BE1022439B1 - Systeme appareil et procede pour production de biomolecules - Google Patents

Abstract

L'invention courante concerne un procédé automatisé pour la production de cellules et/ou de biomolécules comme une protéine ou des peptides comprenant les étapes de culture de cellules dans au moins un bioréacteur à densité de cellules élevée, reliant de ce fait à fluide ledit bioréacteur à une alimentation en milieu de culture et en gaz ou mélange gazeux ; de liaison à fluide dudit bioréacteur à une unité aval ; et de croissance de cellules à une densité d'au moins 50 millions de cellules par ml. Le volume total de bioréacteur est d'au moins 10 litres. L'invention propose également un système approprié pour la mise en oeuvre du procédé. Le système est un système à petite échelle de la taille d'une armoire et peut être placé dans une chambre propre transportable.

Description

Système, appareil et procédé pour la production de biomolécules

Domaine technique L'invention se rapporte à des procédés et à des systèmes pour la production et/ou la purification de cellules ou de produits cellulaires, comme des protéines ou des peptides. Plus particulièrement, l'invention propose des procédés et des systèmes pour la production d'antigènes et/ou de vaccins.

Arrière-plan

Avec l'utilisation accrue de protéines, comme des antigènes, dans le diagnostic clinique et la thérapie, le besoin a surgi pour des procédés de production et de purification plus efficaces, rapides, stériles. Actuellement il y a une demande croissante de vaccins basiques par des programmes de vaccination nationaux et internationaux. Également il y a une demande croissante de vaccins vétérinaires, particulièrement dans les pays émergents. On souhaite que les deux soient disponibles à des prix accessibles et en quantités suffisantes, ce qui n'est pas souvent le cas de nos jours. La production de vaccin viral à l’échelle industrielle est souvent entravée par les inconvénients des équipements de production. Les vaccins contre la grippe sont par exemple produits de manière générale par réplication dans des œufs de poule embryonnaires. Ces virus sont isolés du fluide allantoïdien des œufs de poule infectés et leurs antigènes sont utilisés comme vaccin soit en tant que particules virales intactes soit en tant que particules virales désagrégées par des détergents et/ou des solvants, ce qu'on appelle un vaccin clivé, soit en tant que protéines virales isolées, définis, ce qu’on appelle un vaccin sous-unitaire. Le dernier procédé est lourd, coûteux et souffre souvent d’un énorme retard de production, par exemple en temps de pandémie. De plus, le procédé implique en soi un risque pour la santé, comme les œufs utilisés ne sont pas stériles, contiennent des bactéries et peuvent induire des réactions allergiques.

La culture de cellules est une alternative adéquate pour la production de virus pour des vaccins, par exemple, les virus de la rage, les virus des oreillons, de la rougeole et de la rubéole, les virus de la poliomyélite et les virus FSME peuvent être répliqués dans des cultures de cellules. Des approches et des outils classiques pour fabriquer des cellules ou des produits à base de cellules impliquent de manière classique de nombreuses manipulations manuelles qui sont sujettes à des variations même si elles sont conduites par des techniciens habiles. Des petites quantités de produits sécrétés par des cellules sont produites de différentes façons. Des flasques T, des flacons roulants, des bouteilles agitées ou des sacs de cellules sont des procédés manuels utilisant des incubateurs ou des chambres chaudes pour fournir des environnements pour la croissance et la production cellulaire. Ces procédés sont très coûteux en main-d'œuvre, sujets à des erreurs et difficiles à produire à grande échelle.

La production de produits secrétés par des cellules peut être réalisée en utilisant un bioréacteur (fibres, microfibres, fibre creuse, matière composite céramique, lit fluidisé, lit fixe, etc.) ou en utilisant un réservoir agité. Cela augmente la concentration de produit. Les systèmes actuellement disponibles sont de nature polyvalente et exigent un temps considérable à des opérateurs formés pour installer, charger, vider, inoculer, faire fonctionner, recueillir et décharger. Chaque étape exige de manière classique une documentation manuelle, laquelle est coûteuse en main-d'œuvre et sujette à des erreurs.

Les techniques antérieures utilisent une installation à grande échelle dans laquelle des cellules sont cultivées dans des bioréacteurs à lots par exemple de 10 000 litres (L). Après une période de culture, les antigènes ou les anticorps du lot sont recueillis dans les 8 heures environ. Par ce fait, les 10 000 L de suspension sont clarifiés, le milieu est échangé (le milieu de culture de cellules est remplacé par un milieu tampon) par diafiltration, et les composés sont séparés ou purifiés par chromatographie. Une étape de filtration supplémentaire peut suivre. Les inconvénients de la technique antérieure incluent l'utilisation d'un grand filtre, d'une grande quantité de milieu tampon, d'une grande colonne de chromatographie et d'une quantité nécessaire considérable d'eau purifiée. Ces quantités représentent un coût considérable en termes de production d'eau purifiée et de stockage d'eau. Un inconvénient majeur est la perte de rendement dans l'étape de clarification qui est une étape essentielle de cette installation pour obtenir une diafiltration qui est assez efficace pour échanger le milieu de culture de cellules dans la limite de 8 heures.

Un autre inconvénient des systèmes disponibles actuels est constitué par les grands investissements qui sont exigés en termes d'installations nécessaires, d'espace nécessaire, etc. (le « matériel ») mais également en termes de matière nécessaire pour produire les biomolécules souhaitées. De plus, l'entrée nécessaire d'énergie pèse énormément sur le budget requis. Par conséquent, les investissements énormes à faire mettent une restriction sur un développement ultérieur dans le domaine de la production d'antigènes et/ou de vaccins, non seulement aux US et en Europe, mais également dans les pays en voie de développement.

Le document WO 2012 / 171 026 décrit un système intégré automatisé comprenant une unité de croissance cellulaire et une unité de purification. Le système est toujours assez demandeur en fonctionnement et exige des mesures d'optimisation supplémentaires pour améliorer la facilité d'utilisation et pour augmenter la sortie particulièrement lorsque ledit système n'est pas évolutif.

En conséquence, il y a un besoin de systèmes et de procédés par lesquels des cellules et/ou des produits cellulaires peuvent être cultivés et si on le souhaite purifiés d'une façon totalement automatisée, rapide et stérile. En outre, il y a un besoin d'une méthodologie et d'un système qui fournit une sortie de produit élevée à un coût d'investissement minimal et à des investissements (CAPEX) et des dépenses d'exploitation (OPEX) abaissés.

Le but de l'invention courante est de proposer des procédés et des systèmes pour la production de cellules et/ou de produits cellulaires qui surmontent au moins une partie des inconvénients et des désavantages précédemment mentionnés. Un objectif de l'invention est de proposer des procédés et des systèmes automatisés et intégrés pour la croissance et le maintien de cellules, mais également pour de multiples applications aval variables comme le recueil et/ou la purification de cellules et/ou de produits cellulaires (par exemple, des protéines ou des peptides). Résumé de l'invention

Dans un premier aspect, la présente invention propose un procédé automatisé intégré pour la production de biomolécules comme des protéines ou des peptides comprenant les étapes de culture de cellules dans au moins un bioréacteur à densité cellulaire élevée, reliant à fluide de ce fait ledit bioréacteur à une alimentation en milieu de culture et à un gaz ou un mélange gazeux ; de liaison à fluide dudit bioréacteur à une unité aval ; et de culture de cellules à une densité d'au moins 50 millions de cellules par ml. De préférence, le volume total du bioréacteur est d'au moins 10 litres. Dans un mode de réalisation préféré, les biomolécules produites sont des antigènes.

Dans un second aspect, la présente invention propose un système approprié pour la mise en oeuvre du procédé de l'invention. Le système est un système à petite échelle de la taille d'une armoire et peut être placé dans une chambre propre transportable. Dans un mode de réalisation préféré, l'invention propose un système pour la production de biomolécules comme des protéines ou des peptides, comprenant une unité de culture de cellules et une unité aval qui sont reliées à fluide l'une à l'autre. Ladite unité de culture de cellules comprend au moins un bioréacteur de perfusion, qui permet de cultiver des cellules à une densité d'au moins 50 millions de cellules par ml, et un moyen d'alimentation pour alimenter ledit bioréacteur avec un milieu de cellules et un gaz ou un mélange gazeux. Le système est caractérisé en ce que le volume total de bioréacteur est d'au moins 10 litres.

De manière classique, afin de gérer la production d'une grande quantité de protéines ou de peptides comme des antigènes et/ou des vaccins, un nombre considérable de grands instruments (comme de grands bioréacteurs, de grands filtres, de grandes colonnes de chromatographie par purifications, etc.) est nécessaire. La compacité de la conception et la quantité de ressources de support sont cependant devenues une question importante. Supporter de grandes unités devient un problème de logistique pour le système. Le système de la présente invention n'a aucune exigence de ce type en particulier grâce à l'utilisation d'un bioréacteur de petite taille et le traitement ultérieur d'un petit volume prédéfini de surnageant. Le présent procédé et le système sont exempts de manipulation manuelle, réduisant de ce fait considérablement le risque de contamination.

Des produits cellulaires comme des antigènes sont actuellement produits dans des équipements à grande échelle. Les cellules sont habituellement cultivées pendant environ 20 jours dans un volume considérable de milieu de culture d'environ 10 000 L. Après cela, la culture de cellules est arrêtée et le volume considérable de milieu de culture est ensuite traité pour extraire la molécule souhaitée. Lesdits équipements sont plutôt chers et leur coût est d'environ 100 millions de $.

La présente invention propose des procédés et des systèmes dans lesquels des cellules sont cultivées à une densité élevée. De préférence, ladite culture de densité élevée est effectuée dans un bioréacteur de petite taille à perfusion continue. Plus de préférence, une culture de densité élevée est maintenue dans le bioréacteur. Les systèmes et les procédés de l'invention prévoient une chaîne automatisée, intégrée et continue d'opérations en commençant par la croissance cellulaire jusqu'à l'obtention du produit souhaité qui peut être des cellules ou des produits cellulaires comme des protéines ou des peptides. Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, après l'atteinte d'une densité de cellules prédéterminée à l'intérieur du bioréacteur, un petit volume prédéfini de surnageant est en outre traité dans l'unité aval du système. Le traitement du surnageant, dans le petit volume prédéfini, est effectué tout en maintenant la culture de densité de cellules élevée à l'intérieur du bioréacteur. Par surnageant, on se réfère au milieu de culture qui est à l'intérieur du bioréacteur pendant la culture de cellules.

Entre autres avantages, les systèmes et les procédés de l’invention proposent la production de cellules et/ou de produits cellulaires avec un rendement élevé en comparaison aux procédés et aux systèmes de la technique antérieure réduisant de ce fait les coûts du produit final. Les systèmes et les procédés de l'invention permettent également la production de cellules et/ou de produits cellulaires en utilisant une quantité d'eau purifiée plus petite de manière significative que les systèmes et les procédés de technique antérieure. La présente invention propose des systèmes totalement automatisés et intégrés meilleur marché, dont le coût est au moins 5 à 6 fois inférieur aux systèmes à grande échelle habituels. Cela aboutit finalement à un coût inférieur d'investissement et de production, ce qui est un avantage considérable, par exemple en visant la fabrication pour des pays du Tiers-Monde. L’invention permet de fournir aux pays du Tiers-Monde des systèmes de production nationaux et permet également à des sociétés pharmaceutiques sans antécédents en biotechnologie de produire en masse des produits cellulaires comme des antigènes.

Description des figures

La figure 1 représente un mode de réalisation d'un bioréacteur de l'invention ; la figure 2 représente un mode de réalisation de l'unité de culture de cellules de l'invention ; la figure 3 représente l'unité de culture C qui est reliée à fluide à une unité aval D comprenant un moyen de collecte selon un mode de réalisation de l'invention ; la figure 4 représente l'unité de culture C qui est reliée à fluide à une unité aval D comprenant un moyen de filtration et un moyen de collecte selon un mode de réalisation de l'invention ; la figure 5 représente l'unité de culture C qui est reliée à fluide à une unité aval D comprenant un moyen de filtration et un moyen de purification selon un mode de réalisation de l'invention ; la figure 6 représente la différence entre des procédés de technique antérieure utilisés pour la production de biomolécules et le procédé de la présente invention.

Description détaillée de l'invention

La présente invention concerne un procédé et un système pour la production de cellules et/ou de produits cellulaires ou de biomolécules comme des protéines ou des peptides (par exemple des antigènes). L'invention aspire de manière spécifique à proposer un procédé ayant un rendement optimal en termes d'entrée matière et de sortie de produits. L'invention courante aspire à proposer une méthodologie et un système totalement intégrés et automatisés pour la production de cellules et/ou de biomolécules. Par « protéines ou peptides » et « cellules et/ou biomolécules », on se réfère à des anticorps aussi bien qu'à des antigènes.

Sauf mention contraire, tous les termes utilisés dans la révélation de l’invention, incluant des termes techniques et scientifiques, ont la signification telle que généralement comprise par l'homme de savoir-faire ordinaire auquel cette invention appartient. Au moyen de conseils supplémentaires, les définitions de terme sont incluses pour mieux apprécier l’enseignement de la présente invention.

Tels qu'utilisés dans ce document, les termes suivants ont les significations suivantes : « Un », « une », et « le » tels qu'utilisés dans ce document se réfèrent à des référents tant singuliers que pluriels à moins que le contexte ne dise clairement autre chose. À titre d'exemple, « un compartiment » se réfère à un ou plus d'un compartiment. « Environ » tel qu'utilisé dans ce document en se référant à une valeur mesurable comme un paramètre, une quantité, une durée temporelle, et ainsi de suite, signifie englober des variations de +/- 20 % ou moins, de préférence +/- 10 % ou moins, plus de préférence +/- 5 % ou moins, même plus de préférence +/-1 % ou moins, et toujours plus de préférence +/- 0,1 % ou moins de et à partir de la valeur spécifiée, pour autant que de telles variations soient appropriées à effectuer dans l'invention révélée. Cependant, on comprendra que la valeur à laquelle le modificateur « environ » se réfère soit également révélée de manière spécifique. « Comprendre », « comprenant », et « comprend » et « composé de » tels qu'utilisés dans ce document sont synonymes avec « inclure », « incluant », « inclut » ou « contenir », « contenant », « contient » et sont des termes inclusifs ou ouverts qui spécifient la présence de ce que suit par exemple un composant et n'excluent pas ou n'écartent pas la présence de composants, particularités, élément, organes, étapes supplémentaires, non mentionnés, connus dans la technique ou révélés en son sein.

La mention de plages numériques par un encadrement de valeurs inclut tous les nombres et fractions englobées dans cette plage, aussi bien que les valeurs d'encadrement mentionnées. L’expression « % en poids » (pour cent en poids), ici et partout dans la description sauf mention contraire, se réfère au poids relatif du composant respectif sur la base du poids total de la formulation.

Dans un premier aspect, la présente invention propose un procédé automatisé intégré pour la production de biomolécules comme des protéines ou des peptides. Plus particulièrement, l'invention propose un procédé pour la production d'antigènes et/ou de vaccins. Dans un mode de réalisation préféré, le procédé de l'invention est approprié pour être effectué par un système comprenant une unité de culture de cellules et une unité aval. L'unité de culture de cellules comprend au moins un bioréacteur pour la croissance de cellules et/ou la production de produits cellulaires. L'unité aval peut comprendre des composants différents ou un moyen approprié pour un traitement ultérieur du surnageant, de cellules cultivées et/ou de produits cellulaires.

De préférence, le procédé de l'invention courante comprend les étapes de culture de cellules dans au moins un bioréacteur à densité cellulaire élevée, reliant de ce fait à fluide ledit bioréacteur à une alimentation en milieu de culture et à un gaz ou un mélange gazeux ; de liaison à fluide dudit bioréacteur à une unité aval ; et de culture de cellules à une densité d'au moins 50 millions de cellules par ml. De préférence, le volume total du bioréacteur est d'au moins 10 L. On prévoit de préférence au moins un capteur pour mesurer la densité cellulaire à l'intérieur du bioréacteur.

Dans un mode de réalisation préféré, le volume total de bioréacteur est d'au moins 10 L, de préférence d'au moins 20 L, plus de préférence d'au moins 30 L, même plus de préférence d'au moins 40 L, le plus de préférence d'au moins 50 L. Le volume total du bioréacteur est d'au plus 1 000 L, de préférence d'au plus 900 L, plus de préférence d'au plus 800 L, même plus de préférence d'au plus 700 L, le plus de préférence d'au plus 500 L, même le plus de préférence 500 L. Dans un mode de réalisation préféré supplémentaire, le volume total de bioréacteur est d'au plus 400 L, de préférence d'au plus 300 L, plus de préférence d'au plus 250 L, le plus de préférence d'au plus 100 L. Par volume total de bioréacteur on se réfère au volume total de liquide qui peut être introduit dans le bioréacteur, qui sera alors plein.

De préférence, le volume de milieu de culture fourni au bioréacteur pour la culture de cellules est suffisant pour remplir environ la moitié du volume total dudit bioréacteur. Par exemple, si le volume total du bioréacteur est 1 000 L alors 400 à 700 L, de préférence 450 à 600 L, plus de préférence 480 à 500 L ou n’importe quelle valeur comprise dans les plages mentionnées sont fournis au bioréacteur pour la culture de cellules. De préférence, pour la production d’antigènes, le bioréacteur comprend au moins 80 L, de préférence au moins 90 L, plus de préférence au moins 100 L de milieu de culture et au plus 200 L, de préférence au plus 180 L, plus de préférence au plus 150 L, même plus de préférence au plus 140 L et le plus de préférence environ 125 L de milieu de culture.

Dans un mode de réalisation préféré, des cellules (cellules de mammifère ou d’insecte) et un milieu de culture adapté sont introduits dans le bioréacteur. Un milieu de culture adapté se réfère à la composition du milieu qui est exigé pour la croissance des cellules. Lesdites compositions sont connues des personnes habiles dans la technique et comprennent de manière générale des sels, des vitamines, des acides aminés, des sucres ou n’importe quelle combinaison de ceux-ci. On fournit de préférence le milieu de culture au bioréacteur à partir d'un conteneur externe de milieu de culture, c'est-à-dire non contenu dans le système de l'invention. À partir dudit conteneur externe, le milieu de culture est dirigé vers un réservoir interne de milieu de culture, c'est-à-dire positionné à l'intérieur du système. De préférence, le milieu de culture est préchauffé avant d'être fourni au bioréacteur. Plus de préférence, le milieu de culture est chauffé dans le réservoir interne de milieu de culture. La température de préchauffage du milieu de culture va de 20 à 40 °C, de préférence de 25 à 38 °C, plus de préférence de 30 à 37 °C. Dans un mode de réalisation le plus préféré, ledit milieu de culture est préchauffé à environ 37 °C.

Dans un mode de réalisation préféré, on prévoit un conteneur de collecte des déchets, dans lequel des déchets métaboliques sont enlevés du bioréacteur. Les personnes habiles dans la technique connaissent de tels conteneurs et les raccords exigés pour assurer l'enlèvement des déchets.

Dans un mode de réalisation préféré, un mélange de milieu de culture et de gaz, comme de l'oxygène pur, ou un mélange de milieu de culture et d'un mélange gazeux comprenant de l'oxygène est fourni au bioréacteur par une conduite d'alimentation unique ou par une entrée audit bioréacteur. L'utilisation d'une conduite d'alimentation unique simplifie l'installation du système et du procédé comme il réduit le nombre exigé de raccords et de tuyaux.

Les cellules exigent de l'oxygène pendant leur phase de croissance afin d'avoir une croissance optimale. Le bioréacteur peut être soumis à un mouvement, augmentant de ce fait le transfert d’oxygène d'un facteur d’au moins 10 en comparaison à des procédés classiques. Le fonctionnement du bioréacteur à l'équilibre gazeux est donc réalisé. Cela à son tour augmente la croissance cellulaire, ce qui a un impact positif sur la production de biomolécules. Également, en fonctionnant à l'équilibre constant de gaz, toutes les unités de commande ou tous les dispositifs formant capteurs peuvent être omis, fournissant une méthodologie directe et simple. De plus, une défaillance de capteur n'est plus un problème, et les réparations qui étaient nécessaires dans les systèmes de technique antérieure en raison de ladite défaillance de capteur ne sont désormais pas nécessaires, conduisant à une réduction élevée de coûts de personnel et de fonctionnement. Le mouvement du bioréacteur peut inclure, de manière non exhaustive, la rotation le long d'un axe horizontal, la rotation le long d'un axe vertical, un mouvement de bascule le long d'un axe horizontal incliné ou basculé du bioréacteur ou n'importe quelle combinaison de celles-ci.

Dans un mode de réalisation préféré, les cellules sont cultivées dans le bioréacteur pendant une certaine période de temps qui peut varier de quelques heures à plusieurs jours selon les cellules cultivées. La période de temps de culture est d'au moins 4 heures, d'au moins 10 heures, d'au moins 24 heures, d'au moins 5 jours, d'au moins 7 jours ou n'importe quel temps intermédiaire. La période de temps de culture est d'au plus 70 jours, d'au plus 60 jours, d'au plus 50 jours, d'au plus 40 jours, d'au plus 25 jours, d'au plus 20 jours, d'au plus 10 jours ou n'importe quel temps intermédiaire.

En fonction du produit final, on peut utiliser une transduction virale ou l'introduction de vecteurs viraux. On a utilisé des vecteurs compétents en réplication virale ou des réplicons pendant une longue période de temps comme un système d'expression alternatif pour augmenter les rendements de protéines thérapeutiques dans des cellules mammifères. Le(s) gène(s) cible(s) peu(ven)t être exprimé(s) sous la commande transcriptionnelle de promoteurs viraux de sorte que les ARNm s'accumulent à des niveaux extrêmement élevés dans le cytoplasme après transfection et lors d'une réplication, donnant de grandes quantités de protéines cibles. L'infection virale peut mener à un processus de transduction sans lyse des cellules cultivées ou à la lyse des cellules cultivées apportant de ce fait le contenu des cellules dans le surnageant du bioréacteur.

Comme variante, des cellules d'hybridome ou des cellules transfectées de façon stable peuvent être cultivées afin de produire la protéine ou le peptide souhaité comme un antigène.

Des exemples de systèmes de réplication virale incluent, de manière non exhaustive, des virus de polyoma, des systèmes lentiviraux, des systèmes rétroviraux, des systèmes adénoviraux, des virus adéno-associés. Des exemples de cellules préférées utilisées dans le système courant incluent, de manière non exhaustive, des cellules Vero, des cellules Hek293T, des cellules COS, des cellules CHO.

Dans un mode de réalisation préféré de l'invention courante, le milieu complété du bioréacteur est transféré du bioréacteur vers ou recueilli dans l'unité aval. On comprendra que le bioréacteur et l'unité aval soient reliés à fluide l'un à l'autre. Une pompe a pu être prévue pour transférer le surnageant dans l'unité aval. Un mode de réalisation préféré de l’unité de culture de cellules C est représenté à la figure 2. Le bioréacteur 1 comprenant le milieu de culture de cellules 2 est relié à un réservoir interne de milieu de culture 3. Ladite connexion est fournie par au moins une tubulure d'admission 4 et une admission du bioréacteur 1. De préférence, le réservoir interne de milieu de culture 3 est complété par du milieu de culture en provenance d'un conteneur externe de milieu de culture (non représenté) qui est positionné à l'extérieur du système de l'invention de la taille d'une armoire. Ledit conteneur externe de milieu de culture comprend jusqu'à 10 000 L, de préférence jusqu'à 20 000 L de milieu de culture qui est maintenu à température ambiante, c'est-à-dire environ 20 °C. Le milieu de culture est de préférence préchauffé dans le réservoir interne de milieu de culture 3 à une température d'environ 37 °C.

Le milieu de culture complété, également appelé milieu complété dans ce document, se réfère au surnageant du bioréacteur qui peut comprendre un milieu de culture et/ou des cellules cultivées et/ou leurs produits. Le surnageant du bioréacteur peut être exempt de cellules et/ou de leurs produits. Le produit de cellules se réfère à des biomolécules comme des protéines, des peptides, produites par les cellules et/ou toutes autres biomolécules cellulaires tirées de la lyse de cellules comme des membranes cellulaires.

Au moins une pompe peut être prévue pour assurer le transfert de milieu cellulaire depuis le réservoir 3 vers le bioréacteur 1. De préférence, le transfert de milieu est effectué continuellement et/ou à un débit constant et/ou à des débits variables. Ledit transfert de milieu peut également être effectué de manière discontinue et/ou à un débit constant et/ou à des débits variables. Pour relier l’unité de culture de cellules C à une unité aval ou une autre unité ou dispositif, au moins une tubulure de sortie 5 qui est attachée à une sortie du bioréacteur 1 est prévue. Une boîte de commande 9 peut être prévue dans l'unité de culture de cellules C pour commander les paramètres physiques et/ou chimiques du surnageant recueilli en provenance du bioréacteur. L'unité aval peut comprendre un moyen de filtration et/ou un moyen de collecte et/ou un moyen de dialyse et/ou un moyen de purification de biomolécules comme la purification de peptides ou de protéines. Dans sa forme la plus simple, ladite unité aval comprend seulement un moyen pour recueillir le produit fini souhaité, sans aucune étape de filtration / purification / dialyse antérieure. Les composants de l'unité aval sont facilement reliés à ou débranchés de ladite unité et peuvent donc être facilement remplacés, nettoyés ou stérilisés. L'unité aval peut être personnalisée en fonction des besoins et des souhaits des utilisateurs et peut être alimentée par une combinaison de n'importe laquelle des unités précédemment mentionnées. On fournit donc à l'utilisateur des possibilités multiples de produit fini, des cellules, des cellules filtrées, des produits cellulaires filtrés, des produits cellulaires purifiés ou des biomolécules. L'utilisateur peut choisir et relier les différents compartiments de l'aval en fonction du produit final souhaité.

Dans un mode de réalisation préféré, l'unité aval reçoit un milieu complété ou un milieu complété avec des biomolécules en provenance dudit bioréacteur dans le mode continu. De préférence, l'unité aval reçoit au plus 1 000 ml/min de milieu complété avec des biomolécules en provenance dudit bioréacteur en mode continu. De préférence, le transfert du milieu complété est amorcé quand une densité de cellules prédéterminée est atteinte à l'intérieur du bioréacteur. Ladite densité de cellules prédéterminée est d'au moins 30 millions/ml, de préférence 40 millions/ml, plus de préférence 50 millions/ml, le plus de préférence 60 millions/ml. Dans un mode de réalisation préféré, en parallèle au transfert du milieu complété en provenance du bioréacteur vers l'unité aval, le milieu de culture est ajouté en provenance du réservoir interne de milieu de culture audit bioréacteur comme pour maintenir le volume initial de milieu de culture dans le bioréacteur. Par exemple, si au début du processus le bioréacteur contenait 80 L de milieu de culture, une fois que le transfert de milieu complété en provenance du bioréacteur vers l'unité aval est amorcé, du nouveau milieu de culture est ajouté au bioréacteur en volume suffisant de façon à maintenir un volume de 80 L dans ledit bioréacteur. Si le transfert de milieu complété en provenance du bioréacteur vers l'unité aval est effectué en mode continu, l'ajout de nouveau milieu de culture en provenance du réservoir interne de milieu de culture dans le bioréacteur sera également effectué en mode continu. Le procédé et le système de la présente invention permettent de ce fait le traitement du milieu de culture complété dans l'unité aval en parallèle à la croissance des cellules dans le bioréacteur. Cela procure plusieurs avantages en comparaison à des processus dans lesquels des cellules sont cultivées dans de grands bioréacteurs contenant de grands volumes de culture de cellules suivi par l'arrêt de ladite culture de cellules après une certaine période de temps ou en atteignant une certaine concentration et en démarrant ensuite les processus aval du grand volume de culture de cellules. Entre autres avantages, on peut mentionner une augmentation considérable de rendement et de ce fait une diminution considérable de coût.

Dans un mode de réalisation préféré, le milieu complété avec des biomolécules reçu par l'unité aval subit au moins un processus sélectionné à partir du groupe comprenant la filtration, la récolte, la dialyse, la purification de biomolécules et la concentration protéique ou n'importe quelle combinaison de celles-ci.

La collecte de milieu complété est de préférence effectuée d’une façon continue à un petit débit volumique. Ledit débit volumique est d’au moins 100 ml/min, de préférence au moins 150 ml/min, plus de préférence au moins 200 ml/min, le plus de préférence au moins 250 ml/min. Ledit débit volumique est au plus de 1 000 ml/min, de préférence au plus 800 ml/min, plus de préférence au plus 600 ml/min, le plus de préférence au plus 400 ml/min. La collecte de surnageant peut également être effectuée d'une façon discontinue. Le surnageant recueilli est alors soumis à un traitement ultérieur sélectionné à partir d'une collecte simple, filtrage, purification de molécules, stockage ou n’importe quelle combinaison de ceux-ci. Le traitement de petits volumes de milieu complété réduit considérablement la perte de rendement et améliore la qualité et l'efficacité de traitement, par exemple une meilleure filtration et/ou la qualité de purification. De plus, aucune augmentation d'échelle des opérations effectuées dans l’unité aval n'est exigée évitant de ce fait de dépenser du temps et de l'argent pour augmenter proportionnellement lesdites opérations.

Le mode continu de collecte de la présente invention peut être amorcé par l'opérateur en se basant sur la concentration de produit. La collecte continue jusqu’à ce qu'un intervalle de temps préprogrammé se soit écoulé ou jusqu'à ce que l’opérateur termine manuellement la collecte en utilisant une interface utilisateur fournie dans le système de l’invention.

La figure 6 représente la différence entre des procédés de technique antérieure utilisés pour la production de biomolécules et le procédé de la présente invention. Dans des procédés de technique antérieure, les cellules sont cultivées pendant une certaine période de temps ou jusqu’à atteindre une certaine concentration comme le montre la courbe P de la figure 6. Après cela, la culture de cellules est arrêtée et les processus aval du grand volume de culture de cellules peuvent être commencés et certaines étapes comme la clarification devraient être effectuées en environ 8 heures. Comme on l'a précédemment mentionné, cette méthodologie mène à une perte de rendement importante et est plutôt coûteuse. Le procédé de la présente invention commence par la culture de cellules à une densité élevée, d'au moins 50 millions de cellules parmi. Une fois que la densité exigée est atteinte, la culture de cellules est entretenue dans le temps (courbe I à la figure 6) et un traitement aval du surnageant est amorcé (I0 à la figure 6). Ledit traitement aval est effectué sur des quantités prédéfinies de surnageant et est répété après des intervalles de temps fixés ou non fixés (Ii à Ix à la figure 6). Le traitement aval est sélectionné à partir de la filtration et/ou la collecte et/ou la dialyse et/ou la purification de biomolécules ou n'importe quelle combinaison de celles-ci. Le procédé de la présente invention permet de ce fait une augmentation considérable de rendement, une diminution considérable de coût tout en utilisant des petits équipements exigeant moins d'espace et plus aisés à entretenir.

Dans un mode de réalisation préféré, des cellules cultivées non rompues sont recueillies en masse à partir du bioréacteur dans un sac prévu dans l'unité aval. Les cellules peuvent être des cellules d'hybridome, des cellules transfectées ou transformées ou des cellules cultivées transfectées de façon stable. Afin d'obtenir les cellules sans leur substrat (les fibres), le bioréacteur peut être soumis à une agitation discontinue ou continue avant la collecte. Ladite agitation va de 10 à 150 Hz à une amplitude de 1 à 5 mm, de préférence de 20 à 100 Hz à une amplitude de 1 à 5 mm. L’agitation séparera les cellules des microsupports et les amènera dans le surnageant. Dans le cas où le bioréacteur est muni de supports, l'agitation séparera les cellules desdits supports et les amènera dans le surnageant. Lesdits supports peuvent être des fibres, des microfibres, des fibres creuses ou des microfibres creuses. Comme variante, les supports peuvent être des microbilles en suspension, en lit tassé ou en mode fluidisé. Lesdits supports procurent un substrat excellent pour que les cellules croissent dessus. De préférence, le bioréacteur comprend des microsupports, de préférence des supports de microfibre de polyester. Le recueil du surnageant est effectué en utilisant un moyen de collecte comprenant au moins une pompe. Le sac et/ou l'unité aval peuvent être conçus pour maintenir le surnageant recueilli à la même température que la température du milieu de culture ou à une température différente. Les cellules recueillies peuvent être maintenues dans le sac de l'unité aval à une température d'environ 4 °C. Les cellules cultivées recueillies en masse peuvent être filtrées en utilisant un moyen de filtrage de l'unité aval avant de diriger lesdites cellules dans le sac.

Dans un mode de réalisation préféré, les cellules cultivées sont infectées et ensuite rompues / lysées dans un emplacement conçu à cet effet dans l'unité aval. Le surnageant comprenant les débris de cellule et les produits souhaités est alors recueilli en utilisant le moyen de collecte à partir du bioréacteur. Les débits de collecte sont comme on l'a précédemment mentionné. Le surnageant peut être recueilli et stocké pour utilisation ultérieure dans un sac prévu dans l'unité aval comme on l'a précédemment mentionné. Le surnageant recueilli peut être soumis à une filtration en utilisant un moyen de filtration avant stockage dans un sac de l'unité aval. Comme variante, le surnageant recueilli peut être filtré et/ou soumis à une étape de purification pour séparer une molécule spécifique, comme un antigène, dudit surnageant.

La figure 3 représente un mode de réalisation du système qui est conçu pour recueillir des cellules ou un produit fini en masse. L'unité de culture C est reliée à fluide à l'unité aval D par la tubulure de sortie 5. L'unité de culture C est comme on l'a précédemment décrit. Une pompe, ou un moyen de collecte, peut être prévue pour recueillir le surnageant du bioréacteur. La pompe peut être programmée par exemple pour commencer la collecte de surnageant à partir d'une période de temps prédéfinie à partir du début de la culture. La pompe peut être programmée de façon à recueillir un volume prédéterminé de surnageant dans un mode continu automatisé. Le surnageant collecté est dirigé vers un sac ou un réservoir de collecte 6 dans lequel ledit surnageant sera stocké pour des applications ultérieures.

La figure 4 représente un mode de réalisation du système qui est conçu pour la collecte et le filtrage. L'unité de culture C est reliée à fluide à l'unité aval D par la tubulure de sortie 5. L'unité de culture C est comme on l'a précédemment décrit. La tubulure de sortie 5 dirige le surnageant vers un moyen de filtrage 7. Une pompe, ou un moyen de collecte, peut être prévue pour recueillir le surnageant du bioréacteur. La pompe peut être programmée de façon à commencer la collecte de surnageant à partir d'une période de temps prédéterminée à partir du début de la culture. La pompe peut être programmée de façon à recueillir un volume prédéterminé de surnageant dans un mode continu automatisé. Le surnageant recueilli est filtré par le moyen de filtrage et le surnageant filtré est dirigé et/ou stocké dans un sac ou un réservoir de collecte 6 pour utilisation dans des applications ultérieures.

Une purification peut être effectuée en utilisant un moyen de purification de l'unité aval. Ledit moyen peut être un moyen automatisé pour obtenir un produit biologique purifié tel qu'une protéine (par exemple, un antigène purifié), à partir du surnageant (par exemple, milieu aqueux contenant une protéine) et recueilli comme on l'a précédemment mentionné. Dans un mode de réalisation préféré, le moyen de purification comprend au moins un ou n'importe quelle combinaison de ce qui suit : un dispositif de sélection telle qu'une colonne de chromatographie par purification (purification par affinité, échange d'ions, etc.), une séquence de colonnes de purification ou d'absorbeurs à membrane, au moins un réservoir de liquide, un dispositif pour faire couler le liquide à partir des réservoirs et dans le dispositif de sélection, un dispositif pour détourner l'effluent provenant du dispositif de sélection. Le moyen de purification est susceptible d'être installé dans le système à petite échelle de l'invention de la taille d'une armoire via un mouvement simple ou technique « d'encliquetage » ou de « chargement rapide » et comprend des interfaces mécaniques et électriques pour communiquer avec les autres composants du système de l'invention. On comprendra que les tampons et les solutions exigés pour effectuer le processus ou l'étape de purification puissent être prévus dans au moins un sac. Ledit sac peut être positionné à l'intérieur ou à l'extérieur de l'unité aval et est naturellement muni des raccords nécessaires pour assurer sa connexion à l'unité de purification.

La figure 5 représente un mode de réalisation du système qui est conçu pour la collecte, le filtrage et la purification d'au moins un produit cellulaire, comme une protéine ou un peptide. L'unité de culture C est reliée à fluide à l’unité aval D par la tubulure de sortie 5. L'unité de culture C est comme on l'a précédemment décrit. La tubulure de sortie 5 dirige le surnageant vers un moyen de filtrage 7. Une pompe, ou un moyen de collecte, peut être prévue pour recueillir le surnageant du bioréacteur. La pompe peut être programmée de façon à commencer la collecte de surnageant à partir d'une période de temps prédéterminée à partir du début de la culture. La pompe peut être programmée de façon à recueillir un volume prédéterminé de surnageant dans un mode continu automatisé. Le surnageant recueilli est alors dirigé vers un moyen de purification 12 de l'unité aval D. Le produit cellulaire purifié obtenu peut être stocké dans un réservoir relié au moyen de purification ou dirigé vers un autre composant de l'aval pour des applications ultérieures.

Le dispositif de sélection peut être une colonne de chromatographie comme une chromatographie par affinité, une chromatographie par échange ionique (par exemple anion ou cation), une chromatographie par interaction hydrophobe, une chromatographie par exclusion diffusion (SEC), une chromatographie par immuno-affinité qui est une colonne remplie d'une résine d'affinité, comme une résine anti-IgM, une Protéine A, une Protéine G, ou une résine anti-IgG. L'échange d'anions exploite des différences de charge entre les différents produits contenus dans le surnageant recueilli. Le produit chargé de façon neutre passe sur la cartouche de colonne de chromatographie par échange d'anions sans être retenu, tandis que les impuretés chargées sont retenues. La taille de la colonne peut varier sur la base du type de protéine purifiée et/ou du volume de la solution à partir de laquelle ladite protéine doit être purifiée.

Dans un mode de réalisation préféré, le moyen de purification, par exemple, une colonne d'affinité, et/ou le moyen de filtration sont reliés à de multiples réservoirs de liquide. Les réservoirs contiennent chacun du liquide, comme un tampon de lavage, un tampon d'élution, ou une solution de neutralisation, pour délivrance au moyen de purification et/ou au moyen de filtration. Le moyen de purification comprend en outre un dispositif pré-assaini ou préstérilisé pour faire couler du liquide à partir des réservoirs dans la colonne de chromatographie par exemple. Par exemple, on peut utiliser des vannes et une tubulure préstérilisées qui relient les réservoirs à la colonne.

Les personnes habiles dans la technique connaissent la purification utilisant une colonne de chromatographie et elle peut être effectuée en utilisant les tampons adéquats pour éluer les biomolécules souhaitées. Lors de l'élution de la biomolécule souhaitée, la protéine purifiée éluée peut être automatiquement déposée dans un récipient de collecte préstérilisé, jetable prévu dans l’unité aval et enlevée du moyen de purification. Comme variante, la protéine purifiée éluée peut subir un traitement automatisé ultérieur. Une protéine purifiée, par exemple, un antigène, est sensiblement exempte de contaminants de cellule hôte comme des protéines de cellule hôte, des acides nucléiques et des endotoxines.

Dans un mode de réalisation préféré, la protéine éluée est transférée vers différentes solutions. Le transfert se produit automatiquement en utilisant un module de diafiltration préstérilisé. La diafiltration est le processus de fractionnement qui lave des molécules plus petites à travers une membrane et conserve les molécules d’intérêt dans le rétentat. On peut utiliser la diafiltration pour enlever des sels ou des tampons d'échange. Dans une diafiltration discontinue, la solution est concentrée, et le volume perdu est remplacé par du nouveau tampon. La concentration d'un échantillon à la moitié de son volume et l'ajout de nouveau tampon quatre fois peuvent enlever plus de 96 % du sel. Dans une diafiltration continue, le volume d’échantillon est maintenu par l’afflux de nouveau tampon tandis que le sel et le vieux tampon sont enlevés. Au moins 99 % du sel peuvent être enlevés en ajoutant jusqu'à sept volumes de nouveau tampon pendant la diafiltration continue. De manière spécifique, le module de diafiltration est utilisé pour davantage purifier la protéine (par exemple, l’antigène) et utilise le principe de filtration par flux tangentiel par lequel des molécules de plus de 50 000 Daltons ne peuvent pas passer à travers la membrane, mais des petites molécules, comme des tampons, peuvent passer à travers. En conséquence, on peut utiliser le module de diafiltration pour échanger un tampon par un autre et c'est un substitut plus efficace pour la dialyse. On peut utiliser la diafiltration pour neutraliser le pH et en tant qu'étape de concentration (pour concentrer le produit cellulaire).

Une fois que l’antigène souhaité est produit, la formulation finale qui est le vaccin, peut être formulée par l’ajout d’adjuvants, de stabilisateurs, de conservateurs ou de n’importe quelle combinaison de ceux-ci. Le rôle de l’adjuvant est d'améliorer la réponse immunitaire de l’antigène. Les stabilisateurs augmentent la durée de stockage, et les conservateurs permettent l’utilisation de fioles à doses multiples. Comme variante, l’antigène obtenu peut être lyophilisé.

Dans un mode de réalisation préféré, le moyen de collecte et/ou le moyen de filtration et/ou le moyen de purification incluent au moins un dispositif de contrôle pour contrôler le milieu en circulation : surnageant recueilli non filtré, surnageant filtré, produit purifié et élué, etc. Le dispositif de contrôle peut être une sonde ou un capteur pour mesurer la conductibilité et/ou le pH et/ou l’absorbance à une longueur d’onde particulière dudit milieu en circulation. Un ou plusieurs capteurs de pression peuvent être inclus pour contrôler la pression de milieu en circulation en ce qui concerne des pressions excessives, ou pour maîtriser la vitesse de pompe, par exemple, pour maintenir la vitesse de pompe du moyen de collecte par exemple à une pression souhaitée.

Dans un mode de réalisation préféré, le système est adapté au produit souhaité. Cela signifie que si des cellules doivent être fournies en masse, le système comprendra une unité de culture de cellules C et une unité aval D dans laquelle au moins un sac de collecte est prévu. Si les cellules filtrées doivent être fournies, le système comprendra l'unité de culture de cellule et l'unité aval dans laquelle on prévoit un moyen de filtrage et au moins un sac de collecte. Si une protéine spécifique doit être fournie, le système comprendra l'unité de culture de cellules et l'unité aval dans laquelle au moins un moyen de filtrage et un moyen de purification sont prévus.

Dans un mode de réalisation préféré, le procédé comprend en outre l'étape de mesure de paramètres physiques et/ou chimiques de la culture de cellules et/ou du milieu de culture. Lesdits paramètres sont sélectionnés à partir du groupe comprenant la température, le pH, la salinité, l'acidité ou n'importe quelle combinaison de ceux-ci. Les mesures peuvent être effectuées sur le milieu de culture avant injection dans le bioréacteur et/ou dans le surnageant qui est collecté à partir du bioréacteur.

Dans un mode de réalisation préféré, le procédé et/ou le système de la présente invention permettent une augmentation de rendement de biomolécules, comme des antigènes, en comparaison à des procédés classiques. Ledit rendement de biomolécules va de 15 à 100 g/L, de préférence de 20 à 60 g/L, plus de préférence de 25 à 50 g/L, même plus de préférence de 30 à 45 g/L, le plus de préférence de 35 à 40 g/L de bioréacteur ou n'importe quelle valeur comprise dans les plages mentionnées.

Dans un mode de réalisation préféré, le procédé et le système de la présente invention sont exempts de boucles fermées ou de boucles de recyclage. Cela signifie que le milieu de culture complété n'est renvoyé au bioréacteur à aucune étape du processus comme après son passage à travers l'unité aval. Cela est avantageux car ça réduit considérablement les risques de contamination. En outre, cela simplifie le paramétrage et l'installation du système réduisant de ce fait les coûts.

Dans un second aspect, la présente invention propose un système pour la production de biomolécules comme des protéines ou des peptides, comprenant une unité de culture de cellules et une unité aval qui sont reliées à fluide l'une à l'autre. Ladite unité de culture de cellules comprend au moins un bioréacteur à perfusion, qui permet la croissance de cellules à une densité d'au moins 50 millions de cellules par ml, et un moyen d'alimentation pour alimenter ledit bioréacteur avec un milieu cellulaire et un gaz ou un mélange gazeux. Le système est caractérisé en ce que le volume total de bioréacteur est d'au moins 10 litres. Dans un mode de réalisation préféré, l'unité aval est séparée de et positionnée à l'extérieur de l'unité de culture de cellules.

Dans un mode de réalisation préféré, le bioréacteur permet une croissance cellulaire à densité élevée. Ladite densité est d'au moins 50 millions de cellules/ml, de préférence au moins 80 millions de cellules/ml, plus de préférence au moins 100 millions de cellules/ml, le plus de préférence au moins 200 millions de cellules/ml. Ladite densité peut atteindre 600, 500, 400 ou 300 millions de cellules/ml.

Dans un mode de réalisation préféré, le volume total de bioréacteur est d'au moins 10 L, de préférence au moins 20 L, plus de préférence au moins 30 L, même plus de préférence au moins 40 L, le plus de préférence au moins 50 L. Le volume total de bioréacteur est au plus de 1 000 L, de préférence au plus 900 L, plus de préférence au plus 800 L, même plus de préférence au plus 700 L, le plus de préférence 500 L. Dans un mode de réalisation préféré supplémentaire, le volume total de bioréacteur est au plus de 400 L, de préférence au plus 300 L, plus de préférence au plus 250 L, le plus de préférence au plus 100 L. Le volume total de bioréacteur et le bioréacteur lui-même selon l’invention sont plus petits en comparaison aux bioréacteurs classiques utilisés pour la culture à densité cellulaire élevée. Cela est avantageux en termes d’espace requis pour le système et pour la facilité d'utilisation.

Dans un mode de réalisation préféré, le système est mis en œuvre dans une armoire à petite échelle qui peut être une chambre transportable ou une chambre propre transportable. De préférence, les dimensions de l'armoire à petite échelle sont 0,8 □ 1,6 □ 1,8 m3. Le système selon un mode de réalisation de l’invention peut être placé dans une chambre propre transportable. L'unité de culture de cellules et l'unité aval sont physiquement distinctes, mais conçues pour être placées ensemble dans une chambre transportable (par exemple, adjacentes l'une à l'autre). De préférence, l'unité de culture de cellules et/ou l'unité aval peuvent transférer des données et coordonner l'activité entre elles en utilisant des procédés connus dans la technique comme un port de communication (par exemple, un port de communication infrarouge, un ordinateur de bureau ou portable, etc.). L'unité aval peut être placée à côté de l'unité de culture de cellules vers la fin de la période de production, ou avant. Au moins une conduite de tubulure provenant de chaque unité relie à fluide lesdites unités l'une à l'autre. L'opérateur amorce le processus de culture et/ou le processus de collecte et/ou le processus de purification par l'intermédiaire d'une interface utilisateur comme une interface d'écran tactile sur la chambre transportable et/ou l'unité de culture de cellules.

De préférence, la température de fonctionnement de l'unité de culture de cellules est entre 20 °C et 40 °C, plus de préférence entre 25 °C et 37 °C. La température de fonctionnement de l'unité aval peut être entre 0 °C et 25 °C, plus de préférence entre 1 °C et 20 °C, même plus de préférence entre 2 °C et 10 °C, le plus de préférence environ 4 °C. La température des deux unités est maintenue par des unités de refroidissement et/ou de chauffage et le maintien de la température peut être vérifié par des capteurs. L'intégration de composants, de fonctions et d'opérations réduit énormément la main d'œuvre et le coût nécessaires pour produire des cellules et/ou un produit tiré de cellules. Le système intégré réduit le temps de préparation et de chargement et réduit le nombre d'erreurs induites par l’opérateur qui peuvent provoquer une défaillance. Le séquençage de processus réduit le temps d'opérateur nécessaire et permet que les opérations séquentielles soient automatiques. La modularisation des fonctions dans une unité de culture de cellules et une unité de purification permet une utilisation plus élevée de matériel et des coûts inférieurs. L'unité de culture de cellules permet la production de cellules et de produits tirés de cellules dans un environnement fermé, autosuffisant. Ladite unité peut comprendre au moins un bioréacteur pour des cellules et/ou leur expansion de produits avec un besoin minimal d'interaction d'un technicien. Ledit bioréacteur peut être attaché au système d'une façon fixe, ou peut être attaché audit système de façon amovible.

Le bioréacteur utilisé dans le procédé et/ou le système de l’invention peut être n'importe quel type de bioréacteur qui permet des cultures de cellules à densité élevée. Ledit bioréacteur est de préférence un bioréacteur à perfusion. Ledit bioréacteur peut être muni de supports comme des fibres, des microfibres, des fibres creuses ou des microfibres creuses. Lesdits supports fournissent un excellent substrat pour que les cellules croissent dessus. De préférence, le bioréacteur comprend des microsupports, de préférence des supports de microfibre de polyester. De préférence, les supports de microfibre sont compatibles d’un point de vue biologique. De préférence, ce sont des supports de polyester non tissé. Après inoculation du bioréacteur avec des cellules, l’unité de culture de cellules suit des processus préprogrammés et automatisés pour délivrer des milieux de culture au bioréacteur et/ou maintenir le pH et/ou maintenir la température. Des paramètres de croissance de culture de cellules standards ou uniques peuvent être programmés, de sorte que divers types de cellule puissent être expansés et de sorte que des cellules ou des produits cellulaires puissent être recueillis d'une façon efficace, reproductible avec un risque minimal d’erreur humaine. Dans un mode de réalisation préféré supplémentaire, lesdits supports ont reçu un traitement au plasma pour les rendre hydrophiles. Les cellules s'attacheront aux supports comme un substrat de croissance 3D. Pendant la production de protéine, le surnageant peut devenir chargé du produit fini souhaité. Par surnageant, on se réfère au milieu de culture qui est à l’intérieur du bioréacteur pendant la culture de cellules qui comprend les cellules cultivées et/ou le produit de cellules.

De préférence, les supports présents dans le bioréacteur fournissent une surface de croissance cellulaire d’au moins 1 000 mètres carrés (m2), de préférence au moins 1 200 m2, plus de préférence 1 500 m2, plus de préférence au moins 1 800 m2. Les supports’ fournissent une surface de croissance cellulaire d'au plus 3 000 m2, plus de préférence au plus 2 800 m2, plus de préférence 2 500 m2, le plus de préférence 2 200 m2. De préférence, la surface de croissance cellulaire fournie par les supports est d'environ 2 000 m2.

Dans un mode de réalisation préféré, le bioréacteur utilisé dans le procédé et/ou le système de l’invention est un bioréacteur de petite taille. Ledit bioréacteur peut être un bioréacteur circulaire ayant un diamètre d’au moins 30 cm, de préférence au moins 40 cm et au plus 70 cm, de préférence au plus 60 cm, plus de préférence au plus 50 cm. Ledit bioréacteur peut également être un bioréacteur rectangulaire ou carré ayant une hauteur d'au moins 40 cm, de préférence au moins 50 cm, plus de préférence au moins 60 cm et au plus 110 cm, de préférence au plus 100 cm, plus de préférence au plus 80 cm, le plus de préférence au plus 70 cm. La largeur dudit bioréacteur rectangulaire ou carré est d'au moins 40 cm, de préférence au moins 50 cm, plus de préférence au moins 60 cm et au plus 100 cm, de préférence au plus 90 cm, plus de préférence au plus 80 cm, le plus de préférence au plus 70 cm.

Le bioréacteur peut être mis en rotation ou subir un mouvement augmentant de ce fait le transfert d'oxygène et assurant l'équilibre gazeux dans ledit bioréacteur. Cela permet de diriger des cultures dans un bioréacteur qui est exempt de capteurs fournissant de ce fait une installation de bioréacteur simple et moins compliquée en comparaison aux bioréacteurs de la technique antérieure. De plus, l'utilisation d'un bioréacteur exempt de capteurs permet une diminution considérable du risque de contamination. Faire subir un mouvement au bioréacteur améliore en outre la collecte de cellules. En effet, collecter des cellules à partir d'un bioréacteur contenant des supports, comme des fibres ou des bioréacteurs à microfibres a été difficile à accomplir. De manière classique ; les cellules sont collantes et s'attachent aux supports ou à d'aütres cellules et forment des agrégats. Faire subir un mouvement au bioréacteur force les cellules libres procurant de ce fait un rendement accru de collecte de cellules à des viabilités de cellule élevées sans utiliser d'additifs de libération chimiques ou enzymatiques. Le bioréacteur peut avoir un corps extérieur rigide ou non rigide. Un corps extérieur rigide permet à l'enveloppe de bioréacteur d'être fléchie provoquant le mouvement de microfibres. Ce mouvement améliore la libération des cellules qui se sont attachées au côté de la matrice de bioréacteur.

Dans un mode de réalisation préféré, le bioréacteur est un bioréacteur à perfusion. De préférence, le bioréacteur est muni d'une admission unique. Plus de préférence, du gaz et du milieu de culture sont introduits dans le bioréacteur par la même admission. La perfusion de gaz et de milieu de culture dans le bioréacteur via une admission unique minimise les risques de contamination comme seulement une admission du bioréacteur doit être reliée à une conduite de perfusion. De plus, le bioréacteur est de ce fait muni d'un système aisé de connexion et de déconnexion à la conduite de perfusion simplifiant de ce fait sa séparation du système si le bioréacteur a besoin d'être remplacé par exemple. Un exemple de bioréacteur approprié à utiliser dans le procédé et/ou le système de l'invention est représenté à la figure 1. Le bioréacteur 1 est un bioréacteur à perfusion ayant une forme de beignet et est environ à moitié rempli de milieu de culture 2 pendant la culture de cellules.

De préférence, le bioréacteur est muni d'au moins une admission pour l’introduction de gaz et/ou de milieu de culture et d'au moins une sortie pour la collecte du produit de culture et/ou du milieu contenu dans le bioréacteur. Au moins une tubulure d'entrée est prévue pour relier à fluide le bioréacteur, via son admission, à un réservoir de milieu de culture et/ou une source gazeuse. Au moins une tubulure de sortie est prévue pour relier à fluide le bioréacteur, via sa sortie, à une unité aval et/ou tout autre dispositif.

Dans un mode de réalisation préféré, le bioréacteur peut être relié de façon amovible à un conteneur de milieu de culture de cellules. On fournit le milieu de culture dans l’admission de bioréacteur en utilisant au moins une pompe. De préférence, le milieu est préchauffé à une température entre 25 °C et 37 °C et mélangé avant transfert au bioréacteur. Cela assure que les cellules ne percevront pas de choc thermique en étant mises en contact avec le nouveau milieu (ce qui affecterait négativement leur croissance) aussi bien que d’assurer que toutes les substances nutritives dans le milieu sont mélangées et présentes dans les quantités exigées. Le milieu peut être un liquide comprenant un mélange bien défini de sels, d'acides aminés, de vitamines et un ou plusieurs facteurs de croissance protéiques. Le milieu de culture sert à délivrer des substances nutritives à la cellule et à l'inverse, à enlever ou à empêcher une accumulation toxique de déchets métaboliques.

On fournit également du gaz comme de l’oxygène pur ou un mélange gazeux comprenant de l’oxygène à travers l’admission du bioréacteur. L’oxygène est une exigence essentielle pour la croissance normale de cellules mammifères. De préférence, ledit gaz ou mélange gazeux est fourni sous pression. Dans un mode de réalisation, les cellules seront exposées 9 des concentrations d’oxygène dissous de 300 pM ou moins (160 mmHg de pression partielle), de préférence moins de 200 μΜ, le plus de préférence entre 20 et 150 μΜ.

Dans un mode de réalisation préféré, un gaz ou mélange gazeux et un milieu de culture seront mélangés avant d'être fournis au bioréacteur. Donc, le mélange de gaz ou mélange gazeux et de milieu de culture est fourni par l’intermédiaire d'une seule conduite d’alimentation. Cela procure comme un avantage en ce qu'un milieu cellulaire ayant une concentration d’oxygène optimale est directement fourni aux cellules. Dans un mode de réalisation supplémentaire préféré, ledit gaz ou mélange gazeux est choisi à partir d’air ou d’oxygène. De préférence, on utilise de l’air. L’air doit être vu comme un mélange gazeux, comprenant approximativement 78 % d’azote, 21 % d’oxygène et de l’argon et du dioxyde de carbone. L’alimentation en air au lieu d’oxygène pur ou d'atmosphère enrichie en oxygène a comme avantage que le système utilisant le procédé peut être exempt d'unités d’alimentation en oxygène hautement concentré, ce qui peut impliquer par ailleurs un danger d’explosion ou d'incendie.

La faible solubilité de l’oxygène dans un milieu aqueux (comme un milieu de culture de cellules) par rapport à son taux de consommation amène son débit d’alimentation à être un facteur de limitation pour la croissance cellulaire. De manière générale, le débit de transfert d’oxygène dans un dispositif de fermentation ou un bioréacteur est décrit par : OTR = KLa(Cgaz Cliq), Où OTR = débit de transfert d’oxygène en pmole O2 l^h'1 ;

Ki_a = est le coefficient de transfert d’oxygène en h'1 ;

Cgaz = concentration O2 (équilibre) en phase gazeuse en pM ;

Ciiq = concentration O2 en phase liquide en μΜ

De préférence, le coefficient de transfert d'oxygène (Ki.a) dans le procédé courant est d'au moins 20 h"1, de préférence au moins 30 h1, plus de préférence au moins 35 h'1. Ledit coefficient de transfert d'oxygène est au plus de 100 h'1, de préférence au plus 50 h'1, plus de préférence au plus 40 h'1.

Un coefficient de transfert d'oxygène élevé et par conséquent un OTR également élevé auront une influence positive sur la croissance / santé cellulaire et donc sur le rendement du produit fini souhaité. Les inventeurs du procédé courant ont trouvé qu'un coefficient de transfert d'oxygène tel que précédemment défini est particulièrement avantageux en termes de rendement de produit, même en se servant d'une quantité plutôt petite de culture cellulaire de départ.

Dans un mode de réalisation préféré, le bioréacteur du système et/ou le procédé de l'invention comprennent des supports et sont soumis à mouvement. Les supports et le mouvement augmentent d'une façon synergétique le coefficient de transfert d'oxygène dans le bioréacteur. Faire subir un mouvement au bioréacteur, qui est au moins partiellement rempli du milieu de culture, fait qu'une partie des supports se déplace d'une phase liquide, dans laquelle ils sont en contact avec le milieu de culture, à une phase gazeuse, dans laquelle ils ne sont pas en contact avec ledit milieu. Ce taux de transfert d'oxygène est accru d'au moins 10 fois en comparaison aux bioréacteurs de la technique antérieure.

Dans un mode de réalisation particulier, le système est muni des connexions nécessaires et appropriées pour détourner les déchets de culture de cellules dans un conteneur de déchets.

Le bioréacteur du système peut être relié à fluide à au moins une unité aval. Dans un mode de réalisation préféré, l’unité aval comprend un moyen enfichable sélectionné à partir du groupe comprenant au moins un moyen de filtration, au moins un moyen de collecte, au moins un moyen de dialyse, au moins un moyen de purification de biomolécules et au moins une unité de concentration protéique ou n'importe quelle combinaison de celles-ci.

Dans un mode de réalisation préféré, l'unité aval comprend au moins un moyen de collecte qui est muni d'au moins une admission et d'au moins une sortie. Ledit moyen de l’unité aval peut être relié à l’unité de culture de cellules du système. De préférence la connexion est réalisée en reliant la tubulure de sortie de bioréacteur audit moyen de collecte. Le moyen de collecte comprend au moins une tubulure pour diriger le surnageant recueilli vers un autre composant de l’unité aval. Le moyen de collecte comprend en outre au moins une pompe pour extraire le surnageant du bioréacteur.

Dans un mode de réalisation préféré, l’unité aval comprend au moins un moyen de filtration qui est muni d'au moins une admission et d'au moins une sortie. Ledit moyen peut être relié à fluide au bioréacteur par sa tubulure de sortie ou relié à fluide au moyen de collecte de l’unité aval. De préférence, le moyen de filtrage comprend un filtre qui retiendra de manière sélective des molécules sur la base de leur masse en Dalton par exemple. Le moyen de filtration peut comprendre des filtres creux viraux qui peuvent être utilisés pour filtrer et enlever des particules virales depuis le surnageant. Dans ce cas, la filtration virale travaille sur le principe d'exclusion par taille. Quand une solution protéique avec une contamination virale possible est introduite dans ces filtres creux, les protéines plus petites pénètrent dans la paroi de filtre et font leur chemin jusqu'à l’extérieur du filtre tandis que les particules virales plus grandes sont retenues.

Dans un mode de réalisation préféré, l’unité aval comprend au moins un moyen de purification qui est muni d'au moins une admission et d'au moins une sortie. Ledit moyen peut être relié à fluide au bioréacteur par sa tubulure de sortie ou relié à fluide au moyen de collecte ou au moyen de filtration de l’unité aval. De préférence, le moyen de purification comprend au moins un dispositif de sélection comme on l'a précédemment décrit.

Dans un mode de réalisation préféré, le système comprend une unité de culture de cellules et une unité aval. L'unité de culture de cellules comprend au moins un bioréacteur pour cultiver des cellules. Ledit bioréacteur est relié à un réservoir de milieu de culture pour recevoir du milieu de culture. Pour relier l'unité de culture de cellules à une unité aval ou à une autre unité ou dispositif, au moins une tubulure de sortie attachée à une sortie du bioréacteur est prévue. Ladite tubulure de sortie est appropriée pour être reliée à l’admission de moyen de collecte, à l'admission de moyen de filtrage ou à l'admission de moyen de purification d'une unité aval reliant de ce fait à fluide les deux unités l'une à l'autre. Dans un mode de réalisation préféré supplémentaire, la tubulure de sortie de bioréacteur est reliée à l'admission de moyen de collecte. La sortie de moyen de collecte est reliée à une admission de moyen de filtration et la sortie de moyen de filtration est reliée à l'admission de moyen de purification.

La personne habile dans la technique appréciera que l'on puisse fournir la tubulure et/ou la pompe nécessaires à l'intérieur du système pour parvenir à la connexion à fluide entre les différents compartiments de l'unité de culture de cellules et/ou de l'unité aval. De plus, le système peut être muni d'une pluralité de vannes de commutation utilisées pour acheminer les fluides entre lesdits compartiments différents. De plus, on peut fournir un logiciel pour faire tourner le système et le procédé selon un mode de réalisation de l’invention.

Le procédé et/ou le système de la présente invention peuvent être utilisés pour la culture de n'importe quelle lignée cellulaire et/ou pour la production de n'importe quelle protéine et n'importe quel peptide souhaités. Des lignées cellulaires cultivées possibles sont les cellules Vero, les cellules CHO, les cellules COS, les cellules 293T, les cellules HeLa, les cellules Hep-2, les cellules MCF-7, les cellules U373 ou toute autre lignée cellulaire.

Le procédé et/ou le système peuvent être utilisés pour la production de : - vaccins humains comme, de manière non exhaustive, le vaccin contre la poliomyélite (IPV), le vaccin contre le Rotavirus, le vaccin contre la Grippe, le vaccin contre la Fièvre Jaune, le vaccin contre la Varicelle, les vaccins contre la Rougeole, les Oreillons, la Rubéole, l'Hépatite et la Rage ; - vaccins vétérinaires comme, de manière non exhaustive, le vaccin contre la maladie de Marek et le vaccin contre la maladie de Newcastle.

On suppose que la présente invention n'est limitée à aucune forme de réalisation précédemment décrite et que certaines modifications peuvent être ajoutées à l'exemple de fabrication présenté sans réévaluation des revendications annexées. L'invention est en outre décrite par les exemples non limitatifs suivants qui représentent de plus l'invention et ne sont pas destinés à, ni ne devraient être interprétés pour, limiter la portée de l'invention.

EXEMPLES

Exemple 1 :

Production d'un vaccin contre le Rotavirus

Le rotavirus appartient à la famille de virus Reoviridae. Le rotavirus provoque une gastro-entérite aiguë sévère avec diarrhée et vomissements, principalement chez des nourrissons et des jeunes enfants. Le vaccin contre le rotavirus est un vaccin délivré oralement. Donc, l’antigène n'a pas besoin d'être purifié ; seulement un ajustement du pH et de la concentration est nécessaire et l'ajout d'excipients. De manière facultative, une lyophilisation peut également être souhaitée.

Le vaccin a été obtenu à partir de cellules Vero. Les cellules ont été cultivées selon le procédé de l'invention courante et en utilisant le système de l'invention courante. Les cellules ont été cultivées dans le bioréacteur jusqu'à ce que 100 millions de cellules par ml aient été atteints. Les cellules ont été par la suite inoculées avec une lignée de rotavirus. Un bioréacteur à perfusion a été utilisé, permettant la collecte continue de surnageant avec des particules virales. Le surnageant a été filtré par diafiltration afin d'enlever les débris de cellules et de parvenir à un produit viral pur. Une diafiltration supplémentaire a été mise en œuvre pour l'ajustement de la concentration et du pH final du vaccin.

Exemple 2 :

Production d'un vaccin contre la poliomyélite

La poliomyélite est une maladie transmissible aiguë chez les humains provoquée par un entérovirus humain de la famille Picornaviridae. Le vaccin contre la poliomyélite peut se servir d'un vaccin oral atténué vivant contre la poliomyélite ou un vaccin inactivé pour injection.

La production du vaccin injectable a été effectuée dans des cellules Vero. Les cellules ont été infectées et le surnageant comprenant des cellules lysées et des particules virales a été recueilli dans un mode continu selon la présente invention. Dans une étape suivante, le surnageant a été purifié obtenant de ce fait un vaccin hautement pur.

Exemple 3 : Vaccins contre la maladie de Marek ou contre la maladie de Newcastle

La maladie de Marek est une infection de virus d'Herpès de poulets et rarement de dindes en association proche avec des poulets, vue dans le monde entier. La maladie de Newcastle est une maladie aviaire contagieuse affectant de nombreuses espèces aviaires domestiques et sauvages provoquée par le virus de Newcastle. Les deux vaccins exigent la combinaison de cellules fibroblastiques embryonnaires de poulet et de particules virales. Le vaccin contre la maladie de Marek et le vaccin contre la maladie de Newcastle sont présentés dans une forme associée à une cellule gelée. Les cellules et les particules virales sont très fragiles et exigent une manipulation soigneuse pour éviter des dégâts ou une perte de titre afin de parvenir à une efficacité optimale. Les vaccins sont sous forme injectable. De manière classique, les vaccins pour les deux virus sont produits dans des flacons roulants. Ces derniers exigent des conditions d'équipement énormes aussi bien qu'une entrée de milieux. Par-dessus le marché le procédé de production est très coûteux en main-d'œuvre. L'invention courante a surmonté ces problèmes.

Des cellules fibroblastiques embryonnaires de poulet ont été cultivées sur des microsupports dans un système selon l'invention courante. Les cellules ont été superinfectées avec l'un ou l'autre virus contre la maladie de Marek ou contre la maladie de Newcastle. Afin de récupérer les cellules à partir des fibres dans le bioréacteur (aussi bien que les particules virales) le bioréacteur a été soumis à une agitation / vibration. Les cellules avec des particules virales ont été récupérées et traitées en outre dans l'unité d'application aval.

Claims (15)

1. REVENDICATIONS

   1. Procédé automatisé intégré pour la production d’antigènes comprenant : a. la culture de cellules dans au moins un bioréacteur à densité de cellules élevée, reliant de ce fait à fluide ledit bioréacteur à une alimentation en milieu de culture et à un gaz ou mélange gazeux ; b. liaison à fluide dudit bioréacteur avec une unité aval ; et c. croissance des cellules à une densité d'au moins 50 millions de cellules par ml ; dans lequel le volume total de bioréacteur est d'au moins 10 litres et d'au plus 900 L.
2. 2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel le volume total de bioréacteur est au plus de 800 L, de préférence au plus 700 L, plus de préférence au plus 500 L.
3. 3. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel ledit milieu de culture et le gaz ou mélange gazeux sont fournis audit bioréacteur par une conduite d’alimentation unique.
4. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le coefficient de transfert d’oxygène (kLa) dans le bioréacteur est d'au moins 20 h1.
5. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel ladite unité aval reçoit du milieu de culture complété en provenance dudit bioréacteur en mode continu, ledit milieu de culture complété comprend du milieu de culture et/ou des cellules cultivées et/ou des produits desdites cellules cultivées comprenant des protéines, des peptides et/ou toutes autres biomolécules de cellule tirées de la lyse de cellule comme des membranes cellulaires.
6. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel ladite unité aval reçoit au plus 1 000 ml/min de milieu de culture complété en provenance dudit bioréacteur.
7. 7. Procédé selon n’importe laquelle des revendications précédentes, dans lequel le milieu de culture complété reçu par l’unité aval subit au moins un processus sélectionné à partir du groupe comprenant la filtration, la collecte, la dialyse, la purification de biomolécules et la concentration protéique ou n’importe quelle combinaison de celles-ci.
8. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel ledit bioréacteur est un bioréacteur à perfusion ou un bioréacteur muni de supports fournissant une surface de croissance cellulaire d'au moins 1 000 m2.
9. 9. Système pour la production de biomolécules comme des protéines ou des peptides, comprenant une unité de culture de cellules et une unité aval qui sont reliées à fluide l'une à l'autre, ladite unité de culture de cellules comprend au moins un bioréacteur à perfusion, qui permet la croissance de cellules à une densité d'au moins 50 millions de cellules par ml, et un moyen d'alimentation pour alimenter ledit bioréacteur en milieu de cellule et en gaz ou mélange gazeux, caractérisé en ce que le volume total de bioréacteur est d'au moins 10 litres et d'au plus 900 L.
10. 10. Système selon la revendication 9, dans lequel le volume total de bioréacteur est au plus de 800 L, de préférence au plus 700 L, plus de préférence au plus 500 L.
11. 11. Système selon l'une quelconque des revendications 9 et 10, dans lequel le bioréacteur est un bioréacteur à perfusion.
12. 12. Système selon l'une quelconque des revendications 9 à 11, dans lequel ledit bioréacteur est muni de supports.
13. 13. Système selon la revendication 12, dans lequel lesdits supports fournissent une surface de croissance cellulaire d'au moins 1 000 m2.
14. 14. Système selon l'une quelconque des revendications 9 à 13, dans lequel ladite unité aval comprend un moyen enfichable sélectionné à partir du groupe comprenant au moins un moyen de filtration, au moins un moyen de collecte, au moins un moyen de dialyse, au moins un moyen de purification de biomolécules et au moins une unité de concentration protéique ou n’importe quelle combinaison de ceux-ci.
15. 15. Système selon l'une quelconque des revendications 9 à 14, dans lequel ledit système est mis en œuvre dans une chambre transportable, appropriée pour une chambre propre transportable.