WO2025205329A1 - 細胞培養用フィルム基材、包装体、細胞シート付フィルム基材、細胞シート付フィルム基材の凍結物、細胞培養用フィルム基材の製造方法、および細胞シート付フィルム基材の製造方法 - Google Patents

細胞培養用フィルム基材、包装体、細胞シート付フィルム基材、細胞シート付フィルム基材の凍結物、細胞培養用フィルム基材の製造方法、および細胞シート付フィルム基材の製造方法

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WO2025205329A1
WO2025205329A1 PCT/JP2025/010713 JP2025010713W WO2025205329A1 WO 2025205329 A1 WO2025205329 A1 WO 2025205329A1 JP 2025010713 W JP2025010713 W JP 2025010713W WO 2025205329 A1 WO2025205329 A1 WO 2025205329A1
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film substrate
cell culture
cell
culture
cells
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PCT/JP2025/010713
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English (en)
French (fr)
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篤生 小坂
由貴 中西
敬介 村田
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Central Glass Co Ltd
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Central Glass Co Ltd
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M3/00—Tissue, human, animal or plant cell, or virus culture apparatus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues

Definitions

  • the present invention relates to a film substrate for cell culture, a package, a film substrate with a cell sheet, a frozen film substrate with a cell sheet, a method for manufacturing a film substrate for cell culture, and a method for manufacturing a film substrate with a cell sheet.
  • Patent Document 1 describes a culture method for producing a cell sheet on the temperature-responsive polymer layer of a film fixed to the bottom surface, using a film having a resin layer bonded to the bottom surface of a cell culture vessel and a temperature-responsive polymer layer provided on the resin layer (Claim 1, paragraph 0026, etc. of Patent Document 1).
  • the following film substrate for cell culture packaging, film substrate with cell sheet, frozen film substrate with cell sheet, method for manufacturing film substrate for cell culture, and method for manufacturing film substrate with cell sheet.
  • a film substrate for cell culture having a culture surface on at least one surface, A film substrate for cell culture, wherein the polar component of the surface free energy on the culture surface, as determined based on the Owens-Wendt method, is 10.0 mJ/ m2 or more.
  • the cell culture film substrate according to 1. The film substrate for cell culture functions as a free-standing membrane without being fixed to the inside of a culture vessel.
  • the cell culture film substrate according to 1. or 2. A film substrate for cell culture, wherein the polar component of the surface free energy on the culture surface is 55 mJ/ m2 or less. 5.
  • Film substrate for cell culture 6.
  • a film substrate for cell culture, wherein [C1-C2] is 3 atomic % or more. 7.
  • the cell culture film substrate according to any one of 1. to 6. The cell culture film substrate is made of a material containing an organic polymer compound having an aromatic ring, or an organic polymer compound having an aromatic ring and an oxygen atom.
  • the cell culture film substrate according to any one of 1. to 7. The material constituting the film substrate for cell culture comprises one or more selected from the group consisting of polyether ether ketone, polyethylene terephthalate, and polystyrene.
  • the cell culture film substrate according to any one of 1. to 8. A film substrate for cell culture having a thickness of 5 ⁇ m or more and 250 ⁇ m or less. 10.
  • a packaged product in which the cell culture film substrate according to any one of 1. to 9. is packaged in a packaging material. 11.
  • the process gas includes one or more selected from the group consisting of an inert gas and a gas containing an oxygen atom;
  • the pressure is 0.1 Pa or more and 100 Pa or less,
  • a method for producing a film substrate for cell culture, wherein the discharge treatment intensity is 150 W ⁇ min/m 2 or more and 15,000 W ⁇ min/m 2 or less.
  • a method for producing the cell culture film substrate according to 13. or 14. A method for producing a film substrate for cell culture, wherein the chemical formula of the material of the film substrate for cell culture contains an oxygen atom. 16.
  • the present invention provides a cell culture film substrate with excellent cell adhesiveness for forming a cell sheet, a package using the same, a cell sheet-attached film substrate, a frozen cell sheet-attached film substrate, a method for manufacturing a cell culture film substrate, and a method for manufacturing a cell sheet-attached film substrate.
  • 1 is a cross-sectional view schematically illustrating an example of the configuration of a cell culture film substrate according to the present embodiment.
  • 1A to 1C are cross-sectional views schematically illustrating an example of a process for producing a cell sheet-attached film substrate according to the present embodiment.
  • 10A to 10C are cross-sectional views illustrating steps in a modified example of the freezing method of the present embodiment.
  • the cell culture film substrate of this embodiment has a culture surface on at least one surface, and the polar component of the surface free energy on the culture surface, as determined based on the Owens-Wendt method, is 10.0 mJ/ m2 or more.
  • treatment with a gas containing oxygen atoms is preferable rather than treatment with argon gas
  • treatment conditions using argon gas may also result in a desirable surface state.
  • the interior of the culture surface may be composed of an irradiated region entirely treated with plasma, or may have a non-irradiated region partially untreated with plasma.
  • the area ratio (S1/S2) of the irradiated region (S1) to the non-irradiated region (S2) within the culture surface is not particularly limited, but may be 1 to 70.
  • the irradiated and non-irradiated regions may be arranged in a regular pattern, such as a line-and-space pattern, a polka dot pattern, or a grid pattern. For example, by forming irradiated and non-irradiated regions with a line-and-space pattern on the culture surface, cell orientation in a cell sheet formed on the culture surface can be improved.
  • the contact angle was measured and analyzed using the following measurement mode (sessile drop method): a contact angle meter: DMo-502 (Kyowa Interface Science Co., Ltd.), a dispenser: ADC-311 (Kyowa Interface Science Co., Ltd.), and analysis software: Interface Measurement/Analysis Integrated System FAMAS ver. 7.2.0 (Kyowa Interface Science Co., Ltd.).
  • the relative sensitivity factor of O: 10.9583 and the relative sensitivity factor of C: 4.079 are based on the registered data of the analysis software (JEOL SpecSurf Analysis ver. 1.9.2 2012).
  • the cell culture film substrate may be configured so that C1 and C2 satisfy C1 > C2, thereby stably enhancing cell adhesiveness and cell sheet formation ability.
  • the range of C2 is, for example, 0 atomic % to 40 atomic %, preferably 5 atomic % to 35 atomic %, and more preferably 10 atomic % to 30 atomic %.
  • the cell culture film substrate may be configured so that [C1-C2] is 3 atomic % or more, thereby stably enhancing cell adhesiveness and cell sheet forming ability.
  • [C1-C2] is, for example, 6 atomic % or more, preferably 8 atomic % or more, and more preferably 10 atomic % or more.
  • the cell culture film substrate is made of polyethylene terephthalate
  • [C1-C2] is, for example, 4 atom % or more.
  • the cell culture film substrate is made of polystyrene
  • [C1-C2] is, for example, 6 atomic % or more, preferably 10 atomic % or more, and more preferably 15 atomic % or more.
  • FIG. 1 is a cross-sectional view schematically showing an example of the configuration of a cell sheet-attached film substrate 50 of this embodiment.
  • the film substrate 50 with a cell sheet comprises a film substrate 10 for cell culture and a cell sheet 40 that covers at least a portion of the culture surface 12 of the film substrate 10 for cell culture.
  • the culture surface 12 of the cell culture film substrate 10 is the plasma-treated surface described above.
  • the back surface 14 may or may not be plasma-treated.
  • the cell culture film substrate 10 can be used both as a cell sheet scaffold for culturing cells to form a cell sheet 40 and as a cell sheet support for transporting the cultured cell sheet 40.
  • Such a cell culture film substrate 10 can be used as a medical substrate for transplantation, which is separated from the cell sheet 40 after the cell sheet 40 has been attached to the transplantation site.
  • the area of the cell culture film substrate 10 is not particularly limited, but may be, for example, 0.3 cm2 or more and 1000 cm2 or less.
  • the lower limit of the area of the cell culture film substrate 10 is more preferably 0.6 cm2 or more, even more preferably 1.6 cm2 or more, and particularly preferably 8 cm2 or more, and may be 3 cm2 or more, 4 cm2 or more, 5 cm2 or more, 6 cm2 or more, 7 cm2 or more, or 10 cm2 or more.
  • the upper limit of the area of the cell culture film substrate 10 is more preferably 900 cm2 or less, even more preferably 800 cm2 or less, and particularly preferably 500 cm2 or less, and may be 100 cm2 or less, 50 cm2 or less , or 20 cm2 or less.
  • the cell culture film substrate 10 can be prevented from tearing or curling during transportation, improving handleability.
  • the conformability to the affected area during transplantation can be improved.
  • the conformability to the affected area with higher curvature can be improved, and the film can be applied to, for example, areas where internal organs have been sutured during surgery.
  • the cell culture film substrate 10 may have a sheet shape with a flat surface as a whole when viewed in cross section in the thickness direction.
  • the lower limit of the thickness of the cell culture film substrate 10 is preferably greater than 10 ⁇ m, more preferably 11 ⁇ m or greater, and even more preferably 12 ⁇ m or greater.
  • the self-supporting membrane is preferably a membrane that maintains the planar state of the culture surface 12 of the cell culture film substrate 10 even in the culture medium 30, and more preferably maintains the planar state even after the cell sheet 40 is formed on the culture surface 12.
  • the self-supporting film may be capable of retaining its sheet shape to a certain extent when one end is pinched and lifted with tweezers.
  • Examples of materials that can be used to form the cell culture film substrate 10 include polyether ether ketone (PEEK), polyethylene terephthalate (PET), polybutylene terephthalate (PBT), polystyrene (PS), polycarbonate (PC), modified polyphenylene ether (mPPE), polyphenylene sulfide (PPS), polysulfone (PSU), polyarylate (PAR), liquid crystal polymer (LCP), polyethylene (PE), polypropylene (PP), nylon 66 (N66), ethylene-tetrafluoroethylene copolymer (ETFE), tetrafluoroethylene-perfluoroalkyl vinyl ether copolymer (PFA), acrylonitrile-butadiene-styrene copolymer (ABS), polyethersulfone (PES), silicone, polyvinylidene fluoride (PVDF), polyacetal (POM), polyimide (PI), polyamide (PA), polyglycolic acid
  • the above materials can be processed into a film shape, and a commercially available material can be selected and used. Among these, it is preferable that such a material contains an organic polymer compound having an aromatic ring, or an organic polymer compound having an aromatic ring and an oxygen atom.
  • the cell culture film substrate 10 may be composed of a film containing at least one of these materials as a main component, and is preferably a material that is transparent, has a specific gravity greater than 1.0, and is excellent in various durability, mechanical strength, and processability, and is preferably a polyether ether ketone film, a polyethylene terephthalate film, or polystyrene, and more preferably a polyether ether ketone film.
  • the cell culture film substrate 10 is preferably a resin film including one or more resin layers made of the above-mentioned resin materials. The two or more resin layers may include materials different from each other.
  • the cell culture film substrate 10 may be composed of a resin substrate containing a resin layer made of the above-mentioned material, or a laminate substrate containing a resin layer made of the above-mentioned material and a resin layer and/or inorganic layer made of another material.
  • the resin layer does not need to include a layer formed by chemical vapor deposition such as parylene or a wet coating layer.
  • the inorganic layer in the laminate substrate preferably does not contain glass and may contain metal foil.
  • the cell culture film substrate 10 preferably does not contain a nonwoven fabric or a fiber substrate on the culture surface 12 side.
  • a cell culture film substrate 10 containing PEEK is preferable to one containing PET when comprehensively considered from the viewpoints of a low linear expansion coefficient, solvent resistance, heat resistance, impact resistance, and sterilization resistance. Furthermore, the cell culture film substrate 10 is preferably made of a material having a higher specific gravity than the culture medium 30 .
  • the surface roughness Ra of the culture surface 12 of the cell culture film substrate 10 has a lower limit of 0.3 nm or more, preferably 0.5 nm or more, and an upper limit of 100 nm or less, preferably 10 nm or less, more preferably 2 nm or less.
  • the surface roughness Ra here refers to the arithmetic mean roughness in a square area with sides of 100 nm, measured using surface shape data measured with an atomic force microscope (AFM).
  • AFM atomic force microscope
  • the diameter of the holes is, for example, 1 ⁇ m to 100 ⁇ m, preferably 2 ⁇ m to 50 ⁇ m, and more preferably 3 ⁇ m to 30 ⁇ m.
  • the depth of the holes is, for example, 0.5 ⁇ m to 100 ⁇ m, preferably 1 ⁇ m to 50 ⁇ m, and more preferably 2 ⁇ m to 20 ⁇ m.
  • the combinations of the ranges of the hole diameter and the hole depth are, for example, a hole diameter of 1 ⁇ m or more and 100 ⁇ m or less and a hole depth of 0.5 ⁇ m or more and 100 ⁇ m or less, a hole diameter of 1 ⁇ m or more and 100 ⁇ m or less and a hole depth of 1 ⁇ m or more and 50 ⁇ m or less, a hole diameter of 1 ⁇ m or more and 100 ⁇ m or less and a hole depth of 2 ⁇ m or more and 20 ⁇ m or less, a hole diameter of 2 ⁇ m or more and 50 ⁇ m or less and a hole depth of 0.5 ⁇ m or more and 100 ⁇ m or less, a hole diameter of 1 ⁇ m or more and 10 ...
  • the hole diameter is 2 ⁇ m or more and 50 ⁇ m or less and the hole depth is 1 ⁇ m or more and 50 ⁇ m or less
  • the hole diameter is 2 ⁇ m or more and 50 ⁇ m or less and the hole depth is 2 ⁇ m or more and 20 ⁇ m or less
  • the hole diameter is 3 ⁇ m or more and 30 ⁇ m or less and the hole depth is 0.5 ⁇ m or more and 100 ⁇ m or less
  • the hole diameter is 3 ⁇ m or more and 30 ⁇ m or less and the hole depth is 1 ⁇ m or more and 50 ⁇ m or less
  • the hole diameter is 3 ⁇ m or more and 30 ⁇ m or less and the hole depth is 2 ⁇ m or more and 20 ⁇ m or less.
  • the upper limit of the porosity of the cell culture film substrate 10 is, for example, 15% or less, preferably 10% or less, and more preferably 5% or less.
  • the lower limit of the porosity of the cell culture film substrate 10 is not particularly limited, but may be 0% or more.
  • the adhesion to the cell sheet 40 can be made appropriate.
  • the presence or absence of holes may be measured on the surface of the resin layer formed on the culture surface 12 side of the cell culture film substrate 10 .
  • the culture surface 12 of the cell culture film substrate 10 may be configured not to contain a temperature-responsive polymer, which can prevent a decrease in adhesion between the cell sheet 40 and the cell culture film substrate 10 in a low-temperature environment such as during a cryopreservation process.
  • a temperature-responsive polymer is a material that exhibits cell adhesiveness at the temperature used for cell culture, and exhibits cell non-adhesiveness by changing the temperature from that temperature, making it possible to easily detach a cell sheet.
  • the temperature range in which the temperature-responsive polymer exhibits cell adhesiveness is preferably 10°C to 45°C, particularly 33°C to 40°C, because this allows stable cell culture.
  • the temperature range in which the temperature-responsive polymer exhibits cell non-adhesiveness is preferably 1°C to 36°C, particularly 4°C to 32°C, because this reduces damage to the detachment of the cell sheet.
  • materials constituting the temperature-responsive polymer include temperature-responsive polymers such as poly-N-isopropylacrylamide (PNIPAAm), poly-N-n-propylacrylamide, poly-N-n-propylmethacrylamide, poly-N-ethoxyethylacrylamide, poly-N-tetrahydrofurfurylacrylamide, poly-N-tetrahydrofurfurylmethacrylamide, and poly-N,N-diethylacrylamide, and among these, PNIPAAm, poly-N-n-propylmethacrylamide, and poly-N,N-diethylacrylamide are preferred.
  • the bottom surface of the culture vessel 20 may also be configured so as not to contain a temperature-responsive polymer.
  • the cell culture film substrate 10 Before being used to culture cell sheets, the cell culture film substrate 10 can be packaged in a packaging material. By using a sealed package, it can be stored and distributed without damaging the culture surface. This package may also be sterilized. Sterilization methods include electron beam sterilization, gamma ray sterilization, EOG sterilization, and high-pressure steam sterilization.
  • packaging materials include aluminum, polyethylene terephthalate, ionomer, polyethylene, polyvinyl chloride, polyvinylidene chloride, polyvinyl alcohol, polypropylene, polyester, polycarbonate, polystyrene, polyacrylonitrile, ethylene-vinyl acetate copolymer, ethylene-vinyl alcohol copolymer, ethylene-methacrylic acid copolymer, perfluoroalkoxy fluororesin, nylon, cellophane, and paper. These may be used alone or in combinations of two or more.
  • sterilization that requires gas permeability such as EOG sterilization or high-pressure steam sterilization
  • packaging materials that combine paper or nonwoven fabric with the above materials are preferably used.
  • the packaging material may be multi-packaged, and additional packaging may be added after sterilization. It is preferable that the outermost part of the package be a resin film-like packaging material.
  • the cell culture film substrate 10 before being used for cell sheet cultivation can be placed in a culture vessel 20 and then packaged in a packaging material to form a package.
  • the package can be sterilized after being packaged.
  • FIG. 2 is a cross-sectional view showing a schematic example of a manufacturing method.
  • (a) shows the cell seeding process
  • (b) shows the cell culture process
  • (c) shows the cryopreservation and thawing process
  • (d) shows the extraction process.
  • the cryopreservation and thawing process in (c) is an optional process. These processes may be performed manually by a person or may be automated using an appropriate device, and can be selected appropriately based on quality and cost.
  • a production method in which (c) is not carried out will be described, and details of (c) will be explained later in the section ⁇ Cryopreservation method>.
  • the culturing step may include a cell seeding step shown in FIG. 2( a ) and a cell culturing step shown in FIG. 2( b ).
  • a cell culture film substrate 10 with a plasma-treated culture surface 12 is placed in a culture vessel 20, and a cell-containing culture medium 30 is brought into contact with the culture surface 12 of the cell culture film substrate 10.
  • the cells may be suspended in the culture medium 30 in advance, or a cell suspension containing the cells may be added to the culture medium 30.
  • a cleaning step may be added in which the cell culture film substrate 10 is washed with an aqueous ethanol solution or the like, or a de-electrification step may be added in which static electricity or other charges on the cell culture film substrate 10 are removed.
  • the cell culture film substrate 10 may be partially or entirely immersed in the culture medium 30.
  • the culture medium 30 may be dripped onto a portion of the surface of the cell culture film substrate 10, or the cell culture film substrate 10 may be immersed in the culture medium 30 so that at least a portion of each of the culture surface 12 and side surfaces of the cell culture film substrate 10 is in contact with the culture medium 30.
  • the latter immersion method makes it possible to maintain a stable culture environment during the subsequent cell culture process and/or to increase the area of the culture surface 12 of the cell culture film substrate 10.
  • culture is carried out under appropriate culture conditions to form a cell sheet 40 on the culture surface 12 of the cell culture film substrate 10.
  • a lid (not shown) may be placed over the cells during culture.
  • the cell sheet 40 can be cultured without adhering the cell culture film substrate 10 to the inside of the culture vessel 20.
  • the cell culture film substrate 10 functions as a free-standing membrane during cell culture. Because the cell culture film substrate 10 is not adhered, the cell sheet-attached film substrate 50 can be easily removed from the culture vessel 20 in the removal process. Damage to the cell sheet 40 during removal can also be suppressed.
  • adherered refers to a state in which the film substrate 10 is in close contact with the cell sheet 40 to the extent that it must be physically peeled off during removal. Fixation means that hold the film substrate 10 down with a load other than its own weight to prevent movement are not included in the "adhering" means used here.
  • examples of physical means include a method of peeling off the film while gripping it, or a method of scratching it with a knife or the like and peeling it off.
  • a method for immersing the cell culture film substrate 10 in the culture medium 30 without adhering it to the culture medium 30 one or more of the following may be employed: a method for making the specific gravity of the cell culture film substrate 10 greater than that of the culture medium 30; a method for immobilizing a load on a part of the culture surface 12 of the cell culture film substrate 10 using a weight; or a method for fixing the position of the cell culture film substrate 10 using an instrument. That is, during the cell culture step, cells can be cultured in a state where the cell culture film substrate 10 is immersed in the culture medium 30 by immobilizing the load and/or fixing the position.
  • the culture vessel 20 is a vessel for culturing cells in a medium, and is not particularly limited as long as it is suitable for the type of cells to be cultured and for the intended use.
  • Examples of the culture vessel 20 include dishes, Petri dishes, tissue culture dishes, multi-dishes, flasks, tissue culture flasks, microplates, microwell plates, multi-plates, multi-well plates, chamber slides, petri dishes, tubes, trays, culture bags, and roller bottles.
  • the culture vessel 20 may be a surface-treated culture vessel with cell adhesive properties (for adherent cells) or a non-surface-treated culture vessel (for suspension cells). Whether the culture vessel 20 is surface-treated or not does not affect the cell culture film substrate 10. Unless otherwise specified below, either type can be used.
  • the material of the culture vessel 20 is not particularly limited as long as it is impermeable to the culture medium 30, but examples include polystyrene, polyethylene, polypropylene, polyvinyl alcohol, polyethylene terephthalate, polyacetal, polyvinyl chloride, acrylic resin, polycarbonate, polyether ether ketone, polyethersulfone, polytetrafluoroethylene, polyimide, polyamide, cyclic olefin polymer, cellulose, silicone, nylon 6,6, glass, and metals such as stainless steel and aluminum.
  • the area of the culture vessel 20 is not particularly limited, but any commercially available culture vessel can be used for culture without any problems.
  • it is 0.3 cm2 or more and 1000 cm2 or less.
  • the lower limit is more preferably 0.35 cm2 or more, even more preferably 1.0 cm2 or more, and particularly preferably 1.9 cm2 or more.
  • the upper limit is more preferably 900 cm2 or less, even more preferably 800 cm2 or less, and particularly preferably 500 cm2 or less.
  • the cells are not particularly limited as long as they are clinically useful cells for treating or preventing symptoms associated with cell, tissue, or organ deficiency, dysfunction, or dysfunction, or culturable cells for use in non-clinical trials, and are cells isolated from a living organism.
  • Examples of cells include biological tissue cells, mesenchymal stem cells capable of differentiating into cells belonging to mesenchymal tissue, pluripotent stem cells capable of differentiating into various biological tissues, stem cells and progenitor cells that can be induced to differentiate, etc.
  • the cells may be adherent cells or suspension cells.
  • pluripotent stem cells include induced pluripotent stem cells, embryonic stem cells, nuclear transfer embryonic stem cells, embryonic tumor cells, and embryonic germ cells. These cells may be cultured alone or in combination of two or more types. These cells may be appropriately selected from known cells depending on the intended use of the cells.
  • the origin of the cells is not particularly limited, but examples include mammals, birds, amphibians, fish, insects, plants, and microorganisms. Specific examples of mammals and birds include humans, monkeys, chimpanzees, cows, horses, pigs, sheep, goats, rabbits, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, mice, rats, and chickens.
  • the cell culture is not particularly limited, and conventional means used in technical fields such as medicine, pharmaceuticals, quasi-drugs, cosmetics, food, and veterinary medicine, as well as basic technical fields such as regenerative medicine and bioengineering, can be used.
  • the culture conditions are not particularly limited as long as they allow the cultured cells to reach the desired state.
  • Typical culture conditions include, for example, using a prepared basal medium at 37°C in a 5% CO2 environment.
  • the cell culture period is not particularly limited as long as the cultured cells reach the desired state.
  • the cell culture period is, for example, within 28 days, within 21 days, within 14 days, within 7 days, within 5 days, or within 3 days.
  • the medium may be replaced.
  • the frequency and method of medium replacement are not particularly limited. In general, it is preferable to replace the medium every 1 to 7 days. It is particularly preferable to replace the medium every 1 to 5 days. At this time, the entire medium may be replaced, or a portion of the medium may be left and new medium may be added.
  • the density of the cells to be cultured is not particularly limited as long as it is suitable for the cells to be cultured, the culture vessel, and the intended use of the cultured cells, but is, for example, 5 x 102 cells/ cm2 or more and 1 x 109 cells/cm2 or less .
  • the lower limit of the cell density is more preferably 1 x 103 cells/ cm2 or more, even more preferably 5 x 103 cells/ cm2 or more, and particularly preferably 5 x 104 cells/ cm2 or more.
  • the upper limit of the cell density is more preferably 1 x 108 cells/cm2 or less, even more preferably 5 x 107 cells/cm2 or less , and particularly preferably 1 x 107 cells/ cm2 or less.
  • the density of the cells to be cultured is, for example, 5 ⁇ 10 2 cells/cm 2 to 1 ⁇ 10 9 cells/cm 2 , 5 ⁇ 10 2 cells/cm 2 to 1 ⁇ 10 8 cells/cm 2 , 5 ⁇ 10 2 cells/cm 2 to 5 ⁇ 10 7 cells/cm 2 , 5 ⁇ 10 2 cells/cm 2 to 1 ⁇ 10 7 cells/cm 2, 1 ⁇ 10 3 cells/cm 2 to 1 ⁇ 10 9 cells/cm 2, 1 ⁇ 10 3 cells/cm 2 to 1 ⁇ 10 8 cells/cm 2 , 1 ⁇ 10 3 cells/cm 2 to 5 ⁇ 10 7 cells/cm 2, 1 ⁇ 10 3 cells/cm 2 to 1 ⁇ 10 7 cells/cm 2 , 5 ⁇ 10 3 cells/cm 2 to 1 ⁇ 10 9 cells/cm 2 , 5 ⁇ 10 3 cells/cm 2 to 1 ⁇ 10 9 cells/cm 2 , 5 ⁇ 10 3 cells/cm 2 to 5 ⁇ 10 7 cells/cm 2 , 1 ⁇ 10 3 cells/cm 2 to 1 ⁇ 10 9 cells
  • the medium 30 is not particularly limited as long as it is suitable for the cells to be cultured, and is a liquid containing medium components such as sugars, amino acids, vitamins, inorganic salts, trace metals, and additives. These medium components may be blended alone or in combination of two or more. These medium components may be appropriately selected from known components depending on the cells to be cultured, or may be independently blended components.
  • sugars include monosaccharides such as glucose, fructose, mannose, and galactose; disaccharides such as sucrose, sucralose, trehalose, maltose, and lactose; trisaccharides such as glucosylsucrose, lactosucrose, and raffinose; tetrasaccharides such as acarbose and maltotetraose; cyclodextrins; and oligosaccharides.
  • monosaccharides such as glucose, fructose, mannose, and galactose
  • disaccharides such as sucrose, sucralose, trehalose, maltose, and lactose
  • trisaccharides such as glucosylsucrose, lactosucrose, and raffinose
  • tetrasaccharides such as acarbose and maltotetraose
  • amino acids include L-glutamic acid, L-glutamine, L-arginine, L-cystine, glycine, L-histidine, L-isoleucine, L-leucine, L-lysine, L-methionine, L-phenylalanine, L-serine, L-threonine, L-tryptophan, L-tyrosine, L-valine, L-alanine, L-asparagine, L-aspartic acid, L-cysteine, and L-hydroxyproline.
  • vitamins include sodium L-ascorbate, L-ascorbic acid diphosphate, choline, folic acid, niacin, biotin, pantothenic acid, pyridoxine, riboflavin, thiamine, thymidine, and vitamin B12.
  • inorganic salts include sodium chloride, sodium hydroxide, sodium sulfate, sodium phosphate, disodium hydrogen phosphate, sodium carbonate, sodium bicarbonate, potassium chloride, potassium hydroxide, potassium sulfate, potassium phosphate, dipotassium hydrogen phosphate, potassium carbonate, potassium bicarbonate, calcium chloride, calcium sulfate, calcium nitrate, calcium phosphate, calcium carbonate, magnesium chloride, magnesium sulfate, magnesium nitrate, magnesium phosphate, and magnesium carbonate.
  • trace metals include iron sulfate, iron nitrate, copper sulfate, copper nitrate, and zinc sulfate.
  • additives include serum such as bovine serum, horse serum, or human serum, or artificial serum; growth factors such as FGF2, EGF, HGF, VEGF, and PDGF; proteins such as albumin; antioxidants such as glutathione, ascorbic acid, and ascorbic acid derivatives; antibiotics such as penicillin and streptomycin; pH adjusters such as HEPES; organic acids such as lactic acid and propionic acid; lipids such as cholesterol; fatty acids such as linoleic acid; amines such as ethanolamine and putrescine; reducing agents such as mercaptoethanol and 3-mercapto-1,2-propanediol; thickeners such as sodium alginate, polyvinylpyrrolidone, carboxymethylcellulose, and pullulan; and pH indicators such as phenol red.
  • serum such as bovine serum, horse serum, or human serum, or artificial serum
  • growth factors such as FGF2, EGF, HGF, VEGF, and PDGF
  • proteins such as albumin
  • Examples of the medium 30 containing the above-mentioned medium components include AIM V medium, HFDM-1 medium, equilibrated buffer solutions such as Dulbecco's phosphate buffered saline (D-PBS) and Hank's balanced salt solution (HBSS), DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium), EMEM (Eagle's Minimum Essential Medium), ⁇ -MEM (Minimum Essential Medium alpha Modification), IMDM (Iscove's Modified Dulbecco's Medium), GMEM (Glasgow's MEM), and Ham's F-10.
  • D-PBS Dulbecco's phosphate buffered saline
  • HBSS Hank's balanced salt solution
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
  • EMEM Eagle's Minimum Essential Medium
  • ⁇ -MEM Minimum Essential Medium alpha Modification
  • IMDM Iscove's Modified Dulbec
  • basal medium examples include basal media such as medium, Williams' medium E, Brinster's BMOC-3 medium, and E8 medium. These basal media may be used alone or in combination of two or more. Furthermore, the basal media may contain additional, removed, increased, or decreased medium components depending on the type and condition of the cells. These basal media may be appropriately selected from known media depending on the cells to be cultured, or may have their own unique formulation.
  • the cell sheet 40 has a sheet structure in which cells are physically and functionally connected to each other via adhesion molecules, extracellular matrix, and the like.
  • the cell sheet 40 may have a single-layer structure consisting of one cell layer, or a laminated structure consisting of two or more cell layers.
  • the laminated structure is not particularly limited, but examples include multi-layer structures such as two-layer, three-layer, four-layer, and five-layer structures.
  • a multilayer structure may be obtained when cultured on the cell culture film substrate 10, or it may be obtained by stacking cell sheets with a single layer structure.
  • a cell sheet with a multilayer structure can be obtained by preparing multiple cell sheet-attached film substrates 50 of the present invention, overlaying one cell sheet on top of another, and peeling off the cell culture film substrate from the other cell sheets.
  • an example of the cryopreservation method of this embodiment includes a cooling step of cooling a cell sheet-attached film substrate 50, which includes the cell culture film substrate 10 inside a culture vessel 20 and a cell sheet 40 formed on the surface (culture surface 12) of the cell culture film substrate 10, in a cryopreservation solution 60.
  • the culture vessel may be frozen with a culture lid (not shown) or a lid (not shown) that prevents liquid leakage and microbial contamination.
  • the cell sheet-attached film substrate 50 is cryopreserved inside the culture vessel 20, but the cell sheet-attached film substrate 50 may also be cryopreserved by transferring it to a cryopreservation container separate from the culture vessel 20.
  • a cryopreservation container separate from the culture vessel 20.
  • the cryopreservation container There are no particular limitations on the cryopreservation container, and for example, the one exemplified for the culture vessel 20 can be used.
  • the cell sheet-attached film substrate 50 can take various forms. As shown in Figures 3(a) and 3(b), the cell sheet-attached film substrate 50 may have a structure in which a cell culture film substrate 10 is formed on one side of a cell sheet 40. Alternatively, as shown in Figure 3(c), the cell sheet 40 may be sandwiched between two cell culture film substrates 10a and 10b on both sides. In Figure 3(a), the cell culture film substrate 10 is placed facing the bottom of the culture vessel 20. In Figure 3(b), the cell sheet 40 is placed facing the bottom of the culture vessel 20. In Figure 3(c), the cell culture film substrates 10a and 10b may be made of the same material or different materials. For example, both cell culture film substrates 10a and 10b may be cell culture film substrates containing PEEK, or one may be a cell culture film substrate containing PEEK and the other a cell culture film substrate not containing PEEK.
  • Cryoprotectants are substances used to reduce damage to cells caused by freezing and thawing during cryopreservation.
  • cryoprotectants include cell-impermeant cryoprotectants and cell-permeant cryoprotectants.
  • Specific examples of cell-impermeable cryoprotectants include, for example, albumin, sucrose, trehalose, dextran, polyethylene glycol, polyvinyl alcohol, polyvinylpyrrolidone, polylysine, and the like.
  • Specific examples of cell-permeable cryoprotectants include, for example, dimethyl sulfoxide (DMSO), glycerol, ethylene glycol, propylene glycol, propanediol, and the like.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • cryoprotectants may be formulated singly or in combination of two or more. These cryoprotectants may be appropriately selected from known cryoprotectants depending on the type of cells, the composition of the cryopreservation solution, etc., or a uniquely formulated composition may be used.
  • cryopreservation solutions that do not contain DMSO include, for example, Stem Cell Banker (registered trademark) DMSO-free GMP grade (Nihon Zenyaku Kogyo Co., Ltd.), Bambanker (registered trademark) DMSO-free (CG Lymphotec Co., Ltd.), Cryoscarless (registered trademark) DMSO-free (BioVerde Co., Ltd.), Stem Cell Keep (BioVerde Co., Ltd.), CryoNovo (registered trademark) X12 (Akron BioProducts LCC Co., Ltd.), CryoNovo (registered trademark) P24 ( Akron BioProducts LCC), DMSO-free cell cryopreservation medium for cryopreservation of human ES/iPS cells (ReproCell), Cell Reservoir One (Nacalai Tesque), ThelioKeep (registered trademark: BioVerde), Cellvation (registered trademark: Protide Pharmaceuticals
  • cryopreservation solutions containing DMSO include, for example, Stem Cell Banker (registered trademark) GMP Grade (Nippon Zenyaku Kogyo Co., Ltd.), Stem Cell Banker (registered trademark) EX GMP Grade (Nippon Zenyaku Kogyo Co., Ltd.), Bambanker (registered trademark) hRM (CG Lymphotec Co., Ltd.), Bambanker (registered trademark) (CG Lymphotec Co., Ltd.), iStock (CG Lymphotec Co., Ltd.), CryoStor CS5 (Charles River Laboratories Cell Solutions, Inc.), and CryoStor CS10 (Charles River Laboratories Cell Solutions, Inc.).
  • the cell sheet-attached film substrate 50 is preferably cooled in a cryopreservation solution using a non-throughflow cooling device.
  • the cell sheet 40 is placed on an appropriate cell culture film substrate 10 using a non-throughflow cooling device, which allows the cell sheet, which is the object to be cooled, to be cooled at a uniform temperature, thereby minimizing damage to the cells and suppressing a decrease in cell activity.
  • the cooling rate at 0 to ⁇ 5° C. is, for example, 0.1° C./min or more and 15° C./min or less, preferably 0.25° C./min or more and 12.5° C./min or less, and more preferably 0.5° C./min or more and 10° C./min or less.
  • the freezing temperature is not particularly limited, as long as it can freeze the cultured cells and the cryopreservation solution.
  • the freezing temperature is, for example, -196°C or higher and -25°C or lower.
  • the lower limit is more preferably -180°C or higher, even more preferably -160°C or higher, and particularly preferably -150°C or higher.
  • the upper limit is more preferably -25°C or lower, even more preferably -30°C or lower, and particularly preferably -35°C or lower.
  • the freezing temperature is, for example, -196°C or higher and -25°C or lower, -196°C or higher and -30°C or lower, -196°C or higher and -35°C or lower, -180°C or higher and -25°C or lower, -180°C or higher and -30°C or lower, -180°C or higher and -35°C or lower, -160°C or higher and -25°C or lower, -160°C or higher and -30°C or lower, -160°C or higher and -35°C or lower, -150°C or higher and -25°C or lower, -150°C or higher and -30°C or lower, or -150°C or higher and -35°C or lower.
  • cryopreservation method is not particularly limited as long as the cells can be stably cryopreserved.
  • Cryopreservation methods include, for example, contact with the liquid or gas phase of a cooling agent, use of an ultra-low temperature freezer, etc.
  • a preferred cryopreservation method is contact with the liquid or gas phase of a cooling agent from the viewpoint of temperature.
  • coolants include liquid nitrogen, liquid ethane, liquid propane, liquid helium, and dry ice.
  • Preferred packaging materials include aluminum, polyethylene terephthalate, ionomer, polyethylene, polyvinylidene chloride, polyvinyl alcohol, polypropylene, polyester, polycarbonate, polyacrylonitrile, ethylene-vinyl acetate copolymer, ethylene-vinyl alcohol copolymer, ethylene-methacrylic acid copolymer, polyimide, fluororesins such as perfluoroalkoxy fluororesin and tetrafluoroethylene-hexafluoropropylene copolymer (FEP), and nylon. These materials may be used alone, or two or more may be combined to form a multilayer laminate, or a multilayer package may be used.
  • FEP tetrafluoroethylene-hexafluoropropylene copolymer
  • the cryopreservation method further includes a thawing step of thawing the cell sheet-attached film substrate 50 .
  • the thawing method is not particularly limited, and any conventional means used in technical fields such as medicine, pharmaceuticals, quasi-drugs, cosmetics, food, and veterinary medicine, as well as basic technical fields such as regenerative medicine and bioengineering, can be used.
  • Methods for thawing include, for example, using a water bath, bead bath, incubator, hot plate, defroster, etc., immersing in a melting liquid at a temperature higher than the freezing temperature, or leaving in an environment at a temperature higher than the freezing temperature.
  • the environmental temperature in contact with the frozen product during thawing is not particularly limited as long as it is higher than the freezing temperature and lower than 50° C.
  • the upper limit of the environmental temperature is, for example, 49° C. or lower, preferably 45° C.
  • the lower limit of the environmental temperature is, for example, 0° C. or higher, preferably 5° C. or higher, more preferably 10° C., and even more preferably 15° C. or higher.
  • the range of environmental temperatures in contact with the frozen material when thawing is, for example, 0°C or higher and 49°C or lower, 0°C or higher and 45°C or lower, 0°C or higher and 40°C or lower, 5°C or higher and 49°C or lower, 5°C or higher and 45°C or lower, 5°C or higher and 40°C or lower, 10°C or higher and 49°C or lower, 10°C or higher and 45°C or lower, 10°C or higher and 40°C or lower, 15°C or higher and 49°C or lower, 15°C or higher and 45°C or lower, and 15°C or higher and 40°C or lower.
  • Thawing temperatures of 50°C or higher are not preferred because they may cause thermal damage to cells.
  • the frozen material may be temporarily stored in a temperature environment below the freezing point during thawing.
  • frozen material stored at ⁇ 80°C can be exposed to an environmental temperature of ⁇ 30°C and then thawed at an environmental temperature above the freezing point.
  • the time required to thaw a frozen product is not particularly limited as long as freezing does not cause damage to cells.
  • thawing can be performed without problems if it is more than 10 seconds and less than 60 minutes.
  • the lower limit of the time required to thaw a frozen product is sufficient if it is more than 10 seconds, preferably 20 seconds or more, more preferably 30 seconds or more, and even more preferably 1 minute or more.
  • the upper limit is sufficient if it is 60 minutes or less, preferably 50 minutes or less, more preferably 40 minutes or less, and even more preferably 30 minutes or less.
  • the time required for thawing is more than 10 seconds and less than 60 minutes, more than 10 seconds and less than 50 minutes, more than 10 seconds and less than 40 minutes, more than 10 seconds and less than 30 minutes, 20 seconds to 60 minutes, 20 seconds to 50 minutes, 20 seconds to 40 minutes, 20 seconds to 30 minutes, 30 seconds to 60 minutes, 30 seconds to 50 minutes, 30 seconds to 40 minutes, 30 seconds to 30 minutes, 1 minute to 60 minutes, 1 minute to 50 minutes, 1 minute to 40 minutes, or 1 minute to 30 minutes.
  • the environmental temperature may be set to be constant, or may be set to fluctuate, such as rising in stages.
  • thawing solution there are no particular limitations on the thawing solution, so long as it does not damage the cultured cells.
  • ingredients that may be contained in the thawing solution include sucrose, glucose, maltose, trehalose, and fructose.
  • the thawing solution may also contain the ingredients listed above in the section (Culture Medium).
  • the temperature of the melting liquid is, for example, between 0°C and 45°C.
  • the lower limit is more preferably 4°C or higher, even more preferably 25°C or higher, and especially preferably 28°C or higher.
  • the upper limit is more preferably 40°C or lower, even more preferably 39°C or lower, and especially preferably 38°C or lower.
  • the thawed cell sheet 40 and cell culture film substrate 10 may be washed with a cell washing solution immediately after the thawing process, if necessary.
  • the cell washing solution is not particularly limited and may contain the components described in the above section (Culture Medium).
  • the temperature of the cell washing solution is not particularly limited.
  • the temperature of the cell washing solution is, for example, from 0°C to 45°C.
  • the lower limit is more preferably 4°C or higher, even more preferably 25°C or higher, and particularly preferably 28°C or higher.
  • the upper limit is more preferably 40°C or lower, even more preferably 39°C or lower, and particularly preferably 38°C or lower.
  • the number of times the cultured cells are washed is not particularly limited, and may be one or more times (for example, two, three, four, five, etc.).
  • the transplantation method may include a step of attaching a cell sheet 40 shown in FIG. 2( e ).
  • the cell sheet 40 of the cell sheet-attached film substrate 50 is attached to the transplantation site 70 , and then the cell culture film substrate 10 is peeled off from the cell sheet 40 .
  • the time from attachment to removal in the attachment process can be shortened.
  • the substrate film is not exposed to the tissue as a foreign body for a long period of time, reducing the risk of an immune rejection reaction to the substrate film, reducing the possibility of cell death, and simplifying the procedure.
  • This method can also be used in surgeries such as open-chest surgery to attach a cell sheet to the body.
  • the time from application to removal is preferably 10 minutes or less, more preferably 5 minutes or less, even more preferably 3 minutes or less, and even more preferably 1 minute or less.
  • the remaining rate of the cell sheet 40 on the cell culture film substrate 10 after peeling, converted into an area ratio, is preferably 50% or less, more preferably 30% or less, and even more preferably 10%.
  • Cell transplantation therapy suppresses and prevents the onset and recurrence of symptoms associated with cell, tissue, and organ loss, dysfunction, and dysfunction.
  • Diseases that can be treated with cell transplantation therapy include spinal cord injury, knee articular cartilage injury, ischemic heart disease, age-related macular degeneration, corneal epithelial stem cell deficiency, aplastic anemia, severe lower limb ischemia, intractable skin ulcers, postoperative complications (e.g., suture failure in various organs, bronchial stump fistula, pancreatic fistula, bile leakage), and burns.
  • the cells used in cell transplantation therapy may be autologous cells, allogeneic non-autologous cells, or xenogeneic cells.
  • Preferred cells are autologous cells from the viewpoints of clinical application and safety, and non-autologous cells from the viewpoints of clinical application and productivity.
  • the recipient site may be at least a portion of the body of a recipient, such as a mammal, bird, amphibian, fish, insect, plant, or microorganism.
  • a mammal such as a mammal, bird, amphibian, fish, insect, plant, or microorganism.
  • mammals and birds include humans, monkeys, chimpanzees, cows, horses, pigs, sheep, goats, rabbits, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, mice, rats, and chickens.
  • the recipient site may exclude the inside and outside of the human body. Examples of recipient sites other than the recipient include other cell sheets, medical devices, and tissues or organs isolated from the recipient.
  • tissues or organs isolated include skin, oral tissue, esophagus, trachea, bronchi, lungs, lung lobes, stomach, duodenum, pancreas, spleen, small intestine, large intestine, muscle tissue, and bone (excluding tissues that are to be returned to the same recipient for treatment).
  • [C1-C2] was 3 atomic % or more, indicating that the proportion of oxygen atoms increased due to plasma treatment.
  • [C1-C2] was 6 atomic % or more, and particularly when it was 9 atomic % or more, the polar component was also high and cell adhesiveness was particularly good.
  • Cell culture film substrate 12 Culture surface (surface) 14 Back surface 20 Culture vessel 30 Culture medium 40 Cell sheet 50 Film substrate with cell sheet 60 Cryopreservation solution 70 Transplantation site

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Abstract

本発明の細胞培養用フィルム基材は、少なくとも片方の表面に培養面を有し、Ｏｗｅｎｓ－Ｗｅｎｄｔ法に基づいて求められる、当該培養面における表面自由エネルギーの極性成分が、１０．０ｍＪ／ｍ２以上である。

Description

細胞培養用フィルム基材、包装体、細胞シート付フィルム基材、細胞シート付フィルム基材の凍結物、細胞培養用フィルム基材の製造方法、および細胞シート付フィルム基材の製造方法
　本発明は、細胞培養用フィルム基材、包装体、細胞シート付フィルム基材、細胞シート付フィルム基材の凍結物、細胞培養用フィルム基材の製造方法、および細胞シート付フィルム基材の製造方法に関する。
　これまで細胞シート足場材について様々な開発がなされてきた。この種の技術として、例えば、特許文献１に記載の技術が知られている。
　特許文献１には、細胞培養容器の底面に接合された樹脂層と、樹脂層上に設けられた温度応答性高分子層とを備えるフィルムを用いて、底面に固定されたフィルムの温度応答性高分子層上に細胞シートを製造する培養方法が記載されている（特許文献１の請求項１、段落００２６等）。
特開２０１６－０１３１１１号公報
　しかしながら、本発明者が検討した結果、上記特許文献１に記載のようなフィルムにおいて、温度応答性高分子層を用いない場合、細胞シートを形成するための細胞接着性の点で改善の余地があることが判明した。
　本発明者はさらに検討したところ、フィルム基材の培養面に対してプラズマ処理することにより、培養面における細胞接着性が向上し、良好に細胞シートを形成できることを見出した。
　このような知見に基づき、さらに鋭意研究したところ、表面自由エネルギーの極性成分を指標とすることにより、プラズマ処理による培養面の表面状態について安定的に評価できること、そして、適度に穏やかな条件のプラズマ処理により処理面を活性化することによって、かかる指標を所定値以上とすることにより、細胞接着性および細胞シート形成能を高められることを見出し、本発明を完成するに至った。
　本発明の一態様によれば、以下の細胞培養用フィルム基材、包装体、細胞シート付フィルム基材、細胞シート付フィルム基材の凍結物、細胞培養用フィルム基材の製造方法、および細胞シート付フィルム基材の製造方法が提供される。
１．　少なくとも片方の表面に培養面を有する細胞培養用フィルム基材であって、
　Ｏｗｅｎｓ－Ｗｅｎｄｔ法に基づいて求められる、前記培養面における表面自由エネルギーの極性成分が、１０．０ｍＪ／ｍ２以上である、細胞培養用フィルム基材。
２．　１．に記載の細胞培養用フィルム基材であって、
　当該細胞培養用フィルム基材が培養容器の内部に固着されずに自立膜として機能する、細胞培養用フィルム基材。
３．　１．又は２．に記載の細胞培養用フィルム基材であって、
　前記培養面がプラズマ処理されてなる、細胞培養用フィルム基材。
４．　１．又は２．に記載の細胞培養用フィルム基材であって、
　前記培養面における表面自由エネルギーの極性成分が、５５ｍＪ／ｍ２以下である、細胞培養用フィルム基材。
５．　１．～３．のいずれか一つに記載の細胞培養用フィルム基材であって、
　ＸＰＳ測定により求められる前記培養面の炭素原子と酸素原子の合計に対する酸素原子の存在比率をＣ１とし、前記フィルム基材の材料の化学式から計算される炭素原子と酸素原子の合計に対する酸素原子の存在比率をＣ２としたとき、Ｃ１、Ｃ２が、Ｃ１＞Ｃ２を満たす、
細胞培養用フィルム基材。
６．　５．に記載の細胞培養用フィルム基材であって、
　［Ｃ１－Ｃ２］が、３原子％以上である、細胞培養用フィルム基材。
７．　１．～６．のいずれか一つに記載の細胞培養用フィルム基材であって、
　当該細胞培養用フィルム基材を構成する材料が、芳香環を有する有機高分子化合物、または芳香環および酸素原子を有する有機高分子化合物を含む、細胞培養用フィルム基材。
８．　１．～７．のいずれか一つに記載の細胞培養用フィルム基材であって、
　当該細胞培養用フィルム基材を構成する材料が、ポリエーテルエーテルケトン、ポリエチレンテレフタレート、およびポリスチレンからなる群から選ばれる一または二以上を含む、細胞培養用フィルム基材。
９．　１．～８．のいずれか一つに記載の細胞培養用フィルム基材であって、
　厚みが５μｍ以上２５０μｍ以下である、細胞培養用フィルム基材。
１０．　１．～９．のいずれか一つに記載の細胞培養用フィルム基材を包装材料で包装した包装体。
１１．　１．～９．のいずれか一つに記載の細胞培養用フィルム基材と、
　前記細胞培養用フィルム基材の培養面上に積層した細胞シートと、を含む、
細胞シート付フィルム基材。
１２．　１．～９．のいずれか一つに記載の細胞培養用フィルム基材と、
　前記細胞培養用フィルム基材の培養面上に積層した細胞シートと、を含み、
　前記細胞培養用フィルム基材および前記細胞シートが凍結保存状態である、
細胞シート付フィルム基材の凍結物。
１３．　細胞培養用フィルム基材を準備し、その表面の少なくとも一部にプラズマ処理を施し、Ｏｗｅｎｓ－Ｗｅｎｄｔ法に基づいて求められる表面自由エネルギーの極性成分が１０．０ｍＪ／ｍ２以上となる培養面を前記表面に有する前記細胞培養用フィルム基材を得る、表面処理工程を含む、
細胞培養用フィルム基材の製造方法。
１４．　１３．に記載の細胞培養用フィルム基材の製造方法であって、
　前記プラズマ処理において、
　プロセスガスが、不活性ガスおよび酸素原子を含有するガスからなる群から選ばれる一または二以上を含み、
　圧力が、０．１Ｐａ以上１００Ｐａ以下であり、
　放電処理強度が、１５０Ｗ・ｍｉｎ／ｍ２以上１５０００Ｗ・ｍｉｎ／ｍ２以下である、細胞培養用フィルム基材の製造方法。
１５．　１３．または１４．に記載の細胞培養用フィルム基材の製造方法であって、
前記細胞培養用フィルム基材の材料中の化学式に酸素原子を含む、細胞培養用フィルム基材の製造方法。
１６．　１３．または１４．に記載の細胞培養用フィルム基材の製造方法であって、
前記細胞培養用フィルム基材の材料中の化学式に酸素原子を含まず、
　前記プラズマ処理で用いるプロセスガスが酸素原子を含む細胞培養用フィルム基材の製造方法。
１７．　培養容器の内部に、複数の細胞、培地、および１．～９．のいずれか一つに記載の細胞培養用フィルム基材を導入して、前記細胞培養用フィルム基材の培養面に細胞シートを培養する、培養工程、を含む、
細胞シート付フィルム基材の製造方法。
　本発明によれば、細胞シートを形成するための細胞接着性に優れた細胞培養用フィルム基材、それを用いた包装体、細胞シート付フィルム基材、細胞シート付フィルム基材の凍結物、細胞培養用フィルム基材の製造方法、および細胞シート付フィルム基材の製造方法が提供される。
本実施形態の細胞培養用フィルム基材の構成の一例を模式的に示す断面図である。 本実施形態の細胞シート付フィルム基材の製造方法の工程の一例を模式的に示す工程断面図である。 本実施形態の凍結方法の変形例を模式的に示す工程断面図である。
　以下、本発明の実施の形態について、図面を用いて説明する。なお、すべての図面において、同様な構成要素には同様の符号を付し、適宜説明を省略する。また、図は概略図であり、実際の寸法比率とは一致していない。
＜細胞培養用フィルム基材＞
　本実施形態の細胞培養用フィルム基材の概要を説明する。
　本実施形態の細胞培養用フィルム基材は、少なくとも片方の表面に培養面を有し、Ｏｗｅｎｓ－Ｗｅｎｄｔ法に基づいて求められる、当該培養面における表面自由エネルギーの極性成分が、１０．０ｍＪ／ｍ２以上である。
　本発明者らの知見によれば、表面自由エネルギーの極性成分を指標とすることにより、プラズマ処理による培養面の表面状態について安定的に評価でき、かかる指標を上記下限値以上とすることにより、細胞接着性および細胞シート形成能を高められることが判明した。
　また、本発明者らの検討により、フィルム基材の表面に対して過剰のエネルギー量のプラズマ処理を実施すると、培養面における表面自由エネルギーの極性成分が低下したり、フィルムに過剰なダメージが生じることがあることも見出された。プラズマ処理のエネルギー量は、電極への単位面積当たりの投入電力（Ｗ／ｍ２）と照射時間（ｍｉｎ）の積算値である放電処理強度（Ｗ・ｍｉｎ／ｍ２）で表される。
　詳細なメカニズムは定かではないが、適度なエネルギー量によってプラズマ処理を施すことにより、培地中での細胞接着において、プラズマ処理された培養面における表面状態を適当なものとすることができるため、かかる培養面における細胞接着性を向上でき、延いては細胞シートの形成能を高められるものと推察される。
　プラズマ処理は大気圧下で行っても減圧下で行ってもよいが、雰囲気を制御するために減圧下で行うのが好ましい。プラズマ処理は、例えば、プラズマクリーナーＰＣ－３００（サムコ社製）を用いて行うことができる。
　プラズマの種類は特に限定されないが、高周波プラズマを用いることで加工プロセスの安定性や十分な表面処理能力が実現できるため、高周波低圧プラズマを用いることが好ましい。また、平行に置かれた２枚の平板型電極を用いた容量結合型プラズマを用いることが好ましい。処理部に形成されるイオンシースに向かって異方性エッチングがなされるＲＩＥ（反応性イオンエッチング）処理、処理部にイオンシースを形成せずに等方性エッチングがなされるＰＥ（プラズマエッチング）処理などから好ましい処理モードを選択すればよい。
　プラズマ処理で用いるプロセスガスは所望の物性を実現することができれば特に限定されるものではないが、不活性ガスおよび酸素原子を含有するガスからなる群から選ばれる一または二以上を含むことが好ましい。不活性ガスとして、アルゴン等の希ガスや窒素ガス等が挙げられる。酸素原子を含有するガスとして、酸素ガス、二酸化炭素ガス等が挙げられる。不活性ガスと酸素原子を含有するガスとの混合ガスを用いてもよい。この中でも、アルゴンガス又は酸素ガスを含むガス雰囲気下で行うことが、より好ましい。
　減圧下でのプラズマ処理を行う場合の圧力は、０．１～１００Ｐａであることが好ましく、１～５０Ｐａであることがより好ましい。
　プラズマ処理における放電処理強度は、１５０～１５０００Ｗ・ｍｉｎ／ｍ２であることが好ましく、１０００～１２０００Ｗ・ｍｉｎ／ｍ２であることがより好ましい。
　プラズマ処理においてはフィルム基材が所望の表面状態になるように条件を決めればよく、条件範囲はフィルム基材の材料や状態によって異なる場合がある。例えば、フィルム基材の材料の化学式中に酸素原子を含まないポリスチレンフィルムではアルゴンガスを用いた処理ではなく酸素ガスなどの酸素原子を含むガスを用いた処理が好ましい一方で、構造中に酸素原子を含むポリエーテルエーテルケトンフィルムやポリエチレンテレフタレートフィルムではアルゴンガスを用いた処理条件でも好ましい表面状態が得られる場合もある。
　細胞培養用フィルム基材の表面は、全面がプラズマ処理されていてもよいが、全面の少なくとも一部がプラズマ処理されていなくてもよい。言い換えると、細胞培養用フィルム基材は、プラズマ処理された表面に、細胞接着性を有する培養面を有する。
　一方、細胞培養用フィルム基材の表面と反対側の裏面においては、プラズマ処理されていても、プラズマ処理されていなくてもよいが、プラズマ処理されていない場合、裏面は、細胞接着性を有しない非培養面となる。プラズマ処理されていない非培養面は、表面における少なくとも一部に形成されてもよく、表面における非培養面は、培養面の周縁部の一部に隣接する位置に形成されてもよく、培養面の周縁部の全周に亘って形成されてもよい。また、例えばフィルム基材の一部が舌状に飛び出したタブとなっていて、タブの部分が非培養面となっていてもよい。
　細胞接着性を有しない非培養面が形成されると、細胞シート作製後に細胞シートを剥離させやすく、また、細胞シートを破壊しないで細胞シート付フィルム基材を搬送する等のハンドリング性を向上できる。
　プラズマ処理時に表面をマスキングする等により、前述の非培養面を形成できる。たたし、マスキングする領域やマスキング方法は特に限定されない。
　また、培養面の外形は、特に限定されないが、表面鉛直方向から見たときのフィルム基材の外形に沿った形状でもよく、略円形状や多角形状等でもよい。
　培養面の内部は、全面にプラズマ処理された照射領域で構成されてもよく、部分的にプラズマ処理がされていない非照射領域を有してもよい。培養面の内部における照射領域（Ｓ１）と非照射領域（Ｓ２）との面積比率（Ｓ１／Ｓ２）は、特に限定されないが、１～７０である。照射領域と非照射領域とが規則的なパターン配列を構成してもよく、例えば、ラインアンドスペースパターン、水玉模様パターン、格子状パターン等が挙げられる。たとえば、ラインアンドスペースパターンを有する照射領域と非照射領域とを培養面に形成することにより、培養面上に形成された細胞シートにおける細胞配向性を高められる。
　本実施形態の細胞シート付フィルム基材の製造方法の一例は、
　細胞培養用フィルム基材を準備し、かかる表面の少なくとも一部にプラズマ処理を施し、Ｏｗｅｎｓ－Ｗｅｎｄｔ法に基づいて求められる、表面自由エネルギーの極性成分が、１０．０ｍＪ／ｍ２以上となる培養面を表面に有する細胞培養用フィルム基材を得る、表面処理工程と、を含む。
　また、プラズマ雰囲気中に酸素ガスを含めることによって、低エネルギー量でのプラズマ処理でも、細胞接着性を高められることが分かった。酸素ガスを含まない不活性ガス雰囲気下のプラズマ処理の場合でも、処理後の活性な表面が大気中の酸素ガスや水蒸気と反応し、Ｏを含む官能基が形成されることで細胞接着性が高められたと推測される。ただし、酸素ガス非含有プラズマ処理で十分な細胞接着性を発現するためには、フィルム基材の原料成分に酸素原子を含むものを使用することが望ましい。
　本実施形態では、適度なエネルギー量のプラズマ処理を実施すること、プラズマ雰囲気中に酸素ガスを含めること、および／またはフィルム基材の原料成分に酸素原子を有するものを使用すること等によって、表面自由エネルギーの極性成分を所望の数値範囲内とすることが可能になる。
　以上のように、プラズマ雰囲気中および／または照射対象のフィルム基材の表面に酸素原子を含めることにより、プラズマ処理された表面を細胞に対して親和性がある状態に改質することで、細胞接着性を発現できる。
　また、詳細なメカニズムは定かではないが、プラズマ処理後におけるフィルム基材の表面が活性化されるため、大気中の水分や酸素と反応して、酸素原子または酸素原子を含む官能基が表面に導入される効果もあると、推察される。
　培養面における表面自由エネルギーの極性成分の下限は、例えば、１０．０ｍＪ／ｍ２以上、好ましくは１２．０ｍＪ／ｍ２以上、より好ましくは１４．０ｍＪ／ｍ２以上である。これにより、シート細胞の接着性を高められる。
　一方、培養面における表面自由エネルギーの極性成分の上限は、例えば、５５ｍＪ／ｍ２以下、５０ｍＪ／ｍ２以下でもよく、４５ｍＪ／ｍ２以下でもよく、３０ｍＪ／ｍ２以下でもよい。これにより、細胞シートの剥離性の低下を抑制できる。　
　また、培養面における表面自由エネルギーの分散成分は、例えば、２７ｍＪ／ｍ２～５５ｍＪ／ｍ２、好ましくは２８ｍＪ／ｍ２～５０ｍＪ／ｍ２、より好ましくは２９ｍＪ／ｍ２～４０ｍＪ／ｍ２である。
　表面自由エネルギーの極性成分を所望の数値範囲とするための技術要素としては、プラズマ処理の条件を適切に選択すること、具体的には、（ｉ）プラズマ処理のエネルギー量を過度に大きくしないこと、例えば、（ｉｉ）放電処理強度を上記の範囲内とすること、プラズマ処理面に適切な官能基を導入すること、例えば、プラズマ雰囲気中および／または照射対象のフィルム基材の表面に酸素原子を含めること等が挙げられる。
　なお、極性成分および／または分散成分の測定タイミングは、細胞培養用フィルム基材の製造直後でも良いが、包装、滅菌、保管、開封のいずれの工程直後でもよく、細胞シートの培養に用いる直前であってもよい。ただし、表面状態が、極性成分および／または分散成分の測定時と細胞シートの培養に用いる段階で大きく異なるのであれば、測定した極性成分および／または分散成分と細胞接着性に相関があるとは言い難い。そのため、この中でも、細胞シートの培養に用いる直前に測定することが好ましい。これにより、細胞接着性および細胞シート形成能に優れた培養フィルム基材を、細胞シートの製造に用いることが可能になる。
　なお、細胞シート形成に用いるフィルム基材と物性評価に用いるフィルム基材は兼用せず、同一ロットで作製した同等品を評価サンプルとして使用する。
　表面自由エネルギーの測定手順は、以下の通り。
　まず、接触角計を用いて、培養フィルム基材の培養面における、水との接触角及びジヨードメタンとの接触角を実測する。水またはジヨードメタンとの接触角θは、フィルム基材の表面に、２３℃環境下、２．０μＬの純水または２．０μＬのジヨードメタンを置き、液滴とフィルム基材の表面とのなす角を接触角計で測定、θ／２法にて解析する。
　なお、接触角計：ＤＭｏ－５０２　（協和界面科学株式会社）、ディスペンサー：ＡＤＣ－３１１（協和界面科学株式会社）、解析ソフト：界面測定／解析統合システム　ＦＡＭＡＳ　ｖｅｒ．７．２．０　（協和界面科学株式会社）を用いて、以下の測定モード（液滴法）によって得られる接触角測定及び解析を行う。
　接触角測定と解析はｎ＝３で行い、それら接触角の平均値を、表面自由エネルギー（Ｏｗｅｎｓ－Ｗｅｎｄｔ法）の計算に使用する。
＜接触角測定条件＞
測定法：液滴法（静的接触角）
測定溶媒：純水、ジヨードメタン
解析方法：θ／２法
滴下液量：２．０μＬ
滴下から測定までの待ち時間：１０００ｍｓ
測定温度：２３℃
＜θ／２法＞
　θ／２法について説明する。固体表面上に着滴した液体は、表面張力で丸くなり、球の一部を形成する。このときの形状を画像として取り込み、画像処理により液滴の左右端点と頂点を見つけ、液滴球体の半径（ｒ）と高さ（ｈ）を求める。そして、求めた値を下式へ代入して、接触角θを求める方法である。
　　ｔａｎθ＝（ｈ／ｒ）→θ＝２ａｒｃｔａｎ（ｈ／ｒ）
＜表面自由エネルギー（Ｏｗｅｎｓ－Ｗｅｎｄｔ法）の計算＞
　上記方法により得られた水との接触角θ１とジヨードメタンとの接触角θ２の値と、各液体の分散成分γＬ ｄと極性成分γＬ ｈを、以下の「３」のＯｗｅｎｓ－Ｗｅｎｄｔ理論の「Ｙｏｕｎｇ－Ｄｕｐｒｅの式」に代入し、水の場合とジヨードメタンの場合のそれぞれの式の連立方程式の解として、固体－気体間の表面自由エネルギー（γｓ）の分散成分（γｓ ｄ）と極性成分（γｓ ｈ）を算出する。

　ＸＰＳ測定により求められる、培養面の炭素原子と酸素原子の合計に対する酸素原子の存在比率をＣ１とし、前記フィルム基材の材料の化学式から計算される炭素原子と酸素原子の合計に対する酸素原子の存在比率をＣ２とする。
　ＸＰＳ測定により求められる酸素原子の存在比率は、炭素原子に由来するピーク面積と、酸素原子に由来するピーク面積から相対感度係数法を用いて算出したものである。
　Ｏの相対感度因子：１０．９５８３、Ｃの相対感度因子：４．０７９は解析ソフト（ＪＥＯＬ　ＳｐｅｃＳｕｒｆ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｖｅｒ．　１．９．２　２０１２）の登録データを使用する。
　本実施形態では、細胞培養用フィルム基材は、Ｃ１、Ｃ２が、Ｃ１＞Ｃ２を満たすように構成されてもよい。これにより、細胞接着性および細胞シート形成能を安定的に高められる。
　Ｃ１＞Ｃ２の場合、Ｃ２の範囲は、例えば、０原子％～４０原子％、好ましくは５原子％～３５原子％、より好ましくは１０原子％～３０原子％である。
　また、細胞培養用フィルム基材は、［Ｃ１－Ｃ２］が、３原子％以上に構成されてもよい。これにより、細胞接着性および細胞シート形成能を安定的に高められる。
　細胞培養用フィルム基材がポリエーテルエーテルケトンで構成される場合、［Ｃ１－Ｃ２］は、例えば、６原子％以上、好ましくは８原子％以上、より好ましくは１０原子％以上である。
　細胞培養用フィルム基材がポリエチレンテレフタレートで構成される場合、［Ｃ１－Ｃ２］は、例えば、４原子％以上である。
　細胞培養用フィルム基材がポリスチレンで構成される場合、［Ｃ１－Ｃ２］は、例えば、６原子％以上、好ましくは１０原子％以上、より好ましくは１５原子％以上である。
　以下、本実施形態の細胞培養用フィルム基材の詳細を説明する。
　図１は、本実施形態の細胞シート付フィルム基材５０の構成の一例を模式的に示す断面図である。
　細胞シート付フィルム基材５０は、細胞培養用フィルム基材１０と、細胞培養用フィルム基材１０の培養面１２の少なくとも一部を覆う細胞シート４０と、を有する。
　細胞培養用フィルム基材１０の培養面１２は、上述のプラズマ処理された表面になる。裏面１４は、プラズマ処理されていても、プラズマ処理されていなくてもよい。
　細胞培養用フィルム基材１０は、細胞を培養して細胞シート４０を形成するための細胞シート足場材と、培養された細胞シート４０を運搬する細胞シート支持体との両方に用いることが可能である。
　このような細胞培養用フィルム基材１０は、細胞シート４０を被移植部位に貼付した後に、当該細胞シート４０から分離される、移植用の医療基材として用いることができる。
　細胞培養用フィルム基材１０の面積は、特に制限されるものではないが、例えば、０．３ｃｍ２以上１０００ｃｍ２以下である。細胞培養用フィルム基材１０の面積の下限値としては、より好ましくは０．６ｃｍ２以上、更に好ましくは１．６ｃｍ２以上、特に好ましくは８ｃｍ２以上であり、３ｃｍ２以上、４ｃｍ２以上、５ｃｍ２以上、６ｃｍ２以上、７ｃｍ２以上又は１０ｃｍ２以上であってもよい。一方、細胞培養用フィルム基材１０の面積の上限値としては、より好ましくは９００ｃｍ２以下、更に好ましくは８００ｃｍ２以下、特に好ましくは５００ｃｍ２以下であり、１００ｃｍ２以下、５０ｃｍ２以下又は２０ｃｍ２以下であってもよい。培養容器より大きい場合は、細胞シートが得られない可能性がある。例えば、細胞培養用フィルム基材１０の面積は、０．６ｃｍ２以上９００ｃｍ２以下、１．６ｃｍ２以上８００ｃｍ２以下、３ｃｍ２以上５００ｃｍ２以下、６ｃｍ２以上１００ｃｍ２以下、８ｃｍ２以上５０ｃｍ２以下又は１０ｃｍ２以上２０ｃｍ２以下である。
　なお、表面法線方向から見たときの、細胞培養用フィルム基材１０の形状は、図１において円形が示されているが、円形以外の適宜の形状であってもよく、例えば正方形、正五角形、正六角形、正八角形等の正多角形や、長円形、矩形等であってもよい。
　表面法線方向から見たとき、細胞培養用フィルム基材１０は、表裏面を貫通する開口部を有しないものであってもよく、培養容器２０に設置したとき、培養容器２０の底面が露出する開口部を有しないことが好ましい。
　細胞培養用フィルム基材１０の厚みは、特に限定されないが、好ましくは５μｍ以上２５０μｍ以下である。厚みの下限値としては、より好ましくは６μｍ以上、さらに好ましくは８μｍ以上、１０μｍ以上、１２μｍ以上である。一方、厚みの上限値としては、より好ましくは５０μｍ以下、３０μｍ以下、２５μｍ以下、さらに好ましくは２０μｍ以下である。例えば、細胞培養用フィルム基材１０の厚みは、６μｍ以上５０μｍ以下、８μｍ以上３０μｍ以下、又は１０μｍ以上２０μｍ以下である。
　上記下限値以上とすることにより、細胞培養用フィルム基材１０が搬送時に破れたり丸まってしまったりすることを防げ、取り扱い性を向上できる。上記上限値以下とすることにより、移植時に患部への追従性を向上できる。特に厚みを２０μｍ以下とすると、より曲率の高い患部への追従性を高めることができ、例えば、手術により体内の器官を縫合した箇所などにも適用できる。
　なお、厚み方向の断面視における細胞培養用フィルム基材１０は、全体の表面が平坦なシート状を有してもよい。
　また、培養時における自立膜として機能する観点から、細胞培養用フィルム基材１０の厚みの下限は、１０μｍ超が好ましく、１１μｍ以上がより好ましく、１２μｍ以上がさらに好ましい。これにより、厚みが１０μｍ超の細胞培養用フィルム基材１０を用いることにより、細胞培養工程時において、細胞培養用フィルム基材１０を培養容器２０の内部に固定または固着しない状態で、細胞シート４０を製造することが可能となる。
　自立膜とは、細胞培養用フィルム基材１０の培養面１２の平面状態が、培地３０中でも維持される膜であることが好ましく、培養面１２上に細胞シート４０が形成された後も平面状態が維持されることがより好ましい。培養面１２の平面状態が維持されるため、丸まらない細胞培養用フィルム基材１０は、固着しないで培地３０中での細胞培養特性を高められる。
　また、この自立膜は、鑷子で一端を摘まんで持ち上げたとき、シート形状を一定程度保持できるものであってもよい。
　細胞培養用フィルム基材１０を構成する材料として、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリブチレンテレフタレート（ＰＢＴ）、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、変性ポリフェニレンエーテル（ｍＰＰＥ）、ポリフェニレンスルフィド（ＰＰＳ）、ポリスルフォン（ＰＳＵ）、ポリアリレート（ＰＡＲ）、液晶ポリマー（ＬＣＰ）、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ナイロン６６（Ｎ６６）、エチレン・テトラフルオロエチレン共重合体（ＥＴＦＥ）、テトラフルオロエチレン・パーフルオロアルキルビニルエーテル共重合体（ＰＦＡ）、アクリルニトリル・ブタジエン・スチレン共重合体（ＡＢＳ）、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、シリコーン、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、ポリアセタール（ＰＯＭ）、ポリイミド（ＰＩ）、ポリアミド（ＰＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、フィブロイン、セルロース、再生セルロース、環状オレフィンポリマー、ゼラチン、コラーゲン等が挙げられる。上記の材料をフィルム形状に加工することは公知であり、市販されているものから選択して使用できる。
　この中でも、かかる材料が、芳香環を有する有機高分子化合物、または芳香環および酸素原子を有する有機高分子化合物を含むことが好ましい。
　細胞培養用フィルム基材１０の一例は、これらの材料の少なくとも一つを主成分に含むフィルムで構成されていてもよく、透明で比重が１．０より大きく、各種耐久性や機械的強度、加工性に優れる材料であることが好ましく、好ましくはポリエーテルエーテルケトンフィルム、ポリエチレンテレフタレートフィルムまたはポリスチレン、より好ましくはポリエーテルエーテルケトンフィルムである。
　細胞培養用フィルム基材１０は、上記樹脂材料からなる樹脂層を１層または２層以上含む樹脂フィルムが好ましい。２層以上の樹脂層は、互いに異なる種類の材料を含んでもよい。
　細胞培養用フィルム基材１０は、上記材料からなる樹脂層を含む樹脂基材からなる構成であってもよく、上記材料からなる樹脂層と他の材料からなる樹脂層および／または無機層とを含むラミネート基材からなる構成でもよい。ただし、樹脂層には、パリレンなどの化学蒸着によって形成される層やウェットコーティング層は含まなくてよい。また、ラミネート基材における無機層は、ガラスを含まないことが好ましく、金属箔を含んでもよい。また、細胞培養用フィルム基材１０は、培養面１２側に不織布および繊維基材を含まないことが好ましい。
　ＰＥＥＫを含む細胞培養用フィルム基材１０は、低線膨張係数、耐溶剤性、耐熱性、耐衝撃性、耐滅菌性の観点から総合的に検討すると、ＰＥＴを含む場合と比べて好ましい。
　また、細胞培養用フィルム基材１０は、培地３０よりも比重が高い材料で構成されているものが好ましい。
　細胞培養用フィルム基材１０の培養面１２の表面粗さＲａの下限が、０．３ｎｍ以上、好ましくは０．５ｎｍ以上であり、上限が１００ｎｍ以下、好ましくは１０ｎｍ以下、より好ましくは２ｎｍ以下である。なお、ここでの表面粗さＲａとは、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）にて測定した表面形状データを用いて、一辺１００ｎｍの正方形の領域における算術平均粗さを指す。
　細胞培養用フィルム基材１０の培養面１２を、レーザー顕微鏡で測定した際に、１００μｍ四方の範囲に、直径１μｍ以上１００μｍ以下、かつ深さ０．５μｍ以上１００μｍ以下の穴が３つ以下である細胞培養用フィルム基材である。前記穴の直径は、例えば１μｍ以上１００μｍ以下、好ましくは２μｍ以上５０μｍ以下、より好ましくは３μｍ以上３０μｍ以下である。前記穴の深さは、例えば０．５μｍ以上１００μｍ以下、好ましくは１μｍ以上５０μｍ以下、より好ましくは２μｍ以上２０μｍ以下である。
　穴の直径と穴の深さの範囲の組み合わせは、例えば穴の直径が１μｍ以上１００μｍ以下かつ穴の深さが０．５μｍ以上１００μｍ以下、穴の直径が１μｍ以上１００μｍ以下かつ穴の深さが１μｍ以上５０μｍ以下、穴の直径が１μｍ以上１００μｍ以下かつ穴の深さが２μｍ以上２０μｍ以下、穴の直径が２μｍ以上５０μｍ以下かつ穴の深さが０．５μｍ以上１００μｍ以下、穴の直径が２μｍ以上５０μｍ以下かつ穴の深さが１μｍ以上５０μｍ以下、穴の直径が２μｍ以上５０μｍ以下かつ穴の深さが２μｍ以上２０μｍ以下、穴の直径が３μｍ以上３０μｍ以下かつ穴の深さが０．５μｍ以上１００μｍ以下、穴の直径が３μｍ以上３０μｍ以下かつ穴の深さが１μｍ以上５０μｍ以下、穴の直径が３μｍ以上３０μｍ以下かつ穴の深さが２μｍ以上２０μｍ以下である。
　また、細胞培養用フィルム基材１０の空隙率の上限は、例えば、１５％以下、好ましくは１０％以下、より好ましくは５％以下である。一方、細胞培養用フィルム基材１０の空隙率の下限は、特に限定されないが、０％以上でもよい。
　培養面１２の上記穴が３つ以下であること、および／または、細胞培養用フィルム基材１０の空隙率を上記上限値以下とすることにより、細胞シート４０との密着力を適度なものとすることができる。
　なお、穴の有無は、細胞培養用フィルム基材１０が培養面１２側に形成される樹脂層の表面を測定対象としてもよい。
　空隙率は、理論密度と実測密度から算出する。具体的には、空隙率＝｛１－（実密度／理論密度）｝×１００の計算式により算出する。
　また、細胞培養用フィルム基材１０の培養面１２は、温度応答性ポリマーを含まないように構成されてもよい。これにより、凍結保存工程などの低温環境下で、細胞シート４０と細胞培養用フィルム基材１０との密着性が低下することを抑制できる。
　温度応答性ポリマーは、細胞を培養する際の温度で細胞接着性を発揮し、そこから温度変化を行うことで細胞非接着性を発揮して細胞シートを容易に剥離することが可能となる材料である。温度応答性ポリマーが細胞接着性を発揮する温度領域が１０℃～４５℃、特に３３℃～４０℃の範囲であると、細胞を安定的に培養することができ好ましい。また、温度応答性ポリマーが細胞非接着性を発揮する温度領域は、１℃～３６℃、特に４℃～３２℃の範囲内であると、細胞シートの剥離に与えるダメージを減らすことができるため好ましい。温度応答性ポリマーを構成する材料としては、具体的には、ポリ－Ｎ－イソプロピルアクリルアミド（ＰＮＩＰＡＡｍ）、ポリ－Ｎ－ｎ－プロピルアクリルアミド、ポリ－Ｎ－ｎ－プロピルメタクリルアミド、ポリ－Ｎ－エトキシエチルアクリルアミド、ポリ－Ｎ－テトラヒドロフルフリルアクリルアミド、ポリ－Ｎ－テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド、および、ポリ－Ｎ，Ｎ－ジエチルアクリルアミドなどの温度応答性高分子を挙げることができ、なかでもＰＮＩＰＡＡｍ、ポリ－Ｎ－ｎ－プロピルメタクリルアミド、ポリ－Ｎ，Ｎ－ジエチルアクリルアミドが好ましい。
　なお、培養容器２０の底面も、温度応答性ポリマーを含まないように構成されてもよい。
　細胞シートの培養に使用される前の細胞培養用フィルム基材１０は、包装材料に包装された包装体とすることができる。密封された包装体とすることで、培養面を汚損させずに保存、流通させることができる。また、この包装体は滅菌してもよい。滅菌方法は電子線滅菌、ガンマ線滅菌、ＥＯＧ滅菌、高圧蒸気滅菌、等が挙げられる。
　包装材料は、例えば、アルミニウム、ポリエチレンテレフタレート、アイオノマー、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリビニルアルコール、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリアクリロニトリル、エチレン酢酸ビニル共重合体、エチレン－ビニルアルコール共重合体、エチレン－メタクリル酸共重合体、ペルフルオロアルコキシフッ素樹脂、ナイロン、セロファン、紙材などが挙げられる。これらを単独で用いてもよいし、これらから二つ以上を組み合わせてもよい。ＥＯＧ滅菌や高圧蒸気滅菌のようにガス透過性が求められる滅菌を行う場合は、紙材や不織布材と上記材料とを組合せた包装材料が好ましく用いられる。なお、包装材料は多重梱包としてもよく、滅菌後にさらに包装を重ねてもよく、包装体の最外部分は樹脂のフィルム状の包装材料であることが好ましい。
　また、細胞シートの培養に使用される前の細胞培養用フィルム基材１０を、培養容器２０に入れてから包装材料で包装して包装体とすることもできる。また、包装体としてから滅菌してもよい。
＜細胞シート付フィルム基材の製造方法＞
　プラズマ処理された細胞培養用フィルム基材１０上で細胞シート４０を培養することにより、図１に示すような、細胞シート４０と細胞培養用フィルム基材１０の積層体を含む細胞シート付フィルム基材５０が得られる。
　具体的には、本実施形態の細胞シート付フィルム基材５０の製造方法の一例は、例えば、培養容器２０の内部に、複数の細胞、培地３０、および、プラズマ処理された細胞培養用フィルム基材１０を導入して、細胞培養用フィルム基材１０の培養面１２に細胞シート４０を培養する、培養工程を含んでもよい。
　本実施形態の細胞シート付フィルム基材の製造方法について、図２を用いて具体的に説明する。
　図２は、製造方法の工程の一例を模式的に示す工程断面図である。図２中、（ａ）は細胞播種、（ｂ）は細胞培養、（ｃ）は凍結保存・解凍、（ｄ）は取出、の各プロセスを示す。（ｃ）の凍結保存・解凍は任意のプロセスである。このような工程は、人が手動で行ってもよいし、適切な装置を用いて自動培養してもよく、品質やコストから適宜選択できる。
　ここでは（ｃ）を実施しない製造方法を説明し、（ｃ）の詳細は後述の＜凍結保存方法＞で説明する。
　培養工程は、図２（ａ）に示される細胞播種工程、および図２（ｂ）に示される細胞培養工程を含んでもよい。
　図２（ａ）の細胞播種工程では、培養面１２がプラズマ処理された細胞培養用フィルム基材１０を培養容器２０中に設置し、細胞培養用フィルム基材１０の培養面１２に、細胞を含む培地３０に接触させる。細胞は、培地３０に予め懸濁しておいてもよいが、細胞を含む細胞懸濁液を培地３０に加えてもよい。培養容器２０中に設置する前に、細胞培養用フィルム基材１０をエタノール水溶液等で洗浄する洗浄工程を加えてもよいし、細胞培養用フィルム基材１０の静電気等での帯電を除去する除電工程を加えてもよい。
　細胞培養用フィルム基材１０は、培養工程中、その一部または全体が培地３０中に浸漬した状態としてもよい。具体的には、細胞播種工程では、細胞培養用フィルム基材１０の表面の一部に培地３０を滴下してもよいが、細胞培養用フィルム基材１０の培養面１２および側面のそれぞれの少なくとも一部が培地３０に接触した状態となるように、細胞培養用フィルム基材１０を培地３０中に浸漬してもよい。後者の浸漬方法の方が、前者の滴下方法と比べて、次の細胞培養工程中の培養環境を安定的に維持することが可能になる、および／または、細胞培養用フィルム基材１０の培養面１２の大面積化を図ることが可能になる。
　図２（ｂ）の細胞培養工程では、適当な培養条件下で培養を行い、細胞培養用フィルム基材１０の培養面１２上に細胞シート４０を形成する。培養時には蓋（図示せず）をして培養してもよい。
　細胞培養工程において、細胞培養用フィルム基材１０を培養容器２０の内部に固着せずに、細胞シート４０を培養することができる。このとき、細胞培養用フィルム基材１０は、細胞培養時に自立膜として機能する。細胞培養用フィルム基材１０が固着されていないため、取出工程において、培養容器２０からの細胞シート付フィルム基材５０を簡便に取り出すことが可能になる。また、取出時における細胞シート４０の破損も抑制できる。ここで、固着とは、取出時に物理的手段によって引き剥がし操作が必要な程度に密着した状態を言う。自重以外の荷重で押さえつけて動かないようにする固定手段は、ここでいう「固着」手段には含まれない。
　本明細書において、物理的手段とは、例えば、フィルムを把持しながら引き剥がす方法やナイフ等で傷つけて剥がす方法等が挙げられる。
　なお、細胞培養用フィルム基材１０を固着せずに、培地３０中に浸漬する方法の一つとして、細胞培養用フィルム基材１０の比重を培地３０よりも大きくする方法、細胞培養用フィルム基材１０の培養面１２の一部に対して重りにより荷重固定する方法、あるいは、細胞培養用フィルム基材１０を器具により位置固定する方法等の一つ又は二つ以上を採用してもよい。すなわち、上記細胞培養工程中、荷重固定および／または位置固定により、細胞培養用フィルム基材１０を培地３０中に浸漬した状態で細胞培養することができる。
　製造方法は、図２（ｄ）に示される細胞シート付フィルム基材５０の取出工程を含んでもよい。
　図２（ｄ）の取出工程では、培養容器２０から、細胞シート付フィルム基材５０を取り出す。その後、例えば、細胞シート付フィルム基材５０を、被移植部位等の所望の場所まで搬送してもよい。
　本実施形態の取出工程では、取出方法は特に限定されないが、例えば、細胞シート付フィルム基材５０を構成する細胞培養用フィルム基材１０をつまんで取り出す方法、細胞培養用フィルム基材１０を吸引ノズルに接触させて吸引しながら持ち上げる方法、細胞培養用フィルム基材１０を糸掛けして引き上げる方法等が挙げられる。
（培養容器）
　培養容器２０は、培地中で細胞を培養するための容器であり、培養する細胞の種類及び用途に適したものであれば、特に制限されるものではない。
　培養容器２０としては、例えば、ディッシュ、ペトリディッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、フラスコ、組織培養用フラスコ、マイクロプレート、マイクロウェルプレート、マルチプレート、マルチウェルプレート、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、ローラーボトルなどが挙げられる。
　また培養容器２０は、表面処理された細胞接着性を付与された培養容器（接着細胞用）でも、表面処理されていない培養容器（浮遊細胞用）でもよい。培養容器２０の表面処理の有無は、細胞培養用フィルム基材１０には影響しない。以降、特に明記しない場合は、どちらでも使用ができる。
　培養容器２０の素材としては、培地３０を透過させないものであれば、特に制限されるものではないが、例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリビニルアルコール、ポリエチレンテレフタレート、ポリアセタール、ポリ塩化ビニル、アクリル樹脂、ポリカーボネート、ポリエーテルエーテルケトン、ポリエーテルスルホン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリイミド、ポリアミド、環状オレフィンポリマー、セルロース、シリコ－ン、ナイロン６，６、ガラス、ステンレスやアルミニウムなどの金属などが挙げられる。
　培養容器２０の面積は、特に制限されるものではないが、市販されている培養容器の面積であれば問題なく培養を行える。例えば、０．３ｃｍ２以上１０００ｃｍ２以下である。下限値としては、より好ましくは０．３５ｃｍ２以上、更に好ましくは１．０ｃｍ２以上、特に好ましくは１．９ｃｍ２以上である。一方、上限値としては、より好ましくは９００ｃｍ２以下、更に好ましくは８００ｃｍ２以下、特に好ましくは５００ｃｍ２以下である。
（細胞）
　細胞は、細胞、組織、臓器の欠損及び機能障害、機能不全に関連する症状を治療又は予防するための臨床上有用な細胞、非臨床試験などで使用する培養可能な細胞であって、生体から分離された細胞であれば、特に制限されるものではない。
　細胞としては、例えば、生体組織細胞、間葉系組織に属する細胞に分化する能力を有する間葉系幹細胞、様々な生体組織に分化する能力を有する多能性幹細胞、分化誘導される幹細胞や前駆細胞などが挙げられる。なお、細胞は、接着細胞であっても浮遊細胞であってもよい。
　生体組織細胞の具体例としては、例えば、線維芽細胞、筋線維芽細胞、角膜上皮細胞、網膜細胞、神経細胞、筋細胞、心筋細胞、筋芽細胞、骨細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、肝細胞、膵細胞、腎細胞、歯肉細胞、骨膜細胞、皮膚細胞、内皮細胞などが挙げられる。
　間葉系幹細胞の具体例としては、例えば、脂肪組織由来間葉系幹細胞、骨髄由来間葉系幹細胞、臍帯血由来間葉系幹細胞、臍帯由来間葉系幹細胞などが挙げられる。
　多能性幹細胞の具体例としては、例えば、誘導多能性幹細胞、胚性幹細胞、核移植胚性幹細胞、胚性腫瘍細胞、胚性生殖細胞などが挙げられる。
　また、これらの細胞は、単独で培養してもよいし、二種以上を組み合わせて培養してもよい。これらの細胞については、細胞の用途などに応じて公知のものから適宜設定すればよい。
　なお、細胞の由来は、特に制限されるものではないが、例えば、哺乳類、鳥類、両生類、魚類、昆虫、植物、微生物などが挙げられる。哺乳類及び鳥類の具体例としては、例えば、ヒト、サル、チンパンジー、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウス、ラット、ニワトリなどが挙げられる。
（培養条件）
　細胞培養は、特に制限されるものではなく、医療、医薬品、医薬部外品、化粧品、食品、動物用薬品などの技術分野、及び再生医療、生物工学などの基礎技術分野において使用されている通常の手段を用いることができる。
　培養条件は、培養細胞を目的とする状態にできるのであれば、特に制限されるものではない。一般的な培養条件としては、例えば、調製した基礎培地を用いた３７℃、５％ＣＯ２の環境下である。
　細胞培養の期間は、培養細胞が目的とする状態になるのであれば、特に制限されるものではない。細胞培養の期間としては、例えば、２８日以内、２１日以内、１４日以内、７日以内、５日以内、３日以内である。長期間培養する際は、培地交換しても良い。培地交換の頻度と方法は特に制限されるものではない。一般的には１日～７日毎に交換することが好ましい。特に好ましくは、１日～５日である。この時、全量培地を交換しても良く、一部培地を残し、新しい培地を加えても良い。
　培養する細胞の密度は、培養する細胞、培養容器、培養細胞の用途に適したものであれば、特に制限されるものではないが、例えば、５×１０２細胞／ｃｍ２以上１×１０９細胞／ｃｍ２以下である。細胞密度の下限値としては、より好ましくは１×１０３細胞／ｃｍ２以上、更に好ましくは５×１０３細胞／ｃｍ２以上、特に好ましくは５×１０４細胞／ｃｍ２以上である。一方、細胞密度の上限値としては、より好ましくは１×１０８細胞／ｃｍ２以下、更に好ましくは５×１０７細胞／ｃｍ２以下、特に好ましくは１×１０７細胞／ｃｍ２以下である。
　培養する細胞の密度は例えば、５×１０２細胞／ｃｍ２以上１×１０９細胞／ｃｍ２以下、５×１０２細胞／ｃｍ２以上１×１０８細胞／ｃｍ２以下、５×１０２細胞／ｃｍ２以上５×１０７細胞／ｃｍ２以下、５×１０２細胞／ｃｍ２以上１×１０７細胞／ｃｍ２以下、１×１０３細胞／ｃｍ２以上１×１０９細胞／ｃｍ２以下、１×１０３細胞／ｃｍ２以上１×１０８細胞／ｃｍ２以下、１×１０３細胞／ｃｍ２以上５×１０７細胞／ｃｍ２以下、１×１０３細胞／ｃｍ２以上１×１０７細胞／ｃｍ２以下、５×１０３細胞／ｃｍ２以上１×１０９細胞／ｃｍ２以下、５×１０３細胞／ｃｍ２以上１×１０８細胞／ｃｍ２以下、５×１０３細胞／ｃｍ２以上５×１０７細胞／ｃｍ２以下、５×１０３細胞／ｃｍ２以上１×１０７細胞／ｃｍ２以下、５×１０４細胞／ｃｍ２以上１×１０９細胞／ｃｍ２以下、５×１０４細胞／ｃｍ２以上１×１０８細胞／ｃｍ２以下、５×１０４細胞／ｃｍ２以上５×１０７細胞／ｃｍ２以下、５×１０４細胞／ｃｍ２以上１×１０７細胞／ｃｍ２以下である。
（培地）
　培地３０は、培養する細胞に適したものであれば、特に制限されるものではなく、培地成分を含む液体である。培地成分としては、例えば、糖類、アミノ酸、ビタミン類、無機塩、微量金属、添加物などが挙げられる。
　また、これらの培地成分は、単独で配合してもよいし、二種以上を組み合わせて配合してもよい。これらの培地成分については、培養する細胞などに応じて公知のものから適宜設定してもよいし、独自に配合した成分としてもよい。
　糖類の具体例としては、例えば、グルコースやフルクトース、マンノース、ガラクトースなどの単糖類、スクロースやスクラロース、トレハロース、マルトース、ラクトースなどの二糖類、グルコシルスクロースやラクトスクロース、ラフィノースなどの三糖類、アカルボースやマルトテトラオースなどの四糖類、シクロデキストリン、オリゴ糖などが挙げられる。
　アミノ酸の具体例としては、例えば、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－グルタミン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－シスチン、グリシン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－リジン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－セリン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－チロシン、Ｌ－バリン、Ｌ－アラニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－システイン、Ｌ－ヒドロキシプロリンなどが挙げられる。
　ビタミン類の具体例としては、例えば、Ｌ－アスコルビン酸ナトリウム、Ｌ－アスコルビン酸－二リン酸、コリン、葉酸、ナイアシン、ビオチン、パントテン酸、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、チミジン、ビタミンＢ１２などが挙げられる。
　無機塩の具体例としては、例えば、塩化ナトリウム、水酸化ナトリウム、硫酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、塩化カリウム、水酸化カリウム、硫酸カリウム、リン酸カリウム、リン酸水素二カリウム、炭酸カリウム、炭酸水素カリウム、塩化カルシウム、硫酸カルシウム、硝酸カルシウム、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、硝酸マグネシウム、リン酸マグネシウム、炭酸マグネシウムなどが挙げられる。
　微量金属の具体例としては、例えば、硫酸鉄、硝酸鉄、硫酸銅、硝酸銅、硫酸亜鉛などが挙げられる。
　添加物の具体例としては、例えば、ウシ血清やウマ血清、ヒト血清などの血清、、または人工血清、ＦＧＦ２やＥＧＦ、ＨＧＦ、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦなどの増殖因子、アルブミンなどのタンパク質、グルタチオンやアスコルビン酸、アスコルビン酸誘導体などの抗酸化剤、ペニシリンやストレプトマイシンなどの抗生物質、ＨＥＰＥＳなどのｐＨ調整剤、乳酸やプロピオン酸などの有機酸、コレステロールなどの脂質、リノレン酸などの脂肪酸、エタノールアミンやプトレシンなどのアミン類、メルカプトエタノールや３－メルカプト－１，２－プロパンジオールなどの還元剤、アルギン酸ナトリウムやポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロース、プルランなどの増粘剤、フェノールレッドなどのｐＨ指示薬などが挙げられる。
　上記の培地成分を含有する培地３０としては、例えば、ＡＩＭ　Ｖ　ｍｅｄｉｕｍ、ＨＦＤＭ－１　Ｍｅｄｉｕｍ、ダルベッコリン酸緩衝食塩液（Ｄ－ＰＢＳ）やハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）などの平衡緩衝液、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ　Ｍｅｄｉｕｍ）やＥＭＥＭ（Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ）、α－ＭＥＭ（Ｍｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ　ａｌｐｈａ　Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＩＭＤＭ（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ）、ＧＭＥＭ（Ｇｌａｓｇｏｗ’ｓ　ＭＥＭ）、Ｈａｍ’ｓ　Ｆ－１０　ｍｅｄｉｕｍ、Ｈａｍ’ｓ　Ｆ－１２　ｍｅｄｉｕｍ、Ｈａｍ’ｓ　Ｆ－１２Ｋ　ｍｅｄｉｕｍ、ＲＰＭＩ　ｍｅｄｉｕｍ　１６４０、Ｍ－１９９　ｍｅｄｉｕｍ、Ｌ－１５　ｍｅｄｉｕｍ、ＭｃＣｏｙ’ｓ　５Ａ　Ｍｅｄｉｕｍ、ＭＣＤＢ１０５　ｍｅｄｉｕｍ、ＭＣＤＢ１０７　ｍｅｄｉｕｍ、ＭＣＤＢ１３１　ｍｅｄｉｕｍ、ＭＣＤＢ１５３　ｍｅｄｉｕｍ、ＭＣＤＢ２０１　ｍｅｄｉｕｍ、ＮＣＴＣ１０９　ｍｅｄｉｕｍ、ＮＣＴＣ１３５　ｍｅｄｉｕｍ、Ｗａｙｍｏｕｔｈ’ｓ　ＭＢ７５２／１　ｍｅｄｉｕｍ、ＣＭＲＬ－１０６６　ｍｅｄｉｕｍ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ’ｍｅｄｉｕｍ　Ｅ、Ｂｒｉｎｓｔｅｒ’ｓ　ＢＭＯＣ－３　Ｍｅｄｉｕｍ、Ｅ８　ｍｅｄｉｕｍなどの基礎培地などが挙げられる。
　また、これらの基礎培地は、単独で用いてもよいし、二種以上を組み合わせて用いてもよい。さらに、基礎培地は、細胞の種類や状態に応じて、培地成分を追加、除去、増量、減量してもよい。これらの基礎培地については、培養する細胞などに応じて公知のものから適宜設定してもよいし、独自配合組成を用いてもよい。
（細胞シート）
　細胞シート４０は、細胞同士が接着分子、細胞外マトリックスなどを介して物理的、機能的に連結してシート構造を有するものである。
　細胞シート４０は、１の細胞層から構成される単層構造であってもよいし、２以上の細胞層から構成される積層構造でもよい。積層構造としては、特に制限されるものではないが、２層、３層、４層、５層などの多層構造が挙げられる。
　細胞シート４０が多層構造を持つ場合、細胞培養用フィルム基材１０で培養した際に多層構造が得られることもあるし、単層構造を持つ細胞シートを積層して得ることもできる。特に、本発明の細胞シート付フィルム基材５０を複数用意し、ある細胞シートの上に別の細胞シートを重ね合わせ、別の細胞シートから細胞培養用フィルム基材を剥がすことで、多層構造を持つ細胞シートを得ることができる。
　細胞シート４０の厚みは、特に制限されるものではないが、例えば、０．００１ｍｍ以上２．０ｍｍ以下である。細胞シート４０の厚みの下限値としては、より好ましくは０．０１ｍｍ以上、更に好ましくは０．０３ｍｍ以上、特に好ましくは０．０５ｍｍ以上である。一方、細胞シート４０の厚みの上限値としては、より好ましくは１．５ｍｍ以下、更に好ましくは１．２ｍｍ以下、特に好ましくは１．０ｍｍ以下である。細胞シート４０の厚みは例えば、０．００１ｍｍ以上２．０ｍｍ以下、０．００１ｍｍ以上１．５ｍｍ以下、０．００１ｍｍ以上１．２ｍｍ以下、０．００１ｍｍ以上１．０ｍｍ以下、０．０１ｍｍ以上２．０ｍｍ以下、０．０１ｍｍ以上１．５ｍｍ以下、０．０１ｍｍ以上１．２ｍｍ以下、０．０１ｍｍ以上１．０ｍｍ以下、０．０３ｍｍ以上２．０ｍｍ以下、０．０３ｍｍ以上１．２ｍｍ以下、０．０３ｍｍ以上１．０ｍｍ以下、０．０５ｍｍ以上２．０ｍｍ以下、０．０５ｍｍ以上１．５ｍｍ以下、０．０５ｍｍ以上１．２ｍｍ以下、０．０５ｍｍ以上１．０ｍｍ以下である。細胞シート４０の厚みを上記範囲とすることにより、細胞シート４０内での高い細胞活性率、及び細胞移植に有利な優れた形状維持能を発揮することができる。
　細胞シート４０の面積は、特に制限されるものではないが、例えば、０．３ｃｍ２以上１０００ｃｍ２以下である。細胞シート４０の面積の下限値としては、より好ましくは０．６ｃｍ２以上、更に好ましくは１．６ｃｍ２以上、特に好ましくは８ｃｍ２以上であり、３ｃｍ２以上、４ｃｍ２以上、５ｃｍ２以上、６ｃｍ２以上、７ｃｍ２以上又は１０ｃｍ２以上であってもよい。一方、細胞シート４０の面積の上限値としては、より好ましくは９００ｃｍ２以下、更に好ましくは８００ｃｍ２以下、特に好ましくは５００ｃｍ２以下であり、１００ｃｍ２以下、５０ｃｍ２以下又は２０ｃｍ２以下であってもよい。例えば、細胞シート４０の面積は、０．６ｃｍ２以上９００ｃｍ２以下、１．６ｃｍ２以上８００ｃｍ２以下、３ｃｍ２以上５００ｃｍ２以下、６ｃｍ２以上１００ｃｍ２以下、８ｃｍ２以上５０ｃｍ２以下又は１０ｃｍ２以上２０ｃｍ２以下である。従来、細胞シート単独での移植の際は、細胞シートの強度は低いため、大面積の場合は搬送時に破損する可能性が高かったが、本開示においては、細胞シート４０が細胞培養用フィルム基材に支持されているため、移植時に細胞シートが破れることを防ぐことができるため、細胞シート４０の大きさを８ｃｍ２以上に大きくできる。また、大きく細胞シートを作製し、適宜患部のサイズに調製して使用することもできる。
　なお、細胞シート付フィルム基材５０において、細胞シート４０の下面の全体が、細胞培養用フィルム基材１０の表面（培養面１２）に重なるように配置されていることが好ましい。
＜凍結保存方法＞
　本実施形態の凍結保存方法の一例は、図２（ｃ）に示すように、培養容器２０の内部の細胞培養用フィルム基材１０と細胞培養用フィルム基材１０の表面（培養面１２）に形成された細胞シート４０とを含む細胞シート付フィルム基材５０を、凍結保存液６０中で冷却する冷却工程を含む。培養容器には、培養用の蓋（図示せず）または液漏れおよび微生物混入を防ぐ蓋（図示せず）をして凍結してもよい。
　図２（ｃ）では、培養容器２０の内部で細胞シート付フィルム基材５０の凍結保存を行っているが、培養容器２０とは別の凍結保存容器に細胞シート付フィルム基材５０を移し替えて凍結保存を行ってもよい。凍結保存容器としては、特に制限されるものではないが、例えば、培養容器２０で例示されたものを使用することができる。
　冷却工程において、細胞シート付フィルム基材５０は、様々な態様を採用することが可能である。図３（ａ）（ｂ）に示すように、細胞シート付フィルム基材５０は、細胞シート４０の片側に細胞培養用フィルム基材１０が形成された構造を有してもよく、図３（ｃ）に示すように、細胞シート４０の両面を２枚の細胞培養用フィルム基材１０ａ、１０ｂで挟み込む構造を備えてもよい。図３（ａ）では、細胞培養用フィルム基材１０が培養容器２０の底面に向いた状態で配置される。図３（ｂ）では、細胞シート４０が培養容器２０の底面に向いた状態で配置される。図３（ｃ）では、細胞培養用フィルム基材１０ａ、１０ｂは、同一材料で構成されてもよく、互いに別の材料で構成されてもよい。例えば、細胞培養用フィルム基材１０ａ、１０ｂは、両方とも、ＰＥＥＫを含む細胞培養用フィルム基材でもよく、一方が、ＰＥＥＫを含む細胞培養用フィルム基材であり、他方が、ＰＥＥＫを含まない細胞培養用フィルム基材でもよい。
（凍結保存液）
　凍結保存液６０は、凍結保存による細胞の損傷を低減するための溶液である。
　凍結保存液６０は、細胞の凍結保存に適したものであれば、特に制限されるものではないが、培地に含まれる培地成分、凍結保護剤などを含有してもよい。
　培地成分である糖類、アミノ酸、ビタミン類、無機塩、微量金属、添加物については、上記（培地）の項の説明を充足するものであればよい。また、凍結保存液は、凝固開始温度が－１５℃以上－５℃以下の範囲にあるものが好ましい。
　凍結保護剤は、凍結保存時の凍結や解凍による細胞への損傷を低減するために使用する物質である。凍結保護剤としては、例えば、細胞非浸透性凍結保護剤、細胞浸透性凍結保護剤が挙げられる。
　細胞非浸透性凍結保護剤の具体例としては、例えば、アルブミン、スクロース、トレハロース、デキストラン、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリリジンなどが挙げられる。
　細胞浸透性凍結保護剤の具体例としては、例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、エチレングリコール、プロピレングリコール、プロパンジオールなどが挙げられる。
　また、これらの凍結保護剤は、単独で配合してもよいし、二種以上を組み合わせて配合してもよい。これらの凍結保護剤については、細胞の種類、凍結保存液の組成などに応じて公知のものから適宜設定してもよいし、独自に配合した組成を用いてもよい。
　ＤＭＳＯを含まない市販の凍結保存液としては、例えば、ステムセルバンカー（登録商標）ＤＭＳＯフリーＧＭＰグレード（日本全薬工業社）、バンバンカー（登録商標）ＤＭＳＯフリー（ＣＧリンフォテック社）、クライオスカーレス（登録商標）ＤＭＳＯフリー（バイオベルデ社）、ステムセルキープ（バイオベルデ社）、ＣｒｙｏＮｏｖｏ（登録商標）Ｘ１２（Ａｋｒｏｎ　ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ　ＬＣＣ社）、ＣｒｙｏＮｏｖｏ（登録商標）Ｐ２４（Ａｋｒｏｎ　ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ　ＬＣＣ社）、ヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞凍結保存用ＤＭＳＯフリー細胞凍結保存液（リプロセル社）、Ｃｅｌｌ　Ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ　Ｏｎｅ（ナカライテスク社）、ＴｈｅｌｉｏＫｅｅｐ（登録商標：バイオベルデ社）、Ｃｅｌｌｖａｔｉｏｎ（登録商標：Ｐｒｏｔｉｄｅ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社）、ＲｅｐｒｏＣｒｙｏ　ＲＭ（リプロセル社）、ＳＯＦＯＲＯ　Ｃｒｙｏ（ＳＡＲＡＹＡ社）などが挙げられる。また、ＤＭＳＯを含む市販の凍結保存液としては、例えば、ステムセルバンカー（登録商標）ＧＭＰグレード（日本全薬工業社）、ステムセルバンカー（登録商標）ＥＸ　ＧＭＰグレード（日本全薬工業社）、バンバンカー（登録商標）ｈＲＭ（ＣＧリンフォテック社）、バンバンカー（登録商標）（ＣＧリンフォテック社）、ｉＳｔｏｃｋ（ＣＧリンフォテック社）、ＣｒｙｏＳｔｏｒ　ＣＳ５（Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｒｉｖｅｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｃｅｌｌ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，　ｉｎｃ）、ＣｒｙｏＳｔｏｒ　ＣＳ１０（Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｒｉｖｅｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｃｅｌｌ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，　ｉｎｃ）などが挙げられる。
（冷却工程）
　冷却工程において、細胞シート付フィルム基材５０を、凍結保存液中で非貫流式の冷却装置を用いて冷却することが好ましい。適当な細胞培養用フィルム基材１０上で、細胞シート４０を、非貫流式の冷却装置により、冷却対象物である細胞シートを均一な温度で冷却することが可能となるため、細胞へのダメージが少なく、細胞活性率の低下を抑制できる。
　冷却工程において、０～－５℃における冷却速度は、例えば、０．１℃／分以上１５℃／分以下、好ましくは０．２５℃／分以上１２．５℃／分以下、より好ましくは０．５℃／分以上１０℃／分以下である。
　上記下限値以上とすることにより、不必要な液状の凍結保護材と細胞の接触時間を減らすことができる。上記上限値以下とすることにより、細胞内氷晶の形成を抑制することができる。
　冷却工程において、凍結処理の温度は、培養細胞及び凍結保存液を凍結することができれば、特に制限されるものではない。凍結処理の温度としては、例えば、－１９６℃以上－２５℃以下である。下限値としては、より好ましくは－１８０℃以上、更に好ましくは－１６０℃以上、特に好ましくは－１５０℃以上である。一方、上限値としては、より好ましくは－２５℃以下、更に好ましくは－３０℃以下、特に好ましくは－３５℃以下である。凍結処理の温度は例えば、－１９６℃以上－２５℃以下、－１９６℃以上－３０℃以下、－１９６℃以上－３５℃以下、－１８０℃以上－２５℃以下、－１８０℃以上－３０℃以下、－１８０℃以上－３５℃以下、－１６０℃以上－２５℃以下、－１６０℃以上－３０℃以下、－１６０℃以上－３５℃以下、－１５０℃以上－２５℃以下、－１５０℃以上－３０℃以下、－１５０℃以上－３５℃以下である。
　凍結処理に用いる冷却装置は、特に制限されるものではなく、例えば、急速冷凍装置、極低温冷蔵装置などが挙げられる。冷却装置としては、培養容器に伝熱手段を接触させて培養容器及び細胞を凍結させるよりも、伝熱手段と非接触であり、冷気を一方向ではなく多方向、好ましくは全方向から培養容器に吹き付けて凍結する冷凍装置であることが、均一な温度で細胞を凍結して、解凍後の細胞の生存率を高める観点から好ましい。冷気を培養容器に吹き付けて凍結する冷凍装置としては、具体的には、冷却ファンによる冷気循環により、被冷却物を冷却させる冷却装置、例えば、特開２００５－１２７６６６号公報に開示されている、冷却ファンを備えた非貫流方式の冷却装置などが挙げられる。なお、上記「非貫流方式」とは、被冷却物からの貫流空気の大半が冷却器を通過（貫流）しない方式を意味する。
（冷凍保存工程）
　凍結保存方法は、冷却工程の後、例えば－１９６～－６０℃、好ましくは－１８０～－６５℃、より好ましくは－１５０～－８０℃にて細胞シート付フィルム基材５０を保存する、凍結保存工程を含むことが好ましい。これにより、長期間にわたり細胞シートを安定に維持することができる。
　冷却工程の温度は、冷却装置の設定温度を採用してもよい。
　凍結保存は、細胞を安定に凍結保存することができれば、特に制限されるものではない。
　凍結保存の方法としては、例えば、冷却剤の液相、気相との接触、超低温冷凍庫の使用などが挙げられる。好ましい凍結保存の方法としては、温度の観点から冷却剤の液相、気相との接触である。
　冷却剤としては、例えば、液体窒素、液体エタン、液体プロパン、液体ヘリウム、ドライアイスなどが挙げられる。
　凍結保存の温度は、細胞を安定に凍結保存することができれば、特に制限されるものではない。凍結保存の温度としては、例えば、－１９６℃以上－６０℃以下、－１９６℃以上－１３４℃以下、－１３４℃以上－６０℃以下のいずれの範囲内でもよい。
　凍結保存の温度は、凍結対象となる細胞シート４０の表面温度を採用してもよい。表面温度は、例えば、Ｋ熱電対を用いて測定できる。
　細胞シート付フィルム基材５０の凍結物は、細胞培養用フィルム基材１０と、細胞培養用フィルム基材１０の表面（培養面１２）に形成された細胞シート４０と、を含むものである。細胞シート付フィルム基材５０中、細胞培養用フィルム基材１０および細胞シート４０が凍結保存状態である。
　上記凍結物において、細胞培養用フィルム基材１０および細胞シート４０が例えば、上述の凍結保存の温度にて、具体的には、好ましくは－６０℃以下、より好ましくは－１３５℃以下で凍結保存状態である。また、凍結物は、－１３４℃以上－６０℃以下の範囲で凍結保存状態としてもよい。なお、凍結物は、－１９６℃以上で凍結保存状態とする。
　培養容器や凍結保存容器の内部で凍結した細胞シート付フィルム基材の凍結物は、培養容器内や凍結保存容器で凍結された状態か、容器から取り出された状態で、包装材料で包装された包装体とすることができる。密封された包装体とすることで、細胞シートへの微生物混入防止および細胞シートを汚損させずに保存、流通させることができる。一例として、細胞シート付フィルム基材と凍結保存液を有する容器をフィルム状の包装材料で包装して密封した状態で凍結することで、凍結物の包装体を得ることができる。包装材料としては、アルミニウム、ポリエチレンテレフタレート、アイオノマー、ポリエチレン、ポリ塩化ビニリデン、ポリビニルアルコール、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリアクリロニトリル、エチレン酢酸ビニル共重合体、エチレン－ビニルアルコール共重合体、エチレン－メタクリル酸共重合体、ポリイミド、ペルフルオロアルコキシフッ素樹脂や四フッ化エチレン・六フッ化プロピレン共重合体（ＦＥＰ）等のフッ素系樹脂、ナイロンが好ましい。これらを単独で用いてもよいし、これらから二つ以上を組み合わせて多層ラミネートして用いてもよいし、多重包装した包装体としてもよい。
（解凍工程）
　本実施形態の移植方法が、上記冷凍保存方法を含む場合、冷凍保存方法は、さらに、細胞シート付フィルム基材５０を解凍する、解凍工程を含む。
　解凍方法は、特に制限されるものではなく、医療、医薬品、医薬部外品、化粧品、食品、動物用薬品などの技術分野、及び再生医療、生物工学などの基礎技術分野において使用されている通常の手段を用いることができる。
　解凍の方法としては、例えば、ウォーターバス、ビーズバス、インキュベータ、ホットプレート、デフロスターなどの使用や、凍結温度よりも高い温度の融解液に浸漬する、凍結温度よりも高い温度環境下に静置することなどが挙げられる。
　解凍時の凍結物に接する環境温度は、凍結温度より高い温度且つ５０℃未満であれば、特に制限されるものではない。上記の環境温度の上限は、例えば、４９℃以下、好ましくは４５℃以下、より好ましくは４０℃以下である。一方、環境温度の下限は、例えば、０℃以上、好ましくは５℃以上、より好ましくは１０℃、さらに好ましくは１５℃以上である。
　解凍時の凍結物に接する環境温度の範囲は例えば、０℃以上４９℃以下、０℃以上４５℃以下、０℃以上４０℃以下、５℃以上４９℃以下、５℃以上４５℃以下、５℃以上４０℃以下、１０℃以上４９℃以下、１０℃以上４５℃以下、１０℃以上４０℃以下、１５℃以上４９℃以下、１５℃以上４５℃以下、１５℃以上４０℃以下である。
　なお、解凍温度が５０℃以上である場合、細胞に熱ダメージが生じる可能性があるため好ましくない。また、解凍において凝固点以下の温度環境に一時的に保管してもよい。例えば、－８０℃に保管された凍結物を－３０℃の環境温度に曝した後に凝固点以上の環境温度で解凍することができる。
　凍結物の解凍に要する時間は、細胞に凍結による傷害が生じなければ、特に制限されない。通常、１０秒超、６０分以下であれば問題なく解凍できる。凍結物の解凍に要する時間の下限値としては、１０秒超であれば良く、２０秒以上が好ましく、３０秒以上がより好ましく、１分以上がさらに好ましい。上限値としては、６０分以下であれば良く、好ましくは５０分以下、より好ましくは４０分以下、さらに好ましく３０分以下である。例えば、解凍に要する時間は、１０秒超６０分以下、１０秒超５０分以下、１０秒超４０分以下、１０秒超３０分以下、２０秒以上６０分以下、２０秒以上５０分以下、２０秒以上４０分以下、２０秒以上３０分以下、３０秒以上６０分以下、３０秒以上５０分以下、３０秒以上４０分以下、３０秒以上３０分以下、１分以上６０分以下、１分以上５０分以下、１分以上４０分以下、１分以上３０分以下である。
　解凍が早すぎる場合、温度差による熱衝撃で凍結物に亀裂が生じ細胞シートが破損する恐れがある。解凍が遅すぎる場合、氷点下条件で水分子が再結晶し、氷晶が大きくなり、細胞に重篤な傷害が生じるため好ましくない。
　上記の解凍時間中において、上記の環境温度は、一定となるように設定されてもよく、段階的に上昇等の変動するように設定されてもよい。
　融解液は、培養細胞に損傷を与えないものであれば、特に制限されるものではない。融解液に含有する成分としては、例えば、スクロース、グルコース、マルトース、トレハロース、フルクトースなどが挙げられる。また、融解液は、上記（培地）の項に記載の成分を含有してもよい。
　融解液の温度は、凍結温度よりも高い温度であれば、特に制限されるものではない。融解液の温度としては、例えば、０℃以上４５℃以下である。下限値としては、より好ましくは４℃以上、更に好ましくは２５℃以上、特に好ましくは２８℃以上である。一方、上限値としては、より好ましくは４０℃以下、更に好ましくは３９℃以下、特に好ましくは３８℃以下である。
　解凍した細胞シート４０および細胞培養用フィルム基材１０（細胞シート付フィルム基材５０）は、必要に応じて、解凍処理直後に細胞洗浄液で洗浄してもよい。細胞洗浄液は、特に制限されるものではなく、上記（培地）の項に記載の成分を含有してもよい。
　細胞洗浄液の温度は、特に制限されるものではない。細胞洗浄液の温度としては、例えば、０℃以上４５℃以下である。下限値としては、より好ましくは４℃以上、更に好ましくは２５℃以上、特に好ましくは２８℃以上である。一方、上限値としては、より好ましくは４０℃以下、更に好ましくは３９℃以下、特に好ましくは３８℃以下である。
　培養細胞の洗浄回数は、特に制限されるものではなく、１回又は複数回（例えば、２回、３回、４回、５回など）である。
　本開示での一例においては、培養面１２に温度応答性ポリマーを含まないため、凍結保存工程などの低温環境下で、細胞シート４０が細胞培養用フィルム基材１０から剥離することを抑制でき、凍結保存工程と解凍工程を経ても、細胞シートとフィルムの接着性を維持したままの細胞シート付フィルム基材５０を得ることができる。
　移植方法は、図２（ｅ）に示される細胞シート４０の貼付工程を含んでもよい。
　図２（ｅ）の貼り付け工程では、細胞シート付フィルム基材５０の細胞シート４０を被移植部位７０に貼り付けた後、細胞シート４０から細胞培養用フィルム基材１０を剥離する。
　本実施形態では、貼り付け工程において、貼り付けから剥離までの時間を短時間化することが可能である。短時間化することで、異物として、長時間さらされないので、基材フィルムに対して免疫的に拒絶反応が起こるリスク低減、細胞が死ぬ可能性低減、操作が簡便になる。開胸して体内に細胞シートを貼り付けるような手術にも使用できる。
　貼り付けから剥離までの時間は、好ましくは１０分以下、より好ましくは５分以下、さらに好ましくは３分以下、一層好ましくは１分以下である。
　詳細なメカニズムは定かではないが、細胞培養用フィルム基材１０の培養面１２と細胞シート４０の表面との密着が適度な強さであるため、細胞シート４０が被移植部位７０に対して生物的に結合する前でも、細胞シート４０から細胞培養用フィルム基材１０を剥離可能であると推察される。
　また、本実施形態では、剥離後、細胞培養用フィルム基材１０の上に細胞シート４０が残存することを抑制できる。剥離後の細胞培養用フィルム基材１０上の細胞シート４０の残存率は、面積比換算で、好ましくは５０％以下、より好ましくは３０％以下、さらに好ましくは１０％である。
　細胞移植療法は、細胞、組織、臓器の欠損及び機能障害、機能不全に関連する症状の発症及び再発を抑制、防止するものである。細胞移植療法の対象疾患としては、例えば、脊髄損傷、膝関節軟骨損傷、虚血性心疾患、加齢黄斑変性、角膜上皮幹細胞疲弊症、再生不良性貧血、重症下肢虚血、難治性皮膚潰瘍、術後合併症（例えば、各種臓器の縫合不全、気管支断端瘻、膵液瘻、胆汁漏）、熱傷などが挙げられる。
　また、細胞移植療法に用いる細胞は、自己由来細胞、同種非自己由来細胞、異種由来細胞であってもよい。好ましい細胞としては、臨床応用及び安全性の観点から自己由来細胞であり、臨床応用及び生産性の観点から、非自己由来細胞である。
　被移植部位は、例えば、哺乳類、鳥類、両生類、魚類、昆虫、植物、微生物などの移植対象者における体の少なくとも一部が挙げられる。哺乳類及び鳥類の具体例としては、例えば、ヒト、サル、チンパンジー、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウス、ラット、ニワトリなどが挙げられる。ただし、被移植部位は、ヒトの身体の内部および外部を除外してもよい。移植対象者以外の被移植部位として、例えば、他の細胞シート、医療器具などの器具、移植対象者から分離された状態の組織単独または器官単独などが挙げられる。組織単独または器官単独の例としては、皮膚、口腔内組織、食道、気管、気管支、肺、肺葉、胃、十二指腸、すい臓、脾臓、小腸、大腸、筋組織、骨等が挙げられる（ただし、移植対象者から採取したものと同一人に治療のために戻すものを除く）。
　以上、本発明の実施形態について述べたが、これらは本発明の例示であり、上記以外の様々な構成を採用することができる。また、本発明は上述の実施形態に限定されるものではなく、本発明の目的を達成できる範囲での変形、改良等は本発明に含まれる。
　以下、本発明について実施例を参照して詳細に説明するが、本発明は、これらの実施例の記載に何ら限定されるものではない。
＜細胞培養用フィルム基材の製造＞
　表１に示す材料、厚みを有するフィルム基材を使用し、表１のプラズマ処理条件にて表面処理することにより、細胞培養用フィルム基材を製造した。
なお、ＲＩＥは反応性イオンエッチングのことである。具体的には、以下のような操作で行った。平行に置かれた２枚の平板型電極を備えるチャンバー内のカソード電極上にフィルム基材を載置した。チャンバー内を１０Ｐａまで減圧した後に所定のガスを所定の流量で流し、チャンバー内の圧力安定後、高周波電力（１３．５６ＭＨｚ）を所定の電力で印加し、プラズマを発生させた。所定の処理時間の経過後に電力の印加を終了、ガスを停止し、チャンバーを大気に開放し、フィルム基材を取り出した。プラズマ処理を行った面が培養面となる。
　表１中、放電処理強度は、ＲＦ（高周波）電力×処理時間／電極面積から算出した。
　なお、使用した電極の電極面積は７３６ｃｍ２であった。
　実施例１～５で使用したＰＥＥＫフィルムは、空隙率が５％以下であり、培養面をレーザー顕微鏡で測定した際に、１００μｍ四方の範囲に、直径１μｍ以上１００μｍ以下、かつ深さ０．５μｍ以上１００μｍの穴が１つもない、中実なフィルムであった。空隙率は、「｛１－（実測密度／理論密度）｝×１００」から算出した。
　また、各実施例で使用したフィルムにおいて、プラズマ処理後における表面粗さは、プラズマ処理前よりも粗面化されていた。プラズマ処理後におけるＲａは、実施例１が０．８ｎｍであった。なお、Ｒａの測定を以下のように行った。ＡＦＭ（島津製作所製ＳＰＭ－９７００）を用い、探針は先端径が小さいシリコン単結晶探針（曲率半径約１０ｎｍ）を用いた。表面を範囲１μｍ×１μｍで観察した。Ｒａの算出には装置に付属する解析ソフトを用い、ＸおよびＹ方向の平滑化処理を行った後に、異物や表面の傷を避けた範囲１００ｎｍ×１００ｎｍで表面粗さ解析を実行した。算術平均粗さＲａは、基準長さ内での基準線からの距離の平均値である。
＜細胞接着性＞
　培養に使用する回数と同じ数の基材を、上記＜細胞培養用フィルム基材の製造＞で製造された細胞培養用フィルム基材から切り出し、Φ１４ｍｍサイズに切断し、円盤状のフィルム基材を得た。下記の培養条件にて、細胞シート２０～３０枚の製造を実施した。フィルム基材全面に細胞が接着した場合は成功とカウントした。ただし、部分的な剥離があった場合はカウントしなかった。
　細胞シートの接着成功回数／細胞シートの製造回数から算出された成功率が３０％以上の場合を良好、３０％未満の場合を不良と判断した。なお、極性成分が１４ｍＪ／ｍ２の以上の実施例３～５，６～７は、他の実施例１，２，８と比べて、成功率が相対的に高い結果を示した。
（培養条件）
　凍結保存されたヒト線維芽細胞（ヒト口腔内組織由来）を３７℃で解凍し、培地を用いて洗浄した。５×１０５個の細胞を５％血清含有培地に懸濁し、２枚のディッシュ（６０．１ｃｍ２）に２．５×１０５個ずつ播種した後、３日間培養した。培養した細胞を回収し、５％血清含有培地に懸濁し、４個のフラスコ（２２５ｃｍ２）に２．５×１０５個ずつ播種して継代した後、４日間培養した。
　上記のフィルム基材を、７０％エタノール水溶液、リン酸緩衝液、培地の順で洗浄した後、細胞培養マルチウェルプレート（６穴）における各穴の平底にそれぞれ設置した。このとき、フィルム基材の培養面がウェルプレートの開口を向くように、すなわちフィルム基材の裏面がウェルプレートの穴部の平底と接触するように配置した。ただし、フィルム基材とウェルプレート（培養容器）の内部とを固着させなかった。
　上記で培養した細胞を回収し、２％血清含有培地に懸濁し、フィルム基材が設置済みの細胞培養マルチウェルプレート中の各穴に２７．９×１０４個／ｃｍ２の播種密度で播種し、３７℃、５％ＣＯ２の環境で１日間インキュベートし、フィルム基材の培養面上に細胞シートを作製した。
＜剥離性＞
　分解酵素を使わずにフィルム基材から剥離可能（豚肉片（被移植部位）に細胞シート面を軽く押し当て、その後フィルムをスライドさせるだけで細胞シートとフィルムが剥離できる）なものを、剥離性が良好、分離酵素を使わないと剥離できない場合を不良と判断した。
　なお、細胞接着性が不良の物については剥離性の試験を行っていない。
＜ＳＦＥ（表面自由エネルギー）解析＞
　細胞接着性を評価するのと同じ日に、上記＜細胞培養用フィルム基材の製造＞で製造された細胞培養用フィルム基材からフィルム基材を切り出し、明細書の段落００１９～００２１に記載の表面自由エネルギーの測定手順に従って、ＳＦＥ解析を行った。接触角計としては、協和界面科学製ＤＭｏ－５０２を用いた。
　接触角測定と解析はｎ＝３で行い、それら接触角の平均値を、表面自由エネルギー（Ｏｗｅｎｓ－Ｗｅｎｄｔ法）の計算に使用した。
　具体的には、上記方法により得られた水との接触角θ１とジヨードメタンとの接触角θ２の値と、各液体の分散成分γＬ ｄと極性成分γＬ ｈを、上記のＯｗｅｎｓ－Ｗｅｎｄｔ理論の「Ｙｏｕｎｇ－Ｄｕｐｒｅの式」に代入し、水の場合とジヨードメタンの場合のそれぞれの式の連立方程式の解として、固体－気体間の表面自由エネルギー（γｓ）の分散成分（γｓ ｄ）と極性成分（γｓ ｈ）を算出した。
＜ＸＰＳ測定＞
　細胞接着性を評価するのと同じ日に、上記＜細胞培養用フィルム基材の製造＞で製造された細胞培養用フィルム基材からフィルム基材を切り出し、以下の条件でＸＰＳ測定を行い、培養面の酸素原子の存在比率Ｃ１を測定した。なお、各フィルムの材料の化学式における炭素原子と酸素原子の割合から、酸素原子の存在比率Ｃ２を計算した。
　ＸＰＳの測定条件は、以下の通り。
　　装置：ＪＥＯＬ製ＪＰＳ－９０００ＭＣ
　　Ｘ線条件：単色化ＭｇＫα線（出力１０ｋＶ、１０ｍＡ）
　　分析元素（エネルギー範囲）：Ｃ１ｓ（２７４－２９８ｅＶ）、Ｏ１ｓ（５２２－５４２ｅＶ）
　実施例１～８、比較例１～２を比較すると、培養面における表面自由エネルギーの極性成分が、１０．０ｍＪ／ｍ２以上の場合に細胞接着性が良好以上となり、特に１４ｍＪ／ｍ２以上の場合に特に良好となった。
　比較例１では、プラズマ雰囲気中に酸素ガスがなく、フィルム基材の原料成分に酸素原子を有しないため、表面自由エネルギーの極性成分を上げることが難しかったと考えられる。
　また、比較例２のように、高強度のプラズマエッチング処理を長時間行うと極性成分が低下し、細胞接着性も不良となった。
　また、実施例１～８では［Ｃ１－Ｃ２］が３原子％以上であり、プラズマ処理により酸素原子の比率が増加したことが分かる。フィルム基材の材料がＰＥＥＫである実施例１～５では［Ｃ１－Ｃ２］が６原子％以上であり、特に９原子％以上の場合に極性成分も高くなり、細胞接着性も特に良好となった。
　この出願は、２０２４年３月２７日に出願された日本出願特願２０２４－０５２０６０号および２０２４年１２月２日に出願された日本出願特願２０２４－２０９４８６号を基礎とする優先権を主張し、その開示の全てをここに取り込む。
１０　細胞培養用フィルム基材
１２　培養面（表面）
１４　裏面
２０　培養容器
３０　培地
４０　細胞シート
５０　細胞シート付フィルム基材
６０　凍結保存液
７０　被移植部位　

Claims (17)

  1. 　少なくとも片方の表面に培養面を有する細胞培養用フィルム基材であって、
    　Ｏｗｅｎｓ－Ｗｅｎｄｔ法に基づいて求められる、前記培養面における表面自由エネルギーの極性成分が、１０．０ｍＪ／ｍ２以上である、細胞培養用フィルム基材。
  2. 　請求項１に記載の細胞培養用フィルム基材であって、
    　当該細胞培養用フィルム基材が培養容器の内部に固着されずに自立膜として機能する、細胞培養用フィルム基材。
  3. 　請求項１又は２に記載の細胞培養用フィルム基材であって、
    　前記培養面がプラズマ処理されてなる、細胞培養用フィルム基材。
  4. 　請求項１又は２に記載の細胞培養用フィルム基材であって、
    　前記培養面における表面自由エネルギーの極性成分が、５５ｍＪ／ｍ２以下である、細胞培養用フィルム基材。
  5. 　請求項１又は２に記載の細胞培養用フィルム基材であって、
    　ＸＰＳ測定により求められる前記培養面の炭素原子と酸素原子の合計に対する酸素原子の存在比率をＣ１とし、前記フィルム基材の材料の化学式から計算される炭素原子と酸素原子の合計に対する酸素原子の存在比率をＣ２としたとき、Ｃ１、Ｃ２が、Ｃ１＞Ｃ２を満たす、
    細胞培養用フィルム基材。
  6. 　請求項５に記載の細胞培養用フィルム基材であって、
    　［Ｃ１－Ｃ２］が、３原子％以上である、細胞培養用フィルム基材。
  7. 　請求項１又は２に記載の細胞培養用フィルム基材であって、
    　当該細胞培養用フィルム基材を構成する材料が、芳香環を有する有機高分子化合物、または芳香環および酸素原子を有する有機高分子化合物を含む、細胞培養用フィルム基材。
  8. 　請求項１又は２に記載の細胞培養用フィルム基材であって、
    　当該細胞培養用フィルム基材を構成する材料が、ポリエーテルエーテルケトン、ポリエチレンテレフタレート、およびポリスチレンからなる群から選ばれる一または二以上を含む、細胞培養用フィルム基材。
  9. 　請求項１又は２に記載の細胞培養用フィルム基材であって、
    　厚みが５μｍ以上２５０μｍ以下である、細胞培養用フィルム基材。
  10. 　請求項１又は２に記載の細胞培養用フィルム基材を包装材料で包装した包装体。
  11. 　請求項１又は２に記載の細胞培養用フィルム基材と、
    　前記細胞培養用フィルム基材の培養面上に積層した細胞シートと、を含む、
    細胞シート付フィルム基材。
  12. 　請求項１又は２に記載の細胞培養用フィルム基材と、
    　前記細胞培養用フィルム基材の培養面上に積層した細胞シートと、を含み、
    　前記細胞培養用フィルム基材および前記細胞シートが凍結保存状態である、
    細胞シート付フィルム基材の凍結物。
  13. 　細胞培養用フィルム基材を準備し、その表面の少なくとも一部にプラズマ処理を施し、Ｏｗｅｎｓ－Ｗｅｎｄｔ法に基づいて求められる表面自由エネルギーの極性成分が１０．０ｍＪ／ｍ２以上となる培養面を前記表面に有する前記細胞培養用フィルム基材を得る、表面処理工程を含む、
    細胞培養用フィルム基材の製造方法。
  14. 　請求項１３に記載の細胞培養用フィルム基材の製造方法であって、
    　前記プラズマ処理において、
    　プロセスガスが、不活性ガスおよび酸素原子を含有するガスからなる群から選ばれる一または二以上を含み、
    　圧力が、０．１Ｐａ以上１００Ｐａ以下であり、
    　放電処理強度が、１５０Ｗ・ｍｉｎ／ｍ２以上１５０００Ｗ・ｍｉｎ／ｍ２以下である、細胞培養用フィルム基材の製造方法。
  15. 　請求項１３または１４に記載の細胞培養用フィルム基材の製造方法であって、
    　前記細胞培養用フィルム基材の材料中の化学式に酸素原子を含む、細胞培養用フィルム基材の製造方法。
  16. 　請求項１３または１４に記載の細胞培養用フィルム基材の製造方法であって、
    前記細胞培養用フィルム基材の材料中の化学式に酸素原子を含まず、
    　前記プラズマ処理で用いるプロセスガスが酸素原子を含む細胞培養用フィルム基材の製造方法。
  17. 　培養容器の内部に、複数の細胞、培地、および請求項１又は２に記載の細胞培養用フィルム基材を導入して、前記細胞培養用フィルム基材の培養面に細胞シートを培養する、培養工程、を含む、
    細胞シート付フィルム基材の製造方法。
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