Trousse de diagnostic.
Levin et Bang ont été les premiers à indiquer en
<EMI ID=1.1>
polyphemus) coagule en présence d'une endotoxine bactérienne, dont la quantité détectée a été portée au picogramme
<EMI ID=2.1>
sa sensibilité extrême et de sa spécificité à l'égard des endotoxines, le dosage au moyen du produit de lyse des amibocytes de limule a été appliqué à la détection des endotoxines contaminantes dans les préparations pharmaceutiques et médicaments à usage parentéral utilisés en médecine humaine. En outre, le dosage au moyen du produit de lyse des amibocytes de limule a trouvé des applications cliniques dans le diagnostic précoce de la méningite, des infections urinaires et des syndromes d'urétrite et cervicite.
L'invention concerne un procédé et un appareil de diagnostic de la gonorrhée, en particulier chez l'homme. Bien que des tests de ce genre existent déjà, ils laissent
à désirer en raison de leur complexité, des influences perturbatrices, de la lenteur d'exécution, de leur mauvaise reproductibilité, de leur précision douteuse et des dépenses élevées qu'ils entraînent. Tous ces tests se sont révélés exiger une durée sensible pour l'établissement d'un diagnostic sûr. Beaucoup de ces difficultés sont évitées au moyen du procédé et de l'appareil faisant l'objet de l'invention.
La rapidité et la précision sont améliorées par
la nature de l'épreuve et de l'appareil de diagnostic. Ce test est une épreuve au moyen du produit de lyse dés amibocytes de limule qui s'est révélée particulièrement efficace pour le diagnostic rapide de l'urétrite gonococcique chez l'homme. Diverses épreuves exécutées au moyen du produit de lyse des amibocytes de limule sont expliquées en détail dans British Journal of Venereal Diseases, volume 55, n[deg.] 3,
1979, pages 179 - 182. La prévision par culture de
<EMI ID=3.1>
cité est de 96,3% et la précision d'ensemble est de 98%, ce qui indique que l'épreuve constitue un progrès sensible pour le diagnostic de la gonorrhée.
Les épreuves décrites dans British Journal of Veneral Diseases ci-dessus sont relativement fastidieuses et ne se prêtent pas à.une application clinique pour laquelle la simplicité et la rapidité sont essentielles. Par exemple, les épreuves originales sont exécutées au moyen de tubes à essai et de pipettes en matière plastique pour l'évaluation qualitative du prélèvement. La préparation des tubes à essai, la dilution et l'utilisation des pipettes ne sont pas commodes pour le médecin.
Il est au contraire préférable que le matériel nécessaire pour l'épreuve diagnostique soit emballé dans une trousse contenant un appareil collecteur de prélèvements,
un dispositif de dilution et un réactif à base de produit
de lyse d'amibocytes de limule, de manière que le médecin puisse utiliser ce matériel immédiatement ou après peu de temps, par exemple 30 minutes. La dilution du prélèvement doit être effectuée sans contamination parce que des picogrammes d'endotoxine sont mis en évidence lors du dosage au moyen du produit de lyse d'amibocytes de limule. Le matériel doit en outre être simple et facile à utiliser.
L'invention a pour objet un procédé et un appareil permettant d'arriver aux résultats voulus indiqués ci-dessus d'une manière remarquable qui est efficace, simple, précise et reproductible. Plus spécifiquement, l'invention a pour objet une trousse qui contient tout le matériel nécessaire, notamment les solutions requises pour diluer le prélèvement et en faire le diagnostic après dilution convenable, le tout sans contamination. Les éléments constitutifs de la trousse sont une seringue apyrogène stérile, par exemple une seringue à tuberculine avec une coiffe, un récipient de dilution apyrogène stérile à bouchage frarigible, et une aiguille apyrogène stérile munie d'une gaine ou d'un fourreau, outre une fiole contenant du produit de lyse d'amibocytes de limule lyophilisé pour une seule épreuve.
La seringue est utilisée d'abord sans l'aiguille pour effectuer le prélèvement sous dépression partielle, par traction du piston. D'autres accessoires qui ont été essayés pour la collecte quantitative de l'exsudat à l'urètre sont notamment des tubes capillaires et des sondes de microdilution. Ces accessoires n'ont toutefois pas eu de succès parce que l'exsudat est relativement visqueux et qu'il faut exercer une certaine dépression pour collecter la quantité nécessaire pour une épreuve diagnostique. De plus, les tubes capillaires pointus risquent de blesser le patient. Par conséquent, la seringue à tuberculine sans aiguille s'est révélée préférable pour collecter par dépression l'exsudat à l'urètre sans risque de blesser le patient, tout en conservant une bonne visibilité pendant la collecte du prélèvement.
L'opération de dilution doit être précise, rapide, simple et peu onéreuse tout en évitant la contamination
du prélèvement ou un danger biologique pour l'utilisateur. Il est désirable que le système soit scellé pendant la dilution
du prélèvement et reste scellé pendant le mélange et la dilution jusqu'au moment où le prélèvement est ajouté au produit de lyse. Le dispositif de dilution est un récipient
de diluant muni d'un bouchage frangible. Le dispositif est spécialement conçu pour coopérer avec la seringue de façon
que lorsque celle-ci est insérée dans le dispositif de dilution, après rupture du bouchage frangible, l'étanchéité subsiste entre ces deux éléments pour permettre la dilution
en système clos et en une seule opération. Le diluant est
de l'eau apyrogène stérile ou une solution apyrogène isotonique, par exemple du chlorure de sodium aqueux, etc.
L'aiguille est alors adaptée sur la seringue contenant le prélèvement dilué et,tandis qu'elle est portée par la seringue, est insérée à travers le diaphragme d'une fiole, après quoi une quantité mesurée du prélèvement dilué est introduite dans le produit de lysed'amibocytes de limule que contient la fiole par enfoncement du piston de la seringue.
Dans d'autres formes de réalisation, la conformation de l'aiguille est telle que celle-ci peut être adaptée sur la seringue avant la dilution et permet de rompre le bouchage frangible tandis qu'elle est portée par la seringue. Cette mesure supprime un élément distinct qui serait sinon nécessaire pour rompre le bouchage frangible. Dans l'un et l'autre cas, après que le prélèvement dilué a été débité dans la fiole, le mélange de produit de lyse d'amibocytes de limule et de prélèvement est examiné après environ 30 minutes d'incubation pour déterminer si une gélification s'est opérée. En cas de gélification, l'épreuve fait présumer à
la présence de N. gonorrhoeae.
Lors de la réalisation d'un prélèvement en vue du diagnostic de la cervicite gonococcique ou non gonococcique chez la femme, la collecte d'un prélèvement provenant réellement de l'orifice du col utérin provoque des difficultés supplémentaires. Au laboratoire, des prélèvements peuvent être recueillis à la pipette sous légère dépression, puis dilués dans de l'eau apyrogène. Ces techniques sont acceptables et assurent une sensibilité et une_spécificité élevées [Spagna et al., American Journal of Obstetrics and Gynecology, volume 137, n[deg.] 5, pages 595 - 599, 1980], mais elles ne sont pas applicables pour la pratique médicale courante.
L'utilisation d'une pipette suscite des difficultés en raison de l'emplacement du col utérin et de la variabilité de consistance de l'exsudat. 'De plus, il faut exécuter une série de dilutions qui augmentent le risque d'erreurs et de contamination tant du prélèvement que de la personne qui recueille le prélèvement, parce que celui-ci peut véhiculer des germes dangereux. L'invention vise à éviter ces difficultés et à procurer un dispositif de dilution et de collecte autocontenu que le médecin peut utiliser
au lit du patient. La trousse, tout comme celle conçue pour le diagnostic chez l'homme, comprend le matériel nécessaire pour la collecte du prélèvement au col utérin, pour
la dilution du prélèvement et pour l'épreuve avec le produit de lyse d'amibocytes dans une fiole contenant ce produit de lyse pour une seule épreuve.
Chez la femme, une technique par aspiration permet de recueillir le prélèvement en excès sur la quantité nécessaire, puis de l'amener dans une seringue qui est adaptée ensuite au dispositif de dilution. Cette technique exige toutefois différentes opérations et l'aspiration de l'exsudat du col utérin, bien que possible, devrait être évitée parce qu'elle exige une manipulation supplémentaire, est aléatoire et provoque des contaminations par des endotoxines exogènes. Il est difficile de faire appliquer une technique aussi méticuleuse en pratique médicale courante.
Il serait donc intéressant de disposer d'un procédé qui évite ces inconvénients, qui est bien connu du médecin et que celui-ci peut exécuter rapidement et avec précision pour une dilution rapide et commode. Un procédé que les médecins connaissent bien pour la collecte de prélèvements au col utérin et qui n'expose la patiente à aucun risque consiste à utiliser un écouvillon à tampon d'ouate. L'écouvillon est enfoncé d'un ou deux centimètres dans l'orifice du col utérin. L'ouate est préférée parce qu'elle est mouillable, mais des écouvillons en polyester apyrogène ou autres conviendraient aussi, quoique l'ouate absorbante collecte davantage d'endotoxines. Lorsque le prélèvement a été recueilli dans l'ouate,' il est ensuite utilisé pour le dosage avec le produit de lyse d'amibocytes de limule en vue de déterminer la présence de N. gonorrhoeae.
La discussion générale ci-dessus du procédé et
de l'appareil de l'invention est complétée par une discussion plus détaillée donnée avec référence aux dessins annexés.
Dans les dessins :
Fig. 1 est une vue en élévation de la seringue stérile et de sa coiffe; Fig. 2 est une vue en élévation du dispositif de dilution stérile et de son bouchage; Fig. 3 est une vue en élévation d'une aiguille stérile et de sa gaine; Fig. 4 est une vue d'une fiole de produit de lyse d'amibocytes de limule lyophilisé pour un seul essai; Fig. 5 est une vue, à plus grande échelle, en élévation, du bec de la seringue visible à la Fig. 1 et du col du dispositif de dilution visible à la Fig. 2; Fig. 6 illustre l'utilisation des différents élé- <EMI ID=4.1>
et de dilution du prélèvement; Fig. 7 illustre les stades (e) à (h) de dilution du prélèvement; Fig. 8 illustre les stades (i) à (1) d'introduction du prélèvement dilué dans la fiole de produit de lyse d'amibocytes de limule; Fig. 9 représente un autre dispositif de dilution stérile; Fig. 10 montre un élément permettant de rompre l'opercule du dispositif de la Fig. 9; Fig. 11 montre une autre aiguille; Fig. 12 illustre les stades (a) à (d) de dilution d'un prélèvement au moyen de-l'aiguille de la Fig. 11; Fig. 13 illustre les stades (e) et (f) d'utilisation de l'aiguille de la Fig. 11 et d'introduction du prélèvement dilué dans la fiole de produit de lyse d'amibocytes;
la Fig. 14 montre un écouvillon pour la collecte du prélèvement; Fig. 15 illustre les stades (a) à (d) de dilution <EMI ID=5.1> Fig. 16 illustre les stades (a) et (b) pour une autre forme de réalisation de la seringue et de l'écouvillon.
Les éléments constitutifs de la trousse de diagnostic, comme illustré par les Fig. 1, 2, 3 et 4, comprennent une seringue avec coiffe 10, un dispositif de dilution
<EMI ID=6.1>
préférable d'utiliser une seringue à jeter après usage pour assurer qu'elle soit apyrogène. La seringue 18 comporte
un corps creux 19 et un bec 22. Une marque 21 est apposée sur le corps de seringue 19 pour indiquer un volume de
0,25 ml défini dans la seringue par la cavité depuis le bec jusqu'à la marque. Le bec 22 de la seringue est conique et habituellement couvert d'une coiffe 24. De préférence, la coiffe 24 présente une extrémité pointue fermée 26 et une extrémité ouverte 28,de manière qu'elle puisse recouvrir le bec 22 de la seringue 18.
Le dispositif de dilution 12, comme le montre la Fig. 2, est un dispositif stérile apyrogène de 20 ml comprenant un récipient en matière plastique souple 30 muni d'un bouchage 32 scellé sur le récipient par un joint frangible aisément rompu par torsion du bouchage du récipient. Le liquide contenu dans le récipient 30 est de l'eau apyrogène stérile ou une autre solution aqueuse acceptable. Le bouchage <EMI ID=7.1> l'arracher par torsion du récipient 30. Un prolongement conique 36 fait saillie sur la face supérieure 34 opposée à celle au contact du récipient 30 et est conformé pour s'adapter dans un orifice ou canal du récipient 30, comme décrit plus en détail ci-après.
Bien qu'un dispositif de 20 ml soit représenté, il est évident que la dimension du récipient dépend du volume du prélèvement recueilli et de la sensibilité du dosage. Par exemple, le récipient doit avoir une capacité suffisante pour contenir environ 5 à 20 ml de diluant et
de préférence environ 0,5 à 10 ml du diluant pour une sensibilité du produit de lyse d'amibocytes de limule de 0,25 à 0,5 nanogramme par ml d'endotoxine de référence EC-2.
<EMI ID=8.1>
dont une extrémité est munie d'un adaptateur 40 permettant de la monter sur le bec 22 de la seringue 18. De préférence, l'aiguille gainée 14 est une aiguille 38 stérile, apyrogène, n[deg.] 23 G de 25,4 mm munie d'une gaine de protection 42. La gaine de protection est un corps cylindrique en matière plastique forcé sur l'adaptateur 40 de manière à protéger l'aiguille 38.
La fiole 16 est un tube de verre muni d'un diaphragme supérieur ordinaire 46 qui peut être perforé par l'aiguille 38. Dans le cas illustré à la Fig. 4, la fiole
16 contient du produit de lyse d'amibocytes de limule lyophilisé.
Comme le montre la Fig. 5, le bec 22 et le dispositif de dilution 12 sont spécialement conçus pour assurer
<EMI ID=9.1>
forme d'un cône dont la base 48 fait corps avec la seringue et dont le sommet tronqué 50 facilite l'insertion dans le dispositif de dilution 12. Le bec 22 porte un bourrelet péri-phérique 52 qui améliore l'étanchéité entre la seringue et le dispositif de dilution 12 lorsque le bec est inséré dans le dispositif de dilution. Le dispositif de dilution 12 comporte un col 54 en saillie vers le haut, dans lequel est ménagé un canal 56 dont la forme est sensiblement celle de l'extérieur du bec 22, sauf le bourrelet 52. Spécifiquement, le canal 56 présente un orifice supérieur 58 dont le diamètre est sensiblement identique ou un peu inférieur à celui
<EMI ID=10.1>
dont le diamètre est sensiblement identique ou inférieur à celui du sommet tronqué 50. De cette façon, le canal 56 présente une surface complémentaire s'adaptant sur le bec 22 de la seringue de manière à assurer l'étanchéité entre la seringue et le récipient pendant la dilution du prélèvement. L'opération de dilution est expliquée ci-après dans la description de la forme de réalisation préférée.
Lors de la recherche de la gonorrhée au moyen du
<EMI ID=11.1>
que lorsque la sensibilité est d'environ 0,25 nanogramme d'endotoxine EC-2 étalon par ml, une dilution du prélèvement d'environ 1:400 permet de faire la différence entre une affection provoquée par des gonocoques et une affection d'autre origine. Cette dilution a été déterminée par des études cliniques et peut être exprimée de la façon suivante :
<EMI ID=12.1>
avec
<EMI ID=13.1>
Une épreuve positive au limule égale ou supérieure
à la dilution critique indique l'urétrite gonococcique, tandis qu'une épreuve négative au limule indique uneurétrite non gonococcique. Par exemple, un prélèvement d'exsudat de
<EMI ID=14.1>
viron 10 ml d'eau pour atteindre un rapport de dilution moyen de 1:400 qui conviendrait lorsque le produit de lyse
a une sensibilité de 0,25 nanogramme de EC-2 par ml.
Les dimensions de la seringue étant connues, le calcul indique le niveau exact dans la seringue jusqu' auquel le prélèvement doit être aspiré pour que son volume soit de 0,025 ml.
Le prélèvement dilué est ensuite introduit dans une fiole contenant du produit de lyse, qui est ensuite mis
à incuber et dont la gélification est surveillée. Cette opération, comme expliqué à propos de l'article paru dans British Journal of Venereal Diseases, s'est révélée efficace pour le diagnostic et constitue un progrès sensible dans ce domaine .
La simplicité et la fiabilité de l'épreuve exécutée à l'aide des éléments représentés aux dessins et décrits sont telles qu'elle est applicable au diagnostic et peut être exécutée aisément et avec précision par le médecin. Plus spécifiquement, la seringue stérile apyrogène 18, d'une capacité de 1 ml, est utilisée pour recueillir un prélèvement d'exsudat de l'urètre, normalement chez l'homme, comme illustré à la Fig. 6. La marque 52 sur la seringue indique un volume de 0,025 ml, de sorte qu'il est aisé d'apprécier à quel moment le volume de prélèvement est suffisant.
La seringue 18 est normalement munie d'une coiffe
<EMI ID=15.1>
moment où la coiffe est retirée pour la collecte du prélèvement. Comme indiqué en (a) à (d) à la Fig. 6, après que la
<EMI ID=16.1> au voisinage de l'endroit où il faut opérer le prélèvement. Le piston 20 est alors manoeuvré pour aspirer le prélèvement dans la seringue 18 jusqu'à la marque 52 de 0,025 ml. Une
<EMI ID=17.1>
sans qu'il y ait d'effet défavorable sur les résultats. A ce stade, un volume suffisant est aspiré dans la seringue 18 par la dépression provoquée par le retrait du piston. Le prélèvement est dilué ensuite, avant d'être ajouté au produit de lyse d' amibocytes de limule.
Le diluant est contenu dans le dispositif de dilution 12, qui est stérile et apyrogène et est muni d'un bouchage 32 indiqué à la Fig. 2. Le dispositif de dilution
12 contient de l'eau stérile apyrogène pour la dilution du prélèvement. Ce dispositif de dilution particulier comprend un bouchage frangible qui protège de manière étanche le diluant contenu dans le récipient jusqu'au moment où l'étanchéité est supprimée. Pour donner accès au diluant, comme on le voit en (c) à la Fig. 6, le bouchage 32 est enlevé
<EMI ID=18.1>
de sorte que le joint est rompu. Le bec 22 de la seringue
<EMI ID=19.1>
que le prélèvement puisse être expulsé dans le dispositif 12. pour y être dilué. Comme le montre la Fig. 5, la surface intérieure du canal 56 et la surface extérieure du bec 22
de la seringue 18 sont conçues pour assurer l'étanchéité entre la seringue et le dispositif de dilution pendant que le prélèvement est dilué. De la sorte, la dilution peut être effectuée sans contamination, ni du prélèvement recueilli,
ni de l'opérateur par le prélèvement qui peut contenir des germes dangereux.
Comme indiqué en (d) à la Fig. 6, le piston est enfoncé prudemment pour l'expulsion de l'exsudat dans le récipient. Le dispositif de dilution 12 est alors retourné tandis-qu'il reste adapté à la seringue 18 pour l'achèvement de la dilution. L'opération est exécutée par déplacement du piston 20 de la seringue 18, environ cinq fois de haut en bas, comme montré en (e) à la Fig. 7, le tout sous vive agitation. Après un mélange suffisant, le piston est tiré à nouveau comme indiqué en (f) à la Fig. 7 pour que la seringue se remplisse de prélèvement dilué jusqu'à la marque 21 de
0,25 ml. Après que le dispositif 12 a été retourné, la seringue 18 est retirée de celui-ci par un mouvement de traction avec légère torsion tandis qu'elle contient le prélèvement dilué, comme indiqué en (g) à la Fig. 7. L'opération doit être effectuée sans attouchement du bec 22 de la seringue. Un bouchon est alors appliqué sur le dispositif de dilution par insertion du cône 36 du bouchage 32 dans le col
<EMI ID=20.1>
La fiole contenant le produit de lyse d'amibocytes
<EMI ID=21.1>
diaphragme élastique 46 prévu pour être percé par l'aiguille
38 tout en assurant l'étanchéité. Ce diaphragme 46 est masqué par un couvercle qui le protège contre les poussières, mais qui n'est pas représenté aux figures. Après aspiration de la quantité voulue de prélèvement dilué dans la seringue
18, l'aiguille 38 protégée dans la gaine 42 est montée sur
la seringue 18 par enfoncement direct sur le bec 22. Le frot-
<EMI ID=22.1>
la seringue est suffisant pour immobiliser l'aiguille sur la seringue pendant que l'exsudat est débité dans la fiole contenant le produit de lyse d'amibocytes de limule. Du fait que cette opération est classique en médecine pour l'établissement d'un diagnostic, d'autres détails sur la façon dont l'aiguille est fixée à la seringue ne seront pas précisés ici.
Lorsque l'aiguille est en place, comme indiqué en (i) à la Fig. 8, la gaine 42 est retirée comme indiqué en (j) de manière que l'aiguille soit démasquée pour débiter le prélèvement.
La fiole 44 contenant le produit de lyse d'amibocytes de limule est représentée en (k) de la Fig. 8 après retrait du couvercle. L'aiguille 38 est enfoncée, tandis qu'elle est fixée sur la seringue 18, dans le diaphragme 46 de la fiole et le prélèvement dilué est refoulé dans la fiole par enfoncement du piston 20. L'aiguille et la seringue sont alors retirées et jetées. La fiole 44 contenant le mélange de prélèvement et de produit de lyse d'amibocytes de limule doit être agitée modérément pour la bonne dispersion mutuelle,
<EMI ID=23.1>
observée lorsque la fiole est retournée.
La trousse pour la conduite de l'épreuve diagnostique doit comprendre les différents éléments montrés aux Fig. 1 à 4 qui sont utilisés comme précisé aux Fig. 6 à 8. Néanmoins, il ne s'agit que des formes de réalisation préférées pour la conduite de l'épreuve. D'autres accessoires peuvent être utilisés, à la condition qu'ils permettent la conduite des différentes opérations de collecte, de dilution et de diagnostic sans provoquer .de contamination.
Les Fig. 9 et 10 montrent d'autres éléments qui peuvent être utilisés pour le dispositif de dilution, de même que pour rompre l'opercule. Le dispositif de dilution 61
de la Fig. 9 comprend un récipient 62 de forme généralement cylindrique muni d'un col de raccordement conique 63. Entre le col 63 et le récipient proprement dit 62, une membrane 64 frangible isole le diluant liquide 66 contenu dans le récipient 62 jusqu'à rupture par le perforateur 70 que représente la Fig. 10. Le perforateur 70 comprend une pointe 72
et un corps tubulaire 74 permettant au perforateur 70 d'être tenu par l'utilisateur et forcé dans le col 63 pour la rupture de la membrane 64. Lorsque la membrane est percée, le diluant est mélangé avec le prélèvement recueilli dans la seringue comme indiqué à propos des Fig. 1 à 8 ci-dessus.
Le diamètre intérieur du col 63 est choisi en fonction du diamètre du bec de la seringue pour établir l'étanchéité entre la seringue et le récipient 62 pendant la dilution. En outre, la membrane 64 réalise en fait un coincement, de
sorte qu'au moment où l'utilisateur enfonce le bec 22 de la seringue dans le col 63 du récipient 62, un coincement indique que la seringue est enfoncée de la profondeur voulue
<EMI ID=24.1>
bec 22 de la seringue. De la sorte, des agents pyrogènes n'interviennent pas lors de la dilution et celle-ci est exécutée en milieu apyrogène. L'utilisateur est également protégé contre le risque biologique et la fiabilité de l'épreuve est améliorée. Dans le cas contraire, des agents pyrogènes et autres endotoxines peuvent s'insinuer dans le système et donner lieu à un résultat positif fallacieux.
Lorsque les opérations sont exécutées avec ces autres éléments représentés aux Fig. 9 et 10, le prélèvement ayant été recueilli dans la seringue comme ci-dessus, le piston est'saisi par l'utilisateur et la pointe 72 est enfoncée dans le col 63 du dispositif 61 pour rompre la membrane entre le col et le diluant contenu dans le dispositif. Lorsque la membrane est rompue, le perforateur 70 est retiré et le bec de la seringue est inséré dans le col jusqu'au coincement perçu par l'opérateur. Le piston est alors animé d'un mouvement de va-et-vient pour la dilution du prélèvement, comme indiqué ci-dessus à propos de l'autre dispositif de dilution.
Après dilution convenable, le volume requis de prélèvement dilué est aspiré hors du récipient par le mouvement du piston et la seringue est séparée du dispositif de dilution, puis les opérations sont poursuivies comme indiqué précédemment. En variante, la coiffe 24 de la seringue est conçue de manière à couvrir le bec 22 et, de plus, à rompre la membrane 64 au lieu du perforateur 70. De plus, une telle coiffe pourrait être adaptée sur le dispositif de dilution
61 pour le fermer après que le prélèvement a été dilué et que la seringue a été retirée
Les particularités du matériel de l'invention décrites ci-dessus non seulement facilitent une épreuve qualitative, mais en outre rendent plus simple et plus facile une épreuve quantitative. Par exemple, un bec de pipette, par exemple d'une capacité de 0,05 ml, peut être adapté à l'orifice du dispositif de dilution et une quantité de 0,05 ml de prélèvement dilué peut être déposée sur une plaque de microdilution pour la détermination d'un point final. En prati-
<EMI ID=25.1>
du dispositif de dilution 12 contenant du prélèvement dilué
et le dispositif 12 serait retourné et pressé pour déposer
une goutte (0,05 ml) dans une plaque de microdilution pour effectuer une dilution en série de raison deux, puis une détermination du point final d'endotoxine dans le prélèvement
(voir Journal of Clinical Microbiology, volume 10, pages
394 - 395, 1979).
L'utilisation de la fiole pour épreuve unique dans la trousse pour prélèvement et dilution convient mieux pour des 'épreuves qualitatives et offre l'avantage de la simplicité,
de sorte que le procédé est préféré pour l'examen clinique par le médecin. Le matériel de microdilution convient
mieux pour une étude quantitative et est utile pour évaluer des lots de produits de lyse et déterminer les points d'apparition. Par conséquent, la trousse décrite ci-dessus convient non seulement pour l'essai qualitatif chez le patient, mais également pour des essais quantitatifs.
La Fig. 11 représente un dispositif conçu pour être utilisé conjointement avec la seringue des Fig. 1 à 10, qui supprime deux stades dans l'épreuve diagnostique décrite à propos des figures précédentes. Le dispositif, lorsqu'il est adapté sur le bec 22 de la seringue 18, constitue le moyen de rompre la membrane du récipient et aussi le moyen de donner accès à travers le diaphragme, par exemple de la fiole 44.
Ce dispositif comprend une aiguille en matière plastique relativement courte, mais plus grosse que l'aiguille 38 de la Fig. 3. L'aiguille gainée 80 comprend une aiguille 86 et une gaine 82. Spécifiquement, l'aiguille
86 est une grosse aiguille en matière plastique, stérile, apyrogène, n[deg.] 8 - 16g, de 13 mm, munie d'un cône d'adaptation 84 qui s'applique sur le bec 22 de la seringue. Une gaine 82 est adaptée par-dessus l'aiguille 86, comme la gaine
<EMI ID=26.1> Fig. 10.
Cette aiguille 80 est utilisée pour la conduite de l'épreuve diagnostique de la façon décrite à propos des Fig. l à 10, mais l'élément distinct permettant de rompre la membrane du récipient de dilution est supprimé. En raison de cette similitude, seules quelques opérations de l'utilisation de l'aiguille gainée 80 sont décrites,du fait qu'il est évident que les autres opérations non décrites sont identiques à celles déjà indiquées, ceci afin d'éviter les redondances.
Pour la collecte du prélèvement, l'aiguille gainée
80 est montée sur la seringue 18 immédiatement après que l'exsudat a été collecté chez le patient et reste fixée sur la seringue pendant la dilution dans le dispositif de dilution et l'introduction du prélèvement dans la fiole contenant le produit de lyse d'amibocytes de limule. L'utilisation de l'aiguille gainée 80 est expliquée plus en détail avec référence à la Fig. 12. Après collecte de l'exsudat
à l'urètre, l'aiguille gainée 80 portant la gaine protectrice par-dessus l'aiguille est fixée sur le bec 22 de la seringue 18. La gaine est alors retirée comme indiqué en
(b) à la Fig. 12 de manière que l'aiguille 86 reste en place sur le bec 22. L'aiguille 86 dégagée est alors introduite dans le dispositif de dilution par rupture de la membrane frangible 64 sous laquelle le diluant 66 est conservé de façon étanche dans le dispositif 61, comme indiqué en (c) et
(d). L'aiguille 86 est enfoncée à travers la membrane 64 suffisamment pour que la surface extérieure de l'aiguille
86 assure l'étanchéité avec la membrane 64 tandis que la _surface extérieure 84 vient contre la surface intérieure du col 63 pendant la dilution. Les autres opérations sont les mêmes qu'aux Fig. 7(e) et (f).
Lorsque la dilution est achevée, comme indiqué à
<EMI ID=27.1>
dilué est retirée du récipient de dilution comme indiqué en
(e) à la Fig. 13. Ensuite, l'aiguille 86 est enfoncée dans la fiole de produit de lyse d'amibocytes à travers le diaphragme 46 et le prélèvement dilué est injecté dans la fiole comme indiqué à la Fig. 13(f). Les stades d'incubation sont les mêmes que ceux décrits précédemment. Par conséquent, l'aiguille gainée 80 de plus grand diamètre et faite de matière plastique permet de supprimer le stade de rupture du joint frangible du récipient 61 avant qu'une aiguille soit montée sur le bec 22 de la seringue 18. La suppression de cette opération augmente la vitesse et la précision de l'épreuve et atténue davantage encore le risque de contamination des prélèvements pendant la conduite de l'épreuve.
La trousse décrite ci-dessus permet le diagnostic rapide sur un prélèvement à l'urètre chez l'homme. Certaines particularités sont susceptibles d'une modification aisée pour la conduite de l'épreuve chez la femme. Néanmoins, le prélèvement doit être collecté autrement. Le prélèvement, au lieu d'être aspiré dans la seringue, est absorbé dans un écouvillon et recueilli ainsi dans l'orifice du col utérin. Les éléments utilisés pour recueillir le prélèvement chez la femme et pour ensuite le diluer et enfin l'examiner sont décrits ci-après par analogie avec la description donnée à propos du diagnostic chez l'homme.
L'écouvillon 100 représenté à la Fig. 14 est utilisé conjointement avec la seringue 18 pour recueillir le prélèvement. L'écouvillon 100 comprend un tampon 106 en ouate
ou en une autre matière absorbante convenable dépyrogénée fixée à une extrémité d'une tige 104, qui a une longueur d'environ 3 à 7 cm. La base 102, à l'autre extrémité de la tige
<EMI ID=28.1>
extérieure conique s'ajuste au récipient de dilution et dont la surface intérieure s'ajuste sur le bec 22 de la seringue. La tige 102 est creuse sur toute sa longueur et ouverte à chaque bout, de manière que le tampon 106 communique avec
la base 102. Le dispositif de dilution 108 est suffisamment profond pour recevoir toute la longueur de l'écouvillon 100 lorsque celui-ci est enfoncé dans l'embouchure 105 (Fig. 15).
La Fig. 15 illustre plus en détail la façon d'utili-ser l'écouvillon 100. Avant de recueillir le prélèvement, l'écouvillon 100 est fixé sur le bec 22 de la seringue 18, comme indiqué au stade (b). Les surfaces correspondantes de la base 102 et du bec 22 coopèrent pour retenir l'écouvillon 100 sur la seringue 18 par friction. Pour la collecte du prélèvement, l'extrémité de l'écouvillon 100 est introduite dans l'orifice du col utérin sur une longueur de 1 à 2 cm et le prélèvement est aspiré. Après avoir été recueilli, le prélèvement est dilué dans le dispositif de dilution 108. A
cette fin, l'opercule frangible, qui couvre l'orifice du dispositif de dilution 108 contenant le diluant 110, est d'abord rompu. Le dispositif de dilution 108 présente une embouchure
<EMI ID=29.1>
représenté aux Fig. 2 et 5 pour que l'écouvillon puisse pénétrer dans le récipient et que le col reçoive la base 102 de l'écouvillon 100. Comme on le voit en (c) de la Fig. 15, l'écouvillon est inséré à travers l'opercule frangible rompu dans le récipient de dilution 108 jusqu'à ce que la base 102 forme un joint étanche avec l'embouchure 105 du récipient 108. Le mélange est réalisé par va-et-vient du piston 20 aspirant du diluant dans la seringue 18 et le refoulant de celle-ci en passant par le tampon 106 de l'écouvillon. Après mélange convenable, le piston 20 est manoeuvré pour aspirer dans la seringue 0,2� ml de prélèvement dilué, après quoi la seringue
18 est séparée de l'écouvillon 100, qui reste fixé au récipient de dilution 108, comme indiqué en (d). Les opérations suivantes pour le dosage sont les mêmes que celles illustrées par
la Fig. 8, en (i), (j), (k) et CI), où une aiguille est montée sur le bec 22 de la seringue et le prélèvement dilué est ensuite introduit dans la fiole de produit de lyse d'amibocytes de limule et mis à incuber comme décrit.
La Fig. 16 représente un autre dispositif pour la trousse d'examen de la femme qui supprime la nécessité d'une aiguille 14 distincte dans la Fig. 3 ou 11. La seringue porte par construction l'aiguille courte déjà fixée,laquelle, après la dilution, sert à perforer le diaphragme de caoutchouc comme illustré en (f) à la Fig. 13. La seringue 18 comprend un bec 116 qui comporte une plus grosse aiguille
120 semblable à l'aiguille 86 de la Fig. 13, mais faisant corps avec la seringue 18. L'aiguille intermédiaire 120 se continue dans le reste de la seringue par un. adaptateur 118 de forme semb lable- à celle- du bec 22. L'écouvillon
122 est conçu pour coopérer avec la seringue 18 de façon que
<EMI ID=30.1>
recevoir tant l'aiguille que l'adaptateur 118 du bec 116 pour établir l'étanchéité. Le reste de l'écouvillon 122, sensiblement identique à l'écouvillon 100 décrit avec référence
<EMI ID=31.1>
mité opposée à la base 124 un tampon de coton 130.
Pour la collecte d'un prélèvement, l'écouvillon 122 est monté sur le bec 116 d'une manière semblable à celle
<EMI ID=32.1>
lèvement à l'orifice du col utérin et dilution comme ci-dessus et après que l'écouvillon a été détaché, la seringue peut être utilisée pour introduire le prélèvement dilué dans la fiole de produit de lyse d'amibocytes de limule par simple perforation du diaphragme comme indiqué en �f) de la Fig. 13
à propos du matériel pour examen de l'homme. L'écouvillon 122 peut être présenté dans la trousse déjà monté sur la seringue, de sorte qu'aucune opération d'assemblage ne doit précéder
la collecte du prélèvement. De la sorte, l'insertion de la seringue dans l'écouvillon et le risque de contamination qui en résulte sont supprimés.
Les résultats indiquent que.le volume de diluant pour l'examen chez la femme doit être d'environ 5 à 30 ml d'eau pour un produit de lyse ayant la sensibilité minimum d'environ 0,25 nanogramme par ml EC-2 et que le diluant peut contenir un agent dispersant, par exemple du Pyrosperse en solution à 5%'
Les tampons des écouvillons doivent être dépyrogénés afin que les écouvillons soient exempts de toute endotoxine au seuil de sensibilité retenu. Cette dépyrogénation peut être obtenue par chauffage des écouvillons à une température relativement élevée pendant un temps suffisant. Par exemple, le chauffage des écouvillons à environ 200[deg.]C pendant environ 30 minutes les rend sensiblement exempts d'endotoxines pour le seuil de sensibilité propre au produit de lyse d'amibocytes de limule. D'autres moyens conviennent évidemment aux mêmes fins, par exemple l'exposition à l'oxyde d'éthylène ou au rayonnement du cobalt radio-actif.
L'appareil à écouvillons et le système de dilution scellé décrits ci-dessus peuvent être utilisés également chez l'homme lorsque l'exsudat à l'urètre n'est pas suffisamment abondant pour appliquer le premier procédé décrit. Dans ce cas, bien qu'il soit possible d'utiliser un écouvillon tel que celui de la Fig. 15, la dimension du tampon de coton doit normalement être réduite, le tampon étant porté par une tige dont les dimensions sont voisines de celles d'une aiguille de 25,4 mm, n[deg.] 21 à 23. Le récipient de dilution, de même que le volume de son contenu, doivent être réduits en proportion. Sauf pour ce qui est de la collecte proprement dite du prélèvement, toutes les autres opérations sont identiques à celles décrites ci-dessus à propos de l'examen de la femme.
REVENDICATIONS
1.- Trousse de diagnostic, caractérisée en ce qu'elle comprend :
(a) une seringue dont le bec comporte un orifice pour extraire, par dépression, un prélèvement à examiner et expulser le prélèvement en surpression;
(b) un dispositif de dilution scellé contenant une quantité choisie au préalable d'un diluant pour diluer le prélèvement, le dispositif comportant un orifice donnant accès au diluant;
(c) le bec étant adaptable au dispositif pour recevoir du diluant du dispositif de dilution;
(d) une aiguille propre à être fixée sur le bec de la seringue;
(e) une fiole qui contient un réactif et qui est munie d'un diaphragme qui peut être percé par l'aiguille, et
(f) l'aiguille ayant une longueur suffisante pour traverser le diaphragme et constituer pour le prélèvement dilué un trajet jusqu'au réactif contenu dans la fiole.
Diagnostic kit.
Levin and Bang were the first to indicate in
<EMI ID = 1.1>
polyphemus) coagulates in the presence of a bacterial endotoxin, the detected amount of which has been increased to the picogram
<EMI ID = 2.1>
Because of its extreme sensitivity and its specificity with regard to endotoxins, the assay by means of the lysing product of horseshoe crab amoebocytes has been applied to the detection of contaminating endotoxins in pharmaceutical preparations and parenteral drugs used in human medicine. In addition, dosing with the lyule product of horseshoe crab amoebocytes has found clinical applications in the early diagnosis of meningitis, urinary tract infections and urethritis and cervicitis syndromes.
The invention relates to a method and an apparatus for diagnosing gonorrhea, in particular in humans. Although tests of this kind already exist, they leave
to be desired due to their complexity, disruptive influences, slow execution, poor reproducibility, questionable precision and the high costs involved. All of these tests have been found to require significant time to establish a safe diagnosis. Many of these difficulties are avoided by means of the method and the apparatus which are the subject of the invention.
Speed and accuracy are improved by
the nature of the test and the diagnostic device. This test is a test using the product of lime amoebocytes which has proved particularly effective for the rapid diagnosis of gonococcal urethritis in humans. Various tests performed using the horseshoe crab amoeocyte lysis product are explained in detail in the British Journal of Venereal Diseases, volume 55, n [deg.] 3,
1979, pages 179 - 182. The forecast by crop of
<EMI ID = 3.1>
cited is 96.3% and the overall accuracy is 98%, which indicates that the test constitutes significant progress in the diagnosis of gonorrhea.
The tests described in the British Journal of Veneral Diseases above are relatively tedious and do not lend themselves to clinical application where simplicity and speed are essential. For example, the original tests are performed using plastic test tubes and pipettes for the qualitative assessment of the sample. The preparation of test tubes, dilution and the use of pipettes are not convenient for the doctor.
On the contrary, it is preferable that the equipment necessary for the diagnostic test is packed in a kit containing a sample collection device,
a dilution device and a product-based reagent
lysis of horseshoe crab amibocytes, so that the doctor can use this material immediately or after a short time, for example 30 minutes. The dilution of the sample must be carried out without contamination because endotoxin picograms are highlighted during the assay using the horseshoe crab lysis product. The equipment should also be simple and easy to use.
The subject of the invention is a method and an apparatus for achieving the desired results indicated above in a remarkable manner which is efficient, simple, precise and reproducible. More specifically, the subject of the invention is a kit which contains all the necessary equipment, in particular the solutions required to dilute the sample and make the diagnosis after suitable dilution, all without contamination. The components of the kit are a sterile pyrogen-free syringe, for example a tuberculin syringe with a cap, a sterile pyrogen-free dilution container with a frangible closure, and a sterile pyrogenic needle provided with a sheath or a sheath, in addition to a vial containing lyophilized horsetail amoeocyte lysis product for a single test.
The syringe is used first without the needle to take the sample under partial vacuum, by pulling the piston. Other accessories that have been tried for quantitative collection of exudate from the urethra include capillary tubes and microdilution probes. However, these accessories have not been successful because the exudate is relatively viscous and it is necessary to exert a certain depression to collect the quantity necessary for a diagnostic test. In addition, sharp capillary tubes can injure the patient. Consequently, the needleless tuberculin syringe has proved preferable for collecting the exudate from the urethra by depression without risk of injuring the patient, while maintaining good visibility while collecting the sample.
The dilution operation must be precise, rapid, simple and inexpensive while avoiding contamination
of the sample or a biological danger for the user. It is desirable that the system be sealed during dilution
of the sample and remains sealed during mixing and dilution until the sample is added to the lysis product. The dilution device is a container
thinner with a frangible stopper. The device is specially designed to cooperate with the syringe so
that when the latter is inserted into the dilution device, after rupture of the frangible closure, the seal remains between these two elements to allow dilution
in a closed system and in a single operation. The diluent is
sterile pyrogen-free water or an isotonic pyrogen-free solution, for example aqueous sodium chloride, etc.
The needle is then fitted onto the syringe containing the diluted sample and, while it is carried by the syringe, is inserted through the diaphragm of a vial, after which a measured amount of the diluted sample is introduced into the product. horseshoe crab lysed in the vial by depressing the syringe plunger.
In other embodiments, the shape of the needle is such that it can be adapted on the syringe before dilution and makes it possible to break the frangible blockage while it is carried by the syringe. This removes a separate item that would otherwise be necessary to break the frangible blockage. In either case, after the diluted sample has been dispensed from the vial, the mixture of horseshoe crab lysis product and sample is examined after approximately 30 minutes of incubation to determine whether gelling was operated. In the event of gelation, the test presumes that
the presence of N. gonorrhoeae.
When taking a sample for the diagnosis of gonococcal or non-gonococcal cervicitis in women, the collection of a sample actually coming from the orifice of the cervix causes additional difficulties. In the laboratory, samples can be collected by pipette under slight vacuum, then diluted in pyrogen-free water. These techniques are acceptable and provide high sensitivity and specificity [Spagna et al., American Journal of Obstetrics and Gynecology, volume 137, n [deg.] 5, pages 595 - 599, 1980], but they are not applicable for the current medical practice.
The use of a pipette causes difficulties due to the location of the cervix and the variability of consistency of the exudate. 'In addition, a series of dilutions must be carried out which increase the risk of errors and contamination both of the sample and of the person collecting the sample, because it can carry dangerous germs. The invention aims to avoid these difficulties and to provide a self-contained dilution and collection device which the doctor can use.
to the patient's bed. The kit, like the one designed for human diagnosis, includes the equipment necessary for collecting the cervical specimen, for
dilution of the sample and for the test with the amoebic lysis product in a vial containing this lysis product for a single test.
In women, a suction technique collects the excess sample over the required amount, then brings it into a syringe which is then adapted to the dilution device. However, this technique requires different operations and aspiration of cervical exudate, although possible, should be avoided because it requires additional manipulation, is random and causes contamination with exogenous endotoxins. It is difficult to apply such a meticulous technique in everyday medical practice.
It would therefore be advantageous to have a method which avoids these drawbacks, which is well known to the doctor and which he can execute quickly and precisely for rapid and convenient dilution. One procedure that doctors are familiar with for collecting cervical samples and which does not expose the patient to any risk is to use a cotton swab. The swab is inserted one or two centimeters into the opening of the cervix. Cotton wool is preferred because it is wettable, but pyrogen-free or other polyester swabs would also be suitable, although absorbent cotton collects more endotoxin. When the sample has been collected in the cotton wool, it is then used for the assay with the lime amoebocyte lysis product in order to determine the presence of N. gonorrhoeae.
The above general discussion of the process and
of the apparatus of the invention is supplemented by a more detailed discussion given with reference to the accompanying drawings.
In the drawings:
Fig. 1 is an elevational view of the sterile syringe and its cap; Fig. 2 is an elevational view of the sterile dilution device and its closure; Fig. 3 is an elevational view of a sterile needle and its sheath; Fig. 4 is a view of a vial of lyophilized horseshoe crab amoeocyte lysis product for a single test; Fig. 5 is a view, on a larger scale, in elevation, of the nozzle of the syringe visible in FIG. 1 and the neck of the dilution device visible in FIG. 2; Fig. 6 illustrates the use of the various elements <EMI ID = 4.1>
and dilution of the sample; Fig. 7 illustrates the stages (e) to (h) of dilution of the sample; Fig. 8 illustrates the stages (i) to (1) of introduction of the diluted sample into the vial of horseshoe crab lysis product; Fig. 9 shows another sterile dilution device; Fig. 10 shows an element making it possible to break the cover of the device of FIG. 9; Fig. 11 shows another needle; Fig. 12 illustrates the stages (a) to (d) of dilution of a sample by means of the needle of FIG. 11; Fig. 13 illustrates the stages (e) and (f) of use of the needle of FIG. 11 and introduction of the diluted sample into the vial of amoebic lysis product;
Fig. 14 shows a swab for collecting the sample; Fig. 15 illustrates stages (a) to (d) of dilution <EMI ID = 5.1> Fig. 16 illustrates stages (a) and (b) for another embodiment of the syringe and the swab.
The components of the diagnostic kit, as shown in Figs. 1, 2, 3 and 4, include a syringe with cap 10, a dilution device
<EMI ID = 6.1>
it is best to use a disposable syringe to ensure that it is pyrogen-free. Syringe 18 has
a hollow body 19 and a spout 22. A mark 21 is affixed on the syringe body 19 to indicate a volume of
0.25 ml defined in the syringe by the cavity from the spout to the mark. The nozzle 22 of the syringe is conical and usually covered with a cap 24. Preferably, the cap 24 has a closed pointed end 26 and an open end 28, so that it can cover the nozzle 22 of the syringe 18.
The dilution device 12, as shown in FIG. 2, is a 20 ml sterile pyrogen-free device comprising a flexible plastic container 30 provided with a closure 32 sealed on the container by a frangible seal easily broken by twisting the closure of the container. The liquid in container 30 is sterile pyrogen-free water or other acceptable aqueous solution. The corking <EMI ID = 7.1> twist it out of the container 30. A conical extension 36 protrudes from the upper face 34 opposite to that in contact with the container 30 and is shaped to fit in an orifice or channel of the container 30, as described in more detail below.
Although a 20 ml device is shown, it is obvious that the size of the container depends on the volume of the sample collected and the sensitivity of the assay. For example, the container should have sufficient capacity to hold approximately 5 to 20 ml of diluent and
preferably approximately 0.5 to 10 ml of the diluent for a sensitivity of the lime amoebocyte lysis product of 0.25 to 0.5 nanogram per ml of reference endotoxin EC-2.
<EMI ID = 8.1>
one end of which is provided with an adapter 40 enabling it to be mounted on the nozzle 22 of the syringe 18. Preferably, the sheathed needle 14 is a sterile, pyrogen-free needle 38, n [deg.] 23 G of 25.4 mm provided with a protective sheath 42. The protective sheath is a cylindrical plastic body forced onto the adapter 40 so as to protect the needle 38.
The vial 16 is a glass tube provided with an ordinary upper diaphragm 46 which can be perforated by the needle 38. In the case illustrated in FIG. 4, the vial
16 contains lyophilized horseshoe crab amoeocyte lysis product.
As shown in Fig. 5, the spout 22 and the dilution device 12 are specially designed to ensure
<EMI ID = 9.1>
shape of a cone, the base 48 of which forms a body with the syringe and the truncated top 50 of which facilitates insertion into the dilution device 12. The spout 22 carries a peripheral ring 52 which improves the seal between the syringe and the dilution device 12 when the spout is inserted into the dilution device. The dilution device 12 comprises a neck 54 projecting upwards, in which a channel 56 is formed, the shape of which is substantially that of the outside of the spout 22, except for the bead 52. Specifically, the channel 56 has an upper orifice 58 whose diameter is substantially identical to or slightly less than that
<EMI ID = 10.1>
the diameter of which is substantially identical to or less than that of the truncated apex 50. In this way, the channel 56 has a complementary surface which fits over the nozzle 22 of the syringe so as to seal between the syringe and the container during dilution of the sample. The dilution operation is explained below in the description of the preferred embodiment.
When looking for gonorrhea using the
<EMI ID = 11.1>
that when the sensitivity is approximately 0.25 nanogram of standard EC-2 endotoxin per ml, a dilution of the sample of approximately 1: 400 makes it possible to differentiate between a condition caused by gonococci and a condition of other origin. This dilution has been determined by clinical studies and can be expressed as follows:
<EMI ID = 12.1>
with
<EMI ID = 13.1>
A positive trial with equal or greater horseshoe crab
at critical dilution indicates gonococcal urethritis, while a negative test with a horseshoe crab indicates non-gonococcal urethritis. For example, an exudate sample of
<EMI ID = 14.1>
about 10 ml of water to reach an average dilution ratio of 1: 400 which would be suitable when the lysis product
has a sensitivity of 0.25 nanograms of EC-2 per ml.
The dimensions of the syringe being known, the calculation indicates the exact level in the syringe up to which the sample must be aspirated so that its volume is 0.025 ml.
The diluted sample is then introduced into a flask containing lysis product, which is then put
to incubate and whose gelling is monitored. This operation, as explained in connection with the article published in British Journal of Venereal Diseases, has proved to be effective for diagnosis and constitutes significant progress in this area.
The simplicity and reliability of the test performed using the elements shown in the drawings and described are such that it is applicable to the diagnosis and can be performed easily and precisely by the doctor. More specifically, the sterile pyrogen-free syringe 18, with a capacity of 1 ml, is used to collect a sample of exudate from the urethra, normally in humans, as illustrated in FIG. 6. The mark 52 on the syringe indicates a volume of 0.025 ml, so that it is easy to appreciate when the volume of the sample is sufficient.
Syringe 18 is normally fitted with a cap
<EMI ID = 15.1>
when the cap is removed for collection of the sample. As shown in (a) to (d) in Fig. 6, after the
<EMI ID = 16.1> in the vicinity of the place where the sample must be taken. The piston 20 is then maneuvered to aspirate the sample in the syringe 18 up to the mark 52 of 0.025 ml. A
<EMI ID = 17.1>
without any adverse effect on the results. At this stage, a sufficient volume is drawn into the syringe 18 by the depression caused by the withdrawal of the piston. The sample is then diluted, before being added to the lime amoebocyte lysis product.
The diluent is contained in the dilution device 12, which is sterile and pyrogen-free and is provided with a stopper 32 indicated in FIG. 2. The dilution device
12 contains sterile pyrogen-free water for diluting the sample. This particular dilution device includes a frangible stopper which sealingly protects the diluent contained in the container until the sealing is removed. To give access to the diluent, as seen in (c) in Fig. 6, the plug 32 is removed
<EMI ID = 18.1>
so the seal is broken. Spout 22 of the syringe
<EMI ID = 19.1>
that the sample can be expelled into the device 12. to be diluted there. As shown in Fig. 5, the inner surface of the channel 56 and the outer surface of the spout 22
syringe 18 are designed to seal between the syringe and the dilution device while the sample is diluted. In this way, the dilution can be carried out without contamination, or the sample collected,
nor of the operator by the sample which can contain dangerous germs.
As shown in (d) in Fig. 6, the piston is carefully pushed in to expel the exudate into the container. The dilution device 12 is then returned while it remains adapted to the syringe 18 for the completion of the dilution. The operation is carried out by moving the piston 20 of the syringe 18, about five times from top to bottom, as shown in (e) in FIG. 7, all under vigorous agitation. After sufficient mixing, the piston is pulled again as indicated in (f) in Fig. 7 so that the syringe is filled with diluted sample up to the mark 21 of
0.25 ml. After the device 12 has been turned over, the syringe 18 is withdrawn therefrom by a pulling movement with slight twist while it contains the diluted sample, as indicated in (g) in FIG. 7. The operation must be carried out without touching the nozzle 22 of the syringe. A stopper is then applied to the dilution device by inserting the cone 36 of the stopper 32 into the neck
<EMI ID = 20.1>
The vial containing the amoebic lysis product
<EMI ID = 21.1>
elastic diaphragm 46 designed to be pierced by the needle
38 while ensuring sealing. This diaphragm 46 is masked by a cover which protects it against dust, but which is not shown in the figures. After aspiration of the desired amount of diluted sample into the syringe
18, the needle 38 protected in the sheath 42 is mounted on
the syringe 18 by direct insertion on the spout 22. The friction
<EMI ID = 22.1>
the syringe is sufficient to immobilize the needle on the syringe while the exudate is dispensed into the vial containing the horseshoe crab lysis product. Since this operation is conventional in medicine for establishing a diagnosis, other details on how the needle is attached to the syringe will not be specified here.
When the needle is in place, as shown in (i) in Fig. 8, the sheath 42 is removed as indicated in (j) so that the needle is unmasked to debit the sample.
The flask 44 containing the horseshoe crab lysis product is shown in (k) of FIG. 8 after removing the cover. The needle 38 is inserted, while it is fixed on the syringe 18, in the diaphragm 46 of the vial and the diluted sample is discharged into the vial by depressing the piston 20. The needle and the syringe are then withdrawn and piers. The flask 44 containing the mixture of sample and lime amoebocyte lysis product must be shaken moderately for good mutual dispersion,
<EMI ID = 23.1>
observed when the vial is inverted.
The kit for the conduct of the diagnostic test must include the various elements shown in Figs. 1 to 4 which are used as specified in Figs. 6 to 8. However, these are only the preferred embodiments for the conduct of the test. Other accessories may be used, provided that they allow the various collection, dilution and diagnostic operations to be carried out without causing contamination.
Figs. 9 and 10 show other elements which can be used for the dilution device, as well as for breaking the cover. The dilution device 61
of Fig. 9 comprises a container 62 of generally cylindrical shape provided with a conical connection neck 63. Between the neck 63 and the container itself 62, a frangible membrane 64 isolates the liquid diluent 66 contained in the container 62 until rupture by the perforator 70 shown in FIG. 10. The perforator 70 comprises a point 72
and a tubular body 74 allowing the perforator 70 to be held by the user and forced into the neck 63 for the rupture of the membrane 64. When the membrane is pierced, the diluent is mixed with the sample collected in the syringe as indicated about Figs. 1 to 8 above.
The internal diameter of the neck 63 is chosen as a function of the diameter of the nozzle of the syringe to establish the seal between the syringe and the container 62 during dilution. In addition, the membrane 64 in fact achieves a wedging,
so that when the user pushes the nozzle 22 of the syringe into the neck 63 of the container 62, a wedge indicates that the syringe is pushed in the desired depth
<EMI ID = 24.1>
nozzle 22 of the syringe. In this way, pyrogenic agents do not intervene during the dilution and the latter is carried out in a pyrogen-free medium. The user is also protected against biological risk and the reliability of the test is improved. Otherwise, pyrogens and other endotoxins can creep into the system and give rise to a false positive result.
When the operations are carried out with these other elements shown in FIGS. 9 and 10, the sample having been collected in the syringe as above, the plunger is entered by the user and the tip 72 is pressed into the neck 63 of the device 61 to break the membrane between the neck and the diluent contained in the device. When the membrane is ruptured, the perforator 70 is removed and the nozzle of the syringe is inserted into the neck until the operator perceives it to be jammed. The piston is then moved back and forth for diluting the sample, as indicated above with respect to the other dilution device.
After suitable dilution, the required volume of diluted sample is drawn out of the container by the movement of the piston and the syringe is separated from the dilution device, then the operations are continued as indicated above. As a variant, the cap 24 of the syringe is designed so as to cover the spout 22 and, moreover, to rupture the membrane 64 instead of the perforator 70. In addition, such a cap could be adapted on the dilution device
61 to close it after the sample has been diluted and the syringe has been withdrawn
The peculiarities of the material of the invention described above not only facilitate a qualitative test, but also make it simpler and easier a quantitative test. For example, a pipette spout, for example with a capacity of 0.05 ml, can be adapted to the orifice of the dilution device and an amount of 0.05 ml of diluted sample can be deposited on a microdilution plate for determining an end point. In practice
<EMI ID = 25.1>
of the dilution device 12 containing the diluted sample
and device 12 would be turned over and pressed to deposit
a drop (0.05 ml) in a microdilution plate to carry out a serial dilution of reason two, then a determination of the endotoxin end point in the sample
(see Journal of Clinical Microbiology, volume 10, pages
394 - 395, 1979).
The use of the vial for single test in the sample and dilution kit is better suited for qualitative tests and offers the advantage of simplicity,
so the method is preferred for clinical examination by the doctor. Microdilution equipment suitable
best for quantitative study and is useful for evaluating lots of lysis products and determining points of onset. Therefore, the kit described above is suitable not only for qualitative testing in the patient, but also for quantitative testing.
Fig. 11 shows a device designed to be used in conjunction with the syringe of FIGS. 1 to 10, which eliminates two stages in the diagnostic test described in connection with the preceding figures. The device, when fitted on the nozzle 22 of the syringe 18, constitutes the means of breaking the membrane of the container and also the means of providing access through the diaphragm, for example from the vial 44.
This device comprises a relatively short plastic needle, but larger than the needle 38 of FIG. 3. The sheathed needle 80 comprises a needle 86 and a sheath 82. Specifically, the needle
86 is a large, sterile, pyrogen-free plastic needle, n [deg.] 8 - 16g, 13 mm, fitted with an adapter cone 84 which is applied to the nozzle 22 of the syringe. A sheath 82 is fitted over the needle 86, like the sheath
<EMI ID = 26.1> Fig. 10.
This needle 80 is used for the conduct of the diagnostic test as described with reference to FIGS. l to 10, but the separate element for breaking the membrane of the dilution container is deleted. Because of this similarity, only a few operations of the use of the sheathed needle 80 are described, since it is obvious that the other operations not described are identical to those already indicated, this in order to avoid redundancies.
For collecting the sample, the sheathed needle
80 is mounted on syringe 18 immediately after the exudate has been collected from the patient and remains fixed on the syringe during dilution in the dilution device and the introduction of the sample into the vial containing the amoebic lysis product horseshoe crab. The use of the sheathed needle 80 is explained in more detail with reference to FIG. 12. After collecting the exudate
at the urethra, the sheathed needle 80 carrying the protective sheath over the needle is fixed on the nozzle 22 of the syringe 18. The sheath is then withdrawn as indicated in
(b) in Fig. 12 so that the needle 86 remains in place on the spout 22. The released needle 86 is then introduced into the dilution device by rupture of the frangible membrane 64 under which the diluent 66 is kept tightly in the device 61 , as indicated in (c) and
(d). The needle 86 is pushed through the membrane 64 enough so that the outer surface of the needle
86 seals with the membrane 64 while the outer surface 84 comes against the inner surface of the neck 63 during dilution. The other operations are the same as in Figs. 7 (e) and (f).
When dilution is complete, as indicated in
<EMI ID = 27.1>
diluted is removed from the dilution container as indicated in
(e) in Fig. 13. Next, the needle 86 is inserted into the vial of amoebocyte lysis product through the diaphragm 46 and the diluted sample is injected into the vial as shown in FIG. 13 (f). The incubation stages are the same as those described above. Consequently, the sheathed needle 80 of larger diameter and made of plastic makes it possible to eliminate the stage of rupture of the frangible seal of the container 61 before a needle is mounted on the spout 22 of the syringe 18. The elimination of this operation increases the speed and accuracy of the test and further reduces the risk of contamination of samples during the test.
The kit described above allows rapid diagnosis on a sample from the urethra in men. Certain particularities are susceptible of an easy modification for the conduct of the test in women. However, the levy must be collected otherwise. Instead of being drawn into the syringe, the sample is absorbed into a swab and collected in the orifice of the cervix. The elements used to collect the sample from women and then to dilute it and finally examine it are described below by analogy with the description given with regard to the diagnosis in men.
The swab 100 shown in FIG. 14 is used in conjunction with the syringe 18 to collect the sample. Swab 100 includes a cotton pad 106
or some other suitable depyrogenic absorbent material attached to one end of a rod 104, which is about 3 to 7 cm long. Base 102, at the other end of the rod
<EMI ID = 28.1>
conical outer adjusts to the dilution container and the inner surface adjusts to the nozzle 22 of the syringe. The rod 102 is hollow over its entire length and open at each end, so that the pad 106 communicates with
the base 102. The dilution device 108 is deep enough to receive the entire length of the swab 100 when it is pressed into the mouth 105 (Fig. 15).
Fig. 15 illustrates in more detail how to use the swab 100. Before collecting the sample, the swab 100 is fixed on the nozzle 22 of the syringe 18, as indicated in step (b). The corresponding surfaces of the base 102 and the spout 22 cooperate to retain the swab 100 on the syringe 18 by friction. To collect the sample, the end of the swab 100 is introduced into the orifice of the cervix over a length of 1 to 2 cm and the sample is aspirated. After being collected, the sample is diluted in the dilution device 108. A
To this end, the frangible cover, which covers the orifice of the dilution device 108 containing the diluent 110, is first broken. The dilution device 108 has a mouthpiece
<EMI ID = 29.1>
shown in Figs. 2 and 5 so that the swab can enter the container and the neck receives the base 102 of the swab 100. As seen in (c) of FIG. 15, the swab is inserted through the broken frangible cover into the dilution container 108 until the base 102 forms a tight seal with the mouth 105 of the container 108. The mixing is carried out by back-and-forth comes from the piston 20 sucking the diluent into the syringe 18 and pushing it from the latter through the buffer 106 of the swab. After proper mixing, the plunger 20 is maneuvered to draw into the syringe 0.2 # ml of diluted sample, after which the syringe
18 is separated from the swab 100, which remains attached to the dilution container 108, as indicated in (d). The following operations for dosing are the same as those illustrated by
Fig. 8, in (i), (j), (k) and CI), where a needle is mounted on the nozzle 22 of the syringe and the diluted sample is then introduced into the vial of horseshoe crab lysis product and incubated as described.
Fig. 16 shows another device for the woman's examination kit which eliminates the need for a separate needle 14 in FIG. 3 or 11. The syringe carries by construction the short needle already fixed, which, after dilution, is used to perforate the rubber diaphragm as illustrated in (f) in FIG. 13. The syringe 18 includes a spout 116 which has a larger needle
120 similar to needle 86 of FIG. 13, but integral with the syringe 18. The intermediate needle 120 is continued in the rest of the syringe by one. adapter 118 of form semb lable- to that of the spout 22. The swab
122 is designed to cooperate with the syringe 18 so that
<EMI ID = 30.1>
receive both the needle and the adapter 118 from the nozzle 116 to establish the seal. The rest of the swab 122, substantially identical to the swab 100 described with reference
<EMI ID = 31.1>
mite opposite the base 124 a cotton pad 130.
For collecting a sample, the swab 122 is mounted on the spout 116 in a manner similar to that
<EMI ID = 32.1>
sampling at the cervical os and diluting as above and after the swab has been detached, the syringe can be used to introduce the diluted sample into the vial of horseshoe crab lysis product by simple perforation of the diaphragm as shown in � f) of Fig. 13
about the material for human examination. Swab 122 can be presented in the kit already mounted on the syringe, so that no assembly operation should precede
collection of the sample. In this way, the insertion of the syringe into the swab and the risk of contamination which results therefrom is eliminated.
The results indicate that the volume of diluent for the examination in women must be approximately 5 to 30 ml of water for a lysis product having the minimum sensitivity of approximately 0.25 nanograms per ml EC-2 and that the diluent may contain a dispersing agent, for example Pyrosperse in 5% solution '
The swab pads must be depyrogenated so that the swabs are free of any endotoxin at the selected sensitivity threshold. This depyrogenation can be obtained by heating the swabs at a relatively high temperature for a sufficient time. For example, heating the swabs at about 200 [deg.] C for about 30 minutes makes them substantially free of endotoxins for the sensitivity threshold specific to the horseshoe crab lysis product. Other means are obviously suitable for the same purposes, for example exposure to ethylene oxide or to the radiation of radioactive cobalt.
The swab apparatus and the sealed dilution system described above can also be used in humans when the exudate at the urethra is not abundant enough to apply the first method described. In this case, although it is possible to use a swab such as that in FIG. 15, the size of the cotton swab should normally be reduced, the swab being carried by a rod whose dimensions are close to those of a 25.4 mm needle, n [deg.] 21 to 23. The dilution container , as well as the volume of its contents, must be reduced in proportion. Except for the actual collection of the sample, all the other operations are identical to those described above with regard to the examination of the woman.
CLAIMS
1.- Diagnostic kit, characterized in that it includes:
(a) a syringe, the spout of which has an orifice for extracting, by vacuum, a sample to be examined and expelling the sample under pressure;
(b) a sealed dilution device containing a quantity chosen beforehand of a diluent for diluting the sample, the device comprising an orifice giving access to the diluent;
(c) the spout being adaptable to the device for receiving diluent from the dilution device;
(d) a clean needle to be attached to the nozzle of the syringe;
(e) a vial which contains a reagent and which has a diaphragm which can be pierced by the needle, and
(f) the needle having a length sufficient to pass through the diaphragm and constitute a path for the diluted sample to the reagent contained in the vial.