WO2025005229A1 - 三次元細胞培養物の製造方法、三次元細胞培養物の培養方法、三次元細胞培養物、および被験物質の評価方法 - Google Patents

三次元細胞培養物の製造方法、三次元細胞培養物の培養方法、三次元細胞培養物、および被験物質の評価方法 Download PDF

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    • C12N2513/00—3D culture

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a three-dimensional cell culture using astrocytes, neurons, and microglia, and a method for culturing the three-dimensional cell culture.
  • the present invention further relates to a three-dimensional cell culture containing astrocytes, neurons, and microglia.
  • the present invention further relates to a method for evaluating a test substance using the three-dimensional cell culture.
  • the central nervous system is composed of neurons and glial cells (astrocytes, microglia, and oligodendrocytes), and these cells exert normal brain functions by influencing each other (Non-Patent Document 1).
  • neurons transmit information to other neurons by releasing glutamate into the synaptic cleft, and astrocytes regulate the information transmission of neurons by taking up glutamate (Non-Patent Document 2).
  • astrocytes glial cells
  • oligodendrocytes oligodendrocytes
  • Non-Patent Document 5 various three-dimensional culture systems have been reported to mimic the complex structure of the human brain. Furthermore, it is known that there are species differences in nerve cells and glial cells (Non-Patent Documents 6 and 7), and it is extremely important to use human cells to reproduce the human brain.
  • Patent Document 1 describes a three-dimensional co-culture containing astrocytes, neurons, and microglia derived from human iPS cells.
  • Patent Document 2 describes a three-dimensional organoid containing neurons and glia derived from human iPS cells.
  • Patent Document 3 describes a three-dimensional (spheroid) co-culture containing neurons and glia derived from human iPS cells.
  • the present invention aims to provide a method for producing a three-dimensional cell culture containing human-derived neurons, astrocytes, and microglia that can mimic the functions of the human brain, and a method for culturing a three-dimensional cell culture containing human-derived neurons, astrocytes, and microglia that can mimic the functions of the human brain.
  • a further object of the present invention is to provide a three-dimensional cell culture containing human-derived neurons, astrocytes, and microglia that can mimic the functions of the human brain.
  • a further object of the present invention is to provide a method for evaluating a test substance using the above-mentioned three-dimensional cell culture.
  • the inventors conducted extensive research to solve the above problems and discovered that a three-dimensional cell culture capable of mimicking the functions of the human brain can be produced by adding human astrocytes, human neurons, and human microglia to a culture vessel prior to co-culturing the cells so that the proportion of astrocytes among the total cells added to the culture vessel is 30% or more, and then co-culturing in the culture vessel.
  • the present invention was completed based on these findings.
  • a method for producing a three-dimensional cell culture comprising the steps of: adding human-derived astrocytes, human-derived neurons, and human-derived microglia to a culture vessel prior to co-culturing cells; and co-culturing the astrocytes, the neurons, and the microglia in the culture vessel, wherein the astrocytes account for 30% or more of all cells added to the culture vessel.
  • ⁇ 3> The production method according to ⁇ 1> or ⁇ 2>, wherein the step of adding human-derived astrocytes, human-derived neurons, and human-derived microglia to a culture vessel prior to co-culture of the cells comprises the steps of suspending the human-derived astrocytes, human-derived neurons, and human-derived microglia in a culture medium, and simultaneously adding the culture medium containing the astrocytes, neurons, and microglia obtained as described above to the culture vessel.
  • ⁇ 4> The method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 3>, wherein the astrocytes, the nerve cells, and the microglia are differentiated from human-derived pluripotent stem cells.
  • ⁇ 5> The method according to ⁇ 4>, wherein the human-derived pluripotent stem cells are human iPS cells.
  • ⁇ 6> The method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 5>, wherein the proportion of the microglia in the total cells added to the culture vessel is 50% or less.
  • ⁇ 7> The method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 6>, wherein the proportion of the nerve cells among all the cells added to the culture vessel is 10% or more.
  • ⁇ 8> The method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 7>, wherein the three-dimensional cell culture is in a spheroid shape.
  • a method for culturing a three-dimensional cell culture comprising the steps of: adding human-derived astrocytes, human-derived neurons, and human-derived microglia to a culture vessel prior to co-culturing the cells; and co-culturing the astrocytes, the neurons, and the microglia in the culture vessel, wherein the astrocytes account for 30% or more of all the cells added to the culture vessel.
  • ⁇ 11> The culture method according to ⁇ 9> or ⁇ 10>, wherein the step of adding human-derived astrocytes, human-derived neurons, and human-derived microglia to a culture vessel prior to co-culture of the cells comprises the steps of suspending the human-derived astrocytes, human-derived neurons, and human-derived microglia in a culture medium, and simultaneously adding the culture medium containing the astrocytes, neurons, and microglia obtained as described above to the culture vessel.
  • ⁇ 12> The culture method according to any one of ⁇ 9> to ⁇ 11>, wherein the astrocytes, the nerve cells, and the microglia are differentiated from human-derived pluripotent stem cells.
  • ⁇ 13> The culture method according to ⁇ 12>, wherein the human-derived pluripotent stem cells are human iPS cells.
  • ⁇ 14> The culture method according to any one of ⁇ 9> to ⁇ 13>, wherein the proportion of the microglia in the total cells added to the culture vessel is 50% or less.
  • ⁇ 15> The culture method according to any one of ⁇ 9> to ⁇ 14>, wherein the proportion of the nerve cells in the total cells added to the culture vessel is 10% or more.
  • ⁇ 16> The culture method according to any one of ⁇ 9> to ⁇ 15>, wherein the three-dimensional cell culture is in a spheroid shape.
  • ⁇ 17> A three-dimensional cell culture comprising human-derived astrocytes, human-derived neurons, and human-derived microglia, obtained by the production method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 8>.
  • ⁇ 18> A method for evaluating a test substance, comprising contacting the three-dimensional cell culture according to ⁇ 17> with the test substance.
  • ⁇ 19> A method for evaluating a test substance, comprising producing a three-dimensional cell culture by the production method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 8>, and contacting the three-dimensional cell culture with a test substance.
  • the three-dimensional cell culture produced by the method of the present invention is a culture system that mimics the human brain, and is useful for studying the intercellular interactions between neurons and glial cells in normal brain function, as well as pathological mechanisms.
  • FIG. 1 shows the results of immunostaining of three-dimensional co-cultures.
  • FIG. 2 shows the results of calcium imaging performed in three-dimensional co-cultures.
  • the method for producing a three-dimensional cell culture of the present invention and the method for culturing a three-dimensional cell culture of the present invention are methods that include, prior to co-culturing the cells, a step of adding human-derived astrocytes, human-derived nerve cells, and human-derived microglia to a culture vessel, and a step of co-culturing the astrocytes, nerve cells, and microglia in the culture vessel, in which the proportion of the astrocytes among all the cells added to the culture vessel is 30% or more.
  • the percentage of astrocytes among all cells added to the container is substantially the same as the percentage of astrocytes in the three-dimensional cell culture.
  • the percentage of neurons among all cells added to the container is substantially the same as the percentage of neurons in the three-dimensional cell culture.
  • the percentage of microglia among all cells added to the container is substantially the same as the percentage of microglia in the three-dimensional cell culture.
  • astrocytes, nerve cells, and microglia can be added to a culture vessel simultaneously.
  • the above three types of cells may be placed in one container, suspended and mixed in a culture medium, and then added to the culture container.
  • the step of adding human-derived astrocytes, human-derived nerve cells, and human-derived microglia to the culture container includes a step of suspending human-derived astrocytes, human-derived nerve cells, and human-derived microglia in a culture medium, and a step of simultaneously adding the culture medium containing the astrocytes, nerve cells, and microglia obtained as described above to the culture container.
  • each of the above three types of cells may be suspended in a separate culture medium and added to the same culture vessel at the same time.
  • the three types of frozen cells that have been cryopreserved separately may be thawed and added to the same culture vessel at the same time.
  • the manner in which astrocytes, nerve cells, and microglia are added to the culture vessel simultaneously is not limited to the above.
  • three types of cells can be seeded simultaneously and co-cultured in any ratio. Furthermore, by culturing the three types of cells (astrocytes, neurons, and microglia) in three dimensions, it is possible to reflect and mimic the human brain more closely than conventional culture systems, which is useful for studying the brain's inherent functions and pathogenesis mechanisms. In the present invention, the use of three types of cells makes it possible to evaluate intercellular interactions in brain functions and pathogenesis.
  • Three-dimensional culture of three types of cells allows evaluation of neural activity after three weeks of culture. Since two-dimensional co-culture of three types of cells requires four weeks of culture to evaluate neural activity, it is possible that three-dimensional culture promotes the construction of a neural cell network.
  • the astrocytes, neurons, and microglia are preferably differentiated from human-derived pluripotent stem cells.
  • pluripotent stem cells derived from humans include human iPS cells (human induced pluripotent stem cells), human ES cells (human embryonic stem cells), and human mesenchymal stem cells.
  • Human iPS cells are preferred, but are not limited thereto.
  • Human iPS cells are iPS cells created from human cells.
  • human-derived pluripotent stem cells include pluripotent stem cells derived from a specimen that does not have a mutation in a disease-related gene that causes a nervous system disease, pluripotent stem cells derived from a specimen collected from a healthy human (healthy individual) that does not have a nervous system disease, pluripotent stem cells derived from a specimen collected from a patient with a disease, or pluripotent stem cells derived from a specimen that has a mutation in a disease-related gene.
  • "No mutation in a disease-related gene” means that there is no mutation in a disease-related gene that causes a nervous system disease.
  • the mutation when there is a mutation in a disease-related gene, the mutation may be an endogenous gene mutation that the patient originally has, or an exogenous gene mutation that has been artificially introduced. It is expected that the pathology of a disease derived from a specimen or a disease caused by a mutation in a disease-related gene can be mimicked by producing the three-dimensional cell culture of the present invention using pluripotent stem cells derived from a specimen collected from a patient with a disease, or pluripotent stem cells derived from a specimen that has a mutation in a disease-related gene.
  • ES cells can be established, for example, by culturing early embryos prior to implantation, the inner cell mass that constitutes the above-mentioned early embryos, single blastomeres, etc. (Manipulating the Mouse Embryo A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1994; Thomson, J.A. et al: Science, 282, 1145-1147, 1998).
  • an early embryo produced by nuclear transfer of the nucleus of a somatic cell may be used (Wilmut et al.: Nature, 385, 810, 1997; Cibelli et al.: Science, 280, 1256, 1998; Akira Iritani et al.: Protein Nucleic Acid Enzyme, 44, 892, 1999; Baguisi et al.: Nature Biotechnology, 17, 456, 1999; Wakayama et al.: Nature, 394, 369, 1998). ; Nature Genetics, 22, 127, 1999; Proc. Natl. Acad. Sci.
  • Parthenogenetic embryos may be used as early embryos (Kim et al.: Science, 315, 482-486, 2007; Nakajima et al.: Stem Cells, 25, 983-985, 2007; Kim et al.: Cell Stem Cell, 1, 346-352, 2007; Revazova et al.: Cloning Stem Cells, 9, 432-449, 2007; Revazova et al.: Cloning Stem Cells, 10, 11-24, 2008).
  • ES cells are available from collections or commercially available.
  • human ES cells are available from the Institute for Frontier Medical Sciences, Kyoto University (e.g., KhES-1, KhES-2, and KhES-3), WiCell Research Institute, and ESI BIO.
  • iPS cells are cells that have pluripotency (multi-lineage potential) and the ability to proliferate, and are produced by reprogramming somatic cells through the introduction of reprogramming factors. iPS cells exhibit properties similar to ES cells. There are no particular limitations on the somatic cells used to produce iPS cells, and they may be differentiated somatic cells or undifferentiated stem cells. iPS cells can be produced by known methods, etc. It is also naturally expected that iPS cell production methods developed in the future will be applied.
  • the most basic method for generating iPS cells is to introduce the four transcription factors Oct3/4, Sox2, Klf4, and c-Myc into cells using a virus (Takahashi K, Yamanaka S: Cell 126(4), 663-676, 2006; Takahashi K, et al: Cell 131(5), 861-72, 2007).
  • a virus Teakahashi K, Yamanaka S: Cell 126(4), 663-676, 2006; Takahashi K, et al: Cell 131(5), 861-72, 2007.
  • There are reports of human iPS cells being established by introducing the four factors Oct4, Sox2, Lin28, and Nanog Yu J, et al: Science 318(5858), 1917-1920, 2007.
  • There have also been reports of the establishment of iPS cells by introducing three factors excluding c-Myc Neakagawa M, et al.: Nat. Biotechnol.
  • histone methyltransferase G9a inhibitor BIX-01294, histone deacetylase inhibitor valproic acid (VPA) or BayK8644 can improve the production efficiency and reduce the amount of factors introduced (Huangfu D, et al: Nat. Biotechnol. 26(7), 795-797, 2008; Huangfu D, et al: Nat. Biotechnol. 26(11), 1269-1275, 2008; Silva J, et al: PLoS. Biol. 6(10), e253, 2008).
  • Cells that have been transformed into iPS cells, i.e., reprogrammed, can be selected using the expression of pluripotent stem cell markers (undifferentiated markers) such as Fbxo15, Nanog, Oct3/4, Fgf-4, Esg-1, and Cript as indicators.
  • pluripotent stem cell markers such as Fbxo15, Nanog, Oct3/4, Fgf-4, Esg-1, and Cript as indicators.
  • the selected cells can be recovered as iPS cells.
  • iPS cells can also be induced from somatic cells by adding chemical compounds (Hou P, et al: Science 341 (6146), 651-654, 2013).
  • iPS cells can also be obtained from, for example, FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. (FCDI), Kyoto University, or the RIKEN BioResource Center.
  • human-derived astrocytes include astrocytes induced to differentiate from astrocyte precursor cells (XCell Science, XCS-AP-001-1V, etc.) and iCell (registered trademark) astrocytes (FUJIFILM Cellular Dynamics, C1037), with astrocytes induced to differentiate from astrocyte precursor cells being preferred. When inducing differentiation from astrocyte precursor cells into astrocytes, it is preferable to induce differentiation in the absence of serum.
  • Human-derived neural cells can be obtained, for example, by inducing them from somatic cells taken from healthy individuals (healthy individuals) who do not have any disease-related gene mutations that cause nervous system diseases or nervous system diseases, or from human iPS cells made from somatic cells taken from patients with nervous system diseases, or by inducing them from established human iPS cell lines.
  • the neural cells induced to differentiate from human-derived pluripotent stem cells are not particularly limited, but are preferably motor neurons, cerebral cortical excitatory neurons, or substantia nigra neurons.
  • Methods for inducing differentiation of human-derived pluripotent stem cells into neurons are not particularly limited, but include a method in which neural stem cells are produced from pluripotent stem cells using treatment with low molecular weight compounds, etc., and then the cells are induced to differentiate into neurons, and a method in which the cells are directly induced to differentiate into neurons through gene expression, etc.
  • Methods for inducing differentiation of pluripotent stem cells into neural cells include, for example, (1) A method of culturing in a serum-free medium to form embryoid bodies (cell masses containing neural precursor cells) and differentiate them (SFEB method: Watanabe K, et al., Nat. Neurosci., 8: 288-296, 2005; SFEBq method: Wataya T, et al. Proc. Natl. Acad. Sci.
  • a method of differentiating pluripotent stem cells by introducing and expressing a neural induction factor (such as a gene encoding the Neurogenin2 (NGN2) protein) into the pluripotent stem cells (WO2014/148646; and Zhang Y., et al., Neuron, 78:785-98, 2013); (6) A method of differentiating pluripotent stem cells by introducing and expressing miR-9/9*-124; and combinations of these methods.
  • a neural induction factor such as a gene encoding the Neurogenin2 (NGN2) protein
  • the method of introducing a gene encoding the NGN2 protein into pluripotent stem cells and expressing it is preferred because it allows for the production of mature nerve cells in a short period of time and with high efficiency.
  • Human-derived nerve cells include induced nerve cells differentiated from iPS cells by forced expression of NGN2, iCell (registered trademark) glutamatergic nerve (FUJIFILM Cellular Dynamics, C1033), iCell (registered trademark) GABAergic nerve (FUJIFILM Cellular Dynamics, C1008), iCell (registered trademark) dopamine nerve (FUJIFILM Cellular Dynamics, C1028), iCell (registered trademark) motor nerve (FUJIFILM Cellular Dynamics, C1048), etc., with induced nerve cells differentiated from iPS cells by forced expression of NGN2 and iCell (registered trademark) glutamatergic nerve being preferred.
  • human-derived microglia examples include iCell (registered trademark) microglia (FUJIFILM Cellular Dynamics, C1110) and microglia (Axol Bioscience, AX0664), with iCell (registered trademark) microglia being preferred.
  • Astrocytes are cells that express at least one astrocyte-specific marker gene, which includes GFAP (glial fibrillary acidic protein), S100 ⁇ (S100 calcium binding protein B), KCNJ10 (potassium inwardly rectifying channel subfamily J member 10), AQP4 (Aquaporin-4), and SLC1A3 (solute carrier family 1 member 3).
  • GFAP glial fibrillary acidic protein
  • S100 ⁇ S100 calcium binding protein B
  • KCNJ10 potassium inwardly rectifying channel subfamily J member 10
  • AQP4 Amporin-4
  • SLC1A3 concentrate carrier family 1 member 3
  • the nerve cells are preferably cells that express at least one of the nerve cell-specific marker genes consisting of ⁇ -III tubulin, NeuN, N-CAM (neural cell adhesion molecule), and MAP2 (microtubule-associated protein 2), and have ⁇ -III tubulin-positive processes (hereinafter referred to as neurites).
  • nerve cell-specific marker genes consisting of ⁇ -III tubulin, NeuN, N-CAM (neural cell adhesion molecule), and MAP2 (microtubule-associated protein 2), and have ⁇ -III tubulin-positive processes (hereinafter referred to as neurites).
  • Microglia are cells that express at least one of the microglia-specific marker genes, including IBA1 (ionized calcium-binding adapter molecule 1), CD33, CD45, TREM2 (triggering receptor expressed on myeloid cells 2), P2RY12 (purinergic receptor P2Y, G-protein coupled, 12), TMEM119 (transmembrane protein 119), and CX3CR1 (CX3C-chemokine receptor 1).
  • IBA1 ionized calcium-binding adapter molecule 1
  • CD33 CD45
  • TREM2 triggering receptor expressed on myeloid cells 2
  • P2RY12 purinergic receptor P2Y, G-protein coupled, 12
  • TMEM119 transmembrane protein 119
  • CX3CR1 CX3C-chemokine receptor
  • the expression level of a marker gene can usually be analyzed based on the amount of transcription product corresponding to the gene, or the amount of translation product produced, activity, etc.
  • the expression level can be measured by measuring mRNA, which is the transcription product of the gene, or protein, which is the translation product of the gene, but it is preferable to measure mRNA or cDNA, which is its reverse transcription product.
  • the expression of the translation product (protein) can be detected or measured by immunocytostaining, which uses antibodies to detect intracellular proteins.
  • the proportion of the above-mentioned astrocytes among all cells added to the culture vessel is 30% or more, preferably 35% or more, more preferably 40% or more, and even more preferably 45% or more.
  • the proportion of the above-mentioned astrocytes among all cells added to the culture vessel is generally 80% or less, and preferably 70% or less.
  • the proportion of microglia among all cells added to the culture vessel is preferably 50% or less, more preferably 40% or less, and even more preferably 30% or less. There is no particular lower limit to the proportion of microglia among all cells added to the culture vessel, but it is generally 0.1% or more, preferably 1% or more, and even more preferably 10% or more.
  • microglia activated by neuroinflammation affect other cells, making it possible to evaluate cell-to-cell interactions during neuroinflammation.
  • the proportion of nerve cells among all cells added to the culture vessel is preferably 10% or more, more preferably 15% or more, even more preferably 20% or more, and particularly preferably 25% or more. There is no upper limit to the proportion of nerve cells, but it is generally 65% or less, and preferably 60% or less.
  • astrocytes, neurons, and microglia are co-cultured in a culture vessel.
  • a culture vessel a plate, a dish, a cell culture insert, a flask for cell culture, or the like having a well can be used, and a plate having a well is preferable.
  • PrimeSurface (registered trademark) plate (Sumitomo Bakelite), Cell Repellent plate (Greiner Bio one), and the like can be mentioned, and PrimeSurface plate (Sumitomo Bakelite) is preferable.
  • the shape of the culture vessel may be round-bottomed, U-bottomed, or V-bottomed, but is not limited thereto.
  • the surface inside the container that comes into contact with the culture medium is preferably non-cell-adhesive. This allows the cells to be cultured in a suspended state, making it easier to form spheroids. Alternatively, only certain areas of the surface inside the container may be made cell-adhesive, with the remaining areas being non-cell-adhesive. In this case, cells will gather at the cell-adhesive areas, allowing spheroids to form.
  • the lower limit of the number of cells (the number of cells is the total number of three types of cells; the same applies below) when seeded into a 96-well plate is not particularly limited, but is, for example, preferably 0.7 x 10 cells/well or more, more preferably 1.0 x 10 cells/well or more, even more preferably 1.2 x 10 cells/well or more, even more preferably 1.4 x 10 cells/well or more, particularly preferably 1.6 x 10 cells/well or more, and most preferably 1.8 x 10 cells/well or more.
  • the upper limit of the cell density at the time of seeding into the culture vessel is not particularly limited, and may be, for example, 8.0 ⁇ 10 4 cells/well or less, preferably less than 8.0 ⁇ 10 4 cells/well, more preferably 5.0 ⁇ 10 4 cells/well or less, even more preferably 3.0 ⁇ 10 4 cells/well or less, even more preferably 2.5 ⁇ 10 4 cells/well or less, and particularly preferably 2.3 ⁇ 10 4 cells/well or less.
  • the number of cells seeded into a 96-well plate is preferably from 1.0 x 104 cells/well to 8.0 x 104 cells/well, more preferably from 1.2 x 104 cells/well to 5.0 x 104 cells/well, even more preferably from 1.4 x 104 cells/well to 3.0 x 104 cells/well, still more preferably from 1.6 x 104 cells/well to 2.5 x 104 cells/well, and particularly preferably from 1.8 x 104 cells/well to 2.3 x 104 cells/well.
  • the medium can be selected from known or commercially available media.
  • the medium used for culturing can be a basal medium to which additives have been added.
  • the basal medium can be, for example, DMEM, DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)/F12, BrainPhys (registered trademark) Neuronal Medium, Neurobasal (trademark) Medium-A, Neurobasal (trademark) Medium, Neural Progenitor Basal Medium, NS-A Basal Medium, Basal Medium Eagle (BME), BGJb Medium, C
  • the medium include MRL 1066 Medium, Glasgow Minimum Essential Medium (MEM), Improved MEM Zinc Option, Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM), Medium 199, Eagle MEM, ⁇ MEM, Ham's F12 Medium, RPMI 1640 Medium, and Fischer's Medium.
  • a single medium or a combination of two or more types of medium may be used.
  • Additives that can be added to the culture medium include serum, retinoic acid, Wnt, BMP (bone morphogenetic protein) (such as BMP-4), CNTF (ciliary neurotrophic factor), BDNF (brain-derived neurotrophic factor), GDNF (glial cell line-derived neurotrophic factor), bFGF (basic fibroblast growth factor), EGF (epidermal growth factor), HGF (hepatocyte growth factor), SHH (sonic hedgehog), and NF-kappaB1 (NF-kappaB2).
  • BMP bone morphogenetic protein
  • BMP-4 CNTF
  • BDNF brain-derived neurotrophic factor
  • GDNF glial cell line-derived neurotrophic factor
  • bFGF basic fibroblast growth factor
  • EGF epidermal growth factor
  • HGF hepatocyte growth factor
  • SHH sonic hedgehog
  • NF-kappaB1 NF-kappaB2
  • IGF-1 insulin-like growth factor 1
  • Activin A Heregulin ⁇ -1, interleukins, 8-Br-cAMP, heparin, heparan sulfate, laminin, collagen, fibronectin, progesterone, selenite, B-27 (registered trademark) supplement, N2 Supplement with Transferrin (Apo), N2 Supplement with Transferrin, GlutaMAX (trademark), L(+)-ascorbic acid, ITS-supplement, MEM Non-Essential Amino Acid, GlutaMAX (trademark) supplement, and the like.
  • antibiotics e.g., penicillin, streptomycin, etc.
  • penicillin, streptomycin, etc. may be added.
  • the culture conditions may be selected from those generally used for cell culture, such as conditions at 37° C. and 5% CO 2.
  • the medium may be replaced at appropriate intervals (preferably once every 1 to 7 days, more preferably once every 2 to 3 days), but it is not necessary to replace the medium during the culture period.
  • the three-dimensional cell culture produced in the present invention is preferably in the form of a spheroid.
  • Spheroids can be formed by co-culturing astrocytes, neurons, and microglia in a culture vessel.
  • three-dimensional cell cultures can be produced by co-culturing astrocytes, neurons, and microglia in a gelling culture medium in a culture vessel, and then gelling the culture medium after co-cultivation.
  • the present invention provides a three-dimensional cell culture containing human-derived astrocytes, human-derived neurons, and human-derived microglia, which is obtained by the above-mentioned method for producing a three-dimensional cell culture of the present invention.
  • human-derived astrocytes, human-derived neurons, and human-derived microglia are added to a culture vessel prior to co-culture of cells, and therefore, in the three-dimensional cell culture of the present invention, it is assumed that astrocytes, neurons, and microglia are distributed throughout the core and surface of the three-dimensional cell culture.
  • the three-dimensional cell culture of the present invention is a three-dimensional culture of three types of cells (astrocytes, neurons, and microglia), and can therefore reflect and mimic the human brain, and can be used, for example, to screen for new drugs useful for neurodegenerative diseases.
  • Neurodegenerative diseases include Alzheimer's disease (AD), spinocerebellar degeneration, frontotemporal lobar degeneration (FTLD), Parkinson's disease, amyotrophic lateral sclerosis (ALS), Lewy body disease, Huntington's disease, and Niemann-Pick disease.
  • the present invention provides a method for evaluating a test substance, which comprises contacting the above-described three-dimensional cell culture of the present invention with the test substance.
  • the present invention further provides a method for evaluating a test substance, which comprises producing a three-dimensional cell culture by the production method of the present invention, and contacting the above-described three-dimensional cell culture with the test substance.
  • the present invention further comprises: (1) contacting the three-dimensional cell culture of the present invention with a test substance; (2) culturing the three-dimensional cell culture contacted with the test substance in the above step (1) and a control three-dimensional cell culture of the present invention that was not contacted with the test substance; (3) measuring the function of the three-dimensional cell culture (e.g., glutamine uptake, calcium oscillation, etc.); and (4) selecting a test substance that changes the function as a candidate drug, compared to a control that has not been contacted with the test substance.
  • a method for screening a drug comprising:
  • Test substances include, for example, proteins, peptides, antibodies, nucleic acids (gene expression vectors, siRNA, miRNA, antisense oligonucleotides, mRNA, etc.), viral vectors (AAV, lentivirus, adenovirus, etc.), non-peptide compounds, synthetic compounds, synthetic low molecular weight compounds, natural compounds, cell extracts, extracellular vesicles, plant extracts, animal tissue extracts, plasma, extracts derived from marine organisms, cell culture supernatants, and microbial fermentation products.
  • nucleic acids gene expression vectors, siRNA, miRNA, antisense oligonucleotides, mRNA, etc.
  • viral vectors AAV, lentivirus, adenovirus, etc.
  • non-peptide compounds synthetic compounds, synthetic low molecular weight compounds, natural compounds, cell extracts, extracellular vesicles, plant extracts, animal tissue extracts, plasma, extracts derived from marine organisms, cell culture supernatants
  • Test substances can also be obtained using any of the many approaches in combinatorial library methods known in the art, including (1) biological library methods, (2) synthetic library methods using deconvolution, (3) one-bead one-compound library methods, and (4) synthetic library methods using affinity chromatography selection. While the biological library method using affinity chromatography selection is limited to peptide libraries, other approaches can be applied to peptide, non-peptide oligomer, or small molecule compound libraries of compounds (Lam (1997) Anticancer Drug Des. 12:145-67). Examples of methods for the synthesis of molecular libraries can be found in the art (DeWitt et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6909-13; Erb et al. (1994) Proc.
  • Compound libraries can be stored in solution (see Houghten (1992) Bio/Techniques 13:412-21) or on beads (Lam (1991) Nature 354:82-4), chips (Fodor (1993) Nature 364:555-6), bacteria (U.S. Pat. No. 5,223,409), spores (U.S. Pat. Nos. 5,571,698, 5,403,484, and 5,223,409), plasmids (Cull et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. 2003, 14:131-132), or in the form of plasmon receptors (Pierre et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. 2003, 14:131-132). l. Acad. Sci.
  • the three-dimensional cell culture may be contacted with the test substance by adding the test substance to the culture medium of the three-dimensional cell culture.
  • the contact time is not particularly limited as long as it is long enough to confirm a change in the indicator, but may be, for example, 1 day or more, 2 days or more, 3 days or more, 4 days or more, 5 days or more, 6 days or more, or 7 days or more.
  • the concentration of the test substance added can be adjusted appropriately depending on the properties of the compound (solubility, toxicity, etc.).
  • the culture medium for the three-dimensional cell culture used when contacting the three-dimensional cell culture with the test substance is not particularly limited, as long as it is a medium capable of culturing the three-dimensional cell culture.
  • the culture temperature when contacting the test substance with the three-dimensional cell culture is not particularly limited, but is about 30 to 40°C, preferably about 37°C, and the culture is performed in an atmosphere of CO2- containing air, and the CO2 concentration is preferably about 2 to 5%.
  • Human iPS cell-derived astrocyte precursor cells (XCell Science, XCS-AP-001-1V) were seeded onto a flask coated with Matrigel basement membrane matrix (Corning, 354234) and cultured for 5 days (37°C, 5% CO2 ) using differentiation induction medium to induce differentiation into astrocytes.
  • the differentiated astrocytes were detached using TrypLE (trademark) Select (Thermo Fisher Scientific, 12563-029) and centrifuged at 600 x g for 5 minutes at room temperature. After centrifugation, the supernatant was removed, the cells were suspended in 1 mL of co-culture medium, and the number of cells was counted.
  • TrypLE trademark
  • Select Thermo Fisher Scientific, 12563-029
  • Neural cells generated by forced expression of the Ngn2 gene from iPS cells were thawed in a 37°C water bath. After thawing, the cells were added to co-culture medium and centrifuged at 600 ⁇ g for 5 minutes at room temperature. After centrifugation, the supernatant was removed, the cells were suspended in 1 mL of co-culture medium, and the number of cells was counted.
  • iPS cell-derived microglia iCell® Microglia, FCDI, C1110
  • iCell® Microglia FCDI, C1110
  • Astrocytes, neurons, and microglia were mixed at a cell number ratio of 10:6:3 (53%:32%:16%) and seeded in a 96-well plate (PrimeSurface (registered trademark) Plate 96U, Sumitomo Bakelite, MS-9096U) at 1.9 x 10 4 cells/well.
  • the cells were cultured at 37°C under 5% CO 2 conditions, and half of the medium was replaced three times a week.
  • anti-MAP2 antibody Novus, NB300-213
  • anti-IBA1 antibody Flujifilm Wako Pure Chemical Industries, 019-19741
  • anti-GFAP antibody Merck, MAB3402
  • the secondary antibody reaction was performed using 1000-fold diluted Goat anti-rabbit Alexa Fluor (registered trademark) 488 (Thermo Fisher Scientific, A11008) and 1000-fold diluted Goat anti-Chicken Alexa Fluor (registered trademark) 594 (Thermo Fisher).
  • the cells were treated with 1000-fold diluted Goat anti-Mouse Alexa Fluor (registered trademark) 647 (Thermo Fisher Scientific, A32728), and 1000-fold diluted Hoechst (registered trademark) 33342 solution (Dojindo, H342), and left to stand at room temperature for 60 minutes.
  • FIG. 1 shows nuclei (Hoechst), (B) microglia (IBA1), (C) neurons (MAP2), and (D) astrocytes (GFAP) stained, and signals were detectable in all cells. It was also confirmed that astrocytes, neurons, and microglia were distributed throughout the core and surface of the three-dimensional co-culture.
  • a working solution and a recording solution were prepared as follows.
  • Three-dimensional co-cultures were prepared with a ratio of neurons, astrocytes, and microglia of 5:85:10, 80:10:10, or 60:30:10.
  • the culture medium and an equal volume of Working solution were added, and the cells were incubated at 37°C for one hour. After that, the cells were washed with PBS(-), and an equal volume of Recording solution was added to the culture medium.
  • green fluorescent images of Calbryte(TM) 520 AM were acquired using a confocal quantitative image cytometer CQ1 (3 images/sec, 2 min). Then, the fluorescence intensity was quantified over time using ImageJ (NIH, version.1.50i). The results are shown in Figure 2.
  • the cells were blocked by treating with a 4% BSA solution (Sigma Aldrich, A416) in PBS(-) for 30 minutes. Then, the cells were treated with a 1000-fold diluted anti-IBA1 antibody (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, 011-27991) and an 800-fold diluted anti-NF- ⁇ B p65 antibody (Cell Signaling, 8242) as the primary antibody reaction, and left to stand overnight at 4°C.
  • a 4% BSA solution Sigma Aldrich, A416
  • PBS(-) PBS(-)
  • the sections are treated with 1000-fold diluted Donkey anti-goat Alexa Fluor (registered trademark) 488 (Thermo Fisher Scientific, A11055), 1000-fold diluted Donkey anti-rabbit Alexa Fluor (registered trademark) 594 (Thermo Fisher Scientific, A32754), and 1000-fold diluted Hoechst (registered trademark) 33342 solution (Dojindo, H342) as secondary antibody reaction, and allowed to stand at room temperature for 60 minutes.
  • images are taken using a confocal quantitative image cytometer CQ1 (Yokogawa Electric Corporation, CellVoyager (registered trademark) CQ1) to obtain images.

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Abstract

本発明の課題は、ヒト脳の機能を模倣可能なヒト由来の神経細胞、アストロサイト、およびミクログリアを含む三次元細胞培養物の製造方法および培養方法；ヒト脳の機能を模倣可能なヒト由来の神経細胞、アストロサイト、およびミクログリアを含む三次元細胞培養物；並びに上記三次元細胞培養物を用いた被験物質の評価方法を提供することである。本発明によれば、細胞の共培養に先立って、ヒト由来のアストロサイトと、ヒト由来の神経細胞と、ヒト由来のミクログリアとを培養容器に添加する工程、および上記アストロサイトと、上記神経細胞と、上記ミクログリアとを培養容器中で共培養する工程を含む、三次元細胞培養物の製造方法であって、培養容器に添加された全細胞中に占める上記アストロサイトの割合が３０％以上である、三次元細胞培養物の製造方法が提供される。

Description

三次元細胞培養物の製造方法、三次元細胞培養物の培養方法、三次元細胞培養物、および被験物質の評価方法
　本発明は、アストロサイトと神経細胞とミクログリアとを用いた、三次元細胞培養物の製造方法および三次元細胞培養物の培養方法に関する。さらに本発明は、アストロサイトと神経細胞とミクログリアとを含む三次元細胞培養物に関する。さらに本発明は、上記三次元細胞培養物を用いる被験物質の評価方法に関する。
　中枢神経系は神経細胞とグリア細胞（アストロサイト、ミクログリア、オリゴデンドロサイト）から構成されており、それらの細胞は相互に影響することで脳の正常な機能を発揮している（非特許文献１）。例えば、神経細胞はシナプス間隙にグルタミン酸を放出することで他の神経細胞に情報伝達を行うが、アストロサイトはグルタミン酸の取り込みを行うことで神経細胞の情報伝達を調節する役割を担っている（非特許文献２）。また、ミクログリアは老化や炎症により活性化してアストロサイトに影響を与え、さらにはそのアストロサイトが神経細胞に傷害を与えることが報告されている（非特許文献３および４）。そのため、中枢神経系の研究を行う上で、神経細胞とグリア細胞の細胞間相互作用を評価できる共培養系は大変有用である。
　また、近年はヒト脳の複雑な構造を模倣するために、種々の三次元培養系が報告されている（非特許文献５）。さらには、神経細胞やグリア細胞には種差があることも知られており（非特許文献６および７）、ヒト脳を再現するためにはヒト細胞を用いることが非常に重要である。
　特許文献１には、ヒトｉＰＳ細胞由来のアストロサイト、神経細胞およびミクログリアを含む三次元共培養物が記載されている。特許文献２には、ヒトｉＰＳ細胞由来の神経細胞およびグリアを含む、三次元オルガノイドが記載されている。特許文献３には、ヒトｉＰＳ細胞由来の神経細胞およびグリアを含む三次元（スフェロイド）共培養物が記載されている。
国際公開ＷＯ２０２３／０３９５６７号公報 国際公開ＷＯ２０２２／１８３０１５号公報 国際公開ＷＯ２０２２／１７８３９５号公報
Ｆｒａｎｃｅｓｃａ　Ｃｅｒｂａｉら、ＰＬｏＳ　Ｏｎｅ、７巻、論文番号ｅ４５２５０、２０１２年 Ｊｅｎｓ　Ｖ　Ａｎｄｅｒｓｅｎら、Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、１４巻、論文番号１０８７１９、２０２１年 Ｓｈａｎｅ　Ａ　Ｌｉｄｄｅｌｏｗら、Ｎａｔｕｒｅ、５４１巻、４８１－４８７頁、２０１７年 Ｌａｕｒａ　Ｅ　Ｃｌａｒｋｅら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｕｎｉｔｅｄ　Ｓｔａｔｅｓ　ｏｆ　Ａｍｅｒｉｃａ、１１５巻、Ｅ１８９６－Ｅ１９０５頁、２０１８年 Ｅｄｕａｒｄａ　Ｇ　Ｚ　Ｃｅｎｔｅｎｏら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ、１３巻、論文番号２７、２０１８年 Ａｎｋｅ　Ｍ　Ｔｕｋｋｅｒら、Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１７８巻、７１－８７頁、２０２０年 Ｌｅｏｎｉｄ　Ｔａｒａｓｓｉｓｈｉｎら、Ｇｌｉａ、６２巻、９９９－１０１３頁、２０１４年
　本発明は、ヒト脳の機能を模倣可能なヒト由来の神経細胞、アストロサイト、およびミクログリアを含む三次元細胞培養物の製造方法、およびヒト脳の機能を模倣可能なヒト由来の神経細胞、アストロサイト、およびミクログリアを含む三次元細胞培養物の培養方法を提供することを解決すべき課題とする。本発明はさらに、ヒト脳の機能を模倣可能なヒト由来の神経細胞、アストロサイト、およびミクログリアを含む三次元細胞培養物を提供することを解決すべき課題とする。本発明はさらに、上記三次元細胞培養物を用いた被験物質の評価方法を提供することを解決すべき課題とする。
　本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、細胞の共培養に先立って、ヒト由来のアストロサイトと、ヒト由来の神経細胞と、ヒト由来のミクログリアとを培養容器に、培養容器に添加された全細胞中に占めるアストロサイトの割合が３０％以上となるように添加し、次いで培養容器中で共培養を行うことによって、ヒト脳の機能を模倣可能な三次元細胞培養物を製造できることを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
　即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
＜１＞　細胞の共培養に先立って、ヒト由来のアストロサイトと、ヒト由来の神経細胞と、ヒト由来のミクログリアとを培養容器に添加する工程、および上記アストロサイトと、上記神経細胞と、上記ミクログリアとを培養容器中で共培養する工程を含む、三次元細胞培養物の製造方法であって、培養容器に添加された全細胞中に占める上記アストロサイトの割合が３０％以上である、三次元細胞培養物の製造方法。
＜２＞　上記アストロサイトと、上記神経細胞と、上記ミクログリアとを同時に培養容器に添加する、＜１＞に記載の製造方法。
＜３＞　細胞の共培養に先立って、ヒト由来のアストロサイトと、ヒト由来の神経細胞と、ヒト由来のミクログリアとを培養容器に添加する工程が、ヒト由来のアストロサイトと、ヒト由来の神経細胞と、ヒト由来のミクログリアとを培養培地に懸濁する工程、および上記により得られた上記アストロサイト、上記神経細胞および上記ミクログリアを含む培養培地を同時に培養容器に添加する工程を含む、＜１＞又は＜２＞に記載の製造方法。
＜４＞　上記アストロサイト、上記神経細胞、および上記ミクログリアが、ヒト由来の多能性幹細胞から分化誘導したものである、＜１＞から＜３＞の何れか一に記載の製造方法。
＜５＞　上記ヒト由来の多能性幹細胞が、ヒトｉＰＳ細胞である、＜４＞に記載の製造方法。
＜６＞　培養容器に添加された全細胞中に占める上記ミクログリアの割合が５０％以下である、＜１＞から＜５＞の何れか一に記載の製造方法。
＜７＞　培養容器に添加された全細胞中に占める上記神経細胞の割合が１０％以上である、＜１＞から＜６＞の何れか一に記載の製造方法。
＜８＞　上記三次元細胞培養物が、スフェロイド形状である、＜１＞から＜７＞の何れか一に記載の製造方法。
＜９＞　細胞の共培養に先立って、ヒト由来のアストロサイトと、ヒト由来の神経細胞と、ヒト由来のミクログリアとを培養容器に添加する工程、および上記アストロサイトと、上記神経細胞と、上記ミクログリアとを培養容器中で共培養する工程を含む、三次元細胞培養物の培養方法であって、培養容器に添加された全細胞中に占める上記アストロサイトの割合が３０％以上である、三次元細胞培養物の培養方法。
＜１０＞　上記アストロサイトと、上記神経細胞と、上記ミクログリアとを同時に培養容器に添加する、＜９＞に記載の培養方法。
＜１１＞　細胞の共培養に先立って、ヒト由来のアストロサイトと、ヒト由来の神経細胞と、ヒト由来のミクログリアとを培養容器に添加する工程が、ヒト由来のアストロサイトと、ヒト由来の神経細胞と、ヒト由来のミクログリアとを培養培地に懸濁する工程、および上記により得られた上記アストロサイト、上記神経細胞および上記ミクログリアを含む培養培地を同時に培養容器に添加する工程を含む、＜９＞または＜１０＞に記載の培養方法。
＜１２＞　上記アストロサイト、上記神経細胞、および上記ミクログリアが、ヒト由来の多能性幹細胞から分化誘導したものである、＜９＞から＜１１＞の何れか一に記載の培養方法。
＜１３＞　上記ヒト由来の多能性幹細胞が、ヒトｉＰＳ細胞である、＜１２＞に記載の培養方法。
＜１４＞　培養容器に添加された全細胞中に占める上記ミクログリアの割合が５０％以下である、＜９＞から＜１３＞の何れか一に記載の培養方法。
＜１５＞　培養容器に添加された全細胞中に占める上記神経細胞の割合が１０％以上である、＜９＞から＜１４＞の何れか一に記載の培養方法。
＜１６＞　上記三次元細胞培養物が、スフェロイド形状である、＜９＞から＜１５＞の何れか一に記載の培養方法。
＜１７＞　＜１＞から＜８＞の何れか一に記載の製造方法により得られる、ヒト由来のアストロサイトと、ヒト由来の神経細胞と、ヒト由来のミクログリアとを含む三次元細胞培養物。
＜１８＞　＜１７＞に記載の三次元細胞培養物と被験物質とを接触させることを含む、被験物質の評価方法。
＜１９＞　＜１＞から＜８＞の何れか一に記載の製造方法により三次元細胞培養物を製造すること、および上記三次元細胞培養物と被験物質とを接触させることを含む、被験物質の評価方法。
　本発明の方法で製造される三次元細胞培養物は、ヒト脳を模倣した培養系であり、正常な脳機能における神経細胞とグリア細胞の細胞間相互作用や病態メカニズムの研究に有用である。
図１は、三次元共培養物の免疫染色の結果を示す。 図２は、三次元共培養物においてカルシウムイメージングを実施した結果を示す。
　以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
　本発明の三次元細胞培養物の製造方法ならびに本発明の三次元細胞培養物の培養方法は、細胞の共培養に先立って、ヒト由来のアストロサイトと、ヒト由来の神経細胞と、ヒト由来のミクログリアとを培養容器に添加する工程、および上記アストロサイトと、上記神経細胞と、上記ミクログリアとを培養容器中で共培養する工程を含む方法であり、培養容器に添加された全細胞中に占める上記アストロサイトの割合が３０％以上である。
　「細胞の共培養に先立って」とは、１種または２種の細胞を添加してから、例えば１～２４時間以内であれば、共培養が開始されているとは見なさない。
　容器に添加された全細胞中に占めるアストロサイトの割合と、三次元細胞培養物におけるアストロサイトの割合は、実質的に同じである。容器に添加された全細胞中に占める神経細胞の割合と、三次元細胞培養物における神経細胞の割合は、実質的に同じである。容器に添加された全細胞中に占めるミクログリアの割合と、三次元細胞培養物におけるミクログリアの割合は、実質的に同じである。
　本発明においては、好ましくは、アストロサイトと、神経細胞と、ミクログリアとを同時に培養容器に添加することができる。
　具体的には、例えば、上記の３種の細胞を１つの容器に入れて培養培地に懸濁および混合したものを培養容器に添加してもよい。この場合には、ヒト由来のアストロサイトと、ヒト由来の神経細胞と、ヒト由来のミクログリアとを培養容器に添加する工程は、ヒト由来のアストロサイトと、ヒト由来の神経細胞と、ヒト由来のミクログリアとを培養培地に懸濁する工程、および上記により得られた上記アストロサイト、上記神経細胞および上記ミクログリアを含む培養培地を同時に培養容器に添加する工程を含む。
　あるいは、上記の３種の細胞の各々を、それぞれ別々の培養培地に懸濁したものを、同一の培養容器に同時に添加してもよい。あるいは、それぞれ別々に凍結保存されていた３種の凍結細胞をそれぞれ融解したものを、同一の培養容器に同時に添加してもよい。
　ただし、アストロサイトと、神経細胞と、ミクログリアとを同時に培養容器に添加する態様は、上記に限定されるものではない。
　本発明においては、３種の細胞（アストロサイト、神経細胞、およびミクログリア）を同時に播種することで任意の割合において共培養することができる。また、３種の細胞（アストロサイト、神経細胞、およびミクログリア）を三次元にて培養することで、従来の培養系よりもよりヒト脳を反映および模倣することができ、脳本来の機能や病態形成メカニズムを研究する上において有用である。本発明においては、３種の細胞を使用するため、脳機能や病態形成における細胞間相互作用を評価することができる。
　３種の細胞の三次元培養により３週間の培養で神経活動評価が可能である。３種の細胞の二次元の共培養では神経活動評価を行うには４週間の培養が必要なことから、三次元培養にすることで神経細胞のネットワーク構築を促進している可能性がある。
　また、３種の細胞を同時に播種することにより、神経細胞がネットワークを構築する過程や成熟する過程におけるグリア細胞の影響を評価することができる。
　アストロサイト、神経細胞、およびミクログリアは、好ましくは、ヒト由来の多能性幹細胞から分化誘導したものである。
　ヒト由来の多能性幹細胞としては、ヒトｉＰＳ細胞（ｈｕｍａｎ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ）、ヒトＥＳ細胞（ｈｕｍａｎ　ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ）、ヒト間葉系幹細胞などを挙げることができる。ヒトｉＰＳ細胞が好ましいが、特に限定されない。ヒトｉＰＳ細胞とは、ヒト細胞から作製されたｉＰＳ細胞である。
　ヒト由来の多能性幹細胞としては、神経系疾患の原因となる疾患関連遺伝子に変異がない検体由来の多能性幹細胞、神経系疾患を有しない健康なヒト（健常者）から採取した検体由来の多能性幹細胞、疾患を有する患者から採取した検体由来の多能性幹細胞、または疾患関連遺伝子に変異がある検体由来の多能性幹細胞などが挙げられる。「疾患関連遺伝子に変異がない」とは、神経系疾患の原因となるような疾患関連遺伝子の変異を有しないことを意味する。即ち、遺伝子に変異があっても、疾患の原因とならないような変異である場合には、疾患関連遺伝子に変異がないと解釈するものとする。また、「疾患関連遺伝子に変異がある」場合、その変異は患者が元々有する内因性の遺伝子変異であっても、人為的に遺伝子変異を導入した外因性の遺伝子変異であってもよい。疾患を有する患者から採取した検体由来の多能性幹細胞、または疾患関連遺伝子に変異がある検体由来の多能性幹細胞を用いて本発明の三次元細胞培養物を製造することで、検体由来の疾患や疾患関連遺伝子の変異に起因する疾患の病態を模倣し得ることが想定される。
　ＥＳ細胞は、例えば、着床以前の初期胚、上記の初期胚を構成する内部細胞塊、単一割球などを培養することによって樹立することができる（Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ　ｔｈｅ　Ｍｏｕｓｅ　Ｅｍｂｒｙｏ　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，１９９４、Ｔｈｏｍｓｏｎ，Ｊ．Ａ．ｅｔ　ａｌ：Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８２，１１４５－１１４７，１９９８）。初期胚として、体細胞の核を核移植することによって作製された初期胚を用いてもよい（Ｗｉｌｍｕｔ　ｅｔ　ａｌ：Ｎａｔｕｒｅ，３８５，８１０，１９９７、Ｃｉｂｅｌｌｉ　ｅｔ　ａｌ：Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８０，１２５６，１９９８、入谷明ら：蛋白質核酸酵素，４４，８９２，１９９９、Ｂａｇｕｉｓｉ　ｅｔ　ａｌ：Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１７，４５６，１９９９、Ｗａｋａｙａｍａ　ｅｔ　ａｌ：Ｎａｔｕｒｅ，３９４，３６９，１９９８；Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２２，１２７，１９９９；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６，１４９８４，１９９９、Ｒｉｄｅｏｕｔ　ＩＩＩ　ｅｔ　ａｌ：Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２４，１０９，２０００、Ｔａｃｈｉｂａｎａ　ｅｔ　ａｌ：Ｈｕｍａｎ　Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ　Ｄｅｒｉｖｅｄ　ｂｙ　Ｓｏｍａｔｉｃ　Ｃｅｌｌ　Ｎｕｃｌｅａｒ　Ｔｒａｎｓｆｅｒ，Ｃｅｌｌ，２０１３，ｉｎ　ｐｒｅｓｓ）。初期胚として、単為発生胚を用いてもよい（Ｋｉｍ　ｅｔ　ａｌ：Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１５，４８２－４８６，２００７、Ｎａｋａｊｉｍａ　ｅｔ　ａｌ：Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ，２５，９８３－９８５，２００７、Ｋｉｍ　ｅｔ　ａｌ：Ｃｅｌｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ，１，３４６－３５２，２００７、Ｒｅｖａｚｏｖａ　ｅｔ　ａｌ：Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ，９，４３２－４４９，２００７、Ｒｅｖａｚｏｖａ　ｅｔ　ａｌ：Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ，１０，１１－２４，２００８）。上掲の論文の他、ＥＳ細胞の作製についてはＳｔｒｅｌｃｈｅｎｋｏ　Ｎ，ｅｔ　ａｌ：Ｒｅｐｒｏｄ　Ｂｉｏｍｅｄ　Ｏｎｌｉｎｅ．９：６２３－６２９，２００４、Ｋｌｉｍａｎｓｋａｙａ　Ｉ，ｅｔ　ａｌ：Ｎａｔｕｒｅ　４４４：４８１－４８５，２００６、Ｃｈｕｎｇ　Ｙ，ｅｔ　ａｌ：Ｃｅｌｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　２：１１３－１１７，２００８、Ｚｈａｎｇ　Ｘ，ｅｔ　ａｌ：Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ　２４：２６６９－２６７６，２００６、Ｗａｓｓａｒｍａｎ，Ｐ．Ｍ．ｅｔ　ａｌ：Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．３６５，２００３、などが参考になる。なお、ＥＳ細胞と体細胞の細胞融合によって得られる融合ＥＳ細胞も、本発明の方法に用いられる胚性幹細胞に含まれる。
　ＥＳ細胞の中には、保存機関から入手可能なもの、あるいは市販されているものもある。例えば、ヒトＥＳ細胞については京都大学再生医科学研究所（例えばＫｈＥＳ－１、ＫｈＥＳ－２およびＫｈＥＳ－３）、ＷｉＣｅｌｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、ＥＳＩ　ＢＩＯなどから入手可能である。
　ｉＰＳ細胞は、初期化因子の導入により体細胞を初期化（リプログラミング）することによって作製される、多能性（多分化能）と増殖能を有する細胞を意味する。ｉＰＳ細胞はＥＳ細胞に近い性質を示す。ｉＰＳ細胞の作製に使用する体細胞は特に限定されず、分化した体細胞でもよいし、未分化の幹細胞でもよい。ｉＰＳ細胞は、公知の方法などにより作製することができる。また、今後開発されるｉＰＳ細胞作製法を適用することも当然に想定される。
　ｉＰＳ細胞の作製法の最も基本的な手法は、転写因子であるＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ－Ｍｙｃの４因子を、ウイルスを利用して細胞へ導入する方法である（Ｔａｋａｈａｓｈｉ　Ｋ，Ｙａｍａｎａｋａ　Ｓ：Ｃｅｌｌ　１２６（４），６６３－６７６，２００６、Ｔａｋａｈａｓｈｉ　Ｋ，ｅｔ　ａｌ：Ｃｅｌｌ　１３１（５），８６１－７２，２００７）。ヒトｉＰＳ細胞についてはＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｌｉｎ２８およびＮａｎｏｇの４因子の導入による樹立の報告がある（Ｙｕ　Ｊ，ｅｔ　ａｌ：Ｓｃｉｅｎｃｅ　３１８（５８５８），１９１７－１９２０，２００７）。ｃ－Ｍｙｃを除く３因子（Ｎａｋａｇａｗａ　Ｍ，ｅｔ　ａｌ：Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６（１），１０１－１０６，２００８）、Ｏｃｔ３／４およびＫｌｆ４の２因子（Ｋｉｍ　Ｊ　Ｂ，ｅｔ　ａｌ：Ｎａｔｕｒｅ４５４（７２０４），６４６－６５０，２００８）、あるいはＯｃｔ３／４のみ（Ｋｉｍ　Ｊ　Ｂ，ｅｔ　ａｌ：Ｃｅｌｌ　１３６（３），４１１－４１９，２００９）の導入によるｉＰＳ細胞の樹立も報告されている。また、遺伝子の発現産物であるタンパク質を細胞に導入する手法（Ｚｈｏｕ　Ｈ，　Ｗｕ　Ｓ，Ｊｏｏ　ＪＹ，ｅｔ　ａｌ：Ｃｅｌｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　４，３８１－３８４，２００９；　Ｋｉｍ　Ｄ，Ｋｉｍ　ＣＨ，Ｍｏｏｎ　ＪＩ，ｅｔ　ａｌ：Ｃｅｌｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　４，４７２－４７６，２００９）も報告されている。一方、ヒストンメチル基転移酵素Ｇ９ａに対する阻害剤ＢＩＸ－０１２９４やヒストン脱アセチル化酵素阻害剤バルプロ酸（ＶＰＡ）あるいはＢａｙＫ８６４４などを使用することによって作製効率の向上や導入する因子の低減などが可能であるとの報告もある（Ｈｕａｎｇｆｕ　Ｄ，ｅｔ　ａｌ：Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６（７），７９５－７９７，２００８；Ｈｕａｎｇｆｕ　Ｄ，ｅｔ　ａｌ：Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６（１１），１２６９－１２７５，２００８；Ｓｉｌｖａ　Ｊ，ｅｔ　ａｌ：ＰＬｏＳ．Ｂｉｏｌ．６（１０），ｅ２５３，２００８）。遺伝子導入法についても検討が進められ、レトロウイルスの他、レンチウイルス（Ｙｕ　Ｊ，ｅｔ　ａｌ：Ｓｃｉｅｎｃｅ　３１８（５８５８），１９１７－１９２０，２００７）、アデノウイルス（Ｓｔａｄｔｆｅｌｄ　Ｍ，ｅｔ　ａｌ：Ｓｃｉｅｎｃｅ　３２２（５９０３），９４５－９４９，２００８）、プラスミド（Ｏｋｉｔａ　Ｋ，ｅｔ　ａｌ：Ｓｃｉｅｎｃｅ３２２（５９０３），９４９－９５３，２００８）、トランスポゾンベクター（Ｗｏｌｔｊｅｎ　Ｋ，Ｍｉｃｈａｅｌ　ＩＰ，Ｍｏｈｓｅｎｉ　Ｐ，ｅｔ　ａｌ：Ｎａｔｕｒｅ４５８，７６６－７７０，２００９；Ｋａｊｉ　Ｋ，Ｎｏｒｒｂｙ　Ｋ，Ｐａｃ　ａ　Ａ，ｅｔ　ａｌ：Ｎａｔｕｒｅ４５８，７７１－７７５，２００９；Ｙｕｓａ　Ｋ，Ｒａｄ　Ｒ，Ｔａｋｅｄａ　Ｊ，ｅｔ　ａｌ：Ｎａｔ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　６，３６３－３６９，２００９）、あるいはエピソーマルベクター（Ｙｕ　Ｊ，Ｈｕ　Ｋ，Ｓｍｕｇａ－Ｏｔｔｏ　Ｋ，Ｔｉａｎ　Ｓ，ｅｔ　ａｌ：Ｓｃｉｅｎｃｅ　３２４，７９７－８０１，２００９）を遺伝子導入に利用した技術が開発されている。
　ｉＰＳ細胞への形質転換、即ち初期化（リプログラミング）が生じた細胞はＦｂｘｏ１５、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ３／４、Ｆｇｆ－４、Ｅｓｇ－１およびＣｒｉｐｔなどの多能性幹細胞マーカー（未分化マーカー）の発現などを指標として選択することができる。選択された細胞をｉＰＳ細胞として回収することができる。
　ｉＰＳ細胞の作製法として、遺伝子発現による直接初期化で製造する方法以外に、化合物の添加などにより体細胞からｉＰＳ細胞を誘導することもできる（Ｈｏｕ　Ｐ，ｅｔ　ａｌ：Ｓｃｉｅｎｃｅ　３４１（６１４６），６５１－６５４，２０１３）。
　ｉＰＳ細胞は、例えば、ＦＵＪＩＦＩＬＭ　Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｉｎｃ．（ＦＣＤＩ）、国立大学法人京都大学、または独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンターから提供を受けることもできる。
　ヒト由来のアストロサイトとしては、アストロサイト前駆細胞（ＸＣｅｌｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，ＸＣＳ－ＡＰ－００１－１Ｖなど）から分化誘導したアストロサイト、ｉＣｅｌｌ（登録商標）アストロサイト（ＦＵＪＩＦＩＬＭ　Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｃ１０３７）などが挙げられ、アストロサイト前駆細胞から分化誘導したアストロサイトが好ましい。アストロサイト前駆細胞からアストロサイトに分化誘導する場合、血清非存在下で分化誘導することが好ましい。
　ヒト由来の神経細胞の入手方法としては、例えば、神経系疾患の原因となる疾患関連遺伝子の変異や神経系疾患を有しない健康なヒト（健常者）から採取した体細胞、または神経系疾患を有する患者から採取した体細胞より作製したヒトｉＰＳ細胞から誘導すること、株化されたヒトｉＰＳ細胞から誘導することなどにより入手することが挙げられる。
　ヒト由来の多能性幹細胞から分化誘導した神経細胞は、特に限定されないが、好ましくは、運動神経細胞、大脳皮質興奮神経細胞または黒質神経細胞である。
　ヒト由来の多能性幹細胞から神経細胞を分化誘導するための方法としては、特に限定されないが、低分子化合物処置などを用いて多能性幹細胞から神経幹細胞を作製後、神経細胞へ誘導する方法と、遺伝子発現などにより神経細胞へ直接誘導する方法がある。
　多能性幹細胞から神経細胞を分化誘導するための方法としては、例えば、
（１）無血清培地中で培養して胚様体（神経前駆細胞を含む細胞塊）を形成させて分化させる方法（ＳＦＥＢ法：Ｗａｔａｎａｂｅ　Ｋ，ｅｔ　ａｌ，Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，８：２８８－２９６，２００５；ＳＦＥＢｑ法：Ｗａｔａｙａ　Ｔ，ｅｔ　ａｌ　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，１０５：１１７９６－１１８０１，２００８）；
（２）ストローマ細胞上で培養して分化させる方法（ＳＤＩＡ法：Ｋａｗａｓａｋｉ　Ｈ，ｅｔ　ａｌ，Ｎｅｕｒｏｎ，２８：３１－４０，２０００）；
（３）薬剤を添加したマトリゲル上で培養して分化させる方法（Ｃｈａｍｂｅｒｓ　Ｓ．Ｍ，ｅｔ　ａｌ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２７：２７５－２８０，２００９）；
（４）サイトカインの代替物として低分子化合物を含む培地中で培養して分化する方法（米国特許第５，８４３，７８０号）；
（５）多能性幹細胞に神経誘導因子（Neurogenin2（ＮＧＮ２）タンパク質をコードする遺伝子など）を導入し発現させることで分化させる方法（ＷＯ２０１４／１４８６４６；およびＺｈａｎｇ　Ｙ．，ｅｔ　ａｌ，Ｎｅｕｒｏｎ，７８：７８５－９８，２０１３）；
（６）多能性幹細胞にｍｉＲ－９／９＊－１２４を導入し発現させることで分化させる方法；
およびこれらの方法の組み合わせなどが挙げられる。
　上記のうち、（５）多能性幹細胞にＮＧＮ２タンパク質をコードする遺伝子を導入して発現させる方法は、短期間かつ高効率で成熟した神経細胞が得られることから好ましい。
　ヒト由来の神経細胞としては、ＮＧＮ２の強制発現によるｉＰＳ細胞から分化した誘導神経細胞、ｉＣｅｌｌ（登録商標）グルタミン酸作動性神経（ＦＵＪＩＦＩＬＭ　Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｃ１０３３）、ｉＣｅｌｌ（登録商標）ＧＡＢＡ作動性神経（ＦＵＪＩＦＩＬＭ　Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｃ１００８）、ｉＣｅｌｌ（登録商標）ドーパミン神経（ＦＵＪＩＦＩＬＭ　Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｃ１０２８）、ｉＣｅｌｌ（登録商標）運動神経（ＦＵＪＩＦＩＬＭ　Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｃ１０４８）などが挙げられ、ＮＧＮ２の強制発現によるｉＰＳ細胞から分化した誘導神経細胞およびｉＣｅｌｌ（登録商標）グルタミン酸作動性神経が好ましい。
　ヒト由来のミクログリアとしては、ｉＣｅｌｌ（登録商標）ミクログリア（ＦＵＪＩＦＩＬＭ　Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｃ１１１０）、ミクログリア（Ａｘｏｌ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ＡＸ０６６４）などが挙げられ、ｉＣｅｌｌ（登録商標）ミクログリアが好ましい。
　アストロサイトは、ＧＦＡＰ（glial fibrillary acidic protein）、Ｓ１００β（S100 calcium binding protein B）、ＫＣＮＪ１０（potassium inwardly rectifying channel subfamily J member 10）、ＡＱＰ４（Aquaporin-4）、ＳＬＣ１Ａ３（solute carrier family 1 member 3）からなるアストロサイトに特異的なマーカー遺伝子を少なくとも１以上発現する細胞である。
　神経細胞は、好ましくは、β－ＩＩＩ　ｔｕｂｕｌｉｎ、ＮｅｕＮ、Ｎ－ＣＡＭ（neural cell adhesion molecule）、ＭＡＰ２（microtubule-associated protein 2）からなる神経細胞に特異的なマーカー遺伝子を少なくとも１以上発現し、かつ、β－ＩＩＩ　ｔｕｂｕｌｉｎ陽性の突起（以降、神経突起と呼ぶ）を有する細胞である。
　ミクログリアは、ＩＢＡ１（Ionized calcium-binding adapter molecule 1）、ＣＤ３３、ＣＤ４５、ＴＲＥＭ２（triggering receptor expressed on myeloid cells 2）、Ｐ２ＲＹ１２（purinergic receptor P2Y, G-protein coupled, 12）、ＴＭＥＭ１１９（Transmembrane Protein 119）、ＣＸ３ＣＲ１（CX3C-chemokine receptor 1）からなるミクログリアに特異的なマーカー遺伝子を少なくとも１以上発現する細胞である。
　マーカー遺伝子の発現レベルは、通常、遺伝子に対応する転写産物の産生量、またはその翻訳産物の産生量、活性などにより解析することができる。発現レベルの測定は、遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡや遺伝子の翻訳産物であるタンパク質の測定により行うことができるが、ｍＲＮＡまたはその逆転写産物であるｃＤＮＡの測定により行うことが好ましい。翻訳産物（タンパク質）の発現の検出または測定は、抗体を用いて細胞内のタンパク質を検出する免疫細胞染色により行うことができる。
　本発明においては、培養容器に添加された全細胞中に占める上記アストロサイトの割合が３０％以上であり、好ましくは３５％以上であり、より好ましくは４０％以上であり、さらに好ましくは４５％以上である。培養容器に添加された全細胞中に占める上記アストロサイトの割合の上限は特に限定されないが、一般的には８０％以下であり、好ましくは７０％以下である。
　培養容器に添加された全細胞中に占めるアストロサイトの割合を３０％以上とすることにより、神経細胞の成熟化を促進し、カルシウムイメージングなどによる神経活動評価において、神経細胞の成熟化やネットワーク構築の指標であるカルシウムオシレーションを安定して明瞭に検出できる。
　培養容器に添加された全細胞中に占めるミクログリアの割合は、好ましくは５０％以下であり、より好ましくは４０％以下であり、さらに好ましくは３０％以下である。培養容器に添加された全細胞中に占めるミクログリアの割合の下限は特に限定されないが、一般的には０．１％以上であり、好ましくは１％以上であり、さらに好ましくは１０％以上である。
　ミクログリアの割合を０．１％以上とすることにより、神経炎症によって活性化したミクログリアが他の細胞に影響を与えることが確認できており、神経炎症時の細胞間相互作用の評価が可能である。
　培養容器に添加された全細胞中に占める神経細胞の割合は、好ましくは１０％以上であり、より好ましくは１５％以上であり、さらに好ましくは２０％以上、特に好ましくは２５％以上である。神経細胞の割合の上限は特に限定されないが、一般的には６５％以下であり、好ましくは６０％以下である。
　神経細胞の割合を１０％以上とすることにより、カルシウムイメージングによってカルシウムオシレーションが明確に検出でき、神経活動評価に有用である。また、本発明では神経細胞、アストロサイト、ミクログリアが長期間培養できていることを免疫染色により確認できており、神経活動へのグリア細胞の影響を評価できる。
　本発明においては、アストロサイトと、神経細胞と、ミクログリアとを培養容器中で共培養する。
　培養容器としては、ウェルを有するプレート、ディッシュ、セルカルチャーインサート、または細胞培養用フラスコなどを使用することができ、ウェルを有するプレートが好ましい。具体的には、ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ（登録商標）プレート（住友ベークライト）、セルリペレント・プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ　Ｂｉｏ　ｏｎｅ）などが挙げられ、ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅプレート（住友ベークライト）が好ましい。
　培養容器の形状としては、丸底、Ｕ字底、またはＶ字底などが挙げられるが、特に限定されない。
　容器内の培地が接触する表面の性質としては、細胞非接着性であることが好ましい。これにより、細胞が浮遊状態で培養されることになり、スフェロイドを形成しやすくなる。あるいは、容器内部の表面のある部位のみ細胞接着性とし、それ以外の部位を細胞非接着性としてもよい。この場合には、細胞接着性の部位に、細胞が集まり、スフェロイドを形成することができる。
　９６ウェルプレートへの播種時の細胞数（細胞数とは、３種類の細胞の合計の細胞数である。以下も同様）の下限値は、特に制限されないが、例えば、０．７×１０４細胞／ウェル以上であることが好ましく、１．０×１０４細胞／ウェル以上であることがより好ましく、１．２×１０４細胞／ウェル以上であることがさらに好ましく、１．４×１０４細胞／ウェル以上であることがよりさらに好ましく、１．６×１０４細胞／ウェル以上であることが特に好ましく、１．８×１０４細胞／ウェル以上であることが最も好ましい。培養容器への播種時の細胞密度の上限値は、特に限定されないが、例えば、８．０×１０４細胞／ウェル以下であってもよく、８．０×１０４細胞／ウェル未満が好ましく、５．０×１０４細胞／ウェル以下がより好ましく、３．０×１０４細胞／ウェル以下がさらに好ましく、２．５×１０４細胞／ウェル以下がよりさらに好ましく、２．３×１０４細胞／ウェル以下が特に好ましい。
　９６ウェルプレートへの播種時の細胞数は、好ましくは１．０×１０４細胞／ウェル以上８．０×１０４細胞／ウェル以下であり、より好ましくは１．２×１０４細胞／ウェル以上５．０×１０４細胞／ウェル以下であり、さらに好ましくは１．４×１０４細胞／ウェル以上３．０×１０４細胞／ウェル以下であり、よりさらに好ましくは１．６×１０４細胞／ウェル以上２．５×１０４細胞／ウェル以下であり、特に好ましくは１．８×１０４細胞／ウェル以上２．３×１０４細胞／ウェル以下である。
　培地は、公知の培地または市販の培地から選択することができる。培養に用いる培地は、基礎培地へ添加剤を加えて用いることができる。ここで、基礎培地は、例えば、ＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）／Ｆ１２、ＢｒａｉｎＰｈｙｓ（登録商標）　Ｎｅｕｒｏｎａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ（商標）　Ｍｅｄｉｕｍ－Ａ、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ（商標）　Ｍｅｄｉｕｍ、Ｎｅｕｒａｌ　Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ　Ｂａｓａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ、ＮＳ－Ａ　Ｂａｓａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ、Ｂａｓａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ　Ｅａｇｌｅ　（ＢＭＥ）、ＢＧＪｂ　Ｍｅｄｉｕｍ、ＣＭＲＬ　１０６６　Ｍｅｄｉｕｍ、Ｇｌａｓｇｏｗ　Ｍｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ）、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ＭＥＭ　Ｚｉｎｃ　Ｏｐｔｉｏｎ、Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＩＭＤＭ）、Ｍｅｄｉｕｍ　１９９、Ｅａｇｌｅ　ＭＥＭ、αＭＥＭ、Ｈａｍ’ｓ　Ｆ１２　Ｍｅｄｉｕｍ、ＲＰＭＩ　１６４０　Ｍｅｄｉｕｍ、およびＦｉｓｃｈｅｒ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍなどが挙げられる。また、培地は、単一の培地を用いてもよく、２種以上の培地を組み合わせて用いてもよい。
　培地に添加することができる添加剤として、具体的には血清、レチノイン酸、Ｗｎｔ、ＢＭＰ（bone morphogenetic protein）（ＢＭＰ－４など）、ＣＮＴＦ（ciliary neurotrophic factor）、ＢＤＮＦ（brain-derived neurotrophic factor）、ＧＤＮＦ（glial cell line-derived neurotrophic factor）、ｂＦＧＦ（basic fibroblast growth factor）、ＥＧＦ（epidermal growth factor）、ＨＧＦ（hepatocyte  growth factor）、ＳＨＨ（sonic hedgehog）、ＩＧＦ－１（insulin-like growth factor 1）、Ａｃｔｉｖｉｎ　Ａ、Ｈｅｒｅｇｕｌｉｎβ－１、インターロイキン類、８－Ｂｒ－ｃＡＭＰ、ヘパリン、ヘパラン硫酸、ラミニン、コラーゲン、フィブロネクチン、プロゲステロン、セレナイト、Ｂ－２７（登録商標）サプリメント、Ｎ２　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ　ｗｉｔｈ　Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ（Ａｐｏ）、Ｎ２　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ　ｗｉｔｈ　Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ、ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）、Ｌ（＋）－アスコルビン酸、ＩＴＳ－サプリメント、ＭＥＭ　Ｎｏｎ－Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ａｍｉｎｏ　Ａｃｉｄ、ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）　ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔなどが挙げられるが、特に限定されない。さらに、抗生物質（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎなど）を添加してもよい。
　培養条件としては、一般的な細胞培養の条件を選択すればよい。３７℃、５％ＣＯ２の条件などが例示される。培養中は適切な間隔（好ましくは１日から７日に１回、より好ましくは２日から３日に１回）で培地交換をしてもよいが、培養期間中に培地交換をしなくてもよい。
　本発明において製造される三次元細胞培養物は、好ましくはスフェロイド形状である。アストロサイトと、神経細胞と、ミクログリアとを培養容器中で共培養することによってスフェロイドを形成することができる。あるいは、アストロサイトと、神経細胞と、ミクログリアとを培養容器中でゲル化する培養液中において共培養し、共培養後に培養液をゲル化することによって三次元細胞培養物を製造することもできる。
　本発明によれば、上記した本発明の三次元細胞培養物の製造方法により得られる、ヒト由来のアストロサイトと、ヒト由来の神経細胞と、ヒト由来のミクログリアとを含む三次元細胞培養物が提供される。本発明においては細胞の共培養に先立って、ヒト由来のアストロサイトと、ヒト由来の神経細胞と、ヒト由来のミクログリアとを培養容器に添加していることから、本発明の三次元細胞培養物では、アストロサイト、神経細胞およびミクログリアが、三次元細胞培養物のコアおよび表面の全体に分布して存在していることが想定される。
　本発明の三次元細胞培養物は、３種の細胞（アストロサイト、神経細胞、およびミクログリア）を三次元にて培養したものであることから、ヒト脳を反映および模倣することができ、例えば、神経変性疾患に有用な新たな薬剤のスクリーニングなどに利用可能である。神経変性疾患としては、アルツハイマー病（ＡＤ）、脊髄小脳変性症、前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、レビー小体病、ハンチントン病、およびニーマンピック病などを挙げることができる。
　即ち、本発明によれば、上記した本発明の三次元細胞培養物と被験物質とを接触させることを含む、被験物質の評価方法が提供される。本発明によればさらに、本発明の製造方法により三次元細胞培養物を製造すること、および上記三次元細胞培養物と被験物質とを接触させることを含む、被験物質の評価方法が提供される。
　より具体的には、本発明によればさらに、
（１）本発明の三次元細胞培養物と被験物質とを接触させる工程、
（２）上記工程（１）で上記被験物質と接触させた三次元細胞培養物、および上記被験物質を接触させなかった対照の本発明の三次元細胞培養物を培養する工程、
（３）上記三次元細胞培養物の機能（例えば、グルタミン取り込み、カルシムオシレーションなど）を測定する工程、および
（４）被験物質と接触させなかった対照と比較して、上記の機能を変化させる被験物質を、候補薬剤として選択する工程、
を含む、薬剤のスクリーニング方法が提供される。
　被験物質としては、例えば、タンパク質、ペプチド、抗体、核酸（遺伝子発現ベクター、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｍＲＮＡなど）、ウイルスベクター（ＡＡＶ、レンチウイルス、アデノウイルスなど）、非ペプチド性化合物、合成化合物、合成低分子化合物、天然化合物、細胞抽出物、細胞外小胞、植物抽出物、動物組織抽出物、血漿、海洋生物由来の抽出物、細胞培養上清、および微生物発酵産物などが挙げられる。
　また、被験物質は、（１）生物学的ライブラリー法、（２）デコンヴォルーションを用いる合成ライブラリー法、（３）１ビーズ１化合物（ｏｎｅ－ｂｅａｄ　ｏｎｅ－ｃｏｍｐｏｕｎｄ）ライブラリー法、および（４）アフィニティクロマトグラフィー選別を使用する合成ライブラリー法を含む当技術分野で公知のコンビナトリアルライブラリー法における多くのアプローチのいずれかを使用して得ることができる。アフィニティクロマトグラフィー選別を使用する生物学的ライブラリー法はペプチドライブラリーに限定されるが、その他のアプローチはペプチド、非ペプチドオリゴマー、または化合物の低分子化合物ライブラリーに適用できる（Ｌａｍ（１９９７）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ　Ｄｒｕｇ　Ｄｅｓ．１２：１４５－６７）。分子ライブラリーの合成方法の例は、当技術分野において見出され得る（ＤｅＷｉｔｔ　ｅｔ　ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９０：６９０９－１３；Ｅｒｂ　ｅｔ　ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９１：１１４２２－６；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ　ｅｔ　ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２６７８－８５；Ｃｈｏ　ｅｔ　ａｌ．（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２６１：１３０３－５；Ｃａｒｅｌｌ　ｅｔ　ａｌ．（１９９４）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０５９；Ｃａｒｅｌｌ　ｅｔ．ａｌ．（１９９４）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０６１；Ｇａｌｌｏｐ　ｅｔ　ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１２３３－５１）。化合物ライブラリーは、溶液（Ｈｏｕｇｈｔｅｎ（１９９２）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　１３：４１２－２１を参照のこと）またはビーズ（Ｌａｍ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ　３５４：８２－４）、チップ（Ｆｏｄｏｒ（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ　３６４：５５５－６）、細菌（米国特許第５，２２３，４０９号）、胞子（米国特許第５，５７１，６９８号、同第５，４０３，４８４号、および同第５，２２３，４０９号）、プラスミド（Ｃｕｌｌ　ｅｔ　ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８９：１８６５－９）もしくはファージ（Ｓｃｏｔｔ　ａｎｄ　Ｓｍｉｔｈ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４９：３８６－９０；Ｄｅｖｌｉｎ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４９：４０４－６；Ｃｗｉｒｌａ　ｅｔ　ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８７：６３７８－８２；Ｆｅｌｉｃｉ（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：３０１－１０；米国特許出願公開第２００２／０１０３３６０号）として作製され得る。
　三次元細胞培養物と被験物質とを接触させることは、三次元細胞培養物の培養液へ被験物質を添加することで行ってもよい。接触は、指標の変化が確認できる時間であれば、特に限定されないが、例えば、１日以上、２日以上、３日以上、４日以上、５日以上、６日以上、７日以上である。添加される被験物質の濃度は化合物の特性（溶解性、毒性など）によって適宜調節可能である。
　三次元細胞培養物と被験物質とを接触させる際に用いる、三次元細胞培養物の培養液は、三次元細胞培養物を培養できる培地であれば、特に限定されない。
　被験物質と三次元細胞培養物を接触させる際の培養温度は、特に限定されないが、約３０～４０℃、好ましくは約３７℃であり、ＣＯ２含有空気の雰囲気下で培養が行われ、ＣＯ２濃度は、好ましくは約２～５％である。
　以下の実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例の範囲に限定されるものではない。
＜三次元共培養物の作製＞
　マトリゲル基底膜マトリックス（Ｃｏｒｎｉｎｇ，３５４２３４）にてコーティングしたフラスコに、ヒトｉＰＳ細胞由来アストロサイト前駆細胞（ＸＣｅｌｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，ＸＣＳ－ＡＰ－００１－１Ｖ）を播種し、分化誘導培地を用いて５日間培養（３７℃、５％ＣＯ２）することでアストロサイトへと分化誘導した。
　分化誘導したアストロサイトは、ＴｒｙｐＬＥ（商標）　Ｓｅｌｅｃｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，１２５６３－０２９）にて剥離し、６００×ｇ、室温で５分間遠心した。遠心後、上清を除去し、細胞を１ｍＬの共培養培地にて懸濁し、細胞数を計数した。
　ｉＰＳ細胞からＮｇｎ２遺伝子を強制発現（ＷＯ２０１４／１４８６４６；およびＺｈａｎｇ　Ｙ，ｅｔ　ａｌ，Ｎｅｕｒｏｎ，７８：７８５－９８，２０１３）することにより作製した神経細胞は、３７℃の温浴で解凍した。融解後、細胞を共培養培地に添加し、６００×ｇ、室温で５分間遠心した。遠心後、上清を除去し、細胞を１ｍＬの共培養培地にて懸濁し、細胞数を計数した。
　ｉＰＳ細胞由来ミクログリア（ｉＣｅｌｌ（登録商標）ミクログリア，ＦＣＤＩ，Ｃ１１１０）は、３７℃の温浴で解凍した。融解後、細胞を共培養培地に添加し、６００×ｇ、室温で５分間遠心した。遠心後、上清を除去し、細胞を１ｍＬの共培養培地にて懸濁し、細胞数を計数した。
　アストロサイト、神経細胞およびミクログリアは、１０：６：３（５３％：３２％：１６％）の細胞数の割合で混合し、１．９×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように９６ウェルプレート（ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ（登録商標）プレート９６Ｕ、住友ベークライト、ＭＳ－９０９６Ｕ）に播種した。３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養し、週３回、半量を培地交換した。
＜細胞固定および免疫染色＞
　３週間培養した三次元共培養物は、４％パラホルムアルデヒド・りん酸緩衝液（富士フイルム和光純薬，１６１－２０１４１）で３０分間処理することにより固定した。ＰＢＳ（－）にて洗浄後、ＰＢＳ（－）で０．４％に希釈したＴｒｉｔｏｎ（登録商標）　Ｘ－１００溶液（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ，２１０４－１００）を１５分処理することで透過処理を行った。透過処理後、ＰＢＳ（－）で４％の濃度に調整したＢＳＡ溶液（Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ，Ａ４１６）を３０分処理し、ブロッキングを行った。その後、一次抗体反応として６００倍希釈した抗ＭＡＰ２抗体（Ｎｏｖｕｓ，ＮＢ３００－２１３）、６００倍希釈した抗ＩＢＡ１抗体（富士フイルム和光純薬，０１９－１９７４１）、および３０００倍希釈した抗ＧＦＡＰ抗体（Ｍｅｒｃｋ，ＭＡＢ３４０２）を処理し、４℃で一晩静置した。
　翌日、ＰＢＳ（－）で洗浄後、二次抗体反応として１０００倍希釈したＧｏａｔ　ａｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔ　Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）　４８８（Ｔｈｅｒｍｏ　ｆｉｓｈｅｒ　ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ａ１１００８）、１０００倍希釈したＧｏａｔ　ａｎｔｉ－Ｃｈｉｃｋｅｎ　Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）　５９４（Ｔｈｅｒｍｏ　ｆｉｓｈｅｒ　ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ａ１１０４２）、１０００倍希釈したＧｏａｔ　ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ　Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）　６４７（Ｔｈｅｒｍｏ　ｆｉｓｈｅｒ　ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ａ３２７２８）、および１０００倍希釈したＨｏｅｃｈｓｔ（登録商標）　３３３４２　ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｄｏｊｉｎｄｏ，Ｈ３４２）を処理し、室温で６０分間静置した。ＰＢＳ（－）にて洗浄後、共焦点定量イメージサイトメーターＣＱ１（横河電機株式会社、ＣｅｌｌＶｏｙａｇｅｒ（登録商標）　ＣＱ１）にて撮影し、画像を取得した。図１に取得した画像を示す。（Ａ）は核（Ｈｏｅｃｈｓｔ）、（Ｂ）はミクログリア（ＩＢＡ１）、（Ｃ）は神経細胞（ＭＡＰ２）、（Ｄ）はアストロサイト（ＧＦＡＰ）を染色したもので、いずれの細胞もシグナルを検出することができた。また、アストロサイト、神経細胞およびミクログリアが、三次元共培養物のコアおよび表面の全体に分布して存在していることが確認できた。
＜神経活動評価＞
　下記に従い、Ｗｏｒｋｉｎｇ溶液、およびＲｅｃｏｒｄｉｎｇ溶液を調製した。
　神経細胞、アストロサイト、ミクログリアの割合を５：８５：１０、８０：１０：１０、もしくは６０：３０：１０として作製した三次元共培養物を３週間培養後、培養培地と等量のＷｏｒｋｉｎｇ溶液を加え、３７℃で１時間インキュベートした。その後、ＰＢＳ（－）にて洗浄し、ＰＢＳ（－）と等量のＲｅｃｏｒｄｉｎｇ溶液を加えた。その後、共焦点定量イメージサイトメーターＣＱ１にてＣａｌｂｒｙｔｅ（商標）　５２０　ＡＭの緑色蛍光画像を取得した（３画像／秒、２分間）。その後、ＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ，ｖｅｒｓｉｏｎ．１．５０ｉ）にて経時的に蛍光強度を定量した。結果を図２に示す。神経細胞の割合が５％の三次元共培養物では（図２Ａ）、神経活動の指標であるカルシウムオシレーション（繰り返しの同調的なカルシウムイオンの流入）の強度が弱く不明瞭である。一方、神経細胞の割合が８０％、アストロサイトの割合が１０％の三次元共培養では（図２Ｂ）、明瞭なカルシウムオシレーションが確認できるが間隔が不規則である。神経細胞の割合が６０％、アストロサイトの割合が３０％の三次元共培養では（図２Ｃ）規則的かつ明瞭なカルシウムオシレーションが確認できた。このことから、カルシウムオシレーションの強度や頻度を評価するためには、神経細胞の割合が１０％以上、およびアストロサイトの割合が３０％以上の三次元共培養が適していることが明らかになった。
＜神経炎症時の細胞間相互作用＞
　３週間培養した三次元共培養物は、終濃度が１００ｎｇ／ｍＬとなるようにＬｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ（ＬＰＳ），ｆｒｏｍ　Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｏ１２７（富士フイルム和光純薬，１２４－０５１５１）で処理し、０、０．５、１、３、６、および２４時間後に４％パラホルムアルデヒド・りん酸緩衝液（富士フイルム和光純薬，１６１－２０１４１）で３０分処理することにより固定する。ＰＢＳ（－）にて洗浄後、ＰＢＳ（－）で０．４％に希釈したＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００溶液（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ，２１０４－１００）で１５分間処理することで透過処理を行う。透過処理後、ＰＢＳ（－）で４％の濃度に調整したＢＳＡ溶液（Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ，Ａ４１６）で３０分処理し、ブロッキングを行う。その後、一次抗体反応として１０００倍希釈した抗ＩＢＡ１抗体（富士フイルム和光純薬，０１１－２７９９１）、および８００倍希釈した抗ＮＦ－κＢ　ｐ６５抗体（Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，８２４２）で処理し、４℃で一晩静置する。
　翌日、ＰＢＳ（－）で洗浄後、二次抗体反応として１０００倍希釈したＤｏｎｋｅｙ　ａｎｔｉ－ｇｏａｔ　Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）　４８８（Ｔｈｅｒｍｏ　ｆｉｓｈｅｒ　ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ａ１１０５５）、１０００倍希釈したＤｏｎｋｅｙ　ａｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔ　Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）　５９４（Ｔｈｅｒｍｏ　ｆｉｓｈｅｒ　ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ａ３２７５４）、および１０００倍希釈したＨｏｅｃｈｓｔ（登録商標）　３３３４２　ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｄｏｊｉｎｄｏ，Ｈ３４２）で処理し、室温で６０分間静置する。ＰＢＳ（－）にて洗浄後、共焦点定量イメージサイトメーターＣＱ１（横河電機株式会社、ＣｅｌｌＶｏｙａｇｅｒ（登録商標）　ＣＱ１）にて撮影し、画像を取得する。
　ＬＰＳ処理後のＮＦ－κＢの核内局在の変化を観察することで、ミクログリアの活性化がその他の細胞に影響を与えること、すなわち細胞間相互作用が生じることが確認できる。
 

Claims (19)

  1. 　細胞の共培養に先立って、ヒト由来のアストロサイトと、ヒト由来の神経細胞と、ヒト由来のミクログリアとを培養容器に添加する工程、および前記アストロサイトと、前記神経細胞と、前記ミクログリアとを培養容器中で共培養する工程を含む、三次元細胞培養物の製造方法であって、培養容器に添加された全細胞中に占める前記アストロサイトの割合が３０％以上である、三次元細胞培養物の製造方法。
  2. 　前記アストロサイトと、前記神経細胞と、前記ミクログリアとを同時に培養容器に添加する、請求項１に記載の製造方法。
  3. 　細胞の共培養に先立って、ヒト由来のアストロサイトと、ヒト由来の神経細胞と、ヒト由来のミクログリアとを培養容器に添加する工程が、ヒト由来のアストロサイトと、ヒト由来の神経細胞と、ヒト由来のミクログリアとを培養培地に懸濁する工程、および上記により得られた前記アストロサイト、前記神経細胞および前記ミクログリアを含む培養培地を同時に培養容器に添加する工程を含む、請求項１に記載の製造方法。
  4. 　前記アストロサイト、前記神経細胞、および前記ミクログリアが、ヒト由来の多能性幹細胞から分化誘導したものである、請求項１に記載の製造方法。
  5. 　前記ヒト由来の多能性幹細胞が、ヒトｉＰＳ細胞である、請求項４に記載の製造方法。
  6. 　培養容器に添加された全細胞中に占める前記ミクログリアの割合が５０％以下である、請求項１から５の何れか一項に記載の製造方法。
  7. 　培養容器に添加された全細胞中に占める前記神経細胞の割合が１０％以上である、請求項１から５の何れか一項に記載の製造方法。
  8. 　前記三次元細胞培養物が、スフェロイド形状である、請求項１から５の何れか一項に記載の製造方法。
  9. 　細胞の共培養に先立って、ヒト由来のアストロサイトと、ヒト由来の神経細胞と、ヒト由来のミクログリアとを培養容器に添加する工程、および前記アストロサイトと、前記神経細胞と、前記ミクログリアとを培養容器中で共培養する工程を含む、三次元細胞培養物の培養方法であって、培養容器に添加された全細胞中に占める前記アストロサイトの割合が３０％以上である、三次元細胞培養物の培養方法。
  10. 　前記アストロサイトと、前記神経細胞と、前記ミクログリアとを同時に培養容器に添加する、請求項９に記載の培養方法。
  11. 　細胞の共培養に先立って、ヒト由来のアストロサイトと、ヒト由来の神経細胞と、ヒト由来のミクログリアとを培養容器に添加する工程が、ヒト由来のアストロサイトと、ヒト由来の神経細胞と、ヒト由来のミクログリアとを培養培地に懸濁する工程、および上記により得られた前記アストロサイト、前記神経細胞および前記ミクログリアを含む培養培地を同時に培養容器に添加する工程を含む、請求項９に記載の培養方法。
  12. 　前記アストロサイト、前記神経細胞、および前記ミクログリアが、ヒト由来の多能性幹細胞から分化誘導したものである、請求項９に記載の培養方法。
  13. 　前記ヒト由来の多能性幹細胞が、ヒトｉＰＳ細胞である、請求項１２に記載の培養方法。
  14. 　培養容器に添加された全細胞中に占める前記ミクログリアの割合が５０％以下である、請求項９から１３の何れか一項に記載の培養方法。
  15. 　培養容器に添加された全細胞中に占める前記神経細胞の割合が１０％以上である、請求項９から１３の何れか一項に記載の培養方法。
  16. 　前記三次元細胞培養物が、スフェロイド形状である、請求項９から１３の何れか一項に記載の培養方法。
  17. 　請求項１から５の何れか一項に記載の製造方法により得られる、ヒト由来のアストロサイトと、ヒト由来の神経細胞と、ヒト由来のミクログリアとを含む三次元細胞培養物。
  18. 　請求項１７に記載の三次元細胞培養物と被験物質とを接触させることを含む、被験物質の評価方法。
  19. 　請求項１から５の何れか一項に記載の製造方法により三次元細胞培養物を製造すること、および前記三次元細胞培養物と被験物質とを接触させることを含む、被験物質の評価方法。
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