WO2026021997A1 - Vorrichtung und verfahren zur analyse einer analyten-konzentration - Google Patents

Vorrichtung und verfahren zur analyse einer analyten-konzentration

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WO2026021997A1
WO2026021997A1 PCT/EP2025/070521 EP2025070521W WO2026021997A1 WO 2026021997 A1 WO2026021997 A1 WO 2026021997A1 EP 2025070521 W EP2025070521 W EP 2025070521W WO 2026021997 A1 WO2026021997 A1 WO 2026021997A1
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analytes
filter
microfluidic device
analyte
sample
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Eva WEIMER
Yvonne Beyl
Katrin Luckert
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Robert Bosch GmbH
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Robert Bosch GmbH
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    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/18—Means for temperature control

Definitions

  • the present invention relates to a microfluidic device, in particular a cartridge, for point-of-care or home diagnosis, to a system comprising the latter, and to a method for operating the same, according to the preamble of the independent claims.
  • the female cycle is theoretically divided into menstruation, the follicular phase, ovulation, and the luteal phase.
  • the relative changes in the involved factors, namely the hormones, signal the start of these different phases.
  • the concentration ranges of these hormones in the blood are known and serve as a basis for gynecologists to diagnose imbalances.
  • knowing which phase of the cycle a woman is in is fundamental for taking the appropriate action, for example for women who want to have children, as well as for contraception and cycle awareness.
  • Basal thermometers and cycle-tracking apps sometimes used in combination, provide indirect parameters for a woman's cycle status. Basal body temperature only rises shortly before ovulation, meaning the so-called fertile window (approximately 4-5 days before ovulation to 1 day after) cannot be fully determined. This can result in unintended pregnancies or a reduced chance of becoming pregnant.
  • ovulation tests allow for hormone measurement, particularly of luteinizing hormone (LH), which provides a rough indication of the time of ovulation.
  • LH luteinizing hormone
  • the fertile window cannot be fully determined, which can result in the consequences already described.
  • Such ovulation tests are available, for example, as lateral flow test strips, which are often sensitive. Furthermore, usually only one analyte is detectable in the sample.
  • So-called lab-on-a-chip systems comprise, for example, two main components.
  • the first is a test carrier, for example in the form of a cartridge, which includes structures and mechanisms for manipulating a captured sample, in particular passive components such as channels or reaction chambers, or active components such as valves, pumps, or mixers.
  • the second main component is a processing unit for controlling the microfluidic processes in the cartridge, such as actuating the valves or pumps, as well as for detecting components of the sample before, during, and/or after processing.
  • US patent 2021/0138071 A1 discloses a number of different possible antibodies for the specific binding of corresponding antigens of hormones to be investigated, along with detection methods.
  • the microfluidic device comprises a first reaction chamber with a first filter and at least one second reaction chamber fluidically connected to it with a second filter, wherein at least one first specific capture antibody of a first analyte to be detected is immobilized on the first filter, and wherein at least one second specific capture antibody of a second analyte to be detected is immobilized on the second filter, such that the filters are designed to be "analyte-specific".
  • the filter membranes have macroscopic structures, meaning that they are permeable to the different analytes and other sample components.
  • the microfluidic device can have any number of additional reaction chambers with further filters, each containing a further specific capture antibody of another analyte to be detected. In this way, the concentration of any number of analytes can be determined multiplexically by sequentially connecting filters within the fluidic network of the microfluidic device.
  • the microfluidic device includes upstream specific detection antibodies for binding to the respective analytes and/or upstream competitive analytes for binding to specific immobilized capture antibodies on the first and/or second and/or subsequent filters.
  • the advantage here is that a very precise measurement of the concentration of analytes, especially of different types of analytes, such as different types of hormones, or other different types of analytes, which can be detected using sandwich and competitive ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), is possible in a sample at the point of care or conveniently at home for diagnosis.
  • sandwich and competitive ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • the respective analytes can be detected specifically and sensitively, so that their concentrations can be determined with the same accuracy as in a laboratory analysis at the doctor's office or in the central laboratory.
  • the at least two analytes are bound by specific capture antibodies immobilized on the first and at least one second respective filter.
  • the advantage here is that the binding of the analytes to the immobilized capture antibodies on the filters occurs in parallel and/or in multiplexing, since, for example, one analyte with a specific immobilized capture antibody can be determined simultaneously on each filter.
  • the microfluidic environment increases sensitivity, specificity, and the degree of multiplexing, and also saves reagents compared to individual tests. Furthermore, this allows for heating of the reaction chambers as well as staining and washing steps.
  • sample can be prepared for analysis, for example by dilution.
  • the reaction chambers with the filters are fluidically connected and, in particular, have an analogous design.
  • the first reaction chamber is fluidically connected upstream of the second, meaning that a sample is circulated in a fluidic loop, first entering the first reaction chamber and then the second.
  • the sample is divided into two parts within the microfluidic device, and each part is introduced into a separate reaction chamber, allowing for simultaneous binding of the analytes to the specific, immobilized capture antibodies. Subsequently, each part of the sample is transferred to the other reaction chamber for analyte binding.
  • the spatial separation provided by a separate reaction chamber for each analyte type, along with the optimization of the microfluidic steps, enables parallelization and simultaneous improvement of sensitivity and specificity.
  • a particularly advantageous feature is that analyte concentrations can be determined at the point of care or at home, making it very simple, convenient, and user-friendly.
  • a urine or saliva sample is used, for example.
  • the advantage here is that this can be obtained painlessly and without anxiety, using a simple, non-invasive method.
  • a blood sample can also be used.
  • the microfluidic device according to the invention is, for example, designed as a lab-on-a-chip cartridge, hereinafter referred to as the cartridge.
  • the cartridge includes interfaces to another unit, for example an analyzer, and may include further components.
  • the reaction chambers for example, have dimensions of 0.5 x 0.5 cm and are made of polycarbonate and/or polypropylene to avoid reactions of the analytes on uncoated surfaces.
  • the filter membranes consist of materials such as silicon dioxide (SiO2) or aluminum oxide (Al2O3). Meshes made of copper, nickel, gold, molybdenum, titanium, stainless steel and/or aluminum can also be used.
  • the filters is electrically conductive and the reaction chamber containing it includes two electrodes, so that an enzymatic reaction in the reaction chamber can be electrically detected.
  • the electrodes for example made of platinum or gold, are deposited onto the filter in a ring-shaped manner or are rod-shaped and attached to the filter.
  • the filter itself can also be made of a conductive material such as gold or platinum. In this case, for example, a second electrode is attached to the upper side of the reaction chamber.
  • the electrical measurement begins with the addition of a readout reagent and the application of a voltage between the electrodes. If an analyte or a competitive analyte is bound to the filter membrane, an enzymatic redox reaction starts near the filter membrane, which is detected by the two-electrode system. A voltage (depending on the enzyme system used) is applied between the two electrodes, and the The resulting current is measured, the magnitude of which is proportional to the analyte concentration present. If no analyte is present, there is no increase in current during the reaction.
  • An advantage of electrical detection is that active electrochemical readout can occur during the flow through the microfluidic device (live measurement), for example, with circulating pumps. Readout can also be performed in a static state. This provides advantageous degrees of freedom with respect to the readout process. Furthermore, in an alternative or additional embodiment, it is advantageous if at least one of the filters includes an integrated dye, allowing for colorimetric detection of an enzymatic reaction in the reaction chamber. In this case, the enzyme reaction leads, for example, directly to a color change of the dye integrated into the filter, which can then be read out colorimetrically. During readout, the concentration of the bound analytes is measured based on the absorption of light in a specific wavelength range.
  • the dye is, for example, non-covalently bound to the filter with low affinity.
  • the affinity increases, and the dye is reacted.
  • the dye is released in a voltage-dependent manner when a suitable voltage is applied.
  • a pH-sensitive dye is integrated into the filter, allowing the enzyme reaction to be indirectly detected colorimetrically via a color change of the filter due to a change in pH caused by the enzyme reaction.
  • the pH-sensitive dye is, for example, a fluorescein derivative or an absorbing substance that changes color depending on the pH value, such as phenol red.
  • a key advantage of colorimetric detection is that no expensive metals need to be applied to the filters, which would then have to be disposed of after processing. Furthermore, only a camera, which can consist of simple light-emitting diodes (LEDs), is required for readout.
  • LEDs simple light-emitting diodes
  • the microfluidic device further comprises an input chamber, which is located upstream of at least one of the reaction chambers.
  • an input sample is first directed into the input chamber before it enters a reaction chamber.
  • the input chamber can be heated or temperature-controlled, for example, to temporarily stabilize critical samples by cooling or to at least partially denature them by heat.
  • specific detection antibodies against the target analytes, labeled for identification are placed upstream of the input chamber. These detection antibodies can be stored in the input chamber in either dry or liquid form.
  • the specific capture antibodies immobilized on the filters are specific for luteinizing hormone (LH) and/or follicle-stimulating hormone (FSH) and/or tyrotropin (TSH) and/or human chorionic gonadotropin (hCG), and/or testosterone and/or estrogen and/or progesterone.
  • LH luteinizing hormone
  • FSH follicle-stimulating hormone
  • TSH tyrotropin
  • hCG human chorionic gonadotropin
  • the hormones mentioned are relevant to the female cycle. Information about their concentrations in a sample can provide insights into many aspects of the female cycle.
  • the first filter in the first reaction chamber contains immobilized specific capture antibodies for luteinizing hormone (LH)
  • the second filter in the second reaction chamber contains immobilized specific capture antibodies for follicle-stimulating hormone (FSH)
  • further filters in additional reaction chambers contain immobilized specific capture antibodies for human chorionic gonadotropin (hCG), estrogen, and progesterone.
  • the microfluidic device further comprises at least one electrical and/or optical readout unit for detecting the respective analytes bound to the immobilized capture antibodies.
  • the readout unit is, for example, a current/voltage source and/or a camera, which may consist of or include simple LEDs.
  • a current/voltage source and/or a camera which may consist of or include simple LEDs.
  • the microfluidic device includes an evaluation unit set up to determine the concentration of at least two analytes by means of a Software to comprehensively determine an evaluation algorithm, especially based on artificial intelligence.
  • the evaluation unit is further configured to compare the determined concentrations of at least two analytes with known natural concentrations of the respective analytes in order to use this as a basis for evaluation.
  • This allows, for example, the detection of deviations from natural concentrations of the respective analytes and/or the identification of natural or unnatural fluctuations of the analytes, such as natural or unnatural fluctuations of hormones.
  • the software can, for example, determine deviations from an individual's hormone levels throughout their menstrual cycle. Furthermore, it is beneficial that this provides a comprehensive overview of all determined analyte concentrations.
  • a recommendation for action and/or information is issued to the user.
  • the advantage is that the use of artificial intelligence enables an evaluation with customer-oriented recommendations for action and/or the output of information, instead of a test strip result that needs to be interpreted by the user in a reading window.
  • the microfluidic device further comprises a display unit, for example a screen, on which the issued action recommendation and/or information and/or the determined analyte concentrations are displayed. Additionally or alternatively, the action recommendation and/or the information and/or the determined analyte concentrations are transmitted to a corresponding app and displayed to the user via this app.
  • a display unit for example a screen
  • the microfluidic device comprises at least one heating device for temperature control of the input chamber and/or at least one of the reaction chambers.
  • the heating device is, for example, a heater and/or a Peltier element.
  • the microfluidic device is, for example, a one-piece measuring device the size of a smartphone, which can be conveniently transported, for example in a handbag.
  • the analyzer includes, in particular, a display unit, to which the above-mentioned statements also apply, as well as to the app mentioned therein.
  • the analyzer also includes an optional heating unit, to which the aforementioned statements also apply.
  • the cartridge for example, is designed as a disposable item, while the analyzer, for example, is a multi-use unit.
  • the analyzer is about the size of a smartphone, making it easy to carry, for example, in a handbag.
  • the cartridge in comparison, is smaller, about the size of a matchbox.
  • the analyzer (processing unit) and the cartridge can be designed, for example, as described in DE102016222072A1 or DE102016222075A1, and the cartridge can be processed accordingly.
  • both the microfluidic device, in particular the cartridge, and the analyzer comprise an electrical and/or optical readout unit and/or an evaluation unit and/or a heating device.
  • the readout and/or evaluation units can, for example, complement each other.
  • the invention further relates to a method for the parallel, in particular multiplex, determination of a concentration of at least two Analytes in a sample, in particular in a biological sample such as a urine sample, by means of the microfluidic device or by means of the microfluidic system with the following steps: a) Provision of the sample and input of a particularly defined sample volume into the microfluidic device, in particular into the input chamber.
  • the sample for example a urine sample
  • a container and a defined sample volume is introduced into the microfluidic device, in particular a cartridge, by a user, for example via a microfluidic inlet, for example into an input chamber, using a pipette or other aid.
  • the input chamber can be optionally temperature-controlled to temporarily stabilize critical samples through cooling or to partially denature them through heat.
  • a particular advantage is that the sample can be taken and analyzed at home or at the point of care, saving considerable time and effort.
  • sample is a urine or saliva sample, it can be obtained painlessly and without anxiety, using a simple, non-invasive method.
  • a blood sample can be used, for example.
  • the advantage of this method is that only the specific analyte can bind to the corresponding capture antibodies, thus obtaining a highly specific and accurate result.
  • the analytes can be determined using multiplex assays.
  • the binding of the analytes to the respective filters can be detected, for example, using an ELISA – depending on the analyte to be detected, for example, using a sandwich ELISA or a competitive ELISA.
  • a readout reagent is added for the detection of labeled detection antibodies and/or for the detection of labeled competitive analytes.
  • the readout reagent causes the label, for example, the enzyme of the detection antibody or the competitive analyte, to react with a substrate, thereby inducing, for example, an electrochemical reaction in the form of a redox reaction and/or a color reaction.
  • the analyte concentration in step c) is determined electrically based on an enzymatic reaction, in this case a redox reaction, detected by a two-electrode system in the respective reaction chamber.
  • the respective filters are electrically conductive, and the reaction chamber comprises two electrodes.
  • a readout reagent (enzyme substrate) and, optionally, mediator molecules, which serve as electron shuttles to the membrane during the enzymatic redox reaction are flushed through the microfluidic device and, for example, circulated. Both the readout reagent and any required mediator molecules are located upstream of the microfluidic device, for example, in a reservoir.
  • the electrical measurement starts with the addition of the readout reagent. If an analyte is bound in the sandwich or a competitive analyte is present at the membrane, the enzymatic redox reaction starts near the membrane, which is detected by the two-electrode system. A voltage must be applied between the two electrodes, and the resulting current is recorded. The current response is proportional to the analyte concentration.
  • the advantage here is that active electrochemical readout is possible during the flow of fluid through the microfluidic device using a readout reagent. Additionally, no camera is required for readout; only a simple circuit board is needed to apply a voltage and record a current, resulting in a more cost-effective system.
  • the enzyme reaction leads, for example, directly - or in the case of a pH-sensitive filter indirectly via a change in pH value caused by the enzyme reaction - to a color change of the dye integrated into the filter, so that the color change can be advantageously read out colorimetrically close to the filter.
  • At least one of the analytes is a peptide hormone, in particular luteinizing hormone (LH) and/or follicle-stimulating hormone (FSH) and/or tyrotropin (TSH) and/or human chorionic gonadotropin (hCG), and if at least one of the analytes is a steroid hormone, in particular testosterone and/or estrogen and/or progesterone.
  • LH luteinizing hormone
  • FSH follicle-stimulating hormone
  • TSH tyrotropin
  • hCG human chorionic gonadotropin
  • a particular advantage is that the microfluidic device allows for the parallel analysis of different hormone types, especially peptide and steroid hormones.
  • a peptide hormone is detected in the first reaction chamber on the first filter, particularly via a sandwich ELISA
  • a steroid hormone is detected in the second reaction chamber on the second filter, particularly via a competitive ELISA.
  • the readout step can be performed using the same readout system with the same readout reagent and detectable by the same readout unit. This also enables a high degree of parallelization and multiplexing of analytes.
  • the procedure protocols for peptide and steroid hormones can be specifically adapted and optimized by separating the detection reactions in the different reaction chambers, for example, with regard to flow rate, reaction temperature in the reaction chambers, mixing processes, etc. Dilution processes and the concentrations of the detection reagents are crucial. This also applies to methods in which the analytes to be analyzed belong to the same analyte species. In this way, the sensitivity and specificity of the reactions taking place within a microfluidic device, particularly a cartridge, are increased.
  • a key advantage of determining the concentrations of these hormones is that they are relevant to the female cycle. Measuring their concentration allows for inferences about the cycle, such as the day of the cycle or the fertile days. Furthermore, natural or unhealthy hormone concentrations and fluctuations can be identified, which can provide insights into potential illnesses or phases, such as menopause or favorable training phases for athletes.
  • thermocontrol the first and/or the second reaction chamber in particular to 21–37 °C.
  • the advantage here is that this provides optimal local binding conditions for the binding of the analytes to the respective specific immobilized capture antibodies.
  • the process of introducing the sample into a first reaction chamber with a first filter and into at least a second reaction chamber with a second filter in step b) is repeated by introducing the sample in a microfluidic circuit.
  • the analytes are sequentially bound to the immobilized capture antibodies on the filter membranes iteratively by multiple passes.
  • a recommendation for action and/or information in particular a phase and/or day in the female cycle and/or a fertile window of a test subject, is calculated and displayed in step d) based on the respective analyte concentrations.
  • the output of the recommendation for action and/or the information is displayed, in particular, on a display unit of the microfluidic device or the analyzer.
  • the determined concentration of the at least two analytes can also be displayed.
  • the recommendation for action and/or the information and/or the determined analyte concentrations are transmitted to an associated app and displayed to the user via this app.
  • Fig. 1 schematic representation of a microfluidic device according to the invention in a first embodiment with three filters
  • Fig. 2 a schematic representation of an embodiment of the method according to the invention
  • Fig. 3 the schematic representation of the microfluidic device according to the invention as shown in Figure 1 in various process steps
  • Fig. 4 the schematic representation of the microfluidic device according to the invention as shown in Fig. 3, which is designed in the form of a cartridge.
  • Specific detection antibodies 3a, 3b, 3c each with a label 33a, 33b, 33c for readout, are non-immobilized and located upstream of the input chamber 1 in either dry or liquid form.
  • the first analyte-specific detection antibody 3a with the first label 33a binds specifically to a first analyte
  • the second detection antibody 3b with the second label 33b binds specifically to a second analyte
  • the third detection antibody 3c with the third label 33c binds specifically to a third analyte.
  • input chamber 1 has a volume ranging from 500 microliters to a few milliliters.
  • the input chamber 1 optionally includes a heating device 7, so that the input chamber 1 can be temperature-controlled.
  • the detection antibodies 3a, 3b, 3c are not located upstream of the input chamber 1, but are instead, for example, in a reservoir.
  • the microfluidic device 10 does not include an input chamber 1.
  • Filters 14a, 14b, 14c are electrically conductive and the reaction chambers comprising them each include two electrodes 8, so that an enzymatic reaction in the respective reaction chamber can be electrically detected.
  • filters 14a, 14b, 14c include an integrated, in particular pH-sensitive, dye, so that an enzymatic reaction in the respective reaction chamber can be detected colorimetrically.
  • the microfluidic device 10 includes, for example, any number of reservoirs, which are not shown in the figures. These reservoirs can contain, for example, buffers or reagents, such as for dilution, staining, or washing of the sample.
  • the input chamber 1 and the first, second, and third reaction chambers, each with its respective filter 14a, 14b, 14c, are interconnected via a fluidic network of microfluidic channels 19, in particular in a closed loop.
  • the microfluidic channels 19 are opened and closed via valves 11 (not shown in the figures).
  • the microfluidic device 10 also includes microfluidically connected reservoirs and/or waste containers.
  • the microfluidic device 10 includes, for example, a readout unit (not shown in the figures), such as a current/voltage source and/or a camera/LED, for detecting the analytes subsequently bound to the immobilized capture antibodies 5a, 5b, 5c.
  • the microfluidic device 10 also includes, for example, an evaluation unit configured to determine the concentration of the analytes.
  • the microfluidic device 10 includes, for example, a display unit (not shown in Figure 1).
  • the readout unit, the evaluation unit, and the display unit are, for example, part of the microfluidic device 10 itself or, if the If the microfluidic device 10 is designed, for example, as a cartridge 100, the cartridge 100 comprises at least one interface to at least one readout unit and/or evaluation unit and/or display unit located in an analysis device.
  • the microfluidic device 10 in particular designed as a cartridge 100, and/or the analyzer comprises, for example, at least one pump, in particular a diaphragm pump.
  • Figure 2 shows a flowchart of an embodiment of the inventive method 50 for the parallel, in particular multiplex, determination of the concentration of at least two analytes in a sample
  • Figure 3 shows the microfluidic device 10 according to Figure 1 in various process steps.
  • Figure 3 illustrates the detection of three analytes using a sandwich ELI SA.
  • step a for example at home, a defined volume of a biological sample, in particular a urine sample, is introduced, for example by means of a pipette, into the microfluidic device 10, in particular the cartridge 100, via the fluidic inlet 2 into the input chamber 1.
  • a biological sample in particular a urine sample
  • the input chamber 1 contains first detection antibodies 3a with label 33a, which bind specifically to LH as the first analyte 4a in the sample, as well as second detection antibodies 3b with label 33b, which bind specifically to FSH as the second analyte 4b in the sample, and third detection antibodies 3c with label 33c, which bind specifically to hCG as the third analyte 4c in the sample.
  • LH 4a, FSH 4b, and hCG 4c are bound to the corresponding specific detection antibodies 3a, 3b, and 3c, respectively, and form analyte-detection antibody complexes.
  • input chamber 1 is, for example, temperature-controlled.
  • step b) the sample is passed through the first 14a, the second 14b, and the third filter 14c into the first, second, and third reaction chambers.
  • the LH detection antibody complex binds to the first analyte-specific capture antibody 5a, which is immobilized on the first filter 14a;
  • the FSH detection antibody complex binds to the second specific capture antibody 5b, which is immobilized on the second filter 14b;
  • the hCG detection antibody complex binds to the third specific capture antibody 5c, which is immobilized on the third filter 14c.
  • LH 4a, FSH 4b, and hCG 4c are then located in a sandwich position between the respective immobilized capture antibody 5a, 5b, 5c and the analyte detection antibody 3a, 3b, 3c with labels 33a, 33b, 33c in a so-called sandwich structure. These are shown in Figure 3 mounted on the respective filter 14a, 14b, 14c.
  • the sample is allowed to stand and/or gently agitated in the reaction chambers for a predetermined time, particularly 1–5 minutes, for example at 21–37°C. This is then advantageously followed by a washing step involving the addition of a washing reagent stored in a reservoir into the reaction chambers.
  • the microfluidic device 10 may, for example, not include an input chamber.
  • the sample containing the analytes LH 4a, FSH 4b, and hCG 4c is introduced into the microfluidic device 10 and passed through the reaction chambers with the filters 14a, 14b, and 14c.
  • the analytes LH 4a, FSH 4b, and hCG 4c bind to the specific capture antibodies 5a, 5b, and 5c immobilized on the filters 14a, 14b, and 14c.
  • detection antibodies 3a, 3b, and 3c labeled 33a, 33b, and 33c, which may be stored upstream in a reservoir, are introduced into the reaction chambers, where they then bind to the filter-bound analytes LH 4a, FSH 4b, and hCG 4c.
  • the step for binding the analytes or the detection antibody-bound analytes LH 4a, FSH 4b and hCG 4c Oe (according to the embodiment) to the capture- Antibody 5a, 5b, 5c can be repeated as often as desired by passing the sample in a fluidic circuit.
  • a washing step is then carried out by adding a washing reagent, which is stored in a reservoir, into the reaction chambers.
  • a competitive analyte to the analyte to be detected is first added to the microfluidic device 10. This analyte binds to the respective analyte-specific capture antibody immobilized on the respective filter.
  • the competitive analyte already carries a label, in particular an enzyme, for subsequent selection.
  • step a) the sample is introduced into the microfluidic device 10, and in step b), the sample is directed into the reaction chambers containing filters 14a, 14b, and 14c with specific immobilized capture antibodies.
  • the analyte to be detected displaces the competing analyte from the analyte-specific immobilized capture antibody and binds to it.
  • the sample is allowed to stand and/or gently agitated in the reaction chambers for a predetermined time, particularly 1–5 minutes, for example at 21–37°C. This is then advantageously followed by a washing step involving the addition of a washing reagent stored in a reservoir into the reaction chambers, for example, to remove displaced competitive analytes.
  • the further procedure is the same for the detection of the analytes in the sandwich ELISA and for the detection of the competitive analytes in the competitive ELISA and is described below for the sandwich ELISA for the example analytes LH 4a, FSH 4b and hCG 4c and for the competitive ELISA in general.
  • All detection antibodies 3a, 3b, 3c and/or competitive analytes advantageously carry the same label 33a, 33b, 33c for selection.
  • An enzyme such as horseradish peroxidase (HRP) or alkaline phosphatase (AP), serves as the selection label.
  • HRP horseradish peroxidase
  • AP alkaline phosphatase
  • step c) a selection reagent for the detection of the labeled detection antibodies 3a, 3b, 3c and/or for the detection of the labeled competitive analytes, in particular from a reservoir of the microfluidic device 10, in particular cartridge 100, is introduced into the reaction chambers.
  • the selection reagent is, for example, a substrate such as TMB (3,3',5,5'-tetramethylbenzidine) and causes the label, for example, the enzyme of the detection antibody 3a, 3b, 3c or of the competitive analyte, for example, horseradish peroxidase, to convert the substrate, thereby inducing, for example, an electrochemical reaction in the form of a redox reaction and/or a color reaction.
  • a substrate such as TMB (3,3',5,5'-tetramethylbenzidine) and causes the label, for example, the enzyme of the detection antibody 3a, 3b, 3c or of the competitive analyte, for example, horseradish peroxidase, to convert the substrate, thereby inducing, for example, an electrochemical reaction in the form of a redox reaction and/or a color reaction.
  • each reaction chamber includes two electrodes 8.
  • the electrical measurement starts with the addition of the readout reagent. If LH 4a, FSH 4b and hCG 4c are sandwiched to the filter membrane, or if competitive analytes with labels are bound to the filter membrane, the enzymatic redox reaction starts near the membrane, which is detected by the two-electrode system.
  • the concentration of LH 4a, FSH 4b, and hCG 4c, or the competitive analytes with label is determined colorimetrically in step c) by detecting a color change in a filter 14a, 14b, 14c, particularly a pH-sensitive filter 14a, 14b, 14c.
  • the enzyme reaction leads, for example, directly—or, in the case of a pH-sensitive filter 14a, 14b, 14c indirectly, via a change in pH caused by the enzyme reaction—to a color change in the dye integrated into the filter 14a, 14b, 14c, so that the color change can be read out colorimetrically.
  • the concentration of the bound analytes LH 4a, FSH 4b, and hCG 4c, or the competitive analytes with label is measured based on the absorption of light in a specific wavelength range.
  • a readout unit in particular a current/voltage source, and/or a camera, detects the electrochemical reaction or the intensity of the color reaction. The more analytes are bound to the immobilized specific capture antibodies during detection via the sandwich ELISA, the higher the detected signal.
  • the concentrations of the hormones LH, FSH and hCG or the competitive analytes are determined using software with a comprehensive evaluation algorithm, in particular based on artificial intelligence.
  • the evaluation unit advantageously allows for a comparison of the determined hormone concentrations in the sample with known concentrations, and for an evaluation and classification of these.
  • the determined concentrations of LH 4a, FSH 4b and hCG 4c are then displayed and/or, based on the classification and evaluation of the respective hormone concentrations, a recommendation for action and/or information, in particular a phase and/or a day in the female cycle and/or a fertile window of a test subject, is displayed, for example via a display unit and/or an associated app.
  • sandwich ELISA and competitive ELISA can be combined, i.e., on one of the filters 14a, 14b, 14c, an analyte is detected that can be detected by a sandwich ELISA, and on another filter 14a, 14b, 14c, a different analyte is detected that can be detected by a competitive ELISA.
  • the readout unit and/or the evaluation unit and/or the at least one heating device 7 are, for example, part of a microfluidic device 10, which is in the form of a single-piece device.
  • the microfluidic device 10 is configured as a cartridge 100. This is illustrated in Figure 4 as an example of the device according to Figure 3.
  • the at least one readout unit and/or the evaluation unit and/or the at least one heating unit 7 are not part of the cartridge 100 but are located in a separate analysis device, not shown.
  • the cartridge 100 then has interfaces to this device, which are not shown in the figures.
  • the cartridge 100 may also include other components, not shown.

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Abstract

Es wird eine mikrofluidische Vorrichtung (10), insbesondere Kartusche (100) für eine Diagnose am Point of Care oder zu Hause beschrieben, zur parallelen, insbesondere multiplexen, Bestimmung einer Konzentration zumindest zweier Analyten (4a, 4b, 4c) insbesondere verschiedener Analyten-Arten, in einer Probe, insbesondere einer Urinprobe, umfassend eine erste Reaktionskammer mit einem ersten Filter (14a) und zumindest eine fluidisch mit dieser verbundene zweite Reaktionskammer mit einem zweiten Filter (14b), wobei auf dem ersten Filter (14a) zumindest ein erster spezifischer Fänger-Antikörper (5a) eines ersten nachzuweisenden Analyten (4a) immobilisiert ist, und wobei auf dem zweiten Filter (14b) zumindest ein zweiter spezifischer Fänger-Antikörper (5b) eines zweiten nachzuweisenden Analyten (4b) immobilisiert ist, und weiter umfassend in der mikrofluidischen Vorrichtung (10) vorgelagerte spezifische Nachweis-Antikörper (3a, 3b, 3c) zur Bindung an die jeweiligen Analyten (4a, 4b, 4c) und/oder in der mikrofluidischen Vorrichtung (10) vorgelagerte kompetitive Analyten zur Bindung an den zumindest einen spezifischen immobilisierten Fänger-Antikörper (5a, 5ab) auf dem ersten (14a) und/oder auf dem zumindest einen zweiten Filter (14b).

Description

Beschreibung
Titel
Vorrichtung und Verfahren zur Analyse einer Analyten-Konzentration
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine mikrofluidische Vorrichtung, insbesondere auf eine Kartusche, für eine Diagnose am Point of Care oder zu Hause, auf ein System diese umfassend sowie auf ein Verfahren zum Betrieb derselben, nach dem Oberbegriff der unabhängigen Ansprüche.
Stand der Technik
Der weibliche Zyklus ist gemäß Theorie in Menstruation, Follikelphase, Eisprung und Lutealphase gegliedert Die relativen Änderungen der beteiligten Stellgrößen, nämlich der Hormone, läuten die unterschiedlichen Phasen ein. Die Konzentrationsbereiche der Hormone im Blut sind bekannt und dienen den Gynäkologen als Grundlage für eine Diagnose im Falle von Dysbalancen.
Je nach Lebensphase oder Lebensausrichtung ist das Wissen, in welcher Zyklusphase sich die Frau befindet, grundlegend für die dementsprechende Handlung, so zum Beispiel für Frauen mit Kinderwunsch sowie zur Verhütung und Zyklus-Awareness.
Basalthermometer und Zyklus-Apps, teils kombiniert, liefern indirekte Parameter zum Status des Zyklus der Frau. Die Basaltemperatur steigt erst kurz vor dem Eisprung an, so dass das sogenannte fertile Fenster (ca. 4-5 Tage vor Eisprung bis 1 Tag nach Eisprung) nicht vollständig bestimmt werden kann. Eine Folge können ungewollte Schwangerschaften oder geringere Chance schwanger zu werden sein.
Sogenannte Ovulationstests ermöglichen eine Hormonmessung, insbesondere des luteinisierenden Hormons (LH), die einen groben Anhaltswert für den Zeitpunkt des Eisprungs darstellen. Wie im Falle der indirekten Methoden kann jedoch das fertile Fenster nicht vollständig bestimmt werden, was in den bereits beschriebenen Folgen resultieren kann. Solche Ovulationstests liegen beispielsweise als Teststreifen im Lateral Flow Format vor, deren Sensitivität oft gering ist. Außerdem ist in der Regel lediglich ein Analyt in der Probe nachweisbar.
Systeme wie beispielswiese das Produkt Mira der Firma Quanovate oder das Produkt Inito Fertility Monitor der Firma Inito zeigen, dass das einfache Lateral Flow Format sich weiterentwickeln lässt hinzu einem Nachweisformat für 2-3 Analyte im Multiplex. Jedoch ist bei derartigen Formaten Keine Probenvorbereitung möglich und die Sensitivität ist gering.
Sogenannte Lab-on-a-Chip-Systeme umfassen beispielsweise zwei Hauptkomponenten. Die erste ist ein Testträger, beispielsweise in Form einer Kartusche, welcher Strukturen und Mechanismen für die Manipulation einer aufgenommenen Probe umfasst, insbesondere passive Komponenten wie Kanäle oder Reaktionskammern oder auch aktiven Komponenten wie Ventile, Pumpen oder Mischer. Die zweite Hauptkomponente ist eine Prozessiereinheit zur Steuerung der mikrofluidischen Abläufe in der Kartusche, wie beispielsweise eine Aktuation der Ventile oder der Pumpen, sowie auch zur Detektion von Bestandteilen der Probe vor, während und/oder nach der Prozessierung.
In der WO 02/071060 A2 sind verschiedene Möglichkeiten zum spezifischen Nachweis eines Hormons mittels Antikörpern beschrieben.
In der US 2021/0138071 A1 ist eine Mehrzahl verschiedener möglicher Antikörper zur spezifischen Bindung entsprechender Antigene zu untersuchender Hormone nebst Detektionsverfahren offenbart.
Offenbarung der Erfindung
Erfindungsgemäß werden eine mikrofluidische Vorrichtung, insbesondere eine Kartusche, für eine Diagnose am Point of Care oder zu Hause, ein System umfassend die mikrofluidische Vorrichtung, insbesondere Kartusche, sowie ein Verfahren zum Betrieb derselben, mit den Merkmalen der unabhängigen Patentansprüche bereitgestellt.
Dies beruht insbesondere darauf, dass die mikrofluidische Vorrichtung, insbesondere Kartusche, zur parallelen, insbesondere multiplexen, Bestimmung einer Konzentration zumindest zweier Analyten, insbesondere verschiedener Analyten-Arten, in einer Probe eingerichtet ist. Die Probe ist beispielsweise eine biologische Probe, zum Beispiel eine Urinprobe. Die mikrofluidische Vorrichtung umfasst eine erste Reaktionskammer mit einem ersten Filter und zumindest eine fluidisch mit dieser verbundene zweite Reaktionskammer mit einem zweiten Filter, wobei auf dem ersten Filter zumindest ein erster spezifischer Fänger- Antikörper eines ersten nachzuweisenden Analyten immobilisiert ist, und wobei auf dem zweiten Filter zumindest ein zweiter spezifischer Fänger-Antikörper eines zweiten nachzuweisenden Analyten immobilisiert ist, sodass die Filter „Analyt-spezifisch“ ausgeführt sind. Die Filtermembranen weisen makroskopische Strukturen auf, das heißt, dass sie für die verschiedenen Analyten und sonstige Probenbestandteile durchgängig ausgeführt sind.
Die mikrofluidische Vorrichtung kann eine beliebige Anzahl an weiteren Reaktionskammern mit weiteren Filtern aufweisen, wobei auf jedem weiteren Filter ein weiterer spezifischer Fänger-Antikörper eines weiteren nachzuweisenden Analyten immobilisiert ist. Auf diese Weise kann durch die sequenzielle Aneinanderreihung von Filtern innerhalb des fluidischen Netzwerks der mikrofluidischen Vorrichtung eine multiplexe Bestimmung der Konzentration einer beliebigen Anzahl an Analyten erfolgen.
Außerdem umfasst die mikrofluidische Vorrichtung vorgelagerte spezifische Nachweis-Antikörper zur Bindung an die jeweiligen Analyten und/oder vorgelagerte kompetitive Analyten zur Bindung an spezifische immobilisierte Fänger-Antikörper auf dem ersten und/oder zweiten und/oder weiteren Filtern.
Vorteilhaft hierbei ist, dass eine sehr genaue Messung der Konzentration von Analyten, insbesondere verschiedener Analyten-Arten, wie beispielsweise verschiedener Hormon-Arten, oder weiterer verschiedener Analyten-Arten, deren Nachweis mittels Sandwich- und kompetitiven ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay) durchgeführt werden kann, in einer Probe am Point of Care oder bequem zu Hause für eine Diagnose möglich ist.
Die jeweiligen Analyten sind spezifisch und sensitiv nachweisbar, sodass deren Konzentrationen mit einer Genauigkeit bestimmbar sind wie in einer Laboranalyse beim Arzt bzw. im Zentrallabor.
Die zumindest zwei Analyten werden durch auf dem ersten und dem zumindest einen zweiten jeweiligen Filter immobilisierte spezifische Fänger-Antikörper gebunden. Vorteilhaft hierbei ist, dass die Bindung der Analyten an die immobilisierten Fänger-Antikörper auf den Filtern insbesondere parallel und/oder im Multiplex erfolgt, da auf jedem Filter beispielsweise parallel je ein Analyt mit einem spezifischen immobilisierten Fänger-Antikörper bestimmt werden kann. Im Vergleich zu einem Lateral Flow Format, werden durch die mikrofluidische Umgebung sowohl die Sensitivität, die Spezifität sowie auch der Multiplexgrad erhöht und im Vergleich zu Einzeltests zudem Reagenzien eingespart. Außerdem sind so eine Beheizung der Reaktionskammern sowie Färbe- und Waschschritte möglich.
Vorteilhaft erweist sich zudem, dass die Probe beispielsweise durch Verdünnen für die Analyse vorbereitet werden kann.
Die Reaktionskammern mit den Filtern sind fluidisch miteinander verbunden und insbesondere analog zueinander aufgebaut. Die erste Reaktionskammer ist der zweiten Reaktionskammer beispielsweise fluidisch vorgeschaltet, das heißt, dass eine Probe in einem fluidischen Kreislauf geführt wird wobei sie zunächst in die erste Reaktionskammer geleitet wird und anschließend in die zweite Reaktionskammer. Alternativ wird die Probe in der mikrofluidischen Vorrichtung in zwei Teile aufgeteilt und je ein Teil in je eine Reaktionskammer eingegeben, sodass eine zeitlich gleichzeitige Bindung der Analyten an die spezifischen, immobilisierten Fänger-Antikörper erfolgt. Anschließend wird dann jeder Teil der Probe in die je andere Reaktionskammer zur Bindung der Analyten geleitet. Das Merkmal der räumlichen Trennung durch eine separate Reaktionskammer pro Analyten-Art sowie eine dort mögliche Optimierung der mikrofluidischen Schritte ermöglich die Parallelisierung und gleichzeitiger Verbesserung der Sensitivität und Spezifität.
Zudem wird die sequenzielle und parallele Durchführung unterschiedlicher Nachweisformate (beispielsweise Sandwich- und kompetitiver ELISA) erleichtert. Besonders vorteilhaft ist außerdem, dass eine Bestimmung der Konzentration der Analyten am Point of Care oder zu Hause erfolgen kann, also sehr einfach, bequem und nutzerorientiert. Hierzu wird beispielsweise eine Urinprobe oder eine Speichelprobe verwendet. Vorteilhaft hierbei ist, dass diese schmerz- und angstfrei, auf einfachem, nicht-invasivem Weg erhalten werden kann. Alternativ kann jedoch auch beispielsweise eine Blutprobe verwendet werden.
Besonders vorteilhaft ist außerdem, dass selbst wenn beispielsweise Zwischenschritte des Nachweises der verschiedenen Analyten-Arten unterschiedlich sind, diese dennoch durch die gleiche Vorrichtung oder das gleiche Analysegerät ausgelesen und die Konzentrationen der Analyten parallel und auf gleichem Weg bestimmt werden können. Auf diese Weise werden Zeit, Arbeitsschritte, Behälter, insbesondere Reservoire oder Reagenzien-Töpfchen, sowie die Reagenzien selbst eingespart.
Die erfindungsgemäße mikrofluidische Vorrichtung ist beispielsweise als Lab-on- Chip-Kartusche ausgestaltet, im Folgenden als Kartusche bezeichnet. Die Kartusche umfasst Schnittstellen zu einer weiteren Einheit, beispielsweise einem Analysegerät und kann weitere Bestandteile umfassen.
Weitere vorteilhafte Ausführungsformen der mikrofluidischen Vorrichtung ergeben sich aus den Unteransprüchen.
Die Reaktionskammern umfassen beispielsweise Maße von 0,5 x 0,5 cm und sind beispielsweise aus einem Polycarbonat und/oder einem Polypropylen gefertigt, um Reaktionen der Analyten an nicht beschichteten Oberflächen zu vermeiden.
Die Membranen der Filter umfassen beispielsweise Siliziumdioxid (SiO2) oder Aluminiumoxid (AI2O3). Es können auch Netze aus Kupfer, Nickel, Gold, Molybdän, Titan, Edelstahl und/oder Aluminium zum Einsatz kommen.
Vorteilhaft ist es in einer Ausführungsform, wenn zumindest einer der Filter elektrisch leitfähig ausgeführt ist und die diesen umfassende Reaktionskammer zwei Elektroden umfasst, sodass eine enzymatische Reaktion in der Reaktionskammer elektrisch erfassbar ist. Dabei sind die Elektroden, beispielsweise aus Platin oder Gold, ringförmig auf den Filter aufgedampft oder stabförmig ausgeführt und an dem Filter angebracht. Der Filter selbst kann auch aus einem leitfähigen Material wie Gold oder Platin gefertigt sein. Dann ist beispielsweise eine zweite Elektrode an einer Oberseite der Reaktionskammer angebracht.
Mit der Zugabe eines Auslese-Reagenz und Anlegen einer Spannung zwischen den Elektroden startet die elektrische Messung. Liegt ein Analyt oder ein kompetitiver Analyt gebunden an der Filtermembran vor, so startet eine enzymatische Redoxreaktion nahe der Filtermembran, welche durch das Zwei- Elektrodensystem erfasst wird. Dabei wird eine Spannung (abhängig vom eingesetzten Enzymsystem) zwischen den beiden Elektroden angelegt und der resultierende Strom erfasst, dessen Größe proportional zur vorhandenen Analytenkonzentration ist. Ist kein Analyt vorhanden so kommt es zu keinem Stromanstieg während der Reaktion.
Vorteilhaft bei einer elektrischen Detektion ist, dass eine aktive elektrochemische Auslese bereits während der Durchströmung der mikrofluidischen Vorrichtung erfolgen kann (live-Messung) beispielsweise bei zirkulierenden Pumpen. Ebenso kann die Auslese in einem statischen Zustand erfolgen. Auf diese Weise sind vorteilhaft Freiheitsgrade in Bezug auf die Auslese geschaffen. Desweiteren ist es in einer alternativen oder zusätzlichen Ausführungsform vorteilhaft, wenn zumindest einer der Filter einen integrierten Farbstoff umfasst, sodass eine enzymatische Reaktion in der Reaktionskammer kolorimetrisch erfassbar ist. Hierbei führt die Enzymreaktion beispielsweise direkt zu einem Farbumschlag des in den Filter integrierten Farbstoffs, sodass der Farbumschlag kolorimetrisch ausgelesen werden kann. Bei der Auslese wird die Konzentration der gebundenen Analyten aufgrund einer Absorption von Licht in einem bestimmten Wellenlängenbereich gemessen. Hierbei ist der Farbstoff beispielsweise nichtkovalent mit geringer Affinität am Filter gebunden. Bei Vorliegen eines passenden Enzyms, steigt die Affinität und der Farbstoff wird umgesetzt. Alternativ erfolgt beispielsweise eine spannungsabhängige Freisetzung des Farbstoffs bei Anlegen einer passenden Spannung.
Alternativ ist in den Filter ein pH-sensitiver Farbstoff integriert, sodass die Enzymreaktion indirekt über einen Farbumschlag des Filters aufgrund einer Änderung des pH-Werts durch die Enzymreaktion kolorimetrisch erfassbar ist. Der pH-sensitive Farbstoff ist beispielsweise ein Fluoresceinderivat oder ein absorbierender Stoff, der pH-Wert abhängig seine Farbe ändert, wie beispielsweise Phenolrot.
Vorteilhaft bei einer kolorimetrischen Detektion ist, dass keine teuren Metalle auf die Filter aufgebracht werden müssen, die nach der Prozessierung entsorgt werden müssen. Außerdem wird nur eine Kamera, die beispielsweise aus einfachen Leuchtdioden (LED, engl. light-emitting diode) bestehen kann, zur Auslese benötigt.
In einer vorteilhaften Ausführungsform umfasst die mikrofluidische Vorrichtung ferner eine Eingabekammer, welche zumindest einer der Reaktionskammern vorgelagert ist. Hiermit soll gemeint sein, dass eine eingegebene Probe zunächst in die Eingabekammer geleitet wird bevor sie in eine Reaktionskammer gelangt. Die Eingabekammer ist beispielsweise beheizbar bzw. temperierbar, um beispielsweise kritische Proben durch Kühlung kurzfristig stabilisieren zu können oder durch Hitze zumindest partiell denaturieren zu können. In einer Ausführungsform sind in der Eingabekammer spezifischen Nachweis-Antikörper gegen die Zielanalyte mit einem Label zur Auslese vorgelagert Hierbei können die Nachweis-Antikörper trocken oder flüssig in der Eingabekammer vorgelagert sein.
Es ist in einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform vorgesehen, dass die auf den Filtern immobilisierten, spezifischen Fänger-Antikörper spezifisch sind für das luteinisierende Hormon (LH) und/oder das Follikelstimulierende Hormon (FSH) und/oder Tyreotropin (TSH) und/oder das humane Choriongonadotropin (hCG), und/oder Testosteron und/oder Östrogen und/oder Progesteron.
Die genannten Hormone sind relevante Hormone des weiblichen Zyklus. Ein Aufschluss über deren Konzentrationen in einer Probe kann Aufschluss über viele Aspekte des weiblichen Zyklus geben.
Besonders vorteilhaft umfasst der erste Filter in der erste Reaktionskammer immobilisierte spezifische Fänger-Antikörper für das luteinisierende Hormon (LH), der zweite Filter in der zweiten Reaktionskammer immobilisierte spezifische Fänger-Antikörper für das Follikelstimulierende Hormon (FSH) und weitere Filter in weiteren Reaktionskammern immobilisierte spezifische Fänger-Antikörper für das humane Choriongonadotropin (hCG), für Östrogen und für Progesteron. Diese Hormone bilden den Zyklusstatus einer Frau besonders gut ab, sodass mittels dieser sehr präzise beispielsweise das gesamte fertile Fenster eine Probandin ermittelt werden kann.
In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform umfasst die mikrofluidische Vorrichtung ferner zumindest eine elektrische und/oder optische Auslese-Einheit, zum Erfassen der jeweiligen an die immobilisierten Fänger-Antikörper gebundenen Analyten.
Die Auslese-Einheit ist beispielsweise eine Strom/Spannungsquelle, und/oder eine Kamera, die beispielsweise aus einfachen LEDs besteht, oder diese umfassen kann. Vorteilhaft beim Einsatz einer Auslese-Einheit im Vergleich zu Lateral Flow Tests ist beispielsweise, dass die Sensitivität erhöht ist.
Desweiteren umfasst die mikrofluidische Vorrichtung eine Auswerte- Einheit eingerichtet um eine Konzentration der zumindest zwei Analyten mittels einer Software umfassend eine Auswerte-Algorithmik, insbesondere basierend auf künstlicher Intelligenz, zu bestimmen.
Insbesondere ist die Auswerte- Einheit weiter eingerichtet, um die ermittelten Konzentrationen der zumindest zwei Analyten mit bekannten natürlichen Konzentrationen der jeweiligen Analyten zu vergleichen um diese als Grundlage zur Auswertung zu nutzen. So können beispielsweise auch Abweichungen von natürlichen Konzentrationen der jeweiligen Analyten erkannt werden und/oder natürliche oder nicht-natürliche Schwankungen der Analyten erkannt werden, beispielsweise natürliche oder nicht-natürliche Schwankungen von Hormonen. Vorteilhaft ist hierbei, dass die Software bei ausreichender Datenlage einer Nutzerin beispielsweise Abweichungen vom individuellen Hormonlevel über den Zyklus ermittelt. Desweiteren ist es vorteilhaft, dass so ein Gesamtbild aller bestimmten Konzentrationen der Analyten ermittelt wird.
Vorteilhaft wird basierend hierauf eine Handlungsempfehlung und/oder eine Information an die Nutzerin/den Nutzer ausgegeben.
Vorteilhaft ist, dass der Einsatz von künstlicher Intelligenz eine Auswertung mit kundenorientierter Handlungsempfehlung und/oder die Ausgabe einer Information ermöglicht, anstelle eines selbst zu interpretierenden Teststreifen- Ergebnisses in einem Auslesefenster.
Insbesondere umfasst die mikrofluidische Vorrichtung hierzu weiter eine Anzeigeeinheit, beispielsweise ein Display auf welcher die ausgegebene Handlungsempfehlung und/oder eine Information und/oder die ermittelten Analyten- Konzentrationen angezeigt werden. Zusätzlich oder alternativ werden die Handlungsempfehlung und/oder die Information und/oder die ermittelten Analyten- Konzentrationen an eine zugehörige App übermittelt und der Nutzerin/dem Nutzer über diese ausgegeben.
Die mikrofluidische Vorrichtung umfasst in einer vorteilhaften Ausführungsform zumindest eine Heizeinrichtung zur Temperierung der Eingabekammer und/oder zumindest einer der Reaktionskammern. Die Heizeinrichtung ist beispielsweise ein Heizer und/oder ein Peltier-Element.
Die mikrofluidische Vorrichtung ist beispielsweise ein einteiliges Messgerät in der Größe eines Smartphones, welches bequem, beispielsweise in einer Handtasche, transportiert werden kann.
Ferner wird erfindungsgemäß ein mikrofluidisches System bereitgestellt, umfassend eine erfindungsgemäße mikrofluidische Vorrichtung, welche als Kartusche ausgestaltet ist, und ein Analysegerät, umfassend eine elektrische und/oder optische Auslese-Einheit, insbesondere eine Strom und/oder Spannungsquelle und/oder eine Kamera, zum Erfassen der jeweiligen an die immobilisierten Fänger-Antikörper gebundenen Analyten und eine Auswerte- Einheit eingerichtet die Konzentration der zumindest zwei Analyten mittels einer Software umfassend eine Auswerte-Algorithmik zu bestimmen, wobei das Analysegerät ausgebildet ist die Kartusche zu prozessieren und/oder Ergebnisse aus dieser auszulesen. Die bereits oben genannten Ausführungen bezüglich der Auslese-Einheit gelten hier entsprechend. Die Auswerteeinheit ist vorteilhaft gemeinsam mit einem Prozessor im Analysegerät entsprechend programmiert. Die weiteren bereits oben genannten Ausführungen bezüglich der Auswerte- Einheit gelten hier entsprechend.
Ferner umfasst das Analysegerät insbesondere eine Anzeigeeinheit, zu welcher ebenfalls die oben genannten Ausführungen gelten sowie auch bezüglich der dort genannten App. Außerdem umfasst das Analysegerät eine optionale Heizeinrichtung, zu welcher ebenfalls die bereits genannten Ausführungen gelten.
Die Kartusche ist beispielsweise als Einwegteil ausgeführt, während das Analysegerät beispielsweise eine Mehrfachnutzeinheit ist.
Das Analysegerät weist beispielsweise die Größe eines Smartphones auf, welches bequem, beispielsweise in einer Handtasche, transportiert werden kann. Die Kartusche ist verglichen mit dem Analysegerät kleiner und weist beispielsweise die Größe einer Streichholzschachtel auf.
Das Analysegerät (Prozessiereinheit) und die Kartusche können beispielsweise wie in DE102016222072A1 oder DE102016222075A1 beschrieben ausgeführt sein und die Kartusche kann entsprechend prozessiert werden.
In einer weiteren Ausführungsform des Systems umfassen sowohl die mikrofluidische Vorrichtung, insbesondere Kartusche, sowie auch das Analysegerät eine elektrische und/oder optische Auslese-Einheit und/oder eine Auswerte- Einheit und/oder eine Heizeinrichtung. Hierbei können sich die Auslese- und/oder Auswerteeinheiten beispielsweise ergänzen.
Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zur parallelen, insbesondere multiplexen, Bestimmung einer Konzentration zumindest zweier Analyten in einer Probe, insbesondere in einer biologischen Probe wie beispielsweise einer Urinprobe mittels der mikrofluidischen Vorrichtung oder mittels des mikrofluidischen Systems mit nachfolgenden Schritten: a) Bereitstellen der Probe und Eingabe eines insbesondere definierten Probevolumens in die mikrofluidische Vorrichtung, insbesondere in die Eingabekammer.
Die Probe, beispielsweise eine Urinprobe, wird beispielsweise in einem Gefäß gesammelt und ein insbesondere definiertes Probevolumen beispielsweise mittels einer Pipette oder einem anderen Hilfsmittel durch einen Nutzer oder eine Nutzerin in die mikrofluidische Vorrichtung, insbesondere Kartusche, eingegeben, beispielswiese über einen mikrofluidischen Einlass beispielswiese in eine Eingabekammer.
Die Eingabekammer ist optional temperierbar, um kritische Proben durch Kühlung kurzfristig zu stabilisieren oder durch Hitze partiell zu denaturieren. Besonders vorteilhaft, ist, dass die Probe zu Hause oder am Point of Care genommen und analysiert wird, was viel Zeit und Wege einspart.
Außerdem vorteilhaft hierbei ist, dass wenn die Probe eine Urin- oder Speichelprobe ist, diese schmerz- und angstfrei, auf einfachem, nicht-invasivem Weg erhalten werden kann. Alternativ kann beispielsweise eine Blutprobe verwendet werden.
Die Eingabe eines definierten Probevolumens ist besonders vorteilhaft, da so eine Standardisierung möglich ist. b) Leiten der Probe in eine erste Reaktionskammer mit einem ersten Filter und in zumindest eine zweite Reaktionskammer mit einem zweiten Filter und Bindung des ersten Analyten an einen ersten spezifischen, an den ersten Filter immobilisierten Fänger-Antikörper und Bindung des zumindest einen zweiten Analyten an einen zweiten spezifischen an den zweiten Filter immobilisierten Fänger-Antikörper.
Vorteilhaft hierbei ist, dass an die spezifischen Fänger-Antikörper lediglich der passende Analyt binden kann und somit ein sehr spezifisches und genaues Ergebnis erhalten wird. Außerdem können die Analyten so im Multiplex bestimmt werden. Die Bindung der Analyten an die jeweiligen Filter kann beispielsweise mittels eines ELISA - je nach nachzuweisendem Analyten beispielsweise mittels eines Sandwich- ELI SA oder mittels eines kompetitiven ELISA - nachgewiesen werden. In beiden Fällen wird ein Auslese-Reagenz zugegeben für eine Detektion gelabelter Nachweis-Antikörper und/oder für eine Detektion gelabelter kompetitiver Analyten. Das Auslese- Reagenz bewirkt, dass das Label, beispielsweise das Enzym des Nachweis-Antikörpers oder des kompetitiven Analyten, ein Substrat umsetzt wobei beispielsweise eine elektrochemische Reaktion in Form einer Redoxreaktion und/oder eine Farbreaktion hervorgerufen wird. c) Bestimmen der Konzentration des ersten filtergebundenen Analyten und des zumindest einen zweiten filtergebundenen Analyten, und insbesondere Vergleichen dieser mit bekannten Analyten- Konzentrationen, wobei die Bestimmung und insbesondere der Vergleich der Analyten- Konzentrationen, in einer Auswerte-Einheit mithilfe einer Auswerte-Algorithmik, insbesondere basierend auf künstlicher Intelligenz, erfolgt.
In einer Ausführungsform wird die Konzentration der Analyten in Schritt c) elektrisch bestimmt anhand einer mittels eines Zwei-Eletkrodensystems in der jeweiligen Reaktionskammer erfassten enzymatischen Reaktion, hier einer Redox- Reaktion. Die jeweiligen Filter sind hierbei elektrisch leitfähig ausgeführt und die Reaktionskammer umfasst zwei Elektroden. Vor der Auslese werden ein Auslese-Reagenz (Enzym-Substrat) sowie optional Mediator- Moleküle, welche im Zuge der enzymatischen Redox- Reaktion als Elektronen-Shuttle zur Membran dienen, durch die mikrofluidische Vorrichtung gespült und beispielsweise im Kreis geführt. Sowohl das Auslese-Reagenz als auch die ggf. benötigten Mediator- Moleküle sind in der mikrofluidischen Vorrichtung, beispielsweise in einem Reservoir, vorgelagert.
Mit der Zugabe des Auslese-Reagenz startet die elektrische Messung. Liegt ein Analyt im Sandwich gebunden bzw. ein kompetitiver Analyt an der Membran vor, so startet die enzymatische Redoxreaktion nahe der Membran, welche durch das Zwei- Elektrodensystem erfasst wird. Dabei muss eine Spannung zwischen den beiden Elektroden angelegt werden und der resultierende Strom wird aufgezeichnet. Die Stromantwort ist proportional zur Konzentration des Analyten. Vorteilhaft hierbei ist, dass eine aktive elektrochemische Auslese während der Durchströmung der mikrofluidischen Vorrichtung mit Auslese-Reagenz möglich ist. Zusätzlich wird keine Kamera zur Auslese benötigt sondern nur eine einfache Platine, die es erlaubt eine Spannung anzulegen und einen Strom aufzuzeichnen, was zu einem kostengünstigeren System führt.
In einer alternativen oder zusätzlichen Ausführungsform erfolgt die Bestimmung der Konzentration der Analyten in Schritt c) kolorimetrisch anhand eines Farbumschlags eines Filters, insbesondere eines pH-sensitiven Filters.
Hierbei führt die Enzymreaktion beispielsweise direkt - oder im Fall eines pH- sensitiven Filters indirekt über eine durch die Enzymreaktion hervorgerufene Änderung des pH-Werts -zu einem Farbumschlag des in den Filter integrierten Farbstoffs, sodass der Farbumschlag vorteilhaft nahe dem Filter kolorimetrisch ausgelesen werden kann.
In einer Ausführungsform ist es vorteilhaft, wenn zumindest einer der Analyten ein Peptidhormon, insbesondere das luteinisierende Hormon (LH) und/oder das Follikelstimulierende Hormon (FSH) und/oder Tyreotropin (TSH) und/oder das humane Choriongonadotropin (hCG) ist und wenn zumindest einer der Analyten ein Steroidhormon, insbesondere Testosteron und/oder Östrogen und/oder Progesteron ist.
Besonders vorteilhaft ist, dass eine parallele Analyse von verschiedenen Hormon-Arten, insbesondere Peptid- und Steroidhormonen, in der mikrofluidischen Vorrichtung erfolgen kann. Beispielsweise wird ein Peptidhormon in der ersten Reaktionskammer auf dem ersten Filter insbesondere über einen Sandwich-ELISA nachgewiesen und ein Steroidhormon in der zweiten Reaktionskammer auf dem zweiten Filter insbesondere über einen kompetitiven ELISA. Hierbei sind die Zwischenschritte unterschiedlich, der Ausleseschritt kann jedoch durch dasselbe Auslesesystem unter Zugabe desselben Auslese-Reagenz und detektierbar mittels derselben Auslese-Einheit, durchgeführt werden. Auf diese Weise ist außerdem ein hoher Parallelisierungsund Multiplexgrad an Analyten möglich. Die Ablaufprotokolle des Verfahrens mit Peptid- und Steroidhormonen, können durch die Auftrennung der Nachweisreaktionen in den verschiedenen Reaktionskammern je spezifisch angepasst und optimiert werden beispielsweise bzgl. einer Flussrate, einer Reaktionstemperatur in den Reaktionskammern, Mischvorgängen bzw. Verdünnungsvorgängen und den Konzentrationen der Nachweisreagenzien. Dies gilt auch für ein Verfahren in welchen die zu analysierenden Analyten einer Analyten-Art angehören. Auf diese Weise wird eine Erhöhung der Sensitivität und Spezifität der innerhalb einer mikrofluidischen Vorrichtung, insbesondere einer Kartusche, ablaufenden Reaktionen, erreicht.
Vorteilhaft bei der Bestimmung der Konzentrationen der genannten Hormone ist, dass dies relevante Hormone des weiblichen Zyklus sind. Die Messung deren Konzentration erlaubt Rückschlüsse auf diesen, wie beispielsweise den Tag im weiblichen Zyklus oder die fruchtbaren Tage. Desweiteren können natürliche oder ungesunde Hormonkonzentrationen und -Schwankungen ermittelt werden, welche Rückschlüsse auf mögliche Erkrankungen oder Phasen, wie beispielsweise die Wechseljahre oder günstige Trainingsphasen für Sportler erlauben.
In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform erfolgt in Schritt b) für eine vorbestimmte Zeit, insbesondere für 1 -5 min ein Ruhenlassen der Probe und/oder ein sanftes Bewegen der Probe in der jeweiligen Reaktionskammer. Eine Inkubationszeit in der die Probe ruhend oder sanft bewegt in der Reaktionskammer verbleibt fördert die Bindung der Analyten an die jeweiligen spezifischen immobilisierten Fänger-Antikörper, sodass eine sehr genaue Bestimmung der Konzentration der Analyten in der Probe erfolgen kann.
Desweiteren ist es in einer weiteren Ausführungsform vorteilhaft, wenn eine Temperierung der ersten und/oder der zweiten Reaktionskammer erfolgt, insbesondere auf 21 -37 °C. Vorteilhaft hierbei ist, dass auf diese Weise von der Temperatur her optimale lokale Bindebedingungen für die Bindung der Analyten an die jeweiligen spezifischen immobilisierten Fänger-Antikörper vorliegen.
In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform wird das Führen der Probe in eine erste Reaktionskammer mit einem ersten Filter und in zumindest eine zweite Reaktionskammer mit einem zweiten Filter in Schritt b) wiederholt durch ein Führen der Probe in einem mikrofluidischen Kreislauf. Auf diese Weise erfolgt ein sequenzielles Binden der Analyten an die immobilisierten Fänger-Antiköper auf den Filtermembranen iterativ durch mehrfaches Durchströmen.
Vorteilhaft werden so die Bindungschancen der Analyten an die jeweiligen spezifischen immobilisierten Fänger-Antikörper erhöht und ein geometrisches Array auf Filter-Basis erhalten.
In einer vorteilhaften Ausführungsform wird nach Schritt c) in einem Schritt d) aufgrund der jeweiligen Analyten- Konzentrationen eine Handlungsempfehlung und/oder eine Information, insbesondere eine Phase und/oder ein Tag im weiblichen Zyklus und/oder ein fertiles Fenster einer Probandin berechnet und ausgegeben. Die Ausgabe der Handlungsempfehlung und/oder der Information wird insbesondere auf einer Anzeigeeinheit der mikrofluidischen Vorrichtung oder des Analysegeräts angezeigt. Es kann alternativ oder zusätzlich auch die ermittelte Konzentration der zumindest zwei Analyten ausgegeben werden. Zusätzlich oder alternativ werden die Handlungsempfehlung und/oder die Information und/oder die ermittelten Analyten-Konzentrationen an eine zugehörige App übermittelt und der Nutzerin/dem Nutzer über diese ausgegeben. Vorteilhaft hierbei ist, dass eine Probandin anstelle eines selbst zu interpretierenden Streifen im Auslesefenster von bestehenden Lateral Flow Tests, eine Konzentration der Analyten und/oder eine Information und/oder eine Handlungsempfehlung erhält. Dies vermeidet Unsicherheiten der Probanden sowie beispielsweise ungewollte Schwangerschaften oder eine unnötige Einnahme von Wirkstoffen.
Kurze Beschreibung der Zeichnung
Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind in der Zeichnung dargestellt und in der nachfolgenden Figurenbeschreibung näher erläutert. Es zeigt:
Fig. 1 : die schematische Darstellung einer erfindungsgemäßen mikrofluidischen Vorrichtung in einer ersten Ausführungsform mit drei Filtern,
Fig. 2: die schematische Darstellung eines Ausführungsbeispiels des erfindungsgemäßen Verfahrens,
Fig. 3: die schematische Darstellung der erfindungsgemäßen mikrofluidischen Vorrichtung gemäß Figur 1 in verschiedenen Verfahrensschritten, Fig. 4: die schematische Darstellung der erfindungsgemäßen mikrofluidischen Vorrichtung gemäß Fig. 3, welche in Form einer Kartusche ausgestaltet ist.
Ausführungsformen der Erfindung
In Figur 1 ist eine erste Ausführungsform einer mikrofluidischen Vorrichtung 10 für eine Diagnose am Point of Care oder zu Hause, zur parallelen und multiplexen Bestimmung einer Konzentration dreier Analytenin einer Probe dargestellt. Die mikrofluidische Vorrichtung 10 umfasst eine Eingabekammer 1 sowie nicht in Figur 1 dargestellte Reaktionskammern mit je einem Filter 14a, 14b, 14c. In der ersten Reaktionskammer ist ein erster Filter 14a lokalisiert, in der zweiten Reaktionskammer ist ein zweiter Filter 14b lokalisiert, und in der dritten Reaktionskammer ist ein dritter Filter 14c lokalisiert. Die Eingabekammer 1 ist den Reaktionskammern vorgelagert. Eine zu analysierende Probe wird über einen als Pfeil dargestellten mikrofluidischen Einlass 2 in die Eingabekammer 1 eingegeben. In der Eingabekammer 1 sind spezifische Nachweis-Antikörper 3a, 3b, 3c mit je einem Label 33a, 33b, 33c zur Auslese in trockener oder flüssiger Form nicht-immobilisiert vorgelagert. Der erste Analyt-spezifische Nachweis- Antikörper 3a mit dem ersten Label 33a bindet spezifisch an einen ersten Analyten, der zweite Nachweis-Antikörper 3b mit dem zweiten Label 33b bindet spezifisch an einen zweiten Analyten und der dritte Nachweis-Antikörper 3c mit dem dritten Label 33c bindet spezifisch an einen dritten Analyten.
Die Eingabekammer 1 umfasst beispielsweise ein Volumen von 500 Mikroliter bis zu einigen Millilitern.
Weiter umfasst die Eingabekammer 1 optional eine Heizeinrichtung 7, sodass die Eingabekammer 1 temperierbar ist. In einer alternativen, nicht dargestellten Ausführungsform sind in der Eingabekammer 1 keine Nachweis-Antikörper 3a, 3b, 3c vorgelagert, sondern beispielsweise in einem Reservoir. Weiterhin alternativ und nicht dargestellt umfasst die mikrofluidische Vorrichtung 10 keine Eingabekammer 1 .
Die Reaktionskammern umfassen beispielsweise Abmessungen von 0,5x0, 5 cm. Das Material der Seitenwände der Reaktionskammer ist beispielsweise ein Polycarbonat und/oder ein Polypropylen. Auf dem ersten Filter 14a der ersten Reaktionskammer ist ein erster spezifischer Fänger-Antikörper 5a immobilisiert, welcher an den ersten Analyten spezifisch bindet. Auf dem zweiten Filter 14b der zweiten Reaktionskammer ist ein zweiter spezifischer Fänger-Antikörper 5b immobilisiert welcher an den zweiten Analyten spezifisch bindet und auf dem dritten Filter 14c der dritten Reaktionskammer ist ein dritter spezifischer Fänger- Antikörper 5c immobilisiert, welcher an den dritten Analyten spezifisch bindet Weiter umfasst die mikrofluidischen Vorrichtung 10 beispielsweise ein nicht dargestelltes vorgelagertes Nachweis- Reagenz umfassend kompetitive Analyten zur Bindung an spezifische immobilisierte Fänger-Antikörper 5a, 5ab, 5c in der jeweiligen Reaktionskammer, an die kein Analyt gebunden hat.
Die Filter 14a, 14b, 14c sind beispielsweise elektrisch leitfähig ausgeführt und die diese umfassenden Reaktionskammern umfassen je zwei Elektroden 8, sodass eine enzymatische Reaktion in der jeweiligen Reaktionskammer elektrisch erfassbar ist.
Alternativ oder zusätzlich umfassen die Filter 14a, 14b, 14c einen integrierten, insbesondere pH-sensitiven, Farbstoff, sodass eine enzymatische Reaktion in der jeweiligen Reaktionskammer kolorimetrisch erfassbar ist.
Zur Vorlagerung umfasst die mikrofluidische Vorrichtung 10 beispielsweise eine beliebige Anzahl an Reservoiren, welche in den Figuren nicht dargestellt sind. In diesen können beispielsweise Puffer oder Reagenzien, beispielsweise zur Verdünnung, zum Färben oder zum Waschen der Probe vorgelagert sein.
Die Eingabekammer 1 sowie die erste, zweite und dritte Reaktionskammer mit den jeweiligen Filtern 14a, 14b, 14c sind über ein fluidisches Netzwerk aus mikrofluidischen Kanälen 19, insbesondere in einem Kreislauf, miteinander verbunden. Die mikrofluidischen Kanäle 19 werden über nicht in den Figuren dargestellte Ventile 11 geöffnet und geschlossen. Außerdem umfasst die mikrofluidische Vorrichtung 10 mikrofluidisch angebundene Reservoire und/oder Abfallbehälter.
Weiter umfasst die mikrofluidische Vorrichtung 10 beispielsweise eine nicht in den Figuren dargestellte Auslese-Einheit, beispielsweise in Form einer Strom/Spannungsquelle und/oder einer Kamera/LED zum Erfassen der im weiteren Verlauf jeweiligen an die immobilisierten Fänger-Antikörper 5a, 5b, 5c gebundenen Analyten. Außerdem umfasst die mikrofluidische Vorrichtung 10 beispielsweise eine Auswerte-Einheit, eingerichtet eine Konzentration der Analyten zu bestimmen. Zudem umfasst die mikrofluidische Vorrichtung 10 beispielswiese eine, in Figur 1 nicht dargestellte Anzeigeeinheit.
Die Auslese-Einheit und die Auswerte-Einheit und die Anzeigeeinheit sind beispielsweise ein Teil der mikrofluidischen Vorrichtung 10 selbst oder, wenn die mikrofluidische Vorrichtung 10 beispielsweise als Kartusche 100 ausgebildet ist, so umfasst die Kartusche 100 zumindest eine Schnittstelle zu zumindest einer sich in einem Analysegerät befindlichen Auslese-Einheit und/oder Auswerte- Einheit und/oder Anzeigeeinheit.
Außerdem umfasst die mikrofluidische Vorrichtung 10, insbesondere als Kartusche 100 ausgestaltet, und/oder das Analysegerät beispielsweise zumindest eine Pumpe, insbesondere eine Membranpumpe.
Figur 2 zeigt ein Flussdiagramm eines Ausführungsbeispiels des erfindungsgemäßen Verfahrens 50 zur parallelen, insbesondere multiplexen, Bestimmung einer Konzentration zumindest zweier Analyten in einer Probe und Figur 3 zeigt die mikrofluidische Vorrichtung 10 gemäß Figur 1 in verschiedenen Verfahrensschritten. Hierbei ist in Figur 3 der Nachweis dreier Analyten mittels eines Sandwich- ELI SA dargestellt.
Stellvertretend für andere mittels Sandwich-ELISA nachweisbare Analyten, insbesondere Peptidhormone, wird das erfindungsgemäße Verfahren im Folgenden bespielhaft für LH als erstem Analyten 4a, FSH als zweitem Analyten 4b und hCG als drittem Analyten 4c in einem Ausführungsbeispiel beschrieben.
Es wird in einem Schritt a) beispielsweise zu Hause ein definiertes Volumen einer biologischen Probe, insbesondere eine Urinprobe, beispielsweise mittels einer Pipette in die mikrofluidische Vorrichtung 10, insbesondere die Kartusche 100, über den fluidischen Einlass 2 in die Eingabekammer 1 , eingegeben. Dies soll in Figur 3 durch die neben dem Einlass 2 dargestellten Analyten 4a, 4b, 4c verdeutlicht sein.
In der in Fig. 3 gezeigten Ausführungsform sind in der Eingabekammer 1 erste Nachweis-Antikörper 3a mit Label 33a vorgelagert, welche spezifisch an LH als ersten Analyten 4a in der Probe binden, sowie zweite Nachweis-Antikörper 3b mit Label 33b welche spezifisch an FSH als zweiten Analyten 4b in der Probe binden und dritte Nachweis-Antikörper 3c mit Label 33c, welche spezifisch an hCG als dritten Analyten 4c in der Probe binden. Nach der Bindung liegen LH 4a, FSH 4b und hCG 4c an den passenden spezifischen, mit Label 33a, 33b, 33c versehenen Nachweis-Antikörper 3a, 3b, 3c gebunden vor und bilden Analyt- Nachweisantikörper- Komplexe. Dies ist in Figur 3 in der Eingabekammer 1 gezeigt. Um diese Bindung zu beschleunigen und zu unterstützen, wird die Eingabekammer 1 beispielsweise temperiert.
In einem Schritt b) wird die Probe in die erste, die zweite und die dritte Reaktionskammer durch den ersten 14a, den zweiten 14b und den dritten Filter 14c geleitet. Hierbei erfolgt eine Bindung des LH-Nachweisantikörper-Komplexes an den ersten analytspezifischen, an den ersten Filter 14a immobilisierten Fänger-Antikörper 5a, eine Bindung des FSH-Nachweisantikörper-Komplexes an den zweiten spezifischen, an den zweiten Filter 14b immobilisierten Fänger- Antikörper 5b und eine Bindung des hCG-Nachweisantikörper-Komplexes an den dritten spezifischen, an den dritten Filter 14c immobilisierten Fänger-Antikörper 5c. LH 4a, FSH 4b und hCG 4c befinden sind dann in einer Sandwichposition zwischen dem jeweiligen immobilisierten Fänger-Antikörper 5a, 5b, 5c und dem Analyt-Nachweisantikörper 3a, 3b, 3c mit Label 33a, 33b, 33c in einem so genannten Sandwich-Aufbau. Diese sind in Figur 3 auf dem jeweiligen Filter 14a, 14b, 14c aufgebaut dargestellt.
Um die Bindung zu beschleunigen und zu unterstützen, erfolgt beispielsweise für eine vorbestimmte Zeit, insbesondere für 1 -5 min, beispielsweise bei 21 -37°C, ein Ruhen lassen der Probe und/oder ein sanftes Bewegen der Probe in den Reaktionskammern. Hiernach erfolgt vorteilhaft ein Waschschritt durch Zugabe eines in einem Reservoir vorgelagerten Wasch- Reagenz in die Reaktionskammern.
Alternativ und nicht in den Figuren dargestellt umfasst die mikrofluidische Vorrichtung 10 beispielsweise keine Eingabekammer Die Probe mit den Analyten LH 4a, FSH 4b und hCG 4c wird in die mikrofluidische Vorrichtung 10 eingegeben und durch die Reaktionskammern mit den Filtern 14a, 14b, 14c geleitet. Die Analyte LH 4a, FSH 4b und hCG 4c binden an die auf den Filtern 14a, 14b, 14c immobilisierten spezifischen Fänger-Antikörper 5a, 5b, 5c. Anschließend werden, beispielsweise in einem Reservoir vorgelagerte Nachweisantikörper 3a, 3b, 3c mit Label 33a, 33b, 33c in die Reaktionskammern geleitet, welche dann an die filtergebundenen Analyten LH 4a, FSH 4b und hCG 4c binden.
Der Schritt zur Bindung der Analyte oder der nachweisantikörpergebundenen Analyte LH 4a, FSH 4b und hCG 4c Oe nach Ausführungsform) an die Fänger- Antikörper 5a, 5b, 5c kann beliebig oft wiederholt werden durch ein Führen der Probe in einem fluidischen Kreislauf.
Vorteilhaft erfolgt anschließend ein Waschschritt durch Zugabe eines in einem Reservoir vorgelagerten Wasch- Reagenz in die Reaktionskammern.
Alternativ oder zusätzlich und nicht in den Figuren 1 , 3 und 4 dargestellt, erfolgt der Nachweis von Analyten mittels eines kompetitiven ELISA. Mittels des kompetitiven ELISA sind beispielsweise Steroidhormone, insbesondere Östrogen, Progesteron und Testosteron, nachweisbar.
Vor der Eingabe der Probe in Schritt a) wird zunächst ein zu dem nachzuweisenden Analyten kompetitiver Analyt in die mikrofluidische Vorrichtung 10 zugegeben. Dieser bindet an den jeweiligen Analyt-spezifischen an den jeweiligen Filter immobilisierten Fänger-Antikörper. Der kompetitive Analyt trägt bereits ein Label, insbesondere ein Enzym, für die spätere Auslese.
In Schritt a) erfolgt dann die Eingabe der Probe in die mikrofluidische Vorrichtung 10 und in Schritt b) das Leiten der Probe in die Reaktionskammern mit den Filtern 14a, 14b, 14c mit spezifischen immobilisierten Fänger-Antikörpern. Der nachzuweisende Analyt verdrängt den kompetitiven Analyten von dem Analyt- spezifischen immobilisierten Fänger-Antikörper und bindet selbst daran.
Um die Bindung bzw. Verdrängung zu beschleunigen und zu unterstützen, erfolgt beispielsweise auch hier für eine vorbestimmte Zeit, insbesondere für 1 -5 min, beispielsweise bei 21 -37°C, ein Ruhen lassen der Probe und/oder ein sanftes Bewegen der Probe in den Reaktionskammern. Hiernach erfolgt vorteilhaft ein Waschschritt durch Zugabe eines in einem Reservoir vorgelagerten Wasch- Reagenz in die Reaktionskammern, beispielsweise um verdrängte kompetitive Analyten auszuwaschen.
Das weitere Verfahren ist für den Nachweis der Analyte beim Sandwich- ELI SA und für den Nachweis der kompetitiven Analyte beim kompetitiven ELISA gleich und wird im Folgenden für den Sandwich-ELISA für die Beispiel-Analyte LH 4a, FSH 4b und hCG 4c und für den kompetitiven ELISA allgemein beschrieben.
Alle Nachweis-Antikörper 3a, 3b, 3c und/oder kompetitive Analyten tragen vorteilhaft dasselbe Label 33a, 33b, 33c zur Auslese. Als Label zur Auslese dient beispielsweise ein Enzym, zum Beispiel die Meerrettich-Peroxidase (HRP, engl.: horseradish peroxidase) oder die Alkalische Phosphatase (AP). In einem Schritt c) wird ein Auslese-Reagenz für eine Detektion der gelabelten Nachweis-Antikörper 3a, 3b, 3c und/oder für eine Detektion der gelabelten kompetitiven Analyten, insbesondere aus einem Reservoir der mikrofluidischen Vorrichtung 10, insbesondere Kartusche 100, in die Reaktionskammern geleitet Das Auslese-Reagenz ist beispielsweise ein Substrat wie zum Beispiel TMB (3,3',5,5'-tetramethylbenzidine) und bewirkt, dass das Label, beispielsweise das Enzym des Nachweis-Antikörpers 3a, 3b, 3c oder des kompetitiven Analyten, beispielsweise die Meerrettich-Peroxidase, das Substrat umsetzt wobei beispielsweise eine elektrochemische Reaktion in Form einer Redoxreaktion und/oder eine Farbreaktion hervorgerufen wird.
Zur Detektion einer Redoxreaktion sind die jeweiligen Filter 14a, 14b, 14c elektrisch leitfähig ausgeführt und jede Reaktionskammer umfasst zwei Elektroden 8.
Mit der Zugabe des Auslese- Reagenz startet die elektrische Messung. Liegen LH 4a, FSH 4b und hCG 4c im Sandwich gebunden an der Filtermembran vor bzw. liegen kompetitive Analyten mit Label gebunden an der Filtermembran vor, so startet die enzymatische Redoxreaktion nahe der Membran, welche durch das Zwei- Elektrodensystem erfasst wird.
In einer alternativen oder zusätzlichen Ausführungsform erfolgt die Bestimmung der Konzentration von LH 4a, FSH 4b und hCG 4c bzw. der kompetitiven Analyten mit Label in Schritt c) kolorimetrisch anhand eines Farbumschlags eines Filters 14a, 14b, 14c, insbesondere eines pH-sensitiven Filters 14a, 14b, 14c. Hierbei führt die Enzymreaktion beispielsweise direkt - oder im Fall eines pH- sensitiven Filters 14a, 14b, 14c indirekt über eine durch die Enzymreaktion hervorgerufene Änderung des pH-Werts zu einem Farbumschlag des in den Filter 14a, 14b, 14c integrierten Farbstoffs, sodass der Farbumschlag kolorimetrisch ausgelesen werden kann. Bei der Auslese wird die Konzentration der gebundenen Analyten LH 4a, FSH 4b und hCG 4c bzw. der kompetitiven Analyten mit Label aufgrund einer Absorption von Licht in einem bestimmten Wellenlängenbereich gemessen.
Eine Auslese-Einheit, insbesondere eine Strom/Spannungsquelle , und/oder eine Kamera, erfasst die elektrochemische Reaktion bzw. die Intensität der Farbreaktion. Je mehr Analyten beim Nachweis über den Sandwich-ELISA an die immobilisierten spezifischen Fänger-Antikörper gebunden sind, desto höher ist das detektierte Signal.
Bei den kompetitiven Analyten gilt, dass wenn viel Analyt in der Probe vorhanden ist, wenige kompetitive Analyten gebunden sind, da die Bindungsstellen vieler in der Reaktionskammer immobilisierter spezifischer Fänger-Antikörper durch den Analyten besetzt sind. Je mehr Analyt in der Probe vorhanden ist, desto niedriger ist somit bei der Auslese das detektierte Signal. Ist wenig Analyt in der Probe, so können viele kompetitiven Analyten an die in der Reaktionskammer immobilisierten spezifischen Fänger-Antikörper binden. Bei der Auslese wird dann ein entsprechend hohes Signal detektiert.
Anhand der von der Auslese-Einheit detektierten Redoxreaktion und/oder Farbreaktion werden die Konzentrationen der Hormone LH, FSH und hCG bzw. der kompetitiven Analyten mittels einer Software umfassend eine Auswerte- Algorithmik, insbesondere basierend auf künstlicher Intelligenz, bestimmt.
Zudem erfolgt mittels der Auswerte-Einheit vorteilhaft ein Vergleichen der bestimmten Hormonkonzentrationen in der Probe mit bekannten Konzentrationen und eine Auswertung und Einordnung dieser.
In einem weiteren Schritt werden dann die ermittelten Konzentrationen von LH 4a, FSH 4b und hCG 4c ausgegeben und/oder es wird anhand der Einordnung und Auswertung der jeweiligen Hormonkonzentrationen eine Handlungsempfehlung und/oder eine Information, insbesondere eine Phase und/oder ein Tag im weiblichen Zyklus und/oder ein fertiles Fenster einer Probandin beispielsweise über eine Anzeigeeinheit und/oder eine zugehörige App ausgegeben.
Je nach nachzuweisenden Analyten können Sandwich-ELISA und kompetitiver ELISA kombiniert ablaufen, d.h. auf einem der Filter 14a, 14b, 14c wird ein Analyt nachgewiesen, der mittels einem Sandwich-ELISA detektierbar ist und auf einem weiteren Filter 14a, 14b, 14c wird ein anderer Analyt nachgewiesen, der mittels einem kompetitiven EILSA detektierbar ist.
Die Auslese-Einheit und/oder die Auswerteeinheit und/oder die zumindest eine Heizeinrichtung 7 sind beispielsweise Teil einer mikrofluidischen Vorrichtung 10, welche in Form eines einteiligen Geräts vorliegt. Alternativ ist die mikrofluidische Vorrichtung 10 als Kartusche 100 ausgebildet. Dies ist in Figur 4 beispielhaft für die Vorrichtung gemäß Figur 3 dargestellt. Die zumindest eine Auslese-Einheit und/oder die Auswerte- Einheit und/oder die zumindest eine Heizeinrichtung 7 sind hier nicht Teil der Kartusche 100 sondern liegen in einem separaten, nicht dargestellten Analysegerät vor. Die Kartusche 100 weist dann in den Figuren nicht dargestellte Schnittstellen zu diesem auf. Die Kartusche 100 kann außerdem weitere, nicht dargestellte, Bestandteile aufweisen.

Claims

Ansprüche
1 . Mikrofluidische Vorrichtung (10), insbesondere Kartusche (100) für eine Diagnose am Point of Care oder zu Hause, zur parallelen, insbesondere multiplexen, Bestimmung einer Konzentration zumindest zweier Analyten (4a, 4b, 4c), insbesondere verschiedener Analyten-Arten, in einer Probe, insbesondere einer Urinprobe, umfassend eine erste Reaktionskammer mit einem ersten Filter (14a) und zumindest eine fluidisch mit dieser verbundene zweite Reaktionskammer mit einem zweiten Filter (14b), wobei auf dem ersten Filter (14a) zumindest ein erster spezifischer Fänger-Antikörper (5a) eines ersten nachzuweisenden Analyten (4a) immobilisiert ist, und wobei auf dem zweiten Filter (14b) zumindest ein zweiter spezifischer Fänger-Antikörper (5b) eines zweiten nachzuweisenden Analyten (4b) immobilisiert ist, und weiter umfassend in der mikrofluidischen Vorrichtung (10) vorgelagerte spezifische Nachweis-Antikörper (3a., 3b, 3c) zur Bindung an die jeweiligen Analyten (4a, 4b, 4c) und/oder in der mikrofluidischen Vorrichtung (10) vorgelagerte kompetitive Analyten zur Bindung an den zumindest einen spezifischen immobilisierten Fänger-Antikörper (5a, 5ab,) auf dem ersten (14a) und/oder auf dem zumindest einen zweiten Filter (14b).
2. Mikrofluidische Vorrichtung (10) nach Anspruch 1 , wobei zumindest einer der Filter (14a, 14b, 14c) elektrisch leitfähig ausgeführt ist und die diesen umfassende Reaktionskammer zwei Elektroden (8) umfasst, sodass eine enzymatische Reaktion in der Reaktionskammer elektrisch erfassbar ist.
3. Mikrofluidische Vorrichtung (10) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei zumindest einer der Filter (14a, 14b, 14c) einen integrierten, insbesondere pH-sensitiven, Farbstoff umfasst, sodass eine enzymatische Reaktion in der Reaktionskammer kolorimetrisch erfassbar ist.
4. Mikrofluidische Vorrichtung (10) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, ferner umfassend eine, insbesondere beheizbare, Eingabekammer (1), welche zumindest einer der Reaktionskammern vorgelagert ist und insbesondere wobei die spezifischen Nachweis-Antikörper (3a, 3b. 3c) in der Eingabekammer (1) vorgelagert sind.
5. Mikrofluidische Vorrichtung (10) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die auf den Filtern (14a, 14b, 14c) immobilisierten, spezifischen Fänger-Antikörper (5a, 5b, 5c) spezifisch sind für das luteinisierende Hormon (LH) und/oder das Follikelstimulierende Hormon (FSH) und/oder Tyreotropin (TSH) und/oder das humane Choriongonadotropin (hCG), und/oder Testosteron und/oder Östrogen und/oder Progesteron.
6. Mikrofluidische Vorrichtung (10) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, ferner umfassend zumindest eine elektrische und/oder kolorimetrische und/oder optische Auslese-Einheit, zum Erfassen der jeweiligen an die immobilisierten Fänger-Antikörper (5a, 5b, 5c) gebundenen Analyten (4a, 4b, 4c) und eine Auswerte- Einheit eingerichtet eine Konzentration der zumindest zwei Analyten (4a, 4b, 4c) mittels einer Auswerte-Algorithmik, insbesondere basierend auf künstlicher Intelligenz, zu bestimmen.
7. Mikrofluidisches System umfassend eine mikrofluidische Vorrichtung (10) nach einem der vorhergehenden Ansprüche 1 -5, wobei die mikrofluidische Vorrichtung (10) als Kartusche (100) ausgestaltet ist, und ein Analysegerät, umfassend eine elektrische und/oder optische Auslese-Einheit, zum Erfassen der jeweiligen an die immobilisierten Fänger-Antikörper (5a, 5b, 5c) gebundenen Analyten (4a, 4b, 4c) und eine Auswerte- Einheit eingerichtet die Konzentration der zumindest zwei Analyten (4a, 4b, 4c) mittels einer Auswerte-Algorithmik, insbesondere basierend auf künstlicher Intelligenz, zu bestimmen, und wobei das Analysegerät ausgebildet ist die Kartusche (100), zu prozessieren und/oder Ergebnisse aus dieser auszulesen.
8. Verfahren (50) zur parallelen, insbesondere multiplexen, Bestimmung einer Konzentration zumindest zweier Analyten (4a, 4b, 4c), insbesondere verschiedener Analyten-Arten, in einer Probe, insbesondere einer Urin-Probe, mittels einer mikrofluidischen Vorrichtung (10) gemäß einem der Ansprüche 1 -6 oder mittels einem mikrofluidischen System gemäß Anspruch 7 mit nachfolgenden Schritten a) Bereitstellen der Probe und Eingabe eines Probevolumens in die mikrofluidische Vorrichtung (10), insbesondere in die Eingabekammer (1). b) Leiten der Probe in eine erste Reaktionskammer mit einem ersten Filter (14a) und in zumindest eine zweite Reaktionskammer mit einem zweiten Filter (14b) und Binden des ersten Analyten (4a) an einen ersten spezifischen, an den ersten Filter (14a) immobilisierten Fänger-Antikörper (5a) und Binden des zumindest einen zweiten Analyten (4b) an einen zweiten spezifischen, an den zweiten Filter (14b) immobilisierten Fänger-Antikörper (5b) c) Bestimmen der Konzentration des ersten filtergebundenen Analyten (4a) und des zumindest einen zweiten filtergebundenen Analyten (4b) und insbesondere Vergleichen dieser mit bekannten Analyten- Konzentrationen, wobei die Bestimmung und insbesondere der Vergleich der Analyten- Konzentrationen, in einer Auswerte- Einheit mithilfe einer Auswerte-Algorithmik, insbesondere basierend auf künstlicher Intelligenz, erfolgt.
9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Bestimmung der Konzentration der Analyten (4a, 4b, 4c) in Schritt c) elektrisch anhand einer mittels eines Zwei- Elektroden-Systems in der jeweiligen Reaktionskammer erfassten enzymatischen Reaktion, insbesondere Redoxreaktion, erfolgt.
10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche 8 oder 9, wobei die Bestimmung der Konzentration der Analyten ((4a, 4b, 4c) in Schritt c) kolorimetrisch anhand eines Farbumschlags eines Filters (14a, 14b, 14c), insbesondere eines pH-sensitiven Filters (14a, 14b, 14c), erfolgt.
11 . Verfahren nach einem der Ansprüche 8-10, wobei zumindest einer der Analyten (4a, 4b, 4c) ein Peptidhormon, insbesondere das luteinisierende Hormon (LH) und/oder das Follikelstimulierende Hormon (FSH) und/oder Tyreotropin (TSH) und/oder das humane Choriongonadotropin (hCG) ist und wobei zumindest einer der Analyten (4 a, 4b, 4c) ein Steroidhormon, insbesondere Testosteron und/oder Östrogen und/oder Progesteron ist.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 8-11 , wobei in Schritt b) für eine vorbestimmte Zeit, insbesondere für 1 -5 min, ein Ruhenlassen der Probe und/oder ein sanftes Bewegen der Probe in der jeweiligen Reaktionskammer erfolgt.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 8-12, wobei die erste und/oder die zumindest eine zweite Reaktionskammer zumindest bereichsweise temperiert wird, insbesondere auf 21 -37°C.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 8-13, wobei Schritt b) wiederholt wird durch ein Führen der Probe in einem Kreislauf.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 8-14, wobei nach Schritt c) in einem Schritt d) die jeweilige Konzentration der Analyten (4a, 4b, 4c) ausgegeben und/oder eine Handlungsempfehlung und/oder eine Information, insbesondere eine Phase und/oder ein Tag im weiblichen Zyklus und/oder ein fertiles Fenster einer Probandin berechnet und ausgegeben wird, insbesondere auf einer Anzeigeeinheit und/oder in einer zugehörigen App.
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