BR112016030313B1 - METHOD OF IDENTIFICATION OF A PATIENT WITH RENAL ALLORIFY AND KIT - Google Patents
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Abstract
MÉTODOS DE IDENTIFICAÇÃO, TRATAMENTO E SELEÇÃO DE PACIENTES COM ALOENXERTO RENAL E KIT. São descritos no presente métodos de diagnóstico de rejeição celular aguda (ACR) de um aloenxerto por meio da análise de conjuntos genéticos previsores e kits de prática desses métodos.METHODS OF IDENTIFICATION, TREATMENT AND SELECTION OF PATIENTS WITH RENAL ALLOGRAPHY AND KIT. Methods for diagnosing acute cellular rejection (ACR) of an allograft through the analysis of predictive genetic pools and practice kits for these methods are described in this present study.
Description
[001] O presente pedido reivindica o benefício do Pedido Norte- Americano n° 62/017.784, depositado em 26 de junho de 2014, que é integralmente incorporado ao presente como referência.[001] This application claims the benefit of US Application No. 62/017,784, filed on June 26, 2014, which is fully incorporated herein by reference.
[002] A presente invenção foi realizada com apoio governamental com base no subsídio n° 1U01AI070107-01 concedido pelos Institutos Nacionais de Saúde. O governo detém alguns direitos sobre a presente invenção.[002] The present invention was made with government support based on subsidy No. 1U01AI070107-01 granted by the National Institutes of Health. The government owns certain rights in the present invention.
[003] A presente invenção refere-se a métodos de diagnóstico de rejeição celular aguda (ACR) de um aloenxerto por meio da análise de conjuntos genéticos previsores e kits de prática desses métodos. Os métodos compreendem a análise do sangue de pacientes com aloenxertos renais por meio de determinação do nível de expressão de um conjunto de assinatura genética que contém pelo menos sete genes previamente selecionados, a fim de identificar e tratar esses pacientes. Nível de expressão alterado de um ou mais genes no sangue do paciente de aloenxertos em comparação com os mesmos genes em um controle indica que o paciente encontra-se em risco de rejeição de aloenxertos. Quanto maior o nível de alteração, maior o risco de rejeição. Pode- se aplicar um modelo de enquadramento de regressão logística a valores de expressão normalizados (tais como contagens de leitura de genes por meio de tecnologia de sequenciamento de gerações seguintes) para gerar um modelo estatístico do qual pode ser calculada avaliação de probabilidades de risco de rejeição celular aguda para cada paciente.[003] The present invention relates to methods of diagnosing acute cellular rejection (ACR) of an allograft through the analysis of predictive genetic sets and practice kits for these methods. The methods comprise analyzing the blood of patients with renal allografts by means of determining the level of expression of a genetic signature set that contains at least seven previously selected genes, in order to identify and treat these patients. Altered expression level of one or more genes in the blood of the allograft patient compared to the same genes in a control indicates that the patient is at risk of allograft rejection. The greater the level of change, the greater the risk of rejection. A logistic regression framing model can be applied to normalized expression values (such as gene read counts via next-generation sequencing technology) to generate a statistical model from which risk probabilities of acute cellular rejection can be calculated for each patient.
[004] Os testes existentes de rejeição de aloenxertos renais são caros e complicados. Esses testes normalmente exigem a obtenção de amostras de biópsia do paciente. Frequentemente, no momento em que a rejeição é reconhecida, é tarde demais para fazer qualquer coisa. Aumento da creatinina no soro ou aumento da proteína na urina podem ser avisos de rejeição, mas não a preveem completamente. Existe a necessidade no campo de testes aprimorados que sejam de fácil condução, eliminem a necessidade de biópsia e prevejam melhor o risco de rejeição de aloenxerto renal ou fibrose.[004] Existing renal allograft rejection tests are expensive and complicated. These tests typically require obtaining biopsy specimens from the patient. Often, by the time the rejection is acknowledged, it's too late to do anything about it. Increased serum creatinine or increased urine protein can be warnings of rejection but do not completely predict it. There is a need in the field for improved tests that are easy to conduct, eliminate the need for biopsy, and better predict the risk of renal allograft rejection or fibrosis.
[005] O teste de perfil de expressão do presente aborda essa necessidade e fornece um exame de sangue que é facilmente administrado repetidamente a pacientes com transplante. Pacientes com transplante renal são examinados pelo seu médico com muita frequência após o transplante - na maior parte dos casos, duas vezes por semana para o primeiro mês, alterando- se para semanalmente e a cada duas semanas, chegando a mensalmente após quatro a cinco meses, com os intervalos de tempo entre as visitas aumentando gradualmente em seguida. Durante esse período, a função renal dos pacientes e os níveis de imunossupressão são monitorados. Os esteroides são afilados até 5 mg por meio de pós-cirurgia por três meses e os níveis de tacrolimus (fármaco que suprime o sistema imunológico e é utilizada para evitar a rejeição de órgãos transplantados) são gradualmente reduzidos para um nível estável em até seis a doze meses caso o transcurso pós-transplante não apresente complicações e o paciente não possua alto risco imunológico. Os perfis de expressão genética descritos abaixo podem ser empregados como teste padrão a ser realizado no momento de uma visita clínica. Resultado de teste positivo (ou seja, o paciente expressa esses genes em nível alterado em comparação com controle) indica que o paciente encontra-se em risco de rejeição do órgão transplantado e seria tratado por meio de aumento da dose de fármacos imunossupressores e suspensão do conjunto costumeiro de fármacos imunossupressores. Teste de repetição (que pode ser realizado economicamente, pois o teste é preferencialmente um exame de sangue) orientará o reinício do afunilamento imunossupressor. Se dois testes subsequentes forem negativos, por exemplo, a dose de prednisona pode, por exemplo, cair em 2,5 ou 5 mg ou o nível alvo de tacrolimus seria reduzido em 0,5 mg/dl. Caso o teste de perfil seja positivo na presença de aumento da creatinina, isso indicaria rejeição aguda clínica, conforme evidenciado por lesões renais. Neste caso, o paciente seria tratado com alta dose de esteroides ou agentes antilinfócitos, dependendo do risco imunológico geral do indivíduo.[005] The present expression profile test addresses this need and provides a blood test that is easily administered repeatedly to transplant patients. Kidney transplant patients are seen by their doctor very frequently after transplantation - in most cases twice a week for the first month, changing to weekly and every other week, increasing to monthly after four to five months, with the time intervals between visits gradually increasing thereafter. During this period, patients' kidney function and immunosuppression levels are monitored. Steroids are tapered to 5 mg post-surgery for three months and levels of tacrolimus (a drug that suppresses the immune system and is used to prevent rejection of transplanted organs) are gradually reduced to a stable level within six to twelve months if the post-transplant course is uneventful and the patient is not at high immunological risk. The gene expression profiles described below can be used as a standard test to be performed at the time of a clinical visit. A positive test result (i.e., the patient expresses these genes at an altered level compared to the control) indicates that the patient is at risk of rejection of the transplanted organ and would be treated by increasing the dose of immunosuppressive drugs and discontinuing the usual set of immunosuppressive drugs. Repeat testing (which can be cost-effectively performed as the test is preferably a blood test) will guide restarting the immunosuppressive taper. If two subsequent tests are negative, for example, the prednisone dose could, for example, drop by 2.5 or 5 mg or the target tacrolimus level would be reduced by 0.5 mg/dl. If the profile test is positive in the presence of increased creatinine, this would indicate clinical acute rejection, as evidenced by renal lesions. In this case, the patient would be treated with a high dose of steroids or anti-lymphocyte agents, depending on the individual's general immunological risk.
[006] Em um aspecto, é fornecido um método de identificação de pacientes com aloenxerto renal em risco de perda ou rejeição de aloenxertos, por meio da obtenção de uma amostra biológica do paciente com aloenxerto renal, medição do nível de expressão de um conjunto de assinatura genética previamente selecionado na amostra, comparação do nível de expressão do conjunto de assinatura genética previamente selecionado na amostra com o nível de expressão do conjunto de assinatura genética previamente selecionado em controle, determinação de que o paciente com aloenxerto encontra-se em maior risco de rejeição do aloenxerto se o nível de expressão do conjunto de assinatura genética na amostra for alterado em comparação com o nível de expressão no controle.[006] In one aspect, a method of identifying renal allograft patients at risk of allograft loss or rejection is provided by obtaining a biological sample from the renal allograft patient, measuring the expression level of a previously selected genetic signature set in the sample, comparing the expression level of the previously selected genetic signature set in the sample with the expression level of the previously selected genetic signature set in control, determining that the allograft patient is at increased risk of rejection of the allograft graft if the expression level of the genetic signature set in the sample is changed compared to the expression level in the control.
[007] Em outro aspecto, é fornecido um método de identificação de pacientes com aloenxerto renal em risco de perda ou rejeição de aloenxertos, por meio da obtenção de uma amostra biológica do paciente com aloenxerto renal, medição do nível de expressão de um conjunto de assinatura genética previamente selecionado na amostra, comparação do nível de expressão do conjunto de assinatura genética previamente selecionado na amostra com o nível de expressão do conjunto de assinatura genética previamente selecionado em controle, determinação de que o paciente com aloenxerto encontra-se em maior risco de rejeição do aloenxerto se o nível de expressão de um ou mais genes do conjunto de assinatura genética na amostra for alterado em comparação com o nível de um ou mais genes do conjunto de assinatura genética no controle.[007] In another aspect, a method of identifying patients with renal allograft at risk of loss or rejection of allografts is provided, by obtaining a biological sample from the patient with renal allograft, measuring the expression level of a previously selected genetic signature set in the sample, comparing the expression level of the previously selected genetic signature set in the sample with the expression level of the previously selected genetic signature set in control, determining that the patient with allograft is at greater risk of rejection of the allograft graft if the expression level of one or more genes of the genetic signature set in the sample is changed compared to the level of one or more genes of the genetic signature set in the control.
[008] Em outro aspecto, é fornecido um método de tratamento de pacientes com aloenxerto renal em risco de perda ou rejeição de aloenxertos, por meio da obtenção de uma amostra biológica do paciente com aloenxerto renal, medição do nível de expressão de um conjunto de assinatura genética previamente selecionado na amostra, comparação do nível de expressão do conjunto de assinatura genética previamente selecionado na amostra com o nível de expressão do conjunto de assinatura genética previamente selecionado em amostra de controle, determinação de que o paciente com aloenxerto encontra-se em maior risco de rejeição do aloenxerto se o nível de expressão do conjunto de assinatura genética na amostra for alterado em comparação com o nível de expressão do conjunto de assinatura genética previamente selecionado do controle e tratamento do paciente determinado como estando em risco de rejeição.[008] In another aspect, a method of treating patients with renal allograft at risk of loss or rejection of allografts is provided, by obtaining a biological sample from the patient with renal allograft, measuring the expression level of a previously selected genetic signature set in the sample, comparing the expression level of the previously selected genetic signature set in the sample with the expression level of the previously selected genetic signature set in the control sample, determining that the patient with the allograft is at greater risk of rejection of the allograft if the expression level of the genetic signature set in the sample is altered compared to the expression level of the previously selected genetic signature set of the control and treatment of the patient determined to be at risk of rejection.
[009] Em outro aspecto, é fornecido um método de tratamento de pacientes com aloenxerto renal em risco de perda ou rejeição de aloenxertos, por meio da obtenção de uma amostra biológica do paciente com aloenxerto renal, medição do nível de expressão de um conjunto de assinatura genética previamente selecionado na amostra, comparação do nível de expressão do conjunto de assinatura genética previamente selecionado na amostra com o nível de expressão de amostra controle, determinação de que o paciente com aloenxerto encontra-se em maior risco de rejeição do aloenxerto se o nível de expressão de um ou mais genes do conjunto de assinatura genética na amostra for alterado em comparação com o nível de expressão de um ou mais genes do conjunto de assinatura genética no controle e tratamento do paciente determinado como estando em risco de rejeição.[009] In another aspect, a method of treating renal allograft patients at risk of allograft loss or rejection is provided by obtaining a biological sample from the renal allograft patient, measuring the expression level of a previously selected genetic signature set in the sample, comparing the expression level of the previously selected genetic signature set in the sample with the expression level of the control sample, determining that the allograft patient is at greater risk of allograft rejection if the level of expression of one or more genes of the genetic signature set in the sample is altered compared to the level of expression of one or more genes of the genetic signature set in the control and treatment of the patient determined to be at risk of rejection.
[0010] Em outra realização, é fornecido um método de tratamento de pacientes com aloenxerto renal por meio da obtenção de uma amostra biológica do paciente com aloenxerto, medição do nível de expressão de um gene selecionado definido na amostra, comparação do nível de expressão do conjunto genético na amostra com o nível de expressão de um paciente controle, determinação de que o paciente encontra-se em risco de rejeição do aloenxerto se o nível de expressão do conjunto genético na amostra for alterado em comparação com o nível de expressão do conjunto genético no controle e tratamento do paciente determinado como estando em risco de rejeição.[0010] In another embodiment, a method of treating renal allograft patients is provided by obtaining a biological sample from the allograft patient, measuring the expression level of a defined selected gene in the sample, comparing the expression level of the gene pool in the sample with the expression level of a control patient, determining that the patient is at risk of allograft rejection if the expression level of the gene pool in the sample is changed compared to the expression level of the gene pool in the control, and treating the given patient as being at risk of rejection.
[0011] Em outra realização, é fornecido um método de tratamento de pacientes com aloenxerto renal por meio da obtenção de uma amostra biológica do paciente com aloenxerto, medição do nível de expressão de um gene selecionado definido na amostra, comparação do nível de expressão do conjunto genético na amostra com o nível de expressão de controle, determinação de que o paciente encontra-se em risco de rejeição do aloenxerto se o nível de expressão de um ou mais membros do conjunto genético na amostra for alterado em comparação com o nível de expressão de um ou mais membros do conjunto de assinatura genética no controle e tratamento do paciente determinado como estando em risco de rejeição.[0011] In another embodiment, a method of treating renal allograft patients is provided by obtaining a biological sample from the allograft patient, measuring the expression level of a defined selected gene in the sample, comparing the expression level of the gene pool in the sample with the control expression level, determining that the patient is at risk of allograft rejection if the expression level of one or more members of the gene pool in the sample is altered compared to the expression level of one or more members of the pool of genetic signature in the management and treatment of the patient determined to be at risk of rejection.
[0012] Outra realização fornece um método de tratamento de pacientes com aloenxerto renal por meio da obtenção de uma amostra biológica do paciente com aloenxerto, medição do nível de expressão de um gene selecionado definido na amostra, comparação do nível de expressão do conjunto genético na amostra com o nível de expressão de controle, determinação de que o paciente encontra-se em risco de rejeição do aloenxerto se o nível de expressão do conjunto genético na amostra for alterado com relação ao nível de expressão do conjunto genético no controle e tratamento do paciente determinado como estando em risco de rejeição por meio da administração de fármacos imunossupressores ao paciente ou da administração de alta dose de esteroides ou agentes antilinfócitos.[0012] Another embodiment provides a method of treating renal allograft patients by obtaining a biological sample from the allograft patient, measuring the expression level of a defined selected gene in the sample, comparing the expression level of the gene pool in the sample with the control expression level, determining that the patient is at risk of allograft rejection if the expression level of the gene pool in the sample is changed relative to the expression level of the gene pool in the control, and treating the patient determined to be at risk of rejection by administering immunosuppressive drugs to the patient or by administering a high dose of steroids or anti-lymphocyte agents.
[0013] Outra realização fornece um método de tratamento de pacientes com aloenxerto renal por meio da obtenção de uma amostra biológica do paciente com aloenxerto, medição do nível de expressão de um conjunto genético selecionado na amostra, comparação do nível de expressão do conjunto genético na amostra com o nível de expressão do conjunto genético de controle, determinação de que o paciente encontra-se em risco de rejeição do aloenxerto se o nível de expressão de um ou mais genes do conjunto genético na amostra for alterado em comparação com o nível de expressão de um ou mais membros do conjunto genético no controle e tratamento do paciente determinado como estando em risco de rejeição por meio da administração de fármacos imunossupressores ao paciente ou da administração de alta dose de esteroides ou agentes antilinfócitos.[0013] Another embodiment provides a method of treating renal allograft patients by obtaining a biological sample from the allograft patient, measuring the expression level of a selected gene pool in the sample, comparing the expression level of the gene pool in the sample with the expression level of the control gene pool, determining that the patient is at risk of allograft rejection if the expression level of one or more genes of the gene pool in the sample is altered compared to the expression level of one or more members of the pool genetic control in the management and treatment of the patient determined to be at risk of rejection through the administration of immunosuppressive drugs to the patient or the administration of a high dose of steroids or anti-lymphocyte agents.
[0014] Em outro aspecto, é fornecido um kit para uso na determinação de se um paciente com aloenxerto encontra-se em risco de ACR. O kit compreende um teste de um conjunto de assinatura genética previamente selecionado, primers para um conjunto de assinatura genética previamente selecionado, tampões e controles positivos e negativos e instruções de uso.[0014] In another aspect, a kit is provided for use in determining whether an allograft patient is at risk for ACR. The kit comprises a test of a preselected genetic signature set, primers for a preselected genetic signature set, buffers and positive and negative controls, and instructions for use.
[0015] Em um aspecto, é fornecido um quadro de sequenciamento que compreende pelo menos sete genes dentre os genes SPCS3, ZMAT1, ETAA1, ZNF493, CCDC82, NFYB, F13A1, TUBB1, TSC22D1, SENP6, ANXA5, EFTUD2, SENP7, AP1M1, CLK1, MAP1A e C1GALT1C1.[0015] In one aspect, there is provided a sequencing framework comprising at least seven genes from among the SPCS3, ZMAT1, ETAA1, ZNF493, CCDC82, NFYB, F13A1, TUBB1, TSC22D1, SENP6, ANXA5, EFTUD2, SENP7, AP1M1, CLK1, MAP1A, and C1GALT1C1 genes.
[0016] Em outro aspecto, é fornecido um quadro de sequenciamento que compreende os genes ANXA5, TSC22D1, AP1M1, CLK1, EFTUD2, SENP6 e SENP7.[0016] In another aspect, a sequencing framework comprising the ANXA5, TSC22D1, AP1M1, CLK1, EFTUD2, SENP6 and SENP7 genes is provided.
[0017] Em outro aspecto, é fornecido um quadro de sequenciamento que compreende os genes TSC22D1, ANKA5, EFTUD2, AP1M1, MAP1A, C1GALT1C1, SENP6, CLK1 e SENP7.[0017] In another aspect, a sequencing framework comprising the genes TSC22D1, ANKA5, EFTUD2, AP1M1, MAP1A, C1GALT1C1, SENP6, CLK1 and SENP7 is provided.
[0018] Em outro aspecto, é fornecido um quadro de sequenciamento que compreende os genes CCDC82, F13A1, TUBB1, TSC22D1, SENP6, ANXA5, EFTUD2, SENP7, AP1M1, CLK1 e C1GALT1C1.[0018] In another aspect, a sequencing framework comprising the genes CCDC82, F13A1, TUBB1, TSC22D1, SENP6, ANXA5, EFTUD2, SENP7, AP1M1, CLK1 and C1GALT1C1 is provided.
[0019] Em outro aspecto, é fornecido um quadro de sequenciamento que compreende os genes SPCS3, ZMAT1, ETAA1, ZNF493, CCDC82, NFYB, F13A1, TUBB1, TSC22D1, SENP6, ANXA5, EFTUD2, SENP7, AP1M1, CLK1, MAP1A e C1GALT1C1.[0019] In another aspect, a sequencing framework comprising the SPCS3, ZMAT1, ETAA1, ZNF493, CCDC82, NFYB, F13A1, TUBB1, TSC22D1, SENP6, ANXA5, EFTUD2, SENP7, AP1M1, CLK1, MAP1A and C1GALT1C1 genes is provided.
[0020] Ainda outro aspecto é um kit de teste para identificação de pacientes com aloenxerto renal que sofrem de rejeição aguda clínica e subclínica em risco de perda de aloenxerto, que compreende, em um ou mais recipientes separados: um teste para determinar um conjunto de assinatura genética que compreende pelo menos os genes ANXA5, TSC22D1, AP1M1, CLK1, EFTUD2, SENP6 e SENP7, tampões, controles positivos e negativos e instruções de uso.[0020] Yet another aspect is a test kit for identifying renal allograft patients suffering from acute clinical and subclinical rejection at risk of allograft loss, comprising, in one or more separate containers: a test to determine a genetic signature set comprising at least the ANXA5, TSC22D1, AP1M1, CLK1, EFTUD2, SENP6, and SENP7 genes, buffers, positive and negative controls, and instructions for use.
[0021] Ainda outro aspecto é um kit de teste para identificação de pacientes com aloenxerto renal que sofrem de rejeição aguda clínica e subclínica e em risco de perda de aloenxerto, que compreende, em um ou mais recipientes separados: um teste para determinar um conjunto de assinatura genética que compreende pelo menos os genes TSC22D1, ANKA5, EFTUD2, AP1M1, MAP1A, C1GALT1C1, SENP6, CLK1 e SENP7, tampões, controles positivos e negativos e instruções de uso.[0021] Yet another aspect is a test kit for identifying renal allograft patients suffering from clinical and subclinical acute rejection and at risk of allograft loss, comprising, in one or more separate containers: a test to determine a genetic signature set comprising at least the TSC22D1, ANKA5, EFTUD2, AP1M1, MAP1A, C1GALT1C1, SENP6, CLK1 and SENP7 genes, buffers, positive and negative controls and instructions for use.
[0022] Ainda outro aspecto é um kit de teste para identificação de pacientes com aloenxerto renal que sofrem de rejeição aguda clínica e subclínica e em risco de perda de aloenxerto, que compreende, em um ou mais recipientes separados: um teste para determinar um conjunto de assinatura genética que compreende pelo menos os genes CCDC82, F13A1, TUBB1, TSC22D1, SENP6, ANXA5, EFTUD2, SENP7, AP1M1, CLK1 e C1GALT1C1, tampões, controles positivos e negativos e instruções de uso.[0022] Yet another aspect is a test kit for identifying renal allograft patients suffering from clinical and subclinical acute rejection and at risk of allograft loss, comprising, in one or more separate containers: a test to determine a genetic signature set comprising at least the genes CCDC82, F13A1, TUBB1, TSC22D1, SENP6, ANXA5, EFTUD2, SENP7, AP1M1, CLK1 and C1GALT1C1, buffers, positive and negative controls, and instructions for use.
[0023] Outro aspecto é um kit de teste para identificação de pacientes com aloenxerto renal que sofrem de rejeição aguda clínica e subclínica e em risco de perda de aloenxerto, que compreende, em um ou mais recipientes separados: um teste para determinar um conjunto de assinatura genética que compreende pelo menos os genes SPCS3, ZMAT1, ETAA1, ZNF493, CCDC82, NFYB, F13A1, TUBB1, TSC22D1, SENP6, ANXA5, EFTUD2, SENP7, AP1M1, CLK1, MAP1A e C1GALT1C1, tampões, controles positivos e negativos e instruções de uso.[0023] Another aspect is a test kit for identifying renal allograft patients suffering from clinical and subclinical acute rejection and at risk of allograft loss, comprising, in one or more separate containers: a test to determine a genetic signature set comprising at least the SPCS3, ZMAT1, ETAA1, ZNF493, CCDC82, NFYB, F13A1, TUBB1, TSC22D1, SENP6 genes , ANXA5, EFTUD2, SENP7, AP1M1, CLK1, MAP1A and C1GALT1C1, buffers, positive and negative controls and instructions for use.
[0024] Outro aspecto é um kit de teste para identificação de pacientes com aloenxerto renal que sofrem de rejeição aguda clínica e subclínica e em risco de perda de aloenxerto, que compreende, em um ou mais recipientes separados: um teste para determinar um conjunto de assinatura genética que compreende pelo menos os genes SPCS3, ZMAT1, ETAA1, ZNF493, CCDC82, NFYB, F13A1, TUBB1, TSC22D1, SENP6, ANXA5, EFTUD2, SENP7, AP1M1, CLK1, MAP1A e C1GALT1C1, tampões, controles positivos e negativos e instruções de uso.[0024] Another aspect is a test kit for identifying renal allograft patients suffering from clinical and subclinical acute rejection and at risk of allograft loss, comprising, in one or more separate containers: a test to determine a genetic signature set comprising at least the SPCS3, ZMAT1, ETAA1, ZNF493, CCDC82, NFYB, F13A1, TUBB1, TSC22D1, SENP6 genes , ANXA5, EFTUD2, SENP7, AP1M1, CLK1, MAP1A and C1GALT1C1, buffers, positive and negative controls and instructions for use.
[0025] Um aspecto adicional fornece um método de identificação de pacientes com aloenxerto renal que sofrem de rejeição aguda clínica e subclínica e em risco de perda de enxerto, que compreende as etapas de fornecimento de amostra de sangue de um paciente com aloenxerto renal, isolamento de mRNA da amostra sanguínea, síntese de cDNA a partir do mRNA e medição dos níveis de expressão de um quadro genético que compreende um conjunto de assinatura genética previamente selecionado com o sistema de sequências MiSEQ (Illumina, Inc., San Diego, Califórnia), Nanostring (Conjunto de Expressão de miRNA nCounter® - Nanostring Technologies, Inc., Seattle, Washington) ou qPCR. Os resultados da análise de conjunto genético são comparadas com um controle. O resultado de expressão genética pode ser utilizado para prever o início de reação de rejeição de aloenxertos, diagnosticar reação de rejeição de aloenxertos e/ou caracterizar reação de rejeição de aloenxertos em paciente com transplante. Caso o paciente expresse o conjunto de assinatura genética em nível alterado com relação ao nível de expressão no controle, o paciente encontra-se em risco de rejeição. Quanto mais alterado for o nível de expressão em pacientes do conjunto genético de assinatura em comparação com o controle, maior o risco de rejeição.[0025] An additional aspect provides a method of identifying renal allograft patients suffering from acute clinical and subclinical rejection and at risk of graft loss, comprising the steps of providing a blood sample from a renal allograft patient, isolating mRNA from the blood sample, synthesizing cDNA from the mRNA, and measuring the expression levels of a genetic framework comprising a preselected genetic signature set with the MiSEQ sequence system (Illumina, Inc., San Diego, California), Na nostring (nCounter® miRNA Expression Kit - Nanostring Technologies, Inc., Seattle, Washington) or qPCR. Gene pool analysis results are compared to a control. The gene expression result can be used to predict the onset of an allograft rejection reaction, diagnose an allograft rejection reaction and/or characterize an allograft rejection reaction in a transplant patient. If the patient expresses the genetic signature set at an altered level relative to the expression level in the control, the patient is at risk of rejection. The more altered the expression level in patients of the signature gene pool compared to the control, the greater the risk of rejection.
[0026] Em outro aspecto, os resultados do teste são aplicados a um modelo de enquadramento de regressão logística penalizado (log (p(x))/(1- p(x)) = β*0+β*1g1+ β*igi+ + β*ngn (em que p(x) é a probabilidade de ACR, β*i é a coeficiência penalizada e gi é a contagem de leitura do gene i) que pode ser utilizado para computar avaliação de probabilidade de rejeição aguda para cada paciente.[0026] In another aspect, the test results are applied to a penalized logistic regression framing model (log (p(x))/(1- p(x)) = β*0+β*1g1+ β*igi+ + β*ngn (where p(x) is the probability of ACR, β*i is the penalized coefficient, and gi is the read count of gene i) that can be used to compute assessment of probability of acute rejection for each patient.
[0027] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método de determinação da probabilidade de rejeição de enxerto renal em pacientes por meio de determinação do nível de expressão de um conjunto genético previamente selecionado que contém pelo menos os genes ANXA5, TSC22D1, AP1M1, CLK1, EFTUD2, SENP6 e SENP7 em uma amostra do paciente e comparação do nível de expressão dos genes do conjunto genético previamente selecionado na amostra com o nível de expressão dos genes do conjunto genético previamente selecionado em um controle, para determinar a probabilidade de rejeição de enxerto renal no paciente.[0027] In another aspect, the present invention provides a method of determining the probability of renal graft rejection in patients by determining the expression level of a previously selected gene pool that contains at least the ANXA5, TSC22D1, AP1M1, CLK1, EFTUD2, SENP6 and SENP7 genes in a patient sample and comparing the expression level of the genes of the previously selected gene pool in the sample with the level of expression of the genes of the previously selected gene pool in a control, to determine the probability of rejection of renal graft in the patient.
[0028] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método de determinação da probabilidade de rejeição de enxerto renal em pacientes por meio de determinação do nível de expressão de um conjunto genético previamente selecionado que contém pelo menos os genes TSC22D1, ANKA5, EFTUD2, AP1M1, MAP1A, C1GALT1C1, SENP6, CLK1 e SENP7 em uma amostra do paciente e comparação do nível de expressão dos genes do conjunto genético previamente selecionado na amostra com o nível de expressão dos genes do conjunto genético previamente selecionado em um controle, para determinar a probabilidade de rejeição de enxerto renal no paciente.[0028] In another aspect, the present invention provides a method of determining the probability of renal graft rejection in patients by determining the expression level of a previously selected gene pool that contains at least the TSC22D1, ANKA5, EFTUD2, AP1M1, MAP1A, C1GALT1C1, SENP6, CLK1 and SENP7 genes in a patient sample and comparing the expression level of the genes of the previously selected gene pool in the sample with the expression level of the genes of the gene pool previously selected in a control, to determine the probability of renal graft rejection in the patient.
[0029] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método de determinação da probabilidade de rejeição de enxerto renal em pacientes por meio de determinação do nível de expressão de um conjunto genético previamente selecionado que contém pelo menos os genes CCDC82, F13A1, TUBB1, TSC22D1, SENP6, ANXA5, EFTUD2, SENP7, AP1M1, CLK1 e C1GALT1C1 em uma amostra do paciente e comparação do nível de expressão dos genes do conjunto genético previamente selecionado na amostra com o nível de expressão dos genes do conjunto genético previamente selecionado em controle, para determinar a probabilidade de rejeição de enxerto renal no paciente.[0029] In another aspect, the present invention provides a method of determining the probability of renal graft rejection in patients by determining the expression level of a previously selected gene pool that contains at least the CCDC82, F13A1, TUBB1, TSC22D1, SENP6, ANXA5, EFTUD2, SENP7, AP1M1, CLK1 and C1GALT1C1 genes in a patient sample and comparing the expression level of the genes of the previously selected gene pool in the sample with the expression level of the genes of the genetic set previously selected in control, to determine the probability of renal graft rejection in the patient.
[0030] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método de determinação da probabilidade de rejeição de enxerto renal em pacientes por meio de determinação do nível de expressão de um conjunto genético previamente selecionado que contém pelo menos os genes SPCS3, ZMAT1, ETAA1, ZNF493, CCDC82, NFYB, F13A1, TUBB1, TSC22D1, SENP6, ANXA5, EFTUD2, SENP7, AP1M1, CLK1, MAP1A e C1GALT1C1 em uma amostra do paciente e comparação do nível de expressão dos genes do conjunto genético previamente selecionado na amostra com o nível de expressão dos genes do conjunto genético previamente selecionado em controle, para determinar a probabilidade de rejeição de enxerto renal no paciente.[0030] In another aspect, the present invention provides a method of determining the probability of renal graft rejection in patients by determining the expression level of a previously selected genetic set that contains at least the SPCS3, ZMAT1, ETAA1, ZNF493, CCDC82, NFYB, F13A1, TUBB1, TSC22D1, SENP6, ANXA5, EFTUD2, SENP7, AP1M1, CLK1, MAP1A and C1GALT1C1 in a patient sample and comparing the expression level of genes from the previously selected genetic pool in the sample with the expression level of genes from the previously selected genetic pool in the control, to determine the probability of renal allograft rejection in the patient.
[0031] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método de determinação se pacientes que receberam aloenxerto sofrem rejeição aguda do aloenxerto e avaliação do nível de expressão de um conjunto genético que compreende pelo menos os genes ANXA5, TSC22D1, AP1M1, CLK1, EFTUD2, SENP6 e SENP7 de uma amostra do paciente que recebeu o aloenxerto e comparação do nível de expressão do conjunto genético da amostra com o nível de expressão dos genes do conjunto genético de controle para determinar a probabilidade de rejeição de enxerto renal no paciente.[0031] In another aspect, the present invention provides a method of determining whether patients who have received an allograft experience acute allograft rejection and evaluating the expression level of a gene pool comprising at least the genes ANXA5, TSC22D1, AP1M1, CLK1, EFTUD2, SENP6 and SENP7 of a sample from the patient who received the allograft and comparing the expression level of the gene pool of the sample with the level of expression of the genes of the control gene pool for determine the probability of renal graft rejection in the patient.
[0032] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método de determinação se pacientes que receberam aloenxerto sofrem rejeição aguda do aloenxerto por meio de avaliação do nível de expressão de um conjunto genético que compreende pelo menos os genes TSC22D1, ANKA5, EFTUD2, AP1M1, MAP1A, C1GALT1C1, SENP6, CLK1 e SENP7 de uma amostra do paciente que recebeu o aloenxerto e comparação do nível de expressão do conjunto genético na amostra com o nível de expressão dos genes do conjunto genético em controle para determinar a probabilidade de rejeição de enxerto renal no paciente.[0032] In another aspect, the present invention provides a method of determining whether patients receiving allografts experience acute allograft rejection by assessing the expression level of a gene pool comprising at least the TSC22D1, ANKA5, EFTUD2, AP1M1, MAP1A, C1GALT1C1, SENP6, CLK1 and SENP7 genes from a sample of the patient receiving the allograft and comparing the expression level of the gene pool in the sample with the level of expression of the genes of the genetic set in control to determine the probability of renal graft rejection in the patient.
[0033] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método de determinação se pacientes que receberam aloenxerto sofrem rejeição aguda do aloenxerto por meio de avaliação do nível de expressão de um conjunto genético que compreende pelo menos os genes CCDC82, F13A1, TUBB1, TSC22D1, SENP6, ANXA5, EFTUD2, SENP7, AP1M1, CLK1 e C1GALT1C1 de uma amostra do paciente que recebeu o aloenxerto e comparação do nível de expressão do conjunto genético na amostra com o nível de expressão dos genes do conjunto genético de controle, para determinar a probabilidade de rejeição de enxerto renal no paciente.[0033] In another aspect, the present invention provides a method of determining whether patients who have received allograft experience acute allograft rejection by assessing the expression level of a gene pool comprising at least the genes CCDC82, F13A1, TUBB1, TSC22D1, SENP6, ANXA5, EFTUD2, SENP7, AP1M1, CLK1 and C1GALT1C1 from a sample of the patient who received the aloen graft and comparison of the gene pool expression level in the sample with the gene expression level of the control gene pool, to determine the probability of renal graft rejection in the patient.
[0034] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método de determinação da probabilidade de rejeição de enxerto renal em pacientes por meio de determinação do nível de expressão de um conjunto genético previamente selecionado que contém pelo menos os genes SPCS3, ZMAT1, ETAA1, ZNF493, CCDC82, NFYB, F13A1, TUBB1, TSC22D1, SENP6, ANXA5, EFTUD2, SENP7, AP1M1, CLK1, MAP1A e C1GALT1C1 em uma amostra do paciente e comparação do nível de expressão dos genes do conjunto genético previamente selecionado na amostra com o nível de expressão dos genes do conjunto genético de controle, para determinar a probabilidade de rejeição de enxerto renal no paciente.[0034] In another aspect, the present invention provides a method of determining the probability of renal graft rejection in patients by determining the expression level of a previously selected genetic set that contains at least the SPCS3, ZMAT1, ETAA1, ZNF493, CCDC82, NFYB, F13A1, TUBB1, TSC22D1, SENP6, ANXA5, EFTUD2, SENP7, AP1M1, CLK1, MAP1A and C1GALT1C1 in a patient sample and comparing the expression level of genes from the previously selected genetic pool in the sample with the expression level of genes from the control genetic pool to determine the probability of renal allograft rejection in the patient.
[0035] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método de determinação se pacientes que receberam aloenxertos estão sofrendo rejeição aguda do aloenxerto por meio de avaliação do nível de expressão de um conjunto genético que compreende pelo menos os genes TSC22D1, ANKA5, EFTUD2, AP1M1, C1GALT1C1, SENP6, CLK1 e SENP7 de uma amostra do paciente que recebeu o aloenxerto.[0035] In another aspect, the present invention provides a method of determining whether patients who have received allografts are experiencing acute allograft rejection by assessing the expression level of a gene pool comprising at least the TSC22D1, ANKA5, EFTUD2, AP1M1, C1GALT1C1, SENP6, CLK1 and SENP7 genes from a sample from the patient who has received the allograft.
[0036] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método de determinação se pacientes que receberam aloenxertos estão sofrendo rejeição aguda do aloenxerto por meio de avaliação do nível de expressão de um conjunto genético com onze membros que compreende pelo menos os genes CCDC82, F13A1, TUBB1, TSC22D1, SENP6, ANXA5, EFTUD2, SENP7, AP1M1, CLK1 e C1GALT1C1 de uma amostra do paciente que recebeu o aloenxerto.[0036] In another aspect, the present invention provides a method of determining whether patients who have received allografts are experiencing acute allograft rejection by assessing the expression level of an eleven-member gene pool comprising at least the CCDC82, F13A1, TUBB1, TSC22D1, SENP6, ANXA5, EFTUD2, SENP7, AP1M1, CLK1, and C1GALT1C1 genes from a patient sample that received the allograft.
[0037] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método de determinação se pacientes que receberam aloenxertos estão sofrendo rejeição aguda do aloenxerto por meio de avaliação do nível de expressão de um conjunto genético com 17 membros que compreende pelo menos os genes SPCS3, ZMAT1, ETAA1, ZNF493, CCDC82, NFYB, F13A1, TUBB1, TSC22D1, SENP6, ANXA5, EFTUD2, SENP7, AP1M1, CLK1, MAP1A e C1GALT1C1 de uma amostra do paciente que recebeu o aloenxerto.[0037] In another aspect, the present invention provides a method of determining whether patients who have received allografts are experiencing acute allograft rejection by assessing the expression level of a 17-member gene pool comprising at least the SPCS3, ZMAT1, ETAA1, ZNF493, CCDC82, NFYB, F13A1, TUBB1, TSC22D1, SENP6, ANXA5, EFTUD2, SE genes NP7, AP1M1, CLK1, MAP1A and C1GALT1C1 from a sample of the patient who received the allograft.
[0038] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um kit de determinação se pacientes que receberam aloenxerto estão sofrendo rejeição aguda do aloenxerto que compreende, em um ou mais pares de primers de recipientes para o conjunto genético previamente selecionado, controles positivos e negativos, tampões e instruções de uso.[0038] In another aspect, the present invention provides a kit for determining whether patients who have received allograft are experiencing acute allograft rejection comprising, on one or more pairs of recipient primers for the previously selected genetic pool, positive and negative controls, buffers and instructions for use.
[0039] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um kit de determinação se pacientes que receberam aloenxerto estão sofrendo rejeição aguda do aloenxerto que compreende, em um ou mais pares de primers de recipientes para um conjunto genético com dezessete membros, controles positivos e negativos, tampões e instruções de uso.[0039] In another aspect, the present invention provides a kit for determining whether patients who have received allograft are experiencing acute allograft rejection comprising, on one or more pairs of container primers for a seventeen-member genetic pool, positive and negative controls, buffers, and instructions for use.
[0040] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um kit de determinação se pacientes que receberam aloenxerto estão sofrendo rejeição aguda do aloenxerto que compreende, em um ou mais pares de primers de recipientes para um conjunto genético com onze membros, controles positivos e negativos, tampões e instruções de uso.[0040] In another aspect, the present invention provides a kit for determining whether patients who have received allograft are experiencing acute allograft rejection comprising, on one or more pairs of container primers for an eleven-member genetic pool, positive and negative controls, buffers and instructions for use.
[0041] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um kit de determinação se pacientes que receberam aloenxerto estão sofrendo rejeição aguda do aloenxerto que compreende, em um ou mais pares de primers de recipientes para um conjunto genético com nove membros, controles positivos e negativos, tampões e instruções de uso.[0041] In another aspect, the present invention provides a kit for determining whether patients who have received allograft are experiencing acute allograft rejection comprising, on one or more pairs of container primers for a nine-member genetic pool, positive and negative controls, buffers and instructions for use.
[0042] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um kit de determinação se pacientes que receberam aloenxerto estão sofrendo rejeição aguda do aloenxerto que compreende, em um ou mais pares de primers de recipientes para um conjunto genético com sete membros, controles positivos e negativos, tampões e instruções de uso.[0042] In another aspect, the present invention provides a kit for determining whether patients who have received allograft are experiencing acute allograft rejection comprising, on one or more pairs of recipient primers for a seven-member genetic pool, positive and negative controls, buffers and instructions for use.
[0043] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método de seleção de pacientes com aloenxerto renal para tratamento, a fim de reduzir o risco de rejeição de aloenxerto renal, que compreende: a. fornecimento de amostras de sangue do paciente com aloenxerto renal; b. determinação dos níveis de expressão de um conjunto genético previamente selecionado na amostra; c. comparação dos níveis de expressão dos genes previamente selecionados na amostra com os níveis de expressão dos genes do conjunto genético previamente selecionado em controle; e d. seleção do paciente para tratamento de rejeição de aloenxerto se o nível de expressão de um ou mais genes no conjunto genético da amostra for alterado em comparação com o nível de expressão de um ou mais dos conjuntos genéticos no controle.[0043] In another aspect, the present invention provides a method of selecting renal allograft patients for treatment in order to reduce the risk of renal allograft rejection, comprising: a. providing blood samples from the renal allograft patient; B. determination of the expression levels of a genetic set previously selected in the sample; w. comparison of the expression levels of the genes previously selected in the sample with the expression levels of the genes of the genetic set previously selected in the control; and d. patient selection for treatment of allograft rejection if the expression level of one or more genes in the sample gene pool is changed compared to the expression level of one or more of the gene pools in the control.
[0044] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método de seleção de pacientes com aloenxerto renal para tratamento, a fim de reduzir o risco de rejeição de aloenxerto renal ou perda de aloenxerto, que compreende a comparação do nível de expressão de um conjunto genético previamente selecionado obtido do paciente com o nível de expressão do conjunto genético previamente selecionado em uma amostra de controle obtida de um paciente de aloenxerto que não sofreu rejeição de aloenxerto e seleção do paciente para tratamento de perda ou rejeição de aloenxerto, caso o nível de expressão de um ou mais genes no conjunto genético previamente selecionado do paciente seja alterado em comparação com o nível de expressão de um ou mais dos genes do conjunto genético previamente selecionado no controle.[0044] In another aspect, the present invention provides a method of selecting renal allograft patients for treatment in order to reduce the risk of renal allograft rejection or allograft loss, comprising comparing the expression level of a previously selected genetic set obtained from the patient with the expression level of the previously selected genetic set in a control sample obtained from an allograft patient who has not experienced allograft rejection and selecting the patient for treatment of allograft loss or rejection , if the expression level of one or more genes in the previously selected gene pool of the patient is changed compared to the level of expression of one or more of the genes of the previously selected gene pool in the control.
[0045] Os detalhes de uma ou mais realizações da presente invenção são apresentados nas figuras anexas e na descrição abaixo. Outras características, objetos e vantagens da presente invenção serão evidentes a partir do relatório descritivo, das figuras e das reivindicações.[0045] The details of one or more embodiments of the present invention are presented in the attached figures and in the description below. Other features, objects and advantages of the present invention will become apparent from the descriptive report, the figures and the claims.
[0046] Da forma utilizada no presente, a expressão “cerca de” ou “aproximadamente” normalmente indica em faixa de erro aceitável para o tipo de valor e método de medição. Ela pode indicar, por exemplo, dentro de até 20%, de maior preferência até 10% e, de preferência superior, ainda dentro de 5% de um dado valor ou faixa. Alternativamente, especialmente em sistemas biológicos, a expressão “cerca de” indica dentro de cerca de um logaritmo (ou seja, ordem de magnitude), preferencialmente dentro de um fator de dois de um dado valor.[0046] As used herein, the expression “about” or “approximately” normally indicates an acceptable error range for the type of value and measurement method. It may indicate, for example, within 20%, more preferably within 10%, and more preferably within 5% of a given value or range. Alternatively, especially in biological systems, the expression "about" indicates within about a logarithm (ie order of magnitude), preferably within a factor of two of a given value.
[0047] Da forma utilizada no presente, “ACR” indica rejeição celular aguda.[0047] As used herein, “ACR” indicates acute cellular rejection.
[0048] Segundo a presente invenção, pode-se empregar biologia molecular convencional, microbiologia, DNA recombinante, imunologia, biologia celular e outros métodos relacionados dentro do estado da técnica. Vide, por exemplo, Sambrook et al (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, terceira edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, Nova Iorque; Sambrook et al (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, NY; Ausubel et al, eds. (2005), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., Hoboken N. J.; Bonifacino et al, eds. (2005), Current Protocols in Cell Biology, John Wiley & Sons, Inc., Hoboken, N. J.; Coligan et al, eds. (2005), Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., Hoboken, N. J.; Coico et al, eds. (2005), Current Protocols in Microbiology, John Wiley & Sons, Inc., Hoboken, N. J.; Coligan et al, eds. (2005), Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, Inc., Hoboken, N. J.; Enna et al, eds. (2005), Current Protocols in Pharmacology, John Wiley & Sons, Inc., Hoboken, N. J.; Hames et al, eds. (1999), Protein Expression: A Practical Approach, Oxford University Press: Oxford; Freshney (2000), Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, quarta edição, Wiley-Liss; entre outros. Current Protocols, mencionado acima, é atualizado várias vezes por ano.[0048] According to the present invention, conventional molecular biology, microbiology, recombinant DNA, immunology, cell biology and other related methods within the state of the art can be used. See, for example, Sambrook et al (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, New York; Sambrook et al (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, NY; Ausubel et al, eds. (2005), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., Hoboken N.J.; Bonifacino et al, eds. (2005), Current Protocols in Cell Biology, John Wiley & Sons, Inc., Hoboken, N.J.; Coligan et al, eds. (2005), Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., Hoboken, N.J.; Coico et al, eds. (2005), Current Protocols in Microbiology, John Wiley & Sons, Inc., Hoboken, N.J.; Coligan et al, eds. (2005), Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, Inc., Hoboken, N.J.; Enna et al, eds. (2005), Current Protocols in Pharmacology, John Wiley & Sons, Inc., Hoboken, N.J.; Hames et al, eds. (1999), Protein Expression: A Practical Approach, Oxford University Press: Oxford; Freshney (2000), Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, Fourth Edition, Wiley-Liss; between others. Current Protocols, mentioned above, is updated several times a year.
[0049] Os termos “diminuir”, “diminuído”, “reduzido”, “redução” ou “regulado para baixo” são todos utilizados no presente de forma geral para indicar redução em quantidade estatisticamente significativa. Para evitar dúvida, entretanto, “reduzido”, “redução”, “regulado para baixo”, “diminuído” ou “diminuir” indica redução de pelo menos 10% em comparação com nível de referência, tal como redução de pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90% e até redução de 100%, inclusive (ou seja, nível ausente em comparação com amostra de referência) ou qualquer redução de 10 a 100% em comparação com nível de referência, ou redução de pelo menos cerca de 0,5 vezes, pelo menos cerca de 1,0 vezes, pelo menos cerca de 1,2 vezes, pelo menos cerca de 1,5 vezes, pelo menos cerca de duas vezes, pelo menos cerca de três vezes, pelo menos cerca de quatro vezes, pelo menos cerca de cinco vezes ou pelo menos cerca de dez vezes, ou qualquer redução de 1,0 vez e 10 vezes ou mais em comparação com nível de referência.[0049] The terms "decrease", "decreased", "reduced", "reduced" or "regulated down" are all used herein generally to indicate reduction in statistically significant amount. For the avoidance of doubt, however, "reduced", "reduced", "downregulated", "diminished" or "decrease" indicates reduction of at least about 10% compared to a reference level, such as reduction of at least about 20%, at least about 30%, at least about 40%, at least about 50%, at least about 60%, at least about 70%, at least about 80%, at least about 9 0% and up to and including 100% reduction (i.e., missing level compared to reference sample) or any 10 to 100% reduction compared to reference level, or reduction of at least about 0.5-fold, at least about 1.0-fold, at least about 1.2-fold, at least about 1.5-fold, at least about two-fold, at least about three-fold, at least about four-fold, at least about five-fold, or at least about ten-fold , or any reduction of 1.0 times and 10 times or more compared to the baseline.
[0050] Os termos “aumentado”, “aumento” ou “regulado para cima” são todos utilizados no presente para indicar, de forma geral, aumento em quantidade estatisticamente significativa; para evitar qualquer dúvida, os termos “aumentado” ou “aumento” indicam aumento de pelo menos 10% em comparação com nível de referência, tal como aumento de pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90% ou até aumento de 100%, inclusive, ou qualquer aumento de 10 a 100% em comparação com nível de referência, ou aumento de pelo menos cerca de 0,5 vezes, pelo menos cerca de 1,0 vezes, pelo menos cerca de 1,2 vezes, pelo menos cerca de 1,5 vezes, pelo menos cerca de duas vezes, pelo menos cerca de três vezes, pelo menos cerca de quatro vezes, pelo menos cerca de cinco vezes ou pelo menos cerca de dez vezes, ou qualquer aumento de 1,0 vez a 10 vezes ou mais em comparação com nível de referência.[0050] The terms “increased”, “increased” or “upregulated” are all used herein to generally indicate an increase in a statistically significant amount; for the avoidance of doubt, the terms "increased" or "increased" indicate an increase of at least about 10% compared to a reference level, such as an increase of at least about 20%, at least about 30%, at least about 40%, at least about 50%, at least about 60%, at least about 70%, at least about 80%, at least about 90% or up to and including 100% increase, or any 10 to 100% increase compared to baseline, or at least about 0.5 times, at least about 1.0 times, at least about 1.2 times, at least about 1.5 times, at least about twice, at least about three times, at least about four times, at least about five times, or at least about ten times, or any increase from 1.0 to 10 times or more compared to baseline.
[0051] Da forma utilizada no presente, “determinação do nível de expressão” ou ”detecção do nível de expressão”, tal como, por exemplo, em “determinação do nível de expressão de um gene”, designa a quantificação da quantidade de mRNA presente em uma amostra. A detecção da expressão dos mRNAs específicos pode ser atingida utilizando qualquer método conhecido na técnica ou descrito no presente. Tipicamente, métodos de detecção de mRNA envolvem a detecção específica de sequências, tal como por meio de PCR RT. Sondas e primers específicos de mRNA podem ser projetados utilizando sequências de ácidos nucleicos que são conhecidas na técnica.[0051] As used herein, “determining the expression level” or “detecting the expression level”, as, for example, in “determining the expression level of a gene”, means quantifying the amount of mRNA present in a sample. Detection of expression of specific mRNAs can be achieved using any method known in the art or described herein. Typically, mRNA detection methods involve sequence-specific detection, such as by RT PCR. Specific mRNA probes and primers can be designed using nucleic acid sequences that are known in the art.
[0052] Ao longo de todo o pedido e nas reivindicações anexas, dever-se-á compreender e pretende-se compreender que o uso das expressões “fármaco”, “medicação”, “agente” e “agente terapêutico” são expressões intercambiáveis que definem entidades idênticas ou similares. “Fármaco” designa geralmente um composto químico, molécula pequena ou outra composição biológica, tal como um composto sem sentido, anticorpo, inibidor da protease, hormônio, quemoquina ou citoquina, capaz de induzir efeito terapêutico ou profilático quando administrado adequadamente ao paciente.[0052] Throughout the application and in the attached claims, it should be understood and intended to be understood that the use of the expressions "drug", "medication", "agent" and "therapeutic agent" are interchangeable expressions that define identical or similar entities. "Drug" generally designates a chemical compound, small molecule or other biological composition, such as a nonsense compound, antibody, protease inhibitor, hormone, chemokine or cytokine, capable of inducing a therapeutic or prophylactic effect when properly administered to the patient.
[0053] Da forma utilizada no presente, "tratar" ou "tratamento" de estado, distúrbio ou condição inclui: (1) evitar ou retardar o surgimento de sintomas clínicos ou subclínicos do estado, distúrbio ou condição em desenvolvimento em um mamífero que pode sofrer ou apresentar pré-disposição para o estado, distúrbio ou condição, mas ainda não experimenta nem exibe sintomas clínicos ou subclínicos do estado, distúrbio ou condição (por exemplo, fibrose de aloenxerto renal e/ou perda de aloenxerto); e/ou (2) inibição do estado, distúrbio ou condição, ou seja, suspensão, redução ou retardamento do desenvolvimento da doença ou sua reincidência (no caso de tratamento de manutenção) ou pelo menos um de seus sintomas clínicos ou subclínicos; e/ou (3) alívio da doença, ou seja, causando regressão do estado, distúrbio ou condição ou pelo menos um dos seus sintomas clínicos ou subclínicos; e/ou (4) promoção de redução da severidade de um ou mais sintomas da doença. O benefício a um paciente a ser tratado é estatisticamente significativo ou ao menos perceptível para o paciente ou para o médico.[0053] As used herein, "treating" or "treatment" of a state, disorder or condition includes: (1) preventing or delaying the onset of clinical or subclinical symptoms of the developing state, disorder or condition in a mammal that may be suffering from or predisposed to the state, disorder or condition, but is not yet experiencing or exhibiting clinical or subclinical symptoms of the state, disorder or condition (e.g., renal allograft fibrosis and/or allograft loss); and/or (2) inhibition of the state, disorder or condition, ie, arrest, reduction or delay of the development of the disease or its recurrence (in the case of maintenance treatment) or at least one of its clinical or subclinical symptoms; and/or (3) alleviating the disease, ie, causing regression of the state, disorder or condition or at least one of its clinical or subclinical symptoms; and/or (4) promoting a reduction in the severity of one or more disease symptoms. The benefit to a patient being treated is statistically significant or at least perceptible to the patient or physician.
[0054] Da forma utilizada no presente, o termo “inibição” de doença ou condição (por exemplo, ACR e/ou perda de aloenxerto) indica, por exemplo, suspensão do desenvolvimento de um ou mais sintomas de doenças em pacientes antes que eles ocorram ou sejam detectáveis, por exemplo, pelo paciente ou pelo médico do paciente. Preferencialmente, a doença ou condição não se desenvolve, ou seja, nenhum sintoma da doença é detectável. Ele pode também resultar, entretanto, em retardamento ou redução da velocidade do desenvolvimento de um ou mais sintomas da doença.[0054] As used herein, the term "inhibition" of disease or condition (e.g., ACR and/or allograft loss) indicates, for example, arresting the development of one or more disease symptoms in patients before they occur or are detectable, for example, by the patient or the patient's physician. Preferably, the disease or condition does not develop, that is, no symptoms of the disease are detectable. It may also result, however, in delaying or slowing the development of one or more symptoms of the disease.
[0055] Da forma utilizada no presente, nível “alterado” de expressão de mRNA em comparação com o nível de referência ou nível de controle é nível alterado em pelo menos 0,5 vezes (por exemplo, pelo menos: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 200, 500, 1000, 2000, 5000 ou 10.000 vezes) da expressão do mRNA. Compreende-se que a alteração possa ser aumento ou redução. Alternativamente, nível de expressão alterado é definido como aumento da avaliação das probabilidades de rejeição aguda utilizando parâmetros no modelo de regressão logística estabelecido de um grupo de pacientes em treinamento, comparando-se a avaliação de probabilidade com o corte derivado do conjunto de treinamento.[0055] As used herein, the “altered” level of mRNA expression compared to the reference level or control level is the level changed by at least 0.5 times (e.g., at least: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 200, 500, 1000, 2000, 5000 or 10,000 times) of mRNA expression. It is understood that the alteration can be an increase or a reduction. Alternatively, altered expression level is defined as increased assessment of the probabilities of acute rejection using parameters in the established logistic regression model of a group of patients in training, comparing the assessment of probability with the cutoff derived from the training set.
[0056] “Controle” é definido como amostra obtida de paciente que recebeu um transplante de aloenxerto que não sofre de rejeição celular aguda.[0056] “Control” is defined as a sample obtained from a patient who has received an allograft transplant that does not suffer from acute cellular rejection.
[0057] Determinou-se agora que o aumento da transcrição de um conjunto previamente selecionado de genes pode ser utilizado para prever a probabilidade de que um paciente de aloenxerto renal rejeitará rim transplantado antes que o paciente manifeste qualquer sintoma claro. O teste pode também ser empregado para diagnosticar se um paciente com transplante de rim experimenta rejeição aguda. A sobre-expressão dos conjuntos genéticos pode ser utilizada para identificar pacientes em risco de rejeição aguda.[0057] It has now been determined that increased transcription of a preselected set of genes can be used to predict the likelihood that a renal allograft patient will reject a transplanted kidney before the patient manifests any clear symptoms. The test can also be used to diagnose whether a kidney transplant patient experiences acute rejection. Overexpression of gene pools can be used to identify patients at risk of acute rejection.
[0058] Caso o paciente expresse os genes previamente selecionados em nível alterado com relação ao controle, o paciente encontra-se em risco de rejeição. Quanto maior a alteração do nível de expressão dos genes previamente selecionados em comparação com o controle, maior o risco de rejeição. A informação obtida com o teste pode também ser aplicada a um modelo de enquadramento de regressão logística penalizado (log (p(x))/(1-p(x))= β*0+β*1g1+ β*igi+ + β*9g9 (em que p(x) é a probabilidade de ACR, β*i é a coeficiência penalizada e gi é a contagem de leitura do gene i) que pode ser utilizado para computar avaliação de probabilidade de rejeição aguda para cada paciente. Em uma realização, avaliação mais alta acima indica que o paciente encontra-se em alto risco de rejeição do órgão transplantado.[0058] If the patient expresses the previously selected genes at an altered level in relation to the control, the patient is at risk of rejection. The greater the change in expression level of the previously selected genes compared to the control, the greater the risk of rejection. The information obtained from the test can also be applied to a penalized logistic regression framing model (log(p(x))/(1-p(x))= β*0+β*1g1+ β*igi+ + β*9g9 (where p(x) is the probability of ACR, β*i is the penalized coefficient and gi is the read count of gene i) that can be used to compute assessment of probability of acute rejection for each patient. In one embodiment, highest assessment above indicates that the patient is at high risk of rejection of the transplanted organ.
[0059] Atualmente, o diagnóstico de rejeição aguda exige biópsia de aloenxerto renal acionada por elevação da creatinina na presença de lesão renal. A coleta e o teste de amostras de biópsias de pacientes são caros e demorados. O método de teste do presente é um teste de tecido biológico, preferencialmente um teste com base em sangue que elimina a necessidade de amostras de biópsia. O teste pode ser utilizado para prever a probabilidade de que um paciente com aloenxerto renal rejeitará rim transplantado antes que o paciente manifeste qualquer sintoma claro. O teste pode também ser empregado para diagnosticar se um paciente com transplante de rim está sofrendo rejeição aguda. O teste é barato, altamente preciso, reproduzível e não invasivo.[0059] Currently, the diagnosis of acute rejection requires renal allograft biopsy triggered by elevated creatinine in the presence of renal injury. Collecting and testing patient biopsy specimens is expensive and time-consuming. The present test method is a biological tissue test, preferably a blood based test which eliminates the need for biopsy samples. The test can be used to predict the likelihood that a patient with a renal allograft will reject a transplanted kidney before the patient manifests any clear symptoms. The test can also be used to diagnose whether a kidney transplant patient is experiencing acute rejection. The test is inexpensive, highly accurate, reproducible, and non-invasive.
[0060] Foram identificadas assinaturas do sangue periférico utilizando conjuntos de assinaturas genéticas que compreendem pelo menos sete e até 17 genes previamente selecionados. Esses conjuntos genéticos previamente selecionados podem ser utilizados para diagnosticar com precisão a rejeição subclínica de aloenxertos renais e identificar aloenxertos renais em risco de declínio funcional e histológico subsequente, bem como o risco de rejeição de aloenxerto.[0060] Peripheral blood signatures were identified using sets of genetic signatures comprising at least seven and up to 17 previously selected genes. These preselected genetic pools can be used to accurately diagnose subclinical renal allograft rejection and identify renal allografts at risk of subsequent functional and histological decline, as well as the risk of allograft rejection.
[0061] Os conjuntos de assinatura genética úteis na prática dos métodos descritos no presente são selecionados a partir dos genes a seguir: SPCS3, ZMAT1, ETAA1, ZNF493, CCDC82, NFYB, F13A1, TUBB1, TSC22D1, SENP6, ANXA5, EFTUD2, SENP7, AP1M1, CLK1, MAP1A e C1GALT1C1.[0061] The genetic signature sets useful in practicing the methods described herein are selected from the following genes: SPCS3, ZMAT1, ETAA1, ZNF493, CCDC82, NFYB, F13A1, TUBB1, TSC22D1, SENP6, ANXA5, EFTUD2, SENP7, AP1M1, CLK1, MAP1A and C1GALT1C1.
[0062] O conjunto de assinatura periférica de sete genes de acordo com a presente invenção é: ANXA5, TSC22D1, AP1M1, CLK1, EFTUD2, SENP6 e SENP7.[0062] The peripheral signature set of seven genes according to the present invention is: ANXA5, TSC22D1, AP1M1, CLK1, EFTUD2, SENP6 and SENP7.
[0063] A assinatura do sangue periférico com nove genes de acordo com a presente invenção é: TSC22D1, ANKA5, EFTUD2, AP1M1, MAP1A, C1GALT1C1, SENP6, CLK1 e SENP7.[0063] The peripheral blood signature with nine genes according to the present invention is: TSC22D1, ANKA5, EFTUD2, AP1M1, MAP1A, C1GALT1C1, SENP6, CLK1 and SENP7.
[0064] A assinatura do sangue periférico com onze genes de acordo com a presente invenção é: CCDC82, F13A1, TUBB1, TSC22D1, SENP6, ANXA5, EFTUD2, SENP7, AP1M1, CLK1 e C1GALT1C1.[0064] The peripheral blood signature with eleven genes according to the present invention is: CCDC82, F13A1, TUBB1, TSC22D1, SENP6, ANXA5, EFTUD2, SENP7, AP1M1, CLK1 and C1GALT1C1.
[0065] A assinatura do sangue periférico com 17 genes de acordo com a presente invenção é: SPCS3, ZMAT1, ETAA1, ZNF493, CCDC82, NFYB, F13A1, TUBB1, TSC22D1, SENP6, ANXA5, EFTUD2, SENP7, AP1M1, CLK1, MAP1A e C1GALT1C1.[0065] The peripheral blood signature with 17 genes according to the present invention is: SPCS3, ZMAT1, ETAA1, ZNF493, CCDC82, NFYB, F13A1, TUBB1, TSC22D1, SENP6, ANXA5, EFTUD2, SENP7, AP1M1, CLK1, MAP1A and C1GALT1C1.
[0066] Cada um desses conjuntos de assinatura genética pode ser utilizado na prática da presente invenção. O conjunto de assinatura do sangue com onze genes é, entretanto, uma realização preferida.[0066] Each of these genetic signature sets can be used in the practice of the present invention. The blood signature set of eleven genes is, however, a preferred embodiment.
[0067] A presente invenção fornece um método de identificação de pacientes com aloenxerto renal que sofrem de rejeição aguda clínica e subclínica e em risco de perda de enxerto, que compreende as etapas de fornecimento de amostra sanguínea de um paciente com aloenxerto renal, isolamento de mRNA da amostra sanguínea, síntese de cDNA a partir do mRNA e medição dos níveis de expressão de um quadro genético que compreende um conjunto de assinatura genética selecionado com o sistema de sequências MiSEQ (Illumina, Inc., San Diego, Califórnia), Nanostring (Conjunto de Expressão de miRNA nCounter® - Nanostring Technologies, Inc., Seattle, Washington) ou qPCR. Os resultados da análise de conjunto genético são comparados com um controle. O resultado de expressão genética pode ser utilizado para prever o início de reação de rejeição de aloenxertos, diagnosticar reação de rejeição de aloenxertos e/ou caracterizar reação de rejeição de aloenxertos em paciente com transplante. Caso o paciente expresse o conjunto de assinatura genética em nível alterado com relação ao nível de expressão dos genes do conjunto de assinatura genética, o paciente encontra-se em risco de rejeição. Quanto mais alterado for o nível de expressão do paciente em comparação com o controle, maior o risco de rejeição.[0067] The present invention provides a method of identifying renal allograft patients suffering from acute clinical and subclinical rejection and at risk of graft loss, comprising the steps of providing a blood sample from a renal allograft patient, isolating mRNA from the blood sample, synthesizing cDNA from the mRNA, and measuring the expression levels of a genetic framework comprising a genetic signature set selected with the MiSEQ sequence system (Illumina, Inc., San Diego, California), Nanostring (nCounter® miRNA Expression Kit - Nanostring Technologies, Inc., Seattle, Washington) or qPCR. Gene pool analysis results are compared to a control. The gene expression result can be used to predict the onset of an allograft rejection reaction, diagnose an allograft rejection reaction and/or characterize an allograft rejection reaction in a transplant patient. If the patient expresses the genetic signature set at an altered level with respect to the level of expression of the genes in the genetic signature set, the patient is at risk of rejection. The more altered the patient's expression level compared to the control, the greater the risk of rejection.
[0068] Em um aspecto, é fornecido um método de tratamento de pacientes com aloenxerto renal por meio da obtenção de uma amostra biológica do paciente com aloenxerto renal, medição do nível de expressão de um conjunto de assinatura genética previamente selecionado na amostra, comparação do nível de expressão do conjunto de assinatura genética previamente selecionado na amostra com o nível de expressão dos genes da assinatura genética em uma amostra de controle e determinação de que o paciente com aloenxerto encontra-se em maior risco de rejeição mediada por células T do aloenxerto se o nível de expressão do conjunto de assinatura genética na amostra for alterado com relação ao nível de expressão do conjunto de assinatura genética do controle.[0068] In one aspect, a method of treating renal allograft patients is provided by obtaining a biological sample from the renal allograft patient, measuring the expression level of a previously selected genetic signature set in the sample, comparing the expression level of the previously selected genetic signature set in the sample with the expression level of the genetic signature genes in a control sample, and determining that the allograft patient is at increased risk of T cell-mediated rejection of the allograft if the level expression level of the genetic signature set in the sample is changed relative to the level of expression of the genetic signature set in the control.
[0069] Em outra realização, é fornecido um método de tratamento de pacientes com aloenxerto renal por meio da obtenção de uma amostra biológica do paciente com aloenxerto, medição do nível de expressão de um gene selecionado definido na amostra, comparação do nível de expressão do conjunto genético na amostra com o nível de expressão de um paciente controle, determinação de que o paciente encontra-se em risco de rejeição do aloenxerto se o nível de expressão do conjunto genético na amostra for alterado com relação ao nível de expressão do conjunto genético no controle e tratamento do paciente determinado como estando em risco de rejeição para evitar a rejeição.[0069] In another embodiment, a method of treating patients with renal allograft is provided by obtaining a biological sample from the patient with the allograft, measuring the expression level of a selected gene set in the sample, comparing the expression level of the gene pool in the sample with the expression level of a control patient, determining that the patient is at risk of allograft rejection if the expression level of the gene pool in the sample is changed with respect to the expression level of the gene pool in the control, and treating the patient determined as being at risk of rejection to avoid rejection.
[0070] Outra realização fornece um método de tratamento de pacientes com aloenxerto renal por meio da obtenção de uma amostra biológica do paciente com aloenxerto, medição do nível de expressão de um gene previamente selecionado definido na amostra, comparação do nível de expressão do conjunto genético na amostra com o nível de expressão de controle, determinação de que o paciente encontra-se em risco de rejeição se o nível de expressão do conjunto genético na amostra for alterado com relação ao nível de expressão do conjunto genético no controle e tratamento do paciente determinado como estando em risco de rejeição por meio da administração de fármacos imunossupressores ao paciente ou da administração de alta dose de esteroides ou agentes antilinfócitos.[0070] Another embodiment provides a method of treating renal allograft patients by obtaining a biological sample from the allograft patient, measuring the expression level of a previously selected gene set defined in the sample, comparing the expression level of the gene pool in the sample with the control expression level, determining that the patient is at risk of rejection if the expression level of the gene pool in the sample is changed with respect to the expression level of the gene pool in the control, and treating the patient determined to be at risk of rejection by administering immunosuppressive drugs to the patient or the administration of high doses of steroids or anti-lymphocyte agents.
[0071] Em ainda outra realização, é fornecido um kit de teste para identificação de pacientes com aloenxerto renal que sofrem de rejeição aguda clínica e subclínica e em risco de perda de aloenxerto, que compreende, em um ou mais recipientes separados: um teste para determinar um conjunto de assinatura genética que compreende pelo menos os genes ANXA5, TSC22D1, AP1M1, CLK1, EFTUD2, SENP6 e SENP7, tampões, controles positivos e negativos e instruções de uso.[0071] In yet another accomplishment, a test kit for identification of patients with renal alongure suffering from clinical and subclinical acute rejection and at risk of alien loss, which comprises, in one or more separate containers: a test to determine a genetic signature set that comprises at least the ANXA5, TSC22D1, AP1M1, CLK1, EFTUD2 genes, Senp 6 and SENP7, buffering, positive and negative controls and instructions for use.
[0072] Em ainda outra realização, é fornecido um kit de teste para identificação de pacientes com aloenxerto renal que sofrem de rejeição aguda clínica e subclínica e em risco de perda de aloenxerto, que compreende, em um ou mais recipientes separados: um teste para determinar um conjunto de assinatura genética que compreende pelo menos os genes TSC22D1, ANKA5, EFTUD2, AP1M1, MAP1A, C1GALT1C1, SENP6, CLK1 e SENP7, tampões, controles positivos e negativos e instruções de uso.[0072] In yet another embodiment, there is provided a test kit for identifying renal allograft patients suffering from clinical and subclinical acute rejection and at risk of allograft loss, comprising, in one or more separate containers: a test for determining a genetic signature set comprising at least the genes TSC22D1, ANKA5, EFTUD2, AP1M1, MAP1A, C1GALT1C1, SENP6, CLK1 and SENP7, buffers, positive and negative controls, and instructions for use.
[0073] Ainda outro aspecto é um kit de teste para identificação de pacientes com aloenxerto renal que sofrem de rejeição aguda clínica e subclínica em risco de perda de aloenxerto, que compreende, em um ou mais recipientes separados: um teste para determinar um conjunto de assinatura genética que compreende pelo menos os genes CCDC82, F13A1, TUBB1, TSC22D1, ANXA5, EFTUD2, SENP7, AP1M1, CLK1 e C1GALT1C1, tampões, controles positivos e negativos e instruções de uso.[0073] Yet another aspect is a test kit for identifying renal allograft patients suffering from acute clinical and subclinical rejection at risk of allograft loss, comprising, in one or more separate containers: a test to determine a genetic signature set comprising at least the genes CCDC82, F13A1, TUBB1, TSC22D1, ANXA5, EFTUD2, SENP7, AP1M1, CLK1 and C1GALT 1C1, buffers, positive and negative controls, and instructions for use.
[0074] Ainda outro aspecto é um kit de teste para identificação de pacientes com aloenxerto renal que sofrem de rejeição aguda clínica e subclínica em risco de perda de aloenxerto, que compreende, em um ou mais recipientes separados: um teste para determinar um conjunto de assinatura genética que compreende pelo menos os genes SPCS3, ZMAT1, ETAA1, ZNF493, CCDC82, NFYB, F13A1, TUBB1, TSC22D1, SENP6, ANXA5, EFTUD2, SENP7, AP1M1, CLK1, MAP1A e C1GALT1C1, tampões, controles positivos e negativos e instruções de uso.[0074] Yet another aspect is a test kit for identifying renal allograft patients suffering from acute clinical and subclinical rejection at risk of allograft loss, comprising, in one or more separate containers: a test to determine a genetic signature set comprising at least the SPCS3, ZMAT1, ETAA1, ZNF493, CCDC82, NFYB, F13A1, TUBB1, TSC22D1, SENP6 genes , ANXA5, EFTUD2, SENP7, AP1M1, CLK1, MAP1A and C1GALT1C1, buffers, positive and negative controls and instructions for use.
[0075] Em uma realização adicional, a presente invenção fornece um método de identificação de pacientes com aloenxerto renal que sofrem de rejeição aguda clínica e subclínica e em risco de perda de enxerto, que compreende as etapas de fornecimento de amostra sanguínea de um paciente com aloenxerto renal, isolamento de mRNA da amostra de sangue, síntese de cDNA a partir do mRNA e medição dos níveis de expressão de um quadro genético que compreende um conjunto de assinatura com nove genes selecionado com o sistema de sequências MiSEQ (Illumina, Inc., San Diego, Califórnia), Nanostring (Conjunto de Expressão de miRNA nCounter® - Nanostring Technologies, Inc., Seattle, Washington) ou qPCR. Os resultados da análise de conjunto genético são comparados com o nível de expressão dos genes do conjunto de assinatura em um controle. O resultado de expressão genética pode ser utilizado para prever o início de reação de rejeição de aloenxertos, diagnosticar reação de rejeição de aloenxertos e/ou caracterizar reação de rejeição de aloenxertos em paciente com transplante. Caso o paciente expresse o conjunto de assinatura genética em nível alterado com relação ao controle, o paciente encontra-se em risco de rejeição do íon dos genes do conjunto de assinatura. Quanto maior a alteração (aumento e/ou redução) do nível de expressão dos genes da assinatura genética do paciente em comparação com o controle, maior o risco de rejeição.[0075] In a further embodiment, the present invention provides a method of identifying renal allograft patients suffering from clinical and subclinical acute rejection and at risk of graft loss, comprising the steps of providing a blood sample from a renal allograft patient, isolating mRNA from the blood sample, synthesizing cDNA from the mRNA, and measuring the expression levels of a genetic framework comprising a signature set of nine genes selected with the MiSEQ sequence system (Illumina, Inc., San Diego, California), Nanostring (nCounter® miRNA Expression Kit - Nanostring Technologies, Inc., Seattle, Washington) or qPCR. The results of the gene pool analysis are compared to the expression level of the signature pool genes in a control. The gene expression result can be used to predict the onset of an allograft rejection reaction, diagnose an allograft rejection reaction and/or characterize an allograft rejection reaction in a transplant patient. If the patient expresses the genetic signature set at an altered level relative to the control, the patient is at risk of rejecting the ion of the signature set genes. The greater the change (increase and/or decrease) in the level of expression of the patient's genetic signature genes compared to the control, the greater the risk of rejection.
[0076] Em outra realização, os resultados do teste são aplicados a um modelo de enquadramento de regressão logística penalizado (log (p(x))/(1- p(x))= β*0+β*1g1+ β*igi+ + β*ngn (em que p(x) é a probabilidade de ACR, β*i é a coeficiência penalizada e gi é a contagem de leitura do gene i) que pode ser utilizado para computar avaliação de probabilidade de rejeição aguda para cada paciente. Caso a avaliação de probabilidade do paciente seja mais alta que a avaliação de probabilidade do controle, o paciente encontra-se em risco de rejeição celular aguda.[0076] In another embodiment, test results are applied to a penalized logistic regression framing model (log(p(x))/(1- p(x))= β*0+β*1g1+ β*igi+ + β*ngn (where p(x) is the probability of ACR, β*i is the penalized coefficient, and gi is the read count of gene i) that can be used to compute the probability of acute rejection assessment for each patient. If the patient's probability assessment is higher than the control's probability assessment, the patient is at risk for acute cellular rejection.
[0077] Em outra realização, a presente invenção fornece um método de determinação se pacientes que receberam aloenxertos estão sofrendo rejeição aguda do aloenxerto por meio de avaliação do nível de expressão de um conjunto genético com 17 membros que compreende pelo menos os genes SPCS3, ZMAT1, ETAA1, ZNF493, CCDC82, NFYB, F13A1, TUBB1, TSC22D1, SENP6, ANXA5, EFTUD2, SENP7, AP1M1, CLK1, MAP1A e C1GALT1C1 de uma amostra do paciente que recebeu o aloenxerto.[0077] In another embodiment, the present invention provides a method of determining whether patients who have received allografts are experiencing acute allograft rejection by assessing the expression level of a 17-member gene pool comprising at least the SPCS3, ZMAT1, ETAA1, ZNF493, CCDC82, NFYB, F13A1, TUBB1, TSC22D1, SENP6, ANXA5, EFTUD2, SE genes NP7, AP1M1, CLK1, MAP1A and C1GALT1C1 from a sample of the patient who received the allograft.
[0078] Em alguns métodos do presente, é desejável detectar e quantificar mRNAs presentes em amostras. A detecção e a quantificação da expressão de RNA podem ser atingidas por qualquer um dentre uma série de métodos bem conhecidos na técnica. Utilizando as sequências conhecidas para membros da família de RNA, primers e sondas específicas podem ser projetados para uso nos métodos de detecção descritos abaixo como apropriados.[0078] In some present methods, it is desirable to detect and quantify mRNAs present in samples. Detection and quantification of RNA expression can be accomplished by any of a number of methods well known in the art. Using known sequences for members of the RNA family, specific primers and probes can be designed for use in the detection methods described below as appropriate.
[0079] Em alguns casos, a detecção e a quantificação da expressão de RNA exigem o isolamento de ácido nucleico de amostras, tais como amostras de células ou tecidos. Ácidos nucleicos, incluindo RNA e, especificamente, mRNA podem ser isolados utilizando qualquer método apropriado conhecido na técnica. A extração com base em fenol, por exemplo, é um método comum de isolamento de RNA. Reagentes com base em fenol contêm uma combinação de desnaturantes e inibidores de RNase para rompimento de células e tecidos e subsequente separação de RNA de contaminantes. Procedimentos de isolamento com base em fenol podem recuperar espécies de RNA na faixa de 10 a 200 nucleotídeos (por exemplo, miRNAs maduros e precursores, RNA ribossômico (rRNA) 5S e 5.8S e RNA nuclear pequeno (snRNA) U1). Além disso, procedimentos de extração tais como os que utilizam TRIZOL® ou TRI REAGENT® purificarão todos os RNAs, grandes e pequenos, e são métodos eficientes de isolamento de RNA total de amostras biológicas que contêm miRNAs e RNAs interferentes pequenos (siRNAs). Procedimentos de extração como os que utilizam kit QIAGEN-ALLprep também são contemplados.[0079] In some cases, detection and quantification of RNA expression requires isolation of nucleic acid from samples, such as cell or tissue samples. Nucleic acids, including RNA, and specifically mRNA, can be isolated using any suitable method known in the art. Phenol-based extraction, for example, is a common method of RNA isolation. Phenol-based reagents contain a combination of denaturants and RNase inhibitors for cell and tissue disruption and subsequent separation of RNA from contaminants. Phenol-based isolation procedures can recover RNA species in the 10 to 200 nucleotide range (eg, mature and precursor miRNAs, 5S and 5.8S ribosomal RNA (rRNA), and small nuclear RNA (snRNA) U1). In addition, extraction procedures such as those using TRIZOL® or TRI REAGENT® will purify all RNAs, large and small, and are efficient methods of isolating total RNA from biological samples that contain miRNAs and small interfering RNAs (siRNAs). Extraction procedures such as those using the QIAGEN-ALLprep kit are also contemplated.
[0080] Em algumas realizações, é desejável o uso de PCR RT quantitativa. PCR RT quantitativa (PCR qRT) é uma modificação de reação em cadeia de polimerase utilizada para medir rapidamente a quantidade de produtos de reação em cadeia de polimerase. PCR qRT é comumente utilizada para o propósito de determinar se uma sequência genética está presente em uma amostra e, se estiver presente, o número de cópias na amostra. Qualquer método de PCR que possa determinar a expressão de moléculas de ácido nucleico, incluindo mRNA, encontra-se dentro do escopo da presente invenção. Existem diversas variações do método de PCR qRT conhecido na técnica, três das quais são descritas abaixo.[0080] In some embodiments, it is desirable to use quantitative RT-PCR. Quantitative RT PCR (qRT PCR) is a polymerase chain reaction modification used to rapidly measure the amount of polymerase chain reaction products. qRT PCR is commonly used for the purpose of determining whether a genetic sequence is present in a sample and, if present, the number of copies in the sample. Any PCR method that can determine the expression of nucleic acid molecules, including mRNA, is within the scope of the present invention. There are several variations of the qRT PCR method known in the art, three of which are described below.
[0081] Em outra realização, a presente invenção fornece um kit de determinação se pacientes que receberam aloenxerto estão sofrendo rejeição aguda do aloenxerto que compreende, em um ou mais pares de primers de recipientes para o conjunto genético com 17 membros, controles positivos e negativos, tampões e instruções de uso.[0081] In another embodiment, the present invention provides a kit for determining whether patients who have received allograft are experiencing acute allograft rejection comprising, on one or more pairs of recipient primers for the 17-member gene pool, positive and negative controls, buffers, and instructions for use.
[0082] Em uma realização típica, laboratórios clínicos obterão o valor de expressão utilizando a amostra do paciente e o enviarão para o médico do paciente. O médico comunicará em seguida esse valor para o seu provedor de serviços com base na Web. O provedor de serviços introduzirá aquele valor no sistema de bioinformática que já possui o coeficiente penalizado de cada gene do conjunto genético previamente selecionado e o corte do modelo de regressão logística do conjunto de treinamento. O sistema de bioinformática utilizará essa informação para calcular a avaliação de probabilidade para o paciente. A avaliação calculada refletirá a situação de ACR do paciente.[0082] In a typical realization, clinical laboratories will obtain the expression value using the patient's sample and send it to the patient's physician. The clinician will then communicate this value to their web-based service provider. The service provider will introduce that value into the bioinformatics system, which already has the penalized coefficient of each gene of the genetic set previously selected and the cut of the logistic regression model of the training set. The bioinformatics system will use this information to calculate the probability assessment for the patient. The calculated rating will reflect the patient's ACR status.
[0083] O procedimento geral de aplicação da assinatura genética em diagnóstico de ACR é descrito abaixo utilizando a assinatura com nove genes como exemplo não limitador.[0083] The general procedure for applying the genetic signature in diagnosing ACR is described below using the nine-gene signature as a non-limiting example.
[0084] 1. Seleção do grupo de treinamento: será cuidadosamente selecionado um grupo de pacientes com transplante renal com casos de ACR equilibrado e sem ACR (controle) (número total N~100). O grupo de treinamento terá demografia e indicações clínicas bem caracterizadas que tenham sido analisadas por pelo menos dois patologistas.[0084] 1. Training group selection: A group of kidney transplant patients with cases of balanced ACR and no ACR (control) will be carefully selected (total number N~100). The training group will have well-characterized demographics and clinical indications that have been reviewed by at least two pathologists.
[0085] 2. Expressão da medição de nove genes: os níveis de expressão de nove genes da amostra de sangue após o transplante de cada paciente do grupo de treinamento podem ser medidos utilizando qualquer método, preferencialmente por meio de tecnologia MiSEQ, PCR RT ou Nanostring. O uso desses métodos é descrito nos Exemplos 1 a 3 abaixo.[0085] 2. Expression of nine genes measurement: The expression levels of nine genes from the blood sample after transplantation from each patient in the training group can be measured using any method, preferably by means of MiSEQ technology, RT PCR or Nanostring. The use of these methods is described in Examples 1 to 3 below.
[0086] 3. Estabelecimento de modelo de regressão e corte: Um modelo de enquadramento de regressão logística penalizado utilizando o pacote logistf R (pacote estatístico disponível por meio da r-project.org) será aplicado em seguida sobre valores de expressão dos nove genes para derivar o modelo estatístico do qual será derivado o valor β* para cada gene e a avaliação de probabilidade de rejeição aguda para cada paciente será calculada a partir da equação a seguir: (log (p(x))/(1-p(x))= β*0+β*1g1+ β*igi+ + β*9g9 (em que (p(x) é a probabilidade de ACR, β*i é o coeficiente penalizado e gi é a contagem de leitura do gene i).[0086] 3. Establishment of regression model and cutoff: A penalized logistic regression framing model using the logistf R package (statistical package available through r-project.org) will then be applied to the expression values of the nine genes to derive the statistical model from which the β* value for each gene will be derived and the assessment of the probability of acute rejection for each patient will be calculated from the following equation: (log (p(x))/(1-p(x))= β*0+β*1g1+ β*igi+ + β*9g9 (where (p(x) is the probability of ACR, β*i is the penalized coefficient, and gi is the read count of gene i).
[0087] Com base na avaliação de probabilidade, a estatística de previsão tal como AUC de previsão (área sob a curva) da curva ROC (característica de operação de recebimento) da velocidade positiva verdadeira em comparação com o falso positivo, sensibilidade/especificidade, serão determinados os valores positivos (PPV) e os valores de previsão negativos (NPV). Em dada especificidade (90%), será estabelecido o corte da avaliação de probabilidade que melhor detecta a presença de rejeição aguda. Espera-se que haja divisão clara em dois grupos, em que, se um paciente estiver no grupo superior, eles possuem alta probabilidade de ter rejeição aguda e o teste é determinado como positivo, mas, se estiverem no fundo, eles possuem muito pouca probabilidade de ter rejeição aguda e o teste é determinado como sendo negativo.[0087] Based on the probability assessment, the prediction statistics such as the prediction AUC (area under the curve) of the ROC curve (receiving operation characteristic) of the true positive velocity compared to the false positive, sensitivity/specificity, positive values (PPV) and negative prediction values (NPV) will be determined. In a given specificity (90%), the cutoff of the probability assessment that best detects the presence of acute rejection will be established. There is expected to be a clear division into two groups, where if a patient is in the top group they have a high probability of having acute rejection and the test is determined to be positive, but if they are at the bottom they are very unlikely to have acute rejection and the test is determined to be negative.
[0088] A alternativa é que os pacientes serão divididos em terços com base na sua avaliação de probabilidades determinada conforme acima. Neste caso, se o paciente estiver (1) no terço superior, eles possuem alta probabilidade de ter rejeição aguda e o teste é determinado como sendo positivo; (2) no segundo terço ou grupo intermediário, o seu risco não pode ser determinado com precisão; e (3) no terço inferior, eles possuem probabilidade muito baixa de ter rejeição aguda e o teste é determinado como sendo negativo.[0088] The alternative is that patients will be divided into thirds based on their assessment of probabilities determined as above. In this case, if the patient is (1) in the upper third, they have a high probability of having acute rejection and the test is determined to be positive; (2) in the second third or intermediate group, their risk cannot be accurately determined; and (3) in the lower third, they have a very low probability of having acute rejection and the test is determined to be negative.
[0089] O coeficiente (valor β*) e o corte derivado do grupo de treinamento serão introduzidos e armazenados em um sistema de computador de bioinformática com base na Web que pode ser consultado por consultórios médicos/laboratórios clínicos via Internet.[0089] The coefficient (β* value) and the cutoff derived from the training group will be entered and stored in a web-based bioinformatics computer system that can be consulted by doctors' offices/clinical laboratories via the Internet.
[0090] 4. Diagnóstico de casos novos: para novos pacientes, os níveis de expressão do conjunto de nove genes serão medidos por meio da mesma tecnologia utilizada para o conjunto de treinamento no laboratório clínico. Utilizando um sistema de bioinformática com base na Web, a avaliação de probabilidades será calculada resumindo-se o valor de expressão (gi) dos nove genes multiplicado pelos seus valores β* que são derivados do conjunto de treinamento. A avaliação de probabilidades será comparada com o corte para determinar a situação de ACR. Aumento da avaliação de probabilidades do paciente com relação à avaliação de probabilidades em controle indica que o paciente encontra-se em risco mais alto de rejeição de aloenxertos. Um laboratório clínico enviará os resultados do teste para o médico.[0090] 4. Diagnosis of new cases: for new patients, the expression levels of the set of nine genes will be measured using the same technology used for the training set in the clinical laboratory. Using a web-based bioinformatics system, the probability assessment will be calculated by summarizing the expression value (gi) of the nine genes multiplied by their β* values that are derived from the training set. The probability assessment will be compared with the cut to determine the ACR status. Increased patient odds assessment relative to control odds assessment indicates that the patient is at higher risk of allograft rejection. A clinical laboratory will send the test results to the doctor.
[0091] Os métodos descritos no presente diagnosticam com precisão a rejeição clínica e subclínica e identificam com precisão aloenxertos com risco de declínio funcional e histológico subsequente e pacientes com aloenxerto em risco de perda de enxerto.[0091] The methods described herein accurately diagnose clinical and subclinical rejection and accurately identify allografts at risk of subsequent functional and histological decline and allograft patients at risk of graft loss.
[0092] Quando esses pacientes com aloenxertos são identificados, a presente invenção inclui métodos de tratamento desses pacientes. Os métodos incluem, sem limitações, aumento da administração de fármacos imunossupressores, ou seja, inibidor da calcineurina (CNI), tal como ciclosporina ou tacrolimus, ou fármaco imunossupressor menos fibrogênica, tal como micofenolato mofetil (MMF) ou sirolimus. A classe principal de imunossupressores são os inibidores de calcineurina (CNIs), que inclui tacrolimus (Prograf® e Advagraf®/Astagraf XL (Astellas Pharma Inc.) e genéricos de Prograf®) e ciclosporina (Neoral® e Sandimmune® (Novartis AG) e genéricos). Esteroides como prednisona podem também ser administrados para tratar pacientes em risco de perda de enxerto ou declínio funcional. Agentes antiproliferativos tais como micofenolato mofetil, micofenolato sódio e azatioprina também são úteis nesses tratamentos. A imunossupressão pode ser atingida com muitos fármacos imunossupressores, que incluem esteroides, anticorpos dirigidos e CNIs como tacrolimus. Destes, tacrolimus é um dos mais potentes em termos de supressão do sistema imunológico ou administração de alta dose de esteroides ou agentes antilinfocíticos, dependendo da presença ou ausência de creatinina elevada. O regime de tratamento atualmente preferido para rejeição clínica é alta dose de esteroides ou agentes antilinfocíticos. Outro agente preferido é Nulojix® (belatacept, Bristol-Myers Squibb), agente biológico de infusão.[0092] When such patients with allografts are identified, the present invention includes methods of treating such patients. Methods include, without limitation, increased administration of immunosuppressive drugs, ie calcineurin inhibitor (CNI) such as cyclosporine or tacrolimus, or less fibrogenic immunosuppressive drug such as mycophenolate mofetil (MMF) or sirolimus. The main class of immunosuppressants are calcineurin inhibitors (CNIs), which include tacrolimus (Prograf® and Advagraf®/Astagraf XL (Astellas Pharma Inc.) and generics from Prograf®) and cyclosporine (Neoral® and Sandimmune® (Novartis AG) and generics). Steroids such as prednisone may also be given to treat patients at risk of graft loss or functional decline. Antiproliferative agents such as mycophenolate mofetil, mycophenolate sodium and azathioprine are also useful in these treatments. Immunosuppression can be achieved with many immunosuppressive drugs, which include steroids, targeted antibodies, and CNIs such as tacrolimus. Of these, tacrolimus is one of the most potent in terms of suppressing the immune system or administering high doses of steroids or antilymphocytic agents, depending on the presence or absence of elevated creatinine. The currently preferred treatment regimen for clinical rejection is high-dose steroids or antilymphocytic agents. Another preferred agent is Nulojix® (belatacept, Bristol-Myers Squibb), biologic infusion agent.
[0093] Em certas realizações, são fornecidos kits de determinação de risco de pacientes com aloenxerto renal para perda de aloenxerto.[0093] In certain embodiments, renal allograft patient risk determination kits are provided for allograft loss.
[0094] Os kits conterão primers para o conjunto de assinatura genética com 17 membros conforme descrito no Exemplo 5 abaixo (para testes Nanostring), primers para dois genes domésticos, beta-actina (ACTB) desidrogenase 3-fosfato de gliceraldeído (GAPDH) e uma sonda controle, RNA ribossomal 18S (para testes de qPCR).[0094] The kits will contain primers for the 17-member genetic signature set as described in Example 5 below (for Nanostring tests), primers for two housekeeping genes, beta-actin (ACTB) glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) and a control probe, 18S ribosomal RNA (for qPCR tests).
[0095] Um kit pode conter adicionalmente um ou mais reagentes de extração de mRNA e/ou reagentes de síntese de cDNA. Em outras realizações, o kit pode compreender um ou mais recipientes nos quais os agentes biológicos são colocados e, de preferência, adequadamente divididos. Os componentes dos kits podem ser embalados em meio aquoso ou em forma liofilizada. Os kits podem também compreender um ou mais excipientes, diluentes e/ou veículos farmaceuticamente aceitáveis. Exemplos não limitadores de excipientes, diluentes e/ou veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem água livre de RNAse, água destilada, água tamponada, solução salina fisiológica, PBS, solução de Ringer, solução de dextrose, tampões de reação, tampões de marcação, tampões de lavagem e tampões de hibridização.[0095] A kit may additionally contain one or more mRNA extraction reagents and/or cDNA synthesis reagents. In other embodiments, the kit can comprise one or more containers into which the biological agents are placed and, preferably, suitably divided. Kit components can be packaged in aqueous medium or in lyophilized form. Kits can also comprise one or more pharmaceutically acceptable excipients, diluents and/or carriers. Non-limiting examples of pharmaceutically acceptable excipients, diluents and/or carriers include RNAse-free water, distilled water, buffered water, physiological saline, PBS, Ringer's solution, dextrose solution, reaction buffers, labeling buffers, wash buffers and hybridization buffers.
[0096] Os kits de acordo com a presente invenção podem assumir uma série de formas. Tipicamente, o kit incluirá reagentes apropriados para a determinação dos níveis de expressão de conjuntos genéticos (tais como os descritos no presente) em amostras. Opcionalmente, os kits podem conter uma ou mais amostras de controle. Além disso, os kits, em alguns casos, incluirão informações escritas (indícios) que fornecem referência (tais como valores previamente determinados), em que a comparação entre os níveis de expressão genética no paciente e na referência (valores previamente determinados) indica situação clínica.[0096] Kits according to the present invention can take a variety of forms. Typically, the kit will include appropriate reagents for determining expression levels of gene pools (such as those described herein) in samples. Optionally, kits can contain one or more control samples. In addition, kits will, in some cases, include written information (clues) that provide a reference (such as predetermined values), where the comparison between patient and baseline gene expression levels (predetermined values) indicates clinical status.
[0097] Em alguns casos, os kits compreendem software útil para comparação dos níveis de expressão de conjuntos genéticos ou ocorrências com uma referência (tal como um modelo de previsão). Normalmente, o software será fornecido em formato legível por computador, tal como disco compacto, mas pode também ser disponível para download via Internet. Os kits não são limitados desta forma, entretanto, e outras variações serão evidentes para os técnicos comuns no assunto.[0097] In some cases, the kits comprise software useful for comparing the expression levels of gene pools or instances with a reference (such as a prediction model). Typically, the software will be provided in a computer-readable format, such as a compact disc, but may also be available for download via the Internet. Kits are not limited in this way, however, and other variations will be evident to the average person skilled in the art.
[0098] Os métodos do presente podem também ser utilizados para seleção de tratamento e/ou determinação de plano de tratamento para pacientes, com base nos níveis de expressão de um conjunto genético (tais como os descritos no presente).[0098] The methods of the present can also be used for treatment selection and/or determination of treatment plan for patients, based on the expression levels of a genetic set (such as those described in the present).
[0099] Os níveis de expressão e/ou níveis de expressão de referência podem ser armazenados em meio de armazenagem de dados apropriado (tal como um banco de dados) e, portanto, também são disponíveis para diagnósticos futuros. Isso também permite o diagnóstico eficiente de prevalência para doença, pois resultados de referência apropriados podem ser identificados no banco de dados após a confirmação (no futuro) de que o paciente do qual foi obtida a amostra de referência correspondente de fato desenvolveu fibrose do aloenxerto e/ou experimentou rejeição do aloenxerto.[0099] The expression levels and/or reference expression levels can be stored in appropriate data storage medium (such as a database) and are therefore also available for future diagnostics. This also allows efficient diagnosis of prevalence for the disease, as appropriate reference results can be identified in the database after confirmation (in the future) that the patient from whom the corresponding reference sample was obtained indeed developed allograft fibrosis and/or experienced allograft rejection.
[00100] Da forma utilizada no presente, “banco de dados” compreende dados coletados (por exemplo, informações de nível de referência e/ou analisado e/ou informações do paciente) em um meio de armazenagem apropriado. Além disso, o banco de dados pode compreender adicionalmente um sistema de administração de banco de dados. O sistema de administração de banco de dados é preferencialmente um sistema de administração de banco de dados com base em rede, hierárquico ou orientado a objetos. De maior preferência, o banco de dados será implementado na forma de sistema distribuído (federal), tal como sistema de cliente-servidor. De maior preferência, o banco de dados é estruturado de forma a permitir um algoritmo de busca para comparar um conjunto de dados de teste com os conjuntos de dados compreendidos pela coleção de dados. Especificamente, utilizando esse algoritmo, o banco de dados pode ser pesquisado em busca de conjuntos de dados idênticos ou similares que indiquem risco de rejeição de aloenxerto renal. Desta forma, caso possa ser identificado um conjunto de dados idêntico ou similar na coleção de dados, o conjunto de dados de teste será associado a risco de rejeição de aloenxerto renal. Consequentemente, as informações obtidas da coleção de dados podem ser utilizadas para diagnosticar risco de perda de alenxerto do paciente de aloenxerto com base em um conjunto de dados de teste obtido de um paciente. De maior preferência, a coleta de dados compreende valores característicos de todos os analisados compreendidos por qualquer um dos grupos indicados acima.[00100] As used herein, “database” comprises collected data (eg, reference and/or analyzed level information and/or patient information) on an appropriate storage medium. Furthermore, the database may further comprise a database management system. The database administration system is preferably a network-based, hierarchical or object-oriented database administration system. Most preferably, the database will be implemented in the form of a distributed (federal) system, such as a client-server system. Most preferably, the database is structured in such a way as to allow a search algorithm to compare a test dataset with the datasets comprised by the data collection. Specifically, using this algorithm, the database can be searched for identical or similar datasets that indicate risk of renal allograft rejection. Therefore, if an identical or similar dataset can be identified in the data collection, the test dataset will be associated with risk of renal allograft rejection. Consequently, the information obtained from the data collection can be used to diagnose an allograft patient's risk of allograft loss based on a set of test data obtained from a patient. More preferably, the data collection comprises characteristic values of all analytes comprised by any of the groups indicated above.
[00101] A presente invenção fornece adicionalmente, por exemplo, a comunicação de resultados de teste, diagnósticos ou ambos para técnicos, médicos ou pacientes. Em certas realizações, serão utilizados computadores para comunicar resultados de teste, diagnósticos ou ambos a partes interessadas, tais como médicos e seus pacientes.[00101] The present invention additionally provides, for example, the communication of test results, diagnoses or both to technicians, doctors or patients. In certain embodiments, computers will be used to communicate test results, diagnoses, or both to interested parties, such as physicians and their patients.
[00102] Em algumas realizações, o método descrito no presente compreende adicionalmente a modificação do registro clínico do paciente para identificar o paciente como estando em risco de desenvolvimento de ACR e/ou perda de aloenxerto. O registro clínico pode ser armazenado em qualquer meio de armazenagem de dados apropriado (por exemplo, meio legível por computador).[00102] In some embodiments, the method described herein further comprises modifying the patient's clinical record to identify the patient as being at risk of developing ACR and/or allograft loss. The clinical record may be stored on any appropriate data storage medium (eg, computer-readable medium).
[00103] Em algumas realizações da presente invenção, diagnóstico com base nos métodos fornecidos no presente é comunicado ao paciente com aloenxerto assim que possível após a obtenção do diagnóstico. O diagnóstico pode ser comunicado para o paciente pelo médico responsável. Alternativamente, o diagnóstico pode ser enviado para o paciente por email ou comunicado para o paciente por telefone. O diagnóstico pode ser enviado para o paciente na forma de relatório. Pode-se utilizar um computador para comunicar o diagnóstico por email ou telefone. Em certas realizações, a mensagem que contém resultados de um teste de diagnóstico pode ser gerada e fornecida automaticamente para o paciente utilizando uma combinação de hardware e software de computador que será familiar para os técnicos em telecomunicações.[00103] In some embodiments of the present invention, diagnosis based on the methods provided herein is communicated to the allograft patient as soon as possible after obtaining the diagnosis. The diagnosis can be communicated to the patient by the attending physician. Alternatively, the diagnosis can be emailed to the patient or communicated to the patient over the phone. The diagnosis can be sent to the patient in the form of a report. A computer can be used to communicate the diagnosis by email or telephone. In certain embodiments, the message containing results of a diagnostic test can be automatically generated and delivered to the patient using a combination of computer hardware and software that will be familiar to telecommunications technicians.
[00104] Aspectos da presente invenção incluem produtos de programa de computador para identificar pacientes que sofreram aloenxerto renal e encontram-se em risco de rejeição aguda, em que o produto de programa de computador, quando carregado a um computador, é configurado para empregar um resultado de expressão genética de uma amostra derivada do paciente para determinar se o paciente que sofreu aloenxerto renal encontra-se em risco de rejeição de aloenxerto e o resultado da expressão genética compreende dados de expressão para pelo menos um conjunto de assinatura genética.[00104] Aspects of the present invention include computer program products for identifying patients who have undergone renal allograft and are at risk of acute rejection, wherein the computer program product, when loaded into a computer, is configured to employ a gene expression result from a patient-derived sample to determine whether the patient who has undergone renal allograft is at risk of allograft rejection, and the gene expression result comprises expression data for at least one set of genetic signatures.
[00105] Também são fornecidos perfis de expressão de referência para um fenótipo que é um dentre: (a) baixo risco de rejeição aguda; ou (b) alto risco; em que o perfil de expressão é registrado em meio legível por computador que é acessível pelo usuário, por exemplo, em formato legível pelo usuário. Em certas realizações, o perfil de expressão é um perfil de fenótipo que apresenta baixo risco. Em certas realizações, o perfil de expressão é um perfil de fenótipo que apresenta alto risco.[00105] Reference expression profiles are also provided for a phenotype that is one of: (a) low risk of acute rejection; or (b) high risk; wherein the expression profile is recorded on a computer-readable medium that is accessible by the user, for example, in a user-readable format. In certain embodiments, the expression profile is a low risk phenotype profile. In certain embodiments, the expression profile is a high risk phenotype profile.
[00106] Os perfis de expressão e seus bancos de dados podem ser fornecidos em uma série de meios para facilitar o seu uso. “Mídia” indica um produto industrializado que contém as informações do perfil de expressão de acordo com a presente invenção. Os bancos de dados de acordo com a presente invenção podem ser registrados em meios legíveis por computador, tais como qualquer meio que possa ser lido e acessado diretamente por usuários, usando um computador. Esses meios incluem, mas sem limitações: meios de armazenagem magnética, como disquetes, meios de armazenagem em disco rígido e fita magnética; meios de armazenagem óptica como CD-ROMs; meios de armazenagem elétrica como RAM e ROM; e híbridos dessas categorias, como meios de armazenagem magnética/óptica. Os técnicos no assunto podem apreciar facilmente como qualquer um dos meios legíveis por computador conhecidos atualmente pode ser utilizado para criar um produto industrializado que compreende gravações das informações de banco de dados do presente.[00106] Expression profiles and their databases can be provided in a variety of ways to facilitate their use. "Media" denotes a manufactured product that contains the expression profile information according to the present invention. Databases in accordance with the present invention may be recorded on computer-readable media, such as any medium that can be read and directly accessed by users using a computer. Such media include, but are not limited to: magnetic storage media, such as floppy disks, hard disk storage media, and magnetic tape; optical storage media such as CD-ROMs; electrical storage media such as RAM and ROM; and hybrids of these categories, such as magnetic/optical storage media. Those skilled in the art can readily appreciate how any of the computer-readable media known today can be utilized to create an industrialized product comprising recordings of the database information of the present.
[00107] “Gravado” indica processo de armazenagem de informações em meio legível por computador utilizando qualquer um desses métodos conhecidos na técnica. Qualquer estrutura de armazenagem de dados conveniente pode ser selecionada, com base nos meios utilizados para acesso às informações armazenadas. Diversos formatos e programas processadores de dados podem ser utilizados para armazenagem, tais como arquivos de processamento de texto, formatos de bancos de dados etc. Os bancos de dados de perfis de expressão de pacientes podem, portanto, ser acessados por usuários, ou seja, os arquivos de bancos de dados são gravados em formato legível para o usuário (por exemplo, formato legível por computador, em que o usuário controla o computador).[00107] “Recorded” indicates the process of storing information in a computer-readable medium using any of these methods known in the art. Any convenient data storage structure can be selected, based on the means used to access the stored information. Various formats and data processing programs can be used for storage, such as word processing files, database formats, etc. The patient expression profile databases are therefore user-accessible, i.e. the database files are written in a user-readable format (e.g., computer-readable format, where the user controls the computer).
[00108] Da forma utilizada no presente, “sistema com base em computador” designa o meio de hardware, meio de software e meio de armazenagem de dados utilizados para analisar as informações de acordo com a presente invenção. O hardware mínimo dos sistemas computadorizados de acordo com a presente invenção compreende uma unidade central de processamento (CPU), meio de entrada, meio de saída e meio de armazenagem de dados. Os técnicos no assunto podem apreciar facilmente que qualquer um dos sistemas computadorizados disponíveis atualmente é apropriado para uso na presente invenção. Os meios de armazenagem de dados podem compreender qualquer artigo industrializado que compreende uma gravação das informações do presente conforme descrito acima ou um meio de acesso a memória que pode ter acesso a esse artigo industrializado.[00108] As used herein, "computer-based system" means the hardware medium, software medium and data storage medium used to analyze the information in accordance with the present invention. The minimum hardware of computerized systems according to the present invention comprises a central processing unit (CPU), input means, output means and data storage means. Those skilled in the art can readily appreciate that any of the currently available computer systems are suitable for use in the present invention. The data storage means may comprise any manufactured article comprising a recording of the present information as described above or a memory access means which may have access to such manufactured article.
[00109] Diversos formatos estruturais para os meios de entrada e de saída podem ser utilizados para receber e emitir as informações nos sistemas computadorizados de acordo com a presente invenção, por exemplo, de e para o usuário. Um formato de meio de saída avalia perfis de expressão que possuem graus variados de similaridade com um perfil de expressão de referência. Essa apresentação fornece aos técnicos no assunto avaliação de similaridades e identifica o grau de similaridade contido no perfil de expressão de teste.[00109] Several structural formats for the input and output means can be used to receive and output information in computerized systems according to the present invention, for example, from and to the user. An output medium format evaluates expression profiles that have varying degrees of similarity to a reference expression profile. This presentation provides those skilled in the art with evaluating similarities and identifying the degree of similarity contained in the test expression profile.
[00110] A presente invenção é descrita abaixo em exemplos que se destinam a descrever a presente invenção sem limitar o seu escopo.[00110] The present invention is described below in examples which are intended to describe the present invention without limiting its scope.
[00111] Conforme descrito nos Exemplos abaixo, descobriu-se uma assinatura molecular para prever o desenvolvimento/progressão de rejeição celular aguda de aloenxerto renal. Os dados demonstraram o uso de formação de perfis de mRNA periférico para supervisão e para estratificar os pacientes em risco de fibrose e perda de enxerto, eliminando a necessidade de biópsia de aloenxertos e identificando aqueles que podem beneficiar-se de intervenções iniciais para evitar perda de aloenxerto crônico.[00111] As described in the Examples below, a molecular signature has been discovered to predict the development/progression of acute renal allograft cellular rejection. The data demonstrated the use of peripheral mRNA profiling for surveillance and to stratify patients at risk for fibrosis and graft loss, eliminating the need for allograft biopsy and identifying those who may benefit from early interventions to prevent chronic allograft loss.
[00112] Nos exemplos abaixo, foram utilizados os materiais e métodos a seguir: EXEMPLO 1:TESTE DE MISEQ 1. Teste específico (conjuntos de sondas com código de barras para painel de nove genes, incluindo um quadro de genes domésticos). 2. Kit de preparação de amostra de RNA Illumina® TruSeq® v2. 3. Kit QIAGEN RNeasy® de extração de RNA total com alta qualidade.[00112] In the examples below, the following materials and methods were used: EXAMPLE 1:MISEQ TEST 1. Specific test (bar-coded probe sets for a panel of nine genes, including a table of domestic genes). 2. Illumina® TruSeq® v2 RNA Sample Preparation Kit. 3. High Quality QIAGEN RNeasy® Total RNA Extraction Kit.
[00113] O RNA total será extraído utilizando o Kit QIAGEN RNeasy®. A biblioteca de sequenciamento será gerada utilizando o Kit de Preparação de Amostras de RNA Illumina® TruSeq® v2, seguindo o protocolo do fabricante: resumidamente, mRNA que contém poliA será purificado e fragmentado em primeiro lugar a partir do RNA total. A síntese de cDNA de primeira fita será realizada utilizando primers de hexâmetros aleatórios e transcriptase reversa, seguida pela síntese de cDNA de segunda fita. Após o processo de reparo das extremidades que converte as sobreposições em extremidades obtusas de cDNAs, diversos adaptadores de indexação serão adicionados ao final do cDNA de fita dupla e realizar-se- á PCR para enriquecer os alvos utilizando os pares de primers específicos para o painel genético e genes domésticos. Por fim, as bibliotecas indexadas serão validadas, normalizadas e reunidas para sequenciamento sobre o sequenciador MiSEQ.[00113] Total RNA will be extracted using the QIAGEN RNeasy® Kit. The sequencing library will be generated using the Illumina® TruSeq® v2 RNA Sample Preparation Kit, following the manufacturer's protocol: Briefly, mRNA containing polyA will be purified and fragmented first from total RNA. First strand cDNA synthesis will be performed using random hexameter primers and reverse transcriptase, followed by second strand cDNA synthesis. After the end-repair process that converts the overlaps into blunt ends of cDNAs, several indexing adapters will be added to the end of the double-stranded cDNA and PCR will be performed to enrich the targets using the specific primer pairs for the genetic panel and house genes. Finally, the indexed libraries will be validated, normalized and pooled for sequencing on the MiSEQ sequencer.
[00114] Os dados de RNAseq brutos gerados pelo sequenciador MiSEQ serão processados por meio do procedimento a seguir. As leituras com boa qualidade serão alinhadas em primeiro lugar em diversos bancos de dados de referência humanos, incluindo genoma humano hg19, exon, junção de divisão e bancos de dados de contaminação, incluindo sequências de RNA de ribossomos e mitocôndrias utilizando o algoritmo de alinhamento BWA1. Após leituras de filtragem que mapearam o banco de dados de contaminação, as leituras que são alinhadas exclusivamente a, no máximo, duas faltas de coincidência com as regiões de amplicon desejadas (ou seja, produto de PCR dos primers emparelhados) serão contadas como nível de expressão do gene correspondente e adicionalmente submetidas à normalização de quantis ao longo das amostras após transformação log2 utilizando programas estatísticos R.[00114] The raw RNAseq data generated by the MiSEQ sequencer will be processed using the following procedure. Good quality reads will first be aligned to several human reference databases including hg19 human genome, exon, split junction and contamination databases including ribosome and mitochondrial RNA sequences using the BWA1 alignment algorithm. After filtering reads that mapped the contamination database, reads that are uniquely aligned to at most two mismatches with the desired amplicon regions (i.e., PCR product of the paired primers) will be counted as expression level of the corresponding gene and further subjected to quantile normalization across samples after log2 transformation using R statistical programs.
[00115] 1. Conjunto de códigos específicos (conjuntos de sondas com código de barras para o quadro com nove genes, incluindo três genes domésticos e controles negativos fornecidos pela Nanostring).[00115] 1. Specific codeset (barcoded probe sets for the nine-gene frame, including three domestic genes and negative controls provided by Nanostring).
[00116] 2. Kit Master nCounter® que inclui o Cartucho nCounter, Conjunto de Placas nCounter e Conjunto Preparado nCounter.[00116] 2. nCounter® Master Kit that includes the nCounter Cartridge, nCounter Plate Set and nCounter Ready Set.
[00117] 3. Kit QIAGEN RNeasy® de extração de RNA total com alta qualidade.[00117] 3. High Quality QIAGEN RNeasy® Total RNA Extraction Kit.
[00118] RNA total será extraído utilizando o Kit QIAGEN RNeasy® seguindo o protocolo do fabricante. Sondas de códigos de barras serão combinadas com o RNA total em solução a 65 °C com o kit master. A sonda de captura capturará o alvo para ser imobilizado para dados. Após a hibridização, a amostra será transferida para a Estação nCounter Pre, a sonda/alvo será imobilizada no Cartucho nCounter e as sondas são contadas em seguida pelo Analisador Digital nCounter.[00118] Total RNA will be extracted using the QIAGEN RNeasy® Kit following the manufacturer's protocol. Barcode probes will be combined with total RNA in solution at 65 °C with the master kit. The capture probe will capture the target to be immobilized for data. After hybridization, the sample will be transferred to the nCounter Pre Station, the probe/target will be immobilized on the nCounter Cartridge and the probes are then counted by the nCounter Digital Analyzer.
[00119] Os dados de contagem brutos do analisador Nanostring serão processados utilizando o procedimento a seguir: os dados de contagem brutos serão normalizados em primeiro lugar na contagem dos genes domésticos e os mRNAs com contagens abaixo da média mais três desvios padrão das contagens de controles negativos serão retirados por meio de filtragem. Devido à variação de dados decorrente do lote de reagente, a contagem para cada mRNA de diferentes lotes de reagentes será calibrada multiplicando-se um fator da razão da média das contagens das amostras sobre diferentes lotes de reagentes. As contagens calibradas de diferentes bateladas experimentais serão adicionalmente ajustadas no pacote ComBat.[00119] The raw count data from the Nanostring analyzer will be processed using the following procedure: the raw count data will first be normalized to the domestic gene count and the mRNAs with counts below the mean plus three standard deviations from the negative control counts will be filtered out. Due to data variation due to reagent lot, the count for each mRNA from different reagent lots will be calibrated by multiplying a factor of the ratio of the average sample counts over different reagent lots. Calibrated counts from different experimental batches will be further adjusted in the ComBat package.
[00120] 1. Recipiente de primer (16 tubos com um teste qPCR por tubo para 12 genes, incluindo o quadro com nove genes e dois genes domésticos (ACTB e GAPDH) e a sonda controle RNA ribossomal 18S). Os testes serão encomendados à LifeTech.[00120] 1. Primer container (16 tubes with one qPCR test per tube for 12 genes, including the frame with nine genes and two house genes (ACTB and GAPDH) and the 18S ribosomal RNA control probe). Tests will be ordered from LifeTech.
[00121] 2. Mistura Master Universal TaqMan® II: reagentes para reações de qPCR.[00121] 2. Universal TaqMan® II Master Mix: reagents for qPCR reactions.
[00122] 3. Placa com 96 cavidades conjunto TaqMan® 6x16.[00122] 3. Plate with 96 wells TaqMan® 6x16 set.
[00123] 4. Kit de síntese de cDNA QPCR Agilent AffinityScript: para conversão com eficiência superior de RNA em cDNA e totalmente otimizada para aplicações de PCR quantitativa (QPCR) em tempo real.[00123] 4. Agilent AffinityScript QPCR cDNA Synthesis Kit: For superior efficient conversion of RNA to cDNA and fully optimized for real-time quantitative PCR (QPCR) applications.
[00124] RNA total será extraído das amostras de biópsia de aloenxerto utilizando o kit Allprep (kit QIAGEN-ALLprep, Valencia CA, Estados Unidos). cDNA será sintetizado utilizando o kit AffinityScript RT com primers oligo dt (Agilent Inc., Santa Clara CA). Testes de qPCR TaqMan para o conjunto com nove genes, dois genes domésticos (ACTB, GAPDH) e 18S serão adquiridos da ABI Life Technology (Grand Island NY). Experimentos com qPCR serão realizados sobre cDNAs utilizando a mistura universal TAQMAN e reações de PCR serão monitoradas e obtidas utilizando um sistema ABI7900HT. As amostras serão medidas em três cópias. Serão gerados valores de tempos de ciclo (CT) para o conjunto genético de previsão, bem como os dois gentes de abrigo. O valor ΔCt de cada gene será computado subtraindo-se o valor CT médio para os genes domésticos do valor CT de cada gene.[00124] Total RNA will be extracted from allograft biopsy samples using the Allprep kit (QIAGEN-ALLprep kit, Valencia CA, United States). cDNA will be synthesized using the AffinityScript RT kit with oligo dt primers (Agilent Inc., Santa Clara CA). TaqMan qPCR tests for the nine gene cluster, two house genes (ACTB, GAPDH) and 18S will be purchased from ABI Life Technology (Grand Island NY). Experiments with qPCR will be performed on cDNAs using the TAQMAN universal mix and PCR reactions will be monitored and obtained using an ABI7900HT system. Samples will be measured in three copies. Cycle time (CT) values will be generated for the prediction gene pool as well as the two shelter people. The ΔCt value for each gene will be computed by subtracting the average CT value for the domestic genes from the CT value for each gene.
[00125] Oitenta pacientes adultos com transplante renal foram estudados utilizando a formação de perfis de expressão genética para determinar a presença de rejeição aguda subclínica na sua biópsia. Os pacientes foram predominantemente homens (80%) com idade média de 49,7, variando de 19 a 75. As raças dos pacientes foram 55% brancos, 22,5% afro-americanos, 11,25% asiáticos e 11,25% hispânicos. Os doadores foram 40% doadores vivos e 60% doadores mortos. A idade média dos doadores foi de 41,5 anos, em faixa de 3 a 75 anos. Trinta por cento dos pacientes receberam bloqueador de receptor anti-IL-2 para indução, 27,5% receberam timoglobulina, 27,5% não receberam indução e 0,5% receberam Campath-1H. Todos os pacientes receberam prednisona, prograf e micofenolato mofetil.[00125] Eighty adult kidney transplant patients were studied using gene expression profiling to determine the presence of subclinical acute rejection on their biopsy. Patients were predominantly male (80%) with a mean age of 49.7, ranging from 19 to 75. Patient races were 55% White, 22.5% African American, 11.25% Asian, and 11.25% Hispanic. Donors were 40% living donors and 60% deceased donors. The average age of donors was 41.5 years old, ranging from 3 to 75 years old. Thirty percent of patients received an anti-IL-2 receptor blocker for induction, 27.5% received thymoglobulin, 27.5% received no induction, and 0.5% received Campath-1H. All patients received prednisone, prograf and mycophenolate mofetil.
[00126] 10 cc de sangue periférico foram retirados de oitenta pacientes com transplante renal pós-transplante e armazenados em um tubo Paxgene. O sangue é armazenado em um refrigerador a 4 °C; se o teste não puder ser realizado imediatamente, o teste pode ser realizado no dia seguinte. Caso o sangue deva ser armazenado por mais tempo, ele deverá ser armazenado a -80 °C.[00126] 10 cc of peripheral blood was taken from eighty post-transplant kidney transplant patients and stored in a Paxgene tube. Blood is stored in a refrigerator at 4°C; if the test cannot be performed immediately, the test can be performed the next day. If blood is to be stored longer, it should be stored at -80 °C.
[00127] O teste MiSEQ foi realizado conforme descrito no Exemplo 1 acima.[00127] The MiSEQ test was performed as described in Example 1 above.
[00128] Os dados de expressão obtidos por meio do teste MiSEQ são introduzidos no produto de programa de computador para monitorar pacientes que tenham recebido aloenxerto para reação de rejeição aguda (AC) que acompanha o kit. Este produto de programa de computador, quando carregado em um computador, é configurado para empregar um resultado de expressão genética da amostra derivada de cada um dos pacientes para determinar avaliação e fornecer essa avaliação de ACR para os usuários em formato legível por usuário. A avaliação de ACR é baseada em avaliações de probabilidade derivadas de experimentos de referência a partir dos quais foram validadas as faixas de referência de diagnóstico.[00128] The expression data obtained through the MiSEQ test are entered into the computer program product for monitoring patients who have received allograft for acute rejection reaction (AC) that accompanies the kit. This computer program product, when loaded onto a computer, is configured to employ a gene expression result from the sample derived from each of the patients to determine the assessment and provide that ACR assessment to the users in a user-readable format. The ACR assessment is based on probability assessments derived from reference experiments from which diagnostic reference ranges have been validated.
[00129] Negativo para ACR: avaliação de probabilidade de ACR abaixo de 0,16.[00129] Negative for ACR: ACR probability assessment below 0.16.
[00130] Positivo para ACR: avaliação de probabilidade de ACR acima de 0,5.[00130] Positive for ACR: assessment of probability of ACR above 0.5.
[00131] Os resultados são exibidos nas Tabelas 1 e 2 anexas ao presente.[00131] The results are shown in Tables 1 and 2 attached to this document.
[00132] Os resultados a seguir são baseados em quantificação de sete dentre nove genes por meio de teste MiSEQ. Os sete genes são: ANXA5, TSC22D1, AP1M1, CLK1, EFTUD2, SENP6 e SENP7.[00132] The following results are based on quantification of seven out of nine genes using the MiSEQ test. The seven genes are: ANXA5, TSC22D1, AP1M1, CLK1, EFTUD2, SENP6 and SENP7.
[00133] Conforme exibido na Tabela 1, dos oitenta pacientes, 28 possuem avaliação de 0,16 ou menos e 18 possuem avaliação de 0,5 ou mais. Trinta e dois pacientes encontram-se na faixa intermediária e, portanto, são considerados indeterminados.[00133] As shown in Table 1, of the eighty patients, 28 have a score of 0.16 or less and 18 have a score of 0.5 or more. Thirty-two patients are in the intermediate range and therefore are considered indeterminate.
[00134] Comparação com métodos de diagnóstico convencionais, especificamente patologia, demonstra que, na biópsia, apenas um dos 28 pacientes diagnosticados como sem ACR (Grupo 1) por meio de análise de sangue periférico possui alguma evidência de rejeição aguda na biópsia (Tabela). Este paciente possui nefropatia de BK, que causa inflamação na biópsia de outras causas. Pacientes com esse diagnóstico são excessivamente imunossuprimidos e possuem perfil de sangue periférico diferente de ACR. Estes dados demonstram que inflamações de BK podem ser diferenciadas de inflamações de ACR em sangue periférico utilizando o teste do presente. Concluiu-se que quatro dos 18 pacientes com ACR não possuem ACR na biópsia; dois desses pacientes, entretanto, seguiram para ter ACR, de forma que o teste os identificou corretamente como alto risco.[00134] Comparison with conventional diagnostic methods, specifically pathology, demonstrates that, on biopsy, only one of the 28 patients diagnosed as without ACR (Group 1) through peripheral blood analysis has some evidence of acute rejection on biopsy (Table). This patient has BK nephropathy, which causes inflammation on biopsy of other causes. Patients with this diagnosis are excessively immunosuppressed and have a peripheral blood profile different from ACR. These data demonstrate that BK inflammations can be differentiated from ACR inflammations in peripheral blood using the test of the present. It was concluded that four of the 18 patients with ACR do not have ACR on biopsy; two of these patients, however, went on to have ACR, so the test correctly identified them as high risk.
[00135] Dos 32 pacientes que são intermediários (Grupo 2), concluiu-se que onze pacientes possuem biópsias que são suspeitas (n = 7) ou ACR (n = 4).[00135] Of the 32 patients who are intermediate (Group 2), it was concluded that eleven patients have biopsies that are suspicious (n = 7) or ACR (n = 4).
[00136] Dos 18 pacientes diagnosticados com ACR (Grupo 3), quatro foram diagnosticados como não possuindo ACR, mas dois desses pacientes prosseguiram para ter ACR posteriormente.[00136] Of the 18 patients diagnosed with ACR (Group 3), four were diagnosed as not having ACR, but two of these patients went on to have ACR later.
[00137] Utilizando uma faixa de referência com base nesses resultados, o teste possui sensibilidade e especificidade de 1 e 0,875, respectivamente, com NPV e PPV de 1 e 0,78, respectivamente.[00137] Using a reference range based on these results, the test has a sensitivity and specificity of 1 and 0.875, respectively, with NPV and PPV of 1 and 0.78, respectively.
[00138] 1. Os pacientes do grupo 1 (avaliação de ACR negativa) continuam com o protocolo padrão de redução da imunossupressão, em que os pacientes são reduzidos para prednisona 5 mg se os pacientes ainda estiverem tomando e o nível alvo de prograf é reduzido para 5-7 mg/dl e micofenolato mofetil.[00138] 1. Patients in group 1 (negative ACR assessment) continue with the standard immunosuppression reduction protocol, where patients are reduced to prednisone 5 mg if patients are still taking it and the target level of prograf is reduced to 5-7 mg/dl and mycophenolate mofetil.
[00139] 2. Grupo de pacientes 2 (ACR indeterminado): a abordagem será determinada pelo médico responsável. Potenciais abordagens incluem: a. A imunossupressão não será adicionalmente reduzida, os pacientes sofrerão monitoramento contínuo e, se o teste for positivo, eles serão tratados; b. Será realizada biópsia para confirmar ou eliminar a presença de ACR.[00139] 2. Patient group 2 (ACR undetermined): the approach will be determined by the physician in charge. Potential approaches include: a. Immunosuppression will not be further reduced, patients will undergo continuous monitoring and, if the test is positive, they will be treated; B. Biopsy will be performed to confirm or rule out the presence of ACR.
[00140] 3. Grupo de pacientes 3 (avaliação de ACR positiva), os pacientes receberão curta administração de alta dose de esteroides, tal como 500 mg de prednisona por três dias. O teste será repetido uma semana após o término dos esteroides para determinar se o perfil de ACR então estará normal. Caso não esteja, pode ser realizada biópsia.[00140] 3. Patient group 3 (positive ACR assessment), patients will receive short administration of high dose steroids such as 500 mg of prednisone for three days. The test will be repeated one week after stopping the steroids to determine if the ACR profile will then be normal. If not, a biopsy can be performed.
[00141] Os pares de primers para os 17 genes são os seguintes: [00141] The pairs of primers for the 17 genes are as follows:
[00142] A presente invenção não deve ter seu escopo limitado pelas realizações específicas descritas no presente. Na verdade, diversas modificações da presente invenção, além das descritas no presente, tornar-se- ão evidentes para os técnicos no assunto a partir do relatório descritivo acima e das figuras anexas. Essas modificações destinam-se a enquadrar-se dentro do escopo das reivindicações anexas.[00142] The present invention should not be limited in scope by the specific embodiments described herein. Indeed, various modifications of the present invention, in addition to those described herein, will become apparent to those skilled in the art from the above specification and accompanying figures. Such modifications are intended to fall within the scope of the appended claims.
[00143] Deve-se compreender ainda que todos os valores são aproximados e fornecidos para descrição. Patentes, pedidos de patente, publicações, descrições de produtos e protocolos são mencionados ao longo de todo o presente pedido, cujas descrições são integralmente incorporadas ao presente como referência para todos os propósitos. TABELA 1 TABELA 2 [00143] It should also be understood that all values are approximate and provided for description. Patents, patent applications, publications, product descriptions and protocols are mentioned throughout this application, which descriptions are incorporated in full herein by reference for all purposes. TABLE 1 TABLE 2
Claims (3)
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201462017784P | 2014-06-26 | 2014-06-26 | |
| US62/017,784 | 2014-06-26 | ||
| PCT/US2015/038171 WO2015200887A2 (en) | 2014-06-26 | 2015-06-26 | Method for diagnosing subclinical and clinical acute rejection by analysis of predictive gene sets |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| BR112016030313A2 BR112016030313A2 (en) | 2018-02-20 |
| BR112016030313B1 true BR112016030313B1 (en) | 2023-05-30 |
Family
ID=
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