WO2025252560A1 - Système de microscopie par fluorescence, système de diagnostic par laser et procédé d'imagerie par fluorescence - Google Patents

Système de microscopie par fluorescence, système de diagnostic par laser et procédé d'imagerie par fluorescence

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WO2025252560A1
WO2025252560A1 PCT/EP2025/064720 EP2025064720W WO2025252560A1 WO 2025252560 A1 WO2025252560 A1 WO 2025252560A1 EP 2025064720 W EP2025064720 W EP 2025064720W WO 2025252560 A1 WO2025252560 A1 WO 2025252560A1
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sample
optical
pulses
optical medium
laser
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PCT/EP2025/064720
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Vincent Couderc
Tigran Mansuryan
Benjamin WETZEL
Alessandro Tonello
Bruno PESSOA CHAVES
Yago AROSA LOBATO
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Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite de Limoges
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite de Limoges
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Publication date
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Definitions

  • the present invention relates to laser diagnostic systems and in particular to the field of fluorescence imaging systems.
  • Prior art [0002] It is known to perform fluorescence imaging of a sample using an AA system as illustrated in Figure 1.
  • a light source 11 generates radiation 12, for example polychromatic, which is spectrally filtered by a filter 13 so as to be monochromatic.
  • Monochromatic radiation 12 is directed and then focused onto a sample EC using a dichroic mirror 14 and an objective lens 15, respectively, so as to generate fluorescence radiation 16.
  • This fluorescence radiation 16 is collimated by the objective lens 15 and then optionally spectrally filtered by a filter 17 before being focused by an eyepiece 18 onto a matrix photodetector 19.
  • the matrix photodetector 19 makes it possible to acquire an image of a region of the sample illuminated by the monochromatic radiation 12 and, for example, to detect the presence and location of fluorescent particles in this region.
  • the system in Figure 1 typically includes a translation system 20a on which the sample EC is mounted.
  • the translation system 20a allows the sample EC to be moved relative to the focal point of the monochromatic radiation 12 along a transverse plane.
  • the translation system 20a changes the region of the sample illuminated by the monochromatic radiation 12, the fluorescence image of which is acquired by the photodetector 19. By acquiring an image for each region scanned by the translation system 20a, it is possible to reconstruct a complete fluorescence image of the sample EC.
  • This displacement system can advantageously be replaced by a 2D scanner that allows the radiation (12) to be scanned transversely across the sample EC more quickly.
  • the radiation 12 is focused on the sample in the focal plane 21 of the objective. Furthermore, the depth of field is determined by the distance between the plane of the nearest object in focus and the most distant plane also in focus simultaneously.
  • the depth of field is very shallow and is generally measured in microns. It can be calculated using the following equation: where ⁇ ( ⁇ ) represents the depth of field, ⁇ is the wavelength of the radiation 12, ⁇ is the refractive index of the medium between the sample and the front lens of the objective, and ⁇ is the numerical aperture of the objective.
  • the invention aims to overcome the limitation imposed by the movement of mechanical elements and the speed of change of a longitudinal position of the focal point (also referred to hereafter as “longitudinal focusing speed").
  • the invention proposes a fluorescence microscopy system comprising a focusing system based on controlling the optical power of laser pulses via an optical power modulator. These power-modulated laser pulses are directed into an optical medium in which they undergo self-focusing (a third-order nonlinear optical phenomenon) with an instantaneous response.
  • the focal point in the optical medium has a longitudinal position that varies with the power of the laser pulses.
  • an object of the invention relates to an ultra-fast focusing assembly intended for a fluorescence imaging system or a diagnostic system comprising: - a laser source adapted to deliver first laser pulses having a first wavelength - an ultrafast optical power modulator adapted to modulate the power of the first laser pulses, so as to form second laser pulses with different optical powers; - an optical medium adapted so that the second pulses propagate by undergoing a self-focusing phenomenon within the optical medium, so as to define, for each second pulse, a focal point with a longitudinal position in the optical medium different from the other second pulses, a laser beam emanating from the optical medium and presenting the second self-focused pulses, called third pulses, being called the output beam.
  • Another object of the invention is a fluorescence microscopy system comprising: - an ultra-fast focusing assembly according to the invention - a microscope adapted to: - collect the output beam so that it can illuminate a sample - detect a first fluorescence radiation generated via the first wavelength ⁇ 1 , by the illumination of the sample with the output beam, then - acquire, from the first detected fluorescence radiation, at least one image of the sample for each of the third pulses illuminating the sample, each at least one image being associated with a transverse observation plane of the sample different from the other images.
  • the latter comprises a transverse focusing mechanical system, the microscope being configured so that at least one image of the sample is acquired by a transverse spatial scan of the sample by the output beam via the transverse focusing mechanical system.
  • the latter comprises a coupling optical element disposed on an optical path of the output beam and adapted to collimate the output beam.
  • the latter comprises an interferometric optical device disposed on the optical path upstream of the optical medium, and adapted to divide each first or second laser pulse into a plurality of replicas having different optical powers so that the microscope acquires so-called interlaced images of the sample for each of the self-focused replicas in the optical medium illuminating the sample, each image being associated with a transverse observation plane of the sample different from the other simultaneous images, the interlaced images acquired from a given first or second laser pulse are acquired by the microscope and form said at least one image of the sample.
  • the optical interferometric device is a Fabry-Pérot interferometer or a Michelson interferometer.
  • the optical power modulator is adapted to perform ultrafast modulation with a modulation frequency between 100 kHz and 1000 GHz.
  • the optical power modulator is an optical interferometric assembly or an electro-optical modulator, for example, an electro-optical or acousto-optical modulator.
  • the optical medium is adapted to allow a nonlinear conversion of said first wavelength so that each second modulated laser pulse has at least one second wavelength ⁇ 2 , said nonlinear conversion being, for example, a second harmonic generation or a third harmonic generation, the third pulses thus having said at least one second wavelength ⁇ 2 .
  • the optical medium is adapted so that said nonlinear conversion induces a saturation effect on the laser pulses in order to limit their fluence in the optical medium to a value less than 10 ⁇ 2.
  • the optical medium is a YAG, YVO4, or BBO crystal.
  • the microscope is further adapted to: - detect a second fluorescence beam generated via the second wavelength ⁇ 2 by illuminating the sample with the output beam , and then - acquire, from the second detected fluorescence beam, at least one so-called additional image of the sample for each of the third pulses illuminating the sample, each at least one additional image being associated with a transverse observation plane of the sample different from the other additional images.
  • the microscope includes a processor adapted to reconstruct a three-dimensional depth image from said at least one image of the sample associated with different transverse observation planes of the sample.
  • the optical medium is adapted to allow amplification of the second pulses in the optical medium.
  • the optical medium is a multimode amplifying optical fiber.
  • the latter comprises an additional optical element adapted to allow additional amplification or attenuation of the first pulses upstream of the optical medium.
  • Another object of the invention is a laser sample diagnostic system comprising: - an ultra-fast focusing assembly according to the invention - a diagnostic device adapted to collect the output beam reflected, transmitted, or scattered by a sample so as to determine a physical parameter of the sample.
  • the latter is adapted to collect the output beam reflected or scattered by the sample and then determine a variation in the shape of the sample, which generally has a plate-like shape, by comparing the intensity of the third pulses reflected or scattered by the sample, said variation in the shape of the plate forming said physical parameter of the sample.
  • a final object of the invention is a method for imaging a sample by fluorescence comprising the following steps: - generating first laser pulses having a first length - modulate the power of the first laser pulses, so as to form second laser pulses with different optical powers; - generate, in an optical medium, a self-focusing phenomenon of the second pulses so as to define, for each second pulse, a focal point having a longitudinal position in the optical medium different from the other second pulses, a laser radiation from the optical medium and having the self-focused second pulses, called third pulses, being called the output beam, - detect a first fluorescence radiation generated via the first wavelength ⁇ 1 , by illuminating a sample with the output beam, then - acquire, from the first detected fluorescence radiation, at least one image of the sample for each of the third pulses illuminating the sample, each at least one image being associated with a transverse observation plane of the sample different from the other images.
  • a fluorescence imaging system according to an embodiment of the invention
  • the elements are not to scale and identical reference numerals designate identical elements.
  • the optional features described in the description and the figures can be combined.
  • the invention relates to a laser-based sample diagnostic system enabling ultra-fast focusing of the diagnostic laser beam.
  • ultra-fast here means that focusing is performed at a frequency greater than or equal to 10 kHz.
  • the invention thus makes it possible to overcome the focusing speed inherently limited by the use of a mechanical (or optoelectronic, SLM-type) element, such as that found in the prior art fluorescence microscopy device of Figure 1.
  • FIG. 1 schematically illustrates a fluorescence microscopy system 1 according to the invention, including in particular the ultrafast focusing assembly SMP according to the invention.
  • the ultrafast focusing assembly SMP according to the invention includes a pulsed laser source SL adapted to generate an incident beam FI having first laser pulses IL1.
  • the IL1 pulses delivered by the laser source SL are preferably (but not necessarily) monochromatic with a wavelength and are typically generated with a repetition rate ranging from kilohertz to several hundred megahertz.
  • the pulsed SL laser source is not specific to the invention, and an exhaustive description of its operation or its various embodiments would fall outside the scope of the invention.
  • the ultrafast focusing assembly SMP according to the invention further comprises an ultrafast optical power modulator MP adapted to modulate the optical power of the first laser pulses IL1.
  • the optical power modulator MP makes it possible to form second laser pulses IL2 having different optical powers from the laser pulses IL1, which typically have equal or nearly equal power.
  • the optical power modulator MP is adapted so that at least two laser pulses IL2 have respectively a power ⁇ ⁇ and a power ⁇ ⁇ such that
  • this ⁇ 10% condition was determined by the inventors as being the condition minimal to allow a satisfactory focus difference under conventional operating conditions (see below).
  • the MP optical power modulator is adapted to perform ultrafast modulation of optical power with a modulation frequency between 100 kHz and 1000 GHz.
  • the MP optical power modulator is, for example, an amplitude-division interferometric optical assembly such as a Mach-Zehnder or Michelson interferometer.
  • the MP optical power modulator is an electro-optical modulator, for example based on a Pockels cell, or an acousto-optical modulator, or even a thermo-optical modulator.
  • the MP optical power modulator is resonant at the first wavelength ⁇ .
  • the ultrafast MP modulator comprises a resonant optical microcavity in the strong coupling regime comprising quantum well stacks as described in document WO 2020/193786 A1, the contents of which are considered included by reference.
  • a device makes it possible to obtain a very good response time (i.e., a high modulation frequency) while also allowing excellent modulation depth.
  • the ultrafast SMP focusing assembly according to the invention comprises a nonlinear MO optical medium adapted to induce a self-focusing effect on the IL2 pulses during their propagation within the MO optical medium.
  • the MO optical medium allows a variation in the longitudinal position (along the direction of the optical axis) of the focal point of the IL2 pulses during a variation in their optical power.
  • this self-focusing effect causes the IL2 pulses to focus at a focal point with a distance ⁇ ⁇ measured from the EO input of the MO optical medium which is equal to: with ⁇ 0 the waist (or smallest radius) of the incident beam FI.
  • the optical power ⁇ ⁇ [1; ⁇ ] of each of the pulses ⁇ 2 ⁇ [1; ⁇ ] directly influences the longitudinal position of its focal point within the optical medium MO. More precisely, the higher the optical power ⁇ ⁇ [1; ⁇ ] of the pulse ⁇ 2 ⁇ [1; ⁇ ] is, the higher the focal point of this pulse will be close to the entrance of the optical medium (i.e., will have a low ⁇ ⁇ ).
  • the second pulses IL2 propagate by undergoing a self-focusing phenomenon within the optical medium MO so as to define, for each second pulse ⁇ 2 ⁇ [1; ⁇ ] , a focal point having a longitudinal position ⁇ ⁇ in the optical medium different from the other second pulses ⁇ 2 ⁇ [1; ⁇ ], ⁇ given their different optical power.
  • the third pulses IL3 are the second pulses, at the output of the optical medium MO, having undergone self-focusing IL2, and the output beam FS is the laser radiation exiting the optical medium MO and exhibiting the third pulses IL3.
  • ⁇ denotes the longitudinal dimension in which it is possible to generate focal points with different longitudinal positions in the optical medium MO.
  • the ultrafast focusing assembly SMP of the invention makes it possible to control the longitudinal position of the focal point of the IL2 pulses in an ultrafast manner.
  • the ultrafast focusing assembly SMP of the invention is therefore particularly suitable for being coupled to a diagnostic device adapted to collect the output beam FS reflected, transmitted, or scattered by a sample EC so as to determine, in an ultrafast manner, a physical parameter in different transverse observation planes z1', ...zN' of the sample EC.
  • an optical system comprising for example an optical coupling assembly SC and an objective lens OB as illustrated in Figure 2 makes it possible to translate the ultrafast variation of the longitudinal position of the focal point of the IL2 pulses into a variation of a longitudinal position of the focal point of the IL3 pulses in the sample EC. More specifically, this optical system is adapted to form, in the EC sample, the image of the self-focusing focal points in the MO optical medium.
  • the ultra-fast focusing assembly SMP of the invention makes it possible to diagnose different transverse observation planes z1', ...zN' of the EC sample in an ultra-fast manner.
  • the ultra-fast focusing assembly SMP of the invention therefore allows for a significant improvement compared to known prior art devices in which the longitudinal focusing speed is intrinsically limited by the use of a mechanical/electromechanical/optomechanical element, such as that present in the fluorescence microscopy device of Figure 1.
  • a mechanical/electromechanical/optomechanical element such as that present in the fluorescence microscopy device of Figure 1.
  • the output beam FS is collected by an objective lens OB of the microscope M so as to illuminate the EC sample, which then generates light from the absorption of the first wavelength. a first RF1 fluorescence radiation.
  • the IL3 pulses of the output beam FS have focal points within the optical medium at different positions z1, ...zN, the IL3 pulses are focused into different transverse observation planes z1', ...zN' of the sample EC. This implies that each IL3 pulse will be focused by the objective lens OB within the sample into a respective observation plane, different from the other pulses, depending on the longitudinal position of self-focusing in the optical medium MO, and will therefore allow fluorescence imaging of this respective observation plane.
  • the microscope M of system 1 of the invention comprises an eyepiece OC adapted to form the image of the transverse observation planes z1', ...zN', on a matrix photodetector DT capable of detecting the first fluorescence radiation RF1.
  • a processing unit UT connected to the matrix photodetector DT is configured to acquire, from the first detected fluorescence radiation, an image z1 ' of the sample for each of the IL3 pulses illuminating the sample.
  • each image z1 ' is acquired from a respective IL3 pulse of a different power than the others and thus allows the imaging of a transverse observation plane zi' of the respective sample, and differs from the other images [0065] It is understood that these images ⁇ 1, ... , ⁇ , ... , The different transverse observation planes z1', ...zN' of the sample are acquired successively over time because the modulation of the IL1 pulses by the MP power modulator is also performed successively over time. However, as discussed in detail above, the modulation performed by the MP power modulator is ultrafast.
  • system 1 of the invention makes it possible to "scan" the sample longitudinally in an ultrafast manner by performing the imaging of a plurality of different "slices" of the sample EC (corresponding to the different transverse observation planes z1', ...zN').
  • the fluorescence microscopy system 1 allows for ultra-fast longitudinal focusing within the sample.
  • the fluorescence microscopy system 1 offers a significant improvement over prior art fluorescence microscopy devices in which longitudinal focusing was achieved by a mechanical element and whose speed was inherently limited.
  • the fluorescence microscopy system 1 comprises an optical coupling assembly SC to optimize the coupling of the output beam in the fluorescence microscope M.
  • the optical coupling assembly SC is known from the prior art, and a detailed description of its various embodiments would fall outside the scope of the invention.
  • the SC coupling optical assembly is a lens or a plurality of lenses allowing the output beam FS to be collimated and forming with the objective OB of the microscope M an afocal optical assembly allowing an image to be formed of the different focal points at positions z1, ...zN in different transverse observation planes z1', ...zN' of the sample EC.
  • the objective OB allows—alone or with the entire set of coupling optics SC—the formation of an image of the different focal points at positions z1, ...zN in different transverse observation planes z1', ...zN' of the sample EC, as illustrated in Figure 2.
  • the longitudinal distance between the first observation plane 1 ' (the observation plane furthest upstream in the optical path) and the last observation plane 2 ' (the observation plane furthest downstream in the optical path) is called the "object focusing range ⁇ 1'".
  • sample thickness ⁇ ⁇ is defined as the dimension of the sample along the longitudinal direction ⁇ . To image the entire sample, it is necessary that the object focusing range ⁇ ′ be greater than or equal to ⁇ ⁇ .
  • the laser source and the optical power modulator are adapted so that the maximum power and minimum power of the second pulses are such that ⁇ ′ ⁇ 0.5 and preferably such that ⁇ ′ ⁇ 0.5.
  • the ultrafast focusing assembly SMP comprises an OF optical assembly for focusing the IL2 pulses within the optical medium.
  • the OF optical assembly increases the illumination of the IL2 laser pulses focused within the optical medium. This then increases the variation in the refractive index induced by the Kerr effect, which leads to an increase in the self-focusing effect. Indeed, as explained above and as described by equation (2), an increase in illumination thanks to the OF optical assembly allows a reduction in the self-focusing distance . [0075] Thus, the addition of the OF optical assembly makes it possible to increase the maximum illumination of the IL2 pulses. This therefore allows a shift in the longitudinal position of the focal points towards the EO entrance of the optical medium and, in particular , a shift of the first observation plane upstream of the optical path.
  • the OF optical assembly makes it possible to increase the focusing range ⁇ within which it is possible to generate focal points with different longitudinal positions, and thus allows an increase in the object focusing range ⁇ ′.
  • adding an attenuator or an amplifier before the OF optical assembly makes it possible to adjust the power range of the second pulses after the OF optical assembly to adequately optimize the compatibility of the SL laser source and the MP power modulator with the operating regime of the MO optical medium's self-focusing. The system is thus made more modular.
  • the fluorescence microscopy system 1 includes a translation system ST adapted to allow a transverse spatial scan (along the directions in Figure 4) of the sample by the output beam FS.
  • a transverse spatial scan (along the directions in Figure 4) of the sample by the output beam FS.
  • the processing unit In a single transverse scan, the processing unit (PU ) is then adapted to reconstruct a "complete " fluorescence image of each transverse observation plane of the sample by digital processing . (for example by concatenating or adding the fluorescence intensities of the transverse regions ⁇ ⁇ [1; ⁇ ] of the same observation plane transverse ⁇ ⁇ ′ ).
  • the "complete" fluorescence image of a transverse observation plane of the sample is obtained by a transverse spatial scan of the sample by the output beam via the ST translation system, for the same laser power of the IL2 pulses during the scan.
  • the use of an ST translation system is compatible with all embodiments of the invention of the fluorescence microscopy system 1.
  • the sample EC is mounted on the ST translation system, which is, for example, a piezoelectric translation stage connected to the laser source SL to allow synchronization of the transverse spatial scan with the repetition of the IL1 laser pulses.
  • the ST translation system which is, for example, a piezoelectric translation stage connected to the laser source SL to allow synchronization of the transverse spatial scan with the repetition of the IL1 laser pulses.
  • a scanning system with rotating two mirrors (scanner) is arranged in the beam path to allow a transverse spatial scan of the sample by the output beam.
  • These two systems are more generally grouped under the generic term of transverse focusing mechanical systems.
  • the UT processing unit is adapted to reconstruct a three-dimensional depth image of the sample from the "full" fluorescence images.
  • the MO optical medium is adapted to allow amplification of the first IL2 pulses during their propagation within the MO optical medium.
  • the MO optical medium is a bulk medium, or a multimode optical fiber doped with rare-earth ions and pumped by a pump beam (not shown in the figures). The amplification of the IL2 pulses within the MO medium allows additional control over the longitudinal position of the focal point of the self-focused pulses.
  • the optical medium comprises a structure adapted to allow for better control of the self-focusing of the IL2 pulses in the optical medium.
  • a medium with a Bragg grating allows for the compression of a laser pulse, thereby increasing its peak power during propagation and decreasing the self-focusing distance from the inlet into the nonlinear medium.
  • Figure 5 illustrates an embodiment of the invention allowing for the simultaneous imaging of several transverse observation planes 1′, ..., ..., 1′ of the sample EC.
  • the fluorescence microscopy system 1 includes an interferometric optical device (IOD) positioned in the optical path of the laser beam, optically upstream of the optical medium MO (for example, downstream of the MP modulator as illustrated in Figure 5), and adapted to split each first pulse IL1 (or each second pulse IL2, as appropriate) into a plurality of replicas IL11 , ... IL1N having different optical powers.
  • IOD interferometric optical device
  • the pulse IL1 or IL2 from which a plurality of replicas are formed simultaneously is called the “initial pulse.”
  • the interferometric optical device IOD
  • each replica IL11 , ... IL1N is successively autofocused in the MO medium at a longitudinal position different from the other replicas, depending on its optical power.
  • each replica IL11, ...IL1N is successively focused within the sample in a respective transverse observation plane, different from the other replicas (for example, by managing the respective travel times of the replicas using a delay line).
  • the photodetector DT acquires an interlaced image of the sample.
  • the interlaced images associated with an initial pulse are acquired simultaneously (or almost simultaneously, depending on the interferometric optical setup), and each interlaced image associated with a The initial pulse corresponds to an image of a transverse observation plane of the sample that differs from the other interlaced images.
  • the introduction of the DOI interferometric optical device allows, through the creation of the replicas IL11, ...IL1N, for the simultaneous (or quasi-simultaneous) imaging of a plurality of "slices" of the sample (the transverse observation planes).
  • the DOI interferometric optical device is a Michelson interferometer, a Fabry-Pérot interferometer, or more generally, an amplitude-division interferometer.
  • the DOI interferometric optical device and the MP power optical modulator form a single element.
  • the modulation of the power of the IL1 pulses is performed quasi-instantaneously by the DOI interferometric optical device.
  • the DT photodetector therefore acquires images directly ... , ⁇ temporally intertwined, respectively associated with the transverse observation planes ⁇ 1′, ... , ... , ⁇ ′ .
  • the image acquired by the DT photodetector therefore corresponds to an image in which N transverse planes are focused.
  • Figure 6 illustrates an embodiment of the invention in which the optical medium MO further enables a nonlinear conversion of the first wavelength into at least a second wavelength ⁇ 2 so as to acquire additional fluorescence information on the sample EC.
  • the optical medium is adapted to induce, from the first wavelength ⁇ 1 , a second harmonic generation or a third harmonic generation.
  • the optical medium is a YAG crystal, a YVO4 crystal, or a BBO crystal.
  • the nonlinear conversion of the first wavelength is performed at the focal point of the self-focused IL3 pulse in the MO optical medium. This implies that the focal points of the IL3 pulses are identical for wavelengths ⁇ 1 and ⁇ 2 .
  • each The IL3 pulses of the FS output beam exhibit wavelengths ⁇ 1 and ⁇ 2 , both of which are focused within the sample in the same transverse observation plane ⁇ 1′, ..., ..., ⁇ 2, depending on the power of the IL2 pulse.
  • the sample is adapted to absorb the second wavelength ⁇ 2 so as to emit a second fluorescence radiation RF2.
  • the DT photodetector of the microscope M is adapted to detect the second wavelength ⁇ 2 .
  • this multispectral detection by the DT photodetector is performed by two separate sensors and a spectral optical element (for example, a dichroic mirror or a prism) allowing spatial separation of the first and second wavelengths and their detection by a respective sensor.
  • the processing unit UT is configured to acquire, from the second fluorescence radiation detected by the photodetector DT, an "additional " image of the sample for each of the third pulses illuminating the sample EC .
  • Each additional image therefore corresponds to additional fluorescence information generated by the second wavelength and is associated with a transverse observation plane of the sample different from the other additional images.
  • the material of the optical medium MO is adapted so that the nonlinear conversion of the first wavelength allows a saturation effect to be induced on the laser pulses IL2.
  • the optical medium and the laser source SL are adapted so that the laser pulses IL2 propagate in the optical medium with a fluence of less than 10 ⁇ / ⁇ 2.

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Abstract

Système de microscopie par fluorescence comprenant un milieu optique (ML) non linéaire et comprenant : - une source laser (SL) adaptée pour délivrer des premières impulsions lasers (IL1) présentant une première longueur d'onde λ1; - un modulateur optique de puissance (MP) adapté pour moduler une puissance des premières impulsions lasers (IL1), de manière à former des deuxièmes impulsions lasers (IL2) présentant des puissances optiques différentes; - ledit milieu optique (MO) étant adapté pour que les deuxièmes impulsions se propagent en subissant un phénomène d'autofocalisation au sein du milieu optique de manière à définir, pour chaque deuxième impulsion, un point de focalisation présentant une position longitudinale dans le milieu optique différente des autres deuxièmes impulsions, un rayonnement laser issu du milieu optique et présentant les deuxièmes impulsions autofocalisées, dites troisièmes impulsions, étant appelé faisceau de sortie (FS), - un microscope (M) adapté pour : - collecter un premier rayonnement de fluorescence généré via la première longueur d'onde λ1, par l'illumination d'un échantillon (Ech) avec le faisceau de sortie, puis - acquérir, à partir du premier rayonnement de fluorescence collecté, au moins une image de l'échantillon pour chacune des troisièmes impulsions illuminant l'échantillon, chaque au moins une image étant associée à un plan d'observation transverse de l'échantillon diffèrent des autres images.

Description

DESCRIPTION Titre de l'invention: Système de microscopie par fluorescence, Système de diagnostic par laser et Procédé d’imagerie par fluorescence Domaine [0001] La présente invention concerne les systèmes de diagnostic par laser et notamment le domaine des systèmes d’imagerie par fluorescence. Technique antérieure: [0002] Il est connu d’effectuer une imagerie par fluorescence d’un échantillon à l’aide d’un système AA selon l’illustration de la figure 1. [0003] Une source de lumière 11 génère un rayonnement 12 par exemple polychromatique et filtré spectralement par un filtre 13 de manière à être monochromatique. Le rayonnement monochromatique 12 est dirigé puis focalisé sur un échantillon EC à l’aide d’un miroir dichroïque 14 et d’un objectif 15 respectivement, de manière à générer un rayonnement de fluorescence 16. Ce rayonnement de fluorescence 16 est collimaté par l’objectif 15 puis optionnellement filtré spectralement par un filtre 17 avant d’être focalisé par un oculaire 18 sur un photodétecteur matriciel 19. Le photodétecteur matriciel 19 permet d’acquérir une image d’une région de l’échantillon illuminée par le rayonnement monochromatique 12 et par exemple de détecter la présence et l’emplacement de particules fluorescentes dans cette région. [0004] Afin d’obtenir une image « complète » bi-dimensionnelle de l’échantillon EC, le système de la figure 1 comprend typiquement un système de translation 20a sur lequel est monté l’échantillon EC. Le système de translation 20a permet de déplacer l’échantillon EC par rapport au point de focalisation du rayonnement monochromatique 12 selon un plan transversal. Ainsi, le système de translation 20a permet de changer la région de l’échantillon illuminée par le rayonnement monochromatique 12 et dont l’image de fluorescence est acquise par le photodétecteur 19. En acquérant une image pour chaque région balayée grâce au système de translation 20a, il est possible de reconstruire une image complète de fluorescence de l’échantillon EC. [0005] Ce système de déplacement peut avantageusement être remplacé par un scanner 2D permettant de balayer transversalement le rayonnement (12) sur l’échantillon EC de manière plus rapide. [0006] De manière connue en soi, le rayonnement 12 est focalisé sur l’échantillon dans le plan focal 21 de l’objectif. De plus, la profondeur de champ est déterminée par la distance entre le plan de l'objet le plus proche mis au point et le plan le plus éloigné également mis au point simultanément. Autrement, elle correspond à la dimension de la « tranche » de l’échantillon EC imagée selon la direction longitudinale. Cette « tranche » est centrée sur le plan focal 21. [0007] En microscopie, la profondeur de champ est très courte et se mesure généralement en microns. On peut la calculer par l’équation suivante : où ^^^^^^(^^) représente la profondeur de champ, ^^ est la longueur d'onde du rayonnement 12, ^^ est l'indice de réfraction du milieu entre l’échantillon et la lentille frontale de l'objectif, et ^^^^ est l'ouverture numérique de l'objectif. [0008] Afin d’imager une pluralité de « tranches » différentes de l’échantillon, il est possible de déplacer longitudinalement (c’est-à-dire selon l’axe optique) l’objectif 15 relativement à l’échantillon EC, par exemple à l’aide d’un système de translation 20b. Ainsi, on déplace la position longitudinale du plan focal 21 et sa position au sein de l’échantillon. [0009] Cependant, le contrôle de la position du plan focal 21 dans l’échantillon est réglable à une vitesse limitée par le déplacement d’un élément mécanique (le système de translation 20b) ou d’un ajustement de la phase spatiale par un modulateur optoelectronique lui aussi lent. Le temps caractéristique de ces déplacements sont typiquement de l’ordre de la milliseconde. [0010] L'invention vise à surmonter certains des problèmes précités de l’art antérieur. Plus précisément, l’invention vise à dépasser la limitation imposée par le déplacement d’éléments mécaniques et quant à la vitesse de modification d’une position longitudinale du point de focalisation (aussi appelée par la suite « vitesse de mise au point longitudinale »). [0011] Pour cela, l’invention propose un système de microscopie par fluorescence comprenant un système de mise au point basé sur le contrôle de la puissance optique d’impulsions lasers via un modulateur optique de puissance. Ces impulsions lasers modulées en puissance sont dirigées dans un milieu optique dans lesquelles elles subissent une autofocalisation (phénomène optique non- linéaire d’ordre 3) avec une réponse instantanée. Ainsi, le point de focalisation dans le milieu optique présente une position longitudinale variant avec la puissance des impulsions lasers. [0012] Le couplage de ce rayonnement autofocalisé dans un microscope permet ainsi une mise au point ajustable, au sein d’un échantillon, avec la puissance des impulsions lasers. Dans ces conditions, le contrôle de la puissance, qui peut être réalisé de manière ultra-rapide par un modulateur électro-optique par exemple, permet d'accélérer une mise au point qui est d'habitude réalisée par voie mécanique lente. [0013] Ainsi, le système de microscopie par fluorescence permet d’imager une pluralité de tranches de l’échantillon de manière ultra-rapide. Résumé de l’invention : [0014] A cet effet, un objet de l’invention porte sur un ensemble mise au point ultra- rapide destiné à un système d’imagerie par fluorescence ou un système de diagnostic comprenant : - une source laser adaptée pour délivrer des premières impulsions lasers présentant une première longueur d’onde - un modulateur optique de puissance ultra-rapide adapté pour moduler une puissance des premières impulsions lasers, de manière à former des deuxièmes impulsions lasers présentant des puissances optiques différentes ; - un milieu optique adapté pour que les deuxièmes impulsions se propagent en subissant un phénomène d’autofocalisation au sein du milieu optique de manière à définir, pour chaque deuxième impulsion, un point de focalisation présentant une position longitudinale dans le milieu optique différente des autres deuxièmes impulsions, un rayonnement laser issu du milieu optique et présentant les deuxièmes impulsions autofocalisées, dites troisièmes impulsions, étant appelé faisceau de sortie. [0015] Un autre objet de l’invention est un système de microscopie par fluorescence comprenant : - un ensemble de mise au point ultra-rapide selon l’invention - un microscope adapté pour : - collecter le faisceau de sortie de manière à ce qu’il puisse illuminer un échantillon - détecter un premier rayonnement de fluorescence généré via la première longueur d’onde ^^1, par l’illumination de l’échantillon avec le faisceau de sortie, puis - acquérir, à partir du premier rayonnement de fluorescence détecté, au moins une image de l’échantillon pour chacune des troisièmes impulsions illuminant l’échantillon, chaque au moins une image étant associée à un plan d’observation transverse de l’échantillon diffèrent des autres images. [0016] Selon un mode de réalisation du système de microscopie par fluorescence, ce dernier comprend un système mécanique de mise au point transverse, ledit microscope étant configuré pour que chaque au moins une image de l’échantillon soit acquise par un balayage spatial transverse de l’échantillon par le faisceau de sortie via le système mécanique de mise au point transverse. [0017] Selon un mode de réalisation du système de microscopie par fluorescence, ce dernier comprend un élément optique de couplage disposé sur un trajet optique du faisceau de sortie et adapté pour collimater le faisceau de sortie. [0018] Selon un mode de réalisation du système de microscopie par fluorescence, ce dernier comprend un dispositif optique interférométrique disposé sur le trajet optique en amont du milieu optique, et adapté pour diviser chaque première impulsion laser ou chaque deuxième impulsion laser en une pluralité de répliques présentant des puissances optiques différentes de manière à ce que le microscope acquiert des images dite entrelacées de l’échantillon pour chacune des répliques autofocalisées dans ledit milieu optique et illuminant l’échantillon, chaque image étant associée à un plan d’observation transverse de l’échantillon différent des autres images simultanées, les images entrelacées acquises à partir d’une première ou deuxième impulsion laser donnée étant acquises par le microscope et formant lesdites au moins une images de l’échantillon. De manière préférentielle, le dispositif optique interférométrique est un interféromètre de Fabry-Pérot ou un interféromètre de Michelson. [0019] Selon un mode de réalisation du système de microscopie par fluorescence, le modulateur optique de puissance est adapté pour effectuer une modulation ultrarapide avec une fréquence de modulation comprise entre 100 KHz et 1000 GHz. De manière préférentielle, le modulateur optique de puissance est un ensemble optique interférométrique ou un modulateur électro-optique, par exemple un modulateur électro-optique ou acousto-optique. [0020] Selon un mode de réalisation du système de microscopie par fluorescence, la source laser et le modulateur optique de puissance sont adaptés pour qu’une puissance maximale ^^^^^^^^ et une puissance minimale ^^^^^^^^ des deuxièmes impulsions soient telles que Δ^^′ ≥ 0,5. ^^^^^^ et préférentiellement telles que Δ^^ ′ = ^^^^^^, avec ^^^^^^ une épaisseur de l’échantilllon et avec Δ^^′ une distance longitudinale entre le plan d’observation transverse le plus en aval du trajet optique et le plan d’observation transverse le plus en amont du trajet optique. [0021] Selon un mode de réalisation du système de microscopie par fluorescence, le milieu optique est adapté pour permettre une conversion non linéaire de ladite première longueur d’onde de sorte que chaque deuxième impulsion laser modulée présente au moins une deuxième longueur d’onde ^^2, ladite conversion non linéaire étant par exemple une génération de seconde harmonique ou une génération de troisième harmonique, les troisièmes impulsions présentant ainsi ladite au moins deuxième longueur d’onde ^^2. De manière préférentielle, le milieu optique est adapté pour que ladite conversion non linéaire permette d’induire un effet de saturation des impulsions lasers afin de limiter la fluence de ces dernières dans le milieu optique à une valeur inférieure à 10 ^^/^^^^². De manière encore préférentielle, le milieu optique est un cristal en YAG, YVO4, ou encore en BBO. [0022] Selon un mode de réalisation compatible avec les trois précédents modes de réalisation, le microscope est en outre adapté pour : - détecter un deuxième rayonnement de fluorescence généré via la deuxième longueur d’onde ^^2, par l’illumination de l’échantillon avec le faisceau de sortie, puis - acquérir, à partir du deuxième rayonnement de fluorescence détecté, au moins une image dite additionnelle de l’échantillon pour chacune des troisièmes impulsions illuminant l’échantillon, chaque au moins une image additionnelle étant associée à un plan d’observation transverse de l’échantillon diffèrent des autres images additionnelles. [0023] Selon un mode de réalisation du système de microscopie par fluorescence, le microscope comprend un processeur adapté pour reconstruire une image tridimensionnelle de profondeur à partir desdites au moins une image de l’échantillon associées à des plans d’observation transverses de l’échantillon différents. [0024] Selon un mode de réalisation du système de microscopie par fluorescence, le milieu optique est adapté pour permettre une amplification des deuxièmes impulsions dans le milieu optique. De manière préférentielle, le milieu optique est une fibre optique amplificatrice multimode. [0025] Selon un mode de réalisation du système de microscopie par fluorescence, ce dernier comprend un élément optique additionnel adapté pour permettre une amplification ou une atténuation additionnelle des premières impulsions en amont du milieu optique. [0026] Un autre objet de l’invention est un système de diagnostic d’un échantillon par laser comprenant : - un ensemble de mise au point ultra-rapide selon l’invention - un dispositif de diagnostic adapté pour collecter le faisceau de sortie réfléchi, transmis ou diffusé par un échantillon de manière à déterminer un paramètre physique de l’échantillon. [0027] Selon un mode de réalisation du système de diagnostic, ce dernier est adapté pour collecter le faisceau de sortie réfléchi ou diffusé par l’échantillon puis déterminer une variation d’une forme de l’échantillon présentant une forme générale en forme de plaque par une comparaison d’une intensité des troisièmes impulsions réfléchies ou diffusées par l’échantillon, ladite variation de la forme de la plaque formant ledit paramètre physique de l’échantillon. [0028] Un dernier objet de l’invention est un procédé d’imagerie d’un échantillon par fluorescence comprenant les étapes suivantes : - générer des premières impulsions lasers présentant une première longueur - moduler une puissance des premières impulsions lasers, de manière à former des deuxièmes impulsions lasers présentant des puissances optiques différentes ; - générer, dans un milieu optique, un phénomène d’autofocalisation des deuxièmes impulsions de manière à définir, pour chaque deuxième impulsion, un point de focalisation présentant une position longitudinale dans le milieu optique différente des autres deuxièmes impulsions, un rayonnement laser issu du milieu optique et présentant les deuxièmes impulsions autofocalisées, dites troisièmes impulsions, étant appelé faisceau de sortie, - détecter un premier rayonnement de fluorescence généré via la première longueur d’onde ^^1, par l’illumination d’un échantillon avec le faisceau de sortie, puis - acquérir, à partir du premier rayonnement de fluorescence détecté, au moins une image de l’échantillon pour chacune des troisièmes impulsions illuminant l’échantillon, chaque au moins une image étant associée à un plan d’observation transverse de l’échantillon diffèrent des autres images. Brève description des figures : [0029] D’autres caractéristiques, détails et avantages de l’invention ressortiront à la lecture de la description faite en référence aux dessins annexés donnés à titre d’exemple et qui représentent, respectivement : [0030] [Fig.1], un système d’imagerie par fluorescence connu de l’art antérieur, [0031] [Fig.2], un système d’imagerie par fluorescence selon un mode de réalisation de l’invention, [0032] [Fig.3], une illustration schématique de l’autofocalisation des deuxièmes impulsions dans le milieu optique dans un système d’imagerie par fluorescence selon un mode de réalisation de l’invention, [0033] [Fig.4], un système d’imagerie par fluorescence selon un mode de réalisation de l’invention, [0034] [Fig.5], un système d’imagerie par fluorescence selon un mode de réalisation de l’invention, [0035] [Fig.6], un système d’imagerie par fluorescence selon un mode de réalisation de l’invention, [0036] Dans les figures, sauf contre-indication, les éléments ne sont pas à l’échelle et les références identiques désignent des éléments identiques. [0037] En outre, sauf contre-indication, les caractéristiques optionnelles décrites dans la description et les figures peuvent être combinées entre elles. Description détaillée : [0038] L’invention porte sur un système de diagnostic d’un échantillon par laser permettant une mise au point ultra-rapide de la focalisation du faisceau laser de diagnostic. Pour clarifier, par « ultra-rapide », on entend ici que la mise au point est effectuée à une fréquence supérieure ou égale à 10 kHz. L’invention permet ainsi de dépasser la vitesse de mise au point intrinsèquement limitée par l’utilisation d’un élément mécanique (ou optoélectronique de type SLM) comme notamment présent dans le dispositif de microscopie par fluorescence de la figure 1 connu de l’art antérieur. [0039] Dans l’invention, cette mise au point ultra-rapide est permise par un ensemble de mise au point basé sur une modulation de la puissance optique d’impulsions lasers autofocalisées au sein d’un milieu optique. [0040] Dans la suite de la description, nous détaillerons différents modes de réalisation d’un système de microscopie par fluorescence selon l’invention mais il est entendu que les éléments décrits s’appliquent plus généralement à tout système de diagnostic par laser comprenant l’ensemble de mise au point selon l’invention. De plus, les différentes structures détaillées dans la présente description et les figures sont données à titre d’exemple et ont pour objectif d’illustrer l’invention. Elles ne doivent en aucun cas être considérées comme limitatrices de la portée de l’invention. Diverses modifications et variations des systèmes décrits apparaitrons à l'homme du métier sans s'écarter de la portée et de l'esprit de l'invention. Notamment, tous les moyens équivalents connus de l’homme de l’art permettant de réaliser le microscope, le modulateur optique de puissance et le dispositif optique interférométrique (lorsqu’il est présent) sont couverts par la portée de l’invention. [0041] La figure 2 illustre de manière schématique un système 1 de microscopie par fluorescence selon l’invention comprenant notamment l’ensemble de mise au point ultra-rapide SMP selon l’invention. [0042] L’ensemble de mise au point ultra-rapide SMP selon l’invention comprend une source laser SL impulsionnelle adaptée pour générer un faisceau incident FI présentant des premières impulsions lasers IL1. Les impulsions IL1 délivrées par la source laser SL sont de préférence (mais pas obligatoirement) monochromatiques de longueur d’onde et sont typiquement générées avec un taux de répétition allant du kilohertz à plusieurs centaines de mégahertzs. La source laser SL impulsionnelle n’est pas spécifique à l’invention et une description exhaustive de son fonctionnement ou de ses différents modes de réalisation sortirait du cadre de l’invention. [0043] L’ensemble de mise au point ultra-rapide SMP selon l’invention comprend en outre un modulateur optique de puissance MP ultra-rapide adapté pour moduler la puissance optique des premières impulsions lasers IL1. Ainsi, le modulateur optique de puissance MP permet de former des deuxièmes impulsions lasers IL2 présentant des puissances optiques différentes à partir des impulsions lasers IL1 qui présentent typiquement une puissance égale ou quasi-égale. [0044] Pour clarifier, par « puissances optiques différentes » on entend ici que le modulateur optique de puissance MP est adapté pour qu’au moins deux impulsions lasers IL2 présentent respectivement une puissance ^^^^ et une puissance ^^^^ telles que | ^^^^−^^^^ | | ^^^^−^^ ^^^^ ≥ 10% , préférentiellement ^^ | ^^^^ ≥ 30% . En effet, cette condition ≥ 10% a été déterminée par les inventeurs comme étant la condition minimale pour permettre une différence de mise au point satisfaisante dans des conditions de fonctionnement conventionnelles (voir plus loin). [0045] De manière préférentielle, le modulateur optique de puissance MP est adapté pour effectuer une modulation ultrarapide de la puissance optique avec une fréquence de modulation comprise entre 100 KHz et 1000 GHz. [0046] Le modulateur optique de puissance MP est par exemple un ensemble optique interférométrique à division d’amplitude tel qu’un interféromètre de Mach-Zehnder ou de Michelson. [0047] Selon un autre mode de réalisation, le modulateur optique de puissance MP est un modulateur électro-optique, par exemple basé sur une cellule de Pockels, ou un modulateur acousto-optique, ou encore thermo-optique. [0048] Selon un autre mode de réalisation, le modulateur optique de puissance MP est résonant à la première longueur d’onde ^^1. Par exemple, selon un mode de réalisation, le modulateur ultra-rapide MP comprend une microcavité optique résonante en régime de couplage fort comprenant des empilements de puits quantiques telle que décrite dans le document WO 2020/193786 A1 dont le contenu est considéré comme inclus par référence. Un tel dispositif permet d’obtenir un très bon temps de réponse (c’est-à-dire une fréquence de modulation élevée) tout en permettant une excellente profondeur de modulation. [0049] En plus des éléments décrits plus haut, l’ensemble de mise au point ultra-rapide SMP selon l’invention comprend un milieu optique MO non linéaire et adapté pour induire un effet d’autofocalisation des impulsions IL2 lors de leur propagation au sein du milieu optique MO. Ainsi, le milieu optique MO permet une variation de la position longitudinale (selon la direction de l’axe optique ^^) du point de focalisation des impulsions IL2 lors d’une variation de leur puissance optique. [0050] Pour rappel, l’effet d’autofocalisation est induit par l'effet Kerr optique, un processus non linéaire du troisième ordre qui apparaît dans les milieux exposés à un rayonnement électromagnétique intense et qui produit une variation de l'indice de réfraction ^^ = ^^0 + ^^2^^^^ avec ^^0 et ^^2 l’indice de réfraction linéaire et non linéaire respectivement du milieu optique MO et avec ^^^^ l’intensité des impulsions lasers IL2 au sein du milieu optique MO. [0051] Dans l’invention, pour permettre l’apparition de cet effet Kerr optique (et donc l’autofocalisation des impulsions IL2), il est nécessaire que la source laser SL et le modulateur de puissance MP soient adaptés pour que la puissance optique ^^^^∈[1;^^] de chaque impulsion ^^^^2^^∈[1;^^] soit supérieure à la puissance critique d’autofocalisation ^^^^^^ du milieu optique MO qui vaut : [0052] Comme illustré dans la figure 3, cet effet d’autofocalisation entraine la focalisation des impulsions IL2 en un point de focalisation présentant une distance ^^^^^^ mesurée à partir de l’entrée EO du milieu optique MO qui vaut : avec ^^0 le waist (ou plus petit rayon) du faisceau incident FI. [0053] Pour des impulsions IL2 de puissance suffisamment élevée par rapport à ^^^^^^, on peut écrire : [0054] A titre d’exemple non limitatif, selon un mode de réalisation, la source laser SL est telle que la longueur d’onde ^^1vaut 1064 ^^^^ et ^^0 = 50 ^^^^, le milieu optique MO est en YAG et ^^ 0 = 1,82 et ^^2 = 6 × . Par l’équation (1), on calcule alors la puissance critique qui vaut ^^^^^^ = 1,5 ^^^^ . Ainsi, pour une impulsion IL2 de puissance ^^ = 6 ^^^^, on calcule par l’équation (3) une distance d’autofocalisation vaut ^^^^^^ = 4,2 ^^^^. [0055] Ainsi, on comprend que la puissance optique ^^^^∈[1;^^] de chacune des impulsions ^^^^2^^∈[1;^^] influe directement sur la position longitudinale de son point de focalisation au sein du milieu optique MO. Plus précisément, plus la puissance optique ^^^^∈[1;^^] de l’impulsion ^^^^2^^∈[1;^^] est élevée, plus le point de focalisation de cette impulsion sera proche de l’entrée du milieu optique (c’est-à-dire aura un ^^^^^^ faible). [0056] Ainsi, comme illustré dans la figure 2, pour ^^ impulsions ^^^^21, … , … , ^^^^2^^ de puissance décroissante, on obtient ^^ point de focalisation présentant une position longitudinale ^^1, … , ^^^^, … , ^^^^ de plus en plus éloignée de l’entrée EO du milieu optique. [0057] Plus généralement, dans l’ensemble de mise au point ultra-rapide SMP de l’invention, les deuxièmes impulsions IL2 se propagent en subissant un phénomène d’autofocalisation au sein du milieu optique MO de manière à définir, pour chaque deuxième impulsion ^^^^2^^∈[1;^^], un point de focalisation présentant une position longitudinale ^^^^ dans le milieu optique différente des autres deuxièmes impulsions ^^^^2^^∈[1;^^],^^≠^^ compte tenu de leur puissance optique différente. [0058] Dans la suite de la description, on appelle troisièmes impulsions IL3 les deuxièmes impulsions, en sortie du milieu optique MO, ayant subi une autofocalisation IL2 et on appelle faisceau de sortie FS le rayonnement laser sortant du milieu optique MO et présentant les troisièmes impulsions IL3. De plus, on note Δ^^ la dimension longitudinale dans laquelle il est possible de générer des points de focalisation avec des positions longitudinales différentes dans le milieu optique MO. Cette dimension longitudinale Δ^^ est appelée par la suite « gamme de mise au point » et correspond à la différence entre la position longitudinale ^^^^ du point de focalisation le plus éloigné de l’entrée EO du milieu optique (et donc associé à l’impulsion IL2 de plus faible puissance optique ^^^^^^^^ ) et la position longitudinale ^^1 du point de focalisation le plus proche de l’entrée EO du milieu optique (et donc associé à l’impulsion IL2 de plus forte puissance optique ^^^^^^^^). A partir de l’équation (3), on peut écrire Δ^^ sous la forme suivante : [0059] A titre d’exemple non limitatif, les inventeurs ont démontré qu’une variation de gamme de mise au point Δ^^ = 5 ^^^^ était possible pour un milieu optique MO en YAG et présentant une longueur (dimension selon l’axe optique) de 7 ^^^^. [0060] Ainsi, en contrôlant la puissance optique des impulsions IL2 via le modulateur ultra-rapide MP, l’ensemble de mise au point ultra-rapide SMP de l’invention permet de contrôler la position longitudinale du point de focalisation des impulsions IL2 de manière ultra-rapide. L’ensemble de mise au point ultra-rapide SMP de l’invention est donc particulièrement adapté à être couplé à un dispositif de diagnostic adapté pour collecter le faisceau de sortie FS réfléchi, transmis ou diffusé par un échantillon EC de manière à déterminer de manière ultra-rapide un paramètre physique dans différents plans d’observation transverses z1’, …zN’ de l’échantillon EC. En effet, un système optique, comprenant par exemple un ensemble optique de couplage SC et un objectif OB comme illustré dans la figure 2, permet de reporter la variation ultra-rapide de la position longitudinale du point de focalisation des impulsions IL2 en une variation d’une position longitudinale du point de focalisation des impulsions IL3 dans l’échantillon EC. Plus précisément, ce système optique est adapté pour former, dans l’échantillon EC, l’image des points de focalisation autofocalisés dans le milieu optique MO. Ainsi, l’ensemble de mise au point ultra-rapide SMP de l’invention permet de diagnostiquer différents plans d’observation transverses z1’, …zN’ de l’échantillon EC de manière ultra- rapide. [0061] L’ensemble de mise au point ultra-rapide SMP de l’invention permet donc une amélioration notable par rapport aux dispositifs connus de l’art antérieur dans lequel la vitesse de mise au point longitudinale est intrinsèquement limitée par l’utilisation d’un élément mécanique/électro-mécanique/opto-mécanique comme notamment présent dans le dispositif de microscopie par fluorescence de la figure 1. [0062] Retournons maintenant à la description du système de microscopie par fluorescence 1 selon l’invention. Comme illustré dans la figure 2, le faisceau de sortie FS issu du milieu optique MO et présentant les impulsions ayant subi des autofocalisations IL3 est collecté au sein d’un microscope par fluorescence M afin d’effectuer l’imagerie d’un échantillon EC. Plus précisément, le faisceau de sortie FS est collecté par un objectif OB du microscope M de manière à illuminer l’échantillon EC afin que ce dernier génère à partir de l’absorption de la première longueur d’onde un premier rayonnement de fluorescence RF1. [0063] Compte tenu du fait que les impulsions IL3 du faisceau de sortie FS présentent des points de focalisation au sein du milieu optique dans des positions z1, …zN différentes, les impulsions IL3 sont focalisées dans différents plans d’observation transverses z1’, …zN’ de l’échantillon EC. Cela implique que chaque impulsion IL3 va être focalisée par l’objectif OB au sein de l’échantillon dans un plan d’observation respectif et différent des autres impulsions en fonction de la position longitudinale d’autofocalisation dans le milieu optique MO et va donc permettre d’imager par fluorescence ce plan d’observation respectif. Ainsi, en détectant successivement le premier rayonnement de fluorescence RF1 généré dans ces différents plans d’observation transverses z1’, …zN’, il est possible d’imager successivement une pluralité de « tranches » différentes de l’échantillon EC. [0064] Pour cela, le microscope M du système 1 de l’invention comprend un oculaire OC adapté pour former l’image des plans d’observation transverses z1’, …zN’, sur un photodétecteur matriciel DT capable de détecter le premier rayonnement de fluorescence RF1. En outre, une unité de traitement UT reliée au photodétecteur matriciel DT est configurée pour acquérir, à partir du premier rayonnement de fluorescence détecté, une image ^^^^ de l’échantillon pour chacune des IL3 impulsions illuminant l’échantillon. Comme expliqué plus haut, chaque image ^^^^ est acquise à partir d’une impulsion IL3 respective de puissance différente des autres et donc permet l’imagerie d’un plan d’observation zi’ transverse de l’échantillon respectif et diffèrent des autres images [0065] Il est entendu que ces images ^^1, … , ^^^^, … , des différents plans d’observation transverses z1’, …zN’ de l’échantillon sont acquises successivement au cours du temps car la modulation des impulsions IL1 par le modulateur de puissance MP est elle-aussi effectuée successivement au cours du temps. Cependant, comme évoqué plus haut en détail, la modulation effectuée par le modulateur de puissance MP est ultra-rapide. Cela implique que la variation de la position longitudinale du point de focalisation des impulsions IL2 dans le milieu optique MO (contrôlée par le modulateur de puissance MP) et la variation de la position longitudinale du point de focalisation des impulsions IL3 dans l’échantillon sont elles aussi effectuées de manière ultra-rapide. [0066] En résumé, le système 1 de l’invention permet de « scanner » longitudinalement l’échantillon de manière ultra-rapide en réalisant l’imagerie d’une pluralité de « tranches » différentes de l’échantillon EC (correspondant aux différents plans d’observation transverses z1’, …zN’). Autrement dit, le système de microscopie par fluorescence 1 permet une mise au point ultra-rapide longitudinalement dans l’échantillon. [0067] Aussi, le système de microscopie par fluorescence 1 permet une nette amélioration par rapport aux dispositifs de microscopie par fluorescence connus de l’art antérieur dans lesquels la mise au point longitudinale était effectuée par un élément mécanique et dont la vitesse était intrinsèquement limitée. [0068] De manière préférentielle, comme illustré dans la figure 2, le système de microscopie par fluorescence 1 comprend un ensemble optique de couplage SC afin d’optimiser le couplage du faisceau de sortie dans le microscope par fluorescence M. [0069] L’ensemble optique de couplage SC est connu de l’art antérieur est une description détaillée de ses différents modes de réalisation sortirait du cadre de l’invention. Selon un mode de réalisation préféré, l’ensemble optique de couplage SC est une lentille ou une pluralité de lentilles permettant de collimater le faisceau de sortie FS et formant avec l’objectif OB du microscope M un ensemble optique afocal permettant de former une image des différents points de focalisation aux positions z1, …zN dans différents plans d’observation transverses z1’, …zN’ de l’échantillon EC. [0070] Plus généralement, dans le système 1 de l’invention, l’objectif OB permet -seul ou avec l’ensemble des optiques de couplage SC- de former une image des différents points de focalisation aux positions z1, …zN dans différents plans d’observation transverses z1’, …zN’ de l’échantillon EC comme illustré dans la figure 2. On appelle « gamme de mise au point objet Δ^^′ » la distance longitudinale entre le premier plan d’observation ^^1′ (le plan d’observation le plus en amont du trajet optique) et le dernier plan d’observation ^^^^′ (le plan d’observation le plus en aval du trajet optique). [0071] La relation entre la position des plans d’observation transverses z1’, …zN’ au sein de l’échantillon EC et la position z1, …zN des points de focalisation des impulsion IL2 au sein du milieu optique MO est régie par l’optique géométrique de manière connue en soi. En outre, quelle que soit la conception optique de l’objectif OB (et du système de couplage SC le cas échéant), il existe un facteur ^^^^ tel que Δ^^′ = ^^^^ . Δ^^ , le facteur ^^^^ correspondant au grandissement transversal de l’ensemble optique (formé par l’objectif OB et le système de couplage SC dans le mode de réalisation de la figure 2) réalisant l’image des points de focalisation de positions z1, …zN en des points de focalisations disposé dans les plans d’observation transverses z1’, …zN’. [0072] Il est en général préférable d’imager la totalité de l’épaisseur ^^^^^^ de l’échantillon. On appelle « épaisseur ^^^^^^ de l’échantillon », la dimension de l’échantillon selon la direction longitudinale ^^. Pour imager la totalité de l’échantillon, il est nécessaire que la gamme de mise au point objet Δ^^′ soit supérieure ou égale à ^^^^^^. Comme évoqué plus haut, Δ^^′ = ^^^^ . Δ^^ et Δ^^ dépend (entre autres) directement de la puissance maximale ^^^^^^^^ et de la puissance minimale ^^^^^^^^ des deuxièmes impulsions IL2 (voir équation (4)). Ainsi, de manière préférentielle, la source laser et le modulateur optique de puissance sont adaptés pour qu’une puissance maximale ^^^^^^^^ et une puissance minimale ^^^^^^^^ des deuxièmes impulsions soient telles que Δ^^′ ≥ 0,5. ^^ ′ ^^^^ et préférentiellement telles que Δ^^ ≥ ^^^^^^. [0073] Alternativement, il est préférable d’imager la majorité de l’épaisseur de l’échantillon et on a alors une puissance maximale ^^^^^^^^ et une puissance minimale ^^ ′ ^^^^^^ des deuxièmes impulsions telles que Δ^^ ≥ 0,5. ^^^^^^ [0074] De manière préférentielle, comme illustré dans le mode de réalisation de la figure 2, l’ensemble de mise au point ultra-rapide SMP comprend un ensemble optique OF permettant de focaliser les impulsions IL2 au sein du milieu optique. L’ensemble optique OF permet d’augmenter l’éclairement des impulsions lasers IL2 focalisées au sein du milieu optique. Cela permet alors l’augmentation de la variation de l’indice de réfraction induite par l’effet Kerr ce qui entraine un accroissement de l’effet d’autofocalisation. En effet, comme expliqué ci-dessus et comme décrit par l’équation (2), un accroissement de l’éclairement ^^^^ grâce à l’ensemble optique OF permet une réduction de la distance d’autofocalisation ^^^^^^. [0075] Ainsi, l’ajout de l’ensemble optique OF permet d’augmenter l’éclairement maximal ^^^^,^^^^^^ des impulsions IL2. Cela permet donc un déplacement de la position longitudinale des points de focalisation vers l’entrée EO du milieu optique et notamment un déplacement du premier plan d’observation ^^1′ vers l’amont du trajet optique. Cependant, il est toujours possible de diminuer la puissance de certaines des impulsions IL2 via la source laser ou le modulateur MP pour avoir le dernier plan d’observation ^^^^′ placé à la même position longitudinale avec ou sans ensemble optique OF. Autrement dit, l’ensemble optique OF permet d’accroitre la gamme de mise au point Δ^^ dans laquelle il est possible de générer des points de focalisation avec des positions longitudinales différentes et donc permet une augmentation de la gamme de mise au point objet Δ^^′. [0076] Alternativement, l’ajout d’un atténuateur ou d’un amplificateur avant l’ensemble optique OF permet d’ajuster la plage de puissance des deuxièmes impulsions après l’ensemble optique OF pour optimiser de manière adéquate la compatibilité de la source laser SL et du modulateur de puissance MP avec le régime de fonctionnement de l’autofocalisation du milieu optique MO. Le système est ainsi rendu plus modulaire. [0077] Comme expliqué plus haut, le faisceau de sortie FS est focalisée au sein de l’échantillon EC. Cela implique que la dimension de la tâche focale dans le plan d’observation ^^^^ est réduite. Ainsi, l’information de fluorescence du plan d’observation ^^^^ déterminée via l’image ^^^^ est intrinsèquement limitée spatialement par la dimension de cette tâche focale. [0078] Pour surmonter ce problème, dans le mode de réalisation de la figure 4, le système de microscopie par fluorescence 1 comprend un système de translation ST adapté pour permettre un balayage spatial transverse (selon les directions ^^ et ^^ dans l’exemple de la figure 4) de l’échantillon par le faisceau de sortie FS. Ainsi, on acquiert une pluralité ^^ d’images ^^^^∈[1;^^],^^ des plans d’observation transverses ^^^^∈[1;^^]′ différents d’une même région transverse ^^^^ à partir de ^^ impulsions lasers ^^^^2^^∈[1;^^] de puissances ^^^^∈[1;^^] différentes, puis on balaye différentes régions transverses ^^^^∈[1;^^] de l’échantillon. En un unique balayage transverse, l’unité de traitement UT est alors adaptée pour reconstruire une image de fluorescence « complète » ^^^^,^^ de chaque plan d’observation transverse ^^^^′ de l’échantillon par traitement numérique des (par exemple en concaténant ou en additionnant les intensités de fluorescence des régions transverses ^^^^∈[1;^^] d’un même plan d’observation transverses ^^^^′ ). [0079] Autrement dit, l’image de fluorescence « complète » ^^^^,^^ d’un plan d’observation transverse ^^^^ de l’échantillon est obtenue par un balayage spatial transverse de l’échantillon par le faisceau de sortie via le système de translation ST, pour une même puissance laser des impulsions IL2 lors du balayage. L’utilisation d’un système de translation ST est compatible avec tous les modes de réalisation de l’invention du système de microscopie par fluorescence 1. [0080] Selon le mode de réalisation illustré dans la figure 4, l’échantillon EC est monté sur le système de translation ST qui est par exemple une platine de translation piézo-électrique reliée à la source laser SL pour permettre une synchronisation du balayage spatial transverse avec la répétition des impulsions lasers IL1. Alternativement, selon un autre mode de réalisation, un système de balayage par rotation de deux miroirs (scanner) est disposé sur le trajet du faisceau afin de permettre un balayage spatial transverse de l’échantillon par le faisceau de sortie. Ces deux systèmes sont plus généralement regroupés sous le terme générique de systèmes mécaniques de mise au point transverse. [0081] De manière préférentielle, l’unité de traitement UT est adaptée pour reconstruire une image tridimensionnelle de profondeur de l’échantillon à partir des ^^ images de fluorescence « complète » de l’échantillon correspondant chacune à une tranche respective de l’échantillon (un plan d’observation transverse ^^^^′ respectif). Ce type de reconstruction numérique d’image 3D à partir d’une pluralité d’image 2D planaires est connu de l’homme de l’art et notamment particulièrement utilisé dans le domaine de l’imagerie médicale (par exemple en IRM). [0082] Selon un mode de réalisation de l’invention, le milieu optique MO est adapté pour permettre une amplification des premières impulsions IL2 lors de leur propagation au sein du milieu optique MO. Par exemple, le milieu optique MO est un milieu massif, ou une fibre optique multimode dopée avec des ions terres-rares et pompée par un faisceau de pompe (non représenté dans les figures). L’amplification des impulsions IL2 au sein du milieu MO permet un contrôle additionnel quant à la position longitudinale du point de focalisation des impulsions autofocalisées. En effet, l’amplification d’une impulsion IL2i entraine une augmentation de la puissance ^^^^ de cette impulsion et donc un déplacement de la position longitudinale du point de focalisation vers l’entrée EO du milieu optique (voir équation (3)). Ainsi, tout comme l’ensemble optique OF, un milieu optique MO amplificateur permet l’augmentation de la gamme de mise au point objet Δ^^′. [0083] Selon un mode de réalisation préféré, le milieu optique comprend une structuration adaptée pour permettre un meilleur contrôle de l’autofocalisation des impulsions IL2 dans le milieu optique. Un milieu avec un réseau de Bragg permet par exemple de compresser une impulsion laser augmentant ainsi sa puissance crête pendant sa propagation et diminuant la distance d’autofocalisation a partir de l’entrée dans le milieu non linéaire. [0084] La figure 5 illustre un mode de réalisation de l’invention permettant d’effectuer de l’imagerie simultanée de plusieurs plans d’observation transverses ^^1′, … , … , ^^^^′ de l’échantillon EC. Pour cela, le système de microscopie par fluorescence 1 comprend un dispositif optique interférométrique DOI disposé sur le trajet optique du faisceau laser, optiquement en amont du milieu optique MO (par exemple en aval du modulateur MP comme illustré dans la figure 5) et adapté pour diviser chaque première impulsion IL1 (ou chaque deuxième impulsion IL2 le cas échéant) en une pluralité de répliques IL11, …IL1N présentant des puissances optiques différentes. On appelle « impulsion initiale » l’impulsion IL1 ou IL2 à partir de laquelle une pluralité de répliques est formée simultanément. [0085] De manière critique, de par sa conception optique, le dispositif optique interférométrique DOI est adapté pour former ces répliques IL11, …IL1N simultanément à partir d’une impulsion initiale IL1. Pour les mêmes raisons que celles évoquées plus haut, chaque réplique IL11, …IL1N est autofocalisée successivement dans le milieu MO en une position longitudinale différente des autres répliques selon sa puissance optique. De même, chaque réplique IL11, …IL1N est focalisée successivement au sein de l’échantillon dans un plan d’observation transverse respectif et différent des autres répliques (par exemple en gérant par une ligne à retard les temps de trajet respectif des répliques). Ainsi, pour chacune des répliques d’une impulsion initiale qui sont autofocalisées dans le milieu optique puis illuminent l’échantillon EC, le photodétecteur DT acquiert une image dite entrelacée de l’échantillon. Les images entrelacées associées à une impulsion initiale sont acquises simultanément (ou quasi-simultanément selon le dispositif optique interférométrique) et chaque image entrelacée associée à une impulsion initiale correspond à une image d’un plan d’observation transverse de l’échantillon différent des autres images entrelacées. [0086] Ainsi, à la différence des modes de réalisation précédemment détaillés, l’introduction du dispositif optique interférométrique DOI permet, par la création des répliques IL11, …IL1N, d’imager une pluralité de « tranches » de l’échantillon (les plans d’observation transverses) de manière simultanée (ou quasi-simultanée). [0087] A titre d’exemple non limitatif, le dispositif optique interférométrique DOI est un interféromètre de Michelson, un interféromètre de Fabry-Pérot ou plus généralement un interféromètre à division d’amplitude. [0088] Selon une variante du mode de réalisation de la figure 5, le dispositif optique interférométrique DOI et le modulateur optique de puissance MP forment un seul et même élément. Autrement dit, la modulation de la puissance des impulsions IL1 est effectuée de manière quasi-instantanée par le dispositif optique interférométrique DOI. Dans cette variante, le photodétecteur DT acquiert donc directement des images … , ^^^^ entrelacées temporellement, associées respectivement aux plans d’observation transverses ^^1′, … , … , ^^^^′ . L’image acquise par le photodétecteur DT correspond donc à une image dans laquelle N plans transverses sont mis au point. [0089] La figure 6 illustre un mode de réalisation de l’invention dans lequel le milieu optique MO permet en outre une conversion non linéaire de la première longueur en au moins une deuxième longueur d’onde ^^2 de manière à acquérir une information de fluorescence additionnelle sur l’échantillon EC. Ce mode de réalisation est compatible avec tous les modes de réalisation précédemment détaillés (notamment le mode de réalisation de la figure 5). [0090] A titre d’exemple non limitatif, le milieu optique est adapté pour induire, à partir de la première longueur d’onde ^^1, une génération de seconde harmonique ou une génération de troisième harmonique. Par exemple, le milieu optique est un cristal en YAG, en YVO4, ou encore en BBO. [0091] De manière connue en soi, la conversion non linéaire de la première longueur est effectuée au point de focalisation de l’impulsion IL3 autofocalisée dans le milieu optique MO. Ceci implique que les points de focalisation des impulsions IL3 sont identiques pour les longueurs d’onde ^^1 et ^^2. Ainsi, chaque impulsions IL3 du faisceau de sortie FS présente les longueurs d’onde ^^1 et ^^2 qui sont toutes les deux focalisées au sein de l’échantillon dans un même plan d’observation transverse ^^1′, … , … , ^^^^′ en fonction de la puissance de l’impulsion IL2. [0092] L’échantillon est adapté pour absorber la deuxième longueur d’onde ^^2 de manière à émettre un deuxième rayonnement de fluorescence RF2. [0093] En plus de la détection de la première longueur d’onde ^^1, le photodétecteur DT du microscope M est adapté pour détecter la deuxième longueur d’onde ^^2. A titre d’exemple non limitatif, cette détection multispectrale par le photodétecteur DT est effectuée par deux capteurs distincts et un élément optique spectral (par exemple un miroir dichroïque ou un prisme) permettant une séparation spatiale de la première et de la deuxième longueur d’onde et leur détection par un capteur respectif. [0094] Ainsi, l’unité de traitement UT est configurée pour acquérir, à partir du deuxième rayonnement de fluorescence détecté par le photodétecteur DT, une image ^^^^,^^∈[1;^^] « additionnelle » de l’échantillon pour chacune des troisièmes impulsions ^^^^3^^∈[1;^^] illuminant l’échantillon EC. Chaque image additionnelle ^^^^,^^∈[1;^^] correspond donc à une information de fluorescence additionnelle générée par la deuxième longueur d’onde ^^2 et est associée à un plan d’observation transverse ^^^^′ de l’échantillon diffèrent des autres images additionnelles. Comme expliqué plus haut, ce plan d’observation transverse ^^^^′ pour lequel l’image additionnelle ^^^^,^^∈[1;^^] est acquise via la longueur d’onde ^^2 est identique à celui imagé via la longueur [0095] Dans le mode de réalisation de la figure 6, afin d’éviter l’apparition de dommages optiques induits par le laser dans le milieu optique, le matériau du milieu optique MO est adapté pour que la conversion non linéaire de la première longueur d’onde permette d’induire un effet de saturation des impulsions lasers IL2. Pour cela, de manière préférentielle, le milieu optique et la source laser SL sont adaptés pour que les impulsions lasers IL2 se propagent dans le milieu optique avec une fluence inférieure à 10 ^^/^^^^². [0096] Les inventeurs ont déterminé qu’un milieu optique en YAG présente un effet de saturation par conversion non linéaire satisfaisant permettant d’éviter l’apparition de dommages optiques.

Claims

Revendications 1. Ensemble mise au point ultra-rapide (SMP) destiné à un système d’imagerie par fluorescence ou un système de diagnostic comprenant : - une source laser (SL) adaptée pour délivrer des premières impulsions lasers (IL1) présentant une première longueur d’onde - un modulateur optique de puissance (MP) ultra-rapide adapté pour moduler une puissance des premières impulsions lasers (IL1), de manière à former des deuxièmes impulsions lasers (IL2) présentant des puissances optiques différentes ; - un milieu optique (MO) adapté pour que les deuxièmes impulsions se propagent en subissant un phénomène d’autofocalisation au sein du milieu optique de manière à définir, pour chaque deuxième impulsion, un point de focalisation présentant une position longitudinale (z1,…, zN) dans le milieu optique différente des autres deuxièmes impulsions, un rayonnement laser issu du milieu optique et présentant les deuxièmes impulsions autofocalisées, dites troisièmes impulsions (IL3), étant appelé faisceau de sortie (FS).
2. Système (1) de microscopie par fluorescence comprenant : - un ensemble de mise au point ultra-rapide selon la revendication 1 - un microscope (M) adapté pour : - collecter le faisceau de sortie (FS) de manière à ce qu’il puisse illuminer un échantillon (EC) - détecter un premier rayonnement de fluorescence (RF1) généré via la première longueur par l’illumination de l’échantillon (EC) avec le faisceau de sortie, puis - acquérir, à partir du premier rayonnement de fluorescence détecté, au moins une image de l’échantillon pour chacune des troisièmes impulsions illuminant l’échantillon, chaque au moins une image étant associée à un plan d’observation (z1’, …zN’) transverse de l’échantillon diffèrent des autres images.
3. Système de microscopie par fluorescence selon la revendication précédente comprenant un système mécanique de mise au point transverse (ST), ledit microscope étant configuré pour que chaque au moins une image de l’échantillon soit acquise par un balayage spatial transverse de l’échantillon par le faisceau de sortie via le système mécanique de mise au point transverse (ST).
4. Système de microscopie par fluorescence selon la revendication 2 ou 3, comprenant un élément optique de couplage (SC) disposé sur un trajet optique du faisceau de sortie et adapté pour collimater le faisceau de sortie.
5. Système de microscopie par fluorescence selon l’une quelconque des revendications 2 à 4, comprenant un dispositif optique interférométrique (DOI) disposé sur le trajet optique en amont du milieu optique (MO), et adapté pour diviser chaque première impulsion laser ou chaque deuxième impulsion laser en une pluralité de répliques (IL11, …IL1N) présentant des puissances optiques différentes de manière à ce que le microscope acquiert des images dite entrelacées de l’échantillon pour chacune des répliques autofocalisées dans ledit milieu optique et illuminant l’échantillon, chaque image étant associée à un plan d’observation transverse de l’échantillon différent des autres images simultanées, les images entrelacées acquises à partir d’une première ou deuxième impulsion laser donnée étant acquises par le microscope et formant lesdites au moins une images de l’échantillon.
6. Système de microscopie par fluorescence selon la revendication précédente, dans lequel le dispositif optique interférométrique (DOI) est un interféromètre de Fabry-Pérot ou un interféromètre de Michelson.
7. Système de microscopie par fluorescence selon l’une quelconque des revendications 2 à 6, dans lequel le modulateur optique de puissance est adapté pour effectuer une modulation ultrarapide avec une fréquence de modulation comprise entre 100 KHz et 1000 GHz.
8. Système de microscopie par fluorescence selon la revendication précédente, dans lequel le modulateur optique de puissance est un ensemble optique interférométrique ou un modulateur électro-optique ou acousto-optique.
9. Système de microscopie par fluorescence selon l’une quelconque des revendications 2 à 8, dans lequel la source laser et le modulateur optique de puissance sont adaptés pour qu’une puissance maximale ^^^^^^^^ et une puissance minimale ^^^^^^^^ des deuxièmes impulsions soient telles que Δ^^′ ≥ 0,5. ^^ ′ ^^^^ et préférentiellement telles que Δ^^ = ^^^^^^, avec ^^^^^^ une épaisseur de l’échantilllon et avec Δ^^′ une distance longitudinale entre le plan d’observation transverse le plus en aval du trajet optique et le plan d’observation transverse le plus en amont du trajet optique.
10. Système de microscopie par fluorescence selon l’une quelconque des revendications 2 à 9, dans lequel le milieu optique est adapté pour permettre une conversion non linéaire de ladite première longueur d’onde de sorte que chaque deuxième impulsion laser modulée présente au moins une deuxième longueur d’onde ^^2, ladite conversion non linéaire étant par exemple une génération de seconde harmonique ou une génération de troisième harmonique, les troisièmes impulsions présentant ainsi ladite au moins deuxième longueur d’onde ^^2.
11. Système de microscopie par fluorescence selon la revendication précédente, dans lequel le milieu optique est adapté pour que ladite conversion non linéaire permette d’induire un effet de saturation des impulsions lasers afin de limiter la fluence de ces dernières dans le milieu optique à une valeur inférieure à 10 ^^/^^^^².
12. Système de microscopie par fluorescence selon la revendication précédente, dans lequel le milieu optique est un cristal en YAG, YVO4, ou encore en BBO.
13. Système de microscopie par fluorescence selon l’une quelconque des revendications 10 à 12, dans lequel le microscope est en outre adapté pour : - détecter un deuxième rayonnement de fluorescence (RF2) généré via la deuxième longueur d’onde ^^2, par l’illumination de l’échantillon (Ech) avec le faisceau de sortie, puis - acquérir, à partir du deuxième rayonnement de fluorescence détecté, au moins une image dite additionnelle de l’échantillon pour chacune des troisièmes impulsions illuminant l’échantillon, chaque au moins une image additionnelle étant associée à un plan d’observation transverse de l’échantillon diffèrent des autres images additionnelles.
14. Système de microscopie par fluorescence selon l’une quelconque des revendications 2 à 13, dans lequel le microscope comprend un processeur (UT) adapté pour reconstruire une image tridimensionnelle de profondeur à partir desdites au moins une image de l’échantillon associées à des plans d’observation transverses de l’échantillon différents.
15. Système de microscopie par fluorescence selon l’une quelconque des revendications 2 à 14, dans lequel le milieu optique est adapté pour permettre une amplification des deuxièmes impulsions dans le milieu optique.
16. Système de microscopie par fluorescence selon l’une quelconque des revendications 2 à 15, comprenant un élément optique additionnel adapté pour permettre une amplification ou une atténuation additionnelle des premières impulsions en amont du milieu optique.
17. Système de diagnostic d’un échantillon (EC) par laser comprenant : - un ensemble de mise au point ultra-rapide selon la revendication 1 - un dispositif de diagnostic adapté pour collecter le faisceau de sortie réfléchi, transmis ou diffusé par un échantillon de manière à déterminer un paramètre physique de l’échantillon.
18. Procédé d’imagerie d’un échantillon par fluorescence comprenant les étapes suivantes : A. générer des premières impulsions lasers (IL1) présentant une première longueur d’onde ^^1; B. moduler une puissance des premières impulsions lasers (IL1), de manière à former des deuxièmes impulsions lasers (IL2) présentant des puissances optiques différentes ; C. générer, dans un milieu optique, un phénomène d’autofocalisation des deuxièmes impulsions de manière à définir, pour chaque deuxième impulsion, un point de focalisation présentant une position longitudinale dans le milieu optique différente des autres deuxièmes impulsions, un rayonnement laser issu du milieu optique et présentant les deuxièmes impulsions autofocalisées, dites troisièmes impulsions, étant appelé faisceau de sortie (FS), D. détecter un premier rayonnement de fluorescence généré via la première longueur par l’illumination d’un échantillon (EC) avec le faisceau de sortie, puis E. acquérir, à partir du premier rayonnement de fluorescence détecté, au moins une image de l’échantillon pour chacune des troisièmes impulsions illuminant l’échantillon, chaque au moins une image étant associée à un plan d’observation transverse de l’échantillon diffèrent des autres images.
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