WO2026014249A1 - デジタルｐｃｒシステム、対象核酸検出方法および対象核酸検出記憶媒体 - Google Patents

デジタルｐｃｒシステム、対象核酸検出方法および対象核酸検出記憶媒体

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WO2026014249A1
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wells
nucleic acid
target nucleic
digital pcr
image
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樹生 中川
真理子 山本
惟夫 香村
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Hitachi Ltd
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Hitachi Ltd
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C12M1/36—Apparatus for enzymology or microbiology including condition or time responsive control, e.g. automatically controlled fermentors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N37/00—Details not covered by any other group of this subclass

Definitions

  • the present invention relates to a digital PCR system, a method for detecting a target nucleic acid, and a storage medium for detecting a target nucleic acid.
  • Digital PCR Polymerase Chain Reaction
  • dPCR Digital PCR
  • Digital PCR involves dividing a sample solution into tiny droplets, then carrying out PCR within the divided droplets to amplify and measure the target nucleic acid. Each tiny droplet contains one or more target nucleic acids, and some droplets do not contain the target nucleic acid. Droplets in which the target nucleic acid has been amplified after PCR are counted as positive, while droplets that have not been amplified and do not contain the target nucleic acid are counted as negative. In digital PCR, the average copy number of the target nucleic acid per droplet, i.e., the concentration of the target nucleic acid, is calculated from the counting results using Poisson correction.
  • Patent Document 1 discloses a configuration for reducing quantification errors caused by optical artifacts in dPCR, in which if the optical signals are unevenly distributed in each reaction region, the reaction region is identified as invalid and the reaction region identified as invalid is excluded from the calculation of the amount or concentration of the nucleic acid of interest. Furthermore, Patent Document 2 discloses a method for quantifying the reaction volume in each reaction region in order to reduce quantification errors caused by reaction volume deviations in dPCR. Patent Document 3 discloses a highly robust sample solution separation technique in a sample fractionation device for dPCR, which uses a photocurable resin as a separation liquid. Note that in Patent Document 3, "high robustness" means that the sample solution in the fractions (wells) does not leak out.
  • digital PCR In digital PCR, a sample solution containing the target nucleic acid is divided into multiple wells, and PCR is performed on each well to identify the type of DNA present in each well. Digital PCR is characterized by its ability to measure the target nucleic acid with high sensitivity by performing PCR after dividing the sample into individual wells.
  • cfDNA cell-free DNA
  • cfDNA cell-free DNA
  • ctDNA circulating tumor DNA
  • the number of positive and negative droplets is measured for each fluorescent dye. Since each well contains 0, 1, or multiple target nucleic acids, the proportion of positive droplets is fitted to a Poisson distribution to calculate the concentration of the target nucleic acid molecules (copies/ ⁇ L). Therefore, to accurately determine the concentration of the target nucleic acid, it is necessary to accurately measure the proportion of positive droplets.
  • the inventors discovered that abnormalities such as tiny air bubbles can occur in the wells into which the target nucleic acid is introduced, which can affect the measurement results.
  • the fluorescence intensity of negative wells can be overestimated, potentially leading to a false positive result.
  • the fluorescence intensity of positive wells can be underestimated, potentially leading to a false negative result. This can make it difficult to accurately measure the fluorescence intensity, making it difficult to accurately determine the concentration of the target nucleic acid.
  • the present invention has been made in view of the above-mentioned circumstances, and an object of the present invention is to provide a digital PCR system, a target nucleic acid detection method, and a target nucleic acid detection storage medium that can measure the concentration of a target nucleic acid with high accuracy even if an abnormality occurs in the well into which the target nucleic acid is introduced.
  • a digital PCR system is a system for detecting a target nucleic acid in a sample solution by digital PCR, and includes an imaging device that captures an image including a plurality of wells into which the sample solution has been introduced, and a control unit that recognizes the positions of the plurality of wells in the image, recognizes the presence or absence of an abnormality in each of the wells and the position of the abnormality within the well, calculates a representative value of the fluorescence intensity of each of the wells, corrects the representative value of the fluorescence intensity of wells having the abnormality, and determines the presence or absence of the target nucleic acid in the plurality of wells.
  • FIG. 1 is a conceptual diagram of a digital PCR device 101 used in a digital PCR system 200 according to a first embodiment.
  • 1 is a configuration diagram of a digital PCR system 200 according to a first embodiment.
  • FIG. 2 is a diagram showing an example of an image captured at high resolution of a digital PCR device 101 that has performed digital PCR using the digital PCR system 200 according to the first embodiment.
  • 10 is a flowchart illustrating an example of a procedure for detecting the position of a well 105 from an image.
  • 10 is a flowchart illustrating an example of a procedure for recognizing the position of a well 105.
  • 10 is a flowchart illustrating an example of a procedure for recognizing a bubble 110.
  • FIG. 1 is a conceptual diagram of a digital PCR device 101 used in a digital PCR system 200 according to a first embodiment.
  • 1 is a configuration diagram of a digital PCR system 200 according to a first embodiment.
  • FIG. 2 is a diagram showing
  • FIG. 1 is a conceptual diagram illustrating an example of a network configuration.
  • FIG. 1 is a conceptual diagram illustrating a network trained to obtain an output image (correct image) that is training data from an input image that is training data.
  • FIG. 1 is a conceptual diagram illustrating how an input image containing an abnormal part such as a bubble 110 is input to a trained network to obtain an output image.
  • FIG. 8C is a diagram comparing the output image (well image) and input image (well image) in FIG. 8B with an SSIM image.
  • FIG. 10 is a diagram showing an example of an input image (well image) to be input to an SSIM autoencoder. This is an SSIM image obtained from the input and output images of the autoencoder.
  • FIG. 1 is a conceptual diagram illustrating an example of a network configuration.
  • FIG. 1 is a conceptual diagram illustrating a network trained to obtain an output image (correct image) that is training data from an input image that is training data.
  • FIG. 1 is a
  • 10 is a diagram showing pixels determined to be abnormal pixels when an SSIM image is binarized. This image is created by overwriting the pixels determined to be abnormal on the original well image with color. 10 is a histogram showing the average intensity (average of fluorescent intensity) of wells 105 determined to have bubbles and wells 105 determined to have no bubbles. 10 is a histogram showing the average intensity (average fluorescence intensity) before and after correction for the influence of the air bubble 110 for the well 105 determined to contain an air bubble. 10 is a flowchart illustrating the processing content in the digital PCR system 200 according to the second embodiment. FIG. 10 is an explanatory diagram illustrating an example of temperature dependence of fluorescence intensity. FIG.
  • FIG. 1 is an explanatory diagram illustrating an example of a differential curve obtained by differentiating a melting curve.
  • 1 is a flowchart illustrating the content of a method for detecting a target nucleic acid according to the present embodiment.
  • FIG. 1 is a diagram illustrating the configuration of a storage medium 1400 for detecting a target nucleic acid according to this embodiment and the configuration of a computer 10 that constitutes a data analysis unit.
  • Fig. 1 is a conceptual diagram of a digital PCR device 101 used in a digital PCR system 200 according to the first embodiment.
  • Fig. 2 is a configuration diagram of the digital PCR system 200 according to the first embodiment.
  • the digital PCR device 101 shown in Fig. 1 is used in the digital PCR system 200 shown in Fig. 2.
  • the digital PCR device 101 is composed of an inlet 102, an outlet 107, a channel 104, and wells (microchambers) 105a, 105b, 105c, etc.
  • one digital PCR device 101 has 10,000 to tens of thousands of wells 105.
  • the volume of one well 105 is, for example, about 1 nL.
  • the total volume of the sample solution 108 contained in the multiple wells 105 is, for example, 10 ⁇ L to several tens of ⁇ L.
  • the digital PCR system 200 is composed of a temperature controller 201, a fluorescence detector 202 (imaging device), and a data analysis unit 203 (control unit).
  • the digital PCR device 101 described above is placed on top of the temperature controller 201.
  • the fluorescence detector 202 is composed of a light source 204, lenses 205, 208, and 210, an excitation filter 206, a dichroic mirror 207, a fluorescence filter 209, and a light-receiving sensor 211.
  • the fluorescence detector 202 captures an image including the multiple wells 105 into which the sample solution 108 has been introduced.
  • excitation light from a light source 204 is irradiated onto each well 105 through a lens 205, an excitation filter 206, and a dichroic mirror 207.
  • the excitation light excites a fluorescent substance contained in the sample solution 108 in the well 105, and the emitted fluorescence is detected by a light-receiving sensor 211 through a lens 208, a dichroic mirror 207, a fluorescence filter 209, and a lens 210.
  • the fluorescence data detected by the fluorescence detector 202 is sent to a data analysis unit 203.
  • the data analysis unit 203 may be a computer 10 (FIG. 14) connected to the digital PCR system 200 via a communication circuit 20 (FIG. 14) and a communication interface (I/F) 17 (FIG. 14).
  • the data analysis unit 203 recognizes the positions of the multiple wells 105 in the captured image.
  • the data analysis unit 203 also recognizes the presence or absence of abnormalities in each well 105 and the position of the abnormalities within the well 105.
  • the data analysis unit 203 calculates a representative value of the fluorescence intensity of each well 105. Examples of representative values of fluorescence intensity include the average or median of fluorescence intensity.
  • the data analysis unit 203 corrects the representative value of the fluorescence intensity of wells 105 that have the above-mentioned abnormalities.
  • the representative value can be corrected, for example, by removing the abnormal portion (abnormal pixel) of the well 105.
  • the corrected representative value becomes the average or median of the fluorescence intensity of the well 105 with the abnormal portion of the well 105 removed.
  • the data analysis unit 203 also determines the presence or absence of the target nucleic acid in the multiple wells 105.
  • the presence or absence of the target nucleic acid can be determined by whether or not the fluorescence intensity is measured or whether or not the fluorescence intensity is higher than a predetermined threshold.
  • the sample solution 108 contains target nucleic acid, PCR amplification enzyme, buffer, primers, dNTPs (dATP, dTTP, dGTP, dCTP), and probes.
  • the sample solution 108 is introduced into wells 105 in the digital PCR device 101. Specifically, the sample solution 108 is introduced into the wells 105 from the inlet 102 through the flow path 104. A separating liquid 109 such as oil or photocurable resin is then introduced into the flow path 104 to push out the sample solution 108, and the separating liquid 109 divides the wells 105. In this way, the sample solution 108 is separated and introduced into the microscopic wells 105.
  • the digital PCR device 101 with the sample solution 108 introduced therein undergoes thermal cycling by the temperature controller 201, and the target nucleic acid is amplified by PCR.
  • the amplified target nucleic acid is subjected to fluorescence measurement using the fluorescence detector 202 as described above. Furthermore, analysis is performed in the data analysis unit 203 based on the measured data.
  • Fluorescence intensity can generally be used for this determination. If the measured fluorescence intensity is higher than a predetermined threshold, the well 105 can be determined to be a positive well that contains the target nucleic acid. On the other hand, if the measured fluorescence intensity is lower than the predetermined threshold, the well 105 can be determined to be a negative well that does not contain the target nucleic acid.
  • FIG. 3 shows an example of a high-resolution image of a digital PCR device 101 that has performed digital PCR using the digital PCR system 200 according to the first embodiment.
  • digital PCR amplification products are confirmed in some wells 105, and positive (bright) wells 105 are confirmed.
  • no digital PCR amplification products are confirmed in some wells 105, and negative (dark) wells 105 are confirmed.
  • some wells 105 exhibited abnormalities, specifically air bubbles 110.
  • thermal cycling is performed to change the temperature of the sample solution 108 to cause a reaction. Therefore, when the temperature is raised, the sample solution 108 may evaporate, generating air bubbles 110.
  • the sample solution 108 may be absorbed due to the water-absorbing properties of the resin, resulting in a decrease in the volume of the sample solution 108 relative to the volume of the wells 105, and air bubbles 110 may be generated.
  • the internal pressure decreases by the amount of sample solution 108 reduced, and this is observed as air bubbles 110.
  • One method for sealing each well 105 is to use a solid to seal the well 105. Specifically, a seal is used.
  • a photocurable resin is used as the separation liquid 109, the well 105 is sealed by hardening it. In these cases, if the internal pressure of the well 105 decreases for some reason, air bubbles 110 may form.
  • the photocurable resin may be, for example, a hydrophobic, liquid photocurable resin having a molecular skeleton of a cycloalkane, a normal alkane with six or more carbon atoms, or an isoalkane. Such a photocurable resin is less likely to inhibit the PCR reaction.
  • the photocurable resin preferably has a viscosity of, for example, 500 mPa ⁇ s or less. This allows the photocurable resin to be easily introduced into the inlet 102, flow channel 104, etc. of the digital PCR device 101.
  • the photocurable resin is preferably used in conjunction with any photoinitiator that initiates the photopolymerization reaction.
  • Photocuring may be performed, for example, by irradiating with ultraviolet light having a wavelength of 250 to 600 nm.
  • the photocurable resin in a liquid state is introduced into the flow channel 104 and then cured by exposure to ultraviolet light. This seals the well 105.
  • the oil for example, a silicone-based oil or a Fluorinert-based oil is used.
  • bubbles 110 are formed as described above, excitation light is scattered at the interface of the bubbles 110 when fluorescence measurement is performed. Furthermore, the bubbles 110 do not contain sample solution 108, so the fluorescence intensity is weaker. Therefore, the bubbles 110 cause variations in the fluorescence intensity emitted by the wells 105, making it difficult to accurately determine whether the result is positive or negative.
  • the digital PCR system 200 of this embodiment by recognizing tiny air bubbles 110 in the well 105 and correcting the representative value of the fluorescence intensity of that well 105, it is possible to accurately calculate the fluorescence intensity and the concentration of the target nucleic acid even when air bubbles 110 are present.
  • Fig. 4 is a flowchart illustrating an example of a procedure for detecting the position of the well 105 from an image.
  • the data analysis unit 203 removes the rotational component from the captured image (S401). That is, the image is rotated so that the edges of the well 105 are aligned vertically and horizontally. As a result, the rotational component is removed, as described above.
  • the data analysis unit 203 removes distortion components (S402), that is, corrects the edges of the wells 105 so that they become straight.
  • the data analysis unit 203 removes the background (S403), thereby making it possible to remove influences other than those of the wells 105, such as noise.
  • the data analysis unit 203 detects the position of the well 105 where these procedures have been performed (S404).
  • FIG. 5 is a flowchart illustrating an example of a procedure for recognizing the position of the well 105.
  • the data analysis unit 203 (control unit) projects the image in the first axis direction and creates a projection vector (S501).
  • creating a projection vector means aligning (aligning) the images of the wells 105 in each column and row (images including the edges of the wells 105) vertically if they are aligned vertically, or horizontally if they are aligned horizontally. This can be easily understood by comparing, for example, FIG. 3 (before alignment) with FIG. 9A (after alignment), which will be described later. In this way, areas where wells 105 are present appear brighter, and areas where no wells 105 are present appear darker.
  • the data analysis unit 203 identifies the frequency of the fundamental wave of that vector (S502).
  • a projection vector is created as described above, in this embodiment, the rectangular well 105 appears with a certain frequency. This results in a signal that is somewhat periodic, and this frequency is identified. Note that if the edges of the well 105 are not in the vertical and horizontal directions, a clear periodicity cannot be obtained. For this reason, the image of the well 105 is rotated as described with reference to Figure 4, and a projection vector is created as described above, and its period is determined.
  • the data analysis unit 203 detects local peaks of the fundamental wave (S503).
  • the local peaks correspond to dark areas where there are no wells 105. This allows the wells 105, for example, to be identified as rows.
  • the data analysis unit 203 searches before and after the local peak to detect the end points of the well 105 (S504), thereby detecting the position of the well 105 in the first axial direction.
  • the data analysis unit 203 similarly detects the position of the well 105 in the second axis direction (S505). That is, the data analysis unit 203 similarly performs S501 to S504 for the second axis direction to detect the position of the well 105 in the second axis direction.
  • the data analysis unit 203 aligns the positions of the wells 105 in the first axis direction and the second axis direction to recognize the positions of the wells 105 (S506).
  • an image of the position of the recognized well 105 is used to recognize abnormalities within that well image.
  • An example of the abnormality mentioned above is an air bubble 110.
  • an air bubble 110 is an image of the position of the recognized well 105 mentioned above, that is, an image in which each well 105 is aligned in the column and row directions (see, for example, Figure 9A).
  • An example of a method for recognizing air bubbles 110 is as follows.
  • Figure 6 is a flowchart explaining an example of the procedure for recognizing air bubbles 110.
  • Figure 7 is a conceptual diagram explaining an example of a network configuration.
  • the network is trained using training data (S601). That is, in this embodiment, the presence or absence of bubbles 110 and their positions are recognized by machine learning, in which the data analysis unit 203 inputs images of normal wells 105 and trains the network to recognize wells 105 containing bubbles 110 and their positions.
  • the SSIM Structuretural Similarity Index Measure
  • FIG. 7 may be used as the network.
  • the data analysis unit 203 first reduces the dimensionality of the input image using an encoder.
  • image features are extracted using a convolutional neural network (CNN) using, for example, variance ⁇ (standard deviation), population mean ⁇ , random sampling, or the like as feature quantities (latent variables).
  • CNN convolutional neural network
  • the decoder restores the latent representation obtained by the encoder to the original image.
  • Learning is performed to maximize structural similarity with the original image.
  • learning is performed by using the SSIM index as a loss function, taking into account structural information about the image and correlation between images.
  • Images without bubbles 110 (referred to as normal images) are used as the learning data.
  • an output image (learning data) with no bubbles 110 in the wells 105 and uniform fluorescence intensity becomes the correct image (Figure 8A).
  • Figure 8A is a conceptual diagram illustrating a network trained to obtain an output image (correct image) that is also learning data from an input image that is also learning data.
  • FIG. 8B is a conceptual diagram for explaining how an input image including an abnormal part such as the air bubble 110 is input to a trained network and an output image is obtained.
  • the difference between the input image and the output image of the captured well image is evaluated using SSIM (S603).
  • the SSIM of the pixel neighborhood image is calculated for each pixel.
  • FIG. 8C is a diagram comparing the output image (well image) and input image (well image) in FIG. 8B with the SSIM image.
  • Figure 9C shows an image in which pixels determined to be abnormal pixels have been colored and overwritten on the original well image. As shown in Figure 9D, it can be seen that the abnormal pixel containing the air bubble 110 can be recognized in the original well image.
  • the air bubble 110 can be recognized in this way, it is possible to correct its influence. For example, pixels determined to be abnormal are excluded and a representative value of the fluorescence intensity of the well 105 is determined.
  • the representative value can be, for example, the average value or the median value.
  • the output image of the autoencoder can be used as the well image to extract the representative value.
  • Fig. 10A is a histogram showing the average intensity (average fluorescence intensity) of wells 105 determined to contain bubbles and wells 105 determined to contain no bubbles
  • Fig. 10B is a histogram showing the average intensity (average fluorescence intensity) of wells 105 determined to contain bubbles before and after correction for the influence of bubbles 110.
  • Figure 10A it can be seen that the distribution of average intensities differs depending on whether or not there is an air bubble 110.
  • the representative values of the wells 105 determined to contain bubbles are corrected as described above.
  • this correction results in the distribution of average intensities (before correction) of wells 105 determined to contain bubbles becoming a distribution (after correction) similar to the distribution of average intensities of wells 105 determined to contain no bubbles shown in Figure 10A. This shows that the effect of bubbles 110 can be eliminated by the correction.
  • the digital PCR system 200 determines the presence or absence of target nucleic acid in multiple wells 105, recognizes abnormalities (air bubbles 110), removes their influence, and corrects the representative value of the fluorescence intensity of the wells 105 that have abnormalities. This improves the accuracy of calculating the fluorescence intensity of the wells 105. In other words, correcting the representative value makes it equivalent to measuring the fluorescence intensity with high accuracy. Therefore, the accuracy of determining whether a result is positive or negative is also improved. Furthermore, because the digital PCR system 200 can use wells 105 that contain air bubbles 110 for analysis, it is possible to maintain the number of wells that can be analyzed. Therefore, the digital PCR system 200 can measure the concentration of the target nucleic acid with high accuracy even if an abnormality occurs in the well 105 into which the target nucleic acid is introduced.
  • the abnormality in the well 105 was described as an air bubble 110, but this is not limited to this, and any substance different from the sample solution 108 can be recognized in a similar manner.
  • oil which is the separation liquid 109
  • this embodiment can measure the concentration of the target nucleic acid with high accuracy.
  • FIG. 11 is a flowchart illustrating the processing steps performed by the digital PCR system 200 according to the second embodiment.
  • the method of recognizing bubbles 110 and correcting the representative value of the fluorescence intensity, as described in the first embodiment, is also useful when measuring the melting temperature of each well 105, as described with reference to FIG. 11 .
  • By performing the processing steps shown in FIG. 11 it is possible to measure the melting temperature of each well 105 after PCR.
  • the configuration of the digital PCR system 200 according to the second embodiment is the same as that according to the first embodiment.
  • the sample solution 108 is introduced into each well 105 and divided (S1101). Then, PCR is performed to amplify the target nucleic acid (S1102). Then, while controlling the temperature of the digital PCR device 101 with the temperature regulator 201, fluorescence measurement is performed to measure the temperature dependence of the fluorescence image of each well 105 (S1103).
  • the temperature dependence of the fluorescence image can be measured as follows.
  • the sample solution 108 contains the target nucleic acid, PCR amplification enzyme, buffer, primers, dNTPs, and a probe.
  • asymmetric PCR is performed by differentiating the concentrations of the forward primer and reverse primer to generate an amplification product 1201 (see Figure 12A) having a sequence complementary to the probe.
  • Figure 12A is an explanatory diagram illustrating an example of the temperature dependence of fluorescence intensity. As shown in the explanatory diagram in the upper left of Figure 12A, the amplification product 1201 hybridizes with the probe 1202 at low temperatures.
  • the probe 1202 has a fluorescent dye 1203 and a quencher 1204 attached to its end.
  • the fluorescent dye 1203 and the quencher 1204 separate, causing the probe 1202 to emit fluorescence. In other words, the fluorescence intensity increases. Furthermore, as shown in the explanatory diagram at the bottom right of Figure 12A, when the temperature of the sample solution 108 rises and exceeds the melting temperature determined by the sequences of the amplified product 1201 and probe 1202, the amplified product 1201 and probe 1202 dissociate. As a result, the quencher 1204 is positioned near the fluorescent dye 1203 of the probe 1202, reducing the fluorescence intensity.
  • the digital PCR system 200 described in the first embodiment is also useful for calculating such melting temperatures in the second embodiment.
  • the presence or absence of bubbles 110 and abnormal pixels in each well 105 are identified from the fluorescence image (well image), and then a representative value of the fluorescence intensity of each well 105 is calculated so as to eliminate the influence of the bubbles 110.
  • this process is repeated for the fluorescence image corresponding to the measured temperature. In this way, the melting curve, differential curve, and melting temperature are calculated while excluding the influence of the bubbles 110, thereby enabling the melting temperature to be calculated with high accuracy.
  • Fig. 13 is a flowchart illustrating the details of the method for detecting a nucleic acid of interest according to this embodiment.
  • the method detects a nucleic acid of interest in a sample solution 108 by digital PCR.
  • this method includes the following steps a) to g).
  • Step a) is a dividing step (S1301).
  • step a) the sample solution 108 is divided into a plurality of wells 105.
  • the division into a plurality of wells 105 is performed using a separating liquid 109 such as oil or photocurable resin.
  • PCR is performed between step a) and the following step b).
  • step b) is an imaging step (S1302).
  • an image including the plurality of wells 105 is captured.
  • the image is captured by the fluorescence detector 202 (imaging device).
  • Step c) is the first recognition step (S1303).
  • step c) the positions of the multiple wells 105 in the captured image are recognized.
  • step c) is performed by steps S401 to S404 and steps S501 to S506.
  • Step d) is the second recognition step (S1304).
  • step d) the presence or absence of an abnormality (air bubble 110) contained in each well 105 and the position of the abnormality within the well 105 are recognized.
  • step d) is performed by steps S601 to S604, as described with reference to FIG.
  • Step e) is a calculation step (S1305).
  • step e) a representative value of the fluorescence intensity is calculated for each well 105. Examples of the representative value of the fluorescence intensity include the average value and median value of the fluorescence intensity.
  • Step f) is a correction step (S1306).
  • step f) the representative value of the fluorescence intensity of the wells 105 having an abnormality is corrected.
  • the representative value can be corrected, for example, by removing the abnormal portion (abnormal pixel) of the well 105. In other words, the corrected representative value becomes the average value or median value of the fluorescence intensity of the well 105 after removing the abnormal portion.
  • Step g) is a determination step (S1307).
  • step g) the presence or absence of the target nucleic acid in the multiple wells 105 is determined. The presence or absence of the target nucleic acid can be determined based on whether or not the fluorescence intensity is measured or whether or not the fluorescence intensity is higher than a predetermined threshold.
  • the steps c) to g) are performed by the data analysis unit 203 (control unit).
  • this method determines the presence or absence of target nucleic acid in multiple wells 105, recognizes abnormalities (air bubbles 110), removes their influence, and corrects the representative value of the fluorescence intensity of the wells 105 that have abnormalities. This improves the accuracy of calculating the fluorescence intensity of the wells 105. In other words, correcting the representative value is equivalent to measuring the fluorescence intensity with high accuracy. Therefore, the accuracy of determining whether a result is positive or negative is also improved. Furthermore, because this method can also use wells 105 that have air bubbles 110 for analysis, the number of wells that can be analyzed can be maintained. Therefore, this method can measure the concentration of the target nucleic acid with high accuracy even if an abnormality occurs in the well 105 into which the target nucleic acid is introduced.
  • FIG. 14 is a configuration diagram illustrating the configuration of the target nucleic acid detection storage medium 1400 according to this embodiment and the configuration of a computer 10 constituting a data analysis unit.
  • the storage medium 1400 is used to detect target nucleic acids in a sample solution 108 by digital PCR.
  • the storage medium 1400 is readable by the computer 10 and stores a program for causing the computer 10, specifically the data analysis unit 203 (control unit), to execute each step shown in FIG.
  • steps c) to g) (S1403 to S1407) in the storage medium 1400 are the same as steps c) to g) (S1303 to S1307) of the method described above.
  • the computer 10 includes a CPU 11, a RAM 14, a ROM 15, a HDD 16, a communication I/F 17, an input/output I/F 18, and a media I/F 19.
  • the communication I/F 17 is connected to a communication circuit 20.
  • the input/output I/F 18 is connected to an input/output device 21.
  • the media I/F 19 reads and writes data from a recording medium 22.
  • the ROM 15 stores application programs executed by the CPU 11, various data, etc.
  • the HDD 16 stores image data, various data, control programs, etc. as appropriate.
  • the HDD 16 may be a solid-state drive (SSD), etc.
  • the CPU 11 realizes various functions by executing application programs loaded into the RAM 14.
  • the digital PCR system 200 (not shown in FIG. 14 ) may be connected to one computer 10 or to multiple computers 10 via the communication circuit 20 and the communication I/F 17.
  • step c) is the first recognition step (S1403).
  • step c) the positions of the multiple wells 105 in the captured image are recognized.
  • step c) is performed by steps S401 to S404 and steps S501 to S506.
  • step d) is the second recognition step (S1404).
  • step d) the presence or absence of an abnormality (air bubble 110) contained in each well 105 and the position of the abnormality within the well 105 are recognized.
  • step d) is performed by steps S601 to S604, as described with reference to FIG.
  • Step e) is a calculation step (S1405).
  • this storage medium 1400 may be provided inside the computer 10, or may be provided outside the computer 10 via the communication I/F 17, media I/F 19, etc.

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Abstract

対象核酸を導入するウエル内に異常が生じた場合であっても、高精度に対象核酸の濃度を計測できるデジタルＰＣＲシステムなどを提供する。本発明に係るデジタルＰＣＲシステム（２００）は、デジタルＰＣＲによりサンプル溶液（１０８）中の対象核酸を検出するシステムであり、前記サンプル溶液（１０８）が導入された複数のウエル（１０５）を含む画像を撮像する撮像装置（蛍光検出器（２０２））と、前記画像内の前記複数のウエル（１０５）の位置を認識し、各々の前記ウエル（１０５）に含まれる異常の有無および前記ウエル（１０５）内における前記異常の位置を認識し、各々の前記ウエル（１０５）の蛍光強度の代表値を算出し、前記異常を有するウエル（１０５）の前記蛍光強度の代表値を補正し、前記複数のウエル（１０５）内の対象核酸の有無を判別する制御部（データ解析部（２０３））と、を有する。

Description

デジタルＰＣＲシステム、対象核酸検出方法および対象核酸検出記憶媒体
　本発明は、デジタルＰＣＲシステム、対象核酸検出方法および対象核酸検出記憶媒体に関する。
　デジタルＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ：ポリメラーゼ連鎖反応）は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の断片や遺伝子など（以下、これらを総称して「対象核酸」と言うことがある）を高感度に検出する技術である。デジタルＰＣＲ（以下、「ｄＰＣＲ」と言うことがある）は、従来のリアルタイム定量ＰＣＲと比較して、低頻度な遺伝子変異を検出することができる。
　デジタルＰＣＲは、サンプル溶液を微小な液滴に分割した後、分割された液滴内でＰＣＲを実施して対象核酸を増幅し、計測する。各々の微小な液滴内には、１つ、あるいは、複数の対象核酸を含む液滴と、対象核酸を含まない液滴が存在する。ＰＣＲ後に対象核酸が増幅された液滴はポジティブとして数をカウントし、増幅されず対象核酸が含まれなかった液滴をネガティブとして数をカウントする。デジタルＰＣＲでは、カウントした結果からポアソン補正を用いて、液滴当たりの対象核酸の平均コピー数、すなわち、対象核酸の濃度を算出する。
　特許文献１には、ｄＰＣＲにおいて光学的アーチファクトによって引き起こされる定量化誤差を減少させるため、各反応領域において、光学的シグナルが不均等に分布している場合、反応領域を無効と同定し、無効と同定された反応領域を、関心対象の核酸の量または濃度の計算から排除する構成が開示されている。
　また、特許文献２には、ｄＰＣＲにおける反応体積偏差によって引き起こされる定量化誤差を減少させるため、各反応領域において、反応体積を定量化する方法が開示されている。
　特許文献３には、ｄＰＣＲ用のサンプル分画デバイスにおいて、分離液として光硬化樹脂を用いることにより、ロバスト性の高いサンプル溶液分離技術が開示されている。なお、特許文献３においてロバスト性が高いとは、画分（ウエル）内のサンプル溶液が漏れ出ることがないことを意味する。
特許第６９８５９５０号公報 特許第６９３６６７４号公報 国際公開第２０２４／１２１９５９号
　デジタルＰＣＲでは、対象核酸を含むサンプル溶液を多数のウエルに分割し、各々のウエルに対してＰＣＲを行い、各ウエル内に存在するＤＮＡの種類の判別を行う。デジタルＰＣＲは、各ウエル内に分割した後にＰＣＲを行うことにより、高感度に対象核酸を計測できることが特徴である。
　デジタルＰＣＲの応用のひとつに、血液中に微量に存在するセルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を検出する液体生検がある。セルフリーＤＮＡとは、免疫によって破壊されたり、アポトーシスなどにより死滅したりした細胞に由来するＤＮＡ断片のことである。セルフリーＤＮＡには、腫瘍由来のＤＮＡであるｃｔＤＮＡ（ｃｉｒｃｌａｔｉｎｇ　ｔｕｍｏｒ　ＤＮＡ）が含まれる場合がある。医療の分野では、ｃｔＤＮＡの変異の種類や割合を計測することにより、がんの診断や治療選択、治療効果のモニタリングへの応用が期待されている。診断用途では、対象核酸を高精度に計測する必要がある。
　デジタルＰＣＲでは、各蛍光色素で、ポジティブおよびネガティブなドロップレット数を測定する。各ウエルには０、１、あるいは、複数の対象核酸が含まれるため、ポジティブな液滴数の割合をポアソン分布にあてはめ、対象核酸分子の濃度（コピー／μＬ）を算出する。従って、対象核酸の濃度を正確に求めるためには、ポジティブな液滴数の割合を正確に計測する必要がある。
　しかしながら、本発明者らは、デジタルＰＣＲの研究開発を行っている際に、対象核酸を導入するウエルに微小な気泡などの異常が生じ、計測結果に影響を与え得る場合があることを見出した。このような場合には、ネガティブなウエルの蛍光強度が高く見積られ、ポジティブと誤判定する可能性がある。また、ポジティブなウエルの蛍光強度が低く見積られ、ネガティブと誤判定される場合もある。そのため、蛍光強度を正確に計測することが難しくなり、対象核酸の濃度を精度よく求めることが難しくなる場合がある。
　本発明は、このようなことに鑑みてなされたものである。本発明の目的の一つは、対象核酸を導入するウエル内に異常が生じた場合であっても、高精度に対象核酸の濃度を計測できるデジタルＰＣＲシステム、対象核酸検出方法および対象核酸検出記憶媒体を提供することにある。
　本発明の前記並びにその他の目的と新規な特徴は、本明細書の記述及び添付図面から明らかになるであろう。
　本願において開示される実施形態のうち代表的なものの概要を簡単に説明すれば下記のとおりである。
　本開示の代表的な実施形態に係るデジタルＰＣＲシステムは、デジタルＰＣＲによりサンプル溶液中の対象核酸を検出するシステムであり、前記サンプル溶液が導入された複数のウエルを含む画像を撮像する撮像装置と、前記画像内の前記複数のウエルの位置を認識し、各々の前記ウエルに含まれる異常の有無および前記ウエル内における前記異常の位置を認識し、各々の前記ウエルの蛍光強度の代表値を算出し、前記異常を有するウエルの前記蛍光強度の代表値を補正し、前記複数のウエル内の対象核酸の有無を判別する制御部と、を有する。
　本願において開示される発明のうち、代表的な実施形態によって得られる効果を簡単に説明すると、対象核酸を導入するウエル内に異常が生じた場合であっても、高精度に対象核酸の濃度を計測できるデジタルＰＣＲシステム、対象核酸検出方法および対象核酸検出記憶媒体を提供することができる。
第１実施形態に係るデジタルＰＣＲシステム２００に用いられるデジタルＰＣＲ用デバイス１０１の概念図である。 第１実施形態に係るデジタルＰＣＲシステム２００の構成図である。 第１実施形態に係るデジタルＰＣＲシステム２００により、デジタルＰＣＲを行ったデジタルＰＣＲ用デバイス１０１を高解像度で撮像した画像の一例を示す図である。 画像からウエル１０５の位置を検出する手順の一例を説明するフローチャートである。 ウエル１０５の位置を認識する手順の一例を説明するフローチャートである。 気泡１１０を認識する手順の一例を説明するフローチャートである。 ネットワークの一構成例を説明する概念図である。 学習データである入力画像から学習データである出力画像（正解画像）が得られるように学習させたネットワークについて説明する概念図である。 学習させたネットワークに気泡１１０のような異常部分を含む入力画像を入力し、出力画像を得ることを説明する概念図である。 図８Ｂにおける出力画像（ウエル画像）および入力画像（ウエル画像）と、ＳＳＩＭ画像とを対比した図である。 ＳＳＩＭオートエンコーダに入力する入力画像（ウエル画像）の一例を示す図である。 オートエンコーダの入力画像および出力画像から求めたＳＳＩＭ画像である。 ＳＳＩＭ画像を２値化し、異常ピクセルと判定されたピクセルを示す図である。 異常ピクセルと判定されたピクセルを、元のウエル画像に色付けして上書きした画像である。 気泡ありと判別されたウエル１０５および気泡なしと判別されたウエル１０５の平均強度（蛍光強度の平均）を示すヒストグラムである。 気泡ありと判別されたウエル１０５について気泡１１０の影響を補正する前と補正した後の平均強度（蛍光強度の平均）を示すヒストグラムである。 第２実施形態に係るデジタルＰＣＲシステム２００における処理内容を説明するフローチャートである。 蛍光強度の温度依存性の一例を説明する説明図である。 融解曲線を微分した微分曲線の一例を説明する説明図である。 本実施形態に係る対象核酸検出方法の内容を説明するフローチャートである。 本実施形態に係る対象核酸検出記憶媒体１４００の構成とデータ解析部をなすコンピュータ１０の構成を説明する構成図である。
　以下、適宜図面を参照しつつ、本発明の一実施形態に係るデジタルＰＣＲシステム、対象核酸検出方法および対象核酸検出記憶媒体について説明する。なお、以下の実施の形態においては便宜上その必要があるときは、複数のセクションまたは実施の形態に分割して説明する。しかし、特に明示した場合を除き、それらは互いに無関係なものではなく、一方は他方の一部または全部の変形例、詳細、補足説明などの関係にある。また、以下の実施形態において、要素の数など（個数、数値、量、範囲などを含む）に言及する場合、特に明示した場合および原理的に明らかに特定の数に限定される場合等を除き、その特定の数に限定されるものではなく、特定の数以上でも以下でもよい。
　さらに、以下の実施形態において、その構成要素（要素ステップなども含む）は、特に明示した場合および原理的に明らかに必須であると考えられる場合などを除き、必ずしも必須のものではないことは言うまでもない。同様に、以下の実施形態において、構成要素などの形状、位置関係などに言及するときは、特に明示した場合および原理的に明らかにそうでないと考えられる場合等を除き、実質的にその形状などに近似または類似するものなどを含むものとする。このことは、上記数値および範囲についても同様である。さらに、以下の実施形態の記述は典型的な例示に過ぎず、特許請求の範囲または適用例をいかなる意味においても限定するものではない。
　また、実施形態を説明するための全図において、同一あるいは同様の機能を有する構成要素が複数ある場合には、同一の符号に異なる添字を付して説明する場合がある。また、これらの複数の構成要素を区別する必要がない場合には、添字を省略して説明する場合がある。同一あるいは同様の機能を有する構成要素については、同一の符号を付し、重複した説明を省略する場合がある。
＜デジタルＰＣＲシステム＞
（第１実施形態）
　図１は、第１実施形態に係るデジタルＰＣＲシステム２００に用いられるデジタルＰＣＲ用デバイス１０１の概念図である。図２は、第１実施形態に係るデジタルＰＣＲシステム２００の構成図である。
　前記したように、図１に示すデジタルＰＣＲ用デバイス１０１は、図２に示すデジタルＰＣＲシステム２００に用いられる。図１に示すように、デジタルＰＣＲ用デバイス１０１は、インレット１０２、アウトレット１０７、流路１０４、ウエル（マイクロチャンバ）１０５ａ、１０５ｂ、１０５ｃ・・・により構成される。特に限定されるものではないが、１つのデジタルＰＣＲ用デバイス１０１につき、前記ウエル１０５を１万から数万個有する。１つのウエル１０５の体積は、例えば、１ｎＬ程度である。複数のウエル１０５に収容されるサンプル溶液１０８の合計の体積は、例えば、１０μＬから数十μＬである。
　図２に示すように、デジタルＰＣＲシステム２００は、温調器２０１、蛍光検出器２０２（撮像装置）、データ解析部２０３（制御部）により構成される。前記したデジタルＰＣＲ用デバイス１０１は、温調器２０１の上に設置される。
　蛍光検出器２０２は、光源２０４、レンズ２０５、２０８、２１０、励起フィルタ２０６、ダイクロイックミラー２０７、蛍光フィルタ２０９、受光センサ２１１で構成される。蛍光検出器２０２は、サンプル溶液１０８が導入された複数のウエル１０５を含む画像を撮像する。
　蛍光検出器２０２においては、光源２０４からレンズ２０５、励起フィルタ２０６およびダイクロイックミラー２０７を通して、励起光が各ウエル１０５に照射される。そして、励起光によりウエル１０５内のサンプル溶液１０８に含まれる蛍光物質が励起され、それにより発せられる蛍光がレンズ２０８、ダイクロイックミラー２０７、蛍光フィルタ２０９、レンズ２１０を通して受光センサ２１１で検出される。蛍光検出器２０２で検出された蛍光データは、データ解析部２０３に送られる。データ解析部２０３は、通信回路２０（図１４）および通信インターフェース（Ｉ／Ｆ）１７（図１４）を介してデジタルＰＣＲシステム２００と接続されたコンピュータ１０（図１４）であってもよい。
　データ解析部２０３は、撮像された画像内の複数のウエル１０５の位置を認識する。また、データ解析部２０３は、各々のウエル１０５に含まれる異常の有無およびウエル１０５内における異常の位置を認識する。データ解析部２０３は、各々のウエル１０５の蛍光強度の代表値を算出する。蛍光強度の代表値としては、例えば、蛍光強度の平均値や中央値などが挙げられる。さらに、データ解析部２０３は、前記した異常を有するウエル１０５の蛍光強度の代表値を補正する。代表値の補正は、例えば、ウエル１０５の異常部分（異常ピクセル）を取り除くことにより行うことができる。つまり、補正後の代表値は、ウエル１０５の異常部分を取り除いた蛍光強度の平均値や中央値などとなる。また、データ解析部２０３は、複数のウエル１０５内の対象核酸の有無を判別する。対象核酸の有無は、蛍光強度が計測されているか否かまたは蛍光強度が所定の閾値よりも高かったか否かで判別できる。
　サンプル溶液１０８には、対象核酸、ＰＣＲ増幅用の酵素、バッファ、プライマ、ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ）、および、プローブが含まれている。サンプル溶液１０８は、デジタルＰＣＲ用デバイス１０１内のウエル１０５に導入される。具体的には、サンプル溶液１０８は、インレット１０２より流路１０４を通じてウエル１０５に導入される。その後、流路１０４にオイルや光硬化樹脂などの分離液１０９を入れてサンプル溶液１０８を押し出し、分離液１０９により各ウエル１０５間が分割される。このようにして、サンプル溶液１０８は微小なウエル１０５内に分離して導入される。サンプル溶液１０８を導入したデジタルＰＣＲ用デバイス１０１は、温調器２０１によりサーマルサイクル処理が行われ、対象核酸がＰＣＲにより増幅される。増幅した対象核酸は蛍光検出器２０２を用いて前記したようにして蛍光計測が行われる。また、計測したデータを元にデータ解析部２０３で解析が行われる。ＰＣＲで増幅した対象核酸を蛍光計測することにより、各々のウエル１０５に対象核酸が含まれていたか否かを判別する。この判別には、一般的に、蛍光強度を用いることができる。計測された蛍光強度が所定の閾値よりも高かった場合は、対象核酸が含まれているポジティブなウエル１０５と判別できる。一方、計測された蛍光強度が所定の閾値よりも低かった場合は、対象核酸が含まれていないネガティブなウエル１０５と判別できる。
　図３は、第１実施形態に係るデジタルＰＣＲシステム２００により、デジタルＰＣＲを行ったデジタルＰＣＲ用デバイス１０１を高解像度で撮像した画像の一例を示す図である。図３に示すように、いくつかのウエル１０５内でデジタルＰＣＲによる増幅産物が確認され、ポジティブな（明るい）ウエル１０５が確認できる。その一方で、デジタルＰＣＲによる増幅産物が確認されず、ネガティブな（暗い）ウエル１０５が確認できる。また、ウエル１０５内に異常、具体的には気泡１１０が観察されるものがあった。デジタルＰＣＲでは、サーマルサイクルを行い、サンプル溶液１０８の温度を変化させて反応を行う。従って、温度を上げた際などには、サンプル溶液１０８が蒸発するなどして、気泡１１０が生じる場合がある。また、デジタルＰＣＲ用デバイス１０１の材質として樹脂を使用している場合には、樹脂の吸水性によりサンプル溶液１０８が吸水され、ウエル１０５の容積に対してサンプル溶液１０８が減少し、気泡１１０が生じる場合がある。デジタルＰＣＲ用デバイス１０１の各ウエル１０５を密閉しているような場合には、サンプル溶液１０８が減少した分、内圧が低下し、気泡１１０として観察される。各ウエル１０５を密閉する方法としては、固体を用いてウエル１０５を密閉するような方法がある。具体的にはシールなどを用いて密閉する。または、分離液１０９として光硬化樹脂を用いた場合には、硬化させることによりウエル１０５が密閉される。これらのような場合には、何等かの原因によりウエル１０５の内圧が低下すると気泡１１０が生じる場合がある。
　光硬化樹脂としては、例えば、シクロアルカン、炭素数６以上のノルマルアルカン、またはイソアルカンを分子骨格に持つ、疎水性かつ液体性の光硬化樹脂が用いられる。このような光硬化樹脂であると、ＰＣＲ反応を阻害され難くすることができる。光硬化樹脂は、例えば、粘度が５００ｍＰａ・ｓ以下であることが好ましい。このようにすると、デジタルＰＣＲ用デバイス１０１のインレット１０２、流路１０４などに光硬化樹脂を容易に導入することができる。光硬化樹脂は、光重合反応を開始させる任意の光開始剤とともに用いられることが好ましい。光硬化は、例えば、波長２５０～６００ｎｍの紫外光を照射することにより行うとよい。本実施形態では、液体状態で光硬化樹脂を流路１０４に流入させた後、紫外光を当てることにより硬化させるとよい。これにより、ウエル１０５は密閉される。光硬化樹脂およびその使用方法などは、国際公開第２０２４／１２１９５９号を参照することができる。
　オイルとしては、例えば、シリコーン系のオイルや、フロリナート系のオイルが用いられる。
　前記したようにして気泡１１０が生じた場合は、蛍光計測を実施する際に、励起光が気泡１１０の界面において散乱される。また、気泡１１０部分はサンプル溶液１０８を含まないため蛍光強度が弱くなる。従って、気泡１１０によって、ウエル１０５が発する蛍光強度がばらつきを持ち、正確なポジティブ、ネガティブの判定が難しくなる。
　本実施形態に係るデジタルＰＣＲシステム２００では、ウエル１０５内の微小な気泡１１０を認識し、そのウエル１０５の蛍光強度の代表値を補正することにより、気泡１１０が生じた場合であっても蛍光強度を正確に算出し、対象核酸の濃度を正確に算出できる。
　次に、図４～図６を参照して、ウエル１０５内に微小な気泡１１０が生じていた場合において、蛍光強度を正確に算出し、対象核酸の濃度を正確に算出する手順について説明する。図４は、画像からウエル１０５の位置を検出する手順の一例を説明するフローチャートである。
　図４に示すように、まず、データ解析部２０３（制御部）は、撮像した画像から回転成分を除去する（Ｓ４０１）。つまり、ウエル１０５のエッジ（辺）が鉛直方向および水平方向となるように回転させる。これにより、前記したように、回転成分が除去される。
　次に、データ解析部２０３は、歪み成分を除去する（Ｓ４０２）。つまり、ウエル１０５のエッジが直線状となるように補正する。
　次に、データ解析部２０３は、バックグランドを除去する（Ｓ４０３）。これにより、ウエル１０５以外の影響、例えば、ノイズなどを除去することができる。
　次に、データ解析部２０３は、これらの手順を行ったウエル１０５の位置を検出する（Ｓ４０４）。
　図５は、ウエル１０５の位置を認識する手順の一例を説明するフローチャートである。
　図５に示すように、データ解析部２０３（制御部）は、画像を第１軸方向に投影し、投影ベクトルを作成する（Ｓ５０１）。ここで、投影ベクトルを作成するとは、各列および各行のウエル１０５の画像（ウエル１０５のエッジを含む画像）を縦方向であれば縦方向に、横方向であれば横方向に揃えて並べる（整列させる）という意味である。これは、例えば、図３（整列前）と後述する図９Ａ（整列後）とを見比べると分かりやすい。このようにすると、ウエル１０５があるところは明るくなり、ウエル１０５がないところは暗くなる。
　次に、データ解析部２０３は、そのベクトルの基本波の周波数を特定する（Ｓ５０２）。前記したようにして投影ベクトルを作成すると、本実施形態の場合は、矩形状のウエル１０５がある周波数をもって現れる。これにより、ある程度周期的な信号が表れるので、その周波数を特定する。なお、ウエル１０５のエッジ（辺）が鉛直方向および水平方向となっていないと、きれいな周期性が得られない。そのため、図４を参照して説明したようにウエル１０５の画像を回転させ、また、前記したように投影ベクトルを作成して、その周期を求める。
　次に、データ解析部２０３は、基本波の局所ピークを検出する（Ｓ５０３）。局所ピークは、ウエル１０５がなく、暗くなっている箇所に該当する。これにより、ウエル１０５の例えば列を認識する。
　次に、データ解析部２０３は、その局所ピークの前後を探索し、ウエル１０５の端点を検出する（Ｓ５０４）。これにより、データ解析部２０３は、第１軸方向のウエル１０５の位置を検出する。
　次に、データ解析部２０３は、同様に第２軸方向のウエル１０５の位置を検出する（Ｓ５０５）。つまり、データ解析部２０３は、第２軸方向について、Ｓ５０１～Ｓ５０４を同様に行い、第２軸方向のウエル１０５の位置を検出する。
　次に、データ解析部２０３は、第１軸方向、第２軸方向のウエル１０５の位置を合わせてウエル１０５の位置を認識する（Ｓ５０６）。
　本実施形態では、認識したウエル１０５の位置の画像を用いてそのウエル画像内の異常を認識する。なお、前記した異常としては、例えば、気泡１１０が挙げられる。以下、異常について気泡１１０を例に挙げて説明する。また、ウエル画像とは、前述の認識したウエル１０５の位置の画像、つまり、各々のウエル１０５を列方向および行方向に整列させた画像である（例えば、図９Ａ参照）。気泡１１０の認識の方法の一例を示すと以下のとおりとなる。図６は、気泡１１０を認識する手順の一例を説明するフローチャートである。図７は、ネットワークの一構成例を説明する概念図である。
　図６に示すように、本実施形態では、まず、準備として、学習データを用いてネットワークを学習する（Ｓ６０１）。つまり、本実施形態においては、気泡１１０の有無および気泡１１０の位置の認識は、データ解析部２０３が正常なウエル１０５の画像を入力して学習した機械学習を用い、気泡１１０があるウエル１０５および気泡１１０の位置を認識する。なお、前記したネットワークとしては、例えば、図７に示すＳＳＩＭ（Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ　ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ　ｉｎｄｅｘ　ｍｅａｓｕｒｅ）オートエンコーダのネットワークを用いるとよい。図７に示すように、データ解析部２０３は、まず、エンコーダにより、入力画像を低次元化する。具体的には、特徴量（潜在変数）として例えば分散μ（標準偏差）、母平均σ、ランダムサンプリングなどを用いた畳み込みニューラルネットワーク（ＣＮＮ）などを用い、画像の特徴を抽出する。デコーダでは、エンコーダで得られた潜在表現をもとの画像に復元する。学習は、元の画像との構造的な類似性を最大化するように行う。本実施形態では、ＳＳＩＭ指標を損失関数として使用することで、画像の構造的な情報や画像間の相関性を考慮して学習を行う。この学習データとしては、気泡１１０が生じていない画像（正常画像と称する）を用いる。学習データの入力画像として正常画像を用いて学習させることにより、ウエル１０５に気泡１１０がなく、一様な蛍光強度を持つ出力画像（学習データ）が正解画像となる（図８Ａ）。なお、図８Ａは、学習データである入力画像から学習データである出力画像（正解画像）が得られるように学習させたネットワークについて説明する概念図である。
　次に、本実施形態では、このように学習させたネットワークに対し、検出用のウエル画像を入力し、出力画像を取得する（Ｓ６０２）。このようにすると、出力画像として正常な成分が抽出される（図８Ｂ）。すなわち、気泡１１０のような異常部分が除去され周囲と同様となったウエル画像が出力される。なお、図８Ｂは、学習させたネットワークに気泡１１０のような異常部分を含む入力画像を入力し、出力画像を得ることを説明する概念図である。
　次に、本実施形態では、撮像したウエル画像の入力画像と出力画像の差分をＳＳＩＭで評価する（Ｓ６０３）。ここでは例えば、ピクセルごとにピクセル近傍画像のＳＳＩＭを計算する。前記した差分が大きい画素は類似度が低く、ＳＳＩＭが小さい画素となる。
　そして、類似度の低い（ＳＳＩＭが小さい）ピクセルを異常（気泡１１０）と認識する（Ｓ６０４）。従って、オートエンコーダの入力画像および出力画像からＳＳＩＭ画像を求めることができる。また、ＳＳＩＭ画像を２値化すると、異常ピクセル、すなわち、気泡１１０がより認識し易くなる（図８Ｃ）。なお、図８Ｃは、図８Ｂにおける出力画像（ウエル画像）および入力画像（ウエル画像）と、ＳＳＩＭ画像とを対比した図である。
　図９に、ウエル画像から気泡１１０を認識する例を示す。図９Ａは、ＳＳＩＭオートエンコーダに入力する入力画像（ウエル画像）の一例を示す図である。図９Ａは、ウエル１０５の画像を並べて表示しており、ウエル１０５ごとに正規化した画像である。図９Ａに示すように、ウエル１０５が規則正しく（周期的に）並べられている。図９Ｂは、オートエンコーダの入力画像および出力画像から求めたＳＳＩＭ画像である。図９ＢのＳＳＩＭ画像に示すように、気泡１１０がある箇所のような、一様でない、異常な成分（異常ピクセル）が抽出できる。図９Ｃは、ＳＳＩＭ画像を２値化し、異常ピクセルと判定されたピクセルを示す図である。図９Ｃに示すように（また、図８Ｃを参照して説明したように）、ＳＳＩＭ画像を２値化すると、異常ピクセル、すなわち、気泡１１０がより容易にかつ確実に認識できるようになる。また、図９Ｄは、異常ピクセルと判定されたピクセルを、元のウエル画像に色付けして上書きした画像である。図９Ｄに示すように、元のウエル画像に関して、気泡１１０のある異常ピクセルを認識できていることがわかる。
　このように気泡１１０が認識できれば、その影響を補正することが可能となる。例えば、異常ピクセルと判定されたピクセルを除外して、ウエル１０５の蛍光強度の代表値を定める。なお、代表値としては、例えば、平均値や中央値などを用いることができる。また、オートエンコーダの出力画像をウエル画像として代表値を抽出してもよい。
　図１０Ａは、気泡ありと判別されたウエル１０５および気泡なしと判別されたウエル１０５の平均強度（蛍光強度の平均）を示すヒストグラムである。図１０Ｂは、気泡ありと判別されたウエル１０５について気泡１１０の影響を補正する前と補正した後の平均強度（蛍光強度の平均）を示すヒストグラムである。
　図１０Ａに示すように、気泡１１０の有無により平均強度の分布が異なっていることがわかる。ここで、気泡ありと判別されたウエル１０５の代表値を前述したようにして補正する。図１０Ｂに示すように、この補正により、気泡ありと判別されたウエル１０５の平均強度の分布（補正前）は、図１０Ａに示す気泡なしと判別されたウエル１０５の平均強度の分布と同様な分布（補正後）となる。このことから、補正により気泡１１０の影響を除外できていることがわかる。
　以上に説明したように、デジタルＰＣＲシステム２００は、複数のウエル１０５内の対象核酸の有無を判別するとともに、異常（気泡１１０）を認識してその影響を除去し、異常を有するウエル１０５の蛍光強度の代表値を補正する。これにより、ウエル１０５の蛍光強度を算出する精度が向上する。つまり、代表値の補正により、高精度に蛍光強度が測定されているのと等しくなる。従って、ポジティブ、ネガティブの判定精度も向上する。また、デジタルＰＣＲシステム２００は、気泡１１０が生じたウエル１０５も解析に使用できることから、解析可能なウエル数を維持することができる。従って、デジタルＰＣＲシステム２００は、対象核酸を導入するウエル１０５内に異常が生じた場合であっても、高精度に対象核酸の濃度を計測できる。
　なお、前記した実施形態では、ウエル１０５内の異常を気泡１１０として説明したが、これに限定されるものではなく、サンプル溶液１０８とは異なる物質であれば、同様に認識することができる。例えば、ウエル１０５内の一部に分離液１０９であるオイルが侵入した場合には、本実施形態において気泡１１０について説明したのと同様にして、オイルに関する異常ピクセルを認識し、補正することにより、より正確な蛍光強度を得ることができる。従って、そのような場合でも、本実施形態は、高精度に対象核酸の濃度を計測できる。
（第２実施形態）
　図１１を参照して、第２実施形態に係るデジタルＰＣＲシステム２００について説明する。図１１は、第２実施形態に係るデジタルＰＣＲシステム２００における処理内容を説明するフローチャートである。第１実施形態で説明した気泡１１０を認識して蛍光強度の代表値を補正する方式は、図１１を参照して説明する各ウエル１０５の融解温度を計測する場合においても有用である。図１１に示す処理内容を行えば、ＰＣＲ後の各ウエル１０５の融解温度を計測することができる。なお、第２実施形態におけるデジタルＰＣＲシステム２００の構成は、第１実施形態と同様である。
　図１１に示すように、まず、サンプル溶液１０８を各ウエル１０５に導入し、分割を行う（Ｓ１１０１）。その後、ＰＣＲを行い、対象核酸を増幅する（Ｓ１１０２）。その後、温調器２０１によりデジタルＰＣＲ用デバイス１０１の温度を制御しながら、蛍光計測することにより、各ウエル１０５の蛍光画像の温度依存性を計測する（Ｓ１１０３）。
　蛍光画像の温度依存性は以下のようにして計測することができる。サンプル溶液１０８には、前述したように、対象核酸、ＰＣＲ増幅用の酵素、バッファ、プライマ、ｄＮＴＰ、および、プローブが含まれている。本実施形態では、フォワードプライマとリバースプライマの濃度に差をつけることにより非対称ＰＣＲを行い、プローブと相補的な配列を持つ増幅産物１２０１（図１２Ａ参照）を生成する。なお、図１２Ａは、蛍光強度の温度依存性の一例を説明する説明図である。図１２Ａの左上の説明図に示すように、増幅産物１２０１は、低温ではプローブ１２０２とハイブリダイゼーションする。プローブ１２０２には、その末端に、蛍光色素１２０３とクエンチャー１２０４とが付いている。プローブ１２０２は、増幅産物１２０１と結合することにより、蛍光色素１２０３とクエンチャー１２０４とが離れ、蛍光を発するようになる。つまり、蛍光強度が高くなる。また、図１２Ａの右下の説明図に示すように、高温になり、サンプル溶液１０８の温度が、増幅産物１２０１とプローブ１２０２の配列とで決まる融解温度を超えると、増幅産物１２０１とプローブ１２０２は解離する。その結果、プローブ１２０２の蛍光色素１２０３の近傍にクエンチャー１２０４が配置され、蛍光強度が低くなる。
　前記したように、融解温度は、対象核酸の増幅産物１２０１とプローブ１２０２の配列により決まる。従って、融解曲線を計測して融解温度を算出することにより、対象核酸を判別することができる。一例として、対象核酸の野生型と変異型とを増幅させ、それぞれと相補的な配列を持つプローブを用いれば、図１２Ａに示したような、融解温度の異なる融解曲線１２０５および融解曲線１２０６が得られる。本実施形態では、この融解曲線を微分した微分曲線１２０７および微分曲線１２０８を得（図１２Ｂ）、そのピークとして融解温度１２０９および融解温度１２１０を算出する（Ｓ１１０５）。なお、図１２Ｂは、融解曲線を微分した微分曲線の一例を説明する説明図である。これにより、各ウエル１０５に導入された対象核酸を判別することができる（Ｓ１１０６）。
　第２実施形態におけるこのような融解温度の計算においても、第１実施形態で説明したデジタルＰＣＲシステム２００は有用である。具体的には、第１実施形態と同様に、蛍光画像（ウエル画像）から各ウエル１０５内の気泡１１０の有無と異常ピクセルを認識した後に、気泡１１０の影響を除去するように各ウエル１０５の蛍光強度の代表値を求める。本実施形態では、この処理を、計測した温度に対応する蛍光画像に対して繰り返す。このようにして、気泡１１０の影響を除外しながら、融解曲線、微分曲線、融解温度を算出することにより、精度よく融解温度を求めることができる。気泡１１０の影響がある場合、その散乱光の影響や、温度変化時の気泡１１０の移動により、融解曲線の計測にノイズが重畳される。このため、算出する融解温度に誤差が生じる。従って、対象核酸の判別精度が落ちる場合がある。第２実施形態では、気泡１１０の影響を除去して正確に蛍光強度および融解温度を算出することにより、対象核酸を正確に判別することができる。例えば、野生型と変異型とを正確に判別することができる。
＜対象核酸検出方法＞
　次に、図１３を参照して、対象核酸検出方法（以下、「本方法」と称することがある）の一実施形態について説明する。図１３は、本実施形態に係る対象核酸検出方法の内容を説明するフローチャートである。本方法は、デジタルＰＣＲによりサンプル溶液１０８中の対象核酸を検出するものである。
　図１３に示すように、本方法は、以下のａ）～ｇ）工程を有する。
　ａ）工程は、分割工程である（Ｓ１３０１）。ａ）工程では、サンプル溶液１０８を複数のウエル１０５に分割する。複数のウエル１０５の分割は、オイルや光硬化樹脂などの分離液１０９により行う。このａ）工程と下記のｂ）工程との間でＰＣＲが行われる。
　ｂ）工程は、撮像工程である（Ｓ１３０２）。ｂ）工程では、複数のウエル１０５を含む画像を撮像する。画像の撮像は、蛍光検出器２０２（撮像装置）が行う。
　ｃ）工程は、第１認識工程である（Ｓ１３０３）。ｃ）工程では、撮像した画像内の複数のウエル１０５の位置を認識する。ｃ）工程は、図４および図５を参照して説明したように、Ｓ４０１～Ｓ４０４の各工程およびＳ５０１～Ｓ５０６の各工程により行う。
　ｄ）工程は、第２認識工程である（Ｓ１３０４）。ｄ）工程では、各々のウエル１０５に含まれる異常（気泡１１０）の有無およびウエル１０５内における異常の位置を認識する。ｄ）工程は、図６を参照して説明したように、Ｓ６０１～Ｓ６０４の各工程により行う。
　ｅ）工程は、算出工程である（Ｓ１３０５）。ｅ）工程では、各々のウエル１０５の蛍光強度の代表値を算出する。蛍光強度の代表値は、例えば、蛍光強度の平均値や中央値などが挙げられる。
　ｆ）工程は、補正工程である（Ｓ１３０６）。ｆ）工程では、異常を有するウエル１０５の蛍光強度の代表値を補正する。代表値の補正は、例えば、ウエル１０５の異常部分（異常ピクセル）を取り除くことにより行うことができる。つまり、補正後の代表値は、ウエル１０５の異常部分を取り除いた蛍光強度の平均値や中央値などとなる。
　ｇ）工程は、判別工程である（Ｓ１３０７）。ｇ）工程では、複数のウエル１０５内の対象核酸の有無を判別する。対象核酸の有無は、蛍光強度が計測されているか否かまたは蛍光強度が所定の閾値よりも高かったか否かで判別できる。
　なお、ｃ）～ｇ）工程は、データ解析部２０３（制御部）が行う。
　以上に説明したように、本方法は、複数のウエル１０５内の対象核酸の有無を判別するとともに、異常（気泡１１０）を認識してその影響を除去し、異常を有するウエル１０５の蛍光強度の代表値を補正する。これにより、ウエル１０５の蛍光強度を算出する精度が向上する。つまり、代表値の補正により、高精度に蛍光強度が測定されているのと等しくなる。従って、ポジティブ、ネガティブの判定精度も向上する。また、本方法は、気泡１１０が生じたウエル１０５も解析に使用できることから、解析可能なウエル数を維持することができる。従って、本方法は、対象核酸を導入するウエル１０５内に異常が生じた場合であっても、高精度に対象核酸の濃度を計測できる。
＜対象核酸検出記憶媒体＞
　次に、図１４を参照して、対象核酸検出記憶媒体（以下、「本記憶媒体」と称することがある）１４００の一実施形態について説明する。図１４は、本実施形態に係る対象核酸検出記憶媒体１４００の構成とデータ解析部をなすコンピュータ１０の構成を説明する構成図である。本記憶媒体１４００は、デジタルＰＣＲによりサンプル溶液１０８中の対象核酸を検出するために用いられる。本記憶媒体１４００は、サンプル溶液１０８が導入された複数のウエル１０５を含む画像を撮像した後に、コンピュータ１０に、具体的にはデータ解析部２０３（制御部）に、図１４に示す各工程を実行させるためのプログラムを記録した、コンピュータ１０が読み取り可能なものである。なお、本記憶媒体１４００におけるｃ）～ｇ）工程（Ｓ１４０３～Ｓ１４０７）は、前述した本方法のｃ）～ｇ）工程（Ｓ１３０３～Ｓ１３０７）と同様である。
　まず、コンピュータ１０について説明する。図１４に示すように、コンピュータ１０は、ＣＰＵ１１と、ＲＡＭ１４と、ＲＯＭ１５と、ＨＤＤ１６と、通信Ｉ／Ｆ１７と、入出力Ｉ／Ｆ１８と、メディアＩ／Ｆ１９とを備える。通信Ｉ／Ｆ１７は、通信回路２０に接続される。入出力Ｉ／Ｆ１８は、入出力装置２１に接続される。メディアＩ／Ｆ１９は、記録媒体２２からデータを読み書きする。
　ＲＯＭ１５には、ＣＰＵ１１によって実行されるアプリケーションプログラム、各種データなどが格納されている。ＨＤＤ１６には、画像データや各種データ、制御プログラムなどが適宜保存される。なお、ＨＤＤ１６は、ソリッドステートドライブ（ＳＳＤ）などであってもよい。ＣＰＵ１１は、ＲＡＭ１４に読み込んだアプリケーションプログラムを実行することにより、各種機能を実現する。デジタルＰＣＲシステム２００（図１４において図示せず）は、通信回路２０および通信Ｉ／Ｆ１７を介して１台のコンピュータ１０と接続されていてもよく、複数のコンピュータ１０と接続されていてもよい。
　コンピュータ１０は、プロセッサ（例えば、ＣＰＵ、ＧＰＵ）によりプログラムを実行し、記憶資源（例えば、メモリ）やインターフェースデバイス（例えば、通信Ｉ／Ｆ１７）などを用いながら、プログラムで定められた処理を行う。そのため、プログラムを実行して行う処理の主体を、プロセッサとしてもよい。同様に、プログラムを実行して行う処理の主体が、プロセッサを有するコントローラ、装置、システム、コンピュータ、ノードであってもよい。プログラムを実行して行う処理の主体は、制御部であればよく、特定の処理を行う専用回路を含んでいてもよい。専用回路としては、例えばＦＰＧＡ（Ｆｉｅｌｄ　Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ　Ｇａｔｅ　Ａｒｒａｙ）やＡＳＩＣ（Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ　Ｃｉｒｃｕｉｔ）、ＣＰＬＤ（Ｃｏｍｐｌｅｘ　Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ　Ｌｏｇｉｃ　Ｄｅｖｉｃｅ）などが挙げられる。
　本記憶媒体１４００に記憶されたプログラムをはじめとする各種のプログラムは、プログラムソースからコンピュータ１０にインストールされてもよい。プログラムソースは、例えば、プログラム配布サーバまたはコンピュータが読み取り可能な記憶媒体であってもよい（この記憶媒体には、本記憶媒体１４００が含まれていてもよい）。プログラムソースがプログラム配布サーバの場合、プログラム配布サーバはプロセッサと配布対象のプログラムを記憶する記憶資源を含み、プログラム配布サーバのプロセッサが配布対象のプログラムを他のコンピュータに配布してもよい。また、実施形態において、２以上のプログラムが１つのプログラムとして実現されてもよいし、１つのプログラムが２以上のプログラムとして実現されてもよい。
　次に、本記憶媒体１４００におけるｃ）～ｇ）工程（Ｓ１４０３～Ｓ１４０７）について説明する。
　図１４に示すように、ｃ）工程は、第１認識工程である（Ｓ１４０３）。ｃ）工程では、撮像した画像内の複数のウエル１０５の位置を認識する。ｃ）工程は、図４および図５を参照して説明したように、Ｓ４０１～Ｓ４０４の各工程およびＳ５０１～Ｓ５０６の各工程により行う。
　ｄ）工程は、第２認識工程である（Ｓ１４０４）。ｄ）工程では、各々のウエル１０５に含まれる異常（気泡１１０）の有無およびウエル１０５内における異常の位置を認識する。ｄ）工程は、図６を参照して説明したように、Ｓ６０１～Ｓ６０４の各工程により行う。
　ｅ）工程は、算出工程である（Ｓ１４０５）。ｅ）工程では、各々のウエル１０５の蛍光強度の代表値を算出する。蛍光強度の代表値は、例えば、蛍光強度の平均値や中央値などが挙げられる。
　ｆ）工程は、補正工程である（Ｓ１４０６）。ｆ）工程では、異常を有するウエル１０５の蛍光強度の代表値を補正する。代表値の補正は、例えば、ウエル１０５の異常部分（異常ピクセル）を取り除くことにより行うことができる。つまり、補正後の代表値は、ウエル１０５の異常部分を取り除いた蛍光強度の平均値や中央値などとなる。
　ｇ）工程は、判別工程である（Ｓ１４０７）。ｇ）工程では、複数のウエル１０５内の対象核酸の有無を判別する。対象核酸の有無は、蛍光強度が計測されているか否かまたは蛍光強度が所定の閾値よりも高かったか否かで判別できる。
　なお、本記憶媒体１４００は、コンピュータ１０の内部に備えられていてもよいし、通信Ｉ／Ｆ１７やメディアＩ／Ｆ１９などを通じてコンピュータ１０の外部に備えられていてもよい。
　以上に説明したように、本記憶媒体１４００は、コンピュータ１０を実行して、複数のウエル１０５内の対象核酸の有無を判別するとともに、異常（気泡１１０）を認識してその影響を除去し、異常を有するウエル１０５の蛍光強度の代表値を補正する。これにより、ウエル１０５の蛍光強度を算出する精度が向上する。つまり、代表値の補正により、高精度に蛍光強度が測定されているのと等しくなる。従って、ポジティブ、ネガティブの判定精度も向上する。また、本記憶媒体１４００は、気泡１１０が生じたウエル１０５もコンピュータ１０で解析に使用できることから、解析可能なウエル数を維持することができる。従って、本記憶媒体１４００は、対象核酸を導入するウエル１０５内に異常が生じた場合であっても、高精度に対象核酸の濃度を計測できる。
　以上、本発明に係るデジタルＰＣＲシステム２００、対象核酸検出方法および対象核酸検出記憶媒体１４００について実施形態により詳細に説明したが、本発明は前記した実施形態に限定されるものではなく、様々な変形例が含まれる。例えば、前記した実施形態は本発明を分かり易く説明するために詳細に説明したものであり、必ずしも説明した全ての構成を備えるものに限定されるものではない。また、ある実施形態の構成の一部を他の実施形態の構成に置き換えることが可能であり、また、ある実施形態の構成に他の実施形態の構成を加えることも可能である。また、それぞれの実施形態の構成の一部について、他の構成の追加・削除・置換をすることが可能である。
　１０　　コンピュータ
　１０１　デジタルＰＣＲ用デバイス
　１０５、１０５ａ、１０５ｂ、１０５ｃ　ウエル
　１０８　サンプル溶液
　１１０　気泡（異常）
　２００　デジタルＰＣＲシステム
　２０２　蛍光検出器（撮像装置）
　２０３　データ解析部（制御部）
　１２０９　融解温度
　１２１０　融解温度
　１４００　対象核酸検出記憶媒体（本記憶媒体）

Claims (6)

  1. 　デジタルＰＣＲによりサンプル溶液中の対象核酸を検出するシステムであり、
    　前記サンプル溶液が導入された複数のウエルを含む画像を撮像する撮像装置と、
    　前記画像内の前記複数のウエルの位置を認識し、各々の前記ウエルに含まれる異常の有無および前記ウエル内における前記異常の位置を認識し、各々の前記ウエルの蛍光強度の代表値を算出し、前記異常を有するウエルの前記蛍光強度の代表値を補正し、前記複数のウエル内の対象核酸の有無を判別する制御部と、
    　を有する、デジタルＰＣＲシステム。
  2. 　請求項１に記載のデジタルＰＣＲシステムであって、
    　前記異常の有無および前記異常の位置の認識は、前記制御部が正常なウエルの画像を入力して学習した機械学習を用い、前記異常の有るウエルおよび前記異常の位置を認識する、デジタルＰＣＲシステム。
  3. 　請求項１に記載のデジタルＰＣＲシステムであって、
    　前記サンプル溶液を前記複数のウエルに分割するための分離液として光硬化樹脂が用いられ、
    　前記光硬化樹脂を硬化することにより前記ウエルを分割する、デジタルＰＣＲシステム。
  4. 　請求項１に記載のデジタルＰＣＲシステムであって、
    　前記制御部が、前記画像の温度依存性を取得し、補正後の前記蛍光強度の代表値を用いて前記対象核酸の融解温度を算出する、デジタルＰＣＲシステム。
  5. 　デジタルＰＣＲによりサンプル溶液中の対象核酸を検出する方法であり、
    　ａ）前記サンプル溶液を複数のウエルに分割する工程、
    　ｂ）前記複数のウエルを含む画像を撮像する工程、
    　ｃ）前記画像内の前記複数のウエルの位置を認識する工程、
    　ｄ）各々の前記ウエルに含まれる異常の有無および前記ウエル内における前記異常の位置を認識する工程、
    　ｅ）各々の前記ウエルの蛍光強度の代表値を算出する工程、
    　ｆ）前記異常を有するウエルの前記蛍光強度の代表値を補正する工程、および
    　ｇ）前記複数のウエル内の対象核酸の有無を判別する工程
    　を有する、対象核酸検出方法。
  6. 　デジタルＰＣＲによりサンプル溶液中の対象核酸を検出するための記憶媒体であり、
    　前記サンプル溶液が導入された複数のウエルを含む画像を撮像した後に、
    　コンピュータに、
    　ｃ）前記画像内の前記複数のウエルの位置を認識する工程、
    　ｄ）各々の前記ウエルに含まれる異常の有無および前記ウエル内における前記異常の位置を認識する工程、
    　ｅ）各々の前記ウエルの蛍光強度の代表値を算出する工程、
    　ｆ）前記異常を有するウエルの前記蛍光強度の代表値を補正する工程、
    　ｇ）前記複数のウエル内の対象核酸の有無を判別する工程
    　を実行させるためのプログラムを記録した、コンピュータ読み取り可能な対象核酸検出記憶媒体。
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