WO2025154802A1 - 骨補填材、及びその製造方法 - Google Patents

骨補填材、及びその製造方法

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freeze
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宏 江草
博子 大川
里美 森
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Tohoku University NUC
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Tohoku University NUC
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues

Definitions

  • the present invention relates to a bone substitute material used in surgically treating damaged bone tissue, and a method for producing the same.
  • the inventors have developed a method to three-dimensionally culture iPSCs in a bioreactor, induce bone differentiation, and produce osteoblastic masses of human iPSCs (Patent Document 1). Although spheroids (cell masses) and organoids derived from iPSCs are promising biomaterials, transplanting undifferentiated living cells carries the risk of tumor development. In addition, because the transplanted material is foreign to the body, it is also necessary to control immunogenicity and local inflammation.
  • Non-Patent Document 1 a new concept of regenerative medicine in which cells created in vitro from stem cells are inactivated while retaining their tissue components.
  • tissue can be stored for a long period of time in a "seed” state and then transplanted into a patient to induce tissue regeneration, making it possible to supply the required amount of tissue when needed.
  • inactivating undifferentiated iPSCs may reduce the risk of potential tumor formation and control inflammation.
  • the present inventors have developed a bone filling material that inactivates cells while retaining the activity of promoting bone remodeling, and has excellent osteoconductivity and bone formation induction.
  • radiation exposure, heat treatment, drug treatment, and other methods are used to inactivate cells, they may denature proteins, so they thought that freeze-drying, which can inactivate cells while maintaining the physiological activity and structure of proteins, would be better.
  • freeze-drying dries materials under low-temperature conditions, suppressing thermal denaturation and chemical changes in materials, and also reducing the rate of product deterioration during the drying process, allowing long-term storage at room temperature.
  • freeze-drying conditions may cause chemical changes such as oxidation, deamidation, and hydrolysis, and aggregation due to changes in the higher-order structure of proteins.
  • chemical and physical changes during the manufacturing process may reduce the physiological activity of bone filling materials intended for implantation in vivo, and may also act as antigens.
  • the present inventors have already produced a bone regenerator by freeze-drying iPS cells that have been induced to differentiate into osteoblasts (Patent Document 2).
  • a mass of iPS cells induced to differentiate into osteoblasts is pre-frozen overnight in a -80°C freezer, then freeze-dried on a cooling stage by fixing the temperature at -10°C and gradually lowering the air pressure to 6-20 Pa overnight, producing a bone prosthesis without secondary drying.
  • a shelf-type freeze-dryer that can accurately control the freeze-drying temperature by program and has excellent drying efficiency was not used, it cannot be said that the temperature and time control of each process and the drying of the samples were sufficient.
  • Bone tissue is a composite material consisting of cells, organic matrix, and inorganic matrix.
  • Various biomaterials have been used to treat bone defects, but these biomaterials have certain limitations in their bone formation induction ability and production efficiency.
  • the objective of the present invention is to provide a bone filler that is highly safe and has higher osteoconductive ability and bone formation induction ability.
  • Another objective of the present invention is to provide a method for producing a bone filler that allows for a stable supply, has high production efficiency, and is low cost.
  • the present invention relates to the following bone prosthesis and a method for producing the bone prosthesis.
  • a method for producing a bone filler derived from stem cells comprising the steps of inducing differentiation of stem cells into osteoblasts to form cell masses, a preliminary freezing step, and a primary drying step of freeze-drying at a temperature between -80°C and -10°C. It was found that the performance of bone prosthesis can be improved by precisely adjusting the temperature during the freeze-drying process. In particular, it was found that controlling the shelf temperature during the primary drying process and freezing at a constant temperature in the drying chamber leads to improved performance of the bone prosthesis.
  • the secondary drying step was not carried out, but by carrying out the secondary drying step to desorb the unfrozen water, it is possible to produce a bone prosthesis with good performance.
  • FIG. 1 is a diagram showing a schematic diagram of a process for freeze-drying a cell mass produced from iPS cells.
  • FIG. 2 is a diagram showing a schematic configuration of the tray-type freeze dryer used.
  • FIG. 13 is a diagram showing the results of a study on secondary drying time.
  • the evaluation results of miPS-BGM (mouse iPS-bone graft material) that was subjected to primary drying at various temperatures are shown.
  • the arrow indicates the edge of the bone defect.
  • Scale bar 1.0 mm
  • the images show hematoxylin-eosin (HE) staining (upper row) and immunohistochemical staining with anti-galectin-3 antibody of the femoral defect site 3 weeks after miPS-BGM implantation.
  • the arrows indicate the edge of the defect site.
  • Scale bar 1.0 mm.
  • the top row is an enlarged image of the part enclosed by the dotted line in the HE stained image in the top row of Fig. 6A.
  • the bottom row is an enlarged image of the part enclosed by the dotted line in the immunohistochemical stained image in the bottom row of Fig. 6A.
  • * indicates remaining miPS-BGM, and the arrow indicates a neutrophil.
  • Scale bar 100 ⁇ m.
  • FIG. 1 shows the results of elemental composition analysis of miPS-BGM produced using a tray-type freeze dryer.
  • FIG. 1 shows the results of elemental composition analysis of miPS-BGM produced using a cooling stage freeze-dryer and non-demineralized freeze-dried human bone.
  • a bone filler with high bone formation and differentiation ability can be obtained by freezing for 1 hour or more, preferably 2 hours or more, more preferably 4 hours or more, and even more preferably 6 hours or more.
  • pre-freezing at a temperature of -40°C or lower, preferably -60°C or lower is appropriate.
  • Stabilizers such as sugars and sugar alcohols are known to protect proteins during freezing, so various stabilizers were examined.
  • Sucrose (Merck), trehalose (Nacalai Tesque), maltose (Nacalai Tesque), maltitol (Nacalai Tesque), lactose (Nacalai Tesque), and CaCl 2 (Nacalai Tesque) were used as stabilizers.
  • Each additive was dissolved in PBS to obtain a 10% solution.
  • a miPSC cell mass equivalent to one 25 cm 2 culture flask was left to stand at 4°C for 1 hour in a PBS solution containing 5 ml of each additive, and then frozen at -80°C for 6 hours.
  • Quantitative real-time RT-PCR analysis was performed using Thunderbird SYBR qPCR Mix (Toyobo) and StepOnePlus real-time PCR system (Thermo Fisher Scientific). Expression of the target gene was quantitatively analyzed using the 2- ⁇ Ct method and normalized by the expression of GAPDH.
  • the primer sequences used are shown in Table 2. The primers used were primers for human sequences.
  • the femoral bone samples were degreased by immersion in 70% ethanol and then 100% ethanol for 1 day each for a total of 2 days, and then decalcified in 0.5 mol/L EDTA solution (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) for 4 weeks. After dehydration with ethanol, acetone, and xylene, the samples were embedded in paraffin. Paraffin sections 3.5 ⁇ m thick were stained with hematoxylin and eosin (HE) for morphological observation. Galectin-3, a marker molecule for macrophages, was visualized by immunohistochemical staining.
  • HE hematoxylin and eosin
  • the paraffin sections were deparaffinized by washing twice for 5 minutes with 100% xylene (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and xylene/ethanol (50/50), and then rehydrated with graded ethanol (100%, 95%, 80%, 70%) and distilled water.
  • the antigen was then activated overnight at 60°C using 10 mM citrate buffer (pH 6.0, Fujifilm Wako Pure Chemicals).
  • the slides were washed with PBS and treated with 3% hydrogen peroxide (Fujifilm Wako Pure Chemicals) at room temperature for 10 minutes to inhibit endogenous peroxidase activity.
  • Mouse macrophage-like cell line J774A.1 (JCRB9108) was obtained from the Cell Bank of the National Institutes of Biomedical Innovation, Health and Nutrition. The cells were cultured at 37°C, 5% CO 2 , and humidified using 4.5 g/L glucose -containing DMEM (Nacalai Tesque) without sodium pyruvate, 10% FBS (Japan Bioserum), 2 mM L-glutamine (Fujifilm Wako Pure Chemical), penicillin (50 U)/streptomycin (50 ⁇ g/mL). The cells were passaged twice, with the medium being renewed every 3 days.
  • the cells were collected and seeded in a 6-well plate at a cell density of 3.0 ⁇ 10 5 cells/mL. After 24 hours, the medium was replaced with 5 mg/mL miPS-BGM suspension medium, and the cells were cultured for 3 days. The cells were collected and analyzed for expression of inflammatory and anti-inflammatory genes by real-time RT-PCR.
  • the primer sequences used are shown in Table 3. The primers used were primers for mouse sequences.
  • Macrophage J774A.1 cells were cultured in growth medium containing pulverized miPS-BGM, and gene expression of inflammatory (Il-1 ⁇ , Tnf ⁇ , Il-6) or anti-inflammatory (Il-10, Tgf ⁇ 1, Il-11) cytokines was analyzed on days 1 or 3 using real-time RT-PCR analysis. As shown in the upper images of Figure 7, in the groups to which miPS-BGM produced at either temperature was added, cells had gathered and formed colonies on day 1 compared to the growth medium (GM) group. Gene expression of Tgf ⁇ 1 on day 1 after addition of miPS-BGM was significantly higher than that of the GM group.
  • Tgf ⁇ 1, Il-10, and Il-11 genes was higher in the miPS-BGM (-40°C) group than in the GM group, miPS-BGM (-10°C), and miPS-BGM (30°C) groups.
  • the expression of Il-1 ⁇ , Tnf ⁇ , and Il-6 genes was significantly reduced in all miPS-BGM groups compared to the GM group.
  • the expression of Il-1 ⁇ gene was lower in the miPS-BGM (-40°C) group than in the miPS-BGM (-10°C) and miPS-BGM (30°C) groups, although there was no significant difference (lower graph in Figure 7).
  • hMSCs were cultured in the presence of miPS-BGM that had been first dried at temperatures of -40°C, -10°C, and 30°C.
  • hMSCs and miPS-BGM were mixed and cultured at a cell density of 5 x 10 5 in a growth medium on a dish.
  • hMSCs were washed with PBS and then fixed at room temperature using 3.7% paraformaldehyde. The fixed cells were washed with PBS and permeabilized at room temperature for 5 minutes using 0.5% Triton-X (Fujifilm Wako Pure Chemical).
  • the effect of proteins released from miPS-BGM on the cell migration of hMSCs was evaluated using a scratch wound healing assay.
  • the wound healing assay was performed as follows. hMSCs were seeded in a 12-well plate at a cell density of 1.0 ⁇ 10 5 cells/mL. After 24 hours, the hMSCs were scraped in a straight line using a 200 ⁇ L pipette tip to create a scratch. The cell debris was gently washed with medium, and the medium was replaced with a growth medium in which miPS-BGM ( ⁇ 40°C), miPS-BGM ( ⁇ 10°C), or miPS-BGM (30°C) was suspended at a concentration of 5 mg/mL.
  • miPS-BGM maintained higher amounts of bone metabolism-related proteins M-CSF, IL-27, adiponectin/Acrp30, and IL-6, osteoblast-related proteins SPARC, IL-17E, Decorin, TGF- ⁇ 1, osteoprotegerin, IGF-1, osteopontin, osteoactivin/GPNMB, and VCAM-1, and angiogenesis-related proteins PDGF C, endostatin, VEGF, and VEGFC.
  • proteome analysis mass analysis
  • miPS was induced to differentiate into bone for 30 days, and 0.2 g of cell mass was collected in a microtube and stored in a -80°C freezer for 24 hours to be used as the cell mass before freeze-drying.
  • the cell mass before freeze-drying and miPS-BGM were evaluated by DIA proteome analysis (LC-MS/MS (DIA), Promega) ( Figure 11). 5,812 proteins were identified, of which 98.7% (5,749 proteins) were common before and after freeze-drying. It was revealed that freeze-drying has almost no effect on the protein composition.
  • the microstructure of miPS-BGM produced by the tray freeze dryer is shown by SEM in Figure 12C.
  • the miPS-BGM that was dried at each primary drying temperature and then secondarily dried was observed using a scanning electron microscope (SU8000, Hitachi High-Technologies) at an accelerating voltage of 5 kV.
  • SU8000 Hitachi High-Technologies
  • the miPS-BGM (-40°C) and miPS-BGM (-10°C) samples showed aggregates of spherical structures with a relatively uniform size of about 10 ⁇ m in particle size (average particle size 7 ⁇ m).
  • the miPS-BGM (30°C) flake-like structures with an average particle size of 1 to 2 ⁇ m were observed.
  • Figure 12D shows the microstructure of miPS-BGM (Patent Document 2) produced by a conventional cooling stage freeze dryer (JFD-320 Freeze Drying Device, JEOL) with the primary drying temperature set to -10°C.
  • JFD-320 Freeze Drying Device, JEOL JFD-320 Freeze Drying Device
  • EDX was performed on the miPS-BGM produced using the tray freeze dryer to evaluate the elemental composition of each miPS-BGM.
  • the SEM-EDX images showed distribution of elements Ca, P, C, and O on the surface layer of the miPS-BGM, suggesting the presence of carbonate apatite.
  • the Ca/P ratio (atomic composition%) was similar between miPS-BGM (-40°C) and miPS-BGM (-10°C), being 1.34 and 1.41, respectively.
  • the ratio for miPS-BGM (30°C) was 0.43 ( Figure 12E).
  • EDX was performed on miPS-BGM (Patent Document 2) and human non-demineralized freeze-dried bone (OraGRAFT Cortical: LifeNet Health) produced using a cooling stage freeze-dryer with the primary freeze-drying temperature set at -10°C, and the Ca/P ratio (atomic composition%) was calculated (Figure 12F).
  • the Ca/P ratio of miPS-BGM (Patent Document 2) was 1.20, which was lower than the Ca/P ratio (1.41) of miPS-BGM (-10°C) produced using the above-mentioned shelf freeze-dryer.
  • the Ca/P ratio of human non-demineralized freeze-dried bone was 1.41, which was similar to the Ca/P ratio of miPS-BGM (-10°C) produced using the shelf freeze-dryer. Therefore, it was suggested that the miPS-BGM produced using the tray freeze dryer has a Ca/P ratio closer to that of natural bone compared to the miPS-BGM in Patent Document 2, making it more suitable as an artificial bone (bone filler).
  • the reason why the properties of miPS-BGM are different is thought to be because, although a cooling stage type freeze dryer can freeze-dry samples by placing them on a cooled stage, it is not possible to control the temperature of the drying chamber itself.
  • the shelf type freeze dryer used here is able to control the temperature inside the drying chamber by controlling the shelf temperature, and since there is also a sensor inside the chamber, it is possible to control the temperature more accurately. Furthermore, it is thought that this is because the time to reach a vacuum is quick, at 3 Pa or less in 10 minutes, allowing for rapid drying. This shows that temperature control during freeze-drying is important in order to produce a high-performance bone substitute.
  • XRD X-ray diffraction
  • TEM Transmission Electron Microscopy
  • miPS-BGM was embedded in resin, ultrathin sections (thickness 0.05 ⁇ m) were prepared from the resin block, and observed with a scanning TEM (JEM-ARM200F, JEOL Ltd.) at an accelerating voltage of 80 kV.
  • a cluster structure of needle-shaped particles was observed from the TEM image of miPS-BGM ( Figure 13B).
  • the length of the needle-shaped structure of miPS-BGM (-40°C) was 35 nm on average, which was significantly shorter than the lengths of the needle-shaped structures of miPS-BGM (-10°C) and miPS-BGM (30°C) (48 nm and 64 nm, respectively) (P ⁇ 0.05).
  • the length of the needle-shaped structure correlated with the temperature during primary drying (Figure 13C). Therefore, it is possible to distinguish iPS-BGMs with different temperature conditions for primary drying based on the average length of the needle-shaped structure.
  • Human iPS cell-derived bone filler 8. Analysis of human iPS cell-derived bone filler 8.1 Analysis of protein components of human iPS cell-derived osteoblast mass Protein components of human iPS cell-derived osteoblast mass before freeze-drying were analyzed. Human iPS osteoblast mass was prepared according to Patent Documents 1 and 3. Human iPS osteoblast mass was collected in an Eppendorf tube and stored in a freezer at -80°C. Human iPS cell mass before the start of osteoblast differentiation induction was used as a comparison. Protein expression and relative quantitative analysis were performed at Kazusa Genome Technologies using DIA proteome analysis (Promega Corporation).
  • hiPS-BGM contains proteins related to bone tissue regeneration such as bFGF, FGF-23, BMP-2, BMP-3, DMP-1, ALPP, GDF1, BMP-5, IGF-II, IGFBP-2, IGF-I, BMP-15, BMP-8, BMP-7, Osteoprotegerin/TNFRSF11B, and BMP-9, as well as EGFR-VEGF/PK1.
  • tissue contains many proteins related to angiogenesis, such as Angiopoietin-like 1, Angiopoietin-like Factor, PDGF-AA, Angiopoietin-2, VEGF R3, VEGF R1, and VEGF, and proteins related to bone metabolism, such as Beta IG-H3, IL-17B R, IFN-beta, Calcitonin, IL-17R, MMP-10, and TNF-beta.
  • proteins related to angiogenesis such as Angiopoietin-like 1, Angiopoietin-like Factor, PDGF-AA, Angiopoietin-2, VEGF R3, VEGF R1, and VEGF
  • proteins related to bone metabolism such as Beta IG-H3, IL-17B R, IFN-beta, Calcitonin, IL-17R, MMP-10, and TNF-beta.
  • hiPS-BGM includes COCO, Cadherin-13, Clusterin, C5/C5a, CD30 Ligand/TNFSF8, Kallikrein 5, IL-4, I GFBP-1, IL-1 F8/FIL1 eta, GRO, IL-8, Glut3, IL-29, ALCAM, CNTF, IL-21 R, CD163, IL-5, CD71, IL-21, E It was revealed that they are rich in proteins such as DG-1, Prolactin, IL-26, Growth Hormone (GH), GDF11, CD40 Ligand/TNFSF5/CD154, Cathepsin B, GDF8, GM-CSF, IL-7, CCR4, BNP, IL-2, IL-6, C-peptide, IL-17, GREMLIN, and BTC.
  • hiPS-BGM The temperature conditions for primary drying of hiPS-BGM were examined. As with miPS-BGM, preliminary freezing was performed at -80°C, and cell masses were primary freeze-dried at different shelf temperatures to produce cell masses. An extract of hiPS-BGM was added to bone differentiation induction medium, which was used to culture human bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hMSCs), and the bone formation induction ability of hiPS-BGM was evaluated based on the degree of differentiation. hMSCs were induced using bone differentiation medium in the same manner as described in 3.1.
  • hMSCs human bone marrow-derived mesenchymal stem cells
  • hiPS-BGM was suspended in bone differentiation medium at a concentration of 5 mg/mL and pulverized on ice for 2 minutes at 20% ultrasonic amplitude using an ultrasonic pulverizer. After sonication, the suspension was filtered through a syringe filter (pore size 0.22 ⁇ m, Merck) and added to osteoblast differentiation medium for hMSCs. The osteoblast differentiation medium was replaced every 3 days. 14 days after the start of bone differentiation induction, hMSCs were fixed in 10% neutral buffered formalin solution (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and stained for alkaline phosphatase (ALP) to evaluate the degree of bone differentiation.
  • ALP alkaline phosphatase
  • freeze-drying inactivates cells and eliminates the risk of tumor formation, and by optimizing the temperature and time, it is possible to produce a bone filler with excellent osteoconductivity and osteoinductive properties.
  • Optimal conditions were examined for all three freeze-drying steps: pre-freezing, primary drying, and secondary drying. In each step, the quality changes depending on the processing temperature and time, but the conditions for primary drying are particularly important, and the temperature of the sample must be maintained accurately. Also, from a cost perspective, it is preferable to carry out the three steps in a shorter time and at a higher cooling temperature.

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Abstract

幹細胞を三次元培養により骨芽細胞に分化誘導し、細胞塊を形成させ、骨補填材を製造した。凍結乾燥法を採用することによって、腫瘍形成のリスクを低減し、さらに免疫原性と局所の炎症を制御可能である。予備凍結工程、一次乾燥工程、二次乾燥工程の温度と時間を最適化することによって、性能がよく、コストを低減した骨補填材の提供が可能となった。安全性が高く、より高い骨伝導能、及び骨形成誘導能を備えた骨補填材を提供することができる。

Description

骨補填材、及びその製造方法
　本発明は、損傷した骨の組織を外科的に治療する際に用いる骨補填材、及びその製造方法に関する。
　骨組織は、脳や内臓の保護、骨格の支持、血液の産生やカルシウムなどの電解質の貯蔵等、複数の重要な機能を有している。骨組織は、外傷、骨腫瘍の外科的切除、感染症、骨髄炎などにより損傷を受ける。損傷が軽度の場合には、骨芽細胞が増殖・分化し、骨が再生し、治癒する。しかし、欠損が大きい場合や、骨芽細胞が有効に機能し得ない環境の場合には、骨移植を用いた治療が必要となる場合がある。高齢化が進んでいることにより、骨密度の低い高齢者層が増加しており、骨移植片及び人工骨移植材の市場は年々拡大している。そのため、骨補填材の開発が進んでいる。
　骨補填材としては、大きく分けて、自家骨、同種他家骨、異種骨、人工骨移植材がある。自家骨移植片は、大規模な骨欠損に対するゴールデンスタンダードと考えられているが、ドナー部位への侵襲、限られた供給量、感染などの欠点がある。凍結乾燥骨移植片及び脱灰凍結乾燥骨移植片は、比較的良好な骨誘導性を有することが報告されているが、供給量が限られていること、また、未知のウイルスや細菌感染のリスクの可能性がある。また、人工的な骨補填材にも以下のような問題があることが指摘されている。例えば、β－リン酸三カルシウム（β－ＴＣＰ）は、生体内での吸収が速いため、十分な骨量を確保できない。対照的に、ハイドロキシアパタイトや炭酸アパタイトは、吸収されにくく、骨が再生するスペースを確保するためには有用であるが、長期にわたり残存するため、感染の増加や脆弱性のリスクがある。
　歯科分野では、自家骨と骨代替物を組み合わせることで、これらの欠点に対処してきた。しかし、自家骨と人工骨を併用した上顎洞底挙上術を受けた患者全体の約２５％で術後１年後に骨吸収が生じたとの報告や、オンレーグラフト法による自家骨移植術の６ヵ月後には、骨の高さが２５％減少したことなどが報告されており、骨再生が十分に行われていないことが指摘されている。したがって、骨リモデリングを促進するような微小環境を作ることができる新しい骨補填材の開発が待たれている。
　人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）は、体細胞に決められた因子を導入することで作製でき、優れた増殖能と多能性を示すことから、再生医療への応用が期待されている。近年、ｉＰＳ細胞で、生体臓器に類似した三次元（３Ｄ）組織（オルガノイド）が人工的に作製され利用されるようになってきた。オルガノイドは、幹細胞の自己凝集と自己組織化によって生成され、生体臓器の発生過程を模倣している。オルガノイドの構造や機能が生体臓器と類似していることから、発生学、生理学などの基礎研究をはじめ、病態の解明や創薬研究、さらに再生医療のための移植にも応用されている。発明者らは、ｉＰＳＣをバイオリアクターで３次元培養し、骨分化を誘導し、ヒトｉＰＳＣの骨芽細胞塊を作製する方法を開発している（特許文献１）。ｉＰＳＣ由来のスフェロイド（細胞塊）やオルガノイドは有望なバイオマテリアルであるが、未分化の生細胞を移植することは腫瘍発生のリスクがある。また、移植された材料は生体にとって異物であるため、免疫原性と局所の炎症を制御することも必要となる。
　最近、幹細胞からｉｎ　ｖｉｔｒｏで作製した組織の組織成分を保持したまま細胞を不活化するという、新しい再生医療の概念が提唱された（非特許文献１）。この方法を用いれば、組織を「ｓｅｅｄ」の状態で長期保存し、患者に移植することで、組織再生を誘導することができるため、必要なときに必要な量の組織を供給することができる。さらに、未分化ｉＰＳＣを不活化することで潜在的な腫瘍形成リスクの低減や、炎症を制御できる可能性がある。幹細胞から誘導した細胞を材料とし、不活化することによって、骨伝導能、骨形成誘導能に優れた骨補填材を作製できる可能性があるが、未だ実用化には至っていない。
国際公開第２０１８／１８１９６０号 国際公開第２０１５／０６４７０５号 国際公開第２０２０／１７５５９２号
S. Pigeot, etal., Advanced Materials, 2021, 33, 2103737, https://doi.org/10.1002/adma.202103737. H. Egusa,et al., Stem Cells Dev,2014, 23(18),2156-69. H.Egusa, et al., Plos One, 2010,5(9) :e12743. doi: 10.1371/journal.pone.0012743.
　本発明者らは、骨リモデリングを促進する活性を保持したまま、細胞を不活化し、骨伝導能、骨形成誘導能に優れた骨補填材を開発している。細胞の不活化には、放射線照射、熱処理、薬物処理などの方法が用いられるが、タンパク質を変性させる可能性があるため、タンパク質の生理活性と構造を維持したまま細胞を不活化できる凍結乾燥法が良いと考えた。従来の乾燥法と比較して、凍結乾燥法は低温条件下で材料を乾燥させるため、材料の熱変性や化学変化が抑制される他、乾燥過程による製品の劣化速度を低下させ、室温での長期保存を可能にする。しかしながら、凍結乾燥条件により酸化、脱アミド化、加水分解などの化学変化や、タンパク質の高次構造変化による凝集を引き起こす可能性は否定できない。製造過程におけるこのような化学的・物理的変化は、生体内への埋植を目的とした骨補填材の生理学的活性を低下させるとともに、抗原として作用する可能性もある。本発明者らは、すでに骨芽細胞へ分化誘導したｉＰＳ細胞を凍結乾燥により不活化し、骨再生剤を作製している（特許文献２）。具体的には、骨芽細胞へ分化誘導したｉＰＳ細胞塊を－８０℃の冷凍庫内で一晩予備凍結を行った後、冷却ステージ上で温度を－１０℃に固定し、気圧を一晩かけて徐々に６～２０Ｐａまで下げていく方法で凍結乾燥し、二次乾燥を行わずに骨補填材を製造している。しかし、凍結乾燥温度をプログラムによって正確に制御可能で乾燥効率にも優れる棚式凍結乾燥機を使用していなかったため、各工程の温度制御、時間制御及び試料の乾燥が十分であったとは言えない。製造方法を改良し、制御することにより、より高い骨形成誘導能や炎症抑制能などを備えた骨補填材を製造できる可能性がある。
　骨組織は細胞、有機基質、無機基質からなる複合材料である。骨欠損の治療には様々な生体材料が用いられてきたが、これらの生体材料は骨形成誘導能や生産効率に一定の限界がある。本発明は、安全性が高く、より高い骨伝導能、及び骨形成誘導能を備えた骨補填材を提供することを課題とする。また、安定供給が可能で、生産効率が高く、より低コストで骨補填材を製造する方法を提供することを課題とする。
　本発明は、以下の骨補填材、骨補填材の製造方法に関する。
（１）幹細胞由来の骨補填材の製造方法であって、幹細胞から骨芽細胞に分化誘導し、細胞塊を形成する工程、予備凍結工程、－８０℃以上－１０℃以下で凍結乾燥を行う一次乾燥工程を含むことを特徴とする骨補填材の製造方法。
　凍結乾燥工程の温度を正確に調整して骨補填材を製造することが、その性能につながることが明らかとなった。特に、一次乾燥工程の際に、棚温度を制御して乾燥庫内の温度を一定にして凍結することが骨補填材の性能の向上に繋がることを見出した。
（２）さらに、二次乾燥工程を含むことを特徴とする（１）記載の骨補填材の製造方法。
　従来は、二次乾燥工程を行っていなかったが、二次乾燥工程により未凍結水の脱着（ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ）を行うことにより性能の良い骨補填材を製造することができる。
ｉＰＳ細胞から作製された細胞塊を凍結乾燥する工程を模式的に示す図。 使用した棚式凍結乾燥機の構成を模式的に示す図。 予備凍結条件の検討（１）。凍結温度と時間の検討。 予備凍結条件の検討（２）。安定化剤の検討。 一次乾燥条件の検討（１）。凍結乾燥時の乾燥棚温度条件の検討結果を示す図。 一次乾燥条件の検討（２）。凍結乾燥時の乾燥棚温度条件、－８０℃を含めた検討結果を示す図。 一次乾燥条件の検討（３）。凍結乾燥時の乾燥棚温度条件による骨分化マーカー遺伝子の発現を示す図。 一次乾燥条件の検討（４）。凍結乾燥時間の検討結果を示す図。 二次乾燥時間の検討結果を示す図。 ラット大腿骨欠損モデルへの埋植による評価結果を示す図。種々の温度で一次乾燥を行ったｍｉＰＳ－ＢＧＭ（ｍｏｕｓｅ　ｉＰＳ－ｂｏｎｅ　ｇｒａｆｔ　ｍａｔｅｒｉａｌ）の評価結果を示す。３ＤマイクロＣＴ画像（上）と欠損部正中線の断面画像（下）。矢印は骨欠損の縁を示す。スケールバー：１．０ｍｍ ３ＤマイクロＣＴ画像を用いて骨パラメータを定量的に解析した結果を示す図。骨量（ＢＶ／ＴＶ）及び骨塩量（ＢＭＣ）は、欠損部位で分析した（平均値±ＳＤ、ｎ＝３～７）。 ｍｉＰＳ－ＢＧＭ埋植３週間後の大腿骨欠損部位のヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色像（上段）、及び抗ガレクチン－３抗体による免疫組織染色像を示す。矢印は形成された欠損部の縁を示す。スケールバー：１．０ｍｍ 上段は、図６Ａ上段ＨＥ染色像の点線枠部分の拡大像。下段は図６Ａ下段の免疫組織染色像の点線部分の拡大像。＊は残存するｍｉＰＳ－ＢＧＭを、矢印は好中球を示す。スケールバー：１００μｍ。挿入図は各図において四角で囲んだ部分の拡大図。挿入図スケールバー：１０μｍ。 残存しているｍｉＰＳ－ＢＧＭの面積を示す（平均値±ＳＤ、ｎ＝１２～１４）。 マクロファージ活性に対するｍｉＰＳ－ＢＧＭの効果を示す図。写真は、増殖培地（ＧＭ）又はｍｉＰＳ－ＢＧＭ添加増殖培地で培養したマクロファージの１日後の顕微鏡像；スケールバー：２００μｍ。グラフは、マクロファージを増殖培地又はｍｉＰＳ－ＢＧＭを懸濁した増殖培地で培養し１日後、又は３日後の炎症及び抗炎症関連遺伝子の発現を示す図。 一次乾燥温度－４０℃、－１０℃、３０℃で作製したｍｉＰＳ－ＢＧＭから放出された総タンパク質量を示す図。 ｍｉＰＳ－ＢＧＭ存在下で培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）のＦ－アクチンの蛍光画像。点線で記載している円はｍｉＰＳ－ＢＧＭの位置を示す。スケールバー：１００μｍ。 ｍｉＰＳ－ＢＧＭ周囲のｈＭＳＣの細胞数（平均値±ＳＤ、ｎ＝３）。 創傷治癒アッセイの結果を示す図。スクラッチ形成直後（０時間）と培養９時間後のｈＭＳＣの位相差顕微鏡像（上段、スケールバー：２００μｍ）及び、９時間後のスクラッチ領域内の遊走細胞数（平均±ＳＤ、ｎ＝３）を示すグラフ（下段）。 サイトカイン抗体アレイによるｍｉＰＳ－ＢＧＭの評価。一次乾燥温度－４０℃で製造したｍｉＰＳ－ＢＧＭ、及びコントロールとしてβ－ＴＣＰを比較した。標的である３０８のタンパク質の蛍光シグナル強度をＸ軸に、Ｙ軸に蛍光シグナル強度比（ｍｉＰＳ－ＢＧＭ／β－ＴＣＰ強度）を示す。 ｍｉＰＳ－ＢＧＭのプロテオーム解析結果を示す図。凍結乾燥前のｍｉＰＳ細胞塊とｍｉＰＳ－ＢＧＭ間で共通に、又は特異的に同定されたタンパク質数を表示したベン図。 一次乾燥温度の異なるｍｉＰＳ－ＢＧＭのマクロ写真。 一次乾燥温度の異なるｍｉＰＳ－ＢＧＭの圧縮試験の結果を示す図。 一次乾燥温度の異なるｍｉＰＳ－ＢＧＭのＳＥＭ画像。 冷却ステージ式凍結乾燥機を用いて作製したｍｉＰＳ－ＢＧＭのＳＥＭ画像。 棚式凍結乾燥機を用いて作製したｍｉＰＳ－ＢＧＭの元素組成解析結果を示す図。 冷却ステージ式凍結乾燥機を用いて作製したｍｉＰＳ－ＢＧＭ及び、ヒト非脱灰凍結乾燥骨の元素組成解析結果を示す図。 一次乾燥温度の異なるｍｉＰＳ－ＢＧＭからのカルシウム溶出量の測定結果を示す図。 一次乾燥温度の異なるｍｉＰＳ－ＢＧＭのＸＲＤパターン。 一次乾燥温度の異なるｍｉＰＳ－ＢＧＭのＴＥＭ／ＳＴＥＭ像、スケール、左パネル：２００ｎｍ、右パネル：１００ｎｍ。 ＴＥＭ像から測定したｍｉＰＳ－ＢＧＭの繊維状アパタイトの長さを示す図。 サイトカイン抗体アレイによるヒトｉＰＳ－ＢＧＭの評価。ヒト凍結乾燥骨（ＦＤＢＡ）をコントロールとして比較した。 一次乾燥温度の異なるヒトｉＰＳ－ＢＧＭによる骨分化誘導能をＡＬＰ染色により解析した結果を示す図。 創傷治癒アッセイの結果を示す図。スクラッチ形成後６時間培養したｈＭＳＣの位相差顕微鏡像（上段）及び、６時間後のスクラッチ領域内の遊走細胞数を示すグラフ（下段）。
　骨補填材は、自家骨以外で骨の再生を目的として用いられる材料をいい、人工骨、骨代替物、骨再生剤等と互換的に用いることができる。本発明の骨補填材は、幹細胞を原料とし、骨伝導能及び骨形成誘導能を有するものをいう。なお、骨伝導能とは、例えばインプラントなどの医療材料を生体内の自然骨内に埋入したとき、材料表面に沿って骨が形成され、材料と骨が結合して一体となる機能をいい、骨形成誘導能とは、骨が疾病や傷害により欠損や変性を被った場所で、間葉系幹細胞などの骨芽細胞等への分化を促して新生骨をつくることができる能力をいう。
　本発明の骨補填材の製造に用いる幹細胞は、骨芽細胞に誘導できるものであれば、特に限定されないが、例えば、多能性幹細胞や体性幹細胞が挙げられる。多能性幹細胞としては、ｉＰＳ細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ　Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　Ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ）、ＥＧ細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　Ｇｅｒｍ　ｃｅｌｌ；胚性生殖細胞）又はＥＳ細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ）等が挙げられる。また、体性幹細胞としては、例えば、間葉系幹細胞、骨格幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞等が挙げられるが、骨芽細胞に分化することから、間葉系幹細胞あるいは骨格幹細胞が好ましい。
　上述のように、凍結乾燥であっても条件によって、酸化、脱アミド化、加水分解などの化学変化や、タンパク質の高次構造変化による凝集を引き起こす可能性がある。したがって、凍結乾燥法の条件設定は、性能の良い骨補填材を製造することに繋がる。治療に用いる再生医療等製品の生産には、製品の品質を保証することが必要であり、凍結乾燥工程を最適化し、一定の品質を保証する必要がある。さらに、凍結乾燥工程は乾燥時間が長く、大量の電力を消費するため、高品質を維持しながら生産効率を高めるために、凍結乾燥サイクルを最適化することが極めて重要である。以下の実施例に示すように、本発明者らは、凍結乾燥工程、特に一次乾燥条件の最適化を行い、本発明を完成させた。一次乾燥条件を最適化することで、生体内でのｍｉＰＳ細胞（ｍｏｕｓｅ　ｉＰＳ）、さらにｈｉＰＳ細胞（ｈｕｍａｎ　ｉＰＳＣ）由来骨移植材料の骨置換性を向上させることができた。
　以下、データを示しながら本発明を説明する。以下の実験ではマウス歯肉線維芽細胞由来のｉＰＳ細胞、及びヒトｉＰＳ細胞由来骨芽細胞を用いているが、幹細胞であればどのような細胞を用いてもよい。また、動物種を問わず同様にして骨補填材を製造することができることは言うまでもない。また、ｉＰＳ細胞も歯肉線維芽細胞に限らず、血液細胞、皮膚線維芽細胞、歯髄細胞等種々の細胞から樹立した細胞を用いることができる。
１．ｉＰＳ細胞の培養
　幹細胞の骨細胞への誘導、３次元培養による細胞塊の製造は、以下の方法に限らず公知の方法で行うことができる。Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４をレトロウイルスで導入して作製したマウス歯肉線維芽細胞由来ｉＰＳ細胞（ｍｉＰＳＣ、非特許文献２、３）を用いて以下の実験を行った。ｍｉＰＳＣは不活化したＳＮＬＰ７６．７－４（英国Ｓｔａｎｇｅｒ　ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＤｒ．Ａｌｌａｎ　Ｂｒａｄｌｅｙより供与）フィーダー細胞上でＥＳ培地（ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、ナカライテスク）、１５％ＦＢＳ（Ｂｉｏｓｅｒａ）、２ｍＭ　Ｌ－グルタミン（富士フイルム和光純薬）、１×１０－４Ｍ非必須アミノ酸（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１×１０－４Ｍ　２－メルカプトエタノール（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ペニシリン（５０Ｕ）／ストレプトマイシン（５０μｇ／ｍＬ）（富士フイルム和光純薬））により培養した。ｍｉＰＳＣは、０．２５ｗ／ｖ％トリプシン－１ｍＭ／Ｌ　ＥＤＴＡ溶液を用いて、５～６日ごとに継代した。ｍｉＰＳＣの胚様体は、低接着性培養皿を用いてＥＳ培地中で２日間形成させた。その後、１μＭのオールトランス型レチノイン酸を添加したＥＳ培地で、さらに浮遊培養を２日間行った（非特許文献２）。
　また、フィーダー細胞として用いたＳＮＬＰ７６．７－４細胞は、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、グルコース４．５ｇ／Ｌ）、７％牛胎児血清（ジャパン・バイオシーラム）、２ｍＭ　Ｌ－グルタミン、ペニシリン（５０Ｕ）／ストレプトマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を含む培地で培養した。細胞が９０％コンフルエントに達した時点で、１２μｇ／ｍＬのマイトマイシンＣ（富士フイルム和光純薬）により３７℃で２．５時間処理し、ＤＮＡ複製を阻害し不活化した。その後、生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄しフィーダー細胞として用いた。
２．細胞塊形成
　胚様体は、７０ｍＬフラスコで、骨芽細胞分化培地（α改変培地（ナカライテスク）、１５％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）、０．０１μＭデキサメタゾン（Ｍｅｒｃｋ）、１０ｍＭ　β－グリセロリン酸（Ｍｅｒｃｋ）、５０μｇ／ｍＬアスコルビン酸－２－リン酸（Ｍｅｒｃｋ）、１％抗生物質－抗真菌剤溶液（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））中で培養し、骨芽細胞分化誘導を行った。フラスコをシーソーシェーカーに置き、０．３Ｈｚで３０日間振盪培養した。骨芽細胞分化培地は２日ごとに交換した。
３．凍結乾燥
　上述のように、凍結乾燥法の条件設定が、性能の良い骨補填材を製造することに繋がると考えられることから、凍結乾燥の条件を詳細に検討した。凍結乾燥は、予備凍結（Ｉｎｉｔｉａｌ　ｆｒｅｅｚｉｎｇ、氷晶の形成）、一次乾燥（Ｐｒｉｍａｒｙ　ｄｒｙｉｎｇ、氷晶の昇華）、二次乾燥（Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ　ｄｒｙｉｎｇ、未凍結水の脱着）の３段階からなる（図１Ａ）。典型的な棚式凍結乾燥機は、乾燥庫、凝縮器（コールドトラップ）、減圧装置（真空ポンプ）、温度制御装置から構成される（図１Ｂ）。棚式凍結乾燥機は、乾燥プロセス中に製品を冷却・加熱するために、温度制御可能な棚が乾燥庫内部に配置されており、乾燥対象に接触する乾燥棚の温度を制御することにより、乾燥庫内全体を正確に温度制御し、優れた乾燥効率を実現している。乾燥時の正確な温度制御が重要であると考えられるため、ここでは棚式凍結乾燥機（ＥＹＥＬＡ　ＤＲＣ－１１００、東京理化器械）を用いて凍結乾燥を行っているが、乾燥時に試料温度を正確に制御することができれば、どのような凍結乾燥機を用いてもよい。そのような乾燥機として、例えば、密閉型チューブ式凍結乾燥システム、輻射加熱式真空凍結乾燥装置などがある。なお、本乾燥機の棚温度調節範囲は－４０℃から３０℃であるため、一次乾燥温度を－８０℃に設定した検討のみ、液体窒素式真空凍結乾燥機（ＮＲＬ－ＢＣ０２Ｓ、大陽日酸）を用いている。
　３０日間の骨芽細胞分化誘導後、ｍｉＰＳ細胞塊をＰＢＳで洗浄し、ガラスバイアル（直径１９ｍｍ、長さ４８ｍｍ、日電理化硝子株式会社）に移し、凍結乾燥まで－８０℃または－３０℃の冷凍庫で保存し、凍結乾燥機に急速に移して凍結乾燥を行った。表１に検討した凍結乾燥の条件をまとめた。乾燥棚温度は、一次乾燥工程と二次乾燥工程の間で、１．５℃／分の速度で上昇するように設定した。二次乾燥後、凍結乾燥したｍｉＰＳ－ＢＧＭ（ｍｉＰＳ－ｂｏｎｅ　ｇｒａｆｔ　ｍａｔｅｒｉａｌ。以下、凍結乾燥したｍｉＰＳをｍｉＰＳ－ＢＧＭという。）の劣化を防ぐため、チャンバー内を窒素ガスに置換した。ｍｉＰＳ－ＢＧＭは、オートドライデシケーター（アズワン株式会社）で室温（２３℃）、湿度１５％以下で保存した。
３．１　予備凍結（Ｉｎｉｔｉａｌ　ｆｒｅｅｚｉｎｇ）条件の検討
　予備凍結は、試料全体を凍結させる温度である共晶点以下まで冷却する工程である。この工程は、氷晶を形成し、成長させることで、乾燥試料の多孔性を確保するため極めて重要である。凍結が不十分だと、その後の一次乾燥工程で、真空度の上昇に伴って水分が急速に膨張し、試料の沸騰につながる可能性があるからである。予備凍結工程の条件は、その後の乾燥工程の効率に影響するため、条件の検討を行った。さらに、糖類や糖アルコールなどの様々な安定剤を最初の凍結工程で使用することで、タンパク質へのダメージを軽減し、凍結及び一次乾燥中の安定性を維持できるか検討を行った。
　表１Ａの各条件で作製したｍｉＰＳ－ＢＧＭの抽出物を骨芽細胞分化培地に添加し、これを用いてヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ、馬渕博士、東京医科歯科大学、及び松崎博士、島根大学より供与）を培養し、その分化の程度によりｍｉＰＳ－ＢＧＭの骨形成誘導能を評価した。ｈＭＳＣは、ＭＳＣ増殖培地（ＤＭＥＭ（ピルビン酸不含有、４．５ｇ／Ｌグルコース、ナカライテスク）、２０％ＦＢＳ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、１％ペニシリン（５０Ｕ）／ストレプトマイシン（５０μｇ／ｍＬ）、１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ（同仁化学研究所）、及び１０ｎｇ／ｍＬの組換えｂ－ＦＧＦ（富士フイルム和光純薬））で培養した。ｈＭＳＣは１０ｃｍの培養皿に、細胞密度３×１０４細胞／ｍＬ、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。増殖培地は３－４日ごとに交換した。ｈＭＳＣが８０％コンフルエントに達した時点で、トリプシンにより細胞を収集し、細胞密度４×１０５細胞／ｍＬで２４ウェルプレートに播種し、２４時間後、増殖培地を骨芽細胞分化培地（Ｌｏｎｚａ）に代えて培養を行った。
　ｍｉＰＳ－ＢＧＭは、５ｍｇ／ｍＬの濃度で骨芽細胞分化培地に懸濁し、氷上で超音波粉砕機（ＢＲＡＮＳＯＮ　Ｄｉｇｉｔａｌ　Ｓｏｎｉｆｉｅｒ　ＳＦＸ１５０、ＥＭＥＲＳＯＮ）を用いて２０％の超音波振幅で２分間粉砕した。超音波処理後、懸濁液をシリンジフィルター（孔径０．２２μｍ、Ｍｅｒｃｋ）でろ過し、ｈＭＳＣの骨芽細胞分化培地に添加した。骨芽細胞分化培地は３日ごとに交換した。骨分化誘導開始７日後、ｈＭＳＣは、１０％中性緩衝ホルマリン液（富士フイルム和光純薬）で固定し、カルシウム沈着をアリザリンレッドＳ（ＡＲＳ）染色し、骨分化の程度を評価した。
　アリザリンレッドＳ染色は以下のようにして行った。固定後のｈＭＳＣを脱イオン水で２回洗浄した後、１％ＡＲＳ溶液（ｐＨ６．３、武藤化学株式会社）を加え、室温で穏やかに振盪しながら２０分間染色した。脱イオン水で４回洗浄後、ｈＭＳＣを光学顕微鏡（ＢＸ５１、オリンパス）で観察した。染色の定量には、各ウェルに１０％酢酸（富士フイルム和光純薬）を加え、プレートを室温で３０分間静置した後、溶液をマイクロチューブに集め、３０秒間ボルテックスミキサーにより攪拌した。サンプルを８５℃で１０分間加熱し、その後氷上で５分間冷却した。２０，０００×ｇで１５分間遠心後、上清に１０％水酸化アンモニウム（富士フイルム和光純薬）を加え、上清の吸光度をマイクロプレートリーダー（ｉＭａｒｋ、ＢＩＯ　ＲＡＤ）を用いて４０５ｎｍで測定した。
　結果を図２Ａに示す。上段は染色したウェルの写真を、下段は定量結果を示す。－８０℃で予備凍結を行ったｍｉＰＳ－ＢＧＭの方が、－３０℃で予備凍結を行ったｍｉＰＳ－ＢＧＭに比べ、より骨分化を促進する効果が認められた。－８０℃で６時間以上予備凍結し作製したｉＰＳ－ＢＧＭは、ｈＭＳＣに有意な骨分化を促進した（Ｐ＜０．０５）。予備凍結は－８０℃であれば、１時間であっても、－３０℃２４時間よりも高い骨分化促進効果が見られることや、６時間以上では効果に差は認められないことから、１時間以上、好ましくは２時間以上、より好ましくは４時間以上、さらに好ましくは６時間以上凍結すれば、高い骨形成分化能を有する骨補填材を得ることができる。また、予備凍結温度に関しても、これら結果から－４０℃以下、好ましくは－６０℃以下の温度で凍結すれば良いと思われる。
　糖類や糖アルコールなどの安定剤は、凍結時にタンパク質を保護することが知られているので、種々の安定化剤について検討を行った。スクロース（Ｍｅｒｃｋ）、トレハロース（ナカライテスク）、マルトース（ナカライテスク）、マルチトール（ナカライテスク）、ラクトース（ナカライテスク）、及びＣａＣｌ２（ナカライテスク）を安定剤として使用した。添加剤をそれぞれＰＢＳに溶解し、１０％溶液を得た。２５ｃｍ２培養用フラスコ１本分のｍｉＰＳＣ細胞塊を、５ｍｌの各添加剤が入ったＰＢＳ溶液中で４℃、１時間静置した後、－８０℃で６時間凍結した。凍結したサンプルは、室温（２３℃）で６時間凍結乾燥した。上記と同様にｈＭＳＣの骨分化能促進で評価した。結果を図２Ｂに示す。いずれの安定化剤もｍｉＰＳ－ＢＧＭの骨形成分化能を変化させなかった（図２Ｂ）。
３．２　一次乾燥（Ｐｒｉｍａｒｙ　ｄｒｙｉｎｇ）条件の検討
　一次乾燥の温度条件の検討を行った。表１Ｂに示すように、－８０℃で予備凍結を行い、異なる温度で細胞塊を一次凍結乾燥した。上記と同様にしてアリザリンレッドＳ染色を行い、骨分化誘導能を評価した。結果を図３Ａに示す。上段は骨分化誘導7日目のｈＭＳＣのアリザリンレッドＳ染色画像を示す。図中、ＧＭは増殖培地、ＯＳはｍｉＰＳ－ＢＧＭを含まない骨芽細胞分化培地を示す。また、下段は定量結果を示し、異なるアルファベット間は有意差（Ｐ＜０．０５、ＡＮＯＶＡ後のＴｕｋｅｙの多重比較検定による。以下の実験でも特に断りのない限り、同様に表示する。）があることを示す(平均値±ＳＤ、ｎ＝３)。一次乾燥時の乾燥棚温度－１０℃で作製された骨補填材は、３０℃で作製された骨補填材に対し、有意な骨分化誘導能を有することが示された。さらに、－２０℃、－４０℃とより低い温度で作製すると、より高い骨分化誘導能を有する。－４０℃より低温で凍結乾燥を行った場合に、より高い骨分化誘導能を有するか解析を行った（図３Ｂ）。表１Ｂに記載の一次乾燥温度が－８０℃の温度条件で、ｍｉＰＳ－ＢＧＭを作製し、アリザリンレッドＳ染色により、骨分化誘導能を評価した。－８０℃で一次乾燥を行った場合と－４０℃で一次乾燥を行った場合では、骨分化誘導能に差は認められなかった。性能に差は認められないものの一次乾燥温度を低く設定するためには液体窒素の使用など、冷却にコストがかかることから、－４０℃で一次乾燥を行う方がコスト面からは好ましい。－１０℃であれば、３０℃（室温）に比べて高い骨分化誘導能を有することから、一次乾燥温度は－１０℃以下に設定すればよい。さらに、－２０℃以下であればより高い骨分化誘導能を有することから－２０℃以下で一次乾燥を行うことがより好ましい。
　さらに、定量的リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ解析法により、各温度条件での骨分化関連遺伝子（ＣＯＬ１Ａ１、ＲＵＮＸ２、ＯＣＮ）の発現解析を行った。ｍｉＰＳ－ＢＧＭを添加した骨分化培地でｈＭＳＣを培養７日後、細胞からＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡはＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて単離・精製した。ＤＮＡ－ｆｒｅｅ　ＤＮＡ　Ｒｅｍｏｖａｌ　Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によりＤＮＡ除去後、１μｇのｔｏｔａｌ　ＲＮＡを用いて、公知の方法によりｃＤＮＡを合成した。定量的リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ解析は、Ｔｈｕｎｄｅｒｂｉｒｄ　ＳＹＢＲ　ｑＰＣＲ　Ｍｉｘ（東洋紡）を用い、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ　ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＰＣＲ　ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて行った。標的遺伝子の発現は２－△△Ｃｔ法で定量解析し、ＧＡＰＤＨの発現で正規化した。使用したプライマー配列を表２に示す。なお、使用したプライマーはヒト配列に対するプライマーである。
　－４０℃で凍結乾燥したｍｉＰＳ-ＢＧＭは、ｈＭＳＣのＣＯＬ１Ａ１、ＲＵＮＸ２、ＯＣＮの骨分化関連遺伝子発現を有意に上昇させた（Ｐ＜０．０５）（図３Ｃ）。
　次に、乾燥棚温度を－４０℃に固定し、一次乾燥時間の最適化を行った。なお、予備凍結は－８０℃、２４時間、二次乾燥は３０℃、２時間に固定して検討を行った（表１Ｃ）。その結果、この条件ではｍｉＰＳ－ＢＧＭの一次乾燥が０．５時間のときに、ｈＭＳＣの骨分化が最も高く維持されることが明らかになった（図３Ｄ）。試料の容量等によっても完全に乾燥するまでの時間は変化するため、一概に言うことはできないが、完全に乾燥させることができればより短時間であっても構わない。例えば、この実験条件であれば、１０分以上、好ましくは１５分以上であればよいと思われる。なお、一次乾燥時間１時間、３時間、６時間ではほとんど差は認められなかった。
３．３　二次乾燥（Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ　ｄｒｙｉｎｇ）条件の検討
　次に、二次乾燥時間の最適化を行った。なお、二次乾燥は、未凍結水の脱着を目的とすることから、乾燥温度は室温で行えばよく、ここでは３０℃で行っている。また、予備凍結は－８０℃、２４時間、一次乾燥時間は－４０℃、１時間に固定して検討を行った（表１Ｄ）。その結果、ｍｉＰＳ－ＢＧＭの二次乾燥時間は０．５時間以上であれば、ｈＭＳＣの骨分化が維持されることが明らかになった（図４）。未凍結水はおそらくわずかであると考えられることから、より短時間、例えば１０分程度でも十分であると考えられる。
４．ラット大腿骨欠損モデルによるｉＰＳ－ＢＧＭの評価
　上記の実験結果から、一次乾燥時の棚温度が、ｍｉＰＳ－ＢＧＭの品質に大きく影響することが明らかとなった。予備凍結、二次乾燥の条件を一定に設定し（予備凍結：－８０℃／６時間、二次乾燥：３０℃／０．５時間）、一次乾燥の条件を変えて、（一次乾燥：－４０℃、-１０℃、又は３０℃／０．５時間、）以下の実験を行った。
　一次乾燥時の温度の違いによるｍｉＰＳ－ＢＧＭの品質の違いをラット大腿骨欠損モデルを用いて解析した。異なる一次乾燥温度で作製したｍｉＰＳ－ＢＧＭの治療効果を、大腿骨欠損を有するラットモデルを用いて評価した。ラットモデルは、体重３４０～４１０ｇ（平均３８０ｇ）の１１週齢のＳｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラット（ＣＬＥＡ）を用いた。２％イソフルラン吸入により麻酔導入させ、併用麻酔薬（１ｍｇ／ｍＬ塩酸メデトミジン（ドミトール、明治製菓）、５ｍｇ／ｍＬミダゾラム（ドーミカム、アステラス製薬）を使用し、持続麻酔は０．９％ｗ／ｖ塩化ナトリウム（生理食塩水、大塚製薬）に５ｍｇ／ｍＬのブトルファノール（ベトルファール、明治製菓株式会社）を加えて行った。左脚を剃毛後、ラットをポビドンヨード（カネイチ化学）で消毒し、キシロカインを用いて局所麻酔を行った。皮膚と筋肉を切開し、大腿骨を露出し、大腿骨の中央に丸鋼バリ（Ｄｒｅｎｄｅｌ＋Ｚｗｅｉｌｉｎｇ　Ｄｉａｍａｎｔ）を用いて、灌流下で皮質骨欠損（３ｍｍ×５ｍｍ、臨界サイズ）を形成した。その後、０．２ｃｃのｍｉＰＳ－ＢＧＭを大腿骨の欠損部に埋植した。埋植部位は、１０ｍｍ×２０ｍｍの吸収性コラーゲンメンブレン（コーケンティッシュガイド、高研）で包んだ。大腿骨は、プレハブチタンステントを用いてスプリント固定し、その後、水圧ポリウレタン樹脂入りグラスファイバー（キャストライトα、Ａｌｃａｒｅ）とステンレスワイヤーで大腿骨中央部を包んで結紮した。筋肉と皮膚は５－０ポリプロピレン縫合糸（ＰＲＯＬＥＮＥ、Ｅｔｈｉｃｏｎ）を用いて縫合した。ラットは３７℃のヒーティングマット（夏目製作所）上で手術を行った。３週間後、ラットを安楽死させ、マイクロＣＴや組織学的検査を行った。
　ｍｉＰＳ－ＢＧＭを埋植して３週間後、マイクロＣＴを用いて大腿骨欠損部をスキャンし、骨量、骨密度、骨塩量を定量した。大腿骨サンプルは、１０％中性緩衝ホルマリンにて４℃で１週間固定した。ｍｉＰＳ－ＢＧＭ埋植部位の骨量、骨密度、骨塩量は、３ＤマイクロＸ線ＣＴ装置（Ｓｃａｎ　Ｘｍａｔｅｒ－Ｅ０９０、コムスキャンテクノ）と骨構造解析ソフトウェア（ＴＲＩ／３Ｄ－ＢＯＮ、ラトックシステムエンジニアリング）を用いて評価した。試料のＸ線スキャンは、厚さ１ｍｍの真鍮フィルターを通して、エネルギーレベル８０ｋＶ／６０μＡで行った。３Ｄ画像は、同じＸ線条件でハイドロキシアパタイトファントムをスキャンして得られた骨塩量の検量線に基づいて再構成した。分析対象領域は試料ごとに設定した。皮質領域は、欠損端の両側で外側の基本ラメラ点と内側の基本ラメラ点を直線で結んだ領域と定義した。骨組織に対する具体的な閾値は、分割した画像を元のグレースケールＸ線画像に重ね合わせて決定した。
　ｍｉＰＳ－ＢＧＭ埋植群では、非埋植群に比べて骨再生が促進された（図５Ａ）。さらに、新生骨の形成は、ｍｉＰＳ－ＢＧＭを埋植した場合、非埋植群と比較して有意に高かった（図５Ｂ）。
　骨欠損部の病理学的解析を行った。大腿骨サンプルは、７０％エタノール、続いて１００％エタノールにそれぞれ１日ずつ、計２日間浸漬することにより脱脂し、０．５ｍｏｌ／Ｌ　ＥＤＴＡ溶液（富士フイルム和光純薬）に４週間入れて脱灰した。エタノール、アセトン、キシレンで脱水後、パラフィン包埋した。厚さ３．５μｍのパラフィン切片をヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色し、形態学的観察を行った。また、マクロファージのマーカー分子であるガレクチン－３を免疫組織化学染色により可視化した。免疫組織化学染色は、パラフィン切片を１００％キシレン（富士フイルム和光純薬）、及びキシレン／エタノール（５０／５０）で５分間の洗浄を２回繰り返して脱パラフィンし、段階的エタノール（１００％、９５％、８０％、７０％）及び蒸留水で再水和した。その後、１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０、富士フイルム和光純薬）を用いて６０℃で一晩抗原を賦活化した。スライドをＰＢＳで洗浄し、３％過酸化水素（富士フイルム和光純薬）で室温、１０分間処理し、内因性ペルオキシダーゼ活性を阻害した。その後、スライドをＰＢＳで洗浄し、１％ウシ血清アルブミン（富士フイルム和光純薬）を用いて３０分間静置し、反応を停止した。抗ガレクチン－３抗体（Ｇａｌｅｃｔｉｎ－３／ＬＧＡＬＳ３　Ｒａｂｂｉｔ　ｍＡＢ、Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で４℃、一晩インキュベートした。その後、Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ＴＢＳＴ）でスライドを洗浄し、二次抗体（マウス抗ウサギＩｇＧ－ＨＲＰ、Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で室温、１時間インキュベートした。サンプルをＰＢＳＴで洗浄し、ＤＡＢ基質（Ｍｅｒｃｋ）で１５分間インキュベートして可視化した後、ヘマトキシリンでカウンター染色した。
　骨欠損部のＨＥ染色では、－１０℃、及び３０℃で製造したｍｉＰＳ－ＢＧＭ埋植群（以下、ｍｉＰＳ－ＢＧＭをｍｉＰＳ－ＢＧＭ（－１０℃）、ｍｉＰＳ－ＢＧＭ（３０℃）のように、作製した一次乾燥温度で骨補填材を記載する。）で、急性炎症のマーカーである好中球浸潤が認められた（図６Ａ上段、及び６Ｂ上段）。一方、ガレクチン－３陽性マクロファージは、ｍｉＰＳ－ＢＧＭ（－４０℃）周辺に集積し（図６Ａ下段、及び６Ｂ下段）、ｍｉＰＳ－ＢＧＭ（－１０℃）、及びｍｉＰＳ－ＢＧＭ（３０℃）周辺ではほとんど観察されなかった。顆粒状で残存するｍｉＰＳ－ＢＧＭの総面積を解析した結果、ｍｉＰＳ－ＢＧＭ（３０℃）の面積は、ｍｉＰＳ－ＢＧＭ（－４０℃）及びｍｉＰＳ－ＢＧＭ（－１０℃）の面積よりも有意に大きかった（図６Ｃ）。また、ｍｉＰＳ－ＢＧＭを埋植した１７個のラット大腿骨サンプルでは、巨視的にも組織学的にも腫瘍形成は観察されなかった。
５．炎症反応に対する評価
　種々の一次乾燥温度で作製したｍｉＰＳ－ＢＧＭの炎症反応に対する効果を評価した。マウスマクロファージ様細胞株Ｊ７７４Ａ．１（ＪＣＲＢ９１０８）は、独立行政法人医薬基盤・健康・栄養研究所細胞バンクより入手した。細胞は、ピルビン酸ナトリウムを含まない４．５ｇ／Ｌグルコース含有ＤＭＥＭ（ナカライテスク）、１０％ＦＢＳ（ジャパン・バイオシーラム）、２ｍＭ　Ｌ－グルタミン（富士フイルム和光純薬）、ペニシリン（５０Ｕ）／ストレプトマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を用い、３７℃、５％　ＣＯ２、加湿下で培養した。細胞は３日ごとに培地を更新しながら２回継代した。８０％コンフルエントまで培養後、細胞を集め、６ウェルプレートに３．０×１０５細胞／ｍＬの細胞密度で播種した。２４時間後、培地をそれぞれ５ｍｇ／ｍＬのｍｉＰＳ－ＢＧＭ懸濁培地と交換し、３日培養し、細胞を集めリアルタイムＲＴ－ＰＣＲにより炎症性遺伝子、抗炎症性遺伝子の発現を解析した。使用したプライマー配列を表３に示す。なお、使用したプライマーはマウス配列に対するプライマーである。
　マクロファージＪ７７４Ａ．１細胞を、粉砕したｍｉＰＳ－ＢＧＭを含む増殖培地で培養し、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ解析を用いて、１日目または３日目に炎症性（Ｉｌ－１β、Ｔｎｆα、Ｉｌ－６）、又は抗炎症性（Ｉｌ－１０、Ｔｇｆβ１、Ｉｌ－１１）サイトカインの遺伝子発現を解析した。図７上段の画像で示すように、いずれの温度で製造したｍｉＰＳ－ＢＧＭを添加した群でも、添加１日に増殖培地（ＧＭ）群と比較して細胞が集簇し、コロニーを形成していた。ｍｉＰＳ－ＢＧＭ添加１日目のＴｇｆβ１の遺伝子発現は、ＧＭ群と比較して有意に発現が高かった。Ｔｇｆβ１、Ｉｌ－１０およびIｌ－１１遺伝子の発現は、ｍｉＰＳ－ＢＧＭ（－４０℃）添加群で、ＧＭ群、ｍｉＰＳ－ＢＧＭ（－１０℃）及びｍｉＰＳ－ＢＧＭ（３０℃）添加群よりも高い値を示した。Ｉｌ－１β、ＴｎｆαとＩｌ－６の遺伝子発現は、ＧＭ群と比較していずれのｍｉＰＳ－ＢＧＭ添加群でも著明に減少していた。Ｉｌ－１β遺伝子発現は、ｍｉＰＳ－ＢＧＭ（－４０℃）添加群において、ｍｉＰＳ－ＢＧＭ（－１０℃）及びｍｉＰＳ－ＢＧＭ（３０℃）添加群と比較して有意差は認めないものの低い値を示した（図７下段グラフ）。
６．ｍｉＰＳ－ＢＧＭのタンパク質プロファイル
６．１　タンパク質量の測定
　各一次乾燥温度で製造し、ＰＢＳ中で２日間懸濁したｍｉＰＳ－ＢＧＭから放出されたタンパク質量を測定した。各温度で一次乾燥を行った０．０９ｇのｍｉＰＳ－ＢＧＭをそれぞれ５００μＬのＰＢＳに懸濁し、３７℃、５４ｒｐｍで振盪し、２日後に上清を回収した。ｍｉＰＳ－ＢＧＭから放出された総タンパク質の濃度は、Ｐｉｅｒｃｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ａｓｓａｙ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて測定した。ｍｉＰＳ－ＢＧＭ（－４０℃）は、ｍｉＰＳ－ＢＧＭ（－１０℃）、あるいはｍｉＰＳ－ＢＧＭ（３０℃）よりも有意に多くタンパク質を放出した（図８Ａ）。ｍｉＰＳ－ＢＧＭから放出されたタンパク質のｈＭＳＣの増殖や遊走に対する影響を確認するために、－４０℃、－１０℃、３０℃の各温度で一次乾燥を行ったｍｉＰＳ－ＢＧＭの存在下でｈＭＳＣを培養した。ｈＭＳＣとｍｉＰＳ－ＢＧＭを、ディッシュ上の増殖培地中で、細胞密度５×１０５で混合培養した。７日後、ｈＭＳＣをＰＢＳで洗浄した後、３．７％パラホルムアルデヒドを用い室温で固定した。固定された細胞はＰＢＳで洗浄し、０．５％　Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ（富士フイルム和光純薬）を用いて室温で５分間透過処理した。その後、細胞をＲｈｏｄａｍｉｎｅ　Ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で４０分間染色した。細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、ＤＡＰＩを含む封入剤（ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ）で２０分間反応させ、共焦点レーザー走査型顕微鏡（ＬＳＭ７８０、Ｚｅｉｓｓ）で観察した（図８Ｂ）。ｍｉＰＳ－ＢＧＭとｈＭＳＣの免疫蛍光像から、ｈＭＳＣがｍｉＰＳ－ＢＧＭの周囲に集積していることが示された。ｈＭＳＣの細胞数を定量した結果、ｍｉＰＳ－ＢＧＭ（３０℃）に比べ、ｍｉＰＳ－ＢＧＭ（－４０℃）及びｍｉＰＳ－ＢＧＭ（－１０℃）の周囲の細胞数が有意に増加していた（図８Ｃ）。
６．２　遊走能に対する効果
　ｍｉＰＳ－ＢＧＭから放出されたタンパク質がｈＭＳＣの細胞遊走能に及ぼす影響をスクラッチによる創傷治癒アッセイを用いて評価した。創傷治癒アッセイは、以下のようにして行った。ｈＭＳＣを細胞密度１．０×１０５細胞／ｍＬで１２ウェルプレートに播種した。２４時間後、２００μＬのピペットチップを用いてｈＭＳＣを直線状に掻き取り、スクラッチを作製した。細胞破片を培地で静かに洗浄し、培地を５ｍｇ／ｍＬの濃度でｍｉＰＳ－ＢＧＭ（－４０℃）、ｍｉＰＳ－ＢＧＭ（－１０℃）、ｍｉＰＳ－ＢＧＭ（３０℃）をそれぞれ懸濁させた増殖培地に交換した。スクラッチ直後、９時間後にｈＭＳＣの画像を撮影し、ＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ　Ｉｍａｇｅ）を用いて定量した（図９）。各群のスクラッチ領域内の細胞数を、画像から計数した。ｍｉＰＳ－ＢＧＭ（－４０℃）を培地に添加した遊走細胞数は、ｍｉＰＳ－ＢＧＭ（－１０℃）、ｍｉＰＳ－ＢＧＭ（３０℃）を添加した場合よりも有意に多かった（Ｐ＜０．０５）（図９、下段グラフ）。
６．３　タンパク質成分の解析
　上記結果は、ｍｉＰＳ－ＢＧＭ周辺の細胞挙動が、主にｍｉＰＳ－ＢＧＭの構成タンパク質によって制御されていることを示している。そこで、プロテインアレイを用いて、ｍｉＰＳ－ＢＧＭ（－４０℃）のタンパク質成分を網羅的に解析した（図１０）。凍結乾燥後、０．０５ｇのｍｉＰＳ－ＢＧＭを２ｍＬのＰＢＳに加え、超音波粉砕機で２分間粉砕した。遠心分離（１０００×ｇ、１０分）後、上清１ｍＬをマイクロチューブに採取し、－８０℃の冷凍庫で保存した。対照群として、骨補填材として広く使用されているβ－ＴＣＰ（京セラ）を用いた。ＲａｙＢｉｏ（商標）Ｌａｂｅｌ－Ｂａｓｅｄ　Ｍｏｕｓｅ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ａｒｒａｙ　Ｌ－３０８（ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ）を用いて、ｍｉＰＳ－ＢＧＭ中の合計３０８種類のタンパク質を評価した。β－ＴＣＰと比較して１２１のサイトカイン／サイトカイン関連タンパク質の量が多いことが示された。ここでは詳細は示さないが、ｍｉＰＳ－ＢＧＭでは、骨代謝関連タンパク質であるＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－２７、アディポネクチン／Ａｃｒｐ３０、ＩＬ－６、骨芽細胞関連タンパク質であるＳＰＡＲＣ、ＩＬ－１７Ｅ、Ｄｅｃｏｒｉｎ、ＴＧＦ－β１、オステオプロテゲリン、ＩＧＦ－１、オステオポンチン、オステオアクチビン／ＧＰＮＭＢ、ＶＣＡＭ－１、血管新生関連タンパク質であるＰＤＧＦ　Ｃ、エンドスタチン、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＣがより多く維持されていた。
　ｍｉＰＳ－ＢＧＭを構成するタンパク質に対する凍結乾燥の影響を明らかにするため、プロテオーム解析（質量解析）を用いて凍結乾燥前後のタンパク質組成の変化を解析した。ｍｉＰＳを３０日間骨分化誘導し、０．２ｇの細胞塊をマイクロチューブに採取し、－８０℃のフリーザーで２４時間保存して凍結乾燥前の細胞塊として用いた。凍結乾燥前の細胞塊、及びｍｉＰＳ－ＢＧＭをＤＩＡプロテオーム解析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ（ＤＩＡ）、Ｐｒｏｍｅｇａ）を行い評価した（図１１）。５８１２個のタンパク質が同定されたが、凍結乾燥前後で９８．７％（５７４９タンパク質）が共通であった。凍結乾燥は、タンパク質の構成にほとんど影響がないことが明らかとなった。
７．ｍｉＰＳ－ＢＧＭの形態的な特徴
　異なる一次乾燥温度で作製したｍｉＰＳ－ＢＧＭの形態的な違いを、外観、圧縮試験、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）、エネルギー分散型Ｘ線分析（ＥＤＸ）、Ｃａ濃度測定、Ｘ線回折法（ＸＲＤ）、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）を用いて評価した。
７．１　マクロ観察による形態の特徴
　図１２Ａに示すように、ｍｉＰＳ－ＢＧＭ（－４０℃）、及びｍｉＰＳ－ＢＧＭ（－１０℃）の形態は丸く粒状で、直径もほぼ同程度であったのに対し、ｍｉＰＳ－ＢＧＭ（３０℃）は、粒状の形態を維持しておらず、細かく粉砕されたような形態を示していた。
７．２　圧縮試験の結果
　圧縮試験用成形試料は、１００μＬのｍｉＰＳＣ細胞塊を１ｍｇのゼラチンハイドロゲルと混合し、ポリプロピレンシリンダー（直径４ｍｍ、高さ４．５ｍｍ）に充填し、－８０℃で２４時間凍結した。凍結乾燥は表１Ｅの温度条件で行った。円柱状の試料は、５０Ｎのロードセルを装備したインストロン型万能試験機（Ｉｎｓｔｒｏｎ３３４２）を用い、クロスヘッド速度１．０ｍｍ／分で圧縮破壊した。Ｂｌｕｅｈｉｌｌ（商標）２ソフトウェアを用いて試験機の操作とデータ解析を行った。すべての試験を６回繰り返し、平均値と標準偏差を算出した。圧縮試験の結果、ｍｉＰＳ－ＢＧＭ（－４０℃）、及びｍｉＰＳ－ＢＧＭ（－１０℃）は、ｍｉＰＳ－ＢＧＭ（３０℃）に比べて統計的に有意な圧縮荷重の増加が認められた（図１２Ｂ、Ｐ＜０．０５）。
７．３　走査型電子顕微鏡による観察
　棚式凍結乾燥機で作製したｍｉＰＳ－ＢＧＭのＳＥＭによる微細構造を図１２Ｃに示す。各一次乾燥温度で乾燥した後に二次乾燥したｍｉＰＳ－ＢＧＭを、走査型電子顕微鏡（ＳＵ８０００、日立ハイテクノロジーズ）を用い、加速電圧５ｋＶで観察した。ＳＥＭ観察の結果、ｍｉＰＳ－ＢＧＭ（－４０℃）、及びｍｉＰＳ－ＢＧＭ（－１０℃）の試料は、粒径が約１０μｍ（平均粒径７μｍ）の比較的均一なサイズの球状構造の集合体が観察された。一方、ｍｉＰＳ－ＢＧＭ（３０℃）では、平均粒径１～２μｍのフレーク状の構造が観察された。
　従来法である冷却ステージ式凍結乾燥機（ＪＦＤ－３２０　Ｆｒｅｅｚｅ　Ｄｒｙｉｎｇ　Ｄｅｖｉｃｅ、ＪＥＯＬ社）を用い、一次乾燥温度を－１０℃に設定して作製したｍｉＰＳ－ＢＧＭ（特許文献２）のＳＥＭによる微細構造を図１２Ｄに示す。ＳＥＭ観察の結果、粒径が５μｍ以下のばらつきのある球状構造の集合体が観察され、凍結乾燥温度をプログラムによって正確に制御できる棚式凍結乾燥機を用いて同じ一次乾燥温度で作製したｍｉＰＳ－ＢＧＭ（図１２Ｃ上段）と比較して表面の粒状構造が小さくなり、多孔性に劣る形状を認めた。マクロ観察による形態や、ＳＥＭ観察による粒状構造は一次乾燥時の温度と相関があるものと考えられる。したがって、これら形態と密接に関係する水分量、気孔率、真密度は一次乾燥時の温度と相関する可能性がある。
　さらに、棚式凍結乾燥機で作製したｍｉＰＳ－ＢＧＭに対してＥＤＸを実施して各ｍｉＰＳ－ＢＧＭの元素組成を評価した。ＳＥＭ－ＥＤＸ像から、ｍｉＰＳ－ＢＧＭの表層にはＣａ、Ｐ、Ｃ、Ｏの元素分布が認められ、炭酸アパタイトが含まれていることが示唆された。また、Ｃａ／Ｐ比（原子組成％）はｍｉＰＳ－ＢＧＭ（－４０℃）とｍｉＰＳ－ＢＧＭ（－１０℃）では同等であり、それぞれ１．３４と１．４１であった。一方、ｍｉＰＳ－ＢＧＭ（３０℃）では０．４３であった（図１２Ｅ）。
　また、冷却ステージ式凍結乾燥機を用いて一次凍結乾燥温度を－１０℃に設定して作製したｍｉＰＳ－ＢＧＭ（特許文献２）及びヒト非脱灰凍結乾燥骨（ＯｒａＧＲＡＦＴコーティカル：ＬｉｆｅＮｅｔ　Ｈｅａｌｔｈ社）に対してＥＤＸを実施し、Ｃａ／Ｐ比（原子組成％）を算出した（図１２Ｆ）。ｍｉＰＳ－ＢＧＭ（特許文献２）のＣａ／Ｐ比は１．２０で、上述した棚式凍結乾燥機で作製したｍｉＰＳ－ＢＧＭ（－１０℃）のＣａ／Ｐ比（１．４１）と比較して低い値を示した。また、ヒト非脱灰凍結乾燥骨のＣａ／Ｐ比は１．４１で、棚式凍結乾燥機で作製したｍｉＰＳ－ＢＧＭ（－１０℃）のＣａ／Ｐ比と同様の値を示した。したがって、棚式凍結乾燥機で作製したｍｉＰＳ－ＢＧＭは、特許文献２のｍｉＰＳ－ＢＧＭと比較して天然の骨に近いＣａ／Ｐ比を有し、人工骨（骨補填材）としてより適していることが示唆された。
　このように、一次乾燥の温度が一見同等であっても、ｍｉＰＳ－ＢＧＭの性質が異なる理由は、冷却ステージ式凍結乾燥機は、冷却されているステージ上に試料を載せて凍結乾燥を行うことができるが、乾燥庫自体の温度を制御できないことに起因するものと考えられる。今回使用した棚式凍結乾燥機は、棚温度を制御することによって乾燥庫内の温度管理が可能であり、庫内にセンサーもあるため、より正確に温度管理を行うことができる。さらに、真空に達する時間も１０分で３Ｐａ以下と迅速に真空状態に達し、迅速に乾燥を行うことができるためであると考える。性能の良い骨補填材を製造するためには、凍結乾燥時の温度管理が重要であることを示している。
７．４　カルシウム溶出試験
　一次乾燥温度の異なるｍｉＰＳ－ＢＧＭのカルシウム溶出試験を行った。カルシウム溶出試験は、ｍｉＰＳ－ＢＧＭを０．５Ｍ酢酸（富士フイルム和光純薬）１．５ｍＬで脱灰し、室温（２３℃）で一晩保存した。２３００×ｇ、１０分間の遠心分離により不溶成分を除去した。上清のカルシウム濃度をカルシウムＥ－テストキット（富士フイルム和光純薬）を用いＭＸＢ法（ＯＤ５９５）で測定した。ｍｉＰＳ－ＢＧＭ（－４０℃）と（－１０℃）のカルシウム濃度に比べて、ｍｉＰＳ－ＢＧＭ（３０℃）のカルシウム濃度は有意に低かった（Ｐ＜０．０５）（図１２Ｇ）。
７．５　Ｘ線回折（ＸＲＤ）による解析
　さらに、Ｘ線回折（ＸＲＤ）を用いて微細構造を解析した。ＸＲＤは、ＳｍａｒｔＬａｂ　９ＳＷ（リガク社製）を用いたＸ線回折分析によりｍｉＰＳ－ＢＧＭの組成を解析した。ＸＲＤパターンを図１３Ａに示す。ｍｉＰＳ－ＢＧＭのＸＲＤパターンは、一次乾燥時の温度の影響は認められなかった。２θ＝２６．０（００２）と２θ＝３３．０（１１２）のハイドロキシアパタイトの特徴的なピークは、炭酸アパタイトのパターンと類似しており、高くシャープであったことから、ｍｉＰＳ－ＢＧＭは高い結晶性と純度を有していることが示された。
７．６　透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）による解析
　ＴＥＭ観察は、ｍｉＰＳ－ＢＧＭを樹脂に包埋し、樹脂ブロックから超薄切片（厚さ０．０５μｍ）を作製し、走査型ＴＥＭ（ＪＥＭ－ＡＲＭ２００Ｆ、日本電子株式会社）により加速電圧８０ｋＶで観察した。ｍｉＰＳ－ＢＧＭのＴＥＭ像からは、針状の粒子のクラスター構造が観察された（図１３Ｂ）。ｍｉＰＳ－ＢＧＭ（－４０℃）の針状構造の長さは平均３５ｎｍであり、ｍｉＰＳ－ＢＧＭ（－１０℃）及びｍｉＰＳ－ＢＧＭ（３０℃）の針状構造の長さ（それぞれ４８ｎｍ、６４ｎｍ）に比べて有意に短かった（Ｐ＜０．０５）。針状構造の長さは一次乾燥中の温度と相関があった（図１３Ｃ）。したがって、一次乾燥の温度条件の異なるｉＰＳ－ＢＧＭは針状構造の平均長さによって区別することが可能である。短い針状のハイドロキシアパタイト結晶がマクロファージのＩＬ１０などの抗炎症因子の発現上昇に抗炎症作用を示した報告があることから、－４０℃乾燥条件で得られた短い針状結晶構造が局所の免疫制御に作用する可能性が示唆される。
８．ヒトｉＰＳ細胞由来骨補填材の解析
８．１　ヒトｉＰＳ細胞由来骨芽細胞塊のタンパク質成分の解析
　凍結乾燥を行う前のヒトｉＰＳ細胞由来骨芽細胞塊のタンパク質成分について解析を行った。ヒトｉＰＳ骨芽細胞塊は、特許文献１、及び３に準じて作製した。ヒトｉＰＳ骨芽細胞塊をエッペンドルフチューブに回収し、―８０℃の冷凍庫で保存した。比較対象として、骨芽細胞分化誘導開始前のヒトｉＰＳ細胞塊を用いた。タンパク質発現・相対定量解析を、株式会社かずさゲノムテクノロジーズにて、ＤＩＡプロテオーム解析（プロメガ株式会社）を用いて実施した。
　質量解析から、ヒトｉＰＳ骨芽細胞塊に含まれる７６７８種類のタンパク質が同定された。ヒトｉＰＳ細胞に恒常的に発現するタンパク質（骨芽細胞分化誘導前に発現していたタンパク質）を除き、発現量が多いものを抽出した結果、骨代謝に関わるタンパク質、ＯＧＮ、ＩＧＦＢＰ５、ＣＤ３４、ＴＩＭＰ１、ＦＢＬＮ５、ＬＰＡＲ１、ＩＧＦＢＰ７、ＭＧＰ、ＤＣＮ、ＰＤＧＦＲＢ、ＩＧＦ１、ＴＡＢ２、ＦＧＦＲ２、ＳＰＰ１が多く含まれていることが明らかとなった。また、コラーゲン、ＣＯＬ１Ａ２、ＣＯＬ４Ａ１、ＣＯＬ５Ａ１、ＣＯＬ６Ａ６、ＣＯＬ１５Ａ１、ＣＯＬ１６Ａ１、ＣＯＬ２１Ａ１、ＣＯＬ２６Ａ１が検出された。
８．２　抗体アレイによるヒトｉＰＳ細胞由来骨補填材の解析
　６．３と同様にして、ヒトｉＰＳ細胞由来骨補填材（ｈｉＰＳ－ＢＧＭ）のタンパク質成分についても解析を行った。ｈｉＰＳ－ＢＧＭは、発明者らの方法（特許文献１及び特許文献３）に準じて作製した。ｈｉＰＳ－ＢＧＭをＰＢＳ中で超音波を用いて粉砕した後に、遠心分離機を用いて回収した上清を－８０℃冷凍庫中で保存した。比較対象としてヒト凍結乾燥骨（ＦＤＢＡ：ＯｒａＧＲＡＦＴ（ＬｉｆｅＮｅｔ　Ｈｅａｌｔｈ））を同様に処理し、上清試料を用意した。抗体アレイによる網羅的解析をＨｕｍａｎ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　ａｒｒａｙ　Ｌ－１０００（フィルジェン株式会社）を用いて実施した。ｈｉＰＳ－ＢＧＭとＦＤＢＡに含有するタンパク質を比較解析すると共に、ｍｉＰＳ－ＢＧＭの含有タンパク質データと比較し、共通するタンパク質を検討した（図１４）。
　既存の骨補填材（ＦＤＢＡ）はタンパク質をほとんど含んでいないのに対し、ｈｉＰＳ－ＢＧＭには、ｂＦＧＦ、ＦＧＦ－２３、ＢＭＰ－２、ＢＭＰ－３、ＤＭＰ－１、ＡＬＰＰ、ＧＤＦ１、ＢＭＰ－５、ＩＧＦ－ＩＩ、ＩＧＦＢＰ－２、ＩＧＦ－Ｉ、ＢＭＰ－１５、ＢＭＰ－８、ＢＭＰ－７、Ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ／ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ、ＢＭＰ－９など骨組織再生に関連するタンパク質、ＥＧ－ＶＥＧＦ／ＰＫ１、Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ－ｌｉｋｅ　１、Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ－ｌｉｋｅ　Ｆａｃｔｏｒ、ＰＤＧＦ－ＡＡ、Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ－２、ＶＥＧＦ　Ｒ３、ＶＥＧＦ　Ｒ１、ＶＥＧＦなど血管新生、Ｂｅｔａ　ＩＧ－Ｈ３、ＩＬ－１７Ｂ　Ｒ、ＩＦＮ－ｂｅｔａ、Ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ、ＩＬ－１７Ｒ、ＭＭＰ－１０、ＴＮＦ－ｂｅｔａなど骨代謝に関係するタンパク質が多く含まれていることが明らかとなった。その他ｈｉＰＳ－ＢＧＭには、ＣＯＣＯ、Ｃａｄｈｅｒｉｎ－１３、Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎ、Ｃ５／Ｃ５ａ、ＣＤ３０　Ｌｉｇａｎｄ／ＴＮＦＳＦ８、Ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ　５、ＩＬ－４、ＩＧＦＢＰ－１、ＩＬ－１　Ｆ８／ＦＩＬ１　ｅｔａ、ＧＲＯ、ＩＬ－８、Ｇｌｕｔ３、ＩＬ－２９、ＡＬＣＡＭ、ＣＮＴＦ、ＩＬ－２１　Ｒ、ＣＤ１６３、ＩＬ－５、ＣＤ７１、ＩＬ－２１、ＥＤＧ－１、Ｐｒｏｌａｃｔｉｎ、ＩＬ－２６、Ｇｒｏｗｔｈ　Ｈｏｒｍｏｎｅ（ＧＨ）、ＧＤＦ１１、ＣＤ４０　Ｌｉｇａｎｄ／ＴＮＦＳＦ５／ＣＤ１５４、Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ　Ｂ、ＧＤＦ８、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－７、ＣＣＲ４、ＢＮＰ、ＩＬ－２、ＩＬ－６、Ｃ－ｐｅｐｔｉｄｅ、ＩＬ－１７、ＧＲＥＭＬＩＮ、ＢＴＣなどのタンパク質を豊富に含んでいることが明らかとなった。ｈｉＰＳ－ＢＧＭ（対ＦＤＢＡ）のデータをｍｉＰＳ－ＢＧＭ（対ＦＤＢＡ）のデータと比較した結果、共通する６８種類のタンパク質を特定した（表４）。
９．ｈｉＰＳ－ＢＧＭの骨形成誘導能の評価
　ｈｉＰＳ－ＢＧＭの一次乾燥の温度条件の検討を行った。ｍｉＰＳ－ＢＧＭと同様にして、－８０℃で予備凍結を行い、異なる棚温度で細胞塊を一次凍結乾燥し、作製した。ｈｉＰＳ－ＢＧＭの抽出物を骨分化誘導培地に添加し、これを用いてヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）を培養し、その分化の程度によりｈｉＰＳ－ＢＧＭの骨形成誘導能を評価した。ｈＭＳＣは、３．１に記載されている方法と同様にして、骨分化培地により誘導を行った。
　ｈｉＰＳ－ＢＧＭは、５ｍｇ／ｍＬの濃度で骨分化培地に懸濁し、氷上で超音波粉砕機を用いて２０％の超音波振幅で２分間粉砕した。超音波処理後、懸濁液をシリンジフィルター（孔径０．２２μｍ、Ｍｅｒｃｋ）でろ過し、ｈＭＳＣの骨芽細胞分化培地に添加した。骨芽細胞分化培地は３日ごとに交換した。骨分化誘導開始１４日後、ｈＭＳＣは、１０％中性緩衝ホルマリン液（富士フイルム和光純薬）で固定し、アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）染色し、骨分化の程度を評価した。
　ＡＬＰ染色は以下のようにして行った。固定後のｈＭＳＣを精製水で３回洗浄した後、発色基質（ＡＬＰ染色キット、コスモバイオ）を加え、３７℃で２０分間染色した。精製水で３回洗浄後、ｈＭＳＣを光学顕微鏡（ＢＸ５１、オリンパス）で観察した。染色の定量には、ＩｍａｇｅＪ画像解析ソフトでＡＬＰ染色陽性範囲面積を解析した。
　結果を図１５に示す。上段は骨分化誘導１４日目のＡＬＰ染色画像を、下段は定量結果を示す。図中、添加なしはｈｉＰＳ－ＢＧＭを含まない骨分化培地を示す。また、下段は定量結果を示す（平均値±ＳＤ、ｎ＝３）。一次乾燥時の乾燥棚温度－１０℃で作製された骨補填材は、３０℃で作製された骨補填材に対し、有意な骨分化誘導能を有することが示された。さらに、－４０℃とより低い温度で作製すると、より高い骨分化誘導能を有する。－１０℃であれば、３０℃に比べて高い骨分化誘導能を有することから、一次乾燥温度は－１０℃以下に設定すればよい。さらに、－４０℃以下であればより高い骨分化誘導能を有することから－４０℃以下で一次乾燥を行うことがより好ましい。
１０．ｈｉＰＳ－ＢＧＭの遊走能に対する効果
　ｈｉＰＳ－ＢＧＭから放出されたタンパク質がｈＭＳＣの細胞遊走能に及ぼす影響をスクラッチによる創傷治癒アッセイを用いて評価した。創傷治癒アッセイは、６．２と同様にしてｈＭＳＣを用いて行った。ｈＭＳＣを細胞密度４．０×１０５細胞／ｍＬで１２ウェルプレートに播種した。２４時間後、２００μＬのピペットチップを用いてｈＭＳＣを直線状に掻き取り、スクラッチを作製した。
　細胞破片を培地で静かに洗浄し、培地を５ｍｇ／ｍＬの濃度でｈｉＰＳ－ＢＧＭ（－４０℃）、ｈｉＰＳ－ＢＧＭ（－１０℃）、ｈｉＰＳ－ＢＧＭ（３０℃）をそれぞれ懸濁させた増殖培地に交換した。懸濁方法は、超音波粉砕機を用いて、上述の方法に準じて行った。スクラッチ直後、６時間後にｈＭＳＣの画像を撮影し（図１６、上段画像は６時間後の画像を示す。）、スクラッチ領域内に遊走した細胞数を解析した。各群のスクラッチ領域内の細胞数を、画像から計数した。ｈｉＰＳ－ＢＧＭ（－４０℃）を培地に添加した遊走細胞数は、ｈｉＰＳ－ＢＧＭ（－１０℃）、ｍｉＰＳ－ＢＧＭ（３０℃）を添加した場合よりも有意に多かった（Ｐ＜０．００１）（図１６、下段グラフ）。
　以上示してきたように、凍結乾燥を行うことにより細胞を不活化し腫瘍形成リスクがなく、かつ温度、時間を最適化することによって、骨伝導能、骨形成誘導能に優れた骨補填材を製造することができる。凍結乾燥の３工程、予備凍結、一次乾燥、二次乾燥の全ての工程について、最適な条件を検討した。いずれの工程でも、処理温度、時間によって品質が変わるが、一次乾燥の条件が特に重要であり、試料の温度を正確に維持する必要がある。また、コスト面を考えると、３工程をより短時間で、かつ冷却温度を高く設定して行うことが好ましい。
　ここでは、マウスｉＰＳ細胞を用いて詳細に解析したが、ヒトｉＰＳ細胞でもタンパク質成分、骨形成誘導能、遊走能の解析結果は、マウスで得られた結果と同等であった。したがって、マウスｉＰＳ細胞を用いて得られた結果は、そのままヒトｉＰＳ細胞を使用して製造する骨補填材の製造方法に適用することが可能である。

Claims (6)

  1. 　幹細胞由来の骨補填材の製造方法であって、
    　幹細胞から骨芽細胞に分化誘導し、細胞塊を形成する工程、
    　予備凍結工程、
    　－８０℃以上－１０℃以下で凍結乾燥を行う一次乾燥工程を含むことを特徴とする骨補填材の製造方法。
  2. 　さらに、二次乾燥工程を含むことを特徴とする請求項１記載の骨補填材の製造方法。
  3. 　一次乾燥工程は、１０分以上、６時間以下の時間で行うことを特徴とする請求項１記載の骨補填材の製造方法。
  4. 　予備凍結工程は、－４０℃以下、－８０℃以上の温度で行うことを特徴とする請求項１記載の骨補填材の製造方法。
  5. 　予備凍結工程は、少なくとも１時間行うことを特徴とする請求項４記載の骨補填材の製造方法。
  6. 　請求項１～５記載の製造方法で作製した多能性幹細胞由来の骨補填材。
     
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