BR112020019972A2 - Métodos para identificar um receptor de aloenxerto renal e para identificar um receptor de aloenxerto renal em risco de rejeição aguda do aloenxerto antes do transplante, kit para identificar receptores de aloenxerto renal e método para selecionar um paciente com aloenxerto renal - Google Patents
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Abstract
são revelados aqui conjuntos de assinatura gênica expressos por receptores de aloenxerto renal antes do transplante que determinam o risco de rejeição aguda (ar) pós-transplante e métodos de uso de conjuntos de assinatura gênica para identificar receptores de aloenxerto renal em risco de rejeição aguda. também são revelados aqui kits para uso na invenção, que compreendem pares de iniciadores para os conjuntos de assinatura gênica.
Description
[001] Esta invenção se refere ao campo da biologia molecular e, mais particularmente, à detecção de assinaturas moleculares de mRNA. Mais particularmente, esta invenção se refere a métodos para diagnosticar o risco de um receptor de aloenxerto renal desenvolver rejeição aguda e perda de aloenxerto. Os métodos compreendem a análise do sangue de receptores de aloenxerto renal determinando o nível de expressão de um conjunto de assinatura de mRNA compreendendo 23 mRNAs pré-selecionados, a fim de identificar e tratar tais pacientes pré- e pós-transplante. Uma análise de expressão diferencial pode ser aplicada a valores de contagem de leitura de expressão normalizada (por exemplo, contagens de leitura de genes a partir da tecnologia de sequenciamento de próxima geração) de genes selecionados para derivar uma pontuação de risco cumulativa ponderada para o risco de rejeição aguda e perda de aloenxerto que pode ser obtida para cada paciente.
[002] O transplante renal é o tratamento de escolha para indivíduos com doença renal em estágio terminal (ESRD). No entanto, apesar das melhorias notáveis na perda do enxerto em 1 ano na última década, em cada ano subsequente após o transplante, aproximadamente 3% dos receptores de aloenxerto renal retornam à diálise ou requerem retransplante. Embora dados recentes possam indicar um ligeiro aumento na perda de enxerto de médio prazo desde 2006, associado a uma melhor função renal, as taxas de falha tardia do enxerto permanecem relativamente inalteradas desde a década de 1990.
[003] Danos crônicos no aloenxerto ou fibrose intersticial e atrofia tubular de causa desconhecida são responsáveis pela maioria dos casos de perda de enxerto. Isso impulsionou as pesquisas destinadas a compreender e contrastar os mecanismos responsáveis por esses eventos tardios, incluindo, entre outros, a formação de aloanticorpos e a recorrência da doença primária.
Na verdade, a falta de melhorias a longo prazo, apesar da redução drástica da rejeição aguda, desafiou a suposição de que a rejeição aguda representa um dos principais determinantes dos resultados do enxerto a longo prazo. Esta suposição, no entanto, contrasta com a evidência de que a rejeição aguda precoce (EAR) com uma pontuação de inflamação/ tubulite de 1 ou superior com base em biópsias renais obtidas antes de 6 meses após o transplante, tanto clinicamente manifestada quanto subclínica, afeta negativamente a perda de enxerto a longo prazo em pacientes recebendo regimes imunossupressores atuais. Portanto, a EAR ainda representa um dos principais alvos da terapia imunossupressora após o transplante.
[004] Uma das principais questões dos protocolos imunossupressores atuais é o fato de que eles não são adaptados às necessidades de um único paciente. A prática clínica atual depende de amplos critérios clínicos, incluindo anticorpos anti-HLA, raça, transplante anterior e idade do receptor para prever o risco imunológico individual pós-transplante.
Esses indicadores apresentam desempenho insatisfatório. Como resultado, a maioria dos pacientes recebe um protocolo imunossupressor padronizado, resultando em alguns indivíduos expostos a muita ou a pouca imunossupressão, com complicações resultantes. A identificação precoce de indivíduos com maior risco de rejeição aguda poderia permitir terapias direcionadas destinadas a melhorar os resultados a longo prazo.
[005] Existem evidências de que a composição e função do sistema imunológico em pacientes antes do transplante renal afetam o risco de rejeição aguda (AR) subsequente após o transplante, mas nenhum biomarcador foi identificado para quantificar esse risco. O que é necessário são conjuntos de assinatura gênica que podem ser usados para o perfil de transcrição do sangue dos pacientes antes do transplante renal para prever episódios de rejeição aguda.
[006] Os presentes inventores identificaram e validaram um conjunto de 23 genes baseado em sangue em receptores de aloenxerto antes do transplante, que prevê o risco de EAR e está associado a AR tardia e perda de aloenxerto. A aplicação deste conjunto de genes permite a estratificação imunológica de pacientes transplantados antes do transplante, permitindo assim uma abordagem individualizada da terapia imunossupressora.
[007] São revelados aqui perfis de genes expressos por receptores de aloenxerto renal antes do transplante que determinam o risco de rejeição aguda (AR) pós-transplante.
[008] Em um aspecto, a presente invenção fornece um método para identificar um receptor de aloenxerto renal em risco de desenvolver rejeição aguda, compreendendo as etapas de (a) determinar os níveis de expressão de genes em um conjunto de assinatura gênica em uma amostra de sangue obtida do receptor; (b) comparar os níveis de expressão dos genes no conjunto de assinatura gênica com os níveis de expressão dos mesmos genes no conjunto de assinatura gênica em um conjunto de genes de controle, e (c) determinar que o receptor estará em risco de rejeição aguda e perda de aloenxerto se o nível de expressão de um ou mais genes no conjunto de assinatura gênica na amostra for alterado em comparação com o nível de expressão do mesmo um ou mais genes no conjunto de assinatura gênica no controle.
[009] Em outro aspecto, os resultados do nível de expressão do gene do ensaio são aplicados para resumir como uma pontuação cumulativa ponderada (r) o risco de EAR. A fórmula empregada para a avaliação de risco é r = -(log10(p1)*g1+log10(p2)*g2+…+log10(pi)*gi+...+log10(p23)*g23), onde pi é o valor de significância p do teste t nos valores de expressão para o gene i (i = 1...23) entre os grupos EAR versus não-EAR no conjunto de treinamento, gi é um número lógico para o gene i (i = 1...23), 1 (se o valor de expressão do gene i for maior do que o valor de expressão mediano do grupo EAR do conjunto de treinamento para um gene regulado positivamente ou se o valor de expressão do gene i for menor do que o valor de expressão mediano do grupo não-EAR do conjunto de treinamento para um gene regulado negativamente), ou -1 (se o valor de expressão do gene i for menor do que o valor mediano do grupo não- EAR do conjunto de treinamento para um gene regulado positivamente ou se o valor de expressão do gene i for maior do que o valor mediano do grupo não- EAR do conjunto de treinamento para um gene regulado negativamente), ou 0 (se o valor de expressão do gene i estiver entre os valores medianos dos grupos EAR e não-EAR do conjunto de treinamento). A pontuação cumulativa ponderada (r) pode ser usada como uma pontuação de risco para rejeição aguda para cada paciente. Se a pontuação de risco do paciente for maior do que os pontos de corte dos valores de expressão tercil definidos a partir do conjunto de dados de treinamento, então o paciente corre o risco de rejeição aguda.
[010] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um kit para identificar receptores de aloenxerto renal que estão em risco de rejeição aguda, compreendendo em um ou mais recipientes separados, pares de iniciadores para o conjunto de assinatura gênica: GZMH, ADGRG1, S1PR5, FGFBP2,
NKG7, PRF1, KIAA1671, LAG3, TARP, FCRL6, FASLG, TBX21, TOX, ZNF831, CD8A, C1orf21, CCR5, LDOC1L, CCDC102A, HOPX, PRKCH, SLC25A34, F12, tampões, um painel de genes de manutenção, iniciadores para o painel de genes de manutenção, controles negativos e instruções de uso.
[011] Em ainda outro aspecto, a presente invenção fornece um método para identificar um receptor de aloenxerto renal em risco de rejeição aguda do aloenxerto antes do transplante, compreendendo as etapas de (a) isolar mRNA de uma amostra de sangue do receptor de aloenxerto renal, (b) sintetizar cDNA a partir do mRNA; (c) determinar os níveis de expressão do conjunto de assinatura gênica de 23 membros no sangue do referido receptor; e (d) diagnosticar o receptor de aloenxerto como estando em risco de rejeição aguda e perda de aloenxerto se a pontuação de risco cumulativa ponderada (r) calculada a partir dos níveis de expressão do conjunto de genes de 23 membros for maior do que o ponto de corte tercil, e (e) tratar o receptor identificado como estando em risco de rejeição aguda ou perda de aloenxerto com terapia de indução ou administrar imunossupressão de manutenção mais elevada, tal como doses alvo mais elevadas de inibidores de calcineurina.
[012] Em ainda outro aspecto, a presente invenção fornece um método para tratar pacientes que estão em baixo risco de rejeição aguda e/ou perda de enxerto, compreendendo administrar imunossupressão de manutenção de baixo risco, tal como rapaimicina ou belatacept, diminuindo assim o risco de infecção e malignidade.
[013] Em ainda outro aspecto, a presente invenção fornece um método para selecionar um paciente com aloenxerto renal para terapia de indução antes do transplante para reduzir o risco de rejeição aguda renal ou perda de aloenxerto, que compreende comparar os níveis de expressão do conjunto de assinatura gênica de 23 membros obtido do paciente com o nível de expressão do mesmo conjunto de assinatura gênica em uma amostra de controle obtida de um receptor de aloenxerto que não sofreu rejeição aguda, e tratar o paciente com terapia de indução se o nível de expressão de um ou mais genes no conjunto de assinatura gênica do paciente estiver alterado em comparação com o nível de expressão do mesmo um ou mais genes no conjunto de assinatura gênica no controle.
[014] Estes e outros aspectos da presente invenção serão evidentes para os técnicos no assunto à luz do presente relatório descritivo e reivindicações anexas.
[015] Como usado aqui, um receptor de aloenxerto que está em “alto risco” de rejeição aguda do aloenxerto e perda de aloenxerto é significativamente mais provável de rejeitar o aloenxerto, sem intervenção, do que um indivíduo que está em “baixo risco”.
[016] De acordo com a presente invenção, podem ser empregues técnicas de biologia molecular convencional, microbiologia, DNA recombinante, imunologia, biologia celular e outras técnicas relacionadas dentro da competência da técnica. Ver, por exemplo, Sambrook et al., (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3a ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, N.Y.; Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2a ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, N.Y.; Ausubel et al., eds. (2005) Current Protocols in Molecular Biology.
John Wiley and Sons, Inc.: Hoboken, N.J.; Bonifacino et al., eds. (2005) Current Protocols in Cell Biology. John Wiley and Sons, Inc.: Hoboken, N.J.; Coligan et al., eds. (2005) Current Protocols in Immunology, John Wiley and Sons, Inc.: Hoboken, N.J.; Coico et al., eds. (2005) Current Protocols in Microbiology, John Wiley and Sons, Inc.: Hoboken, N.J.; Coligan et al., eds. (2005) Current
Protocols in Protein Science, John Wiley and Sons, Inc.: Hoboken, N.J.; Enna et al., eds. (2005) Current Protocols in Pharmacology John Wiley and Sons, Inc.: Hoboken, N.J.; Hames et al., eds. (1999) Protein Expression: A Practical Approach. Oxford University Press: Oxford; Freshney (2000) Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique. 4a ed. Wiley-Liss; entre outros. Os protocolos atuais listados acima são atualizados várias vezes por ano.
[017] Tal como aqui utilizado, o “nível de expressão” de um mRNA revelado neste documento significa o nível de expressão de mRNA do marcador, ou o nível mensurável do marcador em uma amostra, que pode ser determinado por qualquer método adequado conhecido na técnica, tal como, mas não limitado a Northern blot, reação em cadeia da polimerase (PCR), por exemplo, PCR quantitativa em tempo real, “qRT-PCR”, RNA-seq, TREex (miSEQ), análise de Nanostring, etc. Conforme usado neste documento, o termo “cerca de” ou “aproximadamente” geralmente significa dentro de uma faixa de erro aceitável para o tipo de valor e método de medição. Por exemplo, pode significar dentro de 20%, mais preferencialmente dentro de 10%, e mais preferencialmente ainda dentro de 5% de um dado valor ou intervalo.
Alternativamente, especialmente em sistemas biológicos, o termo “cerca de” significa dentro de cerca de um log (isto é, uma ordem de grandeza) de preferência dentro de um fator de dois de um determinado valor.
[018] Os termos “diminuição”, “diminuído”, “reduzido”, “redução” ou “regulado negativamente” são todos usados neste documento, de modo geral, para significar uma diminuição em uma quantidade estatisticamente significativa. No entanto, para evitar dúvidas, “reduzido”, “redução”, “regulado negativamente”, “diminuído” ou “diminuição” significa uma diminuição de pelo menos 10% em comparação com um nível de referência, por exemplo, uma diminuição de pelo menos cerca de 20%, ou pelo menos cerca de 30%, ou pelo menos cerca de 40%, ou pelo menos cerca de 50%, ou pelo menos cerca de
60%, ou pelo menos cerca de 70%, ou pelo menos cerca de 80%, ou pelo menos cerca de 90% ou até e incluindo uma diminuição de 100% (ou seja, nível ausente em comparação com uma amostra de referência), ou qualquer diminuição entre 10-100% em comparação com um nível de referência, ou uma diminuição de pelo menos cerca de 0,5 vezes, ou pelo menos cerca de 1 vez, ou pelo menos cerca de 1,2 vezes, ou pelo menos cerca de 1,5 vezes, ou pelo menos cerca de 2 vezes, ou pelo menos cerca de 3 vezes, ou pelo menos cerca de 4 vezes, ou pelo menos cerca de 5 vezes ou pelo menos cerca de 10 vezes, ou qualquer diminuição entre 1,0 vez e 10 vezes ou mais em comparação com um nível de referência.
[019] Os termos “aumentado”, “aumento” ou “regulado positivamente” são todos usados neste documento para, de modo geral, significar um aumento em uma quantidade estatisticamente significativa; para evitar qualquer dúvida, os termos “aumentado” ou “aumento” significam um aumento de pelo menos 10% em comparação com um nível de referência, por exemplo, um aumento de pelo menos cerca de 20%, ou pelo menos cerca de 30%, ou pelo menos cerca de 40%, ou pelo menos cerca de 50%, ou pelo menos cerca de 60%, ou pelo menos cerca de 70%, ou pelo menos cerca de 80%, ou pelo menos cerca de 90% ou até e incluindo um aumento de 100% ou qualquer aumento entre 10-100% em comparação com um nível de referência, ou um aumento de pelo menos cerca de 0,5 vezes, ou pelo menos cerca de 1,0 vez, ou pelo menos cerca de 1,2 vezes, ou pelo menos cerca de 1,5 vezes, ou pelo menos cerca de 2 vezes, ou pelo menos cerca de 3 vezes, ou pelo menos cerca de 4 vezes, ou pelo menos cerca de 5 vezes ou pelo menos cerca de 10 vezes, ou qualquer aumento entre 1,0 vez e 10 vezes ou mais em comparação com um nível de referência.
[020] Tal como aqui utilizado, “determinar o nível de expressão”, “determinando o nível de expressão” ou “detectar o nível de expressão”, como em, por exemplo, “determinar o nível de expressão de um gene” refere-se a quantificar a quantidade de mRNA presente em uma amostra. A detecção da expressão dos mRNAs específicos pode ser alcançada usando qualquer método conhecido na técnica, conforme descrito neste documento.
Normalmente, os métodos de detecção de mRNA envolvem a detecção específica de sequência, tal como por RT-PCR. Iniciadores e sondas específicos de mRNA podem ser projetados usando sequências de ácido nucleico, que são conhecidas na técnica.
[021] Tal como aqui utilizado, um nível “alterado” de expressão de um mRNA em comparação com o nível de referência ou nível de controle é pelo menos 0,5 vezes (por exemplo, pelo menos: 1; 2; 3; 4; 5; 6; 7; 8; 9; 10; 15; 20; 30; 40; 50; 75; 100; 200; 500; 1.000; 2.000; 5.000; ou 10.000 vezes) de nível alterado de expressão do mRNA. Entende-se que a alteração pode ser um aumento ou uma diminuição. Alternativamente, o nível de expressão alterado é definido como um aumento na pontuação de probabilidade de risco usando parâmetros no modelo de regressão logística estabelecido a partir de um grupo de pacientes em treinamento, comparando a pontuação de probabilidade com o ponto de corte derivado do conjunto de treinamento.
[022] Tal como aqui utilizado, “terapia de combinação” significa o tratamento de um indivíduo em necessidade de tratamento com uma certa composição ou droga em que o indivíduo é tratado ou dado uma ou mais outras composições ou drogas para a doença em conjunto com a primeira e/ou em conjunto com uma ou mais outras terapias, tais como, por exemplo, uma terapia imunossupressora ou outra terapia anti-rejeição. Essa terapia de combinação pode ser uma terapia sequencial em que o paciente é tratado primeiro com uma modalidade de tratamento (por exemplo, droga ou terapia) e, em seguida, a outra (por exemplo, droga ou terapia) e assim por diante, ou todos as drogas e/ou terapias podem ser administradas simultaneamente. Em ambos os casos, essas drogas e/ou terapias são consideradas “coadministradas”. Deve ser entendido que “coadministrado” não significa necessariamente que as drogas e/ou terapias são administradas em uma forma combinada (ou seja, elas podem ser administradas separadamente ou em conjunto no mesmo local ou em locais diferentes ao mesmo tempo ou em tempos diferentes).
[023] O termo “derivado farmaceuticamente aceitável”, tal como aqui utilizado, significa qualquer sal, solvato ou pró-droga farmaceuticamente aceitável, por exemplo, éster, de um composto da invenção, que mediante administração ao receptor é capaz de fornecer (direta ou indiretamente) um composto da invenção, ou um metabólito ativo ou resíduo do mesmo. Tais derivados são reconhecíveis pelos técnicos no assunto, sem experimentação indevida. No entanto, é feita referência ao ensinamento de Burger’s Medicinal Chemistry and Drug Discovery, 5ª Edição, Vol. 1: Principles and Practice, que é incorporado neste documento por referência à extensão do ensinamento de tais derivados. Derivados farmaceuticamente aceitáveis incluem sais, solvatos, ésteres, carbamatos e/ou ésteres de fosfato.
[024] Conforme usado neste documento, os termos “terapeuticamente eficaz” e “quantidade eficaz”, usados de maneira intercambiável, aplicados a uma dose ou quantidade, referem-se a uma quantidade de uma composição, composto ou formulação farmacêutica que é suficiente para resultar em uma atividade desejada após a administração a um indivíduo em necessidade do mesmo. No contexto da presente invenção, o termo “terapeuticamente eficaz” refere-se à quantidade de uma composição, composto ou formulação farmacêutica que é suficiente para reduzir ou eliminar pelo menos um sintoma de uma doença ou condição especificada neste documento, por exemplo, rejeição aguda e/ou rejeição de aloenxerto quando uma combinação de ingredientes ativos é administrada, a quantidade eficaz da combinação pode ou não incluir quantidades de cada ingrediente que teria sido eficaz se administrado individualmente. A dosagem da formulação terapêutica irá variar dependendo da natureza da doença ou condição, do histórico médico do paciente, da frequência de administração, da forma de administração, da eliminação do agente do hospedeiro e assim por diante. A dose inicial pode ser maior, seguida por doses de manutenção menores. A dose pode ser administrada, por exemplo, semanalmente, quinzenalmente, diariamente, semi- semanalmente, etc., para manter um nível de dosagem eficaz.
[025] “Controle” é definido como uma amostra obtida de um paciente que recebeu um transplante de aloenxerto e que não sofre rejeição aguda.
[026] “Terapia de indução” é definida neste documento como a administração de um agente imunossupressor a um paciente com alto risco de rejeição aguda iniciada antes ou, de preferência, no dia do transplante. O agente é um agente biológico, um agente depletor de linfócitos ou um antagonista do receptor de interleucina 2 (IL2-RA), conforme descrito abaixo. O objetivo da terapia de indução é esgotar ou modular as respostas das células T em pacientes com alto risco de rejeição aguda no momento do transplante e reduzir o risco de rejeição aguda.
[027] Conforme usado aqui, a rejeição aguda precoce (EAR) é definida como rejeições que ocorrem antes de 6 meses após o transplante.
[028] De acordo com a presente invenção, um paciente que está sendo avaliado para transplante renal terá o ensaio da presente invenção realizado como parte de sua avaliação pré-transplante. O sangue periférico será retirado, o mRNA será extraído e o TREx (miSEQ) será realizado utilizando reagentes e iniciadores para amplificação direcionada e geração de biblioteca de sequenciamento. Este ensaio realiza o sequenciamento direcionado dos 23 genes específicos e dos painéis de genes de manutenção.
Os níveis de expressão serão determinados para os 23 genes e o algoritmo de risco será aplicado para determinar a pontuação de avaliação de risco para os pacientes em risco de rejeição aguda após o transplante. Se a pontuação do paciente estiver acima de 32, o paciente é classificado como sendo de alto risco, caso em que o paciente receberá terapia de indução e imunossupressão de manutenção que será tratada da mesma maneira empregada para um paciente de alto risco, por exemplo, diminuição de força mais lenta das drogas imunossupressoras tais como inibidores de calcineurina (CNI), prevenção de retirada de esteroides, prevenção de inibidores de mTOR (tais como Sirolimus/ Temsirolimus ou Everolimus) ou Belatacept. Se a pontuação estiver abaixo de - 23, o paciente é considerado como sendo de baixo risco para AR, caso em que o paciente não precisaria de terapia de indução ou pode ser um candidato à retirada de esteroides, inibidores de mTOR ou Belatacept. Os pontos de corte exatos são baseados no ensaio TREx (miSEQ) e variam com base em outras tecnologias, tais como Nanostring e qPCR. Digno de nota, o ensaio deve ser considerado no contexto de outros fatores clínicos que podem predefinir um candidato como de alto risco, por exemplo, HLA compatível e a presença de anticorpos anti-HLA, ao planejar o protocolo de imunossupressão para o paciente.
[029] A presente invenção é baseada na identificação de perfis de expressão gênica expressos por um receptor de aloenxerto renal antes do transplante que determinam o risco de rejeição aguda pós-transplante. O perfil de expressão gênica é preditivo de rejeição aguda subclínica e clínica pós- transplante. Isso dá ao médico a capacidade de personalizar a abordagem do regime de imunossupressão no momento do transplante, maximizando assim a imunossupressão naqueles com alto risco e reduzindo a imunossupressão naqueles com risco reduzido. Especificamente, a terapia de indução usando, por exemplo, tireoglobulina/ Globulina Anti-Timócito (ATG), ou um bloqueador anti-IL-2R ou Campath-1H (Alemtuzmab, ou um anticorpo monoclonal anti- CD52 direcionado contra um antígeno presente na superfície de linfócitos T) será administrada a pacientes com alto risco de rejeição aguda e evitada em pacientes com baixo risco de rejeição aguda. A terapia de indução é iniciada no dia do transplante. Para a imunossupressão de manutenção, um indivíduo com menor risco pode, dependendo de outros fatores imunológicos, ser tratado com um imunossupressor mais fraco, tal como Rapamicina ou Belatacept. Estes são reconhecidos pelos técnicos no assunto como menos potentes porque estão associados a uma alta taxa de rejeição aguda. Agentes imunossupressores “mais fortes” incluem CNI, como tacrolimus (Prograf® e Advagraf®/ Astagraf XL (Astellas Pharma Inc.) e genéricos de Prograf® e ciclosporina (Neoral® e Sandimmune® (Novartis AG) e genéricos.
[030] Além disso, as decisões sobre a combinação doador/ receptor podem ser orientadas de forma a minimizar outros fatores imunológicos controláveis. Por exemplo, os transplantes podem ser evitados com base nas combinações doador/ receptor em que o receptor tem anticorpos direcionados contra o doador HLA. Nesta forma de realização, o transplante pode ser evitado se um paciente necessitar de dessensibilização, isto é, plasmaférese e administração de imunoglobulina intravenosa (IVIG) para anticorpos específicos do doador. No entanto, isso se aplicaria principalmente a aloenxertos de doadores vivos. Nesta forma de realização, evitar incompatibilidades doador/receptor pode resultar em economias de custo significativas.
[031] Além disso, se o perfil de expressão gênica identifica um indivíduo como em risco de rejeição aguda, o paciente pode ser submetido a monitoramento mais intensivo dos resultados laboratoriais clínicos ou perfis de expressão gênica para o diagnóstico de rejeição aguda subclínica.
[032] A presente invenção fornece métodos para identificar receptores de aloenxerto renal em risco de rejeição aguda e perda de enxerto antes do transplante, compreendendo as etapas de fornecer uma amostra de sangue de um receptor de aloenxerto renal antes do transplante, isolar mRNA da amostra de sangue, sintetizar cDNA a partir do mRNA, e medir os níveis de expressão de um conjunto de assinatura gênica de 23 membros presente na amostra de sangue. Exemplos não limitativos de métodos de medição de níveis de expressão incluem o RNA-seq, sistema de sequenciamento de expressão de RNA direcionado (TREx) (Illumina, Inc. San Diego Califórnia), Nanostring (nCounter® mRNA Expression Assay-Nanostring Technologies, Inc. Seattle Washington) ou qPCR. Os resultados da análise do conjunto de assinatura gênica são comparados a um controle. Quanto maior a alteração no nível de expressão do paciente em comparação com o controle, maior o risco de rejeição aguda. Esses métodos são descritos nos Exemplos 1 a 6 abaixo.
[033] Foram identificadas assinaturas de sangue periférico usando conjuntos de assinatura gênica compreendendo 23 genes pré- selecionados. Esses conjuntos de assinatura de genes pré-selecionados podem ser usados para identificar com precisão receptores de aloenxerto renal em risco de rejeição aguda e subsequente rejeição do enxerto antes da cirurgia de transplante.
[034] O conjunto de assinatura gênica de 23 membros para uso na prática dos métodos aqui revelados compreende os seguintes genes: GZMH, ADGRG1, S1PR5, FGFBP2, NKG7, PRF1, KIAA1671, LAG3, TARP, FCRL6, FASLG, TBX21, TOX, ZNF831, CD8A, C1orf21, CCR5, LDOC1L, CCDC102A, HOPX, PRKCH, SLC25A34 e F12.
[035] Neste contexto, verificou-se que se o receptor de aloenxerto tem baixo risco de rejeição aguda, mas tem 5 ou 6 incompatibilidades de HLA, torna-se com alto risco de rejeição aguda. A tipagem de HLA pode ser feita por citometria de fluxo, RT-PCR e RNA-Seq.
(Referência: Methods. Abril de 2012; 56(4):471-6. doi:
10.1016/j.ymeth.2012.03.025. Epub 28 de março de 2012. HLA techniques: typing and antibody detection in the laboratory of immunogenetics. Bontadini A.).
[036] Em alguns dos métodos aqui revelados, é desejável detectar e quantificar mRNAs presentes em uma amostra. A detecção e quantificação da expressão de RNA podem ser alcançadas por qualquer um de uma série de métodos bem conhecidos na técnica. Usando as sequências conhecidas para membros da família de RNA, sondas e iniciadores específicos podem ser projetados para uso nos métodos de detecção descritos abaixo, conforme apropriado. Qualquer um de Nanostring, RNAseq ou Reações em Cadeia da Polimerase quantitativas (qPCR), tais como Reações em Cadeia da Polimerase em Tempo Real (RT-PCR) ou sequenciamento de RNA direcionado (TREx) pode ser usado nos métodos aqui revelados. Em alguns casos, a detecção e quantificação da expressão de RNA requerem o isolamento do ácido nucleico de uma amostra, tal como uma célula ou um tecido. Os ácidos nucleicos, incluindo RNA e especificamente mRNA, podem ser isolados usando qualquer técnica adequada conhecida na arte. Por exemplo, a extração à base de fenol é um método comum para o isolamento de RNA. Os reagentes à base de fenol contêm uma combinação de desnaturantes e inibidores de RNAase para a ruptura de células e tecidos e subsequente separação de RNA de contaminantes. Além disso, os procedimentos de extração, tais como os que usam TRIZOL™ ou TRI REAGENT ™, purificarão todos os RNAs, grandes e pequenos, e são métodos eficientes para isolar o RNA total de amostras biológicas que contêm mRNAs. Procedimentos de extração, tais como aqueles que usam o kit de preparação QIAGEN-ALL, também são contemplados.
[037] Em algumas formas de realização, o uso de RT-PCR quantitativa é desejável. A RT-PCR quantitativa é uma modificação do método de reação em cadeia da polimerase usado para medir rapidamente a quantidade de um ácido nucleico. A qRT-PCR é comumente usada para determinar se uma sequência genética está presente em uma amostra e, se estiver presente, o número de cópias na amostra. Qualquer método de PCR que pode determinar a expressão de uma molécula de ácido nucleico, incluindo um mRNA, cai dentro do escopo da presente invenção. Existem várias variações do método qRT-PCR que são bem conhecidas dos técnicos no assunto. Em algumas formas de realização, o perfil de expressão de mRNA pode ser determinado usando um sistema de análise nCounter® (Nanostring Technologies®, Seattle, WA). O sistema de análise nCounter® da Nanostring Technologies cria perfis de centenas de mRNAs, microRNAs ou alvos de DNA simultaneamente com alta sensibilidade e precisão. As moléculas alvo são detectadas digitalmente. O sistema de análise Nanostring usa “códigos de barras” moleculares e imagens de molécula única para detectar e contar centenas de transcrições exclusivas em uma única reação. O protocolo não inclui nenhuma etapa de amplificação. Este é um método preferido para a detecção rápida dos níveis de expressão de mRNAs.
[038] Em outra forma de realização, a invenção fornece kits para determinar se um paciente que receberá um aloenxerto renal está em risco de rejeição aguda do aloenxerto, compreendendo em um ou mais recipientes, pares de iniciadores para o conjunto de assinatura de 23 genes, controles positivo e negativo, tampões e instruções de uso impressas. Os kits também podem conter painéis de genes de manutenção para testar a qualidade dos ensaios e iniciadores para os genes de manutenção. Os painéis de genes de manutenção são descritos no Exemplo 6 abaixo.
[039] Em uma forma de realização típica, um laboratório clínico obterá o valor de expressão usando a amostra de sangue do paciente e enviará para o médico do paciente. O médico então comunicará esse valor ao seu provedor de serviços baseado na web. O provedor de serviços irá inserir esse valor no sistema de bioinformática que já tem o parâmetro de valor p ponderado e o valor de expressão mediano para os grupos EAR e não-EAR para cada gene do conjunto de assinatura de genes pré-selecionados e os pontos de corte tercil definidos a partir do conjunto de treinamento. O sistema de bioinformática usará essas informações para calcular a pontuação de risco para o paciente. A pontuação de risco calculada refletirá o status de AR do paciente.
[040] Em uma forma de realização alternativa, o ensaio será feito centralmente em um laboratório e os resultados serão enviados diretamente para o médico, ou seja, sem aplicação baseada na web.
[041] Um exemplo não limitativo do uso do conjunto de assinatura gênica na previsão do risco de AR é descrito abaixo usando o conjunto de assinatura de 23 genes.
[042] 1) Selecionar um grupo de treinamento: Um grupo de pacientes de transplante de rim com rejeição aguda precoce conhecida (EAR, pontuação de inflamação/ tubulite de 1 ou acima antes de 6 meses após o transplante) e um controle não-EAR (com pontuação de inflamação/ tubulite de 0 antes de 6 meses após o transplante, o diagnóstico com base na patologia; número total N = ~100) serão cuidadosamente selecionados. O grupo de treinamento terá dados demográficos, dados clínicos e resultados patológicos bem caracterizados, que serão analisados por pelo menos dois patologistas.
Os níveis de expressão gênica do conjunto de treinamento são usados para derivar o valor p e o valor de expressão mediano no grupo EAR ou não-EAR para cálculo de pontuação de risco para cada gene.
[043] 2) Medir a expressão dos genes: Os níveis de expressão dos 23 genes das amostras de sangue pré-transplante de cada paciente do grupo de treinamento serão medidos usando qualquer uma das várias técnicas bem conhecidas, e de preferência usando TREx, RT-PCR ou tecnologia Nanostring. O uso das técnicas TREx, Nanostring ou qPCR é descrito nos Exemplos 2, 3 e 4 abaixo. O nível de expressão é representado de forma diferente com base na tecnologia aplicada. TREx usa a contagem de leituras de sequência que são mapeadas para os genes. qPCR usa valores de CT (tempo de ciclo) e Nanostring usa a contagem das transcrições.
[044] 3) Estabelecer uma pontuação de risco cumulativa e corte: A análise de expressão diferencial será realizada para calcular o valor p da diferença dos valores de expressão entre os grupos EAR e não-EAR para cada gene no conjunto de treinamento, conforme descrito acima e o pontuação cumulativa ponderada será determinada para cada paciente. A fórmula empregada para a avaliação de risco é r = -(log10(p1)*g1+log10(p2)*g2+…+ log10(pi)*gi+...+log10(p23)*g23), onde pi é o valor de significância p do teste t nos valores de expressão para o gene i (i = 1...23) entre os grupos EAR versus não-EAR no conjunto de treinamento, gi é um número lógico para o gene i (i =
1...23), 1 (se o valor de expressão do gene i for maior do que o valor de expressão mediano do grupo EAR do conjunto de treinamento para um gene regulado positivamente ou se o valor de expressão do gene i for menor do que o valor de expressão mediano do grupo EAR do conjunto de treinamento para um gene regulado negativamente), ou -1 (se o valor de expressão do gene i for menor do que o valor mediano do grupo não-EAR do conjunto de treinamento para um gene regulado positivamente ou se o valor de expressão do gene i for maior do que o valor mediano do grupo não-EAR do conjunto de treinamento para um gene regulado negativamente), ou 0 (se o valor de expressão do gene i estiver entre os valores medianos dos grupos EAR e não-EAR do conjunto de treinamento).
[045] Com base na pontuação de risco, as estatísticas de previsão, tais como AUC de previsão (área sob a curva) da curva ROC (característica de operação do receptor) da taxa de verdadeiro positivo versus a taxa de falso positivo em várias configurações de limiar são obtidas. A análise ROC pode ser usada para determinar o corte ou modelo ideal e medir a precisão geral da previsão pelo cálculo da área sob a curva, sensibilidade/ especificidade, os valores preditivos positivos (PPV) e os valores preditivos negativos (NPV). Em uma determinada especificidade (90%), um ponto de corte de pontuação de risco será estabelecido que melhor detecta a presença de rejeição aguda. Espera-se que haja um corte claro em dois grupos em que se um paciente está no grupo superior, ele tem uma alta probabilidade de ter rejeição aguda e o teste é determinado como positivo, mas se ele está no grupo inferior, ele tem uma probabilidade muito baixa de ter rejeição aguda e o teste é determinado como negativo.
[046] Alternativamente, os pacientes são divididos em tercis com base em sua pontuação de probabilidade determinada como acima. Nesse caso, se o paciente estiver (1) no tercil superior, ele terá uma alta probabilidade de ter rejeição aguda e o teste será considerado positivo; (2) no segundo tercil ou grupo intermediário, seu risco não pode ser determinado com precisão; e (3) no tercil inferior, ele terá uma probabilidade muito baixa de ter rejeição aguda (e, portanto, são bons candidatos para um transplante bem-sucedido) e o teste é determinado como negativo.
[047] O valor p, os valores de expressão medianos dos grupos EAR e não-EAR para cada gene e os pontos de corte de pontuação de risco derivados do grupo de treinamento são inseridos e armazenados em um sistema de computador de bioinformática baseado na web que pode ser acessado de um laboratório clínico/ ou um consultório médico através da Internet.
[048] 4) Diagnóstico: Os níveis de expressão dos conjuntos de assinatura gênica para um novo paciente com diagnóstico desconhecido são medidos pela mesma tecnologia usada para o conjunto de treinamento no laboratório clínico. Usando um sistema de bioinformática baseado na web, a pontuação de risco será calculada resumindo o valor lógico de expressão (1, 0 ou -1) em comparação com os valores medianos dos grupos EAR e não-EAR dos 23 genes multiplicados por valores log p derivados do conjunto de treinamento. A pontuação de risco é comparada ao ponto de corte para determinar o status de AR. Um aumento na pontuação de risco no paciente em relação à pontuação de risco em um controle indica que o paciente está em um risco aumentado de rejeição aguda. Um laboratório clínico enviará os resultados dos testes ao médico.
[049] Os níveis de expressão e/ou níveis de expressão de referência podem ser armazenados em um meio de armazenamento de dados adequado (por exemplo, um banco de dados) e estão, portanto, também disponíveis para diagnósticos futuros. Isso também permite diagnosticar com eficiência a prevalência de uma doença porque resultados de referência adequados podem ser identificados no banco de dados, uma vez que tenha sido confirmado (no futuro) que o indivíduo do qual a amostra de referência correspondente foi obtida sofreu rejeição aguda.
[050] Conforme usado neste documento, um “banco de dados” compreende dados coletados (por exemplo, analito e/ou informações de nível de referência e/ou informações do paciente) em um meio de armazenamento adequado. Além disso, o banco de dados pode compreender ainda um sistema de gerenciamento de banco de dados. O sistema de gerenciamento de banco de dados é, de preferência, um sistema de gerenciamento de banco de dados baseado em rede, hierárquico ou orientado a objetos. Mais preferencialmente, o banco de dados será implementado como um sistema distribuído (Federal), por exemplo, como um sistema cliente-servidor. Mais preferencialmente, o banco de dados é estruturado de forma a permitir que um algoritmo de pesquisa compare um conjunto de dados de teste com os conjuntos de dados compreendidos pela coleta de dados. Especificamente, usando tal algoritmo, o banco de dados pode ser pesquisado para conjuntos de dados semelhantes ou idênticos, sendo indicativos do risco de rejeição de aloenxerto renal. Assim, se um conjunto de dados idêntico ou semelhante puder ser identificado na coleta de dados, o conjunto de dados de teste será associado ao risco de rejeição de aloenxerto renal. Consequentemente, as informações obtidas a partir da coleta de dados podem ser usadas para diagnosticar o risco de um receptor de aloenxerto para perda de aloenxerto ou com base em um conjunto de dados de teste obtido de um indivíduo. Mais preferencialmente, a coleta de dados compreende valores característicos de todos os analitos compreendidos por qualquer um dos grupos citados acima.
[051] A invenção proporciona ainda a comunicação de resultados de ensaios ou diagnósticos ou ambos a técnicos, médicos ou pacientes, por exemplo. Em certas formas de realização, os computadores serão usados para comunicar resultados de ensaios ou diagnósticos ou ambos às partes interessadas, por exemplo, médicos e seus pacientes.
[052] Em algumas formas de realização, o método revelado neste documento compreende ainda modificar o registro clínico do receptor para identificar o receptor como estando em risco de desenvolver rejeição aguda e/ou perda de aloenxerto. O registro clínico pode ser armazenado em qualquer meio de armazenamento de dados adequado (por exemplo, um meio legível por computador).
[053] Em algumas formas de realização da invenção, um diagnóstico com base nos métodos fornecidos neste documento é comunicado ao receptor de aloenxerto assim que possível, após o diagnóstico ser obtido. O diagnóstico pode ser comunicado ao receptor pelo médico responsável do receptor. Alternativamente, o diagnóstico pode ser enviado a um receptor por e-mail ou comunicado ao indivíduo por telefone. O diagnóstico pode ser enviado a um receptor na forma de um relatório. Um computador pode ser usado para comunicar o diagnóstico por e-mail ou telefone. Em certas formas de realização, a mensagem que contém os resultados de um teste de diagnóstico pode ser gerada e entregue automaticamente ao receptor usando uma combinação de hardware e software de computador que será familiar para os técnicos em telecomunicações.
[054] Aspectos da presente invenção incluem produtos de programa de computador para identificar um indivíduo que não foi submetido a um aloenxerto renal e está em risco de rejeição aguda, em que o produto de programa de computador, quando carregado em um computador, é configurado para empregar um resultado de expressão gênica de um amostra derivada do indivíduo para determinar se um indivíduo que será submetido a um aloenxerto renal está em risco de rejeição aguda, em que o resultado da expressão gênica compreende dados de expressão para pelo menos um conjunto de assinatura gênica.
[055] Também são fornecidos perfis de expressão de referência para um fenótipo que é um dentre: (a) baixo risco de rejeição aguda; ou (b) alto risco de rejeição aguda; em que o perfil de expressão é registrado em um meio legível por computador que é acessível por um usuário, por exemplo, em um formato legível pelo usuário. Em certas formas de realização, o perfil de expressão é um perfil para um fenótipo de baixo risco. Em certas formas de realização, o perfil de expressão é um perfil para um fenótipo de alto risco.
[056] Os perfis de expressão e os bancos de dados dos mesmos podem ser fornecidos em uma variedade de mídias para facilitar seu uso.
“Mídia” refere-se a um produto que contém a informação do perfil de expressão da presente invenção. Os bancos de dados da presente invenção podem ser gravados em mídias legíveis por computador, por exemplo, qualquer meio que possa ser lido e acessado diretamente por um usuário que utiliza um computador. Essas mídias incluem, mas não estão limitadas a: mídia de armazenamento magnético, tais como disquetes, meio de armazenamento de disco rígido e fita magnética; mídia de armazenamento óptico, tal como CD- ROM; mídia de armazenamento elétrico, tal como RAM e ROM; e híbridos dessas categorias, tais como mídia de armazenamento magnético/ óptico. Um técnico no assunto pode facilmente apreciar como qualquer um dos meios legíveis por computador atualmente conhecidos pode ser usado para criar um produto que compreende uma gravação das informações do banco de dados presente.
[057] “Gravado” refere-se a um processo para armazenar informações em meio legível por computador, usando qualquer um desses métodos conhecidos na técnica. Qualquer estrutura de armazenamento de dados conveniente pode ser escolhida, com base nos meios usados para acessar as informações armazenadas. Uma variedade de programas e formatos de processador de dados podem ser usados para armazenamento, por exemplo, arquivo de texto de processamento de texto, formato de banco de dados, etc. Assim, os bancos de dados de perfil de expressão de indivíduos são acessíveis por um usuário, ou seja, os arquivos de banco de dados são salvos em um formato legível pelo usuário (por exemplo, um formato legível por computador, onde um usuário controla o computador).
[058] Tal como aqui utilizado, “um sistema baseado em computador” refere-se aos meios de hardware, meios de software e meios de armazenamento de dados usados para analisar a informação da presente invenção. O hardware mínimo dos sistemas baseados em computador da presente invenção compreende uma unidade de processamento central (CPU), meios de entrada, meios de saída e meios de armazenamento de dados. Um técnico no assunto pode prontamente apreciar que qualquer um dos sistemas baseados em computador atualmente disponíveis são adequados para uso na presente invenção. Os meios de armazenamento de dados podem compreender qualquer produto compreendendo uma gravação da presente informação conforme descrito acima, ou um meio de acesso à memória que pode acessar tal produto.
[059] Em certas formas de realização, são fornecidos kits para determinar o risco de um receptor de aloenxerto renal para rejeição aguda e perda de aloenxerto.
[060] Os kits compreendem iniciadores para o conjunto de assinatura gênica de 23 membros, um painel de genes de manutenção para ensaios TREx e Nanostring (Exemplo 6), iniciadores para genes de manutenção para ensaios de qPCR, incluindo beta-actina (ACTB) e gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase, (GAPDH), e uma sonda de controle, RNA ribossomal 18S.
[061] Um kit pode compreender ainda um ou mais reagentes de extração de mRNA e/ou reagentes para a síntese de cDNA. Em outras formas de realização, o kit pode compreender um ou mais recipientes nos quais os agentes biológicos são colocados e, de preferência, adequadamente aliquotados. O kit também pode conter instruções impressas para o uso dos materiais do kit.
[062] Os componentes dos kits podem ser embalados em meio aquoso ou na forma liofilizada. Os kits também podem compreender um ou mais excipientes, diluentes e/ou veículos farmaceuticamente aceitáveis.
Exemplos não limitativos de excipientes, diluentes e/ou veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem água livre de RNAase, água destilada, água tamponada, soro fisiológico, PBS, solução de Ringer, solução de dextrose, tampões de reação, tampões de marcação, tampões de lavagem e tampões de hibridização.
[063] Os kits da invenção podem assumir uma variedade de formas. Normalmente, um kit incluirá reagentes adequados para determinar os níveis de expressão do conjunto de genes (por exemplo, aqueles aqui revelados) em uma amostra. Opcionalmente, os kits podem conter uma ou mais amostras de controle. Além disso, os kits, em alguns casos, incluirão informações escritas (indicações) que fornecem uma referência (por exemplo, valores predeterminados), em que uma comparação entre os níveis de expressão gênica no indivíduo e a referência (valores predeterminados) é indicativa de um quadro clínico.
[064] Em conclusão, um conjunto de 23 genes foi identificado, cuja expressão no sangue total basal é capaz de prever com precisão AR precoce e tardia e perda de enxerto em receptores de transplante renal, melhor do que as características demográficas/ clínicas basais. Este conjunto, validado em duas coortes independentes, foi particularmente preciso na previsão desses eventos em pacientes com incompatibilidades de HLA ≤4 com o doador, que é a maioria (60-70%) dos pacientes transplantados.
Portanto, o conjunto de genes prediz de maneira ideal o risco de rejeição aguda, permitindo que os médicos, as pessoas da região ventral, estratifiquem os pacientes no momento do transplante e ajustem a imunossupressão de acordo.
[065] A presente invenção é descrita mais abaixo em Exemplos que se destinam a descrever adicionalmente a invenção sem limitar o escopo da mesma.
EXEMPLO 1 ENSAIO DE SEQUENCIAMENTO DE RNA: IDENTIFICAÇÃO DE UM CONJUNTO DE 23
[066] O kit de ensaio de sequenciamento de RNA inclui: 1) Kit de preparação de biblioteca de mRNA Illumina TruSeq; 2) Conjunto de índices simples de RNA TruSeq; e 3) Kit QIAGEN RNeasy® para extração de RNA total de alta qualidade.
[067] O RNA total foi extraído de sangue total retirado de receptores de transplante de rim antes do transplante (basal) usando um kit QIAGEN RNeasy®, e as bibliotecas foram geradas com um kit de preparação de biblioteca de mRNA TruSeq e foram posteriormente multiplexadas com índices simples de RNA TruSeq. As bibliotecas indexadas foram sequenciadas em um sequenciador Illumina HiSeq4000. As leituras com boa qualidade foram primeiro alinhadas a bancos de dados de referência humanos, incluindo o genoma humano hg19, éxon, segmento de junção de splicing e banco de dados de contaminação, incluindo sequências ribossômicas e mitocondriais usando o conhecido algoritmo de alinhamento BWA. Depois de filtrar por leituras, que 3 mapeadas para o banco de dados de contaminação, as leituras que estão exclusivamente alinhadas ao éxon e segmentos de junção de splicing com um máximo de 2 incompatibilidades para cada transcrição foram então contadas como o nível de expressão para cada transcrição correspondente. As contagens de leitura foram transformadas em log2 e normalizadas em um valor mediano global igual, a fim de comparar os níveis de transcrição entre as amostras.
[068] a) Descrição da coorte de pacientes: Este estudo incluiu um total de 235 pacientes com RNAs sanguíneos basais de boa qualidade que foram submetidos a sequenciamento de RNA. Destes, 155 tinham informações disponíveis sobre biópsias de controle feitas em série antes e depois do transplante, enquanto 80 tinham apenas informações sobre biópsias de controle feitas entre os meses 6 a 24 após o transplante. De 155 pacientes com biópsias de controle precoce, 81 foram selecionados aleatoriamente para serem usados como o conjunto de descoberta para a identificação do conjunto de assinatura gênica para prever a rejeição aguda precoce (EAR). Os pacientes foram diagnosticados com base em sua pontuação de inflamação ou tubulite (1 ou superior) de biópsias renais obtidas antes de 6 meses após o transplante. O conjunto de descoberta com diagnósticos EAR e não-EAR bem caracterizados foi usado para identificar o conjunto de genes e derivar os valores de p e os valores de expressão medianos dos grupos EAR e não-EAR para o cálculo da pontuação de risco. Os 74 pacientes restantes foram usados como a primeira coorte de validação (V1). Os 80 pacientes com biópsias de controle posteriores foram usados como a segunda coorte de validação (V2).
[069] (b) Identificação do conjunto de 23 genes: o sequenciamento de RNA foi realizado no conjunto de descoberta de 81 pacientes. Após uma série de controles de qualidade de leitura, as etapas de mapeamento e normalização foram realizadas nas leituras de sequência bruta (4). As contagens de leitura normalizadas obtidas foram usadas como os valores de expressão dos genes. Os valores de expressão para os grupos EAR e não-EAR no conjunto de descoberta (N = 81) foram comparados pelo conhecido teste LIMMA (5). Foram identificados genes expressos diferencialmente (DEGs), 688 regulados positivamente e 653 regulados negativamente. Usando a pontuação de risco com base na comparação da expressão de gene com o valor mediano dos grupos EAR ou não-EAR, um conjunto de 23 genes com o melhor valor preditivo foi identificado a partir dos DEGs com 100 etapas de iteração no conjunto de descoberta (N = 81, AUC= 0,80). A fórmula empregada para a pontuação de risco, r, é descrita acima.
[070] (c) Para estimar a precisão da previsão: dois pontos de corte tercil para as pontuações de risco do gene (32 ou -23) foram definidos e demonstraram valor preditivo positivo (PPV) > 0,70 e valor preditivo negativo (NPV) > 0,88 para previsão de EAR no conjunto de descoberta.
[071] (d) Aplicação do conjunto de 23 genes em dois conjuntos de validação para rejeição aguda precoce e tardia ou previsão de perda de enxerto: A previsão de rejeição aguda precoce pelo conjunto de 23 genes foi validada usando um conjunto de dados V1 (N = 74, AUC= 0,74, PPV = 0,70, NPV = 0,88), nos pontos de corte de tercil (32 e -23) definidos a partir do conjunto de descoberta) teve melhor desempenho em receptores de aloenxerto com menos de 4 incompatibilidades de HLA (AUC= 0,89, PPV = 0,75 e NPV = 1). A pontuação de risco derivada do conjunto de genes também foi significativamente associada com AR após 6 meses pós-transplante e perda de enxerto a longo prazo nos dois conjuntos de validação (N = 154 (V1 + V2), P = 0,041 para rejeição aguda e P = 0,034 para perda do enxerto), especialmente em receptores de aloenxertos com incompatibilidades de HLA ≤ 4 (P = 0,005 para AR e P = 1,57e-4 para perda de enxerto).
[072] No geral, a pontuação de risco previu com precisão a perda de enxerto a qualquer momento (AUC= 0,804 ~ 0,904) e a previsão atingiu uma AUC> 0,80 com pacientes com incompatibilidades de HLA ≤ 4. Quando apenas a perda de enxerto dentro de 2 anos após o transplante foi considerada, a AUC para pacientes com incompatibilidades de HLA ≤ 4 foi de 0,904, enquanto a AUC para a perda de enxerto antes de 5 anos foi de 0,820.
EXEMPLO 2
[073] Uso da fórmula de pontuação de risco cumulativa para calcular a pontuação de risco para um determinado paciente: 1) Calcular o valor p e o valor mediano do grupo EAR e do não- EAR para cada gene do conjunto de descoberta ou do conjunto de treinamento (consulte a coluna “EAR_Med”, “não-EAR_Med” e “Valor P” na tabela anexada); 2) Para um paciente com dados de expressão para o gene 23 (coluna “Paciente”), calcular o número lógico g (coluna “g”); 3) Calcular o log10(p)*g para cada gene (Coluna “-log10 (p)*g); e 4) Somar log10(p)*g para os 23 genes para obter uma pontuação de risco de 65,94, que é maior do que o ponto de corte de 32.
Não- - - Símbolo EAR_Med Valor P Direção Paciente g EAR_Med log10(p) log10(p)*g F12 8,61 8,03 1,58E-03 Para cima 8,26 0 2,80 0,00 SLC25A34 7,04 6,54 1,46E-04 Para cima 7,53 1 3,83 3,83 PRKCH 11,02 11,41 2,78E-03 Para baixo 10,19 1 2,56 2,56 HOPX 8,61 9,05 1,55E-03 Para baixo 7,35 1 2,81 2,81 CCDC102A 7,94 8,48 2,60E-03 Para baixo 6,70 1 2,59 2,59 LDOC1L 8,48 9,04 5,33E-04 Para baixo 8,11 1 3,27 3,27 CCR5 8,91 9,49 4,23E-03 Para baixo 7,33 1 2,37 2,37 C1orf21 8,15 8,74 9,98E-05 Para baixo 6,55 1 4,00 4,00 ZNF831 8,86 9,46 7,68E-04 Para baixo 7,89 1 3,11 3,11 CD8A 11,50 12,11 3,69E-03 Para baixo 11,01 1 2,43 2,43 TOX 7,03 7,71 1,57E-04 Para baixo 6,26 1 3,80 3,80 TBX21 10,98 11,67 2,09E-03 Para baixo 9,63 1 2,68 2,68 FASLG 6,72 7,46 2,45E-04 Para baixo 4,91 1 3,61 3,61 FCRL6 8,60 9,34 1,58E-03 Para baixo 7,80 1 2,80 2,80 TARP 10,45 11,20 2,41E-03 Para baixo 9,17 1 2,62 2,62 LAG3 8,19 9,00 2,00E-03 Para baixo 7,59 1 2,70 2,70 KIAA1671 6,87 7,68 2,50E-04 Para baixo 6,11 1 3,60 3,60 PRF1 12,76 13,61 2,22E-03 Para baixo 11,15 1 2,65 2,65 NKG7 13,70 14,57 1,31E-03 Para baixo 11,83 1 2,88 2,88 FGFBP2 10,78 11,73 1,39E-03 Para baixo 9,51 1 2,86 2,86 S1PR5 10,17 11,18 9,10E-04 Para baixo 8,83 1 3,04 3,04 ADGRG1 10,90 12,02 9,52E-04 Para baixo 9,67 1 3,02 3,02
Não- - - Símbolo EAR_Med Valor P Direção Paciente g EAR_Med log10(p) log10(p)*g GZMH 10,55 11,90 2,05E-03 Para baixo 9,51 1 2,69 2,69 Pontuação de risco: 65,94 E XEMPLO 3
[074] Ensaio de expressão de RNA direcionado (TREx): 1) Kit de ensaio personalizado (conjuntos de iniciadores para o painel de 23 genes e um painel de genes de manutenção (Exemplo 6) e reagentes); 2) Kit de preparação de amostra de RNA Illumina® TruSeq® v2; 3) Conjunto de índices simples de RNA TruSeq; e 4) Kit QIAGEN RNeasy® para extração de RNA total de alta qualidade.
[075] O RNA total será extraído usando o kit QIAGEN RNeasy®. A biblioteca de sequenciamento será gerada usando o kit de preparação de amostra de RNA Illumina® TruSeq® v2 seguindo o protocolo do fabricante: resumidamente, o mRNA contendo poliA será primeiro purificado e fragmentado do RNA total. A síntese da primeira fita de cDNA será realizada utilizando iniciadores hexâmeros aleatórios e transcriptase reversa seguida pela síntese da segunda fita de cDNA. Após o processo de reparo final, que converte as saliências em extremidades cegas de cDNAs, vários adaptadores de indexação serão adicionados ao final do cDNA de fita dupla. A PCR será realizada para enriquecimento dos alvos utilizando os pares de iniciadores específicos para o painel de genes e genes de manutenção. Finalmente, as bibliotecas indexadas serão validadas, normalizadas e agrupadas para sequenciamento no sequenciador MiSEQ.
[076] Os dados de RNAseq brutos gerados pelo sequenciador MiSEQ serão processados usando o seguinte procedimento: As leituras com boa qualidade serão primeiro alinhadas a vários bancos de dados de referência humanos, incluindo o genoma humano hg19, éxon, junção de splicing e bancos de dados de contaminação, incluindo sequências de RNA ribossômico e mitocondrial, usando o algoritmo de alinhamento BWA1. Depois de filtrar as leituras, mapeadas para o banco de dados de contaminação, as leituras que estão exclusivamente alinhadas com um máximo de 2 incompatibilidades com as regiões do amplicon desejado (ou seja, produto de PCR dos iniciadores emparelhados) serão contadas como o nível de expressão para o gene correspondente e ainda submetidas a normalização com base na expressão dos genes de manutenção.
EXEMPLO 4: ENSAIO DE NANOSTRING
[077] 1) CodeSet personalizado (conjuntos de sondas com código de barras para o painel de 23 genes, painel de genes de manutenção (Exemplo 6) e controles negativos fornecidos por Nanostring).
[078] 2) Kit nCounter® Master incluindo nCounter Cartridge, nCounter Plate Pack e nCounter Prep Pack.
[079] 3) Kit QIAGEN RNeasy® para extração de RNA total de alta qualidade.
[080] O RNA total será extraído usando o kit QIAGEN RNeasy® seguindo o protocolo do fabricante; as sondas de código de barras serão recozidas ao RNA total em solução a 65 °C com o kit mestre. A sonda de captura irá capturar o alvo a ser imobilizado para coleta de dados. Após a hibridização, a amostra será transferida para o nCounter Pre Station e a sonda/ alvo será imobilizada no nCounter Cartridge. As sondas são então contadas pelo nCounter Digital Analyzer.
[081] Os dados de contagem brutos do analisador Nanostring serão processados usando o seguinte procedimento: os dados de contagem brutos serão primeiro normalizados para a contagem dos genes de manutenção e os mRNAs com contagens menores do que a mediana mais 3 desvios padrão das contagens dos controles negativos serão filtrados. Devido à variação de dados decorrente do uso de diferentes lotes de reagentes, a contagem para cada mRNA de cada lote de reagente diferente será calibrada multiplicando um fator da razão das contagens médias das amostras em diferentes lotes de reagentes. As contagens calibradas de diferentes lotes experimentais serão posteriormente ajustadas usando o pacote ComBat.
EXEMPLO 5: ENSAIO DE QPCR
[082] 1) Recipiente de iniciador (26 tubos com um ensaio de qPCR por tubo para cada um dos 23 genes, que incluem o painel de 23 genes e 2 genes de manutenção (ACTB e GAPDH) e a sonda de controle (RNA ribossômico 18S). Os ensaios são obtidos da LifeTech.
[083] 2) TaqMan® Universal Master Mix II: reagentes para reações de qPCR.
[084] 3) Placa de 96 poços TaqMan® ARRAY (6x23).
[085] 4) Kit de síntese de cDNA Agilent AffinityScript QPCR: para a mais alta eficiência de conversão de RNA em cDNA e totalmente otimizado para aplicações de PCR quantitativa em tempo real (QPCR).
[086] O RNA total será extraído das amostras de biópsia do aloenxerto usando o kit ALLprep (kit QIAGEN-ALLprep, Valencia, CA EUA). O cDNA será sintetizado utilizando o kit AffinityScript RT com iniciadores oligo dT
(Agilent Inc. Santa Clara, CA). Os ensaios TaqMan qPCR para o conjunto de assinatura de 23 genes, 2 genes de manutenção (ACTB, GAPDH) e RNA ribossômico 18S serão adquiridos na ABI Life Technology (Grand Island, NY).
Os experimentos de qPCR serão realizados em cDNAs usando a mistura universal TAQMAN e as reações de PCR serão monitoradas e adquiridas usando um sistema ABI7900HT. As amostras serão medidas em triplicatas. Os valores de Tempos de Ciclo (CT) para o conjunto de genes de previsão, bem como para os 2 genes de manutenção, serão gerados. O valor ∆CT de cada gene será calculado subtraindo o valor CT médio para os genes de manutenção do valor CT de cada gene.
EXEMPLO 6: PAINEL DE GENES DE MANUTENÇÃO PARA USO NA PRESENTE INVENÇÃO:
[087] São apresentados abaixo 13 candidatos a genes de manutenção que podem ser usados como painéis de genes para monitorar a qualidade nos ensaios da presente invenção. 10 genes por painel são usados para monitorar a qualidade das reações. Os kits também contêm iniciadores para os genes de manutenção. Os 10 genes de manutenção são selecionados a partir do grupo que consiste em CHTOP, YKT6, RER1, PI4KB, ZDHHC5, TMEM248, C6orf89, SMU1, SHC1, DLST, UBE2Q1, FBXO18 e SLC35E1.
[088] 1. Mengel, M. et al. Banff 2011 Meeting report: new concepts in antibody-mediated rejection. Am J Transplant 12, 563-70 (2012).
[089] 2. Yilmaz, S. et al. Protocol core needle biopsy and histologic Chronic Allograft Damage Index (CADI) as surrogate end point for long-term graft survival in multicenter studies. J Am Soc Nephrol 14, 773-9 (2003).
[090] 3. Solez, K. et al. Banff 07 classification of renal allograft pathology: updates and future directions. Am J Transplant 8, 753-60 (2008).
[091] 4. Li H. e Durbin R. (2009) Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler Transform. Bioinformatics, 25:1754-60. [PMID: 19451168].
[092] 5. Ritchie ME, Phipson B, Wu D, Hu Y, Law CW, Shi W e Smyth GK (2015). “limma powers differential expression analyses for RNA- sequencing and microarray studies.” Nucleic Acids Research, 43(7), pp, e47.
[093] Várias formas de realização da invenção foram descritas.
No entanto, será entendido que várias modificações podem ser feitas sem se afastar do sentido e do escopo da invenção. Consequentemente, outras formas de realização estão dentro do escopo das seguintes reivindicações.
[094] Além disso, deve ser entendido que todos os valores são aproximados e são fornecidos para descrição. Patentes, pedidos de patentes, publicações, descrições de produtos e protocolos são citados ao longo deste pedido, cujas divulgações são incorporadas neste documento por referência em sua totalidade para todos os fins.
Claims (19)
1. MÉTODO PARA IDENTIFICAR UM RECEPTOR DE ALOENXERTO RENAL em risco de desenvolver rejeição aguda, caracterizado por compreender as etapas de: (a) determinar os níveis de expressão de um conjunto de assinatura gênica em uma amostra de sangue pré-transplante do receptor de aloenxerto renal; (b) comparar os níveis de expressão do conjunto de assinatura gênica com os níveis de expressão de um conjunto de assinatura gênica em um controle, e (c) determinar que o receptor estará em risco de rejeição de aloenxerto se o nível de expressão de um ou mais genes no conjunto de assinatura gênica na amostra for alterado a partir do nível de expressão do mesmo um ou mais genes no conjunto de assinatura gênica no controle.
2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela alteração compreender um aumento ou uma diminuição no nível de expressão de um ou mais genes no conjunto de assinatura gênica na amostra em comparação com o mesmo um ou mais genes no conjunto de assinatura gênica no controle.
3. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pela alteração compreender um aumento e uma diminuição no nível de expressão de um ou mais genes no conjunto de assinatura gênica na amostra em comparação com o mesmo um ou mais genes no conjunto de assinatura gênica no controle.
4. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo conjunto de assinatura gênica ser selecionado a partir do grupo que consiste em: GZMH, ADGRG1, S1PR5, FGFBP2, NKG7, PRF1, KIAA1671, LAG3, TARP, FCRL6, FASLG, TBX21,
TOX, ZNF831, CD8A, C1orf21, CCR5, LDOC1L, CCDC102A, HOPX, PRKCH, SLC25A34 e F12.
5. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pela etapa de determinação compreender aplicar os níveis de expressão determinados na amostra do paciente a uma pontuação de risco cumulativa ponderada r = - (log10(p1)*g1+log10(p2)*g2+…+log10(pi)*gi+...+log10 (p23)*g23), onde pi é o valor de significância p do teste t nos valores de expressão para o gene i (i = 1...23) entre os grupos EAR versus não-EAR no conjunto de treinamento, gi é um número lógico para o gene i (i = 1...23), 1 (se o valor de expressão do gene i for maior do que o valor de expressão mediano do grupo EAR do conjunto de treinamento para um gene regulado positivamente ou se o valor de expressão do gene i for menor do que o valor de expressão mediano do grupo EAR do conjunto de treinamento para um gene regulado negativamente), ou -1 (se o valor de expressão do gene i for menor do que o valor mediano do grupo não- EAR do conjunto de treinamento para um gene regulado positivamente ou se o valor de expressão do gene i for maior do que o valor mediano do grupo não-EAR do conjunto de treinamento para um gene regulado negativamente), ou 0 (se o valor de expressão do gene i estiver entre os valores medianos dos grupos EAR e não-EAR do conjunto de treinamento) que pode ser usado como um pontuação de risco para rejeição aguda para cada paciente.
6. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelos níveis de expressão serem determinados por um método selecionado a partir do grupo que consiste em Nanostring, TREx e reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR).
7. MÉTODO PARA IDENTIFICAR UM RECEPTOR DE
ALOENXERTO RENAL EM RISCO DE REJEIÇÃO AGUDA DO
ALOENXERTO ANTES DO TRANSPLANTE, caracterizado por compreender as etapas de: (a) obter uma amostra de sangue do receptor de aloenxerto renal; (b) isolar mRNA da amostra de sangue; (c) sintetizar cDNA a partir do mRNA; (d) determinar os níveis de expressão de um conjunto de assinatura gênica no sangue do referido receptor; e (e) diagnosticar o receptor de aloenxerto como estando em risco de rejeição aguda e perda de aloenxerto se o nível de expressão de um ou mais genes no conjunto de assinatura gênica na amostra de sangue do receptor de aloenxerto for alterado em comparação com o nível de expressão do mesmo um ou mais genes na amostra de sangue de controle e tratar o receptor identificado como estando em risco de rejeição aguda ou perda de aloenxerto com terapia de indução.
8. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pela referida terapia de indução compreender administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de globulina anti-timócito ou Campath-1H.
9. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 8, caracterizado pelo conjunto de assinatura gênica ser selecionado a partir do grupo que consiste em GZMH, ADGRG1, S1PR5, FGFBP2, NKG7, PRF1, KIAA1671, LAG3, TARP, FCRL6, FASLG, TBX21, TOX, ZNF831, CD8A, C1orf21, CCR5, LDOC1L, CCDC102A, HOPX, PRKCH, SLC25A34 e F12.
10. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 9, caracterizado pelos níveis de expressão serem determinados por um método selecionado a partir do grupo que consiste em Nanostring, TREx e reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR).
11. KIT PARA IDENTIFICAR RECEPTORES DE ALOENXERTO RENAL em risco de rejeição aguda e perda de aloenxerto, caracterizado por compreender em um ou mais recipientes separados, pares de iniciadores para o conjunto de assinatura gênica: GZMH, ADGRG1, S1PR5, FGFBP2, NKG7, PRF1, KIAA1671, LAG3, TARP, FCRL6, FASLG, TBX21, TOX, ZNF831, CD8A, C1orf21, CCR5, LDOC1L, CCDC102A, HOPX, PRKCH, SLC25A34, F12, tampões, controles positivo e negativo e instruções de uso.
12. KIT, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por compreender ainda um painel de genes de manutenção e iniciadores para o painel de genes de manutenção.
13. KIT, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 12, caracterizado pelos genes no referido painel de genes de manutenção serem selecionados a partir do grupo que consiste em CHTOP, YKT6, RER1, PI4KB, ZDHHC5, TMEM248, C6orf89, SMU1, SHC1, DLST, UBE2Q1, FBXO18 e SLC35E1.
14. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 8, caracterizado por compreender ainda calcular uma pontuação cumulativa ponderada (r = - (log10(p1)*g1+log10(p2)*g2+…+log10(pi)*gi+...+log10(p23)*g23), onde pi é o valor de significância p do teste t nos valores de expressão para o gene i (i = 1...23) entre os grupos EAR versus não-EAR no conjunto de treinamento, gi é um número lógico para o gene i (i = 1…23), 1 (se o valor de expressão do gene i for maior do que o valor de expressão mediano do grupo EAR do conjunto de treinamento para um gene regulado positivamente ou se o valor de expressão do gene i for menor do que o valor de expressão mediano do grupo EAR do conjunto de treinamento para um gene regulado negativamente), ou -1 (se o valor de expressão do gene i for menor do que o valor mediano do grupo não-
EAR do conjunto de treinamento para um gene regulado positivamente ou se o valor de expressão do gene i for maior do que o valor mediano do grupo não-EAR do conjunto de treinamento para um gene regulado negativamente), ou 0 (se o valor de expressão do gene i estiver entre os valores medianos dos grupos EAR e não-EAR do conjunto de treinamento) que pode ser usado como uma pontuação de risco para rejeição aguda para cada paciente.
15. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pela pontuação de probabilidade ser determinada usando um sistema baseado em computador.
16. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 15, caracterizado pela pontuação de probabilidade ser usada para determinar o valor de corte.
17. MÉTODO PARA SELECIONAR UM PACIENTE COM ALOENXERTO RENAL para terapia de indução antes do transplante para reduzir o risco de rejeição aguda renal ou perda de aloenxerto, caracterizado por compreender: - comparar o nível de expressão de um conjunto de assinatura gênica obtido do paciente com o nível de expressão de um conjunto de assinatura gênica em uma amostra de controle obtida de um receptor de aloenxerto que não sofreu rejeição aguda e selecionar o paciente para tratamento com terapia de indução se o nível de expressão de um ou mais genes no conjunto de assinatura gênica do paciente estiver alterado em comparação com o nível de expressão de um ou mais dos genes no conjunto de assinatura gênica no controle, e - administrar terapia de indução ao referido paciente.
18. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pela referida terapia de indução compreender administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de globulina anti-timócito ou Campath-1H.
19. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 18, caracterizado pelo conjunto de assinatura gênica compreender pelo menos os genes GZMH, ADGRG1, S1PR5, FGFBP2,
NKG7, PRF1, KIAA1671, LAG3, TARP, FCRL6, FASLG, TBX21, TOX,
ZNF831, CD8A, C1orf21, CCR5, LDOC1L, CCDC102A, HOPX, PRKCH,
SLC25A34 e F12.
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