WO2026010299A1 - 노화 세포 제거를 위한 펩타이드 억제제, 및 이의 용도 - Google Patents

노화 세포 제거를 위한 펩타이드 억제제, 및 이의 용도

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WO2026010299A1
WO2026010299A1 PCT/KR2025/009272 KR2025009272W WO2026010299A1 WO 2026010299 A1 WO2026010299 A1 WO 2026010299A1 KR 2025009272 W KR2025009272 W KR 2025009272W WO 2026010299 A1 WO2026010299 A1 WO 2026010299A1
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peptide
disease
foxo4
tad
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Inventor
박진주
강동훈
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Gwangju Institute of Science and Technology
Original Assignee
Gwangju Institute of Science and Technology
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Publication date
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/10—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a tag for extracellular membrane crossing, e.g. TAT or VP22

Definitions

  • the present invention relates to peptide inhibitors targeting the FOXO4-p53 interaction for eliminating senescent cells, and uses thereof.
  • SASP senescence-associated secretory phenotype
  • Commonly used cancer treatments function to eliminate cancer cells by inducing DNA damage.
  • insufficient treatment can induce senescence in cancer cells instead of apoptosis.
  • the topoisomerase inhibitor doxorubicin induces DNA damage in cancer cells by interfering with topoisomerase, which unwinds supercoiled DNA.
  • low concentrations of doxorubicin do not induce apoptosis in cancer cells, but rather promote cellular senescence.
  • Senescent cancer cells induced after chemotherapy enhance the invasiveness and stemness of cancer cells, significantly contributing to cancer recurrence. Therefore, effective chemotherapy should aim to eliminate both cancer cells and senescent cancer cells, minimizing the risk of recurrence.
  • senescent cells are generally characterized by resistance to apoptosis
  • drugs targeting EPHB1, PI3K/AKT, and Bcl-2/Bcl-xL which are involved in the apoptosis-resistant pathway, have been developed.
  • drugs such as navitoclax and dastinib also affect normal cells, causing side effects such as thrombocytopenia, neutropenia, and pulmonary hypertension.
  • FOXO4 is a forkhead box O transcription factor that mediates various signals to maintain cellular homeostasis.
  • FOXO4 is expressed in senescent cells and promyelocytic leukemia (PML) cells and interacts with p53 to inhibit its nuclear export. Consequently, this interaction inhibits p53-induced apoptosis in senescent cells in the mitochondria. Furthermore, the FOXO4-p53 interaction contributes to the maintenance of senescent cells by activating the transcription of p21cip1, a common target gene that suppresses apoptosis. FOXO4, in particular, is a promising target for the removal of senescent cells. FOXO4 expression is low in normal cells, but its expression is significantly increased in senescent cells. Several protein-protein interaction inhibitors have been developed using this characteristic.
  • FOXO4-D-Retro-Inverso inhibits the FOXO4-p53 interaction and induces selective apoptosis in senescent cells.
  • FOXO4-DRI has the problem of being expensive to synthesize due to its long 46 amino acids and D-form amino acids, and it targets p53, a tumor suppressor that can cause various side effects in clinical trials.
  • Another drug, ES2 targets FOXO4 conserved region 3 (CR3), but has significantly lower selectivity than FOXO4-DRI.
  • the present invention has been made to solve the above problems, and relates to a novel peptide inhibitor targeting the FOXO4-p53 interaction for eliminating senescent cells, and uses thereof.
  • the peptide inhibitor of the present invention is designed based on the p53 TAD (transactivation domain) sequence, exhibits strong selectivity for senescent cells, is economical to synthesize due to its short length and composition of L-type amino acids, and has the effect of efficiently interfering with the FOXO4-p53 interaction despite its short length and composition of L-type amino acids. Therefore, the peptide inhibitor of the present invention is expected to be widely utilized in various health/medical fields where senescent cell removal is required.
  • the present invention has been devised to solve the above-mentioned problems in conventional technology.
  • a modified peptide in which any one of the amino acids at positions 42 to 57 from the N-terminus within the p53 transactivation domain region is substituted with alanine.
  • a vector comprising a nucleic acid molecule encoding a modified peptide in which any one of the amino acids at positions 42 to 57 from the N-terminus within the p53 transactivation domain region is substituted with alanine.
  • a transformant is provided that is transformed with a vector comprising a nucleic acid molecule encoding a modified peptide in which any one of the amino acids at positions 42 to 57 from the N-terminus in the p53 transactivation domain region is substituted with alanine.
  • a pharmaceutical composition for preventing or treating an aging disease which comprises as an active ingredient a modified peptide in which any one of the amino acids at positions 42 to 57 from the N-terminus in the p53 transactivation domain region is substituted with alanine.
  • the modified peptide may include SEQ ID NO: 15.
  • the present invention provides a modified peptide in which any one of the amino acids at positions 42 to 57 from the N-terminus within the p53 transactivation domain region is substituted with alanine.
  • the peptide refers to a polymer of amino acids, in which the linkage between amino acids is formed by an amide bond or a peptide bond.
  • the modified peptide refers to a case where one or more amino acids in a natural peptide are substituted with other amino acids, deleted, inverted, or inserted through artificial manipulation.
  • the modified peptide may be a fragment of a certain portion extracted from a natural peptide through artificial manipulation.
  • the modified peptide in which any one of the amino acids at positions 42 to 57 from the N-terminus in the p53 transactivation domain region of the present invention is substituted with alanine may be represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 15, but is not limited thereto.
  • the modified peptide in which any one of the amino acids at positions 42 to 57 from the N-terminus in the p53 transactivation domain region of the present invention is substituted with alanine may be a peptide in which any one of the amino acids at positions 42, 48, 49, 51, 56, and 57 from the N-terminus in the p53 transactivation domain region is substituted with alanine, and this may preferably be represented by any one of SEQ ID NOs: 2, 6, 7, 8, 13, 14, and 15, and most preferably may be represented by SEQ ID NO: 15, but is not limited thereto.
  • the modified peptide in which any one of the amino acids at positions 42 to 57 from the N-terminus in the p53 transactivation domain region of the present invention is substituted with alanine, may additionally include a hydrophobic sequence or a cell-penetrating peptide (CPP) sequence at the N-terminus or the C-terminus.
  • CPP cell-penetrating peptide
  • the cell-penetrating peptide refers to a peptide composed of 3 to 30 amino acids that binds to various substances such as proteins, peptides, and DNA and allows the substances to move into cells without a special receptor.
  • it may be a sequence as described in Table 1 below, but is not limited as long as it is a domain that can promote cell membrane penetration or intercellular movement of the desired peptide.
  • a modified peptide in which any one of the amino acids at positions 42 to 57 from the N-terminus in the p53 transactivation domain region additionally including a hydrophobic sequence or a CPP sequence at the N-terminus or C-terminus is substituted with alanine may preferably be represented by SEQ ID NO: 16 or 17, but is not limited thereto.
  • the present invention provides a vector comprising a nucleic acid molecule encoding a modified peptide in which any one of the amino acids at positions 42 to 57 from the N-terminus within the p53 transactivation domain region is substituted with alanine.
  • the nucleic acid refers to a polymer organic substance in which nucleotides are polymerized in a long chain shape, and refers to genetic information encoding the peptide of the present invention.
  • the vector is a means for introducing into a cell to express a protein
  • a known recombinant vector such as a plasmid vector, a cosmid vector, a bacteriophage vector, etc. can be used, and can be easily produced by a person skilled in the art using DNA recombination technology according to any method known in the field to which the present invention pertains.
  • vector in the present invention may be selected from the group consisting of commercially widely used pCDNA vectors, F, R1, RP1, Col, pBR322, ToL, Ti vectors, cosmids, lambda, lambdoid, M13, Mu, p1 P22, Q ⁇ , T-even, T2, T3, T7, etc. phages, and plant viruses, but are not limited thereto.
  • a suitable recombinant vector can be selected depending on the properties of the host cell (prokaryotic cell or prokaryotic cell).
  • the present invention provides a transformant transformed with a vector comprising a nucleic acid molecule encoding a modified peptide in which any one of the amino acids at positions 42 to 57 from the N-terminus within the p53 transactivation domain region is substituted with alanine.
  • the transformation can be performed by any method known to those skilled in the art for introducing a nucleic acid molecule into a cell, preferably a eukaryotic cell such as a mammalian cell.
  • a eukaryotic cell such as a mammalian cell.
  • Such methods include, for example, electroporation, lipofection based on cationic lipids and/or liposomes, calcium phosphate precipitation, nanoparticle-based transfection, virus-based transfection, or cationic polymer-based transfection such as DEAE-dextran or polyethyleneimine.
  • the transformation can be performed using a virus, for example, a lentivirus.
  • An introduced subject whose original trait has been changed by being transformed by the above method is called a transformant.
  • the transformant may be, but is not limited to, a virus, a bacterium, a plant cell, or an animal cell.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating aging diseases, comprising as an active ingredient a modified peptide in which any one of the amino acids at positions 42 to 57 from the N-terminus in the p53 transactivation domain region is substituted with alanine.
  • the aging disease refers to a disease caused by the accumulation of aging, and may include, for example, cancer, diabetes, hypertension, arthritis, osteoporosis, sarcopenia, glomerulonephritis, chronic renal failure, asthma, chronic emphysema, pulmonary embolism, pneumonia, chronic allergies, cataracts, glaucoma, retinal degeneration, hearing loss, aortic disease, arteriosclerosis, heart failure, ischemic heart disease, arrhythmia, peripheral vascular disease and valvular disease, depression, delirium, emotional and behavioral disorders, senile dementia, Parkinson's disease, skin aging disease, etc., and the skin aging disease may include, but is not limited to, wrinkles, freckles, liver spots, dry skin, actinic keratosis, sagging skin, etc., and most preferably, cancer.
  • the cancer refers to a disease characterized by uncontrolled cell growth, and refers to a cell mass called a tumor formed by such abnormal cell growth, which infiltrates surrounding tissues and, in severe cases, metastasizes to other organs of the body. Academically, it is also called a neoplasm. Cancer is an incurable chronic disease that often fails to achieve a fundamental cure even with surgery, radiation, and chemotherapy, causing suffering to patients and ultimately leading to death. There are various factors that cause cancer, but they are divided into intrinsic and extrinsic factors. The exact mechanism by which normal cells transform into cancer cells is not yet known, but it is known that a significant number of cancers are caused by external factors such as environmental factors.
  • Intrinsic factors include genetic factors and immunological factors, while extrinsic factors include chemicals, radiation, and viruses.
  • Genes involved in the development of cancer include oncogenes and tumor suppressor genes. Cancer occurs when the balance between these genes is disrupted by the internal or external factors described above.
  • the cancer may preferably be breast cancer, uterine cancer, esophageal cancer, stomach cancer, brain cancer, rectal cancer, colon cancer, lung cancer, skin cancer, ovarian cancer, cervical cancer, kidney cancer, blood cancer, pancreatic cancer, prostate cancer, testicular cancer, laryngeal cancer, oral cancer, head and neck cancer, thyroid cancer, liver cancer, bladder cancer, osteosarcoma, lymphoma, melanoma, leukemia, etc., but is not limited thereto if the type of cancer is such.
  • the pharmaceutical composition refers to a composition administered for a specific purpose.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is used for the prevention or treatment of aging diseases, specifically, and the cancer treatment may be to inhibit the proliferation of cancer or to inhibit the metastasis of cancer.
  • the pharmaceutical composition may be formulated and used in the form of oral dosage forms such as powders, granules, capsules, tablets, and aqueous suspensions, as well as topical preparations, suppositories, and sterile injectable solutions, according to conventional methods, but is not limited thereto.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may include a pharmaceutically acceptable carrier.
  • Pharmaceutically acceptable carriers may include binders, lubricants, disintegrants, excipients, solubilizers, dispersants, stabilizers, suspending agents, coloring agents, and fragrances for oral administration, and buffers, preservatives, analgesics, solubilizers, isotonic agents, and stabilizers may be mixed and used for injections, and bases, excipients, lubricants, and preservatives may be used for topical administration.
  • the formulation of the pharmaceutical composition of the present invention can be prepared in various ways by mixing it with the pharmaceutically acceptable carriers described above.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be prepared in the form of tablets, troches, capsules, elixirs, suspensions, syrups, wafers, etc.
  • the injection may be prepared in the form of unit dose ampoules or multiple doses.
  • the composition may be formulated as a solution, suspension, tablet, capsule, sustained-release preparation, etc.
  • carriers, excipients, and diluents suitable for formulation include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, malditol, starch, acacia gum, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, water, methyl hydroxybenzoate, propyl hydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, or mineral oil.
  • fillers, anti-coagulants, lubricants, wetting agents, fragrances, emulsifiers, preservatives, and the like may be additionally included.
  • the routes of administration of the pharmaceutical composition include, but are not limited to, oral, intravenous, intramuscular, intraarterial, intramedullary, intrathecal, intracardiac, transdermal, subcutaneous, intraperitoneal, intranasal, enteral, topical, sublingual, or rectal administration. Oral or parenteral administration is preferred.
  • the present invention provides a method for treating an aging disease by administering to a subject in need of treatment for an aging disease a modified peptide in which any one of the amino acids at positions 42 to 57 from the N-terminus in the p53 transactivation domain region is substituted with alanine, or a pharmaceutical composition comprising the peptide.
  • the present invention provides a modified peptide in which any one of the amino acids at positions 42 to 57 from the N-terminus in the p53 transactivation domain region is substituted with alanine, or a use of a pharmaceutical composition comprising the peptide, for treating an aging disease.
  • the peptide inhibitor for eliminating senescent cells of the present invention is designed based on the p53 TAD (transactivation domain) sequence, exhibits strong selectivity for senescent cells, is economical to synthesize due to its short length and L-form amino acid composition, and is effective in efficiently interfering with the FOXO4-p53 interaction despite its short length and L-form amino acid composition. Therefore, the peptide inhibitor of the present invention is expected to be widely utilized in various health/medical fields where senescent cell removal is required.
  • Figure 1 shows the domain structures of the FOXO4 and p53 proteins.
  • the primary sequence of the p53 TAD is shown in Figure 1. Arrows connect domains known to interact.
  • the peptide sequence of the p53 TAD PEP is shown in red.
  • the abbreviations in Figure 1 are as follows:
  • TAD transactivation domain
  • PRD a proline-rich domain
  • DBD DNA binding domain
  • TD tetramerization domain
  • NRD negative regulatory domain
  • CR1 and CR3 transactivation domains
  • FHD forkhead domain
  • NLS nuclear localization sequence
  • NES nuclear export sequence
  • Figure 2 shows the observed interaction between FOXO4 FHD and p53 TAD.
  • the intensity ratio of FHD signals to residue number (I ox /I red ) plot for FHD complexed with TAD modified with S-(1-oxyl-2,2,5,5-tetramethyl-2,5-dihydro-1H-pyrrol-3-yl)methyl methanesulfonothioate (MTSL) at S46C is shown.
  • Figure 2a shows the I ox /I red and respective error bars according to the area, and the asterisk (*) indicates the expanded area due to the influence of MTSL.
  • Figure 2b is a paramagnetic relaxation enhancement (PRE) experimental model of FOXO4 FHD (PDB ID: 1E17), where I ox /I red ⁇ 0.2 is indicated in red, and hydrophobic residues with I ox /I red ⁇ 0.2 are indicated in blue.
  • Figure 2c shows the hetNOE values of the p53 TAD apo and the p53 TAD-FOXO4 FHD complex.
  • Figure 2d shows the difference in hetNOE values between the p53 TAD-FOXO4 FHD complex and the p53 TAD apo.
  • Figure 4 shows the results of a competitive FPA inhibition assay of an alanine-substituted peptide.
  • Figure 4 shows that increasing the concentration of the alanine-substituted peptide inhibits binding of FITC-labeled p53 TAD to FOXO4 FHD.
  • Figure 6 shows the validation results of candidate peptides in a doxorubicin-induced senescence model.
  • Figure 6a shows images of dividing and senescent A375 cells stained for senescence-associated beta-galactosidase (SA-b-gal).
  • Figure 6b shows the viability assay results of senescent and control A375 cells incubated with increasing doses of CPP-CAND and FOXO4-DRI ( ⁇ M).
  • Figure 6c shows the selectivity indices (SI) of FOXO4-DRI and CPP-CAND.
  • SI 50 and SI 75 reflect the changes in IC 50 and IC 75 values obtained from nonlinear regression analysis for both groups.
  • Figure 7 shows the viability analysis results of senescent and control A375 cells cultured with increasing doses of p53 TAD PEP and CAND ( ⁇ M) as additional validation results of candidate peptides in a doxorubicin-induced senescence model.
  • Figure 8 shows that inhibition of FOXO4-p53 binding in CPP-CAND induces apoptosis via a caspase-dependent pathway.
  • Figure 8a shows foci images of FOXO4 and TP53BP1 (53BP1) in mitotic and doxorubicin-induced senescent A375 cells, with the nuclear outlines indicated by yellow lines.
  • Figure 8b is a diagram showing the distribution of FOXO4 and p53bp1 foci per nucleus in A375 cells.
  • Figure 8c shows FOXO4 foci images in senescent A375 cells treated with 30 ⁇ M CPP-CAND for 24 hours.
  • Figure 8d is a bar graph of FOXO4 foci/nucleus in A375 cells.
  • Figure 8e shows the results of caspase 3/7 activity in A375 cells treated with 20 ⁇ M CPP-CAND for 24 hours and in senescent A375 cells. The percentage of green fluorescent cells per cell is indicated by the panel figures.
  • the scale bar in Figures 8a and 8c is 10 ⁇ m, and the scale bar in Figure 8e is 100 ⁇ m.
  • Figure 9 shows the verification results of induction of caspase 3/7 activity by DMSO as a control.
  • CPP-CAND inhibits the FOXO4-p53 interaction in the nucleus, enabling the nuclear export of p53, and selectively inducing apoptosis in senescent cells.
  • FOXO4 FHD was subcloned into pET His6 Tobacco Etch Virus (TEV) LIC cloning vector (2B-T, obtained from Scott Gradia, Addgene plasmid #29666) and transformed into BL21(DE3).
  • p53 TAD(13-61) was subcloned into pET His6 glutathione-S-transferase (GST) TEV LIC cloning vector (2G-T, obtained from Scotta Gradia, Addgene plasmid #29707) and transformed into BL21(DE3) pLysS.
  • NMR experiments were performed using a Bruker 900 MHz NMR spectrometer equipped with a cryogenic probe (KBSI, Ochang, Korea) and a Bruker 600 MHz NMR spectrometer equipped with a cryogenic probe (GIST, Gwangju, Korea). All experiments were performed at 25°C in a buffer containing 20 mM HEPES (pH 7.0), 150 mM NaCl, and 1 mM DTT, and the amide nitrogens and protons of FOXO4 FHD and p53 TAD were assigned previously. NMR experimental data were processed with Topspin (Bruker) and analyzed with the POKY script.
  • ⁇ I ox /I red is the calculated error of the I ox /I red ratio
  • ⁇ I ox is the noise level of the oxidized spectrum
  • ⁇ I red is the noise level of the reduced spectrum.
  • the concentration of p53 TAD PEP was increased while keeping the ratio of 14 N-FOXO4 FHD to 15 N-labeled-p53 TAD the same.
  • Fluorescence polarization analysis was performed at 25°C using a Cytation 5 cell imaging multimode reader (BioTek) equipped with a green FP filter using 96-well microplates (SPL 30496). Each assay was repeated three times, and the results were averaged. Experiments were performed in a buffer containing 20 mM HEPES (pH 7.0), 150 mM NaCl, 1 mM DTT, and 5% DMSO. To determine the dissociation constant (K d ) values of FHD and p53 TAD PEP, 10 nM FITC-labeled p53 TAD PEP was mixed with increasing concentrations of FHD. The plates were then equilibrated at room temperature for 2 h. FPA values were determined using excitation at 485 nm and emission at 528 nm and calculated using Equation 2 below.
  • Human malignant melanoma (A375) cells were obtained from the American Type Culture Collection (ATCC, CRL-1619IG-2) and used within passage 10 for all experiments. Cells were cultured in DMEM (Welgene, LM001-05) supplemented with 10% FBS (Gibco 16000-044) and 1% penicillin/streptomycin (P/S, Gibco 15140-122) at 5% CO 2 and 37°C in a humidified atmosphere.
  • DMEM Human malignant melanoma
  • FBS Gibco 16000-044
  • P/S penicillin/streptomycin
  • TrypLETM enzyme (Express Enzyme, 1X) containing phenol red (Gibco 12605010) was used to detach adherent cells, and the cell lines were regularly tested for mycoplasma contamination using a mycoplasma detection kit (MycoStripTM, InvivoGen, rep-mys-10). Cell senescence was induced using doxorubicin. A375 cells were cultured at 30% to 50% confluency and treated with complete growth medium containing 0.1 ⁇ M doxorubicin (Sigma D1515) for 2 days. Cells were then allowed to recover in fresh growth medium for 4 days before further experiments.
  • Senescence ⁇ -galactosidase assays were performed using a senescence ⁇ -galactosidase staining kit (Cell Signaling Technology, 9860) according to the manufacturer's instructions, and stained cells were imaged using a ZEISS Primovert inverted microscope (Carl Zeiss Microscopy).
  • Cells were seeded in triplicate in 96-well plates, containing approximately 12,000 senescent cells and 6,000 non-senescent cells per well. After 1 day, the plates were treated with various concentrations of peptides and replenished daily for 2 days. Cell proliferation was quantified using the Promega CellTiter 96TM AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS) according to the manufacturer's instructions (Promega G3580) and measured 3 hours later using a microplate reader (Tecan).
  • MTS Promega CellTiter 96TM AQueous One Solution Cell Proliferation Assay
  • cells typically 15,000 were seeded in 8-well plates (SPL 30408). After each experiment, the cells were washed once with PBS (LPS solution CBP007B) and fixed with 10% formalin solution (Sigma HT501128-4L) for 10 min at room temperature. The cells were then washed with PBS and permeabilized with PBS containing 0.1% Triton X-100 (Daejung 8566-4405) for 10 min at room temperature.
  • PBS LPS solution CBP007B
  • formalin solution Sigma HT501128-4L
  • PBST PBS + 0.05% Tween20, LPS Solution CBP007T
  • BSA bovine serum albumin
  • TP53BP1 BD Biosciences 612523
  • the p53 TAD2 domain plays a critical role in the interaction with FOXO4 FHD.
  • CSP analysis is a technique used to observe interaction sites based on changes in the surrounding chemical environment, meaning that even regions not directly involved in the interaction can experience changes in the chemical environment if they are adjacent to regions important for the interaction. Therefore, by observing protein-protein interactions using hetNOE, which provides information on protein flexibility, we can identify key residues directly involved in the interaction.
  • the FPA assays were performed by increasing the concentration of unlabeled FOXO4 FHD and holding the concentration of FITC-labeled p53 TAD PEP constant. As a result, p53 TAD PEP effectively bound to FOXO4 FHD with a Kd of 0.11 ⁇ M (Fig. 3a). Furthermore, we performed 1 H- 15 N HSQC NMR experiments to determine whether p53 TAD PEP effectively inhibits the interaction between FOXO4 FHD and p53 TAD. Specifically, we performed titration experiments on the complex of 15 N-labeled p53 TAD(13-61) and unlabeled FOXO4 FHD with increasing concentrations of p53 TAD PEP.
  • the inventors of the present invention aimed to optimize the sequence of p53 TAD PEP for enhanced cell permeability.
  • the net charge of p53 TAD PEP at pH 7.4 is -6.2.
  • peptide drugs are known to efficiently penetrate cell membranes when the overall charge is neutral or positive.
  • the negatively charged residues of p53 TAD PEP do not appear to be critical for FOXO4 FHD binding. Therefore, the inventors designed a peptide by substituting negatively charged residues D42, D48, D49, E51, E56, and D57 within p53 TAD PEP with alanine to increase binding affinity for FOXO4 FHD and enhance membrane penetration.
  • the inhibitory potency of the designed peptides was verified using an FPA competition assay, demonstrating a sustained effect in inhibiting the interaction between FOXO4 and p53 TAD (Fig. 5a). Consequently, the inhibitory potency was enhanced approximately threefold compared to the p53 TAD PEP (Fig. 5b). Therefore, the inventors were evaluated to have successfully designed a peptide (CAND; SEQ ID NO: 15) optimized for cellular applications.
  • CPP-CAND exhibits selective senolytic activity.
  • Doxorubicin is known to induce cellular senescence in the A375 melanoma cell line.
  • the cells were treated with the peptide of the present invention (CAND), and cell viability was measured using the MTS assay, and IC 50 values were determined accordingly.
  • both p53 TAD PEP and CAND showed limited efficacy in inducing apoptosis in both dividing and senescent cells ( Figure 7).
  • We hypothesized that the ineffectiveness of the peptides in inducing apoptosis in both cell types may be due to inadequate cellular uptake.
  • CPP-CAND inhibits FOXO4-p53 binding and induces apoptosis through a caspase-dependent pathway.
  • FOXO4 is known to be progressively concentrated in euchromatin foci after senescence induction and to be retained in the nucleus of senescent cells through interaction with p53, thereby contributing to the maintenance of the senescent state.
  • Previously developed drugs, FOXO4-DRI and ES2 peptides selectively induce apoptosis in senescent cells by disrupting the FOXO4-p53 interaction in the nucleus of these cells. Since the CPP-CAND of the present invention is designed to disrupt the FOXO4-p53 interaction, the disruption of FOXO4-p53bp1 foci in the nucleus of senescent cells after CPP-CAND treatment was investigated.
  • CPP-CAND inhibits the FOXO4-p53 interaction in the nucleus, enabling the nuclear export of p53, and selectively inducing apoptosis in senescent cells.
  • peptide inhibitor of the present invention will be widely utilized in various health/medical fields where removal of senescent cells is required.

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Abstract

본 발명은 노화 세포 제거를 위한 FOXO4-p53 상호작용을 표적으로 하는 펩타이드 억제제, 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 펩타이드 억제제는 p53 TAD(transactivation domain) 서열을 기반으로 하는 설계되어 노화 세포에 대해 강력한 선택성을 나타내고, 짧은 길이와 L형 아미노산 구성되어 합성 비용이 경제적이며, 짧은 길이와 L형 아미노산 구성되었음에도 불구하고 FOXO4-p53 상호작용을 효율적으로 방해하는 효과가 있다. 따라서 본 발명의 펩타이드 억제제는 노화 세포 제거가 필요한 다양한 보건/의학 분야에서 크게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

노화 세포 제거를 위한 펩타이드 억제제, 및 이의 용도
본 발명은 노화 세포 제거를 위한 FOXO4-p53 상호작용을 표적으로 하는 펩타이드 억제제, 및 이의 용도에 관한 것이다.
성체 이후 유기체는 시간이 지남에 따라 신체 기능과 생식 능력을 상실하여 결국 사망에 이르게 된다. 이는 세포 내부와 외부의 DNA 손상과 다양한 스트레스 요인이 축적된 결과이다. 정상 세포에서 비가역적이고 심각한 DNA 손상이 발생하면 일반적으로 세포사멸 경로를 통해 제거된다. 그러나 노화된 세포가 제거되지 않고 장기간 세포주기 정지 상태로 유지되면, 이때 노화세포는 염증성 사이토카인과 케모카인 성장인자로 구성된 노화관련 분비 표현형(SASP)을 주변 조직으로 분비한다. 이는 염증 환경을 조성하고 세포주기 정지를 촉진하여 주변 조직의 노화를 유도한다. 세포노화는 정상세포뿐만 아니라 암세포에서도 나타나는 현상이다. 일반적으로 사용되는 암 치료 방식인 항암제와 방사선 요법은 DNA 손상을 유도하여 암세포를 제거하는 기능을 하는데, 불충분한 수준의 치료는 암세포의 세포사멸 대신에 노화를 유발한다. 예를 들어, 토포아이소머라제 억제제(topoisomerase inhibitor)인 독소루비신은 초나선형 DNA가 풀리는 토포아이소머라제를 방해하여 암세포의 DNA 손상을 유도한다. 그러나 낮은 농도의 독소루비신은 암세포의 세포 사멸을 유도하지 않고 오히려 세포 노화를 유도한다. 항암치료 후 유도된 노화암세포는 암의 침습성과 줄기성을 강화시켜 암 재발에 크게 기여한다. 따라서 효과적인 화학요법은 암세포와 노화된 암세포를 모두 제거하여 재발 위험을 최소화하는 것을 목표로 해야 한다.
노화 세포를 제거하기 위해 여러 가지 약물이 개발되고 있다. 일반적으로 노화세포는 세포사멸에 대한 저항성을 특징으로 하므로, 세포사멸 저항경로에 관여하는 EPHB1, PI3K/AKT, Bcl-2/Bcl-xL을 표적으로 하는 약물이 개발되어 왔다. 하지만 나비토클락스, 다스티닙 등의 약물은 정상세포에도 영향을 미치기 때문에 혈소판감소증, 호중구감소증, 폐고혈압 등의 부작용을 일으킬 수 있다. 최근 포크헤드 박스 O4(FOXO4)-p53 상호작용이 노화 세포 표적으로서 주목받기 시작했다. FOXO4는 세포 항상성을 유지하기 위해 다양한 신호를 중재하는 포크헤드 박스 O 전사 인자 중 하나이다. FOXO4는 노화 세포의 전골수성 백혈병(promyelocytic leukemia) 체내에 위치하며 p53과 상호작용하여 p53의 핵 배제를 억제한다. 결과적으로, 이러한 상호작용은 미토콘드리아에서 p53에 의해 유도된 노화 세포의 세포사멸을 억제한다. 또한, FOXO4-p53 상호작용은 세포사멸을 억제하는 공통 표적 유전자인 p21cip1의 전사를 활성화하여 노화 세포를 유지하는 데 기여한다. 특히 FOXO4는 노화 세포 제거의 유망한 표적이다. FOXO4는 정상 세포에서 발현이 미비하지만, 노화 세포에서는 그 발현이 크게 증가한다. 이러한 특성을 이용하여 여러 단백질-단백질 상호작용 억제제가 개발되었다. 종래 개발된 FOXO4-D-Retro-Inverso(DRI)는 FOXO4-p53 상호작용을 억제하여 노화 세포의 선택적 세포사멸을 유도한다. 그러나 FOXO4-DRI는 46개의 긴 아미노산과 D형 아미노산으로 인해 합성 비용이 많이 들고, 임상시험에서 다양한 부작용을 일으킬 수 있는 암 억제 인자인 p53을 타깃으로 하는 문제점이 있었다. 또 다른 약물인 ES2는 FOXO4 보존 영역 3(CR3)을 표적으로 하지만 FOXO4-DRI보다 선택성이 상당히 낮다.
따라서 본 발명은 상기와 같은 문제의 해결을 위해 안출된 것으로, 노화 세포 제거를 위한 FOXO4-p53 상호작용을 표적으로 하는 신규한 펩타이드 억제제, 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 펩타이드 억제제는 p53 TAD(transactivation domain) 서열을 기반으로 하는 설계되어 노화 세포에 대해 강력한 선택성을 나타내고, 짧은 길이와 L형 아미노산 구성되어 합성 비용이 경제적이며, 짧은 길이와 L형 아미노산 구성되었음에도 불구하고 FOXO4-p53 상호작용을 효율적으로 방해하는 효과가 있다. 따라서 본 발명의 펩타이드 억제제는 노화 세포 제거가 필요한 다양한 보건/의학 분야에서 크게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
본 발명은 상기와 같은 종래의 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것이다.
이를 위해 본 발명의 일 양태로서, p53 전사활성화 도메인(transactivation domain) 영역 내 N 말단으로부터 42 내지 57 번째 위치의 아미노산 중 어느 하나가 알라닌으로 치환된 변형 펩타이드를 제공한다.
본 발명의 다른 양태로서, p53 전사활성화 도메인(transactivation domain) 영역 내 N 말단으로부터 42 내지 57 번째 위치의 아미노산 중 어느 하나가 알라닌으로 치환된 변형 펩타이드를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태로서, p53 전사활성화 도메인(transactivation domain) 영역 내 N 말단으로부터 42 내지 57 번째 위치의 아미노산 중 어느 하나가 알라닌으로 치환된 변형 펩타이드를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태로서, p53 전사활성화 도메인(transactivation domain) 영역 내 N 말단으로부터 42 내지 57 번째 위치의 아미노산 중 어느 하나가 알라닌으로 치환된 변형 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 노화 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 바람직하게는 상기 변형 펩타이드는 서열번호 15를 포함하는 것일 수 있다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
이하, 본원에 기재된 다양한 구체예가 도면을 참조로 기재된다. 하기 설명에서, 본 발명의 완전한 이해를 위해서, 다양한 특이적 상세사항, 예컨대, 특이적 형태, 조성물 및 공정 등이 기재되어 있다. 그러나, 특정의 구체예는 이들 특이적 상세 사항 중 하나 이상 없이, 또는 다른 공지된 방법 및 형태와 함께 실행될 수 있다. 다른 예에서, 공지된 공정 및 제조 기술은 본 발명을 불필요하게 모호하게 하지 않게 하기 위해서, 특정의 상세사항으로 기재되지 않는다. "한 가지 구체예" 또는 "구체예"에 대한 본 명세서 전체를 통한 참조는 구체예와 결부되어 기재된 특별한 특징, 형태, 조성 또는 특성이 본 발명의 하나 이상의 구체예에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체에 걸친 다양한 위치에서 표현된 "한 가지 구체예에서" 또는 "구체예"의 상황은 반드시 본 발명의 동일한 구체예를 나타내지는 않는다. 추가로, 특별한 특징, 형태, 조성, 또는 특성은 하나 이상의 구체예에서 어떠한 적합한 방법으로 조합될 수 있다.
명세서에서 특별한 정의가 없으면 본 명세서에 사용된 모든 과학적 및 기술적인 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 당업자에 의하여 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.
명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 발명의 일 양태에서, 본 발명은 p53 전사활성화 도메인(transactivation domain) 영역 내 N 말단으로부터 42 내지 57 번째 위치의 아미노산 중 어느 하나가 알라닌으로 치환된 변형 펩타이드를 제공한다.
본 발명에서 상기 펩타이드란, 아미노산의 중합체로서, 아미노산 간의 연결은 아미드 결합 또는 펩타이드 결합으로 이루어진 폴리머를 의미한다.
본 발명에서 상기 변형 펩타이드란, 인위의 조작에 의해 자연물로서 펩타이드에서 1개 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되거나, 결실되거나, 역위되거나, 또는 삽입되는 경우를 의미한다. 또는, 상기 변형 펩타이드는 인위의 조작에 의해 자연물로서 펩타이드에서 일정 부분의 단편이 추출된 것일 수 있다. 상기 본 발명의 p53 전사활성화 도메인(transactivation domain) 영역 내 N 말단으로부터 42 내지 57 번째 위치의 아미노산 중 어느 하나가 알라닌으로 치환된 변형 펩타이드는 서열번호 1 내지 15 중 어느 하나로 표시되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또는 상기 본 발명의 p53 전사활성화 도메인(transactivation domain) 영역 내 N 말단으로부터 42 내지 57 번째 위치의 아미노산 중 어느 하나가 알라닌으로 치환된 변형 펩타이드는 p53 전사활성화 도메인(transactivation domain) 영역 내 N 말단으로부터 42, 48, 49, 51, 56, 및 57 번째 위치의 아미노산 중 어느 하나가 알라닌으로 치환된 것일 수 있고, 이는 바람직하게는 서열번호 2, 6, 7, 8, 13, 14, 및 15 중 어느 하나로 표시되는 것일 수 있으며, 가장 바람직하게는 서열번호 15로 표시되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또는 상기 본 발명의 p53 전사활성화 도메인(transactivation domain) 영역 내 N 말단으로부터 42 내지 57 번째 위치의 아미노산 중 어느 하나가 알라닌으로 치환된 변형 펩타이드는 N 말단, 또는 C 말단에 소수성 서열, 또는 세포 투과 펩타이드(cell-penetrating peptide; CPP) 서열을 추가로 포함하는 것일 수 있다. 이 때 상기 세포 투과 펩타이드란 3 내지 30개의 아미노산으로 구성된 펩타이드로 단백질, 펩타이드, DNA 등 다양한 물질과 결합하여 특별한 수용체 없이도 물질들을 세포 내부로 이동시킬 수 있는 펩타이드를 의미한다. 바람직하게는 하기 표 1에 기재한 서열 등일 수 있으나, 목적하는 펩타이드의 세포막 투과, 또는 세포간 이동을 촉진할 수 있는 도메인이라면 제한되지 않는다.
정의 서열
PFV PFVYLI
CPP GRKKRRQRRRPP
ANTP RQIKIWFQNRRMKWKK
Vp22 DAATATRGRSAASRPTERPRAPARSASRPRRPVE
MTS AAVALLPAVLLALLAPAAADQNQLMP
Pep-1 KETWWETWWTEWSQPKKKRKV
Pep-2 KETWFETWFTEWSQPKKKRKV
전사 트랜스 활성자(TAT) YGRKKRRORRR
아르기닌 테일 아르기닌이 4개 이상 연결(예시: RRRR, RRRRRRRRRR 등)
본 발명에서, 상기 N 말단, 또는 C 말단에 소수성 서열, 또는 CPP 서열을 추가로 포함하는 p53 전사활성화 도메인(transactivation domain) 영역 내 N 말단으로부터 42 내지 57 번째 위치의 아미노산 중 어느 하나가 알라닌으로 치환된 변형 펩타이드는 바람직하게는 서열번호 16 또는 17로 표시되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 양태에서, 본 발명은 p53 전사활성화 도메인(transactivation domain) 영역 내 N 말단으로부터 42 내지 57 번째 위치의 아미노산 중 어느 하나가 알라닌으로 치환된 변형 펩타이드를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공한다.
여기서의 변형 펩타이드에 관한 정의는 본 명세서에서 상술한 바와 같다.
본 발명에서 상기 핵산이란, 뉴클레오타이드가 긴 사슬 모양으로 중합된 고분자 유기물로서, 본 발명의 펩타이드를 코딩하는 유전 정보를 의미한다.
본 발명에서 상기 벡터는 세포 내에 도입되어 단백질을 발현시키기 위한 수단으로서, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파지 벡터 등 공지의 재조합 벡터를 사용할 수 있으며, 본 발명이 속하는 분야에서 공지된 임의의 방법에 따라 DNA 재조합 기술을 이용하여 당업자에 의해 용이하게 제조될 수 있다. 본 발명에서 상기 벡터의 구체적인 예시로는 상업적으로 널리 사용되는 pCDNA 벡터, F, R1, RP1, Col, pBR322, ToL, Ti 벡터, 코스미드, 람다, 람도이드(lambdoid), M13, Mu, p1 P22, Qμ, T-even, T2, T3, T7 등의 파아지, 식물 바이러스로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 목적상 숙주 세포(진행세포 또는 원핵세포)의 성질에 따라 적합한 재조합 벡터를 선택할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명은 p53 전사활성화 도메인(transactivation domain) 영역 내 N 말단으로부터 42 내지 57 번째 위치의 아미노산 중 어느 하나가 알라닌으로 치환된 변형 펩타이드를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.
여기서의 변형 펩타이드 및 벡터에 관한 정의는 본 명세서에서 상술한 바와 같다.
본 발명에서 상기 형질전환이란 세포 내로, 바람직하게는 포유동물 세포 등의 진핵 세포 내로 핵산 분자를 도입하기 위한 통상의 기술자에게 알려진 어느 방법으로 수행될 수 있다. 이러한 방법은 예를 들어 전기천공, 양이온성 지질 및/또는 리포좀에 기초한 리포펙션(lipofection), 칼슘 포스페이트 침전, 나노입자 기초의 형질주입, 바이러스 기초의 형질주입, 또는 DEAE-덱스트란 또는 폴리에틸렌이민 등과 같은 양이온성 폴리머 기초의 형질주입을 포함한다. 또는 상기 형질전환은 바이러스, 예를 들면 렌티바이러스를 이용하여 수행될 수 있다. 상기와 같은 방법으로 형질전환되어 본래의 형질이 변화된 도입 대상체를 형질전환체라 명명한다. 상기 형질전환체는 바이러스, 박테리아, 식물 세포, 또는 동물 세포인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명은 p53 전사활성화 도메인(transactivation domain) 영역 내 N 말단으로부터 42 내지 57 번째 위치의 아미노산 중 어느 하나가 알라닌으로 치환된 변형 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 노화 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.
여기서의 변형 펩타이드에 관한 정의는 본 명세서에서 상술한 바와 같다.
본 발명에서 상기 노화 질환이란 노화(aging)의 축적에 의해 발생하는 질환으로서 예를 들면, 암, 당뇨병, 고혈압, 관절염, 골다공증, 근감소증, 사구체 신염, 만성 신부전, 천식, 만성 폐기종, 폐색전증, 폐렴, 만성 알레르기, 백내장, 녹내장, 망막변성, 난청, 대동맥 질환, 동맥경화증, 심부전, 허혈성 심질환, 부정맥, 말초 혈관질환 및 판막 질환, 우울증, 섬망, 감정 및 행동장애, 노인성 치매, 파킨슨병, 피부 노화 질환 등일 수 있고, 상기 피부 노화 질환은 주름, 기미, 검버섯, 피부 건조증, 광선각화증, 피부 처짐 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 가장 바람직하게는 암(cancer)인 것일 수 있다. 상기 암이란 제어되지 않은 세포성장으로 특징지어지며, 이러한 비정상적인 세포성장에 의해 종양이라고 불리는 세포 덩어리가 형성되어 주위의 조직으로 침투하고 심한 경우에는 신체의 다른 기관으로 전이되기도 하는 것을 의미한다. 학문적으로는 신생물이라고 명명되기도 한다. 암은 수술, 방사선 및 화학요법으로 치료를 하더라도 많은 경우에 근본적인 치유가 되지 못하고 환자에게 고통을 주며 궁극적으로는 죽음에 이르게 하는 난치성 만성질환으로, 암의 발생요인으로는 여러 가지가 있으나, 내적 요인과 외적 요인으로 구분한다. 정상세포가 어떠한 기전을 거처 암세포로 형질전환이 되는지에 대해서는 정확하게 규명되지 않았으나, 상당수의 암이 환경요인 등 외적인자에 의해 영향을 받아 발생하는 것으로 알려져 있다. 내적 요인으로는 유전 인자, 면역학적 요인 등이 있으며, 외적 요인으로는 화학물질, 방사선, 바이러스 등이 있다. 암의 발생에 관련되는 유전자에는 종양형성유전자(oncogenes)와 종양억제유전자(tumor suppressor genes)가 있는데, 이들 사이의 균형이 위에서 설명한 내적 혹은 외적 요인들에 의해 무너질 때 암이 발생하게 된다. 상기 암은 바람직하게는 유방암, 자궁암, 식도암, 위암, 뇌암, 직장암, 대장암, 폐암, 피부암, 난소암, 자궁경부암, 신장암, 혈액암, 췌장암, 전립선암, 고환암, 후두암, 구강암, 두경부암, 갑상선암, 간암, 방광암, 골육종, 림프종, 흑색종, 백혈병 등 일 수 있으나, 암의 종류라면 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 상기 약학조성물이란 특정한 목적을 위해 투여되는 조성물을 의미한다. 본 발명의 목적상, 본 발명의 약학조성물은 노화 질환, 구체적으로는 예방 또는 치료를 위해 사용되는 것이며, 상기 암 치료는 암의 증식을 억제하거나, 또는 암의 전이를 억제하는 것일 수 있다. 상기 약학조성물은 이들로 한정되는 것은 아니지만, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 캡슐, 정제, 수성 현탁액 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사 용액의 형태로 제형화되어 사용될 수 있다. 또한 본 발명의 약학조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체는 경구 투여 시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등이 사용될 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등이 혼합되어 사용될 수 있으며, 국소투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등이 사용될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서(elixir), 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 기타, 용액, 현탁액, 정제, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제형화할 수 있다. 한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말디톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항 응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 약학조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장이 포함된다. 경구 또는 비경구 투하가 바람직하다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명은 노화 질환 치료가 필요한 개체에게 p53 전사활성화 도메인(transactivation domain) 영역 내 N 말단으로부터 42 내지 57 번째 위치의 아미노산 중 어느 하나가 알라닌으로 치환된 변형 펩타이드, 또는 상기 펩타이드를 포함하는 약학조성물을 투여하여 노화 질환을 치료하는 방법을 제공한다.
여기서의 변형 펩타이드, 노화 질환, 및 약학조성물에 관한 정의는 본 명세서에서 상술한 바와 같다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명은 노화 질환을 치료하기 위한 p53 전사활성화 도메인(transactivation domain) 영역 내 N 말단으로부터 42 내지 57 번째 위치의 아미노산 중 어느 하나가 알라닌으로 치환된 변형 펩타이드, 또는 상기 펩타이드를 포함하는 약학조성물의 용도를 제공한다.
여기서의 변형 펩타이드, 노화 질환, 및 약학조성물에 관한 정의는 본 명세서에서 상술한 바와 같다.
이하 상기 본 발명을 실시예에 입각하여 상세히 설명한다.
본 발명의 노화 세포 제거를 위한 펩타이드 억제제는 p53 TAD(transactivation domain) 서열을 기반으로 하는 설계되어 노화 세포에 대해 강력한 선택성을 나타내고, 짧은 길이와 L형 아미노산 구성되어 합성 비용이 경제적이며, 짧은 길이와 L형 아미노산 구성되었음에도 불구하고 FOXO4-p53 상호작용을 효율적으로 방해하는 효과가 있다. 따라서 본 발명의 펩타이드 억제제는 노화 세포 제거가 필요한 다양한 보건/의학 분야에서 크게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 FOXO4 및 p53 단백질의 도메인 구조를 나타낸다. 도 1에서, p53 TAD의 기본 서열이 표시된다. 화살표는 상호 작용하는 것으로 알려진 도메인을 연결한다. p53 TAD PEP의 펩타이드 서열은 빨간색으로 표시된다. 도 1에서 약어는 하기와 같다.
TAD: transactivation domain;
PRD: a proline-rich domain;
DBD: DNA binding domain;
TD: tetramerization domain;
NRD: negative regulatory domain;
CR1 and CR3: transactivation domains;
FHD: forkhead domain;
NLS: nuclear localization sequence;
NES: nuclear export sequence.
도 2는 FOXO4 FHD 및 p53 TAD의 상호작용 관찰을 나타낸다. 도 2에서, S46C에서 S-(1-옥실-2,2,5,5-테트라메틸-2,5-디하이드로-1H-피롤-3-일)메틸 메탄설포노티오에이트(MTSL) 로 수정된 TAD와 복합체를 이루는 FHD에 대한 FHD 신호의 잔기 수에 대한 강도 비율(Iox/Ired) 플롯이 표시된다. 도 2a는 영역에 따른 Iox/Ired 및 각 오차 막대로, 별표(*)는 MTSL의 영향으로 확장된 영역을 나타낸다. 도 2b는 FOXO4 FHD의 상자성 이완 강화(paramagnetic relaxation enhancement; PRE) 실험 모델(PDB ID: 1E17)이며, Iox/Ired가 0.2 미만은 빨간색, Iox/Ired가 0.2 미만인 소수성 잔기는 파란색으로 표시된다. 도 2c는 p53 TAD apo 및 p53 TAD-FOXO4 FHD 복합체의 hetNOE 값을 나타낸다. 도 2d는 p53 TAD-FOXO4 FHD 복합체와 p53 TAD apo 사이의 hetNOE 값의 차이를 나타낸다.
도 3은 FOXO4 FHD와 p53 TAD의 결합에 대한 p53 TAD PEP의 억제 능력 검증 결과를 나타낸다. 도 3a는 FHD의 농도가 증가함에 따라 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC) 표지 p53 TAD PEP의 FPA 값을 측정하는 방법으로 형광 표지된 펩타이드를 사용하여 형광 편광 이방성 실험을 수행한 결과이다. 도 3b에서 1H-15N 이핵 단일 양자 결맞음(HSQC) NMR 스펙트럼은 p53 TAD PEP(각각 0, 100 및 200μM)의 증가하는 화학양론적 등가물과 함께 배양된 15N-표지된 FOXO FHD-14N p53 TAD 복합체에 대해 얻어졌다.
도 4는 알라닌 치환된 펩타이드의 경쟁적 FPA 억제 분석 결과를 나타낸다. 도 4는 알라닌 치환된 펩타이드의 농도를 증가시킴으로써 FOXO4 FHD에 대한 FITC 표지 p53 TAD 결합을 억제함을 보여준다.
도 5는 치환된 잔기를 갖는 펩타이드 후보의 경쟁적 FPA 억제 분석 결과를 나타낸다. 도 5a는 WT 및 서열 최적화된 펩타이드 후보(CAND)의 농도를 증가시킴으로써 FOXO4 FHD에 대한 FITC-표지된 p53 TAD PEP 결합 억제됨을 보여준다. 도 5b는 WT 및 CAND에 대한 pH 7.4에서의 IC50 값 및 순 전하 값을 나타낸다.
도 6은 독소루비신 유발 노화 모델에서 후보 펩타이드의 검증 결과를 나타낸다. 도 6a는 노화 관련 베타-갈락토시다제(SA-b-gal)에 대해 염색된 분열 및 노화 A375 세포의 이미지이다. 도 6b는 증가하는 용량의 CPP-CAND 및 FOXO4-DRI(μM)와 함께 배양된 노화 및 대조군 A375의 생존력 분석 결과이다. 도 6c는 FOXO4-DRI 및 CPP-CAND의 선택성 지수(SI)를 나타낸다. SI50, 및 SI75는 두 그룹 모두에 대한 비선형 회귀 분석에서 얻은 IC50, IC75 값의 변화를 반영한다.
도 7은 독소루비신 유발 노화 모델에서 후보 펩타이드의 검증 추가 결과로서, 증가하는 용량의 p53 TAD PEP 및 CAND(μM)와 함께 배양된 노화 및 대조군 A375의 생존력 분석 결과이다.
도 8은 CPP-CAND에서 FOXO4-p53 결합 억제는 카스파제 의존 경로를 통해 세포사멸을 유도함을 나타낸다. 도 8a는 분열 및 독소루비신 유발 노화 A375 세포에서 FOXO4 및 TP53BP1(53BP1)의 초점 이미지로, 핵의 윤곽은 노란색 선으로 표시된다. 도 8b는 A375 세포에서 핵당 FOXO4 및 p53bp1 초점의 분포를 보여주는 도표이다. 도 8c는 30 μM의 CPP-CAND로 24시간 처리한 노화 A375 세포의 FOXO4 초점 이미지이다. 도 8d는 A375 세포의 FOXO4 초점/핵의 막대 그래프이다. 유의성은 DMSO 대조군을 기준으로 처리되었으며, **** p-값 < 0.0001 이다. 도 8e는 24시간 동안 20 μM CPP-CAND로 24시간 처리된 A375 세포와 노화 A375 세포의 카스파제 3/7 활성 결과이다. 셀당 녹색 형광 세포의 비율이 패널 수치로 표시되었다. 도 8a와 도 8c에서 스케일 바는 10μm이며, 도 8e에서 스케일 바는 100μm이다.
도 9는 대조군으로서 DMSO에 의한 카스파제 3/7 활성 유도의 검증 결과이다.
본 발명자들은 20 μM의 CPP-CAND로 분열 및 노화 세포를 처리하고, 카스파제 3/7 활성을 평가하여 카스파제 의존성 세포 사멸을 확인하였다. 시험 결과, 각 세포 유형에 동일한 농도의 CPP-CAND를 처리하였음에도 불구하고, 노화세포의 44%에서 카스파제 3/7 활성이 관찰된 반면, 분열세포에서는 활성이 거의 관찰되지 않았다. 분열세포와 노화세포를 DMSO로 처리한 대조군에서도 카스파제 3/7 활성이 거의 검출되지 않았다. 이는 카스파제 의존성 세포사멸이 노화세포에서 특이적으로 유도되었음을 의미한다. 종합하면, CPP-CAND는 핵에서 FOXO4-p53 상호작용을 억제하여 p53의 핵외 수송을 가능하게 하고, 노화 세포 선택적으로 세포사멸을 유도한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
[연구 방법]
1. 샘플 준비
FOXO4 FHD(95-195)를 pET His6 담배 식각 바이러스(Tobacco Etch Virus; TEV)LIC 클로닝 벡터(2B-T, obtained from Scott Gradia, Addgene plasmid #29666)에 서브클로닝하고 BL21(DE3)로 형질전환 시켰다. p53 TAD(13-61)를 pET His 6 글루타티온-S-트랜스퍼라제(glutathione-S-transferase; GST) TEV LIC 클로닝 벡터(2G-T, obtained from Scotta Gradia, Addgene plasmid #29707)에 서브클로닝하고 BL21(DE3) pLysS로 형질전환 시켰다. 세포를 37℃의 용원성 배지(LPS solution LB-05)에서 0.7-0.8의 OD600으로 성장시킨 후, 0.5 mM의 이소프로필-1-티오-β-D-갈락토피라노시드(LPS solution IPTG025)를 첨가하고, 18℃에서 밤새 배양하였다. 과발현된 단백질을 50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 및 300 mM 이미다졸을 함유하는 용출 완충액을 사용하여 Ni-NTA 컬럼(Cytiva)에서 정제하였다. His6 및 GST 태그가 붙은 단백질 샘플은 TEV 프로테아제로 절단한 후 Ni-NTA 컬럼에서 반복적으로 정제하였다. FOXO4 FHD 및 p53 TAD의 추가 정제를 위해 AKTA pure 및 AKTA 프라임 시스템(Cytiva)에서 Hi-Load 16/600 superdex 200pg 및 75pg(Cytiva)를 사용하여 겔 여과 크로마토그래피를 수행하였고, 컬럼은 20 mM HEPES(pH 7.0) 및 150 mM NaCl을 함유한 완충액으로 사전 평형화하였다. NMR 연구를 위해, 세포를 15NH4Cl이 포함된 M9 배지에서 성장시켜 15N-표지된 단백질을 생성하였다. FITC 표지 p53 TAD(42-57)를 포함한 모든 펩타이드는 ㈜단디큐어(한국 오창)에서 95% 순도로 제조하였다.
2. NMR 분광학
NMR 실험은 극저온 프로브가 장착된 Bruker 900 MHz NMR 분광기(KBSI, 한국 오창)와 극저온 프로브가 장착된 Bruker 600 MHz NMR 분광기(GIST, 광주)를 사용하여 수행하였다. 모든 실험은 25℃에서 20 mM HEPES(pH 7.0), 150 mM NaCl, 및 1 mM DTT 완충액으로 수행하였고, FOXO4 FHD 및 p53 TAD의 아미드 질소 및 양성자는 이전에 지정되었다. NMR 실험 데이터는 Topspin(Bruker)으로 처리하고 POKY 스크립트로 분석하였다. 1H-15N 이핵 오버하우저 효과(hetNOE) 측정은 극저온 프로브(KBSI, 한국 오창)가 있는 Bruker 900 MHz NMR 분광계를 사용하여 기록하였고, 양성자(1H)의 포화 기간은 5초로 설정하였으며, hetNOE 값은 스펙트럼 세트 간의 피크 높이를 비교하여 파생시켰다. PRE 실험은 극저온 프로브(GIST, 광주)가 장착된 Bruker 600 MHz NMR 분광계를 사용하였고, 상자성 프로브인 MTSL는 p53 TAD의 시스테인 잔기 46에 표지하였다. 300μM의 MTSL 표지 p53 TAD를 150μM의 15N 표지 FOXO4 FHD에 첨가하였고, 20 mM HEPES(pH 7.0)와 150 mM NaCl이 포함된 완충액에서 실험을 진행하였다. 피크 강도를 측정하고, 환원 상태(Ired, diamagnetic, with ascorbate)의 강도에 대한 산화 상태(Iox, paramagnetic, without ascorbate)의 강도 비율을 플롯팅하였다. Iox/Ired 값에 대한 표준 오차는 하기 식 1에 대입하여 개별 스펙트럼의 신호 대 잡음비를 전파하여 계산하였다.
[식 1]
상기 식 1에서, δIox/Ired는 Iox/Ired 비율의 계산된 오류이고, δIox는 산화된 스펙트럼의 잡음 수준이고, δIred는 감소된 스펙트럼의 잡음 수준이다.
1H-15N HSQC 적정 실험의 경우, 14N-FOXO4 FHD와 15N 표지-p53 TAD의 비율을 동일하게 유지하면서 p53 TAD PEP의 농도를 증가시켰다.
3. 형광 편광 이방성 분석
형광 편광 분석은 96웰 마이크로플레이트(SPL 30496)를 활용하여 25℃에서 녹색 FP 필터가 장착된 Cytation 5 세포 이미징 다중 모드 판독기(BioTek)로 수행하였다. 각 분석은 3회 반복되었으며 결과는 평균화하였다. 실험은 20 mM HEPES(pH 7.0), 150 mM NaCl, 1 mM DTT, 및 5% DMSO를 포함하는 완충액에서 수행하였고, FHD와 p53 TAD PEP의 해리 상수(Kd) 값을 결정하기 위해 10 nM FITC 표지 p53 TAD PEP를 증가하는 농도의 FHD와 혼합하였다. 이어서, 플레이트를 실온에서 2시간 동안 평형화시켰다. FPA 값은 485 nm에서의 여기와 528 nm에서의 방출을 사용하여 결정하였으며, 하기 식 2에 대입하여 계산하였다.
[식 2]
경쟁적 억제 실험에서 증가하는 농도의 억제제 펩타이드를 120 nM FHD와 10 nM FITC-p53 TAD PEP의 혼합물로 적정하였고, 시험관 내에서 특정 생물학적 기능을 억제하는 물질의 최대 농도의 절반을 나타내는 IC50 값은 분석을 통해 결정하였다.
4. 세포 배양
인간 악성 흑색종(A375) 세포는 미국 세포주 은행(ATCC, CRL-1619IG-2)에서 얻었으며 모든 실험에 대해 10계대 이내로 사용하였다. 세포를 10% FBS(Gibco 16000-044), 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(P/S, Gibco 15140-122)이 보충된 DMEM(Welgene, LM001-05) 배지에서 5% CO2, 37℃ 습도 환경에서 배양하였다. 부착 세포의 분리를 위해 페놀 레드(Gibco 12605010)가 포함된 TrypLE™ 효소(Express Enzyme, 1X)를 사용하였고, 마이코플라스마 검출 키트(MycoStrip™, InvivoGen, rep-mys-10)를 사용하여 세포주의 마이코플라스마 오염 여부를 정기적으로 시험하였다. 세포의 노화는 독소루비신을 이용하여 유발하였다. A375 세포를 30% 내지 50% 밀도로 배양한 후, 0.1 μM 독소루비신(Sigma D1515)을 함유하는 완전 성장 배지로 2일간 처리하였다. 이후, 세포를 추가 실험 전 4일간 새로운 성장 배지에서 회복시켰다. 노화 β-갈락토시다아제(senescence β-galactosidase) 분석은 제조사의 지침에 따라 노화 β-갈락토시다아제 염색 키트(Cell Signaling Technology, 9860)를 사용하여 수행하였고, 염색된 세포를 ZEISS Primovert 도립 현미경(Carl Zeiss Microscopy)으로 이미지화 하였다.
5. 세포 생존력
세포를 96웰 플레이트에 3중으로 파종하였다. 여기에는 웰당 대략 12,000개의 노화 세포와 6,000개의 비노화 세포가 포함되었다. 1일 후, 플레이트를 다양한 농도의 펩타이드로 처리하고 2일간 매일 보충하였다. 세포 증식은 제조사의 지침(Promega G3580)에 따라 Promega CellTiter 96™ AQueous One Solution Cell Proliferation Assay(MTS)를 처리하고, 3시간 후에 마이크로플레이트 리더(Tecan)로 측정하는 방법으로 정량하였다.
6. 면역형광
면역형광 분석을 위해 세포(일반적으로 15,000개)를 8웰 플레이트(SPL 30408)에 파종하고, 각 실험 후 세포를 PBS(LPS solution CBP007B)로 1회 세척하고 10% 포르말린 용액(Sigma HT501128-4L)으로 실온에서 10분간 고정시켰다. 이후, 세포를 PBS로 세척하고 0.1% Triton X-100(Daejung 8566-4405)이 포함된 PBS로 실온에서 10분간 투과화시켰다. 이어서, 세포를 PBS로 다시 세척하고, 1% 소 혈청 알부민(BSA, Sigma A9418)과 22.52 mg/mL 글리신이 포함된 PBST(PBS + 0.05% Tween20, LPS Solution CBP007T)를 이용하여 1시간 동안 처리하였다. 1차 항체 FOXO4(Cell Signaling Technology 9472) 및 TP53BP1(BD Biosciences 612523)을 1% BSA가 포함된 PBST에 희석하여 4℃에서 밤새 처리하였다. 1차 항체 인큐베이션 후, 세포를 PBST로 세척하고, 1% BSA가 포함된 PBST에 희석된 2차 항체(Goat Anti-Rabbit IgG H&L Alexa Fluor 488, Abcam ab150077; Goat Anti-Mouse IgG H&L Alexa Fluor 594, Abcam ab150116)로 실온에서 1시간 동안 처리하였다. 2차 항체 인큐베이션 후, 세포를 PBST로 다시 세척하고, DAPI(Abcam ab104139)가 포함된 Fluoroshield Mounting 배지를 사용하여 봉입하였다. 카스파제-3/7 염색과 관련된 실험의 경우, Eclipse Ti-U 도립 현미경(NIKON)을 사용하여 이미징하기 24시간 전에 CellEvent Caspase-3/7 녹색 검출 시약(Thermo Scientific C10723) 및 CPP-CAND를 살아있는 세포에 첨가하였다.
[연구 결과]
1. p53 TAD2 영역은 FOXO4 FHD와의 상호작용에서 중요한 역할을 한다.
핵 내 FOXO4와 p53 사이의 상호작용은 세포 노화를 촉진시키는 것으로 보고되었다. 이러한 상호작용은 FOXO4 포크헤드 도메인(FHD)이 p53 TAD에 결합하고 FOXO4 CR3이 p53 DNA 결합 도메인(DBD)에 결합하는 이중 결합에 의해 매개된다(도 1). 본 발명의 발명자들은 FOXO4 FHD와 p53 TAD 사이의 상호 작용을 더 깊이 조사하기 위해 PRE 실험을 수행하였다. 우리는 PRE 실험을 위해 15N-표지된 FOXO4 FHD와 p53 TAD를 사용하였으며, 시스테인 46 위치에서 MTSL 표지한 것을 사용하였다. MTSL은 표지된 잔기 근처에서 피크 확장을 유발하여 FOXO4 FHD의 어느 영역이 p53 TAD에 가까운지 식별할 수 있다. 본 발명자들의 연구 결과는 FOXO4 FHD의 N 말단과 나선 3과 4에서 관찰된 연결 강도의 현저한 감소(0.2 미만)를 보여주었다(도 2a, 및 도 2b). 여기서 상당한 강도 감소를 나타내는 잔기의 약 절반이 소수성 아미노산이라는 것은 주목할만한 관찰 결과이다. 이 발견은 화학적 이동 섭동(chemical shift perturbation; CSP)을 사용한 FOXO4 FHD와 p53 TAD 사이의 상호 작용에 대한 이전 조사 결과와 일치하는 것이며, FOXO4 FHD 및 p53 TAD 상호작용에서 소수성 상호작용의 중요성을 시사한다.
종래 연구에서는 CSP 분석을 통해 p53 TAD와 FOXO4 FHD 간의 상호 작용을 조사하였다. 15N-표지된 p53 TAD에 대한 FOXO4 FHD 적정 후, p53 TAD2 영역 내의 많은 잔기에서 2 시그마 이상의 상당한 섭동이 관찰되었다. 이는 FOXO4 FHD 결합에 대한 p53 TAD2 영역의 중요성을 나타낸다. CSP 분석은 주변 화학 환경의 변화를 기반으로 상호작용 지점을 관찰하는 데 사용되는 기술로서, 이는 상호작용에 직접적으로 관여하지 않는 영역이더라도 상호작용에 중요한 영역에 인접해 있으면 화학적 환경에 변화가 나타날 수 있음을 의미한다. 따라서 단백질 유연성에 대한 정보를 제공하는 hetNOE를 통해 단백질 간의 상호작용을 관찰함으로써 상호작용에 직접적으로 참여하는 핵심 잔기를 확인할 수 있다. 펩타이드 템플릿을 디자인하기 위해 우리는 hetNOE 분석을 통해 FOXO4 FHD와 p53 TAD 간의 상호 작용을 조사하여 p53 TAD2 영역 내 결합과 관련된 중요한 잔기를 조사하였다. 처음에는 apo 상태의 15N으로 표지된 p53 TAD에 대해 hetNOE 실험을 수행하였다. 일반적으로 hetNOE 값이 1에 가까울수록 해당 영역의 구조가 더 강하다는 것을 나타낸다. 시험 결과, 2차 구조가 있는 영역은 일반적으로 높은 값(0.6 이상)을 나타냈으며, p53 TAD apo 상태의 경우 대부분의 잔기가 낮은 값(0.6 미만)을 나타내었다(도 2c). 이 결과는 2차 구조가 결여된 무질서한 단백질을 나타내므로, p53 TAD는 2차 구조 없이 유연한 형태로 존재하는 것으로 보인다. 이어서, 15N으로 표지된 p53 TAD와 표지되지 않은 FOXO4 FHD에 의해 형성된 복합체에 대해 hetNOE 실험을 수행하였다. p53 TAD apo 결과와 달리, 대부분의 잔기의 hetNOE 값은 p53 TAD의 apo 상태에서 관찰된 값에 비해 증가하였다(도 2c). 이는 p53 TAD와 FOXO4 FHD가 서로 결합되어 있음을 나타낸다. 특히, TAD2 및 C-말단에 해당하는 잔기의 경우 hetNOE 값이 0.2 이상 증가하는 것으로 관찰되었다(도 2d). 이 결과는 종래 연구와 일치하며, TAD2 영역이 FOXO4 FHD와의 상호 작용에서 중요한 역할을 한다는 개념을 뒷받침한다. 반대로, 49 위치의 잔기를 제외하고, 45-52 범위 내 잔기는 hetNOE 값이 유의미하게 증가하지 않았다. 이러한 결과를 종합할 때, TAD2의 전방 및 후방 영역과 p53 TAD의 C-말단 위치는 FOXO4 FHD와의 상호작용에 중요한 것으로 보인다.
2. p53 TAD2의 소수성 잔기는 FOXO4 FHD와의 상호 작용에 중요하다.
FOXO4 FHD와 상호작용하는 데 있어 p53 TAD2 영역과 C 말단의 중요성을 기반으로 본 발명자들은 FOXO4-p53 상호작용을 표적으로 하는 억제제를 개발하고자 하였다. 본 발명자들은 p53 TAD 서열의 잔기 42-57에 해당하는 16개의 아미노산으로 구성된 p53 TAD PEP라는 펩타이드 억제제 프로토타입을 설계하였다. 본 발명자들은 hetNOE 분석과 CSP 분석을 고려하여 펩타이드 서열을 선택하였고, 여기에는 상당한 결착 또는 hetNOE 값의 현저한 증가를 나타내는 영역이 포함되었다. FOXO4 FHD에 대한 p53 TAD PEP의 결합 기능을 확인하기 위해 FPA 분석을 수행하였다. FPA 분석은 표지되지 않은 FOXO4 FHD의 농도를 증가시키고 FITC 표지된 p53 TAD PEP의 농도를 일정하게 유지함으로써 수행되었다. 시험 결과, p53 TAD PEP가 0.11μM의 Kd로 FOXO4 FHD에 효과적으로 결합하였다(도 3a). 또한 본 발명자들은 p53 TAD PEP가 FOXO4 FHD와 p53 TAD 간의 상호 작용을 효과적으로 억제하는지 여부를 확인하기 위해 1H-15N HSQC NMR 실험을 수행하였다. 구체적으로, p53 TAD PEP의 농도가 증가하면서 15N 표지 p53 TAD(13-61)와 표지되지 않은 FOXO4 FHD의 복합체에 대한 적정 실험을 수행하였다. 그 결과, p53 TAD PEP를 첨가하면 FOXO4 FHD에서 p53 TAD(13-61)가 분리되어 15N-p53 TAD-FOXO4 FHD 복합체가 결합되지 않은 p53 TAD 상태로 화학적으로 이동하는 것을 관찰하였다(도 3b). 이는 p53 TAD PEP가 p53 TAD와 FOXO4 FHD 사이의 상호 작용을 효과적으로 방해한다는 것을 의미하며, p53 TAD PEP가 FOXO4-p53 상호작용을 표적으로 하는 펩타이드 억제제로서 효과적으로 기능할 수 있음을 시사한다.
나아가 p53 TAD PEP 서열을 개선하려면 FOXO4 FHD 결합에 중요한 잔기가 무엇인지 식별해야 한다. 본 발명자들은 종래 연구에서 산성 잔기와 FOXO4 FHD 결합에 중요한 것으로 알려진 p53 TAD2 영역 내의 잔기를 알라닌 잔기로 대체하여 시험하는 방법으로 이들의 결합에 중요한 잔기를 식별하였다(표 2). 하기 표 2는 야생형(WT) 및 알라닌 치환 펩타이드와 이들의 IC50 값을 나타낸다.
서열번호(No.) 펩타이드 서열 IC50 (μM)
서열번호 1 WT DLMLSPDDIEQWFTED 7.1 ± 0.5
서열번호 2 D42A ALMLSPDDIEQWFTED 1.4 ± 0.1
서열번호 3 L43A DAMLSPDDIEQWFTED N/D
서열번호 4 M44A DLALSPDDIEQWFTED 9.5 ± 4.8
서열번호 5 L45A DLMASPDDIEQWFTED 5.7 ± 3.2
서열번호 6 D48A DLMLSPADIEQWFTED 1.8 ± 0.2
서열번호 7 D49A DLMLSPDAIEQWFTED 1.1 ± 0.2
서열번호 8 E51A DLMLSPDDIAQWFTED 0.9 ± 0.1
서열번호 9 Q52A DLMLSPDDIEAWFTED 1.3 ± 0.3
서열번호 10 W53A DLMLSPDDIEQAFTED N/D
서열번호 11 F54A DLMLSPDDIEQWATED N/D
서열번호 12 T55A DLMLSPDDIEQWFAED 1.3 ± 0.5
서열번호 13 E56A DLMLSPDDIEQWFTAD 1.6 ± 0.3
서열번호 14 D57A DLMLSPDDIEQWFTEA 2.6 ± 0.4
이어서, FITC 표지 p53 TAD PEP와 FOXO4 FHD를 결합할 때 알라닌 치환 p53 TAD PEP의 농도를 적정하여 억제 활성을 평가하였다(도 4). 시험 결과, 잔기 L43, W53 및 F54가 알라닌으로 대체되면 억제 활성이 크게 손상되어, FOXO4 FHD 결합에 대한 이들 잔기의 중요성을 나타낸다(표 2). 더욱이, 잔기 M44가 알라닌으로 대체되면 억제 활성이 약간 감소하는 것이 관찰되었다. 이는 p53 TAD의 소수성 잔기가 FOXO4 FHD 결합에 크게 기여한다는 것을 의미한다. 흥미롭게도, 언급된 서열 이외의 서열의 알라닌 치환은 억제 활성이 감소하지 않고 오히려 강화되었으며, 이는 이러한 잔기가 FOXO4 FHD 결합에 중요하지 않으며 억제 효능을 향상시키기 위한 치환 후보를 나타낼 수 있음을 시사한다.
3. 세포 투과성을 위해 산성도가 감소된 펩타이드가 설계되었다.
알라닌 스크리닝을 기반으로 본 발명의 발명자들은 향상된 세포 투과성을 위해 p53 TAD PEP의 서열을 최적화하고자 하였다. pH 7.4에서 p53 TAD PEP의 순 전하는 -6.2이다. 세포막이 음전하를 띠고 있다는 점을 고려하면, 펩타이드 약물은 전체 전하가 중성 또는 양전하일 때 세포막을 효율적으로 침투하는 것으로 알려져 있다. 상기 표 2의 결과를 참조하면, p53 TAD PEP의 음으로 하전된 잔기는 FOXO4 FHD 결합에 결정적인 것으로 보이지 않는다. 따라서 본 발명자들은 FOXO4 FHD에 대한 결합 친화도를 높이고 막 침투를 향상시키기 위해 p53 TAD PEP 내의 음전하를 띤 잔기 D42, D48, D49, E51, E56 및 D57을 알라닌으로 치환하여 펩타이드를 설계하였다. 설계된 펩타이드들의 억제 효능은 FPA 경쟁 분석을 사용하여 검증하였고, FOXO4와 p53 TAD 사이의 상호작용을 억제하는 데 있어 지속적인 효과가 있는 것으로 나타났다(도 5a). 결과적으로, 억제 능력은 p53 TAD PEP에 비해 약 3배까지 향상되었다(도 5b). 이로서 본 발명자들은 세포 응용에 최적화된 펩타이드(CAND; 서열번호 15)를 성공적으로 설계한 것으로 평가되었다.
4. CPP-CAND는 선택적 세놀리틱(senolytic) 활성을 나타낸다.
독소루비신은 A375 흑색종 세포주에서 세포 노화를 유도하는 것으로 알려져 있다. 본 발명자들은 독소루비신을 사용하여 A375 세포에서 노화를 유도하고, SA-b-gal 염색을 통해 노화된 세포를 확인하였다(도 6a). 상기 세포를 본 발명의 펩타이드(CAND)로 처리하고 MTS 분석으로 세포 생존력을 측정하였으며, 그에 따라 IC50 값을 결정하였다. 그 결과, p53 TAD PEP와 CAND는 모두 분열 세포와 노화 세포 모두에서 세포 사멸을 유도하는 데 제한된 효능을 보였다(도 7). 본 발명자들은 두 가지 유형의 세포 모두에서 세포 사멸을 유도하는 데 있어 펩타이드의 비효율성이 부적절한 세포 흡수에 기인할 수 있다는 가설을 세우고, 이 문제를 해결하기 위해 CPP 서열을 통합하거나 지질 접합과 같은 다양한 기술을 사용하여 펩타이드의 세포 흡수를 향상시키고자 하였다. CAND의 순전하는 -0.2로 전체적으로 중성전하를 띠기 때문에 CAND가 스스로 효과적으로 세포핵으로 이동하기는 어렵다. 따라서 본 발명자들은 세포내 수송을 향상시키고자, 세포 흡수를 향상시키고 핵 위치 파악을 촉진하기 위한 두 개의 CPP 서열 연결된 펩타이드를 설계하였다. 궁극적으로, 한 펩타이드는 N 말단에 소수성 서열을 통합하였고(PFVYLI-CAND; 서열번호 16), 다른 펩타이드는 N 말단에 양전하를 띤 친수성 HIV-TAT 서열을 포함시켰다(CPP-CAND; 서열번호 17). 이들의 시험 결과, 소수성 CPP 서열을 포함하는 PFVYLI-CAND 펩타이드는 두 세포 유형 모두에서 세포 사멸을 유도하는 효능을 나타내지 않았다(도 7). 반면, 양전하를 띤 HIV-TAT 서열을 통합한 CPP-CAND는 세놀리틱 활성을 입증하였다(도 6b). 종래 약제인 FOXO4-DRI와 비교했을 때, SI75는 더 짧은 길이에도 불구하고 약 1.2배 더 높은 선택성으로 상당한 우월성을 나타냈으며, SI50은 비슷한 효능을 나타냈다(도 6c). 추가적으로, HIV-TAT 서열만을 포함하는 펩타이드와 HIV-TAT 서열이 p53 TAD PEP의 N-말단에 도입된 펩타이드로 세포를 처리한 결과, 세포 사멸이 최소한으로 유도되었다(도 7). 이러한 결과는 본 발명에서 개발한 펩타이드가 노화 세포에 선택성을 갖는 세놀리틱 약물로서 세포 내에서 강력한 기능성을 나타냄을 시사한다.
5. CPP-CAND는 FOXO4-p53 결합을 억제하고 카스파제 의존 경로를 통해 세포사멸을 유도한다.
FOXO4는 노화 유도 후 점진적으로 유염색질 초점(euchromatin foci)에 집약되고 p53과의 상호작용을 통해 노화 세포의 핵에 유지되어 노화 상태 유지에 기여하는 것으로 알려져 있다. 종래 개발된 약제인 FOXO4-DRI 및 ES2 펩타이드는 노화 세포의 핵 내에서 FOXO4-p53 상호작용을 파괴하여 이들 세포에서 세포사멸을 선택적으로 유도한다. 본 발명의 CPP-CAND는 FOXO4-p53 상호작용을 방해하도록 설계되었기 때문에 CPP-CAND 처리 후 노화 세포의 핵에서 FOXO4-p53bp1 초점의 파괴를 조사하였다.
면역형광 결과는 분열하는 세포의 핵과 비교하여 노화 세포의 핵 내에서 FOXO4 및 p53bp1 초점의 유의한 증가를 보여주었다(도 8a, 및 도 8b). 본 발명자들은 또한 FOXO4와 p53bp1 초점 사이의 빈번한 중첩을 관찰했는데, 이는 노화 세포의 핵에서 FOXO4와 p53 사이의 상호 작용과 공동 위치화를 나타내고(도 8a), FOXO4-p53 매개 노화의 효과적인 유도를 의미한다. CPP-CAND 처리 후, 노화세포의 핵에서 FOXO4 병소의 수가 약 7.1배로 유의하게 감소하는 것이 관찰되었다. 이는 CPP-CAND에 의한 핵 내 FOXO4-p53 상호작용의 성공적인 억제를 시사한다(도 8c, 및 도 8d). 또한, 본 발명자들은 20 μM의 CPP-CAND로 분열 및 노화 세포를 처리하고, 카스파제 3/7 활성을 평가하여 카스파제 의존성 세포 사멸을 확인하였다. 시험 결과, 각 세포 유형에 동일한 농도의 CPP-CAND를 처리하였음에도 불구하고, 노화세포의 44%에서 카스파제 3/7 활성이 관찰된 반면, 분열세포에서는 활성이 거의 관찰되지 않았다(도 8e). 분열세포와 노화세포를 DMSO로 처리한 대조군에서도 카스파제 3/7 활성이 거의 검출되지 않았다(도 9). 이는 카스파제 의존성 세포사멸이 노화세포에서 특이적으로 유도되었음을 의미한다. 종합하면, CPP-CAND는 핵에서 FOXO4-p53 상호작용을 억제하여 p53의 핵외 수송을 가능하게 하고, 노화 세포 선택적으로 세포사멸을 유도한다.
상기 본 발명의 펩타이드 억제제들의 서열을 하기 표 3에 나타내었다.
서열번호(No.) 펩타이드 서열
서열번호 15 CAND ALMLSPAAIAQWFTAA
서열번호 16 PFVYLI-CAND PFVYLIALMLSPAAIAQWFTAA
서열번호 17 CPP-CAND GRKKRRQRRRPPALMLSPAAIAQWFTAA
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
본 발명의 펩타이드 억제제는 노화 세포 제거가 필요한 다양한 보건/의학 분야에서 크게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

Claims (16)

  1. p53 전사활성화 도메인(transactivation domain) 영역 내 N 말단으로부터 42 내지 57 번째 위치의 아미노산 중 어느 하나가 알라닌으로 치환된 변형 펩타이드.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 펩타이드는 서열번호 1 내지 15 중 어느 하나로 표시되는 것인, 변형 펩타이드.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 펩타이드는 p53 전사활성화 도메인(transactivation domain) 영역 내 N 말단으로부터 42, 48, 49, 51, 56, 및 57 번째 위치의 아미노산 중 어느 하나가 알라닌으로 치환된 것인, 변형 펩타이드.
  4. 제 3항에 있어서,
    상기 펩타이드는 서열번호 2, 6, 7, 8, 13, 14, 및 15 중 어느 하나로 표시되는 것인, 변형 펩타이드.
  5. 제 3항에 있어서,
    상기 펩타이드는 p53 전사활성화 도메인(transactivation domain) 영역 내 N 말단으로부터 42, 48, 49, 51, 56, 및 57 번째 위치의 아미노산이 알라닌으로 치환된 것인, 변형 펩타이드.
  6. 제 5항에 있어서,
    상기 펩타이드는 서열번호 15로 표시되는 것인, 변형 펩타이드.
  7. 제 1항에 있어서,
    상기 펩타이드는 N 말단, 또는 C 말단에 소수성 서열, 또는 세포 투과 펩타이드(cell-penetrating peptide; CPP) 서열을 추가로 포함하는 것인, 변형 펩타이드.
  8. 제 7항에 있어서,
    상기 펩타이드는 서열번호 16 또는 17로 표시되는 것인, 변형 펩타이드.
  9. 제 1의 변형 펩타이드를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  10. 제 9항의 벡터로 형질 전환된 형질 전환체.
  11. 제 1항의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 노화 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물.
  12. 제 11항에 있어서,
    상기 노화 질환은 암, 당뇨병, 고혈압, 관절염, 골다공증, 근감소증, 사구체 신염, 만성 신부전, 천식, 만성 폐기종, 폐색전증, 폐렴, 만성 알레르기, 백내장, 녹내장, 망막변성, 난청, 대동맥 질환, 동맥경화증, 심부전, 허혈성 심질환, 부정맥, 말초 혈관질환 및 판막 질환, 우울증, 섬망, 감정 및 행동장애, 노인성 치매, 파킨슨병, 주름, 기미, 검버섯, 피부 건조증, 광선각화증, 및 피부 처짐으로 구성된 그룹에서 선택되는 어느 하나인 것인, 약학조성물.
  13. 노화 질환 치료가 필요한 개체에게 제 1항의 펩타이드, 또는 제 1항의 펩타이드를 포함하는 약학조성물을 투여하여 노화 질환을 치료하는 방법.
  14. 제 13항에 있어서,
    상기 노화 질환은 암, 당뇨병, 고혈압, 관절염, 골다공증, 근감소증, 사구체 신염, 만성 신부전, 천식, 만성 폐기종, 폐색전증, 폐렴, 만성 알레르기, 백내장, 녹내장, 망막변성, 난청, 대동맥 질환, 동맥경화증, 심부전, 허혈성 심질환, 부정맥, 말초 혈관질환 및 판막 질환, 우울증, 섬망, 감정 및 행동장애, 노인성 치매, 파킨슨병, 주름, 기미, 검버섯, 피부 건조증, 광선각화증, 및 피부 처짐으로 구성된 그룹에서 선택되는 어느 하나인 것인, 방법.
  15. 노화 질환을 치료하기 위한 제 1항의 펩타이드, 또는 제 1항의 펩타이드를 포함하는 약학조성물의 용도.
  16. 제 15항에 있어서,
    상기 노화 질환은 암, 당뇨병, 고혈압, 관절염, 골다공증, 근감소증, 사구체 신염, 만성 신부전, 천식, 만성 폐기종, 폐색전증, 폐렴, 만성 알레르기, 백내장, 녹내장, 망막변성, 난청, 대동맥 질환, 동맥경화증, 심부전, 허혈성 심질환, 부정맥, 말초 혈관질환 및 판막 질환, 우울증, 섬망, 감정 및 행동장애, 노인성 치매, 파킨슨병, 주름, 기미, 검버섯, 피부 건조증, 광선각화증, 및 피부 처짐으로 구성된 그룹에서 선택되는 어느 하나인 것인, 용도.
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