WO2025158889A1 - Ｘ線造影材料を含む樹脂フィルム - Google Patents

Ｘ線造影材料を含む樹脂フィルム

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WO2025158889A1
WO2025158889A1 PCT/JP2025/000168 JP2025000168W WO2025158889A1 WO 2025158889 A1 WO2025158889 A1 WO 2025158889A1 JP 2025000168 W JP2025000168 W JP 2025000168W WO 2025158889 A1 WO2025158889 A1 WO 2025158889A1
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resin film
ray contrast
cells
resin
layer
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PCT/JP2025/000168
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English (en)
French (fr)
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由貴 中西
敬介 村田
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Central Glass Co Ltd
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Central Glass Co Ltd
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Publication date
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    • A61L31/00—Materials for other surgical articles, e.g. stents, stent-grafts, shunts, surgical drapes, guide wires, materials for adhesion prevention, occluding devices, surgical gloves, tissue fixation devices
    • A61L31/02—Inorganic materials
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61L31/06—Macromolecular materials obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61L31/00—Materials for other surgical articles, e.g. stents, stent-grafts, shunts, surgical drapes, guide wires, materials for adhesion prevention, occluding devices, surgical gloves, tissue fixation devices
    • A61L31/14—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L31/18—Materials at least partially X-ray or laser opaque

Definitions

  • the present invention relates to a resin film comprising a resin layer having a first surface on which cultured cells are placed, and an X-ray contrast material.
  • cell sheet technology has been developed as a method for improving tissue survival of transplanted cells, and research is being conducted into cell sheet transplantation therapy for a variety of diseases, including ischemic cardiomyopathy, postoperative air leaks, and stenosis after endoscopic esophageal submucosal dissection, as well as for preventing postoperative complications.
  • Patent Document 1 describes a carrier for transporting cell sheets for transplantation, which comprises a covering layer to which the cell sheet adheres and a support layer made of a base material acceptable for medical use.
  • Patent Document 2 describes a technology for imparting X-ray detectability to a tampon or medical suction device made of a cellulose fiber fleece material by embedding a contrast agent made of barium sulfate and a polymerized thermoplastic base material inside the fleece material through thermal bonding.
  • Patent Document 2 describes that a tampon or medical suction body that has been mistakenly left behind at a surgical site can be detected by X-ray using an X-ray contrast agent fixed to the fiber.
  • the above-mentioned Patent Document 1 does not consider X-ray detection of a carrier for transporting a cell sheet for transplantation.
  • a resin film containing the following X-ray contrast material containing the following X-ray contrast material:
  • the resin film according to 1. A resin film, wherein the layer containing the X-ray contrast material is an X-ray contrast layer containing a pattern of the X-ray contrast material.
  • the resin film according to 1. The resin film, wherein the layer containing the X-ray contrast material is an X-ray contrast resin layer containing a plurality of filler-like X-ray contrast materials and a resin material. 4.
  • the resin film according to any one of 1. to 3. A resin film having a thickness of 5 ⁇ m or more and 250 ⁇ m or less.
  • the resin film according to any one of 1. to 4. A resin film, wherein the resin layer contains one or more selected from the group consisting of polyether ether ketone, polyethylene terephthalate, and polystyrene.
  • the resin film according to any one of 1. to 5. A resin film, wherein the X-ray contrast material comprises an X-ray absorbing contrast material. 7.
  • a resin film, wherein the first surface in the region where the cultured cells are to be placed has been subjected to plasma treatment.
  • the resin film according to any one of 1. to 10. A resin film, wherein the water droplet contact angle ⁇ measured by the ⁇ /2 method on the first surface in the region on which the cultured cells are placed is 70° or less.
  • the resin film according to any one of 1. to 11. A resin film having a 60-degree specular gloss Gs(60°) of 700 or less, measured in accordance with JIS Z8741:1997, of the outermost surface opposite the first surface.
  • the resin film according to any one of 1. to 12. A resin film used for culturing cells and/or transporting cells.
  • the present invention provides a resin film with excellent X-ray detectability and cell adhesion.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing a first embodiment of a resin film.
  • FIG. 2 is a schematic diagram showing a second embodiment of the resin film.
  • FIG. 2 is a schematic diagram showing a third embodiment of a resin film.
  • FIG. 10 is a schematic diagram showing a fourth embodiment of the resin film.
  • FIG. 10 is a schematic diagram showing a fifth embodiment of the resin film.
  • FIG. 10 is a schematic diagram showing a sixth embodiment of the resin film.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing the appearance of a patient after cell transplantation in the body as observed with the naked eye.
  • FIG. 10 is a schematic diagram showing a patient examined by irradiating the patient with X-rays after cell transplantation using the resin film of this embodiment inside the patient's body.
  • FIG. 10 is a schematic diagram showing a patient examined by irradiating the patient with X-rays after cell transplantation using a resin film that does not contain an X-ray contrast material inside the body.
  • the resin film of this embodiment is a resin layer having a first surface including an area for placing cultured cells; a layer containing an x-ray contrast material present on a first surface of the resin layer, on a second surface opposite the first surface, and at least partially within the resin layer; The region on which the cultured cells are placed is present in at least a part of the region of the first surface where the X-ray contrast material is not exposed on the surface.
  • the resin film of this embodiment has a layer containing an X-ray contrast material, and therefore can be detected by X-ray even when it is located in a place that is difficult to see, such as inside a patient's body. Furthermore, in the region without X-ray contrast material where the X-ray contrast material is not exposed on the surface, the cell sheet and the first surface of the resin layer can be tightly attached. Because this resin film has a region where cultured cells can be placed (cell-mounting region) in the region without X-ray contrast material, cells can be cultured on the first surface of the cell-mounting region. Furthermore, the tight adhesion between the cell sheet and the resin layer facilitates the transfer of the cell sheet. As a result, the cell sheet can be easily transferred during cell transplantation, and the used resin film can be easily detected after transplantation.
  • Figure 7 shows a schematic diagram of a patient 100 when examining the patient's appearance with the naked eye after cell transplantation inside the body.
  • the inside of the patient's body 100 does not transmit or reflect visible light, making it difficult to see with the naked eye.
  • Figure 8 shows a schematic diagram of a patient 101 after cell transplantation using the resin film 102 of this embodiment when the patient is examined by irradiating the patient with X-rays inside the body.
  • the resin film 102 of this embodiment contains an X-ray contrast material, and can therefore be visualized by irradiating it with X-rays in this manner. Even if the resin film is placed in a location that is difficult to see, such as inside the patient's 101 body, it can be detected by X-rays.
  • the X-ray contrast material absorbs/scatters X-rays, preventing them from passing through, and non-X-ray-transparent areas appear white in the X-ray image.
  • X-ray inspection can be performed using multi-directional imaging, such as one-way or two-way imaging.
  • FIG. 9 is a schematic diagram of a patient 111 examined by X-ray irradiation after cell transplantation using a resin film 112 that does not contain an X-ray contrast material inside the patient's body.
  • the transplantation surgery is performed using a resin film 112 that does not contain an X-ray contrast material as a carrier for transplanting a cell sheet. If the resin film 112 is unintentionally placed inside the body at this time, it is impossible to determine from its appearance whether it is placed there or not.
  • Resin materials such as PEEK have high X-ray transparency. Since the resin film 112 made of such a resin material does not absorb or scatter X-rays, the portion of the resin film 112 appears black in the X-ray image. Since the surrounding body tissue also appears black, it becomes difficult to see the resin film 112.
  • the resin film of this embodiment contains an X-ray contrast material.
  • This X-ray contrast material may be contained anywhere in the resin film, for example, on the surface of the resin layer, as long as there is at least an X-ray contrast material-free area that does not contain X-ray contrast material in the area on the first surface where the cells are placed, i.e., at least a portion of the first surface of the resin layer.
  • first surface and second surface means a position in contact with the surface or a position directly above the surface without contacting the surface.
  • a laminate layer such as another resin layer may be present between the surface and the layer containing the X-ray contrast material formed on the surface.
  • being present in at least a portion of the resin layer means that the layer containing the X-ray contrast material is present in only a portion of the resin layer in the thickness direction of the resin layer and/or in the direction normal to the surface of the resin layer, or in the entire region of the resin layer.
  • the resin film of this embodiment can be broadly divided into two types: (A) a form in which the layer containing the X-ray contrast material is an X-ray contrast layer containing a pattern of the X-ray contrast material, and (B) a form in which the layer containing the X-ray contrast material is an X-ray contrast resin layer containing a plurality of filler-like X-ray contrast materials and a resin material.
  • the (A) form corresponds to the first embodiment (FIG. 1), the second embodiment (FIG. 2), the fifth embodiment (FIG. 5), and the sixth embodiment (FIG. 6) described below
  • the (B) form corresponds to the third embodiment (FIG. 3) and the fourth embodiment (FIG. 4) described below.
  • the X-ray contrast layer in the form (A) can be formed by a known coating method such as printing using ink or paste containing an X-ray contrast material.
  • the X-ray opaque resin layer in the form (B) can be formed, for example, by using a known film forming method to form a molding material containing a resin material and a plurality of filler-like X-ray opaque materials.
  • the X-ray contrast material may be any substance that appears significantly different from biological tissue when an X-ray transmission image is taken, and preferably contains an X-ray absorbing contrast material, more preferably a metal or a metal compound.
  • an X-ray contrast filler a filler-like X-ray contrast material
  • an ink or paste containing an X-ray contrast filler is suitably used.
  • Suitable radiopaque fillers include particles of zirconia, barium sulfate, barium oxide, etc.
  • the content of the radiopaque filler in the ink or paste containing the radiopaque filler is preferably about 1 to 70 mass %.
  • metal materials such as titanium, gold, silver, and platinum, or metal oxides are also suitable for use as X-ray contrast materials.
  • the metals and metal oxides may be formed by direct vapor deposition on a resin layer, a protective layer (described below), a laminate layer, or the like, or may be added in the form of fine particles.
  • an X-ray contrast layer can be formed by using a printing technique to print ink or paste containing an X-ray contrast filler onto at least a portion of the first surface other than the area where cells are to be placed, using an ink containing an appropriate pigment.
  • the surface to be impregnated with the X-ray contrast material may be roughened and the X-ray contrast material may be placed on the roughened surface, or may be adhered using an appropriate adhesive.
  • the X-ray contrast layer may be formed by directly depositing a film by a method such as vapor deposition while masking areas other than the designated areas.
  • an X-ray opaque resin layer containing a plurality of filler-like X-ray opaque materials and a resin material can be obtained by mixing the X-ray opaque filler into a polymer material, for example by kneading it into the polymer material, and then molding the mixture into a film.
  • the polymer material containing the X-ray opaque filler can be molded into a film by a conventional film molding method such as compression molding, extrusion molding, injection molding, calendar molding, or thermoforming.
  • This X-ray opaque resin layer can be a resin layer containing an X-ray contrast material therein, or a laminate layer laminated on a resin layer.
  • the X-ray opaque filler can be suppressed from being exposed on the surface by making the shape of the X-ray opaque filler spherical with little anisotropy, making the particle size smaller than the thickness of the resin layer, and increasing the wettability with the polymer material.
  • the X-ray opaque filler is not exposed on at least a portion of the first surface of the resin layer formed by the X-ray opaque resin layer.
  • the content of the X-ray opaque material in the resin layer containing the X-ray contrast material is preferably about 1 to 70% by mass.
  • the layer containing an X-ray contrast material When viewed from the normal direction of the first surface of the resin layer, the layer containing an X-ray contrast material may be present so as to overlap the entire or only a part of the resin film. When a layer containing an X-ray contrast material is present so as to completely cover the resin film, the X-ray detectability of the resin film can be further improved. On the other hand, if the resin layer is made of a resin material having a certain level of resistance to tearing and tension, a layer containing an X-ray contrast material may be present so as to overlap only a portion of the resin layer, which reduces the manufacturing cost of the resin film compared to when the layer is formed entirely over the resin layer.
  • the resin layer when viewed from the normal direction (top view) of the first surface, the resin layer may be configured so that no layer containing an X-ray contrast material is present near the outer periphery of the resin layer. This can prevent the resin film from curling. In particular, when the resin film has a circular shape when viewed from the top view, curling can be effectively prevented.
  • the resin film may also include a protective layer that protects at least a portion of the resin layer, for example, the surface of the portion containing the X-ray contrast material.
  • this protective layer may cover and protect at least a portion or the entire surface of the X-ray contrast layer present on the first surface and/or the second surface opposite to the first surface of the resin layer.
  • Suitable protective layers include inorganic protective layers containing inorganic oxides or inorganic nitrides such as SiOx , SiNx , SnOx , TiOx , and AlOx ; organic protective layers such as acrylate-based photocurable resins, thermosetting resins, and cationic polymerization UV-curable epoxy resins; and organic-inorganic hybrid/composite protective layers such as photocurable organic/inorganic hybrid hard coating agents.
  • the X-ray contrast layer is made of ink or paste, it is preferable to provide a protective layer thereon.
  • the protective layer can improve the flatness of the surface of the X-ray contrast layer.
  • the protective layer can suppress elution of the X-ray contrast material into culture media, cryopreservation solutions, cell sheets, and the like.
  • the resin film may also have a laminate layer containing an X-ray contrast material laminated on at least a portion of the surface of the resin layer.
  • the laminate layer is provided on the second surface opposite the first surface of the resin layer, and the entire first surface is an X-ray contrast material-free area.
  • the laminate layer may be either the same type of film as the resin film or a different type of film.
  • the laminate layer be made of a material that is transparent, has a specific gravity of more than 1.0 g/cm 3 , and is excellent in various durability, mechanical strength, and processability. Therefore, polyether ether ketone (PEEK) film or polyethylene terephthalate (PET) film is particularly preferred.
  • the material used for the protective layer and laminate layer is preferably one that does not dissolve in the culture medium, is thin, and has a high specific gravity.
  • the protective layer or laminating layer may be laminated directly to the resin layer or may be laminated via an adhesive layer. Materials commonly used as adhesives for films can be used for such adhesive layers. For example, ester-based or ether-based adhesives can be used.
  • the glossiness of the surface of the resin film opposite the first surface be reduced in order to ensure visibility.
  • reduced gloss refers to a 60-degree specular gloss Gs(60°) measured in accordance with JIS Z8741:1997 of 700 or less, preferably 400 or less. Measurement can be performed at any location on the surface of the resin film opposite to the first surface.
  • Examples of the opposite surface of the resin film include the surface of a resin layer composed of an X-ray contrast resin layer or a laminate layer laminated on the resin layer, the second surface of a resin layer having an X-ray contrast layer on the first surface, and the surface of a protective layer formed on the second surface of the resin layer to protect the X-ray contrast layer.
  • a part or all of the area on the first surface of the resin layer where the cultured cells are placed may be subjected to a hydrophilization treatment such as a plasma treatment.
  • a hydrophilization treatment such as a plasma treatment.
  • the hydrophilic surface refers to a surface having a water droplet contact angle ⁇ measured by the ⁇ /2 method of 70° or less, preferably 65° or less, and more preferably 55° or less.
  • the water droplet contact angle ⁇ is measured by placing 2 ⁇ l of pure water on the first surface in a 25° C. environment, and measuring the angle between the water droplet and the first surface with a contact angle meter using the ⁇ /2 method in accordance with ISO 19403-2: 2017. By creating such a surface, it becomes easier to ensure adhesion with cultured cells.
  • the region on the first surface where cells are placed is present in an area where no X-ray contrast material is present.
  • the region where the X-ray contrast material is not present preferably occupies 50% or more, more preferably 80% or more, and particularly preferably 100%.
  • the X-ray contrast material may be placed on at least a part of this area.
  • FIG. 1 shows a first embodiment of the resin film of the present invention.
  • the resin film 11 has a resin layer 12 and an X-ray contrast layer 13 containing an X-ray contrast material provided on a second surface 15 of the resin layer 12.
  • an X-ray contrast material-free region 16 is provided on a first surface 14 of the resin layer 12.
  • the X-ray contrast layer 13 is partially or entirely made of a radiopaque pattern. The spaces between the radiopaque patterns may be empty spaces, or may be filled with a resin material.
  • the X-ray contrast layer 13 may include a pattern made of a resin material and an X-ray opaque pattern, or may have multiple slit-shaped X-ray opaque patterns arranged at a distance from each other.
  • the X-ray contrast layer 13 is provided on the entire second surface 15 of the resin layer 12, but it may be provided on only a part of the second surface 15, or may form a predetermined pattern.
  • the predetermined pattern include a predetermined design, figure, letter, symbol, etc.
  • the pattern may have an asymmetric shape on the front and back sides, thereby improving the visibility of the front and back sides of the resin film.
  • Examples of the pattern include a checkered pattern, a dotted pattern, a striped pattern, etc. From the viewpoint of suppressing curling of the resin film, a pattern in which the individual patterns are spaced apart, specifically a dotted pattern, is preferred.
  • the first surface 14 and/or the second surface 15 of the resin layer 12 may have a layer containing a substance whose color or state changes with temperature. Furthermore, the X-ray contrast material-free region 16 may be provided on a part or the entirety of the first surface 14, and this region can be made into a region on which cells can be placed by subjecting it to a hydrophilic treatment.
  • FIG. 2 shows a second embodiment of the resin film of the present invention.
  • the resin film 21 has a resin layer 22 and an X-ray contrast layer 23 containing an X-ray contrast material provided on a portion of a first surface 24 of the resin layer 22. Furthermore, an X-ray contrast material-free region 26 is provided on the first surface 24 of the resin layer 22. In this embodiment, no X-ray contrast material is provided on a second surface 25 of the resin layer 22.
  • the X-ray contrast material may form a predetermined pattern on the first surface 24 of the resin layer 22.
  • the X-ray contrast material-free areas 26 can be made into areas on which cells can be placed by applying a hydrophilic treatment.
  • FIG. 3 shows a third embodiment of the resin film of the present invention.
  • the resin film 31 has a resin layer 32 containing an X-ray contrast filler 37 embedded therein as an X-ray contrast material.
  • a first surface 34 of the resin layer 32 is provided with an X-ray contrast material-free region 36.
  • the X-ray contrast filler 37 is embedded inside the resin layer 32, so at least the X-ray contrast filler 37 is not exposed on the first surface 34 side, and an X-ray contrast material-free region 36 can be formed.
  • This X-ray contrast material-free region 36 may be provided on part or the entire first surface 34, and this portion can be made into an area on which cells can be placed by subjecting it to a hydrophilic treatment.
  • FIG. 4 shows a fourth embodiment of the resin film of the present invention.
  • the resin film 41 has a resin layer 42 and a laminate layer 47 containing an X-ray contrast material laminated on a second surface 45 of the resin layer 42.
  • a first surface 44 of the resin layer 42 is provided with an X-ray contrast material-free region 46.
  • FIG. 4 shows an example in which the laminate layer 47 is laminated over the entire second surface 45 of the resin layer 42 , but it may be laminated so as to cover only a part of the second surface 45 .
  • the X-ray contrast material-free region 46 may be provided on a part or the entirety of the first surface 44, and this part can be made into a region on which cells can be placed by subjecting it to a hydrophilic treatment.
  • FIG. 5 shows a fifth embodiment of the resin film of the present invention.
  • the resin film 51 includes a resin layer 52, an X-ray contrast layer 53 containing an X-ray contrast material provided on a second surface 55 of the resin layer 52, and a laminate layer 57 laminated so as to cover the X-ray contrast layer 53.
  • an X-ray contrast material-free region 56 is provided on a first surface 54 of the resin layer 52.
  • the X-ray contrast layer 53 is provided over the entire second surface 55 of the resin layer 52, but it may be provided over only a portion of the second surface 55, or may form a predetermined pattern.
  • the laminate layer 57 may be laminated so as to cover a portion of the second surface 55, and in this case, the laminate layer 57 may cover the entire X-ray contrast layer 53 or a portion of it.
  • the X-ray contrast material-free region 56 may be provided on a part or the entirety of the first surface 54, and this part can be made into a region on which cells can be placed by subjecting it to a hydrophilic treatment.
  • FIG. 6 shows a sixth embodiment of the resin film of the present invention.
  • the resin film 61 has a resin layer 62, an X-ray contrast layer 63 containing an X-ray contrast material provided on a second surface 65 of the resin layer 62, and a protective layer 67 that protects the X-ray contrast layer 63.
  • a first surface 64 of the resin layer 62 is provided with an X-ray contrast material-free region 66.
  • the X-ray contrast layer 63 is provided over the entire second surface 65 of the resin layer 62, but similar to the embodiment in Fig. 1, the X-ray contrast layer 63 may be provided over only a portion of the second surface 65, or a predetermined pattern of X-ray contrast material may be formed. It is sufficient for the protective layer 67 to cover at least the portion where the X-ray contrast layer 63 is provided.
  • the X-ray contrast material-free region 66 may be provided on a part or the entirety of the first surface 64, and this part can be made into a region on which cells can be placed by subjecting it to a hydrophilic treatment.
  • the manufacturing methods for the first embodiment shown in FIG. 1, the second embodiment shown in FIG. 2, the third embodiment shown in FIG. 3 and the sixth embodiment shown in FIG. 6 will be described.
  • One surface of the material used for the resin layer such as a PEEK film, is hydrophilized.
  • hydrophilization treatment include UV ozone treatment and plasma treatment. This provides an area on which cultured cells can be placed, ensuring close contact with the cells.
  • the hydrophilization treatment may be carried out after the surface of the resin layer is impregnated with an X-ray contrast material and then a protective layer is formed, or after the interior of the resin layer is impregnated with an X-ray contrast material.
  • an X-ray contrast material is impregnated into at least a portion of the first surface of the resin layer other than the area where the cells are to be placed, and/or at least a portion of the second surface.
  • the area of the first surface that does not contain the X-ray contrast material becomes an X-ray contrast material-free area.
  • a protective layer to protect the portion containing the X-ray contrast material.
  • the method for providing this protective layer may be a method of forming a vapor-deposited film by vapor deposition that selectively protects the area where the X-ray contrast material is placed, or, particularly when the X-ray contrast material is placed on the backside of the first surface, a polymer material that will become the protective layer may be applied to this surface as a coating liquid, and then the solvent may be removed to form a coating film that serves as the protective film.
  • a manufacturing method of the fourth embodiment shown in FIG. 4 will be described.
  • a film containing an X-ray contrast material is prepared as a laminate layer.
  • the X-ray contrast material may be incorporated on the surface or inside of the film, and the incorporation method is similar to the above-described case of incorporating an X-ray contrast material on the surface of a resin layer or the case of incorporating an X-ray contrast material inside a resin layer, thereby obtaining a film containing an X-ray contrast material.
  • a film containing an X-ray contrast material is laminated as a laminate layer on the resin layer containing the region where cells are to be placed, to obtain a resin film.
  • the surface of the resin layer opposite the surface on which the laminate layer is provided is then hydrophilized. This ensures adhesion to the cells, creating a region on which cultured cells are to be placed. Since no laminate layer is laminated on the first surface, the first surface of the resin layer is a region free of X-ray contrast material.
  • An adhesive may also be used when laminating the resin layer and the laminate layer.
  • a film is laminated as a laminate layer on the side of the resin layer where the X-ray contrast layer is provided, covering the X-ray contrast layer, to obtain a resin film.
  • the surface of the resin layer opposite the surface where the laminate layer is provided is then hydrophilized. This ensures adhesion to the cells and provides an area on which cultured cells can be placed. Because the X-ray contrast layer is provided on the second surface opposite the first surface, the first surface of the resin layer becomes an area free of X-ray contrast material.
  • An adhesive may also be used when laminating the resin layer and laminate layer.
  • a protective layer may be further provided using the method described above.
  • the resin film of this embodiment is a resin film including a resin layer having a first surface on which cultured cells are placed.
  • This first surface has an area on which cells are placed, and this area on which cells are placed preferably occupies 50% or more of the first surface, more preferably 80% or more, and particularly preferably 100%.
  • the cells placed on the first surface are preferably a cell sheet to facilitate transplantation.
  • such cells may be cells cultured elsewhere in sheet form, or cells cultured on the first surface.
  • the first surface functions as a scaffold for culturing the cells, and the resin film is preferably transparent to facilitate observation of the culture status using transmitted light observation under a microscope, for example.
  • the resin film of this embodiment is used by placing cultured cells on the first surface provided in the region not containing an X-ray contrast material.
  • cultured cells such as cell sheets
  • the resin film is placed on a resin film and transferred to the transplantation site. In this process, sufficient adhesion between the resin film and the cultured cells is ensured, and the resin film functions as a self-supporting membrane, facilitating cell transfer. After the cells are detached from the resin film at the transplantation site, the used resin film is removed.
  • the resin film may contain an organic polymer material, or may be configured not to contain a biological membrane such as a collagen film or amniotic membrane.
  • a biological membrane such as a collagen film or amniotic membrane.
  • a resin film containing an organic polymer material can be immediately peeled off from the cell sheet formed on the cell-mounting area (culture surface) after it has been attached to the transplant destination. The time from attachment to peeling may be 10 minutes or less.
  • resin materials include organic polymer materials such as polyether ether ketone (PEEK), polyethylene terephthalate (PET), polybutylene terephthalate (PBT), polystyrene (PS), polycarbonate (PC), modified polyphenylene ether (mPPE), polyphenylene sulfide (PPS), polysulfone (PSU), polyarylate (PAR), liquid crystal polymer (LCP), polyethylene (PE), polypropylene (PP), nylon 66 (N66), ethylene-tetrafluoroethylene copolymer (ETFE), tetrafluoroethylene-perfluoroalkyl vinyl ether copolymer (PFA), acrylonitrile-butadiene-styrene copolymer (ABS), polyethersulfone (PES), silicone, polyvinylidene fluoride (PVDF), polyacetal (POM), polyimide (PI),
  • PEEK polyether ether ketone
  • PET polyethylene
  • resin materials include synthetic polymer materials such as polyether ether ketone (PEEK), polyethylene terephthalate (PET), polybutylene terephthalate (PBT), polystyrene (PS), polycarbonate (PC), modified polyphenylene ether (mPPE), polyphenylene sulfide (PPS), polysulfone (PSU), polyarylate (PAR), liquid crystal polymer (LCP), polyethylene (PE), polypropylene (PP), nylon 66 (N66), ethylene-tetrafluoroethylene copolymer (ETFE), tetrafluoroethylene-perfluoroalkyl vinyl ether copolymer (PFA), acrylonitrile-butadiene-styrene copolymer (ABS), polyethersulfone (PES), silicone, polyvinylidene fluoride (PVDF), polyacetal (POM), polyimide (PI), polyamide (PA), polyglycolic acid (PGA),
  • PVDF
  • the material used for the resin layer is preferably, for example, a transparent material having a specific gravity of more than 1.0 g/cm 3 and excellent in various durability, mechanical strength, and processability.
  • An example of the resin film may be a film containing at least one of these resin materials as a main component, and is preferably a polyether ether ketone film, a polyethylene terephthalate film, or a polystyrene film, and more preferably a polyether ether ketone film.
  • the resin film preferably includes one or more resin layers made of the above-mentioned resin materials. The two or more resin layers may include materials different from each other.
  • the resin film may be composed of a resin substrate including a resin layer made of the above-mentioned material, or may be composed of a laminate substrate including a resin layer made of the above-mentioned material and a resin layer and/or an inorganic layer made of another material.
  • the resin layer does not need to include a layer formed by chemical vapor deposition such as parylene or a wet coating layer.
  • the inorganic layer in the laminate substrate preferably does not include glass and may include metal foil.
  • the resin film preferably does not include a nonwoven fabric or a fiber substrate on the cell-mounting region side. Resin films containing PEEK are preferable to those containing PET when comprehensively considered from the viewpoints of low linear expansion coefficient, solvent resistance, and heat resistance.
  • the resin film is preferably made of a material having a higher specific gravity than the culture medium.
  • the resin film may be transparent, which means that the haze value is 30% or less. Even in the case of a transparent resin film, the contrast ratio is high, and therefore the visibility of the markings 30 is excellent.
  • the surface of the resin film, including the cell-mounting region, is preferably subjected to a hydrophilization treatment, which can improve cell adhesion.
  • hydrophilization treatments include UV ozone treatment and plasma treatment.
  • a hydrophilized surface means a surface having a water droplet contact angle ⁇ of 70° or less as measured by the ⁇ /2 method.
  • the lower limit of the water droplet contact angle ⁇ of the hydrophilized surface is preferably 3° or more, but is not limited thereto.
  • the water droplet contact angle ⁇ is measured by placing 2 ⁇ l of pure water on the substrate in a 25° C.
  • the lower limit of the surface roughness Ra of the hydrophilically treated culture surface is 0.3 nm or more, preferably 0.5 nm or more, and the upper limit is 100 nm or less, preferably 10 nm or less, more preferably 2 nm or less.
  • the surface roughness Ra here refers to the arithmetic mean roughness in a square area with sides of 100 nm, obtained by using surface shape data measured with an atomic force microscope (AFM).
  • the shape of the resin film in the normal direction to the surface is preferably circular, but may be other shapes, such as a regular polygon such as a square, regular pentagon, regular hexagon, or regular octagon, or an oval or rectangle.
  • the thickness of the resin film may be, for example, 5 to 250 ⁇ m from the viewpoint of ease of handling according to the intended use, since if the resin film is too thin, it may be difficult to handle while maintaining the sheet shape by simply holding one end of the resin film with tweezers, and if the resin film is too thick, it may be difficult to properly fit the film to an affected area with a high degree of curvature.
  • the thickness of the resin film refers to the thickness of the resin layer alone, or, if a protective layer or laminate layer is present, the total thickness including the resin layer and the protective layer or laminate.
  • the lower limit of the substrate thickness is preferably 5 ⁇ m or more, more preferably 6 ⁇ m or more, even more preferably 8 ⁇ m or more, 10 ⁇ m or more, or 12 ⁇ m or more.
  • the upper limit of the substrate thickness is preferably 100 ⁇ m or less, more preferably 50 ⁇ m or less, 30 ⁇ m or less, 25 ⁇ m or less, and even more preferably 20 ⁇ m or less.
  • the substrate thickness of the resin film is 6 ⁇ m or more and 50 ⁇ m or less, 8 ⁇ m or more and 30 ⁇ m or less, or 10 ⁇ m or more and 20 ⁇ m or less.
  • the resin film can be prevented from tearing or curling during transportation, improving handleability.
  • the thickness By setting the thickness to be equal to or less than the upper limit, the ability to conform to the affected area during transplantation can be improved.
  • the resin film may have a sheet shape with a flat surface as a whole when viewed in cross section in the thickness direction.
  • the lower limit of the resin film substrate thickness is preferably more than 10 ⁇ m, more preferably 11 ⁇ m or more, and even more preferably 12 ⁇ m or more.
  • the self-supporting membrane is preferably a membrane that maintains the flat state of the cell-mounting region of the resin film even in a culture medium, and more preferably maintains the flat state even after a cell sheet is formed on the cell-mounting region.
  • the resin film does not curl, improving cell culture characteristics in a culture medium without adhering.
  • the self-supporting film may be capable of retaining its sheet shape to a certain extent when one end is pinched and lifted with tweezers.
  • the resin film preferably does not have an opening penetrating from the front to the back in the region where the cell-mounting region is formed, and preferably does not have an opening that exposes the bottom surface of the culture vessel when placed in the culture vessel.
  • the resin film does not have a ring structure, and the region where the cell-mounting region is formed is preferably solid.
  • the area of the resin film is not particularly limited, but is, for example, 0.3 cm or more and 1000 cm or less .
  • the lower limit of the area of the resin film may be 0.6 cm or more , 1.6 cm or more, 3 cm or more, 4 cm or more, 5 cm or more, 6 cm or more, 7 cm or more, 8 cm or more, or 10 cm or more.
  • the upper limit of the area of the resin film is more preferably 900 cm or less, even more preferably 800 cm or less, and particularly preferably 500 cm or less, and may be 100 cm or less , 50 cm or less , or 20 cm or less .
  • the area of the resin film is 0.6 cm 2 or more and 900 cm 2 or less, 1.6 cm 2 or more and 800 cm 2 or less, 3 cm 2 or more and 500 cm 2 or less, 6 cm 2 or more and 100 cm 2 or less, 8 cm 2 or more and 50 cm 2 or less, or 10 cm 2 or more and 20 cm 2 or less.
  • the cell-mounting area of the resin film is measured with a laser microscope, there are three or fewer holes with a diameter of 1 ⁇ m to 100 ⁇ m and a depth of 0.5 ⁇ m to 100 ⁇ m within a 100 ⁇ m square area.
  • the diameter of the holes is, for example, 1 ⁇ m to 100 ⁇ m, preferably 2 ⁇ m to 50 ⁇ m, and more preferably 3 ⁇ m to 30 ⁇ m.
  • the depth of the holes is, for example, 0.5 ⁇ m to 100 ⁇ m, preferably 1 ⁇ m to 50 ⁇ m, and more preferably 2 ⁇ m to 20 ⁇ m.
  • the combinations of the ranges of the hole diameter and the hole depth are, for example, a hole diameter of 1 ⁇ m or more and 100 ⁇ m or less and a hole depth of 0.5 ⁇ m or more and 100 ⁇ m or less, a hole diameter of 1 ⁇ m or more and 100 ⁇ m or less and a hole depth of 1 ⁇ m or more and 50 ⁇ m or less, a hole diameter of 1 ⁇ m or more and 100 ⁇ m or less and a hole depth of 2 ⁇ m or more and 20 ⁇ m or less, a hole diameter of 2 ⁇ m or more and 50 ⁇ m or less and a hole depth of 0.5 ⁇ m or more and 100 ⁇ m or less, a hole diameter of 1 ⁇ m or more and 10 ...
  • the hole diameter is 2 ⁇ m or more and 50 ⁇ m or less and the hole depth is 1 ⁇ m or more and 50 ⁇ m or less
  • the hole diameter is 2 ⁇ m or more and 50 ⁇ m or less and the hole depth is 2 ⁇ m or more and 20 ⁇ m or less
  • the hole diameter is 3 ⁇ m or more and 30 ⁇ m or less and the hole depth is 0.5 ⁇ m or more and 100 ⁇ m or less
  • the hole diameter is 3 ⁇ m or more and 30 ⁇ m or less and the hole depth is 1 ⁇ m or more and 50 ⁇ m or less
  • the hole diameter is 3 ⁇ m or more and 30 ⁇ m or less and the hole depth is 2 ⁇ m or more and 20 ⁇ m or less.
  • the upper limit of the porosity of the resin film is, for example, 15% or less, preferably 10% or less, and more preferably 5% or less.
  • the lower limit of the porosity of the resin film is not particularly limited, but may be 0% or more.
  • the resin film does not necessarily need to have a layer containing a temperature-responsive polymer formed on the surface where the cell-mounting region is formed. This makes it possible to prevent a decrease in the adhesion between the cell sheet and the resin film in a low-temperature environment such as during the cryopreservation process.
  • the above-mentioned temperature-responsive polymer is a material that exhibits cell adhesiveness at the temperature used for cell culture, and exhibits cell non-adhesiveness by changing the temperature from that temperature, making it possible to easily detach a cell sheet.
  • the temperature range in which the temperature-responsive polymer exhibits cell adhesiveness is 10°C to 45°C, particularly 33°C to 40°C, which is preferable because cells can be stably cultured.
  • the temperature range in which the temperature-responsive polymer exhibits cell non-adhesiveness is 1°C to 36°C, particularly 4°C to 32°C, which is preferable because damage to the detachment of the cell sheet can be reduced.
  • materials constituting the temperature-responsive polymer include temperature-responsive polymers such as poly-N-isopropylacrylamide (PNIPAAm), poly-N-n-propylacrylamide, poly-N-n-propylmethacrylamide, poly-N-ethoxyethylacrylamide, poly-N-tetrahydrofurfurylacrylamide, poly-N-tetrahydrofurfurylmethacrylamide, and poly-N,N-diethylacrylamide, and among these, PNIPAAm, poly-N-n-propylmethacrylamide, and poly-N,N-diethylacrylamide are preferred.
  • the bottom surface of the culture vessel may also be configured so as not to contain a temperature-responsive polymer.
  • the cell sheet-attached resin film of this embodiment is The resin film described above; and a cell sheet provided on the cell-mounting region of the first surface of the resin film.
  • An example of the method for producing the cell sheet-attached resin film of this embodiment is as follows: An installation step of placing the above-mentioned resin film in a culture vessel; a culturing step of placing a culture medium P in a culture vessel, seeding cells, and culturing a cell sheet on the cell-mounting region on the first surface of the resin film; and a removal step of removing the cell sheet-attached resin film from the culture vessel.
  • the placing step may include a step of placing the ring member on a resin film in the culture vessel.
  • the removing step may also include a step of removing the ring member from above the resin film.
  • the cells are not particularly limited as long as they are clinically useful cells for treating or preventing symptoms associated with cell, tissue, or organ deficiency, dysfunction, or dysfunction, or culturable cells for use in non-clinical trials, and are cells isolated from a living body.
  • Examples of cells include biological tissue cells, mesenchymal stem cells capable of differentiating into cells belonging to mesenchymal tissue, pluripotent stem cells capable of differentiating into various biological tissues, stem cells and progenitor cells that can be induced to differentiate, etc.
  • the cells may be adherent cells or suspension cells.
  • biological tissue cells include fibroblasts, myofibroblasts, corneal epithelial cells, retinal cells, nerve cells, muscle cells, cardiac muscle cells, myoblasts, bone cells, osteoblasts, chondrocytes, adipocytes, hepatocytes, pancreatic cells, kidney cells, gingival cells, periosteal cells, skin cells, and endothelial cells.
  • mesenchymal stem cells include adipose tissue-derived mesenchymal stem cells, bone marrow-derived mesenchymal stem cells, umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells, and umbilical cord-derived mesenchymal stem cells.
  • pluripotent stem cells include induced pluripotent stem cells, embryonic stem cells, nuclear transfer embryonic stem cells, embryonic tumor cells, and embryonic germ cells. These cells may be cultured alone or in combination of two or more types. These cells may be appropriately selected from known cells depending on the intended use of the cells.
  • the origin of the cells is not particularly limited, but examples include mammals, birds, amphibians, fish, insects, plants, and microorganisms. Specific examples of mammals and birds include humans, monkeys, chimpanzees, cows, horses, pigs, sheep, goats, rabbits, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, mice, rats, and chickens.
  • a cell sheet has a sheet structure in which cells are physically and functionally connected to each other via adhesion molecules, extracellular matrix, etc.
  • the cell sheet may have a single-layer structure consisting of one cell layer, or a laminated structure consisting of two or more cell layers.
  • the laminated structure is not particularly limited, but examples include multi-layer structures such as two-layer, three-layer, four-layer, and five-layer structures.
  • a cell sheet When a cell sheet has a multilayer structure, this may be obtained when cultured on a resin film, or it may be obtained by stacking cell sheets with a single layer structure.
  • a cell sheet with a multilayer structure can be obtained by preparing multiple cell sheet-attached resin films of the present invention, overlaying one cell sheet on top of another, and peeling off the culture carrier substrate from the other cell sheets.
  • the thickness of the cell sheet is not particularly limited, but is, for example, 0.001 mm or more and 2.0 mm or less.
  • the lower limit of the thickness of the cell sheet is more preferably 0.01 mm or more, even more preferably 0.03 mm or more, and particularly preferably 0.05 mm or more.
  • the upper limit of the thickness of the cell sheet is more preferably 1.5 mm or less, even more preferably 1.2 mm or less, and particularly preferably 1.0 mm or less.
  • the thickness of the cell sheet is, for example, 0.001 mm to 2.0 mm, 0.001 mm to 1.5 mm, 0.001 mm to 1.2 mm, 0.001 mm to 1.0 mm, 0.01 mm to 2.0 mm, 0.01 mm to 1.5 mm, 0.01 mm to 1.2 mm, 0.01 mm to 1.0 mm, 0.03 mm to 2.0 mm, 0.03 mm to 1.5 mm, 0.03 mm to 1.2 mm, 0.03 mm to 1.0 mm, 0.05 mm to 2.0 mm, 0.05 mm to 1.5 mm, 0.05 mm to 1.2 mm, or 0.05 mm to 1.0 mm.
  • the area of the cell sheet is not particularly limited, and may be, for example, 0.3 cm2 or more and 1000 cm2 or less.
  • the lower limit of the area of the cell sheet may be 0.6 cm2 or more, 1.6 cm2 or more, 3 cm2 or more, 4 cm2 or more, 5 cm2 or more, 6 cm2 or more, 7 cm2 or more, 8 cm2 or more, or 10 cm2 or more.
  • the upper limit of the area of the cell sheet is more preferably 900 cm2 or less, even more preferably 800 cm2 or less, and particularly preferably 500 cm2 or less, and may be 100 cm2 or less, 50 cm2 or less, or 20 cm2 or less.
  • the area of the cell sheet may be 0.6 cm to 900 cm , 1.6 cm to 800 cm , 3 cm to 500 cm , 6 cm to 100 cm , 8 cm to 50 cm , or 10 cm to 20 cm .
  • the cell sheet is supported on a culture carrier substrate, preventing tearing of the cell sheet during transplantation, allowing the size of the cell sheet to be increased to 8 cm or more .
  • a larger cell sheet can be prepared and adjusted to the size of the affected area as needed.
  • the entire lower surface of the cell sheet is placed so as to overlap the surface (cell-mounting area) of the resin film.
  • Cell culture is not particularly limited, and conventional methods used in fields such as medicine, pharmaceuticals, quasi-drugs, cosmetics, food, and veterinary medicine, as well as basic technical fields such as regenerative medicine and bioengineering, can be used.
  • the culture conditions are not particularly limited as long as they allow the cultured cells to reach the desired state.
  • Typical culture conditions include, for example, using a prepared basal medium at 37°C in a 5% CO2 environment.
  • the cell culture period is not particularly limited as long as the cultured cells reach the desired state.
  • the cell culture period is, for example, within 28 days, within 21 days, within 14 days, within 7 days, within 5 days, or within 3 days.
  • the medium may be replaced.
  • the frequency and method of medium replacement are not particularly limited. In general, it is preferable to replace the medium every 1 to 7 days. It is particularly preferable to replace the medium every 1 to 5 days. At this time, the entire medium may be replaced, or a portion of the medium may be left and new medium may be added.
  • the density of the cells to be cultured is not particularly limited as long as it is suitable for the cells to be cultured, the culture vessel, and the intended use of the cultured cells, but is, for example, 5 x 102 cells/ cm2 or more and 1 x 109 cells/cm2 or less .
  • the lower limit of the cell density is more preferably 1 x 103 cells/ cm2 or more, even more preferably 5 x 103 cells/ cm2 or more, and particularly preferably 5 x 104 cells/ cm2 or more.
  • the upper limit of the cell density is more preferably 1 x 108 cells/cm2 or less, even more preferably 5 x 107 cells/cm2 or less , and particularly preferably 1 x 107 cells/ cm2 or less.
  • the density of the cells to be cultured is, for example, 5 ⁇ 10 2 cells/cm 2 to 1 ⁇ 10 9 cells/cm 2 , 5 ⁇ 10 2 cells/cm 2 to 1 ⁇ 10 8 cells/cm 2 , 5 ⁇ 10 2 cells/cm 2 to 5 ⁇ 10 7 cells/cm 2 , 5 ⁇ 10 2 cells/cm 2 to 1 ⁇ 10 7 cells/cm 2, 1 ⁇ 10 3 cells/cm 2 to 1 ⁇ 10 9 cells/cm 2, 1 ⁇ 10 3 cells/cm 2 to 1 ⁇ 10 8 cells/cm 2 , 1 ⁇ 10 3 cells/cm 2 to 5 ⁇ 10 7 cells/cm 2, 1 ⁇ 10 3 cells/cm 2 to 1 ⁇ 10 7 cells/cm 2 , 5 ⁇ 10 3 cells/cm 2 to 1 ⁇ 10 9 cells/cm 2 , 5 ⁇ 10 3 cells/cm 2 to 1 ⁇ 10 9 cells/cm 2 , 5 ⁇ 10 3 cells/cm 2 to 5 ⁇ 10 7 cells/cm 2 , 1 ⁇ 10 3 cells/cm 2 to 1 ⁇ 10 9 cells
  • the medium is not particularly limited as long as it is suitable for the cells to be cultured.
  • medium components include sugars, amino acids, vitamins, inorganic salts, trace metals, and additives. These medium components may be blended alone or in combination of two or more. These medium components may be appropriately selected from known components depending on the cells to be cultured, etc.
  • sugars include monosaccharides such as glucose, fructose, mannose, and galactose; disaccharides such as sucrose, sucralose, trehalose, maltose, and lactose; trisaccharides such as glucosylsucrose, lactosucrose, and raffinose; tetrasaccharides such as acarbose and maltotetraose; cyclodextrins; and oligosaccharides.
  • monosaccharides such as glucose, fructose, mannose, and galactose
  • disaccharides such as sucrose, sucralose, trehalose, maltose, and lactose
  • trisaccharides such as glucosylsucrose, lactosucrose, and raffinose
  • tetrasaccharides such as acarbose and maltotetraose
  • amino acids include L-glutamic acid, L-glutamine, L-arginine, L-cystine, glycine, L-histidine, L-isoleucine, L-leucine, L-lysine, L-methionine, L-phenylalanine, L-serine, L-threonine, L-tryptophan, L-tyrosine, L-valine, L-alanine, L-asparagine, L-aspartic acid, L-cysteine, and L-hydroxyproline.
  • vitamins include sodium L-ascorbate, L-ascorbic acid diphosphate, choline, folic acid, niacin, biotin, pantothenic acid, pyridoxine, riboflavin, thiamine, thymidine, and vitamin B12.
  • inorganic salts include sodium chloride, sodium hydroxide, sodium sulfate, sodium phosphate, disodium hydrogen phosphate, sodium carbonate, sodium bicarbonate, potassium chloride, potassium hydroxide, potassium sulfate, potassium phosphate, dipotassium hydrogen phosphate, potassium carbonate, potassium bicarbonate, calcium chloride, calcium sulfate, calcium nitrate, calcium phosphate, calcium carbonate, magnesium chloride, magnesium sulfate, magnesium nitrate, magnesium phosphate, and magnesium carbonate.
  • trace metals include iron sulfate, iron nitrate, copper sulfate, copper nitrate, and zinc sulfate.
  • additives include serum such as bovine serum, horse serum, and human serum; growth factors such as FGF2, EGF, HGF, VEGF, and PDGF; proteins such as albumin; antioxidants such as glutathione, ascorbic acid, and ascorbic acid derivatives; antibiotics such as penicillin and streptomycin; pH adjusters such as HEPES; organic acids such as lactic acid and propionic acid; lipids such as cholesterol; fatty acids such as linoleic acid; amines such as ethanolamine and putrescine; reducing agents such as mercaptoethanol and 3-mercapto-1,2-propanediol; thickeners such as sodium alginate, polyvinylpyrrolidone, carboxymethylcellulose, and pullulan; and pH indicators such as phenol red.
  • serum such as bovine serum, horse serum, and human serum
  • growth factors such as FGF2, EGF, HGF, VEGF, and PDGF
  • proteins such as albumin
  • antioxidants such as glutathi
  • Examples of media containing the above-mentioned medium components include AIM V medium, HFDM-1 medium, equilibrated buffers such as Dulbecco's phosphate buffered saline (D-PBS) and Hank's balanced salt solution (HBSS), DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium), EMEM (Eagle's Minimum Essential Medium), ⁇ -MEM (Minimum Essential Medium alpha Modification), IMDM (Iscove's Modified Dulbecco's Medium), GMEM (Glasgow's MEM), and Ham's F-10.
  • D-PBS Dulbecco's phosphate buffered saline
  • HBSS Hank's balanced salt solution
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
  • EMEM Eagle's Minimum Essential Medium
  • ⁇ -MEM Minimum Essential Medium alpha Modification
  • IMDM Iscove's Modified Dulbecco'
  • basal medium Ham's F-12 medium, Ham's F-12K medium, RPMI medium 1640, M-199 medium, L-15 medium, McCoy's 5A Medium, MCDB105 medium, MCDB107 medium, MCDB131 medium, MCDB153 medium, MCDB201 medium, NCTC109 medium, NCTC135 medium, Waymouth's MB752/1 medium, CMRL-1066
  • basal media include basal media such as medium, Williams' medium E, Brinster's BMOC-3 medium, and E8 medium. These basal media may be used alone or in combination of two or more. Furthermore, the basal media may contain additional, removed, increased, or decreased medium components depending on the type and condition of the cells. These basal media may be selected from known media as appropriate depending on the cells to be cultured.
  • An example of the cell culture kit of this embodiment is: A culture vessel; and the resin film described above.
  • the culture vessel is a vessel for culturing cells in a medium, and is not particularly limited as long as it is suitable for the type of cells to be cultured and the intended use.
  • Examples of culture vessels include dishes, Petri dishes, tissue culture dishes, multi-dishes, flasks, tissue culture flasks, microplates, microwell plates, multi-plates, multi-well plates, chamber slides, Petri dishes, tubes, trays, culture bags, and roller bottles.
  • the material of the culture vessel is not particularly limited as long as it is impermeable to the culture medium, but examples include polystyrene, polyethylene, polypropylene, polyvinyl alcohol, polyethylene terephthalate, polyacetal, polyvinyl chloride, acrylic resin, polycarbonate, polyether ether ketone, polyethersulfone, polytetrafluoroethylene, polyimide, polyamide, cycloolefin polymer, cellulose, silicone, nylon 6,6, glass, and metals such as stainless steel and aluminum.
  • the area of the culture vessel is not particularly limited, but any commercially available culture vessel can be used for culture without any problems.
  • it is 0.3 cm2 or more and 1000 cm2 or less.
  • the lower limit is more preferably 0.35 cm2 or more, even more preferably 1.0 cm2 or more, and particularly preferably 1.9 cm2 or more.
  • the upper limit is more preferably 900 cm2 or less, even more preferably 800 cm2 or less, and particularly preferably 500 cm2 or less.
  • the cell culture kit may also include a ring member.
  • the ring member is removably housed in the internal space of the culture vessel and can press down and fix the resin film placed inside the culture vessel.
  • the ring member is, for example, cylindrical or annular.
  • the shape of the ring member is not limited to cylindrical or annular, and may be a ring of any suitable predetermined shape when viewed from above, such as an ellipse, rectangle, or polygon.
  • the ring member does not need to be completely cylindrical or annular; it may be partially missing, or may be U-shaped.
  • the specific gravity of the ring member is greater than 1.0. It is desirable that the specific gravity of the ring member be 1.05 or greater so that it sinks stably in the culture medium.
  • the material of the ring member may include one or more of, for example, resin, glass, ceramics, metal, etc.
  • Resin is suitable for the ring member from the standpoints of moldability and productivity.
  • the resin may include one or more of, for example, polystyrene, ABS resin, AS resin, polyphenyl ether, nylon 66, MS resin, nylon 6, methacrylic resin, acrylic resin, polycarbonate resin, polysulfone resin, polyetherimide resin, polyurethane resin, PBT resin, PET resin, vinyl chloride resin, PBT resin, polyacetal resin, PET resin, fluororesin, etc.
  • the glass may be soda glass, borosilicate glass, quartz glass, etc.
  • the metal may include one or more of stainless steel, aluminum, etc.
  • the ring member may contain various additives based on the materials exemplified here.
  • An example of the cryopreservation method of this embodiment includes a cooling step of cooling the cell sheet-attached resin film in a cryopreservation solution.
  • the cryopreservation of the cell sheet-attached resin film may be performed inside a culture vessel.
  • a cryopreservation solution is a solution for reducing cell damage caused by cryopreservation.
  • the cryopreservation solution is not particularly limited as long as it is suitable for cryopreservation of cells, and may contain medium components contained in the medium, a cryoprotectant, and the like.
  • the medium components such as sugars, amino acids, vitamins, inorganic salts, trace metals, and additives, may be any that satisfy the description in the section (Culture Medium) above.
  • the freezing preservation solution preferably has a freezing initiation temperature in the range of ⁇ 15°C to ⁇ 5°C.
  • Cryoprotectants are substances used to reduce damage to cells caused by freezing and thawing during cryopreservation.
  • cryoprotectants include cell-impermeant cryoprotectants and cell-permeant cryoprotectants.
  • Specific examples of cell-impermeable cryoprotectants include, for example, albumin, sucrose, trehalose, dextran, polyethylene glycol, polyvinyl alcohol, polyvinylpyrrolidone, polylysine, and the like.
  • Specific examples of cell-permeable cryoprotectants include, for example, dimethyl sulfoxide (DMSO), glycerol, ethylene glycol, propylene glycol, propanediol, and the like. These cryoprotectants may be used alone or in combination of two or more. These cryoprotectants may be appropriately selected from known cryoprotectants depending on the type of cells, the composition of the cryopreservation solution, etc.
  • cryopreservation solutions that do not contain DMSO include, for example, Stem Cell Banker (registered trademark) DMSO-free GMP grade (Nihon Zenyaku Kogyo Co., Ltd.), Bambanker (registered trademark) DMSO-free (GC Lymphotec Co., Ltd.), Cryoscarless (registered trademark) DMSO-free (BioVerde Co., Ltd.), Stem Cell Keep (BioVerde Co., Ltd.), CryoNovo (registered trademark) X12 (Akron BioProducts LCC Co., Ltd.), and CryoNovo (registered trademark) P24 ( Akron BioProducts LCC), DMSO-free cell cryopreservation medium for cryopreservation of human ES/iPS cells (ReproCell), Cell Reservoir One (Nacalai Tesque), ThelioKeep (registered trademark: BioVerde), Cellvation (registered trademark: Protide Pharmaceutical
  • cryopreservation solutions containing DMSO include, for example, Stem Cell Banker (registered trademark) GMP Grade (Nippon Zenyaku Kogyo Co., Ltd.), Stem Cell Banker (registered trademark) EX GMP Grade (Nippon Zenyaku Kogyo Co., Ltd.), Bambanker (registered trademark) hRM (GC Lymphotec), Bambanker (registered trademark) (GC Lymphotec), iStock (GC Lymphotec), CryoStor CS5 (Charles River Laboratories Cell Solutions, Inc.), and CryoStor CS10 (Charles River Laboratories Cell Solutions, Inc.).
  • a non-throughflow cooling device makes it possible to cool the cell sheet, which is the object to be cooled, at a uniform temperature, thereby minimizing damage to the cells and preventing a decrease in cell activity.
  • the cooling rate at 0 to ⁇ 5° C. is, for example, 0.1° C./min or more and 15° C./min or less, preferably 0.25° C./min or more and 12.5° C./min or less, and more preferably 0.5° C./min or more and 10° C./min or less.
  • the freezing temperature is not particularly limited, as long as it can freeze the cultured cells and the cryopreservation solution.
  • the freezing temperature is, for example, -196°C or higher and -25°C or lower.
  • the lower limit is more preferably -180°C or higher, even more preferably -160°C or higher, and particularly preferably -150°C or higher.
  • the upper limit is more preferably -25°C or lower, even more preferably -30°C or lower, and particularly preferably -35°C or lower.
  • the freezing temperature is, for example, -196°C or higher and -25°C or lower, -196°C or higher and -30°C or lower, -196°C or higher and -35°C or lower, -180°C or higher and -25°C or lower, -180°C or higher and -30°C or lower, -180°C or higher and -35°C or lower, -160°C or higher and -25°C or lower, -160°C or higher and -30°C or lower, -160°C or higher and -35°C or lower, -150°C or higher and -25°C or lower, -150°C or higher and -30°C or lower, or -150°C or higher and -35°C or lower.
  • the cooling device used for the freezing process is not particularly limited, and examples include quick-freezing devices and cryogenic refrigeration devices. Rather than contacting a heat transfer device with the culture vessel to freeze the culture vessel and cells, a cooling device that does not come into contact with the heat transfer device and sprays cold air onto the culture vessel from multiple directions, preferably all directions, rather than one direction, is preferable from the perspective of freezing cells at a uniform temperature and increasing the survival rate of the cells after thawing.
  • Specific examples of freezing devices that spray cold air onto the culture vessel include cooling devices that cool the object to be cooled by circulating cold air with a cooling fan, such as the non-through-flow cooling device equipped with a cooling fan disclosed in JP 2005-127666 A.
  • the term "non-through-flow system” refers to a system in which the majority of the through-flow air from the object to be cooled does not pass through (through-flow) the cooler.
  • the cryopreservation method preferably includes a cryopreservation step in which, after the cooling step, the cell sheet-attached resin film is stored at, for example, ⁇ 196° C. to ⁇ 60° C., preferably ⁇ 180° C. to ⁇ 65° C., more preferably ⁇ 150° C. to ⁇ 80° C. This allows the cell sheet to be stably maintained for a long period of time.
  • the temperature in the cooling step may be the set temperature of the cooling device.
  • cryopreservation method is not particularly limited as long as the cells can be stably cryopreserved.
  • Cryopreservation methods include, for example, contact with the liquid or gas phase of a cooling agent, use of an ultra-low temperature freezer, etc.
  • a preferred cryopreservation method is contact with the liquid or gas phase of a cooling agent from the viewpoint of temperature.
  • coolants include liquid nitrogen, liquid ethane, liquid propane, liquid helium, and dry ice.
  • the cryopreservation temperature is not particularly limited as long as the cells can be stably cryopreserved, and may be, for example, within any range of ⁇ 196° C. to ⁇ 60° C., ⁇ 196° C. to ⁇ 134° C., or ⁇ 134° C. to ⁇ 60° C.
  • the temperature for cryopreservation may be the surface temperature of the cell sheet to be frozen, which can be measured using, for example, a K thermocouple.
  • the frozen resin film with cell sheet contains a resin film and a cell sheet formed on the surface of the resin film (cell-mounting area). In the resin film with cell sheet, the resin film and cell sheet are in a frozen state.
  • the resin film and cell sheet are frozen at the above-mentioned cryopreservation temperatures, specifically, preferably -60°C or lower, and more preferably -135°C or lower.
  • the frozen product may also be frozen at temperatures between -134°C and -60°C.
  • the frozen product is frozen at temperatures above -196°C.
  • Frozen cell sheet-attached culture carrier substrates frozen inside a culture vessel or cryopreservation container can be packaged in a packaging material, either while frozen in the culture vessel or cryopreservation container, or after being removed from the container.
  • the sealed packaging prevents microbial contamination of the cell sheet and allows the cell sheet to be stored and distributed without being soiled.
  • a frozen product package can be obtained by wrapping a cell sheet-attached culture carrier substrate and a container containing a cryopreservation solution in a film-like packaging material and freezing the container in a sealed state.
  • Preferred packaging materials include aluminum, polyethylene terephthalate, ionomer, polyethylene, polyvinylidene chloride, polyvinyl alcohol, polypropylene, polyester, polycarbonate, polyacrylonitrile, ethylene-vinyl acetate copolymer, ethylene-vinyl alcohol copolymer, ethylene-methacrylic acid copolymer, polyimide, fluororesins such as perfluoroalkoxy fluororesin and tetrafluoroethylene-hexafluoropropylene copolymer (FEP), nylon, cellophane, and paper. These materials may be used alone or in combinations of two or more.
  • FEP tetrafluoroethylene-hexafluoropropylene copolymer
  • packaging materials that combine paper or nonwoven fabric with the above materials are preferably used.
  • the packaging material may be multi-packaged, or additional packaging may be added after sterilization, and the outermost part of the package is preferably a resin film-like packaging material. This package may also be sterilized. Sterilization methods include electron beam sterilization, gamma ray sterilization, EOG sterilization, and high-pressure steam sterilization.
  • the cryopreservation method of this embodiment may further include a thawing step of thawing the cell sheet-attached resin film.
  • the thawing method is not particularly limited, and any conventional means used in technical fields such as medicine, pharmaceuticals, quasi-drugs, cosmetics, food, and veterinary medicine, as well as basic technical fields such as regenerative medicine and bioengineering, can be used.
  • Methods for thawing include, for example, using a water bath, bead bath, incubator, hot plate, defroster, etc., immersing in a melting liquid at a temperature higher than the freezing temperature, or leaving in an environment at a temperature higher than the freezing temperature.
  • the environmental temperature in contact with the frozen product during thawing is not particularly limited as long as it is higher than the freezing temperature and lower than 50° C.
  • the upper limit of the environmental temperature is, for example, 49° C. or lower, preferably 45° C.
  • the lower limit of the environmental temperature is, for example, 0° C. or higher, preferably 5° C. or higher, more preferably 10° C., and even more preferably 15° C. or higher.
  • the range of environmental temperatures in contact with the frozen material when thawing is, for example, 0°C or higher and 49°C or lower, 0°C or higher and 45°C or lower, 0°C or higher and 40°C or lower, 5°C or higher and 49°C or lower, 5°C or higher and 45°C or lower, 5°C or higher and 40°C or lower, 10°C or higher and 49°C or lower, 10°C or higher and 45°C or lower, 10°C or higher and 40°C or lower, 15°C or higher and 49°C or lower, 15°C or higher and 45°C or lower, and 15°C or higher and 40°C or lower.
  • Thawing temperatures of 50°C or higher are not preferred because they may cause thermal damage to cells.
  • the frozen material may be temporarily stored in a temperature environment below the freezing point during thawing.
  • frozen material stored at ⁇ 80°C can be exposed to an environmental temperature of ⁇ 30°C and then thawed at an environmental temperature above the freezing point.
  • the time required to thaw a frozen product is not particularly limited as long as freezing does not cause damage to cells.
  • thawing can be performed without problems if it is more than 10 seconds and less than 60 minutes.
  • the lower limit of the time required to thaw a frozen product is sufficient if it is more than 10 seconds, preferably 20 seconds or more, more preferably 30 seconds or more, and even more preferably 1 minute or more.
  • the upper limit is sufficient if it is 60 minutes or less, preferably 50 minutes or less, more preferably 40 minutes or less, and even more preferably 30 minutes or less.
  • the time required for thawing is more than 10 seconds and less than 60 minutes, more than 10 seconds and less than 50 minutes, more than 10 seconds and less than 40 minutes, more than 10 seconds and less than 30 minutes, 20 seconds to 60 minutes, 20 seconds to 50 minutes, 20 seconds to 40 minutes, 20 seconds to 30 minutes, 30 seconds to 60 minutes, 30 seconds to 50 minutes, 30 seconds to 40 minutes, 30 seconds to 30 minutes, 1 minute to 60 minutes, 1 minute to 50 minutes, 1 minute to 40 minutes, or 1 minute to 30 minutes.
  • the environmental temperature may be set to be constant, or may be set to fluctuate, such as rising in stages.
  • thawing solution there are no particular limitations on the thawing solution, so long as it does not damage the cultured cells.
  • ingredients that may be contained in the thawing solution include sucrose, glucose, maltose, trehalose, and fructose.
  • the thawing solution may also contain the ingredients listed above in the section (Culture Medium).
  • the temperature of the melting liquid is not particularly limited as long as it is higher than the freezing temperature.
  • Examples of the temperature of the melting liquid include 0°C to 45°C.
  • the lower limit is more preferably 4°C or higher, even more preferably 25°C or higher, and particularly preferably 28°C or higher.
  • the upper limit is more preferably 40°C or lower, even more preferably 39°C or lower, and particularly preferably 38°C or lower.
  • Examples of the temperature of the melting liquid include 0°C to 45°C, 0°C to 40°C, 0°C to 39°C, 0°C to 38°C, 4°C to 45°C, 4°C to 40°C, 4°C to 39°C, 4°C to 38°C, 25°C to 45°C, 25°C to 40°C, 25°C to 39°C, 25°C to 38°C, 28°C to 45°C, 28°C to 40°C, 28°C to 39°C, and 28°C to 38°C.
  • the thawed cell sheet and resin film may be washed immediately after thawing with a cell washing solution.
  • the cell washing solution is not particularly limited and may contain the components described in the above section (Culture Medium).
  • the temperature of the cell washing solution is not particularly limited.
  • the temperature of the cell washing solution is, for example, from 0°C to 45°C.
  • the lower limit is more preferably 4°C or higher, even more preferably 25°C or higher, and particularly preferably 28°C or higher.
  • the upper limit is more preferably 40°C or lower, even more preferably 39°C or lower, and particularly preferably 38°C or lower.
  • the number of times the cultured cells are washed is not particularly limited, and may be one or more times (for example, two, three, four, five, etc.).
  • the cell-mounting region does not contain a temperature-responsive polymer, it is possible to prevent the cell sheet from peeling off from the resin film in low-temperature environments such as during the cryopreservation process, and it is possible to obtain a cell-sheet-attached resin film that maintains the adhesiveness between the cell sheet and the film even after undergoing the cryopreservation and thawing processes.
  • the transplantation method of this embodiment includes a transplantation step of attaching a cell sheet formed in a cell-mounting region of a resin film to a transplantation site, and then peeling off the resin film from the cell sheet.
  • the recipient site may be at least a portion of the body of a recipient, such as a mammal, bird, amphibian, fish, insect, plant, or microorganism.
  • a mammal such as a mammal, bird, amphibian, fish, insect, plant, or microorganism.
  • mammals and birds include humans, monkeys, chimpanzees, cows, horses, pigs, sheep, goats, rabbits, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, mice, rats, and chickens.
  • the recipient site may exclude the inside and outside of the human body. Examples of recipient sites other than the recipient include other cell sheets, medical devices, and tissues or organs isolated from the recipient.
  • tissues or organs isolated include skin, oral tissue, esophagus, trachea, bronchi, lungs, lung lobes, stomach, duodenum, pancreas, spleen, small intestine, large intestine, muscle tissue, and bone (excluding tissues that are to be returned to the same recipient for treatment).
  • Cell transplantation therapy suppresses and prevents the onset and recurrence of symptoms associated with cell, tissue, and organ loss, dysfunction, and dysfunction.
  • Diseases that can be treated with cell transplantation therapy include spinal cord injury, knee joint cartilage damage, ischemic heart disease, age-related macular degeneration, corneal epithelial stem cell deficiency, aplastic anemia, severe limb ischemia, intractable skin ulcers, and the prevention of postoperative complications (e.g., suture failure in various organs, bronchial stump fistula, pancreatic fistula, bile leakage), and burns.
  • the cells used in cell transplantation therapy may be autologous cells, allogeneic non-autologous cells, or xenogeneic cells.
  • Preferred cells are autologous cells from the viewpoints of clinical application and safety, and non-autologous cells from the viewpoints of clinical application and productivity.
  • a resin film comprising a resin layer having a first surface including an area on which cultured cells are placed, the resin film containing an X-ray contrast material, and having an X-ray contrast material-free area in the first surface that does not contain an X-ray contrast material, the area on which cultured cells are placed being provided in at least a portion of the X-ray contrast material-free area.
  • the resin film according to 1. wherein the surface of the region where the cultured cells are to be placed has a water droplet contact angle ⁇ of 70° or less as measured by the ⁇ /2 method. 3.
  • the resin film according to 1. or 2. wherein an X-ray contrast layer containing an X-ray contrast material is formed on the surface of the resin layer.
  • the resin film according to 3. wherein the X-ray contrast layer is formed on a second surface of the resin layer opposite to the first surface. 5.
  • the resin film according to any one of 1. to 4. wherein an X-ray contrast material is contained inside the resin layer. 6.
  • the resin film according to any one of 1. to 5. further comprising a laminate layer laminated on the surface of the resin layer. 7.
  • the resin film according to 6. wherein the laminate layer is laminated on a second surface of the resin layer opposite to the first surface.
  • 8. The resin film according to 6. or 7., wherein the laminate layer contains the X-ray contrast material.
  • 9. The resin film according to any one of 1. to 8., further comprising a protective layer that protects at least a portion of the surface.
  • 10. The resin film according to any one of 1. to 9., wherein the thickness of the resin film is 5 to 250 ⁇ m.
  • the resin film according to any one of 1. to 10., wherein the X-ray contrast material contains a metal or a metal compound. 12.
  • 12. The resin film according to any one of 1.
  • the 60-degree specular gloss Gs(60°) of the surface opposite the first surface, measured in accordance with JIS Z8741:1997, is 700 or less.
  • the X-ray contrast material comprises an X-ray contrast filler.
  • the resin layer contains polyether ether ketone (PEEK).
  • PEEK polyether ether ketone

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Abstract

本発明は、培養した細胞を載せる領域を含む第一の表面を有する樹脂層を含む樹脂フィルムであって、当該樹脂フィルムは、Ｘ線造影材料を含み、前記第一の表面中にＸ線造影材料を含まないＸ線造影材料非存在領域を有する、樹脂フィルムである。

Description

Ｘ線造影材料を含む樹脂フィルム
　本発明は、培養した細胞を載せる第一の表面を有する樹脂層とＸ線造影材料とを含む樹脂フィルムに関する。
　近年、移植細胞の組織生着性を向上させる方法として「細胞シート技術」が開発され、虚血性心筋症、肺術後気漏、内視鏡的食道粘膜下層剥離術後の狭窄などの様々な疾患や術後合併症予防に対する細胞シート移植治療の研究が実施されている。
　特許文献１には、細胞シート付着性の被覆層と、医療用材料として許容される基材からなる支持層とを備える、移植用細胞シートを運搬するためのキャリアについて記載されている。
　特許文献２には、セルロース繊維のフリース材からなるタンポンまたは医療用吸引体において、硫酸バリウムおよび重合熱可塑性基材からなる造影剤を、フリース材の内部に熱結合で埋め込むことにより、Ｘ線検出性を付与する技術について記載されている。
国際公開第２０１４／０９１７９６号パンフレット 特開昭６３－１４３０６１号公報
　上記の特許文献２には、手術部位に誤って残置されたタンポンまたは医療用吸引体について、繊維に固定したＸ線造影剤によりＸ線で検出可能であることが記述されている。
　上記の特許文献１では、移植用細胞シートを運搬するためのキャリアに対するＸ線検出について検討されていない。
　本発明の一態様によれば、以下のＸ線造影材料を含む樹脂フィルムが提供される。
１．　培養した細胞を載せる領域を含む第一の表面を有する樹脂層と、
　前記樹脂層の前記第一の表面上、前記第一の表面と反対側の第二の表面上、および前記樹脂層内の少なくとも一部に存在する、Ｘ線造影材料を含む層と、を備え、
　前記培養した細胞を載せる領域が、前記第一の表面のうち、前記Ｘ線造影材料が表面露出していないＸ線造影材料非存在領域の少なくとも一部に存在する、樹脂フィルム。
２．　１．に記載の樹脂フィルムであって、
　前記Ｘ線造影材料を含む層が、前記Ｘ線造影材料のパターンを含むＸ線造影層である、樹脂フィルム。
３．　１．に記載の樹脂フィルムであって、
　前記Ｘ線造影材料を含む層が、複数のフィラー状の前記Ｘ線造影材料と樹脂材料とを含む、Ｘ線造影樹脂層である、樹脂フィルム。
４．　１．から３．のいずれか一つに記載の樹脂フィルムにおいて、
　樹脂フィルムの厚さが、５μｍ以上２５０μｍ以下である、樹脂フィルム。
５．　１．から４．のいずれか一つに記載の樹脂フィルムにおいて、
　前記樹脂層が、ポリエーテルエーテルケトン、ポリエチレンテレフタレート、およびポリスチレンからなる群から選ばれる一または二以上を含む、樹脂フィルム。
６．　１．から５．のいずれか一つに記載の樹脂フィルムにおいて、
　前記Ｘ線造影材料が、Ｘ線吸収造影材料を含む、樹脂フィルム。
７．　１．から６．のいずれか一つに記載の樹脂フィルムにおいて、
　前記Ｘ線造影材料が、金属あるいは金属化合物を含む、樹脂フィルム。
８．　１．から７．のいずれか一つに記載の樹脂フィルムにおいて、
　前記第一の表面の法線方向から見たとき、前記Ｘ線造影材料を含む層が、当該樹脂フィルムの全体または一部のみに重なるように存在する、樹脂フィルム。
９．　２．に記載の樹脂フィルムにおいて、
　前記樹脂層の前記第一の表面上、および／または前記第一の表面と反対側の第二の表面上に存在する前記Ｘ線造影層の少なくとも一部の表面を保護する保護層を含む、樹脂フィルム。
１０．　１．から９．のいずれか一つに記載の樹脂フィルムにおいて、
　前記培養した細胞を載せる領域の前記第一の表面に、プラズマ処理が施されている、樹脂フィルム。
１１．　１．から１０．のいずれか一つに記載の樹脂フィルムにおいて、
　前記培養した細胞を載せる領域の前記第一の表面における、θ／２法で測定された水滴接触角θが７０°以下である、樹脂フィルム。
１２．　１．から１１．のいずれか一つに記載の樹脂フィルムにおいて、
　前記第一の表面の反対側の最も外側に存在する表面のＪＩＳ　Ｚ８７４１：１９９７の規定に準拠して測定した６０度鏡面光沢度Ｇｓ（６０°）が７００以下である、樹脂フィルム。
１３．　１．から１２．のいずれか一つに記載の樹脂フィルムにおいて、
　細胞を培養するため、および／または細胞を搬送するために用いる、樹脂フィルム。
　本発明によれば、Ｘ線検出性および細胞密着性に優れた樹脂フィルムを提供できる。
樹脂フィルムの第一実施態様を示す模式図である。 樹脂フィルムの第二実施態様を示す模式図である。 樹脂フィルムの第三実施態様を示す模式図である。 樹脂フィルムの第四実施態様を示す模式図である。 樹脂フィルムの第五実施態様を示す模式図である。 樹脂フィルムの第六実施態様を示す模式図である。 体内にて細胞移植後の患者の外観を肉眼で診た際の患者を示す模式図である。 体内にて本実施形態の樹脂フィルムを用いて細胞移植後の患者にＸ線を照射して診た際の患者を示す模式図である。 体内にてＸ線造影材料を含まない樹脂フィルムを用いて細胞移植後の患者にＸ線を照射して診た際の患者を示す模式図である。
　以下、本発明の実施の形態について、図面を用いて説明する。なお、すべての図面において、同様な構成要素には同様の符号を付し、適宜説明を省略する。また、図は概略図であり、実際の寸法比率とは一致していない。
　本実施形態の樹脂フィルムは、
　培養した細胞を載せる領域を含む第一の表面を有する樹脂層と、
　樹脂層の第一の表面上、第一の表面と反対側の第二の表面上、および樹脂層内の少なくとも一部に存在する、Ｘ線造影材料を含む層と、を備え、
　培養した細胞を載せる領域が、第一の表面のうち、Ｘ線造影材料が表面露出していないＸ線造影材料非存在領域の少なくとも一部に存在するものである。
　本実施形態の樹脂フィルムは、Ｘ線造影材料を含む層を有するため、患者の体内等の視認が困難な場所にある場合でも、Ｘ線により検出可能になる。
　また、Ｘ線造影材料が表面露出しないＸ線造影材料非存在領域では細胞シートと樹脂層の第一の表面とを密着させることができる。この樹脂フィルムは、Ｘ線造影材料非存在領域に培養した細胞を載せる領域（細胞搭載領域）が存在するため、細胞搭載領域の第一の表面において、細胞を培養することができる。また、細胞シートと樹脂層との密着性により、細胞シートの移送が容易になる。
　以上のことから、細胞移植時は細胞シートの移送を容易にし、移植後には使用済み樹脂フィルムを容易に検出できるようになる。
　図７は、体内にて細胞移植後の患者の外観を肉眼で診た際の患者１００を模式的に示す。可視光が透過／反射しない患者１００の体内は、肉眼による視認が困難である。
　図８は、体内にて本実施形態の樹脂フィルム１０２を用いて細胞移植後の患者にＸ線を照射して診た際の患者１０１を模式的に示す。本実施形態の樹脂フィルム１０２は、Ｘ線造影材料を含むため、このようにＸ線を照射することによって視覚化することができる。樹脂フィルムが患者１０１の体内等の視認が困難な場所に置かれていたとしてもＸ線により検出可能である。
　樹脂フィルムの検出方法では、具体的には、Ｘ線造影材料がＸ線を吸収／散乱することにより、Ｘ線が透過せず、Ｘ線画像においてＸ線非透過領域が白く表示される。Ｘ線検査は、一方向や二方向撮影等の多方向撮影により実施できる。
　図９は、体内にてＸ線造影材料を含まない樹脂フィルム１１２を用いて細胞移植後の患者にＸ線を照射して診た際の患者１１１を模式的に示す。細胞シートを移植するキャリアとしてＸ線造影材料を含まない樹脂フィルム１１２を使用して移植手術を施す。このとき、意図せず、樹脂フィルム１１２が体内に留置されていた場合には、外観から留置の有無について判別できない。
　ＰＥＥＫ等の樹脂材料は、Ｘ線に対する透過性が高い。
　このような樹脂材料をからなる樹脂フィルム１１２は、Ｘ線を吸収／散乱するものではないため、Ｘ線画像では、樹脂フィルム１１２の部分が黒く表示される。周囲にある体組織も黒く表示されるため、樹脂フィルム１１２の視認が困難となる。
　本実施形態の樹脂フィルムには、Ｘ線造影材料が含まれる。このＸ線造影材料は、第一の表面の細胞を載せる領域、すなわち樹脂層の第一の表面の少なくとも一部にＸ線造影材料を含まないＸ線造影材料非存在領域を少なくとも設ける限り、樹脂フィルムのどこに含めてもよく、例えば樹脂層の表面に含まれていてもよいし、樹脂層の内部に含まれていてもよい。
　本明細書では、上記の第一の表面上や第二の表面上において使用される「上」とは、表面に接触する位置、あるいは、表面に接せず、かつその直上の位置を意味する。後者の場合、表面と表面上に形成されるＸ線造影材料を含む層との間に、他の樹脂層等のラミネート層が存在していてもよい。
　また、本明細書では、樹脂層内の少なくとも一部に存在するとは、Ｘ線造影材料を含む層が、樹脂層の厚み方向および／または樹脂層の表面法線方向において、樹脂層の一部分のみの領域に、または、樹脂層の全部の領域に存在することを意味する。
　本実施形態の樹脂フィルムは、大別して、（Ａ）Ｘ線造影材料を含む層が、Ｘ線造影材料のパターンを含むＸ線造影層である形態、および（Ｂ）Ｘ線造影材料を含む層が、複数のフィラー状のＸ線造影材料と樹脂材料とを含むＸ線造影樹脂層である形態を含む。
　（Ａ）形態は、後述の第一実施形態（図１）、第二実施形態（図２）、第五実施態様（図５）、第六実施態様（図６）に対応し、（Ｂ）形態は、後述の第三実施形態（図３）、第四実施態様（図４）にそれぞれ対応する。
　（Ａ）形態におけるＸ線造影層は、例えば、Ｘ線造影材料を含むインクやペーストを用いて印刷等の公知の塗工方法により形成することが可能である。
　（Ｂ）形態のおけるＸ線造影樹脂層は、例えば、複数のフィラー状のＸ線造影材料と樹脂材料とを含む成形材料を公知のフィルム成形方法を用いて形成することが可能である。
　Ｘ線造影材料は、Ｘ線透過像を撮影した際に生体組織とは映り方が大きく異なる物質であればよく、Ｘ線吸収造影材料を含むことが好ましく、具体的には金属や金属化合物を含むことがより好ましい。
　Ｘ線造影材料は、例えば、Ｘ線造影フィラー（フィラー状のＸ線造影材料）又はＸ線造影フィラーを含むインクやペーストなどが好適に使用される。
　Ｘ線造影フィラーとしては、ジルコニア、硫酸バリウム、酸化バリウムなどの粒子が好適に使用される。Ｘ線造影フィラーを含むインクやペースト中のＸ線造影フィラーの含有量は、１～７０質量％程度であることが好ましい。
　あるいは、チタンや金、銀、プラチナなどの金属材料、あるいは金属酸化物もＸ線造影材料として好適に使用される。金属や金属酸化物は、樹脂層、後述の保護層、ラミネート層等に直接蒸着などの方法で形成しても良く、微粒子の形で添加しても良い。
　（Ａ）形態において、適切な顔料を含めてインクとして印刷技術を用いて、第一の表面の細胞を載せる領域以外の部分の少なくとも一部、または第二の表面の少なくとも一部にＸ線造影フィラーを含むインクやペーストを印刷することで、Ｘ線造影層（塗膜）を形成できる。
　印刷による方法の他に、例えば、Ｘ線造影材料を含ませる表面を粗面処理し、かかる粗面にＸ線造影材料を載せてもよいし、適切な接着剤を用いて接着させてもよい、また所定の箇所以外をマスクして蒸着などの方法で直接成膜してＸ線造影層を形成しても良い。
　（Ｂ）形態において、Ｘ線造影フィラーをポリマー材料に練り込むなどして混ぜて、フィルムを成形することで、複数のフィラー状のＸ線造影材料と樹脂材料とを含むＸ線造影樹脂層を得ることができる。
　Ｘ線造影フィラーを練り込んだポリマー材料からフィルムを成形する方法は、通常のフィルム成形法、例えば圧縮成形、押出成形、射出成形、カレンダー成形、熱成形などを用いることができる。
　このＸ線造影樹脂層は、Ｘ線造影材料を内部に含んだ樹脂層や、樹脂層に積層されるラミネート層を構成できる。Ｘ線造影樹脂層の表面において、Ｘ線造影フィラーの露出が抑制されていることが好ましい。例えば、Ｘ線造影フィラーの形状を異方性の少ない球形にし、粒径を樹脂層厚さより小さくし、ポリマー材料との濡れ性を高めることでＸ線造影フィラーの表面露出を抑制できる。例えば、Ｘ線造影樹脂層により構成される樹脂層の第一の表面の少なくとも一部にはＸ線造影フィラーが露出しないようにすることが好ましい。なお、Ｘ線造影材料を含む樹脂層中のＸ線造影材料の含有量は、１～７０質量％程度であることが好ましい。
　樹脂層の第一の表面の法線方向から見たとき、Ｘ線造影材料を含む層が、樹脂フィルムの全体または一部のみに重なるように存在してもよい。
　全体に重なるようにＸ線造影材料を含む層が存在する場合、樹脂フィルムのＸ線検出性をより高められる。
　一方、樹脂層が引裂や引張に所定以上の耐性がある樹脂材料を有する場合、一部のみに重なるようにＸ線造影材料を含む層が存在してもよい。これにより、全体に形成される場合と比べ、樹脂フィルムの製造コストを低減できる。
　また、第一の表面の法線方向（上面視）から見たとき、樹脂層の外周縁の近傍には、Ｘ線造影材料を含む層が存在しないように構成されてもよい。これにより、樹脂フィルムの丸まりを抑制できる。とくに、樹脂フィルムの上面視の形状が円形の場合、丸まり抑制が効果的に得られる。
　また、樹脂フィルムは、樹脂層の少なくとも一部、例えばＸ線造影材料を含む部分の表面を保護する保護層を含んでいてもよい。具体的には、この保護層は、樹脂層の第一の表面上、および／または第一の表面と反対側の第二の表面上に存在するＸ線造影層の少なくとも一部のまたは全部の表面を被覆して保護してもよい。
　保護層としては、ＳｉＯＸ、ＳｉＮＸ、ＳｎＯＸ、ＴｉＯＸ、ＡｌＯＸなどの無機酸化物や無機窒化物を含む無機系保護層、アクリレート系の光硬化樹脂や熱硬化樹脂、カチオン重合紫外線硬化エポキシ樹脂などの有機系保護層、光硬化有機／無機ハイブリットハードコート剤などの有機無機ハイブリッド／コンポジット保護層などが好適に用いられる。特に、Ｘ線造影層がインクやペーストからなる場合、その上に保護層を設けることが好ましい。保護層によりＸ線造影層の表面における平坦性を高められる。また、保護層により、培地や凍結保存液、細胞シートなどへのＸ線造影材料の溶出を抑制することができる。
　また、樹脂フィルムは、樹脂層の表面の少なくとも一部に積層する、Ｘ線造影材料を含むラミネート層を有してもよい。この場合、ラミネート層を樹脂層の第一の表面の反対側の第二の表面に設け、前記第一の表面の全体がＸ線造影材料非存在領域となることが好ましい。なお、ラミネート層としては、樹脂フィルムと同種のフィルム、異種のフィルムどちらでも好ましく使用できるが、樹脂フィルムと同じく、透明で比重が１．０ｇ／ｃｍ３より大きく、各種耐久性や機械的強度、加工性に優れる材料であることが好ましいため、特にポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）フィルムやポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）フィルムが好適に用いられる。
　また、樹脂フィルムを細胞培養の足場として用いる場合、保護層およびラミネート層に使用する材料としては、培養液に溶解せず、薄くて比重が大きいものが好ましい。
　保護層またはラミネート層は、樹脂層と直接積層させてもよいし、接着層を介在させて積層させてもよい。このような接着層としては、フィルムの接着剤として一般的に使用される材料を用いることができる。例えば、エステル系やエーテル系の接着剤を使用することができる。
　また、培養した細胞を載せた樹脂シートを細胞移植手術の際に、内視鏡で確認しながら行うことを想定して、視認性を確保するという観点から、前記第一の表面とは反対側の樹脂フィルムの面において光沢性が抑えられていることが好ましい。
　光沢性が抑えられているとは、例えばＪＩＳ　Ｚ８７４１：１９９７の規定に準拠して測定した６０度鏡面光沢度Ｇｓ（６０°）が７００以下、好ましくは４００以下であることを指す。測定は第一の面と反対側の樹脂フィルムの面の任意の箇所で行うことができる。反対側の樹脂フィルムの面としては、例えば、Ｘ線造影樹脂層により構成される樹脂層や樹脂層に積層されるラミネート層の表面、Ｘ線造影層を第一の表面に備える樹脂層の第二の表面、樹脂層の第二の表面に形成されたＸ線造影層を保護する保護層の表面などが挙げられる。
　また、樹脂層の第一の表面における培養した細胞を載せる領域の一部または全部が、プラズマ処理等の親水化処理が施されていてもよい。
　樹脂層の第一の表面は、培養した細胞を載せるという観点から、少なくとも細胞を載せる領域については、親水化処理により親水性表面であることが好ましい。親水性表面とは、θ／２法で測定された水滴接触角θが、７０°以下、好ましくは６５°以下、より好ましくは５５°以下である表面を指す。
　水滴接触角θは、第一の表面に、２５℃環境下、２μｌの純水を置き、ＩＳＯ１９４０３－２：２０１７に準拠したθ／２法にて、水滴と第一の表面とのなす角を接触角計で測定する。このような表面とすることにより、培養した細胞との密着性を確保することが容易になる。
　また、第一の表面の細胞を載せる領域の一部または全部が、Ｘ線造影材料非存在領域に存在することが好ましい。
　第一の表面のうち、Ｘ線造影材料非存在領域は、５０％以上を占めていることが好ましく、８０％以上を占めていることがより好ましく、１００％であることが特に好ましい。
　なお、第一の表面にＸ線造影材料を含める場合、親水性処理を施さない領域の少なくとも一部あるいは細胞を播種しない領域が存在する場合には、この部分の少なくとも一部にＸ線造影材料を載せてもよい。
　以下、各実施形態について詳述する。
　図１に、本発明の樹脂フィルムの第一実施態様を示す。
　樹脂フィルム１１は、樹脂層１２および、樹脂層１２の第二の表面１５に設けられたＸ線造影材料を含むＸ線造影層１３を有する。また、樹脂層１２の第一の表面１４には、Ｘ線造影材料非存在領域１６が設けられている。
　Ｘ線造影層１３は、その一部または全部がＸ線不透過パターンとなる。Ｘ線不透過パターンの間は、空隙でもよいが、樹脂材料が充填されていてもよい。
　たとえば、樹脂フィルム１１の断面視において、Ｘ線造影層１３には、樹脂材料からなるパターンとＸ線不透過パターンとが含まれてもよく、スリット状のＸ線不透過パターンが複数、離間して配列されていてもよい。
　図１において、樹脂層１２の第二の表面１５の全体にＸ線造影層１３が設けられた例が示されているが、この第二の表面１５の一部にのみ設けられていてもよく、所定のパターンを形成してもよい。所定のパターンとしては、所定の模様、図形、文字、記号などが挙げられる。
　パターンは、表裏非対称形状を有してもよい。これにより、樹脂フィルムの表裏視認性を高められる。模様として、チェック柄、ドット柄、ストライプ柄などが挙げられる。樹脂フィルムの丸まり抑制の観点から、個々の模様が違いに離間した柄、具体的には、ドット柄が好ましい。
　また、樹脂層１２の第一の表面１４および／または第二の表面１５には、温度で色や状態が変化する物質を含む層を有していてもよい。
　また、Ｘ線造影材料非存在領域１６は、第一の表面１４の一部または全体に設けられてもよく、この部分は親水化処理を施すことによって細胞を載せる領域とすることができる。
　図２に、本発明の樹脂フィルムの第二実施態様を示す。
　樹脂フィルム２１は、樹脂層２２および樹脂層２２の第一の表面２４の一部に設けられたＸ線造影材料を含むＸ線造影層２３を有する。さらに、樹脂層２２の第一の表面２４には、Ｘ線造影材料非存在領域２６が設けられている。本実施形態では、樹脂層２２の第二の表面２５にはＸ線造影材料は設けられていない。
　図２において、Ｘ線造影材料は樹脂層２２の第一の表面２４にて所定のパターンを形成してもよい。Ｘ線造影材料非存在領域２６は、親水化処理を施すことによって細胞を載せる領域とすることができる。
　図３に、本発明の樹脂フィルムの第三実施態様を示す。
　樹脂フィルム３１は、Ｘ線造影材料として内部に埋め込まれたＸ線造影フィラー３７を含む樹脂層３２を有する。また、樹脂層３２の第一の表面３４には、Ｘ線造影材料非存在領域３６が設けられている。
　図３において、Ｘ線造影フィラー３７が樹脂層３２の内部に埋め込まれているため、少なくともＸ線造影フィラー３７が第一の表面３４側に露出することがなく、Ｘ線造影材料非存在領域３６を形成することができる。このＸ線造影材料非存在領域３６は、第一の表面３４の一部または全体に設けられてもよく、この部分は親水化処理を施すことによって細胞を載せる領域とすることができる。
　図４に、本発明の樹脂フィルムの第四実施態様を示す。
　樹脂フィルム４１は、樹脂層４２および樹脂層４２の第二の表面４５に積層された、Ｘ線造影材料を含むラミネート層４７を有する。また、樹脂層４２の第一の表面４４には、Ｘ線造影材料非存在領域４６が設けられている。
　図４において、樹脂層４２の第二の表面４５の全体にラミネート層４７が積層された例が示されているが、この第二の表面４５の一部を覆うように積層されていてもよい。
　また、Ｘ線造影材料非存在領域４６は、第一の表面４４の一部または全体に設けられてもよく、この部分は親水化処理を施すことによって細胞を載せる領域とすることができる。
　図５に、本発明の樹脂フィルムの第五実施態様を示す。
　樹脂フィルム５１は、樹脂層５２、樹脂層５２の第二の表面５５に設けられた、Ｘ線造影材料を含むＸ線造影層５３およびＸ線造影層５３を覆うように積層されたラミネート層５７を含む。また、樹脂層５２の第一の表面５４には、Ｘ線造影材料非存在領域５６が設けられている。
　図５において、樹脂層５２の第二の表面５５の全体にＸ線造影層５３が設けられた例が示されているが、この第二の表面５５の一部にのみ設けられていてもよく、所定のパターンを形成してもよい。同様に、ラミネート層５７も第二の表面５５の一部を覆うように積層させていてもよく、この場合、ラミネート層５７はＸ線造影層５３の全部を覆っていても、一部を覆っていてもよい。
　また、Ｘ線造影材料非存在領域５６は、第一の表面５４の一部または全体に設けられてもよく、この部分は親水化処理を施すことによって細胞を載せる領域とすることができる。
　図６に、本発明の樹脂フィルムの第六実施態様を示す。
　樹脂フィルム６１は、樹脂層６２、樹脂層６２の第二の表面６５に設けられたＸ線造影材料を含むＸ線造影層６３、およびＸ線造影層６３を保護する保護層６７を有する。また、樹脂層６２の第一の表面６４には、Ｘ線造影材料非存在領域６６が設けられている。
　図６において、樹脂層６２の第二の表面６５の全体にＸ線造影層６３が設けられた例が示されているが、図１の態様と同様に、この第二の表面６５の一部にのみ設けられていてもよく、Ｘ線造影材料の所定のパターンを形成してもよい。保護層６７も、少なくともＸ線造影層６３が設けられている部分を覆うことで足りる。
　また、Ｘ線造影材料非存在領域６６は、第一の表面６４の一部または全体に設けられてもよく、この部分は親水化処理を施すことによって細胞を載せる領域とすることができる。
　本発明の樹脂フォルムの製造方法の一例について説明する。
（樹脂層にＸ線造影材料を含める樹脂フィルムを形成する方法）
　図１に示した第一の実施形態、図２に示した第二の実施形態、図３に示した第三の実施形態および図６に示した第六の実施形態の製造方法について説明する。
　樹脂層として用いる材料、例えばＰＥＥＫフィルムの一の表面を親水化処理する。この親水化処理は、例えば、ＵＶオゾン処理、プラズマ処理等が挙げられる。このようにすることで細胞との密着性が確保された、培養した細胞を載せる領域となる。
　なお、親水化処理は、樹脂層の表面にＸ線造影材料を含ませた後、さらに保護層を形成した後、又は樹脂層の内部にＸ線造影材料を含ませた後、に行ってもよい。
　次に、樹脂層の第一の表面の細胞を載せる領域以外の部分の少なくとも一部、および／または第二の表面の少なくとも一部にＸ線造影材料を含ませる。なお、第一の表面のＸ線造影材料を含まない領域は、Ｘ線造影材料非存在領域となる。
　また、特に樹脂層の表面にＸ線造影材料を含める場合には、このＸ線造影材料を含む部分を保護する保護層を設けることが好ましい。
　この保護層を設ける方法としては、Ｘ線造影材料が載った部分を選択的に保護するような蒸着法による蒸着膜を形成する方法、あるいは特に第一の表面の裏面にＸ線造影材料を載せた場合、保護層となるポリマー材料を塗布液としてこの面に塗布し、その後溶媒を除去することにより塗布膜を形成して保護膜としてもよい。
（ラミネート層を用いて樹脂フィルムを形成する方法）
　（Ｘ線造影材料を含むラミネート層を用いる場合）
　図４に示した第四の実施形態の製造方法について説明する。
　ラミネート層としてのＸ線造影材料を含んだフィルムを作製する。Ｘ線造影材料は、このフィルムの表面に含めても、内部に含めてもよく、含める方法は上述したような樹脂層の表面にＸ線造影材料を含ませる場合、あるいは樹脂層の内部にＸ線造影材料を含ませる場合に準じた方法にて、Ｘ線造影材料を含んだフィルムを得ることができる。
　続いて、細胞を載せる領域を含む樹脂層に、Ｘ線造影材料を含んだフィルムをラミネート層として積層し、樹脂フィルムを得る。その後、ラミネート層を設けた面とは反対側の樹脂層の面を親水化処理する。このようにすることで細胞との密着性が確保された、培養した細胞を載せる領域となる。このように、第一の表面にはラミネート層を積層させないため、樹脂層の第一の表面はＸ線造影材料非存在領域となる。また、樹脂層とラミネート層とを積層させる際、接着剤を用いてもよい。
　（Ｘ線造影層を含まないラミネート層を用いる場合）
　図５に示した第五の実施形態の製造方法について説明する。
　ラミネート層樹脂層の第二の表面にＸ線造影層を設けることについては前述したとおりである。
　続いて、樹脂層のＸ線造影層を設けた側に、Ｘ線造影層を覆うようにフィルムをラミネート層として積層し、樹脂フィルムを得る。その後、ラミネート層を設けた面とは反対側の樹脂層の面を親水化処理する。このようにすることで細胞との密着性が確保された、培養した細胞を載せる領域となる。Ｘ線造影層は第一の表面とは反対側の第二の表面に設けられているため、樹脂層の第一の表面はＸ線造影材料非存在領域となる。また、樹脂層とラミネート層とを積層させる際、接着剤を用いてもよい。
　ラミネート層を用いて樹脂フィルムを作製するに際して、いずれの場合においても樹脂層にラミネート層を積層させる際に、Ｘ線造影材料がラミネート層の積層面とは反対側の裏面に露出する場合には、上述した方法により保護層をさらに設けてもよい。
　以下、樹脂フィルムの各構成について詳述する。
　本実施形態の樹脂フィルムは、培養した細胞を載せる第一の表面を有する樹脂層を含む樹脂フィルムである。この第一の表面には細胞を載せる領域が設けられ、この細胞を載せる領域は、第一の表面において５０％以上を占めていることが好ましく、８０％以上を占めていることがより好ましく、１００％であることが特に好ましい。
　ここで、第一の表面に載せる細胞としては、移植を容易にするために細胞シートであることが好ましい。また、このような細胞は他所で培養した細胞をシート状にしたものでもよいし、第一の表面にて培養した細胞であってもよい。なお、第一の表面にて細胞を培養させる場合には、当該第一の表面は細胞を培養するための足場として機能し、培養状況を顕微鏡での透過光観察などで観察することを容易にするために樹脂フィルムは透明であることが好ましい。
　本実施形態の樹脂フィルムは、Ｘ線造影材料を含まないＸ線造影材料非存在領域に設けた第一の表面に、培養した細胞を載せて使用される。
　具体的には、皮膚あるいは虚血性心筋症、肺術後気漏、内視鏡的食道粘膜下層剥離術後の狭窄などの様々な疾患や術後合併症予防に対する細胞移植手術などにて、培養した細胞、例えば細胞シートを樹脂フィルムに載せて、移植場所に培養した細胞を移送する。この際には、樹脂フィルムと培養した細胞との密着性は十分に確保され、かつ、樹脂フィルムは自立膜として機能するため、細胞の移送は容易になる。そして、移植場所において、樹脂フィルムから細胞を剥離した後、使用済みの樹脂フィルムを除去する。
　樹脂フィルムは、有機高分子材料を含んでもよく、コラーゲンフィルムや羊膜などの生体膜を含まないように構成されてもよい。基材に生体膜を用いた場合、生体膜上に形成された細胞シートをすぐに剥離することができない傾向にある。これに対して、有機高分子材料を含む樹脂フィルムは、細胞搭載領域（培養面）上に形成された細胞シートを移植先に貼り付けた後、すぐに細胞シートから剥離することができる。貼り付け後から剥離するまでの時間を１０分以下としてもよい。
　樹脂フィルムを構成する材料（以後、樹脂材料とも呼ぶ）として、具体的には、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリブチレンテレフタレート（ＰＢＴ）、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、変性ポリフェニレンエーテル（ｍＰＰＥ）、ポリフェニレンスルフィド（ＰＰＳ）、ポリスルフォン（ＰＳＵ）、ポリアリレート（ＰＡＲ）、液晶ポリマー（ＬＣＰ）、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ナイロン６６（Ｎ６６）、エチレン・テトラフルオロエチレン共重合体（ＥＴＦＥ）、テトラフルオロエチレン・パーフルオロアルキルビニルエーテル共重合体（ＰＦＡ）、アクリルニトリル・ブタジエン・スチレン共重合体（ＡＢＳ）、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、シリコン、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、ポリアセタール（ＰＯＭ）、ポリイミド（ＰＩ）、ポリアミド（ＰＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、フィブロイン、セルロース、再生セルロース、環状オレフィンポリマー、ゼラチン、コラーゲン等の有機高分子材料が挙げられる。
　特に、樹脂材料として、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリブチレンテレフタレート（ＰＢＴ）、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、変性ポリフェニレンエーテル（ｍＰＰＥ）、ポリフェニレンスルフィド（ＰＰＳ）、ポリスルフォン（ＰＳＵ）、ポリアリレート（ＰＡＲ）、液晶ポリマー（ＬＣＰ）、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ナイロン６６（Ｎ６６）、エチレン・テトラフルオロエチレン共重合体（ＥＴＦＥ）、テトラフルオロエチレン・パーフルオロアルキルビニルエーテル共重合体（ＰＦＡ）、アクリルニトリル・ブタジエン・スチレン共重合体（ＡＢＳ）、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、シリコーン、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、ポリアセタール（ＰＯＭ）、ポリイミド（ＰＩ）、ポリアミド（ＰＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、環状オレフィンポリマー等の合成高分子材料が挙げられる。
　樹脂層として用いられる材料としては、例えば、透明で比重が１．０ｇ／ｃｍ３より大きく、各種耐久性や機械的強度、加工性に優れる材料であることが好ましい。
　樹脂フィルムの一例は、これらの樹脂材料の少なくとも１つを主成分に含むフィルムで構成されていてもよく、好ましくはポリエーテルエーテルケトンフィルム、ポリエチレンテレフタレートフィルムまたはポリスチレンフィルム、より好ましくはポリエーテルエーテルケトンフィルムである。
　樹脂フィルムは、上記樹脂材料からなる樹脂層を１層または２層以上含むものが好ましい。２層以上の樹脂層は、互いに異なる種類の材料を含んでもよい。
　樹脂フィルムは、上記材料からなる樹脂層を含む樹脂基材からなる構成であってもよく、上記材料からなる樹脂層と他の材料からなる樹脂層および／または無機層とを含むラミネート基材からなる構成でもよい。ただし、樹脂層には、パリレンなどの化学蒸着によって形成される層やウェットコーティング層は含まなくてよい。また、ラミネート基材における無機層は、ガラスを含まないことが好ましく、金属箔を含んでもよい。また、樹脂フィルムは、細胞搭載領域側に不織布および繊維基材を含まないことが好ましい。
　ＰＥＥＫを含む樹脂フィルムは、低線膨張係数、耐溶剤性、耐熱性の観点から総合的に検討すると、ＰＥＴを含む場合と比べて好ましい。
　また、樹脂フィルムは、培地よりも比重が高い材料で構成されているものが好ましい。
　樹脂フィルムは、透明であってもよい。透明とは、ヘイズ値が３０％以下を意味する。
　透明性を有する樹脂フィルムにおいても、コントラスト比を有するため、刻印３０の視認性に優れる。
　樹脂フィルムの細胞搭載領域を含む表面は、親水化処理が施されていることが好ましい。これにより、細胞密着性を向上できる。この親水化処理は、例えば、ＵＶオゾン処理、プラズマ処理等が挙げられる。
　この中でも、細胞搭載領域がプラズマ処理された樹脂フィルムを用いることが好ましい。
　本明細書において、親水化された面とは、θ／２法で測定された水滴接触角θの上限が７０°以下である表面を意味する。一方、親水化された面の水滴接触角θの下限は３°以上が好ましいが、これに限定されない。水滴接触角θは、基材に、２５℃環境下、２μｌの純水を置き、ＩＳＯ　１９４０３－２：２０１７に準拠したθ／２法にて、水滴と基材とのなす角を接触角計で測定する。
　また、親水化処理された培養面の表面粗さＲａの下限が、０．３ｎｍ以上、好ましくは０．５ｎｍ以上であり、上限が１００ｎｍ以下、好ましくは１０ｎｍ以下、より好ましくは２ｎｍ以下である。
　なお、ここでの表面粗さＲａとは、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）にて測定した表面形状データを用いて、一辺１００ｎｍの正方形の領域における算術平均粗さを指す。
　表面の法線方向における樹脂フィルムの形状は、円形が好ましいが、他の形状であってもよく、例えば、正方形、正五角形、正六角形、正八角形等の正多角形や、長円形、矩形等であってもよい。
　樹脂フィルムの厚さは、薄すぎると鑷子で樹脂フィルムの一端を保持するだけでシート形状を保持したまま取り扱うことが困難なことがあり、また厚すぎると曲率が高い患部に良好に沿わすことが困難になることがあるという用途に即した取扱性の観点から、例えば、５～２５０μｍとしてもよい。樹脂フィルムの厚さとは、樹脂層単独の厚さ、または、保護層やラミネート層がある場合は、樹脂層と保護層やラミネートを含めた合計の厚さをいう。
　基材厚みの下限値としては、好ましくは５μｍ以上、より好ましくは６μｍ以上、さらに好ましくは８μｍ以上、１０μｍ以上、１２μｍ以上である。一方、基材厚みの上限値としては、好ましくは１００μｍ以下、より好ましくは５０μｍ以下、３０μｍ以下、２５μｍ以下、さらに好ましくは２０μｍ以下である。例えば、樹脂フィルムの基材厚みは、６μｍ以上５０μｍ以下、８μｍ以上３０μｍ以下、又は１０μｍ以上２０μｍ以下である。
　また、上記下限値以上とすることにより、樹脂フィルムが搬送時に破れたり丸まってしまったりすることを防げ、取り扱い性を向上できる。上記上限値以下とすることにより、移植時に患部への追従性を向上できる。
　なお、厚み方向の断面視における樹脂フィルムは、全体の表面が平坦なシート状を有してもよい。
　また、培養時における自立膜として機能する観点から、樹脂フィルムの基材厚みの下限は、１０μｍ越えが好ましく、１１μｍ以上がより好ましく、１２μｍ以上がさらに好ましい。これにより、基材厚みが１０μｍ越えの樹脂フィルムを用いることにより、細胞培養工程時において、樹脂フィルムを培養容器の内部に固定または固着しない状態で、細胞シートを製造することが可能となる。
　自立膜とは、樹脂フィルムの細胞搭載領域の平面状態が、培地中でも維持される膜であることが好ましく、細胞搭載領域上に細胞シートが形成された後も平面状態が維持されることがより好ましい。細胞搭載領域の平面状態が維持されるため、丸まらない樹脂フィルムは、固着しないで培地中での細胞培養特性を高められる。
　また、この自立膜は、鑷子で一端を摘まんで持ち上げたとき、シート形状を一定程度保持できるものであってもよい。
　表面法線方向から見たとき、樹脂フィルムは、細胞搭載領域が形成された領域に表裏面を貫通する開口部を有しないものが好ましく、培養容器に設置したとき、培養容器の底面が露出する開口部を有しないことが好ましい。すなわち、樹脂フィルムは、環状構造ではなく、細胞搭載領域が形成された領域は中実であることが好ましい。
　樹脂フィルムの面積は、特に制限されるものではないが、例えば、０．３ｃｍ２以上１０００ｃｍ２以下である。樹脂フィルムの面積の下限値としては、０．６ｃｍ２以上、１．６ｃｍ２以上３ｃｍ２以上、４ｃｍ２以上、５ｃｍ２以上、６ｃｍ２以上、７ｃｍ２以上、８ｃｍ２以上又は１０ｃｍ２以上であってもよい。一方、樹脂フィルムの面積の上限値としては、より好ましくは９００ｃｍ２以下、更に好ましくは８００ｃｍ２以下、特に好ましくは５００ｃｍ２以下であり、１００ｃｍ２以下、５０ｃｍ２以下又は２０ｃｍ２以下であってもよい。例えば、樹脂フィルムの面積は、０．６ｃｍ２以上９００ｃｍ２以下、１．６ｃｍ２以上８００ｃｍ２以下、３ｃｍ２以上５００ｃｍ２以下、６ｃｍ２以上１００ｃｍ２以下、８ｃｍ２以上５０ｃｍ２以下又は１０ｃｍ２以上２０ｃｍ２以下である。
　樹脂フィルムの細胞搭載領域を、レーザー顕微鏡で測定した際に、１００μｍ四方の範囲に、直径１μｍ以上１００μｍ以下、かつ深さ０．５μｍ以上１００μｍ以下の穴が３つ以下である樹脂フィルムである。前記穴の直径は、例えば１μｍ以上１００μｍ以下、好ましくは２μｍ以上５０μｍ以下、より好ましくは３μｍ以上３０μｍ以下である。前記穴の深さは、例えば０．５μｍ以上１００μｍ以下、好ましくは１μｍ以上５０μｍ以下、より好ましくは２μｍ以上２０μｍ以下である。
　穴の直径と穴の深さの範囲の組み合わせは、例えば穴の直径が１μｍ以上１００μｍ以下かつ穴の深さが０．５μｍ以上１００μｍ以下、穴の直径が１μｍ以上１００μｍ以下かつ穴の深さが１μｍ以上５０μｍ以下、穴の直径が１μｍ以上１００μｍ以下かつ穴の深さが２μｍ以上２０μｍ以下、穴の直径が２μｍ以上５０μｍ以下かつ穴の深さが０．５μｍ以上１００μｍ以下、穴の直径が２μｍ以上５０μｍ以下かつ穴の深さが１μｍ以上５０μｍ以下、穴の直径が２μｍ以上５０μｍ以下かつ穴の深さが２μｍ以上２０μｍ以下、穴の直径が３μｍ以上３０μｍ以下かつ穴の深さが０．５μｍ以上１００μｍ以下、穴の直径が３μｍ以上３０μｍ以下かつ穴の深さが１μｍ以上５０μｍ以下、穴の直径が３μｍ以上３０μｍ以下かつ穴の深さが２μｍ以上２０μｍ以下である。
　また、樹脂フィルムの空隙率の上限は、例えば、１５％以下、好ましくは１０％以下、より好ましくは５％以下である。一方、樹脂フィルムの空隙率の下限は、とくに限定されないが、０％以上でもよい。
　細胞搭載領域の上記穴が３つ以下であること、および／または、樹脂フィルムの空隙率を上記上限値以下とすることにより、細胞シートとの密着力を適度なものとすることができる。
　なお、穴の有無は、樹脂フィルムが細胞搭載領域側に形成される樹脂層の表面を測定対象としてもよい。
　空隙率は、理論密度と実測密度から算出する。具体的には、空隙率＝｛１－（実密度／理論密度）｝×１００の計算式により算出する。
　樹脂フィルムは、細胞搭載領域が形成された表面に温度応答性ポリマーを含む層が形成されなくてもよい。
　これにより、凍結保存工程などの低温環境下で、細胞シートと樹脂フィルムとの密着性が低下することを抑制できる。
　上記の温度応答性ポリマーは、細胞を培養する際の温度で細胞接着性を発揮し、そこから温度変化を行うことで細胞非接着性を発揮して細胞シートを容易に剥離することが可能となる材料である。温度応答性ポリマーが細胞接着性を発揮する温度領域が１０℃～４５℃、特に３３℃～４０℃の範囲であると、細胞を安定的に培養することができ好ましい。また、温度応答性ポリマーが細胞非接着性を発揮する温度領域は、１℃～３６℃、特に４℃～３２℃の範囲内であると、細胞シートの剥離に与えるダメージを減らすことができるため好ましい。温度応答性ポリマーを構成する材料としては、具体的には、ポリ－Ｎ－イソプロピルアクリルアミド（ＰＮＩＰＡＡｍ）、ポリ－Ｎ－ｎ－プロピルアクリルアミド、ポリ－Ｎ－ｎ－プロピルメタクリルアミド、ポリ－Ｎ－エトキシエチルアクリルアミド、ポリ－Ｎ－テトラヒドロフルフリルアクリルアミド、ポリ－Ｎ－テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド、および、ポリ－Ｎ，Ｎ－ジエチルアクリルアミドなどの温度応答性高分子を挙げることができ、なかでもＰＮＩＰＡＡｍ、ポリ－Ｎ－ｎ－プロピルメタクリルアミド、ポリ－Ｎ，Ｎ－ジエチルアクリルアミドが好ましい。
　なお、培養容器の底面も、温度応答性ポリマーを含まないように構成されてもよい。
　次に、細胞シート付樹脂フィルムおよびその製造方法について説明する。
　本実施形態の細胞シート付樹脂フィルムは、
　上述の樹脂フィルムと、
　樹脂フィルムの第一の表面の細胞搭載領域上に設けられた細胞シートと、を含む。
　本実施形態の細胞シート付樹脂フィルムの製造方法の一例は、
　培養容器内に、上述の樹脂フィルムを入れる設置工程と、
　培養容器内に培地Ｐを入れ、細胞を播種し、樹脂フィルムの第一の表面の細胞搭載領域上に細胞シートを培養する培養工程と、
　細胞シート付樹脂フィルムを培養容器内から取り出す取出工程と、を含む。
　設置工程は、培養容器内の樹脂フィルムの上にリング部材を設置する工程を含んでもよい。
　また、取出工程は、リング部材を樹脂フィルムの上から除去する工程を含んでもよい。
　細胞は、細胞、組織、臓器の欠損及び機能障害、機能不全に関連する症状を治療又は予防するための臨床上有用な細胞、非臨床試験などで使用する培養可能な細胞であって、生体から分離された細胞あれば、特に制限されるものではない。
　細胞としては、例えば、生体組織細胞、間葉系組織に属する細胞に分化する能力を有する間葉系幹細胞、様々な生体組織に分化する能力を有する多能性幹細胞、分化誘導される幹細胞や前駆細胞などが挙げられる。なお、細胞は、接着細胞であっても浮遊細胞であってもよい。
　生体組織細胞の具体例としては、例えば、線維芽細胞、筋線維芽細胞、角膜上皮細胞、網膜細胞、神経細胞、筋細胞、心筋細胞、筋芽細胞、骨細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、肝細胞、膵細胞、腎細胞、歯肉細胞、骨膜細胞、皮膚細胞、内皮細胞などが挙げられる。
　間葉系幹細胞の具体例としては、例えば、脂肪組織由来間葉系幹細胞、骨髄由来間葉系幹細胞、臍帯血由来間葉系幹細胞、臍帯由来間葉系幹細胞などが挙げられる。
　多能性幹細胞の具体例としては、例えば、誘導多能性幹細胞、胚性幹細胞、核移植胚性幹細胞、胚性腫瘍細胞、胚性生殖細胞などが挙げられる。
　また、これらの細胞は、単独で培養してもよいし、二種以上を組み合わせて培養してもよい。これらの細胞については、細胞の用途などに応じて公知のものから適宜設定すればよい。
　なお、細胞の由来は、特に制限されるものではないが、例えば、哺乳類、鳥類、両生類、魚類、昆虫、植物、微生物などが挙げられる。哺乳類及び鳥類の具体例としては、例えば、ヒト、サル、チンパンジー、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウス、ラット、ニワトリなどが挙げられる。
　細胞シートは、細胞同士が接着分子、細胞外マトリックスなどを介して物理的、機能的に連結してシート構造を有するものである。
　細胞シートは、１の細胞層から構成される単層構造であってもよいし、２以上の細胞層から構成される積層構造でもよい。積層構造としては、特に制限されるものではないが、２層、３層、４層、５層などの多層構造が挙げられる。
　細胞シートが多層構造を持つ場合、樹脂フィルムで培養した際に多層構造が得られることもあるし、単層構造を持つ細胞シートを積層して得ることもできる。特に、本発明の細胞シート付樹脂フィルムを複数用意し、ある細胞シートの上に別の細胞シートを重ね合わせ、別の細胞シートから培養キャリア基材を剥がすことで、多層構造を持つ細胞シートを得ることができる。
　細胞シートの厚みは、特に制限されるものではないが、例えば、０．００１ｍｍ以上２．０ｍｍ以下である。細胞シートの厚みの下限値としては、より好ましくは０．０１ｍｍ以上、更に好ましくは０．０３ｍｍ以上、特に好ましくは０．０５ｍｍ以上である。一方、細胞シートの厚みの上限値としては、より好ましくは１．５ｍｍ以下、更に好ましくは１．２ｍｍ以下、特に好ましくは１．０ｍｍ以下である。細胞シートの厚みは例えば、０．００１ｍｍ以上２．０ｍｍ以下、０．００１ｍｍ以上１．５ｍｍ以下、０．００１ｍｍ以上１．２ｍｍ以下、０．００１ｍｍ以上１．０ｍｍ以下、０．０１ｍｍ以上２．０ｍｍ以下、０．０１ｍｍ以上１．５ｍｍ以下、０．０１ｍｍ以上１．２ｍｍ以下、０．０１ｍｍ以上１．０ｍｍ以下、０．０３ｍｍ以上２．０ｍｍ以下、０．０３ｍｍ以上１．５ｍｍ以下、０．０３ｍｍ以上１．２ｍｍ以下、０．０３ｍｍ以上１．０ｍｍ以下、０．０５ｍｍ以上２．０ｍｍ以下、０．０５ｍｍ以上１．５ｍｍ以下、０．０５ｍｍ以上１．２ｍｍ以下、０．０５ｍｍ以上１．０ｍｍ以下である。細胞シートの厚みを上記範囲とすることにより、細胞シート内での高い細胞活性率、及び細胞移植に有利な優れた形状維持能を発揮することができる。
　細胞シートの面積は、特に制限されるものではないが、例えば、０．３ｃｍ２以上１０００ｃｍ２以下である。細胞シートの面積の下限値としては、０．６ｃｍ２以上、１．６ｃｍ２以上、３ｃｍ２以上、４ｃｍ２以上、５ｃｍ２以上、６ｃｍ２以上、７ｃｍ２以上、８ｃｍ２以上又は１０ｃｍ２以上であってもよい。一方、細胞シートの面積の上限値としては、より好ましくは９００ｃｍ２以下、更に好ましくは８００ｃｍ２以下、特に好ましくは５００ｃｍ２以下であり、１００ｃｍ２以下、５０ｃｍ２以下又は２０ｃｍ２以下であってもよい。例えば、細胞シートの面積は、０．６ｃｍ２以上９００ｃｍ２以下、１．６ｃｍ２以上８００ｃｍ２以下、３ｃｍ２以上５００ｃｍ２以下、６ｃｍ２以上１００ｃｍ２以下、８ｃｍ２以上５０ｃｍ２以下又は１０ｃｍ２以上２０ｃｍ２以下である。従来、細胞シート単独での移植の際は、細胞シートの強度は低いため、大面積の場合は搬送時に破損する可能性が高かったが、本開示においては、細胞シートが培養キャリア基材に支持されているため、移植時に細胞シートが破れることを防ぐことができるため、細胞シートの大きさを８ｃｍ２以上に大きくできる。また、大きく細胞シートを作製し、適宜患部のサイズに調製して使用することもできる。
　なお、細胞シート付き樹脂フィルムにおいて、細胞シートの下面の全体が、樹脂フィルムの表面（細胞搭載領域）に重なるように配置されていることが好ましい。
　細胞培養は、特に制限されるものではなく、医療、医薬品、医薬部外品、化粧品、食品、動物用薬品などの技術分野、及び再生医療、生物工学などの基礎技術分野において使用されている通常の手段を用いることができる。
　培養条件は、培養細胞を目的とする状態にできるのであれば、特に制限されるものではない。一般的な培養条件としては、例えば、調製した基礎培地を用いた３７℃、５％ＣＯ２の環境下である。
　細胞培養の期間は、培養細胞が目的とする状態になるのであれば、特に制限されるものではない。細胞培養の期間としては、例えば、２８日以内、２１日以内、１４日以内、７日以内、５日以内、３日以内である。長期間培養する際は、培地交換しても良い。培地交換の頻度と方法は特に制限されるものではない。一般的には１日～７日毎に交換することが好ましい。特に好ましくは、１日～５日である。この時、全量培地を交換しても良く、一部培地を残し、新しい培地を加えても良い。
　培養する細胞の密度は、培養する細胞、培養容器、培養細胞の用途に適したものであれば、特に制限されるものではないが、例えば、５×１０２細胞／ｃｍ２以上１×１０９細胞／ｃｍ２以下である。細胞密度の下限値としては、より好ましくは１×１０３細胞／ｃｍ２以上、更に好ましくは５×１０３細胞／ｃｍ２以上、特に好ましくは５×１０４細胞／ｃｍ２以上である。一方、細胞密度の上限値としては、より好ましくは１×１０８細胞／ｃｍ２以下、更に好ましくは５×１０７細胞／ｃｍ２以下、特に好ましくは１×１０７細胞／ｃｍ２以下である。
　培養する細胞の密度は例えば、５×１０２細胞／ｃｍ２以上１×１０９細胞／ｃｍ２以下、５×１０２細胞／ｃｍ２以上１×１０８細胞／ｃｍ２以下、５×１０２細胞／ｃｍ２以上５×１０７細胞／ｃｍ２以下、５×１０２細胞／ｃｍ２以上１×１０７細胞／ｃｍ２以下、１×１０３細胞／ｃｍ２以上１×１０９細胞／ｃｍ２以下、１×１０３細胞／ｃｍ２以上１×１０８細胞／ｃｍ２以下、１×１０３細胞／ｃｍ２以上５×１０７細胞／ｃｍ２以下、１×１０３細胞／ｃｍ２以上１×１０７細胞／ｃｍ２以下、５×１０３細胞／ｃｍ２以上１×１０９細胞／ｃｍ２以下、５×１０３細胞／ｃｍ２以上１×１０８細胞／ｃｍ２以下、５×１０３細胞／ｃｍ２以上５×１０７細胞／ｃｍ２以下、５×１０３細胞／ｃｍ２以上１×１０７細胞／ｃｍ２以下、５×１０４細胞／ｃｍ２以上１×１０９細胞／ｃｍ２以下、５×１０４細胞／ｃｍ２以上１×１０８細胞／ｃｍ２以下、５×１０４細胞／ｃｍ２以上５×１０７細胞／ｃｍ２以下、５×１０４細胞／ｃｍ２以上１×１０７細胞／ｃｍ２以下である。
　培地は、培養する細胞に適したものであれば、特に制限されるものではない。培地成分としては、例えば、糖類、アミノ酸、ビタミン類、無機塩、微量金属、添加物などが挙げられる。
　また、これらの培地成分は、単独で配合してもよいし、二種以上を組み合わせて配合してもよい。これらの培地成分については、培養する細胞などに応じて公知のものから適宜設定すればよい。
　糖類の具体例としては、例えば、グルコースやフルクトース、マンノース、ガラクトースなどの単糖類、スクロースやスクラロース、トレハロース、マルトース、ラクトースなどの二糖類、グルコシルスクロースやラクトスクロース、ラフィノースなどの三糖類、アカルボースやマルトテトラオースなどの四糖類、シクロデキストリン、オリゴ糖などが挙げられる。
　アミノ酸の具体例としては、例えば、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－グルタミン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－シスチン、グリシン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－リジン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－セリン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－チロシン、Ｌ－バリン、Ｌ－アラニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－システイン、Ｌ－ヒドロキシプロリンなどが挙げられる。
　ビタミン類の具体例としては、例えば、Ｌ－アスコルビン酸ナトリウム、Ｌ－アスコルビン酸－二リン酸、コリン、葉酸、ナイアシン、ビオチン、パントテン酸、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、チミジン、ビタミンＢ１２などが挙げられる。
　無機塩の具体例としては、例えば、塩化ナトリウム、水酸化ナトリウム、硫酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、塩化カリウム、水酸化カリウム、硫酸カリウム、リン酸カリウム、リン酸水素二カリウム、炭酸カリウム、炭酸水素カリウム、塩化カルシウム、硫酸カルシウム、硝酸カルシウム、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、硝酸マグネシウム、リン酸マグネシウム、炭酸マグネシウムなどが挙げられる。
　微量金属の具体例としては、例えば、硫酸鉄、硝酸鉄、硫酸銅、硝酸銅、硫酸亜鉛などが挙げられる。
　添加物の具体例としては、例えば、ウシ血清やウマ血清、ヒト血清などの血清、ＦＧＦ２やＥＧＦ、ＨＧＦ、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦなどの増殖因子、アルブミンなどのタンパク質、グルタチオンやアスコルビン酸、アスコルビン酸誘導体などの抗酸化剤、ペニシリンやストレプトマイシンなどの抗生物質、ＨＥＰＥＳなどのｐＨ調整剤、乳酸やプロピオン酸などの有機酸、コレステロールなどの脂質、リノレン酸などの脂肪酸、エタノールアミンやプトレシンなどのアミン類、メルカプトエタノールや３－メルカプト－１，２－プロパンジオールなどの還元剤、アルギン酸ナトリウムやポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロース、プルランなどの増粘剤、フェノールレッドなどのｐＨ指示薬などが挙げられる。
　上記の培地成分を含有する培地としては、例えば、ＡＩＭ　Ｖ　ｍｅｄｉｕｍ、ＨＦＤＭ－１　Ｍｅｄｉｕｍ、ダルベッコリン酸緩衝食塩液（Ｄ－ＰＢＳ）やハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）などの平衡緩衝液、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ　Ｍｅｄｉｕｍ）やＥＭＥＭ（Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ）、α－ＭＥＭ（Ｍｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ　ａｌｐｈａ　Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＩＭＤＭ（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ）、ＧＭＥＭ（Ｇｌａｓｇｏｗ’ｓ　ＭＥＭ）、Ｈａｍ’ｓ　Ｆ－１０　ｍｅｄｉｕｍ、Ｈａｍ’ｓ　Ｆ－１２　ｍｅｄｉｕｍ、Ｈａｍ’ｓ　Ｆ－１２Ｋ　ｍｅｄｉｕｍ、ＲＰＭＩ　ｍｅｄｉｕｍ　１６４０、Ｍ－１９９　ｍｅｄｉｕｍ、Ｌ－１５　ｍｅｄｉｕｍ、ＭｃＣｏｙ’ｓ　５Ａ　Ｍｅｄｉｕｍ、ＭＣＤＢ１０５　ｍｅｄｉｕｍ、ＭＣＤＢ１０７　ｍｅｄｉｕｍ、ＭＣＤＢ１３１　ｍｅｄｉｕｍ、ＭＣＤＢ１５３　ｍｅｄｉｕｍ、ＭＣＤＢ２０１　ｍｅｄｉｕｍ、ＮＣＴＣ１０９　ｍｅｄｉｕｍ、ＮＣＴＣ１３５　ｍｅｄｉｕｍ、Ｗａｙｍｏｕｔｈ’ｓ　ＭＢ７５２／１　ｍｅｄｉｕｍ、ＣＭＲＬ－１０６６　ｍｅｄｉｕｍ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ’ｍｅｄｉｕｍ　Ｅ、Ｂｒｉｎｓｔｅｒ’ｓ　ＢＭＯＣ－３　Ｍｅｄｉｕｍ、Ｅ８　ｍｅｄｉｕｍなどの基礎培地などが挙げられる。
　また、これらの基礎培地は、単独で用いてもよいし、二種以上を組み合わせて用いてもよい。さらに、基礎培地は、細胞の種類や状態に応じて、培地成分を追加、除去、増量、減量してもよい。これらの基礎培地については、培養する細胞などに応じて公知のものから適宜設定すればよい。
＜細胞培養キット＞
　次に、細胞培養キットについて説明する。
　本実施形態の細胞培養キットの一例は、
　培養容器と、
　上述の樹脂フィルムと、を含む。
　培養容器は、培地中で細胞を培養するための容器であり、培養する細胞の種類及び用途に適したものであれば、特に制限されるものではない。
　培養容器としては、例えば、ディッシュ、ペトリディッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、フラスコ、組織培養用フラスコ、マイクロプレート、マイクロウェルプレート、マルチプレート、マルチウェルプレート、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、ローラーボトルなどが挙げられる。
　培養容器の素材としては、培地を透過させないものであれば、特に制限されるものではないが、例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリビニルアルコール、ポリエチレンテレフタレート、ポリアセタール、ポリ塩化ビニル、アクリル樹脂、ポリカーボネート、ポリエーテルエーテルケトン、ポリエーテルスルホン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリイミド、ポリアミド、シクロオレフィンポリマー、セルロース、シリコ－ン、ナイロン６，６、ガラス、ステンレスやアルミニウムなどの金属などが挙げられる。
　培養容器の面積は、特に制限されるものではないが、市販されている培養容器の面積であれば問題なく培養を行える。例えば、０．３ｃｍ２以上１０００ｃｍ２以下である。下限値としては、より好ましくは０．３５ｃｍ２以上、更に好ましくは１．０ｃｍ２以上、特に好ましくは１．９ｃｍ２以上である。一方、上限値としては、より好ましくは９００ｃｍ２以下、更に好ましくは８００ｃｍ２以下、特に好ましくは５００ｃｍ２以下である。
　また、細胞培養キットは、リング部材を含んでもよい。
　リング部材は、培養容器の内部空間に取り外し可能に収容される。リング部材は、培養容器内に置かれた樹脂フィルムを押さえつけて固定できる。
　リング部材は、例えば、円筒状又は円環状である。なお、リング部材の形状は、円筒状又は円環状に限られず、例えば上方から見て、楕円、矩形、多角形等の適宜の所定形状をしたリング状であってもよい。また、リング部材は、完全な筒状又は環状である必要はなく、一部が欠いた筒状又は環状であってもよいし、Ｕ字状であってもよい。
　リング部材の比重は、１．０より大きい。リング部材の比重は、培地中に安定して沈むように、１．０５以上であることが望ましい。
　リング部材の材料は、例えば、樹脂、ガラス、セラミックス、金属等の１つ又は複数を含んでもよい。リング部材には、成形性、生産性の観点から、樹脂が好適である。樹脂は、例えば、ポリスチレン、ＡＢＳ樹脂、ＡＳ樹脂、ポリフェニルエーテル、ナイロン６６、ＭＳ樹脂、ナイロン６、メタクリル樹脂、アクリル樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリサルホン樹脂、ポリエーテルイミド樹脂、ポリウレタン樹脂、ＰＢＴ樹脂、ＰＥＴ樹脂、塩化ビニル樹脂、ＰＢＴ樹脂、ポリアセタール樹脂、ＰＥＴ樹脂、フッ素樹脂等の１つ又は複数を含んでもよい。ガラスは、ソーダガラス、ホウケイ酸ガラス、石英ガラス等であってもよい。金属は、ステンレス、アルミニウム等の１つ又は複数を含んでもよい。また、リング部材は、ここで例示した材料を主材料として、各種の添加剤を含んでもよい。
＜保存＞
　本実施形態の凍結保存方法の一例は、上記細胞シート付樹脂フィルムを、凍結保存液中で冷却する冷却工程を含む。培養容器の内部で細胞シート付樹脂フィルムの凍結保存を実施してもよい。
　凍結保存液は、凍結保存による細胞の損傷を低減するための溶液である。
　凍結保存液は、細胞の凍結保存に適したものであれば、特に制限されるものではないが、培地に含まれる培地成分、凍結保護剤などを含有してもよい。
　培地成分である糖類、アミノ酸、ビタミン類、無機塩、微量金属、添加物については、上記（培地）の項の説明を充足するものであればよい。また、凍結保存液は、凝固開始温度が－１５℃以上－５℃以下の範囲にあるものが好ましい。
　凍結保護剤は、凍結保存時の凍結や解凍による細胞への損傷を低減するために使用する物質である。凍結保護剤としては、例えば、細胞非浸透性凍結保護剤、細胞浸透性凍結保護剤が挙げられる。
　細胞非浸透性凍結保護剤の具体例としては、例えば、アルブミン、スクロース、トレハロース、デキストラン、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリリジンなどが挙げられる。
　細胞浸透性凍結保護剤の具体例としては、例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、エチレングリコール、プロピレングリコール、プロパンジオールなどが挙げられる。
　また、これらの凍結保護剤は、単独で配合してもよいし、二種以上を組み合わせて配合してもよい。これらの凍結保護剤については、細胞の種類、凍結保存液の組成などに応じて公知のものから適宜設定すればよい。
　ＤＭＳＯを含まない市販の凍結保存液としては、例えば、ステムセルバンカー（登録商標）ＤＭＳＯフリーＧＭＰグレード（日本全薬工業社）、バンバンカー（登録商標）ＤＭＳＯフリー（ＧＣリンフォテック社）、クライオスカーレス（登録商標）ＤＭＳＯフリー（バイオベルデ社）、ステムセルキープ（バイオベルデ社）、ＣｒｙｏＮｏｖｏ（登録商標）Ｘ１２（Ａｋｒｏｎ　ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ　ＬＣＣ社）、ＣｒｙｏＮｏｖｏ（登録商標）Ｐ２４（Ａｋｒｏｎ　ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ　ＬＣＣ社）、ヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞凍結保存用ＤＭＳＯフリー細胞凍結保存液（リプロセル社）、Ｃｅｌｌ　Ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ　Ｏｎｅ（ナカライテスク社）、ＴｈｅｌｉｏＫｅｅｐ（登録商標：バイオベルデ社）、Ｃｅｌｌｖａｔｉｏｎ（登録商標：Ｐｒｏｔｉｄｅ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社）、ＲｅｐｒｏＣｒｙｏ　ＲＭ（リプロセル社）、ＳＯＦＯＲＯ　Ｃｒｙｏ（ＳＡＲＡＹＡ社）などが挙げられる。また、ＤＭＳＯを含む市販の凍結保存液としては、例えば、ステムセルバンカー（登録商標）ＧＭＰグレード（日本全薬工業社）、ステムセルバンカー（登録商標）ＥＸ　ＧＭＰグレード（日本全薬工業社）、バンバンカー（登録商標）ｈＲＭ（ＧＣリンフォテック社）、バンバンカー（登録商標）（ＧＣリンフォテック社）、ｉＳｔｏｃｋ（ＧＣリンフォテック）、ＣｒｙｏＳｔｏｒ　ＣＳ５（Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｒｉｖｅｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｃｅｌｌ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，　ｉｎｃ）、ＣｒｙｏＳｔｏｒ　ＣＳ１０（Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｒｉｖｅｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｃｅｌｌ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，　ｉｎｃ）などが挙げられる。
　冷却工程において、細胞シート付樹脂フィルムを、凍結保存液中で非貫流式の冷却装置を用いて冷却することが好ましい。非貫流式の冷却装置により、冷却対象物である細胞シートを均一な温度で冷却することが可能となるため、細胞へのダメージが少なく、細胞活性率の低下を抑制できる。
　冷却工程において、０～－５℃における冷却速度は、例えば、０．１℃／分以上１５℃／分以下、好ましくは０．２５℃／分以上１２．５℃／分以下、より好ましくは０．５℃／分以上１０℃／分以下である。
　上記下限値以上とすることにより、不必要な液状の凍結保護材と細胞の接触時間を減らすことができる。上記上限値以下とすることにより、細胞内氷晶の形成を抑制することができる。
　冷却工程において、凍結処理の温度は、培養細胞及び凍結保存液を凍結することができれば、特に制限されるものではない。凍結処理の温度としては、例えば、－１９６℃以上－２５℃以下である。下限値としては、より好ましくは－１８０℃以上、更に好ましくは－１６０℃以上、特に好ましくは－１５０℃以上である。一方、上限値としては、より好ましくは－２５℃以下、更に好ましくは－３０℃以下、特に好ましくは－３５℃以下である。凍結処理の温度は例えば、－１９６℃以上－２５℃以下、－１９６℃以上－３０℃以下、－１９６℃以上－３５℃以下、－１８０℃以上－２５℃以下、－１８０℃以上－３０℃以下、－１８０℃以上－３５℃以下、－１６０℃以上－２５℃以下、－１６０℃以上－３０℃以下、－１６０℃以上－３５℃以下、－１５０℃以上－２５℃以下、－１５０℃以上－３０℃以下、－１５０℃以上－３５℃以下である。
　凍結処理に用いる冷却装置は、特に制限されるものではなく、例えば、急速冷凍装置、極低温冷蔵装置などが挙げられる。冷却装置としては、培養容器に伝熱手段を接触させて培養容器及び細胞を凍結させるよりも、伝熱手段と非接触であり、冷気を一方向ではなく多方向、好ましくは全方向から培養容器に吹き付けて凍結する冷凍装置であることが、均一な温度で細胞を凍結して、解凍後の細胞の生存率を高める観点から好ましい。冷気を培養容器に吹き付けて凍結する冷凍装置としては、具体的には、冷却ファンによる冷気循環により、被冷却物を冷却させる冷却装置、例えば、特開２００５－１２７６６６号公報に開示されている、冷却ファンを備えた非貫流方式の冷却装置などが挙げられる。なお、上記「非貫流方式」とは、被冷却物からの貫流空気の大半が冷却器を通過（貫流）しない方式を意味する。
　凍結保存方法は、冷却工程の後、例えば－１９６℃～－６０℃、好ましくは－１８０℃～－６５℃、より好ましくは－１５０℃～－８０℃にて細胞シート付樹脂フィルムを保存する、凍結保存工程を含むことが好ましい。これにより、長期間にわたり細胞シートを安定に維持することができる。
　冷却工程の温度は、冷却装置の設定温度を採用してもよい。
　凍結保存は、細胞を安定に凍結保存することができれば、特に制限されるものではない。
　凍結保存の方法としては、例えば、冷却剤の液相、気相との接触、超低温冷凍庫の使用などが挙げられる。好ましい凍結保存の方法としては、温度の観点から冷却剤の液相、気相との接触である。
　冷却剤としては、例えば、液体窒素、液体エタン、液体プロパン、液体ヘリウム、ドライアイスなどが挙げられる。
　凍結保存の温度は、細胞を安定に凍結保存することができれば、特に制限されるものではない。凍結保存の温度としては、例えば、－１９６℃以上－６０℃以下、－１９６℃以上－１３４℃以下、－１３４℃以上－６０℃以下のいずれの範囲内でもよい。
　凍結保存の温度は、凍結対象となる細胞シートの表面温度を採用してもよい。表面温度は、例えば、Ｋ熱電対を用いて測定できる。
　細胞シート付樹脂フィルムの凍結物は、樹脂フィルムと、樹脂フィルムの表面（細胞搭載領域）に形成された細胞シートと、を含むものである。細胞シート付樹脂フィルム中、樹脂フィルムおよび細胞シートが凍結保存状態である。
　上記凍結物において、樹脂フィルムおよび細胞シートが、例えば、上述の凍結保存の温度にて、具体的には、好ましくは－６０℃以下、より好ましくは－１３５℃以下で凍結保存状態である。また、凍結物は、－１３４℃以上－６０℃以下の範囲で凍結保存状態としてもよい。なお、凍結物は、－１９６℃以上で凍結保存状態とする。
　培養容器や凍結保存容器の内部で凍結した細胞シート付き培養キャリア基材の凍結物は、培養容器内や凍結保存容器で凍結された状態か、容器から取り出された状態で、包装材料で包装された包装体とすることができる。密封された包装体とすることで、細胞シートへの微生物混入防止および細胞シートを汚損させずに保存、流通させることができる。一例として、細胞シート付き培養キャリア基材と凍結保存液を有する容器をフィルム状の包装材料で包装して密封した状態で凍結することで、凍結物の包装体を得ることができる。包装材料としては、アルミニウム、ポリエチレンテレフタレート、アイオノマー、ポリエチレン、ポリ塩化ビニリデン、ポリビニルアルコール、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリアクリロニトリル、エチレン酢酸ビニル共重合体、エチレン－ビニルアルコール共重合体、エチレン－メタクリル酸共重合体、ポリイミド、ペルフルオロアルコキシフッ素樹脂や四フッ化エチレン・六フッ化プロピレン共重合体（ＦＥＰ）等のフッ素系樹脂、ナイロン、セロファン、紙材が好ましい。これらを単独で用いてもよいし、これらから２つ以上を組み合わせてもよい。ＥＯＧ滅菌や高圧蒸気滅菌のようにガス透過性が求められる滅菌を行う場合は、紙材や不織布材と上記材料とを組合せた包装材料が好ましく用いられる。なお、包装材料は多重梱包としてもよく、滅菌後にさらに包装を重ねてもよく、包装体の最外部分は樹脂のフィルム状の包装材料であることが好ましい。また、この包装体は滅菌してもよい。滅菌方法は電子線滅菌、ガンマ線滅菌、ＥＯＧ滅菌、高圧蒸気滅菌、等が挙げられる。
　本実施形態の冷凍保存方法は、さらに、細胞シート付樹脂フィルムを解凍する、解凍工程を含んでもよい。
　解凍方法は、特に制限されるものではなく、医療、医薬品、医薬部外品、化粧品、食品、動物用薬品などの技術分野、及び再生医療、生物工学などの基礎技術分野において使用されている通常の手段を用いることができる。
　解凍の方法としては、例えば、ウォーターバス、ビーズバス、インキュベータ、ホットプレート、デフロスターなどの使用や、凍結温度よりも高い温度の融解液に浸漬する、凍結温度よりも高い温度環境下に静置することなどが挙げられる。
　解凍時の凍結物に接する環境温度は、凍結温度より高い温度且つ５０℃未満であれば、特に制限されるものではない。上記の環境温度の上限は、例えば、４９℃以下、好ましくは４５℃以下、より好ましくは４０℃以下である。一方、環境温度の下限は、例えば、０℃以上、好ましくは５℃以上、より好ましくは１０℃、さらに好ましくは１５℃以上である。
　解凍時の凍結物に接する環境温度の範囲は例えば、０℃以上４９℃以下、０℃以上４５℃以下、０℃以上４０℃以下、５℃以上４９℃以下、５℃以上４５℃以下、５℃以上４０℃以下、１０℃以上４９℃以下、１０℃以上４５℃以下、１０℃以上４０℃以下、１５℃以上４９℃以下、１５℃以上４５℃以下、１５℃以上４０℃以下である。
　なお、解凍温度が５０℃以上である場合、細胞に熱ダメージが生じる可能性があるため好ましくない。また、解凍において凝固点以下の温度環境に一時的に保管してもよい。例えば、－８０℃に保管された凍結物を－３０℃の環境温度に曝した後に凝固点以上の環境温度で解凍することができる。
　凍結物の解凍に要する時間は、細胞に凍結による傷害が生じなければ、特に制限されない。通常、１０秒超、６０分以下であれば問題なく解凍できる。凍結物の解凍に要する時間の下限値としては、１０秒超であれば良く、２０秒以上が好ましく、３０秒以上がより好ましく、１分以上がさらに好ましい。上限値としては、６０分以下であれば良く、好ましくは５０分以下、より好ましくは４０分以下、さらに好ましく３０分以下である。例えば、解凍に要する時間は、１０秒超６０分以下、１０秒超５０分以下、１０秒超４０分以下、１０秒超３０分以下、２０秒以上６０分以下、２０秒以上５０分以下、２０秒以上４０分以下、２０秒以上３０分以下、３０秒以上６０分以下、３０秒以上５０分以下、３０秒以上４０分以下、３０秒以上３０分以下、１分以上６０分以下、１分以上５０分以下、１分以上４０分以下、１分以上３０分以下である。
　解凍が早すぎる場合、温度差による熱衝撃で凍結物に亀裂が生じ細胞シートが破損する恐れがある。解凍が遅すぎる場合、氷点下条件で水分子が再結晶し、氷晶が大きくなり、細胞に重篤な傷害が生じるため好ましくない。
　上記の解凍時間中において、上記の環境温度は、一定となるように設定されてもよく、段階的に上昇等の変動するように設定されてもよい。
　融解液は、培養細胞に損傷を与えないものであれば、特に制限されるものではない。融解液に含有する成分としては、例えば、スクロース、グルコース、マルトース、トレハロース、フルクトースなどが挙げられる。また、融解液は、上記（培地）の項に記載の成分を含有してもよい。
　融解液の温度は、凍結温度よりも高い温度であれば、特に制限されるものではない。融解液の温度としては、例えば、０℃以上４５℃以下である。下限値としては、より好ましくは４℃以上、更に好ましくは２５℃以上、特に好ましくは２８℃以上である。一方、上限値としては、より好ましくは４０℃以下、更に好ましくは３９℃以下、特に好ましくは３８℃以下である。融解液の温度は例えば、０℃以上４５℃以下、０℃以上４０℃以下、０℃以上３９℃以下、０℃以上３８℃以下、４℃以上４５℃以下、４℃以上４０℃以下、４℃以上３９℃以下、４℃以上３８℃以下、２５℃以上４５℃以下、２５℃以上４０℃以下、２５℃以上３９℃以下、２５℃以上３８℃以下、２８℃以上４５℃以下、２８℃以上４０℃以下、２８℃以上３９℃以下、２８℃以上３８℃以下である。
　解凍した細胞シートおよび樹脂フィルムは、必要に応じて、解凍処理直後に細胞洗浄液で洗浄してもよい。細胞洗浄液は、特に制限されるものではなく、上記（培地）の項に記載の成分を含有してもよい。
　細胞洗浄液の温度は、特に制限されるものではない。細胞洗浄液の温度としては、例えば、０℃以上４５℃以下である。下限値としては、より好ましくは４℃以上、更に好ましくは２５℃以上、特に好ましくは２８℃以上である。一方、上限値としては、より好ましくは４０℃以下、更に好ましくは３９℃以下、特に好ましくは３８℃以下である。
　培養細胞の洗浄回数は、特に制限されるものではなく、１回又は複数回（例えば、２回、３回、４回、５回など）である。
　本開示においては、細胞搭載領域に温度応答性ポリマーを含まないため、凍結保存工程などの低温環境下で、細胞シートが樹脂フィルムから剥離することを抑制でき、凍結保存工程と解凍工程を経ても、細胞シートとフィルムの接着性を維持したままの細胞シート付樹脂フィルムを得ることができる。
＜移植＞
　本実施形態の移植方法は、樹脂フィルムの細胞搭載領域に形成された細胞シートを被移植部位に貼り付けた後、細胞シートから樹脂フィルムを剥離する、移植工程と、を含む。
　被移植部位は、例えば、哺乳類、鳥類、両生類、魚類、昆虫、植物、微生物などの移植対象者における体の少なくとも一部が挙げられる。哺乳類及び鳥類の具体例としては、例えば、ヒト、サル、チンパンジー、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウス、ラット、ニワトリなどが挙げられる。ただし、被移植部位は、ヒトの身体の内部および外部を除外してもよい。移植対象者以外の被移植部位として、例えば、他の細胞シート、医療器具などの器具、移植対象者から分離された状態の組織単独または器官単独などが挙げられる。組織単独または器官単独の例としては、皮膚、口腔内組織、食道、気管、気管支、肺、肺葉、胃、十二指腸、すい臓、脾臓、小腸、大腸、筋組織、骨等が挙げられる（ただし、移植対象者から採取したものと同一人に治療のために戻すものを除く）。
　細胞移植療法は、細胞、組織、臓器の欠損及び機能障害、機能不全に関連する症状の発症及び再発を抑制、防止するものである。細胞移植療法の対象疾患としては、例えば、脊髄損傷、膝関節軟骨損傷、虚血性心疾患、加齢黄斑変性、角膜上皮幹細胞疲弊症、再生不良性貧血、重症下肢虚血、難治性皮膚潰瘍、術後合併症予防（例えば、各種臓器の縫合不全、気管支断端瘻、膵液瘻、胆汁漏）、熱傷などが挙げられる。
　また、細胞移植療法に用いる細胞は、自己由来細胞、同種非自己由来細胞、異種由来細胞であってもよい。好ましい細胞としては、臨床応用及び安全性の観点から自己由来細胞であり、臨床応用及び生産性の観点から、非自己由来細胞である。
　以上、本発明の実施形態について述べたが、これらは本発明の例示であり、上記以外の様々な構成を採用することができる。また、本発明は上述の実施形態に限定されるものではなく、本発明の目的を達成できる範囲での変形、改良等は本発明に含まれる。
　以下、参考形態の例を付記する。
１．　培養した細胞を載せる領域を含む第一の表面を有する樹脂層を含む樹脂フィルムであって、前記樹脂フィルムは、Ｘ線造影材料を含み、前記第一の表面中にＸ線造影材料を含まないＸ線造影材料非存在領域を有し、前記培養した細胞を載せる領域は、前記Ｘ線造影材料非存在領域の少なくとも一部に設けられる、樹脂フィルム。
２．　１．に記載の樹脂フィルムにおいて、前記培養した細胞を載せる領域となる部分の表面は、θ／２法で測定された水滴接触角θが７０°以下である、樹脂フィルム。
３．　１．または２．に記載の樹脂フィルムにおいて、Ｘ線造影材料を含むＸ線造影層が樹脂層の表面に形成される、樹脂フィルム。
４．　３．に記載の樹脂フィルムにおいて、前記Ｘ線造影層が前記第一の表面の反対側である樹脂層の第二の表面に形成される、樹脂フィルム。
５．　１．～４．のいずれか一つに記載の樹脂フィルムにおいて、Ｘ線造影材料が樹脂層の内部に含まれる、樹脂フィルム。
６．　１．～５．のいずれか一つに記載の樹脂フィルムにおいて、前記樹脂層の表面に積層するラミネート層をさらに含む、樹脂フィルム。
７．　６．に記載の樹脂フィルムにおいて、前記ラミネート層が前記第一の表面の反対側である樹脂層の第二の表面に積層される、樹脂フィルム。
８．　６．または７．に記載の樹脂フィルムにおいて、前記ラミネート層が前記Ｘ線造影材料を含む、樹脂フィルム。
９．　１．～８．のいずれか一つに記載の樹脂フィルムにおいて、少なくとも一部の表面を保護する保護層をさらに含む、樹脂フィルム。
１０．　１．～９．のいずれか一つに記載の樹脂フィルムにおいて、樹脂フィルムの厚さが５～２５０μｍである、樹脂フィルム。
１１．　１．～１０．のいずれか一つに記載の樹脂フィルムにおいて、Ｘ線造影材料が金属あるいは金属化合物を含む、樹脂フィルム。
１２．　１．～１１．のいずれか一つに記載の樹脂フィルムにおいて、前記第一の表面の反対側の面のＪＩＳ　Ｚ８７４１：１９９７の規定に準拠して測定した６０度鏡面光沢度Ｇｓ（６０°）が７００以下である、樹脂フィルム。
１３．　１．～１２．のいずれか一つに記載の樹脂フィルムにおいて、Ｘ線造影材料がＸ線造影フィラーを含む、樹脂フィルム。
１４．　１．～１３．のいずれか一つに記載の樹脂フィルムにおいて、樹脂層がポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）を含む、樹脂フィルム。
１５．　１．～１４．のいずれか一つに記載の樹脂フィルムにおいて、前記第一の表面が、細胞を培養するための足場である、樹脂フィルム。
　この出願は、２０２４年１月２６日に出願された日本出願特願２０２４－００９９６６号を基礎とする優先権を主張し、その開示の全てをここに取り込む。
１１　樹脂フィルム
１２　樹脂層
１３　Ｘ線造影層
１４　表面
１５　表面
１６　Ｘ線造影材料非存在領域
２１　樹脂フィルム
２２　樹脂層
２３　Ｘ線造影層
２４　表面
２５　表面
２６　Ｘ線造影材料非存在領域
３１　樹脂フィルム
３２　樹脂層
３４　表面
３６　Ｘ線造影材料非存在領域
３７　Ｘ線造影フィラー
４１　樹脂フィルム
４２　樹脂層
４４　表面
４５　表面
４６　Ｘ線造影材料非存在領域
４７　Ｘ線造影材料を含むラミネート層
５１　樹脂フィルム
５２　樹脂層
５３　Ｘ線造影層
５４　表面
５５　表面
５６　Ｘ線造影材料非存在領域
５７　ラミネート層
５７　場合ラミネート層
６１　樹脂フィルム
６２　樹脂層
６３　Ｘ線造影層
６４　表面
６５　表面
６６　ナイロン
６６　Ｎ
６６　Ｘ線造影材料非存在領域
６７　保護層
１００　患者
１０１　患者
１０２　樹脂フィルム
１１１　患者
１１２　樹脂フィルム

Claims (13)

  1. 　培養した細胞を載せる領域を含む第一の表面を有する樹脂層と、
    　前記樹脂層の前記第一の表面上、前記第一の表面と反対側の第二の表面上、および前記樹脂層内の少なくとも一部に存在する、Ｘ線造影材料を含む層と、を備え、
    　前記培養した細胞を載せる領域が、前記第一の表面のうち、前記Ｘ線造影材料が表面露出していないＸ線造影材料非存在領域の少なくとも一部に存在する、樹脂フィルム。
  2. 　請求項１に記載の樹脂フィルムであって、
    　前記Ｘ線造影材料を含む層が、前記Ｘ線造影材料のパターンを含むＸ線造影層である、樹脂フィルム。
  3. 　請求項１に記載の樹脂フィルムであって、
    　前記Ｘ線造影材料を含む層が、複数のフィラー状の前記Ｘ線造影材料と樹脂材料とを含む、Ｘ線造影樹脂層である、樹脂フィルム。
  4. 　請求項１から３のいずれか一項に記載の樹脂フィルムにおいて、
    　樹脂フィルムの厚さが、５μｍ以上２５０μｍ以下である、樹脂フィルム。
  5. 　請求項１から３のいずれか一項に記載の樹脂フィルムにおいて、
    　前記樹脂層が、ポリエーテルエーテルケトン、ポリエチレンテレフタレート、およびポリスチレンからなる群から選ばれる一または二以上を含む、樹脂フィルム。
  6. 　請求項１から３のいずれか一項に記載の樹脂フィルムにおいて、
    　前記Ｘ線造影材料が、Ｘ線吸収造影材料を含む、樹脂フィルム。
  7. 　請求項１から３のいずれか一項に記載の樹脂フィルムにおいて、
    　前記Ｘ線造影材料が、金属あるいは金属化合物を含む、樹脂フィルム。
  8. 　請求項１から３のいずれか一項に記載の樹脂フィルムにおいて、
    　前記第一の表面の法線方向から見たとき、前記Ｘ線造影材料を含む層が、当該樹脂フィルムの全体または一部のみに重なるように存在する、樹脂フィルム。
  9. 　請求項２に記載の樹脂フィルムにおいて、
    　前記樹脂層の前記第一の表面上、および／または前記第一の表面と反対側の第二の表面上に存在する前記Ｘ線造影層の少なくとも一部の表面を保護する保護層を含む、樹脂フィルム。
  10. 　請求項１から３のいずれか一項に記載の樹脂フィルムにおいて、
    　前記培養した細胞を載せる領域の前記第一の表面に、プラズマ処理が施されている、樹脂フィルム。
  11. 　請求項１から３のいずれか一項に記載の樹脂フィルムにおいて、
    　前記培養した細胞を載せる領域の前記第一の表面における、θ／２法で測定された水滴接触角θが７０°以下である、樹脂フィルム。
  12. 　請求項１から３のいずれか一項に記載の樹脂フィルムにおいて、
    　前記第一の表面の反対側の最も外側に存在する表面のＪＩＳ　Ｚ８７４１：１９９７の規定に準拠して測定した６０度鏡面光沢度Ｇｓ（６０°）が７００以下である、樹脂フィルム。
  13. 　請求項１から３のいずれか一項に記載の樹脂フィルムにおいて、
    　細胞を培養するため、および／または細胞を搬送するために用いる、樹脂フィルム。
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