BR102017001563A2

BR102017001563A2 - RNA APTAMERS AND THEIR DIAGNOSTIC AND THERAPEUTIC APPLICATIONS IN PROSTATE CANCER

Info

Publication number: BR102017001563A2
Application number: BR102017001563-7A
Authority: BR
Inventors: Vivian Alonso Goulart; Luiz Ricardo Goulart Filho; Aline Gomes De Souza; Karina Marangoni
Original assignee: Universidade Federal de Uberlândia; Fundação De Amparo Á Pesquisa Do Estado De Minas Gerais-Fapemig; Universidade Estadual De Campinas - Unicamp; Cirino Alberto Goulart Eireli - Epp (Laboratório Biogenetics)
Priority date: 2017-01-24
Filing date: 2017-01-24
Publication date: 2020-02-18

Abstract

"aptâmeros de rna e suas aplicações diagnósticas e terapêuticas no câncer de próstata" a presente invenção refere-se à caracterização e utilização de aptâmeros de rna ligantes específicos à linhagem tumoral prostática pc-3 selecionadas por 30 cell-selex, e à apâmeros ligantes da molécula de rna longo não codificante, pca3. as sequências desses aptâmeros possuem tamanho variável de 20-50 nucleotídeos, com baixa energia livre, o que os tornam moléculas bastante estáveis. a seq. id nº 04 foi escolhida aleatoriamente para validação in vitro. avaliou-se in vitro a constante de dissociação (kd) e a associação dessa sequência às células alvo por ensaios de citometria de fluxo e por imunofluorescência. esses ensaios comprovaram a efetiva seletividade e especificidade do aptâmero à linhagem tumoral da próstata. esse aptâmero foi capaz de detectar células tumorais em biópsias tumorais e em sangue periférico de pacientes com câncer de próstata (cap) tanto por imunofluorescência em microscopia, por citometria de fluxo e em equipamento portátil de fluorescência. as moléculas selecionadas na presente invenção apresentam grande potencial de ligação e reconhecimento de células tumorais prostáticas e podem ser empregadas em diversas plataformas diagnósticas e terapêuticas."RNA Aptamers and Their Diagnostic and Therapeutic Applications in Prostate Cancer" The present invention relates to the characterization and use of RNA aptamers specific to the prostate tumor line pc-3 selected by 30 cell-selex, and to apamer ligands of long non-coding RNA molecule, pca3. the sequences of these aptamers have a variable size of 20-50 nucleotides, with low free energy, which makes them very stable molecules. seq. id # 04 was chosen at random for in vitro validation. the dissociation constant (kd) and the association of this sequence with the target cells were evaluated in vitro by flow cytometry and immunofluorescence assays. these tests proved the effective selectivity and specificity of the aptamer to the prostate tumor lineage. this aptamer was able to detect tumor cells in tumor biopsies and in peripheral blood of patients with prostate cancer (cap) both by immunofluorescence under microscopy, by flow cytometry and in portable fluorescence equipment. the molecules selected in the present invention have great potential for the attachment and recognition of prostate tumor cells and can be used in various diagnostic and therapeutic platforms.

Description

“APTÂMEROS DE RNA E SUAS APLICAÇÕES DIAGNOSTICAS E TERAPÊUTICAS NO CÂNCER DE PRÓSTATA” [001] Campo da Invenção [002] A presente invenção refere-se à caracterização e utilização de aptâmeros de RNA ligantes específicos à linhagem tumoral prostática PC-3 selecionadas por 3D Cell-SELEX, e à apâmeros ligantes da molécula de RNA longo não codificante, PCA3. As sequências desses aptâmeros possuem tamanho variável de 20-50 nucleotídeos, com baixa energia livre, o que os tornam moléculas bastante estáveis. A Seq. ID N^e 04 foi escolhida aleatoriamente para validação in vitro. Avaliou-se in vitro a constante de dissociação (Kd) e a associação dessa sequência às células alvo por ensaios de citometria de fluxo e por imunofluorescência. Esses ensaios comprovaram a efetiva seletividade e especificidade do aptâmero à linhagem tumoral da próstata. Esse aptâmero foi capaz de detectar células tumorais em biópsias tumorais e em sangue periférico de pacientes com câncer de próstata (CaP) tanto por imunofluorescência em microscopia, por citometria de fluxo e em equipamento portátil de fluorescência. As moléculas selecionadas na presente invenção apresentam grande potencial de ligação e reconhecimento de células tumorais prostáticas e podem ser empregadas em diversas plataformas diagnosticas e terapêuticas. Para testes diagnósticos, prognósticos e de monitoramento terapêutico, os aptâmeros poderão ser usados individualmente ou combinados à nanomateriais e a outras moléculas para a detecção por meio de tecnologias fotônicas, eletroquímicas e por imunensaios convencionais. Para o uso terapêutico ou vacinai, propõe-se o uso de aptâmeros como direcionadores de drogas ou ainda em imunoterapias, conjugados à fármacos, alcalóides, inibidores, toxinas, anticorpos monoclonais, peptídeos, ácidos nucleicos, proteínas, carboidratos e lipídeos, tanto em monoterapia quanto em terapias combinadas. A combinação dos aptâmeros com fármacos associados à liberação lipossomal também apresenta um grande potencial para o tratamento do câncer de próstata.“RNA APTAMERS AND ITS DIAGNOSTIC AND THERAPEUTIC APPLICATIONS IN PROSTATE CANCER” [001] Field of the Invention [002] The present invention relates to the characterization and use of 3D RNA aptamers specific to the PC-3 prostate tumor line selected by 3D Cell-SELEX, and to the binding ligands of the long non-coding RNA molecule, PCA3. The sequences of these aptamers have a variable size of 20-50 nucleotides, with low free energy, which makes them very stable molecules. Seq. ID N ^and 04 were chosen at random for in vitro validation. The dissociation constant (Kd) and the association of this sequence with the target cells were evaluated in vitro by flow cytometry assays and by immunofluorescence. These tests proved the effective selectivity and specificity of the aptamer to the prostate tumor lineage. This aptamer was able to detect tumor cells in tumor biopsies and in peripheral blood of patients with prostate cancer (CaP) both by immunofluorescence under microscopy, by flow cytometry and in portable fluorescence equipment. The molecules selected in the present invention have great potential for the attachment and recognition of prostate tumor cells and can be used in various diagnostic and therapeutic platforms. For diagnostic, prognostic and therapeutic monitoring tests, aptamers can be used individually or combined with nanomaterials and other molecules for detection using photonic, electrochemical and conventional immunoassays. For therapeutic or vaccine use, it is proposed to use aptamers as drug drivers or even in immunotherapies, conjugated to drugs, alkaloids, inhibitors, toxins, monoclonal antibodies, peptides, nucleic acids, proteins, carbohydrates and lipids, both in monotherapy as in combination therapies. The combination of aptamers with drugs associated with liposomal release also has great potential for the treatment of prostate cancer.

2/16 [003] Estado da Técnica [004] A próstata apresenta uma intensa heterogeneidade celular, além de ser um dos órgãos mais sujeitos a alterações durante o envelhecimento. Tais alterações podem provocar doenças como: prostatites, HPB e em casos mais graves o CaP. Prostatite é a patologia prostática mais comum em homens com menos de 50 anos e sua incidência chega a 12%. Sua gênese é pouco compreendida e multifatorial. As formas mais comuns são: prostatites bacterianas agudas e crônicas e prostatodinia. A HPB é caracterizada pelo aumento benigno da próstata, que normalmente se inicia em homens com mais de 40 anos. Os sintomas a ela relacionados podem causar grande prejuízo à qualidade de vida, sendo que em alguns casos é necessário a intervenção cirúrgica.2/16 [003] State of the Art [004] The prostate presents an intense cellular heterogeneity, besides being one of the organs most subject to changes during aging. Such changes can cause diseases such as: prostatitis, BPH and, in more severe cases, CaP. Prostatitis is the most common prostatic disease in men under 50 and its incidence reaches 12%. Its genesis is poorly understood and multifactorial. The most common forms are: acute and chronic bacterial prostatitis and prostatodynia. BPH is characterized by a benign enlargement of the prostate, which normally begins in men over 40 years of age. The symptoms related to it can cause great damage to the quality of life, and in some cases surgical intervention is necessary.

[005] O CaP é uma doença multifatorial e heterogênea (PESTELL, R. G.; NEVALAINEN, Μ. T. PROSTATE CANCER. Totowa, USA: Humana Press, 2008). Seu desenvolvimento, portanto, ainda não é claramente compreendido. A heterogeneidade das células do câncer em geral é explicada por dois modelos: (estocástico) modelo de evolução clonal e pelo modelo de célula-tronco do câncer (CSC) (CHEN, X. et al. New insights into prostate cancer stem cells. Cell cycle, v. 12, n. 4, p. 579-86, 2013). O acompanhamento das alterações prostáticas pode ser realizado em 4 etapas: toque retal, dosagem de antígeno prostático específico (PSA), ultrasonografia transretal e biópsia. Esta última etapa deve ser considerada sempre que houver anormalidades no toque retal ou na dosagem do PSA (HELFAND, B. T.; CATALONA, W. J. The epidemiology and clinical implications of genetic variation in prostate cancer. Urologic Clinics of North America, v. 41, n. 2, p. 277-297, 2014). O toque retal é o teste mais utilizado, apesar de suas limitações, uma vez que somente as porções posterior e lateral da próstata podem ser palpadas, deixando 40% a 50% dos tumores fora do seu alcance. As estimativas de sensibilidade variam entre 55% e 68%. O valor preditivo positivo é estimado entre 25% e 28%. Quando utilizado em associação à dosagem do PSA com valores entre 1,5-2 ng/ml, sua sensibilidade pode[005] CaP is a multifactorial and heterogeneous disease (PESTELL, R. G .; NEVALAINEN, Μ. T. PROSTATE CANCER. Totowa, USA: Humana Press, 2008). Its development, therefore, is not yet clearly understood. The heterogeneity of cancer cells in general is explained by two models: (stochastic) model of clonal evolution and by the cancer stem cell model (CSC) (CHEN, X. et al. New insights into prostate cancer stem cells. Cell cycle, v. 12, n. 4, p. 579-86, 2013). The monitoring of prostatic changes can be performed in 4 stages: digital rectal examination, measurement of prostate specific antigen (PSA), transrectal ultrasound and biopsy. This last step should be considered whenever there are abnormalities in digital rectal examination or PSA measurement (HELFAND, BT; CATALONA, WJ The epidemiology and clinical implications of genetic variation in prostate cancer. Urologic Clinics of North America, v. 41, n. 2, pp. 277-297, 2014). Digital rectal examination is the most used test, despite its limitations, since only the posterior and lateral portions of the prostate can be palpated, leaving 40% to 50% of the tumors out of reach. Sensitivity estimates vary between 55% and 68%. The positive predictive value is estimated between 25% and 28%. When used in association with the PSA dosage with values between 1.5-2 ng / ml, its sensitivity may

3/16 chegar a 95% (INCA. Câncer da próstata: consenso. Ministério da Saúde, v. 1, p. 20, 2002.). A última estimativa mundial realizada em 2012 apontou o CaP como o segundo tipo de câncer mais frequente na população masculina, com cerca de 1,1 milhão de casos novos no ano de 2012. Segundo o INCA, o único fator de risco bem estabelecido para o desenvolvimento do CaP é a idade. Uma vez que 62% dos casos já diagnosticados mundialmente ocorrem em homens acima de 65 anos de idade (INCA. Câncer da próstata: consenso. Ministério da Saúde, v. 1, p. 20, 2002).3/16 reach 95% (INCA. Prostate cancer: consensus. Ministry of Health, v. 1, p. 20, 2002.). The last global estimate made in 2012 pointed to the CaP as the second most common type of cancer in the male population, with around 1.1 million new cases in 2012. According to INCA, the only well-established risk factor for development of CaP is age. Since 62% of cases already diagnosed worldwide occur in men over 65 years of age (INCA. Prostate cancer: consensus. Ministry of Health, v. 1, p. 20, 2002).

[006] No entanto, outros fatores como histórico familiar da doença, alimentação, obesidade e até mesmo a etnia são também fatores de risco relacionados ao desenvolvimento da doença. Os dados informados pelo INCA sobre a questão da mortalidade para o CaP apresentam um perfil ascendente semelhante ao da incidência no Brasil. No entanto, o CaP uma vez diagnosticado e tratado oportunamente pode ser considerado de bom prognóstico. Assim, muitos esforços têm sido dirigidos para melhorias no diagnóstico precoce e tratamento do CaP.[006] However, other factors such as family history of the disease, diet, obesity and even ethnicity are also risk factors related to the development of the disease. The data reported by INCA on the issue of mortality for PC have an upward profile similar to that of incidence in Brazil. However, CaP once diagnosed and treated timely can be considered a good prognosis. Thus, many efforts have been directed towards improvements in the early diagnosis and treatment of CaP.

[007] Na busca de estratégias terapêuticas a US2014064378 relata um método para diagnosticar se o indivíduo tem câncer de próstata, que compreende os passos de obtenção de uma amostra de urina contendo células da próstata; hibridação de um conjunto de pelo menos duas sondas específicas para os cromossomos, para as células da próstata, em que cada uma das sondas específicas dos cromossomos contém um marcador detectável e é específico para cromossomos humanos diferentes.[007] In the search for therapeutic strategies, US2014064378 reports a method to diagnose whether the individual has prostate cancer, which comprises the steps of obtaining a urine sample containing prostate cells; hybridization of a set of at least two chromosome-specific probes, for prostate cells, where each of the chromosome-specific probes contains a detectable marker and is specific for different human chromosomes.

[008] Outro método foi proposto na US201304479 que apresenta um aptâmero que reduz a expressão de clusterina e um antagonista de receptor de androgénio que quando combinados são eficazes para tratar o paciente com câncer de próstata. A DE2002115321 baseia-se em um ácido nucléico que codifica TRPP8. Este é expresso diferencialmente em tecidos de tumor da próstata, onde a expressão do TRPP8 acontece em níveis mais elevados em comparação com[008] Another method was proposed in US201304479 that features an aptamer that reduces the expression of clusterin and an androgen receptor antagonist that when combined are effective to treat the patient with prostate cancer. DE2002115321 is based on a nucleic acid encoding TRPP8. This is differentially expressed in prostate tumor tissues, where TRPP8 expression occurs at higher levels compared to

4/16 células normais do mesmo tecido. Isto permite, a identificação de células tumorais da próstata.4/16 normal cells from the same tissue. This allows for the identification of prostate tumor cells.

[009] Com o mesmo intuito de auxiliar no tratamento e diagnóstico do câncer de próstata a WO 2006096754 A2 relata a utilização de aptâmeros selecionados por SELEX que possuem alta afinidade para o PSMA. Estes aptâmeros são úteis como agentes terapêuticos e de diagnóstico no câncer de próstata e / ou de outras doenças ou distúrbios em que o PSMA esteja envolvido. A invenção ainda apresenta materiais e métodos para a administração dos aptâmeros capazes de se ligar ao PSMA. Um outro aptâmero selecionado para o câncer de próstata foi apresentado na EP 2588608 A1, neste caso o aptâmero selecionado se liga ao antígeno específico da próstata (PSA), sendo possível utilizá-lo com a ferramenta para o diagnóstico do câncer de próstata.[009] With the same intention to assist in the treatment and diagnosis of prostate cancer, WO 2006096754 A2 reports the use of aptamers selected by SELEX that have high affinity for PSMA. These aptamers are useful as therapeutic and diagnostic agents in prostate cancer and / or other diseases or disorders in which PSMA is involved. The invention further presents materials and methods for the administration of aptamers capable of binding PSMA. Another aptamer selected for prostate cancer was presented in EP 2588608 A1, in this case the selected aptamer binds to the prostate specific antigen (PSA), being possible to use it with the tool for the diagnosis of prostate cancer.

[0010] Já o aptâmero CG3 foi selecionado e utilizado com precipitação magnética para amplificação por PCR do RNA longo não codificante, PCA3, a fim de auxiliar no diagnóstico do câncer de próstata (MARANGONI, K. et al. Prostate-specific RNA aptamer: promising nucleic acid antibody-like cancer detection. Scientific Reports, v. 5, p. 12090, 2015).[0010] The aptamer CG3 was selected and used with magnetic precipitation for PCR amplification of the long non-coding RNA, PCA3, in order to assist in the diagnosis of prostate cancer (MARANGONI, K. et al. Prostate-specific RNA aptamer: promising nucleic acid antibody-like cancer detection (Scientific Reports, v. 5, p. 12090, 2015).

[0011] Em outros ensaios terapêuticos diferentes anticorpos monoclonais também foram descritos como importantes ferramentas para o tratamento do câncer. WO2016155506 apresenta o N3G4 como marcador para detecção do câncer. Assim como, JP2016088886, apresentou os anticorpos monoclonais D2 e D4 com o intuito de detectar o câncer de próstata. CN105646710 relata a seleção e utilização do anticorpo anti-VEGFR-2 que pode ser aplicado para o tratamento de doenças provocadas por angiogênese do tumor. As doenças incluem, câncer de próstata, mama, gliobastoma, coloretal pulmão, ovário e tumores sólidos. Também US2015316553, descreve anticorpos monoclonais que reconhecem os domínios extracelulares de PSMA de tecido hiperplásico normal, benigno, e células cancerígenas da próstata. Anti-PD-L1, PD-1 e antiCTLA-4 foram descritos respectivamente em WO 2013079174 A1, WO 2015035606 A1, WO 2014153150 A1 como sendo importantes moléculas na[0011] In other therapeutic trials different monoclonal antibodies have also been described as important tools for the treatment of cancer. WO2016155506 presents N3G4 as a marker for cancer detection. As well, JP2016088886, presented monoclonal antibodies D2 and D4 in order to detect prostate cancer. CN105646710 reports the selection and use of the anti-VEGFR-2 antibody that can be applied for the treatment of diseases caused by tumor angiogenesis. Diseases include, prostate cancer, breast cancer, gliobastoma, colorectal lung, ovary and solid tumors. Also US2015316553, describes monoclonal antibodies that recognize the extracellular domains of PSMA from normal, benign hyperplastic tissue and prostate cancer cells. Anti-PD-L1, PD-1 and antiCTLA-4 were described respectively in WO 2013079174 A1, WO 2015035606 A1, WO 2014153150 A1 as being important molecules in the

5/16 terapia do câncer. Tanto os anticorpos monoclonais como compostos quimioterápicos (Doxorrubina/Docetaxel) e receptores quiméricos podem ser associados as sequências de aptâmeros selecionadas para melhorar o diagnóstico e terapia do câncer de próstata.5/16 cancer therapy. Both monoclonal antibodies, chemotherapeutic compounds (Doxorubin / Docetaxel) and chimeric receptors can be associated with the sequences of aptamers selected to improve the diagnosis and therapy of prostate cancer.

[0012] Assim, todas essas patentes reforçam a utilização e a necessidade de novos sistemas e moléculas para o tratamento e diagnóstico do câncer de próstata. O SELEX e suas variantes como exemplo, o 3D Cell SELEX, apresenta-se como um promissor método para a seleção de aptâmeros que podem ser empregados na investigação e terapia do câncer de próstata. A tecnologia apresenta alta sensibilidade e especificidade, além de baixo custo em relação a outras tecnologias vigentes.[0012] Thus, all these patents reinforce the use and need for new systems and molecules for the treatment and diagnosis of prostate cancer. SELEX and its variants as an example, 3D Cell SELEX, presents itself as a promising method for the selection of aptamers that can be used in the investigation and therapy of prostate cancer. The technology has high sensitivity and specificity, as well as low cost in relation to other current technologies.

[0013] Os aptâmeros selecionados, cuja função é ligar a receptores da membrana celular específicos de células tumorais prostáticas, podem ser utilizados no desenvolvimento de uma composição farmacológica utilizada no intuito de tratar pacientes com câncer de próstata ou mesmo no diagnóstico. Esses fins podem ser realizados através de ensaios in vitro, comumente utilizados em laboratórios ou na aplicação terapêutica,sem apresentar imunogenecidade, nem citotoxicidade para células ou tecidos, como por exemplo: imunohistoquímica, culturas de células, ELISA, western blot, imunofluorescência, imunofenotipagem, citometria de fluxo, conjugação com micropartículas magnéticas ou quantum dot, PCR (reação em cadeia pela polimerase) ou demais testes que utilizam esses aptâmeros direta ou indiretamente a fim de diagnosticar o câncer de próstata. Podendo utilizar em todas estas abordagens amostras de biópsias/ tecido prostático/sangue.[0013] The selected aptamers, whose function is to bind to specific cell membrane receptors of prostate tumor cells, can be used in the development of a pharmacological composition used in order to treat patients with prostate cancer or even in diagnosis. These purposes can be accomplished through in vitro tests, commonly used in laboratories or in therapeutic application, without presenting immunogenicity, nor cytotoxicity to cells or tissues, such as: immunohistochemistry, cell cultures, ELISA, western blot, immunofluorescence, immunophenotyping, flow cytometry, conjugation with magnetic microparticles or quantum dot, PCR (polymerase chain reaction) or other tests that use these aptamers directly or indirectly in order to diagnose prostate cancer. Being able to use biopsy samples / prostate tissue / blood in all these approaches.

[0014] Para a utilização destes diferentes ensaios os aptâmeros podem ser marcados ou conjugados com agentes fluorescentes, agentes colorimétricos, radioisótopos, biotina, PEG (polietileno glicol), digoxigenina, fluoróforos em geral, variantes de Alexa Fluor, GFP (proteína verde fluorescente), anticorpos marcados, grupamento químicos, agentes luminescentes, nanocristais, nanopartículas magnéticas para obtenção imagens in vitro ou in vivo, bem como[0014] For the use of these different tests, aptamers can be labeled or conjugated with fluorescent agents, colorimetric agents, radioisotopes, biotin, PEG (polyethylene glycol), digoxigenin, fluorophores in general, Alexa Fluor variants, GFP (green fluorescent protein) , labeled antibodies, chemical groups, luminescent agents, nanocrystals, magnetic nanoparticles for obtaining in vitro or in vivo images, as well as

6/16 conjugados à nanomateriais e reagentes para detecção e estadiamento do câncer de próstata e monitoramento terapêutico para detecção em sistemas fotônicos associados às tecnologias RAMAN, FTIR e fluorescência, em sistemas eletroquímicos, e para análises proteômicas. Serem também utilizados na composição de contrastes e reagentes para obtenção de imagens in vivo com finalidade de diagnóstico, prognóstico do CaP, e para o monitoramento da eficácia terapêutica, por meio de ressonância magnética, tomografia computatorizada, PET (tomografia por emissão de positrons).6/16 conjugated to nanomaterials and reagents for the detection and staging of prostate cancer and therapeutic monitoring for detection in photonic systems associated with RAMAN, FTIR and fluorescence technologies, in electrochemical systems, and for proteomic analysis. Also be used in the composition of contrasts and reagents to obtain in vivo images for the purpose of diagnosis, prognosis of CaP, and for monitoring therapeutic efficacy, by means of magnetic resonance, computed tomography, PET (positron emission tomography).

[0015] Além disso, serem utilizados também marcados com fluoróforo para confirmação do diagnóstico tumoral em processo de captura magnética visando a separação de células tumorais da próstata ou de exossomos liberados por células tumorais da próstata em biopsias líquidas ou tecido de CaP. Além disso, podem ser utilizados em composição combinada de fármacos e de outros marcadores para o aprimoramento dos processos terapêuticos e de diagnósticos simultâneos, inclusive no diagnóstico de acompanhamento terapêutico, ou em sistemas portáteis com captura magnética acoplado à detecção em tempo real por fluorescência ou por eletroquímica para o diagnóstico do câncer de próstata em sangue periférico, biópsia prostática e em soro. Estes aptâmeros também podem serem utilizados no monitoramento da recidiva da doença, da doença residual mínima e da falha terapêutica do CaP.[0015] Furthermore, they should also be used with fluorophore to confirm the tumor diagnosis in a magnetic capture process aiming at the separation of prostate tumor cells or exosomes released by prostate tumor cells in liquid biopsies or CaP tissue. In addition, they can be used in a combined composition of drugs and other markers for the improvement of therapeutic processes and simultaneous diagnoses, including in the diagnosis of therapeutic follow-up, or in portable systems with magnetic capture coupled to real-time detection by fluorescence or by electrochemistry for the diagnosis of prostate cancer in peripheral blood, prostate biopsy and serum. These aptamers can also be used to monitor disease recurrence, minimal residual disease and therapeutic failure of CaP.

[0016] Os aptâmeros abordados também podem ser desta forma, utilizados em sistemas combinados para o diagnóstico de alvos tumorais específicos como DNA, RNA, microRNAs, RNA longos não codificantes (IncRNA; como o PCA3), ácidos nucleicos em geral, proteínas e antígenos não-proteicos associados aos tumores de próstata por meio de sistemas de detecção eletroquímicos, fotônicos, colunas cromatográficas conjugadas, separação magnética com conjugados fluorescentes ou luminescente. Também em combinações com fármacos antitumorais, anti-inflamatórios, inibidores de receptores tumorais, toxinas, anticorpos, ácidos nucleicos, proteínas, lipídeos, carboidratos, microRNAs,[0016] The aptamers addressed can also be used in this way, in combined systems for the diagnosis of specific tumor targets such as DNA, RNA, microRNAs, long non-coding RNAs (IncRNA; like PCA3), nucleic acids in general, proteins and antigens non-protein associated with prostate tumors by means of electrochemical, photonic detection systems, conjugated chromatographic columns, magnetic separation with fluorescent or luminescent conjugates. Also in combinations with antitumor, anti-inflammatory drugs, tumor receptor inhibitors, toxins, antibodies, nucleic acids, proteins, lipids, carbohydrates, microRNAs,

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IncRNAs, lipossomos, nanofibras, nanopartículas ou mesmo lipossomas para entrega de drogas.IncRNAs, liposomes, nanofibers, nanoparticles or even liposomes for drug delivery.

[0017] Estes aptâmeros ainda podem ser combinados a outros aptâmeros, anticorpos inibidores dos “checkpoints”, (como o anti-CTLA-4, anti-PD-1 e antiPD-L1, anti-CD3), anticorpos monoclonais, fármacos e peptídeos como direcionadores tanto da resposta imunológica nativa quanto de células com receptores de antígenos quiméricos (CARs). Como também serem utilizados como conjugados à drogas, toxinas, alcalóides (Docetaxel), radioisótopos (como 1131), anticorpos e fármacos direcionados diretamente para células tumorais tanto como monoterapia ou em associação com outros medicamentos, como prednisona, anticorpos anti-TGF-beta1, anticorpos anti-IL-6, pirfenidone, nintedanibe (direcionados para os receptores do fator de crescimento vascularVEGFR), sorafenibe (direcionados aos receptores de BRAF, CRAF E VEGF), ou mesmo com inibidores de quinases ou inibidores de tirosinas quinases (TKIs), como o nilotinib e bloqueadores de ERK, fator de crescimento derivado de plaquetas-PDGFR e do fator de crescimento de fibroblasto-FGFR, tanto para a terapêutica de tumores prostáticos iniciais como para o câncer de próstata metastático refratário a androgênio.[0017] These aptamers can still be combined with other aptamers, checkpoint inhibiting antibodies, (such as anti-CTLA-4, anti-PD-1 and antiPD-L1, anti-CD3), monoclonal antibodies, drugs and peptides as drivers of both the native immune response and cells with chimeric antigen receptors (CARs). As well as being used as conjugates to drugs, toxins, alkaloids (Docetaxel), radioisotopes (like 1131), antibodies and drugs directed directly to tumor cells either as monotherapy or in combination with other drugs, such as prednisone, anti-TGF-beta1 antibodies, anti-IL-6 antibodies, pirfenidone, nintedanib (targeted at vascular growth factor receptors VEGFR), sorafenib (targeted at BRAF, CRAF AND VEGF receptors), or even with kinase inhibitors or tyrosine kinase inhibitors (TKIs), such as nilotinib and ERK blockers, platelet-derived growth factor-PDGFR and fibroblast growth factor-FGFR, both for the treatment of early prostate tumors and for androgen-refractory metastatic prostate cancer.

[0018] A conjugação destes aptâmeros também pode ser feita à antígenos vacinais, como NY-ESO-1, PSA, PSMA, TARP, PAP, MUC1, individualmente ou combinados, para estimular a resposta imune contra os tumores prostáticos. Como também serem combinados à anticorpos monoclonais e fármacos, compreendidos por diversos alvos biológicos tumorais anti-TF (fator tecidual), anti-TROP-2, anti-STEAP-1 e anti-IGF para o tratamento do câncer de próstata. Além de poderem ser também avaliados com agonistas de receptores Toll-like 3 e conjugados à inibidores como o enzalutamide ou qualquer outro antiandrogênio não-esteróide para o tratamento de tumores prostáticos. E também no tratamento preventivo de tumores prostáticos, especialmente direcionados à pacientes com hiperplasia benigna e prostatites quando combinados o conjugados à inibidores, anticorpos monoclonais, anti-inflamatórios e[0018] The conjugation of these aptamers can also be done with vaccine antigens, such as NY-ESO-1, PSA, PSMA, TARP, PAP, MUC1, individually or in combination, to stimulate the immune response against prostate tumors. As well as being combined with monoclonal antibodies and drugs, comprised of several biological tumor targets: anti-TF (tissue factor), anti-TROP-2, anti-STEAP-1 and anti-IGF for the treatment of prostate cancer. In addition, they can also be evaluated with Toll-like 3 receptor agonists and conjugated to inhibitors such as enzalutamide or any other non-steroidal antiandrogen for the treatment of prostate tumors. And also in the preventive treatment of prostatic tumors, especially directed at patients with benign hyperplasia and prostatitis when combined with inhibitors, monoclonal antibodies, anti-inflammatory and

8/16 antibióticos.8/16 antibiotics.

[0019] Dessa forma, a presente invenção propõe o uso de sequências de aptâmeros, fusionadas ou não a carreadores, tais como fármacos e/ou substâncias fluorescentes, ou a qualquer outro tipo de carreador e sua utilização no tratamento, diagnóstico e acompanhamento do câncer de próstata.[0019] Thus, the present invention proposes the use of sequences of aptamers, fused or not to carriers, such as drugs and / or fluorescent substances, or to any other type of carrier and its use in the treatment, diagnosis and monitoring of cancer prostate cancer.

[0020]A presente invenção poderá ser melhor compreendida por meio da descrição dos resultados obtidos. Os procedimentos experimentais envolvidos estão detalhados no final desse relatório descritivo. A metodologia empregada para a seleção, caracterização e validação na utilização dos aptâmeros selecionados, foi realizado a partir da linhagem tumoral prostática (PC-3), da linhagem tumoral prostática (LNCaP), da linhagem normal prostática (RWPE-1), da linhagem tumoral de tireoide (TPC-1) e da cultura primária de células isoladas de biópsias de pacientes com CaP. Pelo processo de validação verificou-se a capacidade da Seq. ID N² 04 de se ligar especificamente às células tumorais prostáticas, o que contribui para a potencial aplicação dos aptâmeros selecionados por 3D Cell SELEX no diagnóstico e tratamento do câncer de próstata.[0020] The present invention can be better understood by describing the results obtained. The experimental procedures involved are detailed at the end of this specification. The methodology used for the selection, characterization and validation in the use of the selected aptamers, was carried out from the prostatic tumor lineage (PC-3), from the prostatic tumor lineage (LNCaP), from the normal prostate lineage (RWPE-1), from the lineage thyroid tumor (TPC-1) and primary cell culture isolated from biopsies of patients with CaP. Through the validation process, Seq's capacity was verified. ID N ² 04 to bind specifically to prostate tumor cells, which contributes to the potential application of the aptamers selected by 3D Cell SELEX in the diagnosis and treatment of prostate cancer.

[00211 Exemplo 1 [0022] Este exemplo se refere à seleção, através da tecnologia de 3D Cell SELEX, e caracterização de aptâmeros ligantes a células tumorais prostáticas.[00211 Example 1 [0022] This example refers to the selection, through 3D Cell SELEX technology, and characterization of aptamers binding to prostate tumor cells.

[0023]As sequências identificadas por Seq. ID N° 1 a 8 referem-se aos aptâmeros selecionados como ligantes à um receptor da membrana celular da linhagem tumoral da próstata, PC-3. E as Seq. ID N° 9 a 14 referem a aptâmeros selecionados por SELEX contra RNA longo não codificante, PCA3, alvo no câncer de próstata.[0023] The sequences identified by Seq. ID No. 1 to 8 refer to aptamers selected as ligands to a cell membrane receptor of the prostate tumor lineage, PC-3. And the Seq. ID N ° 9 to 14 refer to aptamers selected by SELEX against long non-coding RNA, PCA3, targeted in prostate cancer.

[0024] Exemplo 2 [0025] Análise de região de similaridade entre os aptâmeros selecionados foram feitas utilizando o programa Clustal.[0024] Example 2 [0025] Analysis of the similarity region between the selected aptamers was done using the Clustal program.

9/16 [0026] A FIGURA 1 apresenta as estruturas secundárias previstas e os valores mínimos de energia livre para todos os oito aptâmeros, selecionados por 3D Cell Selex, que foram obtidos pelo software Sfold.9/16 [0026] FIGURE 1 shows the expected secondary structures and the minimum free energy values for all eight aptamers, selected by 3D Cell Selex, which were obtained by the Sfold software.

[0027] A FIGURA 2 mostra a interação da linhagem celular PC-3 com a Seq. ID N° 04 calculada quantitativamente pela constante de equilíbrio, que mostra uma elevada afinidade com Kd na escala nanomolar (Kd =71,57 12, 96 nM).[0027] FIGURE 2 shows the interaction of the cell line PC-3 with Seq. ID No. 04 calculated quantitatively by the equilibrium constant, which shows a high affinity with Kd on the nanomolar scale (Kd = 71.57 12, 96 nM).

[0028] A FIGURA 3 mostra o ensaio de especificidade e afinidade de ligação do aptâmero que foi determinado por citometria de fluxo. Considerando todas as linhagens de células testadas, o conjugado de PC-3 e Seq. ID N° 04 apresentaram maior intensidade de fluorescência, quando comparada com as outras linhas celulares e a sequência scramble. O conjugado de LNCaP e Seq. ID N° 04 mostrou uma fluorescência menos intensa, e as linhagens celulares RWPE-1 e TPC-1 não apresentaram qualquer fluorescência quando conjugadas com as sequências testadas e Seq. ID N° 04 e scramble.[0028] FIGURE 3 shows the aptamer specificity and binding affinity assay that was determined by flow cytometry. Considering all cell lines tested, the conjugate of PC-3 and Seq. ID N ° 04 showed a higher fluorescence intensity when compared to the other cell lines and the scramble sequence. The LNCaP and Seq conjugate. ID No. 04 showed less intense fluorescence, and the cell lines RWPE-1 and TPC-1 did not show any fluorescence when conjugated with the tested and Seq sequences. ID No. 04 and scramble.

[0029] A FIGURA 4 mostra a análise por microscopia de fluorescência que indica que a Seq. ID N° 04 liga-se à superfície de células PC-3. Por esta razão, nós submetemos a linhagem celular PC-3 à digestão com proteinase K para confirmar se o alvo de ligação do aptâmero é de fato uma proteína de membrana. Depois de tratar durante dois minutos a linhagem celular PC-3 com proteinase K, a Seq. ID N² 04 não liga às células PC-3, confirmando a hipótese de ligação da Seq. ID N° 04 a receptores de superfície celular.[0029] FIGURE 4 shows the analysis by fluorescence microscopy which indicates that Seq. ID No. 04 binds to the surface of PC-3 cells. For this reason, we subject the PC-3 cell line to proteinase K digestion to confirm that the aptamer binding target is indeed a membrane protein. After treating the PC-3 cell line with proteinase K for two minutes, Seq. ID N ² 04 does not bind to PC-3 cells, confirming the hypothesis of Seq binding. ID No. 04 to cell surface receptors.

[0030] Exemplo 3.[0030] Example 3.

[0031] Se refere ao uso do aptâmero identificado pela Seq. ID N² 04 e sua aplicação em biópsias de pacientes com câncer de próstata, demonstrando sua utilização como biomarcador para análises histopatológicas.[0031] Refers to the use of the aptamer identified by Seq. ID N ² 04 and its application in biopsies of patients with prostate cancer, demonstrating its use as a biomarker for histopathological analysis.

[0032] A FIGURA 5 mostra a análise por microscopia de fluorescência que indica que a Seq. ID N° 04 se liga à superfície das células tumorais oriundas de biópsias de pacientes com CaP (quadros à direita)[0032] FIGURE 5 shows the analysis by fluorescence microscopy which indicates that Seq. ID N ° 04 binds to the surface of tumor cells from biopsies of patients with CaP (pictures on the right)

10/16 [0033] Exemplo 4.10/16 [0033] Example 4.

[0034] Se refere às aplicações do aptâmero identificado pela Seq. ID N^s 04 conjugado à molécula de GFP com duas tecnologias para detecção de tumores prostáticos em sangue periférico, sendo uma por citometria de fluxo e outra por fluorescência em equipamento portátil. Os pacientes com câncer de próstata apresentam diferentes níveis de células tumorais circulantes, as quais são prontamente quantificáveis por citometria de fluxo. As mesmas amostras podem ser detectadas em equipamento portátil que mede a fluorescência com filtros de excitação em 488 nm e emissão em 515 nm.[0034] Refers to the applications of the aptamer identified by Seq. ID N ^s 04 conjugated to the GFP molecule with two technologies for detecting prostatic tumors in peripheral blood, one by flow cytometry and the other by fluorescence in portable equipment. Prostate cancer patients have different levels of circulating tumor cells, which are readily quantifiable by flow cytometry. The same samples can be detected in portable equipment that measures fluorescence with excitation filters at 488 nm and emission at 515 nm.

[0035] A FIGURA 6 mostra a análise por citometria de fluxo do aptâmero identificado pela Seq. ID N² 04 na detecção de células tumorais isoladas a partir do sangue de pacientes com câncer de próstata. A) paciente 1: 19% das células (10⁴) analisadas forma marcadas com o aptâmero. B) paciente 2) 5% das células (10⁴) analisadas forma marcadas com o aptâmero.[0035] FIGURE 6 shows the flow cytometric analysis of the aptamer identified by Seq. ID N ² 04 in the detection of tumor cells isolated from the blood of patients with prostate cancer. A) patient 1: 19% of the cells (10 ⁴ ) analyzed were labeled with the aptamer. B) patient 2) 5% of the cells (10 ⁴ ) analyzed were labeled with the aptamer.

[0036] A FIGURA 7 mostra o esquema da análise de fluorescência de amostras biológicas marcadas com o aptâmero identificado pela Seq. ID N² 04 em equipamento portátil.[0036] FIGURE 7 shows the schematic of the fluorescence analysis of biological samples labeled with the aptamer identified by Seq. ID N ² 04 in portable equipment.

[0037] Exemplo 5.[0037] Example 5.

[0038] Se refere ao uso combinado do aptâmero identificado pela Seq. ID N² 09 conjugado a um quantum dot e intercalado com doxorrubicina dispostos dentro de um complexo com lipofectamina e aplicados diretamente contra células tumorais PC-3 e células normais da próstata. O complexo formado não emite fluorescência, embora o quantum dot emite a cor verde e a doxorrubicina a cor vermelha, quando ambos estão livres.[0038] Refers to the combined use of the aptamer identified by Seq. ID N ² 09 conjugated to a quantum dot and intercalated with doxorubicin arranged within a lipofectamine complex and applied directly against PC-3 tumor cells and normal prostate cells. The complex formed does not emit fluorescence, although the quantum dot emits green and doxorubicin red when both are free.

[0039] A FIGURA 8 mostra a liberação controlada de doxorrubicina somente nas células tumorais, como verificado pela presença de aptâmeros e doxorrubicina que somente foi liberada quando a Seq. ID N² 09 reconheceu o PCA3, que é específico para o câncer de próstata.[0039] FIGURE 8 shows the controlled release of doxorubicin only in tumor cells, as verified by the presence of aptamers and doxorubicin that was only released when Seq. ID N ² 09 recognized PCA3, which is specific for prostate cancer.

/16 [0040] Metodologia empregada [0041] Descrevemos agora a metodologia de 3D Cell-SELEX utilizada para obtenção dos aptâmeros Seq. ID N° 1 a 8. As Seq. ID N° 9 a 14 foram selecionadas de maneira semelhante por SELEX contra o alvo IncRNA PCA3 próstata./ 16 [0040] Methodology employed [0041] We now describe the 3D Cell-SELEX methodology used to obtain the Seq aptamers. ID No. 1 to 8. Seq. ID No. 9 to 14 were selected in a similar manner by SELEX against the prostate PCR3 IncRNA target.

[0042] Para obtenção de aptâmeros específicos às células tumorais da próstata por 3D Cell SELEX foram utilizadas como alvo na seleção uma linhagem celular tumoral prostática (PC-3) e uma linhagem celular normal da próstata (RWPE-1) como controle.[0042] To obtain aptamers specific to prostate tumor cells by 3D Cell SELEX, a prostate tumor cell line (PC-3) and a normal prostate cell line (RWPE-1) were used as a control in the selection.

[0043] A estratégia de seleção adotada para a obtenção dos aptâmeros é descrita a seguir:[0043] The selection strategy adopted for obtaining aptamers is described below:

[0044] A cultura em 3D das linhagens celulares utilizadas foi realizada utilizando o Kit de Nano3D Biosciences, conforme descrito por Haisler e colaboradores (HAISLER, W. L. et al. Three-dimensional cell culturing by magnetic levitation. Nature protocols, v. 8, n. 10, p. 1940-9, 2013). Este kit foi fornecido com urn aparelho magnético e com a solução de nanoshuttle (NS), composta de óxido de ferro (Fe2O3) e de nanopartículas de ouro cobertas com poli-lisina. NS foram adicionadas em ambas às culturas de células (PC-3 e RWPE-1) com cerca de 80% de confluência, na proporção de 8 uL de NS por cm². As células foram incubadas numa incubadora de cultura de células padrão de CO2 (37°C, 5% CO2) e, após 12 horas, a cultura de células aderentes foi tripsinizada com solução de tripsina-EDTA (Corning). A tripsina foi inativada utilizando soro fetal bovino (Gibco). As células foram contadas e distribuídas (3,2x10⁶ células/poço) em placas de 6 poços ultra-low attachment multiwell plates (Corning). O aparato magnético foi colocado sobre a tampa da placa de cultura durante 48 horas para promover a levitação magnética e gerar esferoides celulares).[0044] The 3D culture of the cell lines used was performed using the Nano3D Biosciences Kit, as described by Haisler and collaborators (HAISLER, WL et al. Three-dimensional cell culturing by magnetic levitation. Nature protocols, v. 8, n 10, p. 1940-9, 2013). This kit was supplied with a magnetic device and the nanoshuttle solution (NS), composed of iron oxide (Fe2O3) and gold nanoparticles covered with poly-lysine. NS were added to both cell cultures (PC-3 and RWPE-1) with about 80% confluence, at the rate of 8 uL NS per cm ² . The cells were incubated in a standard CO2 cell culture incubator (37 ° C, 5% CO2) and, after 12 hours, the adherent cell culture was trypsinized with trypsin-EDTA solution (Corning). Trypsin was inactivated using fetal bovine serum (Gibco). The cells were counted and distributed (3.2x10 ⁶ cells / well) in 6-well plates ultra-low attachment multiwell plates (Corning). The magnetic apparatus was placed on the cover of the culture plate for 48 hours to promote magnetic levitation and generate cellular spheroids).

[0045] Para selecionar os aptâmeros ligantes à células tumorais prostáticas foi construída uma biblioteca de RNA. Para a construção da biblioteca, utilizou-se 1 ug de DNA genômico extraído do sangue de pacientes com CaP. O pool de DNA[0045] To select the aptamers binding to prostate tumor cells, an RNA library was built. For the construction of the library, 1 ug of genomic DNA extracted from the blood of patients with CaP was used. The DNA pool

12/16 foi fragmentado aleatoriamente usando um sonicador (Thornton) e amplificado por PCR assimétrica usando primers (reverse: hyb-REV and forward: hyb-FOR). [0046] Após a PCR assimétrica, os produtos de reação foram separados por eletroforese em gel de agarose a 2,5%. Os produtos da amplificação que variaram de 40-700 nucleotídeos foram purificados por precipitação do DNA utilizando acetato de amônio (7,5 M), e o pellet foi ressuspenso em 10 ml_ de água purificada. A biblioteca de RNA foi completada através da introdução da sequência do promotor T7 na extremidade 5’ através de amplificação por PCR (26 ciclos) sob as seguintes condições: 20s de desnaturação a 93°C, anelamento 40s a 50°C e extensão de 40 s a 72°C; o último ciclo, seguido por 10 min a 72°C, usando os fix-iniciadores (5 '- GAG GAT GAC GCG G -N40-700- GTC TGC TGC TCG CCC T-3'), que flanquearam todas as sequências de biblioteca. O promotor T7 foi introduzido para expressar aptâmeros de RNA com sequências aleatórias. Os fragmentos purificados foram convertidos em RNA por transcrição in vitro utilizando T7 RiboMAX Kit, de acordo com as instruções do fabricante (Promega).12/16 was randomly fragmented using a sonicator (Thornton) and amplified by asymmetric PCR using primers (reverse: hyb-REV and forward: hyb-FOR). [0046] After asymmetric PCR, the reaction products were separated by 2.5% agarose gel electrophoresis. Amplification products ranging from 40-700 nucleotides were purified by DNA precipitation using ammonium acetate (7.5 M), and the pellet was resuspended in 10 ml of purified water. The RNA library was completed by introducing the T7 promoter sequence at the 5 'end through PCR amplification (26 cycles) under the following conditions: 20s of denaturation at 93 ° C, 40s annealing at 50 ° C and 40 ° extension at 72 ° C; the last cycle, followed by 10 min at 72 ° C, using the fix-primers (5 '- GAG GAT GAC GCG G -N40-700- GTC TGC TGC TCG CCC T-3'), which flanked all library sequences . The T7 promoter was introduced to express RNA aptamers with random sequences. The purified fragments were converted to RNA by in vitro transcription using T7 RiboMAX Kit, according to the manufacturer's instructions (Promega).

[0047] O 3D Cell-SELEX foi realizado com 9 rodadas de seleção. Na primeira rodada de seleção, utilizou-se esferoides da linhagem celular RWPE-1 para seleção negativa, de modo a subtrair aptâmeros não específicos para PC-3. Os outros oito ciclos (2°-9°) foram realizados com esferoides celulares da linhagem PC-3 (célula alvo). Antes de cada ciclo do 3D Cell-SELEX, 3.2 x 10⁶ células foram cultivadas por MLM (método de levitação magnética) para formar as estruturas celulares em 3D, como descrito acima. Após 48 horas de levitação magnética, o esferoide celular foi lavado três vezes com PBS 1X. Em seguida, 10 nmol da biblioteca de RNA foram diluídos em 1 mL de tampão de ligação (0,01 M PBS, 5 nmol de MgCb e 4,5 g de glucose) e incubadas com as células de controle (esferoides RWPE-1) a 37 ° C durante 1h. Após a incubação, as moléculas de RNA que não se ligaram a linhagem celular RWPE-1 foram removidas e submetidas a transcrição reversa. O cDNA obtido foi utilizado como modelo e amplificada por PCR com FIX-primers. O fragmento amplificado foi purificado tal[0047] The 3D Cell-SELEX was carried out with 9 selection rounds. In the first round of selection, spheroids of the cell line RWPE-1 were used for negative selection, in order to subtract non-specific aptamers for PC-3. The other eight cycles (2 ° -9 °) were performed with cellular spheroids of the PC-3 lineage (target cell). Before each cycle of 3D Cell-SELEX, 3.2 x 10 ⁶ cells were cultured by MLM (magnetic levitation method) to form 3D cell structures, as described above. After 48 hours of magnetic levitation, the cellular spheroid was washed three times with PBS 1X. Then, 10 nmol of the RNA library was diluted in 1 ml of binding buffer (0.01 M PBS, 5 nmol of MgCb and 4.5 g of glucose) and incubated with the control cells (spheroid RWPE-1) at 37 ° C for 1h. After incubation, RNA molecules that did not bind to the RWPE-1 cell line were removed and subjected to reverse transcription. The obtained cDNA was used as a model and amplified by PCR with FIX-primers. The amplified fragment was purified as

13/16 como descrito acima e utilizados para reação de transcrição in vitro (RiboMAX ™), de acordo com as instruções do fabricante (Promega). Na segunda rodada de seleção, esferoides celulares da linhagem PC-3 foram incubados a 37°C por 1 h com o sobrenadante recuperado e transcrito na primeira rodada de seleção. Em seguida, o sobrenadante foi removido e as células foram lavadas com uma solução tampão (0,01 M PBS; 5 nmol de MgCI2). Os aptâmeros que se ligaram a linhagem alvo foram eluídos por adição de 500 ul de tampão de lavagem, e aquecidos a 95°C durante 5 min.13/16 as described above and used for in vitro transcription reaction (RiboMAX ™), according to the manufacturer's instructions (Promega). In the second round of selection, cell spheroids of the PC-3 strain were incubated at 37 ° C for 1 h with the supernatant recovered and transcribed in the first round of selection. Then, the supernatant was removed and the cells were washed with a buffer solution (0.01 M PBS; 5 nmol MgCl 2). Aptamers that bound to the target strain were eluted by adding 500 µl of wash buffer, and heated to 95 ° C for 5 min.

[0048] Após centrifugação, a solução diluída foi precipitada, tal como descrito acima e em seguida utilizada para a transcrição reversa. O cDNA recuperado foi usado como descrito na primeira fase. Para obter aptâmeros altamente específico, a pressão de seleção foi realizada a partir do 7^o ao 9^o round de seleção através do aumento do número de lavagens (de duas para três lavagens). Os aptâmeros específicos a linhagem celular PC-3 obtidos foram subclonados e avaliados após nove ciclos de seleção. A quantidade da biblioteca de RNA recuperada após cada round foi quantificada utilizando NanoDrop espectrofotómetro ND-1000 (NanoDrop Technologies) a um comprimento de onda de 260 nm e 280 nm, após a eluição a 95°C, 5 min.[0048] After centrifugation, the diluted solution was precipitated, as described above and then used for reverse transcription. The recovered cDNA was used as described in the first stage. For highly specific aptamers, the selection pressure was held from 7 to 9 round of selection by increasing the number of washes (two to three washes). The PC-3 cell line specific aptamers obtained were subcloned and evaluated after nine selection cycles. The amount of the RNA library recovered after each round was quantified using NanoDrop spectrophotometer ND-1000 (NanoDrop Technologies) at a wavelength of 260 nm and 280 nm, after elution at 95 ° C, 5 min.

[0049] Seauenciamento e análise de bioinformática dos aptâmeros [0050] Depois de nove ciclos de 3D Cell-SELEX, o pool de aptâmeros foi clonado usando pGEM® - T Easy Vector (Promega) em células competentes DH5a, de acordo com as instruções do fabricante. Depois da extração do DNA plamidial, 96 clones do 9^o round foram sequenciados utilizando o primer M13F. Os plasmídeos foram sequenciados na Universidade de Campinas (UnicampBrasil). As sequências obtidas foram alinhadas e as regiões motivos foram identificadas pelo software Clustal W. O software on-line Sfold foi utilizado para prever as estruturas secundárias e para obter o valor de AG (delta G) de cada aptâmero. Três parâmetros foram estabelecidos para avaliar a ligação de especificidade dos aptâmeros de RNA a linhagem celular PC-3: (1) aptâmero deve ter sequência de tamanhos entre 20 a 50 nucleotídeos e (2) a seleção de[0049] Bio-informatics and analysis of aptamers [0050] After nine cycles of 3D Cell-SELEX, the aptamer pool was cloned using pGEM® - T Easy Vector (Promega) in DH5a competent cells, according to the instructions of the manufacturer. After extraction of the DNA plamidial, 9 of 96 clones were sequenced using ^the round M13F primer. The plasmids were sequenced at the University of Campinas (UnicampBrasil). The sequences obtained were aligned and the motif regions were identified by the Clustal W software. The Sfold online software was used to predict secondary structures and to obtain the AG value (delta G) of each aptamer. Three parameters were established to evaluate the specificity binding of RNA aptamers to the PC-3 cell line: (1) aptamer must have a sequence of sizes between 20 to 50 nucleotides and (2) the selection of

14/16 sequências devem basear-se na presença de motivos comuns e (3) as sequências de aptâmeros devem apresentar baixa energia mínima livre (energia livre de Gibbs -AG) o que proporciona dobramento espontâneo das estruturas secundárias.14/16 sequences should be based on the presence of common motifs and (3) the sequences of aptamers should have low minimum free energy (Gibbs -AG free energy) which provides spontaneous folding of secondary structures.

[0051 lAs estratégias utilizadas para validar os aptâmeros selecionados estão descritas abaixo.[0051 lThe strategies used to validate the selected aptamers are described below.

[00521 Microscopia de Fluorescência [0053]0 aptâmero selecionado, Seq. ID N° 04, e uma sequência scramble foram sintetizados com extremidades de biotina por integrated DNA technology (IDT). Para microscopia de fluorescência as células alvo, PC-3; as células de controle negativo, RWPE-1, LNCaP e TPC-1 foram fixadas em placa 35-mm glass bottom com uma solução gelada de acetona-metanol (50% v/v), lavada duas vezes com PBS 1x. As células foram incubadas com o aptâmero e a sequência scramble (500 nM) em 200 μΙ de tampão de ligação a 37°C durante 1 hora. Depois de lavar duas vezes com PBS, incubou-se com 1 pg/ml de estreptavidina-FITC durante 40 minutos a 4°C, as células foram coradas com 4'6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) durante 10 min. Após três lavagens com PBS, imagens de células foram obtidas usando microscópio de fluorescência EVOS, objetiva 20x (Thermo Fisher Scientific).[00521 Fluorescence Microscopy [0053] The selected aptamer, Seq. ID No. 04, and a scramble sequence were synthesized with biotin ends by integrated DNA technology (IDT). For fluorescence microscopy the target cells, PC-3; the negative control cells, RWPE-1, LNCaP and TPC-1 were fixed on a 35-mm glass bottom plate with a cold acetone-methanol solution (50% v / v), washed twice with 1x PBS. The cells were incubated with the aptamer and the scramble sequence (500 nM) in 200 μΙ of binding buffer at 37 ° C for 1 hour. After washing twice with PBS, incubated with 1 pg / ml of streptavidin-FITC for 40 minutes at 4 ° C, cells were stained with 4'6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) for 10 min. After three washes with PBS, cell images were obtained using an EVOS fluorescence microscope, 20x objective (Thermo Fisher Scientific).

[0054]Análise de citometria de fluxo [0055]A especificidade e a afinidade de ligação do aptâmero foi determinada por citometria de fluxo. Para avaliar a especificidade, o aptâmero foi testado em quatro linhagens de células: PC3, LNCaP, RWPE-1, TPC-1 e em células oriundas de biopsia de pacientes com CaP. A sequência de aptâmero foi incubada com 2x10⁵ células a 37°C durante 1 hora em 100 ul de tampão de ligação. Depois de serem lavadas duas vezes com PBS, as células foram incubadas com 1 ug/ml de estreptavidina-FITC durante 40 minutos a 4°C. Em seguida, as células foram analisadas por citometria de fluxo, depois de terem sido lavadas e ressuspensas em 100 ul de tampão de lavagem. Células[0054] Flow cytometry analysis [0055] The specificity and binding affinity of the aptamer was determined by flow cytometry. To assess specificity, the aptamer was tested on four cell lines: PC3, LNCaP, RWPE-1, TPC-1 and on cells from biopsies of patients with CaP. The aptamer sequence was incubated with 2x10 ⁵ cells at 37 ° C for 1 hour in 100 µl of binding buffer. After being washed twice with PBS, cells were incubated with 1 µg / ml streptavidin-FITC for 40 minutes at 4 ° C. Then, the cells were analyzed by flow cytometry, after being washed and resuspended in 100 µl of wash buffer. Cells

15/16 marcadas apenas com estreptavidina-FITC foram utilizadas como controle negativo. A afinidade de ligação do aptâmero A4 à célula alvo, PC-3, foi testada em diferentes concentrações. A média da intensidade de fluorescência das células alvo marcadas com aptâmero foi usada para calcular a afinidade da ligação por subtração da média da intensidade de fluorescência do controle negativo. A constante de dissociação de equilíbrio (Kd) foi obtida pela equação Y = B max X / (Kd + X), usando o software SigmaPlot (Jandel, San Rafael, CA [0056] Tratamento com proteinase K [0057]Para determinar se o aptâmero Seq. ID N° 04 tem como alvo proteínas de superfície de membrana, as células PC-3 foram tratadas com proteinase K. As células cultivadas foram lavadas duas vezes com PBS à temperatura ambiente e dissociadas por 0,05% de tripsina / EDTA. Depois de serem lavadas, 2x10⁵células foram incubadas com 200 pl de 0,1 mg/ml de proteinase K em PBS a 37°C, durante 30 segundos, 1,2 e 10 minutos. O meio completo foi utilizado para parar a reação. Depois de serem lavadas, as células tratadas foram incubadas com o aptâmero Seq. ID N° 04 e submetidos a citometria de fluxo.15/16 labeled only with streptavidin-FITC were used as a negative control. The binding affinity of aptamer A4 to the target cell, PC-3, was tested at different concentrations. The mean fluorescence intensity of the target cells labeled with aptamer was used to calculate the binding affinity by subtracting the mean fluorescence intensity from the negative control. The equilibrium dissociation constant (Kd) was obtained by the equation Y = B max X / (Kd + X), using the SigmaPlot software (Jandel, San Rafael, CA [0056] Proteinase K treatment [0057] To determine if the aptamer Seq. ID No. 04 targets membrane surface proteins, PC-3 cells were treated with proteinase K. The cultured cells were washed twice with PBS at room temperature and dissociated by 0.05% trypsin / EDTA After washing, 2x10 ⁵ cells were incubated with 200 µl of 0.1 mg / ml proteinase K in PBS at 37 ° C for 30 seconds, 1.2 and 10 minutes. The complete medium was used to stop the After being washed, the treated cells were incubated with the Seq. ID No. 04 aptamer and subjected to flow cytometry.

[0058]Detecção em sangue periférico: citometria de fluxo e fluorescência em equipamento portátil [0059]Para determinar o reconhecimento de células tumorais pela Seq. ID N° 04, foi coletado 20 amostras de sangue de pacientes com câncer de próstata. Nestas amostras foi feito a lise de hemácias e 1x10⁵ de células foram incubadas com o aptâmero Seq. ID N° 04 e submetidos a citometria de fluxo e análise de fluorescência em equipamento portátil.[0058] Detection in peripheral blood: flow cytometry and fluorescence in portable equipment [0059] To determine the recognition of tumor cells by Seq. ID No. 04, 20 blood samples were collected from patients with prostate cancer. Red blood cell lysis was performed on these samples and 1x10 ⁵ cells were incubated with the Seq aptamer. ID N ° 04 and submitted to flow cytometry and fluorescence analysis in portable equipment.

[0060]Tratamento de células tumorais PC-3 com complexo terapêutico: aptâmero conjugado à quantum-dot intercalado à doxorrubicina [0061] Para avaliar o efeito terapêutico direcionado de aptâmeros específicos, utilizou-se a linhagem tumoral PC-3 para demonstrar o efeito da liberação controlada pelo aptâmero Seq ID N° 9, ligante tumor-específico, IncRNA PCA3.[0060] Treatment of PC-3 tumor cells with therapeutic complex: aptamer conjugated to quantum-dot intercalated with doxorubicin [0061] To evaluate the targeted therapeutic effect of specific aptamers, the tumor strain PC-3 was used to demonstrate the effect of release controlled by Seq ID No. 9 aptamer, tumor-specific ligand, IncRNA PCA3.

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Assim, foi incubado 1 pg/pL da Seq ID N° 9 com o Qdot 490 ativado (4 nmols) por 4hs sobe agitação leve. Em seguida foi realizado a inativação, incubando o Qdot-CG3 com 180 pl de etanolamina a 100mM, por 1h. A remoção da Seq ID No 9 não ligantes ao Qdot 490 foi removida com o filtro Nanosep (100k), por 10 minutos a 14.000g. O bioconjugado (Qdot-CG3) foi posteriormente acoplado a Doxorubicina (2,8 uM) sob agitação por 30 minutos. Em seguida o complexo Qdot-CG3-Doxorubicina foi acoplado com lipofectamina adicionado a cultura celular em monocamada de células tumorais da próstata (PC-3) e avaliado por microscopia de fluorescência.Thus, 1 pg / pL of Seq ID No. 9 was incubated with Qdot 490 activated (4 nmols) for 4 hours under light agitation. Then the inactivation was performed, incubating the Qdot-CG3 with 180 pl of 100mM ethanolamine, for 1h. The removal of Seq ID No 9 not binding to Qdot 490 was removed with the Nanosep filter (100k), for 10 minutes at 14,000g. The bioconjugate (Qdot-CG3) was subsequently coupled to Doxorubicin (2.8 µM) under stirring for 30 minutes. Then the Qdot-CG3-Doxorubicin complex was coupled with lipofectamine added to the cell culture in a monolayer of prostate tumor cells (PC-3) and evaluated by fluorescence microscopy.

Claims

1 - RNA APTAMERS selected by 3D Cell SELEX characterized by comprising the sequences Seq ID N ² 01 to Seq ID N ² 8.

2- RNA APTAMERS selected by SELEX characterized by comprising the sequences Seq ID N ² 09 to Seq ID N ² 14.

3- APTAMERS according to claim 1, characterized in that they specifically and selectively recognize a cell membrane receptor of prostate tumor cells.

4- APTAMERS according to claim 1, characterized by being used with radioisotope labeling, biotin, PEG (polyethylene glycol), digoxigenin, fluorophores in general, Alexa-Fluor variants with their different wavelengths, quantum-dots, GFP (green fluorescent protein), labeled antibodies, chemical groups, and molecules in general.

5- APTAMERS according to claim 1, characterized by being used to detect target molecules through immunological assays, such as immunoenzymatic tests (such as ELISA, Western Blot, immunofluorescence, immunohistochemistry), immunophenotyping, flow cytometry, electrochemical sensors, among other forms related detection directly or indirectly in prostate tissue samples.

6- APTAMERS according to claim 1, characterized by being used in diagnostic processes, prognosis, or even in pharmacological compositions as a driver of specific drugs for prostate cancer.

APTAMERS according to claim 6, characterized in that the pharmacological composition contains one or more compounds defined by Seq ID N ² 01 to Seq ID N ² 8 and a physiologically acceptable adjuvant.

2/6}

8- APTAMERS according to claims 1, 3, 4 and 5 characterized by being labeled or conjugated to fluorescent agents, colorimetric agents, radioisotopes, luminescent agents, nanocrystals, magnetic nanoparticles for obtaining in vitro or in vivo images, fluorescence detection, luminescence or colorimetry in static or portable equipment, and visualization in microscopes.

9- APTAMERS according to claims 1, 3, 4, 5, 6 and 8, characterized by being used in the composition of contrasts and reagents to obtain in vivo images for the purpose of diagnosis, prognosis of the disease, and for monitoring the effectiveness therapeutic, by means of magnetic resonance, computed tomography, PET (positron emission tomography), or other portable / fixed device for real time detection in vivo.

10- APTAMERS according to claims 1, 3, 4, 5 and 8, characterized by being combined with nanomaterials and reagents for the detection and staging of prostate cancer and therapeutic monitoring for detection in photonic systems associated with RAMAN, FTIR and fluorescence technologies , in electrochemical systems, and for proteomic analysis.

11- APTAMERS according to claims 1, 3 and 8, characterized by being used in magnetic capture to separate exosomes and cells in order to detect other targets and cellular components, proteins, lipids, carbohydrates, nucleic acids.

12- APTAMERS according to claims 1, 3, 8, 10 and 11, characterized by being used in the diagnosis of liquid biopsy in prostate cancer.

13- APTAMERS according to claims 1, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 11 and 12, characterized by being used in combined systems for the diagnosis of specific tumor targets such as DNA, RNA, microRNAs, RNA

3/6 long non-coding (IncRNA; like PCA3), nucleic acids in general, proteins and non-protein antigens associated with prostate tumors by means of electrochemical, photonic detection systems, conjugated chromatographic columns, magnetic separation with fluorescent conjugates or luminescent.

14- APTAMERS according to claims 1, 6 and 7, characterized by being used in combined composition of drugs and other markers for the improvement of therapeutic processes and simultaneous diagnoses, including in the diagnosis of therapeutic monitoring.

15- APTAMERS according to claims 1, 3, 4, 8, 10, 11 and 12, characterized by being used in portable systems with magnetic capture coupled to real-time detection by fluorescence or electrochemistry for the diagnosis of prostate cancer in peripheral blood, prostate biopsy and in serum.

16- APTAMERS according to claims 1, 3, 4, 5, 8, 9, 10, 11 and 12, characterized by being used in the monitoring of disease recurrence, minimal residual disease and therapeutic failure.

17- APTAMERS according to claims 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 and 13, characterized by being used in combination with other markers for diagnostic and therapeutic improvement.

18- APTAMERS according to claims 1, 3, 6 and 7, characterized in that they are used as therapeutic molecules in combinations with anti-tumor, anti-inflammatory drugs, tumor receptor inhibitors, toxins, antibodies, nucleic acids, proteins, lipids , carbohydrates, microRNAs, IncRNAs, liposomes, nanofibers, nanoparticles, and other biocompatible materials.

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19- APTAMERS according to claims 1, 3, 6 and 7, characterized by being used as guides for therapeutic systems and formulations containing conjugated liposomes, carrying drugs or therapeutic formulations internally.

20- APTAMERS according to claims 1, 2, 5, 6 and 18, characterized by being used as drivers of liposomal formulations that carry ligands of the tumor gene IncRNA PCA3, comprised of sequences Seq ID N ² 9 to Seq ID N ² 14 as defined by claim 2.

21- APTAMERS according to claims 1, 2, 3, 6, 7, 19 and 20, characterized in that they are used in liposomal formulations containing PCR3 IncRNA binding aptamers combined with drugs, such as doxorubicin, among others.

22- APTAMERS according to claims 1, 2, 3, 6 and 7, characterized in that they are used in chimeras combined with other aptamers, antibodies (such as anti-CD3), peptides as drivers of both the native immune response and cells with receptors chimeric antigens (CARs).

23- APTAMERS according to claims 1, 3, 6, 7 and 18, characterized in that they are used as conjugates to drugs, toxins, alkaloids (for example Docetaxel), radioisotopes (such as 1131), antibodies and drugs directed directly to tumor cells either as monotherapy or in combination with other medications, such as prednisone, anti-TGF-beta1 antibodies, anti-IL-6 antibodies, pirfenidone, nintedanib (targeted to vascular growth factor-VEGFR receptors), fibroblast growth factor -FGFR and platelet-derived growth factor-PDGFR), sorafenib (targeted at BRAF, CRAF and VEGF receptors), both for the treatment of early prostate tumors and for androgen-refractory metastatic prostate cancer.

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L / 0

24- APTAMERS according to claims 1, 3, 6, 7 and 18, characterized in that they are used as conjugates to checkpoint inhibiting antibodies, such as anti-CTLA-4, anti-PD-1, and anti-PD -L1 in monotherapy or combined for the treatment of initial or advanced tumors.

25- APTAMERS according to claims 1, 3, 4, 7 and 18, characterized in that they are used as conjugates to vaccine antigens, containing NY-ESO-1, PSA, PSMA, TARP, PAP, MUC1, individually or in combination, for stimulate the immune response against prostate tumors.

26- APTAMERS according to claims 1, 3, 6, 7, 18 and 25, characterized in that they are used as conjugates to vaccine antigens and combined with Toll-like 3 receptor agonists.

27- APTAMERS according to claims 1, 3, 6, 7 and 18, characterized by being used as conjugates combined with monoclonal antibodies and drugs, comprised of several biological tumor targets anti-TF (tissue factor), anti-TROP-2 , anti-STEAP-1 and antiIGF.

28- APTAMERS according to claims 1, 3, 6, 7, 18 and 27, characterized in that they are used in conjunction with inhibitors such as enzalutamide or other non-steroidal anti-androgens.

29- APTAMERS according to claims 1, 3, 6, 7 and 18, characterized by being used as liposomal conjugates for targeted release to prostatic tumors with kinase inhibitors, with tyrosine kinase inhibitors (TKIs), such as nilotinib, ERK blockers, and associations with other drugs.

30- APTAMERS according to claims 1, 3, 6, 7, 18 and 19, characterized in that they are used combined or conjugated to inhibitors,

6/6 monoclonal, anti-inflammatory and antibiotic antibodies for the preventive treatment of prostatic tumors, especially directed at patients with benign hyperplasia and prostatitis.

31- APTAMERS according to claims 1, 2, 3 and 6, characterized in that they are used in conjunction with magnetic microparticles for the separation of tumor cells and combined with the sequences fluorophore-labeled Seq ID N ^to 09 to Seq ID Ν ^β 14 tumor diagnosis.

32- APTAMERS according to claims 1, 2, 3, 6, 13, 21, 20 and 31 characterized by being used in combination in various therapies for the diagnosis and therapy of prostate cancer.

33- APTAMERS according to claims 1, 2, 3, 6, 13 and 31, characterized by being used in the detection of prostate cancer in PCR assays for the amplification of the PCR3 IncRNA.