WO2025075010A1 - 細胞接触用溶液又はそのゲル - Google Patents

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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms

Definitions

  • Item 1 A solution or gel for cell contact that has an osmotic pressure of 340 mOsm/kg or less.
  • Item 2 The cell contact solution or gel thereof described in Item 1, having an osmotic pressure of 300 mOsm/kg or less.
  • Item 3 The cell contact solution or gel thereof described in Item 1, having an osmotic pressure of 210 to 300 mOsm/kg.
  • Item 5 The cell contact solution or gel thereof according to Item 1, wherein the cells are insect cells.
  • the medium usually contains a carbon source and inorganic salts that can be assimilated by the cells.
  • the medium may also contain a nitrogen source.
  • media for insect cell culture include TNM-FH medium (Pharmingen), Sf-900 III SFM medium (Life Technologies), ExCell400, ExCell405 (both JRH Biosciences), and Grace's Insect Medium (Nature, 195, 788 (1962)).
  • compositions that form a gel that can be converted into a sol are not particularly limited, but examples include gelatin; polysaccharides such as agar, carrageenan, starch, and xanthan gum; and water-soluble synthetic polymers such as PVA and PEG.
  • gelatin is particularly preferred from the viewpoint of ease of expressing the above-mentioned desirable properties.
  • Gelatin is obtained by pretreating collagen raw materials such as cow bones, cowhide, pig bones, pig skin, and fish scales with an acid or alkali, washing with water, extracting with hot water, purifying, concentrating and drying.
  • the cell culture medium is a cell maintenance medium.
  • the cell maintenance medium There are no particular limitations on the cell maintenance medium, so long as it does not require cell proliferation and can keep cells viable.
  • the solution/gel of the present disclosure is used for contacting cells that are or have been subjected to refrigerated storage.
  • Refrigerated storage tends to reduce the detectability of chemical substances in cells, but by contacting cells with the solution/gel of the present disclosure, this reduction phenomenon can be suppressed, and it is also possible to increase the detectability of chemical substances compared to before refrigerated storage.
  • the amino acid mutation may be, for example, an amino acid substitution, insertion, addition, or deletion, preferably a substitution, and particularly preferably a conservative substitution.
  • chemical response activity refers to the property that a sensor protein recognizes a chemical substance and the sensor protein alone or in conjunction with other proteins exhibits signal transduction activity (e.g., ion channel activity).
  • the sensor protein is an olfactory receptor, it may be a G protein-coupled receptor or an ion channel receptor.
  • the chemical response activity refers to the property that the olfactory receptor recognizes a chemical substance, and the olfactory receptor complex formed by the olfactory receptor and the olfactory receptor co-receptor is activated to exhibit ion channel activity.
  • a chemical substance is contacted with cells expressing proteins that emit fluorescence or luminescence in response to ions (such as calcium ions) that flow into the cells when (a) the olfactory receptor, (b) the olfactory receptor co-receptor, and (c) the olfactory receptor complex respond, and the amount of fluorescence or luminescence from the cells is measured.
  • ions such as calcium ions
  • the measurement can be performed according to the method described in Patent Document 1.
  • the coding sequence of the sensor protein is not particularly limited, so long as it is a base sequence that codes for the sensor protein.
  • the exogenous polynucleotide includes an expression cassette for the sensor protein.
  • the expression cassette is not particularly limited, so long as it is a polynucleotide that can express the sensor protein in the cell.
  • a typical example of an expression cassette for a sensor protein is a polynucleotide that includes a promoter and a coding sequence for the sensor protein that is placed under the control of the promoter.
  • the exogenous polynucleotide preferably contains a coding sequence for an insect olfactory receptor co-receptor.
  • the insect olfactory receptor co-receptor is a membrane protein having a seven-transmembrane structure similar to the olfactory receptor, and functions by forming a heterocomplex with the olfactory receptor.
  • the exogenous polynucleotide preferably contains a coding sequence for a protein that fluoresces or emits light in response to ions (such as calcium ions) that flow into the cell when a sensor protein (particularly an insect olfactory receptor protein) responds.
  • ions such as calcium ions
  • a sensor protein particularly an insect olfactory receptor protein
  • examples of such proteins include aequorin, Yellow Cameleon (YC), GCaMP, and the like.
  • the cells of the present disclosure preferably contain an ion-dependent fluorescent dye such as a calcium ion-dependent fluorescent dye (e.g., Fura-2, Fluo-3, Fluo-4, and the like).
  • the exogenous polynucleotide is preferably integrated into genomic DNA (particularly preferably chromosomal genomic DNA). This allows stable expression of the sensor protein, making it suitable for chemical detection.
  • the polynucleotide can be one continuous region within the genomic DNA, or a combination of two or more continuous regions (for example, a form in which the sensor protein coding sequence is included in continuous region A and the drug resistance gene coding sequence is included in continuous region B, which is a separate continuous region from continuous region A, or a form in which the sensor protein coding sequence is included in both continuous region A and continuous region B).
  • the material of the compartment is not particularly limited as long as it can hold cells.
  • the material can be, for example, resin, metal, etc.
  • the cell chip of the present disclosure may contain only cells with one type of sensor protein, but preferably contains cells with two or more types (more preferably three or more, even more preferably four or more, even more preferably five or more, ten or more, fifteen or more, or twenty or more) of different types of sensor protein.
  • Chemical substances can be detected by measuring the chemical substance response activity of the sensor protein.
  • the chemical substances can be chemical substances in a sample such as body fluids (e.g., urine, blood, saliva), air (e.g., indoor air, air inside a package), water (e.g., river water, seawater, tap water, clean water, sewage), etc.
  • body fluids e.g., urine, blood, saliva
  • air e.g., indoor air, air inside a package
  • water e.g., river water, seawater, tap water, clean water, sewage
  • the chemical substances in the sample can reach the cells and come into contact with the sensor protein of the cells.
  • ions flowing into the cells e.g., by detecting using a protein that emits fluorescence or luminescence in response to ions
  • the chemical substance response activity of the sensor protein can be measured and the chemical substances can be detected.

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Abstract

匂い物質等の化学物質の検出性を向上させることができる細胞接触用溶液又はそのゲルを提供すること。　浸透圧が340mOsm/kg以下である、細胞接触用溶液又はそのゲル。

Description

細胞接触用溶液又はそのゲル
　本発明は、細胞接触用溶液又はそのゲル等に関する。
　ヒトの特定の疾患や精神状態等を特徴付ける匂い物質群が同定されており、検査マーカーとしての利用価値が高いことから、これらをターゲットとした様々な匂いセンサの開発が盛んになっている。生物の嗅覚受容体は、多様性、感度、選択性等の面で半導体等の従来の匂いセンサ素子にはない優れた特性を有することから、嗅覚受容体をセンサ素子とした新しい匂いセンサの開発が期待されている。
　特許文献１では、改変嗅覚受容体を発現する細胞や改変嗅覚受容体を備える脂質二重膜を匂いセンサとして用いることについて開示されている。
国際公開第2022/024902号
　嗅覚受容体等のセンサタンパク質を備える脂質二重膜を人工的に調製する工程を有する匂いセンサは、製造効率が必ずしも十分ではないため、匂いセンサのさらなる製造効率向上が求められている。そこで、センサタンパク質を発現する細胞を利用することに着目した。本発明者は、これに基づいて研究を進める中で、細胞に接触させる液の物性によって、匂い物質などの化学物質の検出性、特に細胞を冷蔵保存した後における化学物質の検出性に差があることを見出した。
　そこで、本開示は、匂い物質等の化学物質の検出性を向上させることができる細胞接触用溶液又はそのゲルを提供することを課題とする。
　本発明者は上記課題に鑑みて鋭意研究を進めた結果、浸透圧が340mOsm/kg以下である、細胞接触用溶液又はそのゲル、であれば、上記課題を解決できることを見出した。即ち、本開示は、下記の態様を包含する。即ち、本発明は、下記の態様を包含する。
　項１．　浸透圧が340mOsm/kg以下である、細胞接触用溶液又はそのゲル。
　項２．　浸透圧が300mOsm/kg以下である、項１に記載の細胞接触用溶液又はそのゲル。
　項３．　浸透圧が210～300mOsm/kgである、項１に記載の細胞接触用溶液又はそのゲル。
　項４．　前記細胞が非哺乳類細胞である、項１に記載の細胞接触用溶液又はそのゲル。
　項５．　前記細胞が昆虫細胞である、項１に記載の細胞接触用溶液又はそのゲル。
　項６．　細胞培地成分を含有する、項１に記載の細胞接触用溶液又はそのゲル。
　項７．　細胞保存液、細胞処理液、又は細胞培地である、項１～６のいずれかに記載の細胞接触用溶液又はそのゲル。
　項８．　細胞維持培地又は細胞増殖培地である、項７に記載の細胞接触用溶液又はそのゲル。
　項９．　冷蔵保存に供する又は供した細胞との接触に用いられる、項１～６のいずれかに記載の細胞接触用溶液又はそのゲル。
　項１０．　前記細胞がセンサタンパク質のコード配列を含む外来性ポリヌクレオチドを含む、項１～６のいずれかに記載の細胞接触用溶液又はそのゲル。
　項１１．　前記センサタンパク質が嗅覚受容体タンパク質である、項１０に記載の細胞接触用溶液又はそのゲル。
　項１２．　センサタンパク質の化学物質応答活性の測定に供する細胞との接触に用いられる、項１～６のいずれかに記載の細胞接触用溶液又はそのゲル。
　項１３．　細胞と項１～６のいずれかに記載の細胞接触用溶液又はそのゲルとを含む区画を含む、細胞チップ。
　項１４．　細胞と項１～６のいずれかに記載の細胞接触用溶液又はそのゲルとを接触させることを含む、前記細胞のセンサタンパク質の化学物質応答活性を向上させる方法。
　本開示によれば、匂い物質等の化学物質の検出性を向上させることができる細胞接触用溶液又はそのゲルを提供することができる。本明細書において、化学物質の検出性の向上とは、細胞接触溶液又はゲルの接触前よりも化学物質の検出性が高くなることのみならず、化学物質の検出性が低下傾向にある場合において当該検出性の低下の程度を抑制する又は当該検出性を維持することも包含する。
試験例2の細胞増殖試験の結果を示す。縦軸は、生細胞数を表す吸光度を示す。横軸に、培地の濃度（非希釈培地が100％）と希釈された液の浸透圧（単位はmOsm/kg）を示す。 試験例3の嗅覚受容体の活性測定結果を示す。縦軸は蛍光強度を示す。横軸に、培地の濃度（非希釈培地が100％）と希釈された液の浸透圧を示す。凡例は化合物a濃度（単位はμM）を示す。 試験例4の嗅覚受容体の活性測定結果を示す。縦軸は蛍光強度を示す。横軸に、培地の濃度（非希釈培地が100％）及び希釈に用いた液、希釈された液の浸透圧（単位はmOsm/kg）、保管及び培養日数を示す。凡例は化合物a濃度（単位はμM）を示す。
　本明細書中において、「含有」及び「含む」なる表現については、「含有」、「含む」、「実質的にからなる」及び「のみからなる」という概念を含む。
　本明細書中において、ある数値範囲について、上限及び下限を任意に組み合わせてなる数値範囲もまた、直接且つ一義的に開示されている。
　本開示は、その一態様において、浸透圧が340mOsm/kg以下である、細胞接触用溶液又はそのゲル（本明細書において、「本開示の溶液／ゲル」と示すこともある。）、に関する。以下に、これについて説明する。
　本開示の溶液／ゲルは、液体（本開示の溶液）又はゲル（本開示のゲル）である。本開示のゲルは、本開示の溶液をゲル化してなるものである。
　浸透圧は、化学物質の検出性の向上作用の観点から、好ましくは330 mOsm/kg以下、より好ましくは320 mOsm/kg以下、さらに好ましくは310 mOsm/kg以下、よりさらに好ましくは300 mOsm/kg以下、とりわけ好ましくは290 mOsm/kg以下であり、また好ましくは210 mOsm/kg以上、より好ましくは220 mOsm/kg以上、さらに好ましくは230 mOsm/kg以上、よりさらに好ましくは240 mOsm/kg以上である。
　浸透圧は、例えば本開示の溶液／ゲルを浸透圧が既知の溶液に溶媒を添加することによる希釈で調製した場合であれば、希釈前の浸透圧に構成比を乗じたものを、全成分それぞれ足し合わせることにより計算することができる。また、本開示の溶液／ゲルの浸透圧は、計算により求めることができない場合は、細胞培地の浸透圧の測定方法として一般的な方法により測定することができる。
　本開示の溶液／ゲルは、細胞へのダメージ（特に、保存下におけるダメージ）を軽減するという観点から、また浸透圧をより適切な範囲に調整するという観点から、細胞培地成分を含有することが好ましい。細胞培地成分は、細胞の培地に含まれるものである限り、特に制限されない。
　培地は、通常、細胞が資化し得る炭素源及び無機塩類等を含有する。また、培地は、窒素源を含むことができる。
　炭素源としては、細胞が資化し得るものであればよく、例えば、グルコース、フラクトース、スクロース、及びこれらを含有する糖蜜、デンプン及びデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸及びプロピオン酸等の有機酸、並びにエタノール及びプロパノール等のアルコール類を用いることができる。
　窒素源としては、例えば、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム及びリン酸アンモニウム等の無機酸又は有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びにペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕及び大豆粕加水分解物、各種発酵菌体及びその消化物を用いることができる。
　無機塩としては、例えば、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅及び炭酸カルシウムを用いることができる。
　培地のより具体的な例としては、昆虫細胞培養培地の場合であれば、TNM-FH培地（Pharmingen社製）、Sf-900 III SFM培地（Life Technologies社製）、ExCell400、ExCell405（いずれもJRH Biosciences社製）、Grace’s Insect Medium（Nature, 195, 788（1962））等が挙げられる。
　細胞培地成分は、1種単独であってもよいし、2種以上の組合せであってもよい。
　本開示の溶液／ゲルの溶媒は、細胞の生存に著しく悪影響を与えないものである限り特に制限されない。当該溶媒は、水を含有することが好ましい。当該溶媒中の水の含有率は、好ましくは50質量％以上、より好ましくは70質量％以上、さらに好ましくは80質量％以上、よりさらに好ましくは85質量％以上、とりわけ好ましくは90質量％以上、特に好ましくは95質量％以上である。
　本開示の溶液は、細胞培地を希釈してなる希釈培地であることが好ましい。希釈に用いる液又はその溶媒は、上記溶媒を使用することができる。この場合、希釈培地の細胞培地濃度（＝（細胞培地容量／希釈培地容量）×100）は、好ましくは95％以下、より好ましくは90％以下、さらに好ましくは85％以下であり、また好ましくは50％以上、より好ましくは60％以上、さらに好ましくは65％以上である。
　本開示の溶液は、一態様において、浸透圧調整成分（塩等）を添加してなる細胞培地、浸透圧調整成分（塩等）の添加量を減らして調製してなる細胞培地、溶媒量を減らして調製してなる細胞培地、等であることも可能である。
　本開示のゲルは、ゾル化可能なものであることが好ましい。ゾル化することにより、検出対象物質の高い拡散性が担保され、迅速且つ安定な測定が可能になると考えられる。また、ゾル化することにより、容易に除去することができるので、検出対象物質の拡散性がより優れた溶液に置換することが可能となる。
　ゾル化可能なゲルを形成する成分（ゲル形成成分：架橋されてネットワークを形成する成分）は、特に制限されないが、例えばゼラチン；寒天、カラギナン、澱粉、キサンタンガム等の多糖類；PVA、PEGなどの水溶性合成ポリマー類等が挙げられる。これらの中でも、上記した望ましい性質を発現させ易いという観点から、特に好ましくはゼラチンが挙げられる。ゼラチンは、牛骨、牛皮、豚骨、豚皮、魚鱗等のコラーゲン原料を、酸またはアルカリで前処理し、水洗、温水抽出、精製、濃縮乾燥することで得られる。ゼラチンのゾル物性及びゲル物性は、コラーゲン原料の種類、前処理、温水抽出条件等によって変化する。上記の本発明に望ましいゾル温度、ゾル－ゲル転移温度、ゾル粘度、ゲル弾性率を実現するためには、ゼラチンの中でも、魚由来のゼラチン（魚ゼラチン）が特に好ましく、前処理や温水抽出条件を適宜調整することで本発明に適したゾル物性及びゲル物性を得ることができる。
　ゲル形成成分は、1種単独であることができ、また2種以上の組合せであることができる。
　本開示の溶液／ゲルは、細胞との接触のために用いられるものである。
　接触の態様は特に制限されない。例えば、本開示の溶液／ゲルと細胞層とが接触している態様、本開示の溶液／ゲル中に細胞が分散している態様が挙げられる。
　本開示の溶液／ゲルは、より具体的には、例えば細胞保存液、細胞処理液、又は細胞培地であることができる。
　細胞保存液は、一態様において、冷蔵保存に用いるためのものである。冷蔵保存の温度は、例えば10℃以下、又は6℃以下である。冷蔵保存の期間は、例えば5日以上、10日以上、15日以上、20日以上、25日以上、30日以上、40日以上、50日以上、60日以上、又は70日以上であることができ、また200日以下、150日以下、又は100日以下であることができる。冷蔵保存の後は、所定の温度（例えば20℃、又は25℃）以上での培養に供することができる。
　細胞処理液は、細胞の一過的な処理に供するための液であり、その限りにおいて特に制限されない。処理時間は、例えば30分間以上、1時間以上、2時間以上、4時間以上、又は8時間以上であることができ、また16時間以下、又は12時間以下であることができる。
　細胞培地は、一態様において、細胞増殖培地である。細胞増殖培地は、細胞の増殖を目的とするものである限り、特に制限されない。本開示の溶液／ゲルは、細胞増殖速度を向上させることが可能であり、このため細胞増殖培地としての使用に特に適している。
　細胞培地は、別の一態様において、細胞維持培地である。細胞維持培地は、細胞の増殖を要せず、細胞を生存状態に保つことができるものである限り特に制限されない。
　本開示の溶液／ゲルは、一態様において、冷蔵保存に供する又は供した細胞との接触に用いられる。冷蔵保存により、細胞の化学物質の検出性は低下する傾向にあるが、本開示の溶液／ゲルを細胞と接触させることにより、当該低下現象を抑制することができ、また化学物質の検出性を冷蔵保存前よりも高めることも可能である。
　本開示の溶液／ゲルは、一態様において、センサタンパク質の化学物質応答活性の測定に供する細胞との接触に用いられる。
　細胞は、特に制限されない。細胞は、化学物質の検出に適しているという観点から、哺乳類細胞、非哺乳類細胞、等の動物細胞が好ましく、本開示の溶液／ゲルの使用により適しているという観点、CO2や厳密な温度管理が不要であるなど管理の容易さから非哺乳類細胞が特に好ましい。非哺乳類細胞としては、例えば昆虫細胞、魚類細胞、両生類細胞、爬虫類細胞、等が挙げられる。
　昆虫細胞としては、例えば、Sf細胞、MG1細胞、High FiveTM細胞、BmN細胞などが用いられる。Sf細胞としては、例えば、Sf9細胞（ATCC CRL1711）、Sf21細胞などが用いられる。昆虫細胞の中でも、特にヒトリガ科（Arctiidae）の昆虫由来細胞が好ましい。
　ヒトリガ科の昆虫由来細胞は、ヒトリガ科の昆虫由来細胞の生体構成細胞の初代培養細胞、又は株化細胞であり、その限りにおいて特に制限されない。
　ヒトリガ科としては、例えばヒトリガ亜科（Arctiinae）、コケガ亜科（Lithosiinae）、カノコガ亜科（Syntominae）等が挙げられるが、これらの中でも好ましくはヒトリガ亜科が挙げられる。ヒトリガ亜科としては、好ましくはSpilosoma（クワゴマダラヒトリ属）、Spilarctia、Rhagonisの属が挙げられ、特に好ましくはクワゴマダラヒトリ属が挙げられる。クワゴマダラヒトリ属としては、特に制限されないが、特に好ましくはクワゴマダラヒトリ（Spilosoma imparilis）が挙げられる。
　ヒトリガ科の昆虫由来細胞は、公知の生物バンクから入手することもできるし、公知の方法に従って又は準じてヒトリガ科の昆虫の生体から採取・培養して得ること、必要に応じて株化して得ることができる。
　クワゴマダラヒトリ由来細胞としては、例えば農業生物資源ジーンバンクのFFPRI-SpIm-2AM-SF細胞（MAFF番号：275052）、FFPRI-SpIm-2AM-IPL411細胞（MAFF番号：275053）等が挙げられる。
　細胞は、センサタンパク質のコード配列を含む外来性ポリヌクレオチドを含むことが好ましい。これにより、任意のセンサタンパク質を発現させることができ、また目的のセンサタンパク質の発現量を増やし目的の化学物質の検出感度を高めることができる。
　外来性ポリヌクレオチドとは、昆虫細胞のゲノムDNA（特に、染色体ゲノムDNA）に由来しない塩基配列を含むポリヌクレオチドであり、その限りにおいて特に制限されない。
　センサタンパク質は、化学物質の存在を検出可能なタンパク質から選択すればよく、例えば化学物質をリガンドとする受容体タンパク質であることができる。センサタンパク質は、好ましくは嗅覚受容体タンパク質であり、特に好ましくは昆虫嗅覚受容体タンパク質である。
　昆虫嗅覚受容体タンパク質は、7回膜貫通構造を有する膜タンパク質であり、生物の匂いセンサとして働く。嗅覚受容体タンパク質のアミノ末端（以下、「N末端」という場合もある。）からカルボキシル末端（以下、「C末端」という場合もある。）に向かって順に、N末端領域（NT）、第1膜貫通ドメイン（TM1）、第1細胞外ループ（EC1）、第2膜貫通ドメイン（TM2）、第1細胞内ループ（IC1）、第3膜貫通ドメイン（TM3）、第2細胞外ループ（EC2）、第4膜貫通ドメイン（TM4）、第2細胞内ループ（IC2）、第5膜貫通ドメイン（TM5）、第3細胞外ループ（EC3）、第6膜貫通ドメイン（TM6）、第3細胞内ループ（IC3）、第7膜貫通ドメイン（TM7）、及びC末端領域（CT）が連結されて構成される。本開示において、各領域は、TMpred（K. Hofmann, W. Stoffel, TMbase - a database of membrane spanning proteins segments, Biol. Chem. Hoppe-Seyler, 374 (1993), p. 166、https://embnet.vital-it.ch/software/TMPRED_form.html）を用いた構造予測（条件はデフォルト）により決定される。
　昆虫嗅覚受容体タンパク質の由来昆虫としては、好ましくはカ科、ショウジョウバエ科等の双翅目昆虫；カイコガ科等の鱗翅目昆虫；ミツバチ科等の膜翅目昆虫；バッタ科等の直翅目昆虫；トコジラミ科等の半翅目昆虫等が挙げられ、さらに好ましくはカ科、ショウジョウバエ科等の双翅目昆虫；バッタ科等の直翅目昆虫；トコジラミ科等の半翅目昆虫が挙げられる。カ科の昆虫としては、例えば、ガンビエハマダラカ（Anopheles gambiae）、ネッタイシマカ（Aedes aegypti）、ネッタイイエカ（Culex quinquefasciatus）等が挙げられる。ショウジョウバエ科の昆虫としては、例えば、キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）、ウスグロショウジョウバエ（Drosophila pseudoobscura）、クロショウジョウバエ（Drosophila virillis）等が挙げられる。カイコガ科の昆虫としては、例えば、カイコガ（Bombyx mori）、クワコ（Bombyx mandarina）、イチジクカサン（Trilocha varians）等が挙げられる。ミツバチ科の昆虫としては、例えば、セイヨウミツバチ（Apis mellifera）、ヒメミツバチ（Apis florea）、オオミツバチ（Apis dorsata）、セイヨウオオマルハナバチ（Bombus terrestris）等が挙げられる。バッタ科の昆虫としては、例えば、トノサマバッタ（Locusta migratoria）等が挙げられ、トコジラミ科の昆虫としては、例えば、トコジラミ（Cimex lectularius）等が挙げられる。
　野生型の昆虫嗅覚受容体タンパク質として、具体的には、例えば、AaOR1、AaOR2、AaOR4、AaOR5、AaOR6、AaOR8、AaOR9、AaOR10a、AaOR15、AaOR22、AaOR24、AaOR25、AaOR26、AaOR27、AaOR28、AaOR30、AaOR34、AaOR36、AaOR38、AaOR41a、AaOR41b、AaOR42、AaOR43、AaOR44、AaOR47、AaOR49、AaOR50、AaOR52、AaOR54、AaOR58、AaOR59、AaOR60、AaOR61、AaOR64、AaOR65、AaOR66、AaOR67a、AaOR69a、AaOR70、AaOR71、AaOR72a、AaOR73、AaOR74、AaOR75、AaOR77、AaOR78、AaOR79、AaOR81、AaOR83b、AaOR84、AaOR85、AaOR86、AaOR87、AaOR91、AaOR95、AaOR97、AaOR96、AaOR99、AaOR100、AaOR102、AaOR103、AaOR104a、AaOR105、AaOR107、AaOR108、AaOR109、AaOR110、AaOR112、AaOR114、AaOR116、AaOR117、AaOR118、AaOR122、AaOR125、AaOR128、AgOR1、AgOR2、AgOR3、AgOR4、AgOR5、AgOR6、AgOR8、AgOR9、AgOR10、AgOR11a、AgOR12a、AgOR12b、AgOR13、AgOR14、AgOR15、AgOR16a、AgOR17、AgOR18、AgOR20、AgOR21、AgOR23、AgOR25、AgOR26、AgOR27、AgOR28、AgOR30、AgOR34、AgOR36、AgOR37、AgOR38、AgOR39a、AgOR40、AgOR42、AgOR44、AgOR45、AgOR46、AgOR47、AgOR49、AgOR50、AgOR54、AgOR56a、AgOR57、AgOR60、AgOR61、AgOR62、AgOR63、AgOR64、AgOR65、AgOR69、AgOR70、AgOR71、AgOR72、AgOR74、AgOR75、AgOR76a、AmOR1、AmOR3、AmOR9、AmOR10、AmOR13、AmOR41、AmOR51、AmOR52、AmOR55、AmOR71、AmOR73、AmOR78、AmOR85、AmOR89、AmOR90、AmOR114、AmOR115、AmOR118、AmOR120、AmOR121、AmOR161、BmOR1、BmOR2、BmOR3、BmOR4、BmOR5、BmOR8、BmOR9、BmOR10、BmOR13、BmOR17、BmOR18、BmOR23、BmOR24、BmOR25、BmOR35、BmOR36、BmOR42、BmOR45、BmOR49、BmOR51、BmOR52、BmOR55、BmOR56、BmOR61、DmOR1a、DmOR9a、DmOR19a、DmOR22a、DmOR22b、DmOR22c、DmOR24a、DmOR30a、DmOR33a、DmOR33b、DmOR33c、DmOR35a、DmOR42b、DmOR43a、DmOR45a、DmOR45b、DmOR47a、DmOR49b、DmOR59b、DmOR65b、DmOR65c、DmOR67b、DmOR67c、DmOR69a、DmOR71a、DmOR74a、DmOR82a、DmOR83a、DmOR83c、DmOR85a、DmOR85c、DmOR85e、DmOR85f、DmOR88a、DmOR92a、DmOR94a、DmOR94b、DmOR98b等が挙げられる。
　本明細書において、ORは嗅覚受容体（Odorant receptor）を示し、DmはDrosophila melanogaster由来であることを示し、BmはBombyx mori由来であることを示し、AgはAnopheles gambiae由来であることを示し、AaはAedes aegypti由来であることを示す。これらを含む各種嗅覚受容体タンパク質のアミノ酸配列及びコード配列は公知であるか、公知の配列に基づいた配列同一性検索により容易に同定することができる。
　センサタンパク質は、化学物質応答活性が著しく低減しない限りにおいて、野生型アミノ酸配列に対するアミノ酸変異を含むことができる。「著しく低減しない」とは、例えば、アミノ酸変異を含むセンサタンパク質の化学物質応答活性が、野生型のセンサタンパク質の化学物質応答活性100％に対して、例えば50％以上、好ましくは60％以上、より好ましくは70％以上、さらに好ましくは80％以上、よりさらに好ましくは90％以上である、ことを意味する。
　アミノ酸変異は、例えばアミノ酸の置換、挿入、付加、又は欠失であり、好ましくは置換であり、特に好ましくは保存的置換である。
　センサタンパク質は、野生型アミノ酸配列、野生型アミノ酸配列に対して例えば70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、よりさらに好ましくは98％以上、特に好ましくは99％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。
　本明細書において、化学物質応答活性とは、センサタンパク質が化学物質を認識し、そのセンサタンパク質単独が又は他のタンパク質と共役してシグナル伝達活性（例えば、イオンチャネル活性）を示す性質をいう。センサタンパク質が嗅覚受容体である場合、Gタンパク質共役型受容体であってもよいし、イオンチャネル型受容体であってもよいが、昆虫嗅覚受容体の場合であれば、嗅覚受容体が化学物質を認識し、その嗅覚受容体と嗅覚受容体共受容体とが形成した嗅覚受容体複合体が活性化されてイオンチャネル活性を示す性質をいう。センサタンパク質の化学物質応答活性は、化学物質と接触したセンサタンパク質のシグナル伝達活性を指標として（例えばシグナル分子の量を定量・評価して）測定することができる。昆虫嗅覚受容体の場合であれば、嗅覚受容体の化学物質応答活性は、化学物質と接触した嗅覚受容体と嗅覚受容体共受容体とが形成する嗅覚受容体複合体のイオンチャネル活性を指標として測定することができる。例えば、(a)嗅覚受容体、(b)嗅覚受容体共受容体、及び(c)嗅覚受容体複合体が応答した場合に細胞内に流入するイオン（カルシウムイオン等）により蛍光又は発光を発するタンパク質を発現する細胞と、化学物質とを接触させ、当該細胞の蛍光又は発光量を測定する。測定された蛍光又は発光量が多い程、嗅覚受容体の化学物質の応答活性が高いと判定する。具体的には特許文献１に記載の方法に従って測定することができる。
　センサタンパク質のコード配列は、センサタンパク質をコードする塩基配列である限り、特に制限されない。外来性ポリヌクレオチドは、その一態様において、センサタンパク質の発現カセットを含む。発現カセットは、細胞内でセンサタンパク質を発現可能なポリヌクレオチドである限り特に制限されない。センサタンパク質の発現カセットの典型例としては、プロモーター、及びそのプロモーターの制御下に配置されたセンサタンパク質のコード配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。
　センサタンパク質が昆虫嗅覚受容体である場合、外来性ポリヌクレオチドは、昆虫の嗅覚受容体共受容体のコード配列を含むことが好ましい。昆虫の嗅覚受容体共受容体は、嗅覚受容体と同様に7回膜貫通構造を有する膜タンパク質であり、嗅覚受容体とヘテロ複合体を形成して機能する。嗅覚受容体と嗅覚受容体共受容体とから構成されるヘテロ複合体である嗅覚受容体複合体は、匂い物質で活性化されるイオンチャネル活性が備わっており、活性化されるとナトリウムイオン（Na+）、カルシウムイオン（Ca2+）等の陽イオンを細胞内に流入させる。
　外来性ポリヌクレオチドは、センサタンパク質（特に、昆虫嗅覚受容体タンパク質）が応答した場合に細胞内に流入するイオン（カルシウムイオン等）により蛍光又は発光を発するタンパク質のコード配列を含むことが好ましい。このようなタンパク質としては、イクオリン、Yellow Cameleon（YC）、GCaMP等が挙げられる。或いは、本開示の細胞は、カルシウムイオン依存性蛍光色素（例えばFura-2、Fluo-3、Fluo-4等）等のイオン依存性蛍光色素を含むことが好ましい。
　昆虫の嗅覚受容体共受容体のコード配列、蛍光又は発光を発するタンパク質のコード配列、薬剤耐性遺伝子のコード配列等のコード配列は、発現カセットの形態で外来性ポリヌクレオチドに含まれていることが好ましい。発現カセットの構成についてはセンサタンパク質の発現カセットと同様である。発現カセットのプロモーターは、複数のコード配列間で共有することが可能である。
　外来性ポリヌクレオチドは、好ましくはゲノムDNA（特に好ましくは染色体ゲノムDNA）に組み込まれている。これにより、安定にセンサタンパク質を発現することができ、化学物質検出に適したものとなる。この場合、ポリヌクレオチドは、ゲノムDNA内の、1つの連続領域であることができ、また2つ以上の連続領域の組み合わせ（例えばセンサタンパク質コード配列が連続領域Aに含まれ、薬剤耐性遺伝子のコード配列が連続領域Aとは別の連続領域である連続領域Bに含まれる形態、或いはセンサタンパク質コード配列が連続領域Aと連続領域Bの両方に含まれる形態）であることができる。
　ポリヌクレオチドは、別の態様において、ゲノムDNAに組み込まれない状態であることができる。この場合、外来性ポリヌクレオチドは、例えばベクターの形態であることができる。この場合、ポリヌクレオチドは、1種のポリヌクレオチド分子であることができ、また2種以上のポリヌクレオチド分子（例えばセンサタンパク質コード配列がポリヌクレオチド分子Aに含まれ、薬剤耐性遺伝子のコード配列がポリヌクレオチド分子Aとは別の分子であるポリヌクレオチド分子Bに含まれる形態、或いはセンサタンパク質コード配列がポリヌクレオチド分子Aとポリヌクレオチド分子Bの両方に含まれる形態）であることができる。
　本発明は、その一態様において、細胞と本開示の溶液／ゲルとを含む区画を含む、細胞チップ（本明細書において、「本開示の細胞チップ」と示すこともある。）、に関する。これにより、チップ中の細胞の化学物質の検出性を向上させることができる。
　区画の形態は、細胞を保持できる態様である限り特に制限されない。細胞の保持性、製造効率、又は化学物質検出性の観点から、区画は、ウェル状であることが好ましい。
　区画の材質は、細胞を保持できるものである限り特に制限されない。材質は、例えば樹脂、金属等であることができる。
　区画の面積は、検出感度の観点、又は製造効率の観点から、好ましくは0.5～100mm2、より好ましくは1～50mm2、さらに好ましくは1.5～40mm2、よりさらに好ましくは2～40mm2である。本開示の好ましい一態様において、当該面積は、50mm2以下、35mm2以下、又は15mm2以下である。
　区画の数は、検出感度の観点、又は製造効率の観点から、好ましくは1～2000個、より好ましくは4～1600個、さらに好ましくは8～400個である。本開示の好ましい一態様において、当該数は、10以上、20以上、又は50以上である。
　区画は、検出感度の観点から、通常、複数個の細胞を含む。区画における面積（mm2）当たりの細胞数（cells）は、例えば50～20000cells／mm2である。検出感度、細胞生存性等の観点から、好ましくは100～15000cells／mm2、より好ましくは100～10000cells／mm2、さらに好ましくは200～10000cells／mm2、よりさらに好ましくは500～7000cells／mm2、とりわけ好ましくは1000～5000cells／mm2である。
　本開示の細胞チップは、1種のセンサタンパク質の細胞のみを含むものであることができるが、センサタンパク質の種類が互いに異なる2種以上（より好ましくは3種以上、さらに好ましくは4種以上、よりさらに好ましくは5種以上、10種以上、15種以上、又は20種以上）の細胞を含むことが好ましい。
　センサタンパク質の化学物質応答活性の測定により、化学物質を検出することができる。化学物質は、例えば体液（例えば、尿、血液、唾液）、空気（例えば、室内の空気、包装内の空気）、水（例えば、河川水、海水、水道水、上水、下水）等の試料中の化学物質であることができる。この場合、例えば本開示の基材の区画に、試料を添加することにより、試料中の化学物質が細胞に到達し、細胞のセンサタンパク質に接触することができる。例えば細胞内に流入するイオンを検出する（例えばイオンにより蛍光又は発光を発するタンパク質により検出する）ことにより、センサタンパク質の化学物質応答活性を測定することができ、化学物質を検出することができる。
　以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
　試験例1．安定発現細胞の作製
　クワゴマダラヒトリ（Spilosoma imparilis）由来細胞（SpIm細胞）に、嗅覚受容体タンパク質（ORA）コード配列、嗅覚受容体共受容体コード配列、カルシウムセンサー蛍光タンパク質コード配列、及びピューロマイシン耐性遺伝子コード配列がプロモーター配列の制御下に配置されてなり、且つこれらの配列が5´ITR（逆向き反復配列）及び3´ITRの間に配置されてなるトランスボゾンベクターを導入し、ピューロマイシンでセレクションを行い、上記コード配列及びプロモーター配列を含む外来DNAが染色体ゲノムDNAに組み込まれてなる嗅覚受容体安定発現SpIm細胞（以下、ORA細胞）を作製した。当該嗅覚受容体は、昆虫由来の嗅覚受容体であり、化合物aの受容体である。ORA細胞は、化合物aに応答して蛍光を発する。
　試験例2．細胞増殖試験
　ORA細胞を96-well plate（CORNING 3903）に1×104／100μL／wellで播種し、27℃インキュベーター（CO2供給なし）内で静置した。培地は、Sf-900III SFM培地を使用した。播種から24時間後に各wellから培養液を除去し、Sf-900III SFM培地、又はSf-900III SFM培地を超純水にて70～90％に希釈した希釈培地それぞれ100μLを各wellに添加して、27℃で6日間培養した。MTT試薬(11465007001 Roche)を各wellに添加し、4℃で4時間静置し、MTT溶解試薬を添加した後、37℃で一晩静置した。マイクロプレートリーダー（ Infinite 200、TECAN）により、560nm及びリファレンスの690nmの吸光度を測定した。
　結果を図１に示す。培地濃度100%と比較して、超純水で希釈した低張群では生細胞数が増加していた。
　試験例3．嗅覚受容体の活性測定1
　ORA細胞を384-well plate（ Greiner_781098 ）に3×104／40μL／wellで播種し、27℃インキュベーター（CO2供給なし）内で静置した。培地は、Sf-900III SFM培地を使用した。播種から24時間後に各wellから培地を除去し、Sf-900III SFM培地、又はSf-900III SFM培地を超純水にて63～91％に希釈した培地に、魚ゼラチンが濃度質量1％含まれた液40μLを各wellに添加した。4℃で31日間、培地がゲル化した状態で保管した後、27℃で3日間、培地がゾル化した状態で培養した。その後、各wellから培地を除去し、0.1%BSA/1×Hanks‘ buffer/20mM HEPES buffer 40μLを各wellに添加した。終濃度が0、0.1、1、10μMになるように化合物a（ORAが応答する物質）を各wellに添加し、添加前後の蛍光強度の変化をマイクロプレートリーダー（FlexStation3、Molecular Devices）を用いて測定した。
　結果を図２に示す。培地濃度100%と比較して、超純水で希釈した低張群では各濃度での匂い応答シグナルが増強されていた。
　試験例4．嗅覚受容体の活性測定2
　ORA細胞を96-well plate（CORNING 3903）に5×104／100μL／wellで播種し、27℃インキュベーター（CO2供給なし）内で静置した。培地は、Sf-900III SFM培地を使用した。播種から24時間後に各wellから培地を除去し、
Sf-900III SFM培地、又はSf-900III SFM培地を超純水若しくはPBS(日水製薬)にて83％に希釈した培地に、魚ゼラチンが濃度質量1％含まれた液100μLを各wellに添加した。4℃で26日間又は54日間、培地がゲル化した状態で保管した後、27℃で2日間、培地がゾル化した状態で培養した。その後、各wellから培地を除去し、0.1%BSA/1×Hanks‘ buffer/20mM HEPES buffer 80μLを各wellに添加した。終濃度が0、0.1、1、10μMになるように化合物a（ORAが応答する物質）を各ウェルに添加し、添加前後の蛍光強度の変化をマイクロプレートリーダー（FlexStation3、Molecular Devices）を用いて測定した。
　結果を図３に示す。4℃26日間及び54日間のいずれの保管期間の場合についても、培地濃度100%と比較して、超純水で希釈した低張群では各濃度での匂い応答シグナルが増強されていた。一方でPBSで希釈することで、水で希釈したものよりも浸透圧が高い群では増強が見られなかった。

Claims (14)

  1. 浸透圧が340mOsm/kg以下である、細胞接触用溶液又はそのゲル。
  2. 浸透圧が300mOsm/kg以下である、請求項１に記載の細胞接触用溶液又はそのゲル。
  3. 浸透圧が210～300mOsm/kgである、請求項１に記載の細胞接触用溶液又はそのゲル。
  4. 前記細胞が非哺乳類細胞である、請求項１に記載の細胞接触用溶液又はそのゲル。
  5. 前記細胞が昆虫細胞である、請求項１に記載の細胞接触用溶液又はそのゲル。
  6. 細胞培地成分を含有する、請求項１に記載の細胞接触用溶液又はそのゲル。
  7. 細胞保存液、細胞処理液、又は細胞培地である、請求項１～６のいずれかに記載の細胞接触用溶液又はそのゲル。
  8. 細胞維持培地又は細胞増殖培地である、請求項７に記載の細胞接触用溶液又はそのゲル。
  9. 冷蔵保存に供する又は供した細胞との接触に用いられる、請求項１～６のいずれかに記載の細胞接触用溶液又はそのゲル。
  10. 前記細胞がセンサタンパク質のコード配列を含む外来性ポリヌクレオチドを含む、請求項１～６のいずれかに記載の細胞接触用溶液又はそのゲル。
  11. 前記センサタンパク質が嗅覚受容体タンパク質である、請求項１０に記載の細胞接触用溶液又はそのゲル。
  12. センサタンパク質の化学物質応答活性の測定に供する細胞との接触に用いられる、請求項１～６のいずれかに記載の細胞接触用溶液又はそのゲル。
  13. 細胞と請求項１～６のいずれかに記載の細胞接触用溶液又はそのゲルとを含む区画を含む、細胞チップ。
  14. 細胞と請求項１～６のいずれかに記載の細胞接触用溶液又はそのゲルとを接触させることを含む、前記細胞のセンサタンパク質の化学物質応答活性を向上させる方法。
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