WO2025182012A1 - 熱応答性評価デバイス - Google Patents

熱応答性評価デバイス

Info

Publication number
WO2025182012A1
WO2025182012A1 PCT/JP2024/007555 JP2024007555W WO2025182012A1 WO 2025182012 A1 WO2025182012 A1 WO 2025182012A1 JP 2024007555 W JP2024007555 W JP 2024007555W WO 2025182012 A1 WO2025182012 A1 WO 2025182012A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
measurement
thermal
evaluation device
culture chamber
culture
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
PCT/JP2024/007555
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
洸児 酒井
雄次郎 田中
陸 高橋
東一郎 後藤
陽介 水野
真澄 山口
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
NTT Inc
NTT Inc USA
Original Assignee
Nippon Telegraph and Telephone Corp
NTT Inc USA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nippon Telegraph and Telephone Corp, NTT Inc USA filed Critical Nippon Telegraph and Telephone Corp
Priority to PCT/JP2024/007555 priority Critical patent/WO2025182012A1/ja
Publication of WO2025182012A1 publication Critical patent/WO2025182012A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C12M1/34—Measuring or testing with condition measuring or sensing means, e.g. colony counters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C12M1/36—Apparatus for enzymology or microbiology including condition or time responsive control, e.g. automatically controlled fermentors
    • C12M1/38—Temperature-responsive control
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M3/00—Tissue, human, animal or plant cell, or virus culture apparatus
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N25/00—Investigating or analyzing materials by the use of thermal means
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means

Definitions

  • the present invention relates to a thermal response evaluation device.
  • Non-Patent Document 1 In culture experimental models such as those described above, neurons with preserved responsiveness to stimuli are often used. For example, an experimental model has been proposed in which sensory neurons are cultured on a substrate that allows measurement of the electrical activity of the neurons, and a heater is used to apply a stimulus, thereby evaluating the responsiveness to thermal stimuli (see, for example, Non-Patent Document 1).
  • Non-Patent Document 1 a heater is used to heat the periphery of the culture substrate, applying thermal stimulation, so the entire neuron being used is subjected to the thermal stimulation. This makes it difficult to apply localized stimulation to the neuron, and it is not possible to determine where in the neuron the action potential is occurring.
  • the present invention was made in light of these circumstances, and aims to provide a thermal response evaluation device that can apply localized thermal stimuli to cultured nerve cells and evaluate their response.
  • one aspect of the present invention provides a thermal responsiveness evaluation device comprising: a culture chamber having a culture compartment for culturing neurons; and a measurement substrate supporting the culture chamber; the culture chamber having the culture compartment penetrating the thickness direction and surrounded by a closed ring in a plan view; and a groove provided on the back surface of the culture chamber and extending from the culture compartment to the side of the culture chamber; the measurement substrate having a base, a thermal stimulation element provided on the top surface of the base, and a measurement unit provided on the top surface; the measurement unit having a measurement electrode and wiring connected to the measurement electrode; the space surrounded by the top surface of the base and the groove is a microchannel into which axons extending from the neurons are introduced; and at least a portion of the thermal stimulation element and the measurement electrode are exposed to the microchannel.
  • the present invention provides a thermal response evaluation device that can apply localized thermal stimuli to cultured neurons and evaluate their response.
  • FIG. 1 is a schematic perspective view of a thermal response evaluation device 1 according to an embodiment.
  • FIG. 2 is a schematic perspective view showing the culture chamber 10.
  • FIG. 3 is a plan view showing the measurement substrate 20.
  • FIG. 4 is a block diagram illustrating the control unit 50.
  • FIG. 5 is an explanatory diagram illustrating the operation of the thermal response evaluation device 1.
  • FIG. 6 is a phase-contrast microscope image of the fabricated device for evaluating thermal response.
  • FIG. 7 is an explanatory diagram showing the response of a typical neuron.
  • an xyz Cartesian coordinate system is set up, and the positional relationships of each component are explained with reference to this xyz Cartesian coordinate system.
  • a specific direction within a horizontal plane is defined as the x-axis direction
  • the direction perpendicular to the x-axis direction within the horizontal plane is defined as the y-axis direction
  • the direction perpendicular to both the x-axis and y-axis directions i.e., the vertical direction
  • up refers to the +z direction, which is vertically upward
  • down refers to the -z direction, which is vertically downward.
  • planar view refers to viewing an object vertically from above (+z side) downward (-z direction).
  • Thermal response evaluation device> 1 is a schematic perspective view of a thermal responsiveness evaluation device 1 of this embodiment.
  • the thermal responsiveness evaluation device 1 has a culture chamber 10 and a measurement substrate 20.
  • the thermal responsiveness evaluation device 1 may further have a culture ring 30, a light source 40, and a control unit 50.
  • the thermal response evaluation device 1 is used to evaluate the thermal responsiveness of nerve cells. That is, the thermal response evaluation device 1 cultures nerve cells in the culture chamber 10, applies a thermal stimulus to the axons of the cultured nerve cells, and can evaluate the response to the applied thermal stimulus based on the action potential emitted by the cells.
  • [Culture chamber] 2 is a schematic perspective view showing the culture chamber 10.
  • the culture chamber 10 is a member having a rectangular shape in a plan view, and has a culture compartment 11 and a plurality of grooves 12.
  • the culture chamber 10 is disposed on the upper surface 21 a of the measurement substrate 20.
  • the culture compartment 11 is a through-hole that penetrates the culture chamber 10 in the thickness direction (Z direction) from the top surface 10a to the bottom surface (back surface) 10b, and is surrounded by a closed ring shape in plan view.
  • the internal space of the culture compartment 11 is used as a space for culturing neurons.
  • the culture compartment 11 is shown as a rectangle with sides parallel to the X and Y directions in a plan view. It is preferable that one side of the culture compartment 11 be 5 mm or more and 20 mm or less in a plan view.
  • the groove 12 is provided on the rear surface 10b of the culture chamber 10 and extends from the culture compartment 11 to the side surface 10x of the culture chamber. One end of the groove 12 reaches the side surface 10x, and the other end reaches the inner surface 11x of the culture compartment 11.
  • the grooves 12 extend linearly in the X direction in plan view, and multiple grooves (four in the figure) are arranged in parallel in the Y direction. Some of the grooves 12 may be curved. Alternatively, the culture chamber 10 may have only one groove 12.
  • the height H and width W1 of the groove 12 are preferably between 1 ⁇ m and 10 ⁇ m. Axons of nerve cells cultured in the culture compartment 11 are introduced into the interior of the groove 12. By having the dimensions of the groove 12 within the above ranges, nerve cells cannot pass through the interior of the groove 12, but axons can be introduced.
  • the length L of the groove 12 is preferably 500 ⁇ m or more and 5000 ⁇ m or less. This allows the axons to extend sufficiently inside the groove 12.
  • the material of the culture chamber 10 there are no particular restrictions on the material of the culture chamber 10, but a resin material is preferred because it is easy to form, and a curable resin is even more preferred.
  • a curable silicone resin silicone rubber
  • silicone resin silicone rubber
  • the separation distance W2 between adjacent grooves 12 is preferably 100 ⁇ m or more. This ensures a sufficient contact area between the culture chamber 10 and the measurement substrate 20, making it easier to secure the two together in close contact.
  • the culture chamber 10 can be manufactured by forming a mold for the culture chamber 10 using photolithography technology and then transferring the mold shape using a curable resin.
  • [Measurement board] 3 is a plan view showing the measurement substrate 20. As shown in FIGS. 1 and 3, the measurement substrate 20 has a base material 21, a thermal stimulation element 22, and a measurement unit 23. The thermal stimulation element 22 and the measurement unit 23 are provided on an upper surface 21a of the base material 21. The upper surface 21a of the base material 21 is the upper surface of the measurement substrate 20.
  • the substrate 21 (measurement substrate 20) supports the culture chamber 10 on its upper surface 21a from the rear surface 10b of the culture chamber 10.
  • the space surrounded by the upper surface 21a of the substrate 21 and the grooves 12 is a microchannel MP into which axons extending from nerve cells are introduced.
  • Each of the multiple grooves 12 forms a microchannel MP.
  • the substrate 21 is a plate material that is rectangular in plan view.
  • the substrate 21 does not need to be optically transparent, but it is preferable that it is transparent to light of the wavelength of laser light, which will be described later.
  • the upper surface 21a of the substrate 21 is insulating. It is also preferable that the upper surface 21a of the substrate 21 has low thermal conductivity.
  • the material for the substrate 21 can be selected from organic or inorganic materials as long as it does not impair the effects of the invention. Glass is preferred as an inorganic material.
  • organic materials that form the substrate 21 include polymeric materials and elastomers.
  • polymeric materials include thermoplastic resins such as polyvinyl chloride, polystyrene, ABS resin, and polylactic acid, and thermosetting resins such as polyimide and phenolic resin.
  • elastomers include polysilicone and synthetic rubber.
  • the thermal stimulation elements 22 have the property of absorbing light and generating heat.
  • Figure 3 shows multiple (12 in the figure) thermal stimulation elements 22 that are rectangular in plan view.
  • the multiple thermal stimulation elements 22 form an element array 22A in which three thermal stimulation elements 22 are aligned in the X direction, and the four element arrays 22A formed are aligned in the Y direction, resulting in a matrix arrangement of 3 rows and 4 columns.
  • the multiple thermal stimulation elements 22 are each independent on the upper surface 21a.
  • the material of the thermal stimulation element 22 is not limited as long as it absorbs light and generates heat and is not cytotoxic. There are no particular restrictions on the material of the thermal stimulation element 22 as long as it exhibits the above properties, and examples include graphene, gold nanoparticles, and black phosphorus, which are used as photothermal conversion materials.
  • the thermal stimulation elements 22 have a side length in the range of 10 ⁇ m to 200 ⁇ m. There are no particular restrictions on the number of thermal stimulation elements 22 or the spacing between the thermal stimulation elements 22, and these can be set appropriately depending on the purpose of the invention.
  • the measuring unit 23 detects action potentials generated in the axon.
  • the measuring unit 23 has a measuring electrode 231 and wiring 232 connected to the measuring electrode 231.
  • the measuring unit 23 also has an insulating layer 233 and a reference electrode 239.
  • the measurement electrodes 231 are rectangular in plan view and are arranged in the center of the substrate 21 in plan view.
  • the size of the measurement electrodes 231 is preferably 10 ⁇ m or more and 200 ⁇ m or less on each side.
  • the multiple measurement electrodes 231 are arranged in a matrix of 4 rows x 4 columns, between the three thermal stimulation elements 22 included in the element array 22A and on both sides of the element array 22A in the X direction.
  • the measurement electrodes 231 and the thermal stimulation elements 22 are arranged alternately along the micropath.
  • the thermal stimulation elements 22 and measurement electrodes 231 overlap the groove portions 12 in a plan view, and at least a portion of them is exposed to the micropassage MP.
  • the multiple thermal stimulation elements 22 and multiple measurement electrodes 231 that make up the element array 22A are arranged along the micropassage MP.
  • the multiple thermal stimulation elements 22 and multiple measurement electrodes 231 are arranged independently for each micropassage MP, without spanning adjacent micropassages MP.
  • One end of the wiring 232 is connected to the measurement electrode 231, and the other end extends to the end 21b in the +X direction of the upper surface 21a of the substrate 21.
  • the other ends of the multiple wirings 232 are arranged at equal intervals.
  • Reference electrodes 239 are provided on both sides of the wiring 232 arranged at the end 21b.
  • the control unit 50 described below, constantly measures the potential difference between the reference electrode 239 and the measurement electrode 231.
  • the reference electrode 239 is used to detect potential changes outside the cell when a neuron fires, based on the potential difference between the reference electrode 239 and the measurement electrode 231.
  • the end of the reference electrode 239 can be set appropriately depending on the purpose, as long as it is possible to detect the potential difference between it and the measurement unit 23.
  • the material of the measurement electrode 23 there are no particular restrictions on the material of the measurement electrode 231, as long as it is a conductor that is not cytotoxic, but from the perspective of cell observation, it is preferable that it be optically transparent.
  • materials for the measurement unit 23 and reference electrode 239 include graphene and indium tin oxide (ITO).
  • the materials of the wiring 232 and reference electrode 239 there are no particular restrictions on the materials of the wiring 232 and reference electrode 239, as long as they are conductors that are not cytotoxic, but from the perspective of cell observation, it is preferable that they be optically transparent.
  • the materials of the wiring 232 and reference electrode 239 may be the same as or different from the material of the measurement electrode 231.
  • the dimensions (width, thickness, length) of the measuring unit 23 and reference electrode 239 can be appropriately determined based on the design concept of the electrical circuit, and can be configured as is typically used to improve detection accuracy.
  • the insulating layer 233 is provided at the end 21b of the substrate 21 between the wiring 232 and between the wiring 232 and the reference electrode 239.
  • the insulating layer 233 extends from the end 21b in the -X direction.
  • the material for the insulating layer 233 can be any known material that is commonly used as an insulating layer for electrical circuits and is non-cytotoxic.
  • connection pads 235 that provide electrical connection with other devices.
  • Such a measuring section 23 can be formed appropriately using known photolithography techniques.
  • the culture ring 30 is a cylindrical member provided on the upper surface 21a of the measurement substrate 20.
  • the culture chamber 10 is disposed inside the culture ring 30.
  • the space 30S surrounded by the inside of the culture ring 30 and the upper surface 21a of the measurement substrate 20 functions as a reservoir for storing culture fluid when culturing neurons.
  • the light source 40 is a laser light source that emits laser light LB.
  • the light source 40 emits laser light LB with a spot diameter of, for example, 100 ⁇ m. It is preferable that the light source 40 irradiates the laser light LB onto the thermal stimulation element 22 from the lower surface ( ⁇ Z side surface) of the measurement substrate 20.
  • the laser light LB is light with a wavelength that can be absorbed by the thermal stimulation element 22.
  • the laser light LB can be red laser light with a wavelength of 785 nm.
  • the thermal stimulation element 22 When the thermal stimulation element 22 is irradiated with the laser light LB, it absorbs the laser light LB and generates heat.
  • the light source 40 may have a position adjustment member that moves and adjusts the position of the light source 40 so that the laser light LB can be irradiated onto a specific thermal stimulation element 22 out of the multiple thermal stimulation elements 22. It may also have an optical path change member that changes the irradiation position of the laser light LB.
  • a known mirror or light-guiding optical system can be used as the optical path change member.
  • Control unit 4 is a block diagram illustrating the control unit 50.
  • the control unit 50 is connected to the measurement substrate 20 and the light source 40.
  • the control unit 50 controls the operation of the light source 40.
  • the control unit 50 also detects the thermal responsiveness of the nerve cells based on the action potential of the axon detected by the measurement unit 23.
  • the control unit 50 has a calculation unit 51, a current pulse generation unit 52, a receiving unit 53, and a memory unit 54.
  • the control unit 50 may also have an input device 59.
  • the calculation unit 51 sets the intensity and pulse width of the laser light LB emitted by the light source 40, and calculates the irradiation conditions for the laser light LB.
  • the calculation unit 51 also A/D converts the electrical signal ES detected via the measurement unit 23, and calculates the action potential of the nerve cell based on the electrical signal ES.
  • the current pulse generation unit 52 generates a current pulse to be input to the light source 40 based on the irradiation conditions of the laser light LB generated by the calculation unit 51.
  • the generated current pulse is input to the light source 40, and the laser light LB is emitted from the light source 40.
  • the receiving unit 53 is connected to the measuring unit 23 and receives the electrical signal transmitted via the measuring unit 23.
  • the receiving unit 53 may amplify the received electrical signal, remove noise contained in the electrical signal, or perform other processing.
  • the memory unit 54 may include both a volatile memory that temporarily stores the results of calculations performed by the calculation unit 51, and a non-volatile storage device that stores multiple irradiation conditions for the laser light LB as specified values.
  • the memory unit 54 may store information such as the spot diameter of the laser light LB, the size of the thermal stimulation element 22, and the photothermal conversion efficiency of the thermal stimulation element 22 in its non-volatile storage area.
  • the calculation unit 51 can retrieve this information from the memory unit 54 and calculate the irradiation conditions for the laser light based on the set values for the amount of heat generated by the thermal stimulation element 22 and the heat generation time.
  • the input device 59 is used to input information such as the spot diameter of the laser light LB, the size of the thermal stimulation element 22, and the light-to-heat conversion efficiency of the thermal stimulation element 22 to the control unit 50.
  • the input device 59 can be an input device such as a keyboard or mouse.
  • FIG. 5 is an explanatory diagram illustrating the operation of the thermal responsiveness evaluation device 1.
  • nerve cells C are cultured in the culture compartment 11, and axons A extend into the microchannel MP.
  • laser light LB is irradiated onto the thermal stimulation element 22 from a light source (not shown).
  • the laser light LB is converted into heat depending on the properties of the material, heating a portion of the axon A that overlaps with the thermal stimulation element 22 (indicated by the symbol ⁇ in Figure 5).
  • the amount of heat generated by the thermal stimulation element 22 can be roughly calculated depending on conditions such as the laser intensity (pulse amplitude) of the laser light LB, the pulse width, the spot diameter, the size (volume) of the thermal stimulation element 22, and the photothermal conversion efficiency of the thermal stimulation element 22. Of these conditions, by setting the laser spot diameter, the size of the thermal stimulation element 22, and the photothermal conversion efficiency to fixed values (constants), the amount of heat generated can be controlled by the laser intensity and pulse width of the laser light LB.
  • an action potential is generated in a portion ⁇ of axon A.
  • the generated action potential is transmitted along axon A as an electrical signal ES.
  • electrical signal ES reaches measurement electrode 231, measurement unit 23 detects electrical signal ES and transmits it to control unit 50 via wiring 232.
  • the control unit 50 evaluates the thermal response of the nerve cells based on the received electrical signal ES (action potential).
  • the control unit 50 synchronizes the time when the laser light LB is emitted from the light source 40 with the time when the electrical signal ES is detected, and calculates the elapsed time from the time when the laser light LB is emitted until the electrical signal ES is received.
  • the response speed of the neuron C that has received a thermal stimulus can be determined from the calculated elapsed time and the distance between the thermal stimulus element 22 and the measurement electrode 231.
  • Electrical signals ES are transmitted to the control unit 50 in sequence from multiple measurement electrodes 231 arranged along the microchannel MP. This allows the speed at which action potentials generated by thermal stimulation are transmitted within the nerve cells C to be evaluated.
  • the thermal stimulation elements 22 are tiny components with sides measuring between 10 ⁇ m and 200 ⁇ m, and are formed discretely. When heated, the thermal stimulation elements 22 are irradiated with laser light LB to generate heat, thereby providing a localized ⁇ m-scale stimulus to the axon A of the nerve cell C, and enabling the responsiveness of the axon A to thermal stimuli to be evaluated.
  • the thermal stimulation element 22 is a tiny component with a side length of between 10 ⁇ m and 200 ⁇ m, and does not easily accumulate heat. Therefore, it is thought that when irradiation with the laser light LB is stopped, it quickly cools down and heating does not continue. As a result, the thermal response evaluation device 1 can apply short-term stimulation on the millisecond scale to the axon A of the nerve cell C, and evaluate the responsiveness of the axon A to thermal stimulation.
  • thermal responsiveness evaluation device 1 uses the thermal stimulus element 22 for heating, which reduces the amount of wiring on the measurement substrate and simplifies the configuration.
  • the thermal response evaluation device 1 described above uses the thermal stimulation element 22 to provide heating, making it possible to provide short-term stimulation.
  • the thermal response evaluation device 1 configured as described above can provide a thermal response evaluation device that can apply localized thermal stimuli to cultured nerve cells and evaluate their response. This makes it possible to reproduce the signal transmission process from thermoreception in a culture experimental system similar to that occurring in the body, making it possible to advance research into thermoreception at the cellular level.
  • thermoreception For example, 1) the response time delay from heat stimulation to the generation of an action potential, 2) the relationship between the response threshold of heat stimulation and propagation characteristics, and 3) the phenomenon of desensitization to high-frequency stimulation can be visualized at the cellular level. Furthermore, analyzing these phenomena in conjunction with cellular information such as protein and gene expression will dramatically advance our understanding of thermoreception.
  • the light source 40 may have a position adjustment member or an optical path change member to control the irradiation position of the laser light LB, but this is not limited to this.
  • the position of the light source 40 may be fixed, and an XY stage may be used as a mounting table for the measurement substrate 20 equipped with the culture chamber 10, making it possible to change the relative position between the light source 40 and the thermal stimulation element 22 on the measurement substrate 20.
  • the culture chamber was fabricated using polydimethylsiloxane (PDMS), a silicone rubber widely used in fluidic devices.
  • PDMS polydimethylsiloxane
  • the desired structure was obtained by pouring uncrosslinked PDMS into a mold for the microchannels and culture compartments, which had been fabricated using photolithography, and then thermally curing the PDMS.
  • the measurement substrate was fabricated by etching the ITO film on a glass substrate with an ITO coating using photolithography to form wiring and a reference electrode. After applying a graphene dispersion for inkjet printing, the measurement electrode and thermal stimulation element were formed by etching with oxygen plasma through a protective film created by photolithography.
  • poly(chloro-p-xylylene) (Parylene C) was vapor-deposited, and then the Parylene C was removed from the areas corresponding to the measurement electrodes, wiring, and thermal stimulation elements using oxygen plasma treatment to form an insulating layer.
  • the surface was treated with polyethyleneimine to obtain a measurement substrate.
  • the position was confirmed under a microscope, and the culture chamber was placed on the measurement substrate so that the measurement electrodes and thermal stimulation elements were aligned with the microchannels, resulting in a thermal response evaluation device.
  • Figure 6 shows a phase-contrast microscope image of the fabricated thermal response evaluation device.
  • the height of the microchannel MP was set to 10 ⁇ m. It was confirmed that the measurement electrodes 231 and thermal stimulation elements 22 were arranged along the microchannel MP.
  • the measurement electrodes 231 were squares with sides of 50 ⁇ m, and the spacing between adjacent measurement electrodes 231 along the microchannel MP was 450 ⁇ m. The measurement electrodes 231 were positioned in the center between adjacent measurement electrodes 231, and the spacing between the measurement electrodes 231 and the thermal stimulation elements 22 was equal.
  • the thermal stimulation element 22 is a square with sides of 100 ⁇ m.
  • Laser light with a wavelength of 785 nm and a spot diameter of 100 ⁇ m was emitted from the laser light source and irradiated onto the thermal stimulation element 22.
  • the laser light had an output of 200 mW and a pulse width of 300 ⁇ m.
  • Figure 7 is an explanatory diagram showing the response of a typical neuron and illustrates the results of action potential detection.
  • action potentials were measured with a delay in the order of signals SC to SH detected by measurement electrodes 231C, 231D, 231E, 231F, 231G, and 231H as they moved away from the thermal stimulation element 22.
  • the fabricated thermal response evaluation device can evaluate the response of sensory neurons to localized, micrometer-scale, short-term thermal stimuli on a millisecond scale, demonstrating the usefulness of this invention.
  • 1...thermal response evaluation device 2...culture, 10...culture chamber, 10a, 21a...top surface, 10b...bottom surface (rear surface), 10b...rear surface, 10x...side surface, 11...culture compartment, 12...groove portion, 20...measurement substrate, 21...substrate, 22...thermal stimulation element, 23...measurement unit, 30S...space, 40...light source, 50...control unit, 231, 231A, 231C...measurement electrode, 232...wiring, A...axon, C...neuron, LB...laser light, MP...microchannel

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Electrochemistry (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

神経細胞を培養する培養区画を有する培養チャンバと、前記培養チャンバを支持する計測基板と、を備え、前記培養チャンバは、厚さ方向に貫通し平面視で閉環状に囲まれた前記培養区画と、前記培養チャンバの裏面に設けられ、前記培養区画から前記培養チャンバの側面まで伸びる溝部と、を有し、前記計測基板は、基材と、前記基材の上面に設けられた熱刺激素子と、前記上面に設けられた計測部と、を有し、前記計測部は、計測電極と、前記計測電極に接続された配線と、を有し、前記基材の上面と前記溝部で囲まれた空間は、前記神経細胞から延びる軸索が導入される微小通路であり、前記熱刺激素子及び前記計測電極は、少なくとも一部が前記微小通路に露出している熱応答性評価デバイス。

Description

熱応答性評価デバイス
　本発明は、熱応答性評価デバイスに関する。
　従来、生体が感覚、痛み、炎症といった刺激に対してどのように応答するかを実験モデルを用いて評価することで、感覚障害や疼痛に対する効果的な治療方法が検討されている。近年では実験動物削減の観点やヒトとの種差への懸念から、従来採用されていた小動物を用いた実験モデルに代えて、ヒトｉＰＳ細胞をはじめとした幹細胞から得られる実験モデル（培養実験モデル）が注目されている。
　上述のような培養実験モデルにおいては、刺激に対する応答性が保存されている神経細胞を用いることが多い。例えば、神経細胞の電気的な活動を計測可能な基板上で感覚神経細胞を培養し、ヒーターを用いて基板周囲を温めることで刺激を印加して、熱刺激に対する応答性を評価する実験モデルが提案されている（例えば、非特許文献１参照）。
A. Odawara et al., Toxicological Sciences 188.1 (2022): 131-141.
　上記非特許文献１に記載の技術では、ヒーターで培養基板の周囲を温めて熱刺激を加えているため、用いる神経細胞の全体が熱刺激を受ける。そのため、神経細胞に対して局所的に刺激を加えることが困難であり、神経細胞のどこで活動電位が生じているかを把握することができない。
　本発明はこのような事情に鑑みてなされたものであって、培養した神経細胞に対し、局所的な熱刺激を加え応答を評価可能な熱応答性評価デバイスを提供することを目的とする。
　上記の課題を解決するため、本発明の一態様は、神経細胞を培養する培養区画を有する培養チャンバと、前記培養チャンバを支持する計測基板と、を備え、前記培養チャンバは、厚さ方向に貫通し平面視で閉環状に囲まれた前記培養区画と、前記培養チャンバの裏面に設けられ、前記培養区画から前記培養チャンバの側面まで伸びる溝部と、を有し、前記計測基板は、基材と、前記基材の上面に設けられた熱刺激素子と、前記上面に設けられた計測部と、を有し、前記計測部は、計測電極と、前記計測電極に接続された配線と、を有し、前記基材の上面と前記溝部で囲まれた空間は、前記神経細胞から延びる軸索が導入される微小通路であり、前記熱刺激素子及び前記計測電極は、少なくとも一部が前記微小通路に露出している熱応答性評価デバイスを提供する。
　本発明によれば、培養した神経細胞に対し、局所的な熱刺激を加え応答を評価可能な熱応答性評価デバイスを提供することができる。
図１は、実施形態の熱応答性評価デバイス１の概略斜視図である。 図２は、培養チャンバ１０を示す概略斜視図である。 図３は、計測基板２０を示す平面図である。 図４は、制御部５０を説明するブロック図である。 図５は、熱応答性評価デバイス１の動作を説明する説明図である。 図６は、作製した熱応答性評価デバイスの位相差顕微鏡像である。 図７は、代表的な神経細胞の応答を示す説明図である。
　以下、図１～図５を参照しながら、本実施形態に係る熱応答性評価デバイスについて説明する。なお、以下の全ての図面においては、図面を見やすくするため、各構成要素の寸法や比率などは適宜異ならせてある。
　以下の説明においては、ｘｙｚ直交座標系を設定し、このｘｙｚ直交座標系を参照しつつ各部材の位置関係について説明する。ここでは、水平面内の所定方向をｘ軸方向、水平面内においてｘ軸方向と直交する方向をｙ軸方向、ｘ軸方向及びｙ軸方向のそれぞれと直交する方向（すなわち鉛直方向）をｚ軸方向とする。
　また、「上」とは鉛直方向上方である＋ｚ方向とし、「下」とは鉛直方向下方である－ｚ方向とする。
　以下の説明において、「平面視」とは、対象物を鉛直方向上方（＋ｚ側）から下向き（－ｚ向き）に見ることを指す。
《熱応答性評価デバイス》
　図１は、本実施形態の熱応答性評価デバイス１の概略斜視図である。熱応答性評価デバイス１は、培養チャンバ１０と、計測基板２０とを有する。熱応答性評価デバイス１は、さらに培養リング３０、光源４０、制御部５０を有していてもよい。
　熱応答性評価デバイス１は、神経細胞の熱応答性を評価するために用いられる。すなわち、熱応答性評価デバイス１は、培養チャンバ１０において神経細胞を培養し、培養した神経細胞の軸索に対して熱刺激を加え、加えた熱刺激に対する反応を細胞が発する活動電位に基づいて評価することができる。
［培養チャンバ］
　図２は、培養チャンバ１０を示す概略斜視図である。図１，２に示すように、培養チャンバ１０は、平面視矩形の部材であり、培養区画１１と複数の溝部１２とを有する。培養チャンバ１０は、計測基板２０の上面２１ａに配置されている。
　培養区画１１は、培養チャンバ１０の上面１０ａから下面（裏面）１０ｂに向けて厚さ方向（Ｚ方向）に貫通し、平面視で閉環状に囲まれた貫通孔である。培養区画１１の内部空間は、神経細胞を培養する空間として用いられる。
　図１，２では、培養区画１１は、平面視でＸ方向及びＹ方向にそれぞれ平行な辺を有する矩形であることとして示している。培養区画１１の一辺は、平面視において５ｍｍ以上２０ｍｍ以下であると好ましい。
　溝部１２は、培養チャンバ１０の裏面１０ｂに設けられ、培養区画１１から培養チャンバの側面１０ｘまで伸びる。溝部１２の一端は、側面１０ｘに達し、他端は培養区画１１の内側面１１ｘに達している。
　溝部１２は、平面視においてＸ方向に直線状に延び、Ｙ方向に複数（図では４本）並列に設けられている。溝部１２は一部が曲がっていてもよい。また、培養チャンバ１０は溝部１２を１本のみ有してもよい。
　溝部１２の高さＨ及び幅Ｗ１は、１μｍ以上１０μｍ以下であると好ましい。溝部１２の内部には、培養区画１１で培養された神経細胞の軸索が導入される。溝部１２の各大きさが上記範囲であることにより、溝部１２の内部には神経細胞が通過できず、軸索は導入可能となる。
　溝部１２の長さＬは５００μｍ以上５０００μｍ以下であると好ましい。これにより、溝部１２の内部で軸索が十分伸長可能である。
　培養チャンバ１０の材料は特に制限はないが、形成が容易であることから樹脂材料であることが好ましく、硬化性樹脂であることがさらに好ましい。培養チャンバ１０の材料としては、硬化性のシリコーン樹脂（シリコーンゴム）が好ましい。培養チャンバ１０をシリコーン樹脂製とすることで、培養チャンバ１０を計測基板２０の上面２１ａに密着させ固定させやすい。
　隣り合う溝部１２同士の離間距離Ｗ２は１００μｍ以上であると好ましい。これにより、培養チャンバ１０と計測基板２０との接触面積を十分に確保し、両者を密着固定させやすい。
　培養チャンバ１０は、フォトリソグラフィ技術を用いて培養チャンバ１０の鋳型を形成した後、硬化性樹脂を用いて鋳型形状を転写することにより製造することができる。
［計測基板］
　図３は、計測基板２０を示す平面図である。図１，３に示すように、計測基板２０は、基材２１と、熱刺激素子２２と、計測部２３とを有する。熱刺激素子２２及び計測部２３は、基材２１の上面２１ａに設けられている。基材２１の上面２１ａは、計測基板２０の上面である。
　基材２１（計測基板２０）は、上面２１ａで培養チャンバ１０を培養チャンバ１０の裏面１０ｂから支持する。基材２１の上面２１ａと溝部１２で囲まれた空間は、神経細胞から延びる軸索が導入される微小通路ＭＰである。複数の溝部１２は、それぞれ微小通路ＭＰを形成している。
　基材２１は、平面視矩形の板材である。基材２１は、光透過性を有していなくてもよいが、後述するレーザー光の波長の光に対し透過性を有すると好ましい。基材２１は、上面２１ａが絶縁性である。また基材２１の上面２１ａは伝熱性も低い方が好ましい。
　基材２１の材料は、形成材料としては、発明の効果を損なわない範囲において、有機材料又は無機材料を選択することができる。無機材料としてはガラスが好ましい。
　基材２１の形成材料である有機材料としては、高分子材料や、エラストマーを挙げることができる。高分子材料としては、例えば、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ＡＢＳ樹脂、ポリ乳酸のような熱可塑性樹脂、ポリイミドやフェノール樹脂のような熱硬化性樹脂を挙げることができる。エラストマーとしては、ポリシリコーンや合成ゴムなどを挙げることができる。
　熱刺激素子２２は、光を吸収して発熱する性質を有する。図３では、平面視矩形の熱刺激素子２２が複数（図では１２個）示されている。
　複数の熱刺激素子２２は、３つの熱刺激素子２２がＸ方向に並ぶ素子列２２Ａを形成し、形成される４つの素子列２２ＡがＹ方向に並ぶことで、３行×４列のマトリクス状に配列している。複数の熱刺激素子２２は、上面２１ａにおいてそれぞれ独立している。
　熱刺激素子２２の材料は、光を吸収し発熱する材料であり、細胞毒性を持たない材料であれば限定しない。熱刺激素子２２の材料としては、上記性質を示すのであれば特に制限はなく、例えば、光熱変換材料として用いられる、グラフェンや金ナノ粒子、黒リンなどが挙げられる。
　熱刺激素子２２は、１辺１０μｍ以上２００μｍ以下の範囲であることが好ましい。熱刺激素子２２の数や、熱刺激素子２２同士の間隔は特に制限はなく、発明の目的に応じて適宜設定することができる。
　計測部２３は、軸索で生じる活動電位を検出する。計測部２３は、計測電極２３１と、計測電極２３１に接続された配線２３２と、を有する。また、計測部２３は、絶縁層２３３と、参照電極２３９とを有する。
　図３では、複数（図では１６個）の計測部２３が示されている。複数の計測部２３は、上面２１ａにおいてそれぞれ独立している。
　計測電極２３１は、平面視矩形を呈し、基材２１の平面視中央に配列している。計測電極２３１の大きさは、１辺１０μｍ以上２００μｍ以下であると好ましい。複数の計測電極２３１は、素子列２２Ａに含まれる３つの熱刺激素子２２の間、及び素子列２２ＡのＸ方向の両側にそれぞれ配置され、４行×４列のマトリクス状に配列している。
　すなわち、計測電極２３１と熱刺激素子２２とは、微小通路に沿って交互に配列している。
　熱刺激素子２２及び計測電極２３１は、平面視で溝部１２と重なり、少なくとも一部が微小通路ＭＰに露出している。また、素子列２２Ａを構成する複数の熱刺激素子２２及び複数の計測電極２３１は、微小通路ＭＰに沿って配列している。
　さらに、複数の熱刺激素子２２及び複数の計測電極２３１は、隣り合う微小通路ＭＰにまたがることなく、微小通路ＭＰごとに独立して配列している。
　配線２３２は、一端が計測電極２３１に接続し、他端が基材２１の上面２１ａの＋Ｘ方向の端部２１ｂにまで伸びている。複数の配線２３２の他端は、等間隔で配列している。
　端部２１ｂにおいて配列する配線２３２の両側には、参照電極２３９が設けられている。後述の制御部５０では、参照電極２３９と計測電極２３１との電位差を常時計測している。参照電極２３９は、参照電極２３９と計測電極２３１との電位差から、神経細胞が発火した際の細胞外での電位変化を検出するために用いられる。
　参照電極２３９の端部は、計測部２３との間の電位差を検出可能であれば、目的に応じて適宜設定することができる。
　計測電極２３１の材料は、細胞毒性を持たない導体であれば特に制限はないが、細胞観察の観点から光透過性を有すると好ましい。計測部２３及び参照電極２３９の材料は、例えば、グラフェンや酸化インジウムスズ（Indium Tin Oxide：ＩＴＯ）などが挙げられる。
　配線２３２及び参照電極２３９の材料は、細胞毒性を持たない導体であれば特に制限はないが、細胞観察の観点から光透過性を有すると好ましい。配線２３２及び参照電極２３９の材料は、計測電極２３１と同じであってもよく、異なっていてもよい。
　計測部２３及び参照電極２３９の寸法（幅、厚さ、長さ）については、電気回路の設計思想において、検出精度を向上させるために通常採用する構成を適宜採用することができる。
　絶縁層２３３は、基材２１の端部２１ｂにおいて、配線２３２間及び配線２３２と参照電極２３９との間に設けられている。絶縁層２３３は、端部２１ｂから－Ｘ方向に延びている。
　絶縁層２３３の材料は、電気回路の絶縁層として通常用いられ、細胞毒性を持たない公知の材料を採用することができる。
　計測基板２０において、絶縁層２３３が設けられている一定の領域は、他の機器との電気的接続を行うコネクションパッド２３５である。
　このような計測部２３は、公知のフォトリソグラフィ技術を用いて適宜形成することができる。
［培養リング］
　図１に示すように、培養リング３０は、計測基板２０の上面２１ａに設けられる筒状の部材である。熱応答性評価デバイス１において、培養リング３０の内側には、培養チャンバ１０が配置されている。
　培養リング３０の内側と計測基板２０の上面２１ａとで囲まれる空間３０Ｓは、神経細胞を培養する際の培養液が貯留される貯留部として機能する。
［光源］
　図１に示すように、光源４０は、レーザー光ＬＢを射出するレーザー光源である。光源４０は、スポット径が例えば１００μｍのレーザー光ＬＢを射出する。光源４０は、計測基板２０の下面（－Ｚ側の面）から熱刺激素子２２にレーザー光ＬＢを照射すると好ましい。
　レーザー光ＬＢは、熱刺激素子２２が吸収可能な波長の光である。例えば、レーザー光ＬＢは、波長７８５ｎｍの赤色レーザー光とすることができる。レーザー光ＬＢが照射された熱刺激素子２２は、レーザー光ＬＢを吸収し発熱する。
　光源４０は、複数の熱刺激素子２２のうち、特定の熱刺激素子２２にレーザー光ＬＢを照射可能とするため、光源４０を移動させ位置を調整する位置調整部材を有していてもよい。また、レーザー光ＬＢの照射位置を変更する光路変更部材を有していてもよい。光路変更部材としては、公知のミラーや導光光学系を採用できる。
［制御部］
　図４は、制御部５０を説明するブロック図である。制御部５０は、計測基板２０及び光源４０に接続されている。制御部５０は、光源４０の動作を制御する。また、制御部５０は、計測部２３で検出した軸索の活動電位に基づいて、神経細胞の熱応答性を検出する。
　制御部５０は、計算部５１と、電流パルス生成部５２と、受信部５３と、記憶部５４とを有する。制御部５０は、入力装置５９を有していてもよい。
　計算部５１は、光源４０に照射させるレーザー光ＬＢの強度、パルス幅を設定し、レーザー光ＬＢの照射条件を計算して求める。また、計算部５１は、計測部２３を介して検出される電気信号ＥＳをＡ／Ｄ変換し、電気信号ＥＳに基づいて神経細胞の活動電位を計算して求める。
　電流パルス生成部５２は、計算部５１で生成したレーザー光ＬＢの照射条件に基づいて、光源４０に入力する電流パルスを生成する。生成された電流パルスは、光源４０に入力され、光源４０からレーザー光ＬＢが射出される。
　受信部５３は、計測部２３が接続させ、計測部２３介して伝達される電気信号を受信する。受信部５３は、受信した電気信号の増幅や、電気信号に含まれるノイズの除去等の加工を行ってもよい。
　記憶部５４は、計算部５１における各計算結果を一時的に記憶する揮発性のメモリと、規定値としてレーザー光ＬＢの照射条件を複数記憶する不揮発性の記憶装置との両方を含むとよい。記憶部５４は、不揮発性の記憶領域に、レーザー光ＬＢのスポット径、熱刺激素子２２の大きさ、熱刺激素子２２の光熱変換効率等の情報を記憶していてもよい。計算部５１は、レーザー光ＬＢの照射条件を計算する際に、これらの情報を記憶部５４から引き出し、熱刺激素子２２で生じさせる熱量及び熱の発生時間の設定値と、に基づいて、レーザー光の照射条件を計算することができる。
　入力装置５９は、例えば、レーザー光ＬＢのスポット径、熱刺激素子２２の大きさ、熱刺激素子２２の光熱変換効率等の情報を制御部５０に入力するために用いる。入力装置５９としては、キーボード、マウス等の入力デバイスを採用することができる。
［動作説明］
　図５は、熱応答性評価デバイス１の動作を説明する説明図である。図５に示すように、培養区画１１において神経細胞Ｃを培養し、微小通路ＭＰ内に軸索Ａが伸びた状態とする。この状態の熱応答性評価デバイス１において、不図示の光源から熱刺激素子２２にレーザー光ＬＢを照射する。
　熱刺激素子２２においては、材料の性質に応じてレーザー光ＬＢが熱へと変換され、熱刺激素子２２と重なる軸索Ａの一部分（図５中、符号αで示す）を加熱する。
　熱刺激素子２２で生じる熱量は、レーザー光ＬＢのレーザー強度（パルス振幅）、パルス幅、スポット径、熱刺激素子２２の大きさ（体積）、熱刺激素子２２の光熱変換効率等の条件に応じて概算することができる。これらの条件のうち、レーザースポット径、熱刺激素子２２の大きさ、光熱変換効率を固定値（定数）とすることで、レーザー光ＬＢのレーザー強度及びパルス幅により発熱量を制御できる。
　熱刺激を受けた軸索Ａの一部分αでは、刺激に応じて活動電位を生じる。生じた活動電位は、電気信号ＥＳとして軸索Ａを伝達する。電気信号ＥＳが計測電極２３１に達すると、計測部２３では電気信号ＥＳを検出し、配線２３２を介して制御部５０に電気信号ＥＳを伝達する。
　制御部５０では、受信した電気信号ＥＳ（活動電位）に基づいて、神経細胞の熱応答を評価する。
　制御部５０では、光源４０からレーザー光ＬＢを照射させた時間と、電気信号ＥＳの検出の時間とを同期させておき、レーザー光ＬＢを照射した時間から電気信号ＥＳを受信するまでの経過時間を算出する。算出した経過時間と、熱刺激素子２２と計測電極２３１との離間距離とから熱刺激を受けた神経細胞Ｃの応答速度を求めることができる。
　制御部５０には、微小通路ＭＰに沿って配列した複数の計測電極２３１から、順に電気信号ＥＳが伝達される。これにより、熱刺激により発生した活動電位が、神経細胞Ｃ内を伝達する速度を評価できる。
　また、計測電極２３１と熱刺激素子２２との間隔を等間隔としておくことで、複数の計測電極２３１のそれぞれで活動電位が検出された時間から、活動電位が軸索Ａ内を伝達する速度を求めやすい。同構成によれば、軸索Ａの位置と応答速度との関係も評価しやすい。
　さらに、レーザー光ＬＢを繰り返し照射することにより、熱刺激を複数回繰り返したときの脱感作について評価することが可能となる。
　以上のような熱応答性評価デバイス１では、熱刺激素子２２は１辺１０μｍ以上２００μｍ以下というような微小な部材であり、離散的に形成されている。加熱時には熱刺激素子２２にレーザー光ＬＢを照射して発熱させるため、神経細胞Ｃの軸索Ａに対してμｍスケールの局所的な刺激を与え、熱刺激に対する軸索Ａの応答性を評価できる。
　また、熱刺激素子２２は１辺１０μｍ以上２００μｍ以下というような微小な部材であり、蓄熱しにくい。そのため、レーザー光ＬＢの照射をやめると、すぐに放冷し加熱が継続されないと考えられる。これにより、熱応答性評価デバイス１では、神経細胞Ｃの軸索Ａに対してミリ秒スケールの短期的な刺激を与え、熱刺激に対する軸索Ａの応答性を評価できる。
　さらに、例えば電気配線に通電させることによる抵抗発熱を利用して軸索Ａに熱刺激を加える構成とすると、計測基板上の配線が混み合い、構成が複雑になることが想定される。このような構成の熱応答性評価デバイスでは、配線間が近接し、漏れ電流が生じやすくなり、制御が困難となりやすい。対して、上述の熱応答性評価デバイス１では、熱刺激素子２２を用いて加熱することにより、計測基板上の配線が少なく、構成が簡素になる。
　そして、レーザー光により軸索Ａを直接加熱する方法を想定した場合、レーザー光が軸索Ａの周囲の培養液に吸収され減衰するため、短時間のうちに適切な加熱が困難となる。これに対し、上述の熱応答性評価デバイス１では、熱刺激素子２２を用いて加熱することにより、短期的な刺激を与えることができる。
　これらにより、以上のような構成の熱応答性評価デバイス１によれば、培養した神経細胞に対し、局所的な熱刺激を加え応答を評価可能な熱応答性評価デバイスを提供することができる。これにより、培養実験系において、身体内と同様な熱受容からの信号伝達の過程を再現することができ、細胞レベルでの熱受容の研究を進めることが可能になる。
　例えば、１）熱刺激から活動電位発生までの応答時間の遅れ、２）熱刺激の応答閾値に対する伝播特性の関係性、３）高頻度刺激に対する脱感作現象などが細胞レベルで可視化される。また、タンパク質や遺伝子の発現といった細胞の情報と対応させてこれらの現象を解析することで、熱受容に関する理解が飛躍的に進む。
　なお、本実施形態においては、レーザー光ＬＢの照射位置を制御するために、光源４０が位置調整部材や光路変更部材を有していてもよいこととしたが、これに限らない。例えば、光源４０の位置を固定するとともに、培養チャンバ１０を備えた計測基板２０を載置する載置台としてＸＹステージを採用し、光源４０と計測基板２０上の熱刺激素子２２との相対位置を変更可能としてもよい。
　以上、添付図面を参照しながら本発明に係る好適な実施の形態例について説明したが、本発明は係る例に限定されない。上述した例において示した各構成部材の諸形状や組み合わせ等は一例であって、本発明の主旨から逸脱しない範囲において設計、仕様等に基づき種々変更可能である。
　以下に本発明を実施例により説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
［熱応答性評価デバイスの作製］
　培養チャンバは、流体デバイスに広く用いられるシリコーンゴムであるPolydimethylsiloxane（ＰＤＭＳ）により作製した。フォトリソグラフィ技術により作製した微小通路および培養区画の鋳型に、架橋前のＰＤＭＳを流し込み、熱硬化することで所望の構造の培養チャンバを得た。
　計測基板は、フォトリソグラフィ技術を用いて、ＩＴＯ膜付きガラス基板上のＩＴＯ膜をエッチングし、配線及び参照電極を形成した。さらに、インクジェット用のグラフェン分散液を塗布した後に、フォトリソグラフィにより作製した保護膜を介して酸素プラズマによりエッチングすることで、計測電極および熱刺激素子を形成した。
　さらにpoly(chloro-p-xylylene)（パリレンＣ）を蒸着した後、計測電極、配線、熱刺激素子に該当する箇所のパリレンＣを酸素プラズマ処理して除去することで絶縁層を形成した。
　細胞の接着性を上げる目的で、表面にPolyethyleneimineによる表面処理を行い、計測基板を得た。
　顕微鏡下で位置を確認し、計測電極及びび熱刺激素子が微小通路に並ぶように、培養チャンバを計測基板上に設置し、熱応答性評価デバイスを得た。
　図６は、作製した熱応答性評価デバイスの位相差顕微鏡像を示す。微小通路ＭＰの高さは１０μｍとした。微小通路ＭＰに沿って、計測電極２３１と熱刺激素子２２が配列していることが確認できた。
　計測電極２３１は、１辺５０μｍの正方形とし、微小通路ＭＰに沿って隣り合う計測電極２３１の間隔は４５０μｍとした。計測電極２３１は、隣り合う計測電極２３１の間の中央に配置し、計測電極２３１と熱刺激素子２２との間隔が等間隔であることとした。
　熱刺激素子２２は、１辺１００μｍの正方形とした。
［熱刺激応答性の評価］
　作製した熱刺激応答性デバイスの培養区画において、ラット胎児の後根神経節から採取した感覚神経細胞を培養したところ、１週間程度で微小通路ＭＰ内への軸索の伸長が確認された。熱応答性の評価実験は培養２～３週間後に行った。
　レーザー光源から波長７８５ｎｍ、スポット径１００μｍのレーザー光を射出させ、熱刺激素子２２に照射した。レーザー光は、出力２００ｍＷ、パルス幅３００μｍとした。
　図７は、代表的な神経細胞の応答を示す説明図であり、活動電位の検出結果を示す図である。
　神経細胞Ｃの細胞体に最も近い熱刺激素子２２にレーザー光を照射したところ（Ｔ０）、熱刺激素子２２の両側の計測電極２３１Ａ，２３１Ｂで検出したシグナルＳＡ，ＳＢにおいて、１ｍｓ程度後（Ｔ１＝１ｍｓ）に活動電位を示すピークが計測された。図７中、「＊」は、活動電位を示すピークを示す。熱刺激を加えることにより、軸索Ａでは１ｍｓ以内には活動電位が発生したことを示す結果を得た。
　また、１００μｍスケールで並べた電極から活動電位の伝播が計測されたことから、局所的な刺激に伴う刺激応答が評価できることが確認できた。
　さらに、微小通路に沿って配列する複数の計測電極２３１では、熱刺激素子２２から遠ざかるに従って、計測電極２３１Ｃ，２３１Ｄ，２３１Ｅ，２３１Ｆ，２３１Ｇ，２３１Ｈで検出したシグナルＳＣ～ＳＨの順に、遅れて活動電位が計測された。
　これらにより、作製した熱応答性評価デバイスでは、マイクロメートルスケールで局所的、かつミリ秒スケールの短期的な熱刺激に対する感覚神経細胞の応答を評価できることが確認でき、本発明が有用であることが確認できた。
　１…熱応答性評価デバイス、２…培養、１０…培養チャンバ、１０ａ，２１ａ…上面、１０ｂ…下面（裏面）、１０ｂ…裏面、１０ｘ…側面、１１…培養区画、１２…溝部、２０…計測基板、２１…基材、２２…熱刺激素子、２３…計測部、３０Ｓ…空間、４０…光源、５０…制御部、２３１，２３１Ａ，２３１Ｃ…計測電極、２３２…配線、Ａ…軸索、Ｃ…神経細胞、ＬＢ…レーザー光、ＭＰ…微小通路

Claims (7)

  1. 　神経細胞を培養する培養区画を有する培養チャンバと、
    　前記培養チャンバを支持する計測基板と、を備え、
    　前記培養チャンバは、厚さ方向に貫通し平面視で閉環状に囲まれた前記培養区画と、
    　前記培養チャンバの裏面に設けられ、前記培養区画から前記培養チャンバの側面まで伸びる溝部と、を有し、
    　前記計測基板は、基材と、
    　前記基材の上面に設けられた熱刺激素子と、
    　前記上面に設けられた計測部と、を有し、
    　前記計測部は、計測電極と、前記計測電極に接続された配線と、を有し、
    　前記基材の上面と前記溝部で囲まれた空間は、前記神経細胞から延びる軸索が導入される微小通路であり、
    　前記熱刺激素子及び前記計測電極は、少なくとも一部が前記微小通路に露出している熱応答性評価デバイス。
  2. 　前記計測基板は、複数の前記熱刺激素子と、複数の前記計測部とを有し、
    　複数の前記熱刺激素子及び複数の前記計測電極は、前記微小通路に沿って配列している請求項１に記載の熱応答性評価デバイス。
  3. 　前記培養チャンバは、複数の前記溝部を有し、
    　複数の前記溝部は、それぞれ前記基材の上面との間に前記微小通路を形成し、
    　複数の前記熱刺激素子及び複数の前記計測電極は、前記微小通路ごとに独立して配列している請求項２に記載の熱応答性評価デバイス。
  4. 　複数の前記熱刺激素子及び複数の前記計測部は、前記微小通路に沿って等間隔に交互に配列している請求項２又は３に記載の熱応答性評価デバイス。
  5. 　前記熱刺激素子にレーザー光を照射する光源を有する請求項１から４のいずれか１項に記載の熱応答性評価デバイス。
  6. 　前記計測基板及び前記光源に接続された制御部を有し、
    　前記制御部は、前記光源を制御すると共に、前記計測部を介して伝達される活動電位に基づいて前記神経細胞の熱応答を評価検出する請求項５に記載の熱応答性評価デバイス。
  7. 　前記制御部は、前記レーザー光を照射した時間から前記活動電位を検出するまでの経過時間を計測し、前記神経細胞の熱刺激に対する応答速度を評価する請求項６に記載の熱応答性評価デバイス。
PCT/JP2024/007555 2024-02-29 2024-02-29 熱応答性評価デバイス Pending WO2025182012A1 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/JP2024/007555 WO2025182012A1 (ja) 2024-02-29 2024-02-29 熱応答性評価デバイス

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/JP2024/007555 WO2025182012A1 (ja) 2024-02-29 2024-02-29 熱応答性評価デバイス

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2025182012A1 true WO2025182012A1 (ja) 2025-09-04

Family

ID=96920204

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2024/007555 Pending WO2025182012A1 (ja) 2024-02-29 2024-02-29 熱応答性評価デバイス

Country Status (1)

Country Link
WO (1) WO2025182012A1 (ja)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006042671A (ja) * 2004-08-04 2006-02-16 Onchip Cellomics Consortium 電極付細胞培養マイクロアレーおよび電気的細胞計測法
US20210348107A1 (en) * 2018-09-19 2021-11-11 University Of Washington Device and systems comprising electrode arrays for electroconductive cells

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006042671A (ja) * 2004-08-04 2006-02-16 Onchip Cellomics Consortium 電極付細胞培養マイクロアレーおよび電気的細胞計測法
US20210348107A1 (en) * 2018-09-19 2021-11-11 University Of Washington Device and systems comprising electrode arrays for electroconductive cells

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DANG KA MY, RINKLIN PHILIPP, SCHNITKER JAN, HABERKORN BASTIAN, ZOBEL KATHRIN, GRIBAUDO SIMONA, PERRIER ANSELME L., CAROLUS JORNE, : "Fabrication of precisely aligned microwire and microchannel structures: Toward heat stimulation of guided neurites in neuronal cultures : Fabrication of precisely aligned microwire and microchannel structures", PHYSICA STATUS SOLIDI. A: APPLICATIONS AND MATERIALS SCIENCE, WILEY - V C H VERLAG GMBH & CO. KGAA, DE, vol. 214, no. 9, 1 September 2017 (2017-09-01), DE , pages 1600729 - 1600729-6, XP093349074, ISSN: 1862-6300, DOI: 10.1002/pssa.201600729 *
FURUKAWA, RYO ET AL.: "Measurement of electrical activity of sensory neurons using microfluidic channels", KAGAKU TO MICRO NANO SYSTEM = JOURNAL OF THE SOCIETY FOR CHEMISTRY AND MICRO-NANO SYSTEMS, SOCIETY FOR CHEMISTRY AND MICRO-NANO SYSTEMS, CN, vol. 22, no. 2, 1 October 2023 (2023-10-01), CN , pages 52 - 53, XP009564503, ISSN: 1881-364X *
LACOUR, S.P. ; ATTA, R. ; FITZGERALD, J.J. ; BLAMIRE, M. ; TARTE, E. ; FAWCETT, J.: "Polyimide micro-channel arrays for peripheral nerve regenerative implants", SENSORS AND ACTUATORS A: PHYSICAL, ELSEVIER BV, NL, vol. 147, no. 2, 3 October 2008 (2008-10-03), NL , pages 456 - 463, XP023980703, ISSN: 0924-4247, DOI: 10.1016/j.sna.2008.05.031 *
NARULA UDIT, RUIZ ANDRES, MCQUAIDE MCKINLEY, DEMARSE THOMAS B., WHEELER BRUCE C., BREWER GREGORY J.: "Narrow microtunnel technology for the isolation and precise identification of axonal communication among distinct hippocampal subregion networks", PLOS ONE, PUBLIC LIBRARY OF SCIENCE, US, vol. 12, no. 5, US , pages e0176868 - e0176868-15, XP093349077, ISSN: 1932-6203, DOI: 10.1371/journal.pone.0176868 *
ODAWARA AOI, SHIBATA MIKAKO, ISHIBASHI YUTO, NAGAFUKU NAMI, MATSUDA NAOKI, SUZUKI IKURO: "In Vitro Pain Assay Using Human iPSC-Derived Sensory Neurons and Microelectrode Array", TOXICOLOGICAL SCIENCES, ACADEMIC PRESS, US, vol. 188, no. 1, 28 June 2022 (2022-06-28), US, pages 131 - 141, XP093349078, ISSN: 1096-6080, DOI: 10.1093/toxsci/kfac045 *
SHIMBA KENTA; KOTANI KIYOSHI; JIMBO YASUHIKO: "Microfabricated Device to Record Axonal Conduction Under Pharmacological Treatment for Functional Evaluation of Axon Ion Channel", IEEE TRANSACTIONS ON BIOMEDICAL ENGINEERING, IEEE, USA, vol. 68, no. 12, 10 May 2021 (2021-05-10), USA, pages 3574 - 3581, XP011888874, ISSN: 0018-9294, DOI: 10.1109/TBME.2021.3078473 *
TOVAR KENNETH R., BRIDGES DANIEL C., WU BIAN, RANDALL CONNOR, AUDOUARD MORGANE, JANG JIWON, HANSMA PAUL K., KOSIK KENNETH S.: "Action potential propagation recorded from single axonal arbors using multielectrode arrays", JOURNAL OF NEUROPHYSIOLOGY, AMERICAN PHYSIOLOGICAL SOCIETY, BETHESDA, MD, US, vol. 120, no. 1, 1 July 2018 (2018-07-01), US , pages 306 - 320, XP093349076, ISSN: 0022-3077, DOI: 10.1152/jn.00659.2017 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Kang et al. Inkjet-printed biofunctional thermo-plasmonic interfaces for patterned neuromodulation
Horváth et al. Infrared neural stimulation and inhibition using an implantable silicon photonic microdevice
Lee et al. Transparent intracortical microprobe array for simultaneous spatiotemporal optical stimulation and multichannel electrical recording
US11097125B2 (en) Micro-electrode array and method for producing a micro-electrode array
Kang et al. Thermoplasmonic optical fiber for localized neural stimulation
Aebersold et al. “Brains on a chip”: Towards engineered neural networks
Bourrier et al. Monolayer graphene coating of intracortical probes for long‐lasting neural activity monitoring
JP7068461B2 (ja) 神経細胞試験用装置
Chen et al. A fiber-based implantable multi-optrode array with contiguous optical and electrical sites
CN108845026B (zh) 声表面波微流控芯片及微米尺寸的声焦域形成方法
CN1156825A (zh) 使用光寻址电位计传感器测量细胞活性的二维传感器
KR20140140886A (ko) 대면적 금속 나노 구조물 및 투명전극층을 포함하는 표면증강라만산란 기판, 이의 제조방법 및 이를 이용한 표면증강라만 분광방법
CN115216405B (zh) 一种多层级联的神经网络微流控芯片及其制备方法
WO2014169190A1 (en) Write-in and read-out activity in brain circuits
Zhang et al. Multimodal Electrocorticogram Active Electrode Array Based on Zinc Oxide‐Thin Film Transistors
Donaldson et al. Transparent, low‐impedance inkjet‐printed PEDOT: PSS microelectrodes for multimodal neuroscience
CN102337211B (zh) 细胞培养装置
US20070092958A1 (en) Method and apparatus for guiding growth of neurons
US20120319705A1 (en) Hybrid three-dimensional sensor array, in particular for measuring electrogenic cell assemblies, and the measuring assembly
CN102106722B (zh) 一种光基因气味仿真系统
KR102691068B1 (ko) 뇌 신경 모델링 장치
Wang et al. Cold laser micro-machining of PDMS as an encapsulation layer for soft implantable neural interface
Kimtan et al. Printable and transparent micro-electrocorticography (μECoG) for optogenetic applications
KR20160038641A (ko) 전기 자극 장치
Kim et al. Hexagonal metal complex based mechanically robust transparent ultrathin gold µECoG for electro-optical neural interfaces

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 24927292

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2026503405

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2026503405

Country of ref document: JP