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CELLULE RTA, APPAREIL ET PROCEDE POUR TITRER UN POLYNU- CLEOTIDE DANS UN LIQUIDE
La présente invention concerne des titrages bio- chimiques et, de manière plus particulière, des titrages pour la mise en oeuvre desquels on utilise une étiquette capable d'émettre un rayonnement décelable en vue d'iden- tifier un acide nucléique et la mesure de la concentra- tion et de l'intercorrélation entre acides nucléiques choisis et leurs fragments.
Une technique connue de titrage chimique et bio- chimique, telle que celle décrite dans les brevets des E.U.A. n 4 133 639, 4 321 057,4 399 099,4 447 546 et autres, comprend un système optique faisant appel aux principes d'une spectroscopie à réflexion totale atténuée (RTA). Pour la cellule de RTA, un tel système optique utilise un guide d'onde optique, typiquement une fibre optique, une tige ou barre ou une plaque. Lorsque l'une des extrémités de la cellule est illuminée par un rayon- nement d'excitation, ce rayonnement subit une réflexion totale interne, de façon à créer une onde évanescente à la surface de la cellule.
Le rayonnement d'excitation est choisi de façon que l'onde évanescente excite la fluorescence dans des substances à titrer et situées dans une mince zone seulement (typiquement d'une épais- seur de quelques centaines à un millier d'unités Angstm) entourant la surface de la cellule. La fluorescence qui en résulte peut fournir une information à partir de la- quelle on peut titrer la matière fluorescente. On a utilisé de tels systèmes jusqu'à ce jour, en vue de titrer, par exemple, des substances antigéniques, de produits chimiques et analogues.
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Il est également bien connu que l'information généti- que dirigeant la synthèse de séquences d'amino-acides ou acides aminés en protéines s'effectue par l'acide désoxy- ribonucléique (ADN) ou l'acide ribonucléique (ARN), qui sont tous deux des molécules complexes, très longues, qui se présentent habituellement sous la forme d'une double hélice. Etant donné que l'ADN ou l'ARN sont ubiquistes dans toute matière vivante sous des formes uniques pour chaque espèce, la nature de l'acide nucléique ou de ses fragments uniques (que l'on appellera collectivement dans la suite du présent mémoire : polynucléotides) peut ser- vir pour déterminer ou déceler la présence d'une espèce donnée. Par exemple, tous les gènes viraux contiennent de l'ARN ou de l'ADN.
On peut aisément isoler de tels acides nucléiques viraux de l'enveloppe ou couche de pro- téines et ils sont actuellement disponibles sous une forme fortement purifiée. Nombre des acides nucléiques viraux sont linéaires et à double brin (ADN dans des virus tels que celui de la variole et SV40. par exemple, et ARN dans des virus tels que les réovirus). Les acides nucléiques à un seul brin peuvent toujours se convertir en acides nucléiques à double brin pour autant que des brins uni- ques complémentaires soient disponibles. Les doubles brins de l'acide nucléique peuvent être séparés en soumettant cet acide nucléique à des conditions de dénaturation (par exemple pH élevé ou faible, hautes températures, réactifs tels que l'EDTA et la guanidine qui brise les liaisons hydrogène , etc. ).
La dénaturation sépare non seulement habituellement l'acide nucléique en brins uniques, mais peut également provoquer la rupture des brins en un im- portant assortiment imprévisible de fragments qu'il est extrêmement difficile de séparer les uns des autres sous une forme identifiable. On utilise fréquemment des en- zymes de restriction pour briser des acides nucléiques en des endroits ou sites spécifiés pour créer une multiplicité
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de fragments qui sont laborieusement séparés par mise en oeuvre de techniques électrophorétiques et d'autresencore, consommatrices de temps, en vue de leur identification dé- finitive.
La présente invention a donc pour objet principal un appareil et un procédé destinés au titrage ou à la détec- tion de fractions ou parties d'acides nucléiques ou de polynucléotides, lesquels appareils et procédés permet- tent d'identifier la source génétique de la partie ou fraction de manière non ambiguë et rapide. Un autre objectif important de la présente invention réside dans un appareil et un procédé de ce genre que l'on peut met- tre en oeuvre directement sur un échantillon contenant des fragments d'acides nucléiques sans devoir au préalable séparer les fragments en groupes homogènes. L'invention a également pour objet l'application au problème de la détection et de l'identification d'acides nucléiques, de la sensibilité et de la simplicité de titrages à flu- orescence faisant appel à des fibres optiques.
Ces objectifs et d'autres encore sont atteints, conformément à la présente invention, par un appareil et un procédé de titrage fluorescent de polynucléotides ou de fractions, parties ou fragments d'acides nucléiques assujettis ou liés à la surface d'une cellule allongée à réflexion totale atténuée (RTA). N'importe quel acide nucléique à double brin présent dans l'échantillon à soumettre au titrage est dénaturé, par exemple, par chauf- fage jusqu'à environ 80 C, de façon à former des brins singuliers de l'acide nucléique. La dénaturation peut être facilitée par l'addition de chélateurs de façon à éliminer des ions stabilisants, tels que Mg++. On peut briser les brins singuliers en séquences de longueur sou- haitée par le recours à des enzymes de restriction appro- priées connues.
Des parties ou fractions choisies de brins singuliers d'acide nucléique à double brin,
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caractéristique de l'espèce à identifier, séparés, par exemple par électrophorèse ou chromatographie en phase liquide, sont assujettis sur le côté le moins optique- ment dense d'une interface à former entre des milieux d'indices de réfraction différents (par exemple une cellule RTA sous la forme d'un prisme,.d'une tige ou barre ou d'un élément optique fibreux et un échantillon de liquide suspecté de contenir l'acide nucléique à déceler ou titrer).
On refroidit alors graduellement l'échantillon en contact avec l'interface ; la me- sure où une partie des brins uniques de l'acide nuclé- ique dans l'échantillon est complémentaire de la partie ou fraction d'acide nucléique à brin unique initialement liée à l'interface, une portion de l'acide nucléique lié sera hybridée avec l'acide nucléique de l'échantillon.
Les polynucléotides quelconques qui ont subi une renaturation avec les parties liées à la surface de la cellule, peuvent à présent être colorés avec un colorant fluorochromique spécifique de polynucléotides à double brin (par exemple,de préférence sous forme dimère pour accroltre la spécificité et la stabilité de la liaison).
En alternative, pour la liaison compétitive, on peut uti- liser des brins singuliers complémentaires pré-marqués ou pré-étiquetés du.polynucléotide, dont la présence doit être décelée ou titrée dans l'échantillon. Les apparie- ments partiels peuvent être éliminés en ajoutant à ce moment une enzyme qui scinde ou clive la double hélice lorsque des fragments à brin unique dans l'échantillon ne forment pas de double brin avec les parties ou frac- tions liées. Une extrémité de la cellule est ensuite illuminée avec un rayonnement d'excitation qui subit une réflexion totale interne dans la cellule, de manière à créer une onde évanescente à la surface de la cellule de RTA.
On choisit le rayonnement d'excitation de façon que l'onde évanescente excite le fluorochrome sur les poly-
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nucléotides colorés dans seulement la mince zone entou- rant ou enveloppant la surface de la cellule de RTA. Si la longueur de chaîne s'adpate dans la zone illuminée par l'onde évanescente, la fluorescence qui en résulte est une mesure des polynucléotides à double brin liés à la surface de la cellule et, par conséquent, une mesure de l'acide nucléique dans l'échantillon complémentaire de l'acide nucléique préchargé sur la cellule de RTA. Les mesures de la durée de vie de la fluorescence peuvent également permettre de mesurer l'efficience quantique du fluorochrome et, par conséquent, le degré d'appariement entre les polynucléotides initialement liés à l'interface et ceux complexés à elle à partir de l'échantillon.
Ceci permet d'établir une distinction parmi des émissions pro- venant du colorant spécifiquement lié, du colorant atypi- que ou moins spécifiquement lié et du colorant non lié, améliorant ainsi les rapports signal-fond.
D'autres objectifs de la présente invention appa- raitront en partie évidents et apparaîtront en partie dans la suite du présent mémoire. Par conséquent, l'in- vention a pour objet l'appareil possédant la construction, la combinaison d'éléments et l'agencement des organes et le procédé impliquant les diverses étapes et la relation et l'ordre d'une ou plusieurs de ces étapes les unes par rapport aux autres que l'on illustre dans la description détaillée qui suit, ainsi que les revendications les dé- finissent par leur portée.
Afin de mieux comprendre la nature et les objets de la présente invention, on se référera à présent à la description détaillée qui suit, réalisée en référence aux dessins annexés, sur lesquels les mêmes notations de référence se rapportent à des éléments identiques et où la figure 1 représente une vue en coupe transversale longitudinale d'une trousse ou set de titrage conforme aux principes de la présente invention et la figure 2
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représente une vue de bout de la forme de réalisation re- présentée sur la figure 1.
Il faut bien comprendre que dans la description dé- taillée de l'appareil suivant la présente invention, la référence à des parties " supérieures" et "inférieures" de l'appareil s'effectue totalement pour des raisons de commodité et pour amener la description en corrélation avec les illustrations schématiques des dessins. Il faut aussi comprendre que l'appareil peut fonctionner en n'importe quelle position ou orientation et par consé- quent, ceci fait partie de la portée de la présente in- vention. Il faut également saisir que la représentation telle qu'elle apparalt sur les figures est schématique et que, par conséquent, elle ne vise nullement à donner des échelles ou des rapports réels.
La présente invention se réalise par un rayonnement d'excitation à réflexion totale interne le long d'une cellule de RTA, laquelle excitation excite la fluorescence qui reflue dans la cellule et la détection de cette fluo- rescence, le tout comme décrit dans la demande de brevet des E.U.A. co-pendante, N de série 406 324, déposée le 9 août 1982 et cédée au cessionnaire de la présente de- mande et à laquelle on peut se référer pour obtenir de plus amples détails relatifs au mode optique de mise en oeuvre de l'invention.
Sur la figure 1, on a représenté une vue en coupe transversale longitudinale d'une trousse de titrage 20 réalisée conformément aux principes de la présente in- vention. Suivant une forme de réalisation préférée, la trousse 20 comprend une cellule de RTA 22, un boîtier 24 et un châssis 26.
La cellule 22 est de préférence un corps allongé, sensiblement cylindrique, optiquement transparent, qui se présente, de manière typique, sous la forme d'une tige ou d'une fibre optique s'étendant depuis son extrémité
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proximale ou face d'entrée 28 jusqu'à une extrémité dis- tale ou terminale 30. La cellule 22 est adaptée à assurer la propagation tout au long de sa longueur, par des ré- flexions totales internes multiples, de rayonnements opti- ques pénétrant par la face 28 dans un angle solide établi, sensiblement rotationnellement symétrique autour de l'axe longitudinal de la cellule.
Lorsque la cellule est une fibre telle que celle représentée sur la figure 1 ((et à des fins d'exposition, on se référera dans la suite du présent mémoire à une telle cellule 22 dans son contexte), ainsi que les spécialistes des fibres optiques le savent parfaitement, l'angle d'acceptation maximale eu égard à l'axe de la fibre, B, pour le rayonnement entrant dans la fibre et se propageant ainsi en elle, est établi par les indicesde réfraction de la fibre et du milieu environnant.
A la face 28, la surface de la fibre est typiquementplane, est disposée normalement au long axe de la fibre et est de préférence fortement polie de manière à minimiser les ter- nissement ou les défauts surfaciques qui pourraient ten- dre à diffuser ou diffracter leur rayonnement d'excita- tion incident.
Pour un rayonnement se propageant initialement à tra- vers un milieu d'indice de réfraction n , incident sur une fibre d'indice de réfraction n , par ailleurs enve- loppée ou entourée d'une matière d'indice de réfraction N2 , l'angle d'acceptation maximal est donné par l'équation qui suit : (1) NA = n 0 sinB = en 1 2 - n22) 1/2 où NA est ce que l'on appelle l'ouverture numérique de la fibre. 'A titre d'exemple non limitatif, la fibre 22 peut être en n'importe laquelle d'un grand nombre de matières optiquement transparentes, comme le verre, le quartz, le polypropylène, des polyoléfines, le nylon, et analogues,
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choisies de façon à posséder un indice de réfraction su- périeur à celui de l'échantillon du fluide à titrer.
L'échantillon est typiquement constitué par une solution aqueuse possédant un indice de réfraction proche de 1,33.
Il faut également comprendre que la matière constitutive de la fibre 22 est également choisie de façon à être re- lativement insoluble et non réactive sur le liquide de l'échantillon. Bien que le calibre.de la fibre 22 puisse varier selon qu'on le souhaite, on a constaté qu'une fibre ou tige d'un diamètre allant d'environ 1 mm à quelques centaines de microns et d'une longueur aussi réduite que
5 mm, était adéquate pour la plupart des titrages, étant cependant entendu qu'une telle longueur et un tel diamètre sont simplement,illustratifs et non limitatifs.
Suivant une forme de réalisation préférée conformé- ment à laquelle la fluorescence induite à la surface de la fibre par le rayonnement d'excitation libéré à travers la fibre, est recueillie ou observée à la même extrémité proximale de la fibre à laquelle le rayonnement d'excita- tionest injecté, il est souhaitable d'empêcher un rayonnement vagabond ou de dispersion de redescendre la fibre à par- tir de la face 30 vers la face 28. Par conséquent, la face 30 peut être façonnée de façon'à arrêter la lumière incidente à l'intérieur, mais est de préférence revêtue d'une matière s'appariant à l'indice de réfraction du milieu environnant la face 30, une telle matière étant à la fois non fluorescente et absorbante vis-à-vis du rayonnement d'excitation.
De manière typique, une résine époxyde chargée de noir de carbone remplit une telle fonction.
Suivant une forme de réalisation illustrative, la partie opératoire de la surface de la fibre est définie par la région activée à laquelle on doit réaliser le ti- trage. Pour activer la surface de la partie opératoire de la fibre 22, cette dernière est traitée, de manière typique, pour réaliser le revêtement 32 en liant en
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premier lieu une amine aromatique à la surface de la fibre à titre d'agent pour obtenir une copulation diazo- Ique au polynucléotide ou à l'acide nucléique à un seul brin. L'amine aromatique doit être couplée à la surface de la fibre par l'intermédiaire d'un élément d'espacement de façon à ce que l'amine soit libre de réagir sans être stériquement empêchée par le verre.
Un certain nombre de techniques de couplage avec élément d'espacement de ce genre que l'on peut utiliser sont bien connues et sont d'ailleurs illustrées dans les exemples qui suivent : EXEMPLE 1
Les groupement hydroxyle sur la surface du verre (que.l'on appellera dans la suite du présent mémoire "G") peuvent être couplés par du triméthoxysilane substitué par une chaîne de radicaux méthylène possédant un groupe amine aromatique en bout de chaîne, typiquement
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Ce réactif est mis dans le commerce par la société , Petrarch Chemical Company.
Le réactif en question, lors- qu'il est en solution,de préférence tamponnée jusqu'à un pH de 8, réagit sur les radicaux hydroxyle du verre (G) de façon à éliminer du méthanol et à former une liaison siloxane comme suit :
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EXEMPLE II
En alternative, on peut coupler à la surface de verre un réactif constitué de deux radicaux époxydes raccordés par une chaîne méthylénique.
Par exemple, en utilisant un excès du réactif en solution fortement al- caline (typiquement NaOH) pour empêcher un trop grand nombre d'extrémités de chaque molécule de réactif de se coupler au verre, la réaction suivante s'opère de façon à engendrer une liaison éther :
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Si l'on fait à présent réagir ce dernier intermé- diaire sur un composé sulfhydrylique ou un thiol, on forme une liaison thioéther comme suit
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EXEMPLE III
Un autre couplage encore peut être réalisé par l'in- termédiaire d'une liaison d'amine aliphatique, comme suit:
(4) G(OH)3 + (CH3O)3-Si- (CH2)3-NH2 # GOSi-(CH2)3-NH2
Au produit de la réaction ci-dessus, on ajoute, à un pH de 8, un excès d'isothiocyanate double avec une chaîne
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méthylénique intermédiaire, de façon à engendrer une liaison thio-urée :
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L'addition d'un excès d'amine aromatique double, à un pH de 8, achève la formation du composé aromatique souhaité, c'est-à-dire
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EXEMPLE IV
Une quatrième technique de couplage au verre en- gendrant un produit inhabituelle ment stable, consiste à traiter le verre à un pH de 8 par un triméthoxysilane possédant un radical chlorobenzyle
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On fait réagir le produit de cette réaction, à un pH de 9, sur l'amine aromatique possédant un radical nitro:
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Ensuite, on traite le produit de la réaction par un agent puissamment réducteur, comme le dithionite de sodium à un pH de 6, de façon à réduire le radical nitro en amine aromatique comme suit :
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L'amine aromatique produite par n'importe laquelle des techniques susmentionnées, peut être utilisée pour lier l'acide nucléique à un seul brin souhaité. A titre d'étape préliminaire, il faut traiter l'amine aromatique liée au verre (que l'on appellera dans la suite du pré- sent mémoire GA-#NH2) par de l'acide nitreux (solution de nitrite acide) autour de 0 C.
Ceci engendre un produit intermédiaire que l'on fait ensuite réagir, à un pH de 8, sur du poly-T (que l'on appellera dans la suite du pré- sent mémoire (TTT), un ADN synthétique connu, dont la seule basé est la thymidine), le tout comme décrit ci- dessous :
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Il est connu que des cellules tendent à produire des brins d'acide nucléique espacés par de courts brins de polyadénine. Par conséquent, ce dernier produit est à présent amené à réagir sur la fraction d'adénine typi- quement présente au début d'une molécule d'acide nuclé- ique à un seul brin (que l'on appellera dans la suite du présent mémoire AAA-NUC) présentant de l'intérêt pour former la fraction d'acide nucléique liée à la surface de la fibre.
Dans la mesure où l'adénine est le conjugué
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de la thymidine, cette dernière formera double brin en présence de Mg+, à un pH de 7, à la température ambiante, pour former une liaison.
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La liaison à double brin peut à présent être rendue permanente en traitant les conjugués adénine-thymidine.par du psoralène (6-lactone de l'acide 6-hydroxy-5-benzofu- rane acrylique) ou tout autre agent de réticulation. On préfère le psoralène parce qu'il est relativement non volatil et qu'il est aisément activé par un rayonnement ultraviolet. Bien que la réaction soit parfaitement @ connue, son utilisation pour rendre l'hybridation irré- versible est supposée être nouvelle. Pour une hybridation appropriée, le segment d'ADN lié doit avoir une longueur d'au moins 10 bases; bien qu'un plus grand nombre de bases puisse être nécessaire pour une spécificité raisonnable.
Il faut voir que cette technique lie la fraction de l'ADN non utilisée dans sa reconnaissance, c'est-à-dire la chaîne polyadéninique présente au début. Le but de pratiquer de . la sorte sert à éviter des problèmes survenant de la fixation possible de la liaison diazoïque à une partie de la sé- quence de reconnaissance de l'acide nucléique à double brin lié. En d'autres termes, la réaction sur le psoralène permet l'attachement à une extrémité de la séquence d'aci- des nucléiques sans colmater ou obstruer le site ou endroit de reconnaissance. Mais, pour le renforcement assuré par le traitement au psoralène, une dénaturation pourrait bri- ser l'acide. Bien évidemment, si l'on prévoit que le type susmentionné de problème ne se posera pas, on peut éliminer cette étape supplémentaire.
Les concentrations en produits chimiques que l'on uti- lise pour former le revêtement 32 dépendent empiriquement
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du type particulier de liaison de revêtement à former et de la nature de la fraction d'acide nucléique que l'on désire lier au revêtement. Cependant, 11 faut noter que les endroits ou sites réactifs (c'est-à-dire les endroits ou sites sur la fibre où le revêtement contient les fractions d'acides nucléiques à brin unique liées et avec lesquelles on cherche à hybrider complémentairement les fragments d'acides nucléiques) doivent en moyenne être espacés de plusieurs fois (trois ou plus de trois foie le diamètre moyen 10A d'un double brin d'ADN typique.
Si la concentration en sites ou endroits est moins dense, la réaction d'hybridation ultime avec le revêtement sera spatialement ou stériquement empêchée et se déroulera par conséquent trop lentement pour de nombreuses fins.
Le procédé de liaison susmentionné comporte un certain nombre de caractéristiques souhaitables. Il assure une liaison puissante au verre. Cette liaison est irréversible, même dans des conditions de dénaturation et est photostable. La réalisation d'un élément d'espacement entre la surface de RTA et la chaine moléculaire permet un accès aisé (pour des conditions cinétiques de diffu- sion raisonnables) et donne suffisamment d'espace pour les flexions de chaîne qui constituent une partie du.pro- cessus d'hybridation. La liaison poly A-poly T garantit que la chaîne se lie à un endroit unique de façon à pré-' server la flexibilité ou souplesse de la chaîne néces- saire à des conditions cinétiques d'hybridation raison- nables. Cette liaison assure également que le site de reconnaissance est exclu de l'endroit de liaison.
L'enceinte ou boîtier 24 est un tube creux, allongé, de préférence, mais non nécessairement,optiquement trans- parent et est formé d'une matière qui est relativement insoluble dans et chimiquement non réactive sur le liquide à titrer. De manière typique, le boîtier 24 est simple- ment un tube de verre possédant un diamètre interne
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supérieur au diamètre externe maximum de la fibre 22 et est de préférence dimensionné de façon à délimiter un volume prédéterminé enveloppant au moins le revêtement activé 32 présent sur la fibre 22. Selon une forme de réalisation préférée, l'inter-espace entre la surface revêtue de la fibre 22 et la paroi interne du boîtier 24 peut avoir des dimensions capillaires.
Le chassis 26 est prévu pour maintenir la fibre 22 et le boîtier 24 en relation fixée, conformément à la- quelle, de manière plus particulière, le boîtier est espacé de la fibre de façon que le volume délimité pré- déterminé d'échantillon puisse envelopper la région acti- vée sur la surface de la fibre et que l'extrémité d'en- trée de la fibre soit maintenue avec précision de façon à permettre une injection de lumière optimale dans la fibre.
Par conséquent, la fibre peut être maintenue parle châssis au voisinage soit de la face 28, soit de la face 30. Ce- . pendant, le contact entre la fibre et le châssis au voi- sinage de la face 28 tend à réduire l'ouverture numérique dans la mesure où l'indice de réfraction de la matière constitutive du châssis est généralement supérieure à n1.
Pour obvier à ce problème, on peut, de manière typique, revêtir la fibre, au moins au voisinage de l'extrémité de la fibre dans laquelle le rayonnement se propage, d'un enrobage, typiquement d'un polymère transparent, de poids moléculaire élevé, disposé de manière à former un milieu à indice de réfraction faible, interposé entre le châssis et la fibre. Pour éviter des problèmes dùs à la présence du châssis au voisinage de l'extrémité proximale de la fibre, le châssis représenté sur la figure 1 est montré simplement sous la forme d'un berceau 36 possédant l'une de ses parties 38 couplées au et supportant le boîtier 24, une autre partie 40 de ce berceau étant cou- plée à et supportant la bague 42 dans laquelle l'extrémité distale 30 de la fibre 22 est fermement montée.
Lamatière
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dont la bague 42 est constituée n'a pas d'importance du point de vue de l'optique, mais doit être chimiquement relativement non réactive avec le liquide de l'échantil- lon à titrer. Selon la forme de réalisation représentée sur la figure 1, le boîtier 24 et la fibre 22 sont montés de façon que les axes longitudinaux tant du boitier que de la fibre soient sensiblement horizontaux,la fibre 20 étant par conséquent posée en porte-à-faux pour s'étendre vers l'intérieur dans le bottier 20 avec son extrémité 28 qui fait saillie à l'extérieur du boitier, la fibre 22 étant maintenue en relation espacée de la surface interne du boîtier 24.
Suivant cette forme de réalisation parti- culière, le boîtier est ouvert aux deux extrémités, de façon à permettre à du liquide d; être introduit ou retiré par n'importe quelle extrémité.
Au cours du fonctionnement de la forme de réalisation représentée,sur la figure 1, le revêtement 32 de la fibre
22 est formé de n'importe lesquelles d'un certain nombre de parties d'acides nucléiques à brin unique. Ces der- nières sont liées de la manière précédemment décrite pour donner des sites ou endroits de fixation à la fibre pour les parties d'acides nucléiques de l'échantillon et les @ parties fixées sont ensuite déterminées ou mesurées par ,coloration.
L'échantillon est d'abord traité par des techniques connues pour concentrer l'acide nucléique potentiel (si cela se révèle nécessaire) et ensuite, les capsides vi- rales ou des structures cellulaires biologiques sont ly- sées, comme par un choc osmotique, un détergent ou tous autres agents de lyse, pour libérer des acides nucléiques.
L'échantillon est ensuite soumis à un traitement qui dé- nature n'importe quel acide nucléique à double brin li- béré et brise la chaine de l'acide nucléique en fragments.
Par exemple, l'ADN à double brin peut etre dénaturé sim- plement par traitement par de la chaleur modérée (75 C)
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et de l'EDTA. L'utilisation d'EDTA élimine également les ions Mg++ si ces derniers sont présents, soit de l'échan- tillon, soit de l'étape de liaison de la polyadénine/ thymidine ; une telle élimination des ions Mg ++ est ex- trêmement souhaitable pour empêcher les ions métal de renaturer l'acide nucléique à brin unique. Bien évi- demment, on peut utiliser des techniques de scission d'ADN enzymatiques connues pour fragmenter l'acide nucléique.
L'ordre dans lequel la fragmentation et la dénaturation s'opèrent n'apas,d' importance aux fins de la présente in- vention.
On injecte ensuite l'échantillon dans l'inter-espace 44 situé entre le boîtier 24 et la fibre 22, comme avec une seringue hypodermique, l'échantillon.étant maintenu dans l'inter-espace 44 par les ménisques formés aux ex- trémités opposées du boîtier 24. On laisse incuber l'échantillon dans l'inter-espace 44 selon qu'on le sou- haite, afin de permettre à la matière à titrer dans léchan- tillon liquide de diffuser vers et renaturer ou complémen- ter les parties d'acide nucléique dans le revêtement ou enrobage 32. La réversibilité des réactions de conju- gaison de l'acide nucléique donne une limite réglée d'avi- dité à la sensibilité du système, en particulier si le système est lavé de manière à éliminer simplement l'acide nucléique absorbé, mais non conjugué.
Cette différence d'avidité ou d'affinité entre l'absorption et la conju- gaison peut être augmentée si, avant de procéder au la- vage, des composés de la famille du psoralène sont ajoutés à l'échantillon. Ces composés se lient aux régions de l'acide nucléique à double brin et, par exposition à de la lumière, servent à réticuler de manière irréversibles ces régions à double brin.
L'acide nucléique renaturé à double brin est coloré, de préférence, en piquant la solution d'échantillon di- rectement avec un colorant fluorochromique possédant une
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large affinité spécifique vis-à-vis de l'acide nucléique à double brin. Les colorants préférés possèdent plus d'un endroit ou site de liaison d'acide nucléique indépendant pour augmenter l'avidité ou affinité et réduire ainsi l'arrière-fond et la concentration en colorant libre.
Des colorants typiques utilisés aux fins de la présente invention sont le bromure d'éthidium, l'orange d'acridine (CI N 46005), la quinacrine, le bromure de diéthidium, l'orange de diacridine, les divers hétéromères et analo- gues. Le,bromure d'éthidium possède une longueur d'onde d'excitation optimale qui varie de 480 à 550 um et la gamme de longueurs d'onde defluorescence optimale de 580 à 650 um. On suppose que la structure du bromure d'éthi- dium est la suivante :
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En alternative, pour réduire une éventuelle insta- bilité du réactif, on peut initialement fournir le colo- rant sous une forme très faiblement préliée seulement à la fibre, de façon à ce qu'il se libère dans de l'eau en l'espace de millisecondes.
Le colorant choisi est de préférence un colorant dont le signal de fluorescence est fortement affecté par la liaison et, par conséquent, par le degré auquel les deux chaînes d'acide nucléique sont hybridées ; colorants de ce genre sont couramment connus sous l'appellation de colorants fluorochromiques.
Pour des colorants fluorochromiques, comme le bromure d'éthidium et l'orange d'acridine ou leurs dimères, la
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concentration nécessaire en échantillon dans l'interface 44 peut être faible, par exemple varier d'environ 10-10 à 10-14M.
Il faut noter que la surface de la solution injectée dans l'inter-espace 44 est supposée contenir environ 6 ordres de grandeur de plus de l'acide nucléique à brin unique que celui présent dans la masse de la solution.
Par conséquent, il existera une vitesse de recombinaison d'acide nucléique supérieure à l'interface de la solution et de la fibre et le colorant sera préférentiellement lié aux doubles brins formés sur la fibre, lesquels brins sont les seuls illuminés. Le colorant flotte librement avant la réaction entre l'acide nucléique soumis à l'essai et le réactif sur la fibre, et constitue une étiquette ou marque pour la forme conjuguée seulement. Etant donné que le colorant est un fluorochrome, il est, de manière inhé- rente, moins efficient à l'état non lié qu'à l'état lié.
L'utilisation de la forme dimère du colorant sert à assu- rer une liaison plus puissante qui porte au carré l'avi- dité ou affinité du colorant pour l'acide nucléique à double brin. Par conséquent, avec des colorants dimères, on obtient une augmentation de la sélectivité vis-à-vis de l'ADN à double brin et un moindre arrière-fond, parce- qu'une plus faible proportion de colorant libre est né- cessaire dans la masse de la solution, assurant ainsi un rapport signal à bruit extrêmement élevé.
L'appareil est couplé au fluorimètre 43, de façon que la face d'entrée 28 soit illuminable par le rayonne- ment, typiquement capable d'exciter ou d'induire la flu- orescence dans le revêtement ou enrobage 32 sous l'effet d'une onde évanescente accompagnant la transmission du rayonnement à travers la fibre. La fluorescence induite dans le complexe étiquetté ou marqué au revêtement 32 reflue ensuite dans la fibre à partir de la matière excitée et ensuite à l'extérieur à travers la face 28
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de façon à être lue par le fluorimètre 83. L'intensité de la fluorescence sera proportionnelle à la quantité d'acide nucléique à double brin présente et constitue par conséquent une,fonction de la quantité relative d'acide nucléique apparié présent dans l'échantillon d'origine.
Il se produira une erreur dans les données susmen- tionnées, provoquée par la variation en efficience quan- tique du colorant qui peut réfléchir le degré de perfec- tion de l'appariement d'hybridation. Une manière de corriger une telle erreur consiste à procéder à une mesure supplémentaire de la durée de vie de la fluorescence qui est proportionnelle à l'efficience quantique. Le rapport de l'intensité du signal à la durée de vie est indépen- dant de l'efficience quantique et par conséquent non en- taché de l'erreur. Les valeurs de la durée de vie réelle peuvent également servir de mesure du degré de corrélation mutuelle des brins d'acide nucléique.
La durée de vie de la fluorescence naturelle peut être définie comme étant la durée nécessaire à la dispa- rition de la fluorescence, suivant la cessation de l'exci- tation, à partir de son maximum I à une valeur de I/e où e est la base népérienne. En utilisant un appareil et des techniques que l'on connaît parfaitement, on peut dé- terminer la durée de vie de la fluorescence en illuminant d'abord la matière avec un rayonnement d'excitation rapi- dement modulé pour le colorant fluorochromique utilisé, par exemple, un rayonnement d'amplitude fluctuante, comme celui d'un laser ou d'un LED sous-seuil et en mesurant en- suite l'amplitude de modulation de la fluorescence engen- drée.
Un autre procédé de titrage que l'on peut réaliser avec l'appareil suivant la présente invention, consiste à pratiquer un titrage du type à liaison de compétition.
Suivant ce dernier, on marque ou étiquette une quantité
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connue du polynucléotide à brin unique que l'on cherche à identifier ou à mesurer; de manière connue, de préfé- rence avec n'importe lequel d'un grand nombre de colorants fluorescents fonctionnalisés connus. On procède à une première mesure du rayonnement fluorescent total d'une telle quantité marquée ou étiquettée à l'aide d'un fluorimètre approprié à des fins de calibrage. On ajoute ensuite une quantité connue du polynucléotide étiqueté ou marqué à la solution d'échantillon.
Le mélange des polynucléotides étiquettés ou marqués et non étiquettés ou non marqués est ensuite placé au contact d'une cellule de RTA et on les laisse entrer en compétition pour des endroits ou sites d'hybridation, la cellule étant préparée et illuminée de la manière décrite plus haut. On procède ensuite à la mesure de l'intensité de fluorescence provenant de la cellule. Le rapport de cette dernière intensité de flu- orescence à l'intensité mesurée au cours du calibrage est ensuite proportionnelle à la quantité de polynucléotide non étiquette ou non marqué présente dans l'échantillon.
Etant donné que l'on peut apporter certains autres changements au procédé et à l'appareil décrits plus haut, sans pour autant sortir du cadre de la présente invention, il est bien entendu que toute la substance que contient la description ci-dessus ou les dessins qui l'accompagnent doit être interprétée comme étant illustrative et dépourvue de sens limitatif.
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RTA CELL, APPARATUS AND METHOD FOR TITRATING POLYNU-CLEOTIDE IN A LIQUID
The present invention relates to biochemical titrations and, more particularly, titrations for the implementation of which a label is used capable of emitting detectable radiation in order to identify a nucleic acid and the measurement of the concentration and intercorrelation between selected nucleic acids and their fragments.
A known technique for chemical and biochemical titration, such as that described in U.S. patents. n 4,133,639, 4,321,057.4 399,099.4 447,546 and others, includes an optical system using the principles of attenuated total reflection spectroscopy (ATR). For the ATR cell, such an optical system uses an optical waveguide, typically an optical fiber, a rod or bar or a plate. When one of the ends of the cell is illuminated by an excitation radiation, this radiation undergoes a total internal reflection, so as to create an evanescent wave on the surface of the cell.
The excitation radiation is chosen so that the evanescent wave excites fluorescence in substances to be titrated and located in only a thin zone (typically a thickness of a few hundreds to a thousand Angstm units) surrounding the cell surface. The resulting fluorescence can provide information from which the fluorescent material can be titrated. Such systems have been used to date to titrate, for example, antigenic substances, chemicals and the like.
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It is also well known that genetic information directing the synthesis of amino acid or amino acid sequences into proteins is carried out by deoxy ribonucleic acid (DNA) or ribonucleic acid (RNA), which are both very long, complex molecules, usually in the form of a double helix. Since DNA or RNA are ubiquitous in all living matter in forms unique for each species, the nature of the nucleic acid or its unique fragments (which will be called collectively in the remainder of this specification: polynucleotides) can be used to determine or detect the presence of a given species. For example, all viral genes contain RNA or DNA.
Such viral nucleic acids can easily be isolated from the envelope or layer of proteins and they are currently available in a highly purified form. Many of the viral nucleic acids are linear and double-stranded (DNA in viruses such as that of smallpox and SV40, for example, and RNA in viruses such as reoviruses). Single-stranded nucleic acids can still convert to double-stranded nucleic acids as long as complementary single strands are available. The double strands of the nucleic acid can be separated by subjecting this nucleic acid to denaturation conditions (for example high or low pH, high temperatures, reagents such as EDTA and guanidine which breaks the hydrogen bonds, etc.) .
Denaturation not only usually separates the nucleic acid into single strands, but can also cause the strands to break into a large unpredictable assortment of fragments which are extremely difficult to separate from each other in an identifiable form. Restriction enzymes are frequently used to break nucleic acids at specified locations or sites to create multiplicity
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fragments which are laboriously separated by the use of electrophoretic techniques and others which still consume time, with a view to their definitive identification.
The main object of the present invention is therefore an apparatus and a method intended for the titration or the detection of fractions or parts of nucleic acids or of polynucleotides, which apparatus and methods make it possible to identify the genetic source of the part. or fraction unambiguously and quickly. Another important objective of the present invention resides in an apparatus and a method of this kind which can be carried out directly on a sample containing fragments of nucleic acids without having to first separate the fragments into homogeneous groups. The subject of the invention is also the application to the problem of the detection and identification of nucleic acids, the sensitivity and the simplicity of fluorescence titrations using optical fibers.
These and other objectives are achieved, in accordance with the present invention, by an apparatus and method for fluorescent titration of polynucleotides or of fractions, parts or fragments of nucleic acids subject to or bound to the surface of an elongated cell to attenuated total reflection (RTA). Any double-stranded nucleic acid present in the sample to be subjected to titration is denatured, for example, by heating to about 80 ° C, so as to form singular strands of nucleic acid. Denaturation can be facilitated by the addition of chelators so as to remove stabilizing ions, such as Mg ++. The individual strands can be broken into desired length sequences by the use of suitable suitable restriction enzymes.
Selected parts or fractions of singular strands of double-stranded nucleic acid,
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characteristic of the species to be identified, separated, for example by electrophoresis or liquid chromatography, are subject to the least optically dense side of an interface to be formed between media of different refractive indices (for example a RTA cell in the form of a prism, a rod or bar or a fibrous optical element and a sample of liquid suspected of containing the nucleic acid to be detected or titrated).
The sample in contact with the interface is then gradually cooled; the measurement where a part of the single strands of nucleic acid in the sample is complementary to the part or fraction of single-stranded nucleic acid initially linked to the interface, a part of the linked nucleic acid will be hybridized with the nucleic acid in the sample.
Any polynucleotides that have undergone renaturation with the cell surface attached parts can now be stained with a fluorochromic dye specific for double-stranded polynucleotides (e.g. preferably in dimer form to enhance specificity and stability of the link).
As an alternative, for competitive binding, it is possible to use complementary singular strands pre-labeled or pre-labeled with the polynucleotide, the presence of which must be detected or titrated in the sample. Partial pairings can be removed by adding an enzyme at this time that cleaves or cleaves the double helix when single-stranded fragments in the sample do not form a double-strand with linked parts or fractions. One end of the cell is then illuminated with excitation radiation which undergoes total internal reflection in the cell, so as to create an evanescent wave on the surface of the RTA cell.
The excitation radiation is chosen so that the evanescent wave excites the fluorochrome on the poly-
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nucleotides stained in only the thin area surrounding or enveloping the surface of the RTA cell. If the chain length adapts into the area illuminated by the evanescent wave, the resulting fluorescence is a measure of the double-stranded polynucleotides linked to the cell surface and, therefore, a measure of the nucleic acid. in the complementary sample of the nucleic acid preloaded on the RTA cell. Measurements of the fluorescence lifespan can also make it possible to measure the quantum efficiency of fluorochrome and, consequently, the degree of pairing between the polynucleotides initially linked to the interface and those complexed to it from the sample.
This allows a distinction to be made between emissions from the specifically bound dye, the atypical or less specifically bound dye and the unbound dye, thereby improving signal-background relationships.
Other objectives of the present invention will appear in part obvious and will appear in part hereinafter. Consequently, the subject of the invention is the apparatus having the construction, the combination of elements and the arrangement of the organs and the method involving the various stages and the relation and order of one or more of these. stages in relation to each other which are illustrated in the detailed description which follows, as well as the claims define them by their scope.
In order to better understand the nature and the objects of the present invention, reference will now be made to the detailed description which follows, produced with reference to the appended drawings, in which the same reference notations relate to identical elements and in which the figure 1 shows a longitudinal cross-sectional view of a titration kit or set in accordance with the principles of the present invention and FIG. 2
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shows an end view of the embodiment shown in Figure 1.
It should be understood that in the detailed description of the apparatus according to the present invention, the reference to "upper" and "lower" parts of the apparatus is made entirely for reasons of convenience and to bring the description in correlation with the schematic illustrations of the drawings. It should also be understood that the apparatus can operate in any position or orientation and therefore is within the scope of the present invention. It should also be understood that the representation as it appears in the figures is schematic and that, therefore, it in no way aims to give scales or real relationships.
The present invention is achieved by excitation radiation with total internal reflection along an RTA cell, which excitation excites the fluorescence which flows back into the cell and the detection of this fluorescence, all as described in the application. USA patent co-pending, serial number 406 324, filed August 9, 1982 and assigned to the assignee of this application and to which reference may be made for further details relating to the optical mode of implementation of the invention .
In Figure 1, there is shown a longitudinal cross-sectional view of a titration kit 20 made in accordance with the principles of the present invention. According to a preferred embodiment, the kit 20 comprises an RTA cell 22, a housing 24 and a chassis 26.
The cell 22 is preferably an elongated, substantially cylindrical, optically transparent body, which is typically in the form of a rod or an optical fiber extending from its end.
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proximal or entry face 28 to a distal or terminal end 30. The cell 22 is adapted to ensure the propagation throughout its length, by multiple total internal reflections, of penetrating optical radiation by the face 28 in an established solid angle, substantially rotationally symmetrical about the longitudinal axis of the cell.
When the cell is a fiber such as that shown in FIG. 1 ((and for the purposes of exposure, reference will be made hereinafter to this memoir to such a cell 22 in its context), as are the specialists in optical fibers know it perfectly, the maximum acceptance angle with respect to the axis of the fiber, B, for the radiation entering the fiber and thus propagating in it, is established by the indices of refraction of the fiber and the surrounding medium .
On the face 28, the surface of the fiber is typically planar, is arranged normally along the long axis of the fiber and is preferably highly polished so as to minimize the fading or surface defects which could tend to diffuse or diffract their incident excitation radiation.
For a radiation initially propagating through a medium with a refractive index n, incident on a fiber with a refractive index n, otherwise enveloped or surrounded by a material with a refractive index N2, the maximum acceptance angle is given by the following equation: (1) NA = n 0 sinB = in 1 2 - n22) 1/2 where NA is what is called the numerical aperture of the fiber. By way of nonlimiting example, the fiber 22 can be made of any of a large number of optically transparent materials, such as glass, quartz, polypropylene, polyolefins, nylon, and the like,
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chosen so as to have a refractive index higher than that of the sample of the fluid to be titrated.
The sample is typically constituted by an aqueous solution having a refractive index close to 1.33.
It should also be understood that the material constituting the fiber 22 is also chosen so as to be relatively insoluble and non-reactive on the liquid of the sample. Although the size of the fiber 22 can vary as desired, it has been found that a fiber or rod with a diameter ranging from about 1 mm to a few hundred microns and of a length as short as
5 mm was adequate for most titrations, it being understood, however, that such a length and such a diameter are merely illustrative and not limiting.
According to a preferred embodiment in which the fluorescence induced on the surface of the fiber by the excitation radiation released through the fiber, is collected or observed at the same proximal end of the fiber to which the radiation of excitation is injected, it is desirable to prevent stray or scattering radiation from lowering the fiber from face 30 to face 28. Therefore, face 30 can be shaped to stop light incident inside, but is preferably coated with a material matching the refractive index of the medium surrounding the face 30, such a material being both non-fluorescent and absorbent vis-à-vis the radiation d 'excitation.
Typically, an epoxy resin loaded with carbon black fulfills such a function.
According to an illustrative embodiment, the operating part of the surface of the fiber is defined by the activated region to which the titration is to be performed. To activate the surface of the operating part of the fiber 22, the latter is typically treated to produce the coating 32 by bonding in
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first, an aromatic amine on the surface of the fiber as an agent for obtaining a diazo coupling with the polynucleotide or the single-stranded nucleic acid. The aromatic amine must be coupled to the surface of the fiber through a spacer so that the amine is free to react without being sterically hindered by the glass.
A number of coupling techniques with such a spacing element which can be used are well known and are moreover illustrated in the examples which follow: EXAMPLE 1
The hydroxyl groups on the surface of the glass (which will be called hereinafter "G") can be coupled by trimethoxysilane substituted by a chain of methylene radicals having an aromatic amine group at the chain end, typically
EMI9.1
This reagent is marketed by the company, Petrarch Chemical Company.
The reagent in question, when in solution, preferably buffered to a pH of 8, reacts on the hydroxyl radicals of the glass (G) so as to remove methanol and to form a siloxane bond as follows:
EMI9.2
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EXAMPLE II
Alternatively, a reagent consisting of two epoxy radicals connected by a methylene chain can be coupled to the glass surface.
For example, by using an excess of the reactant in a highly alkaline solution (typically NaOH) to prevent too many ends of each reagent molecule from coupling to the glass, the following reaction takes place in order to generate a ether bond:
EMI10.1
If the latter intermediate is now reacted with a sulfhydrylic compound or a thiol, a thioether bond is formed as follows
EMI10.2
EXAMPLE III
Yet another coupling can be achieved via an aliphatic amine bond, as follows:
(4) G (OH) 3 + (CH3O) 3-Si- (CH2) 3-NH2 # GOSi- (CH2) 3-NH2
To the product of the above reaction, an excess of double isothiocyanate with a chain is added at a pH of 8
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methylene intermediate, so as to generate a thiourea bond:
EMI11.1
The addition of an excess of double aromatic amine, at a pH of 8, completes the formation of the desired aromatic compound, i.e.
EMI11.2
EXAMPLE IV
A fourth technique for coupling to glass, producing an unusually stable product, consists in treating glass at a pH of 8 with a trimethoxysilane having a chlorobenzyl radical.
EMI11.3
The product of this reaction is reacted, at a pH of 9, with the aromatic amine having a nitro radical:
EMI11.4
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Then, the reaction product is treated with a powerful reducing agent, such as sodium dithionite at a pH of 6, so as to reduce the nitro radical to aromatic amine as follows:
EMI12.1
The aromatic amine produced by any of the above techniques can be used to bind the nucleic acid to a single strand desired. As a preliminary step, the aromatic amine bonded to the glass (which will be called hereinafter GA- # NH2) must be treated with nitrous acid (acid nitrite solution) around 0 C.
This generates an intermediate product which is then reacted, at a pH of 8, with poly-T (which will be called hereinafter in the present specification (TTT), a known synthetic DNA, of which the only based is thymidine), all as described below:
EMI12.2
It is known that cells tend to produce strands of nucleic acid spaced apart by short strands of polyadenine. Consequently, this latter product is now brought to react on the adenine fraction typically present at the start of a single-stranded nucleic acid molecule (which will be called hereinafter in the present specification). AAA-NUC) of interest for forming the nucleic acid fraction bound to the surface of the fiber.
Insofar as adenine is the conjugate
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thymidine, the latter will form a double strand in the presence of Mg +, at a pH of 7, at room temperature, to form a bond.
EMI13.1
The double strand bond can now be made permanent by treating the adenine-thymidine conjugates with psoralen (6-lactone of 6-hydroxy-5-benzofuran acrylic acid) or any other crosslinking agent. Psoralen is preferred because it is relatively non-volatile and is easily activated by ultraviolet radiation. Although the reaction is well known, its use to make irreversible hybridization is believed to be new. For proper hybridization, the linked DNA segment must be at least 10 bases in length; although more bases may be necessary for reasonable specificity.
It must be seen that this technique binds the fraction of DNA not used in its recognition, that is to say the polyadeninic chain present at the start. The purpose of practicing. this sort serves to avoid problems arising from the possible attachment of the diazo bond to part of the recognition sequence of the linked double-stranded nucleic acid. In other words, the reaction on psoralen allows attachment to one end of the nucleic acid sequence without blocking or obstructing the recognition site or site. However, for the reinforcement provided by the psoralen treatment, denaturation could burn the acid. Obviously, if it is expected that the above-mentioned type of problem will not arise, this additional step can be eliminated.
The concentrations of chemicals used to form the coating 32 depend empirically
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the particular type of coating bond to be formed and the nature of the nucleic acid fraction to be bonded to the coating. However, it should be noted that the reactive places or sites (that is to say the places or sites on the fiber where the coating contains the fractions of single-stranded nucleic acids linked and with which it is sought to complementary hybridize the fragments nucleic acids) must on average be spaced several times (three or more than three times the average diameter 10A of a typical double strand of DNA.
If the concentration of sites or locations is less dense, the ultimate hybridization reaction with the coating will be spatially or sterically prevented and will therefore proceed too slowly for many purposes.
The aforementioned bonding method has a number of desirable features. It provides a powerful bond to the glass. This bond is irreversible, even under denaturing conditions and is photostable. The creation of a spacer between the RTA surface and the molecular chain allows easy access (for reasonable kinetic conditions of diffusion) and gives sufficient space for the chain flexions which constitute a part of the. hybridization process. The poly A-poly T bond ensures that the chain binds in a single location so as to preserve the flexibility or suppleness of the chain necessary under reasonable kinetic hybridization conditions. This link also ensures that the recognition site is excluded from the link location.
The enclosure or casing 24 is a hollow tube, elongated, preferably, but not necessarily, optically transparent and is formed of a material which is relatively insoluble in and chemically non-reactive on the liquid to be titrated. Typically, the housing 24 is simply a glass tube having an internal diameter
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greater than the maximum external diameter of the fiber 22 and is preferably dimensioned so as to delimit a predetermined volume enveloping at least the activated coating 32 present on the fiber 22. According to a preferred embodiment, the interspace between the coated surface of the fiber 22 and the internal wall of the housing 24 may have capillary dimensions.
The frame 26 is provided to maintain the fiber 22 and the housing 24 in a fixed relationship, in accordance with which, more particularly, the housing is spaced from the fiber so that the predetermined defined volume of sample can envelop the activated region on the surface of the fiber and that the entry end of the fiber is precisely maintained so as to allow optimal injection of light into the fiber.
Consequently, the fiber can be maintained by the chassis in the vicinity of either the face 28 or the face 30. Ce-. during this time, the contact between the fiber and the chassis in the vicinity of the face 28 tends to reduce the numerical aperture insofar as the refractive index of the material constituting the chassis is generally greater than n1.
To overcome this problem, it is typically possible to coat the fiber, at least in the vicinity of the end of the fiber in which the radiation propagates, with a coating, typically of a transparent polymer, of molecular weight. high, arranged so as to form a medium with a low refractive index, interposed between the frame and the fiber. To avoid problems due to the presence of the chassis near the proximal end of the fiber, the chassis shown in FIG. 1 is shown simply in the form of a cradle 36 having one of its parts 38 coupled to and supporting the housing 24, another part 40 of this cradle being coupled to and supporting the ring 42 in which the distal end 30 of the fiber 22 is firmly mounted.
Lamatière
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of which the ring 42 is made does not matter from the point of view of optics, but must be chemically relatively non-reactive with the liquid of the sample to be titrated. According to the embodiment shown in Figure 1, the housing 24 and the fiber 22 are mounted so that the longitudinal axes of both the housing and the fiber are substantially horizontal, the fiber 20 therefore being cantilevered in order to extend inwards into the housing 20 with its end 28 which projects outside the housing, the fiber 22 being maintained in spaced relation from the internal surface of the housing 24.
According to this particular embodiment, the housing is open at both ends, so as to allow liquid d; be inserted or removed from either end.
During operation of the embodiment shown in Figure 1, the coating 32 of the fiber
22 is formed from any of a number of parts of single-stranded nucleic acids. These are linked in the manner previously described to give fiber attachment sites or locations for the nucleic acid parts of the sample and the fixed parts are then determined or measured by staining.
The sample is first treated by known techniques to concentrate the potential nucleic acid (if this proves necessary) and then, the viral capsids or biological cellular structures are lyzed, as by an osmotic shock, a detergent or any other lysis agent, to release nucleic acids.
The sample is then subjected to a treatment which denotes any released double-stranded nucleic acid and breaks the chain of nucleic acid into fragments.
For example, double-stranded DNA can be denatured simply by treatment with moderate heat (75 C)
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and EDTA. The use of EDTA also eliminates the Mg ++ ions if the latter are present, either from the sample or from the polyadenine / thymidine binding step; such removal of Mg ++ ions is extremely desirable to prevent metal ions from renaturing single stranded nucleic acid. Obviously, enzymatic DNA cleavage techniques known to fragment nucleic acid can be used.
The order in which fragmentation and denaturation take place is not of importance for the purposes of this invention.
The sample is then injected into the inter-space 44 located between the housing 24 and the fiber 22, as with a hypodermic syringe, the sample being held in the inter-space 44 by the menisci formed at the ends. opposite of the housing 24. The sample is allowed to incubate in the inter-space 44 as desired, in order to allow the material to be titrated in the liquid sample to diffuse towards and renaturate or supplement the parts of nucleic acid in the coating or coating 32. The reversibility of the conjugation reactions of the nucleic acid gives a set limit of avidity to the sensitivity of the system, in particular if the system is washed so as to simply remove the absorbed but unconjugated nucleic acid.
This difference in avidity or affinity between absorption and conjugation can be increased if, before washing, compounds of the psoralen family are added to the sample. These compounds bind to regions of double-stranded nucleic acid and, by exposure to light, serve to irreversibly cross-link these double-stranded regions.
The renatured double-stranded nucleic acid is preferably colored by pricking the sample solution directly with a fluorochromic dye having a
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broad specific affinity for double-stranded nucleic acid. Preferred dyes have more than one independent nucleic acid binding site or site to increase avidity or affinity and thereby reduce the background and concentration of free dye.
Typical dyes used for the purposes of the present invention are ethidium bromide, acridine orange (CI N 46005), quinacrine, diethidium bromide, diacridine orange, various heteromers and the like . Ethidium bromide has an optimal excitation wavelength that ranges from 480 to 550 µm and the optimal fluorescence wavelength range from 580 to 650 µm. It is assumed that the structure of ethidium bromide is as follows:
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Alternatively, to reduce possible instability of the reagent, the dye can initially be supplied in a form which is only very slightly prelaminated to the fiber, so that it is released into water in space. milliseconds.
The dye chosen is preferably a dye whose fluorescence signal is strongly affected by the binding and, consequently, by the degree to which the two nucleic acid chains are hybridized; such dyes are commonly known as fluorochromic dyes.
For fluorochromic dyes, such as ethidium bromide and acridine orange or their dimers, the
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necessary concentration of sample in interface 44 may be low, for example varying from approximately 10-10 to 10-14M.
It should be noted that the surface of the solution injected into the inter-space 44 is assumed to contain approximately 6 orders of magnitude more of the single-stranded nucleic acid than that present in the mass of the solution.
Consequently, there will be a higher nucleic acid recombination rate at the interface of the solution and the fiber and the dye will preferably be linked to the double strands formed on the fiber, which strands are the only ones illuminated. The dye floats freely before the reaction between the nucleic acid under test and the reagent on the fiber, and constitutes a label or mark for the conjugated form only. Since the dye is a fluorochrome, it is inherently less efficient in the unbound state than in the bound state.
The use of the dimeric form of the dye serves to provide a stronger bond which squares the avidity or affinity of the dye for double stranded nucleic acid. Therefore, with dimer dyes, an increase in selectivity to double-stranded DNA and a lower background is obtained, because a lower proportion of free dye is required in the mass of the solution, thus ensuring an extremely high signal-to-noise ratio.
The apparatus is coupled to the fluorimeter 43, so that the entry face 28 is illuminable by radiation, typically capable of exciting or inducing fluorescence in the coating or coating 32 under the effect of 'an evanescent wave accompanying the transmission of radiation through the fiber. The fluorescence induced in the labeled or labeled complex on the coating 32 then flows back into the fiber from the excited material and then outside through the face 28
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so as to be read by the fluorimeter 83. The intensity of the fluorescence will be proportional to the quantity of double-stranded nucleic acid present and therefore constitutes a function of the relative quantity of paired nucleic acid present in the sample of origin.
There will be an error in the above data, caused by the variation in quantitative efficiency of the dye which can reflect the degree of perfection of the hybridization pairing. One way to correct such an error is to make an additional measurement of the lifetime of the fluorescence which is proportional to the quantum efficiency. The ratio of signal strength to lifetime is independent of quantum efficiency and therefore not subject to error. The actual lifetime values can also be used as a measure of the degree of mutual correlation of the nucleic acid strands.
The lifespan of natural fluorescence can be defined as being the duration necessary for the disappearance of fluorescence, following the cessation of the excitation, from its maximum I to a value of I / e where e is the natural base. Using an apparatus and techniques that are well known, the lifetime of the fluorescence can be determined by first illuminating the material with rapidly modulated excitation radiation for the fluorochromic dye used, for example. for example, radiation of fluctuating amplitude, such as that of a laser or a sub-threshold LED and then measuring the amplitude of modulation of the fluorescence generated.
Another titration method which can be carried out with the apparatus according to the present invention consists in practicing a titration of the competition link type.
According to the latter, we mark or label a quantity
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known to the single-stranded polynucleotide that one seeks to identify or measure; in known manner, preferably with any of a large number of known functionalized fluorescent dyes. A first measurement of the total fluorescent radiation of such a marked or labeled quantity is carried out using an appropriate fluorimeter for calibration purposes. A known amount of the labeled or labeled polynucleotide is then added to the sample solution.
The mixture of labeled or labeled and unlabeled or unlabeled polynucleotides is then placed in contact with an RTA cell and allowed to compete for hybridization locations or sites, the cell being prepared and illuminated as described upper. The fluorescence intensity from the cell is then measured. The ratio of this latter fluorescence intensity to the intensity measured during calibration is then proportional to the quantity of unlabeled or unlabeled polynucleotide present in the sample.
Since certain other changes to the process and the apparatus described above can be made without departing from the scope of the present invention, it is understood that all of the substance contained in the above description or the accompanying drawings should be interpreted as illustrative and devoid of limiting meaning.