WO2025017233A1 - Recubrimientos antimicrobianos - Google Patents

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Serena Medaglia
Andrea BERNARDOS BAU
María Dolores MARCOS MARTÍNEZ
Ramón MARTÍNEZ MAÑEZ
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Universidad Politecnica de Valencia
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    • C23C2222/20—Use of solutions containing silanes

Definitions

  • the present invention relates to an antimicrobial coating, its preparation process and its use in preventing microbial growth, biofilm formation, inhibiting microbial adhesion and/or eliminating microbial cells adhered thereto.
  • Nosocomial infections are one of the most important problems in the health system, being one of the main causes of mortality and increased morbidity in hospitalized patients.
  • One of the main reasons for these infections is the microbial capacity to adhere to solid surfaces (biotic or abiotic). This capacity causes the formation of polymeric structures called biofilms.
  • biofilms The function of biofilms is to act as a trap for nutrients and as a physical barrier that prevents the penetration and diffusion of common antibiotics and disinfectants.
  • Biofilm formation begins with the adhesion of individual planktonic cells to a surface. These adherent cells develop into microcolonies that then proliferate into mature biofilms. Mature biofilms produce extracellular matrix (ECM) components that are critical for maintaining the distinctive structures of cell aggregates.
  • ECM extracellular matrix
  • antimicrobial substances such as metal derivatives, polyammonium salts and antibiotics
  • AMR Antimicrobial resistance
  • bacteria, viruses, fungi and/or parasites change over time and no longer respond to drugs, making infections more difficult to treat and increasing the risk of disease spread, serious illness and death.
  • antibiotics and other antimicrobial drugs become ineffective and infections become increasingly difficult or impossible to treat.
  • Covalent bonding offers several advantages by providing the most stable bonds between the bioactive compound and the surface. Some studies have reported the immobilization on stainless steel or other surfaces (plastic, titanium and others) of certain bioactive molecules such as antibacterial peptides like magainin, nisin and lysozyme or the immobilization of biopolymers such as chitosan.
  • the present invention provides a solution to that problem.
  • the invention relates to an antimicrobial coating comprising a layer of silica and bioactive molecules functionalized with a molecule of link, where the functionalized bioactive molecules are covalently immobilized to the silica surface by covalent bonds.
  • the invention in a second aspect, relates to a process for depositing an antimicrobial coating according to the first aspect of the invention comprising the following steps: a) providing a substrate, b) activating the surface of the substrate by treating the substrate with a solution of sulfuric acid and hydrogen peroxide, c) deposition of a silica layer on the surface of the substrate by polymerizing silica precursors in an alkaline medium, d) functionalizing the bioactive molecules by reacting them with the linking molecule in liquid phase, e) covalent immobilization of the functionalized bioactive molecules obtained in step d) on the silica layer generated in step c) by deposition of an alcoholic solution comprising the functionalized bioactive molecules, and f) drying the surface at room temperature.
  • the invention relates to an element, for example surgical tools, or surfaces, for example walls or floors, comprising at least partially an antimicrobial coating according to the first aspect or a coating prepared according to the second aspect of the invention.
  • the invention relates to the use of an antimicrobial coating according to the first aspect, an antimicrobial coating prepared according to the second aspect or an element or surface according to the third aspect of the invention in preventing microbial growth, biofilm formation, inhibiting microbial adhesion and/or killing microbial cells adhered thereto.
  • Figure 1 HR-FESEM EDX analysis of SS and SS-S ⁇ O2 surfaces for the determination of the silica layer thickness of the SS-S ⁇ C>2 surface.
  • Figure 2. Comparison of counts (CFU, %) of the S. epidermidis bacteria after contact with functionalized (SS-S ⁇ C>2-Van) and non-functionalized (SS, SS-OH and SS-S ⁇ C>2) surfaces as a function of time.
  • Figure 4 Comparison of counts (log CFU/ml, %) of E. coli bacteria after contact with functionalized (PP-S ⁇ O2-Van) and non-functionalized (PP, PP-OH and PP-S ⁇ C>2) surfaces after 24h.
  • Figure 8 Antimicrobial assay for inhibiting biofilm formation on different steel surfaces against S. epidermidis.
  • the present invention provides an antimicrobial coating comprising a layer of silica and bioactive molecules functionalized with a linker molecule, wherein the functionalized bioactive molecules are covalently immobilized to the surface of the silica via covalent bonds.
  • antimicrobial refers to an element that prevents the formation or development of microorganisms. In particular, it refers to a coating that prevents microbial growth, biofilm formation, inhibits microbial adhesion and/or eliminates microbial cells adhering to it.
  • bioactive molecule refers to molecules that possess antimicrobial activity, in particular antibacterial, antifungal and/or antiviral.
  • polymer(s) in the context of this application means oligomer(s), polymer(s) and copolymer(s), their mixtures and in particular also their formation into organic and/or substantially organic-based composites.
  • the "polymer(s)” in the context of this application are present predominantly or entirely in the form of polymer(s) and/or copolymer(s).
  • the term “functionalize” refers to the modification of a surface or molecule to incorporate certain elements, for example, functional groups or molecules, that provide said surface with particular physicochemical properties.
  • activate refers to the ability of an aqueous solution and/or dispersion to generate hydroxyl groups in a subsequent process step, for example an immersion step, close to the substrate surface. In the process according to the invention, a condition is thus created in which a sequential layer can be formed on the substrate.
  • covalent immobilization refers to the binding by means of a covalent bond. In particular, it refers to the binding between substrate and silica and the binding of silica and bioactive molecule by means of covalent bonds.
  • the present invention is based on improving and overcoming the drawbacks and disadvantages presented by the already known methods, in particular those described in WO 2022067358.
  • the known methods present leaching of active sites, low antimicrobial activities and poor reproducibility in coating materials.
  • This antimicrobial coating can act against any microorganisms, whether bacteria, viruses or even microscopic fungi, yeasts or protozoa.
  • the coating tested on S. epidermidis is therefore a model for other microorganisms.
  • the coating of the first aspect is covalently bonded to the substrate surface (S) by S-O-Si bonds between the substrate and the silica layer.
  • the covalent bonding between the substrate and the coating by means of a silica layer provides the coating with great robustness and allows the bioactive molecules to remain anchored to the substrate for a prolonged period of time and therefore the antimicrobial efficacy of the coated surface is maintained.
  • the silica layer disposed on the substrate is characterized by a thickness between 0.10 pm and 10 pm, preferably the silica layer disposed on the substrate has a thickness between 0.10 pm and 5 pm, and even more preferably between 0.10 pm and 2 pm.
  • the binding of the bioactive molecule is carried out by a direct anchoring of the binding molecule on the steel surface, resulting in a covalent bond of the Fe-O-S ⁇ type.
  • This type of bond is not very robust because the Fe-O bond is quite susceptible to hydrolysis and therefore the resulting coating has a low reusability capacity.
  • the silica layer reinforces the anchors to the steel, and the final anchoring of the binding molecule is carried out through Si-O-Si bonds, these being much more stable.
  • the substrates that can be coated by the coatings of the invention are very varied, such as, for example, metals, polymers, ceramic materials and/or glass.
  • Suitable metals include, among others, titanium, copper, gold, tin, nickel, aluminum, iron, cobalt, silver, platinum, magnesium, manganese, zinc and metal alloys such as steels, bronze or brass.
  • the group of polymers includes conventional polymers such as polyvinyl chloride (PVC), polyvinyl acid (PVA), polyethylene (PE), polystyrene (PS), polypropylene (PP), polycarbonate (PC), polyethylene terephthalate (PET), polyamide (PA), polyurethane (Pll), styrene, butadiene, acrylonitrile (ABS), or biodegradable polymers, such as, for example, polylactic acid (PLA), collagen, biorubbers, or cellulose.
  • PVC polyvinyl chloride
  • PVA polyvinyl acid
  • PE polyethylene
  • PS polystyrene
  • PP polypropylene
  • PC polycarbonate
  • PET polyethylene terephthalate
  • PA polyamide
  • Pll polyurethane
  • ABS acrylonitrile
  • biodegradable polymers such as, for example, polylactic acid (PLA), collagen, biorubbers, or cellulose.
  • Ceramic materials of interest include, for example, TIO2, AI2O3, cermet-type materials, for example, WC-Co or WC-Co-Cr, or bi-component materials such as TIO2 + NiAI.
  • the coatings of the invention may cover the surface of the substrate in whole or in part as required.
  • the bioactive molecules are selected from the group of essential oil components (EOC), organic acids, natural polymers, bacteriocins, and/or enzymes.
  • the bioactive molecule is an essential oil component.
  • the bioactive molecule is selected from the following group of essential oil components: carvacrol, cinnamaldehyde, perillaldehyde, eugenol, thymol, vanillin, geraniol, caffene, thymoquinone, diallyl disulfite, allyl isothiocyanate or mixtures thereof.
  • the bioactive molecule is vanillin.
  • CAE The antimicrobial activity of CAE is not attributed to a single mechanism, but is a cascade of reactions (cell wall degradation, cytoplasmic membrane damage, membrane protein damage, cytoplasm coagulation and proton power depletion) resulting in the destruction of microorganism cells. Furthermore, CAE can penetrate formed biofilms and kill protected microorganisms.
  • the bioactive molecule is present in a concentration range of 0.5 to 1.5 mg/cm 2 , preferably in a range of 0.8 to 1.05 mg/cm 2 .
  • the bioactive molecule in these concentration ranges ensures the desired antimicrobial effect occurs.
  • the linker molecule is an alkoxysilane, preferably the linker molecule is selected from the following group 3-aminopropyl ethoxysilane (APTES), chloromethyl ethoxysilane, chloroethyl ethoxysilane, chloropropylethyl ethoxysilane, (3-mercaptopropyl) ethoxysilane, (4-chlorophenyl ethoxysilane, 3-(Triethoxysilyl)propionitrile, 3-(Triethoxysilyl)propyl isocyanate, more preferably the linker molecule is 3-aminopropyl ethoxysilane (APTES).
  • APTES 3-aminopropyl ethoxysilane
  • the functionalized bioactive molecules are linked to the silica by covalent silicon-oxygen-silicon (Si-O-Si) bonds.
  • Si-O-Si covalent silicon-oxygen-silicon
  • the invention in its second aspect, relates to a process for depositing an antimicrobial coating according to the first aspect on substrates comprising the following steps: a) providing a substrate; b) activating the surface of the substrate by treating the substrate with an activating solution; c) deposition of a silica layer on the surface of the substrate by polymerizing silica precursors in an alkaline medium; d) functionalizing the bioactive molecules by their reaction with the linker molecule in liquid phase; e) covalent immobilization of the functionalized bioactive molecules obtained in step d) on the silica layer generated in step c) by applying a solution comprising the functionalized bioactive molecule, and f) drying the surface.
  • the substrates that can be coated by the invention are highly varied, such as, for example, metals, polymers, ceramic materials and/or glass.
  • Suitable metals include, among others, titanium, copper, gold, tin, nickel, aluminum, iron, cobalt, silver, platinum, magnesium, manganese, zinc and metal alloys such as steels, bronze or brass.
  • the group of polymers includes, among others, polyvinyl chloride (PVC), polyvinyl acid (PVA), polyethylene (PE), polystyrene (PS), polypropylene (PP), polycarbonate (PC), polyethylene terephthalate (PET), polyamide (PA), polyurethane (PU), styrene, butadiene, acrylonitrile (ABS), polylactic acid (PLA), collagen, bio-rubber, or cellulose.
  • Ceramic materials of interest include, for example, TIO2, AI2O3, cermet-type materials, for example, WC-Co or WC-Co-Cr, or bi-component materials such as TIO2 + NiAI.
  • the activating solution of step b) is an acidic and/or oxidizing solution.
  • the substrate surface is activated by an activating solution consisting of an aqueous solution of sulfuric acid, nitric acid, potassium persulfate, oxygen peroxide or a mixture thereof.
  • the activation of the surface is carried out for less than 15 min, preferably 10 min.
  • the contact between the aqueous solution and the substrate surface should be short to avoid corrosive effects thereof while generating sufficient hydroxyl groups on the substrate surface.
  • the deposition of the silica layer in step c) occurs by in situ generation of silica from a precursor selected from the group of tetramethyl orthosilicate (TMOS), tetraethyl orthosilicate (TEOS), methyltrimethoxysilane (MTMS), phenyltrimethoxysilane (PTMS), dimethyldimethoxysilane (DMDMS) and methacryloxypropyltrimethoxysilane (MPTMS).
  • TMOS tetramethyl orthosilicate
  • TEOS tetraethyl orthosilicate
  • MTMS methyltrimethoxysilane
  • PTMS phenyltrimethoxysilane
  • DDMS dimethyldimethoxysilane
  • MPTMS methacryloxypropyltrimethoxysilane
  • TEOS tetraethyl orthosilicate
  • the bioactive molecule is selected from the group of essential oils, natural polymeric organic acids, bacteriocins, enzymes, preferably the bioactive molecule is an essential oil.
  • the bioactive molecule is an essential oil component.
  • the bioactive molecule is selected from the group of essential oil components (EOC) consisting of carvacrol, cinnamaldehyde, perillaldehyde, eugenol, thymol, vanillin, geraniol, caffeine, thymoquinone, diallyl disulfite, allyl isothiocyanate or mixtures thereof.
  • EOC essential oil components
  • the linker molecule employed in step d) is an alkoxysilane, preferably the linker molecule is selected from the following group 3-aminopropyl triethoxysilane, chloromethyl triethoxysilane, chloroethyl triethoxysilane, chloropropylethyl triethoxysilane, (3-mercaptopropyl) triethoxysilane, (4-Chlorophenyl triethoxysilane, 3-(Triethoxysilyl)propionitrile, 3-(Triethoxysilyl)propyl isocyanate.
  • the linker molecule is 3-aminopropyl triethoxysilane.
  • the solution of step e) comprising the functionalized bioactive molecule is a solution of pentane, cyclopentane, hexane, cyclohexane, benzene, toluene, 1,4-dioxane, chloroform, diethyl ether, dichloromethane (DCM), tetrahydrofuran (THF), acetone, dimethylformamide (DMF), acetonitrile (MeCN), dimethyl sulfoxide (DMSO), formic acid, n-butanol, isopropyl alcohol (IPA), methanol, ethanol, water or mixtures thereof.
  • the solution is an aqueous alcoholic solution, preferably a solution of ethanol and water.
  • the drying in step d) occurs at room temperature.
  • the invention in its third aspect, relates to an element or surface comprising at least partially an antimicrobial coating according to the first aspect or a coating prepared according to the second aspect of the invention.
  • the elements or surfaces that may comprise the coating of the invention may be different materials, in particular they may be made of metal, polymers, ceramic materials and/or glass.
  • Suitable metals include, among others, titanium, copper, gold, tin, nickel, aluminum, iron, cobalt, silver, platinum, magnesium, manganese, zinc and metal alloys such as steel, bronze or brass.
  • the group of polymers includes, among others, polyvinyl chloride (PVC), polyvinyl acid (PVA), polyethylene (PE), polystyrene (PS), polypropylene (PP), polycarbonate (PC), polyethylene terephthalate (PET), polyamide (PA), polyurethane (PU), styrene, butadiene, acrylonitrile (ABS), polylactic acid (PLA), collagen, bio-rubber, or cellulose.
  • Ceramic materials of interest include, for example, TIO2, AI2O3, cermet-type materials, for example, WC-Co or WC-Co-Cr, or bi-component materials such as TIO2 + NiAI.
  • a hygienic mask a fabric, a cloth, clinical instruments, a wall, a floor, a piece of furniture, a handrail, a mobile device, a touch screen or an air filter.
  • the invention relates to use of an antimicrobial coating according to the first aspect, an antimicrobial coating prepared according to the second aspect or an element or surface according to the third aspect in the prevention of microbial growth, biofilm formation, the inhibition of microbial adhesion and/or the elimination of microbial cells adhered thereto.
  • the microorganism can be a bacterium, but also a virus, a microscopic fungus, yeast or a protozoan. Bacteria are preferred. The invention will now be explained in greater detail by means of the Examples and Figures below.
  • Example 1.1 Functionalization of bioactive molecules - vanillin
  • vanillin To functionalize the bioactive molecule, in this case vanillin, first, 1 g of vanillin was suspended in 25 mL of dichloromethane and then 1.2 mL of 3-aminopropyl triethoxysilane (APTES) was added to the mixture. The molar ratio between the reagents was 1:1 vanillin:APTES (Scheme 1). The mixture was stirred for 2 h, and after this, the suspension was evaporated under reduced pressure to obtain the corresponding alkoxysilane derivative, (E)-2-methoxy-4-(((3-triethoxysilyl)propyl)imino)methyl)phenol. In this first step, the reaction between vanillin and APTES gives rise to product 3 in which vanillin is linked to the ethoxy group by means of an amine bond (Scheme 1).
  • APTES 3-aminopropyl triethoxysilane
  • the amine bond formed between the aldehyde group of vanillin and the amine group of APTES (3) was reduced to stabilize the attachment of the vanillin group to the trialkoxysilane group (4), Van- APTES.
  • the reduction reaction of the amine bond was carried out by chemical hydrogenation using H2 and palladium on carbon (Pd/C) as catalyst (Scheme 2).
  • Example 1.2 Functionalization of bioactive molecules - carvacrol, eugenol and thymol
  • carvacrol, eugenol and thymol were first transformed into aldehyde derivatives.
  • the aldehydes of carvacrol, eugenol and thymol were reacted with 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) to produce the corresponding alkoxysilane derivatives.
  • APTES 3-aminopropyltriethoxysilane
  • Carvacrol and thymol aldehydes were synthesized by direct formylation using paraformaldehyde.
  • the corresponding essential oil derivatives were synthesized.
  • 2 ml of the aldehydes carvacrol, thymol or eugenol were reacted with 2.3 ml (10 mmol) of (3-aminopropyl)triethoxysilane (APTES) in the presence of dichloromethane (20 ml) and MgSCU, giving the corresponding amines, which were subsequently reduced in the same manner as described for Van-APTES in Example 1.1.
  • the mixture was heated at reflux for 1 h, then filtered and evaporated under reduced pressure to obtain a clear liquid.
  • the first step in SS functionalization is the preparation of the stainless steel surface.
  • the surface of the SS material must be adequately degreased by ultrasound in solvent vapors such as ethanol and acetone, and then with water.
  • solvent vapors such as ethanol and acetone
  • stainless steel plates were placed in a beaker (1 plate in 1 beaker) and sonicated for 10 min in each of the following chemicals in succession: acetone (70% v/v), ethanol and deionized water.
  • the SS surface After the washing procedure, the SS surface must be chemically treated with an acidic or alkaline solution to activate the metal surface and expose the surface hydroxyl groups. Hydroxyl groups are formed by dissociative chemisorption of water molecules, and hydration and hydroxylation are generally considered to occur at the exposed lattice metal ion sites on the surface. This Activation is important because the amount of hydroxyl groups obtained during the activation process strongly influences the initiation of silane bonding and therefore the formation of the silica film. Then, for the activation procedure, the washed SS materials were treated with piranha solution and the SS-OH materials were obtained.
  • the corresponding piranha solution consisted of the addition of hydrogen peroxide to a beaker, to which concentrated sulfuric acid was slowly added, in a ratio of sulfuric acid to hydrogen peroxide of 7:3 (v/v). The resulting mixture was then gently shaken before use.
  • Hydroxyl groups are essential in forming strong covalent bonds with the silanol groups of the coating silica.
  • SS-OH plates were treated with TEOS by a sol-gel procedure.
  • the SS-OH plates were placed in a basic aqueous solution, heated to 80 °C, and then 5 mL of TEOS was added dropwise and the mixture was stirred for thirty minutes. The plates were rinsed twice in ultrapure water and dried at 100 °C overnight.
  • Hydrolysis of TEOS produces silanol groups (Si-OH) in the presence of water and facilitates the rapid adsorption of silicate entities on the surface of the SS-OH material through hydrogen bonding, to further condense and form a metal-siloxane covalent bond (Me-O-Si-OH).
  • Silanol groups facilitate the covalent attachment of organic molecules to the surface, resulting in stable functionalization due to their excellent thermal, mechanical and chemical stability.
  • Field emission scanning electron microscopy (HR-FESEM) was used to study the thickness of the silica layer, comparing SS with SS-S ⁇ C>2 (Fig. 1). As can be seen in the figure, in the area of the silica layer the % of O and S has increased, and the % C and Fe have decreased. Nitrogen does not appear in any case, demonstrating that the silica layer is exclusively silica.
  • this material was put in contact with the vanillin derivative (Van-APTES) previously synthesized, thus forming the SS-S ⁇ C>2-Van materials.
  • Van-APTES vanillin derivative
  • the binding to the surfaces occurs by hydrolysis of the ethoxy groups of the Van-APTES derivative leading to the formation of silanols.
  • the silanols of Van-APTES condense with the silanols of the SS-S ⁇ Ü2 surface and lead to the formation of Si-O-Si covalent bonds.
  • Van-APTES 1 g was solubilized in ethanol.
  • the solution was poured onto the SS-SiC>2 plates and the plates were shaken for 5.5 h at room temperature. The plates were then washed with ethanol and dried at room temperature, giving rise to SS-SiC>2-Van surfaces.
  • this invention also presents as an example the immobilization of an essential oil functionalized with an alkoxysilane (aminopropyltriethoxysilane, APTES), such as the antimicrobial bioactive molecule Vanillin, on a surface, such as polypropylene (PP).
  • an alkoxysilane aminopropyltriethoxysilane, APTES
  • APTES aminopropyltriethoxysilane
  • Vanillin Vanillin
  • the first step in PP functionalization is the preparation of the polypropylene surface.
  • the PP surface must be chemically treated to expose the surface hydroxyl groups.
  • the surface of the polypropylene (PP) plastic was treated with an oxidizing agent (potassium peroxydisulfate) to generate hydroxyl group (PP-OH), which is important for functionalization.
  • Potassium peroxydisulfate is used as a source of radicals in aqueous solution, it is well known as an initiator of free radical polymerization and as an oxidizing agent.
  • the hydroxyl groups of PP are formed by the abstraction of a hydrogen (from the tertiary carbon present in each repeating unit of the polymer) leading to the formation of a macroradical that subsequently reacts with a second hydroxyl radical, leading to the introduction of hydroxyl groups on the surface of the PP.
  • This activation is important because the amount of hydroxyl groups obtained during the activation process strongly influences the initiation of silane bonding and therefore the formation of the silica film.
  • Hydroxyl groups are essential in forming strong covalent bonds with the silanol groups of the coating silica.
  • silica layer coating was deposited and covalently immobilized with APTES-functionalized bioactive molecule as carried out in the processes described in Examples 2.2 and 2.3, giving rise to the surfaces PP-SIO2 and finally PP-S ⁇ C>2-Van.
  • ninhydrin was used as a colorimetric test agent.
  • ninhydrin is used in colorimetric assays for the recognition of amine groups, in these assays a color change from yellow to deep purple is observed only in case of the presence of amino groups in the solution.
  • the deep purple color known as Oxford violet, is produced when two molecules of the compound ninhydrin (2,2-dihydroxyindane-1,3-dione) react with a primary amine, a secondary amine or an amino acid.
  • the ninhydrin assay was developed by immersing SS, SS-OH, SS-S ⁇ Ü2 and SS-S ⁇ C>2-Van plates in the ninhydrin solution and the plates were left in contact with the solution for 10 min at 80 °C. After this time, it was observed that only the SS-S ⁇ Ü2 -Van plates turned purple, confirming the ninhydrin process. functionalization of vanillin on the surface. After that, the SS-S ⁇ C>2-Van plates were immersed in 5 ml of ethanol and sonicated for several hours to separate the Van-ninhydrin complex from the surface.
  • the Van-ninhydrin content of the ethanol solvent was quantified by measuring its absorbance at 400 nm.
  • a calibration curve was previously prepared with the Van-ninhydrin complex obtained by reacting the ninhydrin with the Van-APTES derivative in ethanol (from 0.9 to 10.5 mg/mL) and was used for quantification.
  • the same methodology was performed for the bare and control surfaces: SS plates (bare surface), SS-OH and SS-S ⁇ C>2 plates (control surfaces).
  • the result obtained was 0.95 ⁇ 0.1 mg/cm 2 of functionalization on each SS-S ⁇ C>2-Van steel surface.
  • the result obtained was 0 mg/cm 2 .
  • Example 4 Evaluation of microbial viability - SS-S ⁇ O2-Van and PP-S ⁇ O2-Van.
  • the antimicrobial activity of the coatings of the invention in particular those of example 2 (SS-S ⁇ O2-Van), against microorganisms was evaluated by in-vitro tests with S. epidermidis.
  • Microbial viability assessment was performed in liquid medium, to allow contact between bacteria and functionalized and non-functionalized surfaces during incubation, followed by plating to enumerate the remaining viable colony-forming units (CFU).
  • Materials coated with the coating of the invention were compared with materials such as stainless steel (SS), activated stainless steel (SS-OH) and silica-coated stainless steel (SS-SIO2), these were considered as negative controls.
  • Antimicrobial efficacy was performed in liquid medium, in phosphate buffered solution (PBS). Dilutions inoculated with S. epidermidis in PBS were prepared to obtain a concentration of 10 4 cells/mL. A flask containing the functionalized SS-S ⁇ C>2-Van surfaces was inoculated with 1 mL of S. epidermidis suspension to obtain a final concentration of 10 3 cells/mL. SS, SS-OH and SS-S ⁇ O2 plates were treated following the same procedure as SS-S ⁇ O2-Van. Finally, all samples were incubated with orbital shaking (120 rpm) at 37 °C for 24 h.
  • orbital shaking 120 rpm
  • the antimicrobial activity of the coatings of the invention in particular those of example 2.4 (PP-S ⁇ C>2-Van), against microorganisms was evaluated by in vitro tests with Escherichia coli, which led to the total elimination of the microorganism after 24 h of treatment compared to untreated surfaces (PP, PP-OH and PP-S ⁇ C>2).
  • the results can be observed in Figure 4.
  • the results showed that polypropylene surfaces functionalized with a CAEs, such as Vanillin, reduced bacterial viability by 100% ( Figure 4).
  • Another example carried out to confirm the antimicrobial capacity of our surfaces was to evaluate the capacity of SS-SO2-Van surfaces to inhibit the formation of biofilms.
  • Bacterial adhesion assays with SS-S ⁇ C>2-Van were performed in liquid medium, Tryptic Soy Broth (TSB). Dilutions of S. epidermidis in TSB were prepared to obtain a concentration of 10 4 cells/mL.
  • a flask containing the functionalized SS-S ⁇ C>2-Van plates was inoculated with 1 mL of S. epidermidis suspension to obtain a final concentration of 10 3 cells/mL. Finally, all samples were incubated at 37 °C for 24 h.
  • SS, SS-OH and SS-S ⁇ C>2 plates were also dipped in a similar bacterial suspension as a control. After incubation, non-adhered bacteria were removed by gently washing the plates with sterile phosphate buffered saline (PBS) (pH 7.4). Each plate with adhered bacteria was placed in a flask containing 3 mL of sterile PBS and sonicated for 5 min.
  • PBS sterile phosphate buffered saline
  • antimicrobial coatings were prepared according to the state of the art, in particular by following the procedures described in WO2022067358A1. These procedures are briefly summarized in the following steps: a) providing a substrate, b) activating the substrate surface by treating the substrate with a solution of sulfuric acid and hydrogen peroxide, c) modifying the bioactive molecules, d) functionalizing the surface with the APTES liquid phase binding molecule, e) covalent immobilization of the bioactive molecules modified in c) on the surface with APTES from step d).
  • Example 7 Quantification of the atomic % of the different surfaces.
  • Atomic % analyses were performed by HR-FESEM-EDX (High Resolution Field Emission Scanning Electron Microscope with X-ray detector) on SS, SS-S ⁇ C>2, SS-S ⁇ C>2-Van and SS-Van surfaces, the latter two before and after the biofilm inhibition test, to check the effectiveness of the functionalization of the bioactive molecules on steels before and after the test against biofilm.
  • Figure 6 shows the presence of nitrogen, silicon, a decrease in the percentage of Fe (25.1% for SS-S ⁇ O2 and 0% for SS-S ⁇ C>2-Van) and an increase in the percentage of C (59.7% for SS-S ⁇ O2-Van), confirming the immobilization of the vanillin derivative on the surface.
  • the SS-S ⁇ C>2-Van surface after the antibiofilm test maintained the presence of nitrogen, silicon, a decrease in the percentage of Fe with respect to SS and an increase in the percentage of C were observed, confirming the robustness of the vanillin bond to the surface and therefore the robustness of the coating.
  • Example 8 Comparative antimicrobial assay for inhibition of biofilm formation.
  • a bacterial adhesion assay was performed at a concentration of 104 cells/mL in Tryptic Soy Broth (TSB).
  • TTB Tryptic Soy Broth
  • SS, SS-OH (activated with a solution of sulfuric acid and hydrogen peroxide) and SS-S ⁇ C>2 surfaces are also used as controls.
  • SS, SS-OH, SS-SIO2, SS-Van and SS-SIO2-Van surfaces were inoculated with 1 mL of S. epidermidis suspension to obtain a final concentration of 103 cells/mL and all samples were incubated at 37 °C for 24 h. After incubation, non-adherent bacteria were removed by gently washing the plates with sterile phosphate buffered saline (PBS) (pH 7.4). Plating was then performed to enumerate bacteria adhered to the surfaces.
  • PBS sterile phosphate buffered saline

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Abstract

La presente invención se refiere a un recubrimiento antimicrobiano. Más concretamente, la invención se refiere a un recubrimiento que comprende una capa de sílice y moléculas bioactivas funcionalizadas con una molécula de enlace, donde las moléculas bioactivas funcionalizadas están inmovilizadas covalentemente a la superficie de la sílice mediante enlaces covalentes, a su proceso de preparación y su uso en la prevención del crecimiento microbiano, formación de biopelículas, la inhibición de la adhesión microbiana y/o la eliminación de células microbianas adheridas al mismo.

Description

DESCRIPCIÓN
Recubrimientos antimicrobianos
Campo Técnico
La presente invención se refiere a un recubrimiento antimicrobiano, a su proceso de preparación y su uso en la prevención del crecimiento microbiano, formación de biopelículas, la inhibición de la adhesión microbiana y/o la eliminación de células microbianas adheridas al mismo.
Antecedentes de la Invención
Las infecciones nosocomiales constituyen uno de los problemas más importantes que se presentan en el sistema de salud, siendo una de las principales causas de mortalidad y aumento de la morbilidad en los pacientes hospitalizados. Una de las principales razones de estas infecciones es la capacidad microbiana de adherirse a superficies sólidas (bióticas o abióticas). Esta capacidad provoca la formación de estructuras poliméricas denominadas biopelículas. La función de las biopelículas es actuar como una trampa para los nutrientes y como una barrera física que impide la penetración y difusión de antibióticos y desinfectantes comunes.
La formación de biopelículas comienza con la adhesión de células planctónicas individuales a una superficie. Estas células adherentes se convierten en micro colonias que luego proliferan en biopelículas maduras. Las biopelículas maduras producen componentes de matriz extracelular (ECM) que son críticos para mantener las estructuras distintivas de los agregados celulares.
Una estrategia efectiva para prevenir la formación de biopelículas en superficies bióticas y abióticas es depositar una capa antimicrobiana en la superficie del material. Existen vahos estudios basados en la inmovilización o liberación de sustancias antimicrobianas sobre diferentes superficies, sin embargo, dependiendo de la aplicación, no son completamente exitosos debido a su limitada eficacia o toxicidad.
La inmovilización o liberación de sustancias antimicrobianas, como derivados de metales, sales de poliamonio y antibióticos, ha mostrado resultados alentadores. Aun así, su uso puede estar asociado con efectos secundarios como citotoxicidad, hipersensibilidad y respuestas inflamatorias. Además, el uso indiscriminado de estas sustancias ha generado un problema mayor, que es la resistencia antimicrobiana. La resistencia a los antimicrobianos (RAM) ocurre cuando las bacterias, los virus, los hongos y/o los parásitos cambian con el tiempo y ya no responden a los medicamentos, lo que hace que las infecciones sean más difíciles de tratar y aumenta el riesgo de propagación de enfermedades, enfermedades graves y muerte. Como resultado de la resistencia a los medicamentos, los antibióticos y otros medicamentos antimicrobianos se vuelven ineficaces y las infecciones se vuelven cada vez más difíciles o imposibles de tratar.
Se han empleado vahos enfoques en la búsqueda de superficies antimicrobianas efectivas, incluida la resistencia a la adhesión, la destrucción por contacto y la lixiviación de biocidas. Entre estos enfoques, la muerte bacteriana por contacto parece ser la ruta más prometedora; este enfoque implica modificaciones químicas o físicas para unir un agente antimicrobiano a la superficie.
Entre las estrategias más comúnmente aplicadas para la modificación de superficies se encuentran la adsorción (a través de interacciones electrostáticas), el acoplamiento ligando-receptor y la unión covalente (Vasilev K, Cook J, Ghesser HJ. Antibacterial surfaces for biomedical devices. Expert Rev Med Devices. 2009;6(5):553-567).
La unión covalente ofrece vahas ventajas al proporcionar los enlaces más estables entre el compuesto bioactivo y la superficie. Algunos estudios han reportado la inmovilización sobre superficies de acero inoxidable u otras superficies (plástico, titanio y otras) de ciertas moléculas bioactivas como péptidos antibactehanos como magainina, nisina y lisozima o la inmovilización de biopolímeros como el quitosano.
Algunas de las estrategias desarrolladas recientemente se describen a continuación.
La solicitud de patente española EP3326971A1 , “Sistema antimicrobiano”, divulga la funcionalización de antimicrobianos naturales con grupos thalcoxisilano sobre la superficie de un soporte mesoporoso de sílice.
El artículo “Antibacterial isoeugenol coating on stainless steel and polyethylene surfaces prevents biofilm growth” (Nielsen, C. K., et al. "Antibacterial isoeugenol coating on stainless steel and polyethylene surfaces prevents biofilm growth". Journal of applied microbiology 124.1 (2018): 179-187) divulga recubrimientos de superficies de acero inoxidable y de polietileno con eugenol, para evitar el crecimiento de biofilms.
El documento “Enhanced antimicrobial activity of essential oil components immobilized on silica particles” (Ruiz-Rico, Maria, et al. "Enhanced antimicrobial activity of essential oil components immobilized on silica particles. "Food chemistry 233 (2017): 228-236.) divulga la inmovilización de aceites esenciales mediante 3-aminopropil trietoxisilano, sobre tres soportes distintos de silicio.
El documento “Métodos y soportes para la inmovilización de componentes de aceites esenciales y su efecto sobre la actividad antimicrobiana y antioxidante” (Cebrián Cabo, Santiago. "Métodos y soportes para la inmovilización de componentes de aceites esenciales y su efecto sobre la actividad antimicrobiana y antioxidante." (2020)) describe la inmovilización de componentes de aceites esenciales en nanopartículas de sílice.
La solicitud de patente internacional WO2021107870A1 divulga un polímero antimicrobiano y la preparación de recubrimientos de superficies para aplicaciones antimicrobianas.
La solicitud de patente internacional WO2022067358A1 divulga recubrimiento antimicrobiano que comprende un sustrato, una molécula de enlace y un biosurfactante, donde el biosurfactante se une covalentemente a la superficie del material del sustrato.
No obstante, las estrategias descritas en estado de la técnica presentan vahos inconvenientes tales como la poca robustez de la unión con la molécula bioactiva que eventualmente resulta en una baja actividad microbiana y potencial de reutilización de la superficie bajo. Además, los sistemas descritos no son fácilmente aplicables a distintas superficies, por ejemplo, paredes o encimeras, y/o elementos, por ejemplo, material quirúrgico o prótesis.
La presente invención proporciona una solución a ese problema.
Sumario de la invención
En un primer aspecto, la invención se refiere a un recubrimiento antimicrobiano que comprende una capa de sílice y moléculas bioactivas funcionalizadas con una molécula de enlace, donde las moléculas bioactivas funcionalizadas están inmovilizadas covalentemente a la superficie de la sílice mediante enlaces covalentes.
En un segundo aspecto, la invención se refiere a un proceso para depositar un recubrimiento antimicrobiano de acuerdo al primer aspecto de la invención que comprende las siguientes etapas: a) proporcionar un sustrato, b) activación de la superficie del sustrato mediante el tratamiento del sustrato con una solución de ácido sulfúrico y peróxido de hidrogeno. c) deposición de una capa de sílice en la superficie del sustrato mediante la polimerización de precursores de sílice en medio alcalino, d) funcionalización de las moléculas bioactivas mediante su reacción con la molécula de enlace en fase liquida, e) inmovilización covalente de las moléculas bioactivas funcionalizadas obtenidas en la etapa d) sobre la capa de sílice generada en la etapa c) mediante la deposición de una solución alcohólica que comprende las moléculas bioactivas funcionalizadas, y f) secado de la superficie a temperatura ambiente.
En un tercer aspecto, la invención se refiere a un elemento, por ejemplo, herramientas quirúrgicas, o superficies, por ejemplo, paredes o suelos, que comprende al menos parcialmente un recubrimiento antimicrobiano de acuerdo al primer aspecto o un recubrimiento preparado de acuerdo al segundo aspecto de la invención.
En un cuarto aspecto, la invención se refiere al uso de un recubrimiento antimicrobiano de acuerdo al primer aspecto, un recubrimiento antimicrobiano preparado de acuerdo al segundo aspecto o de un elemento o superficie de acuerdo al tercer aspecto de la invención en la prevención del crecimiento microbiano, formación de biopelículas, la inhibición de la adhesión microbiana y/o la eliminación de células microbianas adheridas al mismo.
Descripción de las figuras
Figura 1. Análisis HR-FESEM EDX de las superficies SS y SS-S¡O2 para la determinación del grosor de la capa de sílice de la superficie SS-S¡C>2. Figura 2. Comparativa de recuentos (UFC, %) de la bacteria S. epidermidis después del contacto con superficies funcionalizadas (SS-S¡C>2-Van) y no funcionalizadas (SS, SS-OH y SS-S¡C>2) en función del tiempo.
Figura 3. Robustez del efecto antimicrobiano de las superficies SS-S¡C>2-Van frente a S. epidermidis tras varios test sucesivos.
Figura 4. Comparativa de recuentos (log CFU/ml, %) de la bacteria E. coli después del contacto con superficies funcionalizadas (PP-S¡O2-Van) y no funcionalizadas (PP, PP-OH y PP-S¡C>2) después de 24h.
Figura 5. Capacidad inhibitoria para la formación de biopelículas de superficies SS-S¡C>2- Van frente a S. epidermidis después de 24h.
Figura 6. Análisis HR-FESEM EDX de las superficies SS, SS-S¡C>2, SS-S¡C>2-Van y SS- SiC>2-Van después del ensayo contra biofilm.
Figura 7. Análisis HR-FESEM EDX de las superficies SS, SS-Van y SS-Van después del ensayo contra biofilm.
Figura 8. Ensayo antimicrobiano de inhibición de la formación de biofilms de las distintas superficies de acero frente a S. epidermidis.
Figura 9. Ensayo antimicrobiano de inhibición de la formación de biofilms de las distintas superficies de acero frente a S. epidermidis en un segundo ciclo de uso.
Descripción detallada de la invención
La presente invención proporciona un recubrimiento antimicrobiano que comprende una capa de sílice y moléculas bioactivas funcionalizadas con una molécula de enlace, donde las moléculas bioactivas funcionalizadas están inmovilizadas covalentemente a la superficie de la sílice mediante enlaces covalentes.
El uso de recubrimientos antimicrobianos mejorados por una inmovilización covalente de una molécula antimicrobiana bioactiva en la superficie mediante una capa intermedia de sílice, supone una novedad en este campo técnico. En particular en lo que se refiere a la bacteria S. epidermidis, considerada una de las causas más frecuentes de infecciones nosocomiales y principal patógeno responsable de las infecciones crónicas asociadas al biopeliculas en tejidos como la piel, las vías respiratorias y los dispositivos médicos.
El término “antimicrobiano” se refiere a un elemento que impide la formación o el desarrollo de los microorganismos. En particular, se refiere a un recubrimiento que previene el crecimiento microbiano, la formación de biopeliculas, inhibe la adhesión microbiana y/o elimina las células microbianas adheridas al mismo.
El término “molécula bioactiva” se refiere a moléculas que poseen actividad antimicrobiana, en particular antibacteriana, antifúngica y/o antiviral.
El término "polímero(s)" en el contexto de esta solicitud significa oligómero(s), polímero(s) y copolímero(s), sus mezclas y principalmente también su formación de composites con base orgánica y/o sustancialmente orgánica. Habitualmente, el (los) "polímero(s)" en el contexto de esta solicitud se presenta(n) predominantemente o completamente en forma de polímero(s) y/o copolímero(s).
El término “funcionalizar” se refiere a la modificación de una superficie o molécula para incorporar ciertos elementos, por ejemplo, grupos funcionales o moléculas, que doten dicha superficie de propiedades fisicoquímicas particulares.
El término "activar" se refiere a la capacidad, en un paso procedimental posterior, por ejemplo, una etapa de inmersión, de una solución y/o una dispersión acuosa, cerca de la superficie del sustrato, de generar grupos hidroxilo. En el procedimiento de acuerdo con la invención se crea de esta manera una condición de que puede formarse una capa secuencial sobre el sustrato.
El término “inmovilización covalente” se refiere a la unión mediante un enlace covalente. En particular se refiere a la unión entre sustrato y sílice y a la unión sílice y molécula bioactiva mediante enlaces covalentes.
Más específicamente, la presente invención se basa en la mejora y superación de los inconvenientes y desventajas que presentan los métodos ya conocidos, en particular aquellos descritos en WO 2022067358. En particular los métodos conocidos presentan lixiviación de los sitios activos, actividades antimicrobianas baja y mala reproducibilidad en el recubrimiento de materiales.
Este recubrimiento antimicrobiano puede actuar frente a los microorganismos que se desee, ya sean bacterias, virus o también hongos microscópicos, levaduras o protozoos. Así, el recubrimiento testado en S. epidermidis constituye un modelo para otros microorganismos.
El recubrimiento del primer aspecto se une de manera covalente a la superficie del sustrato (S) mediante enlaces S-O-Si entre el sustrato y la capa de sílice. La unión covalente entre sustrato y recubrimiento mediante una capa de sílice dota el recubrimiento de gran robustez y permite que las moléculas bioactivas se mantengan ancladas en el sustrato durante un periodo prolongado de tiempo y por tanto se mantenga la eficacia antimicrobiana de la superficie recubierta.
La capa de sílice dispuesta sobre el sustrato se caracteriza por un grosor entre 0.10 pm y 10 pm, preferiblemente la capa de sílice dispuesta sobre el sustrato tiene un grosor entre 0,10 pm y 5 pm, y todavía más preferiblemente entre 0,10 pm y 2 pm.
En las estrategias descritas en el estado de la técnica, por ejemplo, en WO 2022067358, el enlace de la molécula bioactiva se lleva a cabo mediante un anclaje directo de la molécula de enlace sobre la superficie del acero, resultando en una unión covalente de tipo Fe-O-S¡. Este tipo de enlace no es muy robusto porque el enlace Fe-0 es bastante susceptible a la hidrólisis y por ello el recubrimiento resultante tiene una capacidad de reutilización bajo. Sin embargo, en el recubrimiento de la invención, la capa de sílice refuerza los anclajes al acero, y el anclaje final de la molécula de enlace se lleva a cabo a través de enlaces Si-O-Si, siendo estos mucho más estables.
Los sustratos que pueden ser recubiertos por los recubrimientos de la invención son muy vanados, como, por ejemplo, metales, polímeros, materiales cerámicos y/o vidrio. Los metales adecuados incluyen, entre otros, titanio, cobre, oro, estaño, níquel, aluminio, hierro, cobalto, plata, platino, magnesio, manganeso, zinc y aleaciones de metales como aceros, bronce o latón.
En el grupo de los polímeros se incluyen polímeros convencionales, como, por ejemplo, cloruro de polivinilo (PVC), ácido de polivinilo (PVA), polietileno (PE), poliestireno (PS), polipropileno (PP), policarbonato (PC), tereftalato de polietileno (PET), poliamida (PA), poliuretano (Pll), estireno, butadieno, acrilonitrilo (ABS), o polímeros biodegradables, como, por ejemplo, ácido poli láctico (PLA), colágeno, biogomas, o celulosa.
Los materiales cerámicos de interés incluyen, a modo de ejemplo, TÍO2, AI2O3, materiales tipo cermet, por ejemplo, WC-Co o WC-Co-Cr, o materiales bi-componente como pueden ser TÍO2 + NiAI.
Los recubrimientos de la invención pueden recubrir la superficie del sustrato de manera total o parcial según sea necesario.
En dichos recubrimientos antimicrobianos, se prefiere que las moléculas bioactivas se seleccionen del grupo de componentes de aceites esenciales (CAE), ácidos orgánicos, polímeros naturales, bacteriocinas, y/o enzimas. En una realización preferida, la molécula bioactiva es un componente de aceite esencial. En la realización más preferida la molécula bioactiva se selecciona del grupo de componentes de aceites esenciales siguiente: carvacrol, cinamaldehído, perillaldehído, eugenol, timol, vainillina, geraniol, cafeno, timoquinona, dialiyldisulfito, alil isotiocianato o mezclas de los mismos. En la realización aún más preferida la molécula bioactiva es vainillina. La actividad antimicrobiana de los CAE no se atribuye a un único mecanismo, sino que es una cascada de reacciones (degradación de la pared celular, daño de la membrana citoplásmica, daño de la proteína de la membrana, coagulación del citoplasma y agotamiento del poder de los protones) que da como resultado la destrucción de las células de los microorganismos. Además, los CAE pueden penetrar en biopelículas formadas y matar los microorganismos protegidos.
En los recubrimientos de la invención, la molécula bioactiva se encuentra presente en un rango de concentraciones de 0,5 a 1 ,5 mg/cm2, preferiblemente en un rango de 0,8 a 1 ,05 mg/cm2. La molécula bioactiva en estos rangos de concentración asegura se produzca el efecto antimicrobiano deseado.
En lo que se refiere a la molécula espadadora, se prefiere que la molécula de enlace sea un alcoxisilano, preferiblemente la molécula de enlace se selecciona del siguiente grupo 3- aminopropil tñetoxisilano (APTES), clorometil tñetoxisilano, cloroetil tñetoxisilano, cloropropiletil tñetoxisilano, (3-mercaptopropil) tñetoxisilano, (4-Clorofenil tñetoxisilano, 3- (Trietoxisilil)propionitrilo, 3-(Trietoxisilil)propil isocianato, más preferiblemente la molécula de enlace es 3-aminopropil tñetoxisilano (APTES). En la realización preferida del primer aspecto las moléculas bioactivas funcionalizadas están unidas a la sílice mediante enlaces covalentes silicio-oxigeno-silicio (Si-O-Si). Este enlace covalente Si-O-Si entre molécula bioactiva y sílice asegura una unión fuerte y duradera, de manera que el recubrimiento es resistente al paso del tiempo y a múltiples lavados, manteniendo su actividad antimicrobiana.
En su segundo aspecto, la invención se refiere a un proceso para depositar un recubrimiento antimicrobiano de acuerdo al primer aspecto en sustratos que comprende las siguientes etapas: a) proporcionar un sustrato; b) activación de la superficie del sustrato mediante el tratamiento del sustrato con una solución activadora; c) deposición de una capa de sílice en la superficie del sustrato mediante la polimerización de precursores de sílice en medio alcalino; d) funcionalización de las moléculas bioactivas mediante su reacción con la molécula de enlace en fase liquida; e) inmovilización covalente de las moléculas bioactivas funcionalizadas obtenidas en la etapa d) sobre la capa de sílice generada en la etapa c) mediante la aplicación de una solución que comprende la molécula bioactiva funcionalizadas, y. f) secado de la superficie.
En una realización preferida del segundo aspecto, los sustratos que pueden ser recubiertos por la invención son muy vanados, como, por ejemplo, metales, polímeros, materiales cerámicos y/o vidrio. Los metales adecuados incluyen, entre otros, titanio, cobre, oro, estaño, níquel, aluminio, hierro, cobalto, plata, platino, magnesio, manganeso, zinc y aleaciones de metales como aceros, bronce o latón. En el grupo de los polímeros se incluyen, entre otros, cloruro de polivinilo (PVC), ácido de polivinilo (PVA), polietileno (PE), poliestireno (PS), polipropileno (PP), policarbonato (PC), tereftalato de polietileno (PET), poliamida (PA), poliuretano (PU), estireno, butadieno, acrilonitrilo (ABS), ácido poli láctico (PLA), colágeno, biogoma, o celulosa. Los materiales cerámicos de interés incluyen, a modo de ejemplo, TÍO2, AI2O3, materiales tipo cermet, por ejemplo, WC-Co o WC-Co-Cr, o materiales bi-componente como pueden ser TÍO2 + NiAI. En la realización del segundo aspecto, la solución activadora de la etapa b) es una solución ácida y/u oxidante. En una realización preferida del segundo aspecto, la superficie del sustrato se activa mediante una solución activadora que consiste en una solución acuosa de ácido sulfúrico, ácido nítrico, persulfato de potasio, peróxido de oxígeno o una mezcla de los mismos. La activación de la superficie se lleva a cabo durante menos de 15 min, preferiblemente 10 min. El contacto entre la solución acuosa y la superficie del sustrato debe ser corta para evitar los efectos corrosivos de la misma y a la vez generar suficientes grupos hidroxilos en la superficie del sustrato.
En una realización preferida del segundo aspecto, la deposición de la capa de sílice de la etapa c) se produce mediante la generación in situ de sílice a partir de un precursor seleccionado del grupo de ortosilicato de tetrametilo (TMOS), ortosilicato de tetraetilo (TEOS), metiltrimetoxisilano (MTMS), feniltrimetoxisilano (PTMS), dimetildimetoxisilano (DMDMS) y metacriloxipropiltrimetoxisilano (MPTMS). La opción más preferida de precursor es el ortosilicato de tetraetilo (TEOS).
En una realización preferida del segundo aspecto, la molécula bioactiva se selecciona del grupo de aceites esenciales, ácidos orgánicos polímeros naturales, bacteriocinas, enzimas, preferiblemente la molécula bioactiva es un aceite esencial. En una realización más preferida la molécula bioactiva es un componente de aceite esencial. En una realización aún más preferida la molécula bioactiva se selecciona del grupo de componentes de aceites esenciales (CAE) constituido por carvacrol, cinamaldehído, perillaldehído, eugenol, timol, vainillina, geraniol, cafeno, timoquinona, dialiyldisulfito, alil isotiocianato o mezclas de los mismos. En la realización más preferida la molécula bioactiva es vainillina.
En una realización preferida del segundo aspecto, la molécula de enlace empleada en la etapa d) es un alcoxisilano, preferiblemente la molécula de enlace se selecciona del siguiente grupo 3-aminopropil trietoxisilano, clorometil trietoxisilano, cloroetil trietoxisilano, cloropropiletil trietoxisilano, (3-mercaptopropil) trietoxisilano, (4-Clorofenil trietoxisilano, 3- (Trietoxisilil)propionitrilo, 3-(Trietoxisilil)propil isocianato. En la realización más preferida la molécula de enlace es 3-aminopropil trietoxisilano.
En una realización preferida del segundo aspecto, la solución de la etapa e) que comprende la molécula bioactiva funcionalizada es una solución de pentano, ciclopentano, hexano, ciclohexano, benceno, tolueno, 1 ,4-dioxano, cloroformo, éter dietílico, diclorometano (DCM), tetrahidrofurano (THF), acetona, dimetilformamida (DMF), acetonitrilo (MeCN), dimetilsulfóxido (DMSO), ácido fórmico, n-butanol, alcohol isopropílico (IPA), metanol, etanol, agua o sus mezclas. En una realización más preferida, la solución es una solución acuosa alcohólica, preferiblemente una solución de etanol y agua. En una realización preferente el secado de la etapa d) se produce a temperatura ambiente.
En su tercer aspecto, la invención se refiere a un elemento o superficie que comprende al menos parcialmente un recubrimiento antimicrobiano de acuerdo al primer aspecto o un recubrimiento preparado de acuerdo al segundo aspecto de la invención.
Los elementos o superficies que pueden comprender el recubrimiento de la invención pueden ser distintos materiales, en particular pueden ser de metal, polímeros, materiales cerámicos y/o vidrio. Los metales adecuados incluyen, entre otros, titanio, cobre, oro, estaño, níquel, aluminio, hierro, cobalto, plata, platino, magnesio, manganeso, zinc y aleaciones de metales como aceros, bronce o latón. En el grupo de los polímeros se incluyen, entre otros, cloruro de polivinilo (PVC), ácido de polivinilo (PVA), polietileno (PE), poliestireno (PS), polipropileno (PP), policarbonato (PC), tereftalato de polietileno (PET), poliamida (PA), poliuretano (PU), estireno, butadieno, acrilonitrilo (ABS), ácido poli láctico (PLA), colágeno, biogoma, o celulosa. Los materiales cerámicos de interés incluyen, a modo de ejemplo, TÍO2, AI2O3, materiales tipo cermet, por ejemplo, WC-Co o WC-Co-Cr, o materiales bi-componente como pueden ser TÍO2 + NiAI.
Entre los elementos cuya superficie tendría mayor interés recubrir, pueden citarse: una mascarilla higiénica, un tejido, una tela, instrumental de uso clínico, una pared, un suelo, un mueble, un pasamanos, un dispositivo móvil, una pantalla táctil o un filtro de aire. En general, puede tener interés cualquier superficie de cualquier objeto presente en un lugar donde debe predominar la higiene y debe hacerse lo posible por mantenerla, pero donde, desgraciadamente, es habitual la presencia de distintos microorganismos.
En su cuarto aspecto la invención se refiere a uso de un recubrimiento antimicrobiano de acuerdo al primer aspecto, un recubrimiento antimicrobiano preparado de acuerdo al segundo aspecto o de un elemento o superficie de acuerdo al tercer aspecto en la prevención del crecimiento microbiano, formación de biopelículas, la inhibición de la adhesión microbiana y/o la eliminación de células microbianas adheridas al mismo.
El microorganismo puede ser una bacteria, pero también un virus, un hongo microscópico, levaduras o un protozoo. Se tiene preferencia por una bacteria. La invención se explicará ahora con mayor detalle mediante los Ejemplos y Figuras que aparecen a continuación.
Ejemplos
Ejemplo 1. Funcionalización de moléculas bioactivas
Ejemplo 1.1. Funcionalización de moléculas bioactivas - vainillina
Para funcionalizar la molécula bioactiva, en este caso la vainillina, primeramente, se suspendió 1 g de vainillina en 25 mL de diclorometano y luego se añadieron a la mezcla 1 ,2 mL de 3-aminopropil trietoxisilano (APTES). La relación molar entre los reactivos fue de 1 :1 de vainill¡na:APTES (Esquema 1). La mezcla se agitó durante 2 h, y después de esto, la suspensión se evaporó a presión reducida para obtener el correspondiente derivado de alcoxisilano, (E)-2-metoxi-4-(((3-trietoxisilil)propil)imino)metil)fenol. En este primer paso, la reacción entre la vainillina y APTES da lugar al producto 3 en el que la vainillina se une al grupo etoxi por medio de un enlace ¡mina (Esquema 1).
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Esquema 1
En un segundo paso, 5 mmol de derivado de alcoxisilano (producto 3) se solubilizaron en etanol y se añadieron 340 mg de Pd/C. Posteriormente, se pasó un flujo de gas N2 a través del matraz de reacción para desplazar el O2. Luego, se agregó flujo de H2. La mezcla se agitó durante 3 h en atmósfera inerte. Finalmente, el derivado reducido, 2-metox¡-4-(((3- (trietoxisilil)propil)am ino)metil)fenol (Van-APTES), producto 4, se filtró y evaporó a presión reducida para obtener el compuesto puro como un sólido amarillo pálido.
El enlace ¡mina formado entre el grupo aldehido de vainillina y el grupo amina de APTES (3) se redujo para estabilizar la unión del grupo vainillina al grupo trialcoxisilano (4), Van- APTES. La reacción de reducción del enlace ¡mina se llevó a cabo mediante una hidrogenación química utilizando H2 y paladio sobre carbono (Pd/C) como catalizador (Esquema 2).
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Esquema 2
Ejemplo 1.2. Funcionalización de moléculas bioactivas - carvacrol, el eugenol y el timol
Para funcionalizar otras moléculas bioactivas, en este caso carvacrol, el eugenol y el timol, primeramente, se transformaron en derivados de aldehido. En un segundo paso, los aldehidos de carvacrol, eugenol y timol reaccionaron con 3-aminopropiltrietoxisilano (APTES) para producir los derivados de alcoxisilano correspondientes.
Los aldehidos del carvacrol y del timol se sintetizaron por formilación directa utilizando paraformaldehído.
En una síntesis típica, se colocaron 150 ml de acetonitrilo, 40 mmol de carvacrol o timol, 150 mmol de trimetilamina y 40 mmol de MgSCU anhidro dentro de un matraz de fondo redondo. La mezcla se colocó en una atmósfera de argón y se agitó durante 15 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente, se añadieron 270 mmol de paraformaldehído y la mezcla de reacción se calentó a reflujo durante 3,5 h a 83 °C. Luego se dejó enfriar la mezcla a temperatura ambiente. La solución se acidificó con una solución de HCI al 5% (320 mi) y se agitó durante 30 min en atmósfera inerte. Finalmente, la porción orgánica se extrajo con éter dietílico y los disolventes se eliminaron a presión reducida para obtener el aldehido de carvacrol o del timol.
El aldehido del eugenol se sintetizó mediante una reacción de Reimer-Tiemann. En una síntesis típica, 150 mi de agua se calentaron a 80 °C, en un matraz de fondo redondo, y 22 mmol de eugenol se disolvieron en el agua. El calor se redujo a 60 °C, luego se agregaron 400 mmol de KOH y 88 mmol de cloroformo. Como la reacción fue exotérmica, se añadió cloroformo a una velocidad de 1 ml/h durante un período de 7 horas por razones de seguridad. La mezcla de reacción se mantuvo a 60 °C durante un período adicional de 8 horas. Luego, la solución se acidificó con una solución de H2SO4 al 10%. La porción orgánica se extrajo con n-butanona y los disolventes se eliminaron a presión reducida.
Para facilitar la inmovilización covalente de los componentes de aceites esenciales a la capa de sílice, se sintetizaron los correspondientes derivados de aceites esenciales. Para ello se hicieron reaccionar 2 mi de los aldehidos de carvacrol, timol o eugenol con 2,3 mi (10 mmol) de (3-aminopropil)trietoxisilano (APTES) en presencia de diclorometano (20 mi) y MgSCU, dando lugar a las correspondientes ¡minas, que posteriormente se reducen de la misma manera que lo descrito para Van-APTES en el ejemplo 1.1. La mezcla se calentó a reflujo durante 1 h, luego se filtró y se evaporó a presión reducida para obtener un líquido transparente.
Ejemplo 2. Preparación del recubrimiento antimicrobiano
A continuación, se describe la preparación de los recubrimientos de la invención.
Ejemplo 2.1 Activación del sustrato - acero inoxidable (SS)
El primer paso en la funcionalización de SS es la preparación de la superficie de acero inoxidable.
Antes de depositar la capa de sílice, la superficie del material SS debe desengrasarse adecuadamente mediante ultrasonidos en vahos solventes como etanol y acetona, y luego con agua. Para ese fin, se colocaron placas de acero inoxidable (placas SS) en un vaso de precipitados (1 placa en 1 vaso de precipitados) y se sonicaron durante 10 min en cada uno de los siguientes productos químicos en sucesión: acetona (70 % v/v), etanol y agua desionizada.
Después del procedimiento de lavado, la superficie SS debe tratarse químicamente con una solución ácida o alcalina para activar la superficie metálica y exponer los grupos hidroxilo de la superficie. Los grupos hidroxilo se forman por quimisorción disociativa de moléculas de agua y, en general, se considera que la hidratación y la hidroxilación se producen en los sitios de iones metálicos reticulares expuestos en la superficie. Esta activación es importante porque la cantidad de grupos hidroxilo obtenidos durante el proceso de activación influye fuertemente en el inicio de la unión del silano y, por lo tanto, en la formación de la película de sílice. Luego, para el procedimiento de activación, los materiales SS lavados se trataron con solución piraña y se obtuvieron los materiales SS- OH.
La solución piraña correspondiente consistió en la adición de peróxido de hidrógeno en un vaso de precipitados, al cual se le añadió lentamente ácido sulfúrico concentrado, en una proporción de ácido sulfúrico a peróxido de hidrógeno de 7:3 (v/v). A continuación, la mezcla resultante se agitó suavemente antes de su uso.
Las placas SS limpias se sumergieron en la solución de piraña durante 10 min. Pasado este tiempo, las placas se retiraron y se colocaron en una segunda solución de piraña durante 5 min. Después del segundo tratamiento con piraña, las placas SS se enjuagaron dos veces en agua ultrapura antes de colocarlas en un baño de agua ultrapura durante 24 h. Las placas resultantes se denominarán SS-OH. Así, las superficies de SS y SS-OH, difieren únicamente en la presencia en las superficies SS-OH de los grupos hidroxilo generados.
Los grupos hidroxilo son esenciales en la formación de fuertes enlaces covalentes con los grupos silanol de la sílice del recubrimiento.
Ejemplo 2.2 Deposición de la capa de sílice sobre el soporte
Las placas SS-OH se trataron con TEOS mediante un procedimiento sol-gel. Las placas de SS-OH se colocaron en una solución acuosa básica, se calentaron a 80 °C y luego se añadieron gota a gota 5 mL de TEOS y la mezcla se agitó durante treinta minutos. Las placas se enjuagaron dos veces en agua ultrapura y se secaron a 100 °C durante la noche. La hidrólisis del TEOS produce grupos silanol (Si-OH) en presencia de agua y facilita la rápida adsorción de las entidades de silicato en la superficie del SS- material OH a través de enlaces de hidrógeno, para condensar aún más y formar un enlace covalente metal- siloxano (Me-O-Si-OH).
Los grupos silanol facilitan la unión covalente de moléculas orgánicas a la superficie, lo que resulta en una funcionalización estable debido a su excelente estabilidad térmica, mecánica y química. Se utilizó microscopía electrónica de barrido por emisión de campo (HR-FESEM) para estudiar el grosor de la capa de sílice, comparando SS con SS-S¡C>2 (Fig. 1). Como se observa en la figura, en la zona de la capa de sílice ha aumentado el % de O y S, y disminuye el % C y Fe. En ningún caso aparece nitrógeno, demostrándose que la capa de sílice es exclusivamente sílice.
Ejemplo 2.3 Funcionalización de la capa de sílice con las moléculas bioactivas - vainillina
Para la funcionalización la superficie de SS-S¡C>2, este material se puso en contacto con el derivado de vainillina (Van-APTES) previamente sintetizado formando así los materiales SS-S¡C>2-Van. La unión a las superficies se produce por hidrólisis de los grupos etoxi del derivado Van-APTES que conduce a la formación de silanoles. Los silanoles de Van- APTES se condensan con los silanoles de la superficie SS-SÍÜ2 y conducen a la formación de enlaces covalentes Si-O-Si.
Se solubilizó 1 g de Van-APTES en etanol. La solución se vertió en las placas de SS-SÍÜ2 y las placas se agitaron durante 5,5 horas a temperatura ambiente. Luego, las placas se lavaron con etanol y se secaron a temperatura ambiente, dando lugar a las superficies SS- SiC>2-Van
Ejemplo 2.4 Activación del sustrato - polipropileno (PP)
Enfocándonos en lo citado anteriormente, esta invención presenta también como ejemplo la inmovilización de un aceite esencial funcionalizado con un alcoxisilano (aminopropiltrietoxisilinao, APTES), como pueda ser la molécula bioactiva antimicrobiana Vainillina, sobre una superficie, como puede ser por ejemplo el polipropileno (PP).
El primer paso en la funcionalización de PP es la preparación de la superficie de polipropileno. La superficie PP debe tratarse químicamente para exponer los grupos hidroxilo de la superficie. Para ello, se trató la superficie del plástico polipropileno (PP) con un agente oxidante (peroxidisulfato de potasio) para generar grupo hidroxilo (PP-OH), importante para la funcionalización. El peroxidisulfato de potasio se utiliza como fuente de radicales en solución acuosa, es bien conocido como iniciador de la polimerización por radicales libres y como agente oxidante.
Los grupos hidroxilo del PP se forman por la extracción de un hidrógeno (del carbono terciario presente en cada unidad de repetición del polímero) que conduce a la formación de un macroradical que posteriormente reacciona con un segundo radical hidroxilo, dando lugar a la introducción de grupos hidroxilo en la superficie del PP. Esta activación es importante porque la cantidad de grupos hidroxilo obtenidos durante el proceso de activación influye fuertemente en el inicio de la unión del silano y, por lo tanto, en la formación de la película de sílice.
Los grupos hidroxilo son esenciales en la formación de fuertes enlaces covalentes con los grupos silanol de la sílice del recubrimiento.
A continuación, se depositó un recubrimiento de capa de sílice e inmovilizó covalentemente con molécula bioactiva funcionalizada con APTES como los llevados a cabo en los procesos descritos en los ejemplos Ejemplo 2.2 y 2.3, dando lugar a las superficies PP- SÍO2 y finalmente PP-S¡C>2-Van.
Ejemplo 3. Cuantificación de la funcionalización con las moléculas bioactivas - SS-S¡C>2- Van.
Para cuantificar la funcionalización de la superficie SS-S¡C>2-Van, se realizó un ensayo colorimétrico de superficie. Para este propósito, se usó ninhidrina como agente de prueba colorimétrica. Generalmente, la ninhidrina se usa en ensayos colorimétricos para el reconocimiento de grupos amina, en estos ensayos se observa un cambio de color de amarillo a púrpura intenso solo en el caso de la presencia de grupos amino en la solución. El color púrpura intenso, conocido como violeta de Ruhemann, se produce cuando dos moléculas del compuesto ninhidrina (2,2-dihidroxiindano-1 ,3-diona) reaccionan con una amina primaria, una amina secundaria o un aminoácido.
Considerando esto, el ensayo de ninhidrina se desarrolló sumergiendo placas de SS, SS- OH, SS-SÍÜ2 y SS-S¡C>2-Van en la solución de ninhidrina y las placas se dejaron en contacto con la solución durante 10 min a 80 °C. Después de este tiempo, se observó que solo las placas de SS-SÍÜ2 -Van se tornaron de color púrpura, lo que confirma el proceso de funcionalización de la vainillina en la superficie. Después de eso, las placas de SS-S¡C>2- Van se sumergieron en 5 mi de etanol y se sonicaron durante vahas horas para separar el complejo Van-ninhidrina de la superficie. Cuando se liberó todo el color de las placas SS debido a la ninhidhna unida, se cuantificó el contenido de Van-ninhidrina del disolvente de etanol midiendo su absorbancia a 400 nm. Previamente se preparó una curva de calibración con el complejo Van-ninhidrina obtenido al hacer reaccionar la ninhidhna con el derivado Van-APTES en etanol (de 0,9 a 10,5 mg/mL) y se utilizó para la cuantificación. La misma metodología se realizó para las superficies desnudas y de control: placas SS (superficie desnuda), placas SS-OH y SS-S¡C>2 (superficies de control).
El resultado obtenido fue de 0,95 ± 0,1 mg/cm2 de funcionalización sobre cada superficie de acero SS-S¡C>2-Van. Para las placas de SS, SS-OH y SS-SÍÜ2 el resultado obtenido fue de 0 mg/cm2.
Ejemplo 4. Evaluación de la viabilidad microbiana - SS-S¡O2-Van y PP-S¡O2-Van.
La actividad antimicrobiana de los recubrimientos de la invención, en particular los del ejemplo 2 (SS-S¡O2-Van), frente a los microrganismos se evaluó mediante ensayos in-vitro con S. epidermidis.
La evaluación de la viabilidad microbiana se realizó en medio líquido, para permitir el contacto entre las bacterias y las superficies funcionalizadas y no funcionalizadas durante la incubación, seguido de placas para enumerar las unidades formadoras de colonias (UFO) viables restantes. Se compararon materiales recubiertos con el recubrimiento de la invención con materiales como el acero inoxidable (SS), acero inoxidable activado (SS- OH) y acero inoxidable recubierto con sílice (SS-SÍO2), estos fueron considerados como controles negativos.
La eficacia antimicrobiana se realizó en medio líquido, en solución de fosfato (PBS). Se prepararon diluciones inoculadas con S. epidermidis en PBS para obtener una concentración de 104 células/mL. Un matraz que contenía las superficies SS-S¡C>2-Van funcionalizadas, se inoculó con 1 mL de suspensión de S. epidermidis para obtener una concentración final de 103 células/mL. Las placas de SS, SS-OH y SS-SÍO2 se trataron siguiendo el mismo procedimiento que SS-S¡O2-Van. Finalmente, todas las muestras se incubaron con agitación orbital (120 rpm) a 37 °C durante 24 h. Para contabilizar las células viables, se tomaron alícuotas de 100 pl de cada suspensión de muestra (SS, SS-OH, SS-SÍÜ2 y SS-S¡C>2-Van) y se distribuyeron en placas de agar soja triptona (TSA, por sus siglas en inglés). Después de la incubación de la placa a 37 °C durante 24 h, se contaron las colonias y los resultados obtenidos se expresaron como porcentaje de log UFC/mL. Todos los tratamientos se probaron por triplicado.
Las superficies SS-S¡C>2-Van mostraron un efecto antimicrobiano contra S. epidermidis, lo que llevó a la eliminación total del microorganismo después de 24 h de tratamiento en comparación con las superficies no tratadas (SS, SS-OH y SS-SÍO2). Los resultados pueden observarse en la Figura 2.
Adicionalmente, se comprobó la robustez de la actividad antimicrobiana con sucesivos ciclos. Se evaluó el efecto antimicrobiano de las mismas placas ya utilizadas para confirmar la presencia de la molécula antimicrobiana (Van-APTES) en las superficies.
La eficacia de la actividad antimicrobiana (Figura 3) se mantuvo en los dos ensayos siguientes (Ensayo II y Ensayo III) y se obtuvo una reducción total de la viabilidad bacteriana después de un tratamiento de 72 horas. Sin embargo, se observó una disminución en la actividad antimicrobiana de los materiales SS-S¡C>2-Van en los siguientes ciclos de prueba. Así, la eficacia de las placas alcanzó un 80% en el caso del Ensayo IV y un 40% en el Ensayo V (Figura 3) tras 72 horas de incubación en presencia de bacterias. A pesar de esta disminución, la actividad antimicrobiana de las placas es notable.
La actividad antimicrobiana de los recubrimientos de la invención, en particular los del ejemplo 2.4 (PP-S¡C>2-Van), frente a los microrganismos se evaluó mediante ensayos in- vitro con Escherichia coli, lo que llevó a la eliminación total del microorganismo después de 24 h de tratamiento en comparación con las superficies no tratadas (PP, PP-OH y PP- S¡C>2). Los resultados pueden observarse en la Figura 4. Los resultados mostraron que las superficies de polipropileno funcionalizadas con un CAEs, como es la Vainillina, redujeron la viabilidad bacteriana de un 100% (Figura 4).
Ejemplo 5. Comprobación de la adhesión microbiana- SS-S¡C>2-Van.
Otro ejemplo realizado para confirmar la capacidad antimicrobiana de nuestras superficies, fue evaluar la capacidad de las superficies SS-S¡O2-Van para inhibir la formación de biopelículas o biofilms. Los ensayos de adhesión bacteriana con SS-S¡C>2-Van se realizaron en medio líquido, caldo de triptona y soja (TSB, por sus siglas en inglés Tryptic Soy Broth). Se prepararon diluciones de S. epidermidis en TSB para obtener una concentración de 104 células/mL.
Un matraz que contenía las placas SS-S¡C>2-Van funcionalizadas se inoculó con 1 mL de suspensión de S. epidermidis para obtener una concentración final de 103 células/mL. Finalmente, todas las muestras se incubaron a 37 °C durante 24 h. Las placas de SS, SS- OH y SS-S¡C>2 también se sumergieron en una suspensión bacteriana similar como control. Después de la incubación, las bacterias no adheridas se eliminaron lavando suavemente las placas con una solución de fosfato (PBS) estéril (pH 7,4). Cada placa con bacterias adheridas se colocó en un matraz que contenía 3 mi de PBS estéril y se sonicó durante 5 min. Las soluciones sonicadas, que contenían las bacterias recuperadas, se diluyeron en serie y se distribuyeron 100 pL de cada dilución en placas de Tryptic Soy Agar (TSA). Las placas se incubaron durante la noche a 37 °C y el número de colonias se contó al día siguiente. La viabilidad de las bacterias se expresó como % de UFC. Todos los tratamientos se ensayaron por triplicado.
Los resultados en la Figura 5 mostraron que las superficies SS-S¡C>2-Van pudieron inhibir el 75 % de la formación de biopelículas en comparación con las placas SS, SS-OH y SS- S¡O2.
Ejemplo 6. Preparación del recubrimiento antimicrobiano comparativo (SS-Van)
A modo de ejemplo comparativo se prepararon recubrimientos antimicrobianos de acuerdo al estado de la técnica, en particular siguiendo los procedimientos descritos en WO2022067358A1. Estos procedimientos se resumen brevemente en las siguientes etapas: a) proporcionar un sustrato, b) activación de la superficie del sustrato mediante el tratamiento del sustrato con una solución de ácido sulfúrico y peróxido de hidrogeno. c) modificar las moléculas bioactivas d) funcionalización de la superficie con la molécula APTES de enlace en fase liquida, e) inmovilización covalente de las moléculas bioactivas modificadas en c) sobre la superficie con APTES de la etapa d).
Este procedimiento resulta en una unión directa entre el acero y la molécula bioactiva (vainillina) derivatizada con APTES, a través de un anclaje directo de la molécula de enlace (APTES) sobre la superficie del acero (superficie SS-Van).
Ejemplo 7. Cuantificación del % atómico de las diferentes superficies.
Se realizaron análisis de % atómico mediante HR-FESEM-EDX (Microscopio electrónico de barrido de emisión de campo de alta resolución con detector de rayos X) de las superficies SS, SS-S¡C>2, SS-S¡C>2-Van y SS-Van, estas dos últimas antes y después del ensayo de inhibición de biofilm , para comprobar la efectividad de la funcionalización de las moléculas bioactivas sobre aceros antes y después del ensayo contra biofilm.
La Figura 6 muestra la presencia de nitrógeno, de silicio, una disminución del porcentaje de Fe (25,1 para SS-SÍÜ2 y 0% para SS-S¡C>2-Van) y un aumento del porcentaje de C (59,7% para SS-S¡O2-Van), confirmando la inmovilización del derivado de vainillina en la superficie.
Además, la superficie SS-S¡C>2-Van después del ensayo antibiofilm mantuvo la presencia de nitrógeno, de silicio, se observó una disminución del porcentaje de Fe con respecto a SS y un aumento del porcentaje de C, confirmando la robustez del enlace de la vainillina a la superficie y por tanto la robustez del recubrimiento.
En la Figura 7 se observa en SS-Van la presencia de nitrógeno, la presencia de silicio, una disminución del porcentaje de Fe (0% para SS-Van) y un aumento del porcentaje de C (61% para SS-Van), confirmando la inmovilización del derivado de vainillina en la superficie. Sin embargo, la superficie SS-Van después del ensayo antibiofilm pierde totalmente el nitrógeno y silicio (que se encuentran en el APTES que hace de molécula de enlace entre la vainillina y el acero) y cuya presencia se mantiene exactamente igual en el caso de la superficie SS-S¡C>2-Van antes y después del ensayo antibiofilm.
También destacar que el porcentaje de Fe con respecto a SS que se observó para SS- SiC>2-Van después del ensayo antibiofilm fue de un 2,7%, mientras que el porcentaje de Fe con respecto a SS que se observaba para SS-Van después del ensayo antibiofilm es de un 7,5%, confirmando la pérdida del derivado de vainillina en SS-Van y la robustez de los recubrimientos SS-S¡C>2-Van en comparación a SS-Van.
Ejemplo 8. Ensayo comparativo antimicrobiano de inhibición de la formación de biofilms.
La capacidad antimicrobiana, la inhibición de la adhesión bacteriana y, por lo tanto, la reducción de la formación de biofilms en las superficies SS-Van (basadas en el documento WO2022067358A1) y SS-S¡C>2-Van (recubrimiento de la invención) se evaluaron en medio líquido contra la bacteria Staphylococcus epidermidis siguiendo el mismo procedimiento que el ejemplo 5.
Se realizó un ensayo de adhesión bacteriana con una concentración de 104 células/mL en caldo de triptona y soja (TSB, por sus siglas en inglés Tryptic Soy Broth). También se usan como controles las superficies SS, SS-OH (activada con una solución de ácido sulfúrico y peróxido de hidrogeno) y SS-S¡C>2.
Las superficies SS, SS-OH, SS-SÍO2, SS-Van y SS-S¡O2-Van se inocularon con 1 mL de suspensión de S. epidermidis para obtener una concentración final de 103 células/mL y todas las muestras se incubaron a 37 °C durante 24 h. Después de la incubación, las bacterias no adheridas se eliminaron lavando suavemente las placas con una solución de fosfato (PBS) estéril (pH 7,4). Después, se realizó el plantado para enumerar las bacterias adheridas a las superficies.
Los resultados, ver Figura 8, muestran que la superficie SS-S¡O2-Van inhibió el 75 % de la formación de biofilm, mientras que la superficie SS-Van sólo pudo inhibir un 12% la formación de biofilm, en comparación con las placas SS, SS-OH y SS-SÍO2.
Además, se evaluó la robustez de la actividad antimicrobiana de las mismas superficies mediante un ciclo sucesivo. Para ello, se probó el potencial de las superficies ya utilizadas en un primer ensayo como inhibidoras de la formación de biofilms.
Como se puede observar en la Figura 9, la superficie SS-S¡O2-Van siguió inhibiendo el 40 % de la formación de biofilm en su segundo ciclo de uso, mientras que la superficie SS- Van en este segundo ciclo fue incapaz de inhibir la formación de biofilm.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Un recubrimiento antimicrobiano que comprende una capa de sílice y moléculas bioactivas funcionalizadas con una molécula de enlace, donde las moléculas bioactivas funcionalizadas están unidas a la superficie de la sílice mediante enlaces covalentes.
2. El recubrimiento antimicrobiano de acuerdo a la reivindicación anterior, donde la moléculas bioactiva se selecciona del grupo de componentes de aceites esenciales (CAE), ácidos orgánicos polímeros naturales, bacteriocinas, enzimas, preferiblemente la molécula bioactiva es un aceite esencial, más preferiblemente la molécula bioactiva es un componente de aceite esencial (CAE) seleccionado del grupo constituido por carvacrol, cinamaldehído, perillaldehído, eugenol, timol, vainillina, geraniol, cafeno, timoquinona, dialiyldisulfito, alil isotiocianato o mezclas de los mismos.
3. El recubrimiento antimicrobiano de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la molécula de enlace es un alcoxisilano, preferiblemente la molécula de enlace se selecciona del siguiente grupo 3-aminopropil trietoxisilano, clorometil trietoxisilano, cloroetil trietoxisilano, cloropropiletil trietoxisilano, (3-mercaptopropil) trietoxisilano, (4-Clorofenil trietoxisilano, 3-(Trietoxisilil)propionitrilo, 3-(Trietoxisilil)propil isocianato, más preferiblemente la molécula de enlace es 3-aminopropil trietoxisilano.
4. El recubrimiento antimicrobiano de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones anteriores, aplicado al menos parcialmente sobre un sustrato seleccionado del siguiente grupo: metales, polímeros, materiales cerámicos y/o vidrio.
5. El recubrimiento antimicrobiano de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde las moléculas bioactivas funcionalizadas están unidas a la sílice mediante enlaces covalentes silicio-oxigeno-silicio (Si-O-Si).
6. Proceso para depositar un recubrimiento antimicrobiano de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en sustratos que comprende las siguientes etapas: a) proporcionar un sustrato; b) activación de la superficie del sustrato mediante el tratamiento del sustrato con una solución activadora; c) deposición de una capa de sílice en la superficie del sustrato mediante la polimerización de precursores de sílice en medio alcalino; d) funcionalización de las moléculas bioactivas mediante su reacción con la molécula de enlace en fase liquida; e) inmovilización covalente de las moléculas bioactivas funcionalizadas obtenidas en la etapa d) sobre la capa de sílice generada en la etapa c) mediante la deposición de una solución que comprende las moléculas bioactivas funcionalizadas; y f) secado de la superficie.
7. El proceso de acuerdo a la reivindicación 6, donde la deposición de la capa de sílice de la etapa c) se produce mediante la generación in situ de sílice a partir de un precursor seleccionado del grupo de ortosilicato de tetrametilo (TMOS), ortosilicato de tetraetilo (TEOS), metiltrimetoxisilano (MTMS), feniltrimetoxisilano (PTMS), dimetildimetoxisilano (DMDMS) y metacriloxipropiltrimetoxisilano (MPTMS), más preferiblemente a partir de ortosilicato de tetraetilo (TEOS).
8. El proceso de acuerdo a las reivindicaciones 6 a 7, donde la molécula bioactiva se selecciona del grupo de componentes de aceites esenciales, ácidos orgánicos polímeros naturales, bacteriocinas, enzimas, preferiblemente la molécula bioactiva es un aceite esencial, más preferiblemente la molécula bioactiva es un componente de aceite esencial seleccionado del grupo constituido por carvacrol, cinamaldehído, perillaldehído, eugenol, timol, vainillina, geraniol, cafeno, timoquinona, dialiyldisulfito, alil isotiocianato o mezclas de los mismos.
9. El proceso de acuerdo a las reivindicaciones 6 a 8, donde la molécula de enlace empleada en la etapa d) es un alcoxisilano, preferiblemente la molécula de enlace se selecciona del siguiente grupo 3-aminopropil trietoxisilano, clorometil trietoxisilano, cloroetil trietoxisilano, cloropropiletil trietoxisilano, (3-mercaptopropil) trietoxisilano, (4- Clorofenil trietoxisilano, 3-(Trietoxisilil)propionitrilo, 3-(Trietoxisilil)propil isocianato, más preferiblemente la molécula de enlace es 3-aminopropil trietoxisilano.
10. Un elemento o superficie que comprende al menos parcialmente un recubrimiento antimicrobiano de acuerdo a cualquier de las reivindicaciones anteriores 1 a 5 o un recubrimiento preparado de acuerdo a la reivindicación 6 a 9.
11. El uso de un recubrimiento antimicrobiano de acuerdo a las reivindicaciones 1 a 5, un recubrimiento antimicrobiano preparado de acuerdo a la reivindicación 6 a 9 o de un elemento o superficie de acuerdo a la reivindicación 10 en la prevención del crecimiento microbiano, formación de biopelículas, la inhibición de la adhesión microbiana y/o la eliminación de células microbianas adheridas al mismo.
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