WO2026023966A1 - 신규 올살라진 유도체 화합물 및 이를 유효성분으로 포함하는 혈소판 감소증 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

신규 올살라진 유도체 화합물 및 이를 유효성분으로 포함하는 혈소판 감소증 예방 또는 치료용 조성물

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WO2026023966A1
WO2026023966A1 PCT/KR2025/010247 KR2025010247W WO2026023966A1 WO 2026023966 A1 WO2026023966 A1 WO 2026023966A1 KR 2025010247 W KR2025010247 W KR 2025010247W WO 2026023966 A1 WO2026023966 A1 WO 2026023966A1
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WO
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thrombocytopenia
blvrb
composition
chemical formula
osk
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이동한
류경석
정회명
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Korea Basic Science Institute KBSI
Original Assignee
Korea Basic Science Institute KBSI
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    • A23V2250/00—Food ingredients
    • A23V2250/30—Other Organic compounds

Definitions

  • An example of the present invention relates to Olsalkene (OSK), a stereoisomer thereof or a pharmaceutically acceptable salt thereof, a method for preparing the same, a composition comprising the same as an active ingredient for preventing or treating thrombocytopenia, and a use of the composition.
  • OSK Olsalkene
  • a stereoisomer thereof or a pharmaceutically acceptable salt thereof a method for preparing the same, a composition comprising the same as an active ingredient for preventing or treating thrombocytopenia, and a use of the composition.
  • Platelets are derived from megakaryocytes (MKs), which differentiate from pluripotent hematopoietic stem cells. Platelets play a central role in diverse biological processes, including hemostasis and thrombosis, as well as inflammation, angiogenesis, innate and adaptive immunity, and tumor metastasis. Therefore, regulating platelet counts and controlling specific platelet responses are key goals for new drugs treating platelet-related diseases. Platelet dysregulation can lead to various bleeding disorders, including thrombocytopenia. Common treatments for thrombocytopenia involve increasing platelet counts through platelet induction or platelet transfusions. Conversely, thrombocytosis, in contrast to thrombocytopenia, refers to an excess of platelets in the blood.
  • MKs megakaryocytes
  • BLVRB biliverdin reductase B
  • BLVRB utilizes NAD(P)H downstream of heme oxygenase(s)-1 (inducible HMOX1) and -2 (constitutive HMOX2) to reduce biliverdin (BV)-IX ⁇ to bilirubin (BR)-IX ⁇ .
  • BR acts as a potent antioxidant and exhibits cytoprotective effects, although high concentrations can induce toxicity. Therefore, the BV/BR redox cycle under the control of BLVRB plays a crucial role in regulating reactive oxygen species (ROS).
  • iPSCs induced pluripotent stem cells
  • BLVRBS111L a loss-of-function mutant of BLVRB
  • HSCs hematopoietic stem cells
  • CFU-MK MK colony formation
  • wild-type BLVRB did not exhibit these effects.
  • the loss-of-function mutant (BLVRBS111L) induces MK differentiation and, consequently, promotes platelet production through ROS accumulation. Therefore, effectively removing the antioxidant BR by inhibiting BLVRB activity may provide a novel strategy to enhance platelet production by leveraging BLVRB's unique redox regulation within the heme degradation pathway.
  • Xanthene dyes and acridine-containing compounds have been developed to inhibit BLVRB activity. These compounds are structurally similar to the natural BLVRB substrate, flavin mononucleotide (FMN). Among the xanthine dyes, erythrosin B and phloxine B have emerged as the most potent inhibitors. Molecular modeling and X-ray crystallography studies have revealed that erythrosin B and phloxine B bind to the active site of BLVRB. Furthermore, a hydrogen bonding network within the BLVRB active site has been elucidated, highlighting the important role of the S111 residue in catalytic activity.
  • FMN flavin mononucleotide
  • olsalazine exhibited the strongest inhibitory affinity.
  • OSA olsalazine
  • the present inventors focused on developing a new compound that retains the inhibitory, biochemical, and biophysical properties of olsalazine while being cleavable by AzoR. To this end, the inventors devised a novel chemical scheme that replaced the diazenylic bond in olsalazine with an alkene bond, resulting in olsalkene (OSK, (E)-5,5'-(ethene-1,2-diyl)bis(2-hydroxybenzoic acid)).
  • OSK, (E)-5,5'-(ethene-1,2-diyl)bis(2-hydroxybenzoic acid) olsalkene
  • One aspect is to provide Olsalkene, a stereoisomer thereof or a pharmaceutically acceptable salt thereof, represented by the following chemical formula 1.
  • Another aspect is to provide a method for producing the above Olsalkene.
  • Another aspect is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating thrombocytopenia, comprising the above Olsalkene and a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • Another aspect is to provide a pharmaceutical preparation for preventing or treating thrombocytopenia, comprising the pharmaceutical composition described above.
  • Another aspect is to provide a health functional food composition for preventing or improving thrombocytopenia, comprising the above-mentioned Olsalkene and a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • Another aspect provides a method for preventing or treating thrombocytopenia comprising administering Olsalkene or a pharmaceutically acceptable salt thereof to a subject in need thereof.
  • Another aspect provides the use of Olsalkene and pharmaceutically acceptable salts thereof for the manufacture of a medicament for the prevention or treatment of thrombocytopenia.
  • Olsalkene represented by the following chemical formula 1, a stereoisomer thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof is provided.
  • the present invention provides a method for producing Olsalkene, comprising the following steps:
  • a step of reacting a compound represented by chemical formula 2 with BBr 3 A step of reacting a compound represented by chemical formula 2 with BBr 3 .
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating thrombocytopenia, comprising Olsalkene and a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • the thrombocytopenia may be at least one selected from the group consisting of non-immunogenic thrombocytopenia, immunogenic thrombocytopenia, and drug-induced thrombocytopenia.
  • the composition may inhibit the activity of biliverdin (BV)-Ix ⁇ reductase B (BLVRB).
  • BV biliverdin
  • BVRB biliverdin-Ix ⁇ reductase B
  • the composition may inhibit the reduction of biliverdin (BV)-IX ⁇ to bilirubin (BR)-IX ⁇ .
  • the present invention provides a pharmaceutical preparation for preventing or treating thrombocytopenia, comprising the pharmaceutical composition.
  • the formulation may be in the form of an injection, an infusion, a spray, a liquid or a patch.
  • the present invention provides a health functional food composition for preventing or improving thrombocytopenia, comprising Olsalkene and a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • the thrombocytopenia may be at least one selected from the group consisting of non-immunogenic thrombocytopenia, immunogenic thrombocytopenia, and drug-induced thrombocytopenia.
  • the composition may inhibit the activity of biliverdin (BV)-Ix ⁇ reductase B (BLVRB).
  • BV biliverdin
  • BVRB biliverdin-Ix ⁇ reductase B
  • the composition may inhibit the reduction of biliverdin (BV)-IX ⁇ to bilirubin (BR)-IX ⁇ .
  • the present invention provides a method for preventing or treating thrombocytopenia, comprising administering Olsalkene or a pharmaceutically acceptable salt thereof to a subject in need thereof.
  • the present invention also provides the use of Olsalkene and pharmaceutically acceptable salts thereof for the manufacture of a medicament for the prevention or treatment of thrombocytopenia.
  • olsakene a derivative that retains the biochemical and biophysical properties of olsalazine.
  • olsakene is not cleaved by azoreductase (AzoR) in the body, but binds to biliverdin reductase B (BLVRB), thereby inhibiting the reduction of biliverdin (BV) to bilirubin (BR).
  • AzoR azoreductase
  • BLVRB biliverdin reductase B
  • BV biliverdin reductase B
  • BR bilirubin
  • Olsalken can be usefully utilized as a treatment for thrombocytopenia and as a health functional food, as it acts to promote platelet production by inhibiting the activity of biliverdin reductase B.
  • Figures 1A and 1B illustrate the partial purification and enzyme kinetics of the AzoR enzyme.
  • Figure 1A shows SDS-PAGE results showing the protein profile after purification via anion exchange chromatography.
  • Figure 1B shows the enzyme activity assay of AzoR, which is indicated by the decrease in absorbance at 340 nm over time, measured by measuring the reduction of menadione in the eluted fraction.
  • Figures 2A-2D illustrate the cleavage of the diazenylic bond of olsalazine (OSA) to produce 5-aminosalicylic acid (5-ASA) by azoreductase (AzoR) containing cell extracts.
  • Figure 2A shows the 1D 1H NMR spectrum of OSA treated with AzoR activity and fractions of NADH, along with the reference spectra of olsalazine in Figure 2B, NAD + in Figure 2C, and 5-ASA in Figure 2D.
  • Figure 2B shows all chemical structures of OSA
  • Figure 2C shows NAD +
  • Figure 2D shows the product of AzoR catalysis of 5-ASA, using NADH and OSA. All chemical structures are indicated above the corresponding spectra.
  • Figures 3A-3D illustrate the binding of half-holo BLVRB to 5-ASA.
  • Figure 3A shows the 1 H- 15 N HSQC spectra of 0.1 mM half-holo BLVRB in the absence (black) and presence (red) of 1 mM 5-ASA.
  • Figure 3B shows the chemical shift differences between half-holo BLVRB and BLVRB in complex with OSK (black) and 5-ASA (gray).
  • Figure 3C shows NMR titration data for binding to half-holo BLVRB.
  • Figure 3D shows a surface representation of 5-ASA-bound half-holo BLVRB generated using the crystal symmetry of the previously reported PDB structure (7ERA).
  • Figures 4A to 4C show 1D 1H NMR spectra, where Figure 4A shows the fraction of AzoR activity and OSK treated with NADH, Figure 4B shows OSK, and Figure 4C shows NADH.
  • Figures 5A and 5B are isothermal titration calorimetry thermograms of BLVRB through titration of OSK ( Figure 5A) and OSA ( Figure 5B).
  • Figures 6A-6D illustrate the binding topology of OSK within the substrate pocket as revealed by NMR spectroscopy.
  • Figure 6A shows the 1 H- 15 N HSQC spectrum of half-holo BLVRB titrated with OSK.
  • Figure 6B shows the chemical shift differences between half-holo BLVRB and BLVRB complexed with OSK.
  • Figure 6C shows the surface of half-holo BLVRB containing FMN generated using the crystal symmetry of the previously reported PDB structure (1HE4).
  • Figure 6D shows the surface of half-holo BLVRB using OSK derived from the crystal structure.
  • Figures 7A to 7C illustrate structural comparisons of BLVRB and olasalazine (OSA) and olsalkene (OSK) within the complex.
  • Figure 7A depicts the backbone of BLVRB as a ribbon.
  • Figure 7B superimposes the interaction sites of BLVRB with OSA or OSK.
  • Figure 7C is a schematic diagram of the interaction network of the BLVRB:OSK complex.
  • Figures 8A to 8C show linear Weaver-Burk plots of BLVRB using the inhibition mechanism (Figure 8A) and OSK ( Figure 8B) and OSA ( Figure 8C).
  • Figures 9A to 9E are the 1 H- 15 N HSQC spectra of apo-BLVRB, with data overlaid according to the presence (absence (black) and presence (gray)) of PhlB in Figure 9A for OSK, Figure 9B for OSA, and Figure 9C for PhlB.
  • Figure 9D shows NMR titration data for apo-BLVRB binding of OSK and Figure 9E for OSA.
  • Olsalkene represented by the following chemical formula 1, a stereoisomer thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof is provided.
  • olsalkene refers to (E)-5,5'-(ethene-1,2-diyl)bis(2-hydroxybenzoic acid), an olsalazine derivative in which the diazenyl bond of olsalazine is replaced with an alkene bond.
  • the present inventors confirmed that it inhibits BLVRB activity without being cleaved by azoreductase (AzoR) in the body.
  • olsalazine refers to a 5-aminosalicylic acid (5-ASA) derivative, an anti-inflammatory drug primarily used to treat ulcerative colitis. Olsalazine is known to inhibit BLVRB activity. However, studies have shown that olsalazine is degraded in the human gastrointestinal environment because it contains a diazenylated bond that is readily cleaved by abundant azoreductases.
  • 5-ASA 5-aminosalicylic acid
  • stereoisomer refers to compounds having the same molecular formula and bonding structure but different atomic arrangements in three-dimensional space.
  • “Pharmaceutically acceptable salt” may mean a pharmaceutically acceptable salt, hydrate, solvate or prodrug of a compound that retains the desired biological activity of the compound and exhibits minimal or no undesirable toxicological effects.
  • salt refers to an acidic and/or basic salt formed from an inorganic and/or organic acid and base.
  • a salt of a compound may be formed by reacting the compound of the present invention with an equivalent amount of an acid or base in a medium such as a salt precipitate or in an aqueous medium.
  • the present invention provides a method for producing Olsalkene of claim 1, comprising the following steps:
  • a step of reacting a compound represented by chemical formula 2 with BBr 3 A step of reacting a compound represented by chemical formula 2 with BBr 3 .
  • the method for manufacturing Olsalken is not limited to the specific synthetic conditions of the examples, and a person with ordinary knowledge in the field of organic chemistry can appropriately modify and perform the method using known organic chemistry knowledge.
  • variable when a range is described for a variable, the variable will be understood to include all values within the described range including the described endpoints of the range.
  • range "5 to 10" will be understood to include the values 5, 6, 7, 8, 9, and 10, as well as any subranges such as 6 to 10, 7 to 10, 6 to 9, 7 to 9, etc., and any value between integers that fall within the described range, such as 5.5, 6.5, 7.5, 5.5 to 8.5, and 6.5 to 9.
  • a range of "10% to 30%” will be understood to include all integers up to and including 30%, as well as any subranges such as 10% to 15%, 12% to 18%, 20% to 30%, etc., and any value between reasonable integers within the stated range, such as 10.5%, 15.5%, 25.5%, etc.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating thrombocytopenia, comprising Olsalkene and a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • thrombocytopenia refers to a condition in which the number of platelets in the blood is lower than normal. Platelets play a crucial role in promoting hemostasis through clotting during bleeding. Thrombocytopenia can cause symptoms such as easy bruising and persistent bleeding. The causes of thrombocytopenia are diverse, including autoimmune diseases, infections, drug side effects, and bone marrow abnormalities.
  • the thrombocytopenia may be at least one selected from the group consisting of non-immunogenic thrombocytopenia, immunogenic thrombocytopenia, and drug-induced thrombocytopenia.
  • the composition may inhibit the activity of biliverdin (BV)-Ix ⁇ reductase B (BLVRB).
  • BV biliverdin
  • BVRB biliverdin-Ix ⁇ reductase B
  • the composition may inhibit the reduction of biliverdin (BV)-IX ⁇ to bilirubin (BR)-IX ⁇ .
  • biliverdin (BV)-Ix ⁇ reductase B refers to an enzyme that plays an important role in the heme metabolism process.
  • biliverdin reductase refers to an enzyme that catalyzes the reaction that reduces biliverdin to bilirubin.
  • biliverdin (BV) is a green pigment produced during the process of heme breakdown
  • BR bilirubin
  • Biliverdin reductase uses NADPH as a coenzyme to carry out the above reaction. This enzyme is also found in liver cells, spleen, and other tissues, and is known to have antioxidant and cytoprotective functions.
  • prevention means any action that inhibits or delays the onset of thrombocytopenia
  • treatment means any action that improves or beneficially changes thrombocytopenia by administering a pharmaceutical composition according to one aspect.
  • the "pharmaceutical composition” may be provided as a pharmaceutical composition comprising the active ingredient alone or including one or more pharmaceutically acceptable carriers, excipients or diluents.
  • the carrier may be, for example, a colloidal suspension, a powder, a saline solution, a lipid, a liposome, microspheres, or nano-spheres. These may be complexed or associated with a carrier vehicle and may be transported in vivo using carrier systems known in the art, such as lipids, liposomes, microparticles, gold, nanoparticles, polymers, condensation agents, polysaccharides, polyamino acids, dendrimers, saponins, adsorption enhancing substances, or fatty acids.
  • carrier systems known in the art, such as lipids, liposomes, microparticles, gold, nanoparticles, polymers, condensation agents, polysaccharides, polyamino acids, dendrimers, saponins, adsorption enhancing substances, or fatty acids.
  • the above pharmaceutical composition when the above pharmaceutical composition is formulated, it can be prepared using diluents or excipients such as lubricants, sweeteners, flavoring agents, emulsifiers, suspending agents, preservatives, fillers, bulking agents, binders, wetting agents, disintegrating agents, and surfactants that are commonly used.
  • Solid preparations for oral administration may include tablets, pills, powders, granules, capsules, etc., and such solid preparations can be prepared by mixing at least one excipient, such as starch, calcium carbonate, sucrose or lactose, gelatin, etc., with the above pharmaceutical composition.
  • lubricants such as magnesium stearate and talc can also be used.
  • Liquid preparations for oral administration include suspensions, solutions, emulsions, and syrups.
  • simple diluents such as water and liquid paraffin
  • they may contain various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives.
  • Preparations for parenteral administration may include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, and suppositories.
  • Non-aqueous solvents and suspensions may include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, and injectable esters such as ethyl oleate.
  • Suppository bases may include witepsol, macrogol, Tween 61, cacao butter, laurin butter, and glycerogelatin. When manufacturing in the form of eye drops, known diluents or excipients may be used.
  • the above pharmaceutical composition may be administered parenterally or orally, such as by external application to the skin or by intraperitoneal injection, intrarectal injection, subcutaneous injection, intravenous injection, intramuscular injection, intraarterial injection, intramedullary injection, intracardiac injection, intrathecal injection, percutaneous injection, intranasal injection, intraenteric injection, local injection, sublingual injection, or intrathoracic injection.
  • intraperitoneal injection intrarectal injection
  • subcutaneous injection intravenous injection
  • intramuscular injection intraarterial injection
  • intramedullary injection intracardiac injection
  • intrathecal injection percutaneous injection, intranasal injection, intraenteric injection, local injection, sublingual injection, or intrathoracic injection.
  • the above pharmaceutical composition is administered in a pharmaceutically effective amount.
  • pharmaceutically effective amount means an amount sufficient to treat a disease with a reasonable benefit/risk ratio applicable to medical treatment.
  • the effective dosage level may be determined based on the type and severity of the patient's disease, the activity and sensitivity of the drug, the time of administration, the route of administration, and the excretion rate, the duration of treatment, concomitant medications, and other factors well known in the medical field.
  • the above administration may be administered once daily or in several divided doses. For example, it may be administered every other day or once a week.
  • the above pharmaceutical composition may be provided mixed with a conventionally known pharmaceutical composition for the prevention or treatment of thrombocytopenia or a newly developed pharmaceutical composition for the prevention or treatment of thrombocytopenia.
  • a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of thrombocytopenia it is important to mix the pharmaceutical composition in an amount that achieves the maximum effect with the minimum amount without causing side effects, and this can be readily determined by those skilled in the art.
  • the pharmaceutical composition may be administered alone or in combination with another thrombocytopenia treatment.
  • the pharmaceutical composition may be administered in combination with a known composition having a preventive or therapeutic effect on thrombocytopenia or another thrombocytopenia treatment, and may be administered simultaneously, separately, or sequentially, and may be administered singly or in multiple doses. Taking all of the above factors into consideration, it is important to administer an amount that achieves maximum effect with the minimum amount possible without causing side effects, and this can be readily determined by those skilled in the art.
  • the present invention provides a pharmaceutical preparation for preventing or treating thrombocytopenia, comprising the pharmaceutical composition.
  • injection usually refers to a solution, suspension, emulsion, or solid sterile preparation that is administered directly into body tissues or organs such as subcutaneously, intramuscularly, or into blood vessels, or that is dissolved or suspended in a solvent when used.
  • injectable refers to a drug that is inserted into the body through the urethra, anus, vagina, etc. and is dissolved by body temperature or secretions before its effect is revealed.
  • spray refers to a medicine that is sprayed like a mist using a device.
  • liquid formulation refers to a pharmaceutical form that provides a drug in liquid form, and refers to a formulation that contains an active ingredient in liquid form.
  • patch refers to a preparation that adheres to the skin and provides sustained therapeutic effects. Patches have a lower risk of adverse effects, such as gastrointestinal or liver damage, due to oral medications. They can be administered to patients who have difficulty taking oral medications. Furthermore, they are absorbed directly into the bloodstream through the skin, bypassing liver metabolism. Therefore, compared to oral medications, they can be administered in lower doses while maintaining the same efficacy without adverse effects.
  • the formulation may be in the form of an injection, an infusion, a spray, a liquid or a patch.
  • the present invention provides a health functional food composition for preventing or improving thrombocytopenia, comprising Olsalkene and a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • the thrombocytopenia may be at least one selected from the group consisting of non-immunogenic thrombocytopenia, immunogenic thrombocytopenia, and drug-induced thrombocytopenia.
  • the composition may inhibit the activity of biliverdin (BV)-Ix ⁇ reductase B (BLVRB).
  • BV biliverdin
  • BVRB biliverdin-Ix ⁇ reductase B
  • the composition may inhibit the reduction of biliverdin (BV)-IX ⁇ to bilirubin (BR)-IX ⁇ .
  • improvement may mean any action that at least reduces a parameter associated with the condition being treated, for example, the severity of a symptom.
  • the health functional food may be used simultaneously with or separately from a drug for treatment before or after the onset of the disease in order to prevent or improve thrombocytopenia.
  • the active ingredient can be added directly to the food or used in combination with other foods or food ingredients, and can be used appropriately according to conventional methods.
  • the amount of the active ingredient mixed can be appropriately determined depending on the intended use (prevention or improvement).
  • the health functional food can be added in an amount of about 15% by weight or less, more specifically about 10% by weight or less, based on the raw material.
  • the amount may be below the above range.
  • the above health functional food may be formulated into one selected from the group consisting of tablets, pills, powders, granules, powders, capsules, and liquid formulations, further comprising one or more of a carrier, diluent, excipient, and additive.
  • Foods to which compounds according to one aspect may be added include various foods, powders, granules, tablets, capsules, syrups, beverages, gum, tea, vitamin complexes, and health functional foods.
  • carrier excipient, diluent and additive
  • the carrier, excipient, diluent and additive may include at least one selected from the group consisting of lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, erythritol, starch, acacia gum, calcium phosphate, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, polyvinylpyrrolidone, methylcellulose, water, sugar syrup, methylcellulose, methyl hydroxy benzoate, propyl hydroxy benzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
  • the above-mentioned health functional food may contain other ingredients as essential ingredients without special limitations.
  • it may contain various flavoring agents or natural carbohydrates as additional ingredients, as in conventional beverages.
  • natural carbohydrates may include conventional sugars such as monosaccharides, such as glucose, fructose, etc.; disaccharides, such as maltose, sucrose, etc.; and polysaccharides, such as dextrin, cyclodextrin, etc.; and sugar alcohols, such as xylitol, sorbitol, erythritol, etc.
  • natural flavoring agents thaumatin, stevia extracts (e.g., rebaudioside A, glycyrrhizin, etc.)
  • synthetic flavoring agents sacharin, aspartame, etc.
  • the proportion of the above-mentioned natural carbohydrates can be appropriately determined by a person skilled in the art.
  • health functional foods may contain various nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), flavorings such as synthetic flavorings and natural flavorings, coloring agents and thickening agents (cheese, chocolate, etc.), pectic acid and its salts, alginic acid and its salts, organic acids, protective colloid thickeners, pH adjusters, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohol, carbonating agents used in carbonated beverages, etc.
  • vitamins, minerals electrophilitol, etc.
  • flavorings such as synthetic flavorings and natural flavorings
  • coloring agents and thickening agents cheese, chocolate, etc.
  • pectic acid and its salts such as synthetic flavorings and natural flavorings, coloring agents and thickening agents (cheese, chocolate, etc.
  • pectic acid and its salts such as synthetic flavorings and natural flavorings, coloring agents and thickening agents (cheese, chocolate, etc.
  • pectic acid and its salts such as synthetic flavorings
  • the above health functional food may be provided in combination with a conventionally known health functional food for preventing or improving thrombocytopenia, or a newly developed health functional food for preventing or improving thrombocytopenia. If the above health functional food further includes a health functional food for preventing or improving thrombocytopenia, it is important to mix the two in an amount that achieves maximum effect with the minimum amount without causing side effects, and this can be readily determined by those skilled in the art.
  • the health functional food may be consumed alone or in combination with a health functional food for preventing or improving thrombocytopenia.
  • the health functional food may be consumed in combination with a known composition having a preventive or improving effect on thrombocytopenia or another health functional food for preventing or improving thrombocytopenia, and may be consumed simultaneously, separately, or sequentially, and may be consumed singly or in multiple doses. It is important to take all of the above factors into consideration and consume an amount that achieves the maximum effect with the minimum amount without causing side effects, and this can be readily determined by those skilled in the art.
  • E. coli DH5 ⁇ cells were cultured in LB medium at 37°C to obtain the AzoR protein. Because various hydrophilic quinones enhance the mRNA level of the acpD gene encoding the AzoR protein, 0.5 mM methylhydroquinone (2-MHQ) was added to the culture medium when the optical density of the cells at 600 nm ( OD600 ) reached 0.8. The cells were harvested by centrifugation after 3–4 h, and anion-exchange column chromatography using a Hitrap-Q HP column (Cytiva) was performed to concentrate the AzoR protein.
  • 2-MHQ methylhydroquinone
  • the column was pre-calibrated with buffer (pH 8.0, 25 mM Tris-HCl) and then eluted with a 1.0 M NaCl gradient.
  • the AzoR activity of the eluted fractions was measured by an enzyme activity assay using 0.1 mM menadione and 0.1 mM NADH, and the decrease in absorption at 340 nm was measured as previously reported.
  • a 0.1 mM stock solution of menadione was prepared in 100% DMSO. The eluted fractions were diluted 100-fold before analysis.
  • the eluted fraction with the highest activity was diluted 1000-fold in phosphate-based saline (PBS) buffer and used for the cleavage assay of olsalazine, to which 1% DMSO was additionally added to dissolve 0.1 mM menadione.
  • PBS phosphate-based saline
  • N-terminal His6 -tagged BLVRB was expressed in E. coli strain BL21 DE3 using the pET-21b protein expression vector.
  • Transformed E. coli Cells were cultured in LB and M9 media at 37°C to express unlabeled and isotope-labeled ( 15 N or 13 C/ 15 N) BLVRB proteins, respectively.
  • OD600 0.8 0.5 mM IPTG was added.
  • the cells were harvested and lysed by sonication in buffer (pH 8.0, 25 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 10 mM ⁇ ).
  • the BLVRB protein was first purified by His-tag affinity column chromatography using a HisTrap HP column (Cytiva). To remove the His-tag, the protein eluate was dialyzed against buffer (pH 8.0, 50 mM Tris-HCl, 1 mM dithiothreitol) overnight at 4°C after adding thrombin ( ⁇ 5 units/mg protein). Since thrombin bound to the HiTrap-Q HP column at pH 8.0, buffer (pH 8.0, 25 mM Tris-HCl and 1 mM dithiothreitol) was used.
  • Ion exchange column chromatography was performed with 1.0 M dithiothreitol, followed by elution with a 1.0 M NaCl gradient, eluting BLVRB and thrombin at ⁇ 150 and ⁇ 300 mM NaCl, respectively.
  • a HisTrap HP column was attached alongside the HiTrap-Q column.
  • the BLVRB protein was further purified by size exclusion chromatography (SEC) using a HiLoad 16/600 Superdex 75 (Cytiva) with unbuffered solution (50 mM NaCl and 1 mM dithiothreitol). The protein fractions were concentrated using a 10 kDa MWCO (Millipore) ultracentrifugal filter and stored at -70°C before use.
  • Purified BLVRB was denatured in buffer (pH 7.5, 25 mM Tris-HCl, 10 mM ⁇ -mercaptoethanol, and 6.0 M urea) and then applied to a HisTrap HP column. After washing with buffer (pH 5.0, 25 mM Na-acetate, 10 mM ⁇ -mercaptoethanol, and 6.0 M urea), the solution was eluted with a gradient of 1.0 M NaCl.
  • apo-BLVRB was further purified by cation-exchange column chromatography using a HiTrap-SP column (Cytiva). Protein elution was performed with a gradient of 1.0 M NaCl in the presence of 6.0 M urea. The protein eluate was reconjugated by dialysis against buffer (pH 6.5, 50 mM Bis-tris, 150 mM NaCl, and 1 mM DTT).
  • the protein was purified by SEC using a HiLoad 16/600 Superdex 75 with buffer (pH 6.5, 10 mM Bis-tris, 50 mM NaCl, and 1 mM DTT).
  • the apo-BLVRB solution was concentrated and stored at -70°C. Upon thawing the frozen sample, approximately 10% of apo-BLVRB precipitated, but the structure was maintained as confirmed by 1 H- 15 N HSQC spectrum.
  • 1 mM NADPH + was added to the BLVRB protein solution, and further purified by size exclusion chromatography in buffer (pH 8.0, 20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, and 1 mM DTT) using a HiLoad 16/600 Superdex 75.
  • the protein fraction was concentrated using a 10 kDa MWCO ultracentrifugal filter.
  • the protein supernatant (14.8 mg/ml) was integrated and stored at -70°C before use.
  • BLVRB crystals were grown in buffer (pH 6.5, 0.1 M Bis-Tris, 1.9–2.0 M ammonium sulfate) using the hanging-drop method vapor diffusion at 18°C. To soak the OSK molecules, the crystals were incubated in the same crystallization buffer containing 1 mM OSK and 0.2 mM NADP + at 18°C for 1 day. Because the OSK stock solution (100 mM) was prepared in 100% DMSO, 1% DMSO was additionally present in the soaking solution. Crystals of the BLVRB:OSK complex were looped and flash frozen in liquid nitrogen using 20–25% glycerol as a cryoprotectant.
  • X-ray diffraction data were collected at beamline 5C of the Pohang Accelerator Laboratory.
  • the diffraction data were processed using the HKL-2000 program, and the structure was solved by molecular replacement (MR) using the previously reported BLVRB coordinates (PDB code, 7ERA).
  • MR molecular replacement
  • the structural model was refined by alternating model building with the Coot program and refinement with the PHENIX software package. Structural visualization was performed using the Chimera program.
  • a schematic diagram of the interaction network for OSK and OSA complexed with BLVRB was generated using LIGPLOT.
  • Enzyme kinetics were monitored using the absorbance of NADPH at 340 nm using a SpectraMax Gemini EM Microplate Reader (Molecular Devices). Enzyme reactions were performed with 0.5 ⁇ M BLVRB, 100 ⁇ M FMN, and 100 ⁇ M NADPH in PBS buffer containing 0.5% DMSO in the presence of various concentrations of inhibitors (OSK and OSA). The initial reaction rate was estimated from data collected over 5 min and fitted to the Michaelis–Menten equation. The inhibition model and inhibition constant were determined using an in-house Python script for nonlinear least-squares regression fitting.
  • ITC Isothermal titration calorimetry
  • ITC Isothermal Titration Calorimetry experiments were performed at 25°C in buffer (pH 6.5, 50 mM Bis-tris, 50 mM NaCl, 0.1 mM TCEP) using a Microcal Auto-iTC200 (Malvern Instruments). 0.09 mM BLVRB and 1.1 mM drug (OSK or OSA) were loaded into the calorimetric cell (200 ⁇ l) and syringe (40 ⁇ l), respectively. ITC data were analyzed after subtracting the heat of a blank injection measured under identical conditions but in the absence of BLVRB. Data processing was performed using Origin software provided by the manufacturer, and fitting was performed with a single-site binding model.
  • the inventors developed a new synthetic method that replaces the diazenyl bond with an alkene bond while maintaining the trans configuration.
  • Thermodynamic quantities such as ⁇ H and ⁇ S were characterized using isothermal titration calorimetry (ITC), which directly measures the heat generated during the formation of the BLVRB-OSK complex at a constant temperature.
  • ITC isothermal titration calorimetry
  • the dissociation constant (K D ) of OSK was found to be 140 nm (Table 1, Figure 5), indicating that OSK acts as a potent and efficient binder for BLVRB.
  • OSK exhibited a more specific interaction with BLVRB than the xanthine-based inhibitors (Table 1).
  • the binding of OSK was primarily driven by the enthalpy change, reflecting the specific interaction between BLVRB and the compound.
  • the difference in thermodynamic values between OSA and OSK can be explained by the replacement of the diazenylic bond with an alkene bond.
  • the ITC findings support the existence of a specific interaction between BLVRB and OSK.
  • Protein-based NMR spectroscopy is emerging as a highly effective method for identifying intermolecular interactions, including those involving small molecules and proteins. Furthermore, protein-based NMR methods provide valuable insights into binding sites, which are crucial for optimizing the positioning of small molecules within complexes. This typically involves monitoring chemical shift changes in 1H - 15N HSQC spectra. Assigning amide resonances is essential for interpreting HSQC spectra, and this is accomplished using HNCA and HN(CO)CA spectra, which provide 95% of the backbone resonance assignments.
  • the present inventors analyzed the structure of the complex through crystallization of the BLVRB-OSK complex to analyze in detail the binding of Olsalken to BLVRB.
  • the crystal structure of BLVRB bound to NADP + and OSK was determined at a resolution of 1.7 ⁇ .
  • the crystal belongs to the space group P2 1 2 1 2, and each crystal asymmetric unit contains two BLVRB molecules.
  • BLVRB in complex with OSK is very similar to previously determined structures.
  • the backbone RMSD of the complex was 1.06 and 0.17 ⁇ compared to the BLVRB-NADP + -FMN (PDB ID: 1HE4) and BLVRB-NADP + -OSA (PDB ID: 7ERA) complexes, respectively, indicating a high structural similarity between BLVRB in complex with OSK and BLVRB in complex with the base substrate and OSA ( Figure 7A ).
  • the binding site of OSK is closely associated with the nicotinamide moiety of the NADP + cofactor, and the xanthine ring of FMN adopts an orientation similar to that of xanthine-based inhibitors such as phloxine B and erythrosine ( Figure 7B).
  • the main driving forces for OSK binding are ring-stacking interactions between the nicotinamide moiety of NADP + and OSK, and hydrophobic interactions involving residues S111, F113, W116, L125, V128, P152, and H153 ( Figure 7C).
  • favorable interactions are promoted by positively charged residues R78, K120, R124, R170, and K178.
  • OSK shifts the side chain of W116 (as observed in the FMN complex) by approximately 2.5 ⁇ toward the binding pocket, and the side chain of R78 forms a hydrogen bond with OSK, potentially enhancing drug binding.
  • the orientation of R78 may enhance the hydrophobic interaction between the drug compound and BLVRB.
  • the enzyme kinetics of BLVRB in the presence of NADPH were investigated using the inhibitors OSK and OSA.
  • the inhibition mechanism of BLVRB by OSK or OSA is shown in Figure 8A. (Here, E represents BLVRB, and I represents OSK or OSA.)
  • the linear Weaver-Burk plot showed a mixed inhibition pattern characterized by competitive (K ic ) and non-competitive (K iu ) inhibition constants ( Figures 8B to 8C).
  • the linear Weaver-Burk plot of OSK showed a maximum rate (V m ) of 4.80 ⁇ 0.16 ⁇ M/min and a Michaelis constant (K m ) of 61.73 ⁇ 5.28 ⁇ M.
  • the competitive inhibition constant (K ic ) of 559.95 ⁇ 100.98 nM suggests that OSK competes with its substrate (FMN) for binding to the active site of BLVRB.
  • the non-competitive inhibition constant (K iu ) of 606.14 ⁇ 61.32 nM indicates that OSK binds to both NADP + and NADPH complexes of BLVRB, altering its conformation and inhibiting its enzyme activity (Figure 8B).
  • K iu non-competitive inhibition constant
  • OSK and OSA can bind to both the NADP + and NADPH complexes of BLVRB, thereby affecting BLVRB activity. Furthermore, both OSK and OSA can bind to apo-BLVRB, which is distinct from the xanthine-based inhibitor phloxin-B, implying a superior inhibitory activity of OSK (Fig. 9).

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Abstract

일 양상은 올살켄(olsalkene), 이의 제조방법 및 이를 포함하는 혈소판 감소증 예방 또는 치료 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다. 일 양상에 따르면, 올살켄이 체내에서 아조레덕타제(AzoR)에 의해 절단되지 않고 빌리버딘 환원효소 B(BLVRB)에 결합하여 빌리버딘(biliverdin, BV)이 빌리루빈(bilirubin, BR)으로 환원을 억제하는 것을 확인했다. 또한, 빌리버딘 환원효소 B의 활성 억제를 통해 혈소판 생성을 촉진하는 것을 확인했다. 따라서, 상기 올살켄은 빌리버딘 환원효소 B의 활성을 억제하여 혈소판 생성을 촉진하는 역할을 통해 혈소판 감소증 치료제, 건강기능식품 등으로 유용하게 활용될 수 있다.

Description

신규 올살라진 유도체 화합물 및 이를 유효성분으로 포함하는 혈소판 감소증 예방 또는 치료용 조성물
본 발명의 일 예는 올살켄(Olsalkene, OSK), 이의 입체 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 이의 제조방법, 이를 유효성분으로 포함하는, 혈소판 감소증의 예방 또는 치료용 조성물, 및 상기 조성물의 용도에 관한 것이다.
혈소판은 다능성 조혈 줄기세포에서 분화되는 거대핵세포(megakaryocyte, MK)에서 유래한다. 혈소판은 혈액 지혈과 혈전증뿐만 아니라 염증, 신생 혈관 형성, 선천성 면역, 적응 면역 반응, 종양 전이 등 다양한 생물학적 과정에서 중추적인 역할을 한다. 따라서 혈소판 수를 조절하고 특정 혈소판 반응을 제어하는 것은 혈소판 관련 질환을 치료하는 신약의 핵심 목표이다. 혈소판 조절 장애는 혈소판 감소증을 포함한 다양한 출혈 장애를 유발할 수 있다. 혈소판 감소증에 대한 일반적인 치료는 혈소판 생성 유도 또는 혈소판 수혈을 통해 혈소판 수를 증가시키는 것이다. 반대로 혈소판 증가증은 혈소판 감소증과는 대조적으로 혈소판이 혈액 내에 과도하게 많은 상태를 말한다. 원발성(본태성) 및 이차성(반응성) 혈소판증 집단을 대규모 혈소판 전사체 시퀀싱을 통해 분석한 결과, 빌리버딘 환원효소 B(biliverdin reductase B, BLVRB)가 활성 산소 종(ROS)을 조절하여 MK 분화를 통해 혈소판 생산을 조절하는 것으로 밝혀졌다.
헴(heme) 분해 경로에서 BLVRB는 헴 산소화효소(s)-1(유도성 HMOX1) 및 -2(구성성 HMOX2)의 하류에 있는 NAD(P)H를 활용하여 빌리버딘(biliverdin, BV)-IXβ를 빌리루빈(bilirubin, BR)-IXβ로 환원한다. 이 과정의 산물인 BR은 강력한 항산화제 역할을 하며 세포 보호 효과를 나타낸다. 다만, 고농도는 독성을 유발할 수 있다. 따라서 BLVRB의 제어를 받는 BV/BR 산화 환원 주기는 활성 산소 종(ROS)을 조절하는 데 중요한 역할을 한다. BLVRB의 기능상실 돌연변이(BLVRBS111L)를 발현하는 유도 만능 줄기세포(iPSC)를 사용한 연구에 따르면 변형된 CD34+/BLVRBS111L 조혈 줄기세포(HSC)에서 MK 콜로니 형성(CFU-MK)으로 측정한 결과 ROS 축적 및 증식이 많이 증가한 것으로 나타났다. 반면 야생형 BLVRB는 이러한 효과를 나타내지 않았다. 상기 기능 상실 돌연변이체(BLVRBS111L)는 MK 분화를 유도하고, 결과적으로 ROS 축적을 통해 혈소판 생성을 촉진한다. 따라서 BLVRB 활성을 억제하여 항산화제 BR을 효과적으로 제거하면 헴 분해 경로 내에서 BLVRB의 고유한 산화 환원 조절을 활용하여 혈소판 생성을 증가시키는 새로운 전략을 도모할 수 있다.
BLVRB 활성을 억제하기 위해 크산텐 염료와 아크리딘 함유 화합물이 개발되었다. 이러한 화합물은 천연 BLVRB 기질인 플라빈 모노뉴클레오티드(FMN)와 구조가 유사하다. 크산틴 염료 중에서도 에리스로신 B(erythrosin B)와 플록신 B(phloxine B)가 가장 강력한 억제제로 부상했다. 분자 모델링 및 X-선 결정학 연구에 따르면 에리스로신 B와 플록신 B는 BLVRB의 활성 부위에 결합하는 것으로 밝혀졌다. 또한, BLVRB 활성 부위 내의 수소 결합 네트워크가 밝혀졌고 촉매 활성에서 S111 잔기의 중요한 역할이 강조되었다. 흥미롭게도 선형 위버-버크 플롯 분석 결과, 이러한 억제제는 천연 기질인 FMN만큼 깊게 결합하지는 않으나 BLVRB의 결합 포켓과 유사하게 결합하지만 비경쟁적인 방식으로 작용하는 것으로 나타났다. 에리스로신 B와 플록신 B는 모두 식품 착색제로 활용되어 왔으며, 플록신 B는 다양한 그람 양성 박테리아에 대한 항균 활성도 나타냈다. 그러나 에리스로신 B를 만성적으로 투여하면 쥐의 갑상선 종양 촉진과 관련이 있는 것으로 나타났다. 또한, NMR과 동적광산란(DLS) 실험을 통해 에리스로신 B와 플록신 B가 모두 BLVRB의 다중화를 유도하여 치료 효과를 떨어뜨린다는 사실도 확인했다. 따라서 혈소판 장애를 치료하기 위해 BLVRB를 표적으로 하는 신약 후보 물질이 필요하다.
이 목표를 추구하기 위해 약물 용도 변경 접근법을 사용하여 새로운 후보 물질을 선별한 결과 20개의 잠재적 억제제가 확인되었다. FDA 승인 약물의 재창출에서 파생된 억제제 중 올살라진(olsalazine, OSA)은 가장 강력한 억제 친화력을 나타낸다. 최근의 연구에서 다양한 인체 위장 환경에서 올살라진이 분해되는 것을 보고하고 있다. 올살라진은 풍부한 아조레덕타제(azoreductase, AzoR)에 의해 절단되기 쉬운 디아제닐 결합을 포함하고 있다.
따라서 본 발명자들은 올살라진의 억제성, 생화학적, 생물물리학적 특성을 유지하면서 AzoR에 의해 절단되지 않는 새로운 화합물을 개발하는 데 초점을 맞췄다. 이를 위해 본 발명자들은 올살라진의 디아제닐 결합을 알켄 결합으로 대체하는 새로운 화학 체계를 고안하여 올살켄(olsalkene, OSK, (E)-5,5'-(ethene-1,2-diyl)bis(2-hydroxybenzoic acid))을 완성하였다.
일 양상은 하기 화학식 1로 표시되는 올살켄(Olsalkene), 이의 입체 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공하는 것이다.
[화학식 1]
다른 양상은 상기의 올살켄(Olsalkene)의 제조방법을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 상기의 올살켄(Olsalkene) 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 혈소판 감소증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 상기의 약학적 조성물을 포함하는, 혈소판 감소증의 예방 또는 치료용 약학제제를 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 상기의 올살켄(Olsalkene) 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 혈소판 감소증의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 올살켄(Olsalkene) 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 혈소판 감소증의 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 혈소판 감소증의 예방 또는 치료용 약제의 제조를 위한 올살켄(Olsalkene) 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 용도를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 하기 화학식 1로 표시되는 올살켄(Olsalkene), 이의 입체이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다.
[화학식 1]
또한, 본 발명은, 하기의 단계를 포함하는, 상기 올살켄(Olsalkene)의 제조방법을 제공한다:
5-포밀-2-하이드록시벤조산(5-formyl-2-hydroxybenzoic acid)을 요오드화 메틸과 반응시켜 중간체를 제조하는 단계;
상기 중간체와 TiCl4를 반응시켜 하기 화학식 2로 표시되는 화합물을 제조하는 단계; 및
화학식 2로 표시되는 화합물과 BBr3을 반응시키는 단계.
[화학식 2]
또한, 본 발명은, 상기 올살켄(Olsalkene) 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 혈소판 감소증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예로, 상기 혈소판 감소증은, 비면역원성 혈소판 감소증, 면역원성 혈소판 감소증 및 약물-유도 혈소판 감소증으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현 예로, 상기 조성물은 빌리버딘(biliverdin, BV)-Ixβ 환원효소 B(BLVRB)의 활성을 억제하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예로, 상기 조성물은 빌리버딘(biliverdin, BV)-IXβ이 빌리루빈(bilirubin, BR)-IXβ로 환원되는 것을 억제하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은, 상기 약학적 조성물을 포함하는, 혈소판 감소증의 예방 또는 치료용 약학제제를 제공한다.
본 발명의 일 구현 예로, 상기 제제는 주사제형, 주입제형, 분무제형, 액상제형 또는 패취제형일 수 있다.
또한, 본 발명은, 상기 올살켄(Olsalkene) 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 혈소판 감소증의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예로, 상기 혈소판 감소증은, 비면역원성 혈소판 감소증, 면역원성 혈소판 감소증 및 약물-유도 혈소판 감소증으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현 예로, 상기 조성물은 빌리버딘(biliverdin, BV)-Ixβ 환원효소 B(BLVRB)의 활성을 억제하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예로, 상기 조성물은 빌리버딘(biliverdin, BV)-IXβ이 빌리루빈(bilirubin, BR)-IXβ로 환원되는 것을 억제하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 올살켄(Olsalkene) 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 혈소판 감소증의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 혈소판 감소증의 예방 또는 치료용 약제의 제조를 위한 올살켄(Olsalkene) 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 용도를 제공한다.
본 발명자들은 올살라진(olsalazine)의 생화학적, 생물물리학적 특성을 유지한 유도체인 올살켄(olsakene)을 개발하였다. 본 발명자들은 올살켄이 기존 올살라진과 달리 체내에서 아조레덕타제(AzoR)에 의해 절단되지 않고 빌리버딘 환원효소 B(BLVRB)에 결합하여 빌리버딘(biliverdin, BV)이 빌리루빈(bilirubin, BR)으로 환원을 억제하는 것을 확인했다. 또한, 빌리버딘 환원효소 B의 활성 억제를 통해 혈소판 생성을 촉진하는 것을 확인했다.
이를 통해 올살켄이 빌리버딘 환원효소 B의 활성을 억제하여 혈소판 생성을 촉진하는 역할을 통해 혈소판 감소증 치료제, 건강기능식품 등으로 유용하게 활용될 수 있다.
도 1A 내지 1B는 AzoR 효소의 부분 정제 및 효소 동역학을 나타낸다. 도 1A는 음이온 교환 크로마토그래피를 통해 정제 후 단백질 프로파일을 표시하는 SDS-PAGE 결과를 나타낸다. 도 1B는 용출된 분획에서 메나디온의 감소를 측정하여 시간에 따른 340nm에서의 흡광도 감소로 표시되는 AzoR의 효소 활성 분석을 나타낸다.
도 2A 내지 2D는 세포 추출물을 함유한 아조레덕타제(AzoR)에 의해 5-아미노살리실산(5-ASA)을 생성하는 올살라진(OSA)의 디아제닐 결합의 절단을 나타낸다. 도 2A는 도 2B의 올살라진, 도 2C의 NAD+ 및 도 2D의 5-ASA의 기준 스펙트럼과 함께 AzoR 활성 및 NADH의 파벌로 처리된 OSA의 1D 1H NMR 스펙트럼을 나타낸다. 도 2B는 OSA의 모든 화학 구조가, 도 2C는 NAD+, 그리고 도 2D는 5-ASA의 AzoR 촉매의 생성물, NADH와 OSA를 이용한 모든 화학 구조가 해당 스펙트럼 위에 표시되어 있다.
도 3A 내지 3D는 half-holo BLVRB의 5-ASA 결합을 나타낸다. 도 3A는 1mM 5-ASA의 부재(검은색) 및 존재(빨간색)에서 0.1mM half-holo BLVRB의 1H-15N HSQC 스펙트럼을 나타낸다. 도 3B는 OSK(검은색) 및 5-ASA(회색)와 복합체에서 half-holo BLVRB와 BLVRB의 화학적 시프트 차이를 나타낸다. 도 3C는 half-holo BLVRB에 결합하기 위한 NMR 적정 데이터를 나타낸다. 도 3D는 이전에 보고된 PDB 구조(7ERA)의 결정 대칭을 사용하여 생성된 5-ASA가 결합된 half-holo BLVRB의 표면 표현을 나타낸다.
도 4A 내지 4C는 1D 1H NMR 스펙트럼을 나타낸 것으로 도 4A는 AzoR 활성의 분율과 NADH로 처리한 OSK이고, 도 4B는 OSK 및 도 4C는 NADH이다.
도 5A 내지 5B는 OSK (도 5A) 및 OSA (도 5B)의 적정을 통한 BLVRB의 등온 적정 열량 측정 열화상 사진이다.
도 6A 내지 6D는 NMR 분광법으로 밝혀진 기판 포켓 내 OSK의 결합 토폴로지를 나타낸다. 도 6A는 OSK로 적정된 half-holo BLVRB의 1H-15N HSQC 스펙트럼을 나타낸다. 도 6B는 half-holo BLVRB와 OSK와 복합체를 이룬 BLVRB의 화학적 이동 차이를 나타낸다. 도 6C는 이전에 보고된 PDB 구조(1HE4)의 결정 대칭을 사용하여 생성된 FMN이 포함된 half-holo BLVRB의 표면을 나타낸다. 도 6D는 결정 구조로부터 도출된 OSK를 사용한 half-holo BLVRB의 표면을 나타낸다.
도 7A 내지 7C는 복합체 내 BLVRB와 올라살라진(OSA) 및 올살켄(OSK)의 구조 비교한 것이다. 도 7A는 BLVRB의 백본을 리본으로 표현한 것이다. 도 7B는 BLVRB와 OSA 또는 OSK의 상호 작용 위치를 겹쳐 놓은 것을 나타낸다. 도 7C는 BLVRB:OSK 복합체의 상호 작용 네트워크 모식도이다.
도 8A 내지 8C는 억제 메커니즘(도 8A)과 OSK(도 8B) 및 OSA(도 8C)를 사용한 BLVRB의 선형 위버-버크 플롯을 나타낸다.
도 9A 내지 9E는 apo-BLVRB의 1H-15N HSQC 스펙트럼으로, 도 9A는 OSK, 도 9B는 OSA 및 도 9C는 PhlB의 첨가 여부(부재(검은색) 및 존재(회색))에 따른 데이터가 오버레이되어 있다. 도 9D는 OSK, 도 9E는 OSA의 apo-BLVRB 결합에 대한 NMR 적정 데이터를 나타낸다.
이하, 본 발명에서 상세히 설명한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 하기 화학식 1로 표시되는 올살켄(Olsalkene), 이의 입체 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공한다.
[화학식 1]
상기 용어 "올살켄(olsalkene)"이란 (E)-5,5'-(ethene-1,2-diyl)bis(2-hydroxybenzoic acid)으로, 올살라진의 디아제닐 결합을 알켄 결합으로 대체한 올살라진 유도체이다. 본 발명자들은 체내에서 아조레덕타제(azoreductase, AzoR)에 의해 절단되지 않고 BLVRB 활성을 억제하는 것을 확인했다.
상기 용어 "올살라진(olsalazine)"이란 5-아미노살리실산(5-ASA) 유도체로 본래 궤양성 대장염 치료에 사용되는 항염증 약물이다. 올살라진은 BLVRB 활성을 억제하는 것으로 알려졌다. 다만, 올살라진은 풍부한 아조레덕타제에 의해 절단되기 쉬운 디아제닐 결합을 포함하고 있어, 인체 위장 환경에서 올살라진이 분해된다는 연구가 있다.
상기 용어 "입체 이성질체"란 동일한 분자식과 결합 구조를 가지지만 3차원 공간에서의 원자 배열이 다른 화합물을 의미한다.
"약학적으로 허용 가능한 염"란 화합물의 원하는 생물학적 활성을 유지하고 최소를 나타내거나 원하지 않는 독성학적 효과를 나타내지 않는 화합물의 약학적으로 허용가능한 염, 수화물, 용매화물 또는 전구약물(프로드럭)을 의미할 수 있다.
상기 용어 "염"이란 무기 및/또는 유기산 및 염기로 형성된 산성 및/또는 염기성 염 형태를 의미한다. 일 구현 예에 따라, 화합물의 염은 염이 침전하는 것과 같은 매질에 또는 수성 매질에서 본 발명의 화합물을 동등량과 같은 산 또는 염기의 양과 반응시켜 형성될 수 있다.
또한, 본 발명은, 하기의 단계를 포함하는, 청구항 1의 올살켄(Olsalkene)의 제조방법을 제공한다:
5-포밀-2-하이드록시벤조산(5-formyl-2-hydroxybenzoic acid)을 요오드화 메틸과 반응시켜 중간체를 제조하는 단계;
상기 중간체와 TiCl4를 반응시켜 하기 화학식 2로 표시되는 화합물을 제조하는 단계; 및
화학식 2로 표시되는 화합물과 BBr3을 반응시키는 단계.
[화학식 2]
한편, 올살켄의 제조방법이 실시예의 구체적인 합성 조건들로 제한되는 것은 아니며, 유기화학 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 공지된 유기화학 지식을 이용하여 적절히 변경하여 수행할 수도 있다.
달리 명시되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 성분, 반응 조건, 조성물 및 배합물의 양을 표현하는 모든 숫자, 값 및/또는 표현은, 이러한 숫자들이 본질적으로 다른 것들 중에서 이러한 값을 얻는 데 발생하는 측정의 다양한 불확실성이 반영된 근사치들이므로, 모든 경우 "약"이라는 용어에 의해 수식되는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 본 기재에서 수치범위가 개시되는 경우, 이러한 범위는 연속적이며, 달리 지적되지 않는 한 이러한 범 위의 최솟값으로부터 최댓값이 포함된 상기 최댓값까지의 모든 값을 포함한다. 더 나아가, 이러한 범위가 정수를 지칭하는 경우, 달리 지적되지 않는 한 최솟값으로부터 최댓값이 포함된 상기 최댓값까지를 포함하는 모든 정수가 포함된다.
본 명세서에서, 범위가 변수에 대해 기재되는 경우, 상기 변수는 상기 범위의 기재된 종료점들을 포함하는 기재된 범위 내의 모든 값들을 포함하는 것으로 이해될 것이다. 예를 들면, "5 내지 10"의 범위는 5, 6, 7, 8, 9, 및 10의 값들뿐만 아니라 6 내지 10, 7 내지 10, 6 내지 9, 7 내지 9 등의 임의의 하위 범위를 포함하고, 5.5, 6.5, 7.5, 5.5 내지 8.5 및 6.5 내지 9 등과 같은 기재된 범위의 범주에 타당한 정수들 사이의 임의의 값도 포함하는 것으로 이해될 것이다. 또한, 예를 들면, "10% 내지 30%"의 범위는 10%, 11%, 12%, 13% 등의 값들과 30%까지를 포함하는 모든 정수들뿐만 아니라 10% 내지 15%, 12% 내지 18%, 20% 내지 30% 등의 임의의 하위 범위를 포함하고, 10.5%, 15.5%, 25.5% 등과 같이 기재된 범위의 범주 내의 타당한 정수들 사이의 임의의 값도 포함하는 것으로 이해될 것이다.
또한, 본 발명은, 올살켄(Olsalkene) 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 혈소판 감소증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 용어 "혈소판 감소증"이란 혈액 내 혈소판의 수가 정상보다 낮아지는 질환을 의미한다. 혈소판은 출혈 시 응고를 통해 지혈을 촉진하는 중요한 역할을 한다. 혈소판 감소증이 발생하면 쉽게 멍이 들거나 출혈이 멈추지 않는 등의 증상이 나타날 수 있다. 혈소판 감소증의 원인은 다양하며, 자가면역 질환, 감염, 약물 부작용, 골수 이상 등이 포함된다.
본 발명의 일 구현 예로, 상기 혈소판 감소증은, 비면역원성 혈소판 감소증, 면역원성 혈소판 감소증 및 약물-유도 혈소판 감소증으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현 예로, 상기 조성물은 빌리버딘(biliverdin, BV)-Ixβ 환원효소 B(BLVRB)의 활성을 억제하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예로, 상기 조성물은 빌리버딘(biliverdin, BV)-IXβ이 빌리루빈(bilirubin, BR)-IXβ로 환원되는 것을 억제하는 것일 수 있다.
상기 용어 "빌리버딘(biliverdin, BV)-Ixβ 환원효소 B(BLVRB)"이란 헴 대사 과정에서 중요한 역할을 하는 효소를 지칭한다. 구체적으로, 빌리버딘 환원효소는 빌리버딘을 빌리루빈으로 환원시키는 반응을 촉매하는 효소를 의미한다. 여기서 "빌리버딘(biliverdin, BV)"은 헴의 분해 과정에서 생성되는 녹색 색소이며, "빌리루빈(bilirubin, BR)"은 노란색 색소로 최종적으로 담즙을 통해 체외로 배출된다. 빌리버딘 환원효소는 NADPH를 조효소로 사용하여 상기 반응을 진행한다. 이 효소는 간세포와 비장, 그리고 다른 조직에서도 발견되며, 항산화 작용과 세포 보호 기능도 가지고 있는 것으로 알려져 있다.
상기 용어 "예방"이란 혈소판 감소증의 발병을 억제하거나 지연시키는 모든 행위를 의미하고, 상기 용어 "치료"란 일 양상에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 혈소판 감소증이 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
일 양상에 있어서, 상기 "약학적 조성물"은 유효성분을 단독으로 포함하거나, 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하여 약학적 조성물로 제공될 수 있다.
구체적으로, 상기 담체는 예를 들어, 콜로이드 현탁액, 분말, 식염수, 지질, 리포좀, 미소구체(microspheres) 또는 나노 구형입자일 수 있다. 이들은 운반 수단과 복합체를 형성하거나 관련될 수 있고, 지질, 리포좀, 미세입자, 금, 나노입자, 폴리머, 축합 반응제, 다당류, 폴리아미노산, 덴드리머, 사포닌, 흡착 증진 물질 또는 지방산과 같은 당업계에 공지된 운반 시스템을 사용하여 생체 내 운반될 수 있다.
상기 약학적 조성물이 제제화될 경우에는 통상적으로 사용하는 윤활제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제, 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함될 수 있고, 이러한 고형제제는 상기 약학적 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 있으며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propyleneglycol), 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로 젤라틴 등이 사용될 수 있고, 점안제 형태로 제조 시 공지의 희석제 또는 부형제 등이 사용될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 피부 외용 또는 복강내 주사, 직장내 주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사, 동맥내 주사, 골수내 주사, 심장내 주사, 경막내 주사, 경피주사, 비강내 주사, 장관내 주사, 국소주사, 설하 주사, 또는 흉부내 주사 주입방식과 같은 비경구 투여 및 경구 투여가 가능할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
상기 투여는 하루에 한 번 투여되는 것일 수도 있고, 수 회 나누어 투여되는 것일 수도 있다. 예를 들어, 격일로 투여되는 것일 수도 있으며, 일주일에 하루 투여되는 것일 수도 있다.
상기 약학적 조성물은 종래에 알려져 있는 혈소판 감소증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 또는 새롭게 개발되는 혈소판 감소증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물과 혼합되어 제공될 수 있다. 상기 약학적 조성물이 혈소판 감소증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 더 포함하는 경우, 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양이 혼합되는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
또한, 일 양상에 있어서, 상기 약학적 조성물은 단독 투여 또는 다른 혈소판 감소증 치료제와 병용 투여되는 것일 수 있다. 즉, 상기 약학적 조성물은 혈소판 감소증의 예방 또는 치료 효과를 가지는 공지의 조성물 또는 다른 혈소판 감소증 치료제와 병행하여 투여될 수 있고, 동시에, 별도로, 또는 순차적으로 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
또한, 본 발명은, 상기 약학적 조성물을 포함하는, 혈소판 감소증의 예방 또는 치료용 약학제제를 제공한다.
상기 용어 "주사제"란 보통 피하, 근육내 또는 혈관 등의 체내조직 기관에 직접 투여하는 용액, 현탁액, 유탁액 또는 쓸 때 용제에 녹이거나 현탁하여 쓰는 고형의 무균제제를 말한다.
상기 용어 "주입제"란 요도, 항문, 질 등을 통하여 몸 안에 끼워 넣어 체온이나 분비물로 녹인 후에 약효가 나타나게 만든 약을 말한다.
상기 용어 "분무제"란 기구를 사용하여 안개처럼 내뿜어서 쓰는 약을 말한다.
상기 용어 "액상제"란 약물을 액체 형태로 제공하는 의약품 형태로서, 활성 성분을 액체로 포함하고 있는 제형을 말한다.
상기 용어 "패취제"란 피부에 부착하여 지속적으로 약효를 나타내도록 한 제제를 말한다. 패취제는 먹는 약으로 인한 위장 장애, 간 장애의 부작용의 위험이 낮고, 경구 투여가 곤란한 환자에게도 투여가 가능하며, 간 대사를 거치지 않고 피부를 통해 바로 혈관으로 흡수되므로 경구제에 비해 저용량 투여로 부작용 없이 동일한 약효를 나타낼 수 있다는 장점이 있다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 제제는 주사제형, 주입제형, 분무제형, 액상제형 또는 패취제형일 수 있다.
또한, 본 발명은, 올살켄(Olsalkene) 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 혈소판 감소증의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 혈소판 감소증은, 비면역원성 혈소판 감소증, 면역원성 혈소판 감소증 및 약물-유도 혈소판 감소증으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 조성물은 빌리버딘(biliverdin, BV)-Ixβ 환원효소 B(BLVRB)의 활성을 억제하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 조성물은 빌리버딘(biliverdin, BV)-IXβ이 빌리루빈(bilirubin, BR)-IXβ로 환원되는 것을 억제하는 것일 수 있다.
상기 용어 "개선"은 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들어, 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미할 수 있다.
일 양상에 있어서, 상기 건강기능식품은 혈소판 감소증의 예방 또는 개선을 위하여 해당 질병의 발병 단계 이전 또는 발병 후, 치료를 위한 약제와 동시에 또는 별개로서 사용될 수 있다.
상기 건강기능식품에서, 유효성분은 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조 시에 상기 건강기능식품은 원료에 대하여 구체적으로 약 15 중량% 이하, 보다 구체적으로 약 10 중량% 이하의 양으로 첨가될 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있다.
상기 건강기능식품은 담체, 희석제, 부형제 및 첨가제 중 하나 이상을 더 포함하여 정제, 환제, 산제, 과립제, 분말제, 캡슐제 및 액제 제형으로 이루어진 군에서 선택된 하나로 제형될 수 있다. 일 양상에 따른 화합물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 각종 식품류, 분말, 과립, 정제, 캡슐, 시럽제, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강기능성 식품류 등이 있다.
상기 담체, 부형제, 희석제 및 첨가제의 구체적인 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 슈크로즈, 솔비톨, 만니톨, 에리스리톨, 전분, 아카시아 고무, 인산칼슘, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 미세결정성 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 메틸셀룰로즈, 물, 설탕시럽, 메틸셀룰로즈, 메틸 하이드록시 벤조에이트, 프로필하이드록시 벤조에이트, 활석, 스테아트산 마그네슘 및 미네랄 오일로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.
상기 건강기능식품은 상기 유효성분을 함유하는 것 외에 특별한 제한 없이 다른 성분들을 필수 성분으로서 함유할 수 있다. 예를 들어, 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당 알코올일 수 있다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제 (타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어, 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등)) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 당업자의 선택에 의해 적절하게 결정될 수 있다.
상기 외에도, 일 양상에 따른 건강기능식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있으며, 이러한 첨가제의 비율 또한 당업자에 의해 적절히 선택될 수 있다.
상기 건강기능식품은 종래에 알려져 있는 혈소판 감소증의 예방 또는 개선용 건강기능식품 또는 새롭게 개발되는 혈소판 감소증의 예방 또는 개선용 건강기능식품과 혼합되어 제공될 수 있다. 상기 건강기능식품이 혈소판 감소증의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 더 포함하는 경우, 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양이 혼합되는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
또한, 상기 건강기능식품은 단독 섭취 또는 상기 혈소판 감소증의 예방 또는 개선용 건강기능식품과 병용 섭취되는 것일 수 있다. 상기 건강기능식품은 혈소판 감소증의 예방 또는 개선 효과를 가지는 공지의 조성물 또는 다른 혈소판 감소증의 예방 또는 개선용 건강기능식품과 병행하여 섭취될 수 있고, 동시에, 별도로, 또는 순차적으로 섭취될 수 있으며, 단일 또는 다중 섭취될 수 있다. 상기 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 섭취하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
실험재료 및 방법
1. 화학 물질
올살라진, 플록신-B, FMN, NADH, NAD+, NADPH, NADP+, 메틸하이드로퀴논(2-MHQ)을 포함한 모든 화학물질은 달리 명시되지 않는 한 Sigma Aldrich (USA)에서 구입했다. 15N-암모늄 클로라이드, 13C-글루코스 및 2H-디메틸설폭사이드(d6 -DMSO)는 Cambridge Isotope Laboratories에서 구입했다.
2. 올살켄(OSK)의 화학적 합성
모든 시약과 출발 물질, 순도 99.9% 이상의 무수 유기 용매는 Sigma Aldrich, TCI에서 조달하여 사용했다. 박층 크로마토그래피(TLC)는 실리카겔 60 F254를 사용하여 Merck 알루미늄 시트에서 수행했으며 자외선과 포스포몰리브산 및 KMnO4 로 염색하여 시각화했다. 화합물의 정제를 위해 Merck 실리카겔 60(230-400 메쉬)에서 컬럼 크로마토그래피를 수행했다. 1H NMR 스펙트럼은 Bruker DRX-400 분광기에서 기록했다. 화학적 이동(δ)은 내부 표준을 기준으로 측정한 백만 분의 1(ppm)로 보고하고 결합 상수(J)는 헤르츠(Hz)로 표시했다. 제품 질량은 Shimadzu(MALDI-TOF) 질량 분석기로 측정했다.
[올살켄의 합성]
하룻밤 동안 자력 교반기로 질소 기체 환경에서 보관된 100ml 두 목 둥근 바닥 플라스크에 담긴 건조 DMF 용매에 5-포밀-2-하이드록시벤조산 (1g, 0.0060 몰), 요오드화 메틸 (1.49 ml, 0.0240 몰) 및 건조된 K2CO3(2.91 g, 0.0210 몰)를 첨가하고 TLC 분석을 통해 반응 진행을 모니터링했다. 완료 후, 조덩어리를 물(3×25ml)로 담금질하고 디클로로메탄으로 추출한 후 컬럼 크로마토그래피법으로 정제하여 메틸 5-포밀-2-메톡시벤조산염(950mg)을 얻었다. 이와는 별도로, 0℃의 THF에서 Zn 분말 (1.01 g, 0.0224 몰)을 취하고 TiCl4 (2.12 g, 0.0112 몰)을 30분 동안 첨가하고 용액을 실온에서 60℃로 2시간 동안 연속적으로 가열하고 다시 반응 혼합물, 메틸 5-포밀-2-methoxybenzoate (500 mg, 0.0028 몰)를 THF에 한 방울씩 첨가하고 4시간 동안 환류시킨 후 K2CO3로 추가로 담금질하고 DCM 제공 (E)-디메틸 5,5'-(에텐-1,2-디일) 비스(2-메톡시벤조산염) (150 mg)으로 추출했다.
-78℃의 DCM에서 (E)-디메틸 5,5'-(에텐-1,2-디일)비스(2-메톡시벤조산염) (100 mg, 0.0003 몰) 용액에 BBr3 (240 μL, 0.0014)를 10ml 둥근 바닥 플라스크에 넣고 5시간 동안 실온에서 교반했다. 그런 다음 담금질을 위해 1M HCl 1ml를 첨가하고 15분 동안 잘 저어 준 다음 용매를 감압으로 제거하고 조덩어리를 에틸 아세테이트에 용해시키고 물과 소금물로 두 번 세척했다. 생성된 혼합물을 95% 에탄올에 용해시킨 다음 수산화 칼륨 용액을 첨가하여 환류 조건에서 3시간 동안 교반했다. 침전이 발생한 후, 반응 혼합물을 다시 1M HCl과 염수 용액으로 산성화하여 추출하고 에틸 아세테이트 용매에서 재결정화했다. 마지막으로 (E)-5,5'-(에텐-1,2-디일)비스(2-하이드록시벤조산)(60mg, 72%)의 무색 결정 고체를 얻었고 1H NMR 및 질량 스펙트럼 분석을 통해 추가로 확인했다. 1H NMR (CDCl3, 400MHz) δ6.96 (d, 2H, J = 8.64 Hz), 7.12 (s, 2H), 7.79 (d, 2H, J = 8.56 Hz), 7.96 (s, 2H); C16H12O6 : 300.27, 각각 322.5044 (M+Na) 발견됨에 대한 MALDI-TOF m/z calcd.
3. AzoR의 발현 및 부분 정제
대장균 DH5α 세포를 LB 배지에서 배양하여 37℃에서 AzoR 단백질을 얻었다. 다양한 친수성 퀴논은 AzoR 단백질을 암호화하는 acpD 유전자의 mRNA 수준을 향상시키기 때문에 600nm(OD600)에서 세포의 광학 밀도가 0.8에 도달했을 때 0.5mM 메틸하이드로퀴논(2-MHQ)을 배양액에 첨가했다. 세포를 3~4시간 후 원심분리기로 수확하고, AzoR 단백질을 농축하기 위해 Hitrap-Q HP 컬럼(Cytiva)을 사용한 음이온 교환 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 컬럼을 완충액(pH 8.0, 25mM Tris-HCl)으로 사전 보정한 다음 1.0M NaCl 구배를 적용하여 단백질을 용출시켰다. 용출 분획의 AzoR 활성은 0.1mM 메나디온과 0.1mM NADH를 사용한 효소 활성 분석으로 측정하였으며, 340nm에서 흡수가 감소하는 것을 이전에 보고된 방법과 같이 측정했다. 메나디온의 0.1mM 스톡 용액을 100% DMSO에 준비했다. 용출 분획은 분석 전에 100배 희석했다. 마지막으로, 가장 높은 활성의 용출 분획을 인산염 기반 식염수(PBS) 완충액에 1000배 희석한 후 올살라진의 절단 분석에 사용했으며, 여기에 1% DMSO를 추가로 첨가하여 0.1mM 메나디온을 용해시켰다.
4. BLVRB의 발현 및 정제
pET-21b 단백질 발현 벡터를 사용하여 대장균 BL21 DE3 균주에서 N-말단 His6-태그 BLVRB를 발현했다. 형질 전환된 대장균 세포를 37℃에서 LB 및 M9 배지에서 배양하여 각각 비표지 및 동위원소 표지(15N 또는 13C/15N) BLVRB 단백질을 발현시켰다. 단백질 발현을 유도하기 위해 배양액이 OD600 0.8에 도달하면 0.5mM IPTG를 첨가한 후 3~4시간 후 세포를 채취하여 완충액(pH 8.0, 25mM Tris-HCl, 500mM NaCl, 10mM β에서 초음파 처리하여 세포를 용해시켰다. BLVRB 단백질은 먼저 HisTrap HP 컬럼(Cytiva)을 사용하여 His-tag 친화성 컬럼 크로마토그래피로 정제했다. His-tag를 제거하기 위해 단백질 용출물을 트롬빈(단백질 mg당 ~5단위)을 첨가한 후 4℃에서 하룻밤 동안 완충액(pH 8.0, 50mM Tris-HCl, 1mM 디티오트레이톨)에서 투석했다. 트롬빈이 pH 8.0에서 HiTrap-Q HP 컬럼에 결합하였으므로 완충액(pH 8.0, 25mM Tris-HCl 및 1mM 디티오트레이톨)으로 이온 교환 컬럼 크로마토그래피를 수행한 다음 1.0M NaCl 구배로 용출을 수행하여 각각 ~150 및 ~300mM NaCl에서 BLVRB와 트롬빈을 용출시켰다. 완전히 절단된 BLVRB에서 His6-태그가 부착된 BLVRB를 분리하기 위해 HisTrap HP 컬럼을 HiTrap-Q 컬럼의 옆에 나란히 부착했다. BLVRB 단백질은 비완충용액(50mM NaCl 및 1mM 디티오트레이톨)과 함께 HiLoad 16/600 Superdex 75(Cytiva)를 사용하여 크기 배제 크로마토그래피(SEC)로 추가 정제했다. 단백질 분획은 10kDa MWCO(Millipore)의 초원심 필터를 사용하여 농축한 다음 사용하기 전에 -70℃에서 보관했다.
정제된 BLVRB를 완충액(pH 7.5, 25mM Tris-HCl, 10mM β메르캡토에탄올 및 6.0M 요소)에서 변성시킨 다음 HisTrap HP 컬럼에 적용했다. 완충액(pH 5.0, 25mM Na-아세테이트, 10mM β메르캅토에탄올 및 6.0M 요소)으로 세척한 후 추가 1.0M NaCl 구배로 용출시켰다. 완충액(pH 5.0, 20mM Na-아세테이트, 10mM β메르캅토에탄올 및 6.0M 요소)으로 2배 희석한 후, HiTrap-SP 컬럼(Cytiva)을 사용하여 양이온 교환 컬럼 크로마토그래피로 apo-BLVRB를 추가로 정제했다. 단백질 용출은 6.0 M 요소의 존재 하에서 1.0 M NaCl 구배로 수행되었다. 단백질 용출물은 완충액(pH 6.5, 50mM Bis-tris, 150mM NaCl 및 1mM DTT)에서 투석하여 재접합했다. 원심분리기로 응집물(~20%)을 제거한 후, 완충액(pH 6.5, 10mM Bis-tris, 50mM NaCl, 1mM DTT)과 함께 HiLoad 16/600 Superdex 75를 사용하여 SEC로 정제했다. apo-BLVRB 용액을 농축한 다음 -70℃에서 보관했다. 냉동 샘플을 해동하면 apo-BLVRB가 약 10% 침전되지만, 구조의 유지 여부는 1H-15N HSQC 스펙트럼을 통해 확인했다.
5. BLVRB:OSK 복합체의 결정화 및 구조 결정
1mM NADPH+를 BLVRB 단백질 용액에 첨가한 다음, HiLoad 16/600 Superdex 75를 사용하여 완충액(pH 8.0, 20mM Tris-HCl, 150mM NaCl 및 1mM DTT)에서 Size exclusion chromatography로 추가 정제했다. 단백질 분획은 10kDa MWCO의 초원심 필터를 사용하여 농축했다. 단백질 상등액(14.8 mg/ml)을 적분한 다음 사용하기 전에 -70℃에서 보관했다.
BLVRB 결정은 18℃에서 행잉 드롭 방법 증기 확산법을 사용하여 완충액(pH 6.5, 0.1 M 비스-트리스, 1.9~2.0 M 황산암모늄)에서 성장시켰다. OSK 분자를 담그기 위해 결정은 1mM OSK와 0.2mM NADP+를 포함한 동일한 결정화 완충액에서 18℃, 1일 동안 배양했다. OSK 스톡 용액(100mM)은 100% DMSO로 제조되었기 때문에 1% DMSO가 침지 용액에 추가로 존재했다. BLVRB:OSK 복합체의 결정은 20~25% 글리세롤을 동결 보호제로 사용한 액체 질소에서 루프 및 급속 냉동되었다.
X-선 회절 데이터는 포항 가속기 연구소의 빔라인 5C에서 수집되었다. 회절 데이터는 HKL-2000 프로그램을 사용하여 처리한 후, 이전에 보고된 BLVRB 좌표(PDB 코드, 7ERA)를 사용하여 분자 치환(MR)을 통해 구조를 풀었다. 구조 모델은 Coot 프로그램을 사용한 모델 구축과 PHENIX 소프트웨어 패키지를 사용한 세분화를 번갈아 가며 개선했다. 구조 시각화는 Chimera 프로그램을 사용하여 수행했다. BLVRB와 복합된 OSK 및 OSA에 대한 상호 작용 네트워크의 개략도는 LIGPLOT을 사용하여 생성되었다.
6. 효소 활성 분석.
효소 동역학은 SpectraMax Gemini EM Microplate Reader (Molecular Devices)로 340nm에서 NADPH의 흡광도를 사용하여 모니터링했다. 효소 반응은 다양한 농도의 억제제(OSK 및 OSA)가 있는 상태에서 0.5% DMSO가 포함된 PBS 버퍼에 0.5 μM BLVRB, 100 μM FMN 및 100 μM NADPH를 넣어 수행했다. 반응의 초기 속도는 5분 동안 수집한 데이터로부터 추정하고 마이클리스-멘텐 방정식에 맞췄다. 억제 모델과 억제 상수는 비선형 최소 제곱 회귀 피팅의 사내 Python 스크립트를 사용하여 결정했다.
7. 등온 적정 열량 측정(ITC)
ITC(Isothermal Titration Calorimetry) 실험은 25℃의 완충액(pH 6.5, 50mM Bis-tris, 50mM NaCl, 0.1mM TCEP)에서 Microcal Auto-iTC200(Malvern Instruments)을 사용하여 수행했다. 열량 측정 셀(200 μl)과 주사기(40 μl)에 각각 0.09 mM BLVRB와 1.1mM 약물(OSK 또는 OSA)을 로드했다. ITC 데이터는 동일한 조건에서 측정되었지만 BLVRB가 없는 상태에서 측정된 블랭크 주사의 열을 뺀 후 분석되었다. 데이터 처리는 제조사에서 제공한 Origin 소프트웨어를 사용하여 수행되었으며, 피팅은 단일 사이트 결합 모델로 수행되었다.
8. NMR 실험
모든 NMR 실험은 25℃에서 Bruker 800MHz 분광기를 사용하여 수행했다. 0.2mM 15N-표지 BLVRB 또는 apo-BLVRB를 완충액(pH 6.5, 50mM Bis-tris, 50mM NaCl, 5% D2O)에서 제조하고 약물 분자의 유무에 따라 1H-15N 이종 핵 단일 양자 일관성(HSQC) 스펙트럼을 기록했다. 효소 반응을 모니터링하기 위한 1차원(1D)1 H 스펙트럼은 PBS 버퍼에서 수행했다. 화학적 이동 섭동(CSP) 데이터는 (Δ2 + [(Δ2의 제곱근 공식을 사용하여 1H 및 15N의 CS로부터의 상대적 효과를 정규화하여 제시했다. 확산 주문 분광법(DOSY) 스펙트럼은 80밀리초 확산 지연, 2초 이완 지연, 32개의 기울기 강도 증분으로 ledbpgppr2s를 사용하여 측정했다.
실험결과
1. 안정성 향상을 위해 디아제닐을 알켄 결합으로 치환하여 아조레덕타제 절단 방지 확인
본 발명자들은 부분적으로 정제된 대장균(E. coli) AzoR 단백질을 사용하여 OSA가 5-아미노살리실산(5-ASA)으로 절단되는 것을 테스트했다(도 1). 세포 배양에 메틸하이드로퀴논(2-MHQ)을 첨가하여 AzoR의 발현을 향상시켰다.
그 결과, AzoR과 NADPH를 함께 OSA를 배양하면 OSA의 디아제닐 결합이 절단되고 OSA의 원래 용도인 장 질환의 치료 효과를 담당하는 활성 화합물인 5-ASA가 형성된다(도 2). 또한, AzoR 촉매의 산물인 5-ASA와 BLVRB의 결합이 현저히 감소한다(도 3).
이를 위해 본 발명자들은 트랜스 구성을 유지하면서 디아제닐 결합을 알켄 결합으로 대체하는 새로운 합성 방식을 개발했다.
그 결과, 올살켄(OSK)이 생성되었으며, 이 올살켄은 그대로 유지되고 AzoR에 의해 절단되지 않은 것을 확인했다(도 4).
2. BLVRB과 OSK 결합의 열역학적 분석
일정한 온도에서 BLVRB-OSK 복합체가 형성되는 동안 발생하는 열을 직접 측정하는 등온 적정 열량계(ITC)를 사용하여 ΔH 및 ΔS와 같은 열역학적 양을 특성화하였다.
그 결과, OSK의 해리 상수(KD)는 140nm로 밝혀졌으며(표 1, 도 5), 이는 OSK가 BLVRB에 대한 강력하고 효율적인 결합체 역할을 한다는 것을 나타냈다. 이전에 확인된 크산텐 기반 억제제인 플록신 B와 비교 분석한 결과, OSK가 더 긴밀한 결합 친화력을 보이는 것으로 나타났다. 또한, ITC 데이터에서 관찰된 엔탈픽 기여도에서 알 수 있듯이 OSK는 잔틴 기반 억제제에 비해 BLVRB와 더 구체적인 상호작용을 나타냈다(표 1). OSK의 결합은 주로 엔탈피 변화에 의해 주도되며, 이는 BLVRB와 화합물 간의 특정 상호작용을 반영한다. OSA와 OSK 사이의 열역학적 값의 차이는 디아제닐 결합을 알켄 결합으로 치환함으로써 설명할 수 있다. 요약하면, ITC의 연구 결과는 BLVRB와 OSK 사이에 특정한 상호작용이 존재한다는 것을 뒷받침한다.
[표 1] 각 약물과 BLVRB의 결합에 대한 대표적인 ITC 데이터
3. BLVRB과 OSK의 결합 분석
단백질 기반 NMR 분광법은 저분자 및 단백질과 관련된 상호작용을 포함한 분자 간 상호작용을 식별하는 데 매우 효과적인 방법으로 각광받고 있다. 또한 단백질 기반 NMR 방법은 복합체 내에서 저분자의 위치를 최적화하는 데 중요한 결합 부위에 대한 귀중한 통찰력을 제공한다. 일반적으로 여기에는 1H-15N HSQC 스펙트럼의 화학적 이동 변화를 모니터링하는 것이 포함된다. 아미드 공명을 할당하는 것은 HSQC 스펙트럼을 해석하는 데 필수적이며, 이는 백본 공명 할당의 95%를 제공하는 HNCA 및 HN(CO)CA 스펙트럼에 의해 수행된다.
이에 본 발명자들은 결합 시 화학적 이동 변화를 모니터링하기 위해 OSK를 점진적으로 증가된 양으로 적정하여 15N-표지된 BLVRB를 활용한 1H-15N HSQC 실험을 수행했다. 이전 연구를 통해, BLVRB의 FMN 결합 부위는 OSA 결합에 활용되고, 그 중 BLVRB의 촉매 메커니즘에서 Ser111이 주요 잔기임을 참고했다.
이에 HSQC 스펙트럼에서 아미드 화학적 이동 변화를 모니터링한 결과, OSK가 BLVRB에 결합하면 FMN 결합 부위의 아미드 공명에서 변화를 유도하는 것을 관찰했다(도 6A). 또한, 화학적 이동 차이(CSP, chemical shift perturbation)을 분석하고(도 6B) OSK를 BLVRB 표면 구조(도 6C)에 매핑하여 OSK의 BLVRB 표면 결합 효과를 검증하는 데 성공했다(도 6D). 이 분석을 통해 FMN 결합 부위, 특히 FMN의 크산틴 고리가 OSK의 결합 부위임을 명확히 확인했다.
4. BLVRB-OSK 복합체의 X-선 결정 구조 분석
본 발명자들은 올살켄이 BLVRB과의 결합을 상세히 분석하기 위해 BLVRB-OSK 복합체의 결정을 통해 복합체의 구조를 분석하였다.
그 결과, NADP+와 OSK에 결합된 BLVRB의 결정 구조는 1.7Å의 해상도로 결정되었다. 결정은 공간 그룹 P21212에 속하며, 각 결정 비대칭 단위는 두 개의 BLVRB 분자를 포함한다.
OSK와 복합체를 이룬 BLVRB의 전체 구조는 이전에 결정된 구조와 매우 유사하다. 예를 들어, 복합체의 백본 RMSD는 BLVRB-NADP+-FMN(PDB ID: 1HE4) 및 BLVRB-NADP+-OSA(PDB ID: 7ERA) 복합체와 비교하여 각각 1.06 및 0.17 Å로, OSK와 복합된 BLVRB와 기본 기판 및 OSA와 복합된 BLVRB 간의 구조적 유사성이 높다는 것을 나타냈다(도 7A).
구체적으로, OSK의 결합 부위는 NADP+ 보조 인자의 니코틴아마이드 모이티와 밀접하게 연관되어 있으며, FMN의 잔틴 고리는 플록신 B 및 에리스로신과 같은 잔틴 기반 억제제와 유사한 방향을 채택하고 있다(도 7B). OSK 결합의 주요 원동력은 NADP+ 의 니코틴아마이드 모이티와 OSK 사이의 링 스택 상호작용과 잔기 S111, F113, W116, L125, V128, P152 및 H153과 관련된 소수성 상호작용이다(도 7C). 또한, 양전하를 띠는 잔기 R78, K120, R124, R170, K178에 의해 유리한 상호작용이 촉진된다. 특히, OSK는 W116의 측쇄(FMN 복합체에서 관찰된 바와 같이)를 약 2.5Å 정도 결합 포켓 쪽으로 이동시키고, R78의 측쇄는 OSK와 수소 결합을 형성하여 약물 화합물의 결합을 잠재적으로 향상시킨다. 또한, R78의 배향은 약물 화합물과 BLVRB 사이의 소수성 상호작용을 강화할 수 있다.
5. 올살켄을 사용하여 BLVRB 활성 저해 확인
억제제 OSK 및 OSA를 사용하여 NADPH가 있을 때 BLVRB의 효소 동역학을 조사하였다. BLVRB의 OSK 또는 OSA에 의한 억제 메커니즘을 도 8A에 나타냈다. (이때, E는 BLVRB, I는 OSK 또는 OSA를 의미한다.)
그 결과, 선형 위버-버크 플롯은 경쟁적(Kic) 및 비경쟁적(Kiu) 억제 상수를 특징으로 하는 혼합 억제 패턴을 보여주었다(도 8B 내지 8C). OSK의 선형 위버-버크 플롯은 4.80 ± 0.16 μM/min의 최대 속도(Vm)와 61.73 ± 5.28 μM의 마이클리스 상수(Km)를 보여주었다. 559.95 ± 100.98 nM의 경쟁 억제 상수(Kic)는 OSK가 BLVRB의 활성 부위에 결합하기 위해 기질(FMN)과 경쟁한다는 것을 시사한다. 한편, 606.14 ± 61.32 nM의 비경쟁 억제 상수(Kiu)는 OSK가 NADP+ 및 NADPH 복합체 BLVRB에 모두 결합하여 그 형태를 변경하고 효소 활성을 억제한다는 것을 나타낸다(도 8B). OSA의 경우, 4.71 ± 0.09 μM/min의 Vm 및 61.57 ± 2.75 μM의 Km로 유사한 동역학이 관찰된다. 경쟁적(Kic = 551.83 ± 38.65 nM) 및 비경쟁적(Kiu = 787.53 ± 55.17 nM) 억제 상수는 OSA도 활성 부위 결합을 위해 기질과 경쟁하며 NADP+ 및 NADPH 복합체 BLVRB와 상호 작용한다는 것을 시사한다(도 8C).
전반적으로 OSK와 OSA에서 관찰된 혼합 억제 패턴은 이러한 억제제가 NADP+ 및 NADPH 복합체 BLVRB 모두에 결합하여 BLVRB 활성에 영향을 미칠 수 있음을 시사한다. 또한, OSK와 OSA는 모두 잔틴 기반 억제제인 플록신-B와 구별되는 아포-BLVRB에 결합할 수 있으며, 이는 OSK의 더 나은 억제 활성을 의미한다(도 9).
이러한 실험결과들은, 본 발명의 올살켄이 BLVRB의 활성을 억제하여 혈소판 감소증 예방 및 치료에 유용하게 이용될 수 있음을 의미하는 것이다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해되어야 한다.

Claims (12)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 올살켄(Olsalkene), 이의 입체 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
    [화학식 1]
  2. 하기의 단계를 포함하는, 청구항 1의 올살켄(Olsalkene)의 제조방법:
    5-포밀-2-하이드록시벤조산(5-formyl-2-hydroxybenzoic acid)을 요오드화 메틸과 반응시켜 중간체를 제조하는 단계;
    상기 중간체와 TiCl4를 반응시켜 하기 화학식 2로 표시되는 화합물을 제조하는 단계; 및
    하기 화학식 2로 표시되는 화합물과 BBr3을 반응시키는 단계.
    [화학식 2]
  3. 하기 화학식 1로 표시되는 올살켄(Olsalkene) 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 혈소판 감소증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
    [화학식 1]
  4. 청구항 3에 있어서,
    상기 혈소판 감소증은, 비면역원성 혈소판 감소증, 면역원성 혈소판 감소증 및 약물-유도 혈소판 감소증으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  5. 청구항 3에 있어서,
    상기 조성물은 빌리버딘(biliverdin, BV)-Ixβ 환원효소 B(BLVRB)의 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  6. 청구항 3에 있어서,
    상기 조성물은 빌리버딘(biliverdin, BV)-IXβ이 빌리루빈(bilirubin, BR)-IXβ로 환원되는 것을 억제하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  7. 청구항 3의 약학적 조성물을 포함하는, 혈소판 감소증의 예방 또는 치료용 약학제제.
  8. 청구항 7에 있어서,
    상기 제제는 주사제형, 주입제형, 분무제형, 액상제형 또는 패취제형인, 약학제제.
  9. 하기 화학식 1로 표시되는 올살켄(Olsalkene) 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 혈소판 감소증의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
    [화학식1]
  10. 청구항 9에 있어서,
    상기 혈소판 감소증은, 비면역원성 혈소판 감소증, 면역원성 혈소판 감소증 및 약물-유도 혈소판 감소증으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 건강기능식품 조성물.
  11. 청구항 9에 있어서,
    상기 조성물은 빌리버딘(biliverdin, BV)-Ixβ 환원효소 B(BLVRB)의 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는, 건강기능식품 조성물.
  12. 청구항 9에 있어서,
    상기 조성물은 빌리버딘(biliverdin, BV)-IXβ이 빌리루빈(bilirubin, BR)-IXβ로 환원되는 것을 억제하는 것을 특징으로 하는, 건강기능식품 조성물.
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