and pathobiology of Brucella infection in domestic animais. Chapter 12. In Animal brucellosis (K. Nielsen & J.R. Duncan, eds). CRC Press, Boca Raton, Florida, 301-320, 1990; FICHT, T. A. Discovery of Brucella virulence mechanisms using mutational analysis. Vet. Microbiol., v. 90, p. 311-315, 2002; KO, J,;. SPLITTER, G. A. Molecular host-pathogen interaction in brucellosis: current understanding and future approaches to vaccine development for mice and humans. Clin. Microbiol. Rev., v. 16, p. 65-78, 2003; SILVA, T. Μ. A.; COSTA, E. A.; PAIXAO, T. A.; et al. Laboratory animal models for brucellosis research. J. Biomed. Biotechnol., p. 1-9, 2011; VIEIRA, A. L. S.; SILVA, T. Μ. A.; MOL. J. P. S.; et al. MyD88 and TLR9 are required for early control of Brucella ovis infection in mice. Res. Vet. Sei., v. 94, p. 399-405, 2013; SÁ, J. C.; SILVA, T. Μ. A.; COSTA, E. A.; et al. The virB encode type IV secretion system is criticai for establishment of infection and persistence of Brucella ovis infection in mice. Vet. Microbiol., v. 159, p. 130-140, 2012), uma vez que há muitas dificuldades para estudos experimentais com animais de produção. Assim, alternativas vêm sendo tomadas para avaliar a infecção animal e respostas vacinais para B. ovis em novos modelos experimentais (JIMENEZ DE BAGUÉS, M. P.; ELZER, P. H.; BLASCO, J. M.; et al. Protective immunity to Brucella ovis in BALB/c mice following recovery from primary infection or immunization with subcellular vaccines. Infect. Immun., v. 62, p, 632-638, 1994; CASSATARO, J.; PASQUEVICH, K.A.; ESTEIN, S.M. A DNA vaccine coding for the chimera BLSOmp31 induced a better degree of protection against B. ovis and a similar degree of protection against B. melitensis than Rev.1 vaccination, Vaccine, v. 25, p. 5958-5967, 2007).[8] Mice have been used as an infection model for the study of the pathogenesis of human and animal brucellosis. (Chapter 12. In Animal brucellosis (K. Nielsen & JR Duncan, eds) CRC Press, Boca Raton, Florida, 301-320, 1990; FICHT, TA Discovery of Brucella virulence mechanisms using mutational analysis Vet. Microbiol., V. 90, pp. 311-315, 2002; KO, J ;; SPLITTER, GA Molecular host-pathogen interaction in brucellosis: current understanding and future approaches to vaccine development for mice and humans Clinic Microbiol Rev., v. 16, pp. 65-78, 2003; SILVA, T. Μ. COSTA, EA; PASSION, TA; et al., Laboratory animal models for brucellosis research J. Biomed. Biotechnol., Pp. 1-9, 2011; VIEIRA, ALS; SILVA, T. A. A .; MOL JPS; et al., MyD88 and TLR9 are required for early control of Brucella ovis infection in mice Res. Vet. Sci., V. 94, pp. 399-405, 2013; SÁ, JC; SIL VA, T. THE.; COSTA, E. A .; et al. The virB encode type IV secretion system is critical for establishment of infection and persistence of Brucella ovis infection in mice. Vet. Microbiol., V. 159, p. 130-140, 2012), as there are many difficulties for experimental studies with farm animals. Thus, alternatives have been taken to evaluate animal infection and vaccine responses to B. ovis in new experimental models (JIMENEZ DE BAGUÉS, MP; ELZER, PH; BLASCO, JM; et al.) Protective immunity to Brucella ovis in BALB / c mice Infection Immun., v. 62, p, 632-638, 1994; CASSATARO, J.; PASQUEVICH, KA; ESTEIN, SM A DNA vaccine coding for the chimera BLSOmp31 induced a better degree of protection against B. ovis and a similar degree of protection against B. melitensis than Rev.1 vaccination, Vaccine, v. 25, pp. 5958-5967, 2007).

[9] No documento de patente PI 1105977-0, intitulado “CEPA ATENUADA DE BRUCELLA OVIS, COMPOSIÇÃO VACINAL E USO", é demonstrado que a deleção de um gene que codifica proteínas do sistema ABC transportador de B. ovis leva à atenuação desta cepa em camundongos (SILVA T. Μ. A.; PAIXÃO, T. A.; COSTA, E. A. ; et al. Putative ATP-binding cassette transporter is essential for Brucella ovis pathogenesis in mice. Infect. Immun., v. 79, p. 1706-1717, 2011). Essa atenuação sugere que esta cepa pode servir como amostra vacinai contra infecção por B. ovis em carneiros.[9] In patent document PI 1105977-0 entitled "BRUCELLA OVIS ATTENUATED CEPA, VACINAL COMPOSITION AND USE", it is shown that deletion of a gene encoding proteins from the B. ovis transporter ABC system leads to attenuation of this strain. in mice (SILVA T. A. A .; PASSION, TA; COSTA, EA; et al. Putative ATP-binding cassette transporter is essential for Brucella ovis pathogenesis in mice. Infect. Immun., v. 79, p. 1706- 1717, 2011) This attenuation suggests that this strain may serve as a vaccine sample against B. ovis infection in sheep.

[10] Pesquisas feitas ao longo dos últimos 100 anos demonstraram que a melhor estratégia de vacinação contra brucelose é a utilização de microrganismos vivos e atenuados, uma vez que estes oferecem melhor proteção contra o desfio (VERSHILOVA, P. A. The use of live vaccine for vaccination of human beings against brucellosis in the USSR. Bull World Health Organ., v. 24, p. 85-89, 1961; DAVIS, D. S.; ELZER, P. H. Brucella vaccines in wildlife. Vet. Microbiol., v. 90, p. 533-544, 2002; SCHURIG, G. G.; SRIRANGANATHAN, N„ CORBEL, M. J. Brucellosis vaccines: past, presentand future. Vet. Microbiol., v. 90, p. 479-496, 2002). Além disso, tais características aliadas a um mecanismo de liberação destes agentes no hospedeiro de forma gradativa e contínua (microencapsulamento) aumentam a segurança e a eficácia da vacina, uma vez que o antígeno persistirá por mais tempo no organismo, levando a uma resposta imune mais elaborada (FICHT, T.; KAHL-MCDONAGH, Μ M.; ARENAS-GAMBOA, A. M.; RICE-FICHT, A. C. Brucellosis: The case for live, attenuated vaccine. Vaccine, v. 27, p. 40-43, 2009).[10] Research over the past 100 years has shown that the best brucellosis vaccination strategy is the use of live and attenuated microorganisms as they offer better protection against deflection (VERSHILOVA, PA of human beings against brucellosis in the USSR Bull World Health Organ, v. 24, pp. 85-89, 1961; DAVIS, DS; ELZER, PH Brucella vaccines in wildlife., Vet. Microbiol., v. 90, p. 533-544, 2002; SCHURIG, GG; SRIRANGANATHAN, N. CORBEL, MJ Brucellosis vaccines: past, present future (Vet. Microbiol., V. 90, pp. 479-496, 2002). In addition, such characteristics coupled with a mechanism of gradual and continuous release of these agents into the host (microencapsulation) increase the safety and efficacy of the vaccine, as the antigen will persist longer in the body, leading to a stronger immune response. elaborated (FICHT, T .; KAHL-MCDONAGH, ΜM .; ARENAS-GAMBOA, AM; RICE-FICHT, AC Brucellosis: The Case for Live, attenuated vaccine. Vaccine, v. 27, pp. 40-43, 2009) .

[11] Atualmente, uma alternativa para potencializar a eficiência de vacinas, é a administração de imunógenos em compartimentos ou cápsulas. O encapsulamento de imunógenos é uma ferramenta utilizada para melhorar a resposta imune do hospedeiro através da estimulação de captação antigênica, além do que as cápsulas, que são erodíveis, podem também funcionar como um depósito de antígenos, liberando-os lentamente com o objetivo de prolongar a disponibilidade deste no organismo, desenvolvendo assim uma resposta imunológica mais elaborada (RICE-FICHT, A.; KAHL-MCDONAGH, Μ. M.; FICHT, T.; Arenas-gamboa, A. Polymeric particles in vaccine delivery. Curr. Opin. Microbiol., v. 13, p. 106-112, 2010).[11] Currently, an alternative to enhancing vaccine efficiency is the administration of immunogens in compartments or capsules. Immunogen encapsulation is a tool used to enhance the host immune response through antigen uptake stimulation, and capsules, which are erodible, can also function as an antigen depot, slowly releasing them in order to prolong its availability in the body, thus developing a more elaborate immune response (RICE-FICHT, A.; KAHL-MCDONAGH, M. M .; FICHT, T .; arenas-gamboa, A. Polymeric particles in vaccine delivery. Curr. Opin Microbiol., V. 13, pp. 106-112, 2010).

[12] Materiais sintéticos e naturais como o poly-caprolactone e o alginato são bastante utilizados para encapsulamento de imunógenos. Pesquisas demonstraram que a utilização do poly-caprolactone como micropartícula, um polímero sintético, biodegradável, biocompatível e de baixo custo, associado a componentes da membrana externa de B. ovis, conferiu proteção e resposta humoral a carneiros semelhante à resposta conferida pela Rev-1 (MUNOZ, P. M.; ESTEVAN M.; MARIN, C. M.; DE MIGUEL M. J.; GRILLÓ, M. J,; BARBERÁN, M.; IRACHE, J, M.; BLASCO, J. M.; GAMAZO, C. Brucella outer membrane complex-loaded microparticles as a vaccine against Brucella ovis in rams. Vaccine, v. 24, p. 1897 — 1905, 2006).[12] Synthetic and natural materials such as poly-caprolactone and alginate are widely used for immunogen encapsulation. Research has shown that the use of poly-caprolactone as a microparticle, a low cost, biodegradable, biocompatible synthetic polymer, associated with B. ovis outer membrane components, provided protection and humoral response to sheep similar to the response conferred by Rev-1. (MUNOZ, PM; ESTEVAN M .; MARIN, CM; MIGUEL MJ; GRILLÓ, M. J .; BARBERÁN, M .; IRACHE, J, M.; BLASCO, JM; GAMAZO, C. Brucella. microparticles as a vaccine against Brucella ovis in rams (Vaccine, v. 24, p. 1897 - 1905, 2006).

[13] O alginato é um biocomposto natural, não tóxico, biocompatível, presente em todo o mundo (KARNITZ, O.; GURGEL, L. V. A.; GIL, L. F. Removal of Ca2+ and Mg2+ from aqueous single metal Solutions by mercerized cellulose and mercerized sugar-cane bagasse grafted with EDTA dianhydride (EDTAD). Carboh. Pol., v. 79, n.1, p. 184-191, 2010) e de baixo custo (KRASAEKOOPT, W,; BHANDARI, B.; DEETH, H. Evaluation of encapsulation techniques of probiotics for yoghurt. Inter. Dairy J., v. 13, n. 1, p. 3-13, 2003). Este composto tem sido bastante utilizado para encapsular cepas vivas atenuadas de Brucella abortus e B. melitensis, resultando no aumento da imunogenicidade e da proteção em camundongos (ARENAS-GAMBOA, A. M.; FICHT, T. A.; KAHL-MCDONAGH, Μ. M.; RICE-FICHT, A. C. Immunization with a single dose of a microencapsulated Brucella melitensis mutant enhances protection against wild-type challenge. Infect. Immun., v. 76, p. 2448-2455, 2008. ARENAS-GAMBOA, M.; FICHT, T. A.; KAHL-MCDONAGH, Μ. M.; et al. The Brucella abortus S19 AvjbR live candidate is safer than S19 and confers protection against wild-type vaccine challenge in BALB/c mice when delivered in a sustained-release vehicle. Infect. Immun., v. 77, p. 877-884, 2009) e em cervos (ARENAS-GAMBOA, M.; FICHT, T. A.; DAVIS, D. S.; et al. Enhanced immune response of red deer (Cervus elaphus) to live RB51 vaccine strain using composite microspheres. J. Wild. Dis., v. 45, p. 165-173, 2009a).[13] Alginate is a natural, non-toxic, biocompatible biocomposite present worldwide (KARNITZ, O .; GURGEL, LVA; GIL, LF Removal of Ca2 + and Mg2 + from aqueous single metal Solutions by mercerized cellulose and mercerized sugar- cane bagasse grafted with EDTA dianhydride (EDTAD) Carboh Pol., v. 79, n.1, pp. 184-191, 2010) and low cost (KRASAEKOOPT, W ;; BHANDARI, B .; DEETH, H. Evaluation of encapsulation techniques of probiotics for yoghurt (Inter. Dairy J., v. 13, no. 1, pp. 3-13, 2003). This compound has been widely used to encapsulate live attenuated Brucella abortus and B. melitensis strains, resulting in increased immunogenicity and protection in mice (ARENAS-GAMBOA, AM; FICHT, TA; KAHL-MCDONAGH, Μ. M .; RICE -FICHT, AC Immunization with a single dose of a microencapsulated Brucella melitensis mutant enhancements protection against wild-type challenge Infect Immun., V. 76, pp. 2448-2455, 2008. ARENAS-GAMBOA, M .; FICHT, TA ; KAHL-MCDONAGH, M.M.; The Brucella abortus S19 AvjbR live candidate is safer than S19 and confers protection against wild-type vaccine challenge in BALB / c mice when delivered in a sustained-release vehicle. ., v. 77, pp. 877-884, 2009) and in deer (ARENAS-GAMBOA, M .; FICHT, TA; DAVIS, DS; et al. Enhanced immune response of red deer (Cervus elaphus) to live RB51 vaccine strain using composite microspheres, J. Wild, Dis., v. 45, pp. 165-173, 2009a).

[14] Foram encontrados, no estado da técnica, documentos de patente e artigos científicos que descrevem vacinas para proteção contra brucelose, compreendendo cepas atenuadas ou antígenos encapsulados.[14] Patent documents and scientific articles describing brucellosis protection vaccines comprising attenuated strains or encapsulated antigens have been found in the prior art.

[15] O documento de patente US2014/248354, intitulado “Controlled release vaccines and methods for treating Brucella diseases and disorders", descreve composições farmacêuticas compreendendo cepas atenuadas de Brucella melitensis e Brucella abortus, para serem utilizadas como vacinas. Estas composições possuem um sistema de liberação controlada da vacina in vivo, que consiste no encapsulamento da cepa atenuada em alginato. A capacidade de indução de resposta imune protetora desta vacina foi avaliada em camundongos.[15] US2014 / 248354 entitled "Controlled release vaccines and methods for treating Brucella diseases and disorders" describes pharmaceutical compositions comprising attenuated Brucella melitensis and Brucella abortus strains for use as vaccines. These compositions have a system controlled release of the vaccine in vivo, which consists of encapsulating the attenuated strain in alginate.The protective immune response induction capacity of this vaccine was evaluated in mice.

[16] O documento de patente US2006153868, intitulado “Process for the preparation of an inproved Brucella strain plasmid to develop the strain and the vaccine comprising the said strain”, descreve uma cepa atenuada de Brucella abortus, obtida por meio da deleção do gene pgm que codifica a proteína fosfoglicomutase, o processo de obtenção desta cepa atenuada e seu uso como vacina contra brucelose.[16] Patent document US2006153868, entitled "Process for the preparation of an ingested Brucella strain plasmid to develop the strain and vaccine comprising the said strain", describes an attenuated strain of Brucella abortus obtained by deletion of the pgm gene. encoding the protein phosphoglycomutase, the process of obtaining this attenuated strain and its use as a brucellosis vaccine.

[17] O documento de patente W02012/016315, intitulado “A recombinant strain of the bacterium Brucella spp. and live vaccine against brucellosis”, descreve o desenvolvimento de uma cepa mutante atenuada de Brucella abortus obtida por meio da deleção parcial ou completa do gene pgk, que codifica a fosfoglicerato cinase, sendo que tal cepa induz a imunidade protetora em camundongos.[17] Patent document W02012 / 016315 entitled "A recombinant strain of the bacterium Brucella spp. and live vaccine against brucellosis ”describes the development of an attenuated mutant Brucella abortus strain obtained by partial or complete deletion of the pgk gene, which encodes phosphoglycerate kinase, which induces protective immunity in mice.

[18] O artigo científico intitulado “Oral vaccination with microencapsuled strain 19 vaccine confers enhanced protection against Brucella abortus strain 2308 challenge in red deer (Cervus elaphus elaphus)" descreve uma vacina de uso oral, ou subcutâneo, adequada para animais de vida selvagem, que compreende a cepa atenuada S19 de Brucella encapsulada em alginato e vitelline protein B. O uso oral desta vacina em veado-vermelho resultou em carga bacteriana significativamente reduzida quando comparada com controles após o desafio com Brucella (ARENAS-GAMBOA, A. M.; FICHT, T. A.; DAVIS, D. S.; ELZER, P. H.; Kahl-McDonagh, M.; Wong-Gonzalez, A.; Rice-Ficht, A. C. Oral vaccination with microencapsuled strain 19 vaccine confers enhanced protection against Brucella abortus strain 2308 challenge in red deer (Cervus elaphus elaphus). Journal of Wildlife Diseases, v. 45, n. 4, p. 1021-1029, 2009).[18] The scientific article entitled “Oral vaccination with microencapsulated strain 19 vaccine confers enhanced protection against Brucella abortus strain 2308 challenge in red deer (Cervus elaphus elaphus)" describes an oral or subcutaneous vaccine suitable for wildlife animals, comprising attenuated alginate and vitelline protein B attenuated Brucella strain S19. Oral use of this red deer vaccine resulted in significantly reduced bacterial burden when compared to controls following the Brucella challenge (ARENAS-GAMBOA, AM; FICHT, TA DAVIS, DS; ELZER, PH; Kahl-McDonagh, M.; Wong-Gonzalez, A.; Rice-Ficht, AC Oral vaccination with microencapsulated strain 19 vaccine confers enhanced protection against Brucella abortus strain 2308 challenge in red deer (Cervus elaphus elaphus) Journal of Wildlife Diseases, v. 45, no. 4, pp. 1021-1029, 2009).

[19] Entretanto, não há no estado da técnica a descrição de uma vacina viva atenuada encapsulada que tenha comprovação de seu potencial imunogênico em carneiros contra infecção por Brucella ovis. Tampouco está descrita a cepa mutante AabcBA de B. ovis encapsulada em alginato e seu uso como vacina.[19] However, the state of the art does not describe a live attenuated encapsulated vaccine that has proven its immunogenic potential in sheep against Brucella ovis infection. Nor is the alginate encapsulated B. ovis mutant strain AabcBA described and its use as a vaccine.

[20] Tendo em vista a necessidade de uma vacina segura e disponível no Brasil contra B. ovis, a presente tecnologia propõe composições farmacêuticas compreendendo uma cepa mutante viva, atenuada e deficiente de um gene que codifica proteínas de um ABC transportador específico de B. ovis (AabcBA) encapsulada com alginato, cujo potencial de proteção e de imunogenicidade foi demonstrado em carneiros.[20] In view of the need for a safe and available vaccine against B. ovis in Brazil, the present technology proposes pharmaceutical compositions comprising a live, attenuated and deficient mutant strain of a gene encoding proteins of a B specific transporter ABC. ovis (AabcBA) encapsulated with alginate, whose protection and immunogenicity potential has been demonstrated in sheep.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURASBRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES

[21] Na Figura 1, está representada a frequência de carneiros sorologicamente positivos por imunodifusão em gel de ágar (IDGA) experimentalmente infectados pela cepa virulenta ou Brucella ovis AabcBA ao longo de vinte e quatro semanas de infecção. Foram utilizados seis carneiros por grupo.[21] Figure 1 depicts the frequency of serologically positive sheep by agar gel immunodiffusion (IDGA) experimentally infected with the virulent strain or Brucella ovis AabcBA over twenty four weeks of infection. Six rams per group were used.

[22] Na Figura 2, está representada a frequência de detecção da cepa virulenta de Brucella ovis ou Brucella ovis AabcBA por isolamento bacteriano e PCR em amostras biológicas (eixo y) de carneiros experimentalmente infectados ao longo de vinte e quatro semanas. (A) Cultura bacteriológica de amostras de urina, (B) cultura bacteriológica de amostras de sêmen; (C) PCR de amostras de urina, (D) PCR de amostras de sêmen.[22] Figure 2 depicts the frequency of detection of virulent Brucella ovis or Brucella ovis AabcBA strain by bacterial isolation and PCR in biological (y-axis) samples from experimentally infected sheep over twenty-four weeks. (A) Bacteriological culture of urine samples, (B) Bacteriological culture of semen samples; (C) PCR of urine samples, (D) PCR of semen samples.

[23] Na Figura 3, está representado o percentual de proliferação de linfócitos em carneiros experimentalmente infectados com a cepa virulenta ou Brucella ovis AabcBA. As colunas representam a média de seis carneiros controle não estimulados (CN); ou seis carneiros inoculados com a cepa virulenta de B. ovis (B. ovis); ou seis carneiros inoculados com B. ovis AabcBA (AabcBA B. ovis); ou phitohemaglutinina (PHA). Os dados representam média e erro padrão. As médias foram comparadas pelo teste de Tukey. Os asteriscos indicam diferença estatística significativa entre os grupos (* p <0,05; “ p <0,01).[23] Figure 3 shows the percentage of lymphocyte proliferation in sheep experimentally infected with the virulent strain or Brucella ovis AabcBA. The columns represent the average of six unstimulated control sheep (NC); or six rams inoculated with the virulent strain of B. ovis (B. ovis); or six sheep inoculated with B. ovis AabcBA (AabcBA B. ovis); or phitohemagglutinin (PHA). Data represent mean and standard error. Means were compared by Tukey test. Asterisks indicate a statistically significant difference between the groups (* p <0.05; “p <0.01).

[24] Na Figura 4, há a representação gráfica da imunofenotipagem de leucócitos no sangue periférico de carneiros não infectados ou infectados com a cepa virulenta ou Brucella ovis AabcBA na primeira (1), quarta (4) ou décima primeira (11) semanas após a infecção. (A) linfócitos T CD4+, (B), linfócitos T CD8+, (C) linfócitos B, (D) monócitos e (E) linfócitos Tg/Δ. Os dados representam média e erro padrão. As médias foram comparadas pelo teste de Kruskal-Wallis. Os asteriscos indicam diferenças estatisticamente significativas entre os grupos (** p <0,01).[24] In Figure 4, there is a graphical representation of leukocyte immunophenotyping in peripheral blood of sheep not infected or infected with the virulent strain or Brucella ovis AabcBA in the first (1), fourth (4) or eleventh (11) weeks after the infection. (A) CD4 + T lymphocytes, (B), CD8 + T lymphocytes, (C) B lymphocytes, (D) monocytes and (E) Tg / Δ lymphocytes. Data represent mean and standard error. The means were compared by the Kruskal-Wallis test. Asterisks indicate statistically significant differences between groups (** p <0.01).

[25] Na Figura 5, está representada a frequência (%) de detecção de Brucella ovis por cultivo bacteriano (A) ou PCR (B) em órgãos de carneiros infectados experimentalmente com a cepa virulenta ou B. ovis AabcBA em 24 semanas após a infecção. Seis carneiros por grupo.[25] Figure 5 depicts the frequency (%) of detection of Brucella ovis by bacterial culture (A) or PCR (B) in organs of sheep experimentally infected with virulent or B. ovis AabcBA strain at 24 weeks after infection. Six rams per group.

[26] A Figura 6 é uma imagem de microscopia óptica da cápsula de alginato (5x, barra com 500pm) (A); e microscopia de fluorescência de cápsula de alginato contendo Brucella ovis ,\abcBA expressando mCherry (5x, barra com 500pm) (B).[26] Figure 6 is an optical microscopy image of the alginate capsule (5x, 500pm bar) (A); and fluorescence microscopy of Brucella ovis alginate capsule expressing mCherry expressing (5x, 500pm bar) (B).

[27] Na Figura 7 está representado o log de unidades formadoras de colônias de Brucella ovis isoladas no baço (A) e no fígado (B) de camundongos BALB/c machos imunizados ou não com B. ovis AabcBA e, em seguida, desafiados com a cepa virulenta de B. ovis. Cada barra representa a média de 5 (controle negativo), 5 (PBS SC), 5 (PBS IP), 10 (AabcBA B. ovis SC) e 10 (AabcBA B. ovis IP) camundongos com desvio padrão. Os dados brutos sofreram transformação logarítmica antes de ANOVA e as médias foram comparadas pelo teste de Tukey. Diferenças estatísticas são indicadas por asteriscos (* p < 0,05; *** p < 0,001).[27] Figure 7 depicts the log of Brucella ovis colony forming units isolated in the spleen (A) and liver (B) of male BALB / c mice immunized or not with B. ovis AabcBA and then challenged. with the virulent strain of B. ovis. Each bar represents the mean of 5 (negative control), 5 (PBS SC), 5 (PBS IP), 10 (AabcBA B. ovis IP) and 10 (AabcBA B. ovis IP) mice with standard deviation. Raw data underwent log transformation before ANOVA and means were compared by Tukey test. Statistical differences are indicated by asterisks (* p <0.05; *** p <0.001).

[28] Na Figura 8 está representado o log de unidades formadoras de colônias de Brucella ovis recuperadas no baço (A) e no fígado (B) de camundongos BALB/c machos imunizados três vezes com B. ovis /\abcBA e não imunizados e desafiados com a cepa virulenta de B. ovis. Cada barra representa a média de 10 camundongos Não imunizados e 10 camundongos Imunizados com desvio padrão. Os dados brutos sofreram transformação logarítimica antes de ANOVA e as médias foram comparadas pelo teste de Tukey. Diferenças estatísticas são indicadas por asteriscos (*** p < 0,001).[28] Figure 8 depicts the log of Brucella ovis colony forming units recovered from the spleen (A) and liver (B) of male BALB / c mice immunized three times with B. ovis / \ abcBA and challenged with the virulent strain of B. ovis. Each bar represents the average of 10 unimmunized mice and 10 standard deviation immunized mice. The raw data underwent logarithmic transformation before ANOVA and the averages were compared by Tukey test. Statistical differences are indicated by asterisks (*** p <0.001).

[29] Na Figura 9 está representado o log de unidades formadoras de colônias de Brucella ovis isoladas no baço (A) e no fígado (B) de camundongos BALB/c e no baço (C) e no fígado (D) de camundongos C57BL6, machos inoculados com PBS e alginato e imunizados com B ovis AabcBA encapsulada ou não e, em seguida, desafiados com a cepa virulenta de B. ovis. Cada barra representa a média de 5 (Não imunizados), 5 (alginato), 5 (B. ovis habcBA) e 5 (B. ovis AabcBA encapsulado) camundongos com desvio padrão. Os dados brutos sofreram transformação logarítimica antes de ANOVA e as médias foram comparadas pelo teste de Tukey.[29] Figure 9 depicts the log of Brucella ovis colony forming units isolated from the spleen (A) and liver (B) of BALB / c mice and the spleen (C) and liver (D) of C57BL6 mice, males inoculated with PBS and alginate and immunized with or not encapsulated B ovis AabcBA and then challenged with the virulent B. ovis strain. Each bar represents the average of 5 (unimmunized), 5 (alginate), 5 (B. ovis habcBA) and 5 (B. encapsulated B. ovis AabcBA) mice with standard deviation. The raw data underwent logarithmic transformation before ANOVA and the averages were compared by Tukey test.

Diferenças estatísticas são indicadas por asteriscos (* p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001).Statistical differences are indicated by asterisks (* p <0.05; ** p <0.01; *** p <0.001).

[30] Na Figura 10, há imagens de camundongos machos BALB/c e C57BL6 não imunizados ou imunizados com Brucella ovis AabcBA encapsulado e desafiados com a cepa virulenta de B. ovis. Esplenomegalia (cabeça de seta) e microgranulomas (setas) no fígado de camundongos BALB/c (A) e C57BL6 não imunizados (C). Baço sem alteração no tamanho em camundongos BALB/c (B) e C57BL6 (D) imunizados com B. ovis AabcBA encapsulado e ausência de microgranulomas no fígado.[30] In Figure 10, there are images of male BALB / c and C57BL6 mice not immunized or immunized with encapsulated Brucella ovis AabcBA challenged with the virulent B. ovis strain. Splenomegaly (arrowhead) and microgranulomas (arrows) in the liver of unimmunized BALB / c (A) and C57BL6 (C) mice. Spleen without size change in BALB / c (B) and C57BL6 (D) mice immunized with encapsulated B. ovis AabcBA and absence of liver microgranulomas.

[31] Na Figura 11, são apresentadas alterações microscópicas em camundongos machos C57BL6 não imunizados ou imunizados com Brucella ovis AabcBA encapsulado e desafiados com a cepa virulenta de B. ovis. Microgranulomas no fígado de camundongo C57BL6 (seta) não imunizado associado à área extensa de necrose, Η. E. 20x (A) em contraste com discreto microgranuloma no fígado de camundongo C57BL6 imunizado com a cepa mutante encapsulada, Η. E, 20x, barra com 100pm (B). Numerosos neutrófilos com extensa área de necrose no baço de camundongo C57BL6 não imunizado, H.E., 40x (C) e raros neutrófilos no baço de camundongo C57BL6 imunizados com B. ovis AabcBA encapsulado, H.E., 40x, barracom 50 pm (D).[31] In Figure 11, microscopic changes are shown in C57BL6 male mice unimmunized or immunized with encapsulated Brucella ovis AabcBA challenged with the virulent B. ovis strain. Microgranulomas in non-immunized C57BL6 mouse liver (arrow) associated with extensive necrosis area, Η. E. 20x (A) in contrast to mild microgranuloma in the C57BL6 mouse liver immunized with the encapsulated mutant strain, Η. E, 20x, bar at 100pm (B). Numerous neutrophils with extensive area of necrosis in the unimmunized C57BL6 mouse spleen, H.E., 40x (C) and rare neutrophils in the C57BL6 mouse spleen immunized with encapsulated B. ovis AabcBA, H.E., 40x, barrel 50 pm (D).

[32] Na Figura 12, está representada a mediana do escore de lesões no baço e fígado (escore combinado de lesões inflamatórias) de BALB/c (A, B) e C57BL6 (C, D) machos não imunizados, inoculados com alginato, imunizados com Brucella ovis AabcBA encapsulada e não encapsulada. Cada barra representa a média de 5 (não imunizados), 5 (alginato), 5 (S. ovis AabcBA) e 5 (B. ovis AabcBA encapsulado) camundongos com desvio padrão.[32] Figure 12 shows the median score of the spleen and liver injury (combined inflammatory lesion score) of unimmunized male BALB / c (A, B) and C57BL6 (C, D) inoculated with alginate, immunized with encapsulated and unencapsulated Brucella ovis AabcBA. Each bar represents the average of 5 (unimmunized), 5 (alginate), 5 (S. ovis AabcBA) and 5 (encapsulated B. ovis AabcBA) mice with standard deviation.

[33] Na Figura 13, está representada a frequência de carneiros não imunizados, imunizados com Brucella ovis AabcBA encapsulada ou não sorologicamente positivos por imunodifusão em gel de agar (IDGA) antes e depois do desafio com B. ovis. As setas indicam a semana de imunização e desafio e os números do eixo x representam o número de semana depois da imunização e do desafio. Diferenças estatísticas entre os grupos (10 carneiros por grupo) são indicadas por asteriscos (**p<0,01).[33] In Figure 13, the frequency of unimmunized sheep immunized with encapsulated or non-serologically positive Brucella ovis AabcBA immunized by agar gel immunodiffusion (IDGA) before and after challenge with B. ovis is shown. Arrows indicate immunization and challenge week and x-axis numbers represent week number after immunization and challenge. Statistical differences between groups (10 sheep per group) are indicated by asterisks (** p <0.01).

[34] Na Figura 14, está representada a frequência de detecção da cepa virulenta de Brucella ovis por bacteriologia e PCR em amostras biológicas (eixo y) antes e depois do desafio com B. ovis. As setas indicam a semana de imunização (com B. ovis AabcBA encapsulada com alginato ou não) e desafio. (A) cultura bacteriológica de amostras de sêmen, (B) cultura bacteriológica de amostras de urina, (C) PCR de amostras de sêmen, (D) PCR de amsotras de urina.[34] Figure 14 depicts the frequency of detection of virulent Brucella ovis strain by bacteriology and PCR in biological samples (y axis) before and after challenge with B. ovis. Arrows indicate immunization week (with or without alginate encapsulated B. ovis AabcBA) and challenge. (A) bacteriological culture of semen samples, (B) bacteriological culture of urine samples, (C) PCR of semen samples, (D) PCR of urine samples.

[35] Na Figura 15, está representada a frequência de detecção da cepa virulenta de Brucella ovis por bacteriologia (A) e PCR (B) em tecidos de carneiros não imunizados e imunizados com B. ovis AabcBA encapsulada ou não.[35] Figure 15 depicts the frequency of detection of the virulent Brucella ovis strain by bacteriology (A) and PCR (B) in unimmunized and non-encapsulated B. ovis AabcBA immunized sheep tissues.

[36] Na Figura 16, há imagens de alterações macroscópicas em carneiros não imunizados após desafio. (A) Assimetria do epidídimo, (B) granuloma entre os folhetos visceral e parietal da túnuca vaginal adjacente à cauda do epidídimo (seta), (C) aderência fibrosa entre testículo e cabeça do epidídimo (seta) e (D) aderência fibrinosa na túnica vaginal (seta).[36] In Figure 16, there are images of macroscopic changes in unimmunized sheep after challenge. (A) Epididymis asymmetry, (B) Granuloma between the visceral and parietal leaflets of the vaginal tunic adjacent to the epididymis tail (arrow), (C) Fibrous adhesion between the testis and epididymis head (arrow) and (D) Fibrinous adhesion in the vaginal tunic (arrow).

[37] Na Figura 17, há imagens de alterações microscópicas em carneiros não imunizados e imunizados com a cepa mutante de Brucella ovis encapsulada após desafio. (A) epididimite neutrofílica intensa associada à degeneração cística do epitélio (seta), com imunomarcação positiva para B. ovis (quadrante menor, 100X) na cauda do epidídimo de carneiro não imunizado; (B) cauda do epidídimo normal de carneiro imunizado com B. ovis ÁabcBA encapsuada após desafio; (C) Ampolite neutrofílica e linfo-histiocitária moderada em carneiro não imunizado; (D) ampola normal de carneiro imunizado com B. ovis AabcBA encapsuada após desafio, Η. E., 40X, barra com 50pm.[37] In Figure 17, there are images of microscopic changes in unimmunized sheep immunized with the encapsulated Brucella ovis mutant strain after challenge. (A) intense neutrophilic epididymitis associated with cystic degeneration of the epithelium (arrow), with positive immunostaining for B. ovis (smaller quadrant, 100X) at the tail of unimmunized sheep epididymis; (B) normal epididymis tail of sheep immunized with encapsulated B. ovis ÁabcBA after challenge; (C) Moderate neutrophilic and lymphohistiocytic ampolitis in unimmunized sheep; (D) normal ampoule of sheep immunized with encapsulated B. ovis AabcBA after challenge, Η. E., 40X, bar at 50pm.

[38] Na Figura 18, está representada a frequência de detecção de carneiros não imunizados e imunizados com Brucella ovis AabcBA encapsulada ou não com alterações inflamatórias em órgão reprodutores, baço, fígado e linfonodos ilíacos.[38] Figure 18 depicts the frequency of detection of unimmunized and immunized sheep with Brucella ovis AabcBA encapsulated or not with inflammatory changes in reproductive organs, spleen, liver and iliac lymph nodes.

[39] Na Figura 19, está representado o percentual de proliferação de linfócitos em carneiros não imunizados, imunizados com a cepa Brucella ovis AabcBA encapsulada ou não com alginato pós-imunização (A) e pós-desafio (B). As colunas representam a média de 10 carneiros não imunizados; ou 10 carneiros imunizados com B. ovis AabcBA, ou 10 carneiros imunizados com B. ovis AabcBA encapsulada. Os dados representam média e desvio padrão. As médias foram comparadas pelo teste de Kruskal-Wallis. Os asteriscos indicam diferença estatística significativa entre os grupos (* p <0,05; ** p <0,01).[39] In Figure 19, the percentage of lymphocyte proliferation in unimmunized sheep, immunized with the Brucella ovis AabcBA strain, whether or not encapsulated with post-immunization (A) and post-challenge (B), is depicted. The columns represent the average of 10 unimmunized rams; or 10 sheep immunized with B. ovis AabcBA, or 10 sheep immunized with encapsulated B. ovis AabcBA. Data represent mean and standard deviation. The means were compared by the Kruskal-Wallis test. The asterisks indicate a statistically significant difference between the groups (* p <0.05; ** p <0.01).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA TECNOLOGIADETAILED DESCRIPTION OF TECHNOLOGY

[401 A presente invenção trata de uma composição farmacêutica que compreende uma cepa mutante viva, atenuada e deficiente de um gene que codifica proteínas de um ABC transportador específico de Brucella ovis, denominada AabcBA, aliada a um mecanismo de liberação desta cepa no hospedeiro de forma gradativa e contínua, mais excipientes e adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis.[401 The present invention is directed to a pharmaceutical composition comprising a live, attenuated and deficient mutant strain of a gene encoding proteins of a Brucella ovis specific transporter ABC, called AabcBA, coupled with a mechanism of releasing this strain into the host in a manner that is known to be present. gradual and continuous, plus pharmaceutically acceptable excipients and adjuvants.

Mais precisamente, a tecnologia trata de uma composição farmacêutica compreendendo a cepa AabcBA de Brucella ovis encapsulada em alginato mais excipientes e adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis. A invenção trata também da cepa AabcBA de Brucella ovis encapsulada, do processo de encapsulamento e do uso da composição farmacêutica descrita na prevenção de brucelose em carneiros. A cepa B. ovis AabcBA encapsulada confere proteção e tem resposta celular em carneiros experimentalmente infectados com B. ovis.More precisely, the technology deals with a pharmaceutical composition comprising the alginate encapsulated Brucella ovis AabcBA strain plus pharmaceutically acceptable excipients and adjuvants. The invention also relates to the encapsulated Brucella ovis strain AabcBA, the encapsulation process and the use of the pharmaceutical composition described in the prevention of sheep brucellosis. The encapsulated B. ovis strain AabcBA confers protection and cellular response in sheep experimentally infected with B. ovis.

[41] A cepa atenuada de Brucella ovis é caracterizada por compreender uma mutação em genes que codificam para o transportador ABC. A cepa mutante de Brucella ovis (TMS3) foi construída por mutagênese dirigida, através da deleção de duas ORFs (open reading frame) que codificam para proteínas que compõem um sistema transportador do tipo ABC. Estas ORFs estão localizadas em uma ilha genética específica para a espécie de Brucella ovis, que causa doença em ovinos, quando comparada a outras espécies clássicas de Brucella, que infectam animais domésticos.[41] The attenuated Brucella ovis strain is characterized by a mutation in genes encoding the ABC transporter. The Brucella ovis mutant strain (TMS3) was constructed by directed mutagenesis by deleting two ORFs (open reading frame) that encode proteins that make up an ABC-like carrier system. These ORFs are located on a genetic island specific to Brucella ovis, which causes disease in sheep compared to other classic Brucella species that infect domestic animals.

[42] O encapsulamento da cepa em alginato pode ser realizado por meio do processo descrito a seguir: (a) adição das células (0,5 x 1011 a 2 x 1011 UFC de B. ovis) a uma solução de alginato de sódio (1%); (b) gotejamento lento em da mistura obtida em (a) em uma solução de cloreto de cálcio (CaCI2) (0,5%); (c) homogenização das cápsulas formadas em (b) por 15 minutos seguida de lavagem em solução de tampão MOPS (ácido 4-morpholinepropanesulfonic); (d) adição das capsulas obtidas em (c) a uma suspensão de Poli-L lisina (0,5%) (15 minutos) sob agitação; (e) lavagem das capsulas obtidas em (d) em solução de tampão MOPS; (f) adição das partículas obtidas em (e) a uma solução de alginato (0,03%) (5 minutos); (g) lavagem das partículas obtidas em (f) em uma solução de tampão MOPS.[42] The encapsulation of the alginate strain can be performed by the procedure described below: (a) adding the cells (0.5 x 1011 to 2 x 1011 CFU of B. ovis) to a sodium alginate solution ( 1%); (b) slow dripping of the mixture obtained in (a) into a calcium chloride (CaCl2) solution (0.5%); (c) homogenizing the capsules formed in (b) for 15 minutes followed by washing in MOPS buffer solution (4-morpholinepropanesulfonic acid); (d) adding the capsules obtained in (c) to a suspension of Poly-L-lysine (0.5%) (15 minutes) while stirring; (e) washing the capsules obtained from (d) in MOPS buffer solution; (f) adding the particles obtained in (e) to an alginate solution (0.03%) (5 minutes); (g) washing the particles obtained in (f) in a MOPS buffer solution.

[43] O gotejamento descrito na etapa (b) pode ser realizado com o auxílio de uma seringa de insulina. A seringa de insulina pode ter, preferencialmente 0,2 mL com agulha 0,23 x 4 mm.[43] The drip described in step (b) can be performed with the aid of an insulin syringe. The insulin syringe may preferably have 0.2 ml with 0.23 x 4 mm needle.

[44] A homogeneização descrita na etapa “c” pode ser realizada por meio da utilização de um shakerde bancada.[44] The homogenization described in step “c” can be performed using a bench shaker.

[45] A invenção descreve também o uso da composição acima descrita como vacina viva contra brucelose. Esta composição farmacêutica é útil na prevenção de infecções por Brucella ovis em ovinos. A administração da vacina é realizada preferencialmente pela via subcutânea.[45] The invention also describes the use of the composition described above as a live brucellosis vaccine. This pharmaceutical composition is useful in preventing Brucella ovis infections in sheep. Administration of the vaccine is preferably by subcutaneous route.

[46] Carneiros imunizados com esta vacina e desafiados com Brucella não eliminaram a cepa virulenta na urina ou no sêmen e, ao analisarem-se tecidos do sistema reprodutor, baço, fígado e linfonodo ilíaco destes carneiros, a cepa virulenta também não foi encontrada, ao contrario dos carneiros não imunizados. Além disto, não houve alterações durante o exame clínico e tampouco foram observadas lesões nos carneiros durante a necropsia e na microscopia. De acordo com os resultados da imunização com a cepa mutante B. ovis AabcBA encapsulada com alginato, pode-se afirmar que esta é imunogênica e confere proteção a carneiros contra infecção experimental por B. ovis.[46] Sheep immunized with this vaccine and challenged with Brucella did not eliminate the virulent strain in the urine or semen, and when analyzing tissues of the reproductive system, spleen, liver and iliac lymph node, the virulent strain was not found either. unlike unimmunized sheep. In addition, there were no changes during the clinical examination and no lesions were observed in the sheep during autopsy and microscopy. According to the results of immunization with the alginate encapsulated B. ovis AabcBA mutant strain, it can be argued that it is immunogenic and confers protection against experimental infection by B. ovis.

[47] A presente invenção pode ser mais bem compreendida, de modo não limitante, por meio dos exemplos a seguir.[47] The present invention may be better understood, but not limited to, by the following examples.

Exemplo 1: Cinética de infecção da cepa Brucella ovis AabcBA em carneiros [48] Os sistemas ABC transportadores em bactérias estão associados à captação de nutrientes e exportação de toxinas e antibióticos, possuindo função importante na expressão gênica de Brucella spp. As proteínas do ABC transportador têm um potencial patogênico durante a infecção no hospedeiro. Com a deleção do gene de um sistema ABC transportador de B. ovis, pode-se observar a atenuação desta cepa em camundongos, já descrita no documento de patente PI 1105977-0. Com base nesses resultados, esta cepa mutante atenuada pode ter alto potencial imunogênico e de proteção em carneiros.Example 1: Brucella ovis AabcBA strain infection kinetics in sheep [48] Bacterial transporter ABC systems are associated with nutrient uptake and export of toxins and antibiotics, having an important role in Brucella spp gene expression. Transporter ABC proteins have a pathogenic potential during host infection. With the deletion of the gene from a B. ovis transporter ABC system, the attenuation of this strain can be observed in mice, already described in patent document PI 1105977-0. Based on these results, this attenuated mutant strain may have high immunogenic and protective potential in sheep.

[49] Assim, considerou-se importante e necessária a investigação da cinética de infecção desta cepa mutante atenuada em carneiros para posteriormente avaliar sua utilização como cepa vacinai nesta espécie.[49] Thus, it was considered important and necessary to investigate the kinetics of infection of this attenuated mutant strain in sheep to further evaluate its use as a vaccine strain in this species.

[50] Foram utilizados 12 carneiros, não castrados, mestiços, de um ano de idade. Os carneiros foram alimentados com feno e ração para ovinos com 18% de proteína, duas vezes ao dia. Estes tiveram água e sal mineral especial para ovinos disponíveis no piquete à vontade. Seis carneiros foram desafiados com 2 ml_ de uma suspensão contendo 1,2 x 109 UFC/mL de B. ovis cepa ATCC25840 por via intraprepucial e 50 pl_ em ambos os sacos conjuntivais de uma suspensão contendo 1,2 x 1010 UFC da mesma cepa e os outros seis carneiros foram desafiados com 2 ml_ de uma suspensão contendo 1,2 x 109 UFC/mL da cepa de B. ovis AabcBA por via intraprepucial e 50 pL em ambos os sacos conjuntivais de uma suspensão contendo 1,2 x 101° UFC da mesma cepa. Após a infecção, foram feitas coletas semanais de sangue, sêmen e urina para avaliação sorológica, PCR, bacteriologia e sêmen para esfregaço durante seis meses. Para as coletas de sêmen, os animais foram condicionados antes da inoculação com a introdução de uma fêmea no rebanho semanalmente. Após a inoculação os animais foram separados e mantidos em piquetes diferentes (seis animais em cada piquete), com tratadores diferentes.[50] Twelve year-old uncastrated mongrel sheep were used. The sheep were fed hay and sheep feed with 18% protein twice a day. These had special sheep water and mineral salt available at the paddock at will. Six rams were challenged with 2 ml of a suspension containing 1.2 x 10 9 CFU / ml B. ovis strain ATCC25840 intrapreputally and 50 µl in both conjunctival sacs of a suspension containing 1.2 x 10 10 CFU of the same strain and the other six rams were challenged with 2 ml of a suspension containing 1.2 x 10 9 CFU / ml of B. ovis AabcBA strain intrapreputaneously and 50 µl in both conjunctival sacs of a suspension containing 1.2 x 101 ° CFU. of the same strain. After infection, weekly blood, semen and urine samples were taken for serological evaluation, PCR, bacteriology and smear semen for six months. For semen collection, the animals were conditioned prior to inoculation by introducing a female to the herd weekly. After inoculation the animals were separated and kept in different paddocks (six animals in each paddock) with different keepers.

[51] Após seis meses de desafio, os animais foram sedados profundamente com cloridrato de xilazina a 2% (0,1 mg/kg, via endovenosa, Copazine, Schering-Plough Coopers, Brasil), anestesiados com tiopental sódico (via endovenosa, Cristalia, Brasil) e então eutanasiados por eletrocussão. Após a eutanásia, fragmentos de cauda, cabeça e corpo do epidídimo, testículo, glândula vesicular, glândula bulbouretral, ampola, glande, prepúcio, linfonodos ilíacos, baço e fígado foram coletados e destinados às técnicas de isolamento bacteriano, histopatologia, extração de DNA e PCR.[51] After six months of challenge, animals were deeply sedated with 2% xylazine hydrochloride (0.1 mg / kg intravenously, Copazine, Schering-Plow Coopers, Brazil), anesthetized with sodium thiopental (intravenous, Cristalia, Brazil) and then euthanized by electrocution. After euthanasia, tail, head and body fragments of the epididymis, testis, vesicular gland, bulbourethral gland, ampulla, glans, foreskin, iliac lymph nodes, spleen and liver were collected and destined to the techniques of bacterial isolation, histopathology, DNA extraction and PCR.

[53] Este experimento foi aprovado pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal (CETEA/UFMG, protocolo n° 204/2012).[53] This experiment was approved by the Animal Experimentation Ethics Committee (CETEA / UFMG, protocol No. 204/2012).

[54] Resultados demonstraram que um carneiro infectado com a cepa virulenta de B. ovis tornou-se sorologicamente positivo por imunodifusão em gel de ágar (IDGA) na primeira semana pós-infecção, enquanto que todos os carneiros restantes infectados com a cepa virulenta ou B. ovis AabcBA soroconverteram apenas na quarta semanas após a infecção. Ambos os grupos de carneiros permaneceram soropositivos até a décima sexta semana pós-infecção. Em 24 semanas pós-infecção, 50% (3/6) de carneiros inoculados com a cepa virulenta de B. ovis e 33,33% (2/6) de carneiros infectados com B. ovis AabcBA permaneceram soropositivos (Figura 1).[54] Results demonstrated that one sheep infected with the virulent B. ovis strain became serologically positive by agar gel immunodiffusion (IDGA) in the first week post-infection, while all remaining sheep infected with the virulent strain or B. ovis AabcBA seroconverted only in the fourth week after infection. Both groups of sheep remained seropositive until the sixteenth week after infection. At 24 weeks post infection, 50% (3/6) of sheep inoculated with the B. ovis virulent strain and 33.33% (2/6) of sheep infected with B. ovis AabcBA remained seropositive (Figure 1).

[55] Para avaliar a persistência da cepa virulenta e B. ovis AabcBA em carneiros experimentalmente infectados, as amostras de urina e sêmen foram submetidas à cultura bacteriológica e reação em cadeia da polimerase (PCR). B. ovis AabcBA não foi detectado em amostras de urina ou no sêmen nem pela cultura bacteriológica nem por PCR, em nenhum dos intervalos de tempo durante o curso da infecção (isto é, durante 24 semanas após a infecção). Por outro lado, a cepa virulenta de B. ovis foi detectada na urina por cultura bacteriológica a partir da quinta semana pós-infecção, e 33,33% (2/6) dos carneiros permaneceram eliminando o organismo na urina até a última semana pós-infecção (Figura 2A). A detecção de B. ovis no sêmen por bacteriologia se iniciou a partir da quarta semana pós-infecção (Figura 2B). Quando a detecção foi avaliada por PCR, a cepa virulenta de B. ovis foi detectada em amostras de urina a partir da quarta semana após a infecção. Semelhante aos resultados obtidos com a cultura bacteriológica de urina, a PCR também indicou que 33,33% (2/6) dos carneiros permaneceram eliminando a cepa virulenta de B. ovis na urina durante 24 semanas após infecção (Figura 2C). A detecção de B. ovis no sêmen por PCR, se iniciou a partir quinta semana após a infecção (Figura 2D).[55] To assess the persistence of virulent and B. ovis AabcBA strain in experimentally infected sheep, urine and semen samples were subjected to bacteriological culture and polymerase chain reaction (PCR). B. ovis AabcBA was not detected in urine or semen samples either by bacteriological culture or PCR at any time interval during the course of the infection (ie 24 weeks after infection). On the other hand, the virulent B. ovis strain was detected in the urine by bacteriological culture from the fifth week after infection, and 33.33% (2/6) of the sheep remained eliminating the organism in the urine until the last week after infection. -infection (Figure 2A). Detection of B. ovis in semen by bacteriology began from the fourth week after infection (Figure 2B). When detection was assessed by PCR, the virulent B. ovis strain was detected in urine samples from the fourth week after infection. Similar to the results obtained with bacteriological urine culture, PCR also indicated that 33.33% (2/6) of sheep remained eliminating the virulent B. ovis strain in the urine for 24 weeks after infection (Figure 2C). Detection of B. ovis in the semen by PCR began from the fifth week after infection (Figure 2D).

[56] Para avaliar a imunoproliferação de linfócitos, foi realizado um ensaio de proliferação celular. Houve um aumento significativo na proliferação de linfócitos quando os linfócitos dos carneiros desafiados com a cepa virulenta ou B. ovis AabcBA na décima semana após a infecção foram comparados com linfócitos obtidos a partir do controle não estimulado (Figura 3).[56] To assess lymphocyte immunoproliferation, a cell proliferation assay was performed. There was a significant increase in lymphocyte proliferation when sheep lymphocytes challenged with the virulent or B. ovis AabcBA strain in the tenth week after infection were compared with lymphocytes obtained from the unstimulated control (Figure 3).

[57] Com o objetivo de avaliar o perfil de leucócitos do sangue de ovinos experimentalmente infectados com as cepas virulenta e B. ovis AabcBA, foi realizada a imunofenotipagem. A porcentagem de linfócitos T CD4+ aumentou em ambos os grupos infectados (cepa virulenta e B. ovis AabcBA) quando comparada com o controle não infectado na primeira semana pós-infecção. Na quarta e décima primeira semanas após a infecção, a percentagem de linfócitos T CD4+ não diferiram significativamente quando carneiros infectados foram comparados com controles não infectados (Figura 4A). A percentagem de linfócitos T CD8+ no sangue periférico foi significativamente mais elevada em ambos os grupos infectados (cepa virulenta e AabcBA) na quarta e décima primeira semanas após a infecção, quando comparado com os controles não infectados (Figura 4B). Não houve diferença estatística significativa no nível de células T CD8+ na primeira semana pós-infecção, nem no grupo infectado com a cepa virulenta nem AabcBA comparado ao controle. A porcentagem de linfócitos B, monócitos e linfócitos g/Δ foram estatisticamente semelhantes entre todos os grupos ao longo do curso da infecção (Figuras 4C, 4D e 4E). Não foi observada nenhuma diferença entre animais infectados com a cepa mutante e a virulenta ao longo do experimento.[57] In order to evaluate the blood leukocyte profile of sheep experimentally infected with virulent and B. ovis AabcBA strains, immunophenotyping was performed. The percentage of CD4 + T lymphocytes increased in both infected groups (virulent strain and B. ovis AabcBA) when compared to uninfected control in the first week post infection. At the fourth and eleventh weeks after infection, the percentage of CD4 + T lymphocytes did not differ significantly when infected sheep were compared with uninfected controls (Figure 4A). The percentage of peripheral blood CD8 + T lymphocytes was significantly higher in both infected groups (virulent strain and AabcBA) in the fourth and eleventh weeks after infection when compared to uninfected controls (Figure 4B). There was no statistically significant difference in CD8 + T-cell level in the first week after infection, neither in the group infected with the virulent strain nor AabcBA compared to the control. The percentage of B lymphocytes, monocytes and g / Δ lymphocytes were statistically similar across all groups over the course of infection (Figures 4C, 4D and 4E). No differences were observed between animals infected with the mutant strain and virulent strain throughout the experiment.

[58] Para avaliar a detecção das cepas virulenta e B. ovis AabcBA nos tecidos do sistema reprodutor, baço, fígado e linfonodo ilíaco dos carneiros, foram realizados cultivo bacteriano e PCR. A cepa S. ovis AabcBA não foi detectada em nenhuma das amostras de tecidos recolhidos para cultura bacteriológica (Figura 5A). Esta cepa foi detectada por PCR no linfonodo ilíaco de apenas um carneiro (Figura 5B). Em contraste, todos os carneiros infectados pela cepa virulenta de B. ovis tinham evidência de infecção, seja pela cultura bacteriológica ou PCR. Com exceção do baço, todos os outros órgãos de carneiros infectados com a cepa virulenta de B. ovis tiveram frequências variáveis de positividade pela cultura bacteriológica. Dos tecidos mais acometidos, 83,33% (5/6) de carneiros infectados com a cepa virulenta de B. ovis tiveram infecção na cauda e na cabeça do epidídimo, enquanto que 66,66% (4/6) dos carneiros infectados com a cepa virulenta de B. ovis tiveram amostras de ampola bacteriologicamente positivas (Figura 5A). Resultados semelhantes foram obtidos por PCR, mas, adicionalmente, a cepa virulenta de B. ovis foi detectada em 66,66% (4/6) das glândulas vesiculares por PCR (Figura 5B), [59] Antes da infecção, não foram observadas células inflamatórias em nenhuma das amostras de sêmen dos 12 carneiros. Na 4a semana pós-infecção, 16.61% (3/6) dos animais infectados com B. ovis tiveram discreta quantidade de células inflamatórias no ejaculado (predominantemente neutrófilos, com alguns outros leucócitos). Na 8a semana após a infecção, 50% (3/6) destes animais tiveram acúmulo moderado de neutrófilos no ejaculado. Na 12a semana após a infecção, 66,66% (4/6) dos carneiros tiveram células inflamatórias no ejaculado, que foi recorrente em 16, 20 e 24 semanas após a infecção. Em contraste, apenas uma animal infectado com a cepa AabcBA teve discreta quantidade de células inflamatórias na 12a semana após a infecção, que foi ausente em todos os outros tempos da infecção (Tabela 1).[58] To assess the detection of virulent and B. ovis AabcBA strains in the reproductive system, spleen, liver, and iliac lymph node tissues of the sheep, bacterial culture and PCR were performed. The S. ovis AabcBA strain was not detected in any of the tissue samples collected for bacteriological culture (Figure 5A). This strain was detected by PCR in the iliac lymph node of only one sheep (Figure 5B). In contrast, all sheep infected with the virulent B. ovis strain had evidence of infection, either by bacteriological culture or PCR. With the exception of the spleen, all other organs of sheep infected with the virulent B. ovis strain had varying frequencies of bacterial culture positivity. Of the most affected tissues, 83.33% (5/6) of sheep infected with the B. ovis virulent strain had infection in the tail and head of the epididymis, while 66.66% (4/6) of sheep infected with B. virulent B. ovis strain had bacteriologically positive ampoule samples (Figure 5A). Similar results were obtained by PCR, but in addition, the virulent B. ovis strain was detected in 66.66% (4/6) of the vesicular glands by PCR (Figure 5B), [59]. inflammatory cells in none of the 12 sheep semen samples. In the 4th week after infection, 16.61% (3/6) of the B. ovis infected animals had a slight amount of inflammatory cells in the ejaculate (predominantly neutrophils, with some other leukocytes). In the 8th week after infection, 50% (3/6) of these animals had moderate neutrophil accumulation in the ejaculate. At week 12 after infection, 66.66% (4/6) of the sheep had inflammatory cells in the ejaculate, which recurred at 16, 20 and 24 weeks after infection. In contrast, only one animal infected with the AabcBA strain had a slight amount of inflammatory cells at week 12 after infection, which was absent at all other times of infection (Table 1).

Tabela 1 - Células inflamatórias no sêmen de carneiros experimentalmente infectados com Brucella ovis e AabcBA em diferentes tempos de infecção. Avaliação semi-quantitativa no sêmen: (-) ausente, (+) discreto, (++) moderado.Table 1 - Inflammatory cells in semen of sheep experimentally infected with Brucella ovis and AabcBA at different times of infection. Semi-quantitative semen evaluation: (-) absent, (+) discrete, (++) moderate.

[60] Pode-se afirmar, então, que B. ovis AabcBA, que carece de um transportador ABC funcional específico da espécie, desencadeia um perfil de resposta sorológica que é semelhante à da cepa virulenta. Além disso, o mutante é capaz de iniciar uma resposta celular do hospedeiro significativa tal como evidenciado por um ensaio de proliferação de linfócitos. Além de tudo, a cepa mutante não é eliminada no sêmen ou urina, o que é uma característica desejável para uma cepa vacinai. Em conjunto, estes resultados apoiam a hipótese de que este mutante possui um elevado potencial para ser testado como cepa vacinai.[60] It can thus be stated that B. ovis AabcBA, which lacks a species-specific functional ABC transporter, triggers a serological response profile that is similar to that of the virulent strain. In addition, the mutant is capable of initiating a significant host cellular response as evidenced by a lymphocyte proliferation assay. In addition, the mutant strain is not eliminated in semen or urine, which is a desirable trait for a vaccine strain. Taken together, these results support the hypothesis that this mutant has a high potential to be tested as a vaccine strain.

Exemplo 2: Encapsulamento da cepa AabcBA de Brucella ovis em alginato [61] Para o encapsulamento da cepa mutante B. ovis AabcBA, uma solução contendo 1011 UFC de B. ovis foi adicionada a uma solução de alginato de sódio a 1% (Sigma-Aldrich). Essa mistura foi colocada em seringa de insulina (0,2 mL) com agulha 0,23 x 4 mm e gotejada lentamente em 10 mL de uma solução de clotero de cálcio (CaCI2) a 0,5%. Após o gotejamento, as cápsulas foram formadas, em seguida homogenizadas por 15 minutos e lavadas em seguida duas vezes em solução de tampão MOPS (ácido 4-morpholinepropanesulfonic). As cápsulas foram colocadas então em uma suspensão de Poli-L lisina (Sigma-Aldrich) a 0,5% por 15 minutos sob agitação e, em seguida, estas foram lavadas em solução de tampão MOPS. As partículas foram adicionadas a uma solução de alginato a 0,03% durante 5 minutos e, logo após, lavadas em uma solução de tampão MOPS. As partículas foram inoculadas por via subcutânea na dose final de 108 UFC/camundongo. Para avaliar a contagem de UFC nas cápsulas, estas foram colocadas em solução despolimerizadora (solução contendo citrato de sódio, cloreto de sódio e MOPS), por 10 minutos sob agitação e, em seguida, estas cápsulas foram diluídas em PBS e plaqueadas em TSA.Example 2: Encapsulation of the Brucella ovis AabcBA strain in alginate [61] For encapsulation of the mutant B. ovis AabcBA strain, a solution containing 1011 CFU of B. ovis was added to a 1% sodium alginate solution (Sigma- Aldrich). This mixture was placed in an insulin syringe (0.2 mL) with 0.23 x 4 mm needle and slowly dripped into 10 mL of a 0.5% calcium cloter (CaCl2) solution. After dripping, the capsules were formed, then homogenized for 15 minutes and then washed twice in MOPS (4-morpholinepropanesulfonic acid) buffer solution. The capsules were then placed in a suspension of 0.5% Poly-L-lysine (Sigma-Aldrich) for 15 minutes under agitation and then washed in MOPS buffer solution. The particles were added to a 0.03% alginate solution for 5 minutes and then washed in a MOPS buffer solution. The particles were inoculated subcutaneously at the final dose of 108 CFU / mouse. To evaluate the CFU count in the capsules, they were placed in a depolymerizing solution (solution containing sodium citrate, sodium chloride and MOPS) for 10 minutes while stirring, and then these capsules were diluted in PBS and plated on TSA.

[62] O tamanho das partículas foi avaliado através de microscopia óptica e eletrônica de varredura. A eficácia do encapsulamento bacteriano foi avaliada pelo encapsulamento de B. ovis AabcBA expressando mCherry através de microscopia de fluorescência (Leica DM 4000 B). As cápsulas de alginato foram avaliadas por microscopia óptica e B. ovis AabcBA expressando mCherry foi encapsulada com alginato e avaliada por microscopia de fluorescência. Observou-se que as cápsulas vazias ou contendo B. ovis possuem tamanho e forma semelhantes. Estas cápsulas variam entre 300 a 800 pm de diâmetro (Figura 6A). Numerosas colônias bacterianas vermelhas e fluorescentes de B. ovis AabcBA expressando mCherry foram observadas no interior de cápsulas de alginato, confirmando que B. ovis foi eficientemente encapsulada (Figura 6B).[62] Particle size was assessed by optical and scanning electron microscopy. The effectiveness of bacterial encapsulation was evaluated by encapsulating B. ovis AabcBA expressing mCherry by fluorescence microscopy (Leica DM 4000 B). Alginate capsules were evaluated by light microscopy and B. ovis AabcBA expressing mCherry was encapsulated with alginate and evaluated by fluorescence microscopy. Empty or B. ovis-containing capsules were found to have similar size and shape. These capsules range from 300 to 800 pm in diameter (Figure 6A). Numerous red and fluorescent bacterial colonies of B. ovis AabcBA expressing mCherry were observed inside alginate capsules, confirming that B. ovis was efficiently encapsulated (Figure 6B).

Exemplo 3: Avaliação da cepa B. ovis \abcBA encapsulada em alginato em camundongos [63] Para testar a vacina, inicialmente foram utilizados trinta e cinco camundongos BALB/c, machos, entre seis e oito semanas de idade. Um grupo de dez camundongos foi imunizado uma única vez pela via intraperitoneal e outros dez camundongos imunizados via subcutânea com 100 pL de suspensão contendo 108 UFC da cepa B. ovis AabcBA. Outros dez camundongos foram inoculados com PBS estéril (5 por via subcutânea e 5 por via intraperitoneal). Seis semanas após a imunização, 30 camundongos foram desafiados por via intraperitoneal com 100 pL de uma suspensão contendo 106 UFC da amostra virulenta de B. ovis (ATCC25840). Cinco camundongos restantes foram inoculados apenas com PBS pela via intraperitoneal e utilizados como controle negativo. Após duas semanas de desafio, os camundongos foram eutanasiados com anestesia prévia de cloridrato de xilazina (2%, 0,1 mg/kg, via intraperitoneal, Copazine, Schering-Plough Coopers, Brasil) e cloridrato de cetamina (1%, 35 mg/kg, via intraperitoneal) seguida de deslocamento cervical.Example 3: Evaluation of alginate encapsulated B. ovis \ abcBA strain in mice [63] To test the vaccine, initially thirty-five male BALB / c mice, aged between six and eight weeks, were used. One group of ten mice was immunized once via the intraperitoneal route and another ten mice immunized subcutaneously with 100 µl of suspension containing 108 CFU of the B. ovis AabcBA strain. Another ten mice were inoculated with sterile PBS (5 subcutaneously and 5 intraperitoneally). Six weeks after immunization, 30 mice were challenged intraperitoneally with 100 µl of a suspension containing 106 CFU of the virulent B. ovis sample (ATCC25840). Five remaining mice were inoculated with PBS only intraperitoneally and used as a negative control. After two weeks of challenge, mice were euthanized with prior anesthesia of xylazine hydrochloride (2%, 0.1 mg / kg intraperitoneally, Copazine, Schering-Plow Coopers, Brazil) and ketamine hydrochloride (1%, 35 mg / kg, intraperitoneally) followed by cervical dislocation.

[64] Os resultados mostraram que não houve diferença estatística significativa na recuperação de bactérias no baço dos diferentes grupos avaliados (Figura 7A), entretanto, no fígado dos camundongos vacinados tanto pela via subcutânea (p < 0,001) quanto pela via intraperitoneal (p < 0,05) houve redução significativa do número de UFC recuperadas em comparação ao seus respectivos controles (Figura 7B).[64] The results showed that there was no statistically significant difference in bacterial recovery in the spleen of the different groups evaluated (Figure 7A), however, in the liver of mice vaccinated either subcutaneously (p <0.001) or intraperitoneally (p < 0.05) there was a significant reduction in the number of CFU recovered compared to their respective controls (Figure 7B).

[65] Uma vez que não houve diferença na recuperação de CFU quando comparadas as diferentes vias de imunização utilizadas nesse experimento, foi empregada a via subcutânea, por ser a mais utilizada para vacinações.[65] Since there was no difference in CFU recovery when compared to the different immunization pathways used in this experiment, the subcutaneous route was used because it is the most commonly used for vaccinations.

[66] Para verificar o aumento da proteção em modelo murino da cepa B. ovis kabcBA após dose repetida de vacinação, foram feitas três imunizações subcutâneas com a cepa mutante B. ovis AabcBA nos animais com intervalo de uma semana entre cada vacinação. Para isto, foram utilizados 20 camundongos BALB/c, machos, entre 6-8 semanas de idade. Um grupo de 10 camundongos foi imunizado pela via subcutânea com 100 pL de suspensão contendo 108 UFC da cepa B. ovis AabcBA, três vezes, com uma semana de intervalo entre as imunizações. Os 10 camundongos restantes foram inoculados com PBS estéril três vezes, com uma semana de intervalo entre as imunizações. Após 6 semanas da imunização, todos os camundongos foram desafiados por via intraperitoneal com 100 pL de uma suspensão 106 UFC de amostra virulenta de B. ovis (ATCC25840). Após duas semanas de desafio, os camundongos foram eutanasiados com anestesia prévia de cloridrato de xilazina (2%, 0,1 mg/kg, via intraperitoneal, Copazine, Schering-Plough Coopers, Brasil) e cloridrato de cetamina (1%, 35 mg/kg, via intraperitoneal) seguida de deslocamento cervical. Este experimento foi aprovado pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal (CETEA/UFMG, protocolo n° 204/2012). Não foi observada diferença significativa no número de bactérias recuperadas no baço dos camundongos imunizados quando comparados aos não imunizados (Figura 8A), entretanto houve diferença estatística significativa (p < 0,001) quando esta comparação foi feita no fígado (Figura 8B).[66] To verify increased protection in the murine B. ovis kabcBA strain model after repeated dose vaccination, three subcutaneous immunizations with the mutant B. ovis AabcBA strain were performed in animals one week apart between vaccinations. Twenty male BALB / c mice aged 6-8 weeks were used for this purpose. A group of 10 mice were immunized subcutaneously with 100 µL of suspension containing 108 CFU of the B. ovis AabcBA strain three times with one week interval between immunizations. The remaining 10 mice were inoculated with sterile PBS three times, one week apart between immunizations. After 6 weeks of immunization, all mice were challenged intraperitoneally with 100 µl of a 106 CFU suspension of virulent B. ovis sample (ATCC25840). After two weeks of challenge, mice were euthanized with prior anesthesia of xylazine hydrochloride (2%, 0.1 mg / kg intraperitoneally, Copazine, Schering-Plow Coopers, Brazil) and ketamine hydrochloride (1%, 35 mg / kg, intraperitoneally) followed by cervical dislocation. This experiment was approved by the Animal Experimentation Ethics Committee (CETEA / UFMG, protocol No. 204/2012). No significant difference was observed in the number of bacteria recovered in the spleen of immunized mice compared to non-immunized mice (Figure 8A), however there was a statistically significant difference (p <0.001) when this comparison was made in the liver (Figure 8B).

[67] Para avaliar se há um aumento de proteção quando a cepa B. ovis AabcBA é encapsulada com alginato, foram utilizados 20 camundongos BALB/c (linhagem susceptível à infecção por õ. ovis) e 20 camundongos C57BL6 (linhagem resistente à infecção por B. ovis) (Fernandes et al., 1996; Murphy et al., 2001) machos, entre seis e oito semanas de idade, divididos em quatro grupos (para cada linhagem) contendo cinco camundongos em cada grupo: um grupo inoculado com PBS, um segundo grupo imunizado apenas com cápsulas de alginato estéril, um terceiro grupo imunizado apenas com a cepa mutante de B. ovis (100 pL de uma suspensão contendo 108 UFC) e um quarto grupo imunizado com a cepa mutante de B. ovis encapsulada com alginato estéril (100 pL de uma suspensão contendo 108 UFC), todos por via subcutânea. Após 8 semanas da imunização, todos os grupos foram desafiados com a cepa virulenta de B. ovis (100 pL de uma suspensão contendo 106 UFC) por via intraperitoneal. Após duas semanas do desafio, os camundongos foram eutanasiados com anestesia prévia de cloridrato de xilazina (2%, 0,1 mg/kg, via intraperitoneal) e cloridrato de cetamina (1%, 35 mg/kg, via intraperitoneal) seguida de deslocamento cervical. Este experimento foi aprovado pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal (CETEA/UFMG, protocolo n° 395/2013).[67] To assess whether there is an increased protection when the B. ovis AabcBA strain is encapsulated with alginate, 20 BALB / c mice (strain susceptible to Ovis infection) and 20 C57BL6 mice (strain resistant to B. ovis) (Fernandes et al., 1996; Murphy et al., 2001) males, aged between six and eight weeks, divided into four groups (for each strain) containing five mice in each group: one group inoculated with PBS , a second group immunized with sterile alginate capsules only, a third group immunized with the mutant B. ovis strain alone (100 µl of a suspension containing 108 CFU) and a fourth group immunized with the mutant encapsulated B. ovis strain. sterile alginate (100 µl of a suspension containing 108 CFU), all subcutaneously. After 8 weeks of immunization, all groups were challenged with the virulent B. ovis strain (100 µl of a suspension containing 106 CFU) intraperitoneally. Two weeks after challenge, mice were euthanized with previous anesthesia of xylazine hydrochloride (2%, 0.1 mg / kg, intraperitoneally) and ketamine hydrochloride (1%, 35 mg / kg, intraperitoneally) followed by displacement. cervical. This experiment was approved by the Animal Experimentation Ethics Committee (CETEA / UFMG, protocol No. 395/2013).

[68] Observou-se que a carga bacteriana foi reduzida (aproximadamente em um log) no baço de camundongos BALB/c imunizados com B. ovis AabcBA encapsulada quando comparada com os outros grupos (Figura 9A). No fígado, houve redução no número de bactérias recuperadas nos camundongos imunizados com B. ovis AabcBA encapsulada quando comparado aos camundongos não imunizados ou inoculados com alginato estéril (Figura 9B). Também houve redução significativa na carga bacteriana recuperada do baço (Figura 9C) e do fígado (Figura 9D) de camundongos C57BL6 imunizados com a cepa mutante encapsulada quando comparado aos outros grupos, A análise do índice de proteção das diferentes formas de apresentação da cepa vacinai B. ovis AabcBA mostrou que o encapsulamento com alginato aumentou o potencial de proteção da cepa (Tabela 2).[68] Bacterial burden was observed to be reduced (approximately one log) in the spleen of encapsulated B. ovis AabcBA immunized BALB / c mice as compared to the other groups (Figure 9A). In the liver, there was a reduction in the number of bacteria recovered in encapsulated B. ovis AabcBA immunized mice compared to unimmunized or sterile alginate inoculated mice (Figure 9B). There was also a significant reduction in the recovered spleen (Figure 9C) and liver (Figure 9D) bacterial load of C57BL6 mice immunized with the encapsulated mutant strain when compared to the other groups. The protection index analysis of the different forms of vaccine strain presentation B. ovis AabcBA showed that alginate encapsulation increased the strain protection potential (Table 2).

Tabela 2 - Proteção conferida por Brucella ovis AabcBA encapsulada com alginato ou não contra B. ovis em camundosgos BALB/c e C57BL6. * Diferença estatística significativa (p < 0,05) em relação aos demais grupos.Table 2 - Protection conferred by Brucella ovis AabcBA encapsulated with alginate or not against B. ovis in BALB / c and C57BL6 mice. * Statistically significant difference (p <0.05) compared to the other groups.

[69] Na macroscopia, não houve alteração significativa nem do tamanho nem do peso do baço dos camundongos BALB/c (Figuras 10A e 10B) e C57BL6 (Figuras 10C e 10D), imunizados com a cepa B. ovis habcBA encapsulada comparado aos demais grupos, mais evidente visualmente nesta última linhagem.[69] At macroscopy, there was no significant change in either size or spleen weight of the BALB / c (Figures 10A and 10B) and C57BL6 (Figures 10C and 10D) mice immunized with the encapsulated B. ovis habcBA strain compared to the other mice. groups, most visually evident in the latter lineage.

[70] Além disso, no fígado dos camundongos não imunizados com a cepa encapsulada, foi possível observar áreas circulares de aproximadamente 0,3 cm, esbranquiçadas e firme, caracterizadas como microgranulomas (Figuras 10A e 10C), que não foram vistos no fígado dos camundongos imunizados com esta cepa encapsulada (Figuras 10B e 10D).[70] Furthermore, in the liver of mice not immunized with the encapsulated strain, it was possible to observe approximately 0.3 cm circular, whitish, firm areas characterized as microgranulomas (Figures 10A and 10C), which were not seen in the liver of mice. mice immunized with this encapsulated strain (Figures 10B and 10D).

[71] A histopatologia mostrou que, no fígado dos camundongos não imunizados, inoculados com alginato e imunizados com a cepa mutante não encapsulada, havia numerosos microgranulomas no parênquima caracterizados por infiltrado inflamatório linfo-histíocitário e neutrofílico, multifocal aleatório associado à necrose multifocal (Figura 11 A), moderada e acúmulo multifocal e moderado de fibrina com neutrófilos e macrófagos na íntima de arteríolas do espaço porta. No fígado de camundongos imunizados com a cepa mutante encapsulada, houve diminuição significativa do número de microgranulomas (Figura 11B). Na polpa branca e na zona marginal do baço dos camundongos não imunizados com a cepa encapsulada havia grande quantidade de neutrófilos com área de necrose, caracterizando uma esplenite neutrofílica multifocal, intensa associada à necrose (Figura 11C), ao contrário dos imunizados com a cepa encapsulada, em que há raros neutrófilos (Figura 11 D).[71] Histopathology showed that in the liver of unimmunized, alginate-inoculated mice immunized with the unencapsulated mutant strain, there were numerous microgranulomas in the parenchyma characterized by random multifocal lymphohistiocytic inflammatory infiltrate associated with multifocal necrosis (Figure 11 A), moderate and multifocal and moderate accumulation of fibrin with neutrophils and macrophages in the intima of portal space arterioles. In the liver of mice immunized with the encapsulated mutant strain, there was a significant decrease in the number of microgranulomas (Figure 11B). In the white flesh and in the marginal zone of the spleen of mice not immunized with the encapsulated strain there was a large amount of neutrophils with necrosis area, characterizing an intense multifocal neutrophilic splenitis associated with necrosis (Figure 11C), unlike those immunized with the encapsulated strain. , where there are rare neutrophils (Figure 11 D).

[72] Foi atribuído escore às lesões inflamatórias observadas no baço e fígado dos diferentes grupos de camundongos BALB/c e C57BL6. A média do escore das lesões observadas no baço e no fígado dos camundongos BALB/c imunizados com a cepa encapsulada foi significativamente menor (p < 0,01) quando comparada às lesões nos camundongos não imunizados e inoculados com alginato (Figuras 12A e 12B). Na comparação do escore de lesões no baço de camundongos C57BL6, os resultados foram semelhantes, entretanto o valor de P foi < 0,05 (Figura 12C). Na comparação do escore de lesões no fígado, os resultados foram semelhantes aos das lesões de baço e fígado dos camundongos da linhagem BALB/c (Figura 12D).[72] A score was attributed to the inflammatory lesions observed in the spleen and liver of the different groups of BALB / c and C57BL6 mice. The mean score of lesions observed in the spleen and liver of BALB / c mice immunized with the encapsulated strain was significantly lower (p <0.01) compared to lesions in unimmunized and alginate inoculated mice (Figures 12A and 12B). . In comparing the injury score in the spleen of C57BL6 mice, the results were similar, however the P value was <0.05 (Figure 12C). In comparing the liver injury score, the results were similar to those of the spleen and liver lesions of BALB / c mice (Figure 12D).

[73] A ausência de lesões macroscópicas no baço e no fígado, diminuição do número de microgranulomas no fígado e diminuição de infiltrado inflamatório neutrofílico no baço são indicativos de uma boa proteção, assim, estes resultados positivos são encorajadores para utilização da cepa B. ovis AabcBA como vacina em carneiros.[73] The absence of macroscopic lesions in the spleen and liver, decreased number of microgranulomas in the liver, and decreased neutrophilic inflammatory infiltrate in the spleen are indicative of good protection, so these positive results are encouraging for use of the B. ovis strain. AabcBA as a vaccine in sheep.

Exemplo 4: Avaliação da cepa B. ovis AabcBA, encapsulada ou não em alginato, em carneiros [74] Para avaliação da cepa B. ovis AabcBA, encapsulada ou não em alginato, como vacina em carneiros tanto, foram utilizados trinta carneiros, negativos por sorologia e PCR de urina para B. ovis, mestiços, não castrados, com um ano de idade. Os carneiros foram alimentados com feno e ração para ovinos com 18 % de proteína, duas vezes ao dia. Estes tiveram água e sal mineral especial para ovinos disponíveis no piquete à vontade. Dez carneiros foram inoculados por via subcutânea, com 2 mL de PBS, outros 10 animais foram imunizados, por via subcutânea, com 2 mL de uma suspensão contendo 1 x 109 UFC da cepa B. ovis AabcBA e os outros 10 foram imunizados com a cepa mutante de B. ovis AabcBA encapsulada com alginato, por via subcutânea, mesmo volume e mesma concentração do grupo anterior. Os carneiros eram mantidos em piquetes diferentes (dez carneiros em cada piquete), sem contato direto e com tratadores diferentes. Após o período de dois meses, os animais foram desafiados com 2 mL de solução contendo 1,2 x 109 UFC/mL de B. ovis cepa ATCC25840 por via intraprepucial e 50 pL em ambos os sacos conjuntivais de solução contendo 1,2 x 101° UFC da mesma cepa. As inoculações prepucial e conjuntival foram realizadas simultaneamente, de forma que cada animal recebeu o desafio de 3,6 x 109 UFC de B. ovis. Os animais foram submetidos a colheitas quinzenais, dois meses antes e dois meses depois do desafio, de amostras de soro para exame sorológico de IDGA, sangue para imunoproliferação e imunofenotipagem, além de amostras de sêmen para esfregaço, isolamento bacteriano e reação de PCR e urina para isolamento bacteriano e reação de PCR. Ao final do experimento, os carneiros foram sedados profundamente com cloridrato de xilazina (2%, 0,1 mg/kg, via endovenosa, Copazine, Schering-Plough Coopers, Brasil), anestesiados com overdose de tiopental sódico (via endovenosa, Cristalia, Brasil) e então eutanasiados por eletrocussão. Após a eutanásia, fragmentos de cauda, cabeça e corpo do epidídimo, testículo, glândula vesicular, glândula bulbouretral, ampola, glande, prepúcio, linfonodos ilíacos, baço e fígado foram coletados e destinados às técnicas de isolamento bacteriano, histopatologia, extração de DNA e PCR. Este experimento foi aprovado pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal (CETEA/UFMG, protocolo n° 204/2012).Example 4: Evaluation of B. ovis AabcBA strain, whether or not encapsulated in alginate, in sheep [74] For evaluation of B. ovis AabcBA strain, whether encapsulated or not in alginate, as a vaccine in both sheep, thirty sheep, negative by serology and PCR of one-year-old mixed-breed non-castrated B. ovis urine. The sheep were fed hay and sheep feed with 18% protein twice a day. These had special sheep water and mineral salt available at the paddock at will. Ten sheep were subcutaneously inoculated with 2 mL of PBS, another 10 animals were immunized subcutaneously with 2 mL of a suspension containing 1 x 109 CFU of the B. ovis AabcBA strain and the other 10 were immunized with the strain. subcutaneous alginate encapsulated B. ovis AabcBA mutant, same volume and same concentration as previous group. The rams were kept in different paddocks (ten rams in each paddock), without direct contact and with different keepers. After two months, the animals were challenged with 2 mL solution containing 1.2 x 109 CFU / mL B. ovis strain ATCC25840 intrapreputaneously and 50 pL in both conjunctival solution bags containing 1.2 x 101 ° CFU of the same strain. The preputial and conjunctival inoculations were performed simultaneously, so that each animal received the 3.6 x 109 CFU challenge from B. ovis. Animals were subjected to biweekly collections, two months before and two months after challenge, from serum samples for serological examination of IDGA, blood for immunoproliferation and immunophenotyping, as well as swab semen samples, bacterial isolation and PCR and urine reaction. for bacterial isolation and PCR reaction. At the end of the experiment, the sheep were deeply sedated with xylazine hydrochloride (2%, 0.1 mg / kg intravenously, Copazine, Schering-Plow Coopers, Brazil), anesthetized with sodium thiopental overdose (intravenous route, Cristalia, Brazil) and then euthanized by electrocution. After euthanasia, tail, head and body fragments of the epididymis, testis, vesicular gland, bulbourethral gland, ampulla, glans, foreskin, iliac lymph nodes, spleen and liver were collected and destined to the techniques of bacterial isolation, histopathology, DNA extraction and PCR. This experiment was approved by the Animal Experimentation Ethics Committee (CETEA / UFMG, protocol No. 204/2012).

[75] Os resultados demonstraram que noventa por cento (9/10) dos carneiros imunizados com B. ovis AabcBA encapsulada e 70% (7/10) dos carneiros imunizados somente com a cepa mutante tornaram-se sorologicamente positivos por IDGA duas semanas após a imunização.[75] Results showed that ninety percent (9/10) of sheep immunized with encapsulated B. ovis AabcBA and 70% (7/10) of sheep immunized with the mutant strain alone became serologically positive by IDGA two weeks after the immunization.

[76] Ambos os grupos de carneiros permaneceram soropositivos até a quarta quinzena pós-imunização. Como esperado, os carneiros não imunizados não foram positivos para B. ovis antes do desafio. Nas duas primeiras semanas após o desafio, há diminuição significativa de animais soropositivos tanto do grupo imunizado com a cepa mutante encapsulada (3/10; p < 0,001) quanto do grupo imunizado somente com a cepa mutante sem encapsulamento (6/10; p< 0,05). Nas duas semanas seguintes, o número de carneiros soropositivos aumentou em ambos os grupos: imunizados com a cepa mutante encapsulada aumentou para 90% e os imunizados somente com a cepa mutante aumentou para 60%. Na oitava semana após o desafio, a porcentagem de carneiros imunizados com a cepa encapsulada soropositivos é de 90% enquanto que a porcentagem de não imunizados diminuiu para 70% assim como dos imunizados com a cepa não encapsulada (Figura 13).[76] Both groups of sheep remained seropositive until the fourth fortnight after immunization. As expected, unimmunized sheep were not positive for B. ovis prior to challenge. In the first two weeks after challenge, there is a significant decrease in seropositive animals from both the group immunized with the encapsulated mutant strain (3/10; p <0.001) and the group immunized with the unencapsulated mutant strain only (6/10; p < 0.05). Over the next two weeks, the number of seropositive sheep increased in both groups: immunized with the encapsulated mutant strain increased to 90% and those immunized with the mutant strain alone increased to 60%. In the eighth week after challenge, the percentage of sheep immunized with the encapsulated seropositive strain is 90% while the percentage of unimmunized decreased to 70% as well as those immunized with the unencapsulated strain (Figure 13).

[77] Para avaliar a proteção induzida pela cepa B.ovis AabcBA encapsulada ou não, amostras de urina e sêmen foram coletadas e submetidos à cultura bacteriológica e PCR. Durante as quatro quinzenas após a imunização, não houve crescimento bacteriano nem no sêmen, nem na urina da amostra vacinai B. ovis AabcBA nos carneiros imunizados. Depois do desafio, nenhum dos carneiros imunizados com a cepa mutante encapsulada ou não eliminaram B. ovis no sêmen ou na urina. Apenas os carneiros não vacinados eliminaram B. ovis durante quatro quinzenas (Figuras 14A e 14B).[77] To assess protection induced by the encapsulated or unencapsulated B.ovis AabcBA strain, urine and semen samples were collected and subjected to bacteriological culture and PCR. During the fortnight after immunization, there was no bacterial growth in either semen or urine of the B. ovis AabcBA vaccine sample in the immunized sheep. After the challenge, none of the sheep immunized with the encapsulated mutant strain either did not eliminate B. ovis in semen or urine. Only unvaccinated sheep eliminated B. ovis for four fortnight (Figures 14A and 14B).

[78] Não foi detectado o DNA de B. ovis no sêmen ou na urina de carneiros vacinados com a cepa mutante encapsulada ou não com alginato, sendo detectado somente em amostras de sêmen de carneiros não imunizados (Figuras 14C e 14D).[78] B. ovis DNA was not detected in the semen or urine of sheep vaccinated with the alginate-encapsulated or non-encapsulated mutant strain and was only detected in unimmunized sheep semen samples (Figures 14C and 14D).

[79] Para avaliar a detecção de DNA de B. ovis nos tecidos do sistema reprodutor, baço, fígado e linfonodo ilíaco dos carneiros, foram realizados cultivo bacteriano e PCR.[79] To evaluate the detection of B. ovis DNA in the reproductive system, spleen, liver, and iliac lymph node tissues of the sheep, bacterial culture and PCR were performed.

[80] A cepa virulenta de B. ovis não foi detectada através do cultivo bacteriológico em nenhuma das amostras de tecidos recolhidos de animais imunizados com a cepa mutante B. ovis AabcBA encapsulada e não encapsulada, sendo detectada apenas em tecidos de carneiros não imunizados. De todos os tecidos avaliados de carneiros não imunizados, não houve detecção de B. ovis apenas no baço (Figura 15A).[80] The B. ovis virulent strain was not detected by bacteriological culture in any of the tissue samples collected from animals immunized with the encapsulated and non-encapsulated mutant B. ovis AabcBA strain and was detected only in non-immunized sheep tissues. Of all tissues evaluated from unimmunized sheep, B. ovis was not detected only in the spleen (Figure 15A).

[81] Quando se verificou a detecção de DNA de B. ovis por PCR nos tecidos de carneiros imunizados com a cepa mutante encapsulada ou não encapsulada, não houve nenhum tecido positivo. Em 80% (8/10) dos carneiros não imunizado, cabeça e corpo do epidídimo, testículo, glândula vesicular, prepúcio e baço foram positivos no PCR (Figura 15B).[81] When PCR detection of B. ovis DNA was found in the tissues of sheep immunized with the encapsulated or unencapsulated mutant strain, there was no positive tissue. In 80% (8/10) of the unimmunized sheep, epididymis head and body, testis, vesicular gland, foreskin and spleen were positive on PCR (Figure 15B).

[82] Não foram observadas células inflamatórias em nenhuma das amostras de sêmen de todos os carneiros antes do desafio, mesmo após a imunização dos grupos com cepa B. ovis AabcBA encasulada ou não. A partir da 1a quinzena pós-desafio, quase todos os carneiros (8/10) não imunizados apresentaram células inflamatórias no ejaculado (predominantemente neutrófilos, com alguns linfócitos) e a quantidade dessas células variou de discreta a intensa. Quatro carneiros imunizados com a cepa mutante não encapsulada não eliminaram células inflamatórias no sêmen e apenas um carneiro vacinado com a cepa mutante encapsulada, em um único tempo, eliminou moderada quantidade de linfócitos e plasmócitos no sêmen (Tabela 3).[82] No inflammatory cells were observed in any semen samples from all sheep prior to challenge, even after immunization of the groups with or without encased B. ovis AabcBA strain. From the first fortnight post challenge, almost all unimmunized sheep (8/10) had inflammatory cells in the ejaculate (predominantly neutrophils, with some lymphocytes) and the amount of these cells ranged from mild to intense. Four sheep immunized with the unencapsulated mutant strain did not eliminate inflammatory cells in the semen and only one sheep vaccinated with the encapsulated mutant strain at a single time eliminated moderate semen lymphocytes and plasma cells (Table 3).

Tabela 3 - Células inflamatórias no sêmen de carneiros não imunizados e imunizados com Brucella ovis AabcBA encapsulada ou não e desafiados com a cepa virulenta de B. ovis após imunização e após o desafio. Avaliação semi-quantitativa no sêmen (-) ausente, (+) discreto, (++) moderado, (+++) intenso.Table 3 - Inflammatory cells in semen of sheep not immunized and immunized with Brucella ovis AabcBA encapsulated or not and challenged with B. ovis virulent strain after immunization and after challenge. Semi-quantitative evaluation in semen (-) absent, (+) discrete, (++) moderate, (+++) intense.

Avaliação semi-quantitativa no sêmen: (-) ausente, (+) discreto, (++) moderado, (+++) intenso.Semi-quantitative semen evaluation: (-) absent, (+) discrete, (++) moderate, (+++) intense.

[83] Após a primeira quinzena pós-desafio, durante o exame clínico, alguns carneiros não imunizados apresentaram aumento significativo e unilateral da cauda do epidídimo (principalmente esquerda), levando à assimetria (Figura 16A) e dor à palpação. Nas quinzenas seguintes, foi possível sentir durante a palpação escrotal flacidez dos testículos (provavelmente devido à degeneração testicular) e estruturas nodulares, de aproximadamente 2x2 cm, firmes na cauda do epidídimo esquerdo de alguns carneiros não imunizados (granulomas). Os carneiros imunizados não apresentaram nenhuma alteração durante o exame clínico ao longo do experimento.[83] After the first fortnight post-challenge, during the clinical examination, some unimmunized sheep had a significant unilateral tail lift (mainly left) leading to asymmetry (Figure 16A) and pain on palpation. In the following fortnight, it was possible to feel sagging testis during scrotal palpation (probably due to testicular degeneration) and nodular structures, approximately 2x2 cm, firm in the left epididymis tail of some unimmunized sheep (granulomas). The immunized sheep did not show any changes during the clinical examination throughout the experiment.

[84] Durante a necropsia não foram observadas lesões nos carneiros imunizados com a cepa mutante B. ovis AabcBA encapsulada nem naqueles imunizados com a cepa mutante não encapsulada. Entretanto, nos animais não imunizados, pode-se observar estruturas arredondadas, de aproximadamente 3x2x1 cm, amarelo-avermelhadas, firmes, no folheto visceral da túnica vaginal próximo à cauda epidídimo (Figura 16B), aderências fibrosas entre a porção da túnica albugínea que reveste o testículo e a porção desta que reveste a cabeça do epidídimo (Figura 16C), assim como aderência fibrinosa na túnica albugínea (Figura 16D), além de edema na túnica vaginal.[84] During autopsy no lesions were observed in sheep immunized with the encapsulated mutant B. ovis AabcBA strain or in those immunized with the non-encapsulated mutant strain. However, in non-immunized animals, firm, reddish-yellow, rounded structures of approximately 3x2x1 cm may be seen on the visceral leaflet of the vaginal tunic next to the epididymal tail (Figure 16B), fibrous adhesions between the portion of the albuginous tunic covering the testis and the portion that lines the epididymis head (Figure 16C), as well as fibrinous adherence in the albuginous tunic (Figure 16D), as well as edema in the vaginal tunic.

[85] Na microscopia, observou-se infiltrado inflamatório neutrofílico, linfo-histiocitário moderado ou intenso principalmente na cauda (20%) (Figura 17A) e cabeça (20%) do epidídimo, ampola (20%) (Figura 17C) glândula vesicular (30%), linfonodos ilíacos (70%), fígado (10%), baço (60%) e túnica vaginal (20%) dos carneiros não imunizados. Foram observadas mínimas alterações histopatológicas nos animais imunizados com a cepa mutante não encapsulada, como por exemplo, infiltrado inflamatório linfocítico discreto em glândulas vesicular e bulbo uretral (Figura 18), Os fragmentos dos tecidos dos carneiros imunizados com a cepa mutante encapsulada com alginato não apresentaram alterações histológicas significativas (Figuras 17Be 17D).[85] At microscopy, neutrophilic inflammatory infiltrate, moderate or severe lymphohistiocytic infiltrate were observed mainly in the tail (20%) (Figure 17A) and head (20%) of the epididymis, ampoule (20%) (Figure 17C) (30%), iliac lymph nodes (70%), liver (10%), spleen (60%) and vaginal tunic (20%) of unimmunized sheep. Minimal histopathological changes were observed in animals immunized with the unencapsulated mutant strain, such as mild lymphocytic inflammatory infiltrate in vesicular glands and urethral bulb (Figure 18). The tissue fragments of sheep immunized with the alginate encapsulated mutant strain did not show significant histological changes (Figures 17B and 17D).

[86] O ensaio de proliferação foi realizado para avaliar a resposta imune celular da cepa B. ovis AabcBA encapsulada ou não.[86] Proliferation assay was performed to evaluate the cellular immune response of the encapsulated or not encapsulated B. ovis AabcBA strain.

[87] Observou-se um aumento significativo do percentual de linfócitos tanto dos carneiros imunizados com B. ovis AabcBA encpsulada quanto daqueles imunizados com a cepa mutante não encapsulada comparado aos carneiros não imunizados após imunização (p < 0,5) (Figura 19A) e após o desafio (p < 0,01) (Figura 19B).[87] A significant increase in lymphocyte percentage was observed for both sheep immunized with encapsulated B. ovis AabcBA and those immunized with the unencapsulated mutant strain compared to sheep not immunized after immunization (p <0.5) (Figure 19A) and after challenge (p <0.01) (Figure 19B).

[88] De acordo com os resultados apresentados, pode-se afirmar que a cepa mutante B. ovis AabcBA encapsulada com alginato é imunogênica e confere proteção a carneiros contra infecção experimental por B. ovis.[88] According to the results presented, it can be stated that the alginate encapsulated B. ovis AabcBA mutant strain is immunogenic and confers protection to sheep against experimental B. ovis infection.

REIVINDICAÇÕES

Claims

Pharmaceutical composition comprising the alginate-encapsulated Brucella ovis AabcBA strain plus pharmaceutically acceptable excipients and adjuvants.

2. Attenuated Brucella encapsulated strain, characterized in that it is the alginate encapsulated Brucella ovis strain AabcBA.

Encapsulation process comprising the following steps: (a) adding the cells (0.5 x 1011 to 2 x 1011 CFU of B. ovis) to a sodium alginate solution (1%); (b) slow dripping of the mixture obtained in (a) into a calcium chloride (CaCb) solution (0.5%); (c) homogenizing the capsules formed in (b) for 15 minutes followed by washing in MOPS buffer solution (4-morpholinepropanesulfonic acid); (d) adding the capsules obtained in (c) to a suspension of Poly-L-lysine (0.5%) (15 minutes) while stirring; (e) washing the capsules obtained from (d) in MOPS buffer solution; (f) adding the particles obtained in (e) to an alginate solution (0.03%) (5 minutes); (g) washing the particles obtained in (f) in a MOPS buffer solution.

Encapsulation process according to Claim 3, step "b", characterized in that the dripping can be performed with the aid of an insulin syringe, preferably 0.2 ml with 0.23 x 4 mm needle.

Encapsulation process according to claim 3, step "c", characterized in that the homogenization can be carried out by the use of a bench shaker.

Use of the pharmaceutical composition as defined in claim 1 for the prevention of Brucella ovis infections.

Use of the pharmaceutical composition according to claim 6, characterized in that it is by subcutaneous route.