BR112012012983A2

BR112012012983A2 - método para sintetizar um anticorpo multiespecífico, método para sintetizar um painel de anticorpos multiespecíficos, método para sintetizar um análogo de anticorpo, método para sintetizar um painel de análogos de anticorpo e composições

Info

Publication number: BR112012012983A2
Application number: BR112012012983-0A
Authority: BR
Inventors: Justin Scheer; Richard L. Vandlen
Original assignee: Genentech Inc
Priority date: 2009-12-04
Filing date: 2010-12-03
Publication date: 2020-09-15
Also published as: CA2781682A1; CN102770456A; JP6184695B2; US10584181B2; JP2013512927A; EP2507381A2; RU2016105962A; RU2012127799A; EP2507381A4; EP3778917A3; CN102770456B; KR20120123299A; WO2011069104A2; MX2012006406A; EP3778917A2; JP2016166181A; RU2580038C2; WO2011069104A3; HK1245802A1; CN107337734A

Abstract

MÉTODO PARA SINTETIZAR UM ANTICORPO MULTIESPECÍFICO, MÉTODO PARA SINTETIZAR UM PAINEL DE ANTICORPOS MULTIESPECÍFICOS, MÉTODO PARA SINTETIZAR UM ANÁLOGO DE ANTICORPO, MÉTODO PARA SINTETIZAR UM PAINEL DE ANÁLOGOS DE ANTICORPO E COMPOSIÇÕES. Trata-se de anticorpos multiespecíficos que se ligam especificamente a pelo menos dois epítopos diferentes. As variantes estruturais de anticorpos nativos (análogos de anticorpo) também são fornecidas. Também são fornecidos anticorpos multiespecíficos e análogos de anticorpo que têm uma variação de atividades biológicas. Os anticorpos multiespecíficos agonistas e antagonistas e análogos de anticorpo agonistas e antagonistas são fornecidos. Os anticorpos multiespecíficos e análogos de anticorpo conjugados com agentes terapêuticos e/ou diagnósticos também são fornecidos, bem como anticorpos multiespecíficos e análogos de anticorpo conjugados com agentes para aumentar a meia vida in vivo comparados a anticorpos multiespecíficos e análogos de anticorpo ausentes de tais agentes. Em adição, são fornecidos os métodos de produzir anticorpos multiespecíficos e análogos de anticorpo e composições que compreendem anticorpos multiespecíficos e análogos de anticorpo. Também são fornecidos os usos terapêuticos, de pesquisa e diagnóstico de anticorpos multiespecíficos e análogos de anticorpo.

Description

“MÉTODO PARA SINTETIZAR UM ANTICORPO MULTIESPECÍFICO, MÉTODO PARA SINTETIZAR UM PAINEL DE ANTICORPOS MULTIESPECÍFICOS, MÉTODO PARA SINTETIZAR UM ANÁLOGO DE ANTICORPO, MÉTODO PARA SINTETIZAR UM PAINEL DE ANÁLOGOS DE ANTICORPO E COMPOSIÇÕES”

REFERÊNCIA REMISSIVA AOS PEDIDOS DE DEPÓSITO CORRELATOS Este pedido reivindica o benefício de prioridade do Pedido provisório nº US 61/267.006, depositado em 4 de dezembro de 2009, e do Pedido provisório nº US 61/346.566, depositado em 20 de maio de 2010, os quais estão incorporados ao presente documento em sua integridade a título de referência.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS O presente pedido contém uma Listagem de Sequências que foi enviada no formato ASCII através da EFS-Web e está incorporada ao presente documento em sua integridade a título de referência. A dita cópia de ASCII, criada em 30 de novembro de 2010, é nomeada P4377R1IWO-.txt e tem 53.549 bytes de tamanho.

CAMPO DA INVENÇÃO Anticorpos multiespecíficos que se ligam especificamente a pelo menos dois epítopos diferentes são fornecidos. Variantes estruturais de anticorpos nativos (análogos de anticorpos) também são fornecidos. Também são fornecidos anticorpos multiespecíficos e análogos de anticorpos que têm uma gama de atividades biológicas. Anticorpos multiespecíficos agonistas e antagonistas e análogos de anticorpos agonistas e antagonistas são fornecidos. Anticorpos multiespecíficos e análogos de anticorpos conjugados com agentes terapêuticos e/ou de diagnóstico também são fornecidos, assim como anticorpos multiespecíficos e análogos de anticorpos são conjugados com agentes para aumentar a meia-vida in vivo em comparação com os anticorpos multiespecíficos e análogos de anticorpos que carecem de tais agentes. Além disso, são fornecidos métodos para produzir anticorpos multiespecíficos e análogos de anticorpos e composições que compreendem anticorpos multiespecíficos e análogos de anticorpos. Os usos terapêuticos, de pesquisae de diagnóstico dos anticorpos multiespecíficos e análogos de anticorpos também são fornecidos.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO Os anticorpos monoclonais proporcionaram novas terapias para o tratamento de várias desordens incluindo câncer, desordens imunológicas e neurológicas e também doenças infecciosas. Newsome, B. W. et al., Br J Clin Pharmacol 66(1):6 a 19 (2008); Chames, P. et al., Br J Pharmacol 157(2):220 a 33 (2009); Dimitrov, D. S. et al., Methods Mol Biol 525:1 a 27, xiii (2009). Essas terapias foram bem sucedidas, pelo menos em parte, por causa da interação robusta e forte com proteínas alvo e a especificidade singular que os anticorpos —monoclonais proporcionam. A meia-vida relativamente longa e a estabilidade dos anticorpos monoclonais in vivo permitem regimes de dosagem desejada e a toxicidade mediada por célula pode ser englobada pela região de Fc do anticorpo (Tabrizi, M. A. et al., Drug Discov Today 11(1 a 2):81 a 8 [2006]). Em determinados casos, os anticorpos terapêuticos foram usados para bloquear os sinais celulares ligando-se e neutralizando-se regiões funcionais importantes de proteínas secretadas e de superfície celular. Tais propriedades básicas dos anticorpos monoclonais atualmente estão sendo usadas para projetar terapias moleculares com diferentes mecanismos de ação em comparação aos anticorpos tradicionais (Dimitrov, D. S. et al., Methods Mol Biol 525:1 a 27, xiii

[2009]))] Determinadas tecnologias desse tipo atualmente estão em desenvolvimento clínico e mostram sinais de promissão (Chames, P. et al., BrJ Pharmacol 157(2):220 a 33 [2009]). Por exemplo, uma abordagem envolve o direcionamento específico de célula com o uso de anticorpos para entregar fármacos citotóxicos a tumores. Carter, P. J. et al., Câncer J 14(3):154 a 69 (2008); Junutula, J. R. et al., Nat Biotechno!l 26(8):925 a 32 (2008); Senter, P. D., Curr Opin Chem Biol 13(3):235 a 44 (2009). Nesse caso, a especificidade de anticorpo monoclonal direciona as moléculas citotóxicas para direcionar as células, concentrando, desse modo, a alta toxicidade da porção citotóxica onde é necessário, enquanto minimiza o impacto a células não alvo. Tais conjugados de fármaco de anticorpo permitem o aumento da potência para matar células tumorais, enquanto mantêm uma janela de dosagem que minimiza toxicidade forado alvo.

Outro exemplo é a entrega de complexos funcionais como nanopartículas que contêm agentes como siRNAs e que incluem os anticorpos monoclonais na superfície das partículas para direcionar. Schiffelers, R. M. et al., Nucleic Acids Res 32(19):e149 (2004); Vornlocher, H. P., Trends Mol Med 12(1):1a3(2006); Davis, M. E., Mol Pharm 6(3):659 a 68 (2009).

Ainda outra abordagem usa a estrutura bivalente de anticorpos para construir moléculas biespecíficas que se ligam a dois alvos simultaneamente (Fischer, N. et al., Pathobiology 74(1):3 a 14 [2007]). Os anticorpos — biespecíficos “oferecem oportunidades para aumentar a especificidade, ampliando a potência e utilizando mecanismos inovadores de ação que não pode ser alcançados com um anticorpo monoclonal tradicional. Drakeman, D. L. expert Opin Investig Drugs 6(9):1169 a 78 (1997); Kontermann, R. E., Acta Pharmacol Sin 26(1):1 a 9 (2005); Marvin, J. S. et al., Acta Pharmacol Sin 26(6):649 a 58 (2005); Marvin, J. S. et al., Curr Opin Drug Discov Devel 9(2):184 a 93 (2006); Shen, J. et al., J Biol Chem 281(16):10706 a 14 (2006); Chames, P. et al., Curr Opin Drug Discov Devel 12(2):276 a 83 (2009). Reticular dois receptores diferentes com o uso de um anticorpo biespecífico para inibir a trajetória de sinalização mostrou utilidade em várias aplicações.

Em um exemplo, uma tirosina fosfatase de superfície celular foi recrutada em um complexo de receptor IgE para diminuir a atividade do receptor IgE fosforilado (Jackman et al., J.

Biol.

Chem. 285:20850 a 20859 (2010)). Essa abordagem foi mais eficaz do que bloquear o sítio de ligação de ligante porque a inibição de sinalização pelo anticorpo biespecífico ocorreu mesmo na presença de altas concentrações de ligante. /d.

O uso dos anticorpos biespecíficos para recrutar células T citotóxicas também mostrou oportunidades clínicas onde a ativação da célula T foi alcançada próximo a células tumorais pelos receptores de ligação de anticorpo bioespecífico simultaneamente nos dois tipos diferentes de células.

Bargou, R. e. et al., Science 321(5891):974 a 7 (2008); Shekhar, C.,Chem Biol 15(9): 877 a 8 (2008); Baeuerle, P.

A. et al., Câncer Res 69(12):4941 a 4 (2009). Em uma abordagem, um anticorpo biespecífico que tem um braço que é ligado a FcyRill e outro que é ligado ao receptor HER2 foi desenvolvido para terapia de tumores ovarianos e de mama que superexpressam o antígeno HER?2. (Hseih-Ma et al.

Cancer Research 52:6832 a 6839 [1992] e Weiner et al.

Cancer Research 53:94 a 100 [1993]). Os anticorpos biespecíficos também podem mediar a morte por células T.

Tipicamente, os anticorpos biespecíficos ligam o complexo CD3 nas células T a um antígeno associado a tumor.

Um anticorpo biespecífico F(ab'), totalmente humanizado que consiste em anti-CD3 ligado a anti-p185"ER? foi usado para direcionar as células T para matar as células tumorais que superexpressam o receptor HER2. Shalaby et al., J.

Exp.

Med. 175(1):217 (1992). Os anticorpos biespecíficos foram testados em diversos exames clínicos de fase precoce com resultados encorajadores.

Em um exame, 12 pacientes com câncer pulmão, ovariano ou de mama foram tratados com infusões de linfócitos T ativados direcionados com um anticorpo bioespecífico anti-CD3/antitumoral (MOC31). deLeij et a/. Bispecífic antibodies and Targeted Cellular Cytotoxicity, Romet-Lemonne, Fanger e Segal Eds,

Lienhart (1991), página 249. As células direcionadas induziram lise local considerável de células tumorais, uma leve reação inflamatória, mas nenhum efeito colateral tóxico ou respostas de anticorpo anticamundongo. Adicionalmente, os anticorpos biespecíficos pode ser usados no 5 tratamento de doenças infecciosas (por exemplo, para direcionar as células efetoras a células infectadas por vírus como o vírus HIV ou influenza ou protozoários como Toxoplasma gondii), usados para entregar imunotoxinas a células tumorais, ou direcionar complexos imunes a receptores de superfície celular. Consulte, por exemplo, Fanger et al., Crit. Rev. Immunol. 12:101 a 124 (1992). Por exemplo, em relação à infecção de HIV, Berg et a/, PNAS (USA) 88:4723 a 4727 (1991) produziu uma quimera de imunoadesina de anticorpo biespecífico derivado de CD4-IgG murino. Esses trabalhadores construíram uma molécula tetramérica que tem dois braços. Um braço era composto de CDA4 fundido com um domínio constante de cadeia pesada de anticorpo junto com uma fusão de CD4 com um domínio constante de cadeia leve de anticorpo. O outro braço foi composto de uma cadeia pesada completa de um anticorpo anti-CD3 juntamente com uma cadeia leve completa do mesmo anticorpo. Por virtude do braço CD4-IgG, essa molécula biespecífica se liga a CD3 na superfície de células T citotóxicas. A justaposição das células citotóxicas e células infectadas por HIV resulta em morte específica das últimas células.

Vários métodos foram descritos para a síntese dos anticorpos multiespecíficos, incluindo os anticorpos biespecíficos. Os métodos para a síntese de fragmentos de anticorpo bivalente foram descritos no documento WO 99/64460. Muitas dessas abordagens, entretanto, apresentam uma variedade de problemas. Por exemplo, dificuldades com expressão de proteína e produção de grande escala, estabilidade e meia-vida in vivo, dobra e agregação foram todas relatadas. Morimoto, K. et al., J Immunol Methods

224(1 a 2):43 a 50 (1999); Kriangkum, J. et al., Biomol Eng 18(2):31 a 40 (2001); Segal, D. M. e B. J. Bast (2001). "Production of bispecific antibodies". Curr Protoc Immunol Capítulo 2:Unidade 2 13; Graziano, R. F. et al., Methods Mol Biol 283:71 a 85 (2004); Kontermann, R. E. et al., Methods Mol Biol 248:227 a 42 (2004); Das, D. et al., Methods Mol Med 109:329 a 46 (2005); Fischer, N. et al., Pathobiology 74(1):3 a 14 (2007); Shen, J. et al., J Immunol Methods 318(1 a 2):65 a 74 (2007). Adicionalmente, muitos desses métodos são complicados e demorados, limitando, assim, o número e variedade de moléculas que podem ser construídas e triadas para atividades desejadas. Os “métodos descritos no presente documento tratam desses problemas e os métodos, composições, anticorpos multiespecíficos e análogos de anticorpos descritos no presente documento proporcionam benefícios adicionais. Todas as referências citadas no presente documento, incluindo publicações e pedidos de patentes, estão incorporados ao presente documento emsua integridade para qualquer propósito a título de referência.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO Os métodos e composições da invenção são baseados, pelo menos em parte, no desenvolvimento de processos para a produção confiável e possível de se reproduzir de alta pureza dos anticorpos multiespecíficos e análogos de anticorpos. Em determinadas realizações, grandes números de combinações multiespecíficas ou monoespecíficas podem ser facilmente preparadas e triadas para atividades desejadas. Em um aspecto, novos métodos de modificar a função de anticorpos são proporcionados com base na verificação surpreendente e inesperada de que variantes estruturais de — anticorpos nativos podem possuir um amplo espectro de atividades biológicas que variam de antagonista forte a agonista forte com níveis variados de atividade entre os mesmos. Em outro aspecto, com o uso dos métodos descritos no presente documento, os anticorpos multiespecíficos e análogos de anticorpos obtidos a partir de anticorpos-pais preexistentes são proporcionados e possuem funções inovadoras não associadas com os anticorpos-pais. Os métodos e os anticorpos multiespecíficos e análogos de anticorpos descritos no presente documento proporcionam, pelo menos em parte, abordagens inovadoras para a produção, triagem, identificação e desenvolvimento de novos agentes terapêuticos e diagnósticos e ferramentas de pesquisa.

Em um aspecto, os métodos de sintetização de um anticorpo multiespecífico são proporcionados, em que um primeiro fragmento de anticorpo obtido a partir de um primeiro anticorpo-pai que tem uma primeira —“monoespecificidade e um grupo sulfidrila livre é reagido com um reticulador tio- reativo para produzir uma porção fragmento de anticorpo-reticulador, e em que a porção fragmento de anticorpo-reticulador é reagida com um segundo fragmento de anticorpo obtido a partir de um segundo anticorpo-pai que tem uma segunda monoespecificidade e um grupo sulfidrila livre para produzir o — anticorpo multiespecífico, e em que a primeira monoespecificidade é diferente da segunda monoespecificidade. Em determinadas realizações, o primeiro anticorpo-pai é selecionado a partir de anti-Her1 e anti-Her2. Em determinadas realizações, o primeiro anticorpo-pai é anti-Her2 e o segundo anticorpo-pai é anti-Her1 ou o primeiro anticorpo-pai é anti-Her1 e o segundo anticorpo-pai é —anti-Her2. Em determinadas realizações, o anti-Her2 é selecionado a partir de Herceptin&ê (trastuzumabe) e 2C4 (pertuzumabe). Em determinadas realizações, o primeiro anticorpo-pai é anti-Her2 e o primeiro fragmento de anticorpo compreende uma sequência de cadeia leve selecionada a partir de SEQ ID NOs: 1, 2, 3,6 e 7 e/ou uma sequência de cadeia pesada selecionada a partirde SEQ ID NOs: 4,5 e8. Em determinadas realizações, o anti-Her1 é selecionado a partir de D1-5 e C3-101. Em determinadas realizações, o primeiro anticorpo-pai é antiHerl e o primeiro fragmento de anticorpo compreende uma sequência de cadeia leve selecionada a partir de SEQ ID

NOs: 18, 19, 21 e 22 e/ou uma sequência de cadeia pesada selecionada a partir de SEQ ID NOs: 17 e 20. Em determinadas realizações, o anti-Her2 é selecionado a partir de trastuzumabe e pertuzumabe e o anti-Herl é selecionado a partir de D1-5 e C3-101. Em determinadas realizações, o fragmento de anticorpo obtido a partir de anti-Her2 compreende uma sequência de cadeia leve selecionada a partir de SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 6 e 7 e/ou uma sequência de cadeia pesada selecionada a partir de SEQ ID NOs: 4, 5e8 eo fragmento de anticorpo obtido a partir de anti-Her1 compreende uma sequência de cadeia leve selecionada a partir de SEQ ID NOs: 18, 19, 21 e 22 e/ou uma sequência de cadeia pesada selecionada a partir de SEQ ID NOs: 17 e 20.

Em um outro aspecto dos métodos descritos acima, o primeiro anticorpo-pai é selecionado a partir de anti-FoyRIlb e anti-FceRla. Em determinadas realizações, o primeiro anticorpo-pai é anti-FeyRIlb e o segundo anticorpo-pai é anti-FceRla ou o primeiro anticorpo-pai é anti-FceRla e o segundo anticorpo-pai é anti-FeyRIlb. Em determinadas realizações, o anti- FcoyRIlb é 5A6. Em determinadas realizações, o primeiro anticorpo-pai é anti- FoyRIlb e o primeiro fragmento de anticorpo compreende uma sequência de cadeia leve selecionada a partir de SEQ ID NOs: 11 e 12 e/ou uma sequência de cadeia pesada selecionada a partir de SEQ ID NOs: 9 e 10. Em determinadas realizações, o anti-FceRla é 22E7. Em determinadas realizações, o primeiro anticorpo-pai é anti-FceRla e o primeiro fragmento de anticorpo compreende uma sequência de cadeia leve selecionada a partir de SEQ ID NOs: 15 e 16 e/ou uma sequência de cadeia pesada selecionada a partir de SEQ ID NOs: 13 e 14. Em determinadas realizações, o fragmento de anticorpo obtido a partir de anti-FoyRIlb compreende uma sequência de cadeia leve selecionada a partir de SEQ ID NOs: 11 e 12 e/ou uma sequência de cadeia pesada selecionada a partir de SEQ ID NOs: 9 e 10; e o fragmento de anticorpo obtido a partir de anti-FceRla compreende uma sequência de cadeia leve selecionada a partir de SEQ ID NOs: 15 e 16 e/ou uma sequência de cadeia pesada selecionada a partir de SEQ ID NOs: 13 e 14. Em ainda outro aspecto, o reticulador tio-reativo é selecionado a partir de haletos de bis-maleimido, haletos de bis-alquila, dissulfetos de pirídila, sais bis-mercuriais, reticulação mediada por ácido 5-tio-2-nitrobenzoico e bis- tiossulfonatos. Em uma realização, o reticulador é bis-maleimida. Em determinadas realizações, o primeiro fragmento de anticorpo e/ou o segundo fragmento de anticorpo são obtidos a partir de um anticorpo modificado por cisteina (cysteine-engineered antibody). Nessas determinadas realizações, o primeiro fragmento de anticorpo e/ou o segundo fragmento de anticorpos é um tio-Fab. Em determinadas realizações, o anticorpo modificado por cisteina compreende uma substituição de cisteina na posição 110 ou na posição 205 da cadeia leve, em que a numeração dos resíduos é de acordo com o sistema de numeração EU. Em determinadas realizações, o anticorpo modificado por cisteina compreende uma substituição de cisteína na posição 118 ou na posição 121 da cadeia pesada, em que a numeração dos resíduos é de acordo com o sistema de numeração EU. Em determinadas realizações, o primeiro fragmento de anticorpo e/ou o segundo fragmento de anticorpo é obtido a partir de um anticorpo nativo, em que o anticorpo nativo é digerido com pepsina para produzir um fragmento F(ab'), em que o fragmento F(ab'), é purificado e tratado com um agente de redução seguido por um agente de oxidação sob condições em que o dissulfeto entre a cadeia pesada e a cadeia leve de Fab é reformado e os resíduos de cisteína na região de dobradiça permanecem não oxidados.

Em outro aspecto, os métodos de sintetização de um análogo de anticorpo são proporcionados, em que um primeiro fragmento de anticorpo que tem um grupo sulfidrila livre é reagido com um reticulador tio-reativo para produzir uma porção fragmento de anticorpo-reticulador, e em que a porção fragmento de anticorpo-reticulador é reagida com um segundo fragmento de anticorpo que tem um grupo sulfidrila livre para produzir o análogo de anticorpo, e em que o primeiro fragmento de anticorpo e o segundo fragmento de anticorpo são obtidos a partir de um único anticorpo-pai. Em determinadas realizações, o análogo de anticorpo tem uma região de ligação de antígeno que difere estruturalmente da região de ligação de antígeno do anticorpo-pai. Em determinadas realizações, o anticorpo-pai é selecionado a partir de anti-Her1, anti-Her2, anti-FceRla e anti-FeyRIlb. Em determinadas realizações, o anti- Her2 é selecionado a partir de Herceptinê (trastuizumabe) e 2C4 (pertuzumabe). Em determinadas realizações, o anticorpo-pai é anti-Her2 e o primeiro fragmento de anticorpo e o segundo fragmento de anticorpo compreendem a mesma sequência de cadeia leve, em que a sequência de cadeia leve é selecionada a partir de SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 6 e 7 e/ou da mesma sequência de cadeia pesada, em que a sequência de cadeia pesada é selecionada a partir de SEQ ID NOs: 4, 5 e 8. Em determinadas realizações, o anti-Her1 é selecionado a partir de D1-5 e C3-101. Em determinadas realizações, o anticorpo-pai é anti-Her1 e o primeiro fragmento de anticorpo e o segundo fragmento de anticorpo compreendem a mesma sequência de cadeia leve, em que a sequência de cadeia leve é selecionada a partir de SEQ ID —NOs:18,19,21 e 22 e/ou da mesma sequência de cadeia pesada, em que a sequência de cadeia pesada é selecionada a partir de SEQ ID NOs: 17 e 20.

Em determinadas realizações, o anti-FoyRIlb é 5A6. Em determinadas realizações, o anticorpo-pai é anti-FeyRIlb e o primeiro fragmento de anticorpo e o segundo fragmento de anticorpo compreendem a mesma sequência de —cadeialeve, em que a sequência de cadeia leve é selecionada a partir de SEQ ID NOs: 11 e 12 e/ou da mesma sequência de cadeia pesada, em que a sequência de cadeia pesada é selecionada a partir de SEQ ID NO.: 9 € 10. Em determinadas realizações, o anti-FceRla é 22E7. Em determinadas realizações,

o anticorpo-pai é anti-FceRla e o primeiro fragmento de anticorpo e o segundo fragmento de anticorpo compreendem a mesma sequência de cadeia leve, em que a sequência de cadeia leve é selecionada a partir de SEQ ID NOs: 15 e 16 elou a mesma sequência de cadeia pesada, em que a sequência de cadeia pesada é selecionada a partir de SEQ ID NO.: 13 e 14. Em determinadas realizações, o anticorpo-pai é um anticorpo modificado por cisteina. Em determinadas realizações, o anticorpo-pai é um anticorpo nativo. Em um outro aspecto, os métodos de sintetização de um anticorpo multiespecífico ou análogo de anticorpo são proporcionados conforme acima, em que o reticulador é um reticulador modificado que compreende um grupo SH protegido. Em uma realização, o reticulador modificado é bis-maleimido-acetilacetato (BMata) Em determinadas realizações, o anticorpo multiespecífico ou análogo de anticorpo que compreende o reticulador modificado é, ainda, reagido com um agente que compreende um grupo funcional. Em determinadas realizações, o agente é selecionado a partir de polietileno glicol (PEG), peptídeo de ligação de albumina (ABP), um marcador fluorescente, um agente de radioimagem, um agente citotóxico e siRNA. Em determinadas realizações, o anticorpo multiespecífico ou análogo de anticorpo que compreende o reticulador “modificado é, ainda, reagido com PEG. Em determinadas realizações, o PEG é um PEG 2.000 mw (2K), um PEG 12.000 mw (12K), ou um PEG 20.000 mw (20K).

Em ainda outro aspecto, os métodos de sintetização de um painel dos anticorpos multiespecíficos são proporcionados, em que um primeiro fragmento de anticorpo obtido a partir de um primeiro anticorpo-pai que tem uma primeira monoespecificidade e um grupo suifidrila livre é reagido com um reticulador tio-reativo para produzir uma porção fragmento de anticorpo- reticulador, e em que a porção fragmento de anticorpo-reticulador é reagida por pares com cada um dentre dois ou mais fragmentos de anticorpos adicionais obtidos a partir de um ou mais anticorpos-pais de monoespecificidade diferente do primeiro anticorpo-pai, sendo que cada um tem um grupo sulfidrila livre,

para produzir um painel dos anticorpos multiespecíficos.

Em determinadas realizações, a porção fragmento de anticorpo-reticulador é reagida por pares com cada um dentre três ou mais fragmentos de anticorpos adicionais, ou cada um dentre quatro ou mais fragmentos de anticorpos adicionais, ou cada um dentre cinco ou mais fragmentos de anticorpos adicionais, ou cada um dentre dez ou mais fragmentos de anticorpos adicionais, ou cada um dentre 15 ou mais fragmentos de anticorpos adicionais, ou cada um dentre 20 ou mais fragmentos de anticorpos adicionais, ou cada um dentre 25 ou mais fragmentos de anticorpos adicionais, ou cada um dentre 50 ou mais fragmentos de anticorpos adicionais, ou cada um dentre 100 ou mais fragmentos de anticorpos adicionais, em cada caso obtido a partir de um ou mais anticorpos-

pais, ou dois ou mais anticorpos-pais, ou três ou mais anticorpos-pais, ou four ou mais anticorpos-pais, ou cinco ou mais anticorpos-pais, ou dez ou mais anticorpos-pais, ou 15 ou mais anticorpos-pais, ou 20 ou mais anticorpos-pais,

ou 25 ou mais anticorpos-pais, ou 50 ou mais anticorpos-pais, ou 100 ou mais anticorpos-pais, em cada caso de monoespecificidade diferente do primeiro

—anticorpo-pai Em determinadas realizações, o primeiro anticorpo-pai é selecionado a partir de anti-Her1, anti-Her2, anti-FceRla e anti-FeyRilb.

Em determinadas realizações, o primeiro fragmento de anticorpo é obtido a partir de antiHer2 e cada um dentre dois ou mais fragmentos de anticorpos adicionais é obtido a partir de anti-Her1, ou o primeiro fragmento de anticorpo é obtido a partir de antiHerl e cada um dentre dois mais fragmentos de anticorpos adicionais é obtido a partir de anti-Her2, ou o primeiro fragmento de anticorpo é obtido a partir de anti-FceRla e cada um dentre dois ou mais fragmentos de anticorpos adicionais é obtido a partir de anti-FeyRilb, ou o primeiro fragmento de anticorpo é obtido a partir de anti-FeyRIlb e cada um dentre dois ou mais fragmentos de anticorpos adicionais é obtido a partir de anti-FceRla.

Em determinadas realizações, o anti-Her2 é selecionado a partir de Herceptin& (trastuizumabe) e 2C4 (pertuzumabe) Em determinadas realizações, o antiHerl é selecionado a partir de D1-5 e C3-101. Em determinadas realizações, o anti-Her2 é selecionado a partir de trastuzumabe e pertuzumabe e o anti-Her1l é selecionado a partir de D1-5 e C3-101. Em determinadas realizações, o anti-FcyRIlb é 5A6. Em determinadas realizações, o anti-FceRla é 22E7. Em determinadas realizações, o anti-FoyRIlb é SAB e o antiFceRla é 22E7. Em determinadas realizações, o reticulador tio-reativo é selecionado a partir de haletos de bis-maleimido, haletos de bis-alquila, dissulfetos de piridila, sais bis-mercuriais, reticulação mediada por ácido 5-tio- 2-nitrobenzoico e bis-tiossulfonatos.

Em uma realização, o reticulador tio- reativo é bis-maleimida.

Em determinadas realizações, o primeiro fragmento de anticorpo e/ou cada um dentre dois ou mais fragmentos de anticorpos adicionais são obtidos a partir de um anticorpo modificado por cisteína.

Nessas determinadas realizações, o anticorpo modificado por cisteina compreende uma substituição na posição 110 ou na posição 205 da cadeia leve, em que a numeração dos resíduos é de acordo com o sistema de numeração EU, e em que a substituição é cisteina.

Em determinadas realizações, o anticorpo modificado por cisteína compreende uma substituição na posição 118 ou na posição 121 da cadeia pesada, em que a numeração dos resíduos é de acordo com o sistema de numeração EU, e em que a substituição é cisteína.

Em ainda outro aspecto, os métodos de sintetização de um painel —de análogos de anticorpos são proporcionados, em que um primeiro fragmento de anticorpo que tem um grupo sulfidrila livre é reagido com um reticulador tio- reativo para produzir uma porção fragmento de anticorpo-reticulador, e em que a porção fragmento de anticorpo-reticulador é reagida por pares com cada um dentre dois ou mais fragmentos de anticorpos adicionais, sendo que cada um tem um grupo sulfidrila livre, para produzir o painel de análogos de anticorpos,

em que cada um dentre os fragmentos de anticorpos são obtidos a partir de um único anticorpo-pai.

Em determinadas realizações, a porção fragmento de

—anticorpo-reticulador é reagida por pares com cada um dentre três ou mais fragmentos de anticorpos adicionais, ou cada um dentre quatro ou mais fragmentos de anticorpos adicionais, ou cada um dentre cinco ou mais fragmentos de anticorpos adicionais, ou cada um dentre dez ou mais fragmentos de anticorpos adicionais, ou cada um dentre 15 ou mais fragmentos de anticorpos adicionais, ou cada um dentre 20 ou mais fragmentos de anticorpos adicionais, ou cada um dentre 25 ou mais fragmentos de anticorpos adicionais, ou cada um dentre 50 ou mais fragmentos de anticorpos adicionais,

Em determinadas realizações, um ou mais dentre os análogos de anticorpos do painel tem uma região de ligação de antígeno que difere estruturalmente da região de ligação de antígeno do anticorpo-pai.

Em determinadas realizações, o anticorpo-pai é selecionado a partir de anti-Her1, anti-Her2, anti-FceRloa. e anti-FeyRIlb.

Em determinadas realizações, o anti- Her2 é selecionado a partir de trastuzumabe e pertuzumabe.

Em determinadas realizações, o antiHerl é selecionado a partir de D1-5 e C3-101. Em determinadas realizações, o anti-FoyRIlb é 5A6. Em determinadas realizações,

o anti-FceRla é 22E7. Em determinadas realizações, o reticulador tio-reativo é selecionado a partir de haletos de bis-maleimido, haletos de bis-alquila, dissulfetos de piridila, sais bis-mercuriais, reticulação mediada por ácido 5-tio-

—2-nitrobenzoico e bis-tiossulfonatos.

Em uma realização, o reticulador tio- reativo é bis-maleimida.

Em determinadas realizações, o anticorpo-pai é um anticorpo modificado por cisteina.

Nessas determinadas realizações, o anticorpo modificado por cisteina compreende uma substituição na posição 110 ou na posição 205 da cadeia leve, em que a numeração dos resíduos é de acordo com o sistema de numeração EU, e em que a substituição é cisteína. Em determinadas realizações, o anticorpo modificado por cisteína compreende uma substituição na posição 118 ou na posição 121 da cadeia pesada, em que —anumeração dos resíduos é de acordo com o sistema de numeração EU e em que a substituição é cisteína.

Em um outro aspecto, um anticorpo multiespecífico é proporcionado, sintetizado por um processo que compreende reagir um primeiro fragmento de anticorpo obtido a partir de um primeiro anticorpo-pai quetem uma primeira monoespecificidade e um grupo sulfidrila livre com um reticulador tio-reativo para produzir uma porção fragmento de anticorpo- reticulador e, então, reagir a porção fragmento de anticorpo-reticulador com um segundo fragmento de anticorpo obtido a partir de um segundo anticorpo-pai que tem uma segunda monoespecificidade e um grupo sulfidrila livre para produzir o anticorpo multiespecífico, e em que a primeira monoespecificidade é diferente da segunda monoespecificidade. Em determinadas realizações, o primeiro anticorpo-pai é selecionado a partir de anti-Her1 e anti-Her2. Em determinadas realizações, o primeiro anticorpo-pai é anti-Her2 e o segundo anticorpo-pai é anti-Her1 ou o primeiro anticorpo-pai é anti-Her1 e o segundo anticorpo-pai é antiHer2. Em determinadas realizações, o anti-Her2 é selecionado a partir de Herceptin& (trastuzumabe) e 2C4 (pertuzumabe). Em determinadas realizações, o primeiro anticorpo-pai é anti-Her2 e o primeiro fragmento de anticorpo compreende uma sequência de cadeia leve selecionada a partir de SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 6 e 7 e/ou uma sequência de cadeia pesada selecionada a partir de SEQ ID NOs: 4, 5 e 8. Em determinadas realizações, o anti-Herl é selecionado a partir de D1-5 e C3-101. Em determinadas realizações, o primeiro anticorpo-pai é anti-Her1 e o primeiro fragmento de anticorpo compreende uma sequência de cadeia leve selecionada a partir de SEQ ID NOs: 18, 19, 21 e 22 e/ou uma sequência de cadeia pesada selecionada a partir de SEQ ID NOs: 17 e 20. Em determinadas realizações, o anti-Her2 é selecionado a partir de trastuzumabe e pertuzumabe e o anti-Herl é selecionado a partir de D1-5 e C3-101. Em determinadas realizações, o fragmento de anticorpo obtido a partir de anti-Her2 compreende uma sequência de cadeia leve selecionada a partir de SEQ ID NOs: 1,2,3,6e 7 e/ou uma sequência de cadeia pesada selecionada a partir de SEQ ID NOs: 4,5 e 8; e o fragmento de anticorpo obtido a partir de anti-Her1 compreende uma sequência de cadeia leve selecionada a partir de SEQ ID NOs: 18, 19, 21 e226e/ouuma sequência de cadeia pesada selecionada a partir de SEQ ID NOs: 17 e 20.

Em um outro aspecto dos anticorpos multiespecíficos descritos acima, o primeiro anticorpo-pai é selecionado a partir de anti-FcyRllb e anti- FceeRla. Em determinadas realizações, o primeiro anticorpo-pai é anti-FeyRIlb e —osegundo anticorpo-pai é anti-FceRla ou o primeiro anticorpo-pai é anti-FceRlo e o segundo anticorpo-pai é anti-FcyRllb. Em determinadas realizações, o anti- FoyRIlb é 5A6. Em determinadas realizações, o primeiro anticorpo-pai é anti- FeyRIlb e o primeiro fragmento de anticorpo compreende uma sequência de cadeia leve selecionada a partir de SEQ ID NOs: 11 e 12 e/ou uma sequência de cadeia pesada selecionada a partir de SEQ ID NOs: 9 e 10. Em determinadas realizações, o anti-FceRlo é 22E7. Em determinadas realizações, o primeiro anticorpo-pai é anti-FceRla e o primeiro fragmento de anticorpo compreende uma sequência de cadeia leve selecionada a partir de SEQ ID NOs: 15 e 16 e/ou uma sequência de cadeia pesada selecionada a partir de —SEQIDNOs:13e 14. Em determinadas realizações, o fragmento de anticorpo obtido a partir de anti-FceyRIlb compreende uma sequência de cadeia leve selecionada a partir de SEQ ID NOs: 11 e 12 e/ou uma sequência de cadeia pesada selecionada a partir de SEQ ID NOs: 9 e 10; e o fragmento de anticorpo obtido a partir de anti-FceRla compreende uma sequência de cadeia leve selecionada a partir de SEQ ID NOs: 15 e 16 e/ou uma sequência de cadeia pesada selecionada a partir de SEQ ID NOs: 13 e 14. Em ainda outro aspecto, um anticorpo multiespecífico é proporcionado, sintetizado por um processo conforme descrito acima, em que o primeiro anticorpo-pai especificamente liga um alvo em uma célula Te o segundo anticorpo-pai especificamente liga um alvo em uma célula tumoral. Em determinadas realizações, o primeiro anticorpo-pai é anti-CD3 e o segundo anticorpo-pai é selecionado a partir de anti-BLR1, anti-BR3, anti-CD19, anti- CDZ20, anti-CD22, anti-CD72, anti-CD79A, anti-CD79B, anti-CD180, anti-CR2, anti-FCER2, anti-FcRH1, anti-FcRH2, anti-FcRH5, anti-FCRLA, anti-Her2, anti- HLA-DOB e anti-NAG14. Em uma realização, o primeiro anticorpo-pai é anti- CD3 e o segundo anticorpo-pai é anti-CD19. Em uma realização, o primeiro anticorpo-pai é anti-CD3 e o segundo anticorpo-pai é anti-CD20. Em uma realização, o primeiro anticorpo-pai é anti-CD3 e o segundo anticorpo-pai é anti-CD22. Em uma realização, o primeiro anticorpo-pai é anti-CD3 e o segundo anticorpo-pai é anti-FcRH5. Em uma realização, o primeiro anticorpo- pai é ant-CD3 e o segundo anticorpo-pai é anti-Her2. Em determinadas realizações, o anticorpo multiespecífico demonstra especificidade poliepitópica.

Em determinadas realizações, o anticorpo multiespecífico demonstra uma ou mais atividades biológicas indistinguíveis de cada um dentre os anticorpos- pais. Em determinadas realizações, o anticorpo multiespecífico demonstra uma ou mais atividades biológicas distinguíveis de pelo menos um dos anticorpos- pais.

Em outro aspecto, um análogo de anticorpo é proporcionado, sintetizado por um processo que compreende reagir um primeiro fragmento de anticorpo que tem um grupo sulfidrila livre com um reticulador tio-reativo para produzir uma porção fragmento de anticorpo-reticulador e, então, reagir a porção fragmento de anticorpo-reticulador com um segundo fragmento de anticorpo que tem um grupo sulfidrila livre para produzir o análogo de anticorpo, e em que o primeiro fragmento de anticorpo e o segundo fragmento de anticorpo são obtidos a partir de um único anticorpo-pai. Em determinadas realizações, o anticorpo-pai é selecionado a partir de anti-Her1, anti-Her2, anti- FceeRla e anti-FeyRIlb. Em determinadas realizações, o anti-Her2 é selecionado a partir de HerceptinO (trastuzumabe) e 2C4 (pertuzumabe). Em determinadas realizações, o anticorpo-pai é anti-Her2 e o primeiro fragmento de anticorpo e o segundo fragmento de anticorpo compreendem a mesma sequência de cadeia leve, em que a sequência de cadeia leve é selecionada a partir de SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 6 e 7 e/ou da mesma sequência de cadeia pesada, em que a sequência de cadeia pesada é selecionada a partir de SEQ ID NOs: 4, 5e 8.

Em determinadas realizações, o anti-Her1 é selecionado a partir de D1-5 e C3-

101. Em determinadas realizações, o anticorpo-pai é anti-Her1 e o primeiro fragmento de anticorpo e o segundo fragmento de anticorpo compreendem a mesma sequência de cadeia leve, em que a sequência de cadeia leve é selecionada a partir de SEQ ID NOs: 18, 19, 21 e 22 e/ou da mesma sequência de cadeia pesada, em que a sequência de cadeia pesada é selecionada a partir de SEQ ID NOs: 17 e 20. Em determinadas realizações, o anti-FcyRllb é S5A6. Em determinadas realizações, o anticorpo-pai é anti-FcyRllb e o primeiro fragmento de anticorpo e o segundo fragmento de anticorpo compreendem a mesma sequência de cadeia leve, em que a sequência de cadeia leve é selecionada a partir de SEQ ID NOs: 11 e 12 e/ou da mesma sequência de cadeia pesada, em que a sequência de cadeia pesada é selecionada a partir de SEQIDNO. 9e10. Em determinadas realizações, o anti-FceRla é 22E7. Em determinadas realizações, o anticorpo-pai é anti-FceRla e o primeiro fragmento de anticorpo e o segundo fragmento de anticorpo compreendem a mesma sequência de cadeia leve, em que a sequência de cadeia leve é selecionada a partir de SEQ ID NOs: 15 e 16 e/ou da mesma sequência de cadeia pesada, em que a sequência de cadeia pesada é selecionada a partir de SEQ ID NO.: 13 e 14. Em determinadas realizações, o anticorpo-pai é um anticorpo modificado por cisteína. Em determinadas realizações, o anticorpo- paié um anticorpo nativo. Em determinadas realizações, o análogo de anticorpo demonstra uma ou mais atividades biológicas indistinguíveis do anticorpo-pai. Em determinadas realizações, o análogo de anticorpo demonstra uma ou mais atividades biológicas distinguíveis do anticorpo-pai. Em determinadas realizações, a atividade biológica é proliferação celular. Em determinadas realizações, o análogo de anticorpo é um antagonista de células que expressam Her2 e o anticorpo-pai é HerceptinO&O (trastuzumabe). Nessas determinadas realizações, o análogo de anticorpo é selecionado a partir de bis- Fab 1324, bis-Fab 1328 e bis-Fab 1329. Em determinadas realizações, a atividade biológica do análogo de anticorpo é antagonística e a atividade biológica do anticorpo-pai é agonística. Em determinadas realizações, a atividade biológica do análogo de anticorpo é agonística e a atividade biológica do anticorpo-pai é antagonística. Em determinadas realizações, o análogo de anticorpo é um agonista de células que expressam Her2 e o anticorpo-pai é Herceptin& (trastuzumabe). Nessas determinadas realizações, o análogo de anticorpo é selecionado a partir de bis-Fab 1188, bis-Fab 1321, bis-Fab 1322, bis-Fab 1323 e bis-Fab 1325.

Em outro aspecto, as composições que compreendem um ou mais dentre os anticorpos multiespecíficos são proporcionadas. Em determinadas realizações, o um ou mais anticorpos multiespecíficos são selecionados a partir de bis-Fab 1187, bis-Fab 1189, bis-Fab 1190, bis-Fab 1191, bis-Fab 1192, bis-Fab 1193, bis-Fab 1299, bis-Fab 1300, bis-Fab 1301, bis-Fab 1302, bis-Fab1303, bis-Fab 1304, bis-Fab 1305, bis-Fab 1306 e bis- Fab 1307.

Em ainda outro aspecto, composições que compreendem um ou mais análogos de anticorpos são fornecidas. Em certas realizações, o um ou mais análogos de anticorpos são selecionados a partir de bis-Fab 1188, bis- Fab 1204, bis-Fab 1321, bis-Fab 1322, bis-Fab 1323, bis-Fab 1324, bis-Fab 1325, bis-Fab 1326, bis-Fab 1327, bis-Fab 1328, bis-Fab 1329, bis-Fab 1400 e bis-Fab 14017.

Em ainda outro aspecto, métodos para tratar câncer são fornecidos, em que uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo multiespecífico conforme descrito acima é administrada a um sujeito com necessidade de tratamento. Em certas realizações, o primeiro fragmento de anticorpo é anti-Her2 e o segundo fragmento de anticorpo é anti-Her1. Em certas realizações, o anti-Her2 é selecionado a partir de Herceptin& (trastuzumab) e 2C4 (pertuzumab). Em certas realizações, o anti-Her1l é selecionado a partir de D1-5 e C3-101. Em certas realizações, o primeiro fragmento de anticorpo é anti-CD3 e o segundo fragmento de anticorpo é selecionado a partir de anti-BLR1, anti-BR3, anti-CD19, anti-CD20, anti-CD22, anti-CD72, anti-CD79A, anti-CD79B, anti-CD180, anti-CR2, anti-FCER2, anti- FCcRH1, anti-FcRH2, anti-FcRHS5, anti-FCRLA, anti-Her2, anti-HLA-DOB, e anti- NAG14. Em uma realização, o primeiro fragmento de anticorpo é anti-CD3 e o segundo fragmento de anticorpo é anti-CD19. Em uma realização, o primeiro fragmento de anticorpo é anti-CD3 e o segundo fragmento de anticorpo é anti- CD20. Em uma realização, o primeiro fragmento de anticorpo é anti-CD3 e o segundo fragmento de anticorpo é anti-CD22. Em uma realização, o primeiro fragmento de anticorpo é anti-CD3 e o segundo fragmento de anticorpo é anti- —FcRH5. Em uma realização, o primeiro fragmento de anticorpo é anti-CD3 e o segundo fragmento de anticorpo é anti-Her2.

Em outro aspecto, métodos para destruir ou inibir a proliferação de células de tumor ou células cancerígenas são fornecidos,

sendo que compreendem tratar as células com uma quantidade de um anticorpo multiespecífico conforme descrito acima, ou um sal ou solvato farmaceuticamente aceitável do mesmo, sendo que a quantidade é eficaz para destruir ou inibir a proliferação das células de tumor ou células cancerígenas.

Ainda outros aspectos são fornecidos, os quais incluem métodos para tratar: uma doença autoimune; ou uma doença contagiosa que compreende administrar a um sujeito com necessidade do mesmo, uma quantidade eficaz de um anticorpo multiespecífico conforme descrito acima, ou umsalou solvato farmaceuticamente aceitável do mesmo.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 mostra o processo para síntese de bis-Fabs conforme descrito no Exemplo 1. Painel 1, remoção de tio-adutos por redução e oxidação; Painel 2, reação do primeiro tio-Fab ou dobradiça-cis- Fab com reticulador de bis-maleimido; Painel 3, isolamento da espécie monomérica que contém reticulador por cromatografia por exclusão de tamanho (SEC), inserção de painel; Painel 4, reação da espécie reticulada monomérica com o segundo tio-Fab ou dobradiça-cis-Fab, inserção de painel superior que mostra resultados de espectrometria em massa e isolamento do produto de 100 kd de bis-Fab, inserção de painel inferior que mostra isolamento do bis-Fab dimérico por SEC; Painel 5, desenho esquemático do produto de bis-Fab final, análise SDS-PAGE de dois bis- Fabs diferentes, aVEGF/aHer2 (1) e aVEGF/aVEGF (2) sob condições redutoras e não redutoras (+DTT).

A Figura 2 mostra a pureza e certas propriedades biológicas de certos bis-Fabs conforme descrito no Exemplo 2. (A) lado esquerdo, um esquema de certos bis-Fabs e uma tabela que fornece números de identificação de bis-Fab e a fonte de cada tio-Fab; lado direito, análise SDS-

PAGE não redutora dos bis-Fabs listados na tabela; (B) painel superior, inibição de fosforilação de EGFR estimulada por TGFa em células de NR-gD- EGFR por certos bis-Fabs que contêm Fabs derivados de anticorpos anti- EGFR; painel inferior, inibição de fosforilação de Her3 induzida por Heregulin em célulasdeMCF7 por certos bis-Fabs que contêm um Fab derivado de um anticorpo anti-Her2; (C) comparação das moléculas de bis-Fab e Fab indicadas nos crescimento de células de MDA-175; (D) comparação dos bis-Fab, Fab e moléculas de anticorpo indicados no crescimento de células de NR6-EGFR; (E) comparação de pertuzumab e do bis-Fab 1204 no crescimento de células de MDA-175; (F) comparação de trastuzumab, trastuzumab-Fab, e do bis-Fab 1188 no crescimento de células de BT474.

A Figura 3 mostra a produção e caracterização de variantes estruturais de bis-Fab derivados de trastuzumabe conforme descrito no Exemplo 3. (A) Representação esquemática de quatro Fabs derivados de trastuizumabe que mostram os pontos de pontos de tio-fixação (porção superior) e tabela que indica o identificador único para bis-Fab e a fonte de cada tio-Fab (porção inferior); (B) SDS-PAGE não redutora dos bis-Fabs; (C) efeito de bis-Fabs em concentrações variante em crescimento de célula de BTA474; (D) efeito de bis-Fab 1325 (barras listradas inclinadas para cima) em comparação com o anticorpo parental Herceptin& (trastuzumab) (barras abertas) em crescimento de célula de BT474 ao longo do tempo. barras listradas inclinadas para baixo, no tratamento.

A Figura 4 mostra uma análise de filtragem de gel dos bis-Fabs indicados, conforme descrito no Exemplo 3. Os momentos de retenção relativa (eixo horizontal) (RT) e raio hidrodinâmico (Rh) são indicados.

A Figura 5 mostra os resultados da análises da trajetória de sinalização para Her2 bis-Fabs e Herceptin& (trastuzumab) em células de BT474 conforme descrito no Exemplo 3. (A) análise ELISA de fosforilação de AKT em resposta ao tratamento com Herceptin& (trastuzumab), o bis-Fab 1325 agonista, o bis-Fab 1329 antagonista, ou gD; (B) análise por Western blot que sonda a o estado de fosforilação de certas enzimas de trajetória de sinalização de Her (HER3, AKT, e MAPK) em células de —BTA474 tratadas com HerceptinO (trastuzumab), o bis-Fab 1325 agonista, o bis-Fab 1329 antagonista, ou gD (pHER3, pAKT, pMAPK: anticorpos fosfoespecíficos ; HER3, AKT, MAPK: anticorpos não fosfoespecíficos; tubulina: controle); (C) a Tabela C de peptídeos fosforilados derivados de clivagem de tripsina de Her2. Os resíduos fosforilados de interesse em cada peptídeo são indicados por letras versalete pequenas em negrito e itálico na sequência de peptídeo.

A tabela também fornece análise de espectrometria em massa de fosforilação total de sítios de fosfopeptídeo em Her2 após o tratamento (basal), tratamento com Herceptin&O (trastuzumab), tratamento com o bis-Fab 1325 agonista (Bis-Fab), ou tratamento com 10 nm de Heregulin conforme quantificado pela quantificação absoluta (AQUA) ou por quantificação livre de marcadores.

Os dados representam o significado de três replicações técnicas e biológicas independentes e incluem o desvio padrão (SD); (D) a Tabela D abaixo lista os peptídeos sintéticos que contém átomos pesados usados para AQUA (peptídeos de AQUA); “+13C:” o número de átomos de carbono pesados na peptídeo de AQUA; “+15N:” o número de átomos de nitrogênio pesados no peptídeo de AQUA; “adicionar massa:” o aumento de massa total do peptídeo de AQUA sobre a massa do peptídeo natural; “MH+ monoisotópico pesado:"” massa total do peptídeo pesado na no estado — carregado unicamente; resíduos no peptídeo de AQUA que contém átomos pesados são indicados por letras maiúsculas, em negrito, itálico e sublinhadas; sítios de fosforilação no peptídeo de AQUA são indicados por letras em versalete, negrito e itálico;

Sítios de fosforilação são indicados ao longo do eixo horizontal do gráfico do fundo; diferenças em fosforilação de meio por cento são indicadas ao longo do eixo vertical em cada gráfico.

As Figuras 6A e 6B mostram o efeito de aumento de concentrações dos bis-Fabs indicados em liberação de histamina em células de RBL que expressam ambos FceRla e FeyRIlb conforme medido por ELISA conforme descrito no Exemplo 4. A Figura 7 mostra a síntese do reticulador modificado, BMata (A) eoesquema geral para a síntese de um bis-Fab peguilado (B) conforme descrito no Exemplo 5.

A Figura 8 mostra a análise SDS-PAGE (A) e a análise de filtragem de gel S-200 (B) de bis-Fab C3-101Y!*ºC/Herc Y'1 modificado para conter tamanhos variantes de PEG ou ABP conforme descrito no Exemplo 5.

A Figura 9 mostra análises farmacocinéticas de bis-Fab C3- 101Y!!C/Herc YO não modificado (nu) ou modificado para conter tamanhos variantes de PEG ou ABP seguindo administração para camundongos (A) ou ratos nus (B) conforme descrito no Exemplo 5.

A Figura 10 mostra análise de SDS-PAGE de 20K de PEG-bis- Fab 2C4”!!º/D1-5Y11% purificados (A) e um ensaio de inibição de crescimento de célula com o uso de células Calu3 (B) conforme descrito no Exemplo 5.

A Figura 11 mostra um experimento farmacocinético de 20K PEG- 2C4Y!1C/D1-5Y11% pis-Fab (ditioFab) em camundongos beges SCID conforme descrito no Exemplo 5. (A) Diagrama de concentração de soro contra tempo; (B) Diagrama de concentração de soro/dose contra tempo.

A Figura 12 mostra o efeito de 20K PEG- 2C4Y!1ºC/D1-5Y11% pjs- Fab e cada um dos anticorpos parentais, 2C4 e D1-5, em crescimento de célula de tumor em um modelo de camundongo de xenotransplante de Calu3 conforme descrito no Exemplo 5.

A Figura 13 mostra o efeito de 20K PEG- 2C4Y!1ºº/D1-5Y11% pjs- Fab e cada um dos anticorpos parentais, 2C4 e D1-5, em crescimento de célula de tumor em um modelo de camundongo de xenotransplante de Calu3, analisado quanto ao tempo que levou para o tumores duplicarem no tamanho

(2xVo) conforme descrito no Exemplo 5. (A) análise Kaplan-Meier; (B) análise unidirecional. A Figura 14 mostra o efeito de 20K PEG- 2C4Y!1ºC/D1-5Y11% pis. Fab e cada um dos anticorpos parentais, 2C4 e D1-5, em crescimento de célula de tumor em um modelo de camundongo de xenotransplante de Calu3, analisado quanto ao tempo que levou para o tumores atingirem um a volume de 1.500 mm? conforme descrito no Exemplo 5. (A) análise Kaplan-Meier; (B) análise unidirecional.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Referência será feita agora em detalhes a certas realizações da invenção, cujos exemplos são ilustrados nas estruturas e fórmulas anexas. Enquanto a invenção será descrita em conjunção com as realizações enumeradas, será compreendido que elas não têm a intenção de limitar a invenção àquelas realizações. Pelo contrário, a invenção tem a invenção de cobrir todas as alternativas, modificações e equivalentes, as quais podem ser incluídas dentro do escopo da presente invenção conforme definido pelas reivindicações. Um elemento versado na técnica reconhecerá muitos métodos e materiais semelhantes ou equivalentes àqueles descritos no presente documento, os quais podem ser usados na prática da presente invenção. À presente invenção não é limitada de forma alguma aos materiais e métodos descritos. A menos que definido em contrário, termos científicos e técnicos usados no presente documento têm o mesmo significa que compreendido —comumente por uma pessoa de habilidade comum na técnica para a qual essa invenção pertence. Singleton et al., Dictionary of Microbiology e Molecular Biology 2nd ed., J. Wiley & Sons (New York, N.Y. 1994); March, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms e Structure 4th ed., John Wiley &

Sons (New York, N.Y. 1992); e Janeway, C., Travers, P., Walport, M., Shlomchik (2001) Immunobiology, 5th Ed., Garland Publishing, New York fornece a uma pessoa versada na técnica com um guia geral para muitos dos termos usado no presente pedido.

DEFINIÇÕES Para propósitos de interpretar esse relatório descritivo, as seguintes definições se aplicarão e quando apropriado, os termos usados no singular também incluirão o plural e vice versa. No evento de que qualquer definição apresentada entre em conflito com qualquer documento incorporado presente documento a título de referência, a definição apresentada abaixo deverá controlar.

Quando nomes comerciais são usados no presente documento, os depositantes têm a intenção de incluir, de forma independente, a formulação de produto de nome comercial, o fármaco genérico, e o(s) ingrediente(s) —farmacêutico(s) ativo(s) do produto de nome comercial.

O termo "anticorpo" é usado no presente documento no senso mais amplo e se refere a qualquer molécula de imunoglobulina (Ig) que compreenda duas cadeias pesadas e duas cadeias leves, e qualquer fragmento, mutante, variante ou derivação dos mesmos, desde que exibam a atividade biológica desejada (por exemplo, atividade de ligação de epítopo), veja, por exemplo, Miller et al. Jour. of Immunology 170:4.854 a 4.861(2003). Exemplos de anticorpos incluem, mas não são limitados a, anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos, análogos de anticorpo, e fragmentos de anticorpo. Os anticorpos podem ser de murídeo, de humano, humanizados, quiméricos ou derivados de outras espécies.

Resíduos de anticorpo no presente documento são numerados de acordo com o sistema de numeração de Kabat e o sistema de número de EU. O sistema de numeração de Kabat é geralmente usado quando se refere a um resíduo no domínio variável (aproximadamente 1-107 resíduos da cadeia leve e 1-113 resíduos da cadeia pesada) (por exemplo, Kabat et al., Sequences of Immunological Interest. 5th Ed.

Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). O “sistema de numeração de EU” ou “índice de EU” é geralmente usado quanto se refere a um resíduo em uma região constante de cadeia pesada de imunoglobulina (por exemplo, o índice EU relatou em Kabat et al., supra). O “índice de EU como em Kabat” se refere à numeração de resíduo do anticorpo de EU IgG1 humana.

Salvo indicação em contrário no presente documento, as referência a números de resíduos no domínio variável de anticorpos significa numeração de resíduo pelo sistema de numeração de Kabat.

Salvo indicação em contrário no presente documento, referências a números de resíduo no domínio constante de anticorpos significa numeração de resíduo pelo sistema de numeração de EU.

O termo “anticorpo multiespecífico” é usado no presente documento no senso mais amplo e cobre, de forma específica, um anticorpo que tem especificidade poliepitópica.

Anticorpos multiespecíficos incluem, mas não são limitados a, um anticorpo que compreende um domínio variável de cadeia pesada (Vs) e um domínio variável de cadeia leve (V.), em que a unidade V"AV, tem especificidade poliepitópica, anticorpos que têm dois ou mais domínios VL e VH em que cada unidade V4V, se liga a um epítopo diferente, anticorpos que têm dois ou mais domínios variáveis únicos, em que cada domínio variável único se liga a um epítopo diferente, anticorpos de comprimento total, e anticorpos que compreendem um ou mais fragmentos de anticorpo bem como anticorpos que compreendem fragmentos de anticorpo que foi ligado de forma covalente ou não covalente.

De acordo com uma realização, o anticorpo multiespecífico é um anticorpo de IgG que se liga a cada epítopo com uma afinidade de 5 uM a 0,001 pM, 3 uM a 0.001 pM, 1 uM a

0,001 pM, 0,5 uM a 0,001 pM, ou 0,1 uM a 0,001 pM.

O termo “especificidade poliepitópica” refere-se à capacidade de um anticorpo multiespecífico de ligar, de forma específica dois ou mais epítopos diferentes no mesmo alvo ou em alvos diferentes.

Os termos “monoespecífico" e “monoespecificidade” referem-se à capacidade de um anticorpo para ligar somente um epítopo e cobrir, de forma específica, uma molécula alvo.

O termo “análogo de anticorpo” é usado no presente documento no senso mais amplo e cobre, especificamente, uma molécula que liga, especificamente, uma molécula alvo com monoespecificidade e que é estruturalmente diferente de um anticorpo nativo. Análogos de anticorpo podem compreender um ou mais fragmentos de anticorpo de um anticorpo nativo. Análogos de anticorpos incluem, mas não são limitados a, um análogo de anticorpo que compreende um domínio variável de cadeia pesada (V4) e um domínio variável de cadeia leve (V,), em que a unidade VV, é monoespecífica, sendo que os análogos de anticorpo têm dois ou mais domínios VL e VH em que cada unidade V4V, é monoespecífica para o mesmo epítopo, sendo que os análogos de anticorpos têm dois ou mais domínios variáveis únicos, em que cada domínio variável único se liga ao mesmo epítopo, análogos de anticorpo que compreendem um ou mais fragmentos de anticorpo, análogos de anticorpo que compreendem fragmentos de anticorpo que foram ligados de forma covalente ou não covalente, e análogos de anticorpo em que as unidades VuV, domínios variáveis únicos, e/ou fragmentos de anticorpo estão em uma configuração diferente daquela de anticorpos nativos.

Os “fragmentos de anticorpo” compreendem uma porção de um — anticorpo intacto, tipicamente a região de ligação de antígeno ou uma região variável do anticorpo intacto. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem, mas não são limitados a, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, diacorpos (Db); diacorpos em tandem (taDb), anticorpos lineares (veja Patente sob Nº U.S. 5.641.870,

Exemplo 2; Zapata et al., Protein Eng. 8(10):1.057 a 1.062 (1995)); anticorpos dotado de um braço, anticorpos de domínio variável único, minicorpos (Olafsen et al (2004) Protein Eng. Design & Sel. 17(4):315 a 323), moléculas de anticorpo de cadeia única, fragmentos produzidos por uma biblioteca de expressão de Fab, anticorpos anti-idiotípicos (anti-ld),) CDR (região de determinação complementar), e fragmento de ligação de epítopo.

O termo “Fab” refere-se a um fragmento de anticorpo que consiste em uma cadeia L inteira (V, e Ci) juntamente com o domínio de região variável da cadeia H (VH), e o primeiro domínio constante de uma cadeia pesada (CH1). A digestão de papaína de um anticorpo intacto pode ser usada para produzir dois fragmentos Fab, cada um dos quais contêm um sítio de ligação de antígeno único. Tipicamente, o fragmento de cadeia L e cadeia H do Fab produzido por digestão de papaína são ligados por uma ligação de dissulfeto de intercadeia.

O termo “Fc” refere-se a um fragmento de anticorpo que compreende as porções de terminal carbóxi de ambas as cadeias H (Chi2 e Cn3) e uma porção da região de dobradiça retida junta por ligações de dissulfeto. As funções efetoras de anticorpos são determinadas por sequências na região de Fc; essa região também é a parte reconhecida por receptores de Fc (FcR) encontrados em certos tipos de células. Um fragmento Fc pode ser obtido por digestão de papaína de um anticorpo intacto.

O termo “F(ab')y refere-se a um fragmento de anticorpo produzido por digestão de pepsina de um anticorpo intacto. Os fragmentos F(ab')2> contêm dois fragmentos Fab e uma porção da região de dobradiça —retidosjuntos por ligações de dissulfeto. Os fragmentos F(ab”), têm atividade de ligação de antígeno divalente e são capazes de reticular antígeno.

O termo Fab' refere-se a um fragmento de anticorpo que é o produto da redução de um fragmento F(ab'). Os fragmentos Fab' diferem dos fragmentos Fab por ter poucos resíduos adicionais no terminal carboxi do domínio CH1 que inclui uma ou mais cisteínas da região de dobradiça de anticorpo. Fab'-SH é a designação no presente documento para Fab', no qual o(s) resíduo(s) de cisteína dos domínios constantes sustenta(m) um grupo tiol livre.

O termo “região de dobradiça” refere-se à porção de um anticorpo que se estende de Glu216 a Pro230 de IgG1 humana (Burton, Molec. Immunol. 22:161-206 (1985)). Regiões de dobradiça de outros isotipos de IgG podem ser alinhadas com a sequência de IgG1 ao colocar o primeiro e último resíduos de cisteina, sendo que formam ligações S-S de intercadeia pesada nas mesmas posições.

O termo “Fv” refere-se a um fragmento de anticorpo que consiste em um dímero de um domínio de região variável de cadeia pesada e um domínio de região variável de cadeia leve em associação não covalente e firme. A partir da dobra desses dois domínios, emanam seis laços hipervariáveis (3 laços de cada uma das cadeias H e L) que contribuem com resíduos de aminoácido para ligação de antígeno e conferem especificidade de ligação de antígeno ao anticorpo. Entretanto, mesmo um domínio variável único (ou metade de um Fv que compreende somente três CDRs específicos para um antígeno) tem a capacidade de reconhecer e ligar o antígeno, embora, frequentemente em uma afinidade inferior à do sítio de ligação inteiro.

O termo “Fv de cadeia única”, também abreviado como “sFv” ou “scFv”, refere-se a fragmentos de anticorpo que compreendem os domínios de anticorpo V4 e V| conectados em uma cadeia de polipeptídeo única.

Tipicamente, o polipeptideo de scFv compreende, adicionalmente, um polipeptídeo ligante os domínios Vyy e V|, que habilitam o scFv para formar a estrutura desejada para ligação de antígeno. Para uma revisão de scFv, veja Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg e

Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269 a 315 (1994); Malmborg et al., J. Immunol. Methods 183:7 a 13, 1995. O termo “diacorpos" refere-se a fragmentos de anticorpo pequenos preparador ao construir fragmentos de scFv com ligantes curtos (tipicamente cerca de 5 a 10 resíduos) entre os domínios Vy e V|, de modo que o pareamento intercadeia, mas não intracadeia, dos domínios de V seja alcançado, sendo que resulta em um fragmento bivalente, isto é, fragmento que tem dois sítios de ligação de antígeno. Diacorpos biespecíficos são heterodímeros de dois fragmentos de sFv de “permutação” na qual os domínios VHe VW, dos dois anticorpos estão presentes em cadeias de polipeptídeo diferentes. Diacorpos exemplificativos são descritos em, por exemplo, EP 404,097; WO 93/11161; e Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6.444 a 6.448 (1993).

O termo “anticorpo dotado de um braço" refere-se a um anticorpo que compreende (1) um domínio variável unido por uma ligação de peptídeo a um polipeptídeo que compreende um domínio CH2, a domínio CH3 ou um domínio CH2-CH3 e (2) um segundo domínio CH2, CH3 ou CH2-CH3 que carece de um domínio variável. Anticorpos dotados de um braço podem compreender 3 polipeptídeos (1) um primeiro polipeptídeo que compreende um domínio variável (por exemplo, VH), CH1, CH2 e CH3, (2) um segundo polipeptídeo que compreende um domínio variável (por exemplo, VL) e um domínio CL, e (3) um terceiro polipeptídeo que compreende um domínio CH2 e CH3. Anticorpos dotados de um braço pode ter uma região de dobradiça parcial que contém dois resíduos de cisteina os quais foram ligações de —dissulfeto que liga as cadeias pesadas constantes. Tipicamente, os domínios variáveis do anticorpo dotado de um braço formam uma região de ligação de antígeno. Em certos casos, os domínios variáveis do anticorpo dotado de um braço são domínios variáveis únicos, em que cada domínio variável único é uma região de ligação de antígeno.

O termo “anticorpos de domínio único” (sdAbs) ou “anticorpos de domínio variável único (SVD)" refere-se a anticorpos nos quais um domínio variável único (VH ou VL) confere ligação de antígeno. Em outras palavras, o — domínio variável único não necessita interagir com outro domínio variável para reconhecer e ligar o antígeno alvo. Exemplos de anticorpos de domínio único incluem aqueles derivados de camelídeos (llamas e camelos) e peixes cartilaginosos (por exemplo, tubarões lixa) e aqueles derivados de métodos recombinantes de anticorpos de camundongo e humanos (Nature (1989) 341:544 a 546; Dev Comp Immunol (2006) 30:43 a 56; Trend Biochem Sci (2001) 26:230 a 235; Trends Biotechnol (2003):21:484 a 490; WO 2005/035572; WO 03/035694; Febs Lett (1994) 339:285 a 290; WO00/29004; WO 02/051870).

O termo “anticorpos lineares” refere-se aos anticorpos descritos em Zapata et al., Protein Eng. 8(10):1.057 a 1.062 (1995). Brevemente, esses anticorpos compreendem um par de segmentos Fd em tandem (V4-Ch1-Vy- Cn1) os quais, juntamente com polipeptídeos de cadeia leve complementares, formam um par de regiões de ligação de antígeno. Anticorpos lineares podem ser biespecífico ou monoespecífico.

O termo “anticorpo monoclonal”" refere-se a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, isto é, os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos, exceto por possíveis mutações de ocorrência natural que podem estar presente em quantidades menores. Anticorpos monocionais são altamente específicos, sendo que são direcionados contra um único sítio antigênico. Além disso, em contraste às preparações de anticorpo policlonal, as quais incluem anticorpos diferentes direcionados contra determinantes diferentes (epítopos), cada anticorpo monoclonal é direcionado contra um único determinante no antígeno.

Em adição a sua especificidade, os anticorpos monoclonais são vantajosos na medida em que eles podem ser sintetizados não contaminados por outros anticorpos. O modificador “monocional” indica que a natureza do anticorpo é obtida a partir de uma população substancialmente homogênea de anticorpos, e não deve ser interpretado como requerimento de produção do anticorpo por qualquer método particular. Por exemplo, os anticorpos monocionais a serem usados de acordo com a presente invenção podem ser feitos pelo método de hibridoma descrito primeiramente por Kohler et al (1975) Nature 256:495, ou pode ser feito por métodos de DNA recombinante (veja, por exemplo,: U.S. 4816567; U.S. 5807715). Os anticorpos monoclonais também podem ser isolados de bibliotecas de anticorpo de fago com o uso das técnicas descritas em Clackson et al (1991) Nature, 352:624 a 628; Marks et al (1991) J. Mol. Biol., 222:581 a 597; por exemplo.

Um “anticorpo intacto” refere-se a um anticorpo que compreende domínios VL e VH, bem como um domínio constante de cadeia leve (CL) e domínios constantes de cadeia pesada, CH1, CH2 e CH3. Os domínios constantes podem ser domínios constantes de sequência nativa (por exemplo, domínios constantes de sequência nativa humana) ou variante de sequência de aminoácido do mesmo. O anticorpo intacto pode ter uma ou mais “funções efetoras" as quais se referem àquelas atividades biológicas atribuíveis à região constante de Fc (uma região de Fc de sequência nativa ou região de Fc de variante de sequência de aminoácido) de um anticorpo. Exemplos de funções efetoras de anticorpo incluem ligação de C1qg; citotoxicidade dependente de complemento; ligação de receptor de Fc; citotoxicidade mediada por célula —dependente de anticorpo (ADCC); fagocitose; e regulação baixa de receptores de superfície de célula tal como receptor de célula B. Dependendo da sequência de aminoácido do domínio constante de suas cadeias pesadas, anticorpo intactos podem ser designados para

“classes” diferentes. Existem cinco classes principais de anticorpos de imunoglobulina intactos: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM, e diversos desses podem ser divididos, adicionalmente, em “subclasses” (isotipos), por exemplo, IgG1, 1g9G2, I19G3, IgG4, IgA, e IgA2. Os domínios constantes de cadeia pesada que — correspondem às classes diferentes de anticorpos são chamados de a, d, e, ye h, respectivamente. As estruturas de subunidade e configurações tridimensionais de classes diferentes de imunoglobulinas são bem conhecidas. Formas de lg incluem formas sem dobradiça ou de modificações em dobradiça (Roux et al (1998) J. Immunol. 161:4.083 a 4.090; Lund et al (2000) Eur. J.

—Biochem. 267:7.246 a 7.256; US 2005/0048572; US 2004/0229310). Um “receptor ErbB" é uma tirosina quinase de proteína receptora a qual pertence à família de receptor ErbB cujos membros são mediadores importantes de crescimento, diferenciação e sobrevivência de célula. A família de receptor ErbB inclui quatro membros distintos que inclui receptor de fator de crescimento epidermal (EGFR, ErbB1, HER1), HER2 (ErbB2 ou p185neu), HER3 (ErbB3) e HER4 (ErbB4 ou tyro2). Um painel de anticorpos anti-ErbB2 foi caracterizado com o uso da linha de célula de tumor de mama humana SKBR3 (Hudziak et al (1989) Mol. Cell. Biol. 9(3): 1165-1172. A inibição máxima foi obtida com o anticorpo chamado de 4D5 o qual inibiu proliferação celular por 56%. Outros anticorpos no painel reduziram proliferação celular a uma extensão menor neste ensaio. Foi observado, adicionalmente, que o anticorpo 4D5 sintetiza linhas de célula de tumor de mama superexpressas por ErbB2 aos efeitos citotóxicos de TNF-a (Patente sob nº U.S. 5.677.171). Os anticorpos anti-ErbB2 discutidos em Hudziak et al. são caracterizados — adicionalmente em Fendly et al (1990) Cancer Research 50:1.550 a 1.558; Kotts et al. (1990) In Vitro 26(3):59A; Sarup et al. (1991) Growth Regulation 1:72 a 82; Shepard et al. J. (1991) Clin. Immunol. 11(3):117-127; Kumar et al. (1991) Mol. Cell. Biol. 11(2):979 a 986; Lewis et al. (1993) Cancer Immunol.

Immunother. 37:255 a 263; Pietras et al. (1994) Oncogene 9:1.829 a 1.838; Vitetta et al. (1994) Cancer Research 54:5.301 a 5.309; Sliwkowski et al. (1994) J. Biol. Chem. 269(20):14.661 a 14.665; Scott et al. (1991) J. Biol. Chem. 266:14300-5; D'souza et al. Proc. Natl. Acad. Sci. (1994) 91:7.202 a 7.206; Lewisetal (1996) Cancer Research 56:1.457 a 1.465; e Schaefer et al. (1997) Oncogene 15:1.385 a 1.394.

O receptor ErbB irá geralmente compreender um domínio extracelular, que pode ligar um ligante ErbB; um domínio de transmembrana lipofílica; um domínio tirosina quinase intracelular conservado; e a domínio de sinalização carboxila-terminal que hospeda diversos resíduos de tirosina que podem ser fosforilada. O receptor ErbB pode ser um receptor ErbB de “sequência nativa” ou uma “variante de sequência de aminoácido” dos mesmos. Diversos membros da família do receptor ErbB são conhecidos e incluem EGFR (ErbB1, HER1), ErbB2 (HER2), ErbB3 (HER3), e ErbB4 (HER4).

Os termos “ErbB1”, “receptor de fator de crescimento epidérmico”, “"EGFR” e “"HER1” são usados intercaladamente no presente documento e se referem a EGFR como revelado, por exemplo, em Carpenter et al (1987) Ann. Rev. Biochem., 56:881 a 914, que inclui formas mutantes de ocorrência natural dos mesmos (por exemplo, EGFR mutante de deleção como em Humphrey et al(1990) Proc. Nat. Acad. Sci. (EUA) 87:4.207 a 4.211). O termo erbB1 refere- se ao gene que encodifica o produto de proteína EGFR. Anticorpos contra HER1 são descritos, por exemplo, em Murthy et al (1987) Arch. Biochem. Biophys., 252:549 a 560 e em WO 95/25167.

O termo "ERRP", "proteína relacionada ao receptor EGF”, "Proteína relacionada a EGFR" e "proteína relacionada a receptor de fator de crescimento epidérmico" são usados intercaladamente no presente documento e se referem a ERRP como revelado, por exemplo em Patente de Nº U.S.

6.399.743 e Publicação de Nº U.S. 2003/0096373.

Os termos “ErbB2” e “HER2” são usados intercaladamente no presente documento e se referem à proteinaHER2 humana descritas, por exemplo, em Semba et al (1985) Proc. Nat. Acad. Sci. (EUA) 82:6.497 a 6.501 e Yamamoto et al (1986) Nature, 319:230 a 234 (Número de acesso ao —GenBank X03363). O termo “erbB2" refere-se ao gene que encodifica ErbB2 humano e “neu” refere-se ao gene que encodifica p185neu de rato.

Os termos “ErbB3” e “HER3” são usados intercaladamente no presente documento e se referem ao polipeptídeo receptor como revelado, por exemplo, em Patentes de Nº U.S. 5.183.884 e 5.480.968, bem como em Kraus etal(1989) Proc. Nat Acad. Sci. (EUA) 86:9.193 a 9.197. Anticorpos contra ErbB3 são conhecidos na técnica e são descritos, por exemplo, em Patentes de Nº U.S. 5.183.884, 5480968 e em WO 97/35885.

Os termos “ErbB4" e “HER4” são usados intercaladamente no presente documento e se referem ao polipeptídeo receptor como revelado, por exemplo, em Pedido de Patente Nº EP 599.274; Plowman et al (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:1.746 a 1.750; e Plowman et al (1993) Nature 366:473 a 475, que inclui isoformas dos mesmos, por exemplo, como revelado em WO 99/19488. Anticorpos contra HER4 são descritos, por exemplo, em WO 02/18444.

Anticorpos para receptor ErbB estão comercialmente disponíveis a partir de várias fontes, que inclui, por exemplo, Santa Cruz Biotechnology, Inc., Califórnia, EUA.

O termo “variante de sequência de aminoácido” refere-se a polipeptídeos que têm sequências de aminoácido que se diferem de alguma extensão de um polipeptídeo de sequência nativa. Geralmente, variantes de sequência de aminoácido possuirão pelo menos cerca de 70% de identidade de sequência com pelo menos um domínio de ligação de receptor de um ligante ErbB nativo ou com pelo menos um domínio de ligação de ligante de um receptor ErbB nativo, ou eles serão de pelo menos cerca de 80%, ou pelo menos cerca de 90% homólogos por sequência com tal domínio de ligação de receptor ou de ligantes. Os variantes de sequência de aminoácido possuem substituições, deleções, e/ou inserções em determinadas posições na — sequência de aminoácido da sequência de aminoácido nativa. Aminoácidos são projetados pelos nomes convencionais, códigos de uma letra e três letras. “Identidade de sequência” é definida como a porcentagem de resíduos no variante de sequência de aminoácido que são idênticos após alinhar as sequências e introduzir vãos, se necessário, para alcançar a identidade de sequência de porcentagem máxima. Métodos e programas de computador para o alinhamento são bem conhecidos na técnica. Tal programa de computador é “Alinhamento 2", escrito por Genentech, Inc., que foi depositado com documentação de usuário no Escritório de Direitos Autorais dos Estados Unidos, Washington, DC 20559, em 10 de Dezembro de 1991.

“Citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo” e "ADCC” se referem a uma reação mediada por célula em que células citotóxicas inespecíficas que expressam receptores Fc (FcRs) (por exemplo, células assassinas naturais (NK), neutrófilos, e macrófagos) reconhecem anticorpos de ligação em uma célula alvo e subsequentemente causam lise da célula alvo. As células primárias para mediar ADCC, células NK, expressam FcyRIll apenas, enquanto que monócitos expressam a expressão FcyRl, FeyRII e FeyRIll. FcR em células hematopoéticas em resumo está na Tabela 3 na página 464 de Ravetch e Kinet, (1991) “Annu. Rev. Immunol.” 9:457 a 92. Para acessar a atividade ADCC de uma molécula de interesse, um ensaio de ADCC in vitro, tal como descrito nas Patentes de Nº U.S. 5.500.362 e

5.821.337 pode ser executado. Células efetoras úteis para tais ensaios incluem células mononucleares de sangue periférico (PBMC) e células assassinas naturais (NK). Alternativamente, ou adicionalmente, a atividade ADCC da molécula de interesse pode ser avaliada em vivo, por exemplo, em a modelo de animal tal como revelado em Clynes et al., Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

USA 95:652 a 656 (1998). “Células efetoras humanas” são leucócitos que expressam um ou mais receptores de região constante (FCcRs) e executam funções efetoras.

Tipicamente, as células efetoras expressam pelo menos FcyRIl! e executam função efetora ADCC.

Exemplos de leucócitos humanos que mediam ADCC incluem células mononucleares de sangue periférico (PBMC), células assassinas naturais (NK), monócitos, células T citotóxicas e neutrófilas.

As células efetoras podem ser isoladas de uma fonte nativa dos mesmos, por exemplo, de sangue ou PBMCs.

Os termos "receptor Fc" ou “FcR” são usados para descrever um receptor que se liga à região constante de Fc de um anticorpo.

Tipicamente, FcR é um que liga um anticorpo IgG (um receptor gama) e inclui receptores das —subclasses FcyRI, FeyRIl, e Fey RIIl, que incluem variantes alélicos e formas alternativamente unidas desses receptores. receptores FcyRII incluem FeyRIIA (um “receptor de ativação”) e FcyRIIB (um “receptor de inibição”), que tem sequências de aminoácido semelhantes que diferem primariamente nos domínios citoplasmáticos dos mesmos.

Receptor FCyRIIA de ativação contém um motivo de ativação com base em tirosina imunorreceptora (ITAM) em seu domínio citoplasmático.

Receptor FCyRIIB de inibição contém um motivo de inibição com base em tirosina imunorreceptora (ITIM) em seu domínio citoplasmático. (Consulte revisão M. em Daêron, “Annu.

Rev.

Immunol.” 15:203 a 234 (1997)). FcRs são revisados em Ravetch e Kinet, “Annu.

Rev.

Immunol”., 9:457a92(1991); Cape! et al (1994) Immunomethods 4:25-34; e de Haas et al (1995) J.

Lab.

Clin.

Med. 126:330 a 41. Outros FcRs são abrangidos pelo termo “FcR" no presente documento.

O termo também inclui o receptor neonatal, FeRn, que é responsável pela transferência de IgGs maternais para o feto

(Guyer et al (1976) J. Immunol., 117:587 e Kim et al (1994) J. Immunol. 24:249).

“Citotoxicidade dependente de complemento” ou “CDC” refere-se à habilidade de uma molécula para causar lise um alvo na presença de — complemento. A trajetória de ativação de complemento é iniciada pela ligação do primeiro componente do sistema de complemento (C1g9) para uma molécula (por exemplo, um anticorpo) complexada com um antígeno cognato. Para acessar ativação de complemento, um ensaio CDC, por exemplo, como descrito em Gazzano-Santoro et al J. Immunol. Methods, 202:163 (1996), pode ser executado. O termo “anticorpo nativo” refere-se a um unidade de anticorpo de 4 cadeias básica de ocorrência natural que é uma glicoproteina heterotetramérica composta de duas cadeias leves (L) idênticas e duas cadeias pesadas (H) idênticas (um anticorpo IgM consiste em 5 das unidades heterotetraméricas básicas junto com um polipeptídeo adicional chamado de cadeia J, e contendo assim, 10 sítios de ligação de antígeno, enquanto anticorpos IgA segregados podem polimerizar para formar montagens polivalentes que compreendem de 2 a 5 das unidades de 4 cadeias básicas junto com a cadeia J). No caso de IgGs, a unidade de 4 cadeias é geralmente de cerca de 150.000 Daltons. Cada cadeia L é ligada a uma cadeia H por uma ligação de dissulfeto covalente, enquanto as duas cadeias H são ligadas uma à outra por uma ou mais ligações de dissulfeto que dependem do isótipo de cadeia H. Cada cadeia H e L também tem pontes de dissulfeto de intracadeia espaçadas regularmente. Cada cadeia H tem, no N-terminal, um domínio variável (VH) seguido por três domínios constantes (CH) para cada uma das cadeias a e y e quatro domínios Cy para isótipos 1 e e. Cada cadeia L tem, no N-terminal, um domínio variável (Vy) seguido por um domínio constante (CL) em sua outra extremidade. O Vy é alinhado com o Vy e o Cj é alinhado com o primeiro domínio constante da cadeia pesada (CH1). Resíduos de aminoácido particulares são considerados para formar uma interface entre domínios variáveis de cadeia leve e de cadeia pesada. O emparelhamento de um Vy e VL juntos forma um sítio de ligação de antígeno único. Para a estrutura e propriedades das diferentes classes de anticorpos, consulte, por exemplo, Basic e Clinical Immunology, 8º edição, Daniel P. Stites, Abba |. Terr e Tristram G. Parslow (eds.), Appleton & Lange, Nonvalk, CT, 1994, página 71 e Capítulo

6. A cadeia L de qualquer espécie vertebrada pode ser designada para um de dois tipos claramente distintos, chamados de kappa e lambda, com base nas sequências de aminoácido de seus domínios constantes.

O termo “variável” refere-se ao fato de que determinadas porções dos domínios variáveis diferem extensivamente em sequência dentre anticorpos e são usados na ligação e especificidade de cada anticorpo particular para seu antígeno particular. Contudo, a variabilidade não é uniformemente distribuída por todos os domínios variáveis de anticorpos. É concentrada em três segmentos chamados de regiões hipervariáveis tanto em domínio variáveis de cadeia leve quanto de cadeia pesada. As porções mais altamente conservadas de domínios variáveis são chamadas das regiões de arcabouço (FRs). Os domínios variáveis de cadeias pesada e leve nativa, compreendem, cada um, quatro FRs, que adotam amplamente uma configuração de B-lâmina, conectada por três regiões hipervariáveis, que formam laços que conectam, e em alguns casos formam parte da estrutura de B-lâmina. As regiões hipervariáveis em cada cadeia são mantidas juntas em proximidade de FRs e, com as regiões hipervariáveis da outra cadeia, contribuindo para a formação do sítio de ligação de antígeno de anticorpos (consulte, Kabat et al (1991) Sequences of Protens of Immunological Interest, 5º Edição,. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD). Os domínios constantes não estão envolvidos diretamente em ligar um anticorpo a um antígeno, mas exibem várias funções efetoras, tal como participação do anticorpo em citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC). O termo “região hipervariável”, “HVR”, ou “HV”, refere-se às regiõêes de um domínio variável de anticorpo que são hipervariáveis em sequência e/ou formam laços definidos estruturalmente. Geralmente, anticorpos compreendem seis HVRs; três no VH (H1, H2, H3), e três no VL (L1, L2, L3). Em anticorpos nativos, H3 e L3 exibem a maior diversidade das seis HVRs, e H3 em particular é acreditado representar um único papel em conferir especificidade boa a anticorpos. Consulte, por exemplo, Xu et al., Immunity 13:37 a 45 (2000); Johnson and Wu, em Methods in Molecular Biology 248:1 a 25 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003). De fato, anticorpos camélidos de ocorrência natural que consistem em uma cadeia pesada apenas são funcionais e estáveis na falta de cadeia leve. Consulte, por exemplo, Hamers- Casterman et al., Nature 363:446 a 448 (1993); Sheriff et al., Nature Struct. Biol. 3:733 a 736 (1996).

Vários delineamentos de HVR estão em uso e são abrangidos no presente documento. As regiões determinantes de complementaridade de kabat (CDRs) são baseadas em variabilidade de sequência e são as mais comumente usadas (Kabat et al., Sequences de Proteínas de Immunological Interest, 5º Edição, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Chothia refere-se em vez disso, à localização dos laços estruturais (Chothia e Lesk J. Mol. Biol. 196:901 a 917 (1987)). HVRs de ADM representam um compromisso entre as HVRs de Kabat e laços estruturais de —Chothia, e são usadas pelo software de modelagem de anticorpos de Abm de Oxford Molecular. As HVRs de “contato” são com baseadas em uma análise das estruturas de cristal complexas disponíveis. Os resíduos de cada uma dessas HVRs são notados abaixo.

Laço Kabat ADM Chothia Contato [ L24-L34 L24-L34 L26-L32 L30-L36 L2 L50-L56 L50-L56 L50-L52 L46-L55 L3 L89-L97 L89-L97 L91-L96 L89-L96 H1 H31-H35B H26-H35B H26-H32 H30-H35B (Numeração de Kabat) H1 H31-H35 H26-H35 H26-H32 H30-H35 (Numeração de Chothia) H2 H50-H65 H50-H58 H53-H55 H47-H58 H3 H95-H102 H95-H102 H9g6-H101 H93-H101 HVRs podem compreender “HVRs estendidas” como a seguir: 24- 36 ou 24-34 (L1), 46-56 ou 50-56 (L2) e 89-97 ou 89-96 (L3) no VL e 26-35 (H1), 50-65 ou 49-65 (H2) e 93-102, 94-102, ou 95-102 (H3) no VH. Os resíduos de domínio variável são numerados de acordo com Kabat et al, supra, para cada uma dessas definições.

“Regiões de arcabouço” (FR) são aqueles resíduos de domínio variável diferentes dos resíduos de CDR. Cada domínio variável tipicamente tem quatro FRs identificadas como FR1, FR2, FR3, e FR4. Se as CDRs são definidas de acordo com Kabat, os resíduos FR de cadeia leve são posicionados em cerca de resíduos 1-23 (LCFR1), 35-49 (LCFR2), 57-88 (LCFR3), e 98-107 (LCFR4) e os resíduos FR de cadeia pesada são posicionados em cerca de em resíduos 1-30 (HCFR1), 36-49 (HCFR2), 66-94 (HCFR3), e 103-113 (HCFR4) nos resíduos de cadeia pesada. Se as CDRs compreendem resíduos de aminoácido de laços hipervariáveis, os resíduos FR de cadeia leve são posicionados em cerca de em resíduos 1 a 25 (LCFR1), 33 a 49 (LCFR2), 53 a 90 (LCFR3), e 97 a 107 (LCFR4) nos resíduos FR de cadeia leve e de cadeia pesada são posicionados cerca de em resíduos 1-25

(HCFRI), 33 a 52 (HCFR2), 56 a 95 (HCFR3), e 102 a 113 (HCFR4) nos resíduos de cadeia pesada. Em alguns casos, quando a CDR compreende aminoácidos tanto de a CDR como definido por Kabat quanto aqueles de um laço hipervariável, os resíduos FR serão ajustados consequentemente. Por exemplo, quando CDRH1 inclui aminoácidos H26-H35, os resíduos FR1 de cadeia pesada estão em posições 1 a 25 e os resíduos FR2 estão nas posições 36 a 49.

Um “arcabouço consenso humano” é um arcabouço que representa os resíduos de aminoácido de ocorrência mais comum em uma seleção de sequências de arcabouço VL ou VH de imunoglobulina humana.

Geralmente, a seleção de sequências VL ou VH de imunoglobulina humana é de um subgrupo de sequências de domínio variável. Geralmente, o subgrupo de sequências é um subgrupo como em Kabat. Em determinados exemplos, para o VL, o subgrupo é subgrupo kappa | como em Kabat. Em determinados exemplos, para o VH, o subgrupo é o subgrupo Il! como em Kabat.

“Anticorpos quiméricos" referem-se a anticorpos em que uma porção da cadeia pesada e/ou leve é idêntica, ou homóloga às sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma espécie particular ou pertencente a uma classe ou subclasse de anticorpo particular, enquanto o restante da cadeia(s) é idêntico, ou homólogo às sequências correspondentes a anticorpos derivados de outras espécies ou pertencentes a outra classe ou subclasse de anticorpo, bem como fragmentos de tais anticorpos, é fornecido que eles exibem a atividade biológica desejada (Patente de Nº U.S. 4.816.567; e Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6.851 a 6.855 (1984)).

Anticorpos quiméricos incluem anticorpos primatizados que compreendem sequências de ligação de antígeno de domínio variável derivadas de um primata não humano (por exemplo, Old World Monkey, Ape, etc.) e sequências de região constante humana.

Formas “humanizadas” de anticorpos não humanos (por exemplo, roedor) são anticorpos quiméricos que contêm sequência mínima derivada do anticorpo não humano. Para a maior parte, anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo recipiente) em que resíduos de uma região hipervariável do recipiente são substituídos por resíduos de uma região hipervariável de uma espécie não humana (anticorpo doador) tal como camundongo, rato, coelho ou primata não humano que tem a especificidade, afinidade, e capacidade de anticorpo desejada. Em alguns casos, resíduos de região de arcabouço (FR) da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos não humanos correspondentes. Além disso, anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não são encontrados no anticorpo recipiente ou no anticorpo doador. Essas modificações são feitas para refinar desempenho de anticorpo. Em geral, o anticorpo humanizado irá compreender substancialmente todos de pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, em que todos ou substancialmente todos os laços hipervariáveis correspondem àqueles de uma imunoglobulina não humana e todos ou substancialmente todas as FRs são aquelas de uma sequência de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado opcionalmente também irá compreender pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente de uma imunoglobulina humana. Para detalhes adicionais, consulte Jones et al, Nature 321:522 a 525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323 a 329 (1988); e Presta, Curr. Op. Struct. Biol.

2:593 a 596 (1992). “Complexo” ou “complexado”, como usado no presente —documento, refere-se à associação de duas ou mais moléculas que interagem umas com as outras através de ligações e/ou forças (por exemplo, forças de Van der waals, hidrofóbicas, hidrofílicas) que não são ligações de peptídeo. Em determinados exemplos, o complexo é heteromultimérico. Deve ser entendido que o termo “complexo de proteína” ou “complexo de polipeptídeo”, como usado no presente documento, inclui complexos que têm uma entidade de não proteína conjugada a uma proteína no complexo de proteína (por exemplo, que inclui, mas não está limitada a, moléculas químicas tais como uma toxina, —reticulador, ou um agente de detecção).

O termo “heteromultímero” ou “heteromultimérico”, como usado no presente documento, descreve dois ou mais polipeptídeos que interagem uns com os outros por a ligação covalente não peptídica (por exemplo, ligação de dissulfeto) e/ou uma interação não covalente (por exemplo, ligações de hidrogênio, ligações iônicas, forças de Van der Waals, e interações hidrofóbicas), em que pelo menos dois dos polipeptídeos têm diferentes sequências de aminoácido um do outro.

Um anticorpo “que liga" um alvo molecular ou um antígeno de interesse é um capaz de ligação a antígeno com suficiente afinidade de forma que o anticorpo seja útil em direcionar uma proteína ou uma célula ou tecido que expressa o antígeno, e não reagem de forma cruzada significantemente com outras proteínas. Tais anticorpos são úteis, por exemplo, como agentes diagnósticos e/ou terapêuticos e/ou ferramentas de pesquisa. Tipicamente, a extensão de ligação do anticorpo a uma proteína “não alvo” será de menos do que cerca de 10% da ligação do anticorpo a sua proteína alvo particular como determinado por métodos de medida típicos, por exemplo, ordenação de células ativadas por fluorescência (FACS) análise ou radioimunoprecipitação (RIA) ou ELISA.

O termo “ligação específica" ou “liga especificamente a” ou é “específica para” referem-se à ligação de um anticorpo a uma molécula alvo, por exemplo, um polipeptídeo particular ou um epítopo em um polipeptídeo alvo particular, e significa ligação que é diferente de forma mensurável de uma interação não específica (por exemplo, uma interação não específica pode ser ligação para albumina de soro bovino ou de caseína). A ligação específica pode ser medida, por exemplo, por determinar a ligação de uma molécula alvo comparada à ligação de uma molécula de controle.

Por exemplo, a ligação específica pode ser determinada por competição com uma molécula de controle que é semelhante ao alvo, por exemplo, um excesso de alvo não identificado.

Nesse caso, a ligação específica é indicada se a ligação do alvo identificado a uma sonda é inibida de maneira competitiva por alvo não identificado em excesso.

O termo “ligação específica” ou “ligar especificamente a" ou é “específica para" um polipeptídeo particular ou um epítopo em um polipeptídeo alvo particular, como usado no presente documento, pode ser exibido, por exemplo, por uma molécula que têm um Kd para o alvo de pelo menos cerca de 200 nM, alternativamente pelo menos cerca de 150 nM, alternativamente pelo menos cerca de 100 nM, alternativamente pelo menos cerca de 60 nM, alternativamente pelo menos cerca de 50 nM, alternativamente pelomenos cerca de 40 nM, alternativamente pelo menos cerca de 30 nM, alternativamente pelo menos cerca de 20 nM, alternativamente pelo menos cerca de 10 nM, alternativamente pelo menos cerca de 8 nM, alternativamente pelo menos cerca de 6 nM, alternativamente pelo menos cerca de 4 nM, alternativamente pelo menos cerca de 2 nM, alternativamente pelo menos cerca de 1 nM, ou maior.

Em determinados exemplos, o termo “ligação específica” refere-se à ligação onde uma molécula se liga a um polipeptídeo particular ou epítopo em um polipeptídeo particular sem substancialmente ligar a qualquer outro polipeptídeo ou epítopo de polipeptídeo.

Exemplos de moléculas alvo incluem, mas não estão limitados a, proteínas solúveis de soro e seus receptores, tais como citocinas e receptores de citocina, adesinas, fatores de crescimento e seus receptores, hormônios, partículas virais (por exemplo, proteína F de RSV, CMV, StaphA, gripe, vírus da hepatite C), micro- organismos (por exemplo, proteínas de célula bacteriana, células fúngicas),

adesinas, proteínas CD e seus receptores.

“Afinidade de ligação” refere-se à resistência da soma total de interações não covalentes entre um sítio de ligação única de uma molécula (por exemplo, um anticorpo) e seu parceiro de ligação (por exemplo, um antígeno).

A menos que indicado de outra forma, como usado no presente documento, “afinidade de ligação” refere-se a afinidade de ligação intrínseca que reflete uma interação 1:1 entre membros de um par de ligação (por exemplo, anticorpo e antígeno). A afinidade de uma molécula X para seu parceiro Y pode geralmente ser representada pela constante de dissociação (Kd). Por exemplo, —akKd pode ser de cerca de 200 nM, 150 nM, 100 nM, 60 nM, 50 nM, 40 nM, 30 NM, 20 nM, 10 nM, 8 nM, 6 nM, 4 nM, 2 nM, 1 nM, ou mais forte. A afinidade pode ser medida por métodos comuns conhecidos na técnica, que incluem aqueles descritos no presente documento. O anticorpo de baixa afinidade geralmente liga o antígeno lentamente e tende a dissociar prontamente, enquanto que anticorpo de alta afinidade geralmente liga o antígeno mais rápido e tende a manter ligação mais longa. Uma variedade de métodos para medir a afinidade de ligação é conhecida na técnica.

Como usado no presente documento, o “Kd” ou “valor Kd" refere- se a uma constante de dissociação medida por usar ensaios de ressonância de plásmon de superfície, por exemplo, usando um BlAcore""-2000 ou um BIAcore"Y-3000 (BlAcore, Inc., Piscataway, NJ) em 25ºC com chips CM5 de antígeno imobilizado em -10 unidades de resposta (RU). Brevemente, esse método usa chips de biosensor de dextrano carboximetilado (CM5, BlAcore Inc.) ativado com cloridrato de N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) e N-hidroxisuccinimida (NHS) de acordo com as instruções do fornecedor. Antígeno é diluído com 10mM de acetato de sódio, pH 4,8, em Sug/ml (-0,2UM) antes da injeção em uma taxa de fluxo de 5 ul/minuto para alcançar aproximadamente 10 unidades de resposta (RU) de proteína acoplada. Seguindo a injeção de antígeno, 1M de etanolamina é injetada a grupos não reagidos de bloco. Para medições cinéticas, diluições em série de duas vezes de Fab (por exemplo, 0,78 nM a 500 nM) são injetadas em PBS com 0,05% Tween 20 (PBST) em 25ºC em uma taxa de fluxo de — aproximadamente 25 ulíminuto. Taxas de associação (kw) e taxas de dissociação (Korg) são calculadas usando o modelo de ligação de Langmuir um para um simples (versão 3.2 de Software de Avaliação BlAcore) por ajuste simultâneo da associação e sensograma de dissociação. O equilíbrio constante de dissociação (Kd) é calculado como a razão Kos/Kon. Consulte, por exemplo, Chenetal, J. Mol. Biol. 293:865 a 881 (1999). Se a taxa de associação exceder 10º M* S pelo ensaio de ressonância de plásmon de superfície acima, então a taxa de associação pode ser determinada por usar uma técnica de arrefecimento brusco fluorescente que mede o aumento ou diminuição em intensidade de emissão de fluorescência (excitação = 295 nm; emissão = 340 nm, 16 nm de passa-banda) em 25ºC de um anticorpo de antiantígeno de 20 NM (forma Fab) em PBS, pH 7,2, na presença de concentrações crescentes de antígeno como medido em um espectrômetro, tal como um espectrofotômetro equipado com fluxo parado (Aviv Instruments) ou um espectrofotômetro SLM- Aminco série 8000 (ThermoSpectronic) com um cadinho agitado.

Um “amoniácido de cisteína livre" refere-se a um resíduo de amoniácido de cisteina em um polipeptídeo, por exemplo, um anticorpo ou fragmento de anticorpo, que tem um grupo funcional tiol (-SH) e não é emparelhado como uma ponte de dissulfeto intramolecular ou intermolecular. Em determinados exemplos, um resíduo de amoniácido de cisteína livre foi —modificado em um anticorpo parental como descrito, por exemplo, em Número de Publicação de Patente U.S. 2007/0092940 e Junutula, J. R. et al, J Immunol Methods 332(1-2):41 a 52 (2008).

O termo “valor de reatividade de tiol” é uma caracterização quantitativa da reatividade de aminoácidos de cisteina livre. O valor de reatividade de tiol é a porcentagem de um amoniácido de cisteína livre em um anticorpo modificado de cisteína que reage com um reagente reativo de tiol, e convertida em um valor máximo de 1. Por exemplo, um amoniácido de cisteina livre em um anticorpo modificado de cisteína reage em 100% de rendimento com um reagente reativo de tiol, tal como um reagente de biotina maleimida, para formar um anticorpo identificado por biotina que tem um valor de reatividade de tiol de 1,0. Outro aminoácido de cisteina modificado no mesmo ou em anticorpo parental diferente que reage em 80% de rendimento com um reagente reativo de tiol tem um valor de reatividade de tiol de 0,8. Outro aminoácido de cisteina modificado no mesmo ou anticorpo parental diferente que falha totalmente para reagir com um reagente reativo de tiol tem um valor de reatividade de tiol de O. A determinação do valor de reatividade de tiol de uma cisteína particular pode ser conduzida por ensaio ELISA, espectrometria de massa, cromatografia líquida, autoradiografia, ou outros testes analíticos quantitativos.

Um "anticorpo parental" é um anticorpo que é uma fonte de um ou mais fragmentos de anticorpo. O anticorpo parental pode compreender uma sequência nativa ou de tipo selvagem. O anticorpo parental pode compreender uma sequência de aminoácido da qual um ou mais resíduos de aminoácido são substituídos por um ou mais resíduos de cisteíina. O anticorpo parental pode ter modificações de sequência de aminoácido pré-existentes (tais como adições, deleções e/ou substituições) em relação a outras formas nativas, de tipo selvagem ou modificadas de um anticorpo. Um anticorpo parental pode ser direcionado contra um antígeno alvo de interesse, por exemplo, um polipeptídeo biologicamente importante. Um anticorpo parental pode ser direcionado contra antígenos de não-polipeptídeo (tais como antígenos glicolipídicos associados a tumor; consulte, por exemplo, Patente de Nº U.S.

5.091.178. Anticorpos parentais exemplificativos incluem, mas não estão limitados a, anticorpos que têm afinidade e seletividade for superfície de célula e receptores de transmembrana e antígenos associados com tumor (TAA). Um anticorpo ou polipeptídeo “isolado” é um que foi identificado e separado e/ou recuperado de um componente de seu ambiente natural. Componentes contaminantes de seu ambiente natural são materiais que devem interferir com, por exemplo, usos diagnósticos e terapêuticos, e podem incluir enzimas, hormônios, e outros solutos proteicos ou não proteicos. Tipicamente, o anticorpo ou polipeptídeo será purificado (1) para mais do que 95% em peso de proteína como determinado pelo método de Lowry, ou mais do que 99% em peso, (2) para um grau suficiente para obter pelo menos 15 resíduos de N-terminal ou sequência de aminoácido interna por uso de um sequenciador de taça giratória, ou (3) para homogeneidade em SDS-PAGE sob condições de redução ou não redução usando tingimento com azul de —Coomassie ou nitrato de prata. Anticorpo ou polipeptídeo isolado inclui o anticorpo ou polipeptídeo in situ em células recombinantes visto que pelo menos um componente do ambiente natural do anticorpo ou polipeptídeo não estará presente. Geralmente, contudo, anticorpo ou polipeptídeo isolado será preparado por pelo menos uma etapa de purificação.

As expressões "substancialmente homogêneo", "forma substancialmente homogênea" e "homogeneidade substancial" são usadas para indicar que o produto é substancialmente desprovido de subprodutos originados de combinações de polipeptídeo indesejadas (por exemplo, homomultímeros). Expressos em termos de pureza, homogeneidade substancial significa que a quantidade de subprodutos não excede 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 4%, 3%, 2% ou 1% em peso ou é menor do que 1% em peso. Tipicamente, o subproduto está baixo de 5%.

Um “sítio de clivagem com endopeptidase Lis-C”, como usado no presente documento, é um resíduo de lisina em uma sequência de aminoácido que pode ser clivada no lado de C-terminal por endopeptidase Lis-C. Clivagem com endopeptidase Lis-C no lado de C-terminal de um resíduo de Lisina. A menos que indicado de outra forma, o termo “anticorpo —monoclonal 4D5" refere-se a um anticorpo que tem resíduos de ligação de antígeno de, ou derivados de, o anticorpo 4D5 murino (ATCC CRL 10463). Por exemplo, o anticorpo monocional 4D5 pode ser anticorpo monocilonal 4D5 murino ou um variante do mesmo, tal como um 4D5 humanizado. Anticorpos 4D5 humanizados exemplificativos incluem huMAb4D5-1, huMAb4D5-2, huMAb4D5-3, huMAb4D5-4, huMAb4D5-5, huMAb4D5-6, huMAb4D5-7 e huMAb4D5-8 (trastuzumabe, HERCEPTINO) como na Patente de Nº US.

5.821.337. Os termos “tratar” ou “tratamento” refere-se tanto a tratamento terapêutico quanto profilático ou medidas preventivas, em que o objetivo é prevenir ou reduzir a velocidade (moderar) de uma desordem ou alteração fisiológica indesejada. Resultados clínicos benéficos ou desejados incluem, mas não estão limitados a, alívio de sintomas, definhamento de extensão de doença, estado de doença estabilizado (ou seja, não piorando), atraso ou diminuição da velocidade de progressão de doença, melhora ou paliação do estado da doença, e remissão (se parcial ou total), se detectável ou indetectável. O “tratamento” pode também significar prolongar a sobrevivência (por exemplo, como em tratamento de câncer) como comparado a sobrevivência esperada se não receber o tratamento. Aqueles em necessidade de tratamento incluem aqueles já com a condição ou desordem bem como aqueles passíveis de ter a condição ou desordem ou aqueles em que a condição ou desordem deve ser evitada. O termo “quantidade terapeuticamente eficaz” refere-se a uma quantidade de um anticorpo, fragmento de anticorpo, ou derivado, por exemplo,

anticorpo multiespecífico ou anticorpo análogo, para tratar uma doença ou desordem em um sujeito. No caso de tumor (por exemplo, um tumor canceroso), a quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo ou fragmento de anticorpo (por exemplo, um anticorpo multiespecífico ou anticorpo análogo) pode reduzir o número de células de câncer; reduzir o tamanho do tumor primário; inibir (ou seja, diminuir até certo ponto e, de preferência parar) infiltração de célula de câncer em órgãos periféricos; inibir (ou seja, diminuir até certo ponto e, de preferência parar) metástase de tumor; inibir, até certo ponto, crescimento de tumor; e/ou a até certo ponto um ou mais dos sintomas associados com a desordem. Para a extensão, o anticorpo ou fragmento de anticorpo (por exemplo, anticorpo multiespecífico ou anticorpo análogo) pode prevenir crescimento e/ou matar células de câncer existentes, isso pode ser citostático e/ou citotóxico. Para terapia de câncer, a eficácia em vivo pode, por exemplo, ser medida por avaliar a duração de sobrevivência, tempo para progressão de doença (TTP), as taxas de resposta (RR), duração de resposta, e/ou qualidade de vida.

“Reduzir ou inibir" significa a habilidade de causar uma diminuição geral de 20% ou mais, ou 50% ou mais, ou 75%, 85%, 90%, 95%, ou mais. Reduzir ou inibir pode referir-se aos sintomas da desordem que está sendo tratada, a presença ou tamanho de metástases, o tamanho do tumor primário, ou o tamanho ou número dos vasos sanguíneos em desordens angiogênicas.

O termo "biodisponibilidade" refere-se à disponibilidade sistêmica (ou seja, níveis de sangue/plasma) de uma dada quantidade de fármaco administrada a um paciente. Biodisponibilidade é um termo absoluto que indica —medidatantodo tempo (taxa) quanto da quantidade total (extensão de fármaco que alcança a circulação geral de uma forma de dosagem administrada.

Os termos “câncer” e “canceroso” referem-se a ou descrevem a condição fisiológica em mamíferos que é tipicamente caracterizada por crescimento/proliferação celular desregulados. Um “tumor” compreende uma ou mais células cancerosas. Exemplos de câncer incluem, mas não estão limitados a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma, e leucemia ou malignidades linfoides. Exemplos mais particulares de tais cânceres incluem —câncer de células escamosas (por exemplo, câncer de células escamosas epiteliais), câncer pulmonar que inclui câncer pulmonar de célula pequena, câncer pulmonar de célula não pequena (“NSCLC”), adenocarcinoma do pulmão e carcinoma escamoso do pulmão, câncer do peritônio, câncer hepatocelular, câncer gástrico ou de estômago que inclui câncer gastrointestinal, câncer pancreático, glioblastoma, câncer cervical, câncer de ovário, câncer de fígado, câncer de bexiga, hepatoma, câncer de mama, câncer de cólon, câncer retal, câncer colorretal, carcinoma uterino ou endometrial, carcinoma das glândulas salivares, câncer de rim ou renal, câncer de próstata, câncer vulvar, câncer de tireoide, carcinoma hepático, carcinoma anal, carcinoma peniano, bem como câncer de cabeça e pescoço.

Um “câncer que expressa ErbB" é um que compreende células que têm a proteína ErbB presente em sua superfície de célula. Um “câncer que expressa ErbB2" é um que produz níveis suficientes de ErbB2 na superfície das células do mesmo, de tal modo que um anticorpo anti-ErbB2 pode se ligar —aomesmo e ter um efeito terapêutico com respeito ao câncer.

Um câncer que “superexpressa” um receptor antigênico é um que tem níveis significantemente maiores do receptor, tal como ErbB2, na superfície de célula do mesmo, em comparação a uma célula não cancerosa do mesmo tipo de tecido. Tal superexpressão pode ser causada por amplificação de gene ou por translação ou transcrição aumentada. A superexpressão de receptor pode ser determinada em um ensaio diagnóstico ou prognóstico avaliando-se os níveis aumentados da proteína de receptor presente na superfície de uma célula (por exemplo, através de um ensaio imuno-histoquímico; IHC). Alternativa ou adicionalmente, um pode medir os níveis de ácido nucleico que encodifica o receptor na célula, por exemplo, através de hibridação in situ fluorescente (FISH; consulte WO 98/45479), southern blotting, ou técnicas de reação em cadeia de polimerase (PCR), tal —comoPCR quantitativa em tempo real (RT-PCR).

Os tumores que superexpressam ErbB2 (HER2) são classificados por pontuações imuno-histoquímicas que correspondem ao número de cópias de moléculas de HER2 expressas por célula e podem ser determinadas bioquimicamente: O = O a 10.000 cópias/célula, 1+ = pelo menos cerca de

200.000 cópias/célula, 2+ = pelo menos cerca de 500.000 cópias/célula, 3+ = cerca de 1 a 2 x 10º cópias/célula. À superexpressão de HER2 no nível 3+, que leva à ativação independente de ligante da tirosina quinase (Hudziak et al (1987) Proc. Natl Acad. Sci USA, 847159 a 7163), ocorre em aproximadamente 30% dos cânceres de mama e, nesses pacientes, a sobrevida livre de recidiva e sobrevida total são diminuídas (Slamon et al (1989) Science, 244:707 a 712; Slamon et al (1987) Science, 235:177 a 182).

O termo “agente citotóxico” conforme usado na presente invenção refere-se a uma substância que inibe ou previne a função das células e/ou causa a destruição das células. O termo pretende incluir isótopos radioativos (por exemplo,?'At, 1, 151, 9ºy, Re, Re, Sm, 212Bi, 2P, SC e os isótopos radioativos de Lu), agentes quimioterapêuticos e toxinas tal como toxinas de moléculas pequenas ou toxinas enzimaticamente ativas de origem bacteriana, fúngica, de planta ou animal, incluindo análogos sintéticos e derivados dos mesmos.

Um “distúrbio alérgico ou inflamatório” na presente invenção é uma doença ou distúrbio que resulta de uma hiperativação do sistema imunológico de um indivíduo. Os distúrbios alérgicos ou inflamatórios exemplificativos incluem, mas não são limitados a, asma, psoríase, artrite reumatoide, dermatite atópica, esclerose múltipla, lúpus sistêmico, eritematoso, eczema, transplante de órgãos, degeneração macular relacionada à idade, doença de Crohn, colite ulcerativa, esofagite eosinofílica e doenças autoimunes associadas à inflamação.

Uma “doença autoimune” na presente invenção é uma doença ou distúrbio que surge a partir de e direcionada contra tecidos e órgãos do próprio indivíduo ou um cossegregado ou manifestação do mesmo ou condição resultante do mesmo. Em muitos desses distúrbios autoimunes e inflamatórios, inúmeros mercadores clínicos e laboratoriais podem existir, incluindo, mas não limitado a, hipergamaglobulinemia, altos níveis de autoanticorpos, depósitos de complexo de antígeno-anticorpo em tecidos, benefício de corticosteroide ou tratamentos imunossupressores e agregados de célula linfoide em tecidos afetados. Sem ser limitado a qualquer teoria em relação à doença autoimune mediada por célula B, acredita-se que as células B demonstram um efeito patogênico em doenças autoimune humanas através de múltiplas trajetórias mecânicas, incluindo produção de autoanticorpo, formação de complexo imune, ativação de célula T e dendrítica, síntese de citocinas, liberação de quimiocina direta e fornecendo um nidus para neo-linfomagênese ectópica. Cada uma dessas trajetórias pode participar de diferentes graus na patologia de doenças —autoimune. Uma doença autoimune pode ser uma doença específica por órgão (isto é, a resposta imune é especificamente direcionada contra um sistema de órgão tal como o sistema endócrino, o sistema hematopoiético, a pele, o sistema cardiopulmonar, os sistemas gastrointestinal e do fígado, o sistema renal, a tireoide, as orelhas, o sistema neuromuscular, o sistema nervoso central, etc.) ou uma doença sistêmica que pode afetar múltiplos sistemas de órgãos (por exemplo, lúpus eritematoso sistêmico (SLE), artrite reumatoide, polimiosite, efc.).

O termo “citostático” refere-se ao efeito de limitar a função das células, tal como limitar o crescimento celular ou proliferação de células.

Um "agente quimioterapêutico" é um composto químico útil no tratamento de câncer. Os exemplos de agentes quimioterapêuticos incluem Erlotinibe (TARCEVAGO, Genentech/OS! Farm.), Bortezomibe (VELCADEG, Millennium Farm.), Fulvestrante (FASLODEXGO, Astrazeneca), Sutent (SU11248, Pfizer), Letrozol (FEMARAG, Novartis), mesilato de Imatinibe (GLEEVECG, Novartis), PTK787/ZK 222584 (Novartis), Oxaliplatina (EloxatinO, Sanofi, 5-FU (S-fluorouracil, Leucovorinaa Rapamicina (Sirolimus, RAPAMUNEG, “Wyeth, Lapatinibe (GSK572016, GlaxoSmithKline), —Lonafarnibe (SCH 66336), Sorafenibe (BAY43-9006, Bayer Labs.) e Gefitinibe (IRESSAG, Astrazeneca), AG1478, AG1571 (SU 5271; Sugen), agentes alquilantes tal como Tiotepa e CYTOXANO ciclosfosfamida; sulfonatos de alquila tal como bussulfano, improssulfano e pipossulfano; aziridinas tal como benzodopa, — carboquona, meturedopa e uredopa; etileniminas e —metilamelaminas incluindo altretamina, trietilenomelamina, trietilenofosforamida, trietilenotiofosforamida e trimetilomelamina; acetogeninas (especialmente bulatacina e bulatacinona); uma camptotecina (incluindo o análogo sintético topotecano); briostatina; calistatina; CC-1065 (incluindo seus análogos sintéticos adozelesina, carzelesina e bizelesina); criptoficinas (particularmente criptoficihna 1 e criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (incluindo os análogos sintéticos, KW-2189 e CB1-TM1); eleuterobina; pancratistatina; uma sarcodictiina; espongistatina; mostardas de nitrogênio tal como clorambucila, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, —hidrocloreto de óxido de mecloretaminay melfalan, —novembiquina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostarda de uracila; nitrosureias tal como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina e ranimnustina; antibióticos tais como os antibióticos de enediina (por exemplo, caliqueamicina, especialmente caliquueamicina gama 11 e caliqueamicina ômega 11 (Angew Chem Intl.

Ed.

Engl. (1994) 33:183 a 186); dinemicina, incluindo dinemicina A; bisfosfonatos, tal como clodronato; uma esperamicina; assim como neocarzinostatina cromóforo e cromóforo de antibiótico de enediina cromoproteína relacionados), aclacinomisinas, — actinomicina, antramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinis, dactinomicina, daunorrubicina, detorrubicina, — 6-diazo-5-0xo-L-norleucina, — doxorrubicina — ADRIAMICINº (incluindo morfolino-doxorrubicina, cianomorfolino-doxorrubicina, 2-pirrolino- doxorrubicina e deoxidoxorrubicina), epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicinas tal como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, — olivomicinas, — peplomicina, — potfiromicina, — puromícina, quelamicina, — rodorrubicina, —estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubicina; antimetabólitos tal como metotrexato e 5- fluorouracila (5-FU); análogos de ácido fólico tal como denopterina, —metotrexato, pteropterian, trimetrexato; análogos de purina tal como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tal como ancitabina, azaciítidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, dideoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; andrógenos tal como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; —antiadrenais tal como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; repositor de ácido fólico tal como ácido frolínico; aceglatona; glicosídeo de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; eniluracil; amsacrina; bestrabucila; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elfornitina; acetato de eliptínio; uma epotilona; etoglucide; nitrato de gálio; hidroxiureia; lentinano; lonidainina; —maitansinoides tal como maitansina e ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; fenamet; pirarrubicina; losoxantrona; ácido podofillínico; 2-etilidrazida; procarbazina; complexo de polissacaríideo PSKO (JHS Natural Products, Eugene, OU); razoxano; rizoxina;

sizofirano; —espirogermânio; ácido tenuazônico; triaziquona; 2,2',2"- triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurina A, roridihna A e anguidina); uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinoside ("Ara-C"); —ciclofosfamida; tiotepa; taxoides, por exemplo, paclitaxel TAXOLO (Bristol- Miers Squibb Oncologi, Princeton, N.J.), ABRAXANETM livre de Cremofor, formulação de nanopartícula projetada por albumina de paclitaxel (American Farmaceutical Partners, Scaumberg, Illinois), e doxetaxel TAXOTEREO (Rhône- Poulenc Rorer, Antoni, França); cloranbucila; gemcitabina GEMZARG; G6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platina tal como cisplatina e carboplatina; vinblastina; platina; etoposide (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina NAVELBINEG; novantrona; teniposide; edatrexato; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; CPT-11; inibidor de topoisomerase RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); retinoides tal como ácido retinoico; capecitabina; e sais farmaceuticamente aceitáveis, ácidos ou derivados de qualquer um dos acima.

Também incluídos nessa definição de “agente quimioterapêutico” são: (i) agentes anti-hormonais que agem para regular ou inibir a ação de hormônios em tumores tal como antiestrógenos e moduladores de receptor de estrógeno seletivo (SERMs), incluindo, por exemplo, tamoxifeno (incluindo tamoxifeno — NOLVADEXO), raloxifeno, droloxifeno, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, ceoxifeno, LY117018, onapristona e FARESTON toremiífeno; (ii) inibidores de aromatase que inibem a enzima aromatase, que regula a produção de estrógeno nas glândulas adrenais, tal como, por exemplo, 4(5)- imidazois, aminoglutetimida, acetato de megestro! MEGASEG, exemestano AROMASING, formestano, fadrozol, vorozol RIVISORGO, letrozol FEMARAG e anastrozol ARIMIDEXG; (iii) antiandrógenos tal como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida e goserelina; assim como troxacitabina (um análogo de citosina de nucleosídeo de 1,3-dioxolano); (iv) inibidores de aromatase; (v) inibidores de proteína quinase; (vi) inibidores de lipídeo quinase; (vii) oligonucleotídeos de antissenso, particularmente aqueles que inibem a expressão de genes em trajetórias de sinalização implicadas na proliferação de —célulaaberrante, tal como, por exemplo, PKC-alfa, Ralf e H-Ras; (viii) ribozimas tal como um inibidor de expressão de VEGF (por exemplo, ribozima ANGIOZYMEG) e um inibidor de expressão de HER2; (ix) vacinas tal como vacinas de terapia de gene, por exemplo, a vacina ALLOVECTINGO, vacina LEUVECTINE e vacina VAXIDO; ril-2PROLEUKING; inibidor de topoisomerase 1 LURTOTECANO; rmRH ABARELIXO; (x) agentes antiangiogênicoa tal como bevacizumabe (AVASTINGO, Genentech); e (xi) sais farmaceuticamente aceitáveis, ácidos ou derivados de qualquer um dos acima.

Um “agente inibidor de crescimento” quando usado na presente invenção refere-se a um composto ou composição que inibe o crescimento de uma célula ou in vitro ou in vivo. Dessa forma, o agente inibidor de crescimento pode ser um que reduz significativamente a porcentagem das células na fase S. Os exemplos de agentes inibidores de crescimento incluem agentes que bloqueiam a progressão de ciclo de célula (em um local diferente da fase S), tal como agentes que induzem a paragem de G1 e a paragem de fase M. Os —bloqueadores de fase M clássicos incluem os vincas (por exemplo, vincristina e vinblastina), taxanos e inibidores de topoisomerase 1l tal como doxorrubicina, epirrubicina, daunorrubicina, etoposídeo e bleomicina. Os agentes que param G1 também se propagam para a paragem de fase S, por exemplo, agentes alguilantes de DNA tal como tamoxifeno, prednisona, dacarbazina, —mecloretamina, cisplatina, metotrexato, 5-fluorouracila e ara-C. A informação adicional pode ser encontrada em The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn e Israel, eds., Capítulo 1, entitulado "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" por Murakami et al. (WB Saunders: Filadeifia, 1995),

especialmente página 13. Os taxanos (paclitaxel e docetaxel) são fármacos anticâncer ambos derivados do teixo. Docetaxel (TAXOTEREG, Rhone- Poulenc Rorer), derivado do teixo Europeu é um análogo semissintético de paclitaxel (TAXOLO, Bristol-Myers Squibb). Paclitaxel e docetaxel promovem o conjunto de microtúbulos a partir de dímeros de tubulina e estabilizam os microtúbulos prevenindo a despolimerização, o que resulta na inibição da mitose nas células.

“Terapia anticâncer” conforme usado na presente invenção refere- se a um tratamento que reduz ou inibe câncer em um sujeito. Os exemplos de terapia anticâncer incluem radioterapia citotóxica assim como a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente citotóxico, um agente quimioterapêutico, um agente inibidor de crescimento, uma vacina de câncer, um inibidor de angiogênese, um pró-farmaco, uma citocina, um antagonista de citocina, um corticosteroide, um agente imunossupressor, um antiemético, um fragmento de anticorpo ou anticorpo ou um analgésico ao sujeito.

Por “antagonista de citocina” entende-se uma molécula que parcial ou inteiramente bloqueia, inibe ou neutraliza uma atividade biológica de pelo menos uma citocina. Por exemplo, os antagonistas de citocina podem inibira atividade de citocina inibindo-se a secreção e/ou expressão de citocina ou ligando-se a uma citocina ou a um receptor de citocina. Os antagonistas de citocina incluem anticorpos, peptídeos de sequência sintética ou nativa, imunoadesinas e antagonistas de molécula pequena que se ligam a uma citocina ou a um receptor de citocina. O antagonista de citocina é opcionalmente conjugado com ou fundido a um agente citotóxico. Os antagonistas de TNF exemplificativos são etanercepte (ENBRELO), infliimabe (REMICADEO), e adalimumabe (HUMIRA'”), O termo “agente imunossupressor” conforme usado na presente invenção refere-se a substâncias que agem para suprimir ou mascarar o sistema imunológico do sujeito sendo tratado.

Isso inclui substâncias que suprimem a produção de citocina, regulam descendentemente ou suprimem a expressão de autoantígeno ou mascaram os antígenos MHC.

Os exemplos de agentes imunossupressores incluem pirimidinas 2-amino-6-aril-5-substituídas (consulte Patente nº U.S. 4.665.077); micofenolato mofetil tal como CÉLULACEPTO; azatioprina (IMURANO, AZASANQ/6-mercaptopurina; bromocriptina; danazol; dapsona; glutaraldeído (que mascara os antígenos MHC, conforme descrito na Patente nº U.S. 4.120.649); anticorpos anti- idiotíbicos para antígenos MHC e fragmentos de MHC; ciclosporina A; esteroides tal como corticosteroides e glucocorticosteroides, por exemplo, prednisona, prednisolona tal como PEDIAPREDO (fosfato de sódio de prednisolona) ou ORAPREDGO (solução oral de fosfato de sódio de prednisolona), metilprednisolona, e dexametasona; metotrexato (oral ou subcutâneo) (RHEUMATREXGO, TREXALL'"): hidroxicloroquina/cloroquina; sulfasalazina; leflunomida; citocina ou antagonistas de receptor de citocina incluindo anticorpos de anti-interferão-y, -B, ou -a, anticorpos de fator-a antinecrose tumoral (infliimabe ou adalimumabe), imunoadesina anti-TNFa (ENBRELGO, etanercepte), anticorpos de fator-B antinecrose tumoral, anticorpos de antiinterleucin-2 e anticorpos de receptor de anti-IL-2; anticorpos de anti- LFA-1, incluindo anticorpos de anti-CD11a e anti-CD18; anticorpos de anti- L3TA4; globulina antilinfócito heteróloga; anticorpos policlonais ou pan-T ou anticorpos monoclionais anti-CD3 ou anti-CD4/CD4a; peptídeo solúvel que contém um domínio de ligação de LFA-3 (WO 90/08187); estreptoquinase; TGF-fB; estreptodornase; RNA ou DNA do hospedeiro; FK506; RS-61443; deoxispergualina; rapamicina; receptor de célula T- (Cohen et al., Patente nº U.S. 5.114.721); fragmentos de receptor de célula T (Offner et al.

Science 251: 430 a 432 (1991); WO 90/11294; laneway, Nature 341:482 (1989); e WO

91/01133); anticorpos de receptor de célula T (EP 340,109) tal como T10B9; ciclofosfamida (CYTOXANG); dapsona; penicilamina (CUPRIMINEG); troca de plasma; ou imunoglobulina intravenosa (IVIG) Esses podem ser usados sozinhos ou em combinação um com o outro, particularmente combinações de esteroide e outro agente imunossupressor ou tais combinações seguidas por uma dose de manutenção com um agente não esteroide para reduzir a necessidade de esteroides. Um “analgésico” refere-se a um fármaco que age para inibir ou suprimir a dor em um sujeito. Os analgésicos exemplificativos incluem fármacos anti-inflamatórios não esteroidais (NSAIDs) incluindo ibuprofeno (MOTRINO), naproxeno (NAPROSYNO), ácido acetilsalicílico, indometacina, sulindaco e tolmetina, incluindo sais e derivados dos mesmos, assim como várias outras medicações usadas para reduzir as dores penetrantes que podem ocorrer, incluindo anticonvulsivos (gabapentina, feniloina, carbamazepina) ou antidepressivos tricíclicos. Os exemplos específicos incluem acetaminofeno, aspirina, amitriptiina (ELAVILO), carbamazepine (TEGRETOLO), feniltoina (DILANTINO), gabapentina (NEURONTINO), (E)-N-Vanilil-8-metil-S-noneamida (CAPSAICING) ou um bloqueador de nervo.

“Corticosteroide" refere-se a qualquer uma das diversas substâncias de ocorrência natural ou sintética com a estrutura química geral de esteroides que imitam ou aumentam os efeitos dos corticosteroides de ocorrência natural. Os exemplos de corticosteroides sintéticos incluem prednisona, —prednisolona (incluindo metilprednisolona), dexametasona triamcinolona e betametasona.

Uma “vacina de câncer" conforme usada na presente invenção é uma composição que estimula uma resposta imune e um sujeito contra um câncer. As vacinas de câncer consistem tipicamente em uma fonte de material ou células associados ao câncer (antígeno) que pode ser autólogo (do próprio)

ou alogênico (de outros) ao sujeito, juntamente com outros componentes (por exemplo, adjuvantes) para estimular adicionalmente e incentivar a resposta imune contra o antígeno. As vacinas de câncer podem resultar no estímulo do sistema imunológica do sujeito para produzir anticorpos a um ou diversos — antígenos específicos e/ou produzir células T assassinas para atacarem as células de câncer que têm esses antígeNOs “Radioterapia citotóxica” conforme usado na presente invenção refere-se a uma terapia de radiação que inibe ou previne a função das células e/ou causa a destruição das células. A terapia de radiação pode incluir, por exemplo, terapia ou irradiação de feixe externo com um agente entiquetado radioativo, tal como um anticorpo. O termo pretende incluir o uso de isótopos radioativos (por exemplo, AtZ!1, 1121, (128, yºº. Ret, Re! gm'!, Bi!?, Ra», P*? e os isótopos radioativos de Lu).

Conforme usado na presente invenção, o termo “fármaco direcionado por EGFR" refere-se a um agente terapêutico que se liga ao EGFR e, opcionalmente, inibe a ativação de EGFR. Os exemplos de tais agentes incluem anticorpos e pequenas moléculas que si ligam ao EGFR. Os exemplos de anticorpos que se ligam a EGFR incluem MAb 579 (ATCC CRL HB 8506), MAb 455 (ATCC CRL HB8507), MAb 225 (ATCC CRL 8508), MAb 528 (ATCC —CRL 8509) (consulte, Patente nº U.S. 4.943.533, Mendelsohn et a/.) e variantes dos mesmo, tal como 225 quimerizado (C225 ou Cetuximabe; ERBITUXO) e 225 humano reformulado (H225) (consulte, WO 96/40210, Imclone Systems Inc.); anticorpos que ligam tipo Il mutante EGFR (Patente nº U.S. 5.212.290); anticorpos humanizados e quiméricos que ligam EGFR conforme descrito em US 5891996; e anticorpos humanos que ligam EGFR, tal como ABX-EGF (consulte WO 98/50433, Abgenix). O anticorpo anti-EGFR pode ser conjugado com um agente citotóxico, dessa forma gerando um imunoconjugado (consulte, por exemplo, EP 659.439A2, Merck Patent GmbH). Os exemplos de moléculas pequenas que se ligam ao EGFR incluem ZD1839 ou Gefitinibe (IRESSATY; Astra Zeneca), Erlotinibe HCI (CP-358774, TARCEVATY; Genentech/OSI) e AG1478, AG1571 (SU 5271; Sugen). Os inibidores de proteína quinase incluem inibidores de tirosina — quinase que inibe, de certa forma, a atividade de tirosina quinase de uma tirosina quinase tal como um receptor de ErbB.

Os exemplos de tais inibidores incluem os fármacos direcionados por EGFR notados no parágrafo anterior assim como quinazolinas tal como PD 153035,4-(3-cloroanilino) quinazolina, piridopirimidinas, pirimidopirimidinas, pirrolpirimidinas, tal como CGP 59326, CGP 60261 e CGP 62706, e pirazolpirimidinas, 4-(fenilamino)-7H-pirrol[2,3-d] pirimidinas, curcumina (diferuloil metano, 4,5-bis (4-fluoroanilino)ftalimida), tirfostinas que contêm porções químicas de nitrotiofeno; PD-0183805 (Warner- Lambert); moléculas antissenso (por exemplo, aquelas que se ligam ao ácido nucleico que encodifica ErbB); quinoxalinas (Patente nº U.S. 5.804.396); trifostinas (Patente nº U.S. 5.804.396); ZD6474 (Astra Zeneca); PTK-787 (Novartis/Schering AG); inibidores de pan-ErbB tal como Cl-1033 (Pfizer); Affinitac (ISIS 3521; Isis/Lilly); mesilato de Imatinibe (Gleevec; Novartis); PKI 166 (Novartis; GW2016 (Glaxo SmithKline); CI-1033 (Pfizer); EKB-569 (Wyeth); —Semaxanibe (Sugen) ZD6474 (Astrazeneca); PTK-787 (Novartis/Schering AG); INC-1C11 (Imclone); ou conforme descrito em qualquer uma das seguintes publicações de patente: WO 99/09016 (American Cyanamid); WO 98/43960 (American Cyanamid); WO 97/38983 (Warner Lambert); WO 99/06378 (Warner Lambert); WO 99/06396 (Warner Lambert); WO 96/30347 (Pfizer, Inc); WO 96/33978 (Zeneca); WO 96/3397 (Zeneca); e WO 96/33980 (Zeneca). Um “agente antiangiogênico” refere-se a um composto que bloqueia ou interferes com, a um certo nível, o desenvolvimento de vasos sanguíneos.

O fator antiangiogênico pode, por exemplo, ser uma molécula pequena ou anticorpo que se liga a um fator de crescimento ou receptor de fator de crescimento envolvido na promoção da angiogênese. Em certas ocorrências, um fator antiangiogênico na presente invenção é um anticorpo que se liga a um Fator de Crescimento Endotelial Vascular (VEGF).

Um “antiemético” é um composto que reduz ou previne náusea em um sujeito. Os compostos antiemético incluem, por exemplo, antagonistas de receptor de neurocinin-1, antagonistas de receptor de 5HT3 (tal como ondansetrona, granisetrona, tropisetrona e zatisetrona), agonistas de receptor de GABAB, tal como baclofeno, um corticosteroide tal como dexametasona, KENALOGO, ARISTOCORTO, ou NASALIDEO, uma antidopaminérgica, fenotiazinas (por exemplo, proclorperazina, flufenazina, tioridazina e mesoridazina), dronabinol, metroclopramida, domperidona, haloperidol, ciclizina, lorazepam, proclorperazina e levomepromazina.

O termo “citocina' é um termo genérico para as proteínas liberadas por uma população de célula que age em outra célula como mediadores intercelulares. Os exemplos de tais citocinas são linfocinas, monocinas e hormônios de polipeptídeo tradicionais. Estão incluídos dentre as citocinas hormônios de crescimento tal como hormônio de crescimento humano, hormônio de crescimento humano N-metionil e hormônio de crescimento bovino; hormônio da paratireoide; tiroxina; insulina; proinsulina; relaxina; prorrelaxina; hormônios de glicoproteína tal como hormônio folículo estimulante (FSH), hormônio estimulante da tireoide (TSH), e hormônio luteinizante (LH); fator de crescimento hepático, o fator de crescimento de fibroblastos; prolactina; lactogênio placentário; fator-a e -B de necrose tumoral; —substância inibidora de múlleriano; peptídeo associado à gonadotropina de camundongo; inibina, ativina; hormônio de crescimento endotelial vascular; integrina; trombopoietina (TPO); fatores de crescimento de nervos tal como NGF-B; fator de crescimento de plaquetas; fatores de crescimento de transformação (TGFs) tal como TGF-a e TGF-B; fator-| e —ll de crescimento do tipo insulina; eritropoietina (EPO); fatores osteoindutores; interferões tal como interferão-a, -B, e -y; fatores estimulantes de colônia (CSFs) tal como macrofago-CSF (M-CSF); granulocito-macrofago-CSF (GM-CSF); e — granulocito-CSF (G-CSF); interleucinas (ILs) tal como IL-1, IL-1a, IL-2, I1L-3, IL- 4, 1L-5, IL-6, IL-7, I1L-8, IL-9, IL-10, 11-11, 11-12; um fator de necrose tumoral tal como TNF-a ou TNF-B; e outros fatores de polipeptídeo incluindo LIF e ligante de kit (KL). Conforme usado na presente invenção, o termo citocina inclui proteínas de fontes naturais ou de cultura de célula recombinante e equivalentes biologicamente ativos das citocinas de sequência nativa.

O termo “pró-fármaco” conforme usado na presente invenção referese a um precursor ou forma derivada de uma substância farmaceuticamente ativa que é menos citotóxico a células de tumor em comparação ao fármaco progenitor e é capaz de ser ativado enzimaticamente ou hidroliticamente ou convertido na forma progenitora mais ativa. Consulte, por exemplo, Wilman, “Prodrugs in Cancer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions, 14, páginas 375 a 382, 615th Meeting Belfast (1986) e Stella et al “Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery,” Directed Drug Delivery, Borchardt et al (ed.), páginas 247 a 267, Humana Press (1985). Os —pró-fármacos exemplificativos incluem, mas não são limitados a, pró-fármacos que contêm fosfato, pró-fármacos que contêm tiofosfato, pró-fármacos que contêm sulfato, pró-fármacos que contêm peptídeo, pró-fármacos modificados por aminoácido D, pró-fármacos glicosilados, pró-fármacos que contêm B- lactama, pró-fármacos que contêm fenoxiacetamida opcionalmente substituída ou pró-fármacos que contêm fenilacetamida opcionalmente substituída, 5- fluorocitosina e outros pró-fámacos de S5-fluorouridina que podem ser convertidos no fármaco livre de citotóxico mais ativo. Os exemplos de fármacos citotóxicos que podem ser derivados em uma forma de pró-fármaco incluem,

mas não são limitados a, esses agentes quimioterapêuticos descritos acima.

Um “lipossoma” é uma vesícula pequena composta de vários tipos de lipídeos, fosfolipídeos e/ou tensoativo que é útil para entrega de um fármaco (tal como os anticorpos anti-ErbB2 revelados na presente invenção e, — opcionalmente, um agente quimioterapêutico) a um mamífero.

Os componentes do lipossoma são comumente disposto em uma formação de bicamada, similar à disposição de lipídeo de membranas biológicas.

O termo “bula” é usado para se referir a instruções incluídas normalmente em embalagens comerciais de produtos terapêuticos, que contém informações sobre as indicações, uso, dosagem, administração, contraindicações e/ou avisos em relação ao uso de tais produtos terapêuticos. “Exibição de fago” é uma técnica pela qual polipeptídeos variantes são exibidos como proteínas de fusão a uma proteína de revestimento na superfície do fago, por exemplo, fago filamentoso, partículas.

Uma utilidade da exibição de fago está no fato de que grandes bibliotecas de variantes de proteína randomizadas podem ser armazenadas rápida e eficazmente para aquelas sequências que se ligam a uma molécula alvo com alta afinidade.

À exibição de bibliotecas de peptídeo e proteína no fago tem sido usada para triar milhões de polipeptídeos para uns com propriedades de ligação específicas.

Os métodos de exibição de fago polivalente têm sido usados para exibir pequenos peptídeos aleatórios e pequenas proteínas, tipicamente através de fusões a ou plll ou pVIII do fago filamentoso (Wells e Lowman, (1992) Curr.

Opin.

Struct.

Biol, 3:355 a 362 e as referências citadas do mesmo). Na exibição de fago monovalente, uma biblioteca de proteína ou peptídeo é fundida a uma proteína de revestimento de fago ou uma porção da mesma e expressa a níveis baixos na presença da proteina do tipo selvagem.

Os efeitos avidez são reduzidos em relação ao fago polivalente de modo que a classificação é baseada na afinidade de ligante intrínseco e vetores fagemídeos são usados, que simplificam as manipulações de DNA. Lowman e Wells, Methods: A companion to Methods in Enzymology, 3:205 a 0216 (1991). A exibição de fago inclui técnicas para produzir moléculas do tipo anticorpo (Janeway, C., Travers, P., Walport, M., Shlomchik (2001) Immunobiology, 5º — Edição, Garland Publishing, Nova York, páginas 627 a 628; Lee et al).

Um “fagemídeo” é um vetor de plasmídeo que tem uma origem bacteriana de réplica, por exemplo, Co1E1 e uma cópia de uma região intergênica de um bacteriófago. O fagemídeo pode ser usado em qualquer bacteriófago conhecido, incluindo bacteriófago filamentoso e bacteriófago lambdoide. O plasmídeo irá também geralmente conter um marcador selecionável para resistência antibiótica. Os segmentos de DNA clonado nesse vetores podem ser propagados como plasmídeos. Quando as células que abrigam esses vetores são fornecidas com todos os genes necessários para a produção de partículas de fago, o modo de réplica do plasmídeo muda para a réplica por círculo rolante para gerar cópias de um filamento do DNA de plasmídeo e partículas de fago de embalagem. O fagemídeo pode formar partículas de fago infecciosas e não infecciosas. Esse termo inclui fagemídeos que contêm um gene de proteína de revestimento de fago ou fragmento do mesmo ligado a um gene de polipeptídeo heterólogo como uma fusão de gene de tal modo que o polipeptídeo heterólogo seja exibido na superfície da partícula de fago.

Os termos “ligante”, “unidade de ligante”, “ligação” “reticulador”, e “reticulação,” usados alternadamente na presente invenção, significam a uma porção que compreende uma ligação covalente ou uma cadeia de átomos que ligam covalentemente um anticorpo ou fragmento de anticorpo a outro anticorpo, fragmento de anticorpo ou a uma porção de fármaco. Os ligantes incluem um radical bivalente tal como uma alquildil, um arileno, um heteroarileno, porções químicas tal como: -(CR2)JO(CR2)n-, unidades de repetição de alquilóxi (por exemplo, polietilenoxi, PEG, polimetilenoxi) e alquilamino (por exemplo, polietilenoamino, Jeffamine"!”); e éster diácido e amidas incluindo succinato, succinamida, diglicolato, malonato e caproamida. Os ligantes ou reticuladores adicionais incluem haletos de bis-maleimido e bis- —alquil, dissulfetos piridínicos, sais de bis-mercurial, reticulação mediada por ácido — S-tio-2-nitrobenzoico — e — bis-tiossulfonatos. Os — reticuladores comercialmente disponíveis exemplificativos incluem, mas não são limitados a 1,4-bis(maleimido)butano, (1,4-bismaleimidil-2,3-dihidroxibutano), bis(maleimido)hexano, bis(maleimido)etano, 1,4-Di-[3"-(2”- —piridilditio)propionamido]butano, 1,6-Hexano-bis-vinilsulfona, Ditio- bismaleimidoetano, 1,8-Bis-maleimido-dietilenoglicol, e 1,11-Bis-maleimido- trietilenoglicol. Em certas ocorrências, um reagente homo-tri-funcional pode ser usado como um reticulador, por exemplo, Tris[2-maleimidoetilJamina. O termo “marcador” significa qualquer porção que pode ser ligado —covalentemente a anticorpo e que funciona para: (i) fornecer um sinal detectável; (ii) interagir com um segundo marcador para modificar o sinal detectável fornecido pelo primeiro ou segundo marcador, por exemplo, FRET (transferência de energia de ressonância fluorescente); (iii) estabilizar as interações ou aumentar a afinidade de ligação, com antígeno ou ligante; (iv) afetar a mobilidade, por exemplo, mobilidade eletroforética ou permeabilidade de célula, por carga, hidrofobicidade, formato ou outros parâmetros físicos ou (v) fornecer uma porção de captura, para modular a afinidade de ligante, ligação de anticorpo/antígeno ou complexação iônica.

As convenções e definições estereoquímicas usadas na presente invenção geralmente seguem S. P. Parker, Ed., McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (1984) McGraw-Hill Book Company, Nova York; e Eliel, E. e Wilen, S., Stereochemistry of Organic Compounds (1994) John Wiley & Sons, Inc., Nova York. Muitos compostos orgânicos existem nas formas opticamente ativas, isto é, os mesmos têm a capacidade de girar o plano da luz polarizada por plano. Na descrição de um composto opticamente ativo, os prefixos D e L, ou Re S, são usados para denotar a configuração absoluta da molécula sobre seu(s) centro(s) de quiral. Os prefixos d e | ou (+) e (-) são empregados para — designaro sinal de rotação da luz polarizada por plano pelo composto, com (-) ou 1 significando que o composto é levógiro. Um composto prefixado com (+) ou d é dextrógiro. Para uma estrutura química dada, esses estereoisômeros são idênticos exceto que os mesmos são imagens espelhadas um do outro. Um estereoisômero específico pode também ser referido como um enantiômero e uma mistura de tais isômeros é frequentemente chamada de uma mistura enantiomérica. Uma mistura 50:50 de enantiômeros é referido como uma mistura racêmica ou um racemato, que pode ocorrer onde pode ocorrer onde não houve estereoseleção ou estereoespecificidade em um processo ou reação química. Os termos “mistura racêmica"” e “racemato” referem-se a uma mistura equimolar de duas espécies enantioméricas, desprovidas de atividade óptica.

A expressão “sal farmaceuticamente aceitável,” conforme usado na presente invenção, referese sais orgânicos ou inorgânicos farmaceuticamente aceitáveis. Os sais exemplificativo incluem, mas não são limitados a sais de sulfato, citrato, acetato, oxalato, cloreto, brometo, iodeto, nitrato, bissulfato, fosfato, fosfato ácido, isonicotinato, lactato, salicilato, citrato acetato, tartrato, oleato, tanato, pantotenato, bitartrato, ascorbato, succinato, maleato, gentisinato, fumarato, gluconato, glucuronato, sacarato, formato, benzoato, glutamato, metanossulfonato, etanossulfonato, benzenossulfonato, —p-toluenossulfonato e pamoato (isto é, 1,1'-metileno-bis-(2-hidroxi-3- naftoato)). Um sal farmaceuticamente aceitável pode envolver a inclusão de outra molécula tal como um fon de acetato, um íon de succinato ou outro contraíon. O contraíon pode ser qualquer porção orgânica ou inorgânica que estabiliza a carga do composto progenitor.

Ademais, um sal farmaceuticamente aceitável pode ter mais que um átomo carregado em sua estrutura.

As ocorrências em que os múltiplos átomos carregados são parte do sal farmaceuticamente aceitável podem ser múltiplos contraíons.

Portanto, um sal farmaceuticamente — aceitável pode ter um ou mais átomos carregados e/ou um ou mais contraíons. “Solvato — farmaceuticamente aceitável" referese a uma associação de uma ou mais moléculas de solvente e um anticorpo.

Os exemplos de solventes que formam solvatos farmaceuticamente aceitável incluem, mas não são limitados a, água, isopropanol, etanol, metanol, DMSO,

acetato de etila, ácido acético e etanolamina.

As seguintes abreviações são usadas na presente invenção e têm as definições indicada: BME é beta-mercaptoetanol Boc é N-(t-butoxicarbonil), cit é citrulina (ácido 2-amino-5-ureido pentanoico), dap é dolaproina, DCC é 1,3-diciclohexilcarbodiimida, DCM é diclorometano, DEA é dietilamina, DEAD é dietilazodicarboxilato, DEPC é dietilfosforilcianidato, DIAD é diisopropilazodicarboxilato, DIEA é N N-diisopropiletlamina, dil é dolaisoleucina, DMA é dimetilacetamida, DMAP é 4-dimetilaminopiridina, DME é etilenoglico! dimetil éter (ou 1,2-dimetoxietano), DMF é N,N-dimetilformamida, DMSO é dimetilsulfoxida, doe é dolafenina, dov é N,N-dimetilvalina, DTNB é 5,5'-ditiobis(ácido 2-nitrobenzoico), DTPA é ácido dietilenotriaminapentaácetico, DTT é ditiotreitol, EDCI é cloridrato de 1-(3- dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida, EEDQ é 2-etoxi-1-etoxicarbonil-1,2- diidroquinolina, ES-MS é espectrometria de massa de eletropulverização, EtOAc é acetato de etila, Fmoc é N-(9-fluorenilmetoxicarbonil), gli é glicina, HATU é hexafluorofosfato de O-(7-azabenzotriazol-1-il)- N,N,N Nitetrametilurônio, HOBt é 1-hidroxibenzotriazol, HPLC é cromatografia líquida de pressão alta, ile é isoleucina, lis é lisina, MeCN (CH;CN) é acetonitrilo, MeOH é metanol, Mtr é 4-anisildifenilmetila (ou 4-metoxitrítila), nor é (18, 2R)-(+)-norefedrina, PAB é p-aminobenzilcarbamoila, PBS é salina tamponada por fosfato (pH 7), PEG é polietileno glicol, Ph é fenila, Pnp é p- nitrofenila, MC é 6-maleimidocaproila, Phe é L-fenilalanina, PiBrop é bromo tris- pirrolidino fosfônio hexafluorofosfato, SEC é cromatografia de exclusão de tamanho, Su é succinimida, TFA é ácido trifluoroacético, TLC é cromatografia de camada fina, UV é ultravioleta, e val é valina.

Um “sujeito” é um vertebrado, tal como um mamífero, por exemplo, um humano. Os mamíferos incluem, mas não são limitados a, animais de fazenda (tal como vacas), animais de esporte, animais de estimação (tal como gatos, cachorros e cavalos), primatas, camundongos e ratos.

Os reagentes comercialmente disponíveis referidos nos Exemplos foram usados de acordo com as instruções do fabricante a não ser que indicado de outra forma. A fonte dessas células identificadas nos seguintes Exemplos e por toda a especificação, pelos números de acesso ATCC é a Coleção de Cultura do Tipo Americana, Manassas, VA. A não ser que notado de outra forma, a presente invenção usa procedimentos padrão de tecnologia de DNA recombinante, tal como aqueles descritos acima e nos seguintes livros: Sambrook et al., supra; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (Green Publishing Associates e Wiley Interscience, NY, 1989); Innis et al., PCR Protocols: A Guide to Methods e Applications (Academic Press, Inc., NY, 1990); Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, 1988); Gait, Oligonucleotide Synthesis (IRL Press, Oxford, 1984); Freshney, Animal Cell Culture, 1987; Coligan et al., Current Protocols in —Immunology, 19971.

Por toda esta especificação e reivindicações, a palavra “compreender” ou variações tal como “compreende” ou “que compreende” será entendida para implicar a inclusão de um número inteiro determinado ou grupo de números inteiros, mas não a exclusão de qualquer outro número inteiro ou grupo de números inteiros. Uma variedade de termos adicionais é definida ou de outra forma caracterizada na presente invenção. CoMPOSIÇÕES E MÉTODOS

ANTICORPOS MULTIESPECÍFICOS E ANÁLOGOS DE ANTICORPO Para construir anticorpos multiespecíficos, incluindo anticorpos biespecíficos e análogos de anticorpo conforme descritos na presente invenção, fragmentos de anticorpo tendo pelo menos um grupo sulfidrila livre são obtidos. Os fragmentos de anticorpo podem ser obtidos a partir dos anticorpos progenitores, conforme definido acima, incluindo anticorpos modificados por cisteina. Os anticorpos progenitores podem ser digeridos enzimaticamente para produzir fragmentos de anticorpo. Os métodos de digestão enzimática exemplificativos incluem, mas não são limitados a, —pepsina, papaína e Lis-C. Os fragmentos de anticorpo exemplificativos incluem, mas não são limitados a, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, diacorpos (Db); diacorpos em tandem (taDb), anticorpos lineares (consulte Patente nº U.S. 5.641.870, Exemplo 2; Zapata et al., Protein Eng. 8(10):1057 a 1062 (1995)); anticorpos com um braço, anticorpos de domínio único variado, minicorpos (Olafsen et al — (2004) Protein Eng. Design & Sel. 17(4):315 a 323), moléculas de anticorpo de cadeia única, fragmentos produzidos por uma biblioteca de expressão de Fab, anticorpos anti-idiotípico (anti-ld), CDR (região de determinação complementar) e fragmentos de ligação de epítopo. Os fragmentos de anticorpo podem também ser clonados, como fragmentos de DNA que encodificam os ditos fragmentos de anticorpo, em vetores de expressão de plasmídeo ou vetores de fagemídeo e expressos diretamente na E. Coli Métodos de digestão enzimática de anticorpo, clonagem de DNA e métodos de expressão de proteína recombinante são bem conhecidos por versados na técnica e métodos exemplificativos são fornecidos na presente invenção.

Os fragmentos de anticorpo podem ser purificados com o uso de técnicas convencionais e são submetidos à redução para gerar um grupo tiol livre. Os fragmentos de anticorpo que têm um grupo tiol livre são reagidos com um reticulador, por exemplo, bis-maleimida. Tais fragmentos de anticorpo reticulados são puríificados e, então, reagidos com um segundo fragmento de anticorpo que tem um grupo tiol livre. O produto final em que dois de fragmentos anticorpo são reticulados e purificados. Em certas realizações, cada fragmento de anticorpo é um Fab e o produto final, em que dois Fabs são ligados através de bis-maleimida é referido na presente invenção como bismaleimido-(tio-Fab), ou bis-Fab.

Tais anticorpos multiespecíficos e análogos de anticorpo, incluindo bis-Fabs, podem ser explorados para sintetizar rapidamente um grande número de combinações de fragmento de anticorpo ou variantes estruturais de anticorpos nativos ou combinações de fragmento de anticorpo particular e para triar esses em ensaios biológicos para as atividades desejadas.

ANTICORPOS MODIFICADOS DE CISTEÍNA Anticorpos modificados de cisteina foram previamente descritos na publicação de patente nº U.S. 2007/0092940 e em Junutula, J. R., et al, J Immunol Methods 332(1-2):41 a 52 (2008). Anticorpos modificados de cisteína podem ser anticorpos-pais. Esses são úteis para gerar fragmentos de anticorpo que têm uma cisteína livre em um local particular, tipicamente em uma região constante, por exemplo, Cr ou Cyl.

Um anticorpo-pai modificado para conter uma cisteína são referidos no presente documento como um “TioMab” e fragmentos Fab produzidos a partir de tais anticorpos modificados de cisteina, independentemente do método de produção, são referidos no presente documento como

“TioFabs”. Conforme descrito previamente (publicação de patente nº U.S. 2007/0092940 e Junutula, J. R., et al., J] Inmunol Methods 332(1-2):41 a 52

[2008]),) mutantes com resíduos de cisteina (Cis) substituídos (“modificados”) são avaliados para a reatividade dos grupos tiol da cisteina — modificados, recentemente introduzidos. O valor de reatividade de tiol é um termo numérico relativo na faixa de 0 a 1,0 e pode ser medido para qualquer anticorpo modificado de cisteína. Em adição a ter um grupo tiol reativo, TioMabs devem ser selecionados de modo que os mesmos retenham capacidade de ligação de antígeno.

O projeto, seleção e preparação de anticorpos modificados de cisteina foram descritos em detalhes previamente na publicação de patente nº U.S. 2007/0092940 e em Junutula, J. R., et al., ] Immunol Methods 332(1-2):41 a 52 (2008).41-52 (2008).

Sequências de aminoácido de certas cadeias leves (LC) e cadeias pesadas (HC) exemplificativas de tais anticorpos modificados de cisteina e as sequências de tipo selvagem correspondentes são listadas abaixo (o local da cisteina modificada é mostrado em itálico negrito e sublinhado). Como as cisteíinas modificadas são introduzidas nas regiões constantes de cadeias pesadas ou leves, entende-se que os locais fornecidos abaixo para a introdução de cisteina nesses anticorpos especificados podem ser usados por qualquer anticorpo que contém essas regiões constantes, ou substancialmente similares.

1. HERCLC (TiPO SELVAGEM) (SEQ ID NO.: 1)

DIQMTQOSPSSLSASVGDRVTITORASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASF LYSGVPS RFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTVAAP SVFIFPP SDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLS STLT LSKADYEKHKVYACEVTHOQGLSSPVTKSFNRGEC

1. HERCLC!I%"S (SEQID NO.: 2)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITOCORASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASF LYSGVPS RFSGSRSGTDFTLTISSLAPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTCAAP SVFIFPP SDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQOSGNSQESVTEQDSKDS TYSLSSTLT LSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

2. HERCLC?ºO"S (SEQID NO.: 3)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASF LYSGVPS RFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTVAAP SVFIFPP SDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVOWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDS TYSLSSTLT LSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPCTKSFNRGEC

4. HERCHC (TiPO SELVAGEM) (SEQ ID NO.: 4)

EVOLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIY PTNGYTRY ADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWG QGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHT FPAVLOSS GLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCP APELLGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKENWYVDGVEVHNAKT KPREEQYN STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYT LPPSREE MTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK LTVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

5. HERCHC!1%OS (SEQID NO.: 5)

EVOLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGENIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIY PTNGYTRY ADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVY YCSRWGGDGFYAMDYWG QGTLVTCSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHT FPAVLOSS GLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCP APELLGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYN STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYT LPPSREE MTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK LTVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

6. 2C4LC (TiPo SELVAGEM) (SEQ ID NO.: 6)

DIQMTASPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSIGVAWYQQKPGKAPKLLIYSA SYRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYIYPYTFGQGTKVEIK RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQES VTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

7. 2C4LC!!S (SEQID NO.:7)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSIGVAWYQQKPGKAPKLLIYSASY RYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYIYPYTFGQGTKVEIKRTCA APSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDS — KDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHOGLSSPVTKSFNRGEC

8. 2C4HC (VH-CH1) (TIPO SELVAGEM) (SEQ ID NO.: 8)

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYTMDWVRQAPGKGLEWVADVNP NSGGSIYNQRFKGRFTLSVDRSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLGPSFYFDYWGQG TLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTF —PAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT

9. 5A6HC (VH-CH1) (Tipo Selvagem) (SEQ ID NO.: 9)

EVKLEESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSDAWMDWVRQSPERGLE WVAEIRSKPNNHATYYAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQMTSLRPEDTGIYYCT HFDYWGQGTTLTVSSAKTTGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPV TVSWNSGALTSGVHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPS NTKVDKKVEPKSCDKTHT

10. SAGHC2*º (SEQID NO.: 10)

EVKLEESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSDAWMDWVRQSPERGLE WVAEIRSKPNNHATYYAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQMTSLRPEDTGIYYCT HFDYWGQGTTLTVSSCKTTGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPV TVSWNSGALTSGVHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPS NTKVDKKVEPKSCDKTHT

11. 5A6LC (TiPO SELVAGEM) (SEQ ID NO.: 11)

DIQMTQSPSSLSASLGERVSLTCRASQEISGYLSWFQOQKPDGTIKRLIY AASALDSGVPKRFSGSWSGSDYSLTISSLESEDFADYYCLQYVSYPLTFGAGT KVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQ SGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTK SFNRGEC

12. 5A6LC!!**S (SEQID NO.: 12)

DIQMTQSPSSLSASLGERVSLTCRASQEISGYLSWFQQKPDGTIKRLIY AASALDSGVPKRFSGSWSGSDYSLTISSLESEDFADYYCLQYVSYPLTFGAGT KVEIKRTCAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQ — SGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTK SFNRGEC

13. 22E7HC (VH-CH1) (TIPO SELVAGEM) (SEQ ID NO.: 13)

EVKLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYGMSWVRQTPEKRLEW VATISGGNNYTFYPDNLKGRFTISRDNAKNILYLQISSLRSVDTALYYCASLWY RASFAYWGQGTLVTVSSAKTTGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPE PVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHK PSNTKVDKKVEPKSCDKTHT

14. 22E7HC"2!º (SEQID NO.: 14)

EVKLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYGMSWVRQTPEKRLEW VATISGGNNYTFYPDNLKGRFTISRDNAKNILYLQISSLRSVDTALYYCASLWY RASFAYWGQGTLVTVSSCKTTGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPE PVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHK PSNTKVDKKVEPKSCDKTHT

15. 22E7LC (TiPO SELVAGEM) (SEQ ID NO.: 15)

DIMMTQSPSSMYASLGERVTITCKASQDINSYLSWFQQKPGKSPKTLIS RANRLVDGVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLEYEDMGIYYCLQYDDFPFTFGGG TKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQYWKVDNAL QSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVT KSFNRGEC

16. 22E7LC!%S (SEQID NO.: 16)

DIMMTQSPSSMYASLGERVTITCKASQDINSYLSWFQQKPGKSPKTLIS RANRLVDGVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLEYEDMGIYYCLQYDDFPFTFGGG TKVEIKRTCAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNAL QSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVT KSFNRGEC

17. D1-5HC (VH-CH1) (Tipo SELVAGEM) (SEQ ID NO.: 17)

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTGNWIHWVRQAPGKGLE — WVGEISPSGGYTDYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAR

ESRVSYEAAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLV KDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYI|

CNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTH

18. D1-5LC (TiPO SELVAGEM) (SEQ ID NO.: 18)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITOERASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLI YSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYPTPYTFGAG TKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNAL QSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVT KSFNRGEC

19. D1-5LC!!*S (SEQID NO.: 19)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITERASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLI YSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLOPEDFATYYCQQSYPTPYTFGAG TKVEIKRTCAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNAL QSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVT KSFNRGEC

20. C3-101HC (VH-CH1) (TiPo SELVAGEM) (SEQ ID NO.: 20)

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYWISWVRQAPGKGLE WVGTINPYSGATDYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARL AVGVFANRYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLV — KDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYI CNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTH

21. C3-101LC (Tipo SELVAGEM) (SEQ ID NO.: 21)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITERASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLI YSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLAQPEDFATYYCQQSYTTPRTFGAG TKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNAL QSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHOQGLSSPVT KSFNRGEC

22. C3-101LC*!* (SEQID NO.: 22)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLI YSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQOSYTTPRTFGAG TKVEIKRTCAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNAL QSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVT

KSFNRGEC Como anticorpos modificados de cisteína são selecionados para reter a capacidade de ligação de antígeno de seu tipo selvagem, contrapartes de anticorpo-pal, as mesmas são capazes de ligar especificamente a antígeNOs Tais antígenos incluem, por exemplo, antígenos associados a tumor (TAA), proteínas receptoras de superfície de célula e outras moléculas de superfície de célula, proteinas de transmembrana, proteínas de sinalização, fatores reguladores de sobrevivência de célula, fatores reguladores de proliferação celular, moléculas associadas a (para, por exemplo, conhecidas ou suspeitas de contribuir funcionalmente para) diferenciação ou desenvolvimento de tecido, linfocinas, citocinas, moléculas envolvidas em regulação de ciclo celular, moléculas envolvidas em vasculogênese e moléculas associadas a (para, por exemplo, conhecidas ou suspeitas de contribuir funcionalmente a) angiogênese. O antígeno associado a tumor pode ser um fator de diferenciação de agrupamento (isto é, uma proteina CD). Um antígeno ao qual um anticorpo modificado de cisteina é capaz de ligação pode ser um membro de um subconjunto de uma das categorias mencionadas acima, sendo que o(s) outro(s) “subconjunto(s) de dita categoria compreende(m) outras moléculas/antígenos que têm uma característica distinta (com respeito ao antígeno de interesse). O anticorpo-pai também pode ser um anticorpo humanizado selecionado a partir de huMAb4D5-1, huMAb4D5-2, huMAb4D5-3, huMAb4D5- 4, huMAb4D5-5, huMAb4D5-6, huMAb4D5-7 e huMAb4D5-8 (Trastuzumab, —HERCEPTINO) conforme descrito na Tabela 3 da Patente nº U.S. 5.821.337, expressamente incorporada no presente documento a título de referência; anticorpo humanizado 520C9 (WO 93/21319) e humanizado 2C4.

ANTICORPOS MULTIESPECÍFICOS MULTIFUNCIONAIS E ANÁLOGOS DE ANTICORPOS Anticorpos multiespecíficos e análogos de anticorpos podem ser sintetizados com reticuladores modificados de modo que porções químicas funcionais adicionais possam ser fixadas ao anticorpo multiespecífico ou análogo de anticorpo. Reticuladores modificados permitem a fixação de qualquer porção sulfidrila-reativa. Em uma realização, N-succinimidil-S-acetiltiocacetato (SATA) é fixado a bis-maleimida para formar bis-maleimido-acetiltivacetato (BMata). Após a —desproteção do grupo tiol oculto, qualquer grupo funcional que tem uma porção sulfidrila-reativa (ou tiol-reativo) pode ser fixado. Reagentes tiol-reativo exemplificativos incluem um reagente de ligante multifuncional, um reagente de marcador de captura, isto é, afinidade (por exemplo, um reagente de ligante de biotina), um marcador de detecção (por exemplo, um reagente fluoróforo), um reagente de imobilização de fase sólida (por exemplo, SEPHAROSE'Y, poliestireno, ou vidro), ou um intermediário de ligante de fármaco. Um exemplo de um reagente tiol-reativo é N-etil maleimida (NEM). Tais anticorpos multiespecíficos ou análogos de anticorpos que têm reticuladores modificados podem ser adicionalmente —reagidos com um reagente de porção de fármaco ou outro marcador. A reação de um anticorpo multiespecífico ou análogo de anticorpo com um intermediário de ligante de fármaco fornece um conjugado de fármaco de anticorpo multiespecífico ou conjugado de fármaco de análogo de anticorpo,

respectivamente.

Tal abordagem pode ser aplicada à conjugação de outros agentes tiol-reativo nos quais o grupo reativo é, por exemplo, uma maleimida, uma iodoacetamida, um dissulfeto de piridila, ou outro parceiro de conjugação tiol- —reativo (Haugland, 2003, Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes, Inc.; Brinkley, 1992, Bioconjugate Chem. 3:2; Garman, 1997, Non-Radioactive Labelling: A Practical Approach, Academic Press, Londres; Means (1990) Bioconjugate Chem. 1:2; Hermanson, G. em Bioconjugate Techniques (1996) Academic Press, San Diego, págs. 40 a 55,643 a671). O parceiro pode ser um agente citotóxico (por exemplo, uma toxina como doxorubicina ou toxina de pertussis), um fluoróforo como um corante fluorescente como fluoresceína ou rodamina, um agente quelante para um metal radioterápico ou de imageamento, um marcador de peptidila ou não peptidila ou identificador de detecção, ou um agente modificador de desaparecimento como vários isômeros de polietileno glicol, um peptídeo que se liga a um terceiro componente, ou outro carboidrato ou agente lipofílico.

Uma sequência de peptídeo de ligação de albumina (ABP) (Dennis et al. (2002) “Albumin Binding As A General Strategy For Improving The Pharmacokinetics Of Proteins"” J Biol Chem. 277:35035 a 35043; WO 01/45746) também pode ser reagida com anticorpos multiespecíficos ou análogos de anticorpos que têm reticuladores modificados. Sequências de ABP exemplificativas são descritas em: (i) Dennis et al (2002) J Biol Chem. 277:35035 a 35043 nas Tabelas Ill e IV, página 35038; (ii) US 20040001827 em [0076] SEQ ID NOS: 9 a 22; e (iii) WO 01/45746 nas páginas 12 a 13, SEQ IDNOS:z1az14.

MUTAGÊNESE Um DNA que encodifica uma variante de sequência de aminoácido do polipeptídeo de partida é preparado por uma variedade de métodos conhecidos na técnica. Esses métodos incluem, mas não se limitam a, preparação através de mutagênese sítio-direcionada (ou mediada por oligonucleotídeo),mutagênese de PCR, e mutagênese de cassete de um DNA previamente preparado que encodifica o polipeptídeo. Variantes de anticorpos —recombinantes podem ser construídas também através de manipulação de fragmento de restrição ou através de PCR de extensão de sobreposição com oligonucleotídeos — sintéticos. Iniciadores “mutagênicos encodificam a(s) substituição(ões) de códon de cisteína. Técnicas de mutagênese padrão podem ser empregadas para gerar DNA que encodifica tais anticorpos modificados de cisteina mutante. Orientações gerais podem ser encontradas em Sambrook et a/. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989; e Ausubel et al. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing e Wiley-Interscience, Nova York, N.Y., 1993.

Mutagênese síitio-direcionada é um método para preparar variantes de substituição, isto é, proteinas mutantes. Essa tecnologia é bem conhecida na técnica (consulte, por exemplo, Carter (1985) et al. Nucleic Acids Res. 13:4431 a 4443; Ho et al (1989) Gene (Amst.) 77:51 a 59; e Kunkel et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci USA 82:488). Brevemente, ao executar —mutagênese sítio-direcionada de DNA, o DNA de partida é alterado ao primeiro hibridizar um oligonucleotídeo que encodifica a mutação desejada a um único filamento de tal DNA de partida. Após a hibridização, uma DNA polimerase é usada para sintetizar todo um segundo filamento, com o uso do oligonucleotídeo hibridizado como um iniciador, e com o uso do único filamento do DNA de partida como um modelo. Assim, o oligonucleotídeo que encodifica a mutação desejada é incorporado no DNA de filamento duplo resultante. À mutagênese sítio-direcionada pode ser executada dentro do gene que expressa a proteína a ser mutagenizada em um plasmídeo de expressão e o plasmídeo resultante pode ser sequenciado para confirmar a introdução das mutações de substituição de cisteína desejadas (Liu et al (1998) J. Biol. Chem. 273:20252 a 20260). Síitio-direcionamento de protocolos e formatos, incluindo aqueles comercialmente disponíveis, por exemplo, Kit de Múltiplas —Mutagêneses Sítio-Direcionadas QuikChange&O (Stratagene, La Jolla, CA).

A mutagênese de PCR também é adequada para produzir variantes de sequência de aminoácido do polipeptídeo de partida. Consulte Higuchi, (1990) em PCR Protocols, págs. 177 a 183, Academic Press; Ito et al (1991) Gene 102:67 a 70; Bernhard et al (1994) Bioconjugate Chem. 5:126 a 132;e Vallette et al. (1989) Nuc. Acids Res. 17:723 a 733. Brevemente, quando pequenas quantidades de DNA modelo são usadas como material de partida em um PCR, iniciadores que diferem ligeiramente em sequência a partir da região correspondente em um DNA modelo podem ser usados para gerar quantidades relativamente grandes de um fragmento de DNA específico que difere da sequência modelo apenas nas posições em que os iniciadores diferem do modelo.

Outro método para preparar variantes, mutagênese de cassete, tem como base a técnica descrita por Wells et al (1985) Gene 34:315 a 323. O material de partida é o plasmídeo (ou outro vetor) que compreende o DNA de —polipeptídeo de partida a ser mutado. O(s) códon(s) no DNA de partida a ser mutado são identificados. Deve haver um sítio de endonuclease de restrição exclusiva em cada lado do(s) sítio(s) de mutação identificado(s). Se nenhum tal sítio de restrição existe, o mesmo pode ser gerado com o uso do método de mutagênese mediada por oligonucleotídeo descrito acima para introduzi-los em locais apropriados no DNA de polipeptídeo de partida. O DNA de plasmídeo é cortado nesses sítios para linearizá-lo. Um oligonucleotídeo de filamento duplo que encodifica a sequência do DNA entre o sítio de restrição, mas que contém a(s) mutação(ões) desejada(s) é sintetizado com o uso de procedimentos padrão, sendo que os dois filamentos do oligonucleotídeo são sintetizados separadamente e então hibridizados juntos com o uso de técnicas padrão. Esse oligonucleotídeo de filamento duplo é referido como o cassete. Esse cassete é projetado para ter 5' e 3' extremidades que são compatíveis com as — extremidades do plasmídeo linearizado, de modo que o mesmo possa ser diretamente ligado ao plasmídeo. Esse plasmídeo agora contém a sequência de DNA mutado. DNA mutante que contém as substituições de cisteína encodificada pode ser confirmado por sequenciamento de DNA. Mutações únicas são também geradas por mutagênese direcionada por oligonucleotídeo com o uso de DNA de plasmídeo de filamento duplo como modelo através de mutagênese com base em PCR (Sambrook e Russel, (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3º edição; Zoller et al. (1983) Methods Enzymol. 100:468 a 500; Zoller, M.J. e Smith, M. (1982) Nucl. Acids Res. 10:6487 a 6500).

Oligonucleotídeos são preparados através do método de síntese de foforamíidita (U.S. 4415732; U.S. 4458066; Beaucage, S. e Iyer, R. (1992) "Advances in the synthesis of oligonucleotides by the phosphoramidite approach", Tetrahedron 48:2223 a 2311). O método de foforamidita implica a adição cíclica de unidades de monômero de nucleotídeo com uma porção de 3' fosforamídita reativa a uma cadeia de oligonucleotíideo que cresce em um suporte sólido compreendido de vidro de poro controlado ou poliestireno altamente reticulado, e mais comumente na direção 3' a 5' na qual o nucleosídeo de terminação 3' é fixado no suporte sólido no início da síntese (U.S. 5047524; U.S. 5262530). O método é normalmente praticado com o uso de sintetizadores automatizados, comercialmente disponíveis (Applied Biosystems, Foster City, CA). Oligonucleotideos podem ser quimicamente marcados com porções químicas não isotópicas para detecção, captura, estabilização, ou outros propósitos (Andrus, A. "Chemical methods for 5' non-

isotopic labeling of PCR probes and primers" (1995) em PCR 2: A Practical Approach, Oxford University Press, Oxford, págs. 39 a 54; Hermanson, G. em Bioconjugate Techniques (1996) Academic Press, San Diego, págs. 40 a 55, 643 a 671; Keller, G. e Manak, M. em DNA Probes Segunda Edição (1993), —Stockton Press, Nova York, pags. 121 a 23).

A detecção de grupos de cisteína reativa em anticorpos pode ser executada com o uso de um formato de fago ELISA (O PHESELECTOR [ELISA de Fago para Seleção de Tióis Reativos]) conforme descrito no nº de publicação de patente U.S. 2007/0092940 e Junutula, J. R., et al., J] Immunol Methods 332(1a2):41a52 (2008).

PURIFICAÇÃO E EXPRESSÃO DE PROTEÍNA Um DNA que encodifica anticorpos ou fragmentos de anticorpo é prontamente isolado e sequenciado com o uso de procedimentos convencionais (por exemplo, com o uso de sondas de oligonucleotídeo que são capazes de se ligar especificamente a genes que encodificam as cadeias pesadas e leves de anticorpos de murino). As células de hibridoma podem servir como uma fonte de tal DNA. Uma vez isolado, o DNA pode ser colocado em vetores de expressão, que são então transfectados em células hospedeiras como células de E. coli, células COS de símio, células de Ovário de Hamster Chinês (CHO), ou outras células hospedeiras de mamíferos, como células de mieloma (Patente nº U.S. 5.807.715; publicação nº U.S. 2005/0048572 e 2004/0229310) que, de outro modo, não produzem a proteína de anticorpo, para obter a síntese de anticorpos monoclonais nas células hospedeiras recombinantes. Artigos de revisão em expressão recombinante em bactérias de —DNA que encodifica o anticorpo incluem Skerra et al (1993) Curr. Opinion in Immunol. 5:256 a 262 e Plúckthun (1992) Immunol. Revs. 130:151 a 188.

Anticorpos modificados de cisteina, por exemplo, TioFabs, com resíduos de Cis não pareados altamente reativos, podem ser produzidos por: (i)

expressão em um sistema bacteriano, por exemplo. E. coli, ou um sistema de cultura celular de mamífero (WO 01/00245), por exemplo, células de Ovário de Hamster Chinês (CHO); e (ii) purificação com o uso de técnicas de purificação de proteína comuns (Lowman et al. (1991) J. Biol. Chem. 266(17):10982 a 10988).

Procedimentos —de purificação exemplificativos incluem: fracionamento em colunas de troca de íon ou imunoafinidade, precipitação de etanol, HPLC de fase reversa, cromatografia em sílica ou em uma resina de troca de cátion como DEAE, cromatofocagem, SDS-PAGE, precipitação de sulfato de amônia, e filtração de gel com o uso de, por exemplo, Sefadex G-75.

Em um aspecto, a Proteína A imobilizada em uma fase sólida é usada para purificação de imunoafinidade dos produtos de anticorpo de comprimento total da invenção. Proteína A é uma proteína de parede celular 41kD de Staphylococcus aureus que se liga com uma grande afinidade à região Fcde anticorpos. Lindmark et a/., (1983) J. Immunol. Meth. 62:1 a 13. A fase sólida à qual a Proteína A é imobilizada é preferencialmente uma coluna que compreende uma superfície de vidro ou sílica, mais preferencialmente uma coluna de vidro de poro controlado ou uma coluna de ácido silícico. Em algumas aplicações, a coluna foi revestida com um reagente, como glicerol, em umatentativade evitar a aderência não específica de contaminantes.

Como a primeira etapa de purificação, a preparação derivada da Cultura de célula conforme descrito acima é aplicada na fase sólida imobilizada de Proteína A para permitir ligação específica do anticorpo de interesse à Proteína A. A fase sólida é então lavada para remover contaminantes não especificamente ligados à fase sólida. O anticorpo de interesse pode ser recuperado da fase sólida através de eluição em uma solução que contém um agente caotrópico ou detergente suave. Agentes caotrópicos e detergentes suaves exemplificativos incluem, mas não se limitam a, Guanidina-HCI, ureia,

perclorato de lítio, Arginina, Histidina, SDS (dodecil sulfato de sódio), Tween, Triton, e NP-40, todos os quais são comercialmente disponíveis. Diluir o anticorpo em uma solução que contém a agente caotrópico ou detergente suave após eluição a partir da coluna (por exemplo, coluna mAbSure) mantém a estabilidade do anticorpo pós eluição e permite manipulações adicionais, conforme descrito no presente documento.

ANÁLOGOS DE ANTICORPOS E ANTICORPOS MULTIESPECÍFICOS MARCADOS Anticorpos multiespecíficos e análogos de anticorpos da invenção, particularmente aqueles sintetizados com reticuladores modificados que tem um grupo sulfidrila livre, podem ser conjugados com qualquer porção de marcador que pode ser fixado de modo covalente ao anticorpo através de um grupo tiol de cisteína reativa (Singh et al (2002) Anal. Biochem. 304:147 a 15; Harlow E. e Lane, D. (1999) Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Lundblad R.L.

(1991) Chemical Reagents for Protein Modification, 2º edição. CRC Press, Boca Raton, FL). O marcador fixado pode funcionar para: (i) fornecer um sinal detectável; (ii) interagir com um segundo marcador para modificar o sinal detectável fornecido pelo primeiro ou segundo marcador, por exemplo, para render FRET (transferência de energia de ressonância de fluorescência); (iii) estabilizar interações ou aumentar afinidade de ligação, com antígeno ou ligante; (iv) afetar mobilidade, por exemplo, mobilidade eletroforética ou permeabilidade de célula, através de carga, hidrofobicidade, formato, ou outros parâmetros físicos, ou (v) fornecer uma porção de captura, para modular afinidade de ligante, ligação de anticorpo/antígeno, ou complexação iônica.

Anticorpos multiespecíficos marcados podem ser úteis em ensaios de diagnóstico, por exemplo, para detectar a expressão de um antígeno de interesse em células, tecidos, ou soros específicos. Para aplicações de diagnóstico, o anticorpo será tipicamente marcado com uma porção detectável. Numerosos marcadores são disponíveis que podem ser geralmente agrupadas nas seguintes categorias: (a) “Radioisótopos (radionuclídeos), como ?*H, 11C, "ºC, **F, Pp, *S Cu, Ga, Sy, Tc, Min, 12, 124. 1251, 17 Xe, Lu, 21AÇ ou ?ºBi, Anticorpos marcados de radioisótopo são úteis em experimentos de imageamento alvejado de receptor. O anticorpo pode ser marcado com reagentes de ligante que ligam, quelatam ou complexionam de outro modo um metal de radioisótopo em que o reagente é reativo com o tiol de cisteina modificada do anticorpo, com o uso das técnicas descritas em Current — Protocols in Immunology, Volumes 1 e 2, Coligen et al., Ed. Wiley-Interscience, Nova York, NY, Pubs. (1991). Ligantes de quelação que podem complexar um íon de metal incluem DOTA, DOTP, DOTMA, DTPA e TETA (Macrocyclics, Dallas, TX). Radionuclídeos podem ser alvejados por meio de complexação com os conjugados de anticorpo-fármaco da invenção (Wu et al (2005) Nature Biotechnology 23(9):1137 a 1146).

Complexos de metal-quelato adequados como marcadores de anticorpo para experimentos de imageamento são apresentados: Patentes nº U.S. 5.342.606; 5.428.155; 5.316.757; 5.480.990; 5.462.725; 5.428.139;

5.385.893; 5.739.204; 5.750.660; 5.834.456; Hnatowich et a/. (1983) J. —Immunol. Methods 65:147 a 157; Meares et al (1984) Anal. Biochem. 142:688 a 78; Mirzadeh et a/. (1990) Bioconjugate Chem. 1:59 a 65; Meares et al. (1990) J. Cancer 1990, Suppl. 10:21 a 26; Izard et al. (1992) Bioconjugate Chem. 3:346 a 350; Nikula et a/. (1995) Nucl. Med. Biol. 22:387 a 90; Camera et al (1993) Nucl. Med. Biol. 20:955 a 62; Kukis et al (1998) J. Nucl. Med. 39:2105 a 2110; Verel et al. (2003) J. Nucl. Med. 44:1663 a 1670; Camera et a/. (1994) J. Nucl. Med. 21:640 a 646; Ruegg et a/. (1990) Cancer Res. 50:4221 a 4226; Verel et al. (2003) J. Nucl. Med. 44:1663 a 1670; Lee et al. (2001) Cancer Res. 61:4474 a 4482; Mitchell, et al. (2003) J. Nucl. Med. 44:1105 a 1112; Kobayashi et al. (1999) Bioconjugate Chem. 10:103 a 111; Miederer et a/. (2004) J. Nucl. Med. 45:129 a 137; DeNardo et a/. (1998) Clinical Cancer Research 4:2483 a 90; Blend et al. (2003) Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals 18:355 a 363; Nikula et a/. (1999) J. Nucl. Med. 40:166 a 76; Kobayashi et a/. (1998) J. —Nucl Med. 39:829 a 36; Mardirossian et a/. (1993) Nucl. Med. Biol. 20:65 a 74; Roseli et a/. (1999) Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals, 14:209 a 20.

(b) “Marcadores fluorescentes como quelatos de terra rara (quelatos de európio),) tipos de fluoresceína incluindo FITC, 5- carboxifluoresceina, 6-carboxifluoresceina; tipos de rodamina incluindo TAMRA; dansila; Lissamina; cianinas; ficoeritrinas; Texas Red; e análogos do mesmo. Os marcadores fluorescentes podem ser conjugados a anticorpos com o uso das técnicas apresentadas em Current Protocols in Immunology, supra, por exemplo. Corantes fluorescentes e reagentes de marcador fluorescentes incluem — aqueles que são comercialmente disponíveis junto à Invitrogen/Molecular Probes (Eugene, OR) e Pierce Biotechnology, Inc. (Rockford, IL).

(c) “Vários marcadores de enzima-substrato são disponíveis ou apresentadas (Patente nº U.S. 4.275.149). A enzima geralmente catalisa uma alteração química de um substrato cromogênico que pode ser medido com o uso de várias técnicas. Por exemplo, a enzima pode catalisar uma alteração de cor em um substrato, que pode ser medido espectrofotometricamente. Alternativamente, =—a enzima pode alterar a fluorescência ou quimioluminescência do substrato. Técnicas para quantificar uma mudança em fluorescência são descritas acima. O substrato quimioluminescente se torna — eletronicamente excitado através de uma reação química e então pode emitir luz que pode ser medida (com o uso de um quimioluminômetro, por exemplo) ou doa energia para um aceitante fluorescente. Exemplos de marcadores enzimáticos incluem luciferases (por exemplo, luciferase de vagalume e luciferase bacteriana; do documento U.S. 4737456), luciferinay 2,3- diidroftalazinedionas, desidrogenase de malato, urease, peroxidase como peroxidase de rábano (HRP), fosfatase alcalina (AP), B-galactosidase, glicoamilase, lisozima, oxidases de sacarídeo (por exemplo, oxidase de glicose, oxidase de galactose, e glucose-6-fosfato desidrogenase), oxidases heterocíclicas (como oxidase de uricase e xantina), lactoperoxidase, microperoxidase, e similares. Técnicas para conjugar enzimas a anticorpos são descritas em O'Sullivan et al (1981) “Methods for the Preparation of Enzyme- Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay”, em Methods in Enzym. (edJ.Langone &H. Van Vunakis), Academic Press, Nova York, 73:147 a 166. Exemplos de combinações de enzima-substrato incluem, por exemplo: () Peroxidase de rábano (HRP) com peroxidase de hidrogênio como um substrato, sendo que a peroxidase de hidrogênio oxidiza um — precursor de corante (por exemplo, ortofenileno diamina (OPD) ou cloridrato de 3,3',5,5'-tetrametiilbenzidina (TMB)); (ii) fosfatase alcalina (AP) com fosfato de para-nitrofenila como substrato cromogênico; e (Ill) B-D-galactosidase —(B-D-Gal) com um substrato cromogênico (por exemplo, p-nitrofenil-B-D-galactosidase) ou substrato fluorogênico 4-metilumbeliferil-B-D-galactosidase.

Inúmeras outras combinações de enzima-substrato estão disponíveis para aqueles versados na técnica. Para uma revisão geral, consulte as Patentes nº U.S. 4.275.149 e 4.318.980.

Um marcador pode ser indiretamente conjugado com um anticorpo multiespecífico ou análogo de anticorpo. Por exemplo, o anticorpo pode ser conjugado com biotina e qualquer uma das três amplas categorias de marcadores mencionados acima pode ser conjugado com avidina ou estreptavidina, ou vice-versa. Biotina se liga seletivamente a estreptavidina e, assim, o marcador pode ser conjugado com o anticorpo nessa maneira indireta. Alternativamente, para atingir a conjugação indireta do marcador com a variante de polipeptídeo, a variante de polipeptídeo é conjugada com um — pequeno hapteno (por exemplo, digoxina) e um dos diferentes tipos de marcadores mencionados acima é conjugado com uma variante de polipeptídeo anti-hapteno (por exemplo, anticorpo anti-digoxina). Assim, a conjugação indireta do marcador com a variante de polipeptídeo pode ser alcançada (Hermanson, G. (1996) em Bioconjugate Techniques Academic Press, San Diego).

Tais anticorpos multiespecíficos marcados ou análogos de anticorpos marcados podem ser empregados em qualquer método de ensaio conhecido, como ELISA, ensaios de ligação competitiva, ensaios sanduíche direto e indireto, e ensaios de imunoprecipitação (Zola, (1987) Monoclonal — Antybodies: A Manual of Techniques, págs. 147 a 158, CRC Press, Inc.).

O marcador de detecção pode ser útil para localizar, visualizar, e quantificar um evento de ligação ou reconhecimento. Os anticorpos multiespecíficos marcados e análogos de anticorpos marcados da invenção podem detectar receptores de célula de superfície. Outro uso para anticorpos marcados detectáveis é um método de imunocaptura com base em microesferas que compreende conjugar uma microesfera com um anticorpo marcador fluorescente e detectar um sinal de fluorescência mediante a ligação de um ligante. Metodologias de detecção de ligação similares utilizam o efeito de ressonância plasmônica superficial (SPR) para medir e detectar interações de anticorpo-antígeno.

Marcadores de detecção como corantes fluorescentes e corantes quimioluminescentes (Briggs et al. (1997) "Synthesis of Functionalised Fluorescent Dyes and Their Coupling to Amines and Amino Acids", J. Chem.

Soc., Perkin-Trans. 1:1051 a 1058) fornecem um sinal detectável e são geralmente aplicáveis para o marcador de anticorpos, tipicamente com as seguintes propriedades: (i) o anticorpo marcado deve produzir um sinal muito alto com baixo fundo de modo que pequenas quantidades de anticorpos — possam ser sensivelmente detectadas em ambos os ensaios livres de célula e com base em célula; e (ii) o anticorpo marcado deve ser fosfatável de modo que o sinal fluorescente possa ser observado, monitorado e registrado sem branqueamento de foto significativo. Para aplicações que envolvem ligação de superfície de célula de anticorpo marcado em membranas ou superfícies de célula, especialmente células vivas, os marcadores tipicamente (iii) têm boa solubilidade em água para atingir concentração de conjugado eficaz e detecção de sensitividade e (iv) são não tóxicas para células vivas de modo a não interromper os processos metabólicos normais das células ou causam morte celular prematura.

A quantificação direta de intensidade de fluorescência celular e a enumeração de eventos marcados de modo fluorescente, por exemplo, ligação de superfície de célula de conjugados de peptídeo-corante, podem ser conduzidas em um sistema (Sistema FMATO 8100 HTS, Applied Biosystems, Foster City, Califórnia) que automatiza ensaios não radioativos, de mistura-e- leitura com células vivas ou microesferas (Miraglia, "Homogeneous cell- and bead-based assays for high throughput screening using fluorometric microvolume assay technology", (1999) J. of Biomolecular Screening 4:193 a 204). Os usos de anticorpos marcados também incluem ensaios de ligação de receptor de superfície celular, ensaios de imunocaptura, ensaios de imunoadsorção ligados à fluorescência (FLISA), caspase-clivagem (Zheng, "Caspase-3 controls both cytoplasmic and nuclear events associates with Fas- mediated apoptosis in vivo", (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:618 a 23; documento U.S. 6372907), apoptose (Vermes, "A novel assay for apoptosis.

Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labeled Annexin V" (1995) J.

Immunol.

Methods 184:39 a 51) e ensaios de citotoxicidade.

A tecnologia de ensaio de microvolume fluorométrico pode ser usada para identificar a regulação ascendente ou — descendente através de uma molécula que é alvejada para a superfície celular (Swartzman, "A homogeneous and multiplexed immunoassay for high- throughput screening using fluorometroc microvolume assay technology",

(1999) Anal.

Biochem. 271:143 a 51). Anticorpos multiespecíficos marcados e marcados análogos de anticorpos da invenção são úteis como biomarcadores de imageamento e sondas através dos vários métodos e técnicas de imageamento molecular e biomédico como: (i) MRI (imageamento de ressonância magnética); (ii) MicroCT (tomografia computadorizada); (iii) SPECT (tomografia computada de emissão de fóton único); (iv) PET (tomografia de emissão de pósitron) Chen et al (2004) Bioconjugate Chem. 15:41 a 49; (v) bioluminescência; (vi) fluorescência; e (vii) ultrassom.

Imunocintilografia é um procedimento de imageamento no qual anticorpos marcados com substâncias radioativas são administrados em um paciente animal ou humano e tira-se uma foto de sítios no corpo em que o anticorpo é localizado (documento U.S. 6528624). —Biomarcadores de imageamento podem ser medidos e avaliados de modo objetivo como um indicador de processos biológicos normais, processos patogênicos, ou respostas farmacológicas à uma intervenção terapêutica.

Biomarcadores podem ser de diversos tipos: Tipo O são mascadores de histórico naturais de uma doença e correlato longitudinalmente com índices — clínicos conhecidos, por exemplo, avaliação de MRI de inflamação sinuvial em artrite reumatoide; marcadores do Tipo | capturam o efeito de uma intervenção de acordo com um mecanismo-de-ação, embora o mecanismo possa não ser associado a um resultado clínico; marcadores do Tipo Il funcionam como desfechos secundários em que a mudança em, ou sinal do, biomarcador prevê um benefício clínico para “validar” a resposta alvejada, como erosão de osso medida em artrite reumatoide através de CT.

Biomarcadores de imageamento podem, assim, fornecer informações terapêuticas famacodinâmicas (PD) sobre: (i]) expressão de uma proteína alvo, (ii) ligação de um produto terapêutico à proteína alvo, isto é, seletividade, e (ili) dados farmacocinéticos de meia vida e desaparecimento.

Vantagens de biomarcadores de imageamento in vivo em relação a biomarcadores com base laboratorial incluem: tratamento não invasivo, quantificável, avaliação de corpo inteiro, avaliação e dosagem repetitiva, isto é, múltiplos pontos no tempo, e efeitos potencialmente transferíveis de resultados pré-clínicos (animal pequeno) para clínicos (humano). Para algumas aplicações, o bioimageamento suplanta ou minimiza o número de experimentos animais em estudos pré-clínicos.

Marcadores de imageamento de radionuclíideo incluem —radionuclíideos como *H, "'C, "ºC, "SF, 3?P, *s, “cu, Ga, *Y, “*Te, in, 31, 124, 1251, 1941, Xe, Lu, ?UAt, ou 2 Bi.

O íon de metal de radionuclídeo pode ser complexado com um ligante quelante como DOTA.

Reagentes ligantes como DOTA-maleimida (4-maleimidobutiramidobenzil-DOTA) podem ser preparados através da reação de aminobenzi:-DOTA com ácido 4- —maleimidobutírico (Fluka) ativado com isopropilcloroformato (Aldrich), seguindo o procedimento de Axworthy et al. (2000) Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

USA 97(4):1802 a 1807). Reagentes de DOTA-maleimida reagem com a sulfidrila livre do reticulador modificado dos anticorpos multiespecíficos ou análogos de anticorpos da invenção e fornecem um ligante de complexação de metal no anticorpo (Lewis et al (1998) Bioconj.

Chem. 9:72 a 86). Reagentes de marcação de ligante quelante como DOTA-NHS (ácido 1,4,7,10-tetra- azaciclododecano-1,4,7,10-tetra-acético mono (éster de N-hidroxisuccinimida) são comercialmente disponíveis (Macrocyclics, Dallas, TX). Imageamento de alvo receptor com anticorpos marcados de radionuclíideo podem fornecer um marcador de ativação de trajetória mediante detecção e quantificação de acumulação progressiva de anticorpos em tecido com tumor (Albert et al (1998) Bioorg. Med. Chem. Lett. 8:1207 a 1210). Os radio-metais conjugados podem — permanecer intracelulares seguindo degradação lisossomal.

Métodos de marcação de peptídeo são bem conhecidos. Consulte Haugland, 2003, Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes, Inc.; Brinkley, 1992, Bioconjugate Chem. 3:2; Garman, (1997) Non-Radioactive Labelling: A Practical Approach, — Academic Press, Londres; Means (1990) Bioconjugate Chem. 1:2; Glazer et al (1975) Chemical Modification of Proteins. Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology (T. S. Work e E. Work, Editores) American Elsevier Publishing Co., Nova York; Lundblad, R. L. e Noyes, C. M. (1984) Chemical Reagents for Protein Modification, Vols. | e Il, CRC Press, Nova York; Pfleiderer, G. (1985) “Chemical Modification of Proteins”, Modern Methods in Protein Chemistry, H. Tschesche, Editor, Walter DeGryter, Berlin e Nova York; e Wong (1991) Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking, CRC Press, Boca Raton, Fla); De Leon-Rodriguez et al (2004) Chem.Eur. J. 10:1149 a 1155; Lewis et al (2001) Bioconjugate Chem. 12:320 a 324; Li et al (2002) —Bioconjugate Chem. 13:110 a 115; Mier et a/. (2005) Bioconjugate Chem. 16:240 a 237.

Peptídeos e proteínas marcados com duas porções químicas, um repórter fluorescente e arrefecedor brusco em proximidade o suficiente são submetidos a transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET). Grupos de repórter são tipicamente corantes fluorescentes que são excitados mediante luz em certo comprimento de onda e transferem energia para um aceitante, ou arrefecedor brusco, grupo, com o deslocamento de Stokes apropriado para emissão em luminosidade máxima. Corantes fluorescentes incluem moléculas com aromaticidade estendida, como fluoresceina e rodamina, e seus derivados.

O repórter fluorescente pode ser parcialmente ou de modo significativo bruscamente arrefecido pela porção de arrefecedor brusco em um peptídeo intacto.

Mediante clivagem do peptídeo por uma peptidase ou protease, um aumento detectável em fluorescência pode ser medido (Knight, C. (1995) “Fluorimetric Assays of Proteolytic Enzymes”, Methods in Enzymology, Academic Press, 248:18 a 34). Os anticorpos multiespecíficos marcados e análogos de anticorpos marcados da invenção também podem ser usados como um agente de purificação de afinidade.

Nesse processo, o anticorpo marcado é imobilizado em uma fase sólida como uma resina Sefadex ou papel de filtro, com o uso de métodos bem conhecidos na técnica.

O anticorpo imobilizado é posto em contato com uma amostra que contém o antígeno a ser purificado, e depois disso o suporte é lavado com um solvente adequado que removerá substancialmente todo o material na amostra exceto o antígeno a ser purificado, que é ligado ao variante de polipeptídeo imobilizado.

Finalmente, o suporte é lavado com outro solvente adequado, como tampão de glicina, pH 5,0, que irá liberar o antígeno do variante de polipeptídeo.

Reagentes de marcação tipicamente suportam funcionalidade reativa que pode reagir (i) diretamente com a sulfidrila livre do reticulador modificado para formar o anticorpo marcado multiespecífico ou análogo de anticorpo marcado ou (ii) com um anticorpo ligante para formar o anticorpo marcado.

A funcionalidade reativa de reagentes de marcação inclui: maleimida, haloacetila, iodoacetamida éster de succinimidila (por exemplo, NHS, N- —hidroxisuccinimida), isotiocianato, cloreto de sulfonila, 2,6-diclorotriazinila, éster pentafluorofenila, e fosforamidita, embora outros grupos funcionais também possam ser usados.

Um grupo funcional reativo exemplificativo é éster N-

hidroxisuccinimídila (NHS) de um substituinte de grupo carboxila de um marcador detectável, por exemplo, biotina ou um corante fluorescente. O éster NHS do marcador pode ser pré-formado, isolado, purificado, e/ou caracterizado, ou o mesmo pode ser formado in situ e reagido com um grupo —nucleofílicode um anticorpo. Tipicamente, a forma de carboxila do marcador é ativada mediante reação com alguma combinação de um reagente de carbodiimida, por exemplo, diciclohexilcarbodiimida, diisopropilcarbodiimida, ou um reagente de urônio, por exemplo, TSTU tetrafluoroborato de (O-(N- Succinimidil)-N,N,N' N'-tetrametilurônio, HBTU hexafluorofosfato de (O- benzotriazol-1-yI)-N,N,N' N'-tetrametilurônio), ou HATU hexafluorofosfato de (O-(7-azabenzotriazol-1-il)-N,N,N' N'-tetrametilurônio), um ativador, como 1- hidróxibenzotriazol (HOBt), e N-hidroxisuccinimida para render o éster NHS do marcador. Em alguns casos, o marcador e o anticorpo podem ser acoplados mediante ativação in situ do marcador e reação com o anticorpo para formar o conjugado de marcador-anticorpo em uma etapa. Outros reagentes de acoplamento e ativação incluem TBTU (hexafluorofosfato de 2-(1H- benzotriazo-1-i1)-1-1,3,3-tetrametilurônio), TFFH (N,N' Nº N”-tetrametilurônio 2- fluoro-hexafluorofosfato), PyBOP (hexafluorofosfato de benzotriazol-1-il-ó6xi-tris- pirrolidino-fosfônio, EEDQ (2-etóxi-1-etoxicarbonil-1,2-diidro-quinolina),) DCC —(diciclohexilcarbodiimida); DIPCDI (diisopropilcarbodiimida),) MSNT (1- (mesitileno-2-sulfonil)-3-nitro-1H-1,2,4-triazol, e haletos de aril sulfonila, por exemplo, triisopropilbenzenocloreto de sulfonila.

ANTICORPOS MULTIESPECÍFICOS E ANÁLOGOS DE ANTICORPOS QUE CONTÉM PEPTÍDEO DE LIGAÇÃO DE ALBUMINA (ABP) Uma ligação plasma-proteina pode ser um meio eficaz de aprimorar as propriedades farmacocinéticas de moléculas de vida curta. À albumina é a proteina mais abundante no plasma. Peptídeos de ligação de albumina em soro (ABP) podem alterar a farmacodinâmica de proteínas de domínio ativo fundido, incluindo alteração de absorção, penetração, e difusão de tecido. Esses parâmetros farmacodinâmicos podem ser modulados através de seleção específica do peptídeo de ligação de albumina sequência em soro apropriado (publicação de patente nº U.S. 20040001827). Uma série de peptídeos de ligação de albumina foram identificados mediante triagem de exibição em fago (Dennis et al. (2002) “Albumin Binding As A General Strategy For Improving The Pharmacokinetics Of Proteins” J Biol Chem. 277:35035 a 35043; documento WO 01/45746). Compostos da invenção incluem sequências de ABP ensinadas por: (i) Dennis et al (2002) J Biol Chem. 277:35035 a 35043 nas Tabelas Ill e IV, página 35038; (ii) documento U.S. 20040001827 em

[0076] SEQ ID NOS: 9 a 22; e (iii) documento WO 01/45746 nas páginas 12 a 13, SEQ ID NOS: 21 a z14.

Anticorpos multiespecíficos que contêm ligação de albumina (ABP) foram sintetizados por reação de um maleimido-ABP com um anticorpo —multiespecífico ou análogo de anticorpo que contém um reticulador modificado que produz um grupo livre de sulfidrila.

As sequências de peptídeo de ligação de albumina exemplificativas incluem, mas não se limitam às sequências de aminoácido listadas em SEQ ID NOS: 23 a 27: CDKTHTGGGSQARLMEDICLPRWGCLWEDDF SEQ ID NO: 23 QRLMEDICLPRWGCLWEDDF SEQ ID NO: 24 QRLIEDICLPRWGCLWEDDF SEQ ID NO: 25 RLIEDICLPRWGCLWEDD SEQ ID NO: 26 DICLPRWGCLW SEQ ID NO: 27 As sequências de peptídeo de ligação de albumina (ABP) liga albumina de múltiplas espécies (camundongo, rato, coelho, bovino, reso, babuíno e humano) com Kd (coelho) = 0,3 uM. O peptídeo de ligação de albumina não compete com ligantes conhecidos para ligar albumina e tem uma meia vida (T%) em coelhos de 2,3 horas.

CONJUGADOS DE FÁRMACO Os anticorpos multiespecíficos e análogos de anticorpo da invenção, particularmente aqueles sintetizados com reticuladores modificados que têm um grupo livre de sulfidrila, podem ser conjugados com qualquer agente terapêutico, isto, porção de fármaco, que pode ser presa de forma covalente ao anticorpo através de um grupo sulfidrila reativo.

Uma realização exemplificativa de um composto conjugado de anticorpo-fármaco (ADC) compreende um anticorpo multiespecífico ou análogo de anticorpo (cada um referido na seguinte discussão como Ab), e uma porção de fármaco (D) em que o anticorpo multiespecífico ou análogo de anticorpo foi sintetizado com um reticulador modificado que tem um grupo livre de sulfidrila (L) e o anticorpo é preso através do grupo livre de sulfidrila a D; sendo que a composição tem a Fórmula |: Ab—(L-D), 1 em que p é 1, 2, 3 ou 4. A quantidade de porções de fármaco que pode ser conjugada por meio de uma porção de ligante reativo de tiol a um anticorpo multiespecífico ou análogo de anticorpo é limitada pela quantidade de tióis reativos que são introduzidos pelos métodos descritos na presente invenção.

Outra realização exemplificativa de um composto conjugado de anticorpo-fármaco (ADC) compreende um anticorpo multiespecífico ou análogo de anticorpo (Ab), um peptídeo de ligação de albumina (ABP) e uma porção de fármaco (D) em que o anticorpo é ligado à porção de fármaco por uma porção de ligante(L)eo anticorpo é ligado ao peptídeo de ligação de albumina por uma ligação de amida ou uma segunda porção de ligante; sendo que a composição tem a Fórmula la: ABP-Ab—H(L-D), la em que p é 1,2,3, ou 4.

Os compostos ADC da invenção incluem aqueles com utilidade para atividade anticâncer. Particularmente, os compostos incluem um anticorpo conjugado, isto é, ligado de forma covalente por um ligante, a uma porção de — fármaco, isto é, toxina. Quando o fármaco não está conjugado a um anticorpo, o fármaco tem um efeito citotóxico ou citostático. A atividade biológica da porção de fármaco é assim modulada por conjugação a um anticorpo. Os conjugados de anticorpo multiespecífico-fármaco e conjugados de análogo de anticorpo-fármaco (ADC) da invenção seletivamente entrega uma dose eficaz de um agente citotóxico ao tecido de tumor assim maior seletividade, isto é, uma dose eficaz mais baixa, pode ser atingida.

Em uma realização, a biodisponibilidade do ADC da invenção, ou um metabólito intracelular do ADC, é aprimorada em um mamífero quando comparado a um composto de fármaco que compreende a porção de fármaco do ADC e desprovido do componente de anticorpo. Além disso, a biodisponibilidade do ADC, ou um metabólito intracelular do ADC é aprimorado em um mamífero quando comparado ao componente de anticorpo do ADC desprovido da porção de fármaco.

PORÇÕES QUÍMICAS DE FÁRMACO A porção de fármaco (D) dos conjugados de anticorpo-fármaco (ADC) inclui qualquer composto, porção ou grupo que tem um efeito citotóxico ou citostático. As porções de fármaco incluem: (i) agentes quimioterapêuticos, que podem funcionar como inibidores de microtubulina, inibidores de mitose, inibidores de topoisomerase, ou intercaladores de DNA; (ii) toxinas de proteína, —que podem funcionar de modo enzimático; e (iii) radioisótopos.

As porções químicas de fármaco exemplificativo incluem, mas não se limitam a, um maitansinoide, uma auristatina, uma dolastatinay um tricoteceno, CC1065, uma caliqueamicina e outros antibióticos de enediina, um taxano, uma antraciclina, e estereoisômeros, isósteres, análogos ou derivados do mesmo. Os compostos de maitansina adequados para uso como porções químicas de fármaco de maitansinoide são bem conhecidos na técnica, e — podem ser isolados de fontes naturais de acordo com os métodos conhecidos, produzidos com uso de técnicas de engenharia genética (consulte Yu et al. (2002) PROC. NAT. ACAD. SCI. (EUA) 99:7.968 a 7.973), ou maitansinol e análogos de maitansinol preparados sinteticamente de acordo com os métodos conhecidos.

As porções químicas de fármaco de maitansinoide exemplificativas incluem aquelas que têm um anel aromático, tal como: decloro C-19 (US 4256746) (preparado por redução de hidreto de lítio e alumínio de ansamitocina P2); hidróxi C-20 (ou demetila C-20) +/- decloro C-19 (Patente nº US 4361650 e 4307016) (preparado por desmetilação com uso de Streptomyces ou Actinomyces ou descloração com uso de LAH); e demetóxi C- 20, acilóxi C-20 (-OCOR), +/-decloro (Patente nº US 4.294.757) (preparado por acilação com uso de cloretos de acila) e aqueles que têm modificações em outras posições.

As porções químicas de maitansinoide exemplificativas também incluem aquelas que têm modificações tais como: SH C-9 (Patente nº US

4.424.219) (preparado pela reação de maitansinol com H2S ou P2S;5); alcoximetila C-14 (demetóxi/CH, OR) (US 4331598); hidroximetila ou aciloximetila C-14 (CH2OH ou CH20Ac) (Patente nº US 4.450.254) (preparado junto à Nocardia); hidróxi/acilóxi C-15 (Patente nº US. 4.364.866) (preparado — pela conversão de maitansinol por Streptomyces); metóxi C-15 (Patente nº US

4.313.946 e 4.315.929) (isolado de Trewia nudlflora); N-demetila C-18 (Patente nº US 4.362.663 e 4.322.348) (preparado pela desmetilação de maitansinol por Streptomyces); e 4,5-deóxi (Patente 4.371.533) (preparado pela redução de tricloreto de titânio/LAH de maitansinol). Muitas posições em compostos de maitansina são conhecidas como sendo úteis como a posição de ligação, dependendo do tipo da ligação.

Por exemplo, para formar uma ligação de éster, a posição C-3 que tem um grupo hidroxila, a posição C-14 modificada com —hidroximetila, a posição C-15 com um grupo hidroxila e a posição C-20 que tem um grupo hidroxila são todas adequadas.

A porção de fármaco (D) dos conjugados de anticorpo-fármaco (ADC) de Fórmula | incluem maitansinoides que têm a estrutura: H;3C CR)JIm=S— co e o o o o PÉ não en.oº h em que a linha ondulada incida a ligação covalente ao átomo de enxofrede Da um ligante (L) de um conjugado de anticorpo-fármaco (ADC). R pode independentemente ser H ou uma alquila C;-Cs selecionada dentre metila, etila, 1-propila, 2-propila, 1-butila, 2-metil-1-propila, 2-butila, 2-metil-2- propila, 1-pentila, 2-pentila, 3-pentila, 2-metil-2-butila, 3-metil-2-butila, 3-metil-1- butila, 2-metil-1-butila, 1-hexila, 2-hexila, 3-hexila, 2-metil-2-pentila, 3-metil-2- —pentila, 4-metil-2-pentila, 3-metil-3-pentila, 2-metil-3-pentila, 2,3-dimetil-2-butila e 3,3-dimetil-2-butila.

A cadeia de alquileno que liga ao grupo amida ao átomo de enxofre pode ser metanila, etanila ou propila, isto é m é 1, 20u3. Os compostos de maitansina inibem a proliferação celular inibindo a formação de microtúbulos durante a mitose através da inibição da polimerização da proteína microtubulina, tubulina (Remillard et al (1975) Science 189:1.002 a 1.005). Maitansina e maitansinoides são altamente citotóxicos, mas seu uso clínico em terapia de câncer tem sido grandemente limitado por seus severos efeitos colaterais sistêmicos primariamente atribuídos a sua pobre seletividade para tumores.

Estudos clínicos com maitansina foram descontinuados devido a — sérios efeitos adversos no sistema nervoso central e sistema gastrointestinal system (Issel et al (1978) Can. Treatment. Rev. 5:199 a 207).

As porções químicas de fármaco de maitansinoide são porções químicas de fármaco atrativas em conjugados de anticorpo-fármaco devido ao fato de que são: (i) relativamente acessíveis para preparar por fermentação ou “modificação química, derivação de produtos de fermentação, (ii) receptivas à derivação com grupos funcionais adequados para conjugação através dos ligantes de não dissulfeto a anticorpos, (iii) estáveis em plasma, e (iv) eficazes contra uma variedade de linhagens de células tumorosas (US 2005/0169933; WO 2005/037992; Patente nº US. 5.208.020).

Como com outras porções químicas de fármaco, todos os estereoisômeros da porção de fármaco de maitansinoide são contemplados para os compostos da invenção, isto é, qualquer combinação das configurações R e S nos carbonos quirais de D. Em uma realização, a porção de fármaco de —maitansinoide (D) terá a seguinte estereoquímica: H3C CR)JMm=—S— e A fia

ES

CHÃO Oo

CHÃO À As realizações exemplificativas de porções químicas de fármaco maitansinoide incluem: DM1, (CRm = CHCHx; DM3, (CR)m =

CH2CH2CH(CH3); e DMA, (CR2)»n = CH2CH2C(CHsa)2, que têm as estruturas: HG —CHCHS— o '3 A, 2a A ” o o Cc A 2) : CH,O. ” ow! o AAA ÃAÃo êãHOo | CcHO Hn

TV CHCHC—S— 8 H3C 2a! o. A Ú A” He o Oo Cl N RAR CH.O. eo DM3 o PFAúÔ>O não êHOo | CH;O H é HG — CHCHCS— N | 4% Ca Cc a Pe o DMA CHãO. ' o

AAA EHO |

CHO À H O ligante pode ser ligado à molécula de maitansinoide em várias posições, dependendo do tipo da ligação. Por exemplo, uma ligação de éster pode ser formada por reação com um grupo hidroxila com uso de técnicas de ligação convencionais. A reação pode ocorrer na posição C-3 que tem um grupo hidroxila, na posição C-14 modificada com hidroximetila, na posição C-15 com um grupo hidroxila e na posição C-20 que tem um grupo hidroxila. Em uma realização preferencial, a ligação é formada na posição C-3 de maitansinol ou um análogo de maitansinol. A porção de fármaco (D) dos conjugados de anticorpo-fármaco

(ADC) de Fórmula | também incluem dolastatinas e seus análogos e derivados peptídicos, as auristatinas (Patente nº US 5.635.483; 5.780.588). Dolastatinas e auristatinas têm mostrado interferir na dinâmica de microtúbulo, hidrólise de GTP, e divisão nuclear e celular (Woyke et al (2001) Antimicrob. Agents and —Chemother. 45(12):3.580 a 3.584) e têm atividade anticâncer (Patente nº US.

5.663.149) e antifúngica (Pettit et al (1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42:2.961 a 2.965). Várias formas de uma porção de fármaco de dolastatina ou auristatina podem ser ligadas de forma covalente a um anticorpo através do término N (amino) ou do término C (carboxila) da porção de fármaco peptídica (WO 02/088172; Doronina et al (2003) Nature Biotechnology 21(7):778 a 784; Francisco et al (2003) Blood 102(4):1.458 a 1.465).

As porções químicas de fármaco incluem dolastatinas, auristatinas (Patentes nº US 5.635.483; 5.780.588; 5.767.237; 6.124.431), e análogos e derivados das mesmas. Dolastatinas e auristatinas têm mostrado interferir na dinâmica de microtúbulo, hidrólise de GTP, e divisão nuclear e celular (Woyke et al. (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12):3.580 a

3.584) e têm atividade anticâncer (US 5663149) e antifúngica (Pettit et al (1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42:2.961 a 2.965). A porção de fármaco de dolastatina ou auristatina pode ser ligada ao anticorpo através do término N (amino) ou do término C (carboxila) da porção de fármaco peptídica (WO 02/088172).

As realizações de auristatina exemplificativas incluem as porções químicas de fármaco DE e DF de monometilauristatina ligadas ao N-término, reveladas em: WO 2005/081711; Senter et al, Proceedings of the American Association for Cancer Research, Volume 45, Resumo Número 623, apresentado em 28 de março de 2004, A porção de fármaco (D) dos conjugados de anticorpo-fármaco (ADC) de Fórmula | incluem as porções químicas de fármaco de monometilauristatina MMAE e MMAF ligadas através do N-término ao anticorpo, e que têm as estruturas: é N AA 1 AS N "o N | O O O 0 O MMAE Á A 1 A A N ” N DS x DO o O To

MMAF Tipicamente, as porções químicas de fármaco à base de peptídeo podem ser preparadas por formação de uma ligação de peptídeo entre dois ou mais aminoácidos e/ou fragmentos de peptídeo. Tais ligações de peptídeo podem ser preparadas, por exemplo, de acordo com o método de síntese de fase líquida (consulte E. Schrôder e K. Lubke, “The Peptídeos”, volume 1, páginas 76 a 136, 1965, Academic Press) que é bem conhecido no campo de química de peptídeo.

A porção de fármaco inclui caliqueamicina e análogos e derivados da mesma. A família de caliqueamicina de antibióticos é capaz de produzir quebras de DNA de fita dupla a concentrações subpicomolares. Para a preparação de conjugados da família de caliqueamicina, consulte as Patentes nº US 5.712.374; 5.714.586; 5.739.116; 5.767.285; 5.770.701, 5.770.710;

5.773.001; 5.877.296. Os análogos subestruturais de caliqueamicina que podem ser usados incluem, mas não se limitam a, vi, 2, as, N-acetil-v(', PSAG e 8', (Hinman et al. Cancer Research 53:3.336 a 3.342 (1993), Lode et al. Cancer Research 58:2.925 a 2.928 (1998).

As toxinas de proteína incluem: cadeia A de difteria, fragmentos ativos de mão ligação de toxina de difteria, cadeia A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadeia A de ricina (Vitetta et al (1987) Science,

238:1098), cadeia A de abrina, cadeia A de modeccina A, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteinas de diantina, proteinas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII, e PAP-S), inibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inibidores de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, — fenomicina, enomicina, e os tricotecenos (WO 93/21232). Os radioisótopos terapêuticos incluem: *ºP, *%p, ºy, 1251, 131, Bin, Sm, "Re, * Re, 2! At, 2ºBi, 2"ºPb, e isótopos radioativos de Lu. O radioisótopo ou outros marcadores podem ser incorporados no conjugado de formas conhecidas (Fraker et al (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49 a 57; "Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy" Chatal, CRC Press 1989). Ácido 1-isotiocianatobenzil-3-metildietileno triaminepentaacético marcado com carbono 14 (MX-DTPA) é um agente de quelação exemplificativo para conjugação de um radionuclídeo ao anticorpo (WO 94/11026).

LIGANTES Um “Ligante” (L) é uma porção bifuncional ou multifuncional que pode ser usada para ligar uma ou mais Porções químicas de fármaco (D) e uma unidade de anticorpo (Ab) para formar conjugados de anticorpo multiespecífico-fármaco ou conjugados de análogo de anticorpo-fármaco (ADC) de Fórmula |. ADC pode ser preparado convenientemente com uso de um Ligante que tem funcionalidade reativa para ligação ao Fármaco e ao Ab. Um Ab pode formar uma ligação com um grupo funcional de um reagente de ligante, uma porção de fármaco ou intermediário de fármaco-ligante. Em um aspecto, um Ligante tem um sítio reativo que tem um grupo eletrofílico que e reativo a uma cisteína nucleofílica presente em um anticorpo ou fragmento de anticorpo. O tiol de cisteína do anticorpo ou fragmento de anticorpo é reativo com um grupo eletrofílico em um Ligante e forma uma ligação covalente a um

Ligante. Os grupos eletrofílicos úteis incluem, mas não se limitam a, grupos maleimida e haloacetamida. Os anticorpos ou fragmentos de anticorpo projetados por cisteína reagem com reagentes ligantes ou intermediários de fármaco-ligante, com grupos funcionais eletrofílicos tais como maleimida ou a-halo carbonila, de acordo com o método de conjugação na página 766 de Klussman, et a/. (2004), Bioconjugate Chemistry 15(4):765 a 773, e de acordo com os métodos descritos nos Exemplos. Em uma realização, o ligante L de um ADC tem a fórmula: em que: -A- é uma unidade esticadora ligada de modo covalente a um tiol de cisteína do anticorpo (Ab); aébloul; cada -W- é independentemente uma unidade de Aminoácido; w é independentemente um número inteiro na faixa de O a 12; -Y- é uma unidade espaçadora ligada de modo covalente à porção de fármaco; e yé0O, 1lou2.

UNIDADE ESTICADORA A unidade esticadora (-A-), quando presente, é capaz de ligar uma unidade de anticorpo a uma unidade de aminoácido (-W-). Nesse respeito, um anticorpo (Ab) tem um grupo livre de tiol de cisteína ou outro grupo livre de tiol que pode formar uma ligação com um grupo funcional eletrofílico de uma Unidade esticadora. As unidades Unidade esticadoras representativas dessa realização são representadas dentro dos parênteses duplos de Fórmulas Illa e Illb, em que Ab-, -W-, -Y-, -D, w e y são conforme descritos acima, e R é um radical bivalente selecionado dentre (CH>2),, carbociclila C3-Cg, O-(CH>),, arileno, (CH>)-arileno, -arileno-(CH2)J-, (CH2)-( carbociclila C3-Cs), (carbociclila C3-Cs8)—(CH2),, heterociclila C3-Cg, (CH2))-( heterocíclila C3-Csg), —(heterociclla — C3-Ca)-(CHa)Jm, — -(CH2)C(OINRº(CHa)r, — (CHoCHsO)r-, —(CHCH0)-CHa-, (CH2),C(O)NRº(CH2CH2O)-, (CH), C(O)NRº(CH.CH2O),-CH2-, A(CH2CH2O0),C(O)NRº(CH.CH2O)--, H(CHICH2O),C(O)NRº(CHICH2O),-CH2-, e -(CHXCH2O),C(O)NRº(CH2)-- ; em que Rº é H, alguila C1-Cs, fenila ou benzila; e r é independentemente um número inteiro na faixa de 1 a 10.

Arileno inclui radicais de hidrocarboneto aromático bivalentes de 6 a 20 átomos de carbono derivados pela remoção de dois átomos de hidrogênio de um sistema de anel aromático percursos. Os grupos arileno típicos incluem, mas não se limitam a, radicais derivados de benzeno, benzeno substituído, naftaleno, antraceno, bifenila e similares.

Os grupos heterocíclila incluem um sistema de anel em que um ou mais átomos de anel são um heteroátomo, por exemplo, nitrogênio, oxigênio e enxofre. O radical heterociclo compreende 1 a 20 átomos de carbono e 1a3 heteroátomos selecionados dentre N, O, P, e S. Um heterociclo pode ser um monociclo que tem 3 a 7 membros de anel (2 a 6 átomos de carbono e 1a 3 —heteroátomos selecionados dentre N, O, P, e S) ou um biciclo que tem 7 a 10 membros de anel (4 a 9 átomos de carbono e 1 a 3 heteroátomos selecionados dentre N, O, P, e S), por exemplo: um sistema de biciclo [4,5], [5,5], [5,6], ou [6,6]. Heterociclos são descritos em Paquette, Leo A.; “Principles of Modern Heterocyclic Chemistry" (W.A. Benjamin, Nova lorque, 1968), particularmente Capítulos 1, 3, 4, 6,7, e 9; “The Chemistry of Heterocyclic Compounds, À series of Monographs” (John Wiley & Sons, Nova lorque, 1950 até o presente), particularmente Volumes 13, 14, 16, 19 e 28, e J. Am. Chem. Soc. (1960) 82:5.566.

Os exemplos de heterocíclos incluem como forma de exemplo e não limitação piridila, diidropiridila, tetraidropiridila (piperiídila), tiazolila, tetraidrotiofenila, tetraidrotiofenila oxidada por enxofre, pirimidinila, furanila, tienila, pirrolila, pirazolila, imidazolila, tetrazolila, benzofuranila, tianaftalenila, indolila, indolenila, quinolinila, isoquinolinila, benzimidazolila, piperidinila, 4- piperidonila, pirrolidinila, 2-pirrolidonila, pirrolinila, tetraidrofuranila, bis- tetraidrofuranila, = tetraidropiranila, —bis-tetraidropiranila, - tetraidroquinolinila, tetraidroisoquinolinila, = decaidroquinolinila, octaidroisoquinolinila, = azocinila, triazinila, = 6H-1,2,5-tiadiazinila, = 2H,6H-1,5,2-ditiazinila, tienila, tiantrenila, piranila, isobenzofuranila, cromenila, xantenila, fenoxatinila, 2H-pirrolila, isotiazolila, isoxazolila, pirazinila, piridazinila, indolizinila, isoindolila, 3H-indolila, 1H-indazolila, purinila, 4H-quinolizinila, ftalazinila, naftiridinila, quinoxalinila, quinazolinila, cinolinila, pteridinila, 4Ah-carbazolila, carbazolila, B-carbolinila, fenantridinila, acridinila, pirimidinila, fenantrolinila, fenazinila, fenotiazinila, furazanila, fenoxazinila, isocromanila, cromanila, imidazolidinila, imidazolinila, pirazolidinila, pyrazolinila, piperazinila, indolinila, isoindolinila, quinuclidinila, morfolinila, — oxazolidinila, — benzotriazolila, — benzisoxazolila, — oxindolila, benzoxazolinila e isatinoila.

Os grupos carbocíclila incluem um anel saturado ou insaturado quetem3a7 átomos de carbono como um monociclo ou 7 a 12 átomos de carbono como um biciclo. Os carbociclos monocíclicos têm 3 a 6 átomos de anel, ainda mais tipicamente 5 ou 6 átomos de anel. Os carbociclos bicíclicos têm 7 a 12 átomos de anel, por exemplo, disposto como um sistema de biciclo [4,5], [5,5], [5,6] ou [6,6], ou 9 ou 10 átomos de anel dispostos como um sistema de biciclo [5,6] ou [6,6]. Os exemplos de carbociclos monocíclicos incluem ciclopropila, ciclobutila, ciclopentila, 1-ciclopent-1-enila, 1-ciclopent-2- enila, 1-ciclopent-3-enila, ciclohexila, 1-ciclohex-1-enila, 1-ciclohex-2-enila, 1- ciclohex-3-enila, cicloheptila, e ciclooctila.

Deve-se entender a partir de todas as realizações exemplificativas de ADC de Fórmula | tal como Ill a Vl, que mesmo onde não denotado expressamente, de 1 a 4 porções químicas de fármaco estão ligadas a um anticorpo ( p = 1 a 4), dependendo do número de grupos tiol reativos.

O ABS NRIT-C(O)—W,y—Y,-D

O Pa pos feneomanco mero) Ph Uma unidade esticadora ilustrativa é aquela de Fórmula lIlla, e é derivada de maleimido-caproila (MC) em que R*? é -(CHo)s-:

O : AN O

O MC Uma unidade esticadora ilustrativa é aquela de Fórmula Illa, e é derivada de maleimido-propanoila (MP) em que R? é -(CH2)2-: o o : AA o MP Outra unidade esticadora ilustrativa é aquela de Fórmula Illa em queR” é -(CHCH2O0)-CH,-eré2:

O AA

O Oo

Outra unidade esticadora ilustrativa é aquela de Fórmula Illa em que R"? é -(CH2),C(O)NRº(CH2CH20),-CH2- em que Rº é H e cada ré 2: Pp o

RAP

H O Oo MPEG Outra unidade esticadora ilustrativa é aquela de Fórmula Illb em que R”7 é -(CH)s-:

O

H O Em outra realização, a unidade esticadora está ligada à unidade de anticorpo por meio de uma ligação de dissulfeto entre um átomo de enxofre da unidade de anticorpo e uma átomo de enxofre da unidade esticadora. Uma unidade esticadora representativa dessa realização é representada dentro dos parênteses duplos da Fórmula IV, em que R””, Ab-, W-, -Y-, -D, we y são conforme descritos acima. ars fs-Rimao——y o ) Pp W Já em outra realização, o grupo reativo da Unidade esticadora contém um grupo funcional reativo a tiol que pode formar uma ligação com um tiol de cisteína livre ou outro tiol livre de um anticorpo. Os exemplos de grupos funcionais de reação a tiol incluem, mas não se limitam a, maleimida, o- —haloacetila, ésteres ativados tais como ésteres de succinimida, ésteres de 4-nitrofenila, ésteres de pentafluorofenila, ésteres de tetrafluorofenila, anidros, cloretos ácidos, cloretos de sulfonila, isocianatos e isotiocianatos. As unidades unidade esticadoras representativas dessa realização são representadas dentro dos parênteses duplos das Fórmulas Va e Vb, em que -R!?-, Ab-, W., -

Y-, -D, we y são conforme descritos acima. afs—-con-RT mao) ny p ) Pp Va ao fs— ent RT oo) NY p ) Pp Vb Em outra realização, o ligante pode ser um tipo dendrítico para ligação covalente de mais de uma porção de fármaco através de uma porção ligante multifuncional ramificada a um anticorpo (Sun et al (2002) —Bioorganic& Medicinal Chemistry Letters 12:2.213 a 2.215; Sun et al (2003) Bioorganic & Medicinal Chemistry 11:1.761 a 1.768; King (2002) Tetrahedron Letters 43:1.987 a 1.990). Os ligantes dendríticos podem aumentar a razão molar entre fármaco e anticorpo, isto é, carga, que está relacionada ao potencial do ADC. Assim, onde um anticorpo modificado por cisteina sustenta somente um grupo tiol de cisteina reativo, uma pluralidade de porções químicas de fármaco podem ser ligadas através de um ligante dendrítico.

UNIDADE DE AMINOÁCIDO O ligante pode compreende resíduos de aminoácido. A unidade de Aminoácido (-Wy,-), quando presente, liga o anticorpo (Ab) à porção de fármaco (D) do conjugado de anticorpo-fármaco (ADC) da invenção.

-W”- é uma unidade de dipeptídeo, tripeptídeo, tetrapeptídeo, pentapeptídeo, hexapeptídeo, heptapeptídeo, octapeptídeo, nonapeptídeo, decapeptídeo, undecapeptídeo ou dodecapeptídeo. Os resíduos de aminoácido que compreendem a unidade de Aminoácido incluem aqueles de ocorrência natural, assim como aminoácidos menores e análogos de aminoácido de ocorrência não naturali tal como citruliha Cada unidade -W- independentemente tem a fórmula denotada abaixo nos colchetes, e w é um número inteiro na faixa de O a 12:

o

N fe w em que R* é hidrogênio, metila, isopropila, isobutila, sec-butila, benzila, p-hidroxibenzila, -CH2OH, -CH(OH)CH3, -CH2CH2SCH3, -CH2CONH,, - CHCOOH, -CHXCH2CONH, -CHCHCOOH, -(CHo)3NHC(=NH)NH, - (CH2);NH2, —-(CH);NHCOCH3, -(CH2)3NHCHO, -(CH2)UNHC(=NH)NH3, - (CH9ANHz — -(CHINHCOCH3z —-(CHI)9ANHCHO, -(CHo)NHCONH, - (CH2)ANHCONH2, -CHICHCH(OH)CHaNH7, 2-piridilmetil-, 3-piridilmetil-, 4- piridilmetil-, fenila, ciclohexila,

O “ Cs xD ; < LI, É CS.

H A unidade de Aminoácido pode ser clivada de modo enzimático por uma ou mais enzimas, incluindo uma protease associada a tumor, para liberar a porção de Fármaco (-D), que em uma realização é protonada in vivo mediante liberação para fornecer um Fármaco (D).

As unidades -W,- úteis podem ser projetadas e otimizadas em sua seletividade para clivagem enzimática por uma enzima particular, por exemplo, uma protease associada a tumor. Em uma realização, uma unidade —-Wh, é aquela cuja clivagem é catalisada por catepsina B, C e D, ou uma protease de plasmídeo.

As unidades de Aminoácido -W,- exemplificativas incluem um dipeptídeo, um tripeptídeo, um tetrapeptideo ou um pentapeptídeo. Os dipeptídeos exemplificativos incluem: valina-citrulina (vc ou val-cit), alanina- fenilalanina (af ou ala-fe). Os tripeptideos exemplificativos incluem: glicina- valina-citrulina (gli-val-cit) e glicina-glicina-glicina (gli-gli-gli).

Quando R** é outro que não hidrogênio, o átomo de carbono ao qual R** está ligado é quiral. Cada átomo de carbono ao qual R'º* está ligado está independentemente na configuração (S) ou (R), ou uma mistura racêmica. As unidades de aminoácido podem assim ser puras como enantiômero, —racêmicas ou diastereoméricas.

UNIDADE ESPAÇADORA A unidade espaçadora (-Y,-), quando presente (y = 1 ou 2), liga uma unidade de Aminoácido (-“W,-) à porção de fármaco (D) quando uma unidade de Aminoácido está presente (w = 1-12).

Alternativamente, a unidade espaçadora liga a unidade esticadora à porção de fármaco quando a unidade de aminoácido está ausente. A unidade espaçadora também liga a porção de fármaco à unidade de anticorpo quando tanto a unidade de aminoácido quanto a unidade esticadora estão ausentes (w, y = O) As unidades unidade espaçadoras são de dois tipos gerais: —autoimolativa e não autoimolativa. Uma unidade espaçadora não autoimolativa é uma em que parte ou toda a unidade espaçadora permanece ligada à porção de fármaco após a clivagem, particularmente enzimática, de uma unidade de aminoácido do conjugado da anticorpo-fármaco ou da porção de fármaco- ligante.

Quando um ADC que contém uma unidade espaçadora de glicina- glicina ou uma unidade espaçadora de glicina passa por clivagem enzimática por meio de uma protease associada à célula tumorosa, uma protease associada à célula cancerosa ou uma protease associada a linfócito, uma glicina-glicina-porção de fármaco ou uma glicina-porção de fármaco é clivada de Ab-As-Ww-.

Em uma realização, uma hidrólise independente ocorre dentro da célula alvo, clivando a ligação glicina-porção de fármaco e liberando o —Fármaco.

Em outra realização -Y, é uma unidade de p- aminobenzilcarbamoila (PAB) (consulte os Esquemas 2 e 3) cuja porção de fenileno é substituída por Qm em que Q é -alguila C1-Cg, -O-( alquila C1-Cg), - halogênio,- nitro ou -ciano; e m é um número inteiro na faixa de 0 a 4.

As realizações exemplificativas de uma unidade espaçadora não autoimolativa (-Y-) são: -Gli-Gli-; -Gli-; -Ala-Fe-; -Val-Cit-.

Em uma realização, uma porção de fármaco-ligante ou um ADC é fornecido em que a unidade espaçadora está ausente (y=0), ou um sal farmaceuticamente aceitável ou solvato do mesmo.

Alternativamente, um ADC que contém uma unidade espaçadora autoimolativa pode liberar -D. Em uma realização, -Y- é um grupo PAB que é ligado a -W,- por meio do átomo de amino nitrogênio do grupo PAB, e conectado diretamente a -D por meio de um grupo carbonato, carbamato ou éter, em que o ADC tem a estrutura exemplificativa: Om fo Wy "Or o Pp em que Q é - alquila Cy-Cg, -O-( alquila C1-Cg), -halogênio, -nitro ou -ciano; m é um número inteiro na faixa de 0 a 4; e p na faixa de 1a4.

Outros exemplos de unidade espaçadoras autoimolativas incluem, mas não se limitam a, compostos aromáticos que são eletronicamente similares ao grupo PAB tal como derivados de 2-aminoimidazol-5-metanol (Hay et al. (1999) Bioorg. Med. Chem. Lett 9:2237) e orto ou para aminobenzilacetais. Podem ser usadas unidade espaçadoras que passam por ciclização mediante hidrólise da ligação de amida, tal como amidas do ácido 4- aminobutírico substituídas ou não substituídas (Rodrigues et al (1995) Chemistry Biology 2:223), sistemas de anel de biciclo[2.2.1] e biciclo[2.2.2] apropriadamente substituídos (Storm et al (1972) J. Amer. Chem. Soc. 94:5815) e amidas do ácido 2-aminofenilpropiônico (Amsberry, et al (1990) J. Org. Chem. 55:5.867). A eliminação de fármacos que contêm amina que são substituídos em glicina (Kingsbury et al (1984) J. Med. Chem. 27:1.447) são também exemplos de unidade espaçadora autoimolativa útil em ADCs.

Em uma realização a unidade espaçadora é um bis(hidroximetil)estireno ramificado (BHMS), que pode ser usado para incorporar e liberar múltiplos fármacos, que tem a estrutura: o Qm CHIOO, —D Íí DA 1 ) Ab AA MWMÇNHA CHAO), —D Pp que compreende uma unidade de dendrímero de 2-(4- —aminobenzilideno)propano-1,3-diol (WO 2004/043493; de Groot et al (2003) Angew. Chem. Int. Ed. 42:4.490 a 4.494), em que Q é - alquila C1-Cg, -O-( alquila C1-Cg), -halogênio, -nitro ou -ciano; m é um número inteiro na faixa de O a4,néOouli;epestánafaixade 1a4.

LIGANTES DENDRÍTICOS Em outra realização, o ligante pode ser um ligante do tipo dendrítico para ligação covalente de mais de uma porção de fármaco através de uma porção ligante multifuncional ramificada a um anticorpo (Sun et al (2002) Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 12:2.213 a 2.215; Sun et al (2003) Bioorganic & Medicinal Chemistry 11:1.761 a 1.768; King (2002)

Tetrahedron Letters 43:1.987 a 1.990). Os ligantes dendríticos podem aumentar a razão molar entre fármaco e anticorpo, isto é, carga, que está relacionada ao potencial do ADC. Assim, onde um anticorpo sustenta somente um grupo tiol de cisteíina reativo, uma pluralidade de porções químicas de — fármaco podem ser ligadas através de um ligante dendrítico.

As seguintes realizações exemplificativas de reagentes de ligante dendrítico permitem que até nove reagentes de porção de fármaco nucleofílicos sejam conjugados por reação com os grupos funcionais de mostarda de nitrogênio e cloroetila: o o CX, A 3

SN H o 1 x= CH OOoNEN AMENA) Noeo, o o N A —OYs

XY o 1 q Y= CH om chêNHeeeeNcoNNCcaNeN ) Neo o o Z, Ae 3 q XY Zz= — CHZOCHCHCNHCH.CX; o or 1 CHIOCH.CHCNHCHaCY;3 Em outra realização de uma unidade espaçadora, ramiíficada, ligantes dendríticos com unidades de dendrímero de 2,6-bis(hidroximetil)-p- cresol e 2,4,6-tris(hidroximetil)-fenol autoimolativas (WO 2004/01993; Szalai et al (2003) J. Amer. Chem. Soc. 125:15.688 a 15.689; Shamis et al (2004) J.

Amer. Chem. Soc. 126:1.726 a 1.731; Amir et al (2003) Angew. Chem. Int. Ed. 42:4.494 a 4.499) podem ser empregados como ligantes nos compostos da invenção. Em outra realização, as porções químicas D são as mesmas. Já em outra realização, as porções químicas D são diferentes. Em um aspecto, as unidades unidade espaçadoras (-Y,-) são representadas pelas Fórmulas (X) a (XII):

H Q — m e ás A o O x em que Q é - alquila C1-Cg, -O-( alquila C1-Csg), -halogênio, -nitro ou -ciano; e m é um número inteiro na faixa de 0 a 4; à —HN—CH,—CO— À XxI | NHCH3C(O)-NHCHZC(0)- :

XI As realizações de compostos de conjugado de anticorpo-fármaco de Fórmula | incluem Xilla (val-cit), XIllb (MC-val-cit), Xlllc (MC-val-cit-PAB): H Oo alan No H O sf p

À O NH? Xllla o

O H O Ab No NY O H os Ss

A O NH Xillb

Oo À o HO SS So of A E, ) O H OS, Ss * P ss O NH? XIlle Outras realizações exemplificativas dos compostos de conjugado de anticorpo-fármaco de Fórmula la incluem XIVa a XIVe:

O q N—X-C—D Ab—S o p XiVa 11 Ab— S CHIC Y— CD p XIVb Ab S CH,C—D p XIVc

O q Not Xp Ab—S

O Pp XxIVd

O O x H | Ab—S—HCH,C—N CD Pp XIVe em que X é:

me — ; (CH , —(CHCHO) =, i Oo = en Neta | ASI |

R (CH>) q AD ” ; or atoa R ; Vé:

LLOOS R a or —N(CHr e R é independentemente H ou alquila C,-Cs; e né 1 a 12. Em outra realização, um Ligante tem um grupo funcional reativo que tem um grupo nucleofílico que é reativo a um grupo eletrofílico presente em um anticorpo. Os grupos eletrofílicos úteis em um anticorpo incluem, mas não se limitam a, grupos carbonila cetona de aldeído. O heteroátomo de um grupo nucleofílico de um Ligante pode reagir com um grupo eletrofílico em um anticorpo e formar uma ligação covalente a uma unidade de anticorpo. Os grupos nucleofílicos úteis em um Ligante incluem, mas não se limitam a, hidrazida, oxima, amino, hidrazina, tiosemicarbazona, carboxilato de hidrazina, e arilidrazida. O grupo eletrofilico em um anticorpo fornece um sítio conveniente para ligação a um Ligante. Tipicamente, os ligantes do tipo peptídeo podem ser preparados por formação de uma ligação de peptídeo entre dois ou mais aminoácidos e/ou fragmentos de peptídeo. Tais ligações de peptídeo podem ser preparadas, por exemplo, de acordo com o método de síntese de fase líquida (E. Schrôder e K. Lúbke (1965) “The Peptides”, volume 1, páginas 76 a 136, Academic Press) que é bem conhecido no campo da química de peptídeo.

Os intermediários de ligante podem ser montados com qualquer combinação ou sequência de reações incluindo unidades unidade espaçadoras, unidade esticadoras e de aminoácido. As unidades unidade espaçadoras, unidade esticadoras e de aminoácido podem empregar grupos funcionais reativos que são eletrofílicos, nucleofílicos ou radical livre em natureza. Os grupos funcionais reativos incluem, mas não são limitados a:

AD —CcooH OH, 9 H

AD em que X é um grupo de saída, por exemplo, O-mesila, O-tosila, - CI, -Br, -|l; ou maleimida. Em outra realização, o ligante pode ser substituído por grupos que têm solubilidade ou reatividade modulada. Por exemplo, um substituinte carregado tal como sulfonato (-SO3") ou amônio, pode aumentar a solubilidade em água do reagente e facilitar a reação de ligação do reagente de ligante ao anticorpo ou à porção de fármaco, ou facilitar a reação de ligação de Ab-L (intermediário de anticorpo-ligante) com D, ou D-L (fármaco-intermediário ligante) com Ab, dependendo da via sintética empregada para preparar o ADC. Os compostos da invenção expressamente contemplam, mas não se limitam a, ADC preparado com reagentes de ligante: BMPEO, BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, —sulfo-SMCC, e sulfo-SMPB, e SVSB (succinimidil-(4-vinilsulfona)benzoato), e incluindo reagente de bis-maleimida: DTME, BMB, BMDB, BMH, BMOE, BM(PEO)s3, e BM(PEO),, que estão comercialmente disponíveis junto à Pierce Biotechnology, Inc., Customer Service Department, P.O. Box 117, Rockford, IL. 61105 U.S.A, U.S.A 1-800-874-3723, International +815-968-0747. Consulte as páginas 467 a 498, 2.003 a 2.004 Applications Handbook and Catalog. Os reagentes de bis-maleimida permitem a ligação do grupo tiol de um anticorpo ou fragmento de anticorpo modificado por cisteina, a uma porção de fármaco que contém tiol, marcador, ou intermediário ligante, de uma forma sequencial ou concorrente. Outros grupos funcionais além de maleimida, que são reativos com um grupo tiol de um anticorpo modificado por cisteína, porção de fármaco, marcador, ou intermediário ligante incluem iodoacetamida, bromoacetamida, vinil piridina, dissulfeto, dissulfeto de piridila, isocianato e isotiocianato. o ? tv Oo o Bra ENTAO, N o N / o Oo O BM(PEO)3 BM(PEO), Os reagentes de ligante úteis podem ser também obtidos por meio de outras fontes comerciais, tal como Molecular Biosciences Inc.(Boulder, CO), ou sintetizados em concordância com os procedimentos descritos em Toki et al (2002) J. Org. Chem. 67:1.866 a 1.872; Walker, M.A. (1995) J. Org. Chem. 60:5.352 a 5.355; Frisch et al (1996) Bioconjugate Chem. 7:180 a 186; US 6214345; WO 02/088172; US 2003130189; US2003096743; WO 03/026577; WO03/043583; e WO 04/032828.

As unidades esticadoras de fórmula (Illa) podem ser introduzidas em um Ligante por reação dos seguintes reagentes de ligante com o N-término de um unidade de aminoácido: O Oo

T Cortonsao-on(

O O em que n é um número inteiro na faixa de 1a 10 e Té -Hou- —SOsNa;

127 ' Oo O CX Demsanon O Oo em que n é um número inteiro na faixa de 0 a 3; Q o RR ELO os ;

W o o o o R Ar: o O. N o ; and À OO Só

O O, A ou Y : o) As unidades esticadoras podem ser introduzidas em um Ligante por reação dos seguintes reagentes bifuncionais com o N-término de uma unidade de aminoácido: o Q o o Q o Q o AO Pois MO Tony XAor)

Õ O O Oo UA NE Ro e Ana Ton) Ss: on)

Ô O em que X é Br ou |. As unidades unidade esticadoras de fórmula podem ser também introduzidas em um Ligante por reação dos seguintes reagentes bifuncionais com o N-término de uma unidade de aminoácido: = | O Q

S AN A Nº SS ON , 1d

O

SN es Au O Oo As unidades esticadoras de fórmula (Va) podem ser introduzidas em um Ligante por reação dos seguintes reagentes bifuncionais com o N- término de uma unidade de aminoácido: o o cetim) Pon :

O O. cet NO : O Oo As unidades esticadoras de isotiocianato da fórmula mostrada abaixo podem ser preparadas a partir de cloretos de ácido isotiocianatocarboxílico conforme descrito em Angew. Chem., (1975) 87(14),

517. S-CNRF-C(0)$ em que -R"?- é conforme descrito na presente invenção. Um reagente de ligante de dipeptídeo de valina-citrulina (val-cit ou vc) exemplificativo que tem uma unidade esticadora de maleimida e uma unidade espaçadora autoimolativa de para-aminobenzilcarbamoila (PAB) tem a estrutura: o

Q Ms or, HEM, O () AD SA Noz Fmoc-N z

H O TL Nº

HANTO em que Q é - alquila C1-Cg, -O-( alguila C1-Cs), -halogênio, -nitro ou -ciano; e m é um número inteiro na faixa de 0 a 4. Um reagente de ligante de dipeptídeo de fe-lis(Mtr) exemplificativo que tem uma unidade esticadora de maleimida e a uma unidade espaçadora autoimolativa de p-aminobenzila pode ser preparado de acordo com Dubowechik, et al. (1997) Tetrahedron Letters, 38:5.257 a 60, e tem a estrutura: Ame OH

PRO SS À

LA Fmoc-N 2H

H O RN HN—Mtr em que Mtr é mono-4-metoxitritila, Q é - alqguila C1-Cg, -O-( alquila C1-Cg), -halogênio, -nitro ou -ciano; e m é um número inteiro na faixa de 0 a 4. Os compostos de conjugado de anticorpo-fármaco exemplificativos da invenção incluem: Ab-S. o H Oo o Á LA "O N o ON N N N. Ma O “O e o oo ) o 4 PAb-MC- vc-PAB-MMAF Ab-S. [o] nu o o ALMA OA MAS o ON N N N Eta ÃO o x “o % ) o PAb-MC- vc-PAB-MMAE Ab-S. P o no

AAA OH O DO OO OOo TO ) p Ab-MC-MMAE Ab-S. o o H O n No “Ox ELA ) º 9 Oo oH Pp Ab-MC-MMAF em que Val é valina; Cit é citrulina; p é 1, 2, 3, ou 4, e Ab é um anticorpo multiespecífico ou análogo de anticorpo. Outros conjugados de fármaco e anticorpo exemplificativos em que a porção de fármaco de maitansinoide DM1 é ligada através de um ligante BMPEO a um grupo tiol de — trastuzumabe têm a estrutura: 9 4- Ab | bosradgo H;C —CHCHS 9º ? 34º e o

E CH;3O

À SA. º em que Ab é um anticorpo; n é 0, 1 ou 2; e pé 1,2, 3 ou 4. PREPARAÇÃO DE CONJUGADOS DE ANTICORPO-FÁRMACO O ADC de Fórmula | pode ser preparado por diversas vias, empregando reações químicas orgânicas, condições e reagentes conhecidos por aqueles versados na técnica, incluindo: (1) reação de um grupo cisteina de um anticorpo ou fragmento de anticorpo modificado por cisteína com um reagente de ligante, para formar um intermediário de anticorpo-ligante Ab-L, por meio de uma ligação covalente, seguida por reação com uma porção de fármaco ativada D; e (2) reação de um grupo nucleofílico de uma porção de fármaco com um reagente de ligante, para formar o intermediário de fármaco- ligante D-L, por meio de uma ligação covalente, seguida por reação com um grupo cisteína de um anticorpo modificado por cisteíina. Os métodos de conjugação (1) e (2) podem ser empregados com uma variedade de anticorpos projetados de cisteína, porções químicas de fármaco, e ligantes para preparar os conjugados de anticorpo-fármaco de Fórmula |.

Os grupos tiol de cisteína de anticorpo são nucleofílicos e capazes de reagir para formar ligações covalentes com grupos eletrofílicos em reagentes de ligante e intermediários de fármaco-ligante incluindo: (i) ésteres ativos ais como ésteres de NHS, ésteres de HOBt, haloformatos, e haletos ácidos; (ii) haletos de alquila e benzila, tal como haloacetamidas; (ili) grupos aldeídos, cetonas, carboxila e maleimida; e (iv) dissulfetos, incluindo dissulfetos de piridila, por meio de troca de sulfeto. Os grupos nucleofílicos em uma porção de fármaco incluem, mas não se limitam a: grupos amina, tiol, hidroxila, hidrazida, oxima, hidrazina, tiosemicarbazona, carboxilato de hidrazina, e arilhidrazida capazes de reagir para formar ligações covalentes com grupos eletrofílicos em porções químicas de ligante e reagentes de ligante.

A maitansina pode ser, por exemplo, convertida em Mai-SSCH;, que pode ser reduzida a tiol livre, Mai-SH, e reagira com um anticorpo modificado (Chari et al (1992) Cancer Research 52:127 a 131) para gerar um imunoconjugado de maitansinoide-anticorpo com um ligante dissulfeto. Os conjugados de anticorpo-maitansinoide com ligantes de dissulfeto forma relatados (WO 04/016801; US 6884874; US 2004/039176 A1; WO 03/068144; US 2004/001838 A1; Patente nº US 6441163, 5208020, 5416064; WO 01/024763). O ligante de dissulfeto SPP é construído com reagente de ligante 4-(2-piridiltio) pentanoato de N-succinimidila.

Em certas condições, os anticorpos ou fragmentos de anticorpo modificados por cisteína podem ser tornados reativos por conjugação com reagentes de ligante por tratamento com um agente redutor tal como DTT (reagente de Cleland, ditiotreitol)) ou TCEP cloridrato de (tris(2- —carboxietilfosfina; Getz et al (1999) Anal. Biochem. Volume 273:73 a 80; Soltec Ventures, Beverly, MA). Os anticorpos monoclonais modificados por cisteína, de comprimento completo, ou Fabs (TioMabs; TioFabs) expressos em células CHO podem ser reduzidos com um excesso de cerca de 50 vezes de TCEP por 3 horas a 37 ºC para reduzir as ligações de dissulfeto que podem se formar entre os resíduos de cisteina recentemente introduzidos e a cisteína presente no meio de cultura. Os TioMabs ou TioFabs reduzidos podem ser diluídos e carregados em colina de HiTrap S em acetato se sódio a 10 mM, pH 5, e —eluídoscom PBS contendo cloreto de sódio a 0,3M. As ligações de dissulfeto podem ser reestabelecidas entre os resíduos de cisteína presentes no Mab pai com sulfato de cobre aquoso diluído (200 nM) (CuSO,) à temperatura ambiente, de um dia para o outro. Outros oxidantes, isto é, agentes de oxidação, e condições de oxidação, que são conhecidos na técnica podem ser usados. A oxidação ao ar ambiente é também eficaz. Essa etapa de reoxidação parcial branda forma dissulfetos de intracadeia eficazmente com alta fidelidade. Um excesso aproximado de 10 vezes de intermediário de fármaco-ligante, por exemplo, BM(PEO).-DM1 pode ser adicionado, misturado e deixado em repouso por cerca de uma hora à temperatura ambiente para efetuar a conjugação e formar o conjugado de anticorpo-fármaco. A mistura de conjugação pode ser filtrada em gel e carregada e eluída através de uma coluna de HiTrap S para remover o intermediário de fármaco-ligante em excesso e outras impurezas.

ENSAIOS DE PROLIFERAÇÃO CELULAR IN VITRO Em geral, a atividade citotóxica ou citostática de um anticorpo, por exemplo, um anticorpo multiespecífico ou análogo de anticorpo da invenção, ou conjugado de anticorpo-fármaco da invenção (ADC) é medida por: exposição anticorpo ou ao ADC em um meio de cultura de célula; cultura das células por um período de cerca de 6 horas a cerca de 5 dias; e medição da viabilidade de célula. Os ensaios in vitro baseados em célula são usados para medir a viabilidade (proliferação), citotoxicidade, e indução de apoptose (ativação de caspase) pelos anticorpos multiespecíficos, análogos de anticorpo e ADC da invenção.

A potência in vitro de anticorpos multiespecíficos, análogos de anticorpo, e ADC é medida por um ensaio de proliferação celular. O Ensaio de Viabilidade de Célula Luminescente CeliTiter-Gloº está comercialmente disponível (Promega Corp., Madison, WI), o método de ensio homogêneo com —basena expressão recombinante de luciferase de Coleoptera (Patentes nº US 5583024; 5674713 e 5700670). Esse ensaio de proliferação celular determina a quantidade de células viáveis na cultura com base na quantificação do ATP presente, um indicador de células metabolicamente ativas (Crouch et al (1993) J. Immunol. Meth. 160:81 a 88; US 6602677). O Ensaio CellTiter-Gloº pode ser conduzido em formato de 96 poços, tornando-o receptivo à triagem de alto rendimento automática (HTS) (Cree et al (1995) AntiCancer Drugs 6:398 a 404). O procedimento de ensaio homogêneo envolve adicionar o único reagente (Reagente CellTiter-Gloº) diretamente às células cultivadas em meio suplementado por soro. As etapas de lavagem das células, remoção de meio e múltiplos pipetamentos não são necessárias. O sistema detecta tão pouco quanto 15 células/poço em um formato de 384 poços em 10 minutos após a adição do reagente e mistura. As células podem ser tratadas continuamente com anticorpo multiespecífico, análogo de anticorpo ou ADC, ou podem ser tratadas e separadas dos anticorpos ou ADC. De forma geral, as células tratadas brevemente, isto é 3 horas, mostram os mesmos efeitos potenciais que as células tratadas continuamente.

O formato de “adição-mistura-medição" homogêneo resulta em lise celular e geração de um sinal luminescente proporcional à quantidade de ATP presente. A quantidade de ATP é diretamente proporcional à quantidade de células presentes na cultura. O Ensaio CellTiter-Gloº gera um sinal luminescente “do tipo brilho”, produzido pela reação da luciferase, que tem uma meia vida de forma geral maior que cinco horas, dependendo do tipo de célula e meio usados. As células viáveis são refletidas em unidades de luminescência relativa (RLU). O substrato, Luciferinrca de Besouro, é oxidativamente descarboxilado por luciferase de vaga-lume recombinante com conversão concomitante de ATP em AMP e geração de fótons. A meia vida estendida elimina a necessidade de usar injetores de reagente e fornece flexibilidade para —modo contínuo ou em lotes de múltiplas placas. Esse ensaio de proliferação celular pode ser usado com vários formatos de múltiplos poços, por exemplo, formato de 96 ou 384 poços. Os dados podem ser registrados por luminômetro ou dispositivo de imageamento de câmera CCD. A saída de luminescência é apresentada como unidades de luz relativas (RLU), medias pelo tempo. —Alternativamente, os fótons da luminescência podem ser contados em um contador de cintilações na presença de um cintilante. As unidades de luz podem ser representadas então como CPS — contagens por segundo. Luciferase ATP + Luciferin + Oy ———— x Oxyluciferin + AMP + PPi + CO, + light Mg*? ADMINISTRAÇÃO IN Vivo Os anticorpos multiespecíficos, análogos de anticorpo e conjugados de anticorpo-fármaco (ADC) da invenção podem ser administrados por qualquer via apropriada à condição a ser tratada. Tais anticorpos serão tipicamente administrados de modo parental, isto é, infusão, subcutâneo, intramuscular, intravenoso, intradérmico, intratecal e epidural.

FORMULAÇÕES FARMACÊUTICAS As formulações farmacêuticas de anticorpos multiespeciíficos, análogos de anticorpo, e conjugados de anticorpo-fármaco (ADC) terapêuticos da invenção são tipicamente preparadas para administração parenteral, isto é, bolo, intravenosa, injeção intratumor com um veículo parental farmaceuticamente aceitável e em uma forma injetável de dosagem unitária. —Um anticorpo multiespecífico, análogo de anticorpo, ou conjugado de anticorpo- fármaco (ADC) que tem o grau desejado de pureza é opcionalmente misturado com diluentes, carreadores, excipientes ou estabilizantes farmaceuticamente aceitáveis (Remington's Pharmaceutical Sciences (1980) 16º edição, Osol, A.

Ed.), na forma de uma formulação liofilizada ou uma solução aquosa. Os diluentes, carreadores, excipientes e estabilizantes aceitáveis —nãosão tóxicos aos receptores das dosagens e as concentrações empregadas, e incluem tampões tais como fosfato, citrato, e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes (tais como cloreto de octadecildimetilbenzila amônio; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio; fenol, álcool butílico ou benzílico; alquil —parabenos tais como metil ou propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; e m-cresol); polipeptídeos de peso molecular baixo (menos que cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como albumina de soro, gelatina, ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos tais como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, ou lisina; MmMonossacarídeos, dissacarídeos, e outros carboidratos incluindo glucose, manose, ou dextrinas; agentes de quelação tais como EDTA; açúcares tais como sacarose, manitol, trehalose ou sorbitol; contraíons formadores de sal tais como sódio; complexos metálicos (por exemplo, complexos de Zn-proteína); e/ou tensoativo não iônicos tais como TWEEN'Y, —PLURONICS"Y ou polietilenoglicol (PEG). Por exemplo, as formulações de anticorpo —anti-ErbB2 liofilizadas são descritis em WO 97/04801, expressamente incorporado ao presente a título de referência.

Os ingredientes farmacêuticos ativos podem ser também capturados em microcápsulas preparadas, por exemplo, por técnicas de —acumulação ou por polimerização interfacial, por exemplo, hidroximetilcelulose ou microcápsulas de gelatina e microcápsulas de poli-(metilmetacilato), respectivamente, em sistemas de entrega de fármaco coloidal (por exemplo, lipossomos, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Tais técnicas são reveladas em Remington's Pharmaceutical Sciences 16º edição, Osol, A. Ed. (1980).

Preparações de liberação prolongada podem ser preparadas. Os exemplos adequados de preparações de liberação prolongada incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos que contêm o ADC, tais matrizes são na forma de artigos moldados, por exemplo, filmes, ou microcápsulas. Os exemplos de matrizes de liberação prolongada incluem poliésteres, hidrogéis (por exemplo, poli(2-hidroxietil-metacrilato), ou poli(álcoo! vinílico)), polilactidas (US 3773919), copolímeros de ácido L-glutâmico e gama- etill-glutamato, acetato de etileno-vinila não degradável, copolímeros de ácido lático-ácido glicólico degradáveis tais como o LUPRON DEPOT'Y (microesferas injetáveis compostas de copolimero de ácido lático-ácido glicólico e acetato de leuprolida), e ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico.

As formulações a serem usadas para administração in vivo devem ser esteriizadas, o que é rapidamente realizado por filtração através de membranas de filtração esterilizadas.

As formulações incluem aquelas adequadas para as vias de administração anteriores. As formulações podem ser convenientemente apresentadas em forma de dosagem unitária e podem ser preparadas por qualquer um dos métodos bem conhecidos na técnica de farmácia. As técnicas e formulações de forma geral são reveladas em Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co., Easton, PA). Tais métodos incluem a etapa de colocar em associação o ingrediente ático com o carreador que constitui um ou mais ingredientes acessórios. Em geral, as formulações são preparadas — colocando-se uniformemente e intimamente em associação o ingrediente ativo com carreadores líquidos ou carreadores sólidos finamente divididos ou ambos, e então, se necessário, moldar o produto.

As suspensões aquosas da invenção contêm os materiais ativos em mistura por adição com excipientes adequados para a produção de suspensões aquosas. Tais excipientes incluem um agente de suspensão, tal como carboximetilcelulose de sódio, croscarmelose, povidona, metilcelulose, hidroxipropil metilcelulose, alginato de sódio, polivinilpirrolidona, goma —tragacante e goma acácia, e agentes dispersantes ou umectantes tais como fosfatideo de ocorrência natural (por exemplo, lecitina), um produto de condensação de um óxido de alqguileno com um ácido graxo (por exemplo, estearato de polioxietileno), um produto de condensação de óxido de etileno com um álcool alfático de cadeia longa (por — exemplo, —heptadecaetileneoxicetanol), um produto de condensação de óxido de etileno com um éster parcial derivado de um ácido graxo e um anidro de hexitol (por exemplo, mono-oleato de polioxietileno sorbitano). A suspensão aquosa pode também contar um ou mais conservantes tais como p-hidróxi-benzoato de etila ou n-propila, um ou mais agentes colorantes, um ou mais agentes flavorizantes eumoumais agentes adoçantes, tais como sacarose ou sacarina.

As composições farmacêuticas podem estar na forma de uma preparação injetável esterilizada, como uma suspensão aquosa ou oleaginosa injetável esterilizada. Essa suspensão pode ser formulada de acordo com a técnica conhecida com o uso daqueles agentes de dispersão ou molhagem e agentes de suspensão adequados que foram mencionados acima. A preparação injetável esterilizada também pode ser uma solução ou suspensão injetável esterilizada em um diluente ou solvente parenteralmente aceitável não tóxico, como uma solução em 1,3-butano-diol ou preparada como um pó liofiizado. Dentre os veículos e solventes aceitáveis que podem ser empregados estão água, solução de Ringer e solução de cloreto de sódio isotônica. Ademais, óleos fixos esterilizados podem, convencionalmente, ser empregados como um meio de solvente ou suspensão. Para este fim, qualquer óleo fixo brando pode ser empregado, incluindo mono ou diglicerídeos sintéticos. Além disso, ácidos graxos, como ácido oleico, podem, de outra forma, ser usados na preparação de injetáveis. A quantidade de ingrediente ativo que pode ser combinada ao material carreador para produzir lima forma de dosagem única variará — dependendo do hospedeiro tratado e do modo de administração particular. Por exemplo, uma solução aquosa destinada para a infusão intravenosa pode conter de cerca de 3 a 500 ug do ingrediente ativo por milímetro de solução para que aquela infusão de um volume adequado a uma taxa de cerca de 30 ml/h possa ocorrer.

As formulações adequadas para a administração parenteral incluem soluções de injeção esterilizadas aquosas e não aquosas, que podem conter antioxidantes, tampões, bacteriostáticos e solutos que tornam a formulação isotônica com o sangue do recipiente pretendido; e suspensões esterilizadas aquosas e não aquosas que podem incluir agentes de suspensão eagentes espessantes.

Embora a administração oral de terapêuticos de proteína seja desfavorável devido à hidrólise ou desnaturação no intestino, as formulações de anticorpos multiespecíficos, análogos de anticorpo ou ADC adequado para a administração oral podem ser preparados como unidades distintas, como cápsulas, pílulas ou tabletes, sendo que cada um contém uma quantidade predeterminada do anticorpo ou ADC.

As formulações podem ser embaladas em recipientes de dose unitária ou de doses múltiplas, por exemplo, ampolas e frascos vedados, e podem ser armazenadas em uma condição de congelamento a seco (liofiizadas) que exige apenas a adição de um carreador líquido esterilizado, por exemplo, água, para a injeção imediatamente anterior ao uso. Soluções e suspensões de injeção extemporâneas são preparadas a partir pós esterilizados, grânulos e tabletes do tipo previamente descrito. Certas formulações de dose única são aquelas que contêm uma dose diária ou subdose diária única, conforme citado acima no presente documento, ou uma fração apropriada das mesmas, do ingrediente ativo.

Composições veterinárias que compreendem pelo menos um ingrediente ativo, conforme definido acima, junto com um carreador veterinário também são, portanto, fornecidos.

Carreadores veterinários são materiais úteis para o fim de administrar a composição e podem ser materiais sólidos, líquidos ou gasosos que são, de outra forma, inertes ou aceitáveis na técnica veterinária e são compatíveis com o ingrediente ativo.

Essas composições veterinárias podem ser administradas parenteralmente, oralmente ou por qualquer outra rota desejada.

Usos TERAPÊUTICOS Os anticorpos multiespecíficos, os análogos de anticorpo e ADC descritos no presente documento podem ser usados para aplicações terapêuticas.

Por exemplo, tais anticorpos e fragmentos de anticorpo e conjugados anticorpo-fármaco podem ser usados para o tratamento de tumores, incluindo tumores pré-cancerosos, não metastáticos, metastático, e cancerosos (por exemplo, câncer em estado inicial), para o tratamento de distúrbios alérgicos ou inflamatórios, ou para o tratamento de doença —autoimune, ou para o tratamento de um indivíduo em risco de desenvolvimento de câncer (por exemplo, câncer de mama, câncer colorretal, câncer de pulmão, carcinoma de célula renal, glioma, ou câncer de ovário), um distúrbio alérgico ou inflamatório ou uma doença autoimune.

O termo câncer abrange uma coleção de distúrbios proliferativos, incluindo, mas sem limitação, crescimentos pré-cancerosos, tumores benignos, e tumores maligNOs Tumores benignos permanecem localizados no sítio de origem e não têm a capacidade de infiltrar, invadir ou metastizar para sítios distantes.

Tumores malignos invadirão e danificarão outros tecidos à sua volta.

Eles também podem ganhar a habilidade de se romperem de onde iniciaram e se espalharem para outras partes do corpo (metastizar), normalmente através da corrente sanguínea ou através do sistema linfático onde os nódulos linfáticos estão localizados. Tumores primários são classificados pelo tipo de tecido a partir do qual eles surgem; tumores metastáticos são classificados pelo tipo de tecido a partir do qual as células de câncer são derivadas. Através do tempo, as células de um tumor maligno se tornam mais anormais e parecem menos com células normais. Essa mudança na aparência de células cancerosas é chamada de grau de tumor e as células cancerosas são descritas como sendo bem diferenciadas, moderadamente diferenciadas, pouco diferenciadas, ou não diferenciadas. Células bem diferenciadas são de aparição bastante normal e se assemelham a células normais a partir das quais foram originadas. As células não diferenciadas são células que se tornaram tão anormais que não é mais possível determinar a origem das células.

O tumor pode ser um tumor sólido ou um tumor de tecido macio ou não sólido. Exemplos de tumores de tecidos macios incluem leucemia (por exemplo, leucemia mieloide crônica, leucemia mieloide aguda, leucemia linfoblástica aguda adulta, leucemia mieloide aguda, leucemia linfoblástica aguda de célula B madura, leucemia linfocítica crônica, leucemia polinfocítica, ou leucemia de células pilosas), ou linfoma (por exemplo, linfoma de não Hodgkin, linfoma de célula T cutâneo, ou doença de Hodgkin). Um tumor sólido inclui qualquer câncer de tecidos corporais diferentes de sangue, medula óssea ou o sistema linfático. Tumores sólidos podem ser adicionalmente separados naqueles de origem de célula epitelial e aqueles de origem de célula não epitelial. Exemplos de tumores sólidos de célula epitelial incluem tumores do trato gastrointestinal, cólon, mama, próstata, pulmão, rim, fígado, pâncreas, ovário, cabeça e pescoço, cavidade oral, estômago, duodeno, intestino delgado, intestino grosso, ânus, vesícula biliar, lábio, nasofaringe, pele, útero,

órgão genital masculino, órgãos urinários, bexiga, e pele.

Os tumores sólidos de origem não epitelial incluem sarcomas, tumores de cérebro, e tumores ÓssSeoS.

Cânceres epiteliais evoluem, em geral, a partir de um tumor — benigno para um estágio pré-invasivo (por exemplo, carcinoma in situ), para um câncer maligno, que penetrou a membrana basal e invadiu o estroma subepitelial.

Anticorpos multiespecíficos, análogos de anticorpo, e ADC também podem ser usados nessas aplicações terapêuticas, e anticorpos que ligam HER2 podem, em particular, ser usados para tratar o câncer de mama, câncer colorretal, câncer de pulmão, carcinoma de célula renal, glioma, ou câncer de ovário.

Outros indivíduos que são candidatos para receber composições dessa invenção têm, ou estão em risco de desenvolver, a proliferação anormal de tecido fibrovascular, acne rosácea, síndrome da imunodeficiência adquirida, oclusão arterial, queratite atópica, úlceras bacterianas, doença de Behçet, tumores de difusão pelo sangue, doença obstrutiva da carótida, neovascularização coroidal, inflamação crônica, deslocamento da retina crônico, uveite crônica, vitrite crônica, sobreuso de lentes de contato, rejeição de enxerto córneo, neovascularização córnea, neovascularização de enxerto córneo, doença de Crohn, doença de Eales, queratoconjutivite epidêmica, úlcera fúngica, infecções de Herpes simplex, infecções de Herpes zoster, síndromes de hiperviscosidade, sarcoma de Kaposi, leucemia, degeneração de lipídio, doença de Lyme, queratólise marginal, Úlcera de Mooren, Infecções —micobacterianas diferentes de lepra, miopia, doença neovascular ocular, fosseta óptica, síndrome de Osler-Weber (Osler-Weber-Rendu), osteoartrite, doença de Paget, pars planitis, penfigoide, flictenulose, poliartrite, complicações pós-laser, infeções por protozoários, pseudoxantoma elástico,

pterígio ceratite seca, ceratotomia radial, neovascularização retinal, retinopatia de prematuridade, fibroplasias retrolentais, sarcoide, esclerite, anemia falciforme, síndrome de Sjogren, tumores sólidos, doença de Stargart, doença de Steven Johnson, ceratite límbica superior, sífilis, lúpus sistêmica, — degeneração marginal de Terrien, toxoplasmose, tumores de sarcoma de Ewing, tumores de neuroblastoma, tumores de osteosarcoma, tumores de retinoblastoma, tumores de rabdomiossarcoma, colite ulcerativa, oclusão de veia, deficiência de Vitamina A, sarcoidose de Wegener, angiogênese indesejada associada à diabetes, doenças parasíticas, cura de ferimento anormal, cirurgia que segue hipertrofia, ferimento ou trauma (por exemplo, ferimento de pulmão agudo/ARDS), inibição de crescimento de cabelos, inibição de ovulação e formação de corpo lúteo, inibição de implante, e inibição de desenvolvimento de embrião no útero.

Exemplos de distúrbios alérgicos ou inflamatórios ou doenças —autoimunes ou distúrbios que podem ser tratados com o uso de um anticorpo multiespecífico, análogo de anticorpo, um bis-Fab, um ADC, ou qualquer outro anticorpo feito de acordo com os métodos descritos no presente documento incluem, mas sem limitação, artrite (artrite reumatoide, como artrite aguda, artrite reumatoide crônica, artrite gotosa, artrite gotosa aguda, artrite inflamatória crônica, artrite degenerativa, artrite infecciosa, atrite de Lyme, artrite proliferativa, artrite psoriática, artrite vertebral, e artrite reumatoide de surgimento — precoce, osteoartrite, artrite crônica progrediente, artrite deformante, poliartrite crônica primária, artrite reativa, e espondilite anquilosante), doenças de pele hiperproliferativas inflamatórias, psoríase, como psoríase de placa, psoríase gutata, psoríase pustulosa, e psoríase das unhas, dermatite, incluindo dermatite de contato, dermatite de contato crônica, dermatite alérgica, dermatite de contato de alérgico, dermatite herpetiforme, e dermatite atópica, síndrome de hiper IgM ligada ao x, urticária, como urticária alérgica crônica e urticária idiopática crônica, incluindo urticária autoimune crônica, —polimiosite/dermatomiosite, — dermatomiosite — juvenil, — necrólise epidérmica tóxica, escleroderma (incluindo escleroderma sistêmico), esclerose, como esclerose sistêmica, esclerose múltipla (MS), como esclerose múltipla espino-óptica, esclerose múltipla progressiva primária (PPMS), e esclerose múltipla — relapso-remitente (RRMS), esclerose sistêmica progressiva, ateroesclerose, arterioesclerose, esclerose disseminata, e esclerose atáxica, doença intestinal inflamatória (IBD) (por exemplo, doença de Crohn, doenças gastrointestinais autoimunes mediadas, colite, como colite ulcerativa, colite ulcerosa, colite microscópica, colite colagenosa, colite poliposa, enterocolite necrosante, e colite transmural, e doença intestinal inflamatória autoimune), pioderma gangrenoso, eritema nodoso, colangite esclerosante primária, episclerite), síndrome da dificuldade respiratória, incluindo síndrome da dificuldade respiratória adulta ou aguda (ARDS), meningite, inflamação de todo ou parte da úvea, irite, coroidite, um distúrbio hematológico autoimune, espondilite reumatoide, perda de audição repentina, doenças mediadas por IgE, como anafilaxia e rinite alérgica e atópica, encefalite, como a encefalite de Rasmussen e encefalite límbica e/ou de da haste do cérebro, uveite, como uveite anterior, uveite anterior aguda, uveite granulomatosa, uveite não granulomatosa, uveíte facoantigênica, uveite posterior, ou uveite autoimune, glomerulonefrite (GN) com e sem síndrome nefrótica, como glomeruonefrite crônica ou aguda, como GN primária, GN imunomediada, GN membranosa (nefropatira “membranosa) GN membranosa idiopática ou nefropatia membranosa idiopática GN membrano-proliferativa ou proliferativa —membranosa (MPGN), incluindo o Tipo | e o Tipo Il, e GN de progressão rápida, condições alérgicas, reação alérgica, eczema, incluindo eczema alérgico ou atópico, asma, como asma, asma brônquica, e asma autoimune, condições que envolvem a infiltração de células T e respostas inflamatórias crônicas, doença infalmatória pulmonar crônica, miocardite autoimune, deficiência de adesão de leucócitos, lúpus eritematoso sistêmico (SLE) ou lúpus erimatoso sistêmico como SLE cutâneo, lúpus eritematoso cutâneo subagudo, síndrome de lúpus neonatal (NLE), lúpus eritematoso disseminado,

lúpus (incluindo nefrite, cerebrite, pediátrico, não renal, extra-renal, discoide, alopécia), diabetes mellitus (tipo 1) juvenil, incluindo diabetes mellitus dependente de insulina pediátrica (IDDM), diabetes mellitus adulta (diabetes tipo 11), diabetes autoimune, diabetes insípido idiopática, imunorespostas associadas à hipersensibilidade aguda e atrasada mediada por citocinas e T-

linfócitos, tuberculose, sarcoidose, granulomatose, incluindo granulomatose linfomatoide, granulomatose de Wegener, agranulocitose, vasculites, incluindo vasculite (incluindo vasculite de grandes vasos (incluindo polimialgia reumática e artrite de célula gigante (de Takayasu)), vasculite de médios vasos (incluindo doença de Kawasaki e poliartrite nodosa), poliartrite microscópica, vasculite

CNS, vasculite necrosante, cutânea ou de hipersensibilidade, vasculite necrosante sistêmica, e vasculite associada a ANCA, como vasculite ou síndrome de Churg-Strauss (CSS)), artrite temporal, anemia aplástica, anemia aplástica autoimune, anemia positiva de Coombs, anemia de Diamond Blackfan, anemia hemolítica ou anemia homolítica imune, incluindo anemia

—hemolítica autoimune (AIHA), anemia perniciosa (anemia perniciosa), doença de Addison, anemia ou aplasia pura de célula vermelha (PRCA), deficiência de fator VIll, hemofilia A, nutropenia autoimune, pancitopenia, leucopenia, doenças que envolvem diapedese do leucócito, distúrbios inflamatórios de CNS, síndrome de lesão de múltiplos órgãos, como aquelas secundárias à

—septicemia, trauma ou hemorragia, doenças mediadas por complexo de antígeno-anticorpo, doença de membrana basal antiglomerular, síndrome do anticorpo antifosfolipídio, neurite alérgica, doença de Behçet ou Behcet, síndrome de Castleman, síndrome de Goodpasture, síndrome de Reynaud,

síndrome de Sjogren, síndrome de Stevens-Johnson, penfigoide, como penfigoide bolhoso e penfigoide de pele, pênfigo (incluindo pênfigo vulgar, pênfigo foliáceo, pênfigo de penfigoide de membrana mucosa, e pênfigo eritematoso), poliendocrinopatias autoimunes, doença ou síndrome de Reiter,

—nefrite complexa imune, nefrite mediada por anticorpo, neuromielite óptica, polineuropatias, neuropatia crônica, como polineuropatias do IM ou neuropatia mediada por IgM, trombocitopenia (conforme desenvolvido por pacientes de infarto miocárdico, por exemplo), incluindo púrpura tombocitopênica trombótica (TTP) e trombocitopenia imunomediada ou autoimune, como púrpura

—trombicitopênica idiopática (ITP), incluindo ITP crônica ou aguda, doença autoimune dos testículos e ovário, incluindo orquite e ooforite autoimune, hipotireoidismo primário, hipoparatireoidismo, doenças endócrinas autoimunes, incluindo tireoidite, como tireoidite autoimune, doença de Hashimoto, tireoidite crônica (tireoidite de Hashimoto), ou tireoidite subaguda, doença da tireoide autoimune, hipotireoidismo idiopático, doença de Grave, síndromes poliglandulares, como síndromes poliglandulares autoimunes (ou síndromes de endocrinopatia poliglandular), síndromes paraneoplásticas, incluindo síndromes paraneoplásticas neurológicas, como síndrome miastênica de Lambert-Eaton ou sindrome de Eaton-Lambert, síndrome do homem rígido ou pessoa rígida,

—encefalomielite, como encefalomielite alérgica ou encefalomielite alérgica e encefalomielite alérgica experimental (EAE), miastenia grave, como miastenia grave associada a timoma, degeneração cerebelar, neuromiotonia, síndrome de opsoclonus ou opsoclonus mioclonus (OMS), e neuropatia sensorial, neuropatia motora multifocal, síndrome de Sheehan, hepatite autoimune,

hepatite crônica, hepatite lupoide, hepatite de célula gigante, hepatite ativa crônica ou hepatite ativa crônica autoimune, pneumonite intersítial linfoide, bronquiolite obliterante (não transplante) versus NSIP, síndrome de Guillain- Barré, doença de Berger (nefropatia de IgA), nefropatia de IgA idiopática,

dermatose de IgA linear, cirrose biliar primária, pneumonocirrose, síndrome da enteropatia autoimune, doença de Celiac, doença de Coeliac, doença celíaca (enteropatia de glúten), doença refrataria, doença idiopática, crioglobulinemia, esclerose lateral amilotrófica (ALS; doença de Lou Gehrig), doença arterial

— coronária, doença autoimune do ouvido, como doença autoimune do ouvido interno (AIÉD), perda de audição autoimune, síndrome de opsoclonus myoclonus (OMS), policondrite, como policondrite refratário ou policondrite recidivante, proteinose alveolar pulmonar, amiloidose, esclerite, uma linfocitose não-cancerosa, uma linfoitose primária, que inclui linfocitose de célula B monoclonal (por exemplo, gamopatia monoclonal benigna e gamopatia monoclonal de significância não determinada, MGUS), neuropatia periférica, síndrome paraneoplástica, canalopatias, como epilepsia, enxaqueca, arritmia, distúrbios musculares, surdez, cegueira, paralisia periódica, e canaloparias do SNC, autismo, mioparia inflamatória, glomerulosclerose segmentar e focal

(FSGS), oftalmologia endócrinay uveoretinite, corioretinite, distúrbio hepatológico autoimune, fibromialgia, falência múltipla endócrina, síndrome de Schmidt, —adrenalite, atrofia gástrica demência presenil doenças desmielinizantes, como doenças desmielinizantes autoimunes, nefropatia diabética, síndrome de Dressler, alopécia areata, síndrome de CREST

(calcinose, fenômeno de Raynaud, dismotilidade esofágica, esclerodactilia, e telangiectasia), infertilidade autoimune de masculina e feminina, doença de tecido conectivo misturado, doença de Chagas, febre reumática, aborto recorrente, pulmão de fazendeiro, eritema multiforme, síndrome pós cardiotomia, síndrome de Cushing, pulmão de criador de aves, angiite

—granulomatosa alérgica, angiite linfocítica benigna, síndrome de Alport, alveolite, como alveolite alérgica e alveolite fibrosa, doença pulmonar interticial, reação a transfusão, lepra, malária, leishmaniose, tripanossomíase, esquitossomose, ascaridíase, aspergilose, síndrome de Sampter, síndrome de

Caplan, dengue, endocardite, fibrose endomiocardial, fibrose pulmonar intersticial difusa, fibrose pulmonar intersticial, fibrose pulmonar idiopática, fibrose cística, endoftalmita, eritema elevatum diutinum, eristoblastose fetal, fascite eosinofilica, síndrome de Shulman, síndrome de Felty, flariase, ciclite,

como ciclite crônica, ciclite heterocrônica, iridociíclite, ou ciclite de Fuch, púrpura de Henoch-Schonlein, infecção por vírus da imunodeficiência humana (HIV), infecção de ecovírus, cardiomiopatia, doença de Alzheimer, infecção por parvovírus, infecção por vírus de rubéola, síndromes pós vacinação, infecção de rubéola congênita, infecção de vírus Epstein-Barr, caxumba, síndrome de

Evan, falência gonadal autoimune, coreia de Sydenham, nefrite pós- estreptocócica, tromboangeite obliterante, tireotoxicose, tabes dorsal, corioidite, polimialgia de célula gigante, oftamopatia endócrina, pneumonite de hipersensibilidade — crônica, — queratoconjutivite — seca, —queratoconjutivite epidérmica, síndrome nefrítica idiopática, nefropatia de mudança mínima, dano por reperfusão de isquemia e familiar begnina, autoimunidade retinal, inflamação das juntar, bronquite, doença obstrutiva de vias respiratórias crônica, silicose, afta, estomatite aftosa, distúrbios arterioescleróticos, aspermiogênese, hemólise autoimune, doença de Boeck, crioglobulinemia, contractura de Dupuytren, endoftalmia facoanafilática, enterite alérgica, eritema

—nodoso leproso, paralisia facial idiopática, síndrome da fadiga crônica, febre reumática, doença de Hamman-Rich, perda de audição neurossensorial, hemoglobinúria para oxística, hipogonadismo, ileite regional, leucopenia, mononucleose infecciosa, mielite transversa, mixedema idiopático primário, nefrose, oftalmia simpática, orquite granulomatosa, pancreatite, poliradiculite aguda, pioderma gangrenoso, tireoidite de Quervain, atrofia spênica adquirida, infertilidade devido a anticorpos de antiespermatozoide, timoma não maligno, vitiligo, SCID e doenças associadas ao vírus de Epstein-Barr, síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS), doenças parasíticas, como Leishmania,

síndrome do choque tóxico, envenenamento por alimento, condições que envolvem a infiltração de células T, deficiência de adesão de leucócito, imunorespostas associadas à hipersensibilidades aguda e atrasada mediadas por citocinas e linfócitos T, doenças que envolvem diapedese de leucócito, — síndrome de ferimentos múltiplos de órgão, doenças mediadas por completo de antigeno-anticorpo, doença de membrana basal antiglomerular, neurite alérgica, poliendocrinopatias autoimunes, ooforite, mixedema primário, gastrite atrófica autoimune, oftalmia simpática, doenças reumáticas, doença de tecido conectivo misturado, síndrome nefrótica, insulite, falência poliendócrina, neuropatia periférica, síndrome poliglandular autoimune do tipo |, hipoparatireoidismo idiopático de surgimento adulto (AOIH), alopécia total, cardiomiopatia — dilatada, — epidermólise — bolhosa — adquirida (EBA), hemocromatose, miocardite, síndrome nefrótica, colangite esclerosante primária, sinusite purulenta ou não purulenta, sinusite aguda ou crônica, sinusite etmoidal, frontal, maxilar ou esfenoide, um distúrbio relacionado a eosinófilo, como eosinofíilia, eosinofília de infiltração pulmonar, síndrome de eosinofilia-mialgia, síndrome de Loffler, pneumonia eosinofílica crônica, eosinofíilia pulmonar tropical, aspergilose broncopneumônica, aspergiloma, ou eosinófilos que contêm granulomas, anafilaxe, espondiloartrite soronegativa, doença autoimune poliendócrina, colangite esclerosante, esclera, episclera, candidíase mucocutânea crônica, síndrome de Bruton, hipogamaglobulinemia transiente da infância, síndrome de Wiskott-Aldrich, ataxia telangiectasia, distúrbios autoimunes associados à doença de colágeno, reumatismo, doença neurológica, distúrbio de reperfusão isquêmica, redução em reação de pressão sanguínea, disfunção vascular, antigiectasia, ferimento de tecido, isquemia cardiovascular, hiperalgesia, isquemia cerebral e doença que acompanha vascularização, distúrbios de hipersensibilidade alérgica, glomerulonefritide, ferimento de reperfusão, ferimento por reperfusão do miocárdio ou outros tecidos, dermatoses com componentes inflamatórios agudos, meningite purulenta aguda ou outros distúrbios inflamatórios do sistema nervoso central, distúrbios inflamatórios oculares e orbitais, síndromes associadas à transfusão de granulócito, toxicidade induzida por citocina, inflamação séria aguda, inflamação intratável crônica, pielite, pneumonocirrose, retinopatia diabética, distúrbio das grandes artérias diabético, hiperplasia endarterial, úlcera péptica, valvulite e endometriose. Além dos usos terapêuticos, os anticorpos da invenção podem ser usados para outros fins, incluindo métodos de diagnóstico, como métodos de diagnóstico para as doenças e condições descritas no presente documento.

TERAPIA POR COMBINAÇÃO Um anticorpo multiespecífico, análogo de anticorpo, ou conjugado de anticorpo-fármaco (ADC) da invenção pode ser combinado em uma formulação de combinação farmacêutica, ou o regime de dosagem como terapia de combinação, com um segundo composto tendo, por exemplo, propriedades anticâncer. O segundo composto da formulação de combinação farmacêutica ou regime de dosagem tem, de preferência, atividades complementares ao anticorpo ou ADC da combinação, de modo que não afetem adversamente um ao outro.

O segundo composto pode ser um agente quimioterápico, agente citotóxico, citocina, agente inibitório de crescimento, agente anti-hormonal, e/ou cardioprotetor. Tais moléculas são adequadamente apresentadas em combinação em quantidades que são eficazes para os fins pretendidos. Uma composição farmacêutica que contém um anticorpo multiespecífico, análogo de anticorpo ou ADC da invenção também pode ter uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente quimioterápico, como um inibidor formador de tubulina, um inibidor de topoisomerase, ou um ligante de DNA.

Outros regimes terapêuticos podem ser combinados à administração de um agente anticâncer. A terapia de combinação pode ser administrada como um regime simultâneo ou sequencial. Quando administrada sequencialmente, a combinação pode ser administrada em duas ou mais administrações. A administração combinada inclui a coadministração, com o uso de formulações separadas ou uma única formulação farmacêutica, e administração consecutiva em qualquer ordem, em que, de preferência, há um período de tempo enquanto ambos (ou todos) os agentes ativos exercem simultaneamente suas atividades biológicas.

Em uma realização, o tratamento com um anticorpo —multiespecífico, análogo de anticorpo ou ADC envolve a administração combinada de um agente anticâncer identificado na presente invenção, e um ou mais agentes quimioterápicos ou agentes inibitórios de crescimento, incluindo a coadministação de coquetéis de diferentes agentes quimioterápicos. Agentes quimioterápicos incluem taxanos (como paclitaxel e —docetaxel) e/ou antibióticos de antraciclina. As programações de preparação e de dosagem para tais agentes quimioterápicos podem ser usadas de acordo com as instruções do fabricante ou conforme determinado empiricamente pelo praticante versado na técnica. As programações de preparação e de dosagem para tal quimioterapia também são descritas em “Chemotherapy Service”, (1992) Ed. M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, Md.

O anticorpo multiespecífico, análogo de anticorpo ou ADC pode ser combinado com um composto anti-hormonal; por exemplo, um composto antiestrogênio, como tamoxifeno; um antiprogesterona, como onapristona (EP 616812); ou um antiandrogene, como flutamida, em dosagens conhecidas para tais moléculas. Onde o câncer a ser tratado é câncer independente de hormônio, o paciente pode, previamente, ser submetido a terapia anti-hormonal e, após o câncer se tornar independente de hormônio, o anticorpo ou ADC (e, opcionalmente, outros agentes, conforme descrito na presente invenção) pode ser administrado ao paciente. Pode ser benéfico coadministrar, também, um cardioprotetor (para evitar ou reduzir a disfunção do miocárdio associada à terapia) ou uma ou mais citocinas ao paciente. Além dos regimes terapêuticos acima, o paciente pode ser submetido à remoção cirúrgica de células —cancerosas e/ou terapia de radiação.

Dosagens “adequadas para qualquer um dos agentes coadministrados acima são aquelas atualmente usadas e podem ser reduzidas devido à ação combinada (sinergia) do agente recentemente identificado e outros agentes quimioterápicos ou tratamentos.

A terapia de combinação pode fornecer “sinergia” e se provar “sinergística”, isto é, o efeito alcançado quando os ingredientes ativos usados juntos é maior que a soma dos efeitos que resultam do uso de compostos separadamente. Um efeito sinergístico pode ser obtido quando os ingredientes ativos são: (1) coformulados e administrados ou entregues simultaneamente em uma formulação de dosagem unitária, combinada; (2) entregues pela alteração ou em paralelo como formulações separadas; ou (3) por algum outro regime. Quando entregue em terapia de alternação, um efeito sinergístico pode ser obtido quando os compostos são administrados ou entregues sequencialmente, por exemplo, por injeções em seringas separadas. Em geral, durante a terapia de alternação, uma dosagem efetiva de cada ingrediente ativo é administrada sequencialmente, isto é, em série, enquanto na terapia de combinação, as dosagens efetivas de dois ou mais ingrediente ativos são administradas juntas.

CERTAS MOLÉCULAS ALVO EXEMPLIFICADORAS Exemplos de moléculas que podem ser alvejadas por anticorpos multiespecíficos e análogos de anticorpo dessa invenção incluem, mas sem limitação, proteínas de soro solúvel e seus receptores e outras proteínas ligadas por membrana (por exemplo, adesinas).

Em outras realizações, um análogo de anticorpo da invenção é capaz de ligar uma, e um anticorpo multiespecífico da invenção é capaz de ligar uma, duas ou mais citocinas, proteínas relacionadas à citocina, e receptores de citocina selecionados a partir de BMPI, BMP2, BMP3B (GDFIO), —BMP4,BMP6, BMP8, CSFI (M-CSF), CSF2 (GM-CSF), CSF3 (G-CSF), EPO, FGFI (aFGF), FGF2 (bFGF), FGF3 (int-2), FGF4 (HST), FGF5, FGF6 (HST-2), FGF7 (KGF), FGF9, FGF10, FGF11, FGF12, FGF12B, FGF14, FGF16, FGF17, FGF19, FGF20, FGF21, FGF23, IGF1, IGF2, IFNAI, IFNA2, IFNA4, IFNAS, IFNA6, IFNA7, IFNBI, IFNG, IFNWI, FELI, FEL! (EPSELON), FELI (ZETA), ILIA, ILIB, 1IL2, 1L3, ILA4, IL5, I1L6, I1L7, 1L8, 1L9, IL10, ILI, IL12A, IL12B, 1113, IL1A, IL15, IL16, 1117, IL17B, I1L18, I1L19, 1L20, 1122, 1123, 1L24, 1125, 1126, 1127, IL28A, 1L28B, 1129, 11.30, PDGFA, PDGFB, TGFA, TGFB1, TGFB2, TGFB3, LTA (TNF-b), LTB, TNF (TNF-a), TNFSF4 (OX40 ligante), TNFSF5 (CD40 ligante), TNFSF6 (Fasl), TNFSF7 (CD27 ligante), TNFSF8 (CD30 ligante), TNFSF9 (4-1BB ligante), TNFSFIO (TRAIL), TNFSF1I (TRANCE), TNFSF12 (APO3L), TNFSF13 (Abril), TNFSF13B, TNFSF14 (HVEM-L), TNFSF15 (VEGI), TNFSF18, HGF (VEGFD), VEGF, VEGFB, VEGFC, ILIR1, ILIR2, ILIRLA, LLIRL2, IL2RA, IL2RB, IL2RG, IL3RA, IL4R, IL5RA, IL6R, IL7R, IL8RA, IL8RB, IL9R, ILIORA, ILIORB, IL1IRA, ILI2RB1, IL12RB2, ILISRA1, ILISRA?2, ILISRA, IL1I7R,IL18R1, IL20RA, IL21R, IL22R, ILIHY1, ILIRAP, ILIRAPL1, ILIRAPL?2, ILIRN, IL6ST, IL18BP, ILIBRAP, IL22RA2Z, AIFI, HGF, LEP (leptina), PTN, e

THPO.

Em outra realização, uma molécula alvo é uma quimiocina, receptor de quimiocina, ou uma proteína relacionada à quimiocina selecionada a partirde CCLI (1I-309), CCL2 (MCP-1/MCAF), CCL3 (MIP-Ia), CCL4 (MIP-Ib), CCL5 (RANTES), CCL7 (MCP- 3), CCL8 (mcp-2), CCLH (eotaxin), CCL13 (MCP-4), CCL15 (MIP-ld), CCL16 (HCC-4), CCL1I7 (TARC), CCL18 (PARC), CCL19 (MDP-3b)) CCL20 (MIP-3a)) CCL21 (SLC/exodus-2), CCL22

(MDC/STC-), CCL23 (MPIF-I), CCL24 (MPIF-2/eotaxin-2), CCL25 (TECK), CCL26 (eotaxin- 3), CCL27 (CTACIKVILC), CCL28, CXCLI (GROI), CXCL2 (GRO2), CXCL3 (GRO03), CXCL5 (ENA-78), CXCL6 (GCP-2), CXCL9 (MIG), CXCLIO (IP 10), CXCLII (I-TAC), CXCL12 (SDFI), CXCL13, CXCL14, CXCL16, —PF4 (CXCL4), PPBP (CXCL7), CX3CL1 (SCYDI), SCYEI, XCLI (linfotactina), XCL2 (SCM-Ib), BLRI (MDR15), CCBP2 (D6/JAB61), CCRI (CKRIHM145), CCR2 —(mcp-RB/RA)) CCR3 (CKR3/CMKBR3) CCR4, CCR5 (CMKBR5/ChemR13), CCR6 (CMKBR6/CKR-L3/STRL22/DRY6), CCR7 (CKR7/EBII)), CCR8 (CMKBR8/TERICKR- LI, CCR9 (GPR-9-6), CCRLI (VSHKI), CCRL2 (L-CCR), XCRI (GPR5/CCXCRI), CMKLRI, CMKORI (RDCI), CX3CR1 (V28), CXCR4, GPR2 (CCRIO), GPR31, GPR81 (FKSG80), CXCR3 (GPR9/CKR-L2), CXCR6 (TYMSTR /STRL33/Bonzo), HM74, IL8RA (IL8Ra), IL8RB (IL8Rb), LTB4R (GPR16), TCPIO, CKLFSF2, CKLFSF3, CKLFSFA, CKLFSF5, CKLFSF6, CKLFSF7, CKLFSF8, BDNF, C5R1, CSF3, GRCCIO (CIO), EPO, FY (DARC), GDF5, HDFIA, DL8, PRL, RGS3, RGS13, SDF2, SLIT2, TLR2, TLRA4, TREMI, TREM2, e VHL.

Em outras realizações, um análogo de anticorpo da invenção é capaz de se ligar a um, e um anticorpo multiespecífico da invenção é capaz de se ligar a um ou mais alvos selecionados a partir de ABCFI; ACVRI; ACVRIB; —ACVR2; ACVR2B; ACVRLI; ADORAZA; Aggrecan; AGR2; AICDA; AIFI; AIGI; AKAPI; AKAP2; AMH; AMHR2; ANGPTI; ANGPT2; ANGPTL3; ANGPTLA; ANPEP; APC; APOCI; AR; AZGPI (zinco-a-glicoproteina); B7.1; B7.2; BAD; BAFF (BLis); BAGI; BAII; BCL2; BCL6; BDNF; BLNK; BLRI (MDR15); BMPI; BMP2; BMP3B (GDFIO); BMP4; BMP6; BMP8; BMPRIA; BMPRIB; BMPR?2; —BPAGI (plectina); BR3; BRCAI; C190rflO (IL27w); C3; C4A; C5; C5R1; CANTI; CASP1; CASP4; CAVI; CCBP2 (D6/JAB61); CCLI (1-309); CCLII (eotaxin); CCL13 (MCP-4); CCL15 (MIP-Ild); CCL16 (HCC-4); CCL1I7 (TARC); CCL1I8 (PARC); CCL19 (MIP-3b); CCL2 (MCP -1); MCAF; CCL20 (MIP-3a); CCL21

(MTP-2); SLC; exodus-2; CCL22 (MDC/STC-); CCL23 (MPIF- 1); CCL24 (MPIF-2/eotaxin-2); CCL25 (TECK); CCL26 (eotaxina-3); CCL27 (CTACK/ILC); CCL28; CCL3 (MTP-la); CCL4 (MDP-lb); CCL5 (RANTES); CCL7 (MCP-3); CCL8 (mcp-2); CONAI; CCNA2Z; CCNDI; CCNEI; COCNE2; CCORI (CKRIVHM145); CCR2 (mcp-IRB/RA); CCR3 (CKR3/CMKBR3); CCRA; CCR5 (CMKBR5/ChemR13), CCR6 (CMKBR6/CKR-L3/STRL22/DRY6); CCR7 (CKR7/EBII); CCR8 (CMKBR8/TERICKR-LI)) CCR9 (GPR-9-6); CCRLI (VSHKI); CCRL2 (L-CCR); CD164; CD19; CDIC; CD20; CD180 (RP105); CD200; CD307 (FcRH5); CD22; CD24; CD28; CD3; CD37; CD38; CD3E; CD3G; CD3Z; CD4; CD40; CD40L; CD44; CD45RB; CD52; CD69; CD72; CD74; CD79A; CD79B; CD8; CD80; CD81; CD83; CD86; CDHI (E-caderina); CDH10; CDH12; CDH13; CDH18; CDH19; CDH20; CDH5; CDH7; CDH8; CDH9; CDK2; CDK3; CDK4; CDK5; CDK6; CDK7; CDK9; CDKNIA (p21Wapl/Cipl); CDKNIB (p27Kipl); CDKNIC; CDKN2A (P16INK4a); CDKN2B; CDKN2C; CDKN3; CEBPB; CERI; CHGA; CHGB; Chitinase; CHST10; CKLFSF2; CKLFSF3; CKLFSF4; CKLFSF5; CKLFSF6; CKLFSF7; CKLFSF8; CLDN3;CLDN7 (claudina-7); CLN3; CLU (clusterina)) CMKLRI; CMKORI (RDCI); CNRI; COL18A1; COLIAI; COL4A3; COL6A1; CR2; CRP; CSFI (M- CSF); CSF2 (GM-CSF); CSF3 (GCSF);CTLA4; CTNNBI (b-catenina); CTSB (catepsina B); CX3CL1 (SCYDI); CX3CR1 (V28); CXCLI (GROI); CXCL10 (IP- 10); CXCLII (I-TAC/IP-9); CXCL12 (SDFI); CXCL13; CXCL14;CXCL16; CXCL2 (GRO2); CXCL3 (GRO3); CXCL5 (ENA-78/LIX); CXCL6 (GCP-2); CXCL9 (MIG); CXCR3 (GPR9/CKR-L2); CXCR4; CXCR6 (TYMSTR /STRL33/Bonzo); CYB5; CYCI; CYSLTRI; DAB2IP; DES; DKFZp451J0118; DNCLI; DPP4; E2F1; ECGFI; EDGI; EFNAI; EFNA3; EFNB2; EGF; EGFR; ELAC2; ENG; ENO1; ENO?2; ENO3; EPHB4; EPO; ERBB2 (Her-2); EREG; ERK8; ESRI; ESR2; F3 (TF); FADD; FasL; FASN; FCERIA; FCER2; FCGR3A; FcRH1; FeRH2; FCRLA; FGF; FGFI (aFGF); FGF10; FGF11; FGF12; FGF12B; FGF13; FGF14; FGF16;

FGF17; FGF18; FGF19; FGF2 (bFGF); FGF20; FGF21; FGF22; FGF23; FGF3 (int-2); FGF4 (HST); FGF5; FGF6 (HST-2); FGF7 (KGF); FGF8; FGF9; FGFR3; FIGF (VEGFD); FELI (EPSILON); FILI (ZETA); FLJ12584; FLJ25530; FLRTI (fibronectina); FLTI;, FOS; FOSLI (FRA-I); FY (DARC); GABRP (GABAa);

—GAGEBI; GAGECI; GALNACA4S-6ST; GATA3; GDF5; GFI1; GGT1; GM-CSF; GNASI; GNRHI; GPR2 (CCRIO); GPR31; GPR44; GPR81 (FKSG80); GRCCIO (CIO); GRP; GSN (Gelsolin); GSTPI; HAVCR2; HDAC4; HDAC5; HDAC7A; HDAC9; HGF; HIFIA; HDPI; histamina e receptores de histamina; HLA-A; HLA- DOB; HLA-DRA; HM74; HMOXI ; HUMCYT2A; ICEBERG; ICOSL; ID2; IFN-a;

IFNAL IFNAZ; IFNAA; IFNAS; IFNA6; IFNA7Z; IFNB1; IFNgama; DFENWI; IGBPI; IGFI; IGFIR; IGF2; IGFBP2; IGFBP3; IGFBPG6; IL-I; IL10; IL1ORA; IL10RB; IL11; IL1IRA; 11-12; I1L12A; 1L12B; ILI12RB1; IL12RB2; 1113; ILISRA1; ILISBRA?Z; IL14; 1115; ILISRA; 1116; I1L17; IL17B; IL17C; ILI7R; I1L18; IL18BP; ILI8R1; ILI18RAP; I1L19; IL1A; IL1B; ILIF1O; ILIFS; IL1F6; IL1F7; ILIF8; IL1F9; ILTHYI;

ILIRIILIR2; ILIRAP; ILIRAPL1; ILIRAPL2; ILIRL1; ILIRL2, ILIRN; 112; 1120; IL20RA; IL21R; 1122; IL22R; IL22RA2; 1123; 1124; 1125; 1126; 1127; IL28A; 1L28B; 1L29; IL2RA; IL2RB; IL2RG; I1L3; 1130; IL3RA; IL4; IL4R; IL5; IL5RA; IL6; IL6R; IL6ST (glicoproteína 130); EL7; EL7R; EL8; ILB8RA; DL8RB; IL8RB; DL9; DL9R; DLK; INHA; INHBA;INSL3; INSLA4; IRAKI; ERAK2; ITGAI; ITGA2; ITGA3;

ITGAG6 (a6 integrina); ITGAV; ITGB3; ITGBA4 (b4 integrina); JAGI; JAKI; JAK3; JUN; K6HF; KAII; KDR; KITLG; KLF5 (GC Box BP); KLF6; KLKIO; KLK12; KLK13; KLK14; KLK15; KLK3; KLK4; KLK5; KLK6; KLK9; KRT1; KRT19 (Keratin 19), KRT2A; KHTHB6 (queratina do tipo H específica de cabelo); LAMAS; LEP (leptina); Lingo-p75; Lingo-Troy; LPS; LTA (TNF-b); LTB; LTBA4R

(GPR16); LTB4R2; LTBR; MACMARCKS; MAG ou Omgp ; MAP2K7 (c-Jun); MDK; MIBI; midquina; MEF; MIP-2; MKI67; (Ki-67); MMP2; MMP9; MS4A1; MSMB; MT3 (metalotionectina-lll); MTSSI; MUCI (mucina); MYC; MYDB88; NAG14; NCK2; neurocano; NFKBI; NFKB2; NGFB (NGF); NGFR; NgR-Lingo;

NgR- Nogo66 (Nogo); NgR-p75; NgR-Troy; NMEI (NM23A); NOX5; NPPB; NROBI; NROB2; NRIDI; NR1D2; NR1H2; NR1H3; NR1IH4; NR112; NRI1I3; NR2C1; NR2C2; NR2E1; NR2E3; NR2F1; NR2F2; NR2F6; NR3C1; NR3C2; NR4A1; NR4A2; NR4A3; NR5A1; NR5A2; NR6A1; NRPI; NRP2; NTSE; NTNA; ODZI OPRDI; P2RX5; P2RX7; PAP; PARTI; PATE; PAWR; PCA3; PCNA; PDGFA; PDGFB; PECAMI; PF4 (CXCL4); PGF; PGR; fosfacan; PIAS2; PIK3CG; PLAU (uPA); PLG; PLXDCI; PPBP (CXCL7); PPID; PRI; PRKCQ; PRKDI; PRL; PROC; PROK2; PSAP; PSCA; PTAFR; PTEN; PTGS2 (COX-2); PTN; RAC2 (p21Rac2); RARB; RGSI; RGS13; RGS3; RNFIIO (ZNF144); ROBO2; S100A2; SCGB1D2 (lipofilina B); SCGB2A1 (mamaglobina2); SCGB2A2 (mamaglobina 1); SCYEI (citocina ativadora de monócido endotelial); SDF2; SERPINAI; SERPINA3S; SERP1NB5 (maspina); SERPINEI (PAI-I); SERPDMF1; SHBG; SLA2; SLC2A2; SLC33A1; SLC43A1; SLIT2; SPPI; SPRRIB (Sprl); STSGAL1; STABI; STAT6; STEAP; STEAP2; TB4R2; TBX21;TCPIO; TDGFI; TEK; TGFA; TGFBI; TGFBIII; TGFB2; TGFB3; TGFBI; TGFBRI; TGFBR2; TGFBR3; THIL; THBSI (trombospondin-1); THBS2; THBSA; THPO; TIE (Tie-1); TMP3; fator de tecido; TLRIO; TLR2; TLR3; TLR4; TLRS; TLR6; TLR7; TLR8; TLR9; TNF; TNF-a; TNFAEP2 (B94); TNFAIP3; TNFRSFIIA; TNFRSFIA; TNFRSFIB; TNFRSF21; TNFRSF5; TNFRSF6 (Fas); TNFRSF7; TNFRSF8; TNFRSF9; TNFSFIO (TRAIL); TNFSFI 1 (TRANCE); TNFSF12 (APO3L); TNFSF13 (April); TNFSF13B; TNFSF14 (HVEM-L); TNFSF15 (VEGI); TNFSF18; TNFSF4 (OX40 ligante); TNFSF5 (CD40 ligante); TNFSF6 (FasL); TNFSF7 (CD27 ligante); TNFSF8 (CD30 ligante); TNFSF9 (4- 1BB ligante); TOLLIP; receptores do tipo Toll; TOP2A (topoisomerase Ea); TP53;TPMI; TPM2; TRADD; TRAFI; TRAF2; TRAF3; TRAF4; TRAF5; TRAF6; TREMI; TREM2; TRPC6; TSLP; TWEAK; VEGF; VEGFB; VEGFC; versicano; VHL C5; VLA-4; XCLI (linfotactina); XCL2 (SCM-Ib); XCRIGPR5/CCXCRI); YYI; e ZFPM2.

Em certas realizações, uma ou mais moléculas alvo moleculares para anticorpos abrangidas pela presente invenção incluem proteínas CD selecionadas a partir de CD3, CD4, CD8, CD16, CD19, CD20, CD34, CD64, CD79A, CD79B, CD180 (RP105), CD200, e CD307 (FcRH5); membros da família de receptor ErbB selecionadas do receptor EGF (HER1), HER2, HER3 ou receptor HER4; moléculas de adesão celular selecionadas a partir de LFA-1, Mac1, p150.95, VLA4, ICAM-1, VCAM, alfa4/beta7 integrina, e alfav/beta3 integrina, incluindo subunidades ou alfa ou beta das mesmas (por exemplo, anticorpos anti-CD11a, anti-CD18 ou anti-CD11b); fatores de crescimento selecionados a partir de VEGF-A, VEGF-C; fator de tecido (TF); alfa interferona (alfalFN); TNFalfa, e interleucina selecionada a partir de IL-1beta, I1L-3, IL-4, IL- 5, IL-8, IL-9, 11-13, ILI7A/F, 11-18, IL-13Ralfa1, IL13Ralfa2, IL-4R, I1L-SR, 1L-9R, IgE; antígenos de grupo sanguíneo; receptor fIk2/flt3; receptor de obesidade (OB); receptor mpl; CTLA-4; RANKL, RANK, proteína RSV F, proteína C.

O documento WO 96/16673 descreve um anticorpo biespecífico anti-ErbB2/anti-FcyRIll e a Patente nº U.S. 5.837.234 apresenta um anticorpo biespecífico anti-ErbB2/anti-FcyRI. Um anticorpo biespecífico anti-ErbB2/Fca é mostrado em WOS98/02463. AS Patentes nº U.S. 5.821.337 e 6.407.213 ensinam anticorpos biespecíficos anti-ErbB2/anti-CD3. Anticorpos adicionais biespecíficos que se ligam a um epítopo no antígeno CD3 e um segundo epítodo foram descritos. Consulte, por exemplo, as Patentes nº U.S. 5.078.998 (anti-CD3/antígeno de célula tumoral); 5.601.819 (anti-CD3/IL-2R; anti- CD3/CD28; anti-CD3/CD45); 6.129.914 (anti-CD3/antígeno de célula B maligna); 7.112.324 (anti-CD3/CD19); 6.723.538 (anti-CD3/CCR5); 7.235.641 (antrCD3/EpCAM); 7.262.276 (anti-CD3/antígeno tumoral de ovário); e

5.731.168 (anti-CD3/CD419G).

Em uma realização, um anticorpo multiespecífico dessa invenção se liga a pelo menos duas moléculas alvo selecionadas a partir de IL-lalfa e IL-

Ibeta, I1L-12 e I1L-18; 11-13 e 1L-9; 11-13 e I1L-4; 11-13 e I1L-5; IL-5 e IL-4; IL-13 e IL-lbeta; I1L-13 e 11-25; IL-13 e TARC; 11-13 e MDC; I1L-13 e MEF; I1L-13 e TGF- B; 11-13 e agonista LHR; IL-12 e TWEAK, I1L-13 e CL25; I1L-13 e SPRR2a; I1L-13 e SPRR2b; IL-13 e ADAMB, IL-13 e PED2, ILI7A e IL17F, CD3 e CD19, CD138 eCbD20;CD138e CD40; CD19 e CD20; CD20 e CD3; CD38 e CD138; CD38 e CD20; CD38 e CD40; CD40 e CD20; CD-8 e I1L-6; CD20 e BR3, TNFalfa e TGF-beta, TNFalfa e IL-lbeta; TNFalfa e I1L-2, TNF alfa e 1L-3, TNFalfa e IL-A4, TNFalfa e IL-5, TNFalfa e IL6, TNFalfa e IL8, TNFalfa e IL-9, TNFalfa e 11-10, TNFalfa e IL-11, TNFalfa e 11-12, TNFalfa e 11-13, TNFalfa e 11-14, TNFalfa e 11-15, TNFalfa e 11-16, TNFalfa e I1L-17, TNFalfa e I1L-18, TNFalfa e IL-19, TNFalfa e 11-20, TNFalfa e 11-23, TNFalfa e IFNalfa, TNFalfa e CDA4, TNFalfa e VEGF, TNFalfa e MIF, TNFalfa e ICAM-1, TNFalfa e PGE4, TNFalfa e PEG?2, TNFalfa e RANK ligante, TNFalfa e Te38; TNFalfa e BAFF; TNFalfa e CD22; TNFalfa e CTLA-4; TNFalfa e GP130; TNFa e I1L-12p40; VEGF e HER2, VEGF- AeHER2, VEGF-A e PDGF, HER1 e HER2, VEGF-A e VEGF-C, VEGF-C e VEGF-D, HER2 e DR5,VEGF e IL-8, VEGF e MET, receptores VEGFR e MET, VEGFR e EGFR, HER2 e CD64, HER2 e CD3, HER2 e CD16, HER2 e HER3; EGFR(HER1) e HER2, EGFR e HER3, EGFR e HERA4, IL-13 e CD40L, Il4 e CDA40L, TNFR1 e IL-IR, TNFR1 e IL-G6R e TNFR1 e IL-18R, EpCAM e CD3, MAPG e CD28,EGFR e CD64, CSPGs e RGM A; CTLA-4 e BTNO2; IGF1 e IGF2; IGF1/2 e Erb2B; MAG e RGM A; NgR e RGM A; NogoA e RGM A; OMGp e RGM A; PDL-|l e CTLA-4; e RGM A e RGM B.

Em uma realização, um anticorpo multiespecífico dessa invenção se liga ao CD3 e pelo menos uma molécula alvo adicional selecionada a partir de BLR1,BR3, CD19, CD20, CD22, CD72, CD79A, CD79B, CD180 (RP105), CR2, FcRH1, FeRH2, FeRH5, FCER2, FOCRLA4, HLA-DOB, e NAG14. Antígenos solúveis ou fragmentos dos mesmos, opcionalmente conjugados a outras moléculas, podem ser usados como imunogenes para gerar anticorpos. Para moléculas de transmembrana, como receptores, os fragmentos destes (por exemplo, o domínio extracelular de um receptor) podem ser usados como o imunogene. Alternativamente, as células que expressam a molécula de transmembrana podem ser usadas como o imunogene. Tais células podem ser derivadas de uma fonte natural (por exemplo, linhagens de células de câncer) ou podem ser células que foram transformadas por técnicas recombinantes para expressas a molécula de transmembrana. Outros antígenos e formas dos mesmos úteis para o prepara o de anticorpos serão aparentes para aqueles na técnica.

METABÓLITOS DOS CONJUGADOS DE ANTICORPO-FÁRMACO Também no âmbito dessa invenção estão os produtos metabólicos in vivo dos compostos de ADC descritos na presente invenção, ao ponto em que tais produtos são inovadores e não óbvios em relação à técnica anterior. Tais produtos podem resultar, por exemplo, a partir da oxidação, redução, hidrólise, amidação, desamidação, clivagem enzimática, e similares, do composto administrado. Em conformidade, a invenção inclui compostos inovadores e não óbvios produzidos por um processo que compreende colocar em contato um composto dessa invenção com um mamífero por um período de tempo o suficiente para render um produto metabólito do mesmo.

Produtos metabólicos são tipicamente identificados através de preparar ADC radiomarcado (por exemplo 14C ou 3H), administrar o mesmo parenteralmente em uma dose detectável (por exemplo, maior que cerca de 0,5 mg/kg) a um animal como rato, camundongo, porco da índia, macaco ou humano, permitir tempo o suficiente para que o metabolismo ocorra (tipicamente cerca de 30 segundos a 30 horas) e isolar seus produtos de conversão da urina, sangue ou outras amostras biológicas. Esses produtos são facilmente isolados, já que são marcados (outros são isolados pelo uso de anticorpos capazes de se ligar a epitopos que sobrevivem no metabólito). As estruturas metabólitas são determinadas de um modo convencional, por exemplo, por análise MS, LC/MS ou RMN. Em geral, a análise de metabólitos é realizada da mesma forma que estudos de metabolismo de fármaco convencionais bem conhecidos para aqueles versados na técnica. Os produtos —de conversão, contanto que não sejam encontrados de outra forma in vivo, são úteis nos ensaios de diagnóstico para a dosagem terapêutica dos compostos de ADC da invenção.

MÉTODOS DE IMAGEAMENTO Em outras realizações, os anticorpos multiespecíficos ou análogos de anticorpo podem ser marcados através de tiol reativo com radionuclídeos, corantes fluorescentes, porções químicas de substrato de acionamento por biolumescência, — porções químicas de substrato que acionam quimioluminescência, enzimas, e outros marcadores de detecção para experimentos de imageamento com aplicações diagnósticas, —farmacodinâmicas, e terapêuticas. Em geral, o anticorpo multiespecífico marcado ou análogo de anticorpo marcado, isto é, “biomarcador” ou “sonda”, é administrado por injeção, perfusão, ou ingestão oral a um organismo vivo, por exemplo, humano, roedor, ou outro animal pequeno, um órgão perfundido ou amostra de tecido. A distribuição da sonda é detectada em um curso de tempo eérepresentada por uma imagem.

ARTIGOS DE FABRICAÇÃO Em outra realização, um artigo de fabricação, ou “kit”, que contém materiais úteis para o tratamento dos distúrbios descritos acima é fornecido. O artigo de fabricação compreende um recipiente e um marcador ou inserto de embalagem em ou associado ao recipiente. Recipientes adequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos, seringas, embalagem do tipo blister, etc. Os recipientes podem ser formados a partir de uma variedade de materiais, como vidro ou plástico. O recipiente retém um anticorpo multiespecífico, análogo de anticorpo ou composição de ADC que é eficaz para o tratamento da condição e pode ter uma porta de acesso esterilizada (por exemplo, o recipiente pode ter uma bolsa de solução intravenosa ou um frasco que tem uma tampa perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica). Pelo menos um agente ativo na composição é um anticorpo multiespecífico, análogo de anticorpo ou ADC. O marcador ou inserto de embalagem indica que a composição é usada para o tratamento da condição de escolha, como um câncer. Alternativa ou adicionalmente, o artigo de fabricação pode compreender, ainda, um segundo (ou terceiro) recipiente que compreende um tampão farmaceuticamente aceitável, como água bacterioestática para injeção (BWFI), solução salina tamponada com fosfato, solução de Ringer e solução de dextrose. Pode incluir, ainda, outros materiais desejáveis a partir de um ponto de vista comercial e de usuário, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas e seringas.

EXEMPLOS O seguinte são exemplos dos métodos e composições da invenção. Compreende-se que várias outras realizações podem ser praticadas, dada a descrição geral fornecida acima. EXEMPLO 1 — PREPARAÇÃO DE TIO-FABS E DOBRADIÇA-CIS-FABS, PRODUÇÃO DE PROTEÍNA, E SÍNTESE DE BIS-FABS BIESPECÍFICO PREPARAÇÃO DE TiO0-FABS E DOBRADIÇA-CIS-FABS Diversas abordagens foram usadas para criar fragmentos de anticorpo com grupos sulfidrila livres para uso em reações subsequentes. Em uma abordagem, as substituições de cisteina foram introduzidas em construtos de anticorpo em várias posições nos domínios constantes de cadeias leves ou cadeias pesadas por mutagênese de sítio direcionado para criar tio-Mabs conforme descrito previamente em Junutula, et al. J Immunol Methods 332(1-2): 41 a 52 (2008). Tio-Fabs foram gerados de maneira enzimática a partir de tio-Mabs pela diluição de tio-Mabs em 1 mg/ml em 25 mM de Tris, pH 8,0, e digestão de maneira enzimática a 37ºC por 1 hora com o uso de Lis-C (Wako Chemicals USA, Inc., Richmond, VA) a uma razão de 1:1000 (p:p) de enzima para anticorpo. A digestão de Lis-C foi parada com 5 uM do inibidor de protease tosil-L-lisina clorometil cetona (TLCK) (Bachem, Torrence, CA) e purificada por cromatografia de troca de íon de cátion em uma coluna Hi-Trap SP FF de 5 ml! (GE Healthcare, Piscataway, NJ) com o uso de um tampão de acetato de sódio de 50 mM e um gradiente CV de NaCl de O a 300 mM. Os tio-Fabs produzidos por esse método são, às vezes, chamados de “tio-Fabs enzimáticos” na presente invenção. Em outra abordagem, os construtos de DNA que encodifica Fabs, que têm um resíduo cis modificado ou construtos de DNA que encodificam fragmentos de cadeia pesada que contêm um resíduo cis nativo na região de dobradiça, foram subclonados em vetores de expressão de plasmídeo e expressos diretamente em E. coli. Os tio-Fabs produzidos por esse método são, algumas vezes, chamados de “tio-Fabs recombinantes” na presente invenção. Uma terceira abordagem foi usada para anticorpos que não têm um resíduo cis modificado e se baseou no(s) resíduo(s) cis nativo(s) presente(s) na região de dobradiça de IgG. Esse método foi usado para produzir “dobradiça-cis-Fabs" e é descrito com maiores detalhes abaixo.

Para a preparação de dobradiça-cis-Fabs a partir de anticorpos nativos que não continham uma cisteína modificada para uso em reações de síntese, usamos o seguinte procedimento enzimático. Enquanto o seguinte procedimento foi usado para trastuzumabe, o procedimento é, em geral, aplicável a qualquer IgG. Trastuzumab foi digerido com pepsina (1% em p/p) por tratamento em tampão de acetato de sódio a pH 4,5. Após a digestão por 1 hora, o F(ab')2 foi isolado da mistura de digestão pela captura em uma resina de troca de cátion SP-HP e purificado por um gradiente de sal de 10 CV de 0 a 1 M de NaCl. O F(ab')2 foi, então, reduzido em um tampão que continha 25 mm de MES, pH 5,8, 2 mM de EDTA, e 300 mM de NaCl. Após a redução com 1 mM de TCEP, os Fabs foram oxidizados pela adição de 5 mM de DHAA para reformar o dissulfeto entre a cadeia pesada e a cadeia leve. Observou-se rotineiramente que, sob essas condições de reação, apenas o dissulfeto entre a cadeia pesada e a cadeia leve foi reformado; os dois resíduos de cisteíina na região de dobradiça permaneceram não oxidizados. Os dois tióis livres (resíduos cis) na dobradiça foram, então, reagidos com um 1 molar equivalente de N-etolmaleimida (NEM) (Sigma Aldrich, St. Louis, MO). A mistura resultante que contém Fabs modificados uma vez, duas vezes ou não modificados foi, então, reagida com um excesso do reticulador de bis-maleimido. Essas condições de reação renderam três produtos: Fabs com um reticulador e um NEM, Fabs com dois NEM, e Fabs que continham apenas um reticulador. Constatou-se que Fabs que continham apenas um reticulador não têm cisteína livre. Portanto, sob essas condições de reação, um único reticulador reagiu muito eficientemente com ambas as cisteínas, resultando em uma molécula em que as cisteínas foram ciclizadas pelo reticulador. O material que compreende os produtos de reação acima foi purificado a partir da mistura de reação (para remover componentes de reação indesejados) por filtração de gel e usado no acoplamento a outros dobradiça-cis-Fabs preparados de maneira similar ou ao tio-Fabs. Apenas reticulação-cis-Fabs ou tio-Fabs preparados conforme descrito e que contêm um reticulador, um maleimido livree uma sulfridrila livre foram capazes de reagir nas reações de síntese de bis-Fab descritas com maiores detalhes abaixo.

EXPRESSÃO E PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNA A expressão de proteina em E. coli foi executada em cultura de um dia para o outro em frascos de agitação ou em um fermentador de 10 litros conforme descrito previamente.

Consulte, por exemplo, Carter, et al, Biotechnology (N Y) 10(2): 163 a 7 (1992); Simmons, et al., ] Immunol Methods 263(1-2): 133 a 47 (2002). No caso do trastuzumabe (Herceptind de comprimento total) modificado para conter um resíduo de cisteína reativa (hu4D5-tio-Mab), o anticorpo foi expresso e purificado conforme descrito em Junutula, et al.

J] Immunol Methods 332(1-2): 41 a 52 (2008). Péletes de célula de E. coli que expressa tio-Fabs recombinantes ou dobradiça-cis-Fabs recombinantes foram ressuspensos em um tampão contendo 25 mM de Tris,

pHde?7,5,125mM de NaCl, 5 mM de EDTA (TEB) e lisado com o uso de um microfluidizador.

O extrato foi tratado com a polietilenoimina floculante (0,4 %) ajustado a pH de 9,0 por 1 hora com agitação seguida por centrifugação por 45 minutos a 15.000 x g.

Tio-Fabs ou dobradiça-cis-Fabs foram purificados por procedimentos padrão conhecidos na técnica com o uso de Proteína G e cromatografia de troca de cátions.

Especificamente, os sobrenadantes foram filtrados através de um filtro de 0,22 mícron e, então, aplicados diretamente a uma resina de Proteína G, tipicamente Proteína G de Hi-Trap (GE Healthcare, Piscataway, NJ). A eluição foi feita com 0,2 M de ácido acético seguida pela captura com resina de troca de cátions de SP-HP (GE Healthcare, Piscataway,

NJ). Tio-Fabs ou dobradiça-cis-Fabs foram eluídos com a 10 CV de gradiente de O a 1 M de NaCl.

Tio-Fabs purificados foram caracterizados por SDS-PAGE e espectrometria de massa.

Essas caracterizações frequentemente mostraram aumentos de massa de 275 Da e 306 Da.

Verificou-se que esses aumentos de massa eram adutos de dissulfeto na cisteína não pareada que foram removidos por redução e oxidação para preparar os tio-Fabs para reticulação com bis- maleimida.

A redução e oxidação de tio-Fabs foi executada conforme a seguir.

Primeiro, tio-Fabs foram reduzidos por 24 horas pela adição de 2 mM de HCL de tris(2-carboxietil) fosfino (TCEP-HCI; também chamado de TCEP) (Pierce

[Thermo Fisher Scientific], Rockford, 1L) em um tampão contendo 25 mM de MES, pH de 5,8, 300 ml de NaCl, e 5 mM de EDTA. Após a redução, À proteína foi oxidada pela adição de 5 mM de ácido desidroascórbico (DHAA) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Os tio-Fabs isolados foram analisados por —SDS-PAGE e espectrometria de massa para garantir que as proteínas foram reduzidas e oxidadas adequadamente.

SÍNTESE DE BIS-FAB A Figura 1 mostra o esquema para a síntese de bis-Fabs. No primeiro estágio da síntese de bis-Fab, tio-Fabs ou dobradiça-cis-Fabs com uma cisteína não pareada foram usados. Geralmente, o tio-Fab ou dobradiça- cis-Fab estava no mesmo tampão em que a redução e oxidação foram feitas (MES, pH de 5,8, 2 mM de EDTA, e 300 mM de NaCl) em uma concentração de proteína de 1 mg/ml (Figura 1, Painel 1). Há dois produtos de reação indesejáveis potenciais nesse estágio, dímeros de dissulfeto e dímeros —reticulados. Verificou-se que uma concentração de proteína de 1 mg/ml nesse estágio da síntese foi um recurso importante da reação porque a dimerização foi minimizada naquela concentração de proteína. Adicionalmente, controlar a reação usando-se um tampão de pH baixo com EDTA ajudou a minimizar a dimerização. Um excesso de cinco vezes de reticulador de bis-maleimido (Quanta BioDesign, Powell, OH) foi adicionado à mistura de reação (Figura 1, Painel 2). Esse excesso de cinco vezes de reticulador também foi útil na minimização da dimerização indesejável. A reação foi incubada à temperatura ambiente (TA) ou 37ºC por quatro horas até a conclusão. A mistura foi, então, concentrada a um volume adequado para filtração de gel (Figura 1, Painel 3). —Usou-se tipicamente uma coluna de Tricomm de 22 ml de S-200 (GE Healthcare, Piscataway, NJ) para síntese de quantidade de ug a mg. Essa primeira etapa de filtração de gel permitiu a remoção de reticulador não usado rendendo um tio-Fab ou dobradiça-cis-Fab purificado conjugado ao reticulador. As condições descritas acima tipicamente resultaram em pelo menos 90% ou mais do produto desejado. Nenhum tio-Fab ou dobradiça-cis- Fab permaneceu como tiol livre já que todos foram conjugados a um reticulador ou ligados por dissulfeto a outro tio-Fab ou dobradiça-cis-Fab através das cisteinas não pareadas.

O tio-Fab purificado e isolado (ou dobradiça-cis-Fab) mais a espécie reticuladora foram então adicionados ao segundo tio-Fab (ou dobradiça-cis-Fab) e concentrado para 5 mg/ml ou maior, geralmente para um volume adequado para filtragem por gel (Figura 1, Painel 4). Observou- seque uma concentração de proteína de pelo menos 5 mg/ml durante esse estágio da síntese foi importante conduzir a reação à conclusão. Concentrações de proteína inferiores levaram a formação de somente quantidades pequenas de dímeros de bis-Fab reticulados. Sem sermos ligados por teoria, nós hipotetizamos que um efeito estérico ou variável relacionada à viscosidade que retarda a formação de dímeros bis-Fab reticulados é superado ao aumentar as concentrações de reagentes. Adicionalmente, testamos uma faixa de concentrações de proteína até e que inclui 65 mg/ml. Encontramos uma correlação entre concentração de proteína e tempo de reação, de modo que quanto maior a concentração de proteína, mais rápida a reação atingiu a conclusão (dados não mostrados). Após 2 a 24 horas em RT ou 37ºC, a reação estava completa, conforme determinado pela espectrometria em massa (Figura 1, Painel 4). Geralmente, um reagente estava em excesso e permaneceu desacoplado na mistura final. A reação completada foi purificada novamente por filttagem de gel; dessa vez coletamos o pico dimérico, o qual contém 0100 kd de bis-Fab reticulado de forma irreversível através de aminoácido de cisteína livre (no caso de tio-Fabs) ou através de cisteina não pareada localizada na região de dobradiça (no caso de dobradiça-cis-Fabs não modificada) (Figura 1, Painel 4). O progresso de reação durante ambas as etapas foi frequentemente por espectrometria em massa, a qual mostrou claramente a presença de ambos reagentes e a formação do produto de bis-Fab (Figura 1, Painel 4). A pureza do produto desejado após a segunda filtragem de gel foi determinada por espectrometria em massa e SDS- PAGE.

Mediante redução e análise SDS-PAGE, reticulação irreversível foi observada pela presença de uma banda de 50 kd que representa cadeias reticuladas não reduzíveis (Figura 1, Painel 5). Com o uso do processo descrito acima em escala pequena, alcançamos, de forma típica, rendimentos de micrograma para quantidades em micrograma de materiais iniciadores.

Adicionalmente, em uma escala maior, alcançamos, de forma típica, rendimentos de miligrama a partir de quantidades em miligrama de materiais iniciadores.

EXEMPLO 2 — SÍNTESE DE BIS-FABS QUE ALVEJAM HER2 E HER1 E ANÁLISE DE

ATIVIDADES BIOLÓGICAS IN VITRO DE BIS-FAB Para explorar várias atividades biológicas de bis-Fabs, sintetizamos bis-Fabs que alveja componentes do eixo Her, especificamente Her2 e Her1. A importância do eixo Her na indução de crescimento de célula cancerígena foi bem documentada e vários anticorpos inibitórios potentes estão prontamente disponíveis.

Veja, e.g., Kumar, R. et al., Semin Oncol 27(6 Suppl 11):84 a 91; discussão em 92 a 100 (2000); Yarden, Y. et al., Nat Rev Mol Cell Biol 2(2):127 a 37 (2001); Takai, N. et al., Cancer 104(12):2.701 a 8 (2005); Patel, D. et al., /nt J Oncol 34(1):25 a 32 (2009). Foi sugerido que uma molécula de combinação poderia fornecer benefício adicionado ou até mesmo benefício sinergístico sobre uma terapia de anticorpo única.

Veja, e.g., Ranson, et al., Oncology 63 Suppl 1:17 a 24 (2002); Jackson, J. et al., Cancer Res 64(7):2.601 a 9 (2004); Lee-Hoeflich, S.

T. et al., Cancer Res 68(14):5.878 a 87 (2008). Isto é particularmente o caso em que, como no presente contexto, dois receptores colaboram de forma ativa para induzir crescimento de célula de tumor.

Gerou-se bis-Fabs biespecíficos a partir de dois anticorpos diferentes que alvejam Her2 e a partir de dois anticorpos diferentes que alvejam Her1l (EGFR). Os dois anticorpos que alvejam Her2 eram pertuzumab (2C4) e trastuzumab (Herc). Ambos esses anticorpos são moléculas bem caracterizadas, incluindo conhecimento de como elas ligam seus alvos.

Nature 421(6924):756 a 60 (2003); Cancer Cell (4):317 a 28 (2004). Os dois anticorpos que alvejam Her1 eram D1-5 e C3-101. Ambos esses anticorpos se ligam ao domínio extracelular (ECD) de EGFR e as regiões para a qual eles se ligam no ECD de EGFR são conhecidas (Publicação de Pedido de Patente Internacional sob Nº WO 2010/108127). Para cada um desses quarto anticorpos, tio-Fabs recombinantes foram produzidos em E.

Coli Il, conforme descrito.

Então sintetizamos bis-Fabs a partir desses quarto tio-Fabs e um formato combinatório com o uso de uma matriz de síntese.

Começamos com aproximadamente 5 mg de cada tio-Fab.

Combinamos os tio-Fabs diferentes para sintetizar 10 moléculas únicas, conforme mostrado na Tabela 1 abaixo.

TABELA 1. MATRIZ DE SÍNTESE DE BIS-FAB.

Etapa 2 (reagir sto 2047 p1.5voe ca.101 e Fabsda. | Etapa 1) k Add a] aee [ Rana mn era en esenenato | (1204) 204 Here" | Herc""CmHerçY"e D1- Vito 14, Vi1oC | mercnes | (1191) (1188) gvieerentios | C3-101 Hero vivo, | 2catreema ste | meremena ge || PTS o | (1192) (1189) (1400) co 204” C3- Here" /Cc3- D1-5"""/C3- c3-101”!"/c3- vue q091/1ºº 401/11 q1091Yºe q01/1e (1187) (1190) (1193) (1401)

Aproximadamente 1 mg de cada bis-Fab listado na Tabela 1 foi recuperado da síntese. Cada um dos bis-Fabs foi dado um identificador único conforme indicado na Tabela 1 (número em parênteses). A pureza de cada bis- Fab foi analisada por SDS-PAGE (mostrado na Figura 2 A) e espectrometria de massa (dados não mostrados) Essas moléculas foram testadas para determinar se as mesmas retêm a capacidade de inibir sinalização celular e proliferação celular similar aos anticorpos-pais. Testaram-se duas leituras específicas para atividade de sinalização celular, a fosforilação de EGFR em resposta à transformação do fator de crescimento (TGF-a) e a fosforilação de Her3 após tratamento com heregulina (HRG). O ensaio de fosforilação de Her3 prova, de forma específica, a capacidade de Her2 de dimerizar com Her3 em resposta à heregulina (Junttila, T. T., et al., Cancer Cell 15(5): 429 a 40 (2009)). A dimerização permite que Her2 execute a fosforilação de Her3 e ative a trajetória de sinalização e isso é inibido por Fabs de Herceptin& e HerceptinO.

1d Para analisar atividade de anti-EGFR (anti-Her1) dos bis-Fabs, células NR6-EGFR foram testadas com TGF-a a 5 nM a fim de estimular fosforilação de tirosina de EGFR seguida pelo tratamento com os bis-Fabs indicados (Figura 2B, painel superior) em uma dose única de 50 nM. Cada um dos bis-Fabs testados, 1187, 1189, 1190 e 1192 continha um Fab derivado de um anticorpo anti-EGFR (anti-Her1), ou D1-5 ou C3-101. A atividade de fosforilação foi analisada através da prova de transferência por Western blot com a-pTyr conforme descrito em Junttila, T. T., et al., Cancer Cell 15(5): 429 a 40 (2009). Conforme mostrado no painel superior da Figura 2B, cada um dos —bis-Fabs testados exibiu inibição potente de fosforilação de EGFR em células NR6-EGFR. ErbituxO (cetuximabe) é um anticorpo monoclonal comercializado por Bristol-Meyers Squibb Co. que se liga especificamente a ECD de EGFR e foi usado como um controle positivo. As manchas foram sondadas com D-

tubulina para normalizar a carga de proteína em cada uma das faixas.

Para analisar a inibição de dimerização de Her2-Her3, a fosforilação de tirosina induzida por heregulina (HRG) de Her3 em células MCF7 foi monitorada por transferência por Western blotting anti-tirosina — conforme descrito em Junttila, T. T., et al., Cancer Cell 15(5): 429 a 40 (2009). As células MCF7 foram tratadas com HRG a 5nM a fim de estimular fosforilação de Her3 seguida pelo tratamento com os bis-Fabs indicados (Figura 2B, painel inferior) a uma dose única de 50 nM. Cada um dos bis-Fabs testados, 1187, 1191, 1192 e 1204 continha pelo menos um Fab derivado de um anticorpo anti-Her2, 2C4. Conforme mostrado na Figura 2B, painel inferior, cada um dos bis-Fabs testados exibiu inibição potente de fosforilação de Her3 que é o resultado da prevenção de dimerização de Her2-Her3. O anticorpo-pai 2C4 (pertuzumabe) foi usado como um controle positivo. As manchas foram sondadas com a-tubulina para normalizar a carga de proteína em cada uma das faixas. As titulações de Bis-Fab das moléculas mostraram que as moléculas retinham concentrações inibitórias eficazes que eram similares aos Fabs de anticorpo-pai (dados não mostrados).

Posteriormente, examinou-se o efeito de vários bis-Fabs no crescimento celular na cultura. AS linhagens celulares de tumor de mama, MDA-175 (ATCC HTB-25) ou BT474 (ATCC Nº HTB-20), foram usadas para testar bis-Fabs contendo Fab(s)derivado(s) de anti-Her2. Em experimentos não mostrados no presente documento, determinou-se que as células MDA-175 expressam o receptor Her2. Uma linhagem celular de fibroblasto de camundongo transfectada de maneira estável com células NR6-EGFR de EGFR humano (consulte Glading et al., J. Biol. Chem. 275:2.390 a 98 [2000]; Cancer Res. 67(3):1.228 a 38 [2007]), foi usada para testar bis-Fabs contendo Fab(s) derivado(s) de anti-Her1. Cada uma dessas linhagens celulares foi mantida e propagada com o uso de procedimentos de cultura celular padrão.

Para os ensaios de proliferação celular, as células foram cultivadas a fim de confluir e o meio foi trocado por meio fresco (DMEM:F12, FCS a 10%, PenStrep, Glutamax). As células foram tripsinizadas para coleta, lavadas por centrifugação, e trocadas no meio novo contendo soro a 1%. As células foram ajustadas para uma densidade de 20.000 células por ml e 250 Ol foram adicionados a cada cavidade de uma placa de 96 cavidades (5.000 células/cavidade). As células plaqueadas foram cultivadas de um dia para o outro e, então, estimuladas no dia seguinte através da adição de reagentes de anticorpo (por exemplo, bis-Fabs) diretamente nas cavidades.

As células foram cultivadas sob essas condições por cinco dias, após isso, o meio foi aspirado das cavidades e substituído por 250 Ol de meio fresco.

Alamar azul (25 ul) foi adicionado a cada cavidade e incubado a 37ºC por 3 a 4 horas.

A placa foi lida em um leitor de placa fluorescente a 545/590 nm (excitação/emissão). A quantidade de proliferação celular foi relatada diretamente em unidades fluorescentes relativas (RFUs) ou através da normalização de controles.

As Figuras 2C e 2D mostram os resultados de teste de vários bis-Fabs nas linhagens de célula indicadas para seus efeitos em crescimento celular.

A Figura 2C mostra que bis-Fabs 1191 e 1204, cada um contendo dois anti-Her2 Fabs, foram os inibidores mais potentes de crescimento celular MDA-175. As moléculas Fab únicas, 2C4-Fab e Herc- Fab, foram os inibidores menos potentes, e bis-Fab 1192, contendo um Fab anti-Her2 e um Fab anti-Her1 foi intermediário em sua habilidade de inibir o crescimento celular MDA-175 nesse experimento.

A Figura 2D mostra que o bis-Fab 1193, contendo dois Fabs anti-Her1, foi um inibidor potente de crescimento celular NRG-EGFR, semelhante ao anticorpo monoclonal D1-5 (anti-Her1). Bis-Fabs contendo um Fab anti-Her1, bem como o C3-101-Fab, que ainda exibem atividade inibitória de crescimento, foram inibidores menos potentes. Consequentemente, esses resultados mostram que 2C4- e bis-Fabs contendo Herc (1192, 1204, e 1191) eram capazes de inibir proliferação celular em células MDA-175 que expressam Her2. E bis-Fabs que contêm Fab(s) anticEGFR (1187, 1190, 1192, e 1193) foram capazes de inibir proliferação celular em um EGFR expressa as linhagens de célula (NR6-EGFR).

Posteriormente, foi diretamente comparada a atividade inibitória de crescimento celular in vitro de dois bis-Fabs que são análogos estruturais de seus anticorpos parentais à atividade inibitória de crescimento celular in vitro de seu anticorpo parental. A primeira comparação foi entre pertuzumabe (2C4) e bis-Fab 1204 (2C4Y1% /2C4 V110O) em células MDA-175. A Figura 2E mostra que o bis-Fab 2C4 ligado a LC-110C apareceu para exibir a atividade bifásica em inibir a proliferação celular de MDA-175 nesse experimento. Em concentrações mais baixas (1 nM), o bis-Fab pareceu estimular o crescimento enquanto que, em concentrações mais altas ele foi inibitório. A inibição semi-máxima esteve em - 2 nM comparada ao anticorpo parental, pertuzumabe. A segunda comparação foi entre trastuzumabe e o bis-Fab 1188 (Herc”"ºC/HercY1º) em células BT474 que superexpressam Her2. Também foi incluído o trastuzumabe-Fab nesse experimento. Os resultados são mostrados na Figura 2F. Com base nos resultados observados com pertuzumabe e bis-Fab 1204 discutidos acima, foi esperado observar nesse experimento que bis-Fab 1188 deveria inibir proliferação celular BT474 semelhante ao anticorpo parental trastuzumabe. A Figura 2F mostra que, como esperado, trastuzumabe fortemente inibiu a proliferação celular BT474 e o trastuzumabe-Fab foi um inibidor de crescimento celular menos potente. Surpreendentemente, contudo, foi observado que bis-Fab 1188 teve exatamente o efeito oposto em proliferação celular. Como claramente mostrado na Figura 2F, bis-Fab 1188 promoveu fortemente o crescimento celular BT474. As células BT474 se proliferam rapidamente mesmo na falta de quaisquer agonistas exógenos e de fato, não existe nenhum agonista conhecido nessa linhagem celular. Dadas essas propriedades proliferativas da linhagem celular BT474, a revelação de que bis-Fab 1188 pode funcionar como um agonista dessas células foi particularmente surpreendente e inesperada. Uma diferença estrutural entre os braços de Fab de trastuzumabe e os Fabs de bis-Fab 1188 é o sítio de conjugação. Em contraste ao anticorpo parental que tem a estrutura IgG típica com os Fabs unidos através de suas cadeias pesadas, os dois tio-Fabs de bis-Fab 1188 são conjugados através de suas cadeias leves em uma posição entre o primeiro domínio constante e variável. Por nenhum ligante para Her2 ter sido identificado de forma a ativar diretamente o receptor (Yarden, Y. et al, Nat Rev Mol Cell Biol 2(2):127-37 (2001); Jackson, J. et al., Cancer Res 64(7):2601-9 (2004)), foi inesperado que uma diferença estrutural entre o bis-Fab e o anticorpo parental resultaria no bis-Fab que tem atividade agonista diferente da atividade antagonista de seu parental. Dessa forma, a identificação de um trastuzumabe análogo que tem atividade agonista sob essas condições foi bastante surpreendente. Foi interrogado se outras variações na estrutura poderiam influenciar na atividade biológica das moléculas. Foi desenvolvida uma matriz estrutural, ou biblioteca análoga de variantes reticulados por gerar quatro diferentes tio-Fabs derivados de trastuzumabe. Isso será discutido em detalhes adicionais abaixo. EXEMPLO 3 — SÍNTESE E CARACTERIZAÇÃO DE VARIANTES ESTRUTURAIS DE BIS-FAB

DERIVADO DE TRASTUZUMABE Com o uso da abordagem de recombinação de matriz descrita acima, uma série de variantes estruturais de bis-Fab derivados de trastuzumabe é sintetizada. Foram escolhidos quatro pontos de ligação tio diferentes para sintetizar os bis-Fabs; duas das posições estavam na cadeia pesada e duas das posições estavam na cadeia leve. Os Fabs que contêm pontos de ligação tio foram derivados de três diferentes fontes; 1) tio-Mabs com substituições de cisteina que foram digeridos com Lisina-C para liberar o tio-Fab do anticorpo, 2) tio-Fabs com substituições de cisteina que foram diretamente expressos na e purificados a partir da E.

coli, e 3) dobradiça-cis-Fabs gerados pelo método enzimático descrito acima para a ligação de um único reticulador a uma região de dobradiça de um anticorpo não modificado após a digestão com pepsina. Essa abordagem produziu quatro pontos de substituição diferentes em tio-Fabs para a recombinação com outros tio-Fabs, dessa forma rendendo um painel de variantes estruturais (Figura 3A). As quatro diferentes posições de substituição estão na cadeia leve na posição 110 (LC*!ºY5), na cadeia leve na posição 205 (LC?ºs), na cadeia pesada na posição 118 (HC11%Ys) e na cadeia pesada na região de dobradiça (HCÂ9%”), A síntese foi feita em formato de matriz em que o grupo de quatro tio-Fabs foi primeiro conjugado com o reticulador e, então, recombinados entre si para produzir 16 moléculas, 10 das quais foram únicas em massa e estrutura. Os tio- Fabs são retratados esquematicamente na Figura 3A juntamente com uma lista dos identificadores únicos para os bis-Fabs sintetizados e a fonte de cada tio-Fab para cada bis-Fab. Os produtos purificados finais das reações de síntese foram caracterizados por espectrometria em massa para garantir a pureza do material de teste. Adicionalmente, analisou-se o peso molecular dos bis-Fabs por SDS-PAGE não redutor (Figura 3B). Conforme mostrado na Figura 3B, todos os variantes estruturais de bis-Fab tinham pesos moleculares aparentes vastamente diferentes, um resultado interessante considerando que cada um dos tio-Fabs de fonte tinham o mesmo peso molecular e o mesmo reticulador foi usado para sintetizar cada bis-Fab. A explicação mais provável para os diferentes pesos moleculares aparentes é que os sítios de ligação (os pontos de ligação tio) criam variantes estruturais que são observadas no polipeptídeo estendido linearmente que ocorre em condições de desnaturação.

Em seguida, cada uma das variantes estruturais de bis-Fab foi testada para seu efeito na proliferação de célula BT474 em comparação ao trastuzumabe. A Figura 3C mostra o efeito de cada um dos bis-Fabs e o anticorpo progenitor, trastuzumabe, testado a concentrações variadas (indicadas no eixo geométrico horizontal) no crescimento da célula BT474. As células viáveis foram determinadas pela coloração azul Alamar e relatadas como uma porcentagem do máximo normalizado a controles não tratados (% Max no eixo geométrico vertical).

Conforme mostrado na Figura 3C, os variantes estruturais de bis-Fab trastuzumabe exibiram uma ampla faixa de atividades que atravessou dos antagonistas que exibem atividade similar ao anticorpo progenitor (bis- Fabs 1324, 1328, e 1329) para antagonistas muito potentes (bis-Fabs 1321, 1322, 1323, e 1325). Curiosamente, quatro desses bis-Fabs agonistas foram agonistas mais potentes more que o agonista original identificado, bis-Fab 1188 (Figura 3C). Nesse ensaio, o agonista mais potente foi o bis-Fab 1325, que é a combinação de HercHC*'*O e HercLC?ºº% Finalmente, um experimento de curso de tempo foi realizado testando o efeito do bis-Fab 1325 em comparação a Herceptin&O (trastuzumabe) no crescimento de célula BT474. Conforme mostrado na Figura 3D, Herceptin&ê (trastuzumabe) (barras abertas) inibiu oO crescimento por todo o curso do experimento, enquanto que o bis-Fab 1325 (barras listradas inclinadas para cima) promoveu o crescimento celular, consistindo no ensaio de crescimento celular descrito acima.

As barras listradas inclinadas para baixo mostram as células de controle que não receberam tratamento.

Consideraram-se as diversas combinações de ligação do bis- Fabsem conexão com certos atributos físicos das moléculas.

Conforme mostrado na Figura 3B, a análise de SDS-PAGE revelou diferenças em peso molecular aparente entre os diferentes bis-Fabs.

Isso, entretanto, não foi um previsor confiável da atividade de proliferação celular BT474 do bis- Fab.

Mais notavelmente, o agonista mais potente no ensaio de BT474, HercHC!"*s-HercL CC? mostrou um peso molecular aparente muito próximo do peso molecular aparente dos agonistas potentes.

Em adição às diferenças de migração observadas em SDS-PAGE, que é provavelmente devido ao local de sítios de ligação, analisaram-se outras propriedades físicas.

Testou-se para internalização, afinidade para o receptor alvo mediante análise de Scatchard, eluição de SEC-MALS e peso molecular e raio hidrodinâmico.

Os resultados da análise da constante de dissociação de célula de superfície (Kd) e sítios por célula para as moléculas indicadas são mostrados na Tabela 2 abaixo.

Nenhuma diferença significativa foi observada entre moléculas agonistas e antagonistas.

A Figura 4 fornece uma análise de gel de filtração em Shodex SEC que mostra os tempos de retenção relativa (indicados no eixo geométrico horizontal) (RT) e raio hidrodinâmico (Rh) das moléculas indicadas.

Novamente, nenhuma diferença significativa foi observada entre moléculas agonistas e antagonistas.

Consequentemente, esses experimentos não revelaram qualquer diferença significativa nessas propriedades físicas entre moléculas agonistas e antagonistas, apenas diferenças de migração em SDS-PAGE (Figura 3B) e um leve deslocamento em retenção em SEC (Figura 4).

TABELA 2. KD DE SUPERFÍCIE DE CÉLULA ANTAGONISTA E AGONISTA E SÍTIOS POR CÉLULA. [assa [rar [retma | masc [ssa] ET Bis-Fab e Herceptin (trastuzumabe) 36 3,8 37 1,50 x 10º Calu3 (antagonista) Herceptin-Fab (trastuzumabe-Fab) 7,3 92 83 2,10 x 10º Calu3 (antagonista) Bis-Fab 1325 6 ES De De De Dee [o] Herceptin (trastuzumabe) 44 45 0,86 x 10º BT474 (antagonista) A seguir, analisouse a trajetória de sinalização Her, especificamente ao examinar a ativação de receptor em células BT474 após tratamento de agonista.

Em linhagens de célula que superexpressam Her2 como BT474, Herceptin& (trastizumabe) inibe interações de ligante independentes entre Her2 e Her3 o que explica os efeitos antiproliferativos do anticorpo em cultura celular (Junttila, T.

T., et al.

Cancer Cell 15(5):429 a 40 (2009)). A interrupção de interações de Her2/Herô por Herceptink (trastuzumabe) resulta na perda de fosforilação de Her3 e uma diminuição na atividade da quinase de serina/treonina, AKT. 1d.

Compararam-se os efeitos do agonista bis-Fab 1325, do antagonista bis-Fab 1329, o anticorpo-pai, HerceptinO& (trastuzumabe), e um anticorpo de controle que carece de ação de fosforilação, gD, em fosforilação de AKT e Her3. Células BT474 foram tratadas com cada uma dessas moléculas.

Células foram colhidas em 10 minutos, 30 minutos, e duas horas após o tratamento ter sido iniciado.

Lisados de célula foram medidos para fosforilação de AKT mediante ELISA com anticorpos anti- fosfo AKT.

Os resultados são mostrados na Figura 5A.

Os antagonistas Herceptin& (trastuzumabe) e bis-Fab 1329 diminuíram a quantidade de

AKT fosforilado, conforme medido por ELISA, enquanto que o agonista bis- Fab 1325 aumentou a quantidade de AKT fosforilado (Figura 5A). À atividade inibidora do anticorpo e bis-Fab 1329 foi observada em dez minutos e continuou a aumentar levemente por até duas horas.

O antagonista bis-Fab 1329 foi levemente menos potente do que o anticorpo- pai nos primeiros trinta minutos do experimento, mas atingiu o mesmo nível de inibição em 2 horas. (Figura 5A). O agonista bis-Fab 1325, entretanto, resultou em um aumento no nível de fosfo-AKT após dez minutos e o nível de fosfor-AKT continuou a se elevar levemente durante duas horas de tratamento (Figura 5A). Um efeito de anticorpo é visto com gD em que níveis de fosfo-AKT se elevam levemente após o tratamento.

O efeito, entretanto, está dentro da faixa de variabilidade não tratada.

Análise de transferência por Western blot com o uso de anticorpos de fosfo-AKT também mostrou que o nível de fosfo-AKT aumentou em resposta ao

—agonista bis-Fab 1325 (Figura 5B, comparar linha pAKT à linha AKT). Também foram examinados os níveis de fosforilação de Her3, porque o tratamento com Herceptin& (trastuzumabe) é conhecido por reduzir os níveis de Her3 fosforilado (Cancer Cell 15(5):429 a 40 [2009]). Para esses experimentos, células BT474 foram tratadas com HerceptinO (trastuzumabe), bis-Fab 1325, bis-Fab 1329, ou gD em placas de 96 cavidades por até duas horas.

Nos momentos indicados (10 minutos, 30 minutos ou 2 horas) as células foram solubilizadas.

A análise de Western blot dos lisados celulares foi realizada conforme segue.

Os lisados celulares foram separados por SDS- PAGE e transferidos para membranas de nitrocelulose.

As membranas de —nitrocelulose foram sondadas com os anticorpos fosfoespecíficos (pHER3, pAKT, ou pMAPK) ou não fosfoespecíficos (HER3, AKT, ou MAPK) indicados para avaliar o estado de ativação das enzimas de trajetória de sinalização de Her indicadas.

Um anticorpo anti-tubulina foi usado como um controle.

Conforme mostrado na Figura 5B, a análise de western blot com o uso de anticorpos de fosfotirosina anti-Her3 mostraram uma diminuição característica e esperada no fosfo-Herôd em relação aos antagonistas HerceptinO& (trastuzumabe) e bis-Fab 1329 que ocorreu em duas horas (Figura 5B, comparar linha de pHER3 à linha de HER3). O tratamento de células com o anticorpo gD não teve efeito no nível de fosforilação de Her3 (Figura 5B, comparar linha de pHER3 à linha de HER3). Surpreendentemente, não observamos um aumento antecipado em fosfo-Her3 pelo tratamento com o agonista bis-Fab 1325 (Figura 5B, comparar a linha de pHER3 à linha de HER3). De fato, houve uma pequena diminuição na quantidade de fosfo-Her3 através do período de duas horas, similar ao que foi observado com os antagonistas (Figura 5B). A fosforilação observada de MAPK em relação ao tratamento com bis-Fab 1325 (Figura 5B, comparar a linha de pMAPK à linha de MAPK) indica que o agonista pode estar ativando uma trajetória em geral associada à ativação induzida por ligante. Esse resultado surpreendente levanta questões sobre os mecanismos através dos quais os agonistas bis-Fab de Her2 estão atuando.

Portanto, a seguir, investia-se se há um impacto direto na fosforilação de Her2 quando as células são tratadas com o agonista bis-Fab 1325. —Mostrou-se previamente que o tratamento com Herceptin& (trastuzumabe) não altera significativamente o estado de fosforilação de Her2. Kito, K. et al., Cum Genomics 9(4):263 a 74 (2008). Porque Her2 é altamente fosforilado no estado basal (consultar /d.), usou-se espectrometria de massa quantitativa para sondar as mudanças de sítio de fosforilação em Her2 em relação às diferentes moléculas. Como uso de técnicas de fosfo-mapeamento, determinou-se que um número de sítios foram fosforilados a níveis diferentes em Her2 em células BT474 não tratadas (Tabela C, coluna basal). A tabela C abaixo fornece uma lista dos peptídeos fosforilados derivados de clivagem de tripsina de Her2.

E) BS o nº ma 8 xs a om 34 sSSSSTS CIPBAZS 8 à 2 SS ao HFRARAEFHAFNABAA Fo A NESSA % |STSNBS Cesaçs & 3 2 SE 2 ESSES NRSscge SS 8 + SE a eczs or - se eae 8 a = ao so sc3sZSosS cISTSAÂ 8 SS EF do uu o AH a qa car Ho o Goa aa HH qo Ao NEH A o O SgrenBETTAEgoNDE à & vÕSN = | = = je oO o ms Eos” TS sSSSocoRS SE 8 S ES £o eo BS emo VV. o e o o + o as TBSSOT Voromo às MS a SS o o, HH HHCu". ndo H o H +H HE HH go CogaNSToaZoocs o à E Ness 2 FESTAS se socgo E E E 48 [=] og mo EPT. Ss x eo To sSSSST= aSCUlANS Ss Ss 3 es + oOoOoO o basi os o Ex] RT HOR aos om on 7 O TH, nn +” EH H ae CosTeaToNidaNo nn OQ geo : º > o : Ss S co o Ss om & 8 STRAS SCIXGSNS 8 SS 8 ST 858 . doa 8% 8 E, 3a | S5SSSSisS553S 3 T.TcisS = 2 E > E, 23ES) ZSGZZZEEREÇER Z SIE RE| o SEE Zz E EIZ 8 2“ 3 3 Ê 3 mg 2 E BB SSSS ? & N DiontonE och oca 0 õ ; = SoO000 2 g Go 222222 o 5 os Pcoeoo FM E = o a sosstrP2e2299 8 8sal E O SIIOC[OOOS — 2: O 8 < s QE OQONHNWUWMH = Oo O: o“ o = o gaz coco 3 z ZoXuS|re ua Z GPAOXNMXCMZZY :: o of gTEio m| EsSs 1: TTZ= a =anaPo = a. ERREIIEIIE ESSES SER = Zogaçonssssss aeroromsg 8 = = == ç ZocgrÊEFiaaaaso FeEerExçEe Ss 2 EcgogmmooSDSDS CEPE SETZT| O Emo ÇINHONOOASO XCOTFOTFHEÉSZ| o Ss TonsTUNELCERER SAasasvtzals Ss ExEoÓGaaBaDaDna Zu buNETZZO| o o SEoZFiNOO DAR SHOESESÍRSI o à ESC SADI SS SOSSSEDE| E Ho a E Exmuvuajl > 8 SEE NSAZPSOGOS0S ELSE SS 2 Ó ZGETEGOTOT UWHWWHWWM Fr2scsSsSã paáagsre asd ROW LCczeoz Sl; rm OOSNS a noAQAqLcao FERE ZAÃSE WWW OSSO O << < DONO = E o GoOOBaB>=00XI 233 GowmSSTSA| 2 a o = Ono E ISSIESSTSSTSS oPosfPomool 8 o SN ON CO CO (O (O (O (O co eo 1 o = 8 8 egggess2SS2SSSS EXE 2 TSS/ > 8 cogvger RTAC Q as! 8 É [g2ssssapsdosd ss S&S ass: & SNNSSSSÇRRPPPS2RCPS PE Ec [Eos 2 o E 7 & go E 3 Ss TS Ts 3 2 o oo o a = o ST o ” SEIT OOSRÇOSUS o ss o SS [= sesggSsSsSsSSSSSSSS S sesSl,

SAE SNRNSTSTTTLTEOTNOSOS E ITEER

O aminoácido em cada sequência de peptídeo denotado com uma pequena letra maiúscula em negrito e itálico indica o resíduo fosforilado de interesse.

À medição quantitativa desses sítios mostrou que após o tratamento com Herceptin& (trastuizumabe), houve muito poucas mudanças no nível de fosforilação dos fosfopeptídeos comparados às células não tratadas (Tabela C e Figura 5E). Mas, o tratamento com o agonista bis-Fab 1325 mostrou que diversos sítios de fosforilação que aumentaram na quantidade de fosforilação, se comparados às células não tratadas (Tabela C e Figura SE). Alguns dos sítios de fosforilação também aumentaram no nível de fosforilação que seguiu otratamento com Heregulina, um agonista de trajetória de PISK (Tabela C e Figura 5E). Também se realizou um teste estatístico.

Para cada peptídeo, um modelo de efeitos misturados foi ajustado ao nível de fosforilação relativo, com tratamento como um efeito e amostra fixos como um efeito aleatório.

Conforme mostrado na Figura SE, comparações par a par de grupos foram realizadas como uso do método de Tukey-Kramer para ajustar comparações múltiplas.

Isso controla a taxa de positivo falso geral associada à execução de testes estatísticos múltiplos para cada peptídeo.

Resumindo, esses resultados revelam a possível ativação independente de ligante e independente de Her3 das trajetórias de sinalização de célula que levam À proliferação.

Ademais, tais resultados poderiam levar à identificação de componentes de sinalização adicionais que estão envolvidos na proliferação celular, levando, assim, a novos alvos terapêuticos para distúrbios proliferativos celulares, como, mas sem limitação, câncer.

EXEMPLO 4 — SÍNTESE E CARACTERIZAÇÃO DE BIS-FABS QUE ALVEJA FCrIRIIB E

FcsRI Para testar a aplicabilidade geral da abordagem de síntese de bis- Fab em outros alvos moleculares, foi projetada uma matriz de bis-Fab biespecífico com o uso de tio-Fabs ou uma dobradiça-cis-Fab derivada de um anticorpo (5A6) que tem como alvos FcyRllb e tio-Fabs ou uma dobradiça-cis- Fab derivada de um anticorpo que tem como alvo FceRla (22E7). Os anticorpos 5A6 e 22E7 são descritos na publicação de patente nº U.S.20060073142 e Jackman, et al., J.

Biol.

Chem. 285:20850 a 20859 (2010). A proteína de superfície celular de FeyRIlb é uma proteína tirosina fosfatase que pode se desfosforilar próximo a receptores de tirosina como FceRla para inibir sua atividade.

Previamente, foi descrito um IgG biespecífico que tem como alvo esses dois receptores na superfície de mastócitos (/d.). Além disso, foi mostrado que o anticorpo biespecífico foi ligado e reticulado a FeeRla e FoyRlilb que formam um complexo receptor heterodimérico, o que inibiu potencialmente a sinalização celular e a liberação de histamina se iniciou através de IgE que se liga a FeeRla. /d.

Com base nesse mecanismo de ação do IgG biespecífico, foi postulado que um bis-Fab que direciona FcyRIlb e FceeRla na superfície de mastócitos poderá ter um mecanismo análogo de ação.

Dessa forma, sem se ater à teoria, foi suposto que o tratamento com um bis-Fab que direciona FecyRllb e FceeRla levará ao recrutamento de FeyRilb no complexo receptor ativado e resulta na inibição da liberação de histamina.

Para sintetizar bis-Fabs que direcionam FcecyRllb e FceeRla, foram gerados tio-Fabs de cada um dos anticorpos-pai que têm substituições cis na posição 110 na cadeia leve e posição 121 na cadeia pesada.

Também foram gerados dobradiça-cis-Fabs a partir de cada um dos anticorpos-pai que têm apenas um cis na região de dobradiça.

Esses dobradiça-cis-Fabs foram preparados com o uso de métodos de DNA recombinante, isto é, através da subclonagem de um fragmento de DNA do anticorpo-pai Fab e expressão deste em E. coli, seguida por purificação.

Todos os métodos de DNA recombinante e métodos de purificação de proteína foram procedimentos padrão bem conhecidos daqueles elementos versados na técnica e descritos, em geral, acima.

A Tabela 3 abaixo ostra a matriz de síntese de bis-Fab que indica os pontos de fixação tio e fornece o número de identificação exclusivo para cada bis-Fab (em parênteses). TABELA 3. MATRIZ DE SÍNTESE DE BIS-FAB. o Etapa2 - (reagir com bis- 1100 1210 nois Mattio -Fabs da FeyRilb' FeyRilb' FeyRilb' Lo Etapa do À FeeRIQ" FeyRIIb""/FceRIa FeyRilb”"/FeeRIa" FeyRIib"*/FceRIa O cena (1307) (1301) (1304) FosRia'2º FeyRIIb!""/FeeRIAº FeyRIIb""/FeeRIA FeyRIIb"*/FceRIAPO ceRIa (1305) (1299) (1302) FoeRIQHe0is FeyRIib"/FeeRIa O | FeyRIIb""/FceRIa" e | FeyRIb"S"/FceRIAN O certa (1306) (1300) (1303) Previamente, foi descrita a geração de variantes da linhagem celular de RBL que expressam FceRla e FeyRilb (Jackman, et al., J.

Biol.

Chem. 285:20850 a 20859 (2010)). Foi testado o efeito de cada um dos bis- Fabs listados na Tabela 3 na liberação de histamina a partir das células de RBL que expressam FceRla e FeyRIilb.

As células foram tratadas com ua um TOS DIS"FAbs e à Meração de MstammTta OMEGA AM" = concentrações de c: tados são mostrados nas Figuras 6A e 6B.

Conforme pode 10 por ELISA.

Os resul es bis-Fabs exibiram uma gama de atividades.

Para vários ser visto, os diferent potentes, o nível mais elevado de atividade de inibição foi dos antagonistas pr ções de 370 a 110 ng/ml.

Essa é presumidamente a visto em concentra al a quantidade máxima de complexos inibitórios é formada. concentração na qu: nais elevadas, um braço do bis-Fab pode se ligar a esse 15 Em concentrações | 1tro braço, pode não ligar o outro receptor do complexo receptor onde, o ot 1 análogo às curvas de atividade em formato de sino que inibitório.

Esse serie iméricos têm quando a dimerização do receptor é exigida alguns hormônios d Itracelulares (por exemplo, VEGF e seu receptor). Além para gerar sinais ir s moléculas não mostraram qualquer atividade inibitória, 20 disso, inúmeras da cula mostrou inibição extraordinária.

Esses resultados são enquanto uma molé ra 6B.

As quatro moléculas que não exibiram inibição mostrados na Figu potente (1299, 1300, 1301, 1302) contêm pelo menos uma ligação 121Cis de cadeia pesada. A molécula inibitória mais potente, 1303, é ligada a ambos os tio-fabs através da dobradiça-cis. EXEMPLO 5 — BIS-FABS MODIFICADOS E ATIVIDADE IN Vivo Um recurso dos bis-Fabs descritos acima é uma meia vida in vivo curta esperada devido, pelo menos em parte, à ausência de uma região Fc na molécula. Para determinadas aplicações in vivo, seria desejável que os bis- Fabs possuíssem propriedades farmococinéticas similares às dos anticorpos nativos. Em conformidade, foi projetado um método para produzir reticuladores modificados para o uso na síntese de bis-Fabs.

O uso de tais reticuladores modificados, conforme descrito em detalhes acoima, permite a adição de reagentes úteis para modificar a meia vida in vivo, como, mas não se limitando a, polietileno glicol (PEG). Ainda, os reticuladores modificados, conforme descritos no presente documento, permitem a adição de reagentes úteis como agentes de imageamento e detecção, tais como, mas não se limitando a, marcadores fluorescentes ou agentes citotóxicos, como, mas não se limitando a, monometil auristatina E (MMAE), ou reagentes que possuem outras propriedades ou funções desejáveis, como, mas não se limitando a, siRNA.

SÍNTESE DE RETICULADOR MODIFICADO E BIS-FABS MODIFICADOS Projetou-se um processo para sintetizar um reticulador modificado que poderia permitir ligação de qualquer porção reativa a sulfidrila. Abaixo, descreve-se um processo para ligar N-succinimidil-S-acetiltioacetato (SATA) a bis-maleimida para formar bis-maleimido-acetilticacetato (BMata) que tem um grupo SH protegido que pode ser usado em mais reações para a ligação de grupos funcionais desejados.

Iniciou-se com amina de bis-maleimida (MW 546.62) obtida junto à Quanta BioDesign Limited, Powell, OH. Sessenta micromoles (32 mg) foram dissolvidos em 100 ul de dimetilamina (DMA) e diluídos com 1 ml de acetonitrila.

Cento e trinta micromoles (31 mg) de SATA (N-Succinimidil-S- acetilticacetato, MW 231.23, Thermo Fisher Scientific) foram dissolvido em 1 ml de acetonitrila e adicionados à solução de bis-maleimida.

Tampão de Hepes (salde potássio, pH 7,1, 0,5 M) foi adicionado a uma concentração final de 0,15 M e a mistura de reação foi incubada de um dia para o outro no escuro a 4ºC.

A mistura foi diluída 4 vezes com ácido trifluoroacético a 0,1% (TFA) antes da separação em uma coluna C4 de 10x250 mm (Vydac) com um gradiente de acetonitrila de 15 a 50% em TFA a 0,1%). Frações contendo bis-maleimido- —acetiltibacetato (MW 662.29), conforme avaliadas por espectrometria de massa por eletroaspersão (Agilent 6210 TOF), foram agrupadas, secas sob centrifugação a vácuo e armazenadas a -20ºC.

A reação para sintetizar esse reticulador modificado, BMata, é mostrada na Figura 7A.

Um reagente que pode ser ligado a BMata é PEG, cujos efeitos foram investigados sobre a meia vida de bis-Fabs modificados in vivo.

Seguiu- se o seguinte procedimento para gerar um bis-Fab contendo BMata para reação subsequente com PEG.

Um lote de EGFR que alveja bis-Fab (Her1) (C3-101 tio-FabY11%) e Her2 (trastuzumabe (Herc) tio-Fab“Y1º) foi produzido com o reticulador BMata.

Cerca de 500 mg de bis-Fab modificado foram sintetizados com uso de 500 mg de cada tio-Fab como material de partida.

Os tio-Fabs foram expressos em E. coli e purificados conforme descrito acima.

O bis-Fab foi sintetizado primeiramente por reação química de BMata com trastuzumabe tio-FabY"*, O complexo foi isolado por filtração de gel e reagido com = C3-101 tio-FabY!1ºº para produzir o polipeptídeo biespecífico reticulado.

O complexo final foi isolado novamente por filtração de gel e caracterizado por espectrometria de massa e SDS-PAGE conforme descrito acima.

Devido ao tiol mascarado em Bmata (Fig. 7A), o bis-Fab produzido com uso desse reticulador é receptivo a peguilação com polímeros contendo maleimido após a desproteção do grupo bloqueador com hidróxilamina. Para isso, o bis-Fab foi primeiramente separado em diversas alíquotas de cerca de 50 a 60 mg cada. Para cada alíquota, um décimo do volume de hidróxilamina a 0,5 M, EDTA a 25 mM em salina tamponada por fosfato (PBS) e pH 7,2 foi adicionado. A desproteção ocorreu à temperatura ambiente por cerca de duas horas. A remoção do grupo protetor por hidróxilamina resultou na perda de 42 daltons o que pode ser observado por uma mudança na massa do bis-Fab por espectrometria de massa (dados não mostrados). Após a desproteção, um equivalente molar de 1:1 de PEG- maleimido foi adicionado às alíquotas de bis-Fab e deixou-se reagir por 2 a 20 horas. Isso resultou em conversão quase completa do bis-Fab em uma espécie de peso molecular mais alto que contém um único PEG (dados não mostrados). O esquema de reação geral é mostrado na Figura 7B.

Iniciando-se com o bis-Fab reticulado por BMata C3- 101Y!1º Hero”, diversos tamanhos diferentes de polímeros PEG foram usados na reação de síntese descrita acima para gerar bis-Fabs peguilado que leva PEG de peso molecular variável. Os vários polímeros PEG foram obtidos como derivados de maleimido junto à NOF Corporation (Japão). Após a reação com os reagentes PEG, os bis-Fabs peguilados foram purificados por filtração de gel S-200 gel em MÊS a 25 mM, pH 5,8, NaCl a 300 mM, e EDTA a 1 mM. A Figura 8A mostra uma análise SDS-PAGE dos bis-Fabs purificados. Cinco produtos de reação diferentes são mostrados, da esquerda para direita. Começando-se da esquerda está BMata bis-Fab reagido com uma tampa de N- etimaleimida (NEM), então BMata bis-Fab reagido com cadeias de PEG lineares de 2 kDa, 12 kDa e 20 kDa, respectivamente, e finalmente, BMata bis- Fab reagido com um peptídeo de ligação de maleimido e albumina, ABP, mal- H, AGRLMEDICLPRWGCLWEDDF (SEQ ID NO: 24). Nguyen et. al, Prot.

Engineering, Design and Selection 19:291 a 97 (2006). O bis-Fab-ABP foi sintetizado para investigar a porção de ABP como uma alternativa a PEG como um meio de aumentar a meia vida do bis-Fab aumentando a ligação de albumina de soro. Consulte /d.

Esses cinco bis-Fabs modificados foram analisados por cromatografia de filtração de gel, e mostraram ter um raio hidrodinâmico grandemente aumentado. Os bis-Fabs contendo PEG 20 Ke o PEG 12Keo bis-Fab contendo ABP foram observados por eluírem em filtração de gel S-200 significantemente antes que uma IgG humana típica (tempo de retenção de 25,2 minutos) (Figura 8B). Em seguida, investigaram-se os parâmetros farmacocinéticos, incluindo meias vidas, de cada um desses cinco bis-Fabs C3- 101Y! ºC HercY!1º modificados tanto em camundongos quanto em ratos nus. Esses experimentos e resultados são descritos em detalhes abaixo.

FARMACOCINÉTICA DE BIS-FAB Dois experimentos separados foram realizados para avaliar os efeitos das modificações de BMata-PEG ou BMata-ABP descritas acima em meia vida de soro in vivo de bis-Fabs C3-101Y!"C/HercY 1º, Uma única dose de bolo IV de 5 mg/kg foi administrada ou a um camundongo ou a ratos pelados e bis-Fab presente no soro foi analisado por até 14 dias.

Camundongos individuais foram usados para todos os pontos de dados, enquanto nos ratos, as amostras de soro foram retiradas dos mesmos animais ao longo do curso do experimento.

Um ensaio ELISA foi desenvolvido para detectar o bis-Fab biespecífico intacto no soro de camundongo e rato. Os detalhes do ELISA são — como segue.

A concentração de bis-Fab em soro de roedor foi determinada com o uso de um ELISA. De maneira resumida, EGFR-Fc (Reagente Genentech) diluído em 1 pg/ml em PBS, foi revestido sobre placas de poliestireno de 384 cavidades Maxisorb (Nalgate Nunc International Cat nº 464718). Após 16 a 72 horas, o revestimento foi removido e as placas foram bloqueadas com tampão de bloqueio (PBS / BSA a 0,5%/ Proclin 300) por 0,5 a 3 horas.

Diluições de bis-Fab padrão (0,156 a 20 ng/ml) foram preparadas em tampão de ensaio (PBS / BSA de 0,5% / Tween 20 a 0,05% / CHAPS a 0,25%/ EDTA a 5mM/ BGG a 0,2%/ NaCl a 0,35M/ Proclin 300 a 15 ppm). As amostras (soro de rato ou camundongo contendo bis-Fab) foram diluídas a uma diluição mínima de 1/100 em tampão de ensaio, e, então, diluídas em série 8 vezes em faixa de ensaio.

As placas bloqueadas foram lavadas 3 vezes com tampão de lavagem (PBS/ Tween 20 a 0,05%) e padrões e amostras foram adicionadas a cavidades de ensaio apropriadas.

Após uma incubação de 1 hora, as placas foram lavadas 6 vezes com tampão de lavagem.

O bis-Fab ligado foi detectado com o uso de um HER2 ECD biotinilado (Reagente Genentech Lote 39575-15- a biotinilação foi realizada com o uso de química de NHS-Sucimida (produtos orgânicos de pesquisa de Biotin-X-NHS 10554B-2)). Após uma incubação de 1 hora, as placas foram lavadas 6 vezes com tampão de lavagem e estreptavidina peroxidase ligada de rábano (GE Healthcare RPN1231) diluída 1/40.000 em tampão conjugado (PBS / BSA de 0,5% / Tween 20 a 0,05%/Proclin 300 a 15 ppm) foi adicionada a todas as cavidades de ensaio.

Após uma incubação de 30 minutos, as placas foram lavadas 6 vezes e o substrato TMB (KPL Cat. nº 50-65-02) foi adicionado a todas as cavidades de ensaio.

A reação de substrato foi interrompida após 15 a 20 minutos com Ácido Fosfórico a 1M.

As placas foram lidas a 450 nm com o uso de m comprimento de onda de referência de 620 nm.

As concentrações de amostra foram determinadas através da comparação de resultados a padrões com o uso de um algoritmo de ajuste de curva de 4 parâmetros.

Tanto em camundongos com em ratos, a adição de PEG ao bis- Fab diminuiu a taxa de desaparecimento da molécula (Figuras 9A-B, Tabela 4).

A peguilação 2K foi observada por diminuir o desaparecimento por um fator de dois (Figuras 9A-B, Tabela 4). Através da adição de uma PEG 20K, a meia vida de bis-Fab poderia ser estendida até 30 a 35 horas (Figuras 9A-B, Tabela 4). Esses resultados indicam que uma faixa de dosagem pode ser alcançada para —bis-FabsequeabPK da molécula pode ser modulada para acomodar diferentes necessidades através da variação do tamanho do PEG fixado O desaparecimento do bis-Fab não peguilado foi aproximadamente aquele esperado para um F(ab'); e o bis-Fab peguilado 20K possuía uma meia vida e o desaparecimento mais próximo a um IgG. Além disso, houve uma pequena diferença na meia vida entre o bis-Fab 12K e o bis-Fab 20K (Figuras 9A-B, Tabela 4) indicando que um PEG maior pode não aumentar a meia vida significativamente. Finalmente, as meias vidas de ABP-bis-Fab não foram significativamente estendidas sobre os bis-Fabs não modificados nesses experimentos. (Figuras 9A-B, Tabela 4). Os dados farmacocinéticos adicionais são apresentados na Tabela 4 abaixo. TABELA 4. PARÂMETROS FARMACOCINÉTICOS COM BASE EM MODELOS DE DoIS COMPARTIMENTOS.

[| Jam] avo Jean co [ema] vi [ves | Trrstmento.- | noras [atstngm] horas Imvaiano] nom: miafe | 2PeG | 585 | 41066 | 172 | 119 [67046 560/7042] | 12PeG | 716 | 104856 | 277 | 479 |[161263/310]473| | 20PeG | 678 | 91806 | 311 | 544 J126336/39,6]660| | 2re | 50 | 40272 [183 | 106 | na [5251769] | 12PeG | 651 | 83665 | 264 | 611 | nA Jass/os7| | 20PeG | 47 | 0566506 | 322 | 531 | nA J417/802] [ ae | 68 | 76078 | 192 | 706 | na fazolsia] Alpha HL = meia vida de fase alfa; Beta HL = meia vida de fase beta; AUC = área sob a curva de tempo-concentração de soro para último ponto de observação; CL = desaparecimento; Cmax = concentração máxima observada durante o período de dosagem; V.. = volume de distribuição a estado estacionário; N/A = não disponível.

ATIVIDADE IN VIVO DE BIS-FAB Para estudos de modelo de xenoenxerto de camundongo in vivo, construiu-se um bis-Fab peguilado como segue.

Gerou-se, em primeiro lugar, um bis-Fab reticulado de BMata contendo um tio-Fab de direcionamento de Her2, 20C4Y1%º, e um tio-Fab de direcionamento de EGFR (Her1), D1-5Y!"%, Esse bis-Fab reticulado de BMata foi, então, reagido com hidroxilamina e um equivalente molar de 1:1 de mal-PEG 20K a fim de produzir o bis-Fab peguilado.

O bis-Fab peguilado foi purificado e analisado por SDS-PAGE (Figura 10A). O bis-Fab peguilado teve testada sua capacidade de inibir proliferação de células Calu3 in vitro.

As células Calu3 são conhecidas por expressarem Her2 e EGFR (dados não mostrados). Para o ensaio, 8.500 células foram distribuídas por cavidade e tratadas com heregulina a 20M e TGF a 5nM . Testou-se, então, as concentrações variantes de anticorpos-pai e bis- Fab (as concentrações indicadas no eixo horizontal da Figura 10B) em relação à capacidade de bloquear crescimento celular estimulado por ligante.

A placa foilida em um leitor de placa fluorescente a 545/590 nm.

A quantidade de proliferação celular foi relatada diretamente em unidades fluorescentes relativas (RFUs) ou através da normalização de controles.

A Figura 10B mostra que o bis-Fab peguilado foi um inibidor potente de proliferação de Calu3 nesse experimento.

De fato, o mesmo foi mais potente que qualquer um dos —anticorpos-pais, 2C4 e D1-5. A seguir, avaliou-se a farmacocinética do bis-Fab PEG- 2C4Y110/D1-5Y110 20K em camundongos Beges SCID.

Um ensaio de captura baseado em ELISA similar conforme descrito acima para o bis-Fab

Cc3-101Y!*C/HercY!1% foi usado para determinar a quantidade da molécula no soro.

A Figura 11A mostra os resultados plotados como concentração de soro versus tempo enquanto a Figura 11B mostra os resultados plotados como concentração/dose de soro versus tempo.

O bis -Fab PEG- 2C4Y!1º/p1-5Y110º 20K foi removido mais rapidamente do soro que o bis-Fab -PEG- C3-101Y! "ºC /HercY!! 20K (comparar Figuras 11A-B à Figura 9A). Acredita-se que a reatividade cruzada de hospedeiro seja responsável pelo desaparecimento mais rápido de bis-Fab PEG- 2C4Y!!º/D1-5Y11ºº 20K.

Os dados numéricos são apresentados na Tabela 5 abaixo que ilustra adicionalmente a meia vida relativamente curta do bis-Fab PEG- 2C4Y!*/D1- 5Y110 20K nesse experimento.

TABELA 5. PARÂMETROS FARMACOCINÉTICOS. a a a o [56 Te Te Te se ss * ponto de tempo de 2 horas foi excluído da análise de dados.

HL-Lambda z refere-se à meia vida associada à fase de eliminação, CLovs refere-se ao desaparecimento observado, AUCint.ous refere-se à área observada sob a curva de tempo-concentração de soro extrapolada para o infinito.

Examinaram-se, posteriormente, os efeitos do bis-Fab PEG- 2C4Y!10C/D1-5Y11%º 20K em comparação aos anticorpos-pais 2C4 e D1-5 em um modelo de xenoenxerto de Calu3 em camundongos beges SCID.

Injetou-se 5 milhões de células Calu3 /camundongo seguido por injeções diárias de bis- Fab PEG- 2C4Y!!ºº/D1-5Y1ºº 20K (50 mg/kg), 2C4 (25 mg/kg), ou D1-5 (25 mg/kg). Os volumes de tumor foram medidos periodicamente (pontos de tempo indicados na Figura 12) durante o curso do experimento.

Os resultados mostrados na Figura 12 indicam que o bis-Fab PEG- 2C4Y!1º/pD1-5Y11% 20K foi eficaz na redução do crescimento de tumores nessa concentração, similar à efetividade observada com cada anticorpo-pai. Realizou-se, então, um estudo expandido para avaliar os efeitos de bis-Fab PEG- 2C4Y!1ºC/D1-5Y!1% 20K no crescimento de célula de tumor no modelo de camundongo de xenoenxerto de Calu3 descrito acima e em comparação aos anticorpos-pais, 2C4 (pertuzumabe) e D1-5. Em primeiro lugar, analisou-se o período de tempo no qual os tumores progrediam, definido como o tempo no qual os tumores dobraram de tamanho (2xVo) ou o tempo de sobrevivência se não houver progressão de volume de tumor.

Para executar esses experimentos, 5 milhões de células Calu3 (suspensas em HBSS) foram inoculadas subcutaneamente em camundongos beges SCID (camundongos obtidos junto à Charles River Labs, instalação de San Diego). Os anticorpos-pais, 2C4 e D1-5 foram dosados a 25 mg/kg (a concentração de material foi 5 mg/ml), IP, uma vez por semana por quatro semanas. O bis-Fab PEG- 2C4Y"1º/D1-5Y11ºº 20K foi dosado a 50 mg/kg (a concentração de material foi 7,5 mg/ml), IP uma vez por dia por 28 dias. Em todos os casos, a primeira dose foi uma dose de carga de 2X (isto é, 2C4 e D1- 5 50 mg/kg [a concentração de material foi 10 mg/ml] e 100 mg/kg bis-Fab PEG- 2C4Y!1º/D1-5Y11ºº 20K [concentração de material foi 7,5 mg/ml]).

A análise de Kaplan-Meier é mostrada na Figura 13A e uma análise unidirecional é mostrada na Figura 13B. Em segundo lugar, analisou-se o período de tempo necessário para que os tumores progredissem, definido como o tempo no qual os tumores alcançaram um volume de 1.500 mm? ou o tempo de sobrevivência se não houver progressão de volume de tumor. À —análisede Kaplan-Meier é mostrada na Figura 14A e uma análise unidirecional é mostrada na Figura 14B. Os resultados desses estudos indicam que bis-Fab PEG- 2C4Y!1ºC/pD1-5Y11º 20K foi eficaz na inibição de crescimento de célula de tumor na dose de tratamento, abordando a eficácia de cada um dos anticorpos-

pais. Consequentemente, o formato de anticorpo biespecífico aqui descrito é uma plataforma útil para o desenvolvimento de moléculas terapêuticas.

Discussão Her2 está envolvido no desenvolvimento normal e crescimento celular em tecidos de coração, mama e neurais, e está associado ao desenvolvimento de outros sistemas de órgãos. Falls, D. L. et al., Exp Cell Res 284(1):14 a 30 (2003); Casalini, P., et al., J Cell Physiol 200(3):343 a 50 (2004); Negro, A,, et al., Recent Prog Horm Res 59:1 a 12 (2004); Britsch, S. Adv Anat Embryol Cell Biol 190:1 a 65 (2007). Mais notável é o envolvimento de sobre- expressão de Her2 na proliferação de célula de câncer de mama e o uso de sobre-expressão de Her2 como um marcador de diagnóstico para identificar pacientes com câncer de mama que se beneficiarão de HerceptinO (trastuzumabe). Lee, K. F., et al., Nature 378(6.555):394 a 8 (1995); Erickson, S. L., et al, Development 124(24):4.999 a 5.011 (1997); Britsch, S., et al, Genes Dev 12(12):1.825 a 36 (1998); Morris, J. K., et al., Neuron 23(2): 273 a 83 (1999); Woldeyesus, M. T., et al., Genes Dev 13(19):2.538 a 48 (1999); Lin, W,, et al., Proc Natl Acad Sci USA 97(3):1.299 a 304 (2000); Park, S. K., et al. J Cell Biol 154(6):1.245 a 58 (2001); Leu, M., et al., Development 130(11):2.291 a 301 (2003); Brufsky, A. Am J Clin Oncol. 11 de agosto de 2009 (EPub PMID: 19675448). HerceptinO (trastuzumabe) é um anticorpo monocional que se liga ao quarto domínio da porção extracelular do receptor próxima à região de transmembrana (Cho, H. S., et al., Nature 421(6.924):756 a 60 [2003]). Her2 é um de uma família de quatro receptores que contribuem para o crescimento celular e desenvolvimento e também é direcionado para terapia contra doenças (Casalinii/ P., et al, J Cell Physiol 200(3):343 a 50 [2004]). O esforço coordenado de mais de um receptor é, com frequência, responsável pelo acionamento do crescimento de célula de tumor (Yarden, Y. et al., Nat Rev Mol Cell Biol 2(2):127 a 37 (2001); Lee-Hoeflich, S. T., et al., Cancer Res 68(14):

878 a 87 [2008]). Nesse aspecto, a neutralização da atividade de mais de um receptor pode ser desejável a fim de fornecer uma terapia particularmente eficaz para determinados cânceres. Uma abordagem para construir e projetar tais moléculas é usar tecnologias de anticorpo biespecífico, através das quais uma única molécula de anticorpo possui duas únicas atividades monoclonais (Drakeman, D. L., et al., Expert Opin Investig Drugs 6(9):1.169 a 78 (1997); Kontermann, R. E. Acta Pharmacol Sin 26(1):1 a 9 (2005); Chames, P. et al., Curr Opin Drug Discov Devel 12(2):276 a 83 [2009]). Desenvolveu-se a tecnologia bis-Fab descrita no presente documento pelo menos em parte como um meio para varrer para tais moléculas e para pesquisar para aquelas que poderiam fornecer eficácia aumentada sobre um simples anticorpo ou uma combinação de anticorpo. Demonstrou-se aqui que o processo de síntese de bis-Fab é um método sólido e simples para gerar moléculas biespecíficas. Em geral, determinou-se que moléculas de bis-Fab possuíam as atividades bioquímicas combinadas de ambos os anticorpos-pais. Observou-se uma leve queda na afinidade de superfície de célula com alguns some bis-Fabs provavelmente devido à estrutura monovalente das moléculas. Isso pode ser compensado, no entanto, de diversas formas. Por exemplo, bis-Fabs que direcionam dois receptores na superfície de uma célula podem ser sintetizados, dois domínios no mesmo receptor podem ser direcionados, ou a afinidade de Fab monovalente pode ser aumentada. A síntese de um conjunto de bis-Fabs que direcionam Her2 e EGFR com o uso de uma abordagem de matriz descrita aqui rendeu moléculas altamente puras em quantidade suficiente para vários ensaios.

Com o uso de bis-Fabs em ensaios baseados em célula, foram observadas algumas atividades únicas. Por exemplo, o bis-Fab 1191 mostrou inibição potente de proliferação celular com uma curva de inibição escarpada de maneira não característica (Figura 2C). Um aspecto interessante dessa molécula é que a mesma se liga a dois domínios diferentes de Her2 simultaneamente. O braço 2C4 do bis-Fab direciona o domínio Il do ECDe o braço Herc do bis-Fab direciona o domínio IV (Franklin, M. C., et al., Cancer Cell 5(4):317 a 28 (2004); Schmitz, K. R., et al., Exp Cell Res 315(4):659 a 70 —[2009]) A curva aparece cooperativa e pode sugerir um mecanismo de ação que é único em relação a uma molécula que se liga a dois domínios no mesmo alvo. Tal molécula pode oferecer vantagens na eficácia sobre um simples anticorpo ou uma combinação dos dois anticorpos monoclonais individuais em certos ambientes terapêuticos.

Outra revelação mais impactante, no entanto, foi com tio-Fabs de trastuzumabe que foram ligados entre si a fim de formar o bis-Fab 1188. Nesse caso, o bis-Fab é estruturalmente similar a um simples anticorpo-pai exceto que carece da porção Fc.e os Fabs estão ligados de maneira covalente a um sítio que difere da ligação de dissulfeto de dobradiça nativa. O bis-Fab 1188, Here LC! .Herc LC, mostrou um aumento inesperado na proliferação celular, atuando como um agonista ao invés de um potente antagonista (Figura 2F). Isso foi surpreendente porque não apenas foi a atividade oposta àquela de seu anticorpo-pai estruturalmente similar, mas também devido ao fato de que a proliferação celular em células BT474 que sobre-expressam Her2 não depende deliganteeé considerada como estimulada de forma máxima no estado basal. Além disso, um bis-Fab diferente que liga dois Fabs 2C4 junto teve atividade similar a seu anticorpo-pai (Figura 2E). Sem ater-se à teoria, é provável que o mecanismo de ação diferente dos Fabs derivou de diferentes anticorpos responsáveis pelos diferentes resultados observados com os bis-Fabs.

Enquanto 2C4 se liga ao domínio || e inibe a dimerização de Her2 com ele próprio e outros membros da família Her, trastuzumabe parece influenciar formação de complexo de forma diferente já que o domínio IV não é um domínio de dimerização. O epítopo de trastuzumabe está muito próximo à região de transmembrana, um local no qual o anticorpo poderia ter um impacto significativo da orientação das regiões de transmembrana que efetuam a orientação de dois domínios de quinase (Cho, H. S., et al, Nature 421(6.924):756 a 60 [2003]). Interações alostéricas ou outras interações diretas como sítio ativo de quinase poderiam ser influenciadas pela ligação de um anticorpo ou bis-Fab às das moléculas de receptor em estreita proximidade (Bocharov, E. V., et al., J Biol Chem 283(11):6.950 a 6 (2008); Schmitz, K. R., et al., Exp Cell Res 315(4):659 a 70 [2009]). Já que o bis-Fab 1188 é um análogo estrutural de HerceptinO (trastizumabe), investigou-se que a mudança dos sítios de fixação de ligação ainda alteraria a função dessas moléculas. Também se investigou os efeitos de tio-Fabs preparados de diferentes fontes. Mostrou-se que foi possível obter resultados satisfatórios com o uso da região de dobradiça de anticorpo nativo após digestão por pepsina. Isso permite que um indivíduo use qualquer fonte de anticorpo como um ponto de partida para a construção de um bis-Fab sem ter que produzir uma forma mutante (de cis modificada) da molécula. Certamente, devido ao ponto de fixação de tio estar limitado à região de dobradiça, apenas certos variantes estruturais podem ser produzidos. Também se mostrou que resultados satisfatórios poderiam ser obtidos com o uso de tio- —Fabs derivados de tio-Mabs preparados por digestão proteolítica com lisina-C. Além disso, os tio-Fabs recombinantes foram construídos, expressos em E. coli, purificados, e usados com sucesso para criar bis-Fabs que também produziriam resultados satisfatórios. Dessa forma, todos esses métodos fornecem oportunidades gerais para nova síntese e revelação de bis-Fab.

A investigação da presente invenção nas várias ligações de bis- Fabs Herc levou à identificação de um espectro completo de atividades que se situaram na faixa de potentes agonistas, antagonistas, e moléculas que mostraram pouco efeito no crescimento celular. Deste modo, será possível identificar moléculas que possuem atividades diferentes dos anticorpos-pais. Anteriormente, as mudanças na região de dobradiça de anticorpos mostraram ter impacto na função de anticorpo (Dillon) T. M., et al., J Biol Chem 283(23):16.206 a 15 [2008]). Não é sempre possível identificar anticorpos que possuem a atividade desejada, ou de ativação ou inibitória, ou identificar anticorpos com níveis variados de atividade. Deste modo, os variantes de ligação de bis-Fab oferecem uma abordagem para modificar adicionalmente a atividade desejada. Além disso, estudos anteriores com anticorpos anti-CD20 mostraram que mudanças sutis na forma em que o anticorpo interage com o epítopo podem influenciar a função (Ernst, J. A. et al, Biochemistry 44(46):15.150 a 8 [2005]). Um típico programa de modificação de anticorpo pode assim ser estendido para incluir associação covalente de Fabs a fim de ajudar na construção de moléculas candidatas terapêuticas eficazes mais potentes.

Investigaram-se = também certas propriedades físicas e bioquímicas de agonistas de bis-Fab 1325 e 1188 em comparação a um antagonista bis-Fab potente, 1329, e Herceptin& (trastuzumabe). Não foram encontradas diferenças no número de sítios de ligação de receptor na superfície de células BT474 entre os agonistas e antagonistas. Além disso, não houve diferença na afinidade das moléculas para a superfície celular conforme determinado por análise de Scatchard. A kD foi de cerca de 3 nM para ambos os tipos de moléculas. Também foram avaliados o peso molecular, a retenção por filtração de gel e o raio termodinâmico de cada uma das moléculas, mas, novamente, não foram observadas nenhuma diferença sólida nessas — propriedades físicas. Houve uma pequena tendência na direção das moléculas agonistas que têm um raio hidrodinâmico maior pela análise de SEC-MALS; no entanto, as diferenças observadas se situavam dentro da margem de erro. Uma diferença analítica maior na estrutura foi observada em SDS-PAGE onde essas moléculas, que idênticas em peso molecular, mostraram maiores diferenças de migração no gel. As condições de desnaturação de SDS-PAGE não estava relacionadas à análise de estado de solução do presente documento. Por exemplo, as diferenças observadas no gel não revelaram um padrão associado à atividade devido ao fato de que o agonista mais potente, 1325, migrou entre os extremos e similar a um antagonista potente, 1324. Uma diferença principal nessas moléculas é a orientação das regiões Fy uma em relação a outra. Isso poderia explicar as diferentes atividades entre as moléculas. A presente análise não revelou um padrão de estrutura-função preditivo, mas uma investigação de estrutura-função detalhada pode permitir o projeto de uma abordagem de modelagem em 3D para compreensão das relações de atividade. Neste momento, os variantes funcionais de qualquer anticorpo ou combinação de anticorpo podem ser prontamente identificados com o uso de abordagem empírica com base no processo de matriz sintética descrito no presente documento e os ensaios de atividade funcional disponíveis para o(s) anticorpo(s) de interesse.

Com o uso do agonista mais potente derivado da matriz de combinação de trastuzumabe e tio-Fab, 1325, investigou-se a trajetória de sinalização envolvida na propagação do sinal de proliferação celular. Para testar a trajetória de sinalização, virou-se para a análise bem caracterizada da atividade de trastuzumabe que foi recentemente relatada. No presente documento, mostrou-se que trastuzumabe inibe a interação de Her2 e Her3 em células que sobre-expressam Her2 (Junttila, T. T., et al., Cancer Cell 15(5):429 a 40 [2009]). Esses dois receptores estão em um complexo que recruta e ativa —PISK no estado basal. A ativação dessa quinase resulta na fosforilação e ativação da AKT de quinase de sinalização chave. No exame descrito acima, AKT foi fosforilada em um nível muito superior em células que foram tratadas com o agonista bis-Fab 1325. Isso é algo esperado e consistente com as trajetórias de sinalização de proliferação celular conhecidas para Her2. O que foi diferente e inesperado foi que o nível de fosforilação de Her3 não mudou com a adição de agonista. De fato, deu a impressão de que houve uma leve diminuição no nível de fosfo-tirosina em Her3 ao longo do curso de tempo de duas horas. Isso sugere que o agonista pode estar contornando a interação Her2/Her3 a fim de estimular a atividade de AKT. Isso poderia ser realizado através da alteração do estado de fosforilação de Her2 diretamente. Provou-se o estado de fosforilação de Her2 por análise de espectrometria de massa ao observar fosfo-peptídeos individuais no domínio intracelular de receptor (ICD).

Em primeiro lugar, identificou-se diversos peptídeos que foram fosforilados no estado basal em células BT474. Então, observou-se o percentual de fosforilação de Her2 em resposta ao tratamento com trastuzumabe ou agonista

1325. Observou-se que, no total, diversos desses sítios de fosforilação mudaram em resposta ao agonista, mas não em resposta a trastuzumabe.

Parece que o agonista ativa adicionalmente o receptor, mas que essa ativação não resulta em fosforilação aumentada de Her3. Isso indica que um complexo de ativação levemente diferente pode estar propagando o sinal e sugere que o bis-Fab 1325 pode ser útil para ativar Her2 mesmo na ausência de Her3 ou um ligante.

Deste modo, investigou-se as possíveis áreas terapêuticas onde a ativação de Her2 pode ser útil. Uma associação entre Herceptin& (trastuzumabe) e a saúde de um tecido cardíaco foi documentada. Chien, K. R. N Engl J Med 354(8):789 a 90 (2006); Perik, P. J., et al., Eur J Heart Fail 9(2):173 a 7 (2007); Suter, T. M., et al., J Clin Oncol 25(25):3.859 a 65 (2007). Durante a terapia com Herceptin& (trastuzumabe), pode ocorrer toxidade cardíaca. Na presença de cetros fármacos quimioterápicos, por exemplo, antraciclinas, a ocorrência de cardiotoxicidade durante o tratamento com HerceptinO (trastuzumabe) mostrou-se significativamente elevada (Morris, P. G,, et al, Breast Cancer Res Treat DOI

10.1007/s10549-008-0172-5 (2008); Popat, S., et al., Nat Clin Pract Oncol 5(6):324 a 35 [2008]). Antraciclina sozinha é bem conhecida por ocasionar cardiotoxicidade resultando em cardiomiopatia e falha congestiva do coração (Annals of Internal Medicine 125(1):47 a 58 [1996]). O dano associado à antraciclina e Herceptin& (trastuzumabe) combinados pode ser devido à interrupção da função normal de Her2 no processo de repara o natural de tecido do coração danificado. Deste modo, argumentou-se que, devido aos efeitos observados às vezes em tecido cardíaco em pacientes tratados com HerceptinO (trastuzumabe) e devido à atividade de Her2 estar provavelmente associada ao crescimento de célula de coração (Freedman, N. J., et al., J Am Coll Cardiol 48(7):1.448 a 50 [2006]), é possível que um agonista de Her2 beneficiaria pacientes com doença cardíaca. Recentemente, foi mostrado definitivamente que, ao contrário do dogma anterior, os miócitos cardíacos continuam a se proliferar durante o curso da vida adulta (Bergmann, O., R. et al., Science 324(5.923):98 a 102 (2009); Bersell, K., S., et al., Cell 138(2):257 a 70 (2009); Doggen, K,, et al., J Mol Cell Cardiol 46(1):33 a 8 [2009]). Consequentemente, sugeriu-se que as moléculas de bis-Fab de agonista derivado de trastuzumabe, como bis-Fab 1325, podem ativar Her2 em cardiomiócitos de adulto em crescimento fornecendo assim uma direção terapêutica possível para tratamento de certos tipos de doenças do coração. Inúmeros outros tipos de células, tecidos e processos celulares também são dependentes da ativação de Her2 e de outros membros da família HER. Esses receptores são ativados pela família neuregulina de ligantes para a qual muitas funções de sinalização importantes vêm sido observadas. Esses tipos de células, tecidos e processos incluem células musculares, miócitos cardíacos, células de

Schwann, oligodendrícitos, sinapse neuromuscular, neurônios sensoriais cranianos, neurônios sensoriais e motores, nervos periféricos e cranianos, neurônios simpáticos, precursores de neurônio cortical, células granulares do cerebelo, hipotálamo, tecido parassimpático, hipocampo, tecido do coração, desenvolvimento de válvulas cardíacas, septo AV, crescimento, repara o e sobrevivência de cardiomiócitos, angiogênese, desenvolvimento de epitélio pulmonar, miogênese, gonadogênese e proliferação de epitélio gástrico. Falls, D. L. Exp Cell Res 284(1):14 a 30 (2003); Falls, DL. Ju. Neurocytol. 32(5-8):6819 a 647 (2003); Britsch, S. Adv Anat Embryol Cell Biol 190:1-65 (2007). Em conformidade, esses tipos de células são alvos potenciais adicionais para agonistas de Her2. Adicionalmente, a manutenção e diferenciação de células tronco embrionárias humanas (hECS) são dependentes da atividade de Her2 e poderiam fornecer outra aplicação importante de uma molécula agonista de Her2 (Jones, F. E., et al, Oncogene 18(23):3481 a 3490 (1999); Leone, F., E., et al., J Leukoc Biol 74(4):593 a 601 (2003).

Também foi investigado se essa tecnologia é geralmente aplicável através do desenvolvimento de bis-Fabs em alvos moleculares adicionais. Foram sintetizados os bis-Fabs que direcionam FcyRllb e FceRla e os efeitos decada um na liberação de histamina a partir de células RBL que expressam FceRla e FeyRlilb. Os resultados mostraram que os bis-Fabs diferentes exibiram uma faixa de atividades.

Além disso, foi descrito um método ara produzir reticuladores modificados para o uso na síntese de bis-Fabs. Foi mostrado que tais —reticuladores modificados foram úteis para a adição de reagentes úteis para a modificação de meia vida in vivo, como PEG. Também foi mostrado que os bis- Fabs contendo PEG tiveram uma meia vida de soro in vivo aprimorada comparados aos bis-Fabs ausentes de PEG. Finalmente, com o uso de modelos de enxerto de camundongo in vivo, foi mostrado que os bis-Fabs contendo PEG foram eficazes na inibição do crescimento celular tumoral, validando seu potencial como candidatos terapêuticos que têm como alvo tumores sólidos.

Essa nova abordagem aqui descrita para a síntese de moléculas similares a anticorpo, denominadas bis-Fabs, pode ser uma nova ferramenta útil no planejamento de terapias moleculares e no auxílio em pesquisas básicas. Como um método de triagem, essa tecnologia pode ser aplicada, por exemplo, na identificação da combinação de anticorpo específico mais útil para uma dada aplicação ou como uma ferramenta para testar trajetórias de sinalização de receptor. Esse também é útil para produzir de maneira rápida e robusta moléculas para revelação e fornece novas oportunidades para gerar uma ampla faixa de atividades que poderiam, de outra forma, não serem possíveis com estruturas de imunoglobulina nativas.

A presente invenção não deve ser limitada no escopo pelas reivindicações específicas reveladas nos exemplos que são destinados às ilustrações de poucos aspectos da invenção, e quaisquer realizações que sejam funcionalmente equivalentes estão incluídas no âmbito dessa invenção.

De fato, várias modificações da invenção em adição àquelas mostradas e descritas no presente documento se tornarão aparentes àqueles elementos versados na técnica e são destinadas a estarem dentro do âmbito das realizações anexas.

Claims

REIVINDICAÇÕES 1 MÉTODO PARA SINTETIZAR UM ANTICORPO MULTIESPECÍFICO, caracterizado pelo fato de que um primeiro fragmento de anticorpo obtido a partir de um primeiro anticorpo-pai tendo uma primeira —monoespecificidade e um grupo sulfidrila livre é reagido com um reticulador tio- reativo para produzir uma porção fragmento de anticorpo-reticulador, e em que a porção fragmento de anticorpo-reticulador é reagida com um segundo fragmento de anticorpo obtido a partir de um segundo anticorpo-pai tendo uma segunda monoespecificidade e um grupo sulfidrila livre para produzir o anticorpo multiespecífico, e em que a primeira monoespecificidade é diferente da segunda monoespecificidade.

2. MÉTODO PARA SINTETIZAR UM PAINEL DE ANTICORPOS MULTIESPECÍFICOS, caracterizado pelo fato de que um primeiro fragmento de anticorpo obtido a partir de um primeiro anticorpo-pai tendo uma primeira monoespecificidade e um grupo sulfidrila livre é reagido com um reticulador tio-reativo para produzir uma porção fragmento de anticorpo-reticulador, e em que a porção fragmento de anticorpo-reticulador é reagida em pares com cada um dos dois ou mais fragmentos de anticorpo adicionais obtidos a partir de um ou mais anticorpos-pai com —monoespecificidade diferente do primeiro fragmento de anticorpo, cada um tendo um grupo sulfidrila livre, para produzir o painel de anticorpos multiespecíficos.

3. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o primeiro anticorpo-pai é selecionado a partir de anti-Her1l, anti-Her2, anti-FoyRilb e anti-FceRla.

4. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1 ou 3, caracterizado pelo fato de que o primeiro anticorpo-pai é anti-Her2 e o segundo anticorpo-pai é anti-Her1, ou o primeiro anticorpo-pai é anti-Her1 e o segundo anticorpo-pai é anti-Her2, ou o primeiro anticorpo-pai é anti-FeyRllb e o segundo anticorpo-pai é anti-FceRla, ou o primeiro anticorpo-pai é anti-FceRla e o segundo anticorpo-pai é anti-FcyRllb.

5. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 2 ou 3, caracterizado pelo fato de que o primeiro fragmento de anticorpo é obtido a partir de anti-Her2 e cada um dos dois ou mais fragmentos de anticorpo adicionais é obtido a partir de anti-Her1, ou o primeiro fragmento de anticorpo é obtido a partir de anti-Herl e cada um dos dois ou mais fragmentos de anticorpo adicionais é obtido a partir de anti-Her2, ou o primeiro fragmento de anticorpo é obtido a partir de anti-FeeRla e cada um dos dois ou mais fragmentos de anticorpo adicionais é obtido a partir de anti-FeyRilb, ou o primeiro fragmento de anticorpo é obtido a partir de anti-FcyRIlb e cada um dos dois ou mais fragmentos de anticorpo adicionais é obtido a partir de anti- FceRla.

6. “MÉTODO PARA SINTETIZAR UM ANÁLOGO DE ANTICORPO, caracterizado pelo fato de que um primeiro fragmento de anticorpo tendo um grupo sulfidrila livre é reagido com um reticulador tio-reativo para produzir uma porção fragmento de anticorpo-reticulador, e em que a porção fragmento de anticorpo-reticulador é reagida com um segundo fragmento de anticorpo tendo um grupo sulfidrila livre para produzir o análogo de anticorpo, e em que o primeiro fragmento de anticorpo e o segundo fragmento de anticorpo são obtidos a partir de um único anticorpo-pai.

7. MÉTODO PARA SINTETIZAR UM PAINEL DE ANÁLOGOS DE ANTICORPO, caracterizado pelo fato de que um primeiro fragmento de anticorpo tendo um grupo sulfidrila livre é reagido com um reticulador tio-reativo para produzir uma porção fragmento de anticorpo- reticulador, e em que a porção fragmento de anticorpo-reticulador é reagida em pares com cada um dos dois ou mais fragmentos de anticorpo adicionais, cada um tendo um grupo sulfidrila livre, para produzir o painel de análogos de anticorpo, em que cada um dos fragmentos de anticorpo é obtido a partir de um único anticorpo-pal.

8. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 6 ou 7, caracterizado pelo fato de que o anticorpo-pai é selecionado a partir de anti- Her1, anti-Her2, anti-FceRla e anti-FeyRllb.

9. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 3 a 5 e 8, caracterizado pelo fato de que o anti-Her2 é selecionado a partir de trastuzumabe e pertuzumabe.

10. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o primeiro anticorpo-pai é anti-Her2 e em que o primeiro fragmento de anticorpo compreende uma sequência de cadeia leve selecionada a partir das SEQ ID NOs: 1, 2, 3,6 e 7 e uma sequência de cadeia pesada selecionada a partir das SEQ ID NOs: 4, 5 e 8.

11. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 6 ou 8, caracterizado pelo fato de que o anticorpo-pai é anti-Her2 e em que o primeiro fragmento de anticorpo e o segundo fragmento de anticorpo compreendem a mesma sequência de cadeia leve e a mesma sequência de cadeia pesada, em que a sequência de cadeia leve é selecionada a partir das SEQ ID NOs: 1,2,3, 6e7easequência de cadeia pesada é selecionada a partir das SEQ ID NOs: 4,5€8.

12. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 3 a 5 e 8, caracterizado pelo fato de que o anti-Her1 é selecionado a partir de D1-5 e C3-101.

13. — MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o primeiro anticorpo-pai é anti-Her1 e em que o primeiro fragmento de anticorpo compreende uma sequência de cadeia leve selecionada a partir das SEQ ID NOs: 18, 19, 21 e 22 e uma sequência de cadeia pesada selecionada a partir das SEQ ID NOs: 17 e 20.

14. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 6 ou 8, caracterizado pelo fato de que o anticorpo-pai é anti-Her1 e em que o primeiro fragmento de anticorpo e o segundo fragmento de anticorpo compreendem a mesma sequência de cadeia leve e a mesma sequência de cadeia pesada, em que a sequência de cadeia leve é selecionada a partir das SEQ ID NOs: 18, 19, 21, 6 22 e a sequência de cadeia pesada é selecionada a partir das SEQ ID NOs: 17 e 20.

15. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 3 a 5 e 8, caracterizado pelo fato de que o anti-FcyRllb é 5A6.

16. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o primeiro anticorpo-pai é anti-FcyRlIlb e em que o primeiro fragmento de anticorpo compreende uma sequência de cadeia leve selecionada a partir das SEQ ID NOs: 11 e 12 e uma sequência de cadeia pesada selecionada a partir das SEQ ID NOs: 9 e 10.

17. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 6 ou 8, caracterizado pelo fato de que o anticorpo-pai é anti-FeyRIlb e em que o primeiro fragmento de anticorpo e o segundo fragmento de anticorpo compreendem a mesma sequência de cadeia leve e a mesma sequência de cadeia pesada, em que a sequência de cadeia leve é selecionada a partir das SEQ ID NOs: 11 e 12 e a sequência de cadeia pesada é selecionada a partir das SEQ ID NOs: 9 e 10.

18. — MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 3 a 5 e 8, caracterizado pelo fato de que o anti-FceRla é 22E7.

19. . MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o primeiro anticorpo-pai é anti-FceRla e em que o primeiro fragmento de anticorpo compreende uma sequência de cadeia leve selecionada a partir das SEQ ID NOs: 15 e 16 e uma sequência de cadeia pesada selecionada a partir das SEQ ID NOs: 13 e 14.

20. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 6 ou 8, caracterizado pelo fato de que o anticorpo-pai é anti-FceRla e em que o primeiro fragmento de anticorpo e o segundo fragmento de anticorpo 5 compreendem a mesma sequência de cadeia leve e a mesma sequência de cadeia pesada, em que a sequência de cadeia leve é selecionada a partir das SEQ ID NOs: 15 e 16 e a sequência de cadeia pesada é selecionada a partir das SEQ ID NOs: 13 e 14.

21. “MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 20, caracterizado pelo fato de que o reticulador tio-reativo é selecionado a partir de haletos de bis-maleimido, haletos de bis-alquila, dissulfetos de piridila, sais de bis-mercurial, reticulação mediada por ácido 5-tio-2-nitrobenzoico, e bis- tiossulfonatos.

22. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 21, — caracterizado pelo fato de que o reticulador tio-reativo é bis-maleimida.

23. — MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 22, caracterizado pelo fato de que o primeiro fragmento de anticorpo, o segundo fragmento de anticorpo e/ou cada um dos dois ou mais fragmentos de anticorpo adicionais são obtidos a partir de um anticorpo modificado por cisteina.

24. “MÉTODO, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o anticorpo modificado por cisteína compreende uma substituição na posição 110 ou na posição 205 da cadeia leve, em que a numeração dos resíduos está de acordo com o sistema de numeração EU, e emquea substituição é cisteina.

25. “MÉTODO, de acordo com a reivindicação 23 ou 24, caracterizado pelo fato de que o anticorpo modificado por cisteína compreende uma substituição na posição 118 ou na posição 121 da cadeia pesada, em que a numeração dos resíduos está de acordo com o sistema de numeração EU, e em que a substituição é cisteína.

26. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 25, caracterizado pelo fato de que o primeiro fragmento de anticorpo, o segundo fragmento de anticorpo e/ou cada um dos dois ou mais fragmentos de anticorpo adicionais são obtidos a partir de um anticorpo nativo, em que o anticorpo nativo é digerido com pepsina para produzir um fragmento F(ab'),, em que o fragmento F(ab'), é purificado e tratado com um agente de redução seguido por um agente oxidante sob condições em que o dissulfeto entre a cadeia pesada e a cadeia leve de Fab é reformado e resíduos de cisteíina na região de dobradiça permanecem inoxidados.

27. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 26, caracterizado pelo fato de que o reticulador é um reticulador modificado que compreende um grupo SH protegido.

28. — MÉTODO, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que o reticulador modificado é bis-maleimido-acetilacetato (BMata).

29. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 27 ou 28, caracterizado pelo fato de que o anticorpo que compreende o reticulador modificado é reagido ainda com um agente que compreende um grupo funcional.

30. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que o agente é selecionado a partir de polietileno glicol (PEG), peptídeo de ligação de albumina (ABP), um marcador fluorescente, um agente de radioimagem, um agente citotóxico e siRNA.

31. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 29 ou 30, caracterizado pelo fato de que o agente é PEG e o PEG é selecionado a partir de PEG 2.000 mw (2K), PEG 12.000 mw (12K) e PEG 20.000 mw (20K).

32. COMPOSIÇÃO, caracterizada pelo fato de que compreende um ou mais anticorpos multiespecíficos selecionados a partir de bis-Fab 1187, bis-Fab 1189, bis-Fab 1190, bis-Fab 1191, bis-Fab 1192, bis-Fab 1193, bis-Fab 1299, bis-Fab 1300, bis-Fab 1301, bis-Fab 1302, bis-Fab1303, bis-Fab 1304, bis-Fab 1305, bis-Fab 1306 e bis-Fab 1307.

33. COMPOSIÇÃO, caracterizada pelo fato de que compreende um ou mais análogos de anticorpo selecionados a partir de bis- Fab 1188, bis-Fab 1204, bis-Fab 1321, bis-Fab 1322, bis-Fab 1323, bis-Fab 1324, bis-Fab 1325, bis-Fab 1326, bis-Fab 1327, bis-Fab 1328, bis-Fab 1329, bis-Fab 1400 e bis-Fab 1401.

Reduzir e Oxidar Aduto S Reduzir com TCEP por 2 horas Painel 1 pH 5.8 MES, 300 mM NaCl, 5 mM EDTA Remover Oxidar por adição de 5 mM de Aduto ácido dehidroascórbico Reagir com Reticulador o Q sH CG H H a N N Nº inet2 MN AX PY y paine Reticulador oa Não O r bis-maleimido !

HAN XY Isolado através de SEC ? R MAU poente fio nómeros. Painel 3 id ua CENA, ao” Anotada: | 200 4 O NH O 9 00 10.0 20.0 30,0 40.06 80.0 Min Reagir com o segundo tio-Fab Monitorar reação por o espectrometria de massa E [50504 sol g + 2 Bis-Fab, 96308 o tao non | 8 204 477497 “É + O Hs 3 6 SE i o NãO & Toso 67 10097 Painel 4 r 2 >» SArasta Da ' Tão Taco asia dO dimérico segunda filtração em gel “o So 10.0 20,0 30,0 406 50,0 Min Bis-Fab final ; 1) aVEGF/alier2 bis-Fab o o 2) aVEGF'aVEGF bis-Fab Ss 3 Dm er 12 12

FREE Painel 5 O NO mel — Cadeias 50KDI LO SS et Reticuladas ampl o | aneHsaeesaia akxD) o É avEGF pesada Fig. 1

2C4 ou D1-5 ou C3-101 aaa Herceptin (anti-EGFR) nãoredução (anti-Her2) TFSSSZIS

A MW TETTITO tio-Fab-1 a do o tniorabe A SN 1187 2C41LÇ110C0ys C3-101LÇ110Cys A o 1188 — HerclC!1COs — HerclCifoOs o 1189 — HercLC1100Ys — p1-5LÇ110OYs Po 11890 — HercLC119Os C3-101L.Ç110Cys Do 1191 — 2C4LC1100Ys Herct.C?190ys Po 1192 — 2C4LÇ1100s D1-5LÇ1100ys o 1198 — D1-5LÇV100ys C3-101LC110Cys O

A Fig. 2A x 2 50 nM bis-Fab &S 687 1189 1190 1192 TEGABAM + A+ A+ 2 A = d+ 2 + + + opte a-tubulina |. essas ISSA se ss.

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Ensaio de Crescimento de MDA-175 18000 16000: a 14000] — JEITIÉEIADÇS— É PETER con 12000 NR. “*. RU 15500 e” 1192 À SON 8000 | = 1204 À e x — O —2C4-Fab x o 6000 |--A - 1191 X O — 4 Herc-Fab X es 4000: h ES

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0.0 1 10 100 Fig. 2C [bis-Fab] nM Ensaio de Crescimento de NR6-EGFR 14000 a e e . fr Queres Bras rare or Bane 12000 Es Ss Sao . ETA go SNS

10000. Fi. 4 NAS de, A a RFU S-DISMmÃb SE Í “=S-DIS Mm à“. / N 9000] (gg 1103 e. À 1187 A e 6009) |- -& - C3101-Fab BA A e — 1192 s Xi ———— 1 190 a 4000: =

0.0 o1 1 10 100 Fig. 2D [bis-Fab] nM

Ensaio de Crescimento de MDA-175 18000 — Ss - Pertuzumabe 16000 s —f-— 204-2C4 (1204) 14000: " 12000-Ê& RFU És 10000: >. 8000 “e SS! e 6000 ". — .

4000. e. 2000 e PTIg 00 01 1 10 100 Fig. 2E [bis-Fab] nM Ensaio de Crescimento de BT474 o 18000: la o o N o

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0.0 o1 1 10 100 Fig. 2F [bis-Fab] nM cisto cs cisto cis"” sítio is — LC-110 LC-205 HC-118 HC-Hg Fonte — E, coli tio-mAb tio-mAb mAb ID. tio-Fab-1 tio-Fab-2 13821 HercLC110Cys HercL.C119ys 1322 — HercLC110OYs HercL C205Cys 1323 HercLC110Cys HercHC118Cys 1824 — HerclC20SCys Hercl.02056ys 1325 — HerclCi18Cys HercL C205Cys 13268 — HerclC118Oys HercHC1180s 1827 HercLC110Cys HercHCH9-Cys 1328 HercL.C205€ys HercHCH9-Cys 1337 — HercLC!18Os HercHCh9-Cys 1829 — HercLCHsCys HercHCHs-Cys 1188 Hercl.C110Cys Hercl.Ç119Cys 1338 — F(ab'j2 de Herceptin

DA Fig. 3A 3X = SDS-PAGE de não redução Q Pts att o t TD NO SOONcOMN OOo

TO NNS NONO QN OO op à COLOCO QDTSO O a Ne AN a De a A OA o Fig. 3B

Ensaio de Crescimento de BT474 1325 (HC118-LC205) 140 Ago Bona Rs Bon oco É 120 rr good as Fono cubos >” O - de ee ÇA o : 100) EX FS . Cerro É so a SRP x > 1321 a 1327 o? GO | -< O 1322 —ad— 1328 de nenem 1393. mm ue e 1337 Nro 491 1324 —Q— 1329 Rg) Al 1325 ss Qu 1188 "-0-- 1326 — 0 1338 | ml Trastuzumabe

0.0 0.01 01 1 10 Fig. 3C [bis-Fab] nM Contagem Celular

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4.0x108 2 ta de Bis-Fab À 7 & ES nenhum tratamento RS 8 & Ihum tratament 7 à Á q R a 3.0x106 Ad NS 3 AB SS ê 1 ,afR: Ô com (10 ASR

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E : O x % " 1 , º 7 '3/ponte t o Fig. 9A Tempo (Dias) n=3/ponto no tempo Rato pelado 1,000,000 EA nus 100,000-H 2K PEG = XI) - E 10000 VS. 20K PEG 2 x) NS O ABP e A. 8 1,000 ão DES 8 S dd E 8 Á— > So 100 = S . = 10 EFsi—> s Rã * S E. Nos 1 + º 7 n=5/grupo” Fig. 9B Tempo (Dias) voSetcr

2C4/D1-5 bis-Fab o + 20K PEG TP - Fig. 10A 15000 o 13000 o A o “ o õ 12000 NS Z es É 11000 n “e q “—a--E 10000 Oo — = 2C4/D1.5PEG —EÊ go003 |-m-D1.5 a - -8 - 204 8000 0 0.01 o1 1 10 100 . Proteína, nM Fig. 10B

10000 mesm DitioFab HER1/HER2 D1.5/2C4 com PEG 20 K 0,5 mg/kg me = = DitioFab HER1/HER2 D1.5/2C4 com PEG 20 K 5 mg/kg E, messes DitioFab HER1/HER2 D1.5/2C4 com PEG 20 K 50 mg/kg = oo BB. E Er. |) es, 23 10 , Br... Ss e O = x. ... o o hs "E. S v e: o 1 v Ss 3 o 01 cs o

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0.01 00 05 10 15 20 25 30 35 : Tempo (Dias Fig. 11A po (Dias) 100 m—— DitioFab HER1/HER2 D1.5/2C4 com PEG 20 K 0,5 mg/kg mm am DitioFab HER1/HER2 D1.5/2C4 com PEG 20 K 5 mg/kg o & im*ressso DitioFab HER1/HER2 D1.5/2C4 com PEG 20 K 50 mg/kg o "| fe) ve. o “. Bo DE Cs ss? Ns o O SS E, v= SN “e 2 NS "e. Ss " Es . Ss = T o E o e) o “as O "e

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Resumo “MÉTODO PARA SINTETIZAR UM ANTICORPO MULTIESPECÍFICO,

MÉTODO PARA SINTETIZAR UM PAINEL DE ANTICORPOS MULTIESPECÍFICOS, MÉTODO PARA SINTETIZAR UM ANÁLOGO DE —ANTICORPO, MÉTODO PARA SINTETIZAR UM PAINEL DE ANÁLOGOS DE ANTICORPO E COMPOSIÇÕES” Trata-se de anticorpos multiespecíficos que se ligam especificamente a pelo menos dois epítopos diferentes. As variantes estruturais de anticorpos nativos (análogos de anticorpo) também são fornecidas. Também são fornecidos anticorpos multiespecíficos e análogos de anticorpo que têm uma variação de atividades biológicas. Os anticorpos multiespecíficos agonistas e antagonistas e análogos de anticorpo agonistas e antagonistas são fornecidos. Os anticorpos multiespecíficos e análogos de anticorpo conjugados com agentes terapêuticos e/ou diagnósticos também são fornecidos, bem como anticorpos multiespecíficos e análogos de anticorpo conjugados com agentes para aumentar a meia vida in vivo comparados a anticorpos multiespecíficos e análogos de anticorpo ausentes de tais agentes. Em adição, são fornecidos os métodos de produzir anticorpos multiespecíficos e análogos de anticorpo e composições que compreendem anticorpos multiespecíficos e análogos de anticorpo. Também são fornecidos os usos terapêuticos, de pesquisa e diagnóstico de anticorpos multiespecíficos e análogos de anticorpo.