BR112021000934A2 - receptor para vista - Google Patents

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Pierre Ferré
Francisco Cruzalegui
Noureddine Loukili
Olivier Delfour
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Pierre Fabre Medicament
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Abstract

RECEPTOR PARA VISTA. A presente descrição fornece métodos para modular (por exemplo, prevenir, inibir, bloquear) a interação de PSGL-1 e VISTA com agentes (por exemplo, anticorpos) que se ligam a PSGL-1 e/ou VISTA.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "RECEPTOR PARA VISTA".
INTRODUÇÃO
[0001] A imunoterapia tem sido uma virada de jogo no campo da te- rapia do câncer. Os desenvolvimentos na terapia baseada em pontos de controle imunológico estão progredindo em um ritmo impressionante. No entanto, apenas uma porção dos pacientes responde às imunoterapias. Um desafio particular na imunoterapia do câncer tem sido a identificação de biomarcadores baseados em mecanismo que podem ser usados para identificar candidatos para tal tratamento e orientar as decisões de geren- ciamento de doenças (Topalian et a/., N Engl J Med, 366 (26): 2443-54 (2012)). Portanto, a seleção do paciente é uma questão importante, pois evitará a toxicidade relacionada ao tratamento e os custos em pacientes que provavelmente não se beneficiarão.
[0002] A fim de garantir que uma resposta imune inflamatória não se- ja constantemente ativada uma vez que os antígenos tumorais tenham estimulado uma resposta, vários controles ou "pontos de checagem" es- tão no lugar ou ativados. Esses pontos de checagem são principalmente representados pelo receptor de células T ligando-se a ligantes em células no microambiente tumoral circundante, formando sinapses imunológicas que, então, regulam a função da célula T.
[0003] VISTA (supressor de lg de domínio V de ativação de células T) é uma proteína controle de ponto de checagem negativo que regula a ati- vação de células T e as respostas imunes. É uma proteína transmembra- nar do tipo | que contém um único domínio do tipo V do tipo Ig com homo- logia com domínios semelhantes das famílias B7 e CD28 e um domínio intracelular. O domínio da cauda citoplasmática de VISTA contém dois sítios de ligação de proteína cinase C em potencial, bem como resíduos de prolina que podem funcionar como sítios de ancoragem, sugerindo que VISTA pode funcionar como um receptor e um ligante.
[0004] VISTA é homólogo ao PDL-1, mas exibe um padrão de ex- pressão único que é restrito ao compartimento hematopoiético. VISTA é mais altamente expresso em células mieloides e granulocíticas, expresso em níveis mais baixos em células T, mas não está presente em células B (Wang et al., JEM208 (3): 577-592 (2011); Flies et al., J. Immunology187 (4): 1537-1541 (2011)). VISTA é induzido em células T e populações de células mieloides após ativação ou imunização, sugerindo que a inflama- ção induz sua expressão (Wang et al., Supra). Por outro lado, nenhuma expressão de VISTA foi detectada em células tumorais (Le Mercier et al., Cancer Res; 74: 1933-44 (2014)), embora tenha sido relatado que células de câncer gástrico humano expressam VISTA em uma frequência baixa (Bóger et al., Oncolmmunology, 6: 4, e1293215 (2017)). Quando presen- te, a expressão de VISTA parece restrita às células CD11b* infiltrantes no microambiente tumoral de câncer de cólon ou pulmão. No entanto, obser- vou-se que mais estudos eram necessários para identificar as caracterís- ticas do tumor que podem estar associadas à expressão de VISTA no microambiente tumoral (Lines et al., Cancer Immunol Res; 2 (6): 510-7 (2014)).
[0005] VISTA parece funcionar como um receptor negativo em célu- las T e como um ligante expresso em APCs interagindo com um receptor desconhecido em células T.
[0006] Vários achados sugerem que VISTA regula negativamente as respostas das células T, agindo como um ligante que interage com um receptor desconhecido nas células T. Como PD-L1, VISTA é um ligante que suprime profundamente a imunidade (Lines et al., Cancer Res; 74: 1924-32 (2014)), e como PD-L1, o bloqueio de VISTA permite o desen-
volvimento de imunidade terapêutica ao câncer em modelos de oncologia pré-clínica (veja, Le Mercier et al., supra). Enquanto o bloqueio de VISTA aumenta a imunidade, especialmente a imunidade de células T mediada por CD8* e CD4*, o tratamento com uma proteína de fusão de lg solúvel do domínio extracelular de VISTA (VISTA-lg) inibe a proliferação de célu- las T e a produção de citocinas in vitro, e a superexpressão de VISTA em células tumorais MCA10S5 interfere com a imunidade antitumoral protetora em camundongos (Wang et al., supra). Além disso, a administração de um anticorpo monoclonal específico para VISTA aumentou a resposta das células T CD4* in vivo e o desenvolvimento de autoimunidade em camundongos (Wang et al., Supra). Por outro lado, VISTA parece ter ati- vidades funcionais não redundantes com outros membros da superfamília de lg e pode desempenhar um papel no desenvolvimento da autoimuni- dade e vigilância imunológica no câncer. Especificamente, embora estu- dos usando proteínas de fusão Fc mostrem claramente que VISTA tem atividade de ligante (Wang et a/., Supra, Lines et al., Supra), a atividade de sinalização semelhante a receptor também foi descrita (Flies et al., J Clin Invest; 124: 1966-75 (2014)). De fato, um papel negativo direto do VISTA como receptor nas células T é apoiado por vários estudos.
[0007] É bem conhecido que a composição dos infiltrados de células imunes varia não apenas entre diferentes entidades tumorais, mas tam- bém dentro de tumores do mesmo sítio anatômico. Os autores especula- ram que a resposta a diferentes combinações imunoterapêuticas prova- velmente dependerá do meio imunológico do paciente (Farkona et al., BMC Medicine 14: 73 (2016)). A este respeito, a expressão de PDL-1 é conhecida por ser induzida para evitar o ataque imunológico (Sharma et al., Cell, 168: 707-23 (2017)). A expressão de PDL-1 mostra variações intratumorais e intertumorais (Mino-Kenudson, Cancer Biol Med, 13 (2):
157-70 (2016)), mas está associado a uma resposta objetiva a um anti- corpo anti-PD-1 (Topalian et al., supra). Por outro lado, os parceiros de ligação a VISTA que mediam os efeitos da proteína ainda não foram iden- tificados (Le Mercier et al., Frontiers in Immunology, 6: 418 (2015)). Em- bora dois ensaios clínicos de fase | com molécula anti-VISTA tenham sido iniciados, não há biomarcador capaz de prever a resposta de um paciente a esses tratamentos. Assim, há uma necessidade de identificar o parceiro de ligação de VISTA, pois isso facilitaria o desenvolvimento terapêutico e permitiria a seleção de pacientes suscetíveis ao tratamento com agente terapêutico anti-VISTA.
[0008] Todos os métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos descritos neste documento podem ser usados na prática ou no teste da presente invenção, com métodos e materiais adequados sendo descri- tos neste documento. A prática da invenção emprega, a menos que de outra forma indicado, técnicas convencionais ou química de proteínas, virologia molecular, microbiologia, tecnologia de DNA recombinante e farmacologia, que estão dentro da habilidade na técnica. Tais técnicas são totalmente explicadas na literatura (veja, por exemplo, Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, Current Protocols; 5º Ed., 2002; Remington's Pharmaceutical Sciences, 17º ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985; e Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; 3º Ed., 2001). As nomen- claturas usadas em conexão com, e os procedimentos de laboratório e técnicas de, biologia molecular e celular, bioquímica de proteínas, enzi- mologia e química medicinal e farmacêutica aqui descritos são aqueles bem conhecidos e comumente usados na técnica. Todas as publicações, pedidos de patentes, patentes e outras referências aqui mencionadas são incorporadas por referência em sua totalidade. Além disso, os materiais,
métodos e exemplos são apenas ilustrativos e não se destinam a ser limi- tantes, a menos que especificado de outra forma.
[0009] Outras características e vantagens da invenção serão eviden- tes a partir da seguinte descrição detalhada e das reivindicações.
LEGENDAS DAS FIGURAS
[0010] A FIG. 1 mostra um fluxograma do procedimento de rastrea- mento CAPTIREC'T"Y usando reagentes TRICEPS. O ligante de interesse era uma proteína de fusão VISTA-Fc. O ligante de controle era um anti- corpo anti-CD28.
[0011] A FIG. 2 mostra uma ilustração de Protter de PSGL-1. Os sí- tios de N-glicosilação são representados por resíduos rodeados por qua- drados e os peptídeos observados experimentalmente são representados por círculos preenchidos.
[0012] A FIG. 3 mostra os resultados de ensaios de ligação exempla- res para VISTA-Fc ao domínio extracelular do construto A de PSGL-1.
[0013] A FIG. 4 mostra os resultados de ensaios de ligação exempla- res para VISTA-Fc ao domínio extracelular do construto B de PSGL-1.
[0014] A FIG. 5 mostra um histograma exemplar da detecção de PSGL-1 em células HL-60 por citometria de fluxo. O isotipo e o antece- dente são representados pelo pico sombreado em cinza e as células que expressam PSGL-1 são representadas pelo pico sombreado branco.
[0015] A FIG 6 mostra um Western Blot exemplar detectando a inte- ração entre VISTA e PSGL-1. PSGL-1 é indicado por setas; a redução incompleta do PSGL-1 é conhecida por resultar em mais de uma banda.
[0016] A FIG. 7 mostra um gráfico de barras de um anticorpo anti- VISTA atenuando a interação entre VISTA e PSGL-1. Cada barra repre- senta as intensidades das bandas correspondentes à proteína PSGL-1. O símbolo "-" representa nenhum anticorpo anti-VISTA adicionado. O sím-
bolo "+" representa a pré-incubação com anticorpo anti-VISTA.
[0017] A FIG. 8 mostra um histograma exemplar da detecção de PSGL-1 em PBMCs por citometria de fluxo. O isotipo e o antecedente são representados pelo pico sombreado em cinza e as células que expres- sam PSGL-1 são representadas pelo pico sombreado branco.
[0018] A FIG. 9 mostra um Western Blot exemplar mostrando a co- imunoprecipitação de PSGL-1 usando anticorpos anti-VISTA e anti- PSGL-1. PSGL-1 é indicado por uma seta.
[0019] A FIG. 10 mostra a expressão de PSGL-1 em ensaios de ci- tometria de fluxo exemplares de subconjuntos de células T efetoras exau- ridas, efetoras e em repouso virgens &.
[0020] A FIG. 11 mostra a expressão de PSGL-1 em ensaios de ci- tometria de fluxo exemplares de memória central circulante e subconjun- tos de células T de memória efetora circulante.
[0021] A FIG. 12 mostra um exemplo de manchamento multiplex de mMRNA para PSGL1, VISTA e PDL1 em um tumor de pulmão escamoso
[0022] A FIG. 13 mostra um gráfico de barras de PSGL-1 inibindo a liberação de IL-2 dependente de VISTA a partir de células T CD4*.
DEFINIÇÕES
[0023] A menos que definido de outra forma, todos os termos técni- cos e científicos usados neste documento têm o mesmo significado que é comumente entendido por alguém versado na técnica. Todas as paten- tes, pedidos, pedidos publicados e outras publicações são incorporados por referência em sua totalidade. No caso de haver uma pluralidade de definições para um termo aqui, aquelas nesta seção prevalecem, a me- nos que indicado de outra forma.
[0024] O termo "cerca de" ou "aproximadamente" refere-se à faixa normal de erro para um determinado valor ou faixa conhecida pela pes-
soa versada na técnica. Geralmente significa dentro de 20 %, como den- tro de 10 %, ou dentro de 5 % (ou 1 % ou menos) de um determinado va- lor ou intervalo.
[0025] Quando aqui usado, "administrar" ou "administração" refere-se ao ato de injetar ou de outra forma distribuir fisicamente uma substância como ela existe fora do corpo (por exemplo, um anticorpo anti-PSGL-1 e/ou anticorpo anti-VISTA aqui fornecido) em um paciente, tal como por distribuição mucosa, intradérmica, intravenosa, intramuscular e/ou qual- quer outro método de distribuição física aqui descrito ou conhecido na técnica. Quando uma doença, ou um sintoma dela, está sendo tratada, a administração da substância ocorre tipicamente após o início da doença ou dos sintomas dela. Quando uma doença, ou seus sintomas, estão sendo prevenidos, a administração da substância ocorre tipicamente an- tes do início da doença ou seus sintomas.
[0026] Quando aqui usado, um "antagonista" ou "inibidor" refere-se a uma molécula que é capaz de inibir ou de outro modo diminuir uma ou mais das atividades biológicas de uma proteína alvo, como PSGL-1, VIS- TA ou uma molécula coinibidora aqui descrita. Em algumas modalidades, um antagonista de PSGL-1 (por exemplo, um anticorpo antagonista aqui fornecido) pode, por exemplo, agir inibindo ou diminuindo de outra forma a ativação e/ou as vias de sinalização celular da célula que expressa PSGL-1 (por exemplo, uma célula T) e/ou a célula que expressa VISTA (por exemplo, uma célula tumoral com VISTA, uma célula T reguladora, uma célula supressora derivada de mieloide ou uma célula dendrítica su- pressora), inibindo assim uma atividade biológica da célula em relação à atividade biológica na ausência do antagonista. Em algumas modalida- des, os anticorpos aqui fornecidos são anticorpos anti-PSGL-1 antagonis- tas. Em algumas modalidades, um antagonista de uma molécula coinibi-
dora (por exemplo, um anticorpo antagonista contra VISTA, CD86, CD80, PDL-1, PDL-2, CTLA-4, PD1, LAG3, BTNL2, B7-H3, B7-HA4, a butirofilina, CD48, CD244, TIM-3, CD200R, CD200, CD160, BTLA, HVEM, LAIR1, TIM1, Galectina 9, TIM3, CD48, 2B4, CD155, CD112, CD113 ou TIGIT) pode, por exemplo, agir inibindo ou de outra forma diminuindo a ativação e/ou as vias de sinalização celular da célula que expressa a molécula coinibidora (por exemplo, uma célula T ou uma célula apresentadora de antígeno), inibindo assim uma atividade biológica da célula em relação à atividade biológica na ausência do antagonista. Em algumas modalida- des, a molécula antagonista é um anticorpo antagonista, ou seja, um an- ticorpo que inibe ou reduz uma ou mais das atividades biológicas de um antígeno, como PSGL-1, VISTA ou uma molécula coinibidora diferente aqui descrita. Certos anticorpos antagonistas inibem substancialmente ou completamente uma ou mais das atividades biológicas do referido antí- geno.
[0027] Quando aqui usado, um "agonista" ou "ativador" refere-se a uma molécula que é capaz de ativar ou de outra forma aumentar uma ou mais das atividades biológicas de uma proteína alvo, como uma molécula coestimuladora. Em algumas modalidades, um agonista de uma molécula coestimuladora (por exemplo, um anticorpo agonístico de CD154, TNFRSF25, GITR, 4-1BB, OX40, CD27, TMIGD2, ICOS, CD28, CDA40, TL1A, GITRL, 41BBL, OX40L, CD70 , HHLA2Z, ICOSL, uma citocina, LIGHT, HVEM, CD30, CD30L, B7-H2, CD80, CD86, CD40L, TIMA4, TIM1, SLAM, CD48, CD58, CD155, CD112, DR3, GITR, CD2 e CD226) podem, por exemplo, atuar ativando ou de outra forma aumentando as vias de ativação e/ou sinalização celular da célula que expressa a molécula co- estimuladora (por exemplo, uma célula T ou uma célula apresentadora de antígeno), aumentando assim a atividade biológica da célula relativa à atividade biológica na ausência do agonista. Em algumas modalidades, a molécula agonista é um anticorpo agonístico, isto é, um anticorpo que ativa ou aumenta uma ou mais das atividades biológicas de um antígeno, como PSGL-1, VISTA ou uma molécula coinibidora diferente aqui descri- ta. Certos anticorpos agonísticos ativam substancialmente ou completa- mente uma ou mais das atividades biológicas do referido antígeno.
[0028] Os termos "anticorpo" e "imunoglobulina" ou "lg" são usados de forma intercambiável neste documento. Estes termos são usados aqui no sentido mais amplo e abrangem especificamente anticorpos monoclo- nais (incluindo anticorpos monoclonais de tamanho natural) de qualquer isotipo, como IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos, anticorpos quiméricos e fragmentos de anticorpos, des- de que os referidos fragmentos retenham a função biológica desejada. Um anticorpo reativo com um antígeno específico pode ser gerado por métodos recombinantes, como seleção de bibliotecas de anticorpos re- combinantes em fagos ou vetores semelhantes, ou por imunização de um animal com o antígeno ou um ácido nucleico que codifica o antígeno. Es- tes termos destinam-se a incluir um produto polipeptídico de células B dentro da classe de polipeptídeos da imunoglobulina que é capaz de se ligar a um antígeno molecular específico e é composto por dois pares idênticos de cadeias polipeptídicas, em que cada par tem uma cadeia pe- sada (cerca de 50-70 kDa) e uma cadeia leve (cerca de 25 kDa) e cada porção amino-terminal de cada cadeia inclui uma região variável de cerca de 100 a cerca de 130 ou mais aminoácidos e cada porção carbóxi- terminal de cada cadeia inclui uma região constante (Veja, Borrebaeck (ed.) (1995) Antibody Engineering, Segunda Ed., Oxford University Press .; Kuby (1997) Immunology, Terceira Ed., WH Freeman and Company, New York). Em algumas modalidades, o antígeno molecular específico pode ser ligado por um anticorpo aqui fornecido, incluindo o polipeptídeo, fragmento ou epítopo de PSGL-1 alvo.
[0029] Os anticorpos também incluem, mas não estão limitados a, anticorpos sintéticos, anticorpos monoclonais, anticorpos produzidos de forma recombinante, anticorpos multiespecíficos (incluindo anticorpos bi- específicos), anticorpos humanos, anticorpos humanizados, anticorpos camelizados, anticorpos quiméricos, intracorpos, anticorpos anti- idiotípicos (anti-ld) e fragmentos funcionais de qualquer um dos acima, que se refere a uma porção de um polipeptídeo de cadeia pesada ou leve de anticorpo que retém parte ou toda a atividade de ligação do anticorpo a partir do qual o fragmento foi derivado. Exemplos não limitantes de fra- gmentos funcionais incluem Fvs de cadeia única (scFv) (por exemplo, in- cluindo monoespecífico, biespecífico, etc.), fragmentos Fab, fragmentos F(ab'), fragmentos F(ab),, fragmentos F(ab')z, Fvs ligados por dissulfureto (sdFv), fragmentos Fd, fragmentos Fv, diacorpo, triacorpo, tetracorpo e minicorpo. Em particular, os anticorpos fornecidos neste documento in- cluem moléculas de imunoglobulina e porções imunologicamente ativas de moléculas de imunoglobulina, por exemplo, domínios de ligação ao antígeno ou moléculas que contêm um sítio de ligação ao antígeno que se liga a um antígeno VISTA (por exemplo, uma ou mais regiões determi- nantes de complementaridade (CDRs) de um anticorpo anti-VISTA). Tais fragmentos de anticorpo podem ser encontrados descritos em, por exem- plo, Harlow e Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1989); Myers (ed.), Molec. Biology and Biotech- nology: A Comprehensive Desk Reference, New York: VCH Publisher, Inc.; Huston et al., Cell Biophysics, 22:189-224 (1993); Pluckthun and Skerra, Meth. Enzymol., 178:497-515 (1989) and in Day, E.D., Advanced Immunochemistry, Segunda Ed., Wiley-Liss, Inc., New York, NY (1990).
Os anticorpos aqui fornecidos podem ser de qualquer tipo (por exemplo, IgG, IgE, IgM, I1gD, IgA e IgY), qualquer classe (por exemplo, I9G1, IgG2, I9G3, IgG4, IgA1 e IgA2), ou qualquer subclasse (por exemplo, IgG2a e IgG2b) da molécula de imunoglobulina. Os anticorpos anti-PSGL-1 ou anticorpos anti-VISTA aqui fornecidos podem ser anticorpos agonísticos ou anticorpos antagonistas.
[0030] Os termos "anticorpos anti-PSGL-1", "anticorpos que se ligam a PSGL-1", "anticorpos que se ligam a um epítopo PSGL-1" e termos análogos são usados indistintamente aqui e referem-se a anticorpos que se ligam a um polipeptídeo PSGL-1, tal como um antígeno ou epítopo de PSGL-1. Esses anticorpos incluem anticorpos humanizados. Um anticor- po que se liga a um antígeno PSGL-1 pode apresentar reação cruzada com antígenos relacionados. Em algumas modalidades, um anticorpo que se liga ao PSGL-1 não apresenta reação cruzada com outros antígenos. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-PSGL-1 aqui descrito não bloqueia ou inibe a ligação de PSGL-1 a P-selectina, L-selectina ou E- selectina. Um anticorpo que se liga a PSGL-1 pode ser identificado, por exemplo, por imunoensaios, BlAcore ou outras técnicas conhecidas por aqueles versados na técnica. Um anticorpo se liga a PSGL-1, por exem- plo, quando se liga a PSGL-1 com maior afinidade do que qualquer antí- geno de reação cruzada, conforme determinado usando técnicas experi- mentais, como radioimunoensaios (RIA) e ensaios de imunoabsorção en- zimática (ELISAs), por exemplo, um anticorpo que se liga especificamen- te ao PSGL-1. Normalmente, uma reação específica ou seletiva será pelo menos duas vezes o sinal ou ruído de antecedente e pode ser mais de 10 vezes o antecedente. Veja, por exemplo, Paul, ed., 1989, Fundamental Immunology Segunda Edição, Raven Press, New York nas páginas 332 336 para uma discussão sobre a especificidade do anticorpo. Em algu-
mas modalidades, um anticorpo "que se liga" a um antígeno de interesse é aquele que se liga ao antígeno com afinidade suficiente para que o an- ticorpo seja útil como um agente diagnóstico e/ou terapêutico no direcio- namento de uma célula ou tecido que expressa o antígeno, e não apre- sentam reação cruzada significativa com outras proteínas.
Em tais moda- lidades, a extensão da ligação do anticorpo a uma proteína "não alvo" será inferior a cerca de 10 % da ligação do anticorpo à sua proteína alvo particular, conforme determinado por análise de classificação de células ativadas por fluorescência (FACS) ou radioimunoprecipitação (RIA). No que diz respeito à ligação de um anticorpo a uma molécula alvo, o termo "ligação específica" ou "liga-se especificamente a" ou é "específico para" um determinado polipeptídeo ou um epítopo em um determinado polipep- tídeo alvo significa ligação que é mensuravelmente diferente de uma inte- ração não específica.
A ligação específica pode ser medida, por exemplo, determinando a ligação de uma molécula em comparação com a ligação de uma molécula controle, que geralmente é uma molécula de estrutura semelhante que não tem atividade de ligação.
Por exemplo, a ligação es- pecífica pode ser determinada por competição com uma molécula contro- le que é semelhante ao alvo, por exemplo, um excesso de alvo não mar- cado.
Neste caso, a ligação específica é indicada se a ligação do alvo marcado a uma sonda for inibida competitivamente por excesso de alvo não marcado.
O termo "ligação específica" ou "liga-se especificamente a" ou é "específico para" um determinado polipeptídeo ou um epítopo em um polipeptídeo alvo específico, quando aqui usado, pode ser exibido, por exemplo, por uma molécula com um Kp para o alvo de em pelo me- nos cerca de 10º M, alternativamente pelo menos cerca de 10º M, alter- nativamente pelo menos cerca de 10º M, alternativamente pelo menos cerca de 107 M, alternativamente pelo menos cerca de 10º M, alternati-
vamente pelo menos cerca de 10º M, alternativamente pelo menos cerca de 10º M, alternativamente pelo menos cerca de 10º M, alternativa- mente pelo menos cerca de 10? M ou mais. Em algumas modalidades, o termo "ligação específica" refere-se à ligação onde uma molécula se liga a um polipeptídeo ou epítopo particular em um polipeptídeo específico sem se ligar substancialmente a qualquer outro polipeptídeo ou epítopo polipeptídico. Em algumas modalidades, um anticorpo que se liga a PSGL-1 ou VISTA tem uma constante de dissociação (Kp) de < 1 UM, < 100 nM, € 10 nM, €< 1 NM ou € 0,1 nM. Em algumas modalidades, o anti- corpo anti-PSGL-1 ou o anticorpo anti-VISTA se liga a um epítopo de PSGL-1 ou VISTA que é conservado entre PSGL-1 ou VISTA de diferen- tes espécies.
[0031] Um "antígeno" é um antígeno predeterminado ao qual um an- ticorpo pode se ligar seletivamente. O antígeno alvo pode ser um polipep- tídeo, carboidrato, ácido nucleico, lipídeo, hapteno ou outro composto de ocorrência natural ou sintético. Em algumas modalidades, o antígeno alvo é um polipeptídeo, incluindo, por exemplo, um polipeptídeo PSGL-1.
[0032] O termo "fragmento de ligação ao antígeno", "domínio de liga- ção ao antígeno", "região de ligação ao antígeno" e termos semelhantes referem-se àquela porção de um anticorpo que compreende os resíduos de aminoácidos que interagem com um antígeno e conferem ao agente de ligação sua especificidade e afinidade para o antígeno (por exemplo, as regiões determinantes de complementaridade (CDRs)).
[0033] O termo "célula apresentadora de antígeno" ou "APC" refere- se a um grupo heterogêneo de células imunes que mediam a resposta imune celular processando e apresentando antígenos para reconheci- mento por certos linfócitos, como células T. APCs incluem, mas não es- tão limitados a, células dendríticas, macrófagos, células de Langerhans e células B.
[0034] Os termos "liga" ou "ligação", quando aqui usados, referem-se a uma interação entre moléculas para formar um complexo. As interações podem ser, por exemplo, interações não covalentes, incluindo ligações de hidrogênio, ligações iônicas, interações hidrofóbicas e/ou interações de van der Waals. Um complexo também pode incluir a ligação de duas ou mais moléculas mantidas juntas por ligações covalentes ou não covalen- tes, interações ou forças. A resistência das interações não covalentes to- tais entre um único sítio de ligação ao antígeno em um anticorpo e um único epítopo de uma molécula alvo, como PSGL-1, é a afinidade do an- ticorpo ou fragmento funcional para esse epítopo. A relação de associa- ção (k;) para dissociação (k.,) de um anticorpo para um antígeno mono- valente (k;/k.,) é a constante de associação K, que é uma medida de afi- nidade. O valor de K varia para diferentes complexos de anticorpo e antí- geno e depende de k; e k.. A constante de associação K para um anti- corpo aqui fornecido pode ser determinada usando qualquer método aqui fornecido ou qualquer outro método bem conhecido dos versados na téc- nica. A afinidade em um sítio de ligação nem sempre reflete a verdadeira força da interação entre um anticorpo e um antígeno. Quando antígenos complexos contendo múltiplos determinantes antigênicos repetidos, como um PSGL-1 polivalente, entram em contato com anticorpos contendo múl- tiplos sítios de ligação, a interação do anticorpo com o antígeno em um sítio aumentará a probabilidade de uma reação em um segundo sítio. À força dessas múltiplas interações entre um anticorpo multivalente e um antígeno é chamada de avidez. A avidez de um anticorpo pode ser uma medida melhor de sua capacidade de ligação do que a afinidade de seus sítios de ligação individuais. Por exemplo, a alta avidez pode compensar a baixa afinidade, como às vezes é encontrado para anticorpos IgM pen-
taméricos, que podem ter uma afinidade menor do que IgG, mas a alta avidez de IgM, resultante de sua multivalência, permite que ele se ligue ao antígeno de forma eficaz.
[0035] O termo "amostra biológica" se refere a uma amostra que foi obtida de uma fonte biológica, como um paciente ou indivíduo. Em algu- mas modalidades, uma amostra biológica inclui, mas não está limitada a, sangue total, sangue parcialmente purificado, PBMCs, biópsias de tecido e semelhantes. De preferência, uma amostra biológica é uma amostra de tumor. Em algumas modalidades preferidas, uma amostra biológica é ob- tida por uma biópsia de tecido (por exemplo, biópsia de tumor, que pode incluir infiltrados imunes).
[0036] O termo "bloco", ou um equivalente gramatical do mesmo, quando usado no contexto de um anticorpo se refere a um anticorpo que evita ou interrompe uma atividade biológica do antígeno ao qual o anti- corpo se liga. Um anticorpo de bloqueio inclui um anticorpo que se com- bina com um antígeno sem desencadear uma reação, mas que bloqueia outra proteína de se combinar ou complexar posteriormente com aquele antígeno. O efeito de bloqueio de um anticorpo pode ser aquele que re- sulta em uma mudança mensurável na atividade biológica do antígeno. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-PSGL-1 aqui descrito blo- queia a capacidade de VISTA de se ligar a PSGL-1, o que pode resultar na inibição ou bloqueio de sinais supressores de VISTA. Certos anticor- pos anti-PSGL-1 aqui descritos inibem ou bloqueiam sinais supressores de VISTA em células que expressam VISTA, incluindo cerca de 98 % a cerca de 100 % em comparação com o controle apropriado (por exemplo, o controle sendo células não tratadas com o anticorpo sendo testado). Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PSGL-1 aqui descrito bloqueia a ligação de PSGL-1 ao domínio extracelular VISTA e/ou bloqueia a liga-
ção de uma célula que expressa VISTA a uma célula que expressa PSGL-1. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PSGL-1 aqui descrito não bloqueia a ligação de PSGL-1 a uma proteína diferente de VISTA, tal como P-selectina, L-selectina e/ou E-selectina.
[0037] O termo "VISTA" ou "polipeptídeo VISTA" e termos semelhan- tes referem-se ao polipeptídeo ("polipeptídeo", "peptídeo" e "proteína" são usados indistintamente neste documento) codificado pelo gene de Estru- tura de Leitura Aberta do Cromossoma 10 humano (VISTA), que também é conhecido na técnica como B7-H5, receptor de plaquetas Gi24, GI24, Proteína 1 secretada induzida por estresse, SISP1 e PP2135, por exem- plo, compreendendo a sequência de aminoácidos de: 1 mgvptaleag swrwasllfa Iflaaslgpv aafkvatpys Iyvcpegqgnv tlterllgpv 61 dkghdvtfyk twyrssrgev qtcserrpir nItfadlhlh hgghgaants hdlagrhgle 121 sasdhhgnfs itmrnltild sglycclvve irhhhsehrv hgamelqvgt gkdapsncvv 181 ypsssqdsen itaaalatga civgilclp! illlvykgrq aasnrragel vrmdsniggi 241 enpgfeaspp aqgipeakvr hplsyvagrqa psesgrhils epstplsppg padvffpsld 301 pvpdspnfev i (SEQ ID NO: 1) e polipeptídeos relacionados, incluindo suas variantes SNP. O polipeptí- deo VISTA demonstrou ou prevê-se que compreenda várias regiões dis- tintas na sequência de aminoácidos incluindo: uma sequência de sinal (resíduos 1-32; veja, Zhang et al., Protein Sci. 13: 2819-2824 (2004)); um domínio de imunoglobulina - semelhante a IgV (resíduos 33-162); e uma região transmembranar (resíduos 195-215). A proteína VISTA madura inclui os resíduos de aminoácidos 33-311 da SEQ ID NO: 1. O domínio extracelular da proteína VISTA inclui os resíduos de aminoácidos 33-194 da SEQ ID NO: 1. Os polipeptídeos relacionados incluem variantes aléli- cas (por exemplo, variantes SNP); variantes de ligação; fragmentos; deri- vados; variantes de substituição, deleção e inserção; polipeptídeos de fusão; e homólogos interespécies, de preferência, que retêm a atividade VISTA e/ou são suficientes para gerar uma resposta imune anti-VISTA. VISTA pode existir na forma nativa ou desnaturada. Os polipeptídeos VISTA descritos neste documento podem ser isolados de uma variedade de fontes, tais como de tipos de tecidos humanos ou de outra fonte, ou preparados por métodos recombinantes ou sintéticos. Um "polipeptídeo VISTA de sequência nativa" compreende um polipeptídeo possuindo a mesma sequência de aminoácidos que o polipeptídeo VISTA correspon- dente derivado da natureza. Tais polipeptídeos VISTA de sequência nati- va podem ser isolados da natureza ou podem ser produzidos por meios recombinantes ou sintéticos. O termo "polipeptídeo VISTA de sequência nativa" abrange especificamente formas truncadas ou segregadas de ocorrência natural do polipeptídeo VISTA específico (por exemplo, uma sequência de domínio extracelular), formas variantes de ocorrência natu- ral (por exemplo, formas de splicing alternativo) e variantes alélicas de ocorrência natural do polipeptídeo.
[0038] Uma sequência de ácido nucleico de cDNA que codifica o po- lipeptídeo VISTA, por exemplo, compreende: 1 atgggcgtoc ccacggecet ggaggcegge agcetggeget ggggatecet getetteget 61 ctettoctgg ctgcgtecet aggtecggta gcagecttica aggtegecac gecgtattec 121 ctgtatgtct gtcccgaggg gcagaacgte acecteacet gcaggetett gggcectata 181 gacaaagggc acgatgtgac cttctacaag acgtggtacc gcagctegag gggegaggta 241 cagacctgct cagagegecg geccatecege aaceteacgt tecaggaccet teacetgcac 301 catggaggcc accaggctgc caacaccage cacgaccetag cteagegeca caggctagag 361 teggcetecg accaccatgg caacttetec ateaccatge gcaacetgac cetgctagat 421 ageggoctet actgctacet ggtagtagag atcaggcace accactegga gcacagggte 481 catggtgcca tagagctgca ggtgcagaca ggcaaagatg caccatccaa ctatatagta 541 tacccatect ceteccagga tagtgaaaac atcacggctg cagecetgge tacgggtace 601 tgcatcgtag gaatccetetag cetececete ateetagetec tagtetacaa gcaaaggcag
661 gcagcecceteca acegecgtge ccaggageta gtgcggatgg acagcaacat teaagggatt 721 gaaaaccccg getttyaage cteaceacet gececagggga taccegaggc caaagtcagg 781 caccceccetagt cetatgtage ccageggcag cettetgagt ctaggeggca tetgettteg 841 gagcecagcea cececetgte tectecagge cceggagacg tettettece atcectggac 901 ccetgtecctg actetecaaa ctttgaggte atctag (SEQ ID NO: 2)
[0039] Conforme descrito neste documento, VISTA é um imunomodu- lador, que é um regulador de ponto de checagem negativo de respostas imunes (por exemplo, inibe ou suprime respostas imunes). Como também aqui descrito, PSGL-1 é um receptor de VISTA. Como também aqui des- crito, os métodos para modular (por exemplo, prevenir, inibir, bloquear) a interação de PSGL-1 e VISTA com agentes (por exemplo, anticorpos) que se ligam a PSGL-1 e/ou VISTA, são úteis, incluindo, por exemplo, , para inibir ou bloquear sinais supressores de VISTA. A modulação da in- teração de VISTA e PSGL-1 pode resultar em uma resposta imune au- mentada, incluindo um aumento na ativação imune (por exemplo, ativa- ção de células T, como proliferação de células T). Os anticorpos que se ligam a VISTA, úteis em métodos como aqui descritos, incluem aqueles descritos em WO2014/197849 (PCT/US2014/041388).
[0040] Ortólogos para o polipeptídeo VISTA também são bem conhe- cidos na técnica. Por exemplo, o ortólogo de camundongo para o polipep- tídeo VISTA é um supressor de ativação de células T (VISTA) contendo imunoglobulina de região V (também conhecido como PD-L3, PD-1H, PD- XL, Pro1412 e UNQ730), que compartilha aproximadamente 70 % de identidade de sequência com o polipeptídeo humano. Ortólogos de VIS- TA também podem ser encontrados em organismos adicionais, incluindo chimpanzés, vacas, ratos e peixes-zebra.
[0041] Uma "célula que expressa VISTA", "uma célula com expressão de VISTA" ou um equivalente gramatical desta refere-se a uma célula que expressa VISTA endógeno ou transfectado na superfície celular. Células que expressam VISTA incluem células tumorais portadoras de VISTA, células T reguladoras (por exemplo, células T reguladoras CD4* Foxp3*), células supressoras derivadas de mieloides (por exemplo, células su- pressoras derivadas de mieloide CD11b* ou CD11beevada) e/ou células dendríticas supressoras (por exemplo, CD11b + ou células dendríticas CD11pelevada), Uma célula que expressa VISTA produz níveis suficientes de VISTA em sua superfície, de modo que um anticorpo anti-VISTA pode se ligar a ela e/ou PSGL-1 ou uma célula que expressa PSGL-1 pode se ligar a ela.
Em alguns aspectos, a inibição ou bloqueio de tal ligação pode ter um efeito terapêutico.
Uma célula que "superexpressa" VISTA é aque- la que possui níveis significativamente mais elevados de VISTA na super- fície celular, em comparação com uma célula do mesmo tipo de tecido que é conhecido por expressar VISTA.
Essa superexpressão pode ser causada pela amplificação do gene ou pelo aumento da transcrição ou translação.
A superexpressão de VISTA pode ser determinada em um ensaio de diagnóstico ou prognóstico avaliando níveis aumentados da proteína VISTA presente na superfície de uma célula (por exemplo, por meio de um ensaio imuno-histoquímico; análise de FACS). Alternativa- mente, ou adicionalmente, pode-se medir os níveis de ácido nucleico que codifica VISTA ou mRNA na célula, por exemplo, via hibridização fluores- cente in situ; (FISH; veja, WO98/45479 publicado em outubro de 1998), Southern blotting, Northern blotting ou técnicas de reação em cadeia da polimerase (PCR), como PCR quantitativa em tempo real (RT-PCR). Além dos ensaios acima, vários ensaios in vivo estão disponíveis para a pessoa versada.
Por exemplo, pode-se expor células dentro do corpo do paciente a um anticorpo que é opcionalmente marcado com um agente detectável e a ligação do anticorpo a células no paciente pode ser avalia- da, por exemplo, por varredura externa para radioatividade ou pela análi-
se de uma biópsia tirada de um paciente previamente exposto ao anticor- po. Uma célula tumoral que expressa VISTA inclui, mas não está limitada a, células tumorais de leucemia mieloide aguda (AML).
[0042] Uma "doença mediada por VISTA", "distúrbio mediado por VISTA" e "condição mediada por VISTA" são usados indistintamente e referem-se a qualquer doença, distúrbio ou condição que é total ou parci- almente causado por ou é o resultado de VISTA. Tais doenças, distúrbios ou condições incluem aqueles causados por ou de outra forma associa- dos a VISTA, incluindo por ou associados a células que expressam VIS- TA (por exemplo, células tumorais, células supressoras derivadas de mie- loide (MDSC), células dendríticas supressoras (DC supressoras) e/ou cé- lulas T reguladoras (T-regs)). Em algumas modalidades, VISTA é de for- ma aberrante (por exemplo, altamente) expresso na superfície de uma célula. Em algumas modalidades, VISTA pode ser regulado positivamen- te de forma aberrante em um tipo de célula particular. Em outras modali- dades, a sinalização celular normal, aberrante ou excessiva é causada pela ligação de VISTA a um receptor VISTA (por exemplo, PSGL-1), que pode se ligar ou de outra forma interagir com VISTA.
[0043] Os termos "distúrbio proliferativo celular" e "distúrbio prolifera- tivo" referem-se a distúrbios que estão associados a algum grau de proli- feração celular anormal. Em algumas modalidades, o distúrbio proliferati- vo celular é um tumor ou câncer. "Tumor", quando aqui usado, refere-se a todo o crescimento e proliferação de células neoplásicas, malignas ou benignas, e a todas as células e tecidos pré-cancerosos e cancerosos. Os termos "câncer", "canceroso", "distúrbio proliferativo celular", "distúrbio proliferativo" e "tumor" não são mutuamente exclusivos, conforme referido aqui. Os termos "câncer" e "canceroso" referem-se a ou descrevem a condição fisiológica em mamíferos que é tipicamente caracterizada por crescimento celular desregulado. Exemplos de câncer incluem, mas não estão limitados a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma e leucemia ou doenças malignas linfoides. Exemplos mais particulares de tais cânceres incluem câncer de células escamosas (por exemplo, câncer de células escamosas epiteliais), câncer de pulmão incluindo câncer de pulmão de células pequenas, câncer de pulmão de células não pequenas, adeno- carcinoma do pulmão e carcinoma escamoso do pulmão, câncer do peri- tônio, câncer hepatocelular, câncer gástrico ou de estômago, incluindo câncer gastrointestinal, câncer pancreático, glioblastoma, câncer cervical, câncer de ovário, câncer oral, câncer de fígado, câncer de bexiga, câncer do trato urinário, hepatoma, câncer de mama, câncer de cólon, câncer retal, câncer colorretal, carcinoma endometrial ou uterino, carcinoma de glândula salivar, câncer do rim ou renal, câncer de próstata, câncer de vulva, câncer de tireoide, carcinoma hepático, carcinoma anal, carcinoma peniano, melanoma, mieloma múltiplo e linfoma de células B, câncer de cérebro, bem como de câncer de cabeça e pescoço e metástases asso- ciadas. Em algumas modalidades, o câncer é um câncer hematológico, que se refere ao câncer que começa no tecido formador de sangue, como a medula óssea, ou nas células do sistema imunológico. Exemplos de um câncer hematológico são leucemia (por exemplo, leucemia mieloide agu- da (AML), leucemia linfoblástica aguda (ALL), leucemia mieloide crônica (CML), leucemia linfocítica crônica (CLL) ou leucemia monocítica aguda (AMoL)), linfoma (linfoma de Hodgkin ou linfoma não Hodgkin) e mieloma (mieloma múltiplo, plasmocitoma, mieloma localizado ou mieloma extra- medular).
[0044] Uma "molécula coinibidora" (também conhecida como um "re- gulador de ponto de checagem negativo" ou "NCR") refere-se a uma mo- lécula que infrarregula as respostas imunes (por exemplo, ativação de células T) pela liberação de um sinal negativo para células T após seu engajamento por ligantes ou contrarreceptores. As funções exemplares de uma molécula coinibidora são prevenir a ativação imune desproporci- onal, minimizar os danos colaterais e/ou manter a autotolerância periféri- ca. Em algumas modalidades, uma molécula coinibidora é um ligante ou receptor expresso por uma célula apresentadora de antígeno. Em algu- mas modalidades, uma molécula coinibidora é um ligante ou receptor ex- presso por uma célula T. Em algumas modalidades, uma molécula coini- bidora é um ligante ou receptor expresso por uma célula apresentadora de antígeno e uma célula T.
[0045] Uma "molécula coestimuladora" refere-se a uma molécula que regula positivamente as respostas imunes (por exemplo, ativação de cé- lulas T) pela liberação de um sinal positivo às células T após seu envol- vimento por ligantes ou contrarreceptores. Para que uma célula T se tor- ne totalmente ativada, dois sinais são necessários: 1) um sinal específico do antígeno é fornecido através do receptor de célula T interagindo com moléculas de peptídeo-MHC em uma célula apresentadora de antígeno; e 2) um sinal coestimulatório, que é inespecífico para o antígeno, e é forne- cido pela interação entre moléculas coestimuladoras expressas na mem- brana de uma célula apresentadora de antígeno e a célula T. A coestimu- lação de células T fornece proliferação, diferenciação e sobrevivência de células T. Em algumas modalidades, uma molécula coestimuladora é um ligante ou receptor expresso por uma célula apresentadora de antígeno. Em algumas modalidades, uma molécula coestimuladora é um ligante ou receptor expresso por uma célula T. Em algumas modalidades, uma mo- lécula coestimuladora é um ligante ou receptor expresso por uma célula apresentadora de antígeno e uma célula T.
[0046] Um "agente quimioterapêutico" é um agente químico ou bioló-
gico (por exemplo, um agente, incluindo uma pequena molécula de fár- maco ou biológica, como um anticorpo ou célula) útil no tratamento do câncer, independentemente do mecanismo de ação.
Os agentes quimio- terapêuticos incluem compostos usados em terapia direcionada e quimio- terapia convencional.
Exemplos de agentes quimioterápicos incluem, mas não estão limitados a, agentes alquilantes como tiotepa e ciclosfosfamida CYTOXANG,; sulfonatos de alquila, tais como bussulfano, improssulfano e pipossulfano; aziridinas como benzodopa, carboquona, meturedopa e uredopa; etileniminas e metilamelaminas incluindo altretamina, trietileno- melamina, trietilenofosforamida, trietilenotiofosforamida e trimetilolome- lamina; acetogeninas (especialmente bulatacina e bulatacinona); delta-9- tetra-hidrocanabinol (dronabinol, ARINOLO); beta-lapacona; lapacol; col- chicina; ácido betulínico; uma camptotecina (incluindo o análogo sintético topotecano (HYCAMTINO), CPT-11 (irinotecano, CAMPTOSARO), acetil- camptotecina, escopolectina e 9-aminocamptotecina); briostatina; calista- tina; CC-1065 (incluindo seus análogos sintéticos adozelesina, carzelesi- na e bizelesina); podofilotoxina; ácido podofilínico; teniposídeo; criptofici- nas (particularmente criptoficina 1 e criptoficina 8); dolastatina; duocarmi- cina (incluindo os análogos sintéticos, KW-2189 e CB1 -TM1); eleuterobi- na; pancratistatina; uma sarcodictina; espongistatina; mostardas de nitro- gênio, como clorambucil, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifos- famida, mecloretamina, cloridrato de óxido de meclioretamina, melfalano, novembiquina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostarda de uracila; nitrosureias, tais como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina e ranimnustina; antibióticos, tais como os antibióti- cos enedina (por exemplo, caliqueamicina, especialmente caliqueamicina gama | e caliqueamicina ômega |l (veja, por exemplo, Agnew, Chem Intl.
Ed.
Engl. 33: 183-186 (1994)); dinemicina, incluindo dinemicina A; uma esperamicina; bem como cromóforo de neocarzinostatina e cromóforos antiobióticos da cromoproteína enediína relacionados), aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azasserina, bleomicinas, cactinomicina, cara- bicina, caminomicina, carzinofilina, cromomicina, dactinomicina, daunor- rubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-ox0-L-norleucina, ADRIAMYCINGO, do- xorrubicina (incluindo morfolino-doxorrubicina, cianomorfolino-doxorru- bicina, 2-pirrolino-doxorrubicina e desoxidoxorrubicina), epirrubicina, esor- rubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicinas tais como, mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromi- cina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozo- cina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubicina; antimetabólitos, tais como, metotrexato e 5-fluorouracila (5-FU); análogos de ácido fólico, tais como, denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina, tais como, fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; anogos de pirimidina, tais como, ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofíur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridi- na; andrógenos, tais como, calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; antiadrenais, tais como, amino- glutetimida, mitotano, trilostano; reforçador de ácido fólico, como ácido frolínico; aceglatona; glicosídeo aldofosfamida; ácido aminolevulínico; eni- luracila; ansacrina; bestrabucila; bisantreno; edatraxato; defofamina; de- mecolcina; diaziquona; elfornitina; acetato de eliptínio; uma epotilona; etoglucida; nitrato de gálio; hidroxiureia; lentinano; lonidainina; maitansi- noides, tais como, maitansina e ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; fenameto; pirarrubicina; losoxantrona; 2-etil-hidrazida; procarbazina; complexo de polissacarídeo PSK6 (JHS Natural Products, Eugene, Oreg.); razoxano; rizoxina; sizofurano; espiro- germânio; ácido tenuazônico; triaziquona; 2,2',2"-triclorotrietilamina; trico-
tecenos (especialmente, toxina T-2, verracurina A, roridina A e anguidi- na); uretano; vindesina (ELDISINEG, FILDESINO); dacarbazina; mano- mustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinosídeo ("Ara-C"); tiotepa; taxoides, por exemplo, TAXOLO paclitaxel (Bristol- Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ), ABRAXANETY" sem Cremophor, formulação de nanopartículas modificada por albumina de paclitaxel (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, IL.), e TAXOTEREO doxetaxel (Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France); cloranbucila; gencita- bina (GEMZARGO); 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos da platina, como a cisplatina e carboplatina; vinblastina (VELBANGO); pla- tina; etoposídeo (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; vincristina (ONCO- VINO); oxaliplatina; leucovovina; vinorelbina (NAVELBINEG); novantrona; edatrexato; daunomicina; aminopterina; ibandronato; inibidor de topoiso- merase RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); retinoides, como ácido retinoico; capecitabina (XELODAG); sais, ácidos ou derivados farmaceu- ticamente aceitáveis de qualquer um dos anteriores; bem como combina- ções de dois ou mais dos anteriores, como CHOP, uma abreviatura para uma terapia combinada de ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina e prednisolona, e FOLFOX, uma abreviatura para um regime de tratamento com oxaliplatina (ELOXATINTY) combinado com 5-FU e leucovovina. Os agentes quimioterapêuticos adicionais incluem agentes citotóxicos úteis como conjugados de fármaco de anticorpo, tais como, maitansinoides (DM1 e DMA, por exemplo) e auristatinas (MMAE e MMAF, por exemplo).
[0047] Também incluídos na definição de agente quimioterápico es- tão: (i) agentes anti-hormonais que atuam para regular ou inibir a ação hormonal em tumores, tais como, antiestrogênios e moduladores seleti- vos do receptor de estrogênio (SERMs), incluindo, por exemplo, tamoxi- feno (incluindo NOLVADEXG; citrato de tamoxifeno), raloxifeno, droloxi-
feno, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, ceoxifeno, LY 117018, onapristona e FARESTONOÕ (citrato de toremifina); (ii) inibidores da aromatase que ini- bem a enzima aromatase, que regula a produção de estrogênio nas glân- dulas adrenais, como, por exemplo, 4(5)-imidazóis, aminoglutetimida, MEGASEGO (acetato de megestrol), AROMASINGO (exemestano; Pfizer), formestano, fadrozol, RI VISor& (vorozol), FEMARAPG (letrozol; Novartis) e ARIMIDEXO (anastrozol; AstraZeneca); (iii) antiandrógenos, tais como, flu- tamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida e goserelina; bem como, troxaci- tabina (um análogo de citosina de nucleosídeo 1,3-dioxolano); (iv) inibidores de proteína cinase, tais como, inibidores de ME (WO 2007/044515); (v) ini- bidores da cinase lipídica; (vi) oligonucleotídeos antissenso, particular- mente aqueles que inibem a expressão de genes em vias de sinalização implicadas na proliferação de células aberrantes, por exemplo, PKC-alfa, Raf e H-Ras, tais como, oblimersen (GENASENSEG, Genta Inc.); (vii) ribozimas, tais como, inibidores da expressão de VEGF (por exemplo, ANGIOZYMEOGO) e inibidores da expressão de HER2; (viii) vacinas, tais como, vacinas de terapia genética, por exemplo, ALLOVECTINGO, LEU- VECTINO e VAXIDO; PROLEUKINO rlL-2; inibidores da topoisomerase 1, como LURTOTECANGO; ABARELIXO rmRH; (ix) agentes antiangiogê- nicos, tais como, bevacizumabe (AVASTING, Genentech) (x) agentes imunomoduladores, tais como, anticorpos de Agente Biespecífico de Cé- lula T (BITE) e células T receptoras de antígeno quimérico (CAR); e sais, ácidos e derivados farmaceuticamente aceitáveis de qualquer um dos an- teriores.
[0048] Uma "CDR" refere-se a uma das três regiões hipervariáveis (H1, H2 ou H3) dentro da região não estrutural da estrutura da folha B de VH de imunoglobulina (Ig ou anticorpo), ou uma das três regiões hiperva- riáveis (L1, L2 ou L3) dentro da região não estrutural da estrutura da folha
B do anticorpo VL. Por conseguinte, as CDRs são sequências de região variável intercaladas com as sequências de região estrutural. As regiões CDR são bem conhecidas por aqueles versados na técnica e foram defi- nidas por, por exemplo, Kabat como as regiões de maior hipervariabilida- de dentro dos domínios variáveis (V) do anticorpo (Kabat et al., J. Biol. Chem. 252: 6609 -6616 (1977); Kabat, Adv. Prot. Chem. 32: 1-75 (1978)). As sequências da região CDR também foram definidas estruturalmente por Chothia como aqueles resíduos que não fazem parte da estrutura de folha B conservada e, portanto, são capazes de se adaptar a diferentes conformações (Chothia e Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)). Ambas as terminologias são bem reconhecidas na técnica. As sequências da re- gião CDR também foram definidas por ADM, Contact e IMGT. As posi- ções de CDRs dentro de um domínio variável de anticorpo canônico fo- ram determinadas por comparação de numerosas estruturas (Al-Lazikani et al., J. Mol. Biol. 273: 927-948 (1997); Morea et al., Methods 20: 267 - 279 (2000)). Como o número de resíduos dentro de uma região hipervari- ável varia em diferentes anticorpos, resíduos adicionais em relação às posições canônicas são convencionalmente numerados com a, b, ce as- sim por diante próximo ao número do resíduo no esquema de numeração de domínio variável canônico (Al-Lazikani et al., supra (1997)). Tal no- menclatura é similarmente bem conhecida por aqueles versados na téc- nica.
[0049] O termo "região hipervariável", "HVR" ou "HV", quando aqui utilizado, refere-se às regiões de um domínio variável de anticorpo que são hipervariáveis em sequência e/ou formam alças estruturalmente defi- nidas. Geralmente, os anticorpos compreendem seis regiões hipervariá- veis; três no VH (H 1, H2, H3) e três no VL (LI, L2, L3). Uma série de deli- neamentos de região hipervariável estão em uso e são aqui englobados.
As CDRs de Kabat são baseadas na variabilidade da sequência e são os mais comumente usados (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immuno- logical Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Chothia refere-se, em vez disso, à localização das alças estruturais (Chothia e Lesk J Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)). O final da alça Chothia CDR-HI quando numerado usando a convenção de numeração de Kabat varia entre H32 e H34 dependendo do comprimento da alça (isso ocorre porque o esquema de numeração de Kabat coloca as inserções em H35A e H35B; se nem 35A nem 35B estiver presente, a alça termina em 32; se apenas 35A estiver presente, a alça termina em 33; se ambos 35A e 35B estiverem presentes, a alça termina em 34). As regiões hipervariáveis ADM representam um compromisso entre as CDRs de Kabat e as alças estruturais de Chothia, e são usadas pelo software de modelagem de anticorpos ADM da Oxford Molecular. As regiões hiper- variáveis de "contato" são baseadas em uma análise das estruturas cris- talinas complexas disponíveis. Os resíduos de cada uma dessas regiões hipervariáveis são indicados abaixo.
[0050] Recentemente, um sistema de numeração universal foi desen- volvido e amplamente adotado, ImMunoGeneTics (IMGT) Information SystemO (Lafranc et al., Dev. Comp. Immunol. 27 (1): 55-77 (2003)). IMGT é um sistema de informação integrado especializado em imunoglo- bulinas (IG), receptores de células T (TR) e complexo principal de histo- compatibilidade (MHC) de humanos e outros vertebrados. Aqui, as CDRs são referidas em termos de sequência de aminoácidos e da localização dentro da cadeia leve ou pesada. Como a "localização" das CDRs dentro da estrutura do domínio variável da imunoglobulina é conservada entre as espécies e está presente em estruturas chamadas alças, usando siste- mas de numeração que alinham sequências de domínio variável de acor-
do com características estruturais, CDR e resíduos de estrutura e são fa- cilmente identificados. Esta informação pode ser usada no enxerto e substituição de resíduos de CDR de imunoglobulinas de uma espécie em uma estrutura aceptora de, normalmente, um anticorpo humano. A cor- respondência entre a numeração de Kabat e o sistema de numeração único IMGT também é bem conhecida por aqueles versados na técnica (por exemplo, Lefranc et al., Supra). Um sistema exemplar, mostrado aqui, combina Kabat e Chothia.
Tabela 1: Definições de CDR Exemplar .
ama ES Too fo Sofa]
[0051] As regiões hipervariáveis podem compreender "regiões hiper- variáveis estendidas" como segue: 24-36 ou 24-34 (LI), 46-56 ou 50-56 (L2) e 89-97 ou 89-96 (L3) na VL e 26-35 ou 26-35A (H1), 50-65 ou 49-65 (H2) e 93-102, 94-1 02 ou 95-102 (H3) na VH. Os resíduos do domínio variável são numerados 25 de acordo com Kabat et al., Supra, para cada uma destas definições. Quando aqui usados, os termos "HVR" e "CDR" são usados indistintamente.
[0052] O termo "região constante" ou "domínio constante" refere-se a uma porção do terminal carbóxi da cadeia leve e pesada que não está diretamente envolvida na ligação do anticorpo ao antígeno, mas exibe várias funções efetoras, como a interação com o receptor Fc. Os termos referem-se à porção de uma molécula de imunoglobulina possuindo uma sequência de aminoácidos mais conservada em relação à outra porção da imunoglobulina, o domínio variável, que contém o sítio de ligação ao antígeno. O domínio constante contém os domínios CH1, CH2 e CH3 da cadeia pesada e o domínio CL da cadeia leve.
[0053] No contexto de um polipeptídeo, o termo "derivado", quando aqui usado, refere-se a um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos de um polipeptídeo PSGL-1, um fragmento de um poli- peptídeo PSGL-1 ou um anticorpo que se liga a um polipeptídeo PSGL-1 que foi alterado pela introdução de substituições, deleções ou adições de resíduos de aminoácidos. O termo "derivado", quando aqui usado, tam- bém se refere a um polipeptídeo PSGL-1, um fragmento de um polipeptí- deo PSGL-1 ou um anticorpo que se liga a um polipeptídeo PSGL-1 que foi quimicamente modificado, por exemplo, pela ligação covalente de qualquer tipo de molécula para o polipeptídeo. Por exemplo, mas não como limitação, um polipeptídeo PSGL-1, um fragmento de um polipeptí- deo PSGL-1 ou um anticorpo PSGL-1 pode ser modificado quimicamente, por exemplo, por glicosilação, acetilação, peguilação, fosforilação, amida- ção, derivação por grupos de proteção/bloqueio conhecidos, clivagem proteolítica, ligação a um ligante celular ou outra proteína, etc. Os deriva- dos são modificados de uma maneira que é diferente do peptídeo ou po- lipeptídeos de ocorrência natural ou inicial, seja no tipo ou localização das moléculas anexadas. Os derivados incluem ainda a deleção de um ou mais grupos químicos que estão naturalmente presentes no peptídeo ou polipeptídeo. Um derivado de um polipeptídeo PSGL-1, um fragmento de um polipeptídeo PSGL-1 ou um anticorpo PSGL-1 pode ser quimicamen- te modificado por modificações químicas usando técnicas conhecidas por aqueles versados na técnica, incluindo, mas não se limitando a produtos químicos específicos clivagem, acetilação, formulação, síntese metabóli-
ca de tunicamicina, etc. Além disso, um derivado de um polipeptídeo PSGL-1, um fragmento de um polipeptídeo PSGL-1 ou um anticorpo PSGL-1 pode conter um ou mais aminoácidos não clássicos. Um deriva- do de polipeptídeo possui uma função semelhante ou idêntica a de um polipeptídeo PSGL-1, um fragmento de um polipeptídeo PSGL-1 ou um anticorpo PSGL-1 aqui descrito.
[0054] O termo "sonda detectável", quando aqui usado, refere-se a uma composição que fornece um sinal detectável. O termo inclui, sem limitação, qualquer fluoróforo, cromóforo, radiomarcador, enzima, anticor- po ou fragmento de anticorpo e semelhantes, que fornecem um sinal de- tectável por meio de sua atividade.
[0055] O termo "agente de diagnóstico" refere-se a uma substância administrada a um indivíduo que auxilia no diagnóstico de uma doença. Essas substâncias podem ser usadas para revelar, apontar e/ou definir a localização de um processo causador de doença. Em algumas modalida- des, um agente de diagnóstico inclui uma substância que é conjugada a um anticorpo aqui fornecido, que quando administrada a um indivíduo ou contatada a uma amostra de um indivíduo, auxilia no diagnóstico de cân- cer, formação de tumor ou qualquer outra doença, distúrbio ou condição mediada por VISTA.
[0056] O termo "agente detectável" refere-se a uma substância que pode ser usada para determinar a existência ou presença de uma molé- cula desejada, como um anticorpo aqui fornecido, em uma amostra ou indivíduo. Um agente detectável pode ser uma substância que é capaz de ser visualizada ou uma substância que pode ser determinada e/ou medi- da (por exemplo, por quantificação).
[0057] O termo "detecção", quando aqui usado, abrange a detecção quantitativa ou qualitativa.
[0058] O termo "codificar" ou seus equivalentes gramaticais, uma vez que é usado em referência à molécula de ácido nucleico, refere-se a uma molécula de ácido nucleico em seu estado nativo ou quando manipulada por métodos bem conhecidos por aqueles versados na técnica que po- dem ser transcritos para produzir MRNA, que é então traduzido em um polipeptídeo e/ou um fragmento do mesmo. A fita antissenso é o com- plemento de tal molécula de ácido nucleico e a sequência de codificação pode ser deduzida a partir dela.
[0059] O termo "epítopo", quando aqui usado, refere-se à região de um antígeno, como o polipeptídeo PSGL-1 ou fragmento de polipeptídeo PSGL-1, ao qual um anticorpo se liga. De preferência, um epítopo como aqui utilizado é uma região localizada na superfície de um antígeno, tal como polipeptídeo PSGL-1 ou fragmento de polipeptídeo PSGL-1, que é capaz de ser ligado a uma ou mais regiões de ligação ao antígeno de um anticorpo, e que tem atividade antigênica ou imunogênica em um animal, como um mamífero (por exemplo, um humano), que é capaz de provocar uma resposta imunológica. Um epítopo com atividade imunogênica é uma porção de um polipeptídeo que induz uma resposta de anticorpo em um animal. Um epítopo com atividade antigênica é uma porção de um poli- peptídeo ao qual um anticorpo se liga conforme determinado por qualquer método bem conhecido na técnica, por exemplo, por um imunoensaio. Os epítopos antigênicos não precisam ser necessariamente imunogênicos. Os epítopos geralmente consistem em agrupamentos de superfície qui- micamente ativos de moléculas, como aminoácidos ou cadeias laterais de açúcar e têm características estruturais tridimensionais específicas, bem como características de carga específicas. Um epítopo pode ser formado por resíduos contíguos ou por resíduos não contíguos colocados em es- treita proximidade pelo dobramento de uma proteína antigênica. Os epí-
topos formados por aminoácidos contíguos são normalmente retidos na exposição a solventes desnaturantes, enquanto os epítopos formados por aminoácidos não contíguos são tipicamente perdidos sob a referida ex- posição. Em algumas modalidades, um epítopo PSGL-1 é uma caracte- rística de superfície tridimensional de um polipeptídeo PSGL-1. Em outras modalidades, um epítopo PSGL-1 é uma característica linear de um poli- peptídeo PSGL-1. Geralmente, um antígeno tem vários ou muitos epíto- pos diferentes e reage com muitos anticorpos diferentes.
[0060] O termo "excipiente", quando aqui usado, refere-se a uma substância inerte que é comumente usada como diluente, veículo, con- servante, aglutinante ou agente estabilizador e inclui, mas não se limita a, proteínas (por exemplo, albumina sérica, etc.), aminoácidos (por exem- plo, ácido aspártico, ácido glutâmico, lisina, arginina, glicina, histidina, etc.), ácidos graxos e fosfolipídeos (por exemplo, alquil sulfonatos, capri- lato, etc.), tensoativos (por exemplo, SDS, polissorbato, tensoativo não iônico, etc.), sacarídeos (por exemplo, sacarose, maltose, trealose, etc.) e polióis (por exemplo, manitol, sorbitol, etc.). Veja, também, Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) Mack Publishing Co., Easton, PA, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade.
[0061] No contexto de um peptídeo ou polipeptídeo, o termo "frag- mento", quando aqui usado, refere-se a um peptídeo ou polipeptídeo que compreende menos do que a sequência de aminoácidos de tamanho na- tural. Tal fragmento pode surgir, por exemplo, de um truncamento no ter- minal amino, um truncamento no terminal carbóxi e/ou uma deleção in- terna de um resíduo (s) da sequência de aminoácidos. Os fragmentos podem, por exemplo, resultar de splicing alternativo de RNA ou da ativi- dade de protease in vivo. Em algumas modalidades, fragmentos de PSGL-1 ou VISTA incluem polipeptídeos compreendendo uma sequência de aminoácidos de pelo menos 5 resíduos de aminoácidos contíguos, pe- lo menos 10 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 15 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 20 resíduos de aminoácidos con- tíguos, pelo menos 25 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 40 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 50 resíduos de ami- noácidos contíguos, pelo menos 60 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 70 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 80 resí- duos de aminoácidos contíguos, pelo menos 90 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 100 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo me- nos 125 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 150 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 175 resíduos de aminoácidos contí- guos, pelo menos 200 resíduos de aminoácidos contíguos ou pelo menos 250 contíguos resíduos de aminoácidos da sequência de aminoácidos de um polipeptídeo PSGL-1 ou VISTA ou um anticorpo que se liga a um po- lipeptídeo PSGL-1 ou VISTA. Em algumas modalidades, um fragmento de um polipeptídeo PSGL-1 ou VISTA ou um anticorpo que se liga a um antígeno PSGL-1 ou VISTA retém pelo menos 1, pelo menos 2 ou pelo menos 3 funções do polipeptídeo ou anticorpo.
[0062] O termo resíduos de "estrutura" ou "FR" refere-se aos resí- duos do domínio variável que não sejam os resíduos da região hipervari- ável aqui definidos. Os resíduos de FR são aqueles resíduos de domínio variável que flanqueiam as CDRs. Os resíduos de FR estão presentes, por exemplo, em anticorpos quiméricos, humanizados, humanos, de do- mínio, diacorpos, anticorpos lineares e anticorpos biespeciíficos.
[0063] Um "fragmento funcional" de um anticorpo exibirá pelo menos uma, senão algumas ou todas as funções biológicas atribuídas ao anti- corpo intacto, a função compreendendo pelo menos uma ligação especí- fica ao antígeno alvo.
[0064] O termo "proteína de fusão", quando aqui usado, refere-se a um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos de um anticorpo e uma sequência de aminoácidos de um polipeptídeo ou proteí- na heteróloga (por exemplo, um polipeptídeo ou proteína que normalmen- te não faz parte do anticorpo (por exemplo, um anticorpo não anti-PSGL- 1 ou um anticorpo não anti-VISTA)). O termo "fusão" quando usado em relação a PSGL-1, VISTA, um anticorpo anti-PSGL-1 ou um anticorpo an- ti-VISTA refere-se à união de um peptídeo ou polipeptídeo, ou fragmento, variante e/ou derivado do mesmo, com um peptídeo ou polipeptídeo hete- rólogo. Em algumas modalidades, a proteína de fusão retém a atividade biológica do PSGL-1, do VISTA, do anticorpo anti-PSGL-1 ou do anticor- po anti-VISTA. Em algumas modalidades, a proteína de fusão compreen- de um anticorpo anti-PSGL-1 ou um anticorpo anti-VISTA domínio VH, domínio VL, VH CDR (um, dois ou três VM CDRs) e/ou VL CDR (um, dois ou três VL CDRs), em que a proteína de fusão se liga a um epítopo PSGL-1 ou VISTA.
[0065] O termo "cadeia pesada", quando usado em referência a um anticorpo, refere-se a uma cadeia polipeptídica de cerca de 50-70 kDa, em que a porção amino-terminal inclui uma região variável de cerca de 120 a 130 ou mais aminoácidos e uma porção carbóxi-terminal que inclui uma região constante. A região constante pode ser um dos cinco tipos distintos, referidos como alfa (a), delta (5), épsilon (e), gama (y) e mu (yu), com base na sequência de aminoácidos da região constante da cadeia pesada. As distintas cadeias pesadas diferem em tamanho: a, ô e y con- têm aproximadamente 450 aminoácidos, enquanto 4 e e contêm aproxi- madamente 550 aminoácidos. Quando combinados com uma cadeia le- ve, esses tipos distintos de cadeias pesadas dão origem a cinco classes bem conhecidas de anticorpos, IgA, 1gD, IgE, IgG e IgM, respectivamen-
te, incluindo quatro subclasses de IgG, nomeadamente IgG1, IgG2, I9G3 e I9gG4. Uma cadeia pesada pode ser uma cadeia pesada humana.
[0066] O termo "região de articulação" refere-se aqui a um trecho de aminoácido flexível na parte central das cadeias pesadas das classes de imunoglobulina IgG e IgA, que liga essas 2 cadeias por ligações dissulfe- to. A região de articulação é geralmente definida como estendendo-se de Glu216 a Pro230 de IgG1 humana (Burton, Mol Immunol, 22: 161-206, 1985). As regiões de articulação de outros isotipos de IgG podem ser ali- nhadas com a sequência de IgG1, colocando o primeiro e o último resí- duos de cisteína formando ligações S-S entre cadeias pesadas nas mesmas posições. O "domínio CH2" de uma porção Fc de IgG humana (também referido como domínio "Cy2") geralmente se estende de cerca do aminoácido 231 a cerca do aminoácido 340. O domínio CH2 é único por não estar intimamente emparelhado com outro domínio. Em vez dis- so, duas cadeias de carboidratos ramificadas ligadas a N são interpostas entre os dois domínios CH2 de uma molécula de IgG nativa intacta. Es- peculou-se que o carboidrato pode fornecer um substituto para o empare- lhamento domínio-domínio e ajudar a estabilizar o domínio CH2 (Burton, Mol Immunol, 22: 161-206, 1985). O "domínio CH3" compreende o trecho de resíduos C-terminais a um domínio CH2 em uma porção Fc (isto é, de cerca do resíduo de aminoácido 341 a cerca de resíduo de aminoácido 447 de uma IgG).
[0067] O termo "hospedeiro", quando aqui usado, refere-se a um animal, como um mamífero (por exemplo, um humano).
[0068] O termo "célula hospedeira", quando aqui usado, refere-se à célula em questão específica transfectada com uma molécula de ácido nucleico e a progênie ou progênie potencial de tal célula. A progênie de tal célula pode não ser idêntica à célula-mãe transfectada com a molécula de ácido nucleico devido a mutações ou influências ambientais que po- dem ocorrer nas gerações sucessivas ou integração da molécula de áci- do nucleico no genoma da célula hospedeira.
[0069] Formas "humanizadas" de anticorpos não humanos (por exemplo, murinos) são anticorpos quiméricos que incluem imunoglobuli- nas humanas (anticorpo receptor) em que os resíduos de CDR nativos são substituídos por resíduos da CDR correspondente de uma espécie não humana (anticorpo doador), como camundongo, rato, coelho ou pri- mata não humano com a especificidade, afinidade e capacidade deseja- das. Em alguns casos, um ou mais resíduos da região FR da imunoglobu- lina humana são substituídos por resíduos não humanos corresponden- tes. Além disso, os anticorpos humanizados podem compreender resí- duos que não são encontrados no anticorpo receptor ou no anticorpo do- ador. Essas modificações são feitas para refinar ainda mais o desempe- nho do anticorpo. Uma cadeia pesada ou leve de anticorpo humanizado pode compreender substancialmente todos de pelo menos um ou mais domínios variáveis, em que todos ou substancialmente todas as CDRs correspondem àqueles de uma imunoglobulina não humana e todos ou substancialmente todos os FRs são aqueles de uma imunoglobulina hu- mana sequência. Em algumas modalidades, o anticorpo humanizado compreenderá pelo menos uma porção de uma região constante de imu- noglobulina (Fc), tipicamente a de uma imunoglobulina humana. Para ob- ter mais detalhes, consulte, Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et a/., Nature, 332:323-329 (1988); e Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992); Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285- 4289 (1992); e Patente Norte-americana Nos: 6.800.738 (emitido em 5 de Outubro, 2004), 6.719.971 (emitido em 27 de Setembro, 2005), 6.639.055 (emitido em 28 de Outubro, 2003), 6.407.213 (emitido em 18 de Junho,
2002) e 6.054.297 (emitido em 25 de Abril, 2000).
[0070] Uma "quantidade eficaz" é uma quantidade suficiente para efetuar resultados benéficos ou desejados. Uma quantidade eficaz pode ser administrada em uma ou mais administrações, aplicações ou dosa- gens. Tal liberação depende de uma série de variáveis, incluindo o perío- do de tempo para o qual a unidade de dosagem individual deve ser usa- da, a biodisponibilidade do agente, a via de administração, etc. Em algu- mas modalidades, a quantidade eficaz também se refere à quantidade de um anticorpo aqui fornecido para atingir um resultado especificado (por exemplo, inibição de uma atividade biológica de PSGL-1 ou VISTA de uma célula, como a modulação da ativação de células T). Em algumas modalidades, este termo se refere à quantidade de uma terapia (por exemplo, um anticorpo aqui fornecido) que é suficiente para reduzir e/ou melhorar a gravidade e/ou a duração de uma dada doença, distúrbio ou condição e/ou um sintoma relacionado para isso. Este termo também abrange uma quantidade necessária para a redução ou melhoria do avanço ou progressão de uma determinada doença, distúrbio ou condi- ção, redução ou melhoria da recorrência, desenvolvimento ou início de uma determinada doença, distúrbio ou condição e/ou para melhorar ou aumentar o (s) efeito (s) profilático (s) ou terapêutico (s) de outra terapia (por exemplo, uma terapia diferente do anticorpo anti-PSGL-1 aqui forne- cido). Em algumas modalidades, a quantidade eficaz de um anticorpo é de cerca de 0,1 mg/kg (mg de anticorpo por kg de peso do indivíduo) a cerca de 100 mg/kg. Em algumas modalidades, uma quantidade eficaz de um anticorpo fornecido é cerca de 0,1 mg/kg, cerca de 0,5 mg/Kg, cerca de 1 mg/kg, 3 mg/kg, 5 mg/kg, cerca de 10 mg/kg, cerca de 15 mg/kg, cerca de 20 mg/Kg, cerca de 25 mg/kg, cerca de 30 mg/kg, cerca de 35 mg/kg, cerca de 40 mg/kg, cerca de 45 mg/kg, cerca de 50 mg/Kg, cerca de 60 mg/kg , cerca de 70 mg/Kg, cerca de 80 mg/kg, cerca de 90 mg/kg ou cerca de 100 mg/kg (ou um intervalo aí).
[0071] O termo "inibir", ou um equivalente gramatical do mesmo, quando usado no contexto de um anticorpo se refere a um anticorpo que suprime, restringe ou diminui uma atividade biológica do antígeno ao qual o anticorpo se liga. O efeito inibidor de um anticorpo pode ser aquele que resulta em uma mudança mensurável na atividade biológica do antígeno. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-PSGL-1 aqui descrito inibe a capacidade de VISTA de se ligar a PSGL-1, o que pode resultar na inibi- ção da atividade coinibidora de VISTA. Certos anticorpos anti-PSGL-1 aqui descritos inibem ou bloqueiam sinais supressores de VISTA em cé- lulas que expressam VISTA em mais de 5 %, como de cerca de 5% a cerca de 50 %, ou em mais de 50 % (por exemplo, de cerca de 50 % a cerca de 98 %) em comparação com o controle apropriado (por exemplo, o controle sendo células não tratadas com o anticorpo sendo testado). Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PSGL-1 aqui descrito inibe a ligação de PSGL-1 ao domínio extracelular VISTA e/ou inibe a ligação de uma célula que expressa VISTA a uma célula que expressa PSGL-1. Além disso, em algumas modalidades, o anticorpo anti-PSGL-1 aqui des- crito não inibe a ligação de PSGL-1 a uma proteína diferente de VISTA, como P-selectina, L-selectina e/ou E-selectina.
[0072] O termo "infiltrado imune" ou "células imunes tumorais" refere- se a células que se infilttam no microambiente de um tumor, incluindo, mas não se limitando a, linfócitos (por exemplo, células T, células B, célu- las exterminadoras naturais (NK)), células dendríticas, mastócitos e ma- crófagos.
[0073] Quando aqui usado, o termo "em combinação" no contexto da administração de outras terapias refere-se ao uso de mais de uma terapia
(por exemplo, um anticorpo anti-PSGL-1 e um anticorpo anti-VISTA). O uso do termo "em combinação" não restringe a ordem ou o tempo em que as terapias são administradas a um indivíduo (por exemplo, uma terapia antes, simultaneamente ou após outra terapia). Uma primeira terapia po- de ser administrada antes (por exemplo, 1 minuto, 45 minutos, 30 minu- tos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 sema- nas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas ou 12 semanas), simultanea- mente ou depois (por exemplo, 1 minuto, 45 minutos, 30 minutos, 45 mi- nutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 sema- nas, 6 semanas, 8 semanas ou 12 semanas) a administração de um se- gunda terapia para um indivíduo que teve, tem ou é suscetível a uma do- ença, distúrbio ou condição mediada por VISTA. Qualquer terapia adicio- nal pode ser administrada em qualquer ordem ou tempo com as outras terapias adicionais (por exemplo, um anticorpo anti-PSGL-1 e um anticor- po anti-VISTA). Em algumas modalidades, os anticorpos podem ser ad- ministrados em combinação com uma ou mais terapias (por exemplo, te- rapias que não são os anticorpos que são atualmente administrados para prevenir, tratar, gerenciar e/ou melhorar uma doença, distúrbio ou condi- ção mediada por VISTA) . Exemplos não limitantes de terapias que po- dem ser administradas em combinação com um anticorpo incluem um antagonista para uma molécula coinibidora, um agonista para uma molé- cula coestimuladora, um agente quimioterapêutico, radiação, agentes analgésicos, agentes anestésicos, antibióticos ou agentes imunomodula- dores ou qualquer outro agente listado na U.S. Pharmacopoeia e/ou Physician's Desk Reference.
[0074] Um anticorpo "isolado" está substancialmente livre de material celular ou outras proteínas contaminantes da célula ou tecido fonte e/ou outros componentes contaminantes dos quais o anticorpo é derivado, ou substancialmente livre de precursores químicos ou outros produtos quíi- micos quando sintetizado quimicamente.
A linguagem "substancialmente livre de material celular" inclui preparações de um anticorpo em que o an- ticorpo é separado dos componentes celulares das células das quais é isolado ou produzido de forma recombinante.
Assim, um anticorpo que está substancialmente livre de material celular inclui preparações de anti- corpo com menos de cerca de 30 %, 20 %, 10 % ou 5 % (em peso seco) de proteína heteróloga (também referida neste documento como uma "proteína contaminante"). Em algumas modalidades, quando o anticorpo é produzido de forma recombinante, é substancialmente livre de meio de cultura, por exemplo, meio de cultura representa menos do que cerca de %, 10 % ou 5 % do volume da preparação de proteína.
Em algumas modalidades, quando o anticorpo é produzido por síntese química, é substancialmente livre de precursores químicos ou outros produtos quíi- micos, por exemplo, é separado de precursores químicos ou outros pro- dutos químicos que estão envolvidos na síntese da proteína.
Consequen- temente, tais preparações do anticorpo têm menos do que cerca de 30 %, 20 %, 10 %, 5 % (em peso seco) de precursores químicos ou compostos diferentes do anticorpo de interesse.
Os componentes contaminantes também podem incluir, mas não estão limitados a, materiais que interferi- riam com os usos terapêuticos para o anticorpo e podem incluir enzimas, hormônios e outros solutos proteicos ou não proteicos.
Em algumas mo- dalidades, o anticorpo será purificado (1) para mais de 95 % em peso de anticorpo, conforme determinado pelo método de Lowry (Lowry et al.
J.
Bio.
Chem. 193: 265-275, 1951), tal como 99 % em peso, (2) a um grau suficiente para obter pelo menos 15 resíduos de N-terminal ou sequência de aminoácidos interna pelo uso de um sequenador de copo giratório, ou (3) para homogeneidade por SDS-PAGE sob condições redutoras ou não redutoras usando Azul Coomassie ou, de preferência, mancha de prata. O anticorpo isolado inclui o anticorpo in situ nas células recombinantes, uma vez que pelo menos um componente do ambiente natural do anti- corpo não estará presente. Normalmente, no entanto, o anticorpo isolado será preparado por pelo menos uma etapa de purificação. Em algumas modalidades, os anticorpos aqui fornecidos são isolados.
[0075] Uma molécula de ácido nucleico "isolada" é aquela que está separada de outras moléculas de ácido nucleico que estão presentes na fonte natural da molécula de ácido nucleico. Além disso, uma molécula de ácido nucleico "isolada", como uma molécula de cDNA, pode ser subs- tancialmente livre de outro material celular ou meio de cultura quando produzida por técnicas recombinantes, ou substancialmente livre de pre- cursores químicos ou outros produtos químicos quando sintetizada quimi- camente. Em algumas modalidades, uma (s) molécula (s) de ácido nu- cleico que codifica um anticorpo aqui fornecido é isolada ou purificada.
[0076] O termo "cadeia leve", quando usado em referência a um anti- corpo, refere-se a uma cadeia polipeptídica de cerca de 25 kDa, em que a porção amino-terminal inclui uma região variável de cerca de 100 a cer- ca de 110 ou mais aminoácidos e um porção terminal que inclui uma re- gião constante. O comprimento aproximado de uma cadeia leve é de 211 a 217 aminoácidos. Existem dois tipos distintos, referidos como capa (K) de lambda (A), com base na sequência de aminoácidos dos domínios constantes. As sequências de aminoácidos de cadeia leve são bem co- nhecidas na técnica. Uma cadeia leve pode ser uma cadeia leve humana.
[0077] Quando aqui usado, os termos "gerenciar", "gerenciando" e "gerenciamento" referem-se aos efeitos benéficos que um indivíduo deri-
va de uma terapia (por exemplo, um agente profilático ou terapêutico), que não resulta em uma cura da doença. Em algumas modalidades, um indivíduo é administrado com uma ou mais terapias (por exemplo, agen- tes profiláticos ou terapêuticos, como um anticorpo aqui fornecido) para "gerenciar" uma doença, distúrbio ou condição mediada por VISTA, inclu- indo um ou mais sintomas dos mesmos, de modo que para prevenir a progressão ou agravamento da doença, distúrbio ou condição.
[0078] O termo "anticorpo monoclonal" refere-se a um anticorpo obti- do a partir de uma população de anticorpos homogêneos ou substancial- mente homogêneos, isto é, os anticorpos que formam esta população são essencialmente idênticos, exceto para possíveis mutações de ocorrência natural que podem estar presentes em quantidades menores. Em outras palavras, um anticorpo monoclonal é um anticorpo homogêneo decorren- te do crescimento de um clone de célula única (por exemplo, um hibrido- ma, uma célula hospedeira eucariótica transfectada com uma molécula de DNA que codifica para o anticorpo homogêneo, uma célula hospedeira procariótica transfectada com uma molécula de DNA que codifica para o anticorpo homogêneo, etc.) e é geralmente caracterizado por cadeias pe- sadas de uma e apenas uma classe e subclasse, e cadeias leves de apenas um tipo. Esses anticorpos são altamente específicos e dirigidos contra um único antígeno. Além disso, em contraste com as preparações de anticorpos policlonais que tipicamente incluem vários anticorpos dire- cionados contra vários determinantes, ou epítopos, cada anticorpo mono- clonal é direcionado contra um único epítopo do antígeno. Em algumas modalidades, um "anticorpo monoclonal", quando aqui usado, é um anti- corpo produzido por um único hibridoma ou outra célula, em que o anti- corpo se liga a apenas um epítopo VISTA conforme determinado, por exemplo, por ELISA ou outra ligação de antígeno ou ligação competitiva ensaio conhecido na técnica. O termo "monoclonal" não está limitado a qualquer método particular para fazer o anticorpo. Por exemplo, os anti- corpos monoclonais aqui fornecidos podem ser produzidos pelo método de hibridoma conforme descrito em Kohler et a/.; Nature, 256: 495 (1975) ou pode ser isolado de bibliotecas de fago usando as técnicas. Outros métodos para a preparação de linhagens celulares clonais e de anticor- pos monoclonais assim expressos são bem conhecidos na técnica (veja, por exemplo, Capítulo 11 em: Short Protocols in Molecular Biology, (2002) 5º. Ed., Ausubel et a/., Eds ., John Wiley and Sons, New York). Outros métodos exemplares de produção de outros anticorpos monoclio- nais são fornecidos nos Exemplos aqui.
[0079] O termo "nativo" quando usado em conexão com materiais biológicos, tais como, moléculas de ácido nucleico, polipeptídeos, células hospedeiras e semelhantes, refere-se àqueles que são encontrados na natureza e não manipulados por um ser humano.
[0080] O termo "farmaceuticamente aceitável", quando aqui usado, significa ser aprovado por uma agência reguladora do governo federal ou estadual, ou listado na Farmacopeia Norte-americana, Farmacopeia Eu- ropeia ou outra farmacopeia geralmente reconhecida para uso em ani- mais, e mais particularmente em humanos.
[0081] "Anticorpos policlonais", quando aqui usado, refere-se a uma população de anticorpos gerada em uma resposta imunogênica a uma proteína com muitos epítopos e, portanto, inclui uma variedade de anti- corpos diferentes direcionados ao mesmo e a diferentes epítopos dentro da proteína. Os métodos para a produção de anticorpos policlonais são conhecidos na técnica (Veja, por exemplo, veja, por exemplo, Capítulo 11 em: Short Protocols in Molecular Biology, (2002) 5º. Ed., Ausubel et al., Eds., John Wiley and Sons, New York).
[0082] Quando aqui usado, o termo "polinucleotídeo", "nucleotídeo", "ácido nucleico", "molécula de ácido nucleico" e outros termos semelhan- tes são usados intercambiáveis e incluem DNA, RNA, mRNA e semelhan- tes.
[0083] Quando aqui usado, os termos "prevenir", "prevenindo" e "pre- venção" referem-se à inibição total ou parcial do desenvolvimento, recor- rência, início ou propagação de uma doença, distúrbio ou condição medi- ada por VISTA e/ou sintoma relacionado ao mesmo, resultante da admi- nistração de uma terapia ou combinação de terapias fornecidas neste do- cumento (por exemplo, uma combinação de agentes profiláticos ou tera- pêuticos, como um anticorpo aqui fornecido).
[0084] Quando aqui usado, o termo "agente profilático" refere-se a qualquer agente que pode inibir total ou parcialmente o desenvolvimento, recorrência, início ou disseminação de uma doença, distúrbio ou condição mediada por VISTA e/ou sintoma relacionado a ele em um indivíduo. Em algumas modalidades, o termo "agente profilático" se refere a um anticor- po anti-PSGL-1 aqui fornecido. Em algumas outras modalidades, o termo "agente profilático" se refere a um agente diferente de um anticorpo anti- PSGL-1 aqui fornecido. Em algumas modalidades, um agente profilático é um agente que é conhecido por ser útil ou tem sido ou está sendo usado para prevenir uma doença, distúrbio ou condição mediada por VISTA e/ou um sintoma relacionado ao mesmo ou impedir o início, desenvolvi- mento, progressão e/ou gravidade de uma doença, distúrbio ou condição mediada por VISTA e/ou um sintoma relacionado ao mesmo. Em algu- mas modalidades, o agente profilático é um anticorpo anti-PSGL-1 huma- nizado, como um anticorpo monoclonal anti-PSGL-1 humanizado.
[0085] O termo "ligante 1 da glicoproteína da selectina P" (também conhecido como PSGL-1, PSGL1, ligante da selectina P, SELPLG, CLA e
CD162) refere-se a um polipeptídeo ("polipeptídeo", "peptídeo" e "proteí- na" são usados indistintamente aqui) codificado pelo gene SELPLG, por exemplo, compreendendo a sequência de aminoácidos: 1 mplqllilli IlgpgnsIgl wdtwadeaek algpllardr rgateyeyld ydflpetepp 61 emilrnstdtt pltgpgtpes ttvepaarrs tgldaggavt elttelanmg nIstdsaame 121 igttapaate aqttplaate aqttritate aqttplaate aqttppaate aqttqgptgle 181 aqttapaame aqgttapaame aqttppaame aqttqattame aqttapeate aqttqgptate 241 agqttplaame alstepsate alsmepttkr glfipfsvss vthkgipmaa snlsvnypvg 301 apdhisvkqc llaililalv atiffvctvv lavristrkgh mypvrnyspt emvcissilp 361 dggegpsata ngglskaksp gltpepredr egdditlhsf Ip (SEQ ID NO: 3) e polipeptídeos relacionados, incluindo suas variantes SNP. PSLG-1 é um ligante de glicoproteína do tipo mucina humana que é conhecido por se ligar a todas as três selectinas (P-selectina, E-selectina e L-selectina), mas se liga à P-selectina com a maior afinidade (McEver et al., J. Clin.
Invest., 100 (3): 485-492 (1997) e Carlow et al., Inmunological Reviews, 230: 75-96 (2009)). O PSGL-1 é um homodímero ligado por dissulfeto com duas subunidades de 120 kD e é expresso na superfície de monóci- tos, linfócitos, granulócitos e em algumas células-tronco CD34*. Como tal, esta proteína é conhecida por desempenhar um papel no tráfego de leu- cócitos durante a inflamação por amarração de leucócitos a plaquetas ativadas ou endotélios que expressam selectinas. PSGL-1 tipicamente tem duas modificações pós-translação, sulfatação de tirosina e a adição do tetrassacarídeo sialil Lewis x (sLex) aos seus glicanos ligados em O, por sua atividade de ligação de alta afinidade. A expressão aberrante do gene SELPLG e polimorfismos neste gene estão associados a defeitos nas respostas imunes inatas e adaptativas.
[0086] Como aqueles versados na técnica apreciarão, um anticorpo anti-PSGL-1 aqui fornecido pode se ligar a um polipeptídeo PSGL-1, fra- gmento de polipeptídeo, antígeno e/ou epítopo, como um epítopo é parte do antígeno maior, por exemplo, que faz parte do fragmento polipeptídico maior, que, por sua vez, por exemplo, faz parte do polipeptídeo maior. O PSGL-1 pode existir em uma forma nativa ou desnaturada. Os polipeptí- deos PSGL-1 aqui descritos podem ser isolados de uma variedade de fontes, tais como, de tipos de tecidos humanos ou de outra fonte, ou pre- parados por métodos recombinantes ou sintéticos. Um "polipeptídeo PSGL-1 de sequência nativa" compreende um polipeptídeo possuindo a mesma sequência de aminoácidos que o polipeptídeo PSGL-1 corres- pondente derivado da natureza. Esses polipeptídeos PSGL-1 de sequên- cia nativa podem ser isolados da natureza ou podem ser produzidos por meios recombinantes ou sintéticos. O termo "polipeptídeo PSGL-1 de se- quência nativa" abrange especificamente as formas truncadas ou secre- tadas de ocorrência natural do polipeptídeo PSGL-1 específico (por exemplo, uma sequência de domínio extracelular), formas variantes de ocorrência natural (por exemplo, formas de splicing alternativo) e ocor- rendo variantes alélicas do polipeptídeo.
[0087] Uma sequência de ácido nucleico de cDNA que codifica um polipeptídeo PSGL-1, por exemplo, compreende: 1 atggggtata ggctgtcaca tggecetgcc taagtaacca catteteget tectecttec 61 acacacagcc attgggggtt gcteggatce gggactgceg cagggggtac cacagcagta 121 cctggcageg taggctagga ccttgtcact aaagcagaga agccacttet tetaggeecca 181 cgaggcagct gteccatgct ctactgagea cggtagtgce atgcectetge aactectect 241 gttgctgatc ctactgggcec ctagcaacag cttgcagetg taggacacct gggcagatga 301 agccegagaaa gecttagate cectgettge cegggacegg agacaggeca cegaatatga 361 gtacctagattatgatttce taccagaaac ggagceceteca gaaatgctga ggaacagcac 421 tgacaccact cctcetgactg ggcctggaac cectgagtect accactgtagg agectactge 481 aaggcgttct actagectag atacaggagg ggcagtcaca gagcetgacca cggagctage 541 caacatgggg aacctgtoca cggattcagc agctatggag atacagacca ctcraaccage 601 agccacggag gcacagacca ctecactgge agccacagag gcacagacaa ctegactgac
661 ggccacggag gcacagacca ctecactgge agccacagag gcacagacca ctecaceage 721 agccacggaa gcacagacca cteraacecac aggectagag gcacagacca ctgcaceage 781 agccatggag gcacagacca ctgcaccagc agecatggaa gcacagacca ctecaceage 841 agccatggag gcacagacca ctcaaacceac agecatggag gcacagacca ctgcaceaga 901 agccacggag gcacagacca cteaacecac agecacggag gcacagacca ctecactage 961 agccatggag gecetgteca cagaacecag taccacagag gecetgteca tagaacetac 1021 taccaaaaga ggotetattca tacectttte tatatectet gttacteaca agggcattee 1081 catggcagcc agcaatttat cegteaacta cccagtaggg gececagacce acatetetgt 1141 gaagcagtac ctactggeca tectaatett ggcgctagta gecactatet tettegtata 1201 cactatagta ctaggegatee gecteteceg caagggecac atgtacceceg tacgtaatta 1261 ctcececeace gagatagtet gcateteate cetattaect gataggggta aggggecete 1321 tgccacagcc aatgggggcece tatecaagge caagageceg ggectgacge cagageceag 1381 ggaggaccgt gagggggatg accteacect gcacagette ctecettage teactetgec 1441 atctattttg gcaagacece acetecacgg getetectgg geccacecetg agtgcecaga 1501 ceccattecea cagetetggg cttectegga gacecctagg gatagagatec tteagggaag 1561 gaactctggc cacccaaaca ggacaagage agectaggge caagcagacg ggcaagtgga 1621 gccaccetett tectecetee geggatgaag cecagecaca ttteagecga ggtecaagge 1681 aggaggccat ttacttgaga cagattetet cetttttect gteceeceate ttetetagat 1741 ccectetaaca teteccatgg cteteceegoe ttetectagt cactagagte tectececat 1801 gtacccaagg aagatggage tececeatee cacacgceact gcactacecat tatettttag 1861 ttgccatggt caccaaacag gaagtagaca ttetaaggga ggagtactga agagtgacgg 1921 acttctgagg ctatttecta ctactectet gacttaggge agcettggate ttettaggca 1981 cctetetagg aaaacecagg gtgagattca gectatgagg getaggatag gtttegtaga 2041 cccaagggca gacctttett taggactata tagaccaagg agcttccatc tagtgacaag 2101 tgacceccag ctategecte ttgeettece ctataggecac tttecagggt ggactetate 2161 ttgtticactg cagtatccca actgcaggte cagtgcaggc aataaatatg tgatagacaa 2221 acgata (SEQ ID NO: 4)
[0088] Os ortólogos para o polipeptídeo PSGL-1 humano também são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, ortólogos de PSGL-1 po- dem ser encontrados em organismos como camundongo (Mus muscu-
lus), rato (Rattus norvegicus), cachorro (Canis lupus familiaris), gado (Bos Taurus), peixe-zebra (Danio rerio), cavalo (Equus caballus), chimpanzé (Pan troglodytes), etc.
[0089] Uma "doença mediada por PSGL-1", "distúrbio mediado por PSGL-1" e "condição mediada por PSGL-1" são usados indistintamente e referem-se a qualquer doença, distúrbio ou condição que seja total ou parcialmente causada por ou é o resultado de PSGL-1. Tais doenças, dis- túrbios ou condições incluem aqueles causados por ou de outra forma associados a PSGL-1, incluindo por ou associados a células que expres- sam PSGL-1 (por exemplo, células tumorais, células supressoras deriva- das de mieloides (MDSC), células dendríticas supressoras (DC supresso- ras ), e/ou células T reguladoras (T-regs)). Em algumas modalidades, o PSGL-1 é de forma aberrante (por exemplo, altamente) expresso na su- perfície de uma célula. Em algumas modalidades, o PSGL-1 pode ser re- gulado positivamente de forma aberrante em um tipo de célula particular. Em outras modalidades, a sinalização celular normal, aberrante ou ex- cessiva é causada pela ligação de PSGL-1 a um ligante PSGL-1 (por exemplo, VISTA), que pode se ligar ou de outra forma interagir com PSGL-1. Em uma modalidade preferida, a doença mediada por PSGL-1 é causada pela ligação de PSGL-1 a um ligante PSGL-1 específico (por exemplo, VISTA), mas não a outros ligantes (por exemplo, as selectinas).
[0090] O termo "radiação", quando usado no contexto terapêutico, refere-se a um tipo de tratamento que usa um feixe de energia intensa para matar células-alvo (por exemplo, células cancerosas). A radioterapia inclui o uso de raios-X, prótons ou outras formas de energia que são ad- ministradas por meio de um feixe externo. A radioterapia também inclui o tratamento de radiação que é colocado no corpo de um paciente (por exemplo, braquiterapia), por meio do qual um pequeno recipiente de ma-
terial radioativo é implantado diretamente no ou próximo a um tumor.
[0091] Os termos "nível de expressão relativa" referem-se a uma quantificação do nível de expressão de uma proteína em uma determina- da amostra em relação a outra proteína de referência na mesma amostra e/ou a outra amostra de referência. No contexto dos métodos aqui descri- tos, o nível de expressão de PSGL-1 pode ser expresso em números ab- solutos, como com base em uma curva padrão, ou pode ser expresso em níveis de expressão relativos contra uma ou mais outras proteínas que são testadas em a amostra (por exemplo, VISTA, CD11b, CD33, CD4 ou CDB8).
[0092] O termo "anticorpo recombinante" refere-se a um anticorpo que é preparado, expresso, criado ou isolado por meios recombinantes. Os anticorpos recombinantes podem ser anticorpos expressos usando um vetor de expressão recombinante transfectado em uma célula hospe- deira, anticorpos isolados de uma biblioteca de anticorpos combinatória recombinante, anticorpos isolados de um animal (por exemplo, um ca- mundongo ou vaca) que é transgênico e/ou transcromossômico para imunoglobulina humana genes (veja, por exemplo, Taylor, LD et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20: 6287-6295) ou anticorpos preparados, ex- pressos, criados ou isolados por qualquer outro meio que envolve o spli- cing de sequências de genes de imunoglobulina a outras sequências de DNA. Tais anticorpos recombinantes podem ter regiões variáveis e cons- tantes derivadas de sequências de imunoglobulina da linha germinativa humana (Veja, Kabat, EA et a/. (1991) Sequences of Proteins of Immuno- logical Interest, Quinta Edição, US Department of Health and Human Ser- vices, NIH Publication No. 91- 3242). Em algumas modalidades, no en- tanto, tais anticorpos recombinantes são submetidos à mutagênese in vitro (ou, quando um animal transgênico para sequências de lg humana é usado, mutagênese somática in vivo) e, assim, as sequências de amino- ácidos das regiões VH e VL dos anticorpos recombinantes são sequên- cias que, embora derivadas de e relacionadas com as sequências VH e VL da linha germinativa humana, podem não existir naturalmente no re- pertório da linha germinativa do anticorpo humano in vivo.
[0093] Quando aqui usado, o termo "efeitos colaterais" abrange os efeitos indesejáveis e adversos de uma terapia (por exemplo, um agente profilático ou terapêutico). Os efeitos indesejados não são necessaria- mente adversos. Um efeito adverso de uma terapia (por exemplo, um agente profilático ou terapêutico) pode ser prejudicial ou desconfortável ou arriscado. Exemplos de efeitos colaterais incluem diarreia, tosse, gas- troenterite, respiração ofegante, náusea, vômito, anorexia, cólicas abdo- minais, febre, dor, perda de peso corporal, desidratação, alopecia, dispe- néia, insônia, tontura, mucosite, efeitos nos nervos e músculos, fadiga, boca seca e perda de apetite, erupções cutâneas ou inchaços no sítio da administração, sintomas semelhantes aos da gripe, como febre, calafrios e fadiga, problemas do trato digestivo e reações alérgicas. Os efeitos in- desejáveis adicionais experimentados pelos pacientes são numerosos e conhecidos na técnica. Muitos são descritos no Physician's Desk Refer- ence (67º ed., 2013).
[0094] Quando aqui usado, os termos "indivíduo" e "paciente" são usados indistintamente. Quando aqui usado, em algumas modalidades, um indivíduo é um mamífero, como um não primata (por exemplo, vacas, porcos, cavalos, gatos, cães, ratos, etc.) ou um primata (por exemplo, macaco e humano). Em algumas modalidades, o indivíduo é um humano. Em algumas modalidades, o indivíduo é um mamífero (por exemplo, um humano) com uma doença, distúrbio ou condição mediada por VISTA e/ou um sintoma relacionado ao mesmo. Em outra modalidade, o indiví-
duo é um mamífero (por exemplo, um humano) em risco de desenvolver uma doença, distúrbio ou condição mediada por VISTA e/ou um sintoma relacionado ao mesmo.
[0095] Quando aqui usado, "substancialmente todos" refere-se a pelo menos cerca de 60 %, pelo menos cerca de 70 %, pelo menos cerca de 75 %, pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 85 %, pelo menos cerca de 90 %, pelo menos cerca de 95 %, pelo menos cerca de 98 %, pelo menos cerca de 99 % ou cerca de 100 %.
[0096] Quando aqui usado, o termo "agente terapêutico" refere-se a qualquer agente que pode ser usado no tratamento, prevenção ou alívio de uma doença, distúrbio ou condição, incluindo no tratamento, preven- ção ou alívio de um ou mais sintomas de uma doença, distúrbio ou condi- ção mediada por VISTA e/ou um sintoma relacionado ao mesmo. Em al- gumas modalidades, um agente terapêutico se refere a um anticorpo anti- PSGL-1 aqui fornecido. Em algumas modalidades, um agente terapêutico se refere a um agente diferente de um anticorpo anti-PSGL-1 aqui forne- cido. Em algumas modalidades, um agente terapêutico é um agente que é conhecido por ser útil para, ou foi ou está sendo usado atualmente para o tratamento, prevenção ou alívio de um ou mais sintomas de uma doen- ça, distúrbio, condição médica mediada por VISTA e/ou um sintoma rela- cionado ao mesmo.
[0097] A combinação de terapias (por exemplo, uso de agentes tera- pêuticos) pode ser mais eficaz do que os efeitos aditivos de quaisquer duas ou mais terapias únicas. Por exemplo, um efeito sinérgico de uma combinação de agentes terapêuticos permite o uso de dosagens mais baixas de um ou mais dos agentes e/ou administração menos frequente dos agentes a um indivíduo com uma doença, distúrbio ou condição me- diada por VISTA e/ou um sintoma relacionado ao mesmo. A capacidade de utilizar dosagens mais baixas de terapias terapêuticas e/ou de admi- nistrar as terapias com menos frequência reduz a toxicidade associada à administração das terapias a um indivíduo, sem reduzir a eficácia das te- rapias na prevenção, tratamento ou alívio de um ou mais sintomas de uma doença, distúrbio ou condição mediada por VISTA e/ou um sintoma relacionado ao mesmo. Além disso, um efeito sinérgico pode resultar em eficácia melhorada de terapias na prevenção, tratamento ou alívio de um ou mais sintomas de uma doença, distúrbio ou condição mediada por VISTA e/ou um sintoma relacionado aos mesmos. Finalmente, o efeito sinérgico de uma combinação de terapias (por exemplo, agentes terapêu- ticos) pode evitar ou reduzir os efeitos colaterais adversos ou indesejados associados ao uso de qualquer terapia única.
[0098] O termo "quantidade terapeuticamente eficaz", quando aqui usado, refere-se à quantidade de um agente terapêutico (por exemplo, um anticorpo anti-PSGL ou qualquer outro agente terapêutico, incluindo como aqui descrito, incluindo, por exemplo, um anticorpo anti-VISTA ) que é suficiente para reduzir e/ou melhorar a gravidade e/ou a duração de uma determinada doença, distúrbio ou condição e/ou um sintoma rela- cionado a ela. Uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente terapêutico pode ser uma quantidade necessária para a redução ou me- lhoria do avanço ou progressão de uma determinada doença, distúrbio ou condição, redução ou melhoria da recorrência, desenvolvimento ou início de uma determinada doença, distúrbio ou condição e/ou para melhorar ou aumentar o efeito profilático ou terapêutico de outra terapia (por exemplo, uma terapia diferente da administração de um anticorpo anti-PSGL-1, in- cluindo como aqui descrito).
[0099] Quando aqui usado, o termo "terapia" refere-se a qualquer protocolo, método e/ou agente que pode ser usado na prevenção, gestão,
tratamento e/ou melhoria de uma doença, distúrbio ou condição mediada por VISTA. Em algumas modalidades, os termos "terapias" e "terapia" referem-se a uma terapia biológica, terapia de suporte e/ou outras terapi- as úteis no tratamento, prevenção e/ou melhoria de uma doença, distúr- bio ou condição mediada por VISTA conhecida por um com habilidade na técnica, como pessoal médico.
[00100] “Quando aqui usado, os termos "tratar", "tratamento" e "tratan- do" referem-se à redução ou melhoria da progressão, gravidade e/ou du- ração de uma doença, distúrbio ou condição mediada por VISTA, resul- tante da administração de uma ou mais terapias (incluindo, mas não se limitando à, administração de um ou mais agentes terapêuticos, como um anticorpo anti-PSGL-1, incluindo como aqui descrito). Em algumas moda- lidades, tais termos se referem à redução ou inibição do câncer (por exemplo, um câncer hematológico). Em algumas modalidades, tais ter- mos referem-se à redução ou melhoria da progressão, gravidade e/ou duração de uma doença, distúrbio ou condição, que é responsiva à mo- dulação imunológica, tal modulação resultante do aumento da ativação de células T.
[00101] O termo "microambiente tumoral" refere-se ao ambiente celu- lar no qual existe um tumor. Um microambiente tumoral pode incluir va- sos sanguíneos circundantes, células imunes, fibroblastos, células infla- matórias derivadas da medula óssea, linfócitos, moléculas de sinalização e a matriz extracelular.
[00102] O termo "domínio variável" ou "região variável" refere-se a uma porção das cadeias leves ou pesadas de um anticorpo que está ge- ralmente localizado no terminal amino da cadeia leve ou pesada e tem um comprimento de cerca de 120 a 130 aminoácidos na cadeia pesada e cerca de 100 a 110 aminoácidos na cadeia leve, e são usados na ligação e especificidade de cada anticorpo particular para seu antígeno particular. Os domínios variáveis diferem extensivamente na sequência entre dife- rentes anticorpos. A variabilidade na sequência está concentrada na CDR, enquanto as porções menos variáveis no domínio variável são refe- ridas como regiões estruturais (FR). Cada região variável compreende três CDRs que são conectadas a quatro FR. As CDRs das cadeias leve e pesada são as principais responsáveis pela interação do anticorpo com o antígeno. Embora não esteja diretamente envolvida na ligação ao antíge- no, a FR determina o dobramento das moléculas e, portanto, a quantida- de de CDR que é apresentada na superfície da região variável para inte- ração com o antígeno. Em algumas modalidades, a região variável é uma região variável humana.
[00103] O termo "numeração de resíduo de domínio variável como em Kabat" ou "numeração de posição de aminoácido como em Kabat", e va- riações dos mesmos, refere-se ao sistema de numeração usado para domínios variáveis de cadeia pesada ou domínios variáveis de cadeia leve da compilação de anticorpos em Kabat et a/., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5º Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991). Usando este sistema de numeração, a sequência de aminoácidos linear real pode conter menos ou mais amino- ácidos correspondendo a um encurtamento de, ou inserção em, um FR ou CDR do domínio variável. Por exemplo, um domínio variável de cadeia pesada pode incluir uma única inserção de aminoácido (resíduo 52a de acordo com Kabat) após o resíduo 52 de H2 e resíduos inseridos (por exemplo, resíduos 82a, 82b e 82c, etc., de acordo com Kabat) após o re- síduo 82 de FR de cadeia pesada. A numeração de Kabat de resíduos pode ser determinada para um determinado anticorpo por alinhamento em regiões de homologia da sequência do anticorpo com uma sequência numerada de Kabat "padrão". O sistema de numeração Kabat é geral- mente usado quando se refere a um resíduo no domínio variável (aproxi- madamente resíduos 1-107 da cadeia leve e resíduos 1-113 da cadeia pesada) (por exemplo, Kabat et al., Sequences of Immunological Interest. 5a. Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). O "sistema de numeração EU" ou "índice EU" é geralmente usa- do quando se refere a um resíduo em uma região constante da cadeia pesada de imunoglobulina (por exemplo, o índice EU relatado em Kabat et al., Supra). O "índice EU como em Kabat" refere-se à numeração de resíduos do anticorpo IgG 1 EU humano. A menos que indicado de outra forma neste documento, as referências a números de resíduos no domí- nio variável de anticorpos significam numeração de resíduos pelo sistema de numeração de Kabat. Outros sistemas de numeração foram descritos, incluindo, por exemplo, por ADM, Chothia, Contact e IMGT.
[00104] O termo "variante" quando usado em relação a PSGL-1, VIS- TA ou a um anticorpo anti-PSGL-1 ou um anticorpo anti-VISTA refere-se a um peptídeo ou polipeptídeo compreendendo um ou mais (tal como, por exemplo, cerca de 1 a cerca de 25, cerca de 1 a cerca de 20, cerca de 1 a cerca de 15, cerca de 1 a cerca de 10, ou cerca de 1 a cerca de 5) substituições, deleções e/ou adições de sequência de aminoácidos em comparação com uma sequência nativa ou não modificada . Por exemplo, um PSGL-1 ou variante VISTA pode resultar de um ou mais (tal como, por exemplo, cerca de 1 a cerca de 25, cerca de 1 a cerca de 20, cerca de 1 a cerca de 15, cerca de 1 a cerca de 10, ou cerca de 1 a cerca de 5) alterações em uma sequência de aminoácidos de PSGL-1 nativo ou VIS- TA, respectivamente. Também a título de exemplo, uma variante de um anticorpo anti-PSGL-1 ou anticorpo anti-VISTA pode resultar de um ou mais (tal como, por exemplo, cerca de 1 a cerca de 25, cerca de 1 a cer-
ca de 20, cerca de 1 a cerca de 15, cerca de 1 a cerca de 10, ou cerca de 1 a cerca de 5) alterações em uma sequência de aminoácidos de um an- ticorpo anti-PSGL-1 nativo ou previamente não modificado ou anticorpo anti-VISTA. As variantes podem ocorrer naturalmente, como variantes alélicas ou de ligação, ou podem ser construídas artificialmente. As vari- antes polipeptídicas podem ser preparadas a partir das moléculas de áci- do nucleico correspondentes que codificam as variantes. Em algumas modalidades, a variante PSGL-1, variante VISTA ou anticorpo anti-PSGL- 1 ou uma variante de anticorpo anti-VISTA retém pelo menos PSGL-1, VISTA, anticorpo anti-PSGL-1 ou atividade funcional de anticorpo anti- VISTA, respectivamente. Em algumas modalidades, uma variante de an- ticorpo anti-PSGL-1 liga PSGL-1 e/ou é antagonista à atividade de PSGL-
1. Em algumas modalidades, uma variante de anticorpo anti-VISTA se liga a VISTA e/ou é antagônica à atividade de VISTA. Em algumas moda- lidades, a variante é codificada por uma variante de polimorfismo de nu- cleotídeo único (SNP) de uma molécula de ácido nucleico que codifica PSGL-1, VISTA, anticorpo anti-PSGL-1 ou regiões ou sub-regiões VH ou VL do anticorpo anti-VISTA.
[00105] O termo "vetor" refere-se a uma substância que é usada para introduzir uma molécula de ácido nucleico em uma célula hospedeira. Os vetores aplicáveis para uso incluem, por exemplo, vetores de expressão, plasmídeos, vetores fágicos, vetores virais, epissomas e cromossomas artificiais, que podem incluir sequências de seleção ou marcadores ope- ráveis para integração estável no cromossoma de uma célula hospedeira. Além disso, os vetores podem incluir um ou mais genes marcadores se- lecionáveis e sequências de controle de expressão apropriadas. Genes marcadores selecionáveis que podem ser incluídos, por exemplo, forne- cem resistência a antibióticos ou toxinas, complementam deficiências au-
xotróficas ou fornecem nutrientes críticos que não estão no meio de cultu- ra. As sequências de controle de expressão podem incluir promotores constitutivos e indutíveis, realçadores da transcrição, terminadores da transcrição e semelhantes que são bem conhecidos na técnica. Quando duas ou mais moléculas de ácido nucleico devem ser coexpressas (por exemplo, uma cadeia pesada e leve de anticorpo), ambas as moléculas de ácido nucleico podem ser inseridas, por exemplo, em um único vetor de expressão ou em vetores de expressão separados. Para a expressão de vetor único, os ácidos nucleicos codificadores podem ser operacio- nalmente ligados a uma sequência de controle de expressão comum ou ligados a diferentes sequências de controle de expressão, tais como, um promotor indutível e um promotor constitutivo. A introdução de moléculas de ácido nucleico em uma célula hospedeira pode ser confirmada usando métodos bem conhecidos na técnica. Tais métodos incluem, por exemplo, análise de ácido nucleico, como Northern blots ou reação em cadeia da polimerase (PCR), amplificação de mMRNA, ou immunoblotting para ex- pressão de produtos gênicos ou outros métodos analíticos adequados para testar a expressão de uma sequência de ácido nucleico introduzida ou seu produto do gene correspondente. É entendido por aqueles versa- dos na técnica que a molécula de ácido nucleico é expressa em uma quantidade suficiente para produzir o produto desejado (por exemplo, um anticorpo anti-PSGL-1 aqui fornecido), e é ainda entendido que os níveis de expressão podem ser otimizados para obter expressão suficiente usando métodos bem conhecidos na técnica.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[00106] A prática da descrição emprega, salvo indicação em contrário, técnicas convencionais em biologia molecular, microbiologia, análise ge- nética, DNA recombinante, química orgânica, bioquímica, PCR, síntese e modificação de oligonucleotídeos, hibridização de ácido nucleico e cam- pos relacionados dentro da habilidade da técnica. Essas técnicas são descritas nas referências aqui citadas e são totalmente explicadas na lite- ratura. Veja, por exemplo, Maniatis et a/.(1982) Molecular Cloning: A La- boratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Sambrook et al.(1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Sambrook et a/.(2001) Molecular Clon- ing: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Ausubel et a/., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987 e atualizações anuais); Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (1987 e atualizações anuais) Gait (ed.) (1984) Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; Eck- stein (ed.) (1991) Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, IRL Press; Birren et al.(eds.) (1999) Genome Analysis: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press. PSGL-1 É UM RECEPTOR PARA VISTA
[00107] Durante a carcinogênese, as células tumorais interagem com um microambiente complexo que é composto de matriz extracelular e cé- lulas hospedeiras não neoplásicas, incluindo células mesenquimais, célu- las endoteliais vasculares e células inflamatórias ou imunes. O microam- biente desempenha um papel crucial na supressão das respostas de cé- lulas T específicas do tumor. A fim de garantir que uma resposta inflama- tória imune não seja constantemente ativada uma vez que os antígenos tumorais tenham estimulado uma resposta, vários pontos de checagem estão em vigor ou ativados. Esses pontos de checagem são principal- mente representados pela ligação do receptor da célula T a ligantes nas células no microambiente circundante, formando sinapses imunológicas que, então, regulam as funções da célula T.
[00108] VISTA é um desses pontos de checagem imunes. A proteína é hematopoieticamente restrita e, em vários modelos de câncer, só foi de- tectada em leucócitos infiltrantes de tumor e não em células tumorais. VISTA regula negativamente a imunidade das células T por meio do im- pacto direto nas células T, envolvendo diferentes receptores/ligantes, pois, único entre as proteínas de ponto de checagem imune, ele atua tan- to como um ligante quanto como um receptor (Le Mercier, supra).
[00109] Os presentes inventores identificaram agora PSGL-1 como um parceiro de ligação (por exemplo, um ligante ou um receptor) da proteína VISTA. PSGL-1 é uma glicoproteína transmembranar homodimérica de 120 kDa contendo glicanos ligados a O e N, cujo papel mais conhecido é no tráfego de células imunes por meio da ligação de selectina. O PSGL-1 é expresso em células de linhagens linfoides, mieloides e dendríticas (Laszik et al., Blood, 88 (8): 3010-21 (1996)). As células T virgens ex- pressam a forma de ligação não selectina do PSGL-1, que pode envolver outros parceiros de ligação atualmente desconhecidos (Veerman et al., Nat. Immunol. 8 (5), 532-539 (2007)). A expressão em células tumorais também foi observada. Foi recentemente demonstrado que o PSGL-1 promove a exaustão das células T, facilitando o crescimento do tumor de melanoma, através da indução de um parceiro desconhecido (Tinoco et al., Immunity, 44: 1190-03 (2016)).
[00110] Os inventores demonstraram ligação direta entre as duas pro- teínas e mostraram que PSGL-1 e VISTA cooperam na prevenção da ati- vação de células T. Na verdade, a interação física entre VISTA e PSGL-1 é a base de uma interação funcional, já que ambos os genes são coex- pressos em vários tumores. Nenhum dos outros receptores VISTA putati- vos exibe tal colocalização, enfatizando a especificidade da relação. Além disso, VISTA e PSGL-1 são expressos no microambiente de células tu-
morais. Mais especificamente, a hibridização in situ revelou que ambos os genes são expressos em células adjacentes no microambiente tumo- ral. Cada célula que expressa PSGL-1 é adjacente a uma célula que ex- pressa VISTA em infiltrados imunes, indicando que PSGL-1 é um substi- tuto confiável para VISTA ativado.
DIAGNÓSTICO DE TRANSTORNOS MEDIADOS POR VISTA
[00111] Os dados acima indicam que PSGL-1 é um biomarcador con- fiável para o diagnóstico de um distúrbio mediado por VISTA, como um câncer mediado por VISTA. Reagentes, tais como, sondas de ácido nu- cleico marcadas ou anticorpos aqui fornecidos, que se ligam ao ácido nu- cleico ou proteína PSGL-1, podem ser usados para fins de diagnóstico para detectar, diagnosticar ou monitorar uma doença, distúrbio ou condi- ção mediada por VISTA.
[00112] Assim, em um primeiro aspecto, a invenção se refere a um método in vitro para detectar um câncer mediado por VISTA em um indi- víduo, o referido método compreendendo as etapas de: a) contar uma amostra biológica do referido indivíduo com um reagente capaz de se ligar à proteína ou ácido nucleico PSGL-1; e b) detectar a ligação do referido reagente com a referida amostra biológica.
[00113] De acordo com o presente método, a ligação de PSGL-1 indi- ca a presença de câncer mediado por VISTA. De preferência, a ligação de PSGL-1 em infiltrados imunes do microambiente tumoral indica a pre- sença de câncer mediado por VISTA.
[00114] O reagente capaz de se ligar à proteína ou ácido nucleico PSGL-1 pode ser qualquer reagente ou composto conhecido por um es- pecialista na técnica que seja capaz de se ligar especificamente ao PSGL-1. Por exemplo, a pessoa versada perceberá imediatamente que uma sonda de DNA ou RNA que hibridiza especificamente com PSGL-1 se liga especificamente a PSGL-1. Da mesma forma, alguém versado na técnica perceberá imediatamente que um anticorpo anti-PSGL-1, como os descritos neste documento, se liga especificamente ao PSGL-1.
[00115] A invenção também se refere a um método in vitro para detec- tar um câncer mediado por VISTA em um indivíduo, o referido método compreendendo as etapas de: a) contatar uma amostra biológica do referido indivíduo com um reagente capaz de se ligar à proteína ou ácido nucleico PSGL-1; e b) quantificar a ligação do referido reagente com a referida amostra biológica.
[00116] De acordo com o presente método, a ligação de PSGL-1 indi- ca a presença de câncer mediado por VISTA. De preferência, a ligação de PSGL-1 em infiltrados imunes do microambiente tumoral indica a pre- sença de câncer mediado por VISTA.
[00117] Como será evidente para alguém versado na técnica, o nível de ligação do reagente ao PSGL-1 pode ser quantificado por qualquer meio conhecido pela pessoa versada na técnica, conforme detalhado a seguir. Os métodos preferidos incluem a utilização de ensaios imunoen- zimáticos, tais como, ELISA ou ELISPOT, imunofluorescência, imuno- histoquímica (IHC), radioimunoensaio (RIA) ou FACS.
[00118] A quantificação da etapa b) do presente método é uma refle- xão direta do nível de expressão de PSGL-1 na amostra, notadamente em infiltrados imunes do microambiente tumoral. O presente método permite assim a identificação de um câncer mediado por VISTA através da determinação do nível de expressão de PSGL-1, como descrito acima. Em uma forma de realização preferida, o nível de expressão de PSGL-1 na referida amostra, nomeadamente em infiltrados imunes do microambi-
ente tumoral, é comparado com um nível de referência.
[00119] De acordo com uma outra modalidade preferida, a invenção se refere a um método in vitro para detectar um câncer mediado por VISTA em um indivíduo, o referido método compreendendo as etapas de: a) determinar o nível de expressão de PSGL-1 em uma amos- tra biológica do referido indivíduo; e b) comparar o nível de expressão da etapa a) com um nível de referência;
[00120] Em que um aumento no nível testado de PSGL-1 na etapa a) em comparação com o nível de referência é indicativo de uma doença, distúrbio ou condição mediada por VISTA.
[00121] A invenção também se refere a um método in vitro para o di- agnóstico de um câncer mediado por VISTA em um indivíduo, o referido método compreendendo as etapas de: a) determinar o nível de expressão de PSGL-1 em uma amos- tra biológica do referido indivíduo; e b) comparar o nível de expressão da etapa a) com um nível de referência; em que um aumento no nível testado de PSGL-1 na etapa (b) em compa- ração com o nível de referência é indicativo de uma doença, distúrbio ou condição mediada por VISTA.
[00122] O nível de expressão de PSGL-1 é vantajosamente compara- do ou medido em relação aos níveis em uma célula de controle ou amos- tra também referida como um "nível de referência" ou "nível de expressão de referência". "Nível de referência", "nível de expressão de referência", "nível de controle" e "controle" são usados indistintamente na especifica- ção. Um "nível de controle" significa um nível de linha de base separado medido em uma célula de controle comparável, que geralmente está livre de doença ou câncer. A referida célula de controle pode ser do mesmo indivíduo, uma vez que, mesmo em um paciente canceroso, o tecido que é o sítio do tumor compreende ainda tecido saudável não tumoral. Tam- bém pode originar-se de outro indivíduo normal ou que não apresente a mesma doença da qual foi obtida a doença ou a amostra para teste. No contexto da presente invenção, o termo "nível de referência" se refere a um "nível de controle" de expressão de PSGL-1 usado para avaliar um nível de teste de expressão de PSGL-1 em uma amostra contendo célu- las cancerosas de um paciente. Por exemplo, quando o nível de PSGL-1 na amostra biológica de um paciente é superior ao nível de referência de PSGL-1, as células serão consideradas como tendo um alto nível de ex- pressão ou superexpressão de PSGL-1. O nível de referência pode ser determinado por uma pluralidade de métodos. Os níveis de expressão podem assim definir células portadoras de PSGL-1 ou, alternativamente, o nível de expressão de PSGL-1 independente do número de células que expressam PSGL-1. Assim, o nível de referência para cada paciente po- de ser prescrito por uma relação de referência de PSGL-1, em que a re- lação de referência pode ser determinada por qualquer um dos métodos para determinar os níveis de referência aqui descritos.
[00123] Por exemplo, o controle pode ser um valor predeterminado, que pode assumir uma variedade de formas. Pode ser um único valor de corte, como uma mediana ou média. O "nível de referência" pode ser um único número, igualmente aplicável a cada paciente individualmente, ou o nível de referência pode variar, de acordo com subpopulações especiífi- cas de pacientes. Assim, por exemplo, os homens mais velhos podem ter um nível de referência diferente do que os homens mais jovens para o mesmo câncer, e as mulheres podem ter um nível de referência diferente dos homens para o mesmo câncer. Alternativamente, o "nível de referên-
cia" pode ser determinado medindo o nível de expressão de PSGL-1 em células cancerosas não oncogênicas do mesmo tecido que o tecido das células neoplásicas a serem testadas. Da mesma forma, o "nível de refe- rência" pode ser uma certa proporção de PSGL-1 nas células neoplásicas de um paciente em relação aos níveis de PSGL-1 em células não tumo- rais dentro do mesmo paciente. O "nível de referência" também pode ser um nível de PSGL-1 de células cultivadas in vitro, que pode ser manipu- lado para simular células tumorais, ou pode ser manipulado de qualquer outra maneira que produza níveis de expressão que determinam com precisão o nível de referência. Por outro lado, o "nível de referência" pode ser estabelecido com base em grupos comparativos, como em grupos sem níveis elevados de PSGL-1 e grupos com níveis elevados de PSGL-
1. Outro exemplo de grupos comparativos seriam grupos com uma doen- ça, condição ou sintomas específicos e grupos sem a doença. O valor predeterminado pode ser arranjado, por exemplo, onde uma população testada dividida igualmente (ou desigualmente) em grupos, como um grupo de baixo risco, um grupo de médio risco e um grupo de alto risco.
[00124] O nível de referência também pode ser determinado por com- paração do nível de PSGL-1 em populações de pacientes com o mesmo câncer. Isso pode ser realizado, por exemplo, por análise de histograma, na qual uma coorte inteira de pacientes é apresentada graficamente, em que um primeiro eixo representa o nível de PSGL-1 e um segundo eixo representa o número de pacientes na coorte cujas células tumorais ex- pressar PSGL-1 em um determinado nível. Dois ou mais grupos separa- dos de pacientes podem ser determinados pela identificação de subcon- juntos de populações da coorte que têm níveis iguais ou semelhantes de PSGL-1. A determinação do nível de referência pode então ser feita com base em um nível que melhor distingue esses grupos separados. Um ní-
vel de referência também pode representar os níveis de dois ou mais marcadores, um dos quais é PSGL-1. Dois ou mais marcadores podem ser representados, por exemplo, por uma relação de valores para os ní- veis de cada marcador.
[00125] Da mesma forma, uma população aparentemente saudável terá um intervalo "normal" diferente do que terá uma população que é co- nhecida por ter uma condição associada à expressão de PSGL-1. Con- sequentemente, o valor predeterminado selecionado pode levar em con- sideração a categoria na qual um indivíduo se enquadra. As faixas e ca- tegorias apropriadas podem ser selecionadas com não mais do que expe- rimentação de via por aqueles versados na técnica. Por "elevado" "au- mentado" entende-se alto em relação a um controle selecionado. Nor- malmente, o controle será baseado em indivíduos normais aparentemen- te saudáveis em uma faixa etária apropriada.
[00126] Será também entendido que os controles de acordo com a in- venção podem ser, além de valores predeterminados, amostras de mate- riais testados em paralelo com os materiais experimentais. Os exemplos incluem tecido ou células obtidas ao mesmo tempo do mesmo indivíduo, por exemplo, partes de uma única biópsia ou partes de uma única amos- tra de célula do indivíduo.
[00127] De preferência, o nível de referência de PSGL-1 é o nível de expressão de PSGL-1 em amostras de tecido normal (por exemplo, de um paciente que não tem uma doença, distúrbio ou condição mediada por VISTA, ou do mesmo paciente antes do início da doença).
[00128] Em algumas modalidades, a expressão de uma determinada proteína é uma indicação da presença de um certo tipo de célula em uma amostra. Por exemplo, a expressão de PSGL-1, CD4 e/ou CD8 por célu- las na amostra pode indicar a presença de células T na amostra. Da mesma forma, a expressão de VISTA sozinho ou em combinação com CD11b ou CD33 por células na amostra pode indicar a presença de célu- las tumorais com VISTA, células T reguladoras (por exemplo, células T reguladoras CD4* Foxp3*), células supressoras derivadas de mieloide (por exemplo, células supressoras derivadas de mieloide CD11b* ou CD11pelevado e/ou CD33*) e/ou células dendríticas supressoras (por exemplo, células dendríticas CD11b* ou CD11bº&vado), De preferência, a expressão de VISTA, CD11b, CD33, CD4 e CD8, principalmente em infil- trados imunes do microambiente tumoral, indica a presença de um câncer mediado por VISTA em um indivíduo.
[00129] De acordo com esta modalidade específica, o método in vitro para detectar um câncer mediado por VISTA em um indivíduo compreen- de as etapas de: a) determinar o nível de expressão de PSGL-1 e pelo menos um dentre VISTA, CD11b, CD33, CD4 e CD8 em uma amostra biológica do referido indivíduo; e b) comparar o nível de expressão de PSGL-1 e pelo menos um dentre VISTA, CD11b, CD33, CD4 e CD8 da etapa a) com um nível de referência; em que um aumento no nível testado de PSGL-1 na etapa (b) em compa- ração com o nível de referência é indicativo de uma doença, distúrbio ou condição mediada por VISTA.
[00130] A invenção também se refere a um método in vitro para o di- agnóstico de um câncer mediado por VISTA em um indivíduo, o referido método compreendendo as etapas de: a) determinar o nível de expressão de PSGL-1 e pelo menos um dentre VISTA, CD11b, CD33, CD4 e CD8 em uma amostra biológica do referido indivíduo; e a) comparar o nível de expressão de PSGL-1 e pelo menos um dentre VISTA, CD11b, CD33, CD4 e CD8 da etapa a) com um nível de referência; em que um aumento no nível testado de PSGL-1 na etapa (b) em compa- ração com o nível de referência é indicativo de uma doença, distúrbio ou condição mediada por VISTA.
[00131] Um diagnóstico mais definitivo de uma doença, distúrbio ou condição mediada por VISTA pode permitir que os profissionais de saúde empreguem medidas preventivas ou tratamento agressivo mais cedo, evi- tando assim o desenvolvimento ou progressão adicional da doença, dis- túrbio ou condição mediada por VISTA.
IDENTIFICAÇÃO DE PACIENTES SUSCETÍVEIS A RESPONDER A AGENTES TERAPÊUTICOS ANTI-VISTA
[00132] Os dados acima indicam que PSGL-1 é um biomarcador con- fiável para o diagnóstico de um distúrbio mediado por VISTA, como um câncer mediado por VISTA. Os pacientes assim identificados são susce- tíveis a responder aos agentes terapêuticos anti-VISTA.
[00133] Em outro aspecto, a invenção se refere a um método in vitro para identificação de pacientes com tumor que são suscetíveis de serem tratados por um agente terapêutico anti-VISTA. Vantajosamente, os refe- ridos pacientes expressam PSGL-1, nomeadamente em infiltrados imu- nes, e a expressão de PSGL-1 indica que os referidos pacientes são sus- ceptíveis de serem tratados por um agente terapêutico anti-VISTA.
[00134] Em uma primeira modalidade, a presente invenção se refere a um método in vitro para diagnosticar em um paciente um câncer que é suscetível ao tratamento com um agente bloqueador de VISTA, o referido método compreendendo as etapas de: a) determinar o nível de expressão de PSGL-1 em uma amos-
tra biológica do referido paciente; e b) comparar o nível de expressão da etapa a) com um nível de referência; e c) diagnosticar que o câncer é suscetível ao tratamento com um agente bloqueador de VISTA a partir da referida comparação.
[00135] Em outra modalidade, o referido nível de referência é o nível de expressão de PSGL-1 em uma segunda amostra biológica de um se- gundo paciente com o mesmo câncer mediado por VISTA que o primeiro paciente, em que o segundo paciente é responsivo ao tratamento. Em uma forma de realização preferida, um nível semelhante de expressão de PSGL-1 na primeira amostra biológica em comparação com o nível de expressão de PSGL-1 na segunda amostra biológica indica que o primei- ro paciente responderá ao tratamento.
[00136] Em outra modalidade, a etapa a) compreende a determinação do nível de expressão de PSGL-1 e pelo menos um dentre VISTA, CD11b, CD33, CD4 e CD8 na referida amostra biológica, de preferência por infiltrados imunológicos. Vantajosamente, o nível de expressão de PSGL-1 e pelo menos um dentre VISTA, CD11b, CD33, CD4 e CD8, ou os níveis de expressão relativos dos mesmos, na primeira amostra bioló- gica com o nível de expressão de PSGL-1 é comparado com pelo menos um dentre VISTA, CD11b, CD33, CD4 e CDB8, ou os níveis de expressão relativa dos mesmos, em uma segunda amostra biológica de um segundo paciente com o mesmo câncer mediado por VISTA que o primeiro pacien- te, em que o segundo paciente responde a o tratamento. Em uma moda- lidade preferida, um nível semelhante de expressão de PSGL-1 e pelo menos um dentre VISTA, CD11b, CD33, CD4 e CD8, ou os níveis de ex- pressão relativos dos mesmos, na primeira amostra biológica em compa- ração com o nível de expressão de PSGL -1 e pelo menos um dentre
VISTA, CD11b, CD33, CD4 e CD8, ou os níveis de expressão relativos dos mesmos, na segunda amostra biológica indica que o primeiro pacien- te responderá ao tratamento. MEDINDO A EXPRESSÃO PSGL-1
[00137] A expressão PSGL-1 pode ser medida por qualquer meio dis- ponível para a pessoa versada na técnica. A expressão de PSGL-1 pode assim ser medida medindo o nível de um ácido nucleico PSGL-1 (por exemplo, mMRNA PSGL-1 ou o cDNA correspondente) ou medindo o nível da proteína PSGL-1.
[00138] Neste caso, o método de acordo com a invenção pode com- preender uma ou uma pluralidade de etapas intermediárias entre a amos- tragem da amostra biológica e a medição da expressão de PSGL-1, as referidas etapas correspondendo à extração da referida amostra biológica de uma amostra de mMRNA (ou do cDNA correspondente) ou uma amos- tra de proteína. A preparação ou extração de mRNA (e sua retrotranscri- ção em cDNA) ou proteínas de uma amostra de células são meramente procedimentos de via bem conhecidos dos versados na técnica.
[00139] “Uma vez que o MRNA (ou cDNA correspondente) ou amostra de proteína é obtida, a expressão de PSGL-1, em relação ao mRNA (ou seja, em todo o MRNA ou cDNA presente na amostra), ou proteínas (ou seja, em todas as proteínas presentes na amostra), podem ser medidas. O método utilizado para este fim depende então do tipo de transformação (MRNA, cDNA ou proteína) e do tipo de amostra disponível.
[00140] “Quando a expressão do marcador é medida em relação ao MRNA (ou cDNA correspondente), qualguer método comumente usado por aqueles versados na técnica pode ser aplicado. Essas tecnologias para analisar o nível de expressão gênica, como, por exemplo, análise de transcriptoma, incluem métodos bem conhecidos, como PCR (Reação em
Cadeia da Polimerase, se estiver usando DNA), RT-PCR (PCR de Trans- crição Reversa, se estiver usando RNA) ou RT-PCR quantitativa ou ar- ranjos de ácido nucleico (incluindo arranjos de DNA e arranjos de oligo- nucleotídeos) para um maior rendimento.
[00141] O termo "arranjos de ácido nucleico", quando aqui usado, refe- re-se a uma pluralidade de diferentes sondas de ácido nucleico anexadas a um substrato, que pode ser um microchip, uma lâmina de vidro ou um grânulo com o tamanho de uma microesfera. O microchip pode consistir em polímeros, plásticos, resinas, polissacarídeos, sílica ou um material à base de sílica, carbono, metais, vidro inorgânico ou nitrocelulose.
[00142] As sondas podem ser ácidos nucleicos, tais como, cDNA ("ar- ranjo de CDNA"), mMRNA ("arranjo de mMRNA'") ou oligonucleotídeos ("ar- ranjo de oligonucleotídeos"), sendo os referidos oligonucleotídeos tipica- mente adequados para ter um comprimento entre aproximadamente 25 e 60 nucleotídeos .
[00143] Para determinar o perfil de expressão de um determinado ge- ne, um ácido nucleico correspondente a todo ou parte do referido gene é marcado e, em seguida, colocado em contato com a arranjo em condi- ções de hibridização, resultando na formação de complexos entre o refe- rido ácido nucleico alvo marcado e as sondas ligadas à superfície do chip que são complementares a este ácido nucleico. A presença de comple- xos hibridizados marcados é então detectada.
[00144] Essas tecnologias são adequadas para monitorar o nível de expressão de um gene em particular ou de uma pluralidade de genes ou mesmo de todos os genes do genoma (genoma completo ou transcripto- ma completo) em uma amostra biológica (células, tecidos, etc.).
[00145] Em uma modalidade preferida, o perfil de expressão é deter- minado usando PCR quantitativa. A PCR quantitativa, ou em tempo real,
é uma tecnologia bem conhecida e facilmente disponível para aqueles versados na técnica e não precisa de uma descrição precisa.
[00146] Em uma modalidade particular, que não deve ser considerada como limitante do escopo da invenção, a determinação do perfil de ex- pressão usando PCR quantitativa pode ser realizada como segue. Resu- midamente, as reações de PCR em tempo real são realizadas usando o TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems). 6 uL de cCDONA são adicionados a uma mistura de 9 ul de PCR contendo 7,5 ul de TaqMan Universal PCR Master Mix, 0,75 uL de uma mistura 20X de son- da e iniciadores e 0,75 ul de água. A reação consistiu em uma etapa de iniciação de 2 min a 50 graus C, seguido por 10 min a 95 graus C, e 40 ciclos de amplificação incluindo 15 seg a 95 graus C e 1 min a 60 graus C. A reação e aquisição de dados podem ser realizadas usando o ABI PRISM 7900 Sequence Detection System (Applied Biosystems). O núme- ro de moléculas de modelo transcrito em uma amostra é determinado re- gistrando o ciclo de amplificação na fase exponencial (limite do ciclo ou CT), momento em que o sinal de fluorescência pode ser detectado acima da fluorescência de antecedente. Assim, o número inicial de moléculas de modelo transcrito está inversamente relacionado à CT.
[00147] Em outra modalidade preferida, o perfil de expressão é deter- minado pelo uso de um microarranjo nucleico.
[00148] A presente invenção se refere ainda a um microarranjo dedi- cado à implementação dos métodos de acordo com a invenção, compre- endendo no máximo 500, de preferência no máximo 300, no máximo 200, mais preferencialmente no máximo 150, no máximo 100, ainda mais pre- ferencialmente no máximo 75, no máximo 50, no máximo 40, no máximo 30, no máximo 20, no máximo 10 sondas distintas, pelo menos 1 das quais se liga especificamente ao MRNA de PSGL-1 (ou cDNA correspon-
dente) ou proteína. Em uma modalidade preferida, o referido microarranjo é um microarranjo de ácido nucleico, compreendendo no máximo 500, de preferência no máximo 300, no máximo 200, mais preferencialmente no máximo 150, no máximo 100, ainda mais preferencialmente no máximo 75, no máximo 50, no máximo 40, no máximo 30, no máximo 20, no má- ximo 10 sondas distintas (excluindo assim, por exemplo, microarranjos pangenômicos), pelo menos 1 das quais hibridiza especificamente com o mMRNA de PSGL-1 (ou cDNA correspondente). O referido microarranjo também pode conter pelo menos uma sonda que hibridiza especificamen- te com um gene de manutenção, além da sonda que hibridiza especifi- camente com PSGL-1. Por exemplo, o gene de manutenção é o gene be- ta-2-microglobulina.
[00149] —Alternativamente, é possível usar qualquer tecnologia atual ou futura adequada para determinar a expressão do gene com base na quantidade de mRNA na amostra. Por exemplo, aqueles versados na técnica podem medir a expressão de um gene por hibridização com uma sonda de ácido nucleico marcada, tal como, por exemplo, por meio de Northern Blot (para MRNA) ou Southern Blot (para cDNA), mas também usando técnicas como como o método de análise serial de expressão gê- nica (SAGE) e seus derivados, como LongSAGE, SuperSAGE, DeepSA- GE, etc.
[00150] Também é possível usar microarranjos de tecido (também co- nhecidos como TMAs) como material de partida. Os TMAs consistem em blocos de parafina nos quais até 1000 núcleos de tecido separados são montados em conjunto para permitir a análise histológica multiplex. Na técnica de microarranjo de tecido, uma agulha oca é usada para remover núcleos de tecido de até 0,6 mm de diâmetro de regiões de interesse em tecidos incluídos em parafina, como biópsias clínicas ou amostras de tu-
mor. Esses núcleos de tecido são então inseridos em um bloco de parafi- na receptor em um padrão de arranjo com espaçamento preciso. As se- ções deste bloco são cortadas usando um micrótomo, montadas em uma lâmina de microscópio e então analisadas por qualquer método de análi- se histológica padrão. Cada bloco de microarranjo pode ser cortado em 100 - 500 seções, que podem ser submetidas a testes independentes. Os testes comumente empregados em microarranjo de tecido incluem imu- no-histoquímica e hibridização fluorescente in situ. Para análise no nível de mRNA, a tecnologia de microarranjos de tecido pode ser acoplada à hibridização fluorescente in situ. Um exemplo de hibridização in situ usando o RNAscope 2.5 (Advanced Cell Diagnostics, Hayward, CA) é mostrado nos exemplos.
[00151] Finalmente, o sequenciamento paralelo em massa pode ser usado para determinar a quantidade de mMRNA na amostra (RNA-Seq ou "Sequenciamento Shotgun do Transcriptoma Completo"). Para este efeito, uma pluralidade de métodos de sequenciamento paralelo em massa estão disponíveis. Tais métodos são descritos, por exemplo, US 4.882.127, U.S.
4.849.077; U.S. 7.556.922; U.S. 6.723.513; WO 03/066896; WO 2007/ 111924 US 2008/0020392; WO 2006/084132; US 2009/0186349; US 2009/0181860; US 2009/0181385; US 2006/0275782; EP-B1-1141399; Shendure & Ji, Nat Biotechnol., 26(10): 1135-45 (2008); Pihlak et al., Nat Biotechnol., 26(6): 676- 684 (2008); Fuller et al., Nature Biotechnol., 27(11): 1013-1023 (2009); Mardis, Genome Med., 1(4): 40 (2009); Metz- ker, Nature Rev. Genet., 11(1): 31-46 (2010).
[00152] Quando a expressão do marcador é medida em relação à pro- teína, é possível usar anticorpos específicos contra PSGL-1. A ligação do anticorpo anti-PSGL-1 pode ser detectada e/ou quantificada e/ou deter- minada por vários ensaios disponíveis para a pessoa versada na técnica,
tais como, por exemplo, imunoprecipitação, imunoquímica (IHC), Western Blot, Dot Blot, ELISA, ELISPOT, arranjos de proteínas, arranjos de anti- corpos ou arranjos de tecidos acoplados a imuno-histoquímica. Outras técnicas que podem ser usadas incluem classificação de células ativadas por fluorescência (FACS), técnicas de FRET ou BRET, métodos de mi- croscopia ou histoquímica, particularmente incluindo microscopia confocal e métodos de microscopia eletrônica, métodos baseados no uso de um ou uma pluralidade de comprimentos de onda de excitação e um ade- quado método óptico, como um método eletroquímico (técnicas de volta- metria e amperometria), microscopia de força atômica e métodos de radi- ofrequência, como espectroscopia de ressonância multipolar, confocal e não confocal, detecção de fluorescência, luminescência, quimiolumines- cência, absorbância, refletância, transmitância e birrefringência ou índice de refração (por exemplo, por meio de ressonância de plasmônio superfi- cial, por elipsometria, por meio do método de espelho ressonante, etc.), citometria de fluxo, imagem radioisotópica ou de ressonância magnética, análise por meio de eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE); por meio de HPLC-espectrofotometria de massa, por meio de cromato- grafia líquida/espectrofotometria de massa/espectrometria de massa (LC- MS/MS). Todas estas técnicas são bem conhecidas por aqueles versados na técnica e não é necessário detalhá-las aqui.
[00153] “Embora qualquer um dos métodos acima seja adequado para a realização dos presentes métodos, FACS, ELISA, ELISPOT, western blotting e IHC podem ser mencionados em particular. Os métodos prefer- idos incluem ELISPOT, FACS e IHC. DETERMINAÇÃO DO ESTADO DE PSGL-1 DO TUMOR
[00154] A determinação da ligação de um reagente a PSGL-1 (como descrito acima) permite a determinação do estado de PSGL-1 do tumor a ser tratado. O estado de PSGL-1 pode ser determinado por qualquer mé- todo ou técnica conhecida ou atualmente utilizada pela pessoa versada na técnica, geralmente com base na determinação do nível de expressão de PSGL-1. Com base no status de PSGL-1 do tumor; então, é possível prever se um paciente responderá a um agente terapêutico anti-VISTA.
[00155] Recentemente, tornou-se aparente que os dados imunológicos (o tipo, densidade e localização das células imunes nas amostras de tu- mor) são um melhor preditor da sobrevida do paciente do que os métodos histopatológicos atualmente usados para estadiar o câncer colorretal.
[00156] Além disso, o aumento da evidência de ensaios clínicos apóia o potencial de terapias que visam a atividade imunológica em certos tipos de câncer (Robert et a/., Stagg et al.). Isso levou ao desenvolvimento de métodos mais padronizados de caracterização do infiltrado imune tumoral em cânceres, como o "escore imunológico", que visa quantificar o infiltra- do imune in situ, além de parâmetros clínicos padronizados para auxiliar no prognóstico e na seleção de pacientes para imunoterapia em vários tipos de câncer (veja, eg Galon et al., J Pathol 232 (2): 199-209 (2014); Galon et al., J Trans! Med 14: 273 (2016)).
[00157] O método de detecção ou diagnóstico de um câncer mediado por VISTA descrito neste documento inclui, portanto, a determinação do escore de PSGL-1 do tumor.
[00158] De acordo com esta modalidade, o método compreende as etapas de: a) contatar uma amostra biológica do referido indivíduo com um reagente capaz de se ligar à proteína ou ácido nucleico PSGL-1; b) quantificar a ligação do referido reagente com a referida amostra biológica; e c) classificar as células tumorais comparando o nível quantifi-
cado obtido na etapa a) a uma escala apropriada com base em dois pa- râmetros que são a intensidade do manchamento e a porcentagem de células positivas.
[00159] Em uma modalidade preferida, a etapa b) compreende a quan- tificação da ligação do referido reagente com PSGL-1 em infiltrados imu- nes do microambiente tumoral na referida amostra biológica.
[00160] De acordo com esta modalidade preferida, o método compre- ende as etapas de: a) contatar uma amostra biológica do referido indivíduo com um reagente capaz de se ligar à proteína ou ácido nucleico PSGL-1; b) quantificar a ligação do referido reagente com a referida amostra biológica; e c) classificar as células imunes tumorais comparando o nível quantificado obtido na etapa a) a uma escala apropriada com base em dois parâmetros que são a intensidade do manchamento e a porcenta- gem de células positivas.
[00161] As células imunes tumorais (ou infiltrados imunes) compreen- dem as células imunes presentes no microambiente tumoral, notavelmen- te as células imunossupressoras do microambiente tumoral, como alguns macrófagos, monócitos etc. Em uma modalidade preferida, infiltrados imunes incluem linfócitos (por exemplo, células T, células B, células ex- terminadoras naturais (NK)), células dendríticas, mastócitos e macrófa- gos. Por conseguinte, nesta modalidade a etapa b) compreende quantifi- car a ligação do referido reagente com PSGL-1 em linfócitos (por exem- plo, células T, células B, células exterminadoras naturais (NK)), células dendríticas, mastócitos e macrófagos presentes no microambiente tumo- ral na referida amostra biológica.
[00162] Qualquer método de análise de risco convencional pode ser usado para estimar o valor prognóstico de PSGL-1. Os métodos de análi- se representativos incluem a análise de regressão de Cox, que é um mé- todo semiparamétrico para modelar dados de sobrevivência ou tempo até o evento na presença de casos censurados (Hosmer e Lemeshow, 1999; Cox, 1972). Em contraste com outras análises de sobrevivência, por exemplo, Life Tables ou Kaplan-Meyer, Cox permite a inclusão de variá- veis preditoras (covariáveis) nos modelos. Usando um método de análise de convenção, por exemplo, Cox, pode-se ser capaz de testar hipóteses sobre a correlação do status de expressão de PSGL-1 em um tumor pri- mário com o tempo de início de qualquer recidiva da doença (tempo de sobrevivência livre de doença ou tempo para doença metastática), ou tempo até a morte da doença (tempo de sobrevida geral). A análise de regressão de Cox também é conhecida como análise de risco proporcio- nal de Cox. Este método é padrão para testar o valor prognóstico de um marcador tumoral no tempo de sobrevida do paciente. Quando usado no modo multivariado, o efeito de várias covariáveis são testados em parale- lo de modo que covariáveis individuais que têm valor prognóstico inde- pendente possam ser identificadas, isto é, os marcadores mais úteis. O termo "status de PSGL-1" negativo ou positivo também pode ser referido como [PSGL-1 (-)] ou [PSGL-1 (+)].
[00163] Uma amostra pode ser "classificada" durante o diagnóstico ou monitoramento do câncer. Em sua forma mais simples, o escore pode ser negativa ou positiva categórica conforme avaliado pelo exame visual das amostras por imuno-histoquímica. Um escore mais quantitativo envolve o julgamento dos dois parâmetros de intensidade de manchamento e a proporção de células manchadas ("positivas") que são amostradas.
[00164] Em uma modalidade, para garantir a padronização, as amos- tras podem ser classificadas para os níveis de expressão de PSGL-1 em diferentes escalas, a maioria delas com base em uma avaliação da inten- sidade do produto de reação e a porcentagem de células positivas (Payne et al., Predictive markers in breast cancer - the present, Histopa- thology 2008, 52, 82-90).
[00165] Em outra modalidade, a referido escore compreende o uso de uma escala apropriada com base na intensidade do manchamento e na porcentagem de células positivas.
[00166] Como um primeiro exemplo, por analogia com o escore Quick Allred para avaliação de IHC do receptor de estrogênio e receptor de pro- gesterona, as amostras podem ser classificadas para níveis de expressão de PSGL-1 em uma escala global de O a 8 combinando escores para in- tensidade de reatividade e para a proporção de células manchadas (Har- vey JM, Clarck GM, Osborne CK, Allred DC; J. Clin. Oncol. 1999; 17; 1474-1481). Mais particularmente, o primeiro critério de intensidade de reatividade é pontuado em uma escala de O a 3, O correspondendo a "Nenhuma reatividade" e 3 correspondendo a "Reatividade forte". O se- gundo critério de proporção reativa é pontuado em uma escala de 0 a 5, 0 correspondendo a "Sem reatividade" e 5 a "proporção 67-100 % reativa". A intensidade do escore da reatividade e do escore da proporção reativa são somadas para produzir o escore total de O a 8. Um escore total de 0- 2 é considerado negativo, enquanto um escore total de 3-8 é considerado positivo.
[00167] De acordo com esta escala, os termos "status de PSGL-1" ne- gativo ou positivo de tumores usados na presente descrição referem-se a níveis de expressão de PSGL-1 que correspondem a escores 0-2 ou 3-8 na escala Allred, respectivamente.
[00168] A Tabela2 a seguir ilustra as diretrizes para interpretar os re- sultados de IHC de acordo com o método Allred.
Tabela 2 “Intensidade de imunore- — "O" : 2 atividade Escore 1 Reativo à proporção Escore 2 “Semreatividade ————— O Semreatividade OQ “Reatividadeftaca — — 1 <q1% P ABp /< “Reatividademoderada = 2 110% 2 000 “Reatividadeforte = 3 1133% Bo e BBB % A e eriIno a ASP = “Escore Total (Escore 1 +Escore2) Interpretação || OR o Negamwo O St! ' 3-8 Positivo
[00169] De acordo com a invenção, a referida escala apropriada pode ser uma escala de O a 8 em que nenhuma reatividade é classificada 0, e uma reatividade forte em uma proporção de 67-100 % reativa é classifi- cada 8
[00170] Em outras palavras, é descrito um processo de determinação in vitro ou ex vivo do estado de um tumor de um indivíduo, em que o refe- rido processo compreende as etapas de (a) marcar um tumor de um indi- víduo de acordo com a escala de Allred; e (b) determinar que o estado do tumor é [PSGL-1 (+)] com um escore Allred de 3 a 8; ou (c) determinar que o estado do tumor é [PSGL-1 (-)] com um escore Allred de 0 a 2.
[00171] Em um aspecto particular da invenção, um tumor é [PSGL-1 (+)] com um escore Allred de 3.
[00172] Em um aspecto particular da invenção, um tumor é [PSGL-1 (+)] com um escore Allred de 4.
[00173] Em um aspecto particular da invenção, um tumor é [PSGL-1 (+)] com um escore Allred de 5.
[00174] Em um aspecto particular da invenção, um tumor é [PSGL-1
(+)] com um escore Allred de 6.
[00175] Em um aspecto particular da invenção, um tumor é [PSGL-1 (+)] com um escore Allred de 7.
[00176] Em um aspecto particular da invenção, um tumor é [PSGL-1 (+)] com um escore Allred de 8.
[00177] Em outro aspecto particular da invenção, um tumor é [PSGL-1 (+)] com um escore Allred de 3 a 8.
[00178] Outro método particular aqui descrito para determinar in vitro ou ex vivo o estado de PSGL-1 de células tumorais em um indivíduo, é caracterizado por compreender as etapas de: (a) classificar células tumorais de PSGL-1 como descrito aci- ma; e (b) determinar que o estado de PSGL-1 de células tumorais é [PSGL-1 (+)] com um escore de 3 a 8; ou (c) determinar que o status de PSGL-1 de células tumorais é [PSGL-1 (-)] com um escore de 0 a 2.
[00179] Outro método particular aqui descrito para determinar in vitro ou ex vivo o estado de PSGL-1 de células imunes tumorais em um indiví- duo, é caracterizado por compreender as etapas de: (a) classificar as células imunes tumorais de PSGL-1 descritas acima; e (b) determinar que o status de PSGL-1 de células imunes tu- morais é [PSGL-1 (+)] com um escore de 3 a 8; ou (c) determinar que o status de PSGL-1 de células imunológi- cas tumorais é [PSGL-1 (-)] com um escore de 0 a 2.
[00180] Em uma modalidade preferida, células imunes tumorais (isto é, infiltrados imunes) incluem linfócitos (por exemplo, células T, células B, células exterminadoras naturais (NK)), células dendríticas, mastócitos e macrófagos. Por conseguinte, nesta modalidade, a etapa a) compreende a quantificação da ligação do referido reagente com PSGL-1 em linfócitos (por exemplo, células T, células B, células exterminadoras naturais (NK)), células dendríticas, mastócitos e macrófagos presentes no microambiente tumoral na referida amostra biológica.
[00181] “Como um segundo exemplo, por analogia com o escore con- vencional para avaliação IHC do receptor HER-2, por exemplo, as amos- tras podem ser classificadas para níveis de expressão de PSGL-1 em um método de escore um pouco mais simples integrando a intensidade de manchamento (manchamento preferencialmente membranoso) e a pro- porção de células que apresentam manchamento em uma escala combi- nada de O a 3+.
[00182] Nesta escala, referida como a escala simplificada, 0 e 1+ são negativos, enquanto 2+ e 3+ representam manchamento positivo. No en- tanto, os escores 1 + -3 + podem ser recodificados como positivos porque cada escore positivo pode estar associado a um risco significativamente maior de recidiva e doença fatal quando comparada ao escore 0 (negati- vo), mas aumentar a intensidade entre os escores positivos pode fornecer redução de risco adicional .
[00183] De um modo geral, os termos "status de PSGL-1" negativo ou positivo de tumores usados na presente descrição se referem a níveis de expressão de PSGL-1 que correspondem aos escores 0-1 + ou 2 +-3 + na escala simplificada, respectivamente. Apenas a reatividade membra- nosa circunferencial completa do tumor invasivo deve ser considerada e frequentemente assemelha-se a uma aparência de "tela de galinha". De acordo com as diretrizes atuais, as amostras classificadas como limítrofes (escore de 2+ ou 3+) para PSGL-1 devem passar por avaliações adicio- nais. A análise IHC deve ser rejeitada e repetida ou testada por FISH ou qualquer outro método se, como exemplo não limitante, os controles não forem os esperados, os artefatos envolverem a maior parte da amostra e a amostra tiver forte positividade membranosa de dutos mamários nor- mais (interno controles) sugerindo recuperação excessiva de antígeno.
[00184] Para maior clareza, a Tabela 3 a seguir resume esses parâ- metros. Tabela 3 Status de | Descrição da IHC pm Ape Sem reatividade ou reatividade membranosa em menos de 10
E EEE 1* Reatividade membranosa fraca/quase imperceptível é detecta- da em mais de 10 % das células tumorais ou células imunes tumorais. As células são imunorreativas apenas em parte da membrana. 2º Reatividade membranosa completa de fraca a moderada é ob- servada em mais de 10 % das células tumorais ou células imunes tumorais. 3* A forte reatividade completa é observada em mais de 10 % das O aminaetacammeniva
[00185] A escala apropriada pode ser uma escala de O a 3+ em que nenhuma reatividade membranosa de células tumorais ou células imunes tumorais é classificada como 0 e a reatividade completa forte em mais de % das células tumorais é classificada como 3+.
[001868] Em mais detalhes, como descrito acima, a referida escala apropriada é uma escala de O a 3 em que nenhuma reatividade membra- nosa de células tumorais ou células imunes tumorais é classificada como O; reatividade membranosa perceptível fraca em mais de 10 % das célu- las tumorais ou células imunes tumorais é classificada 1+; reatividade membranosa completa de fraca a moderada em mais de 10 % das célu- las tumorais ou células imunes tumorais é classificada 2+; e forte reativi- dade completa em mais de 10 % das células tumorais ou células imunes tumorais classificada 3+.
[00187] Em outras palavras, é descrito um processo de determinação in vitro ou ex vivo do estado de um tumor de um indivíduo, em que o refe- rido processo compreende as etapas de (a) escore de um tumor de um indivíduo de acordo com a escala simplificada como acima descrito; e (b) determinar que o estado do tumor é [PSGL-1 (+)] com um escore de 2+ ou 3+; ou (c) determinar que o estado do tumor é [PSGL-1 (-)] com um escore de O ou 1+.
[00188] Em um aspecto particular da invenção, um tumor é [PSGL-1 (+)] com um escore de 2+.
[00189] Em um aspecto particular da invenção, um tumor é [PSGL-1 (+)] com um escore de 3+.
[00190] Em outro aspecto particular da invenção, um tumor é [PSGL-1 (+)] com um escore de 2+ ou 3+.
[00191] Em outra modalidade, o método para determinar in vitro ou ex vivo o status de células tumorais de PSGL-1 em um indivíduo pode com- preender as etapas de: (a) classificar células tumorais de PSGL-1 do referido indivíduo de acordo com o método descrito acima; e (b) determinar que o estado de PSGL-1 das células tumorais é [PSGL-1 (+)] com um escore de 2+ ou 3+; ou (c) determinar que o status de PSGL-1 das células tumorais é [PSGL-1 (-)] com um escore de O ou 1+.
[00192] Em outra modalidade, o método para determinar in vitro ou ex vivo as células imunes tumorais do estado PSGL-1 em um indivíduo pode compreender as etapas de: (a) classificar células imunes tumorais de PSGL-1 do referido indivíduo de acordo com o método descrito acima; e (b) determinar que o status de PSGL-1 de células imunes tu- morais é [PSGL-1 (+)] com um escore de 2+ ou 3+; ou (c) determinar que o status de PSGL-1 das células imunes tu- morais é [PSGL-1 (-)] com um escore de O ou 1+.
[00193] Em uma modalidade preferida, células imunes tumorais (isto é, infiltrados imunes) incluem linfócitos (por exemplo, células T, células B, células exterminadoras naturais (NK)), células dendríticas, mastócitos e macrófagos. Por conseguinte, nesta modalidade, a etapa a) compreende a quantificação da ligação do referido reagente com PSGL-1 em linfócitos (por exemplo, células T, células B, células exterminadoras naturais (NK)), células dendríticas, mastócitos e macrófagos presentes no microambiente tumoral na referida amostra biológica.
[00194] Geralmente, os resultados de um teste ou ensaio podem ser apresentados em qualquer um de uma variedade de formatos. Os resul- tados podem ser apresentados qualitativamente. Por exemplo, o relatório de teste pode indicar apenas se um determinado polipeptídeo foi detecta- do ou não, talvez também com uma indicação dos limites de detecção. Os resultados podem ser exibidos como semiquantitativos. Por exemplo, vários intervalos podem ser definidos e os intervalos podem ser atribuí- dos a um escore (por exemplo, O a 3+ ou O a 8, dependendo da escala usada) que fornece um certo grau de informação quantitativa. Tal escore pode refletir vários fatores, por exemplo, o número de células em que PSGL-1 é detectado, a intensidade do sinal (que pode indicar o nível de expressão de células portadoras de PSGL-1 ou PSGL-1), etc. Os resulta- dos podem ser exibidos de forma quantitativa, por exemplo, como uma porcentagem de células nas quais PSGL-1 é detectado, como uma con- centração de proteína, etc.
[00195] “Como será apreciado por alguém versado na técnica, o tipo de resultado fornecido por um teste irá variar dependendo das limitações técnicas do teste e do significado biológico associado à detecção do poli- peptídeo. Por exemplo, no caso de certos polipeptídeos, uma saída pu- ramente qualitativa (por exemplo, se o polipeptídeo é detectado ou não em um determinado nível de detecção) fornece informações significati- vas. Em outros casos, uma saída mais quantitativa (por exemplo, uma relação do nível de expressão do polipeptídeo na amostra sendo testada em relação ao nível normal) é necessária. ANTICORPOS ANTI-PSGL-1
[00196] Os anticorpos para uso nos presentes métodos são anticorpos que se ligam a PSGL-1, incluindo um polipeptídeo PSGL-1, um fragmento de polipeptídeo PSGL-1 ou um epítopo PSGL-1. Os anticorpos anti- PSGL-1 incluem anticorpos anti-PSGL-1 humanizados. Também são for- necidos anticorpos (por exemplo, anticorpos anti-PSGL-1 humanizados) que bloqueiam competitivamente um anticorpo anti-PSGL-1 aqui forneci- do de ligação a um polipeptídeo PSGL-1.
[00197] A presente descrição também fornece anticorpos que se ligam ao PSGL-1 e agonizam ou antagonizam a interação entre PSGL-1 e VIS- TA. De preferência, o anticorpo anti-PSGL-1 inibe ou bloqueia a ligação de PSGL-1 para VISTA, principalmente para o domínio extracelular de VISTA. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PSGL-1 inibe ou blo- queia a ligação de uma célula que expressa VISTA a uma célula T que expressa PSGL-1, como, por exemplo, uma célula mieloide, uma célula dendrítica, um macrófago ou uma célula T. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PSGL-1 não bloqueia ou inibe a ligação de PSGL-1 a P-
selectina, L-selectina ou E-selectina.
[00198] Os anticorpos anti-PSGL-1 (por exemplo, anticorpos anti- PSGL-1 humanizados) fornecidos neste documento também podem ser conjugados ou fundidos de forma recombinante a um agente de diagnós- tico, agente detectável ou agente terapêutico (por exemplo, conjugado anticorpo-fármaco). Por exemplo, um agente detectável pode ser uma sonda detectável. Além disso, são fornecidas composições, incluindo composições farmacêuticas, compreendendo um anticorpo anti-PSGL-1 (por exemplo, um anticorpo anti-PSGL-1 humanizado).
[00199] Os anticorpos fornecidos neste documento que se ligam a um antígeno, por exemplo, PSGL-1 pode ser produzido por qualquer método conhecido na técnica para a síntese de anticorpos, em particular, por sín- tese química ou por técnicas de expressão recombinante. Por exemplo, vários anticorpos anti-PSGL-1 e métodos de produção de tais anticorpos foram descritos anteriormente (veja, por exemplo, WO 2005/110475, WO 2003/013603; Publicação de Pedido de Patente Norte-americana Nos. 2009/0198044, 2005/0266003, 2009/0285812, 2013/0011391 e 2015/ 0183870; e Patentes Norte-americanas Nos. 7.833.530 e 8.361.472).
[00200] Os anticorpos policlonais que se ligam a um antígeno podem ser produzidos por vários procedimentos bem conhecidos na técnica. Por exemplo, um antígeno humano pode ser administrado a vários animais hospedeiros, incluindo, mas não se limitando a, coelhos, camundongos, ratos, etc. para induzir a produção de soros contendo anticorpos policlo- nais específicos para o antígeno humano. Vários adjuvantes podem ser usados para aumentar a resposta imunológica, dependendo da espécie hospedeira, e incluem, mas não estão limitados a, Freund (completo e incompleto), géis minerais como hidróxido de alumínio, substâncias ativas de superfície, como lisolecitina, polióis plurônicos, poliânions, peptídeos,
emulsões de óleo, hemocianinas de lapa, dinitrofenol e adjuvantes huma- nos potencialmente úteis, tais como, BCG (bacilo Calmette-Guerin) e Corynebacterium parvum. Esses adjuvantes também são bem conheci- dos na técnica.
[00201] Os anticorpos monoclonais podem ser preparados usando uma ampla variedade de técnicas conhecidas na técnica, incluindo o uso de tecnologias de hibridoma, recombinante e de exibição de fago, ou uma combinação das mesmas. Por exemplo, os anticorpos monoclonais po- dem ser produzidos utilizando técnicas de hibridoma incluindo aquelas conhecidas na técnica e ensinadas, por exemplo, em Harlow et a/., Anti- bodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2º ed. 1988); Hammerling et al., em: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563 681 (Elsevier, N.Y., 1981) (as referências incorporadas por referência na sua totalidade). O termo "anticorpo monoclonal", quan- do aqui usado, não se limita a anticorpos produzidos através da tecnolo- gia de hibridoma. Outros métodos exemplares de produção de anticorpos monoclonais são discutidos em outro lugar neste documento, tais como, por exemplo, o uso do KM mouse'Y. Métodos exemplares adicionais de produção de anticorpos monoclonais são fornecidos nos Exemplos aqui. Alternativamente, também é possível usar um anticorpo anti-PSGL-1 tal como, por exemplo, os anticorpos descritos em WO 2003/013603, WO 2005/110475, WO 2009/140623, Dimitroff et al., Cancer Res, 65 (13) : 5750-60 (2005), Veerman et al., Nature Immunol 8 (5): 532-9 (2007), Ti- nocco et al., Immunity 44: 1190-1203 (2016).
[00202] Métodos para a produção e rastreamento de anticorpos espe- cíficos usando tecnologia de hibridoma são rotineiros e bem conhecidos na técnica. Resumidamente, os camundongos podem ser imunizados com um antígeno PSGL-1 e uma vez que uma resposta imune é detecta-
da, por exemplo, anticorpos específicos para o antígeno PSGL-1 são de- tectados no soro do camundongo, o baço do camundongo é colhido e os esplenócitos isolados. Os esplenócitos são então fundidos por técnicas bem conhecidas a quaisquer células de mieloma adequadas, por exem- plo, células da linhagem celular SP20 disponível na ATCC. Os hibridomas são selecionados e clonados por diluição limitada.
[00203] Além disso, uma técnica RIMMS (vários sítios de imunização repetitiva) pode ser usada para imunizar um animal (Kilptrack et al., 1997 Hybridoma 16: 381-9, incorporado por referência na sua totalidade). Os clones de hibridoma são então testados por métodos conhecidos na téc- nica para células que segregam anticorpos capazes de se ligar a um de- terminado polipeptídeo. O fluido ascítico, que geralmente contém altos níveis de anticorpos, pode ser gerado imunizando camundongos com clones de hibridoma positivos.
[00204] — Por conseguinte, também são aqui fornecidos métodos de ge- ração de anticorpos por cultura de uma célula de hibridoma que secreta um anticorpo modificado aqui fornecido, em que, em algumas modalida- des, o hibridoma é gerado pela fusão de esplenócitos isolados de um camundongo imunizado com PSGL-1, incluindo um polipeptídeo PSGL-1, um fragmento de polipeptídeo PSGL-1 ou um epítopo PSGL-1, com célu- las de mieloma e, em seguida, rastreamento de hibridomas resultantes da fusão para clones de hibridoma que secretam um anticorpo capaz de se ligar ao PSGL-1.
[00205] Os anticorpos anti-PSGL-1 capazes de modular (por exemplo, aumentar ou inibir) a interação entre PSGL-1 e VISTA podem ser identifi- cados por qualquer método conhecido por aqueles versados na técnica. Exemplos de ensaios para detectar e medir a interação entre PSGL-1 e VISTA são descritos na Seção Experimental. Qualquer um desses ensai-
os pode ser usado para testar se um anticorpo anti-PSGL-1 pode modular a interação entre PSGL-1 e VISTA.
[00206] “Fragmentos de anticorpos que reconhecem (por exemplo, se ligam a) PSGL-1 podem ser gerados por qualquer técnica conhecida por aqueles versados na técnica. Por exemplo, os fragmentos Fab e F(ab') 2 aqui fornecidos podem ser produzidos por clivagem proteolítica de molé- culas de imunoglobulina, usando enzimas como papaína (para produzir fragmentos Fab) ou pepsina (para produzir fragmentos F(ab')-). Os frag- mentos F(ab'), contêm a região variável, a região constante da cadeia leve e o domínio CH1 da cadeia pesada. Além disso, os anticorpos forne- cidos neste documento também podem ser gerados usando vários méto- dos de exibição de fago conhecidos na técnica.
[00207] Por exemplo, os anticorpos também podem ser gerados usan- do vários métodos de exibição de fago. Em métodos de exibição de fago, domínios de anticorpo funcionais são exibidos na superfície de partículas de fago que carregam as sequências de polinucleotídeo que as codifi- cam. Em particular, as sequências de DNA que codificam os domínios VH e VL são amplificadas a partir de bibliotecas de cDNA de animais (por exemplo, bibliotecas de cCDNA humano ou murino de tecidos afetados). O DNA que codifica os domínios VH e VL é recombinado juntamente com um ligante scFv por PCR e clonado em um vetor fagemídeo. O vetor é eletroporado em E. coli e a E. coli é infectada com fago auxiliar. Os fagos usados nestes métodos são tipicamente fagos filamentosos incluindo fd e M13 e os domínios VH e VL são geralmente fundidos de forma recombi- nante com o gene Ill ou o gene VIII do fago. O fago que expressa um domínio de ligação ao antígeno que se liga a um antígeno particular pode ser selecionado ou identificado com o antígeno, por exemplo, usando an- tígeno marcado ou ligado ao antígeno ou capturado em uma superfície sólida ou grânulo. Exemplos de métodos de exibição de fago que podem ser usados para fazer os anticorpos fornecidos neste documento incluem aqueles descritos em Brinkman et a/., 1995, J. Immunol. Methods182:41- 50; Ames et al., 1995, J. Immunol. Methods184:177-186; Kettleborough et al., 1994, Eur. J. Immunol. 24:952-958; Persic et al/., 1997, Gene187:9-18; Burton et al., 1994, Advances in Immunology57:191-280; PCT/GB91/ 01134; WO 90/02809, WO 91/10737, WO 92/01047, WO 92/18619, WO 93/1 1236, WO 95/15982, WO 95/20401, e WOS97/13844; e Patente Nor- te-americana Nos. 5.698.426, 5.223.409, 5.403.484, 5.580.717, 5.427.908,
5.750.753, 5.821.047, 5.571.698, 5.427.908, 5.516.637, 5.780.225,
5.658.727, 5.733.743 e 5.969.108; cada um dos quais é incorporado aqui por referência em sua totalidade.
[00208] Conforme descrito nas referências acima, após a seleção do fago, as regiões de codificação do anticorpo do fago podem ser isoladas e utilizadas para gerar anticorpos inteiros, incluindo anticorpos humanos, ou qualquer outro fragmento de ligação ao antígeno desejado, e expres- sas em qualquer hospedeiro desejado, incluindo células de mamíferos, células de insetos, células de plantas, leveduras e bactérias, por exem- plo, conforme descrito abaixo. Técnicas para produzir fragmentos Fab, Fab' e F(ab'), de forma recombinante também podem ser empregadas usando métodos conhecidos na técnica, tais como, aqueles descritos na publicação PCT nº WO 92/22324; Mullinax et a/., 1992, BioTechniques 12 (6): 864-869; Sawai et al/., 1995, AJRI 34: 26-34; e Better et al., 1988, Science 240: 1041-1043 (as referências incorporadas por referência na sua totalidade).
[00209] Para gerar anticorpos inteiros, iniciadores de PCR incluindo sequências de nucleotídeos VH ou VL, um sítio de restrição e uma se- quência de flanqueamento para proteger o sítio de restrição podem ser usados para amplificar as sequências de VH ou VL em clones de scFv. Utilizando técnicas de clonagem conhecidas por aqueles versados na técnica, os domínios VH amplificados por PCR podem ser clonados em vetores que expressam uma região constante VH, por exemplo, a região constante gama 4 humana e os domínios VL amplificados por PCR po- dem ser clonados em vetores que expressam um Região constante VL, por exemplo, regiões constantes capa ou lambda humanas. Os domínios VH e VL também podem ser clonados em um vetor que expressa as regi- ões constantes necessárias. Os vetores de conversão de cadeia pesada e vetores de conversão de cadeia leve são então cotransfectados em |i- nhagens celulares para gerar linhagens celulares estáveis ou transitórias que expressam anticorpos de tamanho natural, por exemplo, IgG, usando técnicas conhecidas por aqueles versados na técnica.
[00210] Para alguns usos, incluindo o uso in vivo de anticorpos em humanos e ensaios de detecção in vitro, podem ser usados anticorpos humanos ou quiméricos. Os anticorpos totalmente humanos são particu- larmente desejáveis para o tratamento terapêutico de indivíduos huma- nos. Os anticorpos humanos podem ser produzidos por uma variedade de métodos conhecidos na técnica, incluindo métodos de exibição de fa- go descritos acima usando bibliotecas de anticorpos derivadas de se- quências de imunoglobulina humana. Veja também as Patentes Norte- americanas Nos. 4.444.887 e 4,716,111; e WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735 e WO 91/10741; cada um dos quais é incorporado aqui por referência em sua totalidade.
[00211] Em algumas modalidades, são produzidos anticorpos huma- nos. Os anticorpos humanos e/ou anticorpos totalmente humanos podem ser produzidos usando qualquer método conhecido na técnica. Por exemplo, camundongos transgênicos que são incapazes de expressar imunoglobulinas endógenas funcionais, mas que podem expressar genes de imunoglobulinas humanas.
Por exemplo, os complexos de genes de imunoglobulina de cadeia pesada e leve humana podem ser introduzidos aleatoriamente ou por recombinação homóloga em células-tronco embri- onárias de camundongo.
Alternativamente, a região variável humana, re- gião constante e região de diversidade podem ser introduzidas em célu- las-tronco embrionárias de camundongo além dos genes de cadeia pesa- da e leve humana.
Os genes de imunoglobulina de cadeia pesada e leve de camundongo podem ser tornados não funcionais separadamente ou simultaneamente com a introdução de loci de imunoglobulina humana por recombinação homóloga.
Em particular, a deleção homozigótica da regi- ão JH evita a produção de anticorpos endógenos.
As células-tronco em- brionárias modificadas são expandidas e microinjetadas em blastocistos para produzir camundongos quiméricos.
Os ratos quiméricos são então criados para produzir descendentes homozigóticos que expressam anti- corpos humanos.
Os camundongos transgênicos são imunizados da ma- neira normal com um antígeno selecionado, por exemplo, todo ou uma porção do polipeptídeo.
Os anticorpos monoclonais dirigidos contra o an- tígeno podem ser obtidos a partir de camundongos transgênicos imuniza- dos usando tecnologia de hibridoma convencional.
Os transgenes de imunoglobulina humana abrigados pelos camundongos transgênicos se reorganizam durante a diferenciação de células B e, subsequentemente, passam por troca de classe e mutação somática.
Assim, usando essa técnica, é possível produzir anticorpos IgG, IgA, IgM e IgE terapeutica- mente úteis.
Para uma visão geral desta tecnologia para a produção de anticorpos humanos, consulte Lonberg e Huszar (1995, /nt.
Rev.
Immu- nol. 13: 65-93). Para uma discussão detalhada desta tecnologia para a produção de anticorpos humanos e anticorpos monoclonais humanos e protocolos para a produção de tais anticorpos, veja, por exemplo, WO 98/24893, WO 96/34096 e WO 96/33735; e Patentes Norte-americanas Nos. 5.413.923, 5.625.126, 5.633.425, 5.569.825, 5.661.016, 5.545.806,
5.814.318 e 5.939.598, que são incorporadas aqui por referência em sua totalidade. Outros métodos são detalhados nos Exemplos aqui. Além dis- so, empresas como Abgenix, Inc. (Freemont, CA) e Genpharm (San Jose, CA) podem ser contratadas para fornecer anticorpos humanos dirigidos contra um antígeno selecionado usando tecnologia semelhante à descrita acima.
[00212] Um anticorpo quimérico é uma molécula na qual diferentes porções do anticorpo são derivadas de diferentes moléculas de imuno- globulina. Os métodos para a produção de anticorpos quiméricos são co- nhecidos na técnica. Veja, por exemplo, Morrison, 1985, Science229: 1202; Oi et al., 1986, BioTechniques 4: 214; Gillies et a/., 1989, J. Immu- nol. Methods 125: 191-202; e Patentes Norte-americanas Nos. 5.807.715,
4.816.567, 4.816.397 e 6.331.415, que são incorporadas neste documen- to por referência em sua totalidade.
[00213] Um anticorpo humanizado é um anticorpo ou sua variante ou fragmento do mesmo que é capaz de se ligar a um antígeno predetermi- nado e que compreende uma região estrutural tendo substancialmente a sequência de aminoácidos de uma imunoglobulina humana e uma CDR tendo substancialmente a sequência de aminoácidos de uma imunoglo- bulina não humana. Um anticorpo humanizado compreende substancial- mente todos de pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis (Fab, Fab', F(ab')2, Fabc, Fv) em que todas ou substancialmente todas as regiões CDR correspondem àquelas dentre uma - imunoglobulina huma- na (por exemplo, anticorpo doador) e todas ou substancialmente todas as regiões estruturais são aquelas de uma sequência consenso de imuno- globulina humana.
Em algumas modalidades, um anticorpo humanizado também compreende pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente a de uma imunoglobulina humana.
Normalmente, o anticorpo conterá tanto a cadeia leve quanto pelo menos o domínio variável de uma cadeia pesada.
O anticorpo também pode in- cluir as regiões CH1, articulação, CH2, CH3 e CH4 da cadeia pesada.
O anticorpo humanizado pode ser selecionado de qualquer classe de imu- noglobulinas, incluindo IgM, IgG, IgD, IgA e IgE, e qualquer isotipo, inclu- indo I9G1, I9gG2, IgG3 e IgG4. Normalmente, o domínio constante é um domínio constante de fixação do complemento, onde se deseja que o an- ticorpo humanizado exiba atividade citotóxica e a classe é tipicamente Ig9gG1. Quando tal atividade citotóxica não for desejável, o domínio cons- tante pode ser da classe IgG2. Exemplos de domínios constantes VL e VH que podem ser usados em algumas modalidades incluem, mas não estão limitados a, C-capa e C-gama-1 (nG1m) descritos em Johnson et al. (1997) J.
Infect.
Dis. 176, 1215-1224 e aqueles descritos na Patente Norte-americana No. 5.824.307. O anticorpo humanizado pode compre- ender sequências de mais de uma classe ou isotipo, e selecionar domí- nios constantes particulares para otimizar as funções efetoras desejadas está dentro da habilidade comum na técnica.
As regiões de estrutura e CDR de um anticorpo humanizado não precisam corresponder precisa- mente às sequências parentais, por exemplo, a CDR do doador ou a es- trutura de consenso podem ser mutagenizados por substituição, inserção ou deleção de pelo menos um resíduo de modo que a CDR ou resíduo de estrutura naquele sítio não corresponde ao consenso ou ao anticorpo de importação.
Essas mutações, no entanto, não serão extensas.
Normal- mente, pelo menos 75 % dos resíduos de anticorpos humanizados cor-
responderão aos das sequências parentais de FR e CDR, mais frequen- temente 90 % ou mais do que 95 %. Os anticorpos humanizados podem ser produzidos usando uma variedade de técnicas conhecidas na técnica, incluindo, mas não se limitando a, enxerto de CDR (EP 239 400; WO 91/09967; e Patentes Norte-americanas Nos. 5.225.539, 5.530.101 e
5.585.089), estratificação ou refaceamento (EP 592 106 e EP 519 596; Padlan, 1991, Molecular Immunology 28 (4/5): 489-498; Studnicka et al., 1994, Protein Engineering 7 (6): 805-814; e Roguska et al/., 1994, Proc Natl Acad Sci9g1: 969-973), embaralhamento de cadeias (Patente Norte- americana No. 5.565.332) e técnicas descritas em, por exemplo, U.S. Pat. No. 6,407,213, U.S. Pat. No. 5,766,886, WO 93/17105, Tan et al., J. Immunol. 169:1119 25 (2002), Caldas et al., Protein Eng. 13(5):353-60 (2000), Morea et al., Methods 20(3):267 79 (2000), Baca et al., J. Biol. Chem. 272 (16):10678-84 (1997), Roguska et al., Protein Eng. 9 (10): 895 904 (1996), Couto et al., Cancer Res. 55 (23 Supp): 5973s-5977s (1995), Couto et al., Cancer Res. 55(8):1717-22 (1995), Sandhu JS, Gene 150(2):409-10 (1994), e Pedersen et al., J. Mol. Biol. 235 (3):959-73 (1994). Veja também a Pub. de Patente Norte-americana No. US 2005/0042664 A1, que é incorporado por referência neste documento em sua totalidade. Frequentemente, os resíduos da estrutura nas regiões da estrutura serão substituídos pelo resíduo correspondente do anticorpo doador de CDR para alterar (por exemplo, melhorar) a ligação ao antíge- no. Essas substituições de estrutura são identificadas por métodos bem conhecidos na técnica, por exemplo, por modelagem das interações da CDR e resíduos de estrutura para identificar resíduos de estrutura impor- tantes para a ligação ao antígeno e comparação de sequência para iden- tificar resíduos de estrutura incomuns em posições particulares. (Veja, por exemplo, Queen et a/l., Patente Norte-americana No. 5.585.089; e
Reichmann et a/., 1988, Nature 332: 323, que são incorporados neste do- cumento por referência em sua totalidade.)
[00214] Os anticorpos de domínio único, por exemplo, anticorpos sem as cadeias leves, podem ser produzidos por métodos bem conhecidos na técnica. Veja, Riechmann et a/., 1999, J. Immunol. 231:25-38; Nuttall et al., 2000, Curr. Pharm. Biotechnol. 1(3): 253-263; Muylderman, 2001, J. Biotechnol. T4(4): 277302; Patente Norte-americana No. 6.005.079; e Nos. WO 94/04678, WO 94/25591 e WO 01/44301, cada um dos quais é incorporado aqui por referência em sua totalidade.
[00215] Além disso, os anticorpos que se ligam a PSGL-1 podem, por sua vez, ser utilizados para gerar anticorpos anti-idiotipo que "mimetizam" um antígeno usando técnicas bem conhecidas por aqueles versados na técnica. (Veja, por exemplo, Greenspan & Bona, 1989, FASEB J. 7 (5): 437-444; Nissinoff, 1991, J. Immunol. 147 (8): 2429-2438).
[00216] Os anticorpos aqui fornecidos incluem, mas não estão limita- dos a, anticorpos sintéticos, anticorpos monoclonais, anticorpos produzi- dos de forma recombinante, anticorpos multiespecíficos (incluindo anti- corpos biespecíficos), anticorpos humanos, anticorpos humanizados, an- ticorpos camelizados, anticorpos quiméricos, intracorpos, anticorpos anti- idiotípicos (anti-ld) e fragmentos funcionais de qualquer um dos anterio- res. Exemplos não limitantes de fragmentos funcionais incluem Fvs de cadeia única (scFv) (por exemplo, incluindo monoespecifico, biespecífico, etc.), fragmentos Fab, fragmentos F(ab'), fragmentos F(ab),, fragmentos F(ab')) fragmentos, Fvs ligados por dissulfureto (sdFv), fragmentos Fd, fragmentos Fv, diacorpo, triacorpo, tetracorpo e minicorpo.
[00217] Em particular, os anticorpos fornecidos neste documento in- cluem moléculas de imunoglobulina e porções imunologicamente ativas de moléculas de imunoglobulina, por exemplo, moléculas que contêm um sítio de ligação de antígeno que se liga a PSGL-1 (por exemplo, polipep- tídeo PSGL-1, fragmento de polipeptídeo PSGL-1, epítopo PSGL-1). As moléculas de imunoglobulina aqui fornecidas podem ser de qualquer tipo (por exemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IlgY), classe (por exemplo, I9G1, Ig9G2, I9G3, IgG4, IgA1 e I9gA2) ou subclasse da molécula de imunoglobu- lina.
[00218] Variantes e derivados de anticorpos incluem fragmentos funci- onais de anticorpos que retêm a capacidade de se ligarem a PSGL-1 (por exemplo, polipeptídeo PSGL-1, fragmento de polipeptídeo PSGL-1, epí- topo PSGL-1). Fragmentos funcionais exemplares incluem fragmentos Fab (um fragmento de anticorpo que contém o domínio de ligação ao an- tígeno e compreende uma cadeia leve e parte de uma cadeia pesada |i- gada por uma ligação dissulfeto); Fab' (um fragmento de anticorpo con- tendo um único domínio anti-ligação compreendendo um Fab e uma por- ção adicional da cadeia pesada através da região de articulação); F(ab'), (duas moléculas Fab' unidas por ligações dissulfeto intercadeias nas re- giões de articulação das cadeias pesadas; as moléculas Fab' podem ser direcionadas para os mesmos epítopos ou diferentes); um Fab biespeciífi- co (uma molécula Fab possuindo dois domínios de ligação ao antígeno, cada um dos quais pode ser direcionado a um epítopo diferente); uma cadeia Fab de cadeia única compreendendo uma região variável, tam- bém conhecida como sFv (a região determinativa de ligação ao antígeno variável de uma única cadeia leve e pesada de um anticorpo ligadas en- tre si por uma cadeia de 10-25 aminoácidos); um Fv ligado por dissulfeto, ou dsFv (a variável, região determinante de ligação ao antígeno de uma única cadeia leve e pesada de um anticorpo ligados entre si por uma liga- ção dissulfeto); um VH camelizado (a região determinante de ligação ao antígeno variável de uma única cadeia pesada de um anticorpo em que alguns aminoácidos na interface VH são aqueles encontrados na cadeia pesada de anticorpos de camelo de ocorrência natural); um sFv biespecí- fico (uma molécula sFv ou dsFv possuindo dois domínios de ligação ao antígeno, cada um dos quais pode ser direcionado a um epítopo diferen- te); um diacorpo (um sFv dimerizado formado quando o domínio VH de um primeiro sFv se monta com o domínio VL de um segundo sFv e o do- mínio VL do primeiro sFv se monta com o domínio VH do segundo sFv; as duas regiões de ligação ao antígeno do diacorpo pode ser direcionado para o mesmo ou diferentes epítopos); e um triacorpo (um sFv trimeriza- do, formado de maneira semelhante a um diacorpo, mas no qual três do- mínios de ligação ao antígeno são criados em um único complexo; os três domínios de ligação ao antígeno podem ser direcionados para o mesmo ou diferentes epítopos) derivados de anticorpos também incluem uma ou mais sequências CDR de um sítio de combinação de anticorpo. As se- quências CDR podem ser ligadas entre si em um andaime quando duas ou mais sequências CDR estão presentes. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende um Fv de cadeia única ("scFv"). Os scFvs são fra- gmentos de anticorpo que compreendem os domínios VH e VL de um an- ticorpo, em que esses domínios estão presentes em uma única cadeia polipeptídica. Geralmente, o polipeptídeo scFv compreende ainda um |i- gante polipeptídico entre os domínios VH e VL que permite que o scFv forme a estrutura desejada para ligação ao antígeno. Para uma revisão dos scFvs, veja, Pluckthun em The Pharmacology of Monoclonal Antibo- dies, vol. 113, Eds Rosenburg e Moore. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994).
[00219] Os anticorpos aqui fornecidos podem ser monoespeciíficos, biespecíficos, triespecíficos ou de maior multiespecificidade. Os anticor- pos multiespecíficos podem ser específicos para diferentes epítopos de um polipeptídeo PSGL-1 ou podem ser específicos para um polipeptídeo PSGL-1, bem como para um epítopo heterólogo, tal como um polipeptí- deo heterólogo ou material de suporte sólido. Em algumas modalidades, os anticorpos aqui fornecidos são monoespecíficos para um determinado epítopo de um polipeptídeo PSGL-1 e não se ligam a outros epítopos.
[00220] Também são aqui fornecidas as proteínas de fusão compre- endendo um anticorpo aqui fornecido que se liga a um PSGL-1 e um poli- peptídeo heterólogo. Em algumas modalidades, o polipeptídeo heterólogo ao qual o anticorpo está fundido é útil para direcionar o anticorpo para células com PSGL-1 expresso na superfície celular.
[00221] “Também são aqui fornecidos painéis de anticorpos que se |i- gam a um PSGL-1. Em algumas modalidades, os painéis de anticorpos têm diferentes constantes de taxa de associação, diferentes constantes de taxa de dissociação, diferentes afinidades para PSGL-1 e/ou diferen- tes especificidades para um PSGL-1. Em algumas modalidades, os pai- néis compreendem ou consistem em cerca de 10, cerca de 25, cerca de 50, cerca de 75, cerca de 100, cerca de 125, cerca de 150, cerca de 175, cerca de 200, cerca de 250, cerca de 300, cerca de 350, cerca de 400, cerca de 450, cerca de 500, cerca de 550, cerca de 600, cerca de 650, cerca de 700, cerca de 750, cerca de 800, cerca de 850, cerca de 900, cerca de 950 ou cerca de 1000 anticorpos ou mais. Os painéis de anti- corpos podem ser usados, por exemplo, em placas de 96 ou 384 cavida- des, como para ensaios como ELISAs. USO DIAGNÓSTICO DE REAGENTES DE LIGAÇÃO AO PSGL-1
[00222] Os anticorpos anti-PSGL-1 fornecidos neste documento po- dem ser usados para avaliar os níveis de PSGL-1 em uma amostra bioló- gica usando métodos imuno-histológicos clássicos, conforme descrito neste documento ou conforme conhecido por aqueles versados na técni-
ca (por exemplo, veja, Jalkanen et a/., 1985, J. Cell. Biol. 101: 976-985; e Jalkanen et al., 1987, J. Cell.Biol. 105: 3087-3096). Outros métodos ba- seados em anticorpos úteis para detectar a expressão do gene da proteí- na incluem imunoensaios, tais como, o ensaio de imunoabsorção enzimá- tica (ELISA) e o radioimunoensaio (RIA). Os marcadores de ensaio de anticorpo adequados são conhecidos na técnica e incluem marcadores de enzima, tais como, glicose oxidase; radioisótopos, tais como, iodo (2º, 121)), carbono (*ºC), enxofre (%ºS), trício (?H), índio (*2!ln) e tecnécio (Tc); marcadores luminescentes, como luminol; e marcadores fluorescentes, tais como, fluoresceína e rodamina, e biotina.
[00223] “Também é aqui fornecido a detecção e o diagnóstico de uma doença, distúrbio ou condição mediada por VISTA em um ser humano. Em algumas modalidades, o diagnóstico compreende: a) administrar (por exemplo, parenteralmente, subcutaneamente ou intraperitonealmente) a um indivíduo uma quantidade eficaz de um anticorpo marcado que se liga a um PSGL-1; b) aguardar um intervalo de tempo após a administração para permitir que o anticorpo marcado se concentre preferencialmente em sítios no indivíduo onde o PSGL-1 é expresso (e para que a molécula marcada não ligada seja limpa para o nível de antecedente); c) determi- nar o nível de antecedente; e d) detectar o anticorpo marcado no indiví- duo, de modo que a detecção do anticorpo marcado acima do nível de antecedente indique que o indivíduo tem uma doença, distúrbio ou condi- ção mediada por VISTA. O nível de antecedente pode ser determinado por vários métodos, incluindo a comparação da quantidade de molécula marcada detectada com um valor padrão previamente determinado para um sistema particular.
[00224] Será entendido na técnica que o tamanho do indivíduo e o sis- tema de imagem usado irão determinar a quantidade de porção de ima-
gem necessária para produzir imagens de diagnóstico. No caso de uma porção de radioisótopo, para um indivíduo humano, a quantidade de radi- oatividade injetada variará normalmente de cerca de 5 a 20 milicuries de Tc. O anticorpo marcado irá então acumular-se preferencialmente na localização das células que contêm a proteína específica. A imagem do tumor in vivo é descrita em S.W. Burchiel et a/., "'mmunopharmacokinet- ics of Radiolabeled Antibodies and Their Fragments." (Chapter 13 in Tu- mor Imaging: The Radiochemical Detection of Cancer, S.W. Burchiel e B.A. Rhodes, eds., Masson Publishing Inc. (1982).
[00225] “Dependendo de várias variáveis, incluindo o tipo de marcador usado e o modo de administração, o intervalo de tempo após a adminis- tração para permitir que o anticorpo marcado se concentre preferencial- mente em sítios no indivíduo e para o anticorpo marcado não ligado ser limpo para o nível de antecedente é de 6 a 48 horas ou de 6 a 24 horas ou de 6 a 12 horas. Em outra modalidade, o intervalo de tempo após a administração é de 5 a 20 dias ou de 5 a 10 dias.
[00226] Em algumas modalidades, o monitoramento de uma doença, distúrbio ou condição mediada por VISTA é realizado pela repetição do método para diagnosticar a doença, distúrbio ou condição mediada por VISTA, por exemplo, um mês após o diagnóstico inicial, seis meses após o inicial diagnóstico, um ano após o diagnóstico inicial, etc.
[00227] A presença da molécula marcada pode ser detectada no indi- víduo usando métodos conhecidos na técnica para varredura in vivo. Es- ses métodos dependem do tipo de marcador usado. Aqueles versados serão capazes de determinar o método apropriado para detectar uma eti- queta particular. Métodos e dispositivos que podem ser usados nos mé- todos de diagnóstico fornecidos neste documento incluem, mas não estão limitados a, tomografia computadorizada (CT), varredura de corpo inteiro,
como tomografia por emissão de pósitrons (PET), imagem por ressonân- cia magnética (MRI) e ultrassonografia.
[00228] Em algumas modalidades, a molécula é marcada com um ra- dioisótopo e é detectada no paciente usando um instrumento cirúrgico responsivo à radiação (Thurston et a/., Patente Norte-americana No.
5.441.050). Em outra modalidade, a molécula é marcada com um com- posto fluorescente e é detectada no paciente usando um instrumento de varredura responsivo à fluorescência. Em outra modalidade, a molécula é marcada com um metal emissor de pósitrons e é detectada no paciente usando tomografia por emissão de pósitrons. Em ainda outra modalidade, a molécula é marcada com um marcador paramagnético e é detectada em um paciente usando imagem de ressonância magnética (MRI). AGENTES TERAPÊUTICOS ANTI-VISTA
[00229] Em uma primeira modalidade, o agente terapêutico anti-VISTA é um agente que inibe a função do inibidor do ponto de checagem de VISTA. A inibição da função inibidora de VISTA pode ser realizada em nível de DNA, RNA ou proteína. Nas modalidades, um ácido nucleico ini- bidor (por exemplo, um dsRNA, siRNA ou shRNA) pode ser usado para inibir a expressão de VISTA. Em outras modalidades, o inibidor do sinal inibidor de VISTA é um polipeptídeo, por exemplo, um ligante solúvel (por exemplo, PSGL-1-Fc) ou um anticorpo ou fragmento de ligação ao antí- geno do mesmo (também referido aqui como "uma molécula de anticor- po"), que se liga ao VISTA. De preferência, o agente terapêutico anti- VISTA é um anticorpo.
[00230] Os anticorpos que inibem a função de VISTA são particular- mente úteis para o tratamento do câncer. Os presentes inventores des- creveram anteriormente anticorpos direcionados contra VISTA que indu- zem forte inibição do crescimento tumoral (veja, WO 2014/197849 e WO
2016/094837, ambos aqui incorporados por referência). Outros anticorpos anti-VISTA com propriedades anticâncer também foram descritos na téc- nica (veja, por exemplo, WO 2014/039983A1, WO 2015/145360A1, WO 2015/097536, WO 2017/137830, WO 2017/181139, todos os quais são aqui incorporados por referência em sua totalidade).
[00231] Tais anticorpos anti-VISTA altamente específicos e/ou especí- ficos (aqui referidos como "anticorpos anti-VISTA") podem ser policlonais ("PAbs anti-VISTA") ou monoclonais ("MAbs anti-VISTA"), embora para utilizações terapêuticas e, em alguns casos, diagnósticos ou outras utili- zações in vitro, os anticorpos monoclonais são preferidos.
[00232] Em modalidades específicas, o anticorpo é um anticorpo hu- manizado, um anticorpo monoclonal, um anticorpo recombinante, um fra- gmento de ligação ao antígeno ou qualquer combinação dos mesmos. Em modalidades particulares, o anticorpo é um anticorpo monoclonal humanizado conforme descrito em WO 2016/094837 (por exemplo, 5B, 46A, 97A, 128A, 146C, 208A, 215A, 26A, 164A, 230A, 76E1, 53A, 259A, 33A, 39A, 124A, 175A, 321D, 141A, 51A, 353A ou 305A aqui descritos (por exemplo, Tabelas 12-33 de WO 2016/094837) com um domínio Vu, domínio V., CDR1 de Vu, CDR2 de Vu, CDR3 de Vu, CDR1 de V., CDR2 de V, e/ou CDR3 de V,), ou seu fragmento de ligação ao antígeno, que se liga a um polipeptídeo VISTA (por exemplo, um VISTA solúvel ou ex- presso na superfície celular), um fragmento VISTA ou um epítopo VISTA.
[00233] Em outras modalidades, os anticorpos anti-VISTA usados no método da invenção são anticorpos (i) que bloqueiam competitivamente (por exemplo, de uma maneira dependente da dose) um anticorpo anti- VISTA conforme descrito em WO 2016/094837 de ligação a um polipeptí- deo VISTA (por exemplo, um VISTA solúvel ou expresso na superfície celular), um fragmento VISTA ou um epítopo VISTA e/ou (ii) que se liga a um epítopo VISTA que está ligado por um anticorpo anti-VISTA (por exemplo, anticorpos anti-VISTA humanizados) conforme descrito em WO 2016/094837. Em outras modalidades, o anticorpo bloqueia competitiva- mente (por exemplo, de uma maneira dependente da dose) o anticorpo monoclonal 5B, 46A, 97A, 128A, 146C, 208A, 215A, 26A, 164A, 230A, 76E1, 53A, 259A, 33A, 39A, 124A, 175A, 321D, 141A, 51A, 353A ou 305A aqui descrito (por exemplo, Tabelas 12-33) ou uma variante huma- nizada deste de ligação a um polipeptídeo VISTA (por exemplo, um VIS- TA solúvel ou expresso na superfície celular), um fragmento VISTA ou um epítopo VISTA. Em outras modalidades, o anticorpo se liga a um epí- topo VISTA que é ligado (por exemplo, reconhecido) pelo anticorpo mo- noclonal 5B, 46A, 97 A, 128A, 146C, 208A, 215A, 26A, 164A, 230A, 76E1, 53A, 259A, 33A, 39A, 124A, 175A, 321D, 141A, 51A, 353A ou 305A des- crito em WO 2016/094837 (por exemplo, Tabelas 12-33 de WO 2016/094837) ou uma variante humanizada deste (por exemplo, anticor- pos anti-VISTA humanizados).
[00234] Mais preferivelmente, o anticorpo anti-VISTA do método da invenção é o anticorpo 26A descrito em WO 2016/094837. Em uma pri- meira modalidade, este anticorpo compreende uma cadeia pesada com- preendendo 3 CDRs e a cadeia leve compreendendo 3 CDRs, em que as referidas CDRs são mostrados na Tabela 4. Em outra modalidade, o anti- corpo anti-VISTA compreende uma cadeia pesada compreendendo 3 CDRs e a cadeia leve compreendendo 3 CDRs, em que as referidas CDRs são mostrados na Tabela 5.
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[00235] Os anticorpos monoclonais anti-VISTA da descrição inclu- em moléculas intactas e fragmentos de anticorpos (tais como, por exemplo, fragmentos Fab e F(ab')2) que são capazes de se ligar es- pecificamente a VISTA. Os fragmentos Fab e F(ab')2 carecem do fra- gmento Fc do anticorpo intacto, são eliminados mais rapidamente da circulação do animal ou planta e podem ter menos ligação não especí- fica ao tecido do que um anticorpo intacto (Wahl et a/., 1983, J. Nucl. Med. 24: 316). Fragmentos de anticorpos são, portanto, úteis em apli- cações terapêuticas, entre outras aplicações.
[00236] O termo "fragmento de anticorpo" refere-se a uma porção de um anticorpo de tamanho natural, geralmente a ligação ao alvo ou região variável. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem frag- mentos Fab, Fab', F(ab')2 e Fv. Um fragmento "Fv" é o fragmento míi- nimo de anticorpo que contém um reconhecimento de alvo completo e sítio de ligação. Esta região consiste em um dímero de um domínio variável de cadeia pesada e um leve em uma associação não covalen- te forte (dímero VH-VL). É nesta configuração que as três CDRs de cada domínio variável interagem para definir um sítio de ligação ao alvo na superfície do dímero VH-VL. Frequentemente, as seis CDRs conferem especificidade de ligação ao anticorpo. No entanto, em al- guns casos, mesmo um único domínio variável (ou metade de um Fv compreendendo apenas três CDRs específicas para um alvo) pode ter a capacidade de reconhecer e ligar o alvo, embora com uma afinidade mais baixa do que todo o sítio de ligação. Fragmentos de anticorpo "Fv de cadeia única" ou "scFvy" compreendem os domínios VH e VL de um anticorpo, em que esses domínios estão presentes em uma única ca- deia polipeptídica. Geralmente, o polipeptídeo Fv compreende ainda um ligante polipeptídico entre os domínios VH e VL que permite que o scFv forme a estrutura desejada para a ligação ao alvo. "Anticorpos de domínio único" são compostos por um único domínio VH ou VL que exibe afinidade suficiente para VISTA. Em uma modalidade específica, o anticorpo de domínio único é um anticorpo camelizado (Veja, por exemplo, Riechmann, 1999, Journal of Immunological Methods 231: 25-38).
[00237] O fragmento Fab contém o domínio constante da cadeia leve e o primeiro domínio constante (CH1) da cadeia pesada. Os fra- gmentos Fab' diferem dos fragmentos Fab pela adição de alguns resí- duos no terminal carboxila do domínio CHI da cadeia pesada incluindo uma ou mais cisteínas da região de articulação do anticorpo. Os frag- mentos F(ab') são produzidos por clivagem da ligação dissulfeto nas cisteínas de articulação do produto de digestão com pepsina F(ab')2. Os acoplamentos químicos adicionais de fragmentos de anticorpo são conhecidos por aqueles versados na técnica.
[00238] Os anticorpos monoclonais anti-VISTA da descrição podem ser anticorpos quiméricos. O termo anticorpo "quimérico", quando aqui usado, refere-se a um anticorpo com sequências variáveis derivadas de imunoglobulinas não humanas, como anticorpo de rato ou camun- dongo, e regiões constantes de imunoglobulinas humanas, tipicamente escolhidas a partir de um padrão de imunoglobulina humana. Os mé- todos para a produção de anticorpos quiméricos são conhecidos na técnica. Veja, por exemplo, Morrison, 1985, Science 229(4719):1202- 7; Oi et al., 1986, BioTechniques 4:214-221; Gillies et al., 1985, J. Immunol. Methods 125:191-202; Patentes Norte-americana Nos.
5.807.715; 4.816.567; e 4.816397, que são incorporadas aqui por refe- rência em sua totalidade.
[00239] Os anticorpos monoclonais anti-VISTA da descrição podem ser humanizados. As formas "humanizadas" de anticorpos não huma- nos (por exemplo, murino) são imunoglobulinas quiméricas, cadeias de imunoglobulinas ou fragmentos das mesmas (tais como Fv, Fab, Fab”, F(ab')2 ou outras subsequências de ligação ao alvo de anticorpos) que contêm sequências mínimas derivadas de imunoglobulinas não huma- nas. Em geral, o anticorpo humanizado compreenderá substancial- mente todos de pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variá- veis, em que todas ou substancialmente todas as regiões CDR corres- pondem àquelas de uma imunoglobulina não humana e todas ou subs- tancialmente todas as regiões FR são aquelas de uma sequência de consenso de imunoglobulina humana e podem ser referidas como "en- xertadas com CDR". O anticorpo humanizado também pode compre- ender pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglo- bulina (Fc), tipicamente a de uma sequência de consenso de imuno- globulina humana. Métodos de humanização de anticorpos, incluindo métodos de projetar anticorpos humanizados, são conhecidos na téc- nica. Veja, por exemplo, Lefranc et a/l., 2003, Dev. Comp. Immunol. 27:55-77; Lefranc et al/., 2009, Nucl. Acids Res. 37: D1006-1012; Le- franc, 2008, Mol. Biotechnol. 40: 101-111; Riechmann et a/., Nature 332:323-7, 1988; Patente Norte-americana Nos: 5.530.101; 5.585.089;
5.693.761; 5.693.762; e 6.180.370 de Queen et al.; EP239400; Publi- cação PCT WO 91/09967; Patente Norte-americana No. 5.225.539; EP592106; EP519596; Padlan, 1991, Mol. Immunol., 28: 489-498; Studnicka et a/., 1994, Prot. Eng. 7:805-814; Roguska et a/l., Proc. Natl. Acad. Sci. 91:969-973; e Patente Norte-americana No. 5.565.332, to- das aqui incorporadas por referência na sua totalidade.
POLINUCLEOTÍDEOS QUE CODIFICAM UM ANTICORPO
[00240] Também aqui fornecido são polinucleotídeos compreen- dendo uma sequência de nucleotídeos que codifica um anticorpo aqui fornecido que se liga a PSGL-1 (por exemplo, polipeptídeo PSGL-1, fragmento de polipeptídeo PSGL-1, epítopo PSGL-1). Também são fornecidos neste documento polinucleotídeos que hibridizam sob con- dições de hibridização de estringência alta, de estringência intermediá- ria ou de estringência baixa, por exemplo, conforme definido supra,
para polinucleotídeos que codificam um anticorpo ou anticorpo modifi- cado aqui fornecido.
[00241] Também são fornecidos neste documento polinucleotídeos compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica um anti- corpo fornecido neste documento que se liga a VISTA (por exemplo, polipeptídeo VISTA, fragmento de polipeptídeo VISTA, epítopo VIS- TA). Também são fornecidos neste documento polinucleotídeos que hibridizam sob condições de hibridização de estringência alta, de es- tringência intermediária ou de estringência baixa, por exemplo, con- forme definido supra, para polinucleotídeos que codificam um anticor- po ou anticorpo modificado aqui fornecido.
[00242] Em certas modalidades, as moléculas de ácido nucleico fornecidas neste documento compreendem ou consistem em uma se- quência de ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos Vu e/ou V, divulgada neste documento, ou qualquer combinação das mesmas (por exemplo, como uma sequência de nucleotídeos que co- difica um anticorpo fornecido neste documento, tal como um anticorpo de tamanho natural, cadeia pesada e/ou leve de um anticorpo ou um anticorpo de cadeia única aqui fornecido).
EXPRESSÃO RECOMBINANTE DE UM ANTICORPO
[00243] Uma variedade de sistemas de expressão pode ser usada para expressar os presentes anticorpos, por exemplo, um anticorpo anti-PSGL-1 ou um anticorpo anti-VISTA como aqui descrito. Em um aspecto, tais sistemas de expressão representam veículos pelos quais as sequências de codificação de interesse podem ser produzidas e subsequentemente purificadas, porém, também representam células que podem, quando transitoriamente transfectadas com as sequências de codificação de nucleotídeos apropriadas, expressar um anticorpo da invenção in situ.
[00244] A invenção fornece vetores que compreendem os polinu-
cleotídeos aqui descritos. Em uma modalidade, o vetor contém um po- linucleotídeo que codifica uma cadeia pesada de um anticorpo IgG da invenção, isto é, um anticorpo que carrega uma mutação no domínio Fc. Em outra modalidade, o referido polinucleotídeo codifica a cadeia leve de um anticorpo IgG da invenção. A invenção também fornece vetores compreendendo moléculas de polinucleotídeo que codificam proteínas de fusão, anticorpos modificados, fragmentos de anticorpos e sondas dos mesmos.
[00245] Afim de expressar a cadeia pesada e/ou leve de um anti- corpo aqui descrito, tal como um anticorpo anti-PSGL-1 ou um anticor- po anti-VISTA, os polinucleotídeos que codificam as referidas cadeias pesadas e/ou leves são inseridos em vetores de expressão de modo que os genes estejam operativamente ligados a sequências transcrici- onais e translacionais.
[00246] Sequências "operacionalmente ligadas" incluem ambas as sequências de controle de expressão que são contíguas ao gene de interesse e sequências de controle de expressão que atuam em trans ou à distância para controlar o gene de interesse. O termo "sequência de controle de expressão", quando aqui usado, refere-se a sequências polinucleotídicas que são necessárias para efetuar a expressão e o processamento das sequências de codificação às quais estão ligadas. As sequências de controle de expressão incluem as sequências de iniciação, terminação, promotora e realçadora da transcrição apropria- das; sinais de processamento de RNA eficientes, como sinais de spli- cing e poliadenilação; sequências que estabilizam o mRNA citoplas- mático; sequências que realçam a eficiência da translação (isto é, se- quência de consenso Kozak); sequências que realçam a estabilidade da proteína; e quando desejado, sequências que realçam a secreção de proteínas. A natureza de tais sequências de controle difere depen- dendo do organismo hospedeiro; em procariotas, tais sequências de controle geralmente incluem promotor, sítio de ligação ribossômica e sequência de terminação da transcrição; em eucariotas, geralmente, tais sequências de controle incluem promotores e sequência de termi- nação da transcrição. O termo "sequências de controle" se destina a incluir, no mínimo, todos os componentes cuja presença é essencial para a expressão e processamento e também pode incluir componen- tes adicionais cuja presença é vantajosa, por exemplo, sequências lí- der e sequências de par de fusão.
[00247] O termo "vetor", quando aqui usado, destina-se a referir-se a uma molécula de ácido nucleico capaz de transportar outro ácido nucleico ao qual foi ligada. Um tipo de vetor é um "plasmídeo", que se refere a uma alça de DNA de fita dupla circular na qual segmentos de DNA adicionais podem ser ligados. Outro tipo de vetor é um vetor viral, em que segmentos de DNA adicionais podem ser ligados ao genoma viral. Certos vetores são capazes de replicação autônoma em uma cé- lula hospedeira na qual são introduzidos (por exemplo, vetores bacte- rianos tendo uma origem de replicação bacteriana e vetores episso- mais de mamíferos). Outros vetores (por exemplo, vetores de mamífe- ros não epissomais) podem ser integrados no genoma de uma célula hospedeira após a introdução na célula hospedeira e, portanto, são replicados juntamente com o genoma hospedeiro.
[00248] Certos vetores são capazes de direcionar a expressão de genes aos quais estão operativamente ligados. Esses vetores são aqui referidos como "vetores de expressão recombinantes" (ou simples- mente, "vetores de expressão"). Em geral, os vetores de expressão úteis em técnicas de DNA recombinante estão na forma de plasmí- deos. Na presente especificação, "plasmídeo" e "vetor" podem ser usados alternadamente, pois o plasmídeo é a forma de vetor mais co- mumente usada. No entanto, a invenção se destina a incluir tais for- mas de vetores de expressão, tais como plasmídeos bacterianos,
YACs, cosmídeos, retrovírus, epissomas derivados de EBV e todos os outros vetores que o especialista saberá ser conveniente para garantir a expressão das cadeias pesada e/ou leve dos anticorpos da inven- ção. O especialista perceberá que os polinucleotídeos que codificam as cadeias pesada e leve podem ser clonados em vetores diferentes ou no mesmo vetor. Em uma modalidade preferida, os referidos poli- nucleotídeo são clonados em dois vetores.
[00249] Os polinucleotídeos da invenção e vetores que compreen- dem essas moléculas podem ser usados para a transformação de uma célula hospedeira adequada. O termo "célula hospedeira", quando aqui usado, destina-se a referir-se a uma célula na qual um vetor de expressão recombinante foi introduzido a fim de expressar o presente anticorpo (por exemplo, um anticorpo anti-PSGL-1 ou um anticorpo anti-VISTA). Deve ser entendido que tais termos se destinam a referir- se não apenas à célula em questão em particular, porém, também à progênie de tal célula. Como certas modificações podem ocorrer nas gerações seguintes devido a mutações ou influências ambientais, tal progênie pode não ser, de fato, idêntica à célula-mãe, porém, ainda está incluída no escopo do termo "célula hospedeira", quando aqui usado.
[00250] A transformação pode ser realizada por qualquer método conhecido para a introdução de polinucleotídeos em uma célula hos- pedeira. Tais métodos são bem conhecidos por aqueles versados na técnica e incluem transformação mediada por dextrano, precipitação de fosfato de cálcio, transfecção mediada por polibreno, fusão de pro- toplastos, eletroporação, encapsulação do polinucleotídeo em lipos- somas, injeção biolística e microinjeção direta de DNA nos núcleos.
[00251] A célula hospedeira pode ser cotransfectada com dois ou mais vetores de expressão, incluindo o vetor que expressa a proteína da invenção. Em particular, os outros vetores de expressão podem co-
dificar enzimas envolvidas em modificações pós-translacionais, tal co- mo glicosilação. Por exemplo, uma célula hospedeira pode ser trans- fectada com um primeiro vetor que codifica um anticorpo como des- crito acima (por exemplo, um anticorpo anti-PSGL-1 ou um anticorpo anti-VISTA) e um segundo vetor que codifica um polipeptídeo de glico- siltransferase. Alternativamente, a célula hospedeira pode ser trans- formada com um primeiro vetor que codifica um anticorpo (por exem- plo, um anticorpo anti-PSGL-1 ou um anticorpo anti-VISTA), um se- gundo vetor que codifica uma glicosiltransferase, conforme descrito acima, e um terceiro vetor que codifica outra glicosiltransferase. As células de mamífero são comumente usadas para a expressão de imunoglobulinas terapêuticas recombinantes, especialmente para a expressão de anticorpos recombinantes inteiros. Por exemplo, células de mamífero, como células HEK293 ou CHO, em conjunto com um vetor, contendo o sinal de expressão, tal como aquele que transporta o principal elemento promotor de gene intermediário inicial de citomega- lovírus humano, são um sistema eficaz para expressar o presente an- ticorpo, notavelmente um anticorpo anti-PSGL-1 ou um anticorpo anti- VISTA (Foecking et a/., 1986, Gene 45:101; Cockett et a/., 1990, Bio/ Technology 8:2).
[00252] “Também é possível selecionar uma célula hospedeira que modula a expressão das sequências inseridas ou modifica e processa o produto do gene da forma específica desejada. Tais modificações (por exemplo, glicosilação) e processamento de produtos proteicos podem ser importantes para a função da proteína. Diferentes células hospedeiras têm características e mecanismos específicos para o pro- cessamento pós-translacional e modificação de proteínas e produtos gênicos. Linhagens celulares ou sistemas hospedeiros apropriados são escolhidos para garantir a modificação e processamento corretos do anticorpo de interesse expresso. Assim, as células hospedeiras eu-
carióticas que possuem a maquinaria celular para o processamento adequado da transcrição primária, glicosilação do produto do gene po- dem ser utilizadas. Essas células hospedeiras de mamífero incluem, porém, não estão limitadas a, células CHO, COS, HEK293, NS/0, BHK, Y2/0, 3T3 ou de mieloma (todas essas linhagens celulares estão disponíveis em depósitos públicos, como a Collection Nationale des Cultures de Microorganismes, Paris, France ou na American Type Cul- ture Collection, Manassas, VA, U.S.A.).
[00253] Paraa produção de proteínas recombinantes a longo prazo e de alto rendimento, a expressão estável é preferida. Em uma moda- lidade da invenção, as linhagens celulares que expressam de forma estável o anticorpo (por exemplo, um anticorpo anti-PSGL-1 ou um an- ticorpo anti-VISTA) podem ser projetadas. Em vez de usar vetores de expressão que contêm origens virais de replicação, as células hospe- deiras são transformadas com DNA sob o controle dos elementos re- guladores de expressão apropriados, incluindo promotores, realçado- res, terminadores de transcrição, sítios de poliadenilação e outras se- quências apropriadas conhecidas pelos versados na técnica, e um marcador selecionável. Após a introdução do DNA estranho, as células modificadas podem crescer por um a dois dias em um meio enriqueci- do e, em seguida, são movidas para um meio seletivo. O marcador selecionável no plasmídeo recombinante confere resistência à seleção e permite que as células integrem de forma estável o plasmídeo em um cromossoma e se expandam em uma linhagem celular. Outros mé- todos para construir linhagens celulares estáveis são conhecidos na técnica. Em particular, foram desenvolvidos métodos para integração específica do sítio. De acordo com esses métodos, o DNA transforma- do sob o controle dos elementos reguladores de expressão apropria- dos, incluindo promotores, realçadores, terminadores de transcrição, sítios de poliadenilação e outras sequências apropriadas é integrado no genoma da célula hospedeira em um sítio alvo específico que foi previamente clivado (Moele et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 104(9): 3055-3060; US 5.792.632; US 5.830.729; US 6.238.924; WO 2009/ 054985; WO 03/025183; WO 2004/067753, todos dos quais são aqui incorporados por referência).
[00254] “Uma série de sistemas de seleção podem ser usados, in- cluindo, porém, não se limitando à timidina cinase do vírus do Herpes simples (Wigler et al., Cell 11: 223, 1977), hipoxantina-guanina fosfor- ribosiltransferase (Szybalska et al., Proc Natl Acad Sci USA 48:202, 1992), seleção de glutamato sintase na presença de metionina sul- foximida (Adv Drug Del Rev, 58:671, 2006, e site ou literatura de Lon- za Group Ltd.) e adenina fosforribosiltransferase (Lowy et al., Cell 22:817, 1980) genes em células tk, hgprt ou aprt, respectivamente. Além disso, a resistência a antimetabólitos pode ser usada como base de seleção para os seguintes genes: dhfr, que confere resistência ao metotrexato (Wigler et al., Proc Natl Acad Sci USA 77: 357, 1980); gpt, que confere resistência ao ácido micofenólico (Mulligan et al., Proc Natl Acad Sci USA 78: 2072, 1981); neo, que confere resistência ao aminoglicosídeo, G-418 (Wu et al., Biotherapy 3: 87, 1991); e higro, que confere resistência à higromicina (Santerre et al., Gene 30: 147, 1984). Métodos conhecidos na técnica de tecnologia de DNA recombi- nante podem ser rotineiramente aplicados para selecionar o clone re- combinante desejado, e tais métodos são descritos, por exemplo, em Ausubel et al., Eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wil- ey & Sons (1993). Os níveis de expressão de um anticorpo podem ser aumentados pela amplificação do vetor. Quando um marcador no sis- tema de vetor que expressa um anticorpo é amplificável, um aumento no nível de inibidor presente na cultura aumentará o número de cópias do gene marcador. Uma vez que a região amplificada está associada ao gene que codifica o anticorpo de interesse (por exemplo, um anti-
corpo anti-PSGL-1 ou um anticorpo anti-VISTA), a produção do referi- do anticorpo também aumentará (Crouse et al., Mol Cell Biol 3: 257, 1983). Existem métodos alternativos de expressão do gene da inven- ção e são conhecidos por aqueles versados na técnica. Por exemplo, uma proteína de ligador de zinco modificada pode ser projetada para ser capaz de ligar os elementos reguladores de expressão a montante do gene da invenção; a expressão da referida proteína de ligador de zinco projetada (ZFN) na célula hospedeira da invenção leva a aumen- tos na produção de proteína (veja, por exemplo, Reik et a/l., Biotechnol. Bioeng., 97(5), 1180-1189, 2006). Além disso, a ZFN pode estimular a integração de um DNA em uma localização genômica predeterminada, resultando na adição de genes específicos do sítio de alta eficiência (Moehle et al, Proc Natl Acad Sci USA 104:3055, 2007).
[00255] O anticorpo da invenção pode ser preparado cultivando uma cultura das células hospedeiras transformadas sob as condições de cultura necessárias para expressar o anticorpo desejado. O anti- corpo expresso resultante pode, então, ser purificado a partir do meio de cultura ou extratos celulares. As formas solúveis do anticorpo po- dem ser recuperadas do sobrenadante da cultura. Ele pode, então, ser purificado por qualquer método conhecido na técnica para purificação de uma molécula de imunoglobulina, por exemplo, por cromatografia (por exemplo, troca iônica, afinidade, particularmente por afinidade de Proteína A para Fc, e assim por diante), centrifugação, solubilidade diferencial ou por qualquer outra técnica padrão para a purificação de proteínas. Métodos adequados de purificação serão evidentes para uma pessoa versada na técnica.
CONJUGADOS DE ANTICORPOS E PROTEÍNAS DE FUSÃO
[00256] Em algumas modalidades, os anticorpos fornecidos neste documento são conjugados ou fundidos de forma recombinante a um agente diagnóstico, detectável ou terapêutico ou qualquer outra molé-
cula. Os anticorpos conjugados ou fundidos de forma recombinante podem ser úteis, por exemplo, para monitorar ou prognosticar o início, desenvolvimento, progressão e/ou gravidade de uma doença, distúrbio ou condição mediado por VISTA como parte de um procedimento de teste clínico, como determinar a eficácia de uma terapia particular.
[00257] Tal diagnóstico e detecção podem ser realizados, por exemplo, por acoplamento do anticorpo (por exemplo, um anticorpo anti-PSGL-1) a substâncias detectáveis incluindo, porém, não se limi- tando a, várias enzimas, tais como, porém, não se limitando a, peroxi- dase de rábano silvestre, fosfatase alcalina, beta-galactosidase, ou acetilcolinesterase; grupos prostéticos, tais como, porém, não limita- dos a, estreptavidina/biotina e avidina/biotina; materiais fluorescentes, tais como, porém, não limitados a, umbeliferona, fluoresceína, isotioci- nato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, clo- reto de dansil ou ficoeritrina; materiais luminescentes, tal como, porém, não se limitando a, luminol; materiais bioluminescentes, tal como, po- rém, não se limitando a, luciferase, luciferina e aequorina; material quimioluminescente, tal como, porém, não limitado a, um composto à base de acridínio ou um HALOTAG; materiais radioativos, tais como, porém, não se limitando a, iodo (131l, 1251, 1231, e 1211,), carbono (*“C), enxofre (%?S), trício (?H), índio (“SIn, ln, 12ln, e ln,), tecnécio (Toc), tálio (2ºTi), gálio (Ga, Ga), paládio (*ºPd), molibdênio (ººMo), xenônio (*33Xe), flúor (*SF), *53Sm, “Lu, 15ºGd, 1ººPm, La, 175Yb, 166Ho, 20Y, “Sc, 186Re, 188Re, 142Pr, 105Rh, Ru, Ge, 57Co, Zn, 85Sr, 32P, 153Gqd, 16ººYb, S Cr, Mn, 7ºSe, ***Sn, e */Sn; e metais emis- sores de pósitrons usando várias tomografias de emissão de pósitrons e íons metálicos paramagnéticos não radioativos.
[00258] Também são fornecidos aqui anticorpos que são conjuga- dos ou fundidos de forma recombinante a uma fração terapêutica (ou uma ou mais frações terapêuticas), bem como seus usos. O anticorpo pode ser conjugado ou fundido de forma recombinante a uma fração terapêutica, tal como uma citotoxina, por exemplo, um agente citostáti- co ou citocida, um agente terapêutico ou um íon de metal radioativo, por exemplo, emissores alfa.
Uma citotoxina ou agente citotóxico inclui qualquer agente que seja prejudicial às células.
As porções terapêuti- cas incluem, porém, não estão limitadas a, antimetabólitos (por exem- plo, metotrexato, 6-mercaptopurina, G6-tioguanina, citarabina, 5- fluorouracil decarbazina); agentes de alquilação (por exemplo, meclo- retamina, tioepa clorambucila, melfalana, carmustina (BCNU) e lomus- tina (CCNU), ciclotosfamida, bussulfano, dibromomanitol, estreptozo- tocina, mitomicina C, e cisdiclorodiamina platina (11) (DDP), e cisplati- na); antraciclinas (por exemplo, daunorrubicina (anteriormente dauno- micina) e doxorrubicina); antibióticos (por exemplo, d actinomicina (an- teriormente actinomicina), bleomicina, mitramicina e antramicina (AMC)); Moléculas de auristatina (por exemplo, auristatina PHE, auris- tatina F, monometil auristatina E, briostatina 1 e solastatina 10; veja Woyke et al., Antimicrob.
Agents Chemother. 46:3802-8 (2002), Woyke et al., Antimicrob.
Agents Chemother. 45:3580-4 (2001), Mohammad et al., Anticancer Drugs 12:735-40 (2001), Wall et al., Biochem.
Biophys.
Res.
Commun. 266:76-80 (1999), Mohammad et al., Int.
J.
Oncol. 15:367-72 (1999), todos os quais são aqui incorporados por referên- cia); hormônios (por exemplo, glicocorticoides, progestinas, andróge- nos e estrogênios), inibidores da enzima de reparo de DNA (por exemplo, etoposídeo ou topotecano), inibidores da cinase (por exem- plo, composto ST1571, mesilato de imatinibe (Kantarjian et al., Clin Cancer Res. 8 (7):2167-76 (2002)); agentes citotóxicos (por exemplo, paclitaxel, citocalasina B, gramicidina D, brometo de etídio, emetina, mitomicina, etoposídeo, tenoposídeo, vincristina, vimblastina, colchici- na, doxorrubicina, daunorrubicina, di-hidróxi antracina diona, mitoxan- trona, mitramicina, actinomicina D, 1-desidrotestosterona, glicorticoi-
des, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol e puromicina e seus análogos ou homólogos e aqueles compostos descritos nas Patentes Norte-americana Nos. 6.245.759. 6.399.633. 6.383.790. 6.335.156.
6.271.242. 6.242.196. 6.218.410. 6.218.372. 6.057.300. 6.034.053.
5.985.877. 5.958.769. 5.925.376. 5.922.844. 5.911.995. 5.872.223.
5.863.904. 5.840.745. 5.728.868. 5.648.239. 5.587.459); inibidores da farnesil transferase (por exemplo, R115777, BMS-214662 e aqueles descritos por, por exemplo, Patente Norte-americana Nos: 6.458.935.
6.451.812. 6.440.974. 6.436.960. 6.432.959. 6.420.387. 6.414.145.
6.410.541. 6.410.539. 6.403.581. 6.399.615. 6.387.905. 6.372.747.
6.369.034. 6.362.188. 6.342.765. 6.342.487. 6.300.501. 6.268.363.
6.265.422. 6.248.756. 6.239.140. 6.232.338. 6.228.865. 6.228.856.
6.225.322. 6.218.406. 6.211.193. 6.187.786. 6.169.096. 6.159.984.
6.143.766. 6.133.303. 6.127.366. 6.124.465. 6.124.295. 6.103.723.
6.093.737. 6.090.948. 6.080.870. 6.077.853. 6.071.935. 6.066.738.
6.063.930. 6.054.466. 6.051.582. 6.051.574, e 6.040.305); inibidores da topoisomerase (por exemplo, camptotecina; irinotecano; SN-38; to- potecano; 9-aminocamptotecina; GG-211 (GI 147211); DX-8951f; IST- 622; rubitecano; pirazoloacridina; XR-5000; saintopinay UCE6; UCE1022; TAN-1518A; TAN 1518B; KT6006; KT6528; ED-110; NB- 506; ED-110; NB-506; e rebecamicina); bulgareína; ligantes de sulco menor de DNA, tais como corante Hoescht 33342 e corante Hoechst 33258; nitidina; fagaronina; epiberberina; coralina; beta-lapachona; BC-4-1; bisfosfonatos (por exemplo, alendronato, cimadronte, clodro- nato, tiludronato, etidronato, ibandronato, neridronato, olpandronato, risedronato, piridronato, pamidronato, zolendronato) inibidores de HMG-C0oA redutase, (por exemplo, lovastatina, sinvastatina, atorvasta- tina, pravastatina, fluvastatina, estatina, cerivastatina, lescol, lupitor, rosuvastatina e atorvastatina); oligonucleotídeos antissenso (por exemplo, aqueles descritos nas Patentes Norte-americana Nos.
6.277.832, 5.998.596, 5.885.834, 5.734.033 e 5.618.709); inibidores da adenosina desaminase (por exemplo, Fosfato de fludarabina e 2- Clorodesoxiadenosina); ibritumomabe tiuxetano (ZevalinO); tositu- momabe (BexxarO)) e seus sais, solvatos, clatratos e profármacos farmaceuticamente aceitáveis.
[00259] — Além disso, um anticorpo fornecido neste documento pode ser conjugado ou fundido de forma recombinante a uma porção tera- pêutica ou porção de fármaco que modifica uma determinada resposta biológica. As porções terapêuticas ou porções de fármaco não devem ser interpretadas como limitadas a agentes terapêuticos químicos clássicos. Por exemplo, a porção do fármaco pode ser uma proteína, peptídeo ou polipeptídeo possuindo uma atividade biológica desejada. Tais proteínas podem incluir, por exemplo, uma toxina, tal como abri- na, ricina A, exotoxina de pseudomonas, toxina da cólera ou toxina da difteria; uma proteína como o fator de necrose tumoral, y-interferona, a-interferona, fator de crescimento nervoso, fator de crescimento deri- vado de plaquetas, ativador de plasminogênio tecidual, um agente apoptótico, por exemplo, TNF-y, TNF-y, AIM | (veja, Publicação Inter- nacional No. WO 97/33899), AIM II (veja, Publicação Internacional No. WO 97/34911), Ligante Fas (Takahashi et a/., 1994, J. Immunol,, 6:1567-1574), e VEGF (veja, Publicação Internacional No. WO 99/23105), um agente antiangiogênico, por exemplo, angiostatina, en- dostatina ou um componente da via de coagulação (por exemplo, fator de tecido); ou, um modificador de resposta biológica, como, por exem- plo, uma linfocina (por exemplo, interferon gama, interleucina-1 ("IL- 1"), interleucina-2 ("IL-2"), interleucina-5 ("IL-5 "), interleucina-6 ("IL-6"), interleucina-7 ("IL-7"), interleucina 9 ("IL-9"), interleucina-10 ("IL-10"), interleucina-12 ("IL-12"), interleucina-15 ("IL-15"), interleucina-23 ("IL- 23"), fator estimulador de colônia de granulócitos macrófagos ("GM- CSF") e fator estimulador de colônias de granulócitos ("G -CSF")), ou um fator de crescimento (por exemplo, hormônio do crescimento ("GH")), ou um agente de coagulação (por exemplo, cálcio, vitamina K, fatores de tecido, tais como, porém, não limitados a, fator de Hageman (fator XII) , cininogênio de alto peso molecular (HMWK), pré-calicreína (PK), proteínas-fatores de coagulação Il (protrombina), fator V, Xlla, VIII, Xllla, XI, Xla, IX, IXa, X, fosfolipídeo e monômero de fibrina).
[00260] Também são fornecidos aqui anticorpos que são fundidos de forma recombinante ou conjugados quimicamente (conjugações covalentes ou não covalentes) a uma proteína ou polipeptídeo heteró- logo (ou fragmento deste, por exemplo, a um polipeptídeo de cerca de 10, cerca de 20, cerca de 30, cerca de 40, cerca de 50, cerca de 60, cerca de 70, cerca de 80, cerca de 90 ou cerca de 100 aminoácidos) para gerar proteínas de fusão, bem como seus usos. Em particular, são fornecidas aqui proteínas de fusão compreendendo um fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo fornecido neste documento (por exemplo, um fragmento Fab, fragmento Fd, fragmento Fv, frag- mento F(ab), um domínio VH, uma CDR VH, um domínio VL ou um VL CDR) e uma proteína, polipeptídeo ou peptídeo heterólogo. Em al- gumas modalidades, a proteína, polipeptídeo ou peptídeo heterólogo ao qual o anticorpo é fundido é útil para direcionar o anticorpo a um tipo de célula particular, como uma célula de expressão de PSGL-1 ou VISTA. Por exemplo, um anticorpo que se liga a um receptor de super- fície celular expresso por um determinado tipo de célula (por exemplo, uma célula imune) pode ser fundido ou conjugado a um anticorpo mo- dificado aqui fornecido.
[00261] Além disso, um anticorpo fornecido neste documento pode ser conjugado a frações terapêuticas, como um íon de metal radioati- vo, como emissores alfa, como 2'ºBi ou queladores macrocíclicos úteis para conjugar íons de radiometal, incluindo, porém, não se limitando a, 131/n, 13LU, 131Y, 13Ho, Sm, para polipeptídeos. Em algumas moda-
lidades, o quelador macrocíclico é ácido 1,4,7,10-tetraazaciclodode- cano-N,N',N” N”-tetraacético (DOTA) que pode ser ligado ao anticor- po por meio de uma molécula ligante. Tais moléculas ligantes são co- mumente conhecidas na técnica e descritas em Denardo et a/., 1998, Clin Cancer Res. 4(10):2483-90; Peterson et al/., 1999, Bioconjug. Chem. 10(4):553-7; and Zimmerman et al., 1999, Nucl. Med. Biol. 26(8):943-50, cada qual incorporado por referência em suas totalida- des.
[00262] Além disso, os anticorpos fornecidos neste documento po- dem ser fundidos com sequências marcadoras, como um peptídeo pa- ra facilitar a purificação. Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos do marcador é um peptídeo hexa-histidina, como o mar- cador fornecido em um vetor pQE (QIAGEN, Inc.), entre outros, muitos dos quais estão comercialmente disponíveis. Conforme descrito em Gentz et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824, por exem- plo, hexa-histidina proporciona purificação conveniente da proteína de fusão. Outros marcadores de peptídeo úteis para purificação incluem, porém, não estão limitadas a, marcador de hemaglutinina ("HA"), que corresponde a um epítopo derivado da proteína hemaglutinina da gripe (Wilson et a/., 1984, Cell 37:767), e o marcador "FLAG".
[00263] “Métodos para fundir ou conjugar porções terapêuticas (in- cluindo polipeptídeos) a anticorpos são bem conhecidos, veja, por exemplo, Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer The- rapy, Reisfeld et a/. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hell- strom et al., "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2a Ed.), Robinson et a/. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: À Review", in Monoclonal Antibodies 84: Biological And Clinical Applica- tions, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results,
And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Anti- body In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et a/.(eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985), Thorpe et a/., 1982, Immunol. Rev. 62:119-58; Patentes Norte-americana Nos. 5.336.603. 5.622.929. 5.359.046. 5.349.053. 5.447.851.
5.723.125. 5.783.181. 5.908.626. 5.844.095, e 5.112.946; EP 307.434; EP 367.166; EP 394.827; Publicações PCT WO 91/06570, WO 96/04388, WO 96/22024, WO 97/34631, e WO 99/04813; Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 10535-10539, 1991; Traunecker et al., Nature, 331:84-86, 1988; Zheng et al., J. Immunol., 154:5590-5600, 1995; Vil et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:11337-11341, 1992, que são incorporados neste documento por referência em sua totalidade.
[00264] As proteínas de fusão podem ser geradas, por exemplo, através das técnicas de rearranjo de genes, rearranjo de motivos, rear- ranjo de exon e/ou rearranjo de códons (coletivamente referidos como "rearranjo de DNA"). O rearranjo de DNA pode ser empregado para alterar as atividades dos anticorpos aqui fornecidos (por exemplo, anti- corpos com afinidades mais altas e taxas de dissociação mais baixas). Veja, em geral, a Patentes Norte-americana Nos. 5.605.793,
5.811.238, 5.830.721, 5.834.252 e 5.837.458; Patten et al., 1997, Curr. Opinion Biotechnol. 8:724-33; Harayama, 1998, Trends Biotechnol. 16(2):76-82; Hansson et a/l., 1999, J. Mol. Biol. 287: 265-76; e Lorenzo and Blasco, 1998, Biotechniques 24(2): 308- 313 (cada uma dessas patentes e publicações são aqui incorporadas por referência em sua totalidade). Os anticorpos, ou os anticorpos codificados, podem ser alterados sendo submetidos à mutagênese randomizada por PCR pro- pensa a erros, inserção de nucleotídeos randomizada ou outros méto- dos antes da recombinação. Um polinucleotídeo que codifica um anti- corpo fornecido neste documento pode ser recombinado com um ou mais componentes, motivos, seções, partes, domínios, fragmentos,
etc. de uma ou mais moléculas heterólogas.
[00265] Um anticorpo aqui fornecido também pode ser conjugado a um segundo anticorpo para formar um heteroconjugado de anticorpo como descrito nas Patentes Norte-americana No. 4.676.980, que é in- corporada neste documento por referência em sua totalidade.
[00266] A porção terapêutica ou fármaco conjugado ou fundido de forma recombinante a um anticorpo aqui fornecido que se liga a um PSGL-1 deve ser escolhida para atingir o(s) efeito(s) profilático(s) ou terapêutico(s) desejado(s). Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo modificado. Um clínico ou outro pessoal médico deve considerar o seguinte ao decidir sobre o qual a porção terapêutica ou fármaco para conjugar ou fundir de forma recombinante a um anticor- po aqui descrito: a natureza da doença, a gravidade da doença e a condição do indivíduo.
[00267] Os anticorpos fornecidos neste documento (por exemplo, um anticorpo anti-PSGL-1 ou um anti-VISTA) também podem ser ane- xados a suportes sólidos, que são particularmente úteis para imunoen- saios ou purificação do antígeno alvo. Esses suportes sólidos incluem, porém, não estão limitados a, vidro, celulose, poliacrilamida, náilon, poliestireno, cloreto de polivinila ou polipropileno.
COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS
[00268] As composições farmacêuticas, incluindo formulações tera- pêuticas, contendo um ou mais dos agentes terapêuticos fornecidos neste documento (por exemplo, um agente terapêutico anti-VISTA, tal como um anticorpo anti-VISTA) podem ser preparadas para armaze- namento misturando o anticorpo tendo o desejado grau de pureza com transportadores, excipientes e/ou estabilizadores fisiologicamente aceitáveis opcionais (Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) Mack Publishing Co., Easton, PA), na forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas. Os transportadores, excipientes e/ou estabiliza-
dores aceitáveis não são tóxicos para os receptores nas dosagens e concentrações empregadas e incluem tampões, tais como fosfato, ci- trato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes (tais como cloreto de octadecildimetilbenzil amônio; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio; fenol, álcool butílico ou benzílico; alquil parabenos, tais como metil ou propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclo-hexanol; 3- pentanol; e m-cresol); polipeptídeos de baixo peso molecular (menos de cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como albumina sérica, gelati- na ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tal como polivinilpirro!i- dona; aminoácidos, tal como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidra- tos, incluindo glicose, manose ou dextrinas; agentes queladores tal como EDTA; açúcares tal como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; contraíons formadores de sal, tal como sódio; complexos de metal (por exemplo, complexos Zn-proteína); e/ou tensoativos não iônicos, tal como TWEENTY, PLURONICSY ou polietileno glicol (PEG).
[00269] Os agentes terapêuticos anti-VISTA aqui fornecidos, nota- velmente os anticorpos anti-VISTA, também podem, por exemplo, ser formulados em lipossomas. Os lipossomas contendo a molécula de interesse são preparados por métodos conhecidos na técnica, tais co- mo descritos em Epstein et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688; Hwang et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030; e Patentes Norte-americana Nos. 4.485.045 e 4.544.545. Lipossomas com tempo de circulação realçado são descritos nas Patentes Norte- americana No. 5.013.556.
[00270] —Imunolipossomas particularmente úteis podem ser gerados pelo método de evaporação de fase reversa com uma composição |i- pídica contendo fosfatidilcolina, colesterol e fosfatidiletanolamina deri- vatizada com PEG (PEG-PE). Os lipossomas são extrusados através de filtros de tamanho de poro definido para produzir lipossomas com o diâmetro desejado. Fragmentos Fab' de um anticorpo aqui fornecido podem ser conjugados aos lipossomas, conforme descrito em Martin et al. (1982) J. Biol. Chem. 257:286-288 por meio de uma reação de intercâmbio de dissulfeto. Um agente quimioterapêutico (tal como a Doxorrubicina) está opcionalmente contido no lipossoma; Veja Gabi- zon et al., (1989) J. National Cancer Inst. 81(19):1484.
[00271] As formulações, tais como aquelas aqui descritas, também podem conter mais de um composto ativo conforme necessário para a indicação particular a ser tratada. Em algumas modalidades, as formu- lações compreendem um agente terapêutico anti-VISTA (por exemplo, um anticorpo anti-VISTA) fornecido neste documento e um ou mais compostos ativos com atividades complementares que não afetam ad- versamente uns aos outros. Essas moléculas estão adequadamente presentes em combinação em quantidades que são eficazes para o propósito pretendido. Por exemplo, um anticorpo aqui fornecido pode ser combinado com um ou mais outros agentes terapêuticos. Essa te- rapia combinada pode ser administrada ao paciente em série ou simul- taneamente ou em sequência.
[00272] Um agente terapêutico anti-VISTA fornecido neste docu- mento (por exemplo, um anticorpo anti-VISTA) também pode ser apri- sionado na microcápsula preparada, por exemplo, por técnicas de co- acervação ou por polimerização interfacial, por exemplo, hidroximetil- celulose ou microcápsula de gelatina e poli-(metilmetacilato) microcáp- sula, respectivamente, em sistemas de distribuição de fármacos coloi- dais (por exemplo, lipossomas, microesferas de albumina, microemul- sões, nanopartículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Tais técnicas são descritas em Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) Mack Publishing Co., Easton, PA.
[00273] As formulações a serem utilizadas para administração in vivo podem ser estéreis. Isto é facilmente realizado por filtração atra- vés de, por exemplo, membranas de filtração estéreis.
[00274] As preparações de liberação prolongada também podem ser preparadas. Exemplos adequados de preparações de liberação prolongada incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbi- cos sólidos contendo o polipeptídeo, matrizes essas que estão na for- ma de artigos moldados, por exemplo, filmes ou microcápsulas. Exemplos de matrizes de liberação prolongada incluem poliésteres, hidrogéis (por exemplo, poli(2-hidroxietil-metacrilato) ou álcool polivinií- lico), polilactídeos (Patente Norte-americano No. 3.773.919), copolime- ros de ácido L-glutâmico e etil-L-glutamato, etileno-acetato de vinila não degradável, copolímeros degradáveis de ácido lático-ácido glicóli- co, tals como o LUPRON DEPOT'Y (microesferas injetáveis compostas de copolímero de ácido lático-ácido glicólico e acetato de leuprolida) e ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. Enquanto polímeros co- mo etileno-acetato de vinila e ácido lático-ácido glicólico permitem a liberação de moléculas por mais de 100 dias, certos hidrogéis liberam proteínas por períodos mais curtos. Quando encapsulados, os anticor- pos permanecem no corpo por um longo tempo, eles podem desnatu- rar ou agregar como resultado da exposição à umidade a 37 ºC, resul- tando em uma perda de atividade biológica e possíveis alterações na imunogenicidade. Estratégias racionais podem ser planejadas para estabilização dependendo do mecanismo envolvido. Por exemplo, se for descoberto que o mecanismo de agregação é a formação da liga- ção S-S intermolecular através do intercâmbio tio-dissulfeto, a estabili- zação pode ser alcançada modificando os resíduos de sulfidrila, liofili- zando a partir de soluções ácidas, controlando o teor de umidade, usando aditivos apropriados e desenvolvendo composições matriz de polímero específico.
[00275] Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas fornecidas neste documento contêm quantidades terapeuticamente eficazes de um ou mais dos agentes anti-VISTA terapêuticos forneci- dos neste documento (por exemplo, um anticorpo anti-VISTA) e, opci- onalmente, um ou mais agentes profiláticos adicionais de agentes te- rapêuticos, em um transportador farmaceuticamente aceitável. Essas composições farmacêuticas são úteis na prevenção, tratamento ou alí- vio de um ou mais sintomas de uma doença, distúrbio ou condição mediado por VISTA.
[00276] Os transportadores farmacêuticos adequados para a admi- nistração dos compostos fornecidos neste documento incluem quais- quer desses transportadores conhecidos pelos versados na técnica como sendo adequados para o modo de administração particular.
[00277] Além disso, os agentes terapêuticos anti-VISTA fornecidos neste documento, nomeadamente os anticorpos anti-VISTA, podem ser formulados como o único ingrediente farmaceuticamente ativo na composição ou podem ser combinados com outros ingredientes ativos (tais como um ou mais outros ingredientes profiláticos ou agentes te- rapêuticos).
[00278] As composições podem conter um ou mais anticorpos for- necidos aqui. Em algumas modalidades, os agentes terapêuticos anti- VISTA fornecidos neste documento (por exemplo, anticorpos anti- VISTA) são formulados em preparações farmacêuticas adequadas, tais como soluções, suspensões, comprimidos, comprimidos dispersí- veis, pílulas, cápsulas, pós, formulações de liberação prolongada ou elixires, para administração oral ou em soluções ou suspensões esté- reis para administração parentérica, bem como preparação de emplas- tro transdérmico e inaladores de pó seco. Em algumas modalidades, os agentes terapêuticos anti-VISTA fornecidos neste documento (por exemplo, os anticorpos anti-VISTA) descritos acima são formulados em composições farmacêuticas usando técnicas e procedimentos bem conhecidos na técnica (1985) Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, 4º Ed., p. 126).
[00279] Em algumas modalidades das composições, as concentra- ções eficazes de um ou mais agentes terapêuticos anti-VISTA (por exemplo, um anticorpo anti-VISTA) são misturadas com um transpor- tador farmacêutico adequado. Em algumas modalidades, as concen- trações dos compostos nas composições são eficazes para a distribui- ção de uma quantidade, após a administração, que trata, previne ou melhora uma doença, distúrbio ou condição mediado por VISTA ou sintoma da mesma.
[00280] Em algumas modalidades, as composições são formuladas para administração de dosagem única. Para formular uma composi- ção, a fração em peso do composto é dissolvida, suspensa, dispersa ou de outra forma misturada em um transportador selecionado em uma concentração eficaz de modo que a condição tratada seja alivia- da, prevenida ou um ou mais sintomas sejam melhorados.
[00281] Em algumas modalidades, o agente terapêutico anti-VISTA fornecido neste documento (por exemplo, um anticorpo anti-VISTA) é incluído no transportador farmaceuticamente aceitável em uma quanti- dade eficaz suficiente para exercer um efeito terapeuticamente útil na ausência de efeitos colaterais indesejáveis sobre o paciente tratado. À concentração terapeuticamente eficaz pode ser determinada empiri- camente testando os compostos em sistemas in vitro e in vivo usando métodos de via e, em seguida, extrapolada a partir deles para dosa- gens para humanos.
[00282] A concentração do agente terapêutico anti-VISTA (por exemplo, um anticorpo anti-VISTA) na composição farmacêutica de- penderá, por exemplo, das características físico-químicas do agente terapêutico, do cronograma de dosagem e da quantidade administra- da, bem como de outros fatores conhecidos por aqueles versados na técnica.
[00283] Em algumas modalidades, uma dosagem terapeuticamente eficaz produz uma concentração sérica de agente terapêutico anti- VISTA (por exemplo, um anticorpo anti-VISTA) de cerca de 0,1 ng/ml a cerca de 50-100 pg/ml. As composições farmacêuticas, em outra mo- dalidade, fornecem uma dosagem de cerca de 0,001 mg a cerca de 2000 mg de agente terapêutico (por exemplo, de anticorpo) por quilo- grama de peso corporal por dia. As formas farmacêuticas de dosagem unitária podem ser preparadas para fornecer cerca de 0,01 mg, 0,1 mg ou 1 mg a cerca de 500 mg, 1000 mg ou 2000 mg, e em algumas mo- dalidades de cerca de 10 mg a cerca de 500 mg do agente terapêutico anti-VISTA (por exemplo, um anticorpo anti-VISTA) e/ou uma combi- nação de outros ingredientes essenciais opcionais por forma de dosa- gem unitária.
[00284] O agente terapêutico anti-VISTA (por exemplo, um anticor- po anti-VISTA) pode ser administrado de uma vez ou pode ser dividido em uma série de doses menores a serem administradas em intervalos de tempo. Entende-se que a dosagem precisa e a duração do trata- mento é uma função da doença a ser tratada e pode ser determinada empiricamente usando protocolos de teste conhecidos ou por extrapo- lação de dados de teste in vivo ou in vitro. Deve-se notar que as con- centrações e os valores de dosagem também podem variar com a gra- vidade da condição a ser aliviada. Deve ser ainda compreendido que para qualquer indivíduo em particular, os regimes de dosagem especí- ficos podem ser ajustados ao longo do tempo de acordo com a neces- sidade individual e o julgamento profissional da pessoa que administra ou supervisiona a administração das composições, e que os intervalos de concentração aqui estabelecidos são apenas exemplares e não se destinam a limitar o escopo ou prática das composições reivindicadas.
[00285] Após a mistura ou adição do agente terapêutico anti-VISTA,
a mistura resultante pode ser uma solução, suspensão, emulsão ou similares. A forma da mistura resultante depende de uma série de fato- res, incluindo o modo de administração pretendido e a solubilidade do composto no transportador ou veículo selecionado. A concentração eficaz é suficiente para melhorar os sintomas da doença, distúrbio ou condição tratado e pode ser determinada empiricamente.
[00286] Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas são fornecidas para administração a humanos e animais em formas de dosagem unitária, tais como comprimidos, cápsulas, pílulas, pós, grâ- nulos, soluções ou suspensões parenterais estéreis e soluções ou suspensões orais e emulsões de óleo em água contendo quantidades adequadas dos compostos ou seus derivados farmaceuticamente acei- táveis. O agente terapêutico anti-VISTA (por exemplo, um anticorpo anti-VISTA) é, em algumas modalidades, formulado e administrado em formas de dosagem unitária ou formas de dosagem múltipla. As for- mas de "dose unitária", quando aqui usadas, referem-se a unidades fisicamente discretas adequadas para indivíduos humanos e animais e embaladas individualmente como é conhecido na técnica. Cada dose unitária contém uma quantidade predeterminada do agente terapêutico suficiente para produzir o efeito terapêutico desejado, em associação com o transportador, veículo ou diluente farmacêutico necessário. Exemplos de formas de dosagem unitária incluem ampolas e seringas e comprimidos ou cápsulas embalados individualmente. As formas de dosagem unitária podem ser administradas em frações ou múltiplos das mesmas. Uma forma de "dose múltipla" é uma pluralidade de for- mas de dosagem unitária idênticas embaladas em um único recipiente para serem administradas na forma de dosagem unitária segregada. Exemplos de formas de múltiplas doses incluem frasconetes, frascos de comprimidos ou cápsulas ou frascos de quartilhos ou galões. Por- tanto, a forma de dosagem múltipla é um múltiplo de doses unitárias que não são segregadas na embalagem.
[00287] Em algumas modalidades, um ou mais agentes terapêuti- cos anti-VISTA (por exemplo, um antibiótico anti-VISTA) fornecidos aqui estão em uma formulação farmacêutica líquida. As composições líquidas farmaceuticamente administráveis podem, por exemplo, ser preparadas por dissolução, dispersão ou de outra forma misturando um composto ativo conforme definido acima e adjuvantes farmacêuti- cos opcionais em um transportador, tal como, por exemplo, água, so- lução salina, dextrose aquosa, glicerol, glicois, etanol e similares, para assim formar uma solução ou suspensão. Se desejado, a composição farmacêutica a ser administrada também pode conter pequenas quan- tidades de substâncias auxiliares não tóxicas, como agentes umectan- tes, agentes emulsificantes, agentes solubilizantes, agentes tampo- nantes de pH e similares, por exemplo, acetato, citrato de sódio, deri- vados de ciclodextrina, monolaurato de sorbitano, acetato de trietano- lamina de sódio, oleato de trietanolamina e outros agentes semelhan- tes.
[00288] Os métodos reais de preparação de tais formas de dosa- gem são conhecidos, ou ficarão evidentes, para aqueles versados na técnica; por exemplo, veja, Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) Mack Publishing Co., Easton, PA.
[00289] “Formas de dosagem ou composições contendo um agente terapêutico, especificamente um anticorpo, na faixa de 0,005% a 100% com o equilíbrio constituído de um transportador não tóxico podem ser preparadas. Os métodos de preparação destas composições são co- nhecidos por aqueles versados na técnica.
[00290] As formas de dosagem farmacêutica orais são sólidas, em gel ou líquidas. As formas de dosagem sólidas incluem comprimidos, cápsulas, grânulos e pós a granel. Os tipos de comprimidos orais in- cluem pastilhas para mastigar, prensadas, e comprimidos que podem ser com revestimento entérico, revestido com açúcar ou revestido com película. As cápsulas podem ser cápsulas de gelatina dura ou mole, enquanto os grânulos e os pós podem ser fornecidos na forma não efervescente ou efervescente com a combinação de outros ingredien- tes conhecidos por aqueles versados na técnica.
[00291] Em algumas modalidades, as formulações são formas de dosagem sólidas. Em algumas modalidades, as formulações são cáp- sulas ou comprimidos. Os comprimidos, pílulas, cápsulas, trociscos e similares podem conter um ou mais dos seguintes ingredientes, ou compostos de natureza similar: um aglutinante; um lubrificante; um di- luente; um deslizante; um agente desintegrante; um agente corante; um adoçante; um agente aromatizante; um agente umectante; um re- vestimento emético; e um revestimento de filme. Exemplos de ligantes incluem celulose microcristalina, goma tragacanto, solução de glicose, mucilagem de acácia, solução de gelatina, melaço, polvinilpirrolidina, povidona, crospovidonas, sacarose e pasta de amido. Lubrificantes incluem talco, amido, estearato de magnésio ou cálcio, licopódio e áci- do esteárico. Os diluentes incluem, por exemplo, lactose, sacarose, amido, caulim, sal, manitol e fosfato dicálcico. Os deslizantes incluem, porém, não estão limitados a, dióxido de silício coloidal. Os agentes desintegrantes incluem croscarmelose sódica, amido glicolato de só- dio, ácido algínico, amido de milho, amido de batata, bentonita, metil- celulose, ágar e carboximetilcelulose. Os agentes corantes incluem, por exemplo, qualquer um dos corantes FD e C solúveis em água cer- tificados e aprovados, suas misturas; e corantes FD e C insolúveis em água suspensos em hidrato de alumina. Os agentes adoçantes inclu- em sacarose, lactose, manitol e agentes adoçantes artificiais, tal como sacarina e qualquer número de sabores secos por spray. Os agentes aromatizantes incluem sabores naturais extraídos de plantas, como frutas e misturas sintéticas de compostos que produzem uma sensa-
ção agradável, como, porém, não se limitando a, hortelã-pimenta e sa- licilato de metila. Os agentes umectantes incluem monoestearato de propileno glicol, mono-oleato de sorbitano, monolaurato de dietileno glicol e laural éter de polioxietileno. Os revestimentos eméticos inclu- em ácidos graxos, gorduras, ceras, goma-laca, goma laca amoníaca e ftalatos de acetato de celulose. Os revestimentos de filme incluem hi- droxietilcelulose, carboximetilcelulose de sódio, polietileno glicol 4000 e acetato ftalato de celulose.
[00292] Os agentes terapêuticos anti-VISTA (por exemplo, anticor- pos anti-VISTA) fornecidos neste documento podem ser fornecidos em uma composição que os protege do ambiente ácido do estômago. Por exemplo, a composição pode ser formulada em um revestimento enté- rico que mantém sua integridade no estômago e libera o composto ati- vo no intestino. A composição também pode ser formulada em combi- nação com um antiácido ou outro ingrediente.
[00293] “Quando a forma unitária de dosagem é uma cápsula, pode conter, além do material do tipo acima, um veículo líquido, como um óleo graxo. Além disso, as formas unitárias de dosagem podem conter vários outros materiais que modificam a forma física da dosagem uni- tária, por exemplo, revestimentos de açúcar e outros agentes entéri- cos. Os compostos também podem ser administrados como um com- ponente de um elixir, suspensão, xarope, bolacha, polvilho, goma de mascar ou similares. Um xarope pode conter, além dos compostos ati- VOS, Sacarose como agente edulcorante e certos conservantes, coran- tes e sabores.
[00294] O agente terapêutico também pode ser misturado com ou- tros materiais ativos que não prejudicam a ação desejada, ou com ma- teriais que complementam a ação desejada, tais como antiácidos, blo- queadores de H2 e diuréticos. O ingrediente ativo é um agente tera- pêutico anti-VISTA, notavelmente um anticorpo, ou seu derivado far-
maceuticamente aceitável, conforme descrito neste documento. Po- dem ser incluídas concentrações mais elevadas, até cerca de 98% em peso do ingrediente ativo.
[00295] Em algumas modalidades, as formulações de comprimidos e cápsulas podem ser revestidas conforme conhecido por aqueles ver- sados na técnica a fim de modificar ou manter a dissolução do ingredi- ente ativo. Assim, por exemplo, podem ser revestidos com um reves- timento convencional entericamente digerível, tal como fenilsalicilato, ceras e acetato ftalato de celulose.
[00296] Em algumas modalidades, as formulações são formas de dosagem líquidas. As formas de dosagem oral líquidas incluem solu- ções aquosas, emulsões, suspensões, soluções e/ou suspensões re- constituídas a partir de grânulos não efervescentes e preparações efervescentes reconstituídas a partir de grânulos efervescentes. As soluções aquosas incluem, por exemplo, elixires e xaropes. As emul- sões são óleo-em-água ou água-em-óleo.
[00297] Os elixires são preparações hidroalcoólicas transparentes, adoçadas. Os transportadores farmaceuticamente aceitáveis usados em elixires incluem solventes. Os xaropes são soluções aquosas con- centradas de um açúcar, por exemplo, sacarose, e podem conter um conservante. Uma emulsão é um sistema de duas fases em que um líquido é disperso na forma de pequenos glóbulos em outro líquido. Os tranportadores farmaceuticamente aceitáveis usados em emulsões são líquidos não aquosos, agentes emulsificantes e conservantes. As suspensões usam agentes de suspensão e conservantes farmaceuti- camente aceitáveis. As substâncias farmaceuticamente aceitáveis usadas em grânulos não efervescentes, para serem reconstituídos em uma forma de dosagem oral líquida, incluem diluentes, adoçantes e agentes umectantes. As substâncias farmaceuticamente aceitáveis usadas em grânulos efervescentes, para serem reconstituídos em uma forma de dosagem oral líquida, incluem ácidos orgânicos e uma fonte de dióxido de carbono. Os agentes corantes e aromatizantes são usa- dos em todas as formas de dosagem acima.
[00298] Os solventes incluem glicerina, sorbitol, álcool etílico e xa- rope. Exemplos de conservantes incluem glicerina, metil e propilpara- beno, ácido benzoico, benzoato de sódio e álcool. Exemplos de líqui- dos não aquosos utilizados em emulsões incluem óleo mineral e óleo de caroço de algodão. Exemplos de agentes emulsificantes incluem gelatina, goma arábica, tragacanto, bentonita e tensoativos, tais como monooleato de polioxietileno sorbitano. Os agentes de suspensão in- cluem carboximetilcelulose de sódio, pectina, tragacanto, Veegum e acácia. Os agentes adoçantes incluem sacarose, xaropes, glicerina e adoçantes artificiais, como a sacarina. Os agentes umectantes incluem monoestearato de propileno glicol, monooleato de sorbitano, monolau- rato de dietileno glicol e éter laurílico de polioxietileno. Os ácidos orgâà- nicos incluem o ácido cítrico e o tartárico. As fontes de dióxido de car- bono incluem bicarbonato de sódio e carbonato de sódio. Os agentes corantes incluem qualquer um dos corantes FD e C solúveis em água certificados e aprovados, e suas misturas. Os agentes aromatizantes incluem sabores naturais extraídos de plantas, como frutas, e combi- nações sintéticas de compostos que produzem uma sensação de sa- bor agradável.
[00299] Para uma forma de dosagem sólida, a solução ou suspen- são, por exemplo, carbonato de propileno, óleos vegetais ou triglicerí- deos, é, em algumas modalidades, encapsulada em uma cápsula de gelatina. Tais soluções, e a preparação e encapsulação das mesmas, são descritas nas Patentes Norte-americana Nos. 4.328.245;
4.409.239; e 4.410.545. Para uma forma de dosagem líquida, a solu- ção, por exemplo, em um polietileno glicol, pode ser diluída com uma quantidade suficiente de um transportador líquido farmaceuticamente aceitável, por exemplo, água, para ser facilmente medida para admi- nistração.
[00300] Alternativamente, formulações orais líquidas ou semissóli- das podem ser preparadas dissolvendo ou dispersando o composto ativo ou sal em óleos vegetais, glicóis, triglicerídeos, ésteres de propi- leno glicol (por exemplo, carbonato de propileno) e outros transporta- dores, e encapsulando essas soluções ou suspensões em invólucros de cápsulas de gelatina dura ou mole. Outras formulações úteis inclu- em aquelas estabelecidas nas Patentes Norte-americana Nos. RE28.819 e 4.358.603. Resumidamente, tais formulações incluem, po- rém, não estão limitadas àquelas que contêm um composto fornecido neste documento, um mono- ou poli-alquileno glicol dialquilado, inclu- indo, porém, não se limitando a, 1,2-dimetoximetano, diglima, triglima, tetraglima, polietileno glicol-350-dimetil éter, polietileno glicol-550- dimetil éter, polietileno glicol-750-dimetil éter em que 350, 550 e 750 se referem ao peso molecular médio aproximado do polietileno glicol e um ou mais antioxidantes, como hidroxitolueno butilado (BHT), hidro- xianisol butilado (BHA), galato de propila, vitamina E, hidroquinona, hidroxicumarinas, etanolamina, lecitina, cefalina, ácido ascórbico, áci- do málico, sorbitol, ácido fosfórico, ácido tiodipropiônico e seus ésteres e ditiocarbamatos.
[00301] Outras formulações incluem, porém, não estão limitadas a soluções alcoólicas aquosas incluindo um acetal farmaceuticamente aceitável. Os alcoóis usados nestas formulações são quaisquer sol- ventes miscíveis em água farmaceuticamente aceitáveis com um ou mais grupos hidroxila, incluindo, porém, não se limitando a, propileno glicol e etanol. Os acetais incluem, porém, não estão limitados a, di(alquila inferior)acetais de alquil aldeídos inferiores, tais como ace- taldeído dietil acetal.
[00302] A administração parenteral, em algumas modalidades, é caracterizada por injeção, seja por via subcutânea, intramuscular, in- tratumoral ou intravenosa, também é contemplada neste documento. Os injetáveis podem ser preparados em formas convencionais, como soluções ou suspensões líquidas, formas sólidas adequadas para so- lução ou suspensão em líquido antes da injeção, ou como emulsões. Os injetáveis, soluções e emulsões também contêm um ou mais exci- pientes. Os excipientes adequados são, por exemplo, água, solução salina, dextrose, glicerol ou etanol. Além disso, se desejado, as com- posições farmacêuticas a serem administradas também podem conter pequenas quantidades de substâncias auxiliares não tóxicas, como agentes umectantes ou emulsificantes, agentes tamponantes de pH, estabilizadores, realçadores de solubilidade e outros agentes, como por exemplo, acetato de sódio, monolaurato de sorbitano, oleato de trietanolamina e ciclodextrinas.
[00303] A implantação de um sistema de liberação lenta ou de libe- ração prolongada, de modo que um nível constante de dosagem seja mantido (veja, por exemplo, Patente Norte-americana No. 3.710.795) também está contemplada neste documento. Resumidamente, um composto fornecido neste documento é disperso em uma matriz inter- na sólida, por exemplo, polimetilmetacrilato, polibutilmetacrilato, cloreto de polivinila plastificado ou não plastificado, náilon plastificado, terefta- lato de polietileno plastificado, borracha natural, poli-isopreno, poli- isobutileno, polibutadieno, polietileno, copolímeros de etileno-acetato de vinila, borrachas de silicone, polidimetilsiloxanos, copolímeros de carbonato de silicone, polímeros hidrofílicos, tais como hidrogéis de ésteres de ácido acrílico e metacrílico, colágeno, álcool polivinílico reti- culado e acetato de polivinila parcialmente hidrolisado reticulado, que é cercado por uma membrana polimérica externa, por exemplo, polieti- leno, polipropileno, copolímeros de etileno/propileno, copolímeros de etileno/acrilato de etila, copolímeros de etileno/acetato de vinila, borra-
chas de silicone, polidimetil siloxanos, borracha de neoprene, polietile- no clorado, cloreto de polivinila, copolímeros de cloreto de vinila com acetato de vinila, cloreto de vinilideno, etileno e propileno, tereftalato de polietileno de ionômero, borrachas de epicloro-hidrina de borracha butílica, copolímero de etileno/álcool vinílico, terpolímero de etile- no/acetato de vinila/álcool vinílico e copolímero de etileno/viniloxieta- nol, que é insolúvel em fluidos corporais. O agente terapêutico (por exemplo, um anticorpo) se difunde através da membrana polimérica externa em uma etapa de controle da taxa de liberação. A quantidade de agente terapêutico contido em tais composições parenterais é al- tamente dependente da sua natureza específica, bem como da ativi- dade do composto e das necessidades do indivíduo.
[00304] As preparações para administração parenteral incluem so- luções estéreis prontas para injeção, produtos solúveis secos estéreis, como pós liofilizados, prontos para serem combinados com um solven- te imediatamente antes do uso, incluindo comprimidos hipodérmicos, suspensões estéreis prontas para injeção, produtos insolúveis secos estéreis prontos para serem combinados com um veículo imediata- mente antes do uso e emulsões estéreis. As soluções podem ser aquosas ou não aquosas.
[00305] Se administrados por via intravenosa, os transportadores adequados incluem solução salina fisiológica ou solução salina tampo- nada com fosfato (PBS) e soluções contendo agentes espessantes e solubilizantes, tais como glicose, polietileno glicol e polipropileno glicol e suas misturas.
[00306] Os transportadores farmaceuticamente aceitáveis usados em preparações parenterais incluem veículos aquosos, veículos não aquosos, agentes antimicrobianos, agentes isotônicos, tampões, anti- oxidantes, anestésicos locais, agentes de suspensão e dispersão, agentes emulsificantes, agentes sequestrantes ou quelantes e outras substâncias farmaceuticamente aceitáveis.
[00307] “Exemplos de veículos aquosos incluem Injeção de Cloreto de Sódio, Injeção de Ringers, Injeção Isotônica de Dextrose, Injeção de Água Estéril, Injeção de Dextrose e de Ringer Lactado. Os veículos parenterais não aquosos incluem óleos fixos de origem vegetal, óleo de caroço de algodão, óleo de milho, óleo de gergelim e óleo de amendoim. Os agentes antimicrobianos em concentrações bacteriostá- ticas ou fungistáticas podem ser adicionados a preparações parente- rais embaladas em recipientes de múltiplas doses que incluem fenóis ou cresóis, mercuriais, álcool benzílico, clorobutanol, ésteres do ácido metil e propil p-hidroxibenzoico, timerosal, cloreto de benzalcônio e cloreto de benzetônio. Os agentes isotônicos incluem cloreto de sódio e dextrose. Os tampões incluem fosfato e citrato. Os antioxidantes in- cluem bissulfato de sódio. Os anestésicos locais incluem cloridrato de procaína. Os agentes de suspensão e dispersão incluem carboximetil- celulose de sódio, hidroxipropil metilcelulose e polivinilpirrolidona. Os agentes emulsificantes incluem Polissorbato 80 (TWEENG 80). Um agente sequestrante ou quelante de íons metálicos inclui EDTA. Os transportadores farmacêuticos também incluem álcool etílico, polietile- no glicol e propileno glicol para veículos miscíveis em água; e hidróxi- do de sódio, ácido clorídrico, ácido cítrico ou ácido lático para ajuste de pH.
[00308] A concentração do agente terapêutico anti-VISTA farma- ceuticamente ativo (por exemplo, um anticorpo anti-VISTA) é ajustada de modo que uma injeção forneça uma quantidade eficaz para produ- zir o efeito farmacológico desejado. A dose exata depende da idade, peso e condição do paciente ou animal como é conhecido na técnica.
[00309] As preparações parentéricas de dose unitária podem ser embaladas em uma ampola, um frasconete ou uma seringa com uma agulha. Todas as preparações para administração parentérica podem ser estéreis, como é conhecido e praticado na técnica.
[00310] llustrativamente, a infusão intravenosa ou intra-arterial de uma solução aquosa estéril contendo um composto ativo é um modo de administração eficaz. Outra modalidade é uma solução ou suspen- são aquosa ou oleosa estéril contendo um material ativo injetado con- forme necessário para produzir o efeito farmacológico desejado.
[00311] Os injetáveis são projetados para administração local e sis- têmica. Em algumas modalidades, uma dosagem terapeuticamente eficaz é formulada para conter uma concentração de pelo menos cerca de 0,1% em p/p até cerca de 90% em p/p ou mais, em algumas moda- lidades mais do que 1% em p/p do composto ativo para o(s) tecido(s) tratado(s).
[00312] O agente terapêutico, como um anticorpo, pode ser sus- penso em forma micronizada ou outra forma adequada. A forma da mistura resultante depende de uma série de fatores, incluindo o modo de administração pretendido e a solubilidade do composto no transpor- tador ou veículo selecionado. A concentração eficaz é suficiente para melhorar os sintomas de uma doença, distúrbio ou condição mediado por VISTA e pode ser determinada empiricamente.
[00313] Em algumas modalidades, as formulações farmacêuticas são pós liofilizados, que podem ser reconstituídos para administração como soluções, emulsões e outras misturas. Eles também podem ser reconstituídos e formulados como sólidos ou géis.
[00314] O pó liofiizado é preparado por dissolução de um agente terapêutico, tal como um anticorpo, fornecido neste documento, ou um derivado farmaceuticamente aceitável do mesmo, em um solvente adequado. Em algumas modalidades, o pó liofilizado é estéril. O sol- vente pode conter um excipiente que melhora a estabilidade ou outro componente farmacológico do pó ou solução reconstituída, preparada a partir do pó. Excipientes que podem ser usados incluem, porém, não estão limitados a, dextrose, sorbitol, frutose, xarope de milho, xilitol, glicerina, glicose, sacarose ou qualquer outro agente adequado. O sol- vente também pode conter um tampão, tal como citrato, fosfato de só- dio ou potássio ou outro tampão conhecido por aqueles versados na técnica em, em algumas modalidades, pH neutro. A filtração estéril subsequente da solução seguida por liofilização sob condições padrão conhecidas por aqueles versados na técnica fornece a formulação de- sejada. Em algumas modalidades, a solução resultante será distribuí- da em frasconetes para liofilização. Cada frasconete conterá uma do- sagem única ou dosagens múltiplas do composto. O pó liofilizado pode ser armazenado em condições apropriadas, como a cerca de 4 ºC até a temperatura ambiente.
[00315] A reconstituição deste pó liofilizado com água para injeção fornece uma formulação para uso em administração parenteral. Para reconstituição, o pó liofilizado é adicionado em água estéril ou em qualquer outro transportador adequado. A quantidade precisa depende do composto selecionado. Essa qunatidade pode ser determinada em- piricamente.
[00316] As misturas tópicas são preparadas conforme descrito para a administração local e sistêmica. A mistura resultante pode ser uma solução, suspensão, emulsões ou similares e pode ser formulada co- mo cremes, géis, pomadas, emulsões, soluções, elixires, loções, sus- pensões, tinturas, pastas, espumas, aerossois, irrigações, sprays, su- positórios, bandagens, emplastros dérmicos ou quaisquer outras for- mulações adequadas para administração tópica.
[00317] Os agentes terapêuticos fornecidos neste documento po- dem ser formulados como aerossois para aplicação tópica, tal como por inalação (veja, por exemplo, Patentes Norte-americanas Nos.
4.044.126, 4.414.209 e 4.364.923, que descrevem aerossois para dis- tribuição de um esteroide útil para o tratamento de doenças inflamató-
rias, particularmente asma). Estas formulações para administração ao trato respiratório podem estar na forma de um aerossol ou solução pa- ra um nebulizador, ou como um pó microfino para insuflações, sozi- nhas ou em combinação com um transportador inerte como a lactose. Nesse caso, as partículas da formulação terão, em algumas modalida- des, diâmetros inferiores a 50 mícrons, em algumas modalidades, me- nos de 10 mícrons.
[00318] Os agentes terapêuticos podem ser formulados para apli- cação local ou tópica, como para aplicação tópica na pele e nas mem- branas mucosas, como nos olhos, na forma de géis, cremes e loções e para aplicação no olho ou para aplicação intracisternal ou intraespi- nhal. A administração tópica é contemplada para distribuição trans- dérmica e também para administração aos olhos ou mucosa, ou para terapias de inalação. Soluções nasais do composto ativo sozinho ou em combinação com outros excipientes farmaceuticamente aceitáveis também podem ser administradas.
[00319] Estas soluções, particularmente aquelas destinadas ao uso oftálmico, podem ser formuladas como soluções isotônicas 0,01% - 10%, pH cerca de 5-7, com sais apropriados.
[00320] Outras vias de administração, tais como emplastros trans- dérmicos, incluindo dispositivos iontoforéticos e eletroforéticos e admi- nistração retal, também são contempladas aqui.
[00321] Os adesivos transdérmicos, incluindo dispositivos iotoforéti- cos e eletroforéticos, são bem conhecidos por aqueles versados na técnica. Por exemplo, tais emplastros são descritos nas Patentes Nor- te-americana Nos. 6.267.983. 6.261.595. 6.256.533. 6.167.301.
6.024.975. 6.010715. 5.985.317. 5.983.134. 5.948.433, e 5.860.957.
[00322] As formas de dosagem farmacêutica para administração retal são supositórios retais, cápsulas e comprimidos para efeito sis- têmico. Supositórios retais são usados aqui para significar corpos sóli-
dos para inserção no reto que derretem ou amolecem à temperatura corporal liberando um ou mais ingredientes farmacologicamente ou terapeuticamente ativos. As substâncias farmaceuticamente aceitáveis utilizadas em supositórios retais são bases ou veículos e agentes para realçar o ponto de fusão. Exemplos de bases incluem manteiga de ca- cau (óleo de teobroma), glicerina-gelatina, carbocera (polioxietileno glicol) e misturas apropriadas de mono-, di- e triglicerídeos de ácidos graxos. Podem ser utilizadas combinações das várias bases. Os agen- tes para realçar o ponto de fusão dos supositórios incluem espermace- te e cera. Os supositórios retais podem ser preparados pelo método de compressão ou por moldagem. O peso de um supositório retal, em al- gumas modalidades, é de cerca de 2a 39.
[00323] Os comprimidos e cápsulas para administração retal podem ser fabricados usando a mesma substância farmaceuticamente aceitá- vel e pelos mesmos métodos que para as formulações para adminis- tração oral.
[00324] Os agentes terapêuticos (por exemplo, anticorpos) e outras composições aqui fornecidas também podem ser formulados para se- rem direcionados a um determinado tecido, receptor ou outra área do corpo do indivíduo a ser tratado. Muitos desses métodos de direcio- namento são bem conhecidos por aqueles versados na técnica. Todos esses métodos de direcionamento são contemplados neste documento para uso nas presentes composições. Para exemplos não limitantes de métodos de direcionamento, veja, por exemplo, Patentes Norte- americana Nos. 6.316.652. 6.274.552. 6.271.359. 6.253.872. 6.139.865.
6.131.570. 6.120.751. 6.071.495. 6.060.082. 6.048.736. 6.039.975.
6.004.534. 5.985.307. 5.972.366. 5.900.252. 5.840.674. 5.759.542 e
5.709.874.
[00325] Em algumas modalidades, as suspensões lipossomais, in- cluindo lipossomas direcionados a tecidos, tais como lipossomas dire-
cionados a tumores, também podem ser adequadas como transporta- dores farmaceuticamente aceitáveis. Estes podem ser preparados de acordo com métodos conhecidos por aqueles versados na técnica. Por exemplo, as formulações de lipossomas podem ser preparadas como descrito na Patente Norte-americana No. 4.522.811. Resumidamente, OS lipossomas, tais como vesículas multilamelares (MLV's) podem ser formados por secagem de fosfatidil colina de ovo e fosfatidil serina ce- rebral (relação molar de 7:3) no interior de um frasco. Uma solução de um composto aqui fornecido em solução salina tamponada com fosfato sem cátions divalentes (PBS) é adicionada e o frasco é agitado até que o filme de lipídeo seja disperso. As vesículas resultantes são lava- das para remover o composto não encapsulado, precipitado por centri- fugação e, em seguida, ressuspensas em PBS. MÉTODOS DE TRATAMENTO, PREVENÇÃO E/OU ALÍVIO
[00326] Em outro aspecto, a presente invenção também se refere a um agente terapêutico anti-VISTA (por exemplo, um anticorpo anti- VISTA) para uso no tratamento de uma doença, distúrbio ou condição mediado por VISTA em um paciente. É fornecida aqui uma terapia an- ti-VISTA (por exemplo, um anticorpo anti-VISTA) aqui fornecida para uso na prevenção, tratamento e/ou alívio de um ou mais sintomas de uma doença, distúrbio ou condição, como uma doença mediada por VISTA, distúrbio ou condição, notavelmente um câncer mediado por VISTA. Vantajosamente, a referida doença, distúrbio ou condição me- diado por VISTA foi previamente detectada ou diagnosticada por um dos métodos aqui fornecidos.
[00327] Em uma modalidade, a presente invenção refere-se a um agente terapêutico anti-VISTA (por exemplo, um anticorpo anti-VISTA) para uso no tratamento de uma doença, distúrbio ou condição media- do por VISTA em um paciente, em que a referida doença, distúrbio ou condição mediado por VISTA, foi previamente detectado ou diagnosti-
cado por um dos métodos aqui fornecidos. Em outras palavras, a in- venção se refere, portanto, a um agente terapêutico anti-VISTA para tratar uma doença, distúrbio ou condição mediado por VISTA em um paciente, em que o agente terapêutico anti-VISTA é administrado a um paciente que foi diagnosticado com uma doença, distúrbio ou condição mediado por VISTA por um método descrito acima.
[00328] Em algumas modalidades, são fornecidas aqui composi- ções compreendendo um ou mais anticorpos (por exemplo, um anti- corpo anti-VISTA) aqui fornecidas para uso no controle, prevenção ou tratamento de uma doença, distúrbio ou condição mediado por VISTA e/ou o alívio de um ou mais sintomas de uma doença, distúrbio ou condição mediado por VISTA. Doenças, distúrbios ou condições medi- adas por VISTA exemplares incluem um distúrbio proliferativo celular, tumor e doença do enxerto versus hospedeiro (GVHD) ou um sintoma dos mesmos. Preferivelmente, a referida doença, distúrbio ou condição mediado por VISTA é um câncer.
[00329] É, portanto, aqui fornecido um agente terapêutico anti- VISTA (por exemplo, um anticorpo anti-VISTA) para uso no tratamento de um câncer mediado por VISTA em um paciente, o referido uso compreendendo: a) contatar uma amostra biológica do referido indivíduo com um reagente capaz de se ligar especificamente ao ácido nucleico ou proteína PSGL-1; e b) quantificar a ligação do referido reagente à referida amostra biológica, determinando assim o nível de expressão de PSGL- 1 na referida amostra.
[00330] De acordo com uma modalidade preferida, o presente uso compreende ainda uma etapa de classificação do tumor comparando o nível de expressão de PSGL-1 na amostra biológica do indivíduo (por exemplo, por infiltrados imunes de um microambiente tumoral) a uma escala apropriada com base em dois parâmetros que são a intensida- de da coloração e a porcentagem de células positivas.
[00331] Em outra modalidade, a presente invenção refere-se a um agente terapêutico anti-VISTA (por exemplo, um anticorpo anti-VISTA) para uso no tratamento de um câncer mediado por VISTA em um pa- ciente, em que o referido uso compreende a determinação prévia do status de PSGL-1 do referido tumor, conforme descrito acima. De acordo com esta modalidade, um tumor que é [PSGL-1 (+)] é indicativo de um câncer mediado por VISTA e está, portanto, suscetível a res- ponder ao tratamento com um agente terapêutico anti-VISTA (por exemplo, um anticorpo anti-VISTA).
[00332] De acordo com outra modalidade preferida, o presente uso compreende ainda comparar o nível de expressão de PSGL-1 na amostra biológica do indivíduo (por exemplo, por infiltrados imunes de um microambiente tumoral) com um nível de referência.
[00333] De acordo com esta modalidade preferida, o agente tera- pêutico anti-VISTA (por exemplo, um anticorpo anti-VISTA) é para uso no tratamento de um câncer mediado por VISTA em um paciente, o referido uso compreendendo: a) determinar o nível de expressão de PSGL-1 em uma amostra biológica do referido indivíduo, por exemplo, por infiltrados imunes de um microambiente tumoral na referida amostra biológica; b) comparar o nível de expressão da etapa a) com um nível de referência; e c) determinar um câncer mediado por VISTA quando o nível de expressão da etapa a) é maior do que o nível de referência.
[00334] De acordo com outra modalidade preferida, o agente tera- pêutico anti-VISTA (por exemplo, um anticorpo anti-VISTA) é para uso no tratamento de um câncer mediado por VISTA em um paciente, o referido uso compreendendo:
a) determinar o nível de expressão de PSGL-1 em uma amostra biológica do referido indivíduo, por exemplo, por infiltrados imunes de um microambiente tumoral na referida amostra biológica; b) comparar o nível de expressão da etapa a) com um nível de referência; e c) diagnosticar um câncer mediado por VISTA quando o nível de expressão da etapa a) é superior ao nível de referência.
[00335] Vantajosamente, o método da invenção compreende am- bas as etapas de: e classificar o tumor comparando o nível de expressão de PSGL-1 na amostra biológica do indivíduo (por exemplo, por infiltrados imunes de um microambiente tumoral) a uma escala apropriada com base em dois parâmetros que são a intensidade da coloração e a por- centagem de células positivas ; e e comparar o nível de expressão de PSGL-1 na amostra bio- lógica do indivíduo (por exemplo, por infiltrados imunes de um micro- ambiente tumoral) com um nível de referência.
[00336] Vantajosamente, o uso acima do agente terapêutico anti- VISTA compreenderá ainda a determinação do nível de expressão de pelo menos um dentre VISTA, CD11b, CD33, CD4 e CD8, conforme detalhado acima. Em tais casos, um nível de expressão de PSGL-1 e pelo menos um dentre VISTA, CD11b, CD33, CD4 e CDB8, ou os níveis de expressão relativos dos mesmos, mais alto do que o nível de refe- rência indica um câncer mediado por VISTA.
[00337] De acordo com outra modalidade, a invenção é direcionada para um agente terapêutico anti-VISTA (por exemplo, um anticorpo anti-VISTA) para uso no tratamento de um câncer mediado por VISTA em um paciente, o referido uso compreendendo: a) contatar uma amostra biológica do referido indivíduo com um reagente capaz de se ligar especificamente ao ácido nucleico ou proteína PSGL-1; e b) quantificar a ligação do referido reagente à referida amostra biológica, determinando assim o nível de expressão de PSGL- 1 na referida amostra; e c) adaptar o tratamento do agente terapêutico anti-VISTA com base no nível da etapa a).
[00338] De acordo com uma modalidade preferida, o presente uso compreende ainda uma etapa de classificação do tumor comparando o nível de expressão de PSGL-1 na amostra biológica do indivíduo (por exemplo, por infiltrados imunes de um microambiente tumoral) a uma escala apropriada com base em dois parâmetros que são a intensida- de da coloração e a porcentagem de células positivas.
[00339] Em outra modalidade, a presente invenção refere-se a um agente terapêutico anti-VISTA (por exemplo, um anticorpo anti-VISTA) para uso no tratamento de um câncer mediado por VISTA em um pa- ciente, em que o referido uso compreende a determinação prévia do status de PSGL-1 do referido tumor, conforme descrito acima. De acordo com esta modalidade, um tumor que é [PSGL-1 (+)] é indicativo de um câncer mediado por VISTA e está, portanto, suscetível a res- ponder ao tratamento com um agente terapêutico anti-VISTA (por exemplo, um anticorpo anti-VISTA).
[00340] De acordo com outra modalidade preferida, o presente uso compreende ainda comparar o nível de expressão de PSGL-1 na amostra biológica do indivíduo (por exemplo, por infiltrados imunes de um microambiente tumoral) com um nível de referência.
[00341] A referida adaptação do tratamento com agente terapêutico anti-VISTA pode consistir em: - uma redução ou supressão do referido tratamento com agente terapêutico anti-VISTA se o paciente tiver sido diagnosticado como não respondendo ao agente terapêutico anti-VISTA, ou
- a continuação do referido tratamento com agente terapêu- tico anti-VISTA se o paciente tiver sido diagnosticado como respon- dendo ao agente terapêutico anti-VISTA.
[00342] Um paciente está respondendo ao referido tratamento se houver uma diferença na expressão de PSGL-1 entre o nível de ex- pressão da etapa a) e o nível de referência. Por exemplo, uma diferen- ça da expressão de PSGL-1 entre o nível de expressão da etapa a) e o nível de expressão de PSGL-1 em uma segunda amostra biológica do paciente obtida antes de ser tratado indica se o referido paciente está respondendo ao referido tratamento. Vantajosamente, um nível mais alto de expressão de PSGL-1 na etapa a) em comparação com o nível de expressão de PSGL-1 em uma segunda amostra biológica do paciente obtida antes de ser tratado indica que o referido paciente está respondendo ao referido tratamento.
[00343] Em algumas modalidades, o uso acima compreende a de- terminação do nível de expressão de pelo menos um dentre VISTA, CD11b, CD33, CD4 e CD8, além de PSGL-1 e comparação do nível de expressão de PSGL-1 e pelo menos um dentre VISTA, CD11b, CD33, CD4 e CDB8, ou os níveis de expressão relativos dos mesmos, na primeira amostra biológica com o nível de expressão de PSGL-1 e pelo menos um dentre VISTA, CD11b, CD33, CD4 e CDB8, ou os níveis de expressão relativos dos mesmos, em uma segunda amostra bioló- gica do paciente obtida antes de ser tratado. Neste caso, um nível dife- rencial de expressão ou níveis de expressão relativos de PSGL-1 e pelo menos um dentre VISTA, CD11b, CD33, CD4 e CD8 na primeira amostra biológica em comparação com o nível de expressão ou níveis de expressão relativos de PSGL-1 e pelo menos um dentre VISTA, CD11b, CD33, CD4 e CD8 na segunda amostra biológica indica que o paciente está respondendo ao tratamento.
[00344] Em alguns aspectos deste método, o tratamento inclui a administração de um anticorpo anti-VISTA e/ou um anticorpo anti- PSGL-1 como aqui descrito.
[00345] Em alguns aspectos, o método inclui em que a primeira amostra biológica compreende infiltrados imunes de um microambien- te tumoral.
[00346] Em algumas modalidades, são fornecidos aqui métodos para prevenir ou tratar uma doença, distúrbio ou condição aqui descri- tos pela administração a um indivíduo de uma quantidade terapeuti- camente eficaz de um agente terapêutico anti-VISTA (por exemplo, um anticorpo anti-VISTA), incluindo como descrito neste documento, ou uma composição dos mesmos. Em algumas modalidades, um método para tratar a doença, distúrbio ou condição compreende a administra- ção ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição farmacêutica que compreende um anticorpo anti-VISTA e um transportador, excipiente e/ou estabilizador farmaceuticamente aceitável. Um método fornecido neste documento também pode incluir opcionalmente pelo menos um agente terapêutico adicional, tais como aqueles descritos neste documento (por exemplo, um anticorpo anti- VISTA), como um tratamento separado ou em combinação. Também são descritas aqui composições, incluindo composições farmacêuticas, compreendendo um agente terapêutico anti-VISTA (por exemplo, um anticorpo anti-VISTA) fornecido aqui para uso no tratamento, preven- ção e/ou alívio de um ou mais sintomas de uma doença, distúrbio ou condição, como uma doença, distúrbio ou condição mediado por VIS- TA. Uma doença, distúrbio ou condição mediado por VISTA exemplar inclui um distúrbio proliferativo celular (por exemplo, câncer ou tumor) ou um sintoma do mesmo.
[00347] Em algumas modalidades, são aqui descritas composições que compreendem um agente terapêutico anti-VISTA (por exemplo, um anticorpo anti-VISTA) para uso na prevenção, tratamento e/ou alí-
vio de um ou mais sintomas de uma doença, distúrbio ou condição mediado por VISTA, como um distúrbio proliferativo celular. Um distúr- bio proliferativo celular inclui câncer ou formação de tumor, ou um sin- toma do mesmo. Em algumas modalidades, o distúrbio proliferativo celular está associado ao aumento da expressão e/ou atividade de VISTA. Em algumas modalidades, o distúrbio proliferativo celular está associado ao aumento da expressão de VISTA na superfície de uma célula cancerosa.
[00348] Em outro aspecto, a presente invenção também se refere a um agente terapêutico anti-VISTA (por exemplo, um anticorpo anti- VISTA) para uso no tratamento de uma doença, distúrbio ou condição mediado por PSGL-1 em um paciente. É fornecida aqui uma terapia anti-VISTA (por exemplo, um anticorpo anti-VISTA) fornecida aqui para uso na prevenção, tratamento e/ou alívio de um ou mais sintomas de uma doença, distúrbio ou condição, como uma doença, distúrbio ou condição mediado por PSGL-1, notavelmente um câncer mediado por PSGL-1. Vantajosamente, a referida doença, distúrbio ou condição mediado por PSGL-1 foi previamente detectado ou diagnosticado por um dos métodos fornecidos neste documento.
[00349] Em uma modalidade, a presente invenção refere-se a um agente terapêutico anti-VISTA (por exemplo, um anticorpo anti-VISTA) para uso no tratamento de uma doença, distúrbio ou condição media- do por PSGL-1 em um paciente, em que a referida doença, distúrbio ou condição mediado por PSGL-1 foi previamente detectado ou diag- nosticado por um dos métodos aqui fornecidos. Em outras palavras, a invenção refere-se, portanto, a um agente terapêutico anti-VISTA para tratar uma doença, distúrbio ou condição mediado por PSGL-1 em um paciente, em que o agente terapêutico Anti-VISTA é administrado a um paciente que foi diagnosticado com uma doença, distúrbio ou con- dição mediado por PSGL-1 usando um método descrito acima.
[00350] Em algumas modalidades, são fornecidas neste documento composições compreendendo um ou mais anticorpos (por exemplo, um anticorpo anti-VISTA) fornecidos neste documento para uso no controle, prevenção ou tratamento de uma doença, distúrbio ou condi- ção mediado por PSGL-1 e/ou ao alívio de um ou mais sintomas de uma doença, distúrbio ou condição mediado por PSGL-1. Doenças, distúrbios ou condições mediados por PSGL-1 exemplares incluem um distúrbio proliferativo celular, tumor e doença do enxerto versus hos- pedeiro (GVHD) ou um sintoma dos mesmos. Preferivelmente, a refe- rida doença, distúrbio ou condição mediado por PSGL-1 é um câncer.
[00351] É, portanto, aqui fornecido um agente terapêutico anti- VISTA (por exemplo, um anticorpo anti-VISTA) para uso no tratamento de um câncer mediado por PSGL-1 em um paciente, o referido uso compreendendo: c) contatar uma amostra biológica do referido indivíduo com um reagente capaz de se ligar especificamente ao ácido nucleico ou proteína PSGL-1; e d) quantificar a ligação do referido reagente à referida amostra biológica, determinando assim o nível de expressão de PSGL- 1 na referida amostra.
[00352] De acordo com uma modalidade preferida, o presente uso compreende ainda uma etapa de classificação do tumor comparando o nível de expressão de PSGL-1 na amostra biológica do indivíduo (por exemplo, por infiltrados imunes de um microambiente tumoral) a uma escala apropriada com base em dois parâmetros que são a intensida- de da coloração e a porcentagem de células positivas.
[00353] Em outra modalidade, a presente invenção refere-se a um agente terapêutico anti-VISTA (por exemplo, um anticorpo anti-VISTA) para uso no tratamento de um câncer mediado por PSGL-1 em um pa- ciente, em que o referido uso compreende a determinação prévia do status de PSGL-1 do referido tumor, conforme descrito acima. De acordo com esta modalidade, um tumor que é [PSGL-1 (+)] é indicativo de um câncer mediado por PSGL-1 e está, portanto, suscetível a res- ponder ao tratamento com um agente terapêutico anti-VISTA (por exemplo, um anticorpo anti-VISTA).
[00354] “De acordo com outra modalidade preferida, o presente uso compreende ainda comparar o nível de expressão de PSGL-1 na amostra biológica do indivíduo (por exemplo, por infiltrados imunes de um microambiente tumoral) com um nível de referência.
[00355] De acordo com esta modalidade preferida, o agente tera- pêutico anti-VISTA (por exemplo, um anticorpo anti-VISTA) é para uso no tratamento de um câncer mediado por PSGL-1 em um paciente, o referido uso compreendendo: d) determinar o nível de expressão de PSGL-1 em uma amostra biológica do referido indivíduo, por exemplo, por infiltrados imunes de um microambiente tumoral na referida amostra biológica; e) comparar o nível de expressão da etapa a) com um nível de referência; e f) determinar um câncer mediado por PSGL-1 quando o ní- vel de expressão da etapa a) é maior do que o nível de referência.
[00356] De acordo com outra modalidade preferida, o agente tera- pêutico anti-VISTA (por exemplo, um anticorpo anti-VISTA) é para uso no tratamento de um câncer mediado por PSGL-1 em um paciente, o referido uso compreendendo: d) determinar o nível de expressão de PSGL-1 em uma amostra biológica do referido indivíduo, por exemplo, por infiltrados imunes de um microambiente tumoral na referida amostra biológica; e) comparar o nível de expressão da etapa a) com um nível de referência; e f) diagnosticar um câncer mediado por PSGL-1 quando o nível de expressão da etapa a) é superior ao nível de referência.
[00357] Vantajosamente, o método da invenção compreende am- bas as etapas de: e classificar o tumor comparando o nível de expressão de PSGL-1 na amostra biológica do indivíduo (por exemplo, por infiltrados imunes de um microambiente tumoral) a uma escala apropriada com base em dois parâmetros que são a intensidade da coloração e a por- centagem de células positivas ; e e comparar o nível de expressão de PSGL-1 na amostra biológica do indivíduo (por exemplo, por infiltrados imunes de um mi- croambiente tumoral) com um nível de referência.
[00358] Vantajosamente, o uso acima do agente terapêutico anti- VISTA compreenderá ainda a determinação do nível de expressão de pelo menos um dentre VISTA, CD11b, CD33, CD4 e CD8, conforme detalhado acima. Em tais casos, um nível de expressão de PSGL-1 e pelo menos um dentre VISTA, CD11b, CD33, CD4 e CDB8, ou os níveis de expressão relativos dos mesmos, mais altos do que o nível de refe- rência indicam um câncer mediado por PSGL-1.
[00359] “De acordo com outra modalidade, a invenção é direcionada a um agente terapêutico anti-VISTA (por exemplo, um anticorpo anti- VISTA) para uso no tratamento de um câncer mediado por PSGL-1 em um paciente, o referido uso compreendendo: d) contatar uma amostra biológica do referido indivíduo com um reagente capaz de se ligar especificamente ao ácido nucleico ou proteína PSGL-1; e e) quantificar a ligação do referido reagente à referida amostra biológica, determinando assim o nível de expressão de PSGL- 1 na referida amostra; e f) adaptar o tratamento do agente terapêutico anti-VISTA com base no nível da etapa a).
[00360] De acordo com uma modalidade preferida, o presente uso compreende ainda uma etapa de classificação do tumor comparando o nível de expressão de PSGL-1 na amostra biológica do indivíduo (por exemplo, por infiltrados imunes de um microambiente tumoral) a uma escala apropriada com base em dois parâmetros que são a intensida- de da coloração e a porcentagem de células positivas.
[00361] Em outra modalidade, a presente invenção refere-se a um agente terapêutico anti-VISTA (por exemplo, um anticorpo anti-VISTA) para uso no tratamento de um câncer mediado por PSGL-1 em um pa- ciente, em que o referido uso compreende a determinação prévia do status de PSGL-1 do referido tumor, conforme descrito acima. De acordo com esta modalidade, um tumor que é [PSGL-1 (+)] é indicativo de um câncer mediado por PSGL-1 e está, portanto, suscetível a res- ponder ao tratamento com um agente terapêutico anti-VISTA (por exemplo, um anticorpo anti-VISTA).
[00362] De acordo com outra modalidade preferida, o presente uso compreende ainda comparar o nível de expressão de PSGL-1 na amostra biológica do indivíduo (por exemplo, por infiltrados imunes de um microambiente tumoral) com um nível de referência.
[00363] A referida adaptação do tratamento com agente terapêutico anti-VISTA pode consistir em: - uma redução ou supressão do referido tratamento com agente terapêutico anti-VISTA se o paciente tiver sido diagnosticado como não respondendo ao agente terapêutico anti-VISTA, ou - a continuação do referido tratamento com agente terapêu- tico anti-VISTA se o paciente tiver sido diagnosticado como respon- dendo ao agente terapêutico anti-VISTA.
[00364] Um paciente está respondendo ao referido tratamento se houver uma diferença na expressão de PSGL-1 entre o nível de ex- pressão da etapa a) e o nível de referência. Por exemplo, uma diferen-
ça de expressão de PSGL-1 entre o nível de expressão da etapa a) e o nível de expressão de PSGL-1 em uma segunda amostra biológica do paciente obtida antes de ser tratado indica se o referido paciente está respondendo ao referido tratamento. Vantajosamente, um nível mais alto de expressão de PSGL-1 na etapa a) em comparação com o nível de expressão de PSGL-1 em uma segunda amostra biológica do paciente obtida antes de ser tratado indica que o referido paciente está respondendo ao referido tratamento.
[00365] “Exemplos de distúrbios proliferativos celulares a serem tra- tados, prevenidos ou sintomas dos quais podem ser aliviados pelos anticorpos fornecidos neste documento incluem, porém, não estão |i- mitados a, cânceres hematológicos (por exemplo, leucemias, linfomas ou mielomas), bexiga, mama, cólon, tecido conjuntivo, cânceres retal, gástrico, esofágico, pulmão, laringe, rim, oral, ovário ou de próstata, ou sarcomas, melanomas ou gliomas, ou metástases de qualquer um desses cânceres. Cânceres hematológicos exemplares incluem, po- rém, não estão limitados a, leucemia mieloide aguda (AML), leucemia linfoblástica aguda (ALL), leucemia mielogenosa crônica (CML), leu- cemia linfocítica crônica (CLL), leucemia monocítica aguda (AMoL), linfoma de Hodgkin, linfoma não Hodgkin, mieloma múltiplo, plasmoci- toma, mieloma localizado ou mieloma extramedular.
[00366] Em algumas modalidades, o câncer hematológico é um lin- foma. Em outras modalidades, o câncer hematológico é uma leucemia. Em algumas modalidades, o câncer hematológico é um mieloma. Em outra modalidade, o câncer hematológico é leucemia mieloide aguda (AML). Em outra modalidade, o câncer hematológico é leucemia linfo- blástica aguda (ALL). Em outra modalidade, o câncer hematológico é a leucemia mielogenosa crônica (CML). Em outra modalidade, o câncer hematológico é a leucemia linfocítica crônica (CLL). Em outra modali- dade, o câncer hematológico é leucemia monocítica aguda (AMoL).
Em outra modalidade, o câncer hematológico é linfoma de Hodgkin. Em outra modalidade, o câncer hematológico é um linfoma não Hod- gkin. Em outra modalidade, o câncer hematológico é mieloma múltiplo. Em outra modalidade, o câncer hematológico é plasmacitoma. Em ou- tra modalidade, o câncer hematológico é mieloma localizado. Em outra modalidade, o câncer hematológico é mieloma extramedular.
[00367] Em algumas modalidades, o câncer hematológico é a sín- drome mielodisplásica, uma leucemia aguda, por exemplo, leucemia aguda de células T, leucemia mielogenosa aguda (AML), leucemia promielocítica aguda, leucemia mieloblástica aguda, leucemia mega- carioblástica aguda, leucemia linfoblástica aguda precursora B, leuce- mia linfoblástica aguda precursora T, leucemia de Burkitt (linfoma de Burkitt) ou leucemia bifenotípica aguda; uma leucemia crônica, por exemplo, linfoma mieloide crônico, leucemia mielogenosa crônica (CML), leucemia monociítica crônica, linfoma linfocítico pequeno ou leucemia prolinfocítica de células B; linfoma de células pilosas; leuce- mia prolinfocítica de células T; ou um linfoma, por exemplo, linfoma histiocítico, linfoma linfoplasmocitário (por exemplo, macroglobulinemia de Waldenstrôóm), linfoma de zona marginal esplênica, neoplasia de células plasmáticas (por exemplo, mieloma de células plasmáticas, plasmocitoma, uma doença de deposição de imunoglobulina monoclo- nal, ou uma doença de cadeia pesada), linfoma de células B de zona marginal extranodal (MALT), linfoma de células B de zona marginal nodal (NMZL), linfoma folicular, linfoma de células de revestimento, linfoma difuso de células B grandes, linfoma mediastinal (tímico) de células B grandes, linfoma intravascular de células B grandes, linfoma de efusão primário, leucemia linfocítica granular de células T grandes, leucemia de células NK agressiva, leucemia/linfoma de células T adul- tas, linfoma de células NK/T extranodal, linfoma de células T do tipo enteropatia, tipo nasal, linfoma de células T hepatoesplênico, linfoma de células NK blásticas, micose fungoide (Síndrome de Sézary), um distúrbio linfoproliferativo cutâneo primário de células T CD30-positivo (por exemplo, linfoma anaplásico cutâneo primário de células grandes ou papulose linfomatoide), linfoma de células T angioimunoblástico, linfoma de células T periférico, linfoma anaplásico de células grandes, não especificado, um linfoma de Hodgkin ou um linfoma de Hodgkin com predominância de linfócitos nodulares.
[00368] Um agente terapêutico anti-VISTA (por exemplo, um anti- corpo anti-VISTA) descrito neste documento pode ser administrado a um humano para fins terapêuticos. Além disso, um agente terapêutico anti-VISTA (por exemplo, um anticorpo anti-VISTA) pode ser adminis- trado a um mamífero não humano que expressa VISTA com o qual o anticorpo reage de forma cruzada (por exemplo, um primata, porco, rato ou camundongo) para uso fins veterinários ou como um modelo animal de doença humana. Em relação ao último, tais modelos ani- mais podem ser úteis para avaliar a eficácia terapêutica dos anticorpos aqui fornecidos (por exemplo, teste de dosagens e cursos de tempo de administração).
[00369] Em algumas modalidades, o agente terapêutico anti-VISTA é um anticorpo que pode ser usado em um método de modulação da função de células T mediada pela ligação de VISTA a PSGL-1. Tais métodos podem incluir o contato da célula T com um anticorpo anti- VISTA aqui descrito. Em algumas modalidades, o anticorpo anti- PSGL-1 não bloqueia ou inibe a ligação de PSGL-1 à P-selectina, L- selectina ou E-selectina. Em algumas modalidades, o método para modular a função das células T inclui a administração de uma quanti- dade eficaz de uma composição compreendendo um anticorpo anti- VISTA fornecido neste documento a um indivíduo. Em alguns aspec- tos, a função das células T que é modulada inclui o aumento da ativa- ção das células T. Essa ativação de células T pode incluir ainda o au-
mento da proliferação de células T. Os métodos para testar a modula- ção de uma resposta imune são bem conhecidos por aqueles versa- dos na técnica, e entende-se que um especialista na técnica seria ca- paz de conduzir prontamente tais ensaios.
[00370] Em algumas modalidades, um agente terapêutico anti- VISTA (por exemplo, um anticorpo anti-VISTA) ou uma composição compreendendo um agente terapêutico anti-VISTA (por exemplo, um anticorpo anti-VISTA), incluindo como aqui descrito, pode ser usado sozinho ou em combinação com outro composto ou tratamento. Por exemplo, em algumas modalidades, o outro composto é um antagonis- ta para uma molécula coinibidora ou um agonista para uma molécula coestimuladora. Em tais modalidades, a terapia combinada leva ao revigoramento ou ativação de novo do sistema imunológico por meio de células T ativadas que é maior do que a administração de qualquer composto ou tratamento individualmente. Esta ativação do sistema imunológico resultará em uma resposta fisiológica altamente benéfica no tratamento de uma doença, distúrbio ou condição mediado por VISTA, incluindo no contexto do tratamento do câncer (por exemplo, tratamento hematológico do câncer).
[00371] Em algumas modalidades, os métodos aqui descritos po- dem incluir a administração de uma quantidade terapeuticamente efi- caz de um anticorpo anti-VISTA em combinação com uma quantidade terapeuticamente eficaz de um antagonista para uma molécula coinibi- dora. Em algumas modalidades, a molécula coinibidora é selecionada a partir do grupo que consiste em CD86, CD80, PDL-1, PDL-2, CTLA- 4, PD1, LAG3, BTNL2, B7-H3, B7-H4, uma butirofilina, CD48 , CD244, TIM-3, CD200R, CD200, CD160, BTLA, HVEM, LAIR1, TIM1, Galecti- na 9, TIM3, CD48, 2B4, CD155, CD112, CD113 e TIGIT. O antagonis- ta da molécula coinibidora inclui um anticorpo contra a molécula coini- bidora. É reconhecido que o antagonista de outras moléculas coinibi-
doras é bem conhecido na técnica, tais como aqueles descritos em Mercier et al., Frontiers in Immunology, 6:418 (2015), Kyi et al, FEBS Letters, 588: 368-376 (2014) e Pardoll, Nature Reviews, 12:252-264 (2012). De acordo com esta modalidade, a invenção se refere ao uso de um agente terapêutico anti-VISTA (por exemplo, um anticorpo anti- VISTA) para uso no tratamento de tumor mediado por VISTA como descrito acima, o referido uso compreendendo ainda a administração de um antagonista a uma molécula coinibidora, em que a referida mo- lécula coinibidora é selecionada a partir do grupo que consiste em CD86, CD80, PDL-1, PDL-2, CTLA-4, PD1, LAG3, BTNL2, B7-H3, B7- H4, uma butirofilina, CD48, CD244, TIM-3, CD200R, CD200, CD160, BTLA, HVEM, LAIR1, TIM1, Galectina 9, TIM3, CD48, 2B4, CD155, CD112, CD113 e TIGIT.
[00372] Em algumas modalidades, os métodos aqui descritos po- dem incluir a administração de uma quantidade terapeuticamente efi- caz de um anticorpo anti-VISTA em combinação com uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agonista para uma molécula coestimu- ladora. Em algumas modalidades, a molécula coestimuladora é seleci- onada a partir do grupo que consiste em CD154, TNFRSF25, GITR, 4- 1BB, OX40, CD27, TMIGD2, ICOS, CD28, CD40, TL1IA, GITRL, 41BBL, OX40L, CD70, HHLA?2Z, ICOSL, uma citocina, LIGHT, HVEM, CD30, CD30L, B7-H2, CD80, CD86, CD40L, TIMA4, TIM1, SLAM, CD48, CD58, CD155, CD112, DR3, GITR, CD2 e CD226. O agonista da molécula coestimuladora inclui um anticorpo agonístico contra a molécula coestimuladora. É reconhecido que os agonistas de molécu- las coestimuladoras são bem conhecidos na técnica, tais como aque- les descritos em Mercier et a/., Frontiers in Immunology, 6:418 (2015), Kyi et al., FEBS Letters, 588:368-376 (2014) and Capece et al., J. Bi- omed. Biotechnol. 2012:926321, 17 pages (2012). De acordo com esta modalidade, a invenção se refere ao uso de um agente terapêutico an-
ti-VISTA (por exemplo, um anticorpo anti-VISTA) para uso no trata- mento de tumor mediado por VISTA como descrito acima, o referido uso compreendendo ainda a administração de um agonista a uma mo- lécula coestimuladora, em que a referida molécula coestimuladora é selecionada a partir do grupo que consiste em CD154, TNFRSF25, GITR, 4-1BB, OX40, CD27, TMIGD2, ICOS, CD28, CD40, TL1A, GI- TRL, 41BBL, OX40L, CD70, HHLA2, ICOSL, uma citocina, LIGHT, HVEM, CD30, CD30L, B7-H2, CD80, CD86, CD40L, TIM4, TIM1, SLAM, CD48, CD58, CD155, CD112, DR3, GITR, CD2, e CD226.
[00373] Em algumas modalidades, os métodos descritos neste do- cumento podem incluir a administração de uma quantidade terapeuti- camente eficaz de um agente terapêutico anti-VISTA (por exemplo, um anticorpo anti-VISTA) em combinação com uma forma convencional de terapia para o tratamento do câncer, tal como uma quantidade te- rapeuticamente eficaz de um agente quimioterapêutico aqui descrito ou uma radioterapia aqui descrita. De acordo com esta modalidade, a invenção se refere ao uso de um agente terapêutico anti-VISTA (por exemplo, um anticorpo anti-VISTA) para uso no tratamento de tumor mediado por VISTA como descrito acima, o referido uso compreen- dendo ainda a administração de uma forma convencional de terapia para o tratamento do câncer, tal como uma quantidade terapeutica- mente eficaz de um agente quimioterapêutico aqui descrito ou uma radioterapia aqui descrita.
[00374] Vários sistemas de distribuição são conhecidos e podem ser usados para administrar um agente terapêutico anti-VISTA (por exemplo, um anticorpo anti-VISTA como aqui descrito), incluindo, po- rém, não se limitando a, encapsulação em lipossomas, micropartícu- las, microcápsulas, células recombinantes capazes de expressar o an- ticorpo, endocitose mediada por receptor (veja, por exemplo, Wu e Wu, J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987)), construção de um ácido nucleico como parte de um retroviral ou outro vetor, etc. Métodos de administração de um agente terapêutico (por exemplo, um anticorpo anti-VISTA fornecido neste documento) ou composição farmacêutica incluem, porém, não estão limitados a, administração parenteral (por exemplo, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, in- tratumoral e subcutânea), epidural e mucosal (por exemplo, vias intra- nasal e oral). Em algumas modalidades, um agente terapêutico (por exemplo, um anticorpo anti-VISTA aqui fornecido) ou uma composição farmacêutica é administrada por via intranasal, intramuscular, intrave- nosa, intratumoral ou subcutânea. Os agentes terapêuticos ou compo- sições podem ser administrados por qualquer via conveniente, por exemplo, por infusão ou injeção em bolus, por absorção através de revestimentos epiteliais ou mucocutâneos (por exemplo, mucosa oral, mucosa intranasal, mucosa retal e intestinal, etc.) e podem ser admi- nistrados juntamente com outros agentes biologicamente ativos. A administração pode ser sistêmica ou local. Além disso, a administra- ção pulmonar também pode ser empregada, por exemplo, pelo uso de um inalador ou nebulizador e formulação com um agente de aerossol. Veja, por exemplo, Patentes Norte-americana Nos. 6.019.968,
5.985.320, 5.985.309, 5.934.272, 5.874.064, 5.855.913, 5.290.540 e
4.880.078; e Publicações PCT Nos. WO 92/19244, WO 97/32572, WO 97/44013, WO 98/31346 e WO 99/66903, cada uma das quais está incorporada neste documento por referência em sua totalidade.
[00375] Em algumas modalidades, pode ser desejável administrar um agente terapêutico ou uma composição farmacêutica fornecida aqui localmente para a área que necessita de tratamento. Isto pode ser conseguido, por exemplo, e não por meio de limitação, infusão lo- cal, por administração tópica (por exemplo, por spray intranasal), por injeção (nomeadamente, uma injeção intratumoral), ou por meio de um implante, sendo o implante de um material poroso, não poroso ou ge-
latinoso, incluindo membranas, como membranas sialásticas ou fibras. Em algumas modalidades, ao administrar um anticorpo fornecido neste documento, deve-se ter cuidado ao usar materiais para os quais o an- ticorpo não absorve.
[00376] Em algumas modalidades, um agente terapêutico aqui for- necido pode ser distribuído em uma vesícula, em particular um lipos- soma (veja, Langer, 1990, Science 249: 1527-1533; Treat et al., in Li- posomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez- Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353-365 (1989); Lo- pez-Berestein, ibid., pp. 317-327; veja geralmente ibid.).
[00377] Em algumas modalidades, um agente terapêutico fornecido neste documento pode ser distribuído em um sistema de liberação controlada ou de liberação prolongada. Em algumas modalidades, uma bomba pode ser usada para alcançar a liberação controlada ou prolon- gada (veja, Langer, supra; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:20; Buchwald et a/., 1980, Surgery 88:507; Saudek et a/., 1989, N. Engl. J. Med. 321:574). Em outra modalidade, os materiais poliméricos podem ser usados para alcançar a liberação controlada ou prolongada de um agente terapêutico (por exemplo, um anticorpo fornecido neste documento) ou uma composição fornecida neste documento (veja, por exemplo, Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974); Controlled Drug Bioa- vailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Ranger and Peppas, 1983, J., Macro- Mol. Sci. Rev. MacroMol. Chem. 23:61; veja, da mesma forma, Levy et al., 1985, Science 228:190; During et a/., 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howard et a/., 1989, J. Neurosurg. 7 1:105); Patente Norte-americana No. 5.679.377; Patente Norte-americana No. 5.916.597; Patente Nor- te-americana No. 5.912.015; Patente Norte-americana No. 5.989.463; Patente Norte-americana No. 5.128.326; Publicação PCT No. WO
99/15154; e Publicação PCT No.
WO 99/20253. Exemplos de políme- ros usados em formulações de liberação prolongada incluem, porém, não estão limitados a, poli(2-hidroxi etil metacrilato), poli(metil metacri- lato), ácido poliacrílico, polifacetato de etileno-co-vinila), ácido polime- tacrílico, poliglicolídeos (PLG), polianidridos, poli(N-vinil pirrolidona), álcool polivinílico, poliacrilamida, polietileno glicol, polilactídeos (PLA), poli(lactídeo-co-glicolídeos) (PLGA), e poliortoésteres.
Em algumas modalidades, o polímero usado em uma formulação de liberação pro- longada é inerte, livre de impurezas lixiviáveis, estável no armazena- mento, estéril e biodegradável.
Em ainda outra modalidade, um siste- ma de liberação controlada ou prolongada pode ser colocado na pro- ximidade do alvo terapêutico, por exemplo, as passagens nasais ou pulmões, exigindo assim apenas uma fração da dose sistêmica (veja, por exemplo, Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984)). Sistemas de liberação controlada são discutidos na revisão por Langer (1990, Science 249:1527-1533). Qualquer técnica conhecida por alguém versado na técnica pode ser usada para produzir formulações de liberação prolongada compreenden- do um ou mais anticorpos aqui fornecidos.
Veja, por exemplo, Patente Norte-americana No. 4.526.938, Publicação PCT WO 91/05548, Publi- cação PCT WO 96/20698, Ning et al., 1996, "Intratumoral Radioim- munotherapy of a Human Colon Cancer Xenograft Using a Sustained- Release Gel," Radiotherapy & Oncology 39:179- 189, Song et al, 1995, "Antibody Mediated Lung Targeting of Long-Circulating Emul- sions," PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372- 397, Cleek et a/., 1997, "Biodegradable Polymeric Carriers for a bFGF Antibody for Cardiovascular Application," Pro.
Int'l.
Symp.
Control.
Rel.
Bioact.
Mater. 24:853-854, and Lam et a/., 1997, "Microencapsulation of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody for Local Delivery," Proc.
Int'l.
Symp.
Control Rel.
Bioact.
Mater. 24:759-760.
[00378] Em algumas modalidades, uma composição útil em um mé- todo fornecido neste documento compreende um, dois ou mais anti- corpos fornecidos neste documento (por exemplo, um anticorpo anti- VISTA). Em outra modalidade, uma composição útil em um método fornecido neste documento compreende um, dois ou mais anticorpos fornecidos neste documento e um agente terapêutico diferente de um anticorpo fornecido neste documento. Em algumas modalidades, os agentes são conhecidos por serem úteis, ou foram ou são atualmente usados para a prevenção, tratamento e/ou alívio de um ou mais sinto- mas de uma doença, distúrbio ou condição mediado por VISTA. Além de agentes terapêuticos, as composições aqui fornecidas também po- dem compreender um transportador.
[00379] As composições fornecidas neste documento incluem com- posições a granel úteis na fabricação de composições farmacêuticas (por exemplo, composições que são adequadas para administração a um indivíduo ou paciente) que podem ser usadas na preparação de formas de dosagem unitária. Em algumas modalidades, uma composi- ção fornecida neste documento é uma composição farmacêutica. Tais composições compreendem uma quantidade profilaticamente ou tera- peuticamente eficaz de um ou mais agentes terapêuticos (por exem- plo, um agente terapêutico anti-VISTA, tal como um anticorpo anti- VISTA aqui fornecido, ou outro agente terapêutico) e um transportador farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, as composi- ções farmacêuticas são formuladas para serem adequadas para a via de administração a um indivíduo.
[00380] Em algumas modalidades, a composição é formulada de acordo com procedimentos de via como uma composição farmacêutica adaptada para administração intravenosa a seres humanos. Normal- mente, as composições para administração intravenosa são soluções em tampão aquoso isotônico estéril. Quando necessário, a composi-
ção também pode incluir um agente solubilizante e um anestésico lo- cal, como lidocaína ou linocaína para aliviar a dor no sítio da injeção. Essas composições, no entanto, podem ser administradas por uma via diferente da intravenosa.
[00381] Os ingredientes das composições aqui fornecidas podem ser fornecidos separadamente ou misturados na forma de dosagem unitária, por exemplo, como um pó liofilizado seco ou concentrado livre de água em um recipiente hermeticamente fechado, como uma ampo- la ou sachê indicando a quantidade de ativo agente. Onde a composi- ção é para ser administrada por infusão, ela pode ser distribuída com um frasco de infusão contendo água estéril de grau farmacêutico ou solução salina. Quando a composição é administrada por injeção, uma ampola de água estéril para injeção ou solução salina pode ser forne- cida para que os ingredientes possam ser misturados antes da admi- nistração.
[00382] Em algumas modalidades, um anticorpo aqui fornecido é embalado em um recipiente hermeticamente fechado, como uma am- pola ou sachê indicando a quantidade de anticorpo. Em algumas mo- dalidades, o anticorpo é fornecido como um pó liofilizado esterilizado a seco ou concentrado sem água em um recipiente hermeticamente fe- chado e pode ser reconstituído, por exemplo, com água ou solução salina para a concentração apropriada para administração a um indiví- duo. Em algumas modalidades, o anticorpo é fornecido como um pó liofilizado estéril seco em um recipiente hermeticamente fechado com uma dosagem unitária de pelo menos 0,1 mg, pelo menos 0,5 mg, pelo menos 1 mg, pelo menos 2 mg ou pelo menos 3 mg, tal como pelo menos 5 mg, pelo menos 10 mg, pelo menos 15 mg, pelo menos 25 mg, pelo menos 30 mg, pelo menos 35 mg, pelo menos 45 mg, pelo menos 50 mg, pelo menos 60 mg, pelo menos 75 mg, pelo menos 80 mg, pelo menos 85 mg, pelo menos 90 mg, pelo menos 95 mg ou pelo menos 100 mg. O anticorpo liofilizado pode ser armazenado entre 2 e 8 ºC em seu recipiente original e o anticorpo pode ser administrado em 12 horas, como em 6 horas, em 5 horas, em 3 horas ou em 1 hora após a reconstituição. Em uma modalidade alternativa, um anticorpo é fornecido na forma líquida em um recipiente hermeticamente fechado, indicando a quantidade e a concentração do anticorpo. Em algumas modalidades, a forma líquida do anticorpo é fornecida em um recipien- te hermeticamente fechado de pelo menos 0,1 mg/ml, pelo menos 0,5 mg/ml, ou pelo menos 1 mg/ml, tal como pelo menos 5 mg/ml, pelo menos 10 mg/ml, pelo menos 15 mg/ml, pelo menos 25 mg/ml, pelo menos 30 mg/ml, pelo menos 40 mg/ml, pelo menos 50 mg/ml, pelo menos 60 mg/ml, pelo menos 70 mg/ml, pelo menos 80 mg/ml, pelo menos 90 mg/ml, ou pelo menos 100 mg/ml.
[00383] A quantidade de um agente terapêutico anti-VISTA (por exemplo, um anticorpo anti-VISTA) ou uma composição fornecida nes- te documento que será eficaz na prevenção, tratamento e/ou alívio de um ou mais sintomas de uma doença, distúrbio ou condição mediado por VISTA pode ser determinada por técnicas clínicas padrão.
[00384] “Consequentemente, uma dosagem de um agente terapêuti- co anti-VISTA (por exemplo, um anticorpo anti-VISTA) ou uma compo- sição que resulta em um título sérico de cerca de 0,1 ug/ml a cerca de 450 pg/ml, e em algumas modalidades pelo menos 0,1 ug/ml, pelo menos 0,2 ug/ml, pelo menos 0,4 pg/ml, pelo menos 0,5 pg/ml, pelo menos 0,6 ug/ml, pelo menos 0,8 ug/ml, pelo menos 1 pg/ml, a pelo menos 1,5 ug/ml, tal como pelo menos 2 ug/ml, pelo menos 5 ug/ml, pelo menos 10 pg/ml, pelo menos 15 pg/ml, pelo menos 20 ug/ml, pelo menos 25 ug/ml, pelo menos 30 ug/ml, pelo menos 35 ug/ml, pelo me- nos 40 pg/ml, pelo menos 50 pg/ml, pelo menos 75 pg/ml, pelo menos 100 ug/ml, pelo menos 125 pg/ml, pelo menos 150 pg/ml, pelo menos 200 ug/ml, pelo menos 250 ug/ml, pelo menos 300 pg/ml, pelo menos
350 pg/ml, pelo menos 400 pg/ml ou pelo menos 450 ug/ml pode ser administrada a um ser humano para a prevenção, tratamento e/ou alí- vio de um ou mais sintomas de uma doença, distúrbio ou condição mediado por VISTA. Além disso, os ensaios in vitro podem ser opcio- nalmente empregados para ajudar a identificar os intervalos de dosa- gem ideais. A dose precisa a ser empregada na formulação também dependerá da via de administração e da gravidade de uma doença, distúrbio ou condição mediado por VISTA e deve ser decidida de acor- do com o diagnóstico do médico e das circunstâncias de cada pacien- te.
[00385] As doses eficazes podem ser extrapoladas a partir de cur- vas de dose-resposta derivadas de sistemas de teste in vitro ou de modelo animal.
[00386] Para os anticorpos aqui fornecidos, a dosagem administra- da a um paciente pode ser, em algumas modalidades, de 0,1 mg/kg a 100 mg/kg do peso corporal do paciente. Em algumas modalidades, a dosagem administrada ao paciente é de cerca de 1 mg/kg a cerca de 75 mg/kg do peso corporal do paciente. Em algumas modalidades, a dosagem administrada a um paciente está entre 1 mg/kg e 20 mg/kg do peso corporal do paciente, tal como 1 mg/kg a 5 mg/kg do peso corporal do paciente. Geralmente, os anticorpos humanos têm uma meia-vida mais longa dentro do corpo humano do que os anticorpos de outras espécies devido à resposta imune aos polipeptídeos estranhos. Assim, doses mais baixas de anticorpos humanos e administração menos frequente são frequentemente possíveis. Além disso, a dosa- gem e a frequência de administração dos anticorpos fornecidos neste documento podem ser reduzidas aumentando a absorção e penetra- ção nos tecidos dos anticorpos por modificações, como, por exemplo, lipidação.
[00387] Em algumas modalidades, aproximadamente 100 mg/kg ou menos, aproximadamente 75 mg/kg ou menos, aproximadamente 50 mg/kg ou menos, aproximadamente 25 mg/kg ou menos, aproxima- damente 10 mg/kg ou menos, aproximadamente 5 mg/kg ou menos, aproximadamente 1 mg/kg ou menos, aproximadamente 0,5 mg/kg ou menos, ou aproximadamente 0,1 mg/kg ou menos de um anticorpo aqui fornecido é administrado 5 vezes, 4 vezes, 3 vezes, 2 vezes ou 1 vez para prevenir, tratar ou aliviar um ou mais sintomas de uma doen- ça, distúrbio ou condição mediado por VISTA. Em algumas modalida- des, um anticorpo fornecido neste documento é administrado cerca de 1-12 vezes, em que as doses podem ser administradas conforme ne- cessário, por exemplo, semanalmente, quinzenalmente, mensalmente, bimensalmente, trimestralmente, etc., conforme determinado por um médico. Em algumas modalidades, uma dose mais baixa (por exem- plo, 1-15 mg/kg) pode ser administrada com mais frequência (por exemplo, 3-6 vezes). Em outras modalidades, uma dose mais elevada (por exemplo, 25-100 mg/kg) pode ser administrada com menos fre- quência (por exemplo, 1-3 vezes). No entanto, como será evidente pa- ra os versados na técnica, outras quantidades e programações de do- sagem são facilmente determináveis e dentro do escopo da descrição.
[00388] Em algumas modalidades, aproximadamente 100 mg/kg, aproximadamente 75 mg/kg ou menos, aproximadamente 50 mg/kg ou menos, aproximadamente 25 mg/kg ou menos, aproximadamente 10 mg/kg ou menos, aproximadamente 5 mg/kg ou menos, aproximada- mente 1 mg/kg ou menos, aproximadamente 0,5 mg/kg ou menos, aproximadamente 0,1 mg/kg ou menos de um anticorpo aqui fornecido em uma formulação de liberação prolongada é administrado a um indi- víduo, como um ser humano, para prevenir, tratar e/ou aliviar um ou mais sintomas de uma doença mediada por VISTA. Em outra modali- dade, aproximadamente 100 mg/kg, aproximadamente 75 mg/kg ou menos, aproximadamente 50 mg/kg ou menos, aproximadamente 25 mg/kg ou menos, aproximadamente 10 mg/kg ou menos, aproxima- damente 5 mg/kg ou menos, aproximadamente 1 mg/kg ou menos, aproximadamente 0,5 mg/kg ou menos, ou aproximadamente 0,1 mg/kg ou menos em bolus de um anticorpo aqui fornecido não em uma formulação de liberação prolongada é administrado a um indivíduo, tal como um ser humano, para prevenir, tratar e/ou aliviar um ou mais sin- tomas de uma doença, distúrbio ou condição mediado por VISTA e, após um certo período de tempo, aproximadamente 100 mg/kg, apro- ximadamente 75 mg/kg ou menos, aproximadamente 50 mg/kg ou menos, aproximadamente 25 mg/kg ou menos, aproximadamente 10 mg/kg ou menos, aproximadamente 5 mg/kg ou menos, aproximada- mente 1 mg/kg ou menos, aproximadamente 0,5 mg/kg ou menos, ou aproximadamente 5 mg/kg ou menos de um anticorpo aqui fornecido em uma liberação prolongada é administrado ao indivíduo (por exem- plo, intranasalmente ou intramuscularmente) uma, duas, três ou quatro vezes. De acordo com esta modalidade, um determinado período de tempo pode ser de 1 a 5 dias, uma semana, duas semanas ou um mês.
[00389] Em algumas modalidades, uma única dose de um anticorpo aqui fornecido é administrada a um paciente para prevenir, tratar e/ou aliviar um ou mais sintomas de uma doença, distúrbio ou condição mediado por VISTA, incluindo uma ou mais doses, tais como duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze, treze, qua- torze, quinze, dezesseis, dezessete, dezoito, dezenove, vinte, vinte e um, vinte e dois, vinte e três, vinte e quatro, vinte e cinco ou vinte e seis, incluindo em intervalos bissemanais (por exemplo, cerca de 14 dias) ao longo de um ano, em que a dose é selecionada a partir do grupo que consiste em cerca de 0,1 mg/kg, cerca de 0,5 mg/kg, cerca de 1 mg/kg, cerca de 5 mg/kg, cerca de 10 mg/kg, cerca de 15 mg/kg, cerca de 20 mg/kg, cerca de 25 mg/kg, cerca de 30 mg/kg, cerca de 35 mg/kg, cerca de 40 mg/kg, cerca de 45 mg/kg , cerca de 50 mg/kg, cerca de 55 mg/kg, cerca de 60 mg/kg, cerca de 65 mg/kg, cerca de 70 mg/kg, cerca de 75 mg/kg, cerca de 80 mg/kg, cerca de 85 mg/kg, cer- ca de 90 mg/kg, cerca de 95 mg/kg, cerca de 100 mg/kg ou uma com- binação das mesmas (por exemplo, cada dose mensal pode ou não ser idêntica).
[00390] Em algumas modalidades, uma única dose de um anticorpo aqui fornecido é administrada ao paciente para prevenir, tratar e/ou aliviar um ou mais sintomas de uma doença, distúrbio ou condição mediado por VISTA, incluindo em uma ou mais vezes, tais como duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze ou doze vezes, in- cluindo intervalos quase mensais (por exemplo, cerca de 30 dias) ao longo de um ano, em que a dose é selecionada a partir de o grupo que consiste em cerca de 0,1 mg/kg, cerca de 0,5 mg/kg, cerca de 1 mg/kg, cerca de 5 mg/kg, cerca de 10 mg/kg, cerca de 15 mg/kg, cerca de 20 mg/kg, cerca de 25 mg/kg, cerca de 30 mg/kg, cerca de 35 mg/kg, cerca de 40 mg/kg, cerca de 45 mg/kg, cerca de 50 mg/kg, cer- ca de 55 mg/kg, cerca de 60 mg/kg, cerca de 65 mg/kg, cerca de 70 mg/kg, cerca de 75 mg/kg, cerca de 80 mg/kg, cerca de 85 mg/kg, cer- ca de 90 mg/kg, cerca de 95 mg/kg, cerca de 100 mg/kg ou uma com- binação dos mesmos (por exemplo, cada dose mensal pode ou não ser idêntica).
[00391] Em algumas modalidades, uma única dose de um anticorpo aqui fornecido é administrada a um paciente para tratar, prevenir e/ou aliviar um sintoma de uma doença, distúrbio ou condição mediado por VISTA, incluindo em uma ou mais vezes, como duas, três, quatro, cin- co ou seis vezes, incluindo intervalos quase bimestrais (por exemplo, cerca de 60 dias) ao longo de um ano, em que a dose é selecionada a partir do grupo que consiste em cerca de 0,1 mg/kg, cerca de 0,5 mg/kg, cerca de 1 mg/kg, cerca de 5 mg/kg, cerca de 10 mg/kg, cerca de 15 mg/kg, cerca de 20 mg/kg, cerca de 25 mg/kg, cerca de 30 mg/kg, cerca de 35 mg/kg, cerca de 40 mg/kg, cerca de 45 mg/kg, cer- ca de 50 mg/kg, cerca de 55 mg/kg, cerca de 60 mg/kg, cerca de 65 mg/kg, cerca de 70 mg/kg, cerca de 75 mg/kg , cerca de 80 mg/kg, cerca de 85 mg/kg, cerca de 90 mg/kg, cerca de 95 mg/kg, cerca de 100 mg/kg ou uma combinação das mesmas (por exemplo, cada dose bimestral pode ou não ser idêntica) .
[00392] Em algumas modalidades, uma única dose de um anticorpo aqui fornecido é administrada a um paciente para tratar, prevenir e/ou aliviar um ou mais sintomas de uma doença, distúrbio ou condição mediado por VISTA, incluindo em uma ou mais vezes, tais como duas, três ou quatro vezes em intervalos de cerca de três meses (por exem- plo, cerca de 120 dias) ao longo de um ano, em que a dose é selecio- nada a partir do grupo que consiste em cerca de 0,1 mg/kg, cerca de 0,5 mg/kg, cerca de 1 mg/kg, cerca de 5 mg/kg, cerca de 10 mg/kg, cerca de 15 mg/kg, cerca de 20 mg/kg, cerca de 25 mg/kg, cerca de 30 mg/kg, cerca de 35 mg/kg, cerca de 40 mg/kg, cerca de 45 mg/kg, cer- ca de 50 mg/kg, cerca de 55 mg/kg, cerca de 60 mg/kg, cerca de 65 mg/kg, cerca de 70 mg/kg, cerca de 75 mg/kg, cerca de 80 mg/kg, cer- ca de 85 mg/kg, cerca de 90 mg/kg, cerca de 95 mg/kg, cerca de 100 mg/kg ou uma combinação dos mesmos (por exemplo, cada dose tri- mestral pode ou não ser idêntica).
[00393] Em algumas modalidades, a via de administração de uma dose de um anticorpo aqui fornecida a um paciente é intranasal, intra- muscular, intravenosa ou uma combinação dos mesmos, porém, ou- tras vias aqui descritas também são aceitáveis. Cada dose pode ou não ser administrada por uma via de administração idêntica. Em algu- mas modalidades, um anticorpo fornecido neste documento pode ser administrado através de múltiplas vias de administração simultanea- mente ou subsequentemente a outras doses do mesmo ou de um anti-
corpo diferente fornecido neste documento.
[00394] Em algumas modalidades, os agentes terapêuticos anti- VISTA (por exemplo, anticorpos anti-VISTA) fornecidos neste docu- mento são administrados profilaticamente ou terapeuticamente a um indivíduo. Os agentes terapêuticos anti-VISTA (por exemplo, anticor- pos anti-VISTA) podem ser profilaticamente ou terapeuticamente ad- ministrados a um indivíduo de modo a prevenir, diminuir ou aliviar uma doença, distúrbio ou condição mediado por VISTA, ou sintoma dos mesmos.
KITS
[00395] Também é fornecido neste documento um pacote ou kit farmacêutico compreendendo um ou mais recipientes preenchidos com um ou mais dos ingredientes das composições farmacêuticas aqui fornecidas, tais como um ou mais anticorpos (por exemplo, um anti-PSGL-1 e/ou um anticorpo anti-VISTA) aqui fornecido. Opcional- mente associado a tais recipientes pode estar um aviso na forma pres- crita por uma agência governamental que regulamenta a fabricação, uso ou venda de produtos farmacêuticos ou biológicos, cujo aviso re- flete a aprovação da agência de fabricação, uso ou venda para admi- nistração humana. Em algumas modalidades , o kit compreende um folheto informativo. O termo "folheto informativo" é usado para se refe- rir a instruções habitualmente incluídas em embalagens comerciais de produtos terapêuticos, que contêm informações sobre as indicações, uso, dosagem, administração, contraindicações e/ou advertências rela- tivas ao uso de tais produtos terapêuticos, bem como instruções de uso.
[00396] Também são fornecidos aqui kits que podem ser usados nos métodos acima. Em algumas modalidades, um kit compreende um anticorpo (por exemplo, um anti-PSGL-1 e/ou um anticorpo anti- VISTA) aqui fornecido, como um anticorpo isolado (por exemplo, um anticorpo anti-PSGL-1 e/ou um anti-VISTA), em um ou mais recipien- tes. Em algumas modalidades, os kits fornecidos neste documento contêm um PSGL-1 ou VISTA substancialmente isolado como um con- trole. Em algumas modalidades, os kits fornecidos aqui compreendem ainda um anticorpo de controle que não reage com o PSGL-1 e/ou VISTA. Em algumas modalidades, os kits fornecidos neste documento contêm um meio para detectar a ligação de um anticorpo modificado para PSGL-1 e/ou VISTA (por exemplo, o anticorpo pode ser conjuga- do a um substrato detectável, como um composto fluorescente, um substrato enzimático, um composto radioativo ou um composto lumi- nescente, ou um segundo anticorpo que reconhece o primeiro anticor- po pode ser conjugado a um substrato detectável). Em algumas moda- lidades, o kit pode incluir um PSGL-1 e/ou VISTA produzido de forma recombinante ou sintetizado quimicamente. O PSGL-1 e/ou VISTA for- necidos no kit também podem ser fixados em um suporte sólido. Em algumas modalidades, o meio de detecção do kit descrito acima inclui um suporte sólido ao qual PSGL-1 e/ou VISTA está ligado. Tal kit tam- bém pode incluir um anticorpo anti-humano marcado com repórter não ligado. Em algumas modalidades, a ligação do anticorpo ao PSGL-1 e/ou VISTA pode ser detectada pela ligação do anticorpo marcado com repórter.
[00397] Entende-se que modificações que não afetam substancial- mente a atividade das várias modalidades desta descrição também são fornecidas neste documento. Por conseguinte, os exemplos a se- guir se destinam a ilustrar, porém, não a limitar a presente descrição.
EXEMPLOS EXEMPLO | Identificação do Receptor para VISTA
[00398] Este exemplo descreve pela primeira vez a identificação de um receptor de VISTA usando CAPTIREC'Y, um sistema de captura de ligante-receptor baseado em TRICEPS'Y (Dualsystems Biotech AG).
[00399] O método CAPTIREC'TY, com uma proteína de fusão VIS- TA-Fc como o ligante de interesse e o anticorpo anti-CD28 como um ligante de controle, foi realizado em células T virgens isoladas de célu- las T primárias humanas. As sequências de nucleotídeos e aminoáci- dos do construto de proteína de fusão VISTA-Fc usado nos experi- mentos abaixo são mostradas abaixo:
[00400] “Sequência de nucleotídeos da proteína de fusão VISTA-Fc (códigos de sequência sublinhados para VISTA; códigos de sequência em negrito para o fragmento Fc de um anticorpo I9gG1 humano)
ATGGGCGTGCCCACAGCCCTGGAAGCTGGCAGCTGGAGGTEGGÇ GAAGCCTGCTGTTCGCCCTSGTTTCTGGCCGCCOTCCOTGGGACET GTGGCCGCCTTTAAGGTCGCCACCCCOTTACAGCCOTGTACGTGTGC CCCGAGGGCCAGAACGTGACCCTGACCTGCAGACTGCTGGGCCC TGTGGACAAGGGCCACGACGTGACCTTCTACAAGACCTGGTACA GGAGCAGCAGGGGCGAGGTCCAGACCTGCAGCGAGAGGAGGCC CATCAGGAACCTGACCTTCCAGGACCTGCACCTGCACCACGGAG GCCATCAGGCCGCCAACACCTCCCACGACCTGGCTCAGAGGCAC GGACTGGAGAGCGCCAGCGATCACCACGGCAACTTCAGCATCAC CATGAGGAACCTCACCCTGCTGGACAGCGGCCTEGTACTGEGTTGCET GGTGGTGGAGATCAGGCACCACCACAGCGAGCACAGAGTGCACG GCGCCATGGAACTGCAGGTGCAGACCGGAAAGGACGCCCCCAG CAACTGCGTGGTGTACCCCAGCAGCTCCCAGGACAGCGAGAACA TCACCGCCGCCAGATCTGTGGAGTGCCCACCTTGCCCAGCACCA CCTGTGGCAGGACCTTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAA GGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGG TGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTG GTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCG CGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCC TCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAA GTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCATCCTCCATCGAGAAAA CCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTA CACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTC AGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGC CGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAG ACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTA CAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAAC
GTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTA CACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA (SEQ ID NO: 37)
[00401] Sequência de aminoácidos da proteína de fusão VISTA-Fc (a sequência sublinhada é VISTA; a sequência em negrito é o frag- mento Fc de um anticorpo IgG1 humano)
MGVPTALEAGSWRWGSLLFALFLAASLGPVAAFKVATPYSLYVCPE GQNVTLTCRLLGPYDKGHDVTFYKTWYRSSRGEVQTCSERRPIRNL TFQDLHLHHGGHQAQAANTSHDLAQRHGLESASDHHGNFSITMRNLTL LDSGLYCCLVVEIRHHHSEHRVHGAMELQVQTGKDAPSNCVVYPSS SQDSENIRSVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV VVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLT VLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPP SREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLD
SDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLS PGK (SEQ ID NO: 38)
[00402] Uma visão geral do procedimento CAPTIRECTY é delinea- da na FIG. 1. Resumidamente, a proteína de fusão VISTA-Fc e o anti- corpo anti-CD28 foram acoplados separadamente com TRICEPSTY. As células T humanas virgens foram isoladas a partir de células T hu- manas primárias disponíveis comercialmente. As glicoproteínas de su- perfície das células T virgens foram seletivamente oxidadas. Foi reali-
zada a ligação do ligante e o acoplamento do receptor à superfície ce- lular das células T virgens oxidadas. As células T que reagiram foram então lisadas e o lisado resultante foi purificado por afinidade para os complexos ligante-proteína receptora. As proteínas purificadas foram então clivadas por digestão com tripsina, liberando peptídeos recepto- res. Os peptídeos receptores resultantes foram analisados por croma- tografia líquida-espectrometria de massa em tandem (LC-MS/MS). Pa- ra permitir a análise estatística, os experimentos foram feitos em tripli- cados bioquímicos.
[00403] O isolamento de células T virgens foi realizado selecionan- do negativamente as células T virgens de células T primárias humanas de doadores saudáveis, que foram adquiridas da ALLCELLS (Alame- da, CA). A fim de selecionar negativamente as células desejadas, um kit de isolamento de células T Virgens Pan de Miltenyi (% 130-097-095) foi usado de acordo com o protocolo do fabricante. Resumidamente, células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) foram ressus- pensas em tampão fluente de MACS e incubadas por 5 min com uma mistura de anticorpos monoclonais anti-humanos conjugados com bio- tina contra HLA-DR, CD14, CD15, CD16, CD19, CD25, CD36, CD56, CD57, CD45RO, CD123, CD244, CD235a e y/5 anti-TCR, seguido por uma incubação de 10 min com grânulos magnéticos antibiotina conju- gados com anticorpos monoclonais anti-CD61 e antibiotina. As células T virgens foram então selecionadas negativamente usando o separa- dor autoMACS (Miltenyi Biotech, San Diego CA). 100x10º células T virgens foram usadas por reação de captura de ligante TRICEPSTY.
[00404] As etapas restantes do procedimento CAPTIREC'TY, que incluíram o acoplamento da proteína de fusão VISTA-Fc ou do anticor- po anti-CD28 ao TRICEPSTY, oxidando seletivamente glicoproteínas de superfície das células T virgens, ligação do ligante e acoplamento do receptor à célula superfície das células T oxidadas, lise das células
T, purificação por afinidade do lisado celular e digestão com tripsina, foram realizados de acordo com procedimentos modificados descritos em Frei et al., Nat. Protoc., 8 (7): 1321-1336 (2013) e Frei et al., Nat. Biotechnol., 30 (10): 997-1001 (2012).
[00405] Os peptídeos receptores resultantes foram analisados por LC-MS/MS em um espectrômetro Thermo LTQ Orbitrap XL equipado com uma fonte de íons de eletrovaporização. As amostras foram me- didas no modo de aquisição dependente de dados em um gradiente de 120 min usando uma coluna compactada C18 de 10 cm. Seis amos- tras individuais no conjunto de dados CAPTIREC'TY foram analisadas com um modelo estatístico ANOVA. Este modelo assume que o erro de medição segue a distribuição gaussiana e vê características indivi- duais como réplicas da abundância de uma proteína e explica explici- tamente essa redundância. Ele testa cada proteína para abundância diferencial em todas as comparações de pares de amostras de ligante e controle e relata os valores de p. Em seguida, os valores de p são ajustados para comparações múltiplas para controlar a taxa de desco- berta falsa em todo o experimento (FDR).
[00406] As identificações de peptídeos foram filtradas para uma FDR de <= 1 % e quantificadas usando uma abordagem sem marca- dor baseada em MS1. Para a quantificação de MS1, o software não linear DYNAMICS Progenesis QI para proteômica foi usado, definido para considerar todos os peptídeos únicos. As proteínas identificadas foram filtradas para associação com os termos membrana, segregada, glicosilação, utilizando as informações fornecidas pelo Uniprot. As identificações de proteínas com base em apenas um peptídeo não fo- ram consideradas para a análise.
[00407] Os dados CAPTIREC'TY processados foram representados graficamente na forma de um gráfico do vulcão no nível de proteína, que representa a alteração de dobra versus significância estatística. O valor de p ajustado obtido para cada proteína é representado grafica- mente contra a magnitude do enriquecimento de vezes entre as duas condições experimentais. O espaço do receptor candidato é definido por um fator de enriquecimento > 4 vezes e significância estatística (valor de p ajustado por FDR < 0,01).
[00408] Das glicoproteínas observadas, a CD28 foi identificada com peptídeos no conjunto de dados de controle. Isso indicou um fluxo de trabalho CAPTIRECTY bem-sucedido. PSGL-1 foi identificado com 6 peptídeos e o próprio VISTA também foi identificado com 12 peptídeos no conjunto de dados da proteína de fusão VISTA-Fc (veja, Tabela 6). Tabela 6 ra aa 54 do Cromossoma 10
[00409] Para o parceiro de ligação identificado, PSGL-1, uma ilus- tração de Protter foi gerada (FIG. 2), que anota sítios de N-glicosilação (resíduos circundados por quadrados) e os peptídeos experimental- mente observados (preenchidos em círculos) (Omasits et al., Bioinfor- matics: advance online pub., Outubro de 2013). Este mapeamento mostra que todos os seis peptídeos detectados se localizam no domí- nio intracelular do PSGL-1. A análise do domínio extracelular de PSGL-1 revela que existem poucos sítios de clivagem de peptídeo tríp- tico no domínio extracelular, apesar do tamanho do domínio. PSGL-1 contém três sítios de N-glicosilação e os peptídeos com esses sítios teriam sido perdidos na análise por LC-MS/MS descrita acima. Os pep- tídeos potenciais restantes são muito grandes, muito pequenos ou são processados durante a seleção de proteínas, fornecendo uma justifica- tiva para a descoberta de que apenas os peptídeos mapeados para o domínio intracelular de PSGL-1 foram detectados.
[00410] Tendo em vista a análise acima, PSGL-1 foi determinado ser o parceiro de ligação heterofílico para VISTA. Visto que VISTA foi anteriormente mostrado ser um regulador de ponto de checagem ne- gativo de amplo espectro que é expresso em células hematopoiéticas (Lines et al., Cancer Res., 74 (7) 1924-1932 (2014)), os resultados acima mostram que a interação de VISTA com PSGL-1 provavelmente leva à supressão de células T. Portanto, interferir (por exemplo, inibir ou bloquear) essa interação com agentes que visam PSGL-1 e/ou VISTA, como anticorpos anti-PSGL-1 e/ou anti-VISTA, pode levar a revigoramento ou ativação de novo do sistema imunológico através de células T ativadas. Esta ativação do sistema imunológico resultará em uma resposta fisiológica altamente benéfica no tratamento de uma do- ença, distúrbio ou condição mediada por VISTA, incluindo no contexto do tratamento do câncer (por exemplo, tratamento hematológico do câncer). EXEMPLO |l Ligação de VISTA a PSGL-1
[00411] Este exemplo descreve as propriedades de ligação de VIS- TA a PSGL-1.
[00412] Uma proteína de fusão VISTA-Fc (por exemplo, descrita no Exemplo 1) foi imobilizada em uma superfície sólida e testada quanto à sua ligação ao domínio extracelular de PSGL-1. Para esses experi- mentos, dois construtos diferentes foram gerados contendo o domínio extracelular de PSGL-1. Ambas as construções foram fundidas com a sequência de sinal capa de IgG e um fragmento Fc. Além disso, uma sequência de propeptídeo ou unidade de repetição em tandem, que pode ser importante para o funcionamento adequado, foi adicionada (veja, por exemplo, Cummings R.D., Brazilian J Med Biol Res, 32: 519- 28 (1999)). As células foram co-transfectadas com os construtos que expressam glicosiltransferases GCNT1 e FUT3 para garantir a modifi- cação pós-translação adequada da proteína, que era conhecida por ser importante para a ligação de alta afinidade de PSGL-1 à P- selectina (Sako et a/., Cell, 75(6):1179-86 (1993); Yang et al., Throm- bosis and Haemostasis, 81(1):1-7 (1999); Carlow et al., Inmunol Rev 230(1):75-96 (2009); Kumar et al., Blood, 88(10):3872-9 (1996); Cummings R.D., Brazilian J Med Biol Res, 32:519-28 (1999)). As se- quências de aminoácidos dos construtos de PSGL-1 são mostradas abaixo: Construto A de PSGL-1 - Sequência de aminoácidos (PSGL-1 fundido com Fc com sequência de sinal capa de IgG e se- quência de pró-peptídeo). Sequência de sinal IgG capa = itálico; Se- quência de propeptídeo = negrito; Sequência de Fc = sublinhado.
MPLQLLLLLILLGPGNSLALWDTWADEAEKALGPLLARDRRQATEY EYLDYDFLPETEPPEMLRNSTDTTPLTGPGTPESTTVEPAARRSTGL DAGGAVTELTTELANMGNLSTDSAAMEIQTTQPAATEAQTTPLAATE AQTTRLTATEAQTTPLAATEAQTTPPAATEAQTTQPTGLEAQTTAPA AMEAQTTAPAAMEAQTTPPAAMEAQTTQTTAMEAQTTAPEATEAQT TQPTATEAQTTPLAAMEALSTEPSATEALSMEPTTKRGLFIPFSVSSV THKGIPMAASNLSVARSVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMIS RTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTY RVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQ VYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTT
PPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTOKS LSLSPGK (SEQ ID NO: 39)
[00413] Construto B de PSGL-1 - Sequência de aminoácidos (PSGL-1 fundido com Fc com sequência de sinal capa de IgG e unida- de de repetição em tandem). Sequência de sinal IgG capa = itálico; Unidade de repetição em tandem = negrito; Sequência de Fc = subli- nhado.
METDTLLLWVLLLWVPGSTGDQATEYEYLDYDFLPETEPPEMLRNST DTTPLTGPGTPESTTVEPAARRSTGLDAGGAVTELTTELANMGNLST DSAAMEIQTTAPAATEAQTTQAPVPTEAQTTPLAATEAQTTRLTATEA QTTPLAATEAQTTPPAATEAQTTQPTGLEAQTTAPAAMEAQTTAPAA MEAQTTPPAAMEAQTTATTAMEAQTTAPEATEAQTTQPTATEAQTT PLAAMEALSTEPSATEALSMEPTTKRGLFIPFSVSSVTHKGIPMAASN LSVNYPVGAPDHISVARSVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMIS RTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTY RVVSVLTVLHQODWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQ VYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTT
PPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTOKS LSLSPGK (SEQ ID NO: 40)
[00414] Para estes experimentos, construto A de PSGL-1 (PSGL- 1A) e construto B (PSGL-1B) foram testados contra VISTA-Fc imobili- zado.
[00415] A amostra VISTA-Fc imobilizada foi equilibrada em solução salina tamponada com HEPES (HBS) contendo cálcio (cloreto de cál- cio 1,5 mM) e magnésio (cloreto de magnésio 1,0 mM). O mesmo tampão foi usado como tampão fluente. As amostras contendo o PSGL-1A ou PSGL-1B, que também continha cálcio e magnésio, fo- ram fluídas através de uma superfície sólida contendo o VISTA-Fc imobilizado a uma taxa de fluxo de 60 ul/min, com 120 segundos de tempo de contato e 300 segundos para dissociação após a superfície ter sido regenerada com um pulso de 3 segundos de glicina (pH 1,5). Seis concentrações de diferença de PSGL-1A e PSGL-1B foram testa- das (0,3 uM, 0,60 uM, 1,20 uM, 2,4 uM, 4,8 uM e 9,6 UM).
[00416] Duas análises diferentes dos experimentos foram realiza- das: (1) um modelo de ligação de dois estados; e (2) uma análise de afinidade de equilíbrio (modelo 1:1). Para PSGL-1A, o modelo de liga- ção de dois estados mostrou uma afinidade de ligação (Kp) de 32,1 UM, enquanto o modelo 1: 1 mostrou uma KD de 3,01 uM (FIG. 3). Pa- ra PSGL-1B, o modelo de ligação de dois estados mostrou Kp de 5,09
UM, enquanto o modelo 1:1 mostrou uma Kp de 4,76 uM (FIG. 4).
[00417] As análises acima mostraram que havia uma resposta de sinal líquido para ambas as construções PSGL-1A e PSGL-1B. Os sensogramas resultantes mostram características associadas à liga- ção e dissociação. Nota-se que as estimativas de afinidade foram qua- litativas. Uma estimativa quantitativa da ligação pode ser possível quando a atividade de superfície é grande do que a atividade dos pre- sentes experimentos (por exemplo,> 0,5 % com uma construção PSGL-1 purificada). Além disso, nesses experimentos usando injeções de PSGL-1A resultou em transporte de amostra em execuções subse- quentes. Nestes experimentos, as afinidades estimadas entre VISTA e PSGL-1 foram comparativamente semelhantes, PSGL-1A (cerca de 3 UM) e PSGL-1B (cerca de 5 uM). EXEMPLO Ill Ligação de VISTA a PSGL-1 em células
[00418] Este exemplo descreve a ligação de VISTA a PSGL-1 ex- presso por uma linha celular promielocitóica (HL-60; ATCC, CCL-240) usando uma abordagem de reticulação bifuncional.
[00419] Nestes experimentos, a expressão de PSGL-1 foi avaliada usando um anticorpo monoclonal anti-PSGL-1 conjugado com PE (Ab- cam; ab78188) designado KPL-1. A expressão de PSGL-1 por células HL-60 foi detectada por citometria de fluxo usando métodos padrão (FIG. 5). O número de cópias da proteína PSGL-1 foi estimado em aproximadamente 263.000 + 2.800 por célula.
[00420] “Também nestes experimentos, as amostras da proteína de fusão VISTA-Fc (descrito no Exemplo |) e controles negativos de um anticorpo anti-CD28 (BioXcell, BEO248) e IgG1-Fc (R&D Systems; 110-HG-100) foram acoplados covalentemente a um ligador bifuncio- nal (Sulfo-SBED - ThermoFisher Scientific; 33073) nas condições de fabricação recomendadas. As amostras resultantes foram incubadas com células HL-60 por 30 min. à temperatura ambiente em um sítio escuro. A reticulação foi fotoativada com uma fonte de luz UV por 20 min. As células foram então lisadas e um pull-down da Proteína À Sepharose foi realizado. Um Western Blot usando um anticorpo poli- clonal anti-PSGL-1 (R&D Systems; AF3345) ou Estreptavidina-HRP foi realizado nas amostras.
[00421] “Como mostrado na FIG. 6, o VISTA-Fc interage com PSGL- 1, mas não com o IgG-Fc de controle de isotipo negativo ou o anticor- po anti-CD28.
[00422] “Experimentos adicionais foram realizados confirmando a especificidade desta interação. A experiência acima foi repetida, exce- to antes da incubação das proteínas marcadas com Sulfo-SBED com as células HL-60, um anticorpo monoclional anti-VISTA foi adicionado às células. A análise foi conduzida usando ImageQuant.
[00423] “Como mostrado na FIG. 7, a inoculação com um anticorpo anti-VISTA resultou na atenuação da interação entre VISTA e PSGL-1.
[00424] Esses experimentos mostram que o PSGL-1 expresso em células HL-60 é um parceiro de ligação para VISTA. Esses experimen- tos também mostram que essa interação é específica e atenuada por anticorpos bloqueadores anti-VISTA. EXEMPLO |V Ligação de VISTA a PSGL-1 em PBMCs
[00425] Este exemplo descreve a ligação de VISTA a PSGL-1 ex- presso por células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) usando uma abordagem de reticulação.
[00426] Nestes experimentos, a expressão de PSGL-1 foi avaliada usando um anticorpo monoclonal anti-PSGL-1 conjugado com PE (Ab- cam; ab78188) designado KPL-1. A expressão de PSGL-1 por PBMCs foi detectada por citometria de fluxo usando métodos padrão (FIG. 8). O número de cópias da proteína PSGL-1 foi estimado em aproxima-
damente 38.000 por célula.
[00427] Além disso, PBMCs foram deixadas sem tratamento ou in- cubadas com um agente de reticulação (BS? 10 mM; ThermoFisher Scientific; 21580) por 90 min. no gelo. Após a extinção da reação de reticulação quando necessário, as células foram lisadas e os lisados resultantes foram pré-limpos com Herceptin e GammaBind Plus Sepharose (GE Healthcare; 17-0886-01). As amostras resultantes fo- ram imunoprecipitadas com anticorpo anti-VISTA ou um anticorpo anti- PSGL-1 (KPL-1) durante a noite. As amostras imunoprecipitadas foram testadas por Western Blot usando um anticorpo policlonal anti-PSGL-1 (R&D Systems; AF3345).
[00428] “Conforme mostrado na FIG. 9, linha 4, após reticulação, nenhuma banda específica de PSGL-1 foi detectada após imunopreci- pitação com um anticorpo anti-VISTA. Por exemplo, isso pode ser de- vido ao bloqueio de epítopos específicos na formação do complexo VISTA-PSGL-1 e, portanto, evitando a imunoprecipitação. O anticorpo anti-PSGL-1 precipitou vários complexos de peso molecular mais alto (— 250-450 kDa) em PBMCs tratadas com BSº (FIG. 9, última pista), que também eram positivos para PSGL-1.
[00429] Nessos experimentos, os anticorpos anti-VISTA e anti- PSGL-1 precipitaram uma proteína de — 240 kDa a partir de PBMCs não tratadas com nenhum dos reticuladores. Este complexo era positi- vo para PSGL-1, demonstrando que PSGL-1 interage com VISTA (FIG. 9, pistas 3 e 5). A imunoprecipitação com anticorpo de controle de isotipo não produziu tal banda (FIG. 9, pistas 1 e 2).
[00430] Esses experimentos mostram que o PSGL-1 expresso em PBMCs é um parceiro de ligação para VISTA.
EXEMPLO V Expressão de PSGL-1
[00431] Este exemplo descreve a expressão de PSGL-1 em vários subconjuntos de células T.
[00432] Nessos experimentos, a expressão de PSGL-1 foi avaliada usando um anticorpo CD162 anti-humano conjugado com PE. Os se- guintes subconjuntos de células T foram avaliados: células virgens e em repouso (por exemplo, fenótipo relatado: CD45RO/CD45RA*/ CCORT*/CDE2L*+/CD27*/CD28*/CD127*), células efetoras (por exemplo, fenótipo relatado: CD45RO*/CD57*/CD279/CD95*/CCR7/CD62L'), células efetoras exauridas (por exemplo, fenótipo relatado: CD45RO*/ CD57*/CD279*/CD9I5*+/CDA4SRA/CCOR7/CD62L) e células de memória circulantes (por exemplo, fenótipo relatado: Central: CD45RO*/ CD45RA/CCR7*/CD62L* ou Efetor: CD45RO*/CD45RA/CCR7/ CD62L*).
[00433] Nesses experimentos, as amostras de PBMC humanas fo- ram obtidas na ALLCELLS (Emeryville, CA). Dois painéis de marcado- res de células T foram preparados da seguinte forma: a. Painel 1: marcadores de células T + marcadores específicos de efe- tor/efetor exaurido i. CD45RA-FITC ii. CD45RO-PerCP-eFluor 710 iii. CD197 (CCR7)-Brilliant Violet 510 iv. CD62L-APC-eFluor 780 v. CD57-Pacific Blue vi. CD95 (Fas)-PE-Cy7 vii. CD279-APC viii. CD162-PE b. Painel 2: marcadores de células T + marcadores específicos Nai- ve/em repouso ix. CD45RA-FITC x. CD45RO-PerCP-eFluor 710 xi. CD197 (CCR7)-Brilliant Violet 510 xii. CD62L-APC-eFluor 780 xiii. CD27-Pacific Blue xiv. CD28-PE-Cy7 xv. CD127-APC xvi CD162-PE
[00434] —Nessos experimentos, aproximadamente 1E6 células e re- agente de bloqueio FcR (Miltenyl-Biotec, 130-092-247) foram adicio- nados a cada painel junto com os controles de isotipo apropriados pa- ra cada anticorpo e incubados por 30 min. a 4 ºC no escuro. As células foram então lavadas e as Intensidades de Fluorescência Médias (MFI) foram calculadas para cada amostra em um Analisador MACS Quant. Os valores de MFI foram quantificados usando o kit Quantum Simply Cellular anti-Mouse IgG (Bangs Laboratories, 815B). 1E5 eventos por fluoróforo foram coletados da população viável (DAPI negativo) e ex- portados para análise no FlowJo.
[00435] “Conforme mostrado nas FIGS. 10 e 11, o PSGL-1 estava presente nos subconjuntos de células T centrais e efetoras virgens/em repouso, efetoras, exauridas. Também mostrado nas FIGS. 10 e 11,a expressão de PSGL-1 foi elevada em subtipos efetores em relação às células T virgens e exauridas. O nível mais alto de expressão estava no subconjunto efetor, enquanto o nível mais baixo de expressão esta- va no subconjunto virgem/em repouso. A Tabela 7 mostra os números de cópia para a expressão PSGL-1 em cada subconjunto. Tabela 7
[00436] Esses experimentos mostram que o PSGL-1 é expresso diferencialmente em vários subconjuntos de células T em PBMCs hu- manos.
EXEMPLO VI Análise in silico da expressão de VISTA e PSGL-1.
[00437] Este exemplo mostra que a expressão VISTA está correla- cionada com PSGL1 em várias indicações.
[00438] O Genoma de Câncer Atlas (TCGA) fornece uma análise abrangente dos perfis do genoma do câncer com tecnologias de alto rendimento, incluindo sequenciamento de próxima geração e métodos baseados em microarranjo. Os dados depositados pelo TOGA contêm informações sobre a sequência de nucleotídeos e a expressão do gene. O site cBioportal para Cancer Genomics (http://www .cbioportal.org/) for- nece visualização, análise e download de conjuntos de dados genômi- cos de câncer em grande escala. Inclui estudos de genômica e tran- scriptômica do TCGA.
[00439] Para cada indicação de TCGA, o sítio cBioportal foi consul- tado para identificar o MRNA cuja expressão se correlaciona mais com VISTA. Essa análise de correlação foi realizada por meio do teste de Spearman. Os resultados estatísticos (p valor < 0,05) são apresenta- dos na Tabela 8; Os mMRNAs são classificados com base em sua cor- relação com VISTA. Tabela 8 INDICA- PSGL1 (SEPLG) VSIG3 (IGSF11) VSIG8 coef, de corr, | Classifi- | coef, de corr, | Classifi- | coef, de corr, | Classi- de Spearman | cação* | de Spearman | cação* | de Spearman | ficação* 0,72 1 -0,02 8812 0,07 14042 (LUAD) Endome- trial 0,72 2 -0,02 9150 0,01 8031 (UCEC)
INDICA- PSGL1 (SEPLG) VSIG3 (IGSF11) VSIG8
ÇÃO coef, de corr, | Classifi- | coef, de corr, | Classifi- | coef, de corr, | Classi- de Spearman | cação* | de Spearman | cação* | de Spearman | ficação* Melano- ma 7 -0,31 19751 |005 7401 (SKCM) saNSCLC 0,68 -0,24 17909 | 0,03 7886 (LUSC) Fígado 0,62 10 0,13 4558 0,15 5208 (LIHC) Rim 0,49 34 -0,11 16030 |-0,17 9336 (KIRC) Colorretal 0,17 3931 -0,04 13252 (COAD) Bexiga 0,41 35 -0,22 18573 |-0,12 14214 (BLCA)
[00440] A Tabela8 mostra que a expressão PSGL1 se correlaciona altamente com a expressão VISTA em vários cânceres. A correlação é mais alta em NSCCLC. Por comparação, outros receptores putativos (isto é, VSIG3 e VSIG8) mostraram apenas correlação fraca.
EXEMPLO VII Avaliação da expressão de mRNA de VISTA e PSGL1 com escopo de RNA
[00441] Este exemplo mostra o padrão de expressão de mRNA e colocalização de VISTA e PSGL1 em microarranjos de tecido (TMA) de carcinoma de células escamosas de pulmão (SCC) e adenocarci- noma (ADK). Materiais e métodos
[00442] Blocos de pulmão embebidos em parafina TMA de SCC e ADK (3 blocos cada) foram recentemente seccionados e processados em lâminas de vidro antes das etapas técnicas de hibridização in situ (ISH) serem realizadas. As amostras de tecido dissecado foram colo- cadas em formalina tamponada neutra a 10 % fresca (NBF) por 16-32 horas em temperatura ambiente (RT). As amostras foram então desi- dratadas, incluídas em parafina e cortadas em seções de 5 + 1 um que foram montadas em lâminas Superfrost& Plus. As lâminas foram cozi- das em estufa a seco por 1 hora a 60 ºC.
[00443] Seções de tecido com 5 um de espessura foram desparafi- nizadas em xileno, seguido por desidratação em uma série de etanol. As seções de tecido foram então incubadas em tampão de citrato (10 nmol/L, pH 6) mantido a uma temperatura de ebulição (100 ºC a 103 ºC) usando uma placa quente por 15 minutos, enxaguadas em água desionizada e imediatamente tratadas com 10 ug/mL de protease (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) a 40 ºC por 30 minutos em um forno de hibridização HybEZ (Advanced Cell Diagnostics, Hayward, CA).
[00444] As seções de tecido tratadas foram então hibridizadas com as sondas de PSGL-1 ou VISTA usando o ensaio RNAscopeO 2.5 (Advanced Cell Diagnostics, Hayward, CA), seguindo as instruções do fabricante.
[00445] As lâminas foram manchadas com hematoxilina e eosina para realizar uma verificação de qualidade e uma avaliação microscó- pica de cada núcleo. O exame foi realizado usando um microscópio óptico padrão com aumento de 20 a 40X. A planilha Excel foi utilizada para aquisição de dados.
[00446] Verificações de controle negativo e positivo foram geradas usando 2 sondas específicas. Esses escores foram avaliados para confirmar a ausência de contaminação (sondas negativas) e a presen- ça de mMRNA ubíquo (sondas positivas). O protocolo foi executado manualmente.
[00447] Os tecidos marcados foram avaliados usando um método semiquantitativo com um sistema de classificação duplo para cada al- vo.
[00448] O sistema de classificação de distribuição de tecido variou de O a 3 e representou a extensão de células positivas dentro da popu- lação (infiltrado imune) e foi considerado um imunoclassificação.
[00449] Sistema de graduação de imunoclassificação: variou de O a 3 da seguinte forma: * 0: ausente * 1: baixo * 2: moderado 3: alto
[00450] O sistema de graduação ACD, isto é, o sistema de gradua- ção recomendado pelo fabricante do ensaio RNAscope& 2.5 (Advan- ced Cell Diagnostics, Hayward, CA), foi usado para estimar a quanti- dade de pontos de RNA dentro das células. Cada ponto representa uma única molécula de RNA, pois o RNAscope detecta moléculas in- dividuais de RNA. Este sistema variava de O a 4 em relação ao núme- ro de pontos e/ou clusters (0: nenhum ponto; 4: vários pontos e clus- ters) no citoplasma e pode ser considerado como um sistema de clas- sificação intracelular. Resultados TMA de SCC de Pulmão
[00451] Três TMAs de SCC de pulmão foram analisados. Uma tri- plicata de núcleos estava presente para cada paciente. Tabela 9 Nsmede mess — fi as
[00452] A marcação de ambos os mRNAs de VISTA e PSGL-1 foi observada principalmente no microambiente tumoral (infiltrados de cé- lulas imunes). As células marcadas com positivo mostraram uma mor- fologia mieloide (relacionada a macrófagos). No entanto, alguns pon- tos positivos foram ocasionalmente observados em linfócitos (ambos
MRNAs) e neutrófilos (apenas VISTA).
[00453] O mRNA de VISTA foi predominante nos infiltrados do mi- croambiente tumoral. Todos os núcleos de SCC do pulmão expressa- ram este alvo em alguma extensão. Os pontos pareciam pequenos e numerosos dentro do citoplasma. Ocasionalmente, as células endote- liais exibiam pontos VISTA. Células tumorais de MRNA VISTA positi- vas foram observadas em mais de 80 % dos núcleos.
[00454] Em comparação com VISTA, a expressão de mRNA de PSGL-1 foi menor nos infiltrados do microambiente tumoral. Os pontos pareceram maiores, mas eram menos no citoplasma do que os pontos VISTA. As células tumorais ocasionalmente expressavam mRNA de PSGL-1 (30 % dos núcleos); na maioria das vezes, o grau de ACD (ou seja, número de pontos no citoplasma) era bastante baixo.
[00455] “Quase todos os núcleos exibiram uma marcação de mMRNA de VISTA positiva moderada a alta em comparação com 35 % para MRNA de PSGL-1. Nenhum dos núcleos parecia negativo para ambos Os alvos, ou seja, cada um dos núcleos era positivo para VISTA, PSGL-1 ou ambos. Os resultados estão resumidos na Tabela 10. Tabela 10 Imunoclassificação de MRNA de VISTA Imunoclassificação de mMRNA de PSGL-1
[00456] Em conclusão: e Colocalização do MRNA de VISTA e PSGL-1 foi observa- da dentro do microambiente tumoral, um exemplo do qual é mostrado na FIG. 12; e quase todas as células positivas para PSGL1 eram adja- centes a células positivas para VISTA; e em cada núcleo, pelo menos algumas células que expres-
sam igualmente PSGL-1 e VISTA foram observadas; e células positivas para VISTA puderam ser observadas sem células adjacentes positivas para PSGL-1. Algumas células posi- tivas para VISTA puderam ser observadas sem células positivas PSGL-1 adjacentes aparentes. No entanto, nenhuma célula positiva para PSGL-1 sem célula positiva para VISTA adjacente foi observada, o que significa que células positivas para PSGL-1 estavam sempre ad- jacentes às células positivas para VISTA. Isso se deve em parte ao fato das células positivas para VISTA estarem predominantes no infil- trado imune.
ADK TMA de Pulmão
[00457] Três ADK TMA de pulmão foram analisados. Um quadrupli- cado de núcleos estava presente para cada paciente.
Tabela 11
[00458] “Quanto ao SCC de pulmão, a marcação de mRNA de VIS- TA e PSGL-1 foi observada no microambiente tumoral (infiltrado de células imunes). As células marcadas positivas mostraram uma morfo- logia mieloide (relacionada aos macrófagos). No entanto, alguns pon- tos positivos foram ocasionalmente observados em linfócitos (ambos os alvos) e neutrófilos (somente VISTA).
[00459] O padrão de expressão igualmente para VISTA e PSGL-1 foi muito semelhante em ADK do pulmão ao que foi observado em SCC de pulmão.
[00460] Mais de 50% dos núcleos exibiram uma marcação positiva alta para o MRNA de VISTA, enquanto aproximadamente 50% dos nú- cleos mostraram marcação positiva para o MRNA de PSGL1. Para PSGL-1, alguns núcleos pareceram negativos (7%). Os resultados são resumidos na Tabela 12. Tabela 12 Imunoclassificação de mRNA de Imunoclassificação de mRNA de
[00461] Colocalização semelhante ou padrões de relacionamento entre mMRNA de VISTA e PSGL-1 foram observados em ADK de pul- mão como em SCC de pulmão.
[00462] A análise semiquantitativa dos padrões de expressão de MRNA de VISTA e PSGL-1 por RNAscope dual revelou que os alvos eram frequentemente colocalizados ou expressos dentro de células adjacentes no microambiente tumoral. O MRNA de VISTA pareceu ser mais expresso do que PSGL1. No entanto, todos os núcleos de SCC de pulmão e 83% dos núcleos de ADK de pulmão expressaram ambos os alvos.
[00463] O RNAscope revela que o PSGL-1 pode ser expresso nas mesmas células ou na vizinhança das células de expressão de VISTA
EXEMPLO VIII Liberação de IL-2 a partir de células T CD4* na presença de anti- corpos PSGL-1Fc +/- anti VISTA ou anti-PSGL1 (72h)
[00464] Este exemplo descreve a inibição mediada por PSGL-1 da ativação de células T.
Métodos:
[00465] As experiências foram feitas em triplicado.
[00466] As células T CD4+ foram isoladas de dois doadores huma- nos saudáveis por seleção negativa usando kits Milenyi.
[00467] Um anticorpo anti-CD3 (comercializado por eBiosciences, BioxCell ref BEOO01-2 clone OKT3 lote 640417J1 (mIlgG2a)) foi reves-
tido em placas de 96 cavidades na concentração de 2,5 ug/ml em 100 ul por 4h a 37 ºC. Em seguida, as placas foram lavadas 2 vezes com PBS. O anticorpo C9G4 e a proteína de fusão PSGL-1-Fc foram reves- tidos durante a noite a 4 ºC a uma concentração de 224 nM em 100 ul em triplicados.
[00468] As placas foram lavadas 4 vezes com PBS. 100.000 células T CD4* que adicionamos a cada cavidade em 200 ul de meio contendo um anticorpo anti-CD28 (2,5 ug/ml) e com ou sem o anticorpo anti- VISTA 26A (10 pg/ml) que é descrito em WO 2014/197849 (mais es- pecificamente, o anticorpo utilizado foi um anticorpo humanizado com as seguintes sequências de CDR, conforme descrito em WO 2014/ 197849: CDRH1: SEQ ID Nº 1297, CDRH2: SEQ ID Nº 1559, CDRH3: SEQ ID Nº 1394, CDRL1: SEQ ID Nº 1432, CDRL2: SEQ ID Nº 1477, e CDRL3: SEQ ID Nº 1499, ou o anticorpo de controle C9G4 (descrito em WO 2015/162292A).
[00469] Após uma incubação de 72h, os sobrenadantes foram re- movidos e centrifugados por 5 minutos em 1200 rpm. Após centrifuga- ção, os sobrenadantes foram transferidos para novas placas de 96 ca- vidades e congelados a -80 ºC até IL-2 ser testada.
[00470] A concentração de IL-2 nos sobrenadantes foi medida usando um kit comercial (BDTYCBA Human IL2 Flex Set, Reftt558270). Resultados:
[00471] A fim de testar as propriedades imunossupressoras de PSGL-1, o status de ativação das células T foi examinado após a es- timulação na presença ou ausência da proteína. Para este fim, uma proteína de fusão PSGL-1-Fc foi primeiro modificada, consistindo no domínio extracelular de PSGL-1 e na região Fc de IgG humana. As células T CD4* foram, então, ativadas por anticorpos anti-CD3 e CD28 na presença PSGL-1-Fc ou um IgG de controle. A liberação de IL-2 foi monitorada, como um marcador de ativação dessas células.
[00472] “Conforme mostrado na FIG. 13, a incubação de células T na presença de PSGL-1 desencadeia uma redução de 2 vezes na libe- ração de |L-2, um marcador de ativação de células T, em comparação ao controle, ou seja, uma proteína irrelevante revestida na mesma concentração (c9G4) . Os resultados obtidos foram semelhantes para os dois doadores diferentes. Assim, o PSGL-1 inibe a ativação das células T.
[00473] A adição de anticorpos anti-VISTA reverte parcialmente es- ta inibição (veja, FIG. 13). Na verdade, mais de 50% da inibição foi ali- viada pelos anticorpos anti-VISTA. A adição do anticorpo de controle (c9G4) não afetou a inibição da liberação de IL-2 pelo PSGL1-Fc, en- fatizando a especificidade do efeito observado com os anticorpos anti- VISTA. Esta reversão específica após adição de anticorpos anti-VISTA demonstra que a inibição dependente de PSGL-1 da ativação de célu- las T é pelo menos parcialmente mediada por VISTA.
[00474] Esses resultados confirmam que VISTA e PSGL1 intera- gem tanto física quanto funcionalmente. A interrupção dessa interação (aqui com anticorpos anti-VISTA) realça a liberação de IL-2 e, portan- to, a ativação de células T.

Claims (26)

REIVINDICAÇÕES
1. Método in vitro para o diagnóstico de um tumor mediado por VISTA em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreen- de as etapas de: a) contatar uma amostra biológica do referido indivíduo com um reagente capaz de se ligar especificamente ao ácido nucleico ou proteína PSGL-1; e b) quantificar a ligação do referido reagente com a referida amostra biológica, determinando assim o nível de expressão de PSGL- 1 na referida amostra.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido reagente é escolhido entre uma sonda de DNA, uma sonda de RNA e um anticorpo anti-PSGL-1.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracteri- zado pelo fato de que a ligação de PSGL-1 em infiltrados imunes do microambiente tumoral é quantificada.
4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma etapa de classificação do tumor comparando o nível da etapa (B) a uma escala apropriada com base em dois parâmetros que são a intensidade da coloração e a porcentagem de células positivas.
5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma etapa de comparação do nível de expressão da etapa b) com um nível de refe- rência, em que um aumento no nível testado de PSGL-1 na etapa (b) comparado ao nível de referência é indicativo de um tumor mediado por VISTA.
6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o referido nível de referência é o nível de expressão de PSGL-1 em amostras de tecido normal.
7. Método, de acordo com a reivindicação 5 ou 6, caracteri- zado pelo fato de que: e etapa a) compreende ainda medir o nível de expressão de pelo menos um dentre VISTA, CD11b, CD33, CD4 e CD8 pelos referi- dos infiltrados imunes na referida amostra biológica; e e etapa b) compreende comparar o nível de expressão da etapa a) com um nível de controle, em que um aumento no nível testado de PSGL-1 e/ou VISTA, CD11b, CD33, CD4 ou CD8 em comparação com o nível de controle de PSGL- 1 e/ou VISTA, CD11b, CD33, CD4 ou CD8 , é indicativo de um câncer mediado por VISTA.
8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações a 7, caracterizado pelo fato de que o tumor mediado por VISTA é selecionado a partir do grupo que consiste em cânceres hematológicos (por exemplo, leucemias, linfomas ou mielomas), cânceres de bexiga, mama, cólon, tecido conjuntivo, reto, câncer gástrico, esofágico, pul- monar, laringe, rim, oral, ovário ou de próstata, ou sarcomas, melano- mas ou gliomas, ou metástases de qualquer um desses.
9. Agente terapêutico anti-VISTA para uso no tratamento de um câncer mediado por VISTA em um paciente, o referido uso carac- terizado pelo fato de que compreende uma etapa anterior de diagnós- tico do referido câncer mediado por VISTA no referido paciente, como definido nas reivindicações 1 a 8.
10. Agente terapêutico anti-VISTA para uso de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o referido agente é um anticorpo anti-VISTA.
11. Agente terapêutico anti-VISTA para uso de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo anti-VISTA é selecionado a partir do grupo que consiste em: a) um anticorpo anti-VISTA, o referido anticorpo compreen-
dendo uma cadeia pesada compreendendo 3 CDRs das sequências SEQ ID NOs: 1296, 1354 e 1393, conforme definido por Kabat; e uma cadeia leve compreendendo 3 CDRs de sequências SEQ ID NOs: 1432, 1477 e 1499, conforme definido por Kabat; e b) um anticorpo anti-VISTA, o referido anticorpo compreen- dendo uma cadeia pesada compreendendo 3 CDRs das sequências SEQ ID NOs: 1296, 1559 e 1393, conforme definido por Kabat; e uma cadeia leve compreendendo 3 CDRs das sequências SEQ ID NOs: 1432, 1633 e 1499, conforme definido por Kabat.
12. Agente terapêutico anti-VISTA para uso de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo anti-VISTA é um anticorpo humanizado.
13. Agente terapêutico anti-VISTA para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 12, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma etapa de adaptação do tratamento com o agente terapêutico anti-VISTA, em que a referida adaptação do trata- mento é: - uma redução ou supressão do referido tratamento com agente terapêutico anti-VISTA se o paciente tiver sido diagnosticado como não respondendo ao agente terapêutico anti-VISTA, ou - a continuação do referido tratamento com agente terapêu- tico anti-VISTA se o paciente tiver sido diagnosticado como respon- dendo ao agente terapêutico anti-VISTA.
14. Anticorpo caracterizado pelo fato de que agoniza ou an- tagoniza a interação de VISTA e PSGL-1.
15. Anticorpo de acordo com a reivindicação 14, caracteri- zado pelo fato de que é um anticorpo anti-PSGL-1 agonístico ou frag- mento de anticorpo.
16. Anticorpo de acordo com a reivindicação 14, caracteri- zado pelo fato de que é um anticorpo anti-PSGL-1 antagonista ou fra-
gmento de anticorpo.
17. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 16, caracteri- zado pelo fato de que o referido anticorpo é capaz de inibir ou bloque- ar a ligação de PSGL-1 ao domínio extracelular de VISTA.
18. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 16, caracteri- zado pelo fato de que o referido anticorpo é capaz de inibir ou bloque- ar a ligação de uma célula de expressão de VISTA a uma célula T de expressão de PSGL-1.
19. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 18, caracteri- zado pelo fato de que a célula de expressão de VISTA é uma célula mieloide, uma célula dendrítica, um macrófago ou uma célula T.
20. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 18 ou 19, ca- racterizado pelo fato de que a célula de expressão de VISTA é uma célula tumoral.
21. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 18 a 20, caracterizado pelo fato de que a célula de expressão de PSGL-1 é uma célula T.
22. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 14 a 21, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo não bloqueia ou inibe a ligação de PSGL-1 à P-selectina, L-selectina ou E- selectina.
23. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo como definido em qualquer uma das rei- vindicações 14 a 22 e veículos, excipientes e/ou estabilizadores fisio- logicamente aceitáveis.
24. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 23, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um antago- nista para uma molécula coinibidora ou um agonista para uma molécu- la coestimuladora.
25. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica-
ção 24, caracterizada pelo fato de que o antagonista é um anticorpo contra a molécula coinibidora.
26. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindica- ção 24 ou 25, caracterizada pelo fato de que a molécula coinibidora é selecionada a partir do grupo que consiste em CD86, CD80, PDL-1, PDL-2, CTLA-4, PD1, LAG3, BTNL2, B7-H3, B7-H4, uma butirofilina, CD48, CD244, TIM-3, CD200R, CD200, CD160, BTLA, HVEM, LAIR1, TIM1, Galectina 9, TIM3, CD48, 2B4, CD155, CD112, CD113 e TIGIT.
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