WO2025005063A1 - 細胞外化学環境の細胞内伝達機構を有する細胞及び該細胞の用途 - Google Patents

細胞外化学環境の細胞内伝達機構を有する細胞及び該細胞の用途 Download PDF

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WO2025005063A1
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molecular recognition
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membrane
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太輔 梅野
貴洋 関
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Chiba University NUC
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Chiba University NUC
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    • C07K—PEPTIDES
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms

Definitions

  • the present invention relates to cells that have the function of transmitting the extracellular chemical environment (particularly the amount of chemical molecules present) into the cell, and uses of the cells.
  • Non-Patent Document 1 the "whole cell sensor” that uses the whole microorganism as a sensor is considered promising (Non-Patent Document 1).
  • the greatest features of the whole cell sensor are its portability and flexibility. All the functions required for the sensor (detection ⁇ transmission ⁇ output) are contained in a bag of the microorganism, which is 1 micron in length (10 -15 L internal volume).
  • the sensor does not require a power source to operate, and the output form, such as fluorescence, chemiluminescence, and redox reaction coupled with electrode reaction, can be freely selected. For this reason, efforts are being made to expand the lineup of whole cell sensors that do not require equipment for fieldwork and environmental monitoring (Non-Patent Document 2, Non-Patent Document 3, Non-Patent Document 4).
  • GPCRs G-protein coupled receptors
  • HKs histidine kinases
  • GPCRs G-protein coupled receptors
  • HKs histidine kinases
  • the part that protrudes to the outside of the cell contains a domain that recognizes target molecules with high specificity, and the interaction between this domain and the target molecule causes an allosteric structural change in the membrane protein. This then causes a change in the domain structure on the opposite side of the membrane, the cytoplasmic side.
  • GPCRs changes in the interaction properties with G-proteins, arrestins, etc. trigger a gene expression cascade inside the cell.
  • target recognition on the outside of the cell exposes the phosphorylation domain in the intracellular domain, and this phosphorylation induces phosphoryl transfer to the partner response regulator, which results in the signal transduction system being turned on and off.
  • Eukaryotic organisms such as yeast and mammalian cells have their own GPCR cascades.
  • the endogenous GPCR cascades are "hijacked” by the overexpressed GPCR and become responsive to the target molecules of the heterologous GPCR.
  • the heterologous GPCR-expressing eukaryotic cells thus obtained function as whole cell sensors for specific target molecules (Non-Patent Document 5, Non-Patent Document 6).
  • this biosensor directly utilizes the endogenous cascade, crosstalk with endogenous GPCRs is unavoidable.
  • Non-Patent Document 7 Patent Document 1
  • the membrane proteins in these examples were only used as scaffolds to present proteins on the cell surface, and no mechanism was present to transmit extracellular interactions to the inside of the cell.
  • Whole cell sensors have a major technical challenge: the difference in concentration between the inside and outside of the cell membrane.
  • Many whole cell sensors use sensor proteins inside the cell, so the target substance is detected inside the cell. This type of sensor makes it difficult to detect molecules that cannot pass through the cell membrane, such as metal ions and highly water-soluble molecules. Even if the target molecule can be forcibly drawn into the cell using the transporter of the whole cell sensor, the concentration inside the cell will be far removed from the original concentration of the measurement sample (outside the cell).
  • the target molecule that enters the cell is diluted among thousands of similar impurity molecules, making it difficult to detect the exact concentration.
  • the inventors focused on the periplasmic space of bacteria such as E. coli.
  • This space is surrounded by outer and inner membranes.
  • the molecular permeability of the intracellular membrane is low, and highly water-soluble and ionic molecules (logP ⁇ 3) are almost impermeable.
  • This space is isolated from the metabolic network inside the cell.
  • the outer membrane contains many porins, ensuring the free movement of compounds with a molecular weight of 600 or less (Reference 1: BiochimBiophys Acta. 2009 May;1794(5):808-16.).
  • the periplasmic space is an environment similar to the extracellular environment.
  • the present inventors (1) confirmed that in a cell system, molecular recognition protein A was fused to an extracellular loop of membrane protein B via linker C, and that the molecular recognition protein A was presented in the periplasmic space, and further confirmed that the function of membrane protein B was improved by stabilization associated with recognition of ligand D by the molecular recognition protein A.
  • the present inventors (2) fused a molecular recognition protein A to an extracellular loop of a membrane protein B via a linker C in a cell system, and fused a reporter protein E to the membrane protein B, and confirmed that the molecular recognition protein A was presented in the periplasmic space, and further confirmed that the function of the reporter protein E was improved by stabilization associated with the recognition of a ligand D by the molecular recognition protein A. From the above, the present inventors have confirmed that a cell has been completed that has the function of transmitting information (particularly molecular recognition information) from outside the cell (particularly the periplasmic space) into the cell.
  • the present invention is as follows. 1. A cell expressing or capable of expressing the following fusion protein, and having a function of transmitting molecular recognition information related to the amount or concentration of a target chemical molecule present outside the cell, or a change therein, into the cell via the fusion protein:
  • the fusion protein comprises a molecular recognition protein A, a membrane protein B, and a linker C, wherein the molecular recognition protein A is fused to an extracellular loop of the membrane protein B via the linker C, and the molecular recognition protein A is presented extracellularly.
  • the fusion protein is in an unstable state when it does not recognize ligand D by the molecular recognition protein A, and the fusion protein is in a stable state when it recognizes ligand D by the molecular recognition protein A, and the stabilization improves the protein folding ability of the molecular recognition protein A and the membrane protein B, and further improves the function of the membrane protein B.
  • the "cells" of the present invention are typically genetically modified cells, but may also be cells produced using genome editing technology.
  • unstable state when ligand D is not recognized by molecular recognition protein A refers to a state in which the molecular recognition protein A is unable to exert its inherent function due to abnormal protein folding of molecular recognition protein A and/or membrane protein B
  • stable state refers to a state in which molecular recognition protein A is able to exert its inherent function
  • improved function of membrane protein B refers to the ability of membrane protein B to exert its inherent function. For example, in the case of a typical membrane protein such as TetA, which has a function capable of imparting resistance to drugs such as antibiotics, the degree of growth in the presence of a toxic drug is an indicator of improved function.
  • the cell in this case is a cell that utilizes the recognition event of molecular recognition protein A, such as an enzyme, antibody, or receptor, for regulating the function of membrane protein B on/off by linking the molecular recognition protein A to an extracellular loop of membrane protein B via linker C and presenting it as a fusion protein, and thus can function as a "whole cell sensor.”
  • molecular recognition protein A include any protein or peptide or a mutant thereof selected from any water-soluble protein group and peptide group that can be fused to a membrane protein as a polyamino acid, such as enzymes (oxidoreductases, transferases, hydrolases, lyases, isomerases, ligases, translocases), metal-binding proteins, small molecule-binding proteins, protein-binding proteins, and proteins having molecular recognition ability for each receptor or multi-component signal transduction system, or binding motifs for small molecules or proteins present in proteins, or peptides having small molecule-bind
  • enzymes may include, but are not limited to, alkaline phosphatase, galactosidase, glucuronidase, peroxidase, lipase, acyl-CoA ligase, nuclease, luciferase, glucose oxidase, urease, etc.
  • Metal binding proteins may include, but are not limited to, zinc binding protein ZinT, lanthanide binding protein Lanmodulin, calcium binding protein Calmodulin, nickel responsive transcription factor NikR, copper responsive transcription factor CueR, etc.
  • Small molecule binding proteins and their motifs may include, but are not limited to, glutamate binding protein, maltose binding protein, ATP synthase subunit, arsenic binding peptide, retinoic acid receptor, etc.
  • Combinations of molecular recognition proteins A and ligands D will be obvious to those skilled in the art, but typical combinations may include, but are not limited to, phosphorylated compounds such as alkaline phosphatase and BCIP (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate), as well as phosphate and phosphite, glucuronidase and glucuronic acid-modified compounds, acyl-CoA ligase and organic acids, luciferase and luciferin, glucose oxidase and glucose, urease and urea, ATP synthase subunits and ATP, glutamate-binding proteins and glutamate, arsenic-binding peptides and arsenic, Lanmodulin and NdCl3 , and retinoic acid receptors and retinoic acid.
  • phosphorylated compounds such as alkaline phosphatase and BCIP (5-bromo-4-chloro-3-indoly
  • membrane protein B can include a group of membrane proteins having a membrane-spanning site and mutants thereof.
  • membrane proteins B may include, but are not limited to, transport proteins (uniporters, symporters, antiporters, ABC transporters), channel proteins, transmembrane enzymes, photoreceptor pump proteins, photoreceptor signaling proteins, scaffolding membrane proteins, stress response membrane proteins, stress receptor transmembrane enzymes, signal receptor membrane proteins, transmembrane chaperone proteins, transmembrane division control proteins, and the like.
  • linker C is an amino acid or polyamino acid (peptide) used to bind to the extracellular loops of molecular recognition protein A and membrane protein B, and is generally a sequence of 1 to 12 amino acid residues, but the number of amino acids (length) is not limited thereto. It is preferably provided at the N-terminus and C-terminus of molecular recognition protein A, in which case it is divided into linker C1 and linker C2.
  • C1 and C2 may have the same sequence or different sequences.
  • a library can be prepared in which random DNA sequences are provided as linkers C1 and C2 at both ends of the DNA encoding molecular recognition protein A, and optimal linker mutants can be selected, for example, by utilizing the selective pressure function of membrane protein B in the medium.
  • the fusion protein comprises a molecular recognition protein A, a membrane protein B, and a linker C, wherein the molecular recognition protein A is fused to an extracellular loop of the membrane protein B via the linker C, and the molecular recognition protein A is presented extracellularly; and
  • a reporter protein E is fused to the membrane protein B with or without a linker F, wherein the reporter protein E is displayed in the cytoplasm; and, the fusion protein is in an unstable state when it does not recognize ligand D by the molecular recognition protein A, and the fusion protein is in a stable state when it recognizes ligand D by the molecular recognition protein A, and the stabilization improves the protein folding ability of the molecular recognition protein A, the membrane protein B, and the reporter protein E, and further improve
  • the cell in this case presents a fusion protein in which a molecular recognition protein A such as an enzyme, antibody, or receptor is linked via a linker C to the extracellular loop of a membrane protein B, and a reporter protein E is further fused to the membrane protein B, thereby utilizing the recognition event of the molecular recognition protein A against a ligand D to regulate the ON/OFF function of the membrane protein B, and is a cell that can function as a "whole cell sensor.”
  • a molecular recognition protein A such as an enzyme, antibody, or receptor
  • reporter protein E include one or more proteins selected from a group of proteins that can be fused to membrane proteins as polyamino acids, such as transcription factors, enzymes, protein-binding proteins, membrane proteins, water-soluble proteins, and other functional partial structures, or a group of mutants thereof.
  • transcription factors may include, but are not limited to, AraC, SigV, TetR, LacI, T7RNAP, etc.
  • Enzymes may include, but are not limited to, Cat, FDS, CrtM, LacZ, hsvTK, Aph, etc.
  • Protein-binding proteins may include, but are not limited to, a partial structure of RsiV, etc.
  • reporter protein E refers to, for example, in the case of an enzyme or fluorescent protein, an increase in color development or fluorescent color intensity.
  • the cell according to the preceding item 6, wherein the function of the reporter protein E is cell proliferation, cell death, division, biosynthesis, signal transduction, gene expression control, or electron transport.
  • the function of the reporter protein E is cell proliferation, cell death, division, biosynthesis, signal transduction, gene expression control, or electron transport.
  • a biosensor comprising the cell according to the above 1 or 2.
  • a method for monitoring ligand D in the environment comprising the steps of: (1) A step of placing the cell described in the preceding item 1 or 2 into an environment containing ligand D, and (2) a step of monitoring the concentration of the ligand D in the environment using the function of the reporter protein E as an indicator.
  • a method for screening a ligand D of a molecular recognition protein A comprising the steps of: (1) A step of placing the cell described in the preceding item 1 or 2 into an environment containing a candidate compound D' for ligand D, and (2) a step of detecting the activity of the candidate compound D' for ligand D using the function of the reporter protein E as an indicator. 12.
  • a fusion protein comprising a molecular recognition protein A, a membrane protein B and a linker C; wherein the molecular recognition protein A is fused to an extracellular loop of the membrane protein B via the linker C; and, the fusion protein is in an unstable state when it does not recognize ligand D by the molecular recognition protein A, and the fusion protein is in a stable state when it recognizes ligand D by the molecular recognition protein A, and the stabilization improves the protein folding ability of the molecular recognition protein A and the membrane protein B, and further improves the function of the membrane protein B. Fusion proteins. 14.
  • a fusion protein comprising a molecular recognition protein A, a membrane protein B, a linker C and a reporter protein E; wherein the molecular recognition protein A is fused to an extracellular loop of the membrane protein B via the linker C, and the reporter protein E is fused to the membrane protein B with or without a linker F; and, the fusion protein is in an unstable state when it does not recognize ligand D by the molecular recognition protein A, and the fusion protein is in a stable state when it recognizes ligand D by the molecular recognition protein A, and the stabilization improves the protein folding abilities of the molecular recognition protein A, the membrane protein B, and the reporter protein E, and further improves the function of the reporter protein E. Fusion proteins.
  • the present invention provides cells that have the function of transmitting extracellular chemical information (particularly the presence or absence of proteins, enzyme substrates, receptor ligands, coenzymes, etc.) into cells, as well as various uses of the cells.
  • the area between PhoA and TetA indicated by a red circle X corresponds to the random mutation site.
  • the green circles (TG, ST) correspond to restriction enzyme sites, and the yellow circles (S, T) correspond to the amino acids at the insertion point of TetA.
  • Results showing dose-response to Tc, a PhoA-specific ligand D (A) Model structure of the sensor using the crystal structure of LanM (PDB:6MI5) and the predicted structure of TetA by ⁇ Fold2. The area between LanM and TetA indicated by a red circle X corresponds to the random mutation site. (B) Selection of linker mutants that demonstrate TetA function. (C) Confirmation of metal specificity of the selected linker mutants. The vertical axis shows the rate of increase in turbidity in the presence of metal relative to the condition without metal, which is set to 1. From the left, the bars indicate Lin-3, Lin-4, Lin-5, Lin-6, Lin-14, and Lin-15.
  • A Schematic diagram of the plasmid construct of the extracellular to intracellular transfer mechanism using RsiV cyto V1 as a reporter.
  • B Schematic diagram of the mechanism of action of the sensor using RsiV cyto V1 as a reporter with the TI reporter system. Conversion of enzymatic substrate recognition in extracellular space to transcription factor output 1.
  • A Dose-response curve of RsiV function for the PhoA substrate BCIP.
  • FIG. 1 shows the structure of the plasmid used in each Example. Structural diagram of the plasmid used in Examples 3-4.
  • FIG. 2 shows the structure of the plasmid used in Example 2.
  • FIG. 1 shows the structure of the plasmid used in Example 3.
  • FIG. 1 shows the structure of the plasmid used in Example 3.
  • the present invention relates to a cell (hereinafter sometimes abbreviated as "the cell of the present invention") that has a function of transmitting the extracellular chemical environment (particularly, molecular recognition information) into the cell, and to uses of the cell of the present invention.
  • the chemical environment means the amount or concentration of a specific chemical molecule.
  • the cell of the present invention is not particularly limited as long as it has the function of transmitting the extracellular chemical environment into the cell, but is at least a cell that expresses or is capable of expressing the fusion protein described below.
  • Fusion protein (1) comprising a molecular recognition protein A, a membrane protein B and a linker C; Here, the molecular recognition protein A is fused to an extracellular loop of the membrane protein B via a linker C, and the molecular recognition protein A is displayed extracellularly.
  • Fusion protein (2) comprising a molecular recognition protein A, a membrane protein B and a linker C;
  • molecular recognition protein A is fused to an extracellular loop of membrane protein B via linker C, and molecular recognition protein A is displayed extracellularly
  • reporter protein E is fused to membrane protein B with or without linker F, and reporter protein E is displayed in the cytoplasm.
  • the outside of a cell refers to the periplasmic space in the case of gram-negative bacteria including E. coli, and further in the case where membrane protein B is an inner membrane protein.
  • the cell of the present invention is not particularly limited as long as it expresses or can express the above-mentioned fusion protein, and also includes, for example, genetically modified cells (including prokaryotic cells and eukaryotic cells), artificial cells (such as pseudocells and liposomes harboring transcription/translation systems derived from E. coli, yeast, or wheat), and intracellular organelles capable of expressing membrane proteins (such as mitochondria, endoplasmic reticulum, and chloroplasts). Furthermore, if the cells of the invention do not have an endogenous membrane protein expression system present, a heterologous membrane protein B gene(s) can be introduced.
  • genetically modified cells including prokaryotic cells and eukaryotic cells
  • artificial cells such as pseudocells and liposomes harboring transcription/translation systems derived from E. coli, yeast, or wheat
  • intracellular organelles capable of expressing membrane proteins such as mitochondria, endoplasmic reticulum, and chloroplasts.
  • the working principle of the present invention is shown in Figure 1.
  • the working principle of the present invention is as follows.
  • the fusion protein (1) is in an unstable state when it does not recognize ligand D by molecular recognition protein A, and is in a stable state when it recognizes ligand D by molecular recognition protein A.
  • This stabilization improves the protein folding ability of molecular recognition protein A and membrane protein B, and further improves the function of membrane protein B.
  • the fusion protein (2) is in an unstable state when it does not recognize ligand D by molecular recognition protein A, and is in a stable state when it recognizes ligand D by molecular recognition protein A.
  • This stabilization improves the protein folding abilities of molecular recognition protein A, membrane protein B, and reporter protein E, and further improves the function of reporter protein E.
  • any molecular recognition protein A is fused in-frame at the genetic level to the extracellular loop of membrane protein B, thereby presenting it outside the cell.
  • the molecular recognition protein A thus presented outside the cell is appropriately destabilized by genetic mutation (and the associated introduction of amino acid substitutions), it can no longer fold (form a functional structure) on its own (reduced folding ability).
  • the "gene mutation” in the present invention can be performed using any known mutation method (e.g., random mutation, site-specific mutation, amino acid substitution, partial deletion of amino acid residues, or insertion of a peptide or other protein).
  • a preferred example of the mutation of the present invention is destabilization of a protein (fusion mutant).
  • protein stability refers to the stability of the folded state, that is, the free energy change ( ⁇ Gfold) that occurs when the polypeptide chain that constitutes the protein forms a functional structure (when folding). The ⁇ Gfold of a correctly folded protein has a large negative value.
  • destabilization means that the ⁇ Gfold is reduced by the "genetic mutation” defined above, approaching zero (or it may be slightly ⁇ Gfold>0). For example, if a certain amino acid substitution reduces the stability of the functional structure (fold), the amino acid substitution is a "mutation that causes destabilization (destabilizing mutation)".
  • Capture of ligand D which is a target molecule of molecular recognition protein A placed outside the cell, results in stabilization of fusion protein (1) or fusion protein (2).
  • a gene expression regulator such as a transcription factor as the intracellular (cytoplasmic) reporter protein E
  • concentration of ligand D the extracellular environment
  • a fluorescent protein such as GFP
  • reporter protein E is not limited to transcription factor.
  • Various functions can be exemplified, such as phosphate signal system proteins, enzymes involved in biosynthesis and biodegradation, chaperones, and electron transfer. The same can be said for the function of membrane protein B.
  • it may also have photosynthesis, electron transfer protein, enzyme function, and a function as a sensor itself.
  • the main feature of the cell of the present invention is its high arbitrariness.
  • the molecular recognition protein A used as a sensor element outside the cell may be a receptor or an enzyme. Therefore, all molecules known as receptor ligands and molecules known as enzyme substrates can be targeted, making it possible to create a biosensor that detects a variety of small molecules.
  • the molecular recognition is performed outside the cell (in the case of E. coli, in the permeability space) where no intracellular contaminating molecules are present, sensing according to the inherent binding affinity of the intracellular protein is possible.
  • the recognition of ligand D by molecular recognition protein A leads to an improvement in the folding ability of membrane protein B or reporter protein E, so there is no need to redesign the so-called allosteric mechanism.
  • the "molecular recognition protein A” of the present invention is not particularly limited as long as it can bind to a membrane protein B described below via a linker C described below and can be presented outside the cell (particularly in the periplasmic space).
  • the molecular recognition protein A is preferably a water-soluble protein.
  • proteins include metal-binding peptides, arsenic-binding peptides, antibodies, enzymes, and receptors.
  • proteins include alkaline phosphatase, glucuronidase, acyl-CoA ligase, ATP synthase subunits, glutamate-binding protein GluBP, maltose-binding protein MalE, zinc-binding protein ZinT, and lanthanoid-binding protein Lanmodulin.
  • the molecular recognition protein A also contains a peptide motif.
  • the "ligand D" of the present invention is not particularly limited, so long as it is recognized (eg, binds) by the molecular recognition protein A.
  • examples of combinations of molecular recognition protein A and ligand D include an enzyme and a substrate, a peptide motif and its target, an antibody/mini-antibody and an antigen, a nuclear receptor and its ligand, etc.
  • alkaline phosphatase and BCIP (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate), glucuronidase and glucuronic acid, acyl-CoA ligase and an organic acid, luciferase and luciferin, glucose oxidase and glucose, urease and urea, ATP synthase subunit and ATP, glutamate-binding protein and glutamate, arsenic-binding peptide and arsenic, Lanmodulin and NdCl 3 , and retinoic acid receptor and retinoic acid.
  • the host cell is a gram-negative bacterium (having double-membrane cells) such as E.
  • the membrane protein B is an inner membrane-localized protein (TetA, LacY, etc.)
  • the ligand D has the property of being able to pass through the outer membrane. This is because porin is present in the outer cell membrane, so water-soluble molecules with a molecular weight of about 650 can be freely delivered to the periplasmic space. Furthermore, by modifying this porin, even larger molecules can be treated as ligand D.
  • the outer membrane can be removed by the action of peptidoglycan-degrading enzymes, etc. For this reason, it can also be used to detect antigen-antibody reactions.
  • membrane protein B includes not only known wild-type membrane protein(s) but also genetically modified membrane protein(s) and the like. Examples of such proteins include rhodopsin, two-component regulatory systems, transporters, GPCRs, etc.
  • TetA TetA
  • GR Gloeobacter-derived rhodopsin
  • channel rhodopsin ChR various histidine kinases (PhoQ, RcsC, EnvZ, ArcB)
  • TetA transport proteins TetA
  • LacY COX
  • aquaporin various GPCRs ( ⁇ 1B adrenergic receptor ⁇ 1BAR, adenosine A2A receptor A2AR, serotonin 2A receptor (5H2TR), dopamine D2 receptor (D2R), etc.).
  • the sequence of the "linker C” of the present invention is not particularly limited as long as it can bind the molecular recognition protein A to the extracellular loop of the membrane protein B. Furthermore, the "linker C” of the present invention may have the role of maintaining the destabilized state of the fusion protein when the ligand D is not recognized by the molecular recognition protein A. Specifically, the sequence (structure) of the linker C inhibits the normal (usual) protein folding ability of the molecular recognition protein A, or the normal (usual) protein folding ability of the molecular recognition protein A and the membrane protein B.
  • linker C is an amino acid or polyamino acid (peptide) used to bind to the extracellular loops of molecular recognition protein A and membrane protein B, and is generally a sequence of 1 to 12 amino acid residues, but the number of amino acids (length) is not limited thereto. It is preferably provided at the N-terminus and C-terminus of molecular recognition protein A, in which case it is divided into linker C1 and linker C2.
  • C1 and C2 may have the same sequence or different sequences.
  • a library can be prepared in which random DNA sequences are provided as linkers C1 and C2 at both ends of the DNA encoding molecular recognition protein A, and optimal linker mutants can be selected, for example, by utilizing the selective pressure function of membrane protein B in the medium.
  • reporter protein E The "reporter protein E” of the present invention is not particularly limited as long as it is directly or indirectly bound to a membrane protein and is presented inside the cell (cytoplasm). Examples include transcription factors, signal transduction proteins, enzymes, fluorescent proteins, etc. Specific examples include RsiV, AraC, SigV, TetR, LacI, T7RNAP, EnvZ, Cat, FDS, LacZ, GFP, etc.
  • the functions of reporter protein E are not particularly limited, but examples of the functions include physiological functions such as cell proliferation, cell death, division, biosynthesis, signal transduction, gene expression control, and electron transport.
  • the "fusion protein" of the present invention is in an unstable state when the molecular recognition protein A does not recognize the ligand D.
  • the unstable state of the fusion protein means a state in which the normal protein folding ability of the molecular recognition protein A and/or the membrane protein B is inhibited.
  • the "fusion protein” of the present invention is in a stable state when the molecular recognition protein A recognizes the ligand D.
  • the stable state of the fusion protein means that the protein folding ability of the molecular recognition protein A and/or the membrane protein B is improved (higher) compared to the unstable state.
  • the folding energy ⁇ Gfold value increases by adding up the binding energy when molecular recognition protein A binds to ligand D, stabilizing the folding of molecular recognition protein A.
  • This stabilization of molecular recognition protein A is also essential for folding of membrane protein B, which is its fusion partner, so the function of membrane protein B is conditional on the molecular recognition protein A interacting with ligand D.
  • the method for destabilizing and introducing the fusion protein is not particularly limited as long as the above-mentioned state can be maintained, but as described in the Examples below, the normal (usual) protein folding ability of the molecular recognition protein A, or the normal (usual) protein folding ability of the molecular recognition protein A and the membrane protein B can be inhibited by the sequence (structure) of the linker C.
  • a molecular recognition protein A mutant and/or a membrane protein B mutant that have been destabilized by introducing amino acid mutations in advance may be used.
  • the linker F linking the reporter protein E to the membrane protein B is not essential.
  • the membrane protein B when the molecular recognition protein A is stabilized by the ligand D, the membrane protein B can maintain a functional structure. Furthermore, the reporter protein E tethered thereto can maintain a functional structure (show protein activity) under the conditions (cases) in which the membrane protein B maintains its functional structure.
  • the fusion form of molecular recognition protein A-membrane protein B-reporter protein E does not necessarily have to be expressed as a single in-frame gene (translation product) as long as it is fused in an operational state. In other words, A, B, and C may be expressed as separate translation products, and then fused enzymatically after translation using intein or sortase, or chemically fused using a click reagent or condensation agent.
  • the cells of the present invention can be used for various applications (particularly as sensors) by detecting and quantifying functional changes in membrane protein B and/or reporter protein E. Examples are described below, but the present invention is not limited thereto.
  • a method for monitoring ligand D in the environment comprising the steps of: (1) A step of placing the cells of the present invention into an environment containing ligand D; and (2) A step of monitoring the concentration of ligand D in the environment using the function of reporter protein E as an indicator.
  • the above-mentioned environment is not particularly limited as long as the cells of the present invention can grow in it, but examples thereof include plant facilities and the like.
  • a method for screening for a ligand D of a molecular recognition protein A comprising the steps of: (1) A step of placing the cell of the present invention into an environment containing a candidate compound D' for ligand D. (2) A step of detecting the activity of candidate compound D' for ligand D using the function of reporter protein E as an indicator. Note that in (1), a competitor of ligand D may also be present. The activity of the candidate compound D' of the ligand D is calculated based on the improvement or decrease in the function of the reporter protein E.
  • the promoter to be introduced into the cell of the present invention is appropriately selected and used depending on the species of the host cell to be used.
  • any promoter may be used as long as it can be expressed in a host cell such as E. coli.
  • promoters derived from E. coli or phages such as ⁇ PR promoter, PL promoter, trp promoter, and lac promoter can be exemplified. Artificially designed and modified promoters such as tac promoter can be used.
  • yeast is used as a host, any promoter may be used as long as it can be expressed in yeast.
  • gal1 promoter gal10 promoter, heat shock protein promoter, MF ⁇ 1 promoter, PHO5 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH promoter, and AOX1 promoter
  • the recombinant vector is autonomously replicable in the cell and is composed of a promoter, an RNA splice site, a gene of interest, a polyadenylation site, and a transcription termination sequence.
  • a replication origin may be included as desired.
  • the promoter the SR ⁇ promoter, the SV40 promoter, the LTR promoter, the CMV promoter, and the like can be used, and further, the early gene promoter of the cytomegalovirus, and the like may also be used.
  • An expression vector is a DNA that carries an exogenous gene to a host cell, in other words, a vector DNA that can express a target gene in a host cell.
  • the vector DNA is not particularly limited as long as it can be replicated in the host, and is appropriately selected depending on the type of the host and the purpose of use.
  • the vector DNA may be a vector DNA obtained by extracting naturally occurring DNA, or a vector DNA in which a part of DNA other than the part necessary for replication is missing.
  • Representative examples of vector DNA include vector DNA derived from plasmids, bacteriophages, and viruses.
  • Examples of plasmid DNA include a plasmid derived from Escherichia coli, a plasmid derived from Bacillus subtilis, and a plasmid derived from yeast.
  • the fusion protein of the present invention is not particularly limited as long as it has the following configuration and characteristics.
  • the fusion protein (1) comprises a molecular recognition protein A, a membrane protein B, and a linker C.
  • the molecular recognition protein A is fused to an extracellular loop of the membrane protein B via the linker C.
  • the fusion protein (1) is in an unstable state when it does not recognize ligand D via molecular recognition protein A.
  • the fusion protein (1) is in a stable state when it recognizes the ligand D by the molecular recognition protein A, and this stabilization improves the protein folding ability of the molecular recognition protein A and the membrane protein B, and further improves the function of the membrane protein B.
  • the fusion protein (2) comprises a molecular recognition protein A, a membrane protein B, a linker C, and a reporter protein E.
  • the molecular recognition protein A is fused to an extracellular loop of the membrane protein B via the linker C
  • the reporter protein E is fused to the membrane protein B with or without the linker F.
  • the fusion protein (2) is in an unstable state when it does not recognize ligand D by molecular recognition protein A.
  • the fusion protein (2) is in a stable state when it recognizes the ligand D by the molecular recognition protein A, and this stabilization improves the protein folding abilities of the molecular recognition protein A, the membrane protein B, and the reporter protein E, and further improves the function of the reporter protein E.
  • Example 1 Construction of a cell containing (expressing) a fusion protein containing a molecular recognition protein A, a membrane protein B, and a linker C
  • a cell capable of detecting (recognizing) ligand D which is an extracellular (periplasmic space) molecule, was constructed.
  • the tetracycline ( Tc ) transporter TetA (SEQ ID NO : 1), a 12-transmembrane protein, was selected as membrane protein B.
  • TetA confers Tc resistance to E. coli, and its function can be easily read out by observing the growth of E. coli in the presence of Tc.
  • Pho A As molecular recognition protein A, we selected Escherichia coli alkaline phosphatase PhoA (SEQ ID NO: 2). Pho A has two SS bonds, and in Escherichia coli, it does not function unless it is expressed outside the cell (periplasmic space). Therefore, if its functional activity can be confirmed, it can be confirmed that PhoA is presented outside the cell (periplasmic space) and interacts with the substrate.
  • a linker library was created by inserting the phoA gene, which had a base sequence encoding a linker with random mutations of three amino acids at both the N- and C-termini, into the sixth of the six extracellular loops of the TetA protein, which is closest to the C-terminus (Fig. 2AB).
  • the PhoA linker mutant Lin-27 increased turbidity in a BCIP concentration-dependent manner at 5 ⁇ g/ml Tc, with a maximum signal-to-noise (S/N) ratio of 28.5-fold (Fig. 4).
  • Lin-33, 43, and 46 increased turbidity in a BCIP concentration-dependent manner at 3 and 4 ⁇ g/ml Tc, with a maximum S/N ratio of 18.7-fold at 3 ⁇ g/ml Tc for Lin-33, 30.5-fold at 4 ⁇ g/ml Tc for Lin-43, and 32.6-fold at 4 ⁇ g/ml Tc for Lin-46.
  • the negative control, the LanM linker mutant did not respond to BCIP at any Tc concentration.
  • Example 2 Construction of a cell containing (expressing) a fusion protein containing a molecular recognition protein A, a membrane protein B, and a linker C
  • a linker library was created in which LanM was inserted into the sixth periplasmic loop of TetA together with a library of linkers ( FIG. 5A ). From this library, we searched for linker mutants that showed TetA function in response to the lanthanide neodymium (Nd).
  • Example 3 Construction Example 1 of a cell containing (expressing) a fusion protein containing a molecular recognition protein A, a membrane protein B, a linker C, and a reporter protein E (3-1)
  • a molecule (ligand D) capture event by a receptor protein (molecular recognition protein A) outside the cell can be transmitted to the inside of the cell
  • an extracellular molecular detection sensor was constructed using Bacillus subtilis RsiV as reporter protein E, an intracellular protein.
  • RsiV is an anti-sigma factor that specifically inhibits the function of SigV, one of the ECF sigma factors that interacts with RNA polymerase and controls gene expression.
  • This reporter system When the expressed RsiV cyto V1 is functional, the intracellularly expressed SigV is captured, and the transcription of sfGFP from the SigV-regulated promoter is suppressed. This reduces the green fluorescent signal.
  • This reporter system also employs a signal inversion circuit using transcriptional interference (TI). Briefly, mCherry is expressed from a constant promoter, but it faces in the opposite direction to sfGFP. Therefore, when RsiV is not functioning, TI occurs due to transcription from the SigV-regulated promoter, and mCherry transcription is suppressed. On the other hand, when RsiV functions, transcription from the SigV-regulated promoter is suppressed, and TI is released.
  • TI transcriptional interference
  • the cells in which the fusion protein of the present invention is expressed or capable of being expressed are not limited to a specific molecular recognition protein A.
  • RsiV cyto V1 which is the reporter protein E fused to the C-terminus of TetA, which is the membrane protein B, is a protein that inhibits the activity of the transcription factor SigV expressed in the cytoplasm. Therefore, if RsiV cyto V1 is not present in the cytoplasm, the reporter protein E does not function.
  • the result that the activity of SigV was suppressed in a ligand D-dependent manner indicates that the reporter protein E, RsiV, is presented in the cytoplasm.
  • PhoA is a metalloprotein and requires metal ions (zinc and magnesium) to form a functional structure. Therefore, the formation of the functional structure of PhoA is inhibited by chelating metal ions in the environment with a chelating agent, which makes the metal ions unavailable to PhoA. To confirm whether this can be read out by the function of RsiV, which is the reporter protein E, the dose response to the chelating agent EDTA was confirmed.
  • cells expressing a fusion protein containing protein A (PhoA), membrane protein B (TetA), a mutated linker linking the two proteins, and reporter protein E (RsiV) are dose-responsive biosensors for BCIP, a ligand D specific to PhoA.
  • the reporter protein E, RsiV cyto V1 and SigV are proteins derived from other organisms, and the fluorescent protein is expressed from a promoter specifically controlled by SigV. These proteins are not affected by other proteins in the host E. coli, so crosstalk does not occur substantially.
  • Example 4 Construction Example 2 of a cell containing (expressing) a fusion protein containing a molecular recognition protein A, a membrane protein B, a linker C, and a reporter protein E
  • a sensor was constructed using the transcription factor AraC as a reporter.
  • AraC is an intracellular transcription factor with a total length of 291 amino acids, which consists of two domains, a substrate-binding domain (LBD) and a DNA-binding domain (DBD). When activated, the DBD binds to the promoter regulated by the gene (Para BAD ), transcription occurs, and the gene is expressed.
  • RsiV cyto V1 and SigV which were used as reporter protein E of the fusion protein in Example 3 and this Example, are characterized in that they function as biosensors without introducing a mutation into the linker C that links the membrane protein B (without being limited to the linker sequence).
  • membrane protein B can maintain its functional structure when stabilized by ligand D recognition by molecular recognition protein A.
  • reporter protein E tethered thereto can maintain its functional structure (show protein activity) under the conditions (cases) in which membrane protein B maintains its functional structure.
  • cells expressing or capable of expressing the fusion protein of the present invention can be used to search (screen) for ligand D that binds to molecular recognition protein A, to search for molecular recognition protein A mutants that bind better to ligand D, and to search for molecular recognition protein A mutants that bind to ligand D even in the presence of a competing substance.
  • the reporter protein E is proteins derived from other organisms, and fluorescent proteins are expressed from a promoter specifically controlled by SigV. These proteins are not affected by other proteins in the host E. coli, so crosstalk does not occur substantially.
  • Example 5 Evaluation of substrate specificity of E. coli cells containing the linker mutant Lin-27
  • the substrate specificity of E. coli expressing Lin-27, one of the linker mutants of TetA::PhoA selected in Example 1 above is evaluated.
  • E. phosphorylation substrates of PhoA, BCIP, p-nitrophenylphosphate (pNPP), and pyridoxal phosphate (PLP) to liquid cultures of E. coli containing the Lin-27 mutant, and compared the dose response of each phosphorylation substrate (Fig. 18).
  • Lin-27 mutant expressing the Lin-27 mutant was grown in liquid media containing 5, 7.5, and 10 ⁇ g/ml tetracycline (Tc), and the growth of the E. coli was measured at eight points (1.6-fold serial dilution series) with each substrate at a maximum PhoA concentration of 500 ⁇ M.
  • Example 6 Construction of a metal sensor using ZinT as molecular recognition protein A: Extracellular to intracellular transfer mechanism of Cd using ZinT as a sensor element
  • ZinT SEQ ID NO: 8
  • ZinT is a periplasmic protein involved in the uptake of zinc present in the external environment, but is known to bind more strongly to cadmium (Reference 2: BBRC, 364: 66-71 (2007)).
  • the zinT gene was inserted in-frame fusion into the sixth periplasmic loop of TetA using a library linker.
  • TetA had RsiV cyto attached to its C-terminus, similar to TetA::PhoA used in the above (Example 1).
  • Figure 20 We introduced this library into E. coli carrying a reporter plasmid and screened for mutants that showed RsiV function in response to zinc. Colonies were allowed to form in LB solid medium containing 300 ⁇ M ZnCl2 , and 88 colonies that showed yellow to red fluorescence when the "TI-type" reporter system was employed were randomly selected.
  • the selected colonies were cultured in LB liquid medium with or without 300 ⁇ M ZnCl2 , and the RsiV activity (PSigV transcriptional repression ability, i.e., improved mCherry/GFP fluorescence ratio (Figure 19)) was compared.
  • Four linker mutants were found to have ZnCl2 -dependent increased RsiV activity of 1.2-fold or more ( Figure 19B).
  • the present invention can provide cells that have the function of transmitting extracellular information (particularly the presence or absence of proteins, enzyme substrates or ligands, coenzymes, etc.) into cells, as well as various uses of the cells.

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Abstract

微生物全体をセンサーとして用いるWhole cell sensorは、非常に有望視されている技術であるが、細胞膜内外の濃度差問題という重大な技術課題を有する。　本発明では、細胞系において、分子認識タンパク質Ａを膜タンパク質Ｂの細胞外ループにリンカーＣを介して融合させ、分子認識タンパク質Ａはペリプラズム空間に提示されていることを確認し、さらに、分子認識素子ＡによるリガンドＤの認識に伴う安定化により、膜タンパク質Ｂの機能が向上することを確認した。このことにより、ペリプラズム空間などの細胞外の分子認識情報を細胞内に伝達する機能を有する細胞を、Whole cell sensorとして提供することができた。

Description

細胞外化学環境の細胞内伝達機構を有する細胞及び該細胞の用途
　本発明は、細胞外の化学環境（特に、化学分子の存在量）を細胞内に伝達する機能を有する細胞及び該細胞の用途に関する。
　合成生物学分野では、微生物全体をセンサーとして用いる「Whole cell sensor」が有望視されている（非特許文献１）。Whole cell sensorの最大の特徴は、携行性とフレキシビリリティである。微生物の全長1ミクロン（10-15Lの内容積）の袋中に、センサーに必要な全ての機能（検知→伝達→出力）が収まっている。そして、センサーの作動には電源を要さず、出力形態、蛍光や化学発光、電極反応などと共役する酸化還元反応などを自由に選ぶことができる。このため、フィールドワークや環境モニタリングなどでは、機材不要のWhole cell sensorのラインナップ拡充の努力が精力的になされている（非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４）。
　「外情報を内部に伝える」分子機械は自然界にも多く知られる。たとえばG-proteincou pled receptor (GPCR)や二成分系におけるヒスチジンキナーゼ（HK）などがある。これらはいずれも膜貫通タンパク質である。その細胞外部に突出した部分には、標的分子と特異性の高い分子認識をするドメインが存在し、このドメインと標的分子との相互作用が、膜タンパク質のアロステリック構造変化を引き起こす。そして、膜の反対側である細胞質側のドメイン構造の変化を引き起こす。GPCRの場合は、G-protein、アレスチンなどとの相互作用特性の変化によって細胞内部の遺伝子発現カスケードがトリガーされる。二成分系では、細胞外部の標的認識によって、細胞内部ドメインのリン酸化ドメインの露出がもたらされ、そのリン酸化によって、パートナーとなるレスポンスレギュレータへのリン酸転移が惹起され、結果、シグナル伝達系がオンオフされる。
　酵母や哺乳細胞などの真核生物は、それ自身がGPCRカスケードを有している。これらに異種のGPCRタンパク質を過剰発現することによって、内在するGPCRカスケードは、過剰発現したGPCRに「ハイジャック」され、異種由来GPCRの標的分子に応答するようになる。こうして得られた異種GPCR発現真核細胞は、特定の標的分子に対するWhole cell sensorとして機能する（非特許文献５、非特許文献６）。
　一方で、このバイオセンサーは、内在するカスケードをそのまま利用するので、内在の GPCRとのクロストークが避けられない。
　膜タンパク質を介して抗体などのタンパク質を、大腸菌のペリプラズムに提示／アンカーする技術が報告されている（非特許文献７、特許文献１）。しかし、これらの例の膜タンパク質は、タンパク質を細胞表層に提示する足場としてのみ利用されているのみであり、細胞外での相互作用を細胞内に伝達する機構が不在であった。
特表２０２１－５０５６７５号公報
Sensors, 17(7), 1623, (2017) Biosens. Bioelectron., 15, 70, 482-90 (2015) Biotechnol. J., 13(1), (2018) Analyst, 143, 630-634 (2018) Curr. Chem.Genom., 4, 84-91 (2010) Cell, 177, 782-796 (2019) PNAS, 101, 25, 9193-9198 (2004)
　Whole cell sensorは、重大な技術課題である細胞膜内外の濃度差問題を有する。Whole cell sensorの多くは、センサータンパク質を細胞の中で働かせるため、標的物質が検知される場所は、細胞内である。金属イオンや水溶性の高い分子など、細胞膜を通過できない分子は、この形式のセンサーでは検出しづらいことになる。また、Whole cell sensorのトランスポータ（輸送体）などを使って細胞内に強制的に引き込むことができたとしても、その細胞内の濃度は、測定サンプル（細胞外）の本来の濃度とはかけ離れたものとなる。また、細胞内に入った標的分子は、数千の類似した夾雑分子の中に希釈された状態であり、正確な濃度の検知は難しい。
　本発明者らは、Whole cell sensorの重大な欠点を克服するために、大腸菌等の持つペリプラズム空間に着目した。この空間は、外膜と内膜に囲まれた空間である。細胞内膜の分子透過性は低く、水溶性・イオン性の高い分子（logP < 3）はほとんど通さない。この空間は、細胞内部の代謝ネットワークからは隔離されている。一方、外膜は多数のポーリンが存在しており、分子量600以下の化合物については、自由往来が保証されている（参考文献１：BiochimBiophys Acta. 2009 May;1794(5):808-16.）。ペリプラズム空間は、細胞外環境と近い環境である。
　本発明者らは、（１）細胞系において、分子認識タンパク質Ａを膜タンパク質Ｂの細胞外ループにリンカーＣを介して融合させ、該分子認識タンパク質Ａはペリプラズム空間に提示されていることを確認し、さらに、該分子認識タンパク質ＡによるリガンドＤの認識に伴う安定化により、該膜タンパク質Ｂの機能が向上することを確認した。
　さらに、本発明者らは、（２）細胞系において、分子認識タンパク質Ａを膜タンパク質Ｂの細胞外ループにリンカーＣを介して融合させ、かつレポータータンパク質Ｅを該膜タンパク質Ｂと融合させ、該分子認識タンパク質Ａはペリプラズム空間に提示されていることを確認し、さらに、該分子認識タンパク質ＡによるリガンドＤの認識に伴う安定化により、該レポータータンパク質Ｅの機能が向上することを確認した。
　以上により、本発明者らは、細胞外（特に、ペリプラズム空間）の情報（特に、分子認識情報）を細胞内に伝達する機能を有する細胞が完成していることを確認した。
　すなわち、本発明は以下の通りである。
　１．以下の融合タンパク質が発現している又は発現可能な細胞であり、細胞外の標的化学分子の存在量・濃度又はその変化量に係る分子認識情報を、当該融合タンパク質を介して細胞内に伝達する機能を有する細胞であって、
　当該融合タンパク質は、分子認識タンパク質Ａ、膜タンパク質Ｂ及びリンカーＣを含み、ここで、該分子認識タンパク質Ａは該膜タンパク質Ｂの細胞外ループに該リンカーＣを介して融合しており、かつ、該分子認識タンパク質Ａは細胞外に提示されている、
　並びに、
　該融合タンパク質は該分子認識タンパク質ＡによるリガンドＤを認識していない時は不安定な状態であり、及び
　該融合タンパク質は該分子認識タンパク質ＡによるリガンドＤを認識している時は安定な状態であり、該安定化により、該分子認識タンパク質Ａ及び該膜タンパク質Ｂのタンパク質フォールディング能が向上し、さらに該膜タンパク質Ｂの機能が向上する、
　細胞。
　なお、本願発明の「細胞」は、典型的には遺伝子組み換え細胞であるが、ゲノム編集技術を用いた細胞であってもよい。
　また、「分子認識タンパク質ＡによるリガンドＤを認識していない時は不安定な状態である」とは、分子認識タンパク質Ａ及び／又は膜タンパク質Ｂのタンパク質フォールディングが正常に行われないために分子認識タンパク質Ａ本来の機能が発揮できていない状態を指し、「安定な状態」とは、分子認識タンパク質Ａが本来の機能を発揮できている状態であることを表す。また、「膜タンパク質Ｂの機能が向上する」とは、膜タンパク質Ｂ本来の機能が発揮できることを表す。例えば、典型的な膜タンパク質であるTetAのように、抗生物質など薬物耐性機能を付与できる機能を有している場合、毒性薬物存在下での生育度合いが機能向上の指標となる。
　すなわち、ここでの細胞は、膜タンパク質Ｂの細胞外ループに、任意の酵素、抗体、レセプターなどの分子認識タンパク質ＡをリンカーＣを介して連結させて融合タンパク質として提示することにより、分子認識タンパク質ＡのリガンドＤに対する認識イベントを、膜タンパク質Ｂの機能のＯＮ／ＯＦＦ調節に利用するための細胞であり、「Whole cell sensor」として機能し得る細胞であるといえる。
　なお、分子認識タンパク質Ａとしては、酵素（酸化還元酵素，転移酵素，加水分解酵素，リアーゼ，異性化酵素，リガーゼ，トランスロカーゼ），金属結合タンパク質，低分子結合タンパク質，タンパク質結合タンパク質、および各レセプターや多成分シグナル伝達系の分子認識能をもつタンパク質，あるいはタンパク質中に存在する低分子やタンパク質に対する結合モチーフ，低分子結合能またはタンパク質結合能を有するペプチドなど，ポリアミノ酸として膜タンパク質に融合可能なあらゆる水溶性タンパク質群およびペプチド群から選択されたいずれかのタンパク質もしくはペプチド又はその変異体を挙げることができる。
　典型的には、酵素としてアルカリフォスファターゼ、ガラクトシダーゼ，グルクロニダーゼ、ペルオキダーゼ，リパーゼ，アシルCoAリガーゼ、ヌクレアーゼ，ルシフェラーゼ、グルコースオキシダーゼ、ウレアーゼなどを含み得るが，これらに限定されない．また，金属結合タンパク質として亜鉛結合タンパク質ZinT、ランタノイド結合タンパク質Lanmodulin ，カルシウム結合タンパク質Calmodulin，ニッケル応答転写因子NikR，銅応答転写因子CueRなどを含み得るが，これらに限定されない．低分子結合タンパク質やそのモチーフとしては，グルタミン酸結合タンパク質，マルトース結合タンパク質，ATP合成酵素サブユニット、ヒ素結合ペプチド，レチノイン酸レセプターなどを含み得るが，これらに限定されない．
　そして、分子認識タンパク質ＡとリガンドＤとの組み合わせは当業者には自明であるが、典型的な組み合わせとしては、アルカリフォスファターゼとBCIP(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate)などに代表されるリン酸化化合物およびリン酸や亜リン酸、グルクロニダーゼとグルクロン酸修飾された化合物、アシルCoAリガーゼと有機酸、ルシフェラーゼとルシフェリン、グルコースオキシダーゼとグルコース、ウレアーゼと尿素、ATP合成酵素サブユニットとATP、グルタミン酸結合タンパク質とグルタミン酸、ヒ素結合ペプチドとヒ素、LanmodulinとNdCl3、及びレチノイン酸レセプターとレチノイン酸などを含み得るが，これらに限定されない．
　また、膜タンパク質Ｂは、膜を貫通する部位を有する膜タンパク質群およびその変異体を挙げることができる．
　典型的には膜タンパク質Ｂとしては、輸送タンパク質（単輸送体，共輸送体，対向輸送体、ABC輸送体），チャネルタンパク質，膜貫通型酵素，光受容ポンプタンパク質，光受容シグナル伝達タンパク質，足場形成膜タンパク質，ストレス応答膜タンパク質，ストレス受容膜貫通酵素，シグナル受容膜タンパク質，膜貫通シャペロンタンパク質，膜貫通分裂制御タンパク質，などを含み得るが，これらに限定されない．
　そして、「リンカーＣ」は、分子認識タンパク質Ａ及び膜タンパク質Ｂの細胞外ループに結合するために用いられるアミノ酸もしくはポリアミノ酸（ペプチド）であり、一般的には1～１２アミノ酸残基の配列であるが，アミノ酸の数（長さ）はこれらに限定はされない。分子認識タンパク質ＡのN端及びC端に設けることが好ましく、その場合はリンカーＣ１及びリンカーＣ２として分かれる。Ｃ１及びＣ２はそれぞれ同一配列でも異なった配列でもよい。
　また、分子認識タンパク質ＡをコードするDNAの両端にリンカーＣ１及びリンカーＣ２としてランダムなDNA配列を設けたライブラリーを作製し、例えば、膜タンパク質Ｂの培地における選択圧機能を利用して最適なリンカー変異体を選抜することができる。
　２．以下の融合タンパク質が発現している又は発現可能な細胞であり、細胞外の標的化学分子の存在量・濃度又はその変化量に係る分子認識情報を、当該融合タンパク質を介して細胞内に伝達する機能を有する細胞であって、
　当該融合タンパク質は、分子認識タンパク質Ａ、膜タンパク質Ｂ及びリンカーＣを含み、ここで、該分子認識タンパク質Ａは該膜タンパク質Ｂの細胞外ループに該リンカーＣを介して融合しており、かつ、該分子認識タンパク質Ａは細胞外に提示されている、及び、
　レポータータンパク質ＥはリンカーＦを介する又は介さずに該膜タンパク質Ｂと融合しており、ここで、該レポータータンパク質Ｅは細胞質に提示されている、
　並びに、
　該融合タンパク質は該分子認識タンパク質ＡによるリガンドＤを認識していない時は不安定な状態であり、及び
　該融合タンパク質は該分子認識タンパク質ＡによるリガンドＤを認識している時は安定な状態であり、該安定化により、該分子認識タンパク質Ａ及び該膜タンパク質Ｂ及びレポータータンパク質Ｅのタンパク質フォールディング能が向上し、さらに該レポータータンパク質Ｅの機能が向上する、
　細胞。
　すなわち、ここでの細胞は、膜タンパク質Ｂの細胞外ループに、任意の酵素、抗体、レセプターなどの分子認識タンパク質ＡをリンカーＣを介して連結させて融合タンパク質として提示すると共に、膜タンパク質Ｂにはさらにレポータータンパク質Ｅが融合されていることにより、分子認識タンパク質ＡのリガンドＤに対する認識イベントを、膜タンパク質Ｂの機能のＯＮ／ＯＦＦ調節に利用するための細胞であり、「Whole cell sensor」として機能し得る細胞である。
　なお、代表的なレポータータンパク質Ｅとしては、転写因子，酵素，タンパク質結合タンパク質，膜タンパク質や水溶性タンパク質など機能性を持つ部分構造などの，ポリアミノ酸として膜タンパク質に融合可能なタンパク質群又はそれらの変異体からなる群から選択された１もしくは２以上のタンパク質を挙げることができる．
　典型的には、転写因子としては， AraC, SigV, TetR, LacI, T7RNAPなどを含み得るが，これらに限定されない．酵素としては，Cat, FDS,CrtM，LacZ，hsvTK，Aphなどを含み得るが，これらに限定されない． タンパク質結合タンパク質としてはRsiVの部分構造などを含み得るが，これらに限定されない.
　ここで、「レポータータンパク質Ｅの機能が向上する」とは、例えば、酵素、蛍光タンパク質の場合は、発色、蛍光色の強度が上がるなどを指す。
　３．前記細胞外は、ペリプラズム空間である、前項１又は２に記載の細胞。
　なお、典型的には、大腸菌のペリプラズム空間である、前項３の細胞。
　４．前記リガンドＤは外膜通過可能な性質を有する、前項３に記載の細胞。
　５．前記リガンドＤの有無により、前記膜タンパク質Ｂの機能が調節及び／又は制御されている、前項１又は２に記載の細胞。
　６．前記リガンドＤの有無により、前記レポータータンパク質Ｅの機能が調節及び／又は制御されている、前項２に記載の細胞。
　７．前記レポータータンパク質Ｅの機能が細胞増殖、細胞死、分裂、生合成、シグナル伝達、遺伝子発現制御又は電子伝達である、前項６に記載の細胞。
　８．前記レポータータンパク質Ｅの機能が細胞増殖、細胞死、分裂、生合成、シグナル伝達、遺伝子発現制御又は電子伝達である、前項６に記載の細胞。
　８．前項１又は２に記載の細胞からなる、バイオセンサー。
　９．細胞外での前記リガンドＤの検出及び／又は環境中のリガンドＤの濃度を定量するためのバイオセンサーである、前項８に記載のバイオセンサー。
　１０．以下の工程を含む、環境中のリガンドＤのモニタリング方法、
（１）前項１又は２に記載の細胞を、リガンドＤを含む環境中に投入する工程、及び
（２）前記レポータータンパク質Ｅの機能を指標として、該環境中の該リガンドＤの濃度をモニタリングする工程。
　１１．以下の工程を含む、分子認識タンパク質ＡのリガンドＤのスクリーニング方法、
（１）前項１又は２に記載の細胞を、リガンドＤ候補化合物Ｄ’を含む環境中に投入する工程、及び
（２）前記レポータータンパク質Ｅの機能を指標として、リガンドＤ候補化合物Ｄ’の活性を検出する工程。
　１２．前記（１）において、リガンドＤの競合物質が存在している、前項１１に記載の方法。
　１３．分子認識タンパク質Ａ、膜タンパク質Ｂ及びリンカーＣを含む融合タンパク質、
　ここで、該分子認識タンパク質Ａは該膜タンパク質Ｂの細胞外ループに該リンカーＣを介して融合しており、
　並びに、
　該融合タンパク質は該分子認識タンパク質ＡによるリガンドＤを認識していない時は不安定な状態であり、及び
　該融合タンパク質は該分子認識タンパク質ＡによるリガンドＤを認識している時は安定な状態であり、該安定化により、該分子認識タンパク質Ａ及び該膜タンパク質Ｂのタンパク質フォールディング能が向上し、さらに該膜タンパク質Ｂの機能が向上する、
　融合タンパク質。
　１４．分子認識タンパク質Ａ、膜タンパク質Ｂ、リンカーＣ及びレポータータンパク質Ｅを含む融合タンパク質、
　ここで、該分子認識タンパク質Ａは該膜タンパク質Ｂの細胞外ループに該リンカーＣを介して融合しており、かつ、該レポータータンパク質ＥはリンカーＦを介する又は介さずに該膜タンパク質Ｂと融合しており、
　並びに、
　該融合タンパク質は該分子認識タンパク質ＡによるリガンドＤを認識していない時は不安定な状態であり、及び
　該融合タンパク質は該分子認識タンパク質ＡによるリガンドＤを認識している時は安定な状態であり、該安定化により、該分子認識タンパク質Ａ、該膜タンパク質Ｂ及びレポータータンパク質Ｅのタンパク質フォールディング能が向上し、さらに該レポータータンパク質Ｅの機能が向上する、
　融合タンパク質。
　本発明は、細胞外の化学情報（特に、タンパク質、酵素の基質や受容体のリガンド、補酵素などの有無）を細胞内に伝達する機能を有する細胞並びに該細胞を使用した各用途を提供することができた。
（Ａ）：分子認識タンパク質Ａ、膜タンパク質Ｂ及びリンカーＣを含む融合タンパク質を発現する細胞。（Ｂ）：分子認識タンパク質Ａ、膜タンパク質Ｂ、リンカーＣ及びレポータータンパク質Ｅを含む融合タンパク質を発現する細胞。 （Ａ）PhoAの結晶構造（PDB:1HQA）とTetAのαFold2による予測構造を利用したセンサーのモデル構造。PhoAとTetAの間の赤丸Xで示した部分がランダム変異箇所に当たる。緑丸（TG、ST）は制限酵素サイト、黄色丸（S、T）はTetAの挿入点のアミノ酸に当たる。（Ｂ）PhoAのリンカーライブラリの作成。phoA遺伝子のN末とC末それぞれに制限酵素サイト（緑：GGTACC-、-ACTAGT）とランダム化した塩基（赤色：-NNK NNKNNK、NNKNNKNNK-）を付加し、tetA遺伝子の細胞外ループに当たる箇所に挿入した。（Ｃ）TetA機能およびPhoA機能を示すリンカー変異体の選抜。（Ｄ）プレートで選抜したリンカー変異体の液体培養での機能評価。赤丸が取得した変異体に当たる。（Ｅ）選抜したリンカー変異体の再機能評価。 リンカー変異体のリンカーのアミノ酸配列。 PhoAに特異的なリガンドＤであるTcに対して、用量応答性を示す結果。 （Ａ）LanMの結晶構造（PDB:6MI5）とTetAのαFold2による予測構造を利用したセンサーのモデル構造。LanMとTetAの間の赤丸Xで示した部分がランダム変異箇所に当たる。（Ｂ） TetA機能を示すリンカー変異体の選抜。（Ｃ）選抜したリンカー変異体の金属特異性の確認結果。縦軸は金属なしの条件を１として、それに対する金属存在時の濁度の上昇率を示している。左棒から、Lin-3, Lin-4, Lin-5, Lin-6, Lin-14,およびLin-15を示す。 LanMに特異的なリガンドＤであるNdCl3に対して、用量応答性を示す結果。 RsiVcytoV1をレポーターとした細胞外（ペラリズム空間）から細胞内への伝達機構の構築の概要図。（Ａ）RsiVcytoV1をレポーターとした細胞外から内伝達機構のプラスミドコンストラクトの概要図。（Ｂ）TIレポーターシステムを用いたRsiVcytoV1をレポーターとしたセンサーの作動機序の概要図。 細胞外（ペラリズム空間）での酵素基質認識の転写因子出力への変換１。（Ａ）PhoA基質BCIPに対するRsiV機能の用量応答曲線。（Ｂ）BCIP存在下におけるEDTAに対するRsiV機能の用量応答曲線。（Ｃ）BCIPおよびEDTA存在下における金属イオンに対するRsiV機能の用量応答曲線。 AraCDBDをレポーターとした細胞外（ペラリズム空間）から細胞内への伝達機構の構築の概要。（Ａ）AraCDBDをレポーターとした細胞外から内伝達機構のプラスミドコンストラクトの概要図。（Ｂ）AraCDBDをレポーターとしたセンサーの作動機序の概要図。 AraCDBDを使用した細胞外（ペラリズム空間）での酵素基質認識の転写因子出力への変換の結果。 各実施例で使用したプラスミドの構造図。 実施例３－４で使用したプラスミドの構造図。 実施例２で使用したプラスミドの構造図。 実施例３で使用したプラスミドの構造図。 実施例３で使用したプラスミドの構造図。 実施例４で使用したプラスミドの構造図。 実施例４で使用したプラスミドの構造図。 TetAをレポーターとする細胞外分子センサーの構築及び酵素基質特異性の評価 RsiVcytoV1をレポーターとする細胞外→細胞内への伝達機構の構築 実施例６で使用したプラスミドの構造図。 TetA-ZintT-RsiVcytoV1のLinker-1～Linker-3のLinker配列
（本発明の概要）
　本発明は、細胞外の化学環境（特に、分子認識情報）を細胞内に伝達する機能を有する細胞（以後、「本発明の細胞）」と略する場合がある）、並びに本発明の細胞の用途に関する。なお、化学環境とは、特定の化学分子の存在量・濃度を意味する。
（本発明の細胞）
　本発明の細胞は、細胞外の化学環境を細胞内に伝達する機能を有する細胞であれば、特に限定されないが、少なくとも、以下で説明する融合タンパク質が発現している又は発現可能な細胞である。
　融合タンパク質（１）；分子認識タンパク質Ａ、膜タンパク質Ｂ及びリンカーＣを含み、
ここで、分子認識タンパク質Ａは膜タンパク質Ｂの細胞外ループにリンカーＣを介して融合しており、かつ、分子認識タンパク質Ａは細胞外に提示されている。
　融合タンパク質（２）：分子認識タンパク質Ａ、膜タンパク質Ｂ及びリンカーＣを含み、
ここで、分子認識タンパク質Ａは膜タンパク質Ｂの細胞外ループにリンカーＣを介して融合しており、かつ、分子認識タンパク質Ａは細胞外に提示されている、及びレポータータンパク質ＥはリンカーＦを介する又は介さずに膜タンパク質Ｂと融合しており、ここで、レポータータンパク質Ｅは細胞質に提示されている。
　なお、本発明の細胞外とは、大腸菌を含むグラム陰性菌の場合、さらに膜タンパク質Ｂが内膜タンパク質である場合はペリプラズム空間となる。また、本発明の細胞とは、上記の融合タンパク質が発現している又は発現可能な細胞であれば特に限定されないが、例えば、遺伝子改変細胞（原核細胞、真核細胞を含む）、人工細胞（大腸菌由来、酵母由来、コムギ由来などの転写・翻訳系を内包した擬細胞、リポソームなど）、膜タンパク質の発現が可能な細胞内オルガネラ（ミトコンドリア、小胞体、葉緑体など）等も含む。
　さらに、本発明の細胞が、内因性の膜タンパク質発現系が存在しない場合には、異種の膜タンパク質Ｂの遺伝子（群）を導入することもできる。
（本発明の作動原理）
　本発明の作動原理を図１に示す。本発明の作動原理は、以下の通りである。
　融合タンパク質（１）は、分子認識タンパク質ＡによるリガンドＤを認識していない時は不安定な状態であり、かつ、分子認識タンパク質ＡによるリガンドＤを認識している時は安定な状態である。該安定化により、分子認識タンパク質Ａ及び膜タンパク質Ｂのタンパク質フォールディング能が向上し、さらに該膜タンパク質Ｂの機能が向上する。
　融合タンパク質（２）は、分子認識タンパク質AによるリガンドＤを認識していない時は不安定な状態であり、かつ、分子認識タンパク質ＡによるリガンドＤを認識している時は安定な状態である。該安定化により、分子認識タンパク質Ａ、膜タンパク質Ｂ及びレポータータンパク質Ｅのタンパク質フォールディング能が向上し、さらにレポータータンパク質Ｅの機能が向上する。
（本発明の細胞の構築方法）
　本発明の細胞の概要を図１に示す。本発明の細胞は、上記作動原理が実行できれば、製造方法は限定されないが、以下を例示することができる。
　（Ａ）最初に、任意の分子認識タンパク質Ａを膜タンパク質Ｂの細胞外ループに遺伝子レベルでin-frame融合することによって、細胞外に提示する。こうして細胞外に提示された分子認識タンパク質Ａを、遺伝子変異（とそれに伴うアミノ酸置換の導入）などによって適度に不安定化させると、もはや自力ではフォールド（機能構造の形成）できないようになる（フォールディング能の低下）。このとき、分子認識タンパク質Ａのミスフォールドは、連結されている膜タンパク質Ｂのフォールド構造形成をも不能とし、結果として、膜タンパク質Ｂの機能も失われる（低下している）。
　一方で、分子認識タンパク質Ａを安定化させる外的要素であるリガンドＤ（パートナータンパク質との相互作用、受容体として相互作用するべき小分子などとの結合）によって、タンパク質Ａが安定化され、そのフォールド構造が回復する場合、連結された膜タンパク質Ｂの構造形成も可能となり、膜タンパク質Ｂの機能向上がおこる（図１Ａ）。
　（Ｂ）上記（Ａ）の融合タンパク質（１）の膜タンパク質Ｂに、細胞質側に配向するようにレポータータンパク質Ｅを融合する。この構成は、細胞外（ペリプラズム空間）で分子認識タンパク質ＡがリガンドＤとの結合によって安定化されるという現象が、膜タンパク質Ｂを介して、細胞質側のレポータータンパク質Ｅの機能向上を起こす（図１Ｂ）。
（遺伝子変異）
　本発明での「遺伝子変異」は、自体公知の変異（例、ランダム変異や部位特異的変異アミノ酸置換、アミノ酸残基の一部欠損やペプチドや別種タンパク質の挿入）方法を利用することができる。
　加えて、本発明の変異の好ましい例として、タンパク質（融合変異体）の不安定化を起すことである。まず、タンパク質の安定性とは、フォールディング状態の安定性、すなわち、そのタンパク質をなすポリペプチド鎖が、機能構造を形成するとき（フォールディングするとき）に生じる自由エネルギー変化（ΔGfold）である。正しくフォールドするタンパク質のΔGfoldは大きな負の値をとる。そして、「不安定化」とは、上記定義の「遺伝子変異」により、そのΔGfoldを減らし、ゼロに漸近させる（あるいは僅かにΔGfold>0となっても良い）ことを意味する。例えば、あるアミノ酸置換によって、機能構造（フォールド）の安定性が低下する場合、そのアミノ酸置換は「不安定化をもたらす変異（不安定化変異）」である。
　細胞外に配置した分子認識タンパク質Ａの標的分子であるリガンドＤ捕獲は、融合タンパク質（１）又は融合タンパク質（２）の安定化をもたらす。
　細胞内（細胞質）のレポータータンパク質Ｅとしての転写因子などの遺伝子発現調節因子などを選べば、細胞外環境の分子情報（リガンドＤの濃度）を、細胞内でのタンパク質発現レベルの大小に翻訳することができる。さらに、その制御下流にGFPなどの蛍光タンパク質を配置すると、細胞の蛍光レベルによって、リガンドＤの濃度を読み出すセンサーが構成できる。また、GFPのかわりに分裂増殖や細胞死、生合成などの生理機能に関わる遺伝子（セット）を制御下に配することによって、細胞の任意の生理機能を高い自由度をもって外的に操作することができる。
　レポータータンパク質Ｅの機能は転写因子に限定されない。リン酸シグナル系タンパク質、生合成・生分解を担う酵素、シャペロンや電子伝達など、さまざまな機能を例示することができる。また、膜タンパク質Ｂの機能も同様である。物質の選択的、能動的な輸送機能に加え、光合成、電子伝達タンパク質、酵素機能、そしてそれ自身がセンサーとしての機能などを持つものでも良い。
　本発明の細胞（本発明のセンサー）の主な特徴は、任意性の高さである。細胞外でセンサー素子として用いる分子認識タンパク質Ａは、レセプターでも酵素でも良い。このため、レセプターのリガンドとして知られている分子、酵素基質として知られている分子が全て標的とし得るので、さまざまな小分子を検出するバイオセンサーを作成可能である。 また、その分子認識が、細胞内由来の夾雑分子の存在しない細胞外（大腸菌の場合ペラリズム空間）で行われるため、細胞内タンパク質の持つ本来の結合親和性に応じたセンシングが可能である。
　そして、本発明の作動原理では、分子認識タンパク質ＡのリガンドＤの認識が膜タンパク質Ｂ又はレポータータンパク質Ｅのフォールディング能向上を起こすため、いわゆるアロステリック機構を再デザインする必要がない。
（分子認識タンパク質Ａ）
　本発明の「分子認識タンパク質Ａ」は、以下で説明する膜タンパク質Ｂと以下で説明するリンカーＣを介して結合でき、かつ、細胞外（特に、ペリプラリズム空間）で提示できるものであれば特に限定されない。分子認識タンパク質Ａは、水溶性タンパク質であることが好ましい。
　例えば、金属結合ペプチド、ヒ素結合ペプチド、抗体、酵素やレセプターを例示することができる。具体的には、アルカリフォスファターゼ、グルクロニダーゼ、アシルCoAリガーゼ、ATP合成酵素サブユニット、グルタミン酸結合タンパク質GluBP、マルトース結合タンパク質MalE、亜鉛結合タンパク質ZinT、ランタノイド結合タンパク質Lanmodulin、等を例示することができる。
　加えて、分子認識タンパク質Ａは、ペプチドモチーフも含む。
（リガンドＤ）
　本発明の「リガンドＤ」は、分子認識タンパク質Ａに認識（例、結合する）されれば、特に限定されない。
　例えば、分子認識タンパク質ＡとリガンドＤの組み合わせは、酵素と基質、ペプチドモチーフとその標的、抗体／ミニ抗体と抗原、核レセプターとそのリガンド等を例示することができる。具体的には、アルカリフォスファターゼとBCIP(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate)、グルクロニダーゼとグルクロン酸、アシルCoAリガーゼと有機酸、ルシフェラーゼとルシフェリン、グルコースオキシダーゼとグルコース、ウレアーゼと尿素、ATP合成酵素サブユニットとATP、グルタミン酸結合タンパク質とグルタミン酸、ヒ素結合ペプチドとヒ素、LanmodulinとNdCl3、レチノイン酸レセプターとレチノイン酸を例示することができる。
　大腸菌などのグラム陰性菌（二重膜型の細胞を持つ）を宿主細胞とし、かつ膜タンパク質Ｂが内膜局在型のタンパク質（TetA, LacYなど）の場合、リガンドＤは、外膜通過可能な性質を有することが好ましい。細胞外膜にはポーリンが存在するため、分子量650程度の水溶性分子は自由にペリプラズム空間に送達されるためである。また、このポーリンの改変によってさらに大きな分子もリガンドＤとして扱うこともできる。また、外膜はペプチドグリカン分解酵素の作用などによって除去することも可能である。このため、抗原・抗体反応の検出などにも展開可能である。
（膜タンパク質Ｂ）
　本発明の「膜タンパク質Ｂ」は、公知の野生型膜タンパク質（群）だけでなく、遺伝子改変膜タンパク質（群）等も対象とする。
　例えば、ロドプシン、二成分制御系、トランスポーター、GPCR等を例示することができる。具体的には、TetA、GR（Gloeobacter由来ロドプシン）、チャネルロドプシンChR、各種ヒスチジンキナーゼ（PhoQ, RcsC, EnvZ, ArcB）、輸送タンパク質TetA, LacY,　COX, アクアポリン,各種GPCR（α1Bアドレナリン受容体α1BAR，アデノシンA2A受容体A2AR、セロトニン2A受容体(5H2TR)、ドーパミンD2受容体(D2R)等）を例示することができる。
（リンカーＣ）
　本発明の「リンカーＣ」は、分子認識タンパク質Ａを膜タンパク質Ｂの細胞外ループに結合できれば、配列は特に限定されない。
　さらに、本発明の「リンカーＣ」は、分子認識タンパク質ＡによるリガンドＤを認識していない時において、融合タンパク質の不安化状態を維持する役割を有しても良い。具体的には、リンカーＣの配列（構造）により、分子認識タンパク質Ａの正常な（通常な）タンパク質フォールディング能、又は、分子認識タンパク質Ａ及び膜タンパク質Ｂの正常な（通常な）タンパク質フォールディング能を阻害する。
　そして、「リンカーＣ」は、分子認識タンパク質Ａ及び膜タンパク質Ｂの細胞外ループに結合するために用いられるアミノ酸もしくはポリアミノ酸（ペプチド）であり、一般的には１～１２アミノ酸残基の配列であるが，アミノ酸の数（長さ）はこれらに限定はされない。分子認識タンパク質ＡのN端及びC端に設けることが好ましく、その場合はリンカーＣ１及びリンカーＣ２として分かれる。Ｃ１及びＣ２はそれぞれ同一配列でも異なった配列でもよい。
　また、分子認識タンパク質ＡをコードするDNAの両端にリンカーＣ１及びリンカーＣ２としてランダムなDNA配列を設けたライブラリーを作製し、例えば、膜タンパク質Ｂの培地における選択圧機能を利用して最適なリンカー変異体を選抜することができる。
（レポータータンパク質Ｅ）
　本発明の「レポータータンパク質Ｅ」は、膜タンパク質に直接又は間接的に結合され、かつ、細胞内（細胞質）で提示されれば特に限定されない。
　例えば、転写因子、シグナル伝達タンパク質、酵素、蛍光タンパク質等を例示することができる。具体的には、RsiV, AraC, SigV, TetR, LacI, T7RNAP, EnvZ, Cat, FDS, LacZ, GFP等を例示することができる。
　なお、レポータータンパク質Ｅの機能は、特に限定されないが、細胞増殖、細胞死、分裂、生合成、シグナル伝達、遺伝子発現制御、電子伝達等の生理機能を例示することができる。
（融合タンパク質の状態）
　本発明の「融合タンパク質」は、分子認識タンパク質ＡがリガンドＤを認識していない時は、不安定な状態である。なお、融合タンパク質の不安定な状態とは、分子認識タンパク質Ａ及び／又は膜タンパク質Ｂの正常なタンパク質フォールディング能が阻害された状態を意味する。
　本発明の「融合タンパク質」は、分子認識タンパク質ＡがリガンドＤを認識している時は、安定な状態である。なお、融合タンパク質の安定な状態とは、分子認識タンパク質Ａ及び／又は膜タンパク質Ｂのタンパク質フォールディング能が、不安定な状態と比較して、向上している（高い）ことを意味する。
　詳しくは、分子認識タンパク質ＡがリガンドＤと結合する際の結合エネルギー算入によりフォールディングエネルギーΔGfold値が増し、分子認識タンパク質Ａのフォールディングが安定化する。この分子認識タンパク質Ａの安定化は、融合パートナーである膜タンパク質Ｂフォールディングにも必須であるため、膜タンパク質Ｂの機能は、分子認識タンパク質ＡがリガンドＤと相互作用していることを条件としたものとなる。
　融合タンパク質の不安定化導入方法は、上記状態を維持することができれば特に限定されないが、下記実施例に記載のように、リンカーＣの配列（構造）により、分子認識タンパク質Ａの正常な（通常な）タンパク質フォールディング能、又は、分子認識タンパク質Ａ及び膜タンパク質Ｂの正常な（通常な）タンパク質フォールディング能を阻害することができる。別方法として、予めアミノ酸変異を導入して不安定化した分子認識タンパク質Ａ変異体及び／又は膜タンパク質Ｂ変異体を使用しても良い。
　レポータータンパク質Ｅは、下記実施例の結果から明らかなように、膜タンパク質Ｂを連結するリンカーＦが必須ではない。
　詳しくは、リガンドＤによって分子認識タンパク質Ａが安定化されるとき、膜タンパク質　Ｂは機能構造を維持できる。さらに、それにテザリングされているレポータータンパク質Ｅは、膜タンパク質Ｂが機能構造を維持している条件（場合）には、機能構造を維持することができる（タンパク質活性を示す）。
　また、分子認識タンパク質Ａ－膜タンパク質Ｂ－レポータータンパク質Ｅの融合形態は、作動状態で融合されていれば、必ずしも一つのin-frame遺伝子（翻訳産物）として発現される必要はない。すなわちＡ、Ｂ、Ｃは別々の翻訳産物として発現されたのち、インテインやSortaseなどによって翻訳後に酵素的に融合、あるいはクリック試薬や縮合剤によって化学的に融合されていても良い。
（本発明の細胞の用途）
　本発明の細胞は、下記実施例から明らかなように、膜タンパク質Ｂ及び／又はレポータータンパク質Ｅの機能変化を検出・定量することにより、様々な用途（特に、センサー）に使用することができる。以下に例示を記載するが得に限定されない。
（１）膜タンパク質Ｂ及び／又はレポータータンパク質Ｅの活性の変化によるリガンドＤの検出・定量
　具体的には、細胞外でのリガンドＤの検出及び／又は環境中のリガンドＤの濃度を定量するためのバイオセンサーである。
（２）リガンドＤの有無により、膜タンパク質Ｂ及び／又はレポータータンパク質Ｅの機能の調節・制御
　具体的な調節・制御には、細胞増殖、細胞死、分裂、生合成、シグナル伝達、遺伝子発現制御、電子伝達等の生理機能の調節・制御等を例示することができる。
　以下の工程を含む、環境中のリガンドＤのモニタリング方法。
（１）本発明の細胞を、リガンドＤを含む環境中に投入する工程
（２）レポータータンパク質Ｅの機能を指標として、環境中のリガンドＤの濃度をモニタリングする工程
　なお、上記環境とは、本発明の細胞が生育できれば特に限定されないが、プラント施設等を例示することができる。
　以下の工程を含む、分子認識タンパク質ＡのリガンドＤのスクリーニング方法。
（１）本発明の細胞を、リガンドＤ候補化合物Ｄ’を含む環境中に投入する工程
（２）レポータータンパク質Eの機能を指標として、リガンドＤ候補化合物Ｄ’の活性を検出する工程
　なお、（１）において、リガンドＤの競合物質が存在していても良い。
　また、リガンドＤ候補化合物Ｄ’の活性は、レポータータンパク質Ｅの機能の向上・低下を基にして算出される。
（プロモータ）
　本発明の細胞に導入するプロモータは、使用する宿主細胞の種によって適宜選択して使用される。細菌を宿主として使用する場合、プロモータとして、大腸菌などの宿主細胞中で発現できるものであれば特に限定されず、いずれを使用してもよい。例えば、λPRプロモータ、PLプロモータ、trpプロモータ、およびlacプロモータなどの、大腸菌やファージに由来するプロモータを例示できる。tacプロモータなどの人為的に設計改変されたプロモータを使用してもよい。酵母を宿主とする場合、プロモータとして、酵母中で発現できるものであれば特に限定されず、いずれを使用してもよい。例えば、gal1プロモータ、gaｌ10プロモータ、ヒートショックタンパク質プロモータ、MFα1プロモータ、PHO5プロモータ、PGKプロモータ、GAPプロモータ、ADHプロモータ、およびAOX1プロモータなどを例示できる。動物細胞を宿主とする場合は、組換えベクターが該細胞中で自律複製可能であると同時に、プロモータ、RNAスプライス部位、目的遺伝子、ポリアデニル化部位、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、所望により複製起点が含まれていてもよい。プロモータとして、SRαプロモータ、SV40プロモータ、LTRプロモータ、およびC MVプロモータなどを使用することができ、また、サイトメガロウイルスの初期遺伝子プロモータなどを使用してもよい。
（発現ベクター）
　発現ベクターは、宿主細胞に外部遺伝子を運搬するDNA、言い換えればベクターDNAであって、宿主細胞中で目的遺伝子を発現させ得るDNAをいう。ベクターDNAは宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、宿主の種類および使用目的により適宜選択される。ベクターDNAは、天然に存在するDNAを抽出して得られたベクターDNAの他、複製に必要な部分以外のDNAの部分が一部欠落しているベクターDNAでもよい。代表的なベクターDNAとして例えば、プラスミド、バクテリオファージおよびウイルス由来のベクターDNAを挙げることができる。プラスミドDNAとして、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミドなどを例示できる。
（本発明の融合タンパク質）
　本発明の融合タンパク質は、以下の構成及び特性を有すれば、特に限定されない。
〇融合タンパク質（１）は、分子認識タンパク質Ａ、膜タンパク質Ｂ及びリンカーＣを含む。なお、分子認識タンパク質Ａは膜タンパク質Ｂの細胞外ループにリンカーＣを介して融合している。
　融合タンパク質（１）は分子認識タンパク質AによるリガンドＤを認識していない時は不安定な状態である。
　融合タンパク質（１）は分子認識タンパク質ＡによるリガンドＤを認識している時は安定な状態であり、該安定化により、分子認識タンパク質Ａ及び膜タンパク質Ｂのタンパク質フォールディング能が向上し、さらに膜タンパク質Ｂの機能が向上する。
〇融合タンパク質（２）は、分子認識タンパク質Ａ、膜タンパク質Ｂ、リンカーＣ及びレポータータンパク質Ｅを含む。なお、分子認識タンパク質Ａは膜タンパク質Ｂの細胞外ループにリンカーＣを介して融合しており、かつレポータータンパク質ＥはリンカーＦを介する又は介さずに膜タンパク質Ｂと融合している。
　融合タンパク質（２）は分子認識タンパク質ＡによるリガンドＤを認識していない時は不安定な状態である。
　融合タンパク質（２）は分子認識タンパク質ＡによるリガンドＤを認識している時は安定な状態であり、該安定化により、分子認識タンパク質Ａ、膜タンパク質Ｂ及びレポータータンパク質Ｅのタンパク質フォールディング能が向上し、さらにレポータータンパク質Ｅの機能が向上する。
　以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
　本発明におけるその他の用語や概念は、当該分野において慣用的に使用される用語の意味に基づくものであり、本発明を実施するために使用する技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。また、各種の分析などは、使用した分析機器又は試薬、キットの取り扱い説明書、カタログなどに記載の方法を準用して行った。
　なお、本明細書中に引用した技術文献、特許公報及び特許出願明細書中の記載内容は、本発明の記載内容として参照されるものとする。
（実施例１）　分子認識タンパク質Ａ、膜タンパク質Ｂ及びリンカーＣを含む融合タンパク質を含む（発現する）細胞の構築例１
　本実施例では、細胞外（ペリプラズム空間）の分子であるリガンドＤの検出（認識）可能な細胞を構築した。
　膜タンパク質Ｂとして12回膜貫通タンパク質であるテトラサイクリン（Tetracycline : Tc）トランスポーターTetA（配列番号１）を選択した。TetAは、大腸菌にTc耐性を有し、 Tc存在下で大腸菌の生育を見ることで機能を容易に読み出すことができる。
　分子認識タンパク質Ａとして大腸菌アルカリフォスファターゼPhoA（配列番号２）を選択した。Pho Aは２つのS-S結合を有しており、大腸菌は細胞外側（ペリプラズム空間）で発現させないと機能を示さない。そのため、その機能活性が確認できればPhoAは細胞外側（ペリプラズム空間）に提示され、基質と相互作用していることが確認できる。
　tetA遺伝子に関し、TetAタンパク質の6箇所ある細胞外側ループの最もC末端寄りの6番目のループに当たる位置に、N末端とC末端に3アミノ酸ずつのランダム変異を加えたリンカーをコードする塩基配列を付加したphoA遺伝子を挿入したリンカーライブラリを作成した（図２ＡＢ）。
　このライブラリの中から、PhoAの基質結合による安定化をTetA機能によって読み出すことのできるリンカー変異体を探索した（図２Ｂ）。5μg/mlのTcおよび、100μMのPhoAの比色基質であるBCIP(脱リン酸化されることで青色色素を形成する)を含むプレート上にコロニーを形成させたところ、Tc耐性を示すコロニーが３５３個形成され、その中から十分なPhoA活性（青色色素を形成）を示したコロニーを４８個選抜した（図２Ｃ）。
　選抜したコロニーをLB液体培地において、5μg/ml Tc存在下で、100μM BCIPの有無の２条件で培養し、PhoA基質に応答してTetA機能を示す変異体を絞り込んだところ、BCIPに依存して濁度が２倍以上増加する変異体を１１個得た（図２Ｄ）。これらの変異体のプラスミドを回収し、同条件で再機能評価を行った。４つLin-27、Lin-33、Lin-43及びLin-46（図３）についてBCIPの有無により濁度に２倍以上の差が見られた（図２Ｅ）。
　これら４つのリンカー変異体（分子認識タンパク質Ａ、膜タンパク質Ｂ及びリンカーＣを含む融合タンパク質（タンパク質群））のいずれかを含む細胞が、PhoA（分子認識タンパク質Ａ）の基質に応答してTetA（膜タンパク質Ｂ）の機能を示すセンサーであることを確認した。
　PhoAのリンカー変異体Lin-27, 33, 43, 46に関し、細胞外（ペリプラズム空間）の分子であるリガンドＤを検出するセンサーとしての機能を評価するために、その基質であるBCIPに対する用量応答性を確認した（図４）。
　各リンカー変異体を発現させた大腸菌を3，4，5μg/mlのTcを含む各液体培地において、BCIPを最大濃度400μMとして８点ふり（1.6倍の段階希釈系列）、生育を測定した。ネガティブコントロールとして、Ndに応答するLanMのLin-3を用いた（参照：下記実施例２）。
　PhoAのリンカー変異体Lin-27は5μg/mlのTcにおいてBCIP濃度依存的に濁度が上昇し、その最大のSignal to noise（S/N）比は28.5倍であった（図４）。Lin-33,43,46は3および4μg/mlのTc存在下においてBCIP濃度依存的に濁度が上昇し、それぞれ最大のS/N比はL in-33は3μg/ml Tcにおいて18.7倍、Lin-43は4μg/ml Tcにおいて30.5倍、Lin-46は4μg/ml Tcにおいて32.6倍であった。ネガティブコントロールであるLanMのリンカー変異体はどのTc濃度においてもBCIPに対する応答を示さなかった。
　以上の結果から、タンパク質ＡであるPhoA、膜タンパク質ＢであるTetA及び両タンパク質同士を連結する変異を導入したリンカーＣを含む融合タンパク質を発現する細胞は、PhoAに特異的なリガンドＤであるBCIPに対して、用量応答性を示すバイオセンサーであることを確認した。
（実施例２）分子認識タンパク質Ａ、膜タンパク質Ｂ及びリンカーＣを含む融合タンパク質を含む（発現する）細胞の構築例２
　本実施例では、分子認識タンパク質ＡとしてMethylobacterium extorquens由来のランタノイド結合タンパク質ランモジュリンLanM（配列番号３）を用いてセンサーの構築を試みた。LanMをライブラリ化したリンカーと共にTetAの6番目のペリプラズムループへ挿入したリンカーライブラリを作成した（図５Ａ）。
　このライブラリの中から、ランタノイドであるネオジム(Nd)に応答してTetA機能を示すリンカー変異体を探索した。3μg/mL Tcおよび100μM NdCl3を含むプレートにおいて、 Tc耐性を示すコロニーが180個形成され、そのうち96個をランダムに選抜した。選抜したコロニーを、3μg/mL Tcを含み、100μM NdCl3の有無のLB液体培地で培養し、濁度を比較したところ、Nd３＋に依存して濁度が1.2倍以上増加する変異体が6つ（Lin-3,Lin-4,Lin-5,Lin-6,Lin-14およびLin-15：図３）選抜された（図５Ｂ）。
　これらの変異体のプラスミドを回収し、再度大腸菌に導入し、コロニーを形成させた。生えたコロニーをピックし、金属選択性を確認するために、3 μg/mlのTcを含み、100 μM NdCl3, 50 μM EuCl3, 100 μM Ycl3,100 μM CaCl2, 金属なしの５条件において、Tet A機能を再解析した。
　以上の結果、すべてのリンカー変異体（分子認識タンパク質Ａ、膜タンパク質Ｂ及びリンカーＣを含む融合タンパク質）のいずれかを含む細胞が、LanM（分子認識タンパク質Ａ）の基質に応答してTetA（膜タンパク質Ｂ）の機能を示すセンサーであることを確認した（図５Ｃ）。
　LanMのLin-3に関し、そのセンサー機能を評価するために、NdCl3に対する用量応答性を確認した（図６）。Lin-3を発現させた大腸菌を2, 3, 4 μg/mlのTcを含む各液体培地において、NdCl3を最大濃度1000 μMとして８点振り（3倍希釈系列）、生育を測定した。ネガティブコントロールとしてBCIPに応答するPhoAのLinker-27を用いた。
　以上の結果、Lin-3は各Tc濃度においてNdCl3濃度依存的に濁度が上昇し、その最大のS/N比は、3μg/ml Tcにおける11.1倍であった。ネガティブコントロールであるPhoAのLinker-27についてはどのTc濃度でもNdCl3依存的な生育は見られなかった。
　以上の結果から、タンパク質ＡであるLanM、膜タンパク質ＢであるTetA及び両タンパク質同士を連結する変異を導入したリンカーＣを含む融合タンパク質を発現する細胞は、LanMに特異的なリガンドＤであるNd(NdCl3)に対して、用量応答性を示すバイオセンサーであることを確認した（図６）。
　実施例１及び実施例２で取得したリンカー変異体のリンカー配列のアミノ酸を図３に示した。
（実施例３）分子認識タンパク質Ａ、膜タンパク質Ｂ、リンカーＣ及びレポータータンパク質Ｅを含む融合タンパク質を含む（発現する）細胞の構築例１
（３－１）
　本実施例では、細胞外での受容体タンパク質（分子認識タンパク質Ａ）による分子（リガンドＤ）捕獲イベントを細胞内部へと伝達可能かを確認するために、枯草菌RsiVを細胞内タンパク質であるレポータータンパク質Ｅとした細胞外分子検出センサーを構築した。
　RsiVは、RNAポリメラーゼと相互作用し遺伝子発現を制御するECFシグマ因子の1つのSigVの機能を特異的に抑制するアンチシグマ因子である。このSigVの捕獲にはRsiVの細胞内ドメインRsiVcyto（配列番号４）のみが必要である。RsiVcytoに不安定化変異（K13E, V15D）を導入したRsiVcytoV1をリンカー変異体Lin-27（参照：実施例１）のC末端に融合したタンパク質遺伝子を載せたセンサープラスミドを構築した（図７Ａ）。
　RsiVcytoV1の機能を評価するために、定常発現するSigV,SigVによって発現するsfGFP、sfGFPと逆方向に配した定常発現するmCherryを載せたレポータープラスミドを構築した（図７Ａ）。
　発現させたRsiVcytoV1が機能状態にある場合、細胞内で発現させたSigVが捕捉され、SigV制御プロモータからのsfGFPの転写が抑制される。これにより緑色蛍光シグナルが低下する。また、本レポーターシステムはTranscriptional interference（TI）を用いたシグナル反転回路を採用している。簡単に説明すると、mCherryは定常プロモータから発現しているが、sfGFPとは逆方向を向いているため、RsiVが機能していない場合、SigV制御プロモータから起こる転写によってTIが起こり、mCherryの転写が抑制される。一方でRsiVが機能することで、SigV制御プロモータからの転写が抑制されるため、TIが解除される。これにより定常プロモータからのmCherryの発現が上昇し、赤色蛍光シグナルが増加する。このようにすることで、PhoAの基質存在時（ON条件）には、sfGFP蛍光シグナルの減少というOFFシグナルになっていたものが、mCherry蛍光の増加というONシグナルへと反転される（図７Ｂ）。
　基質との結合によるPhoAの安定化をRsiV機能として読み出せるか調べるために、PhoAの野生型および変異体の基質であるBCIPの用量応答性を確認した。図７Ａに示したセンサープラスミド及びレポータープラスミドを大腸菌へ導入し、コロニーを形成させた。その中から3コロニーをピックし、液体培地において、BCIPを最大濃度400μMとして８点ふり（2倍の段階希釈系列）、RsiV機能を解析した。
　野生型に加え、酵素活性が上昇する変異体D153G、基質親和性の上昇する変異体D153A及び酵素活性と基質親和性が低下する変異体R166Sでも同様に解析を行なった。
　上記の結果、野生型が最も良く応答しており、BCIPが200μMの点でmCherry/GFPが２倍以上となっており、BCIPが3.125μMの点と比較するとS/N比は最大4.3倍であった（図８Ａ）。また、PhoAへの変異導入によって応答曲線が変化することが確認できた。これらの結果は、細胞外で起こった酵素と基質との結合イベントが膜タンパク質を介して細胞内ドメインに伝達し、遺伝子発現の切り替わりという形に変換されたことを意味している。加えて、細胞外に提示した酵素の変異による安定性変化などの酵素自体のプロファイルの変化を読み出せることを示している。
　より詳しくは、本発明の融合タンパク質が発現している又は発現可能な細胞では、特定の分子認識タンパク質Ａに限定されないことを意味する。
　また、膜タンパク質ＢであるTetAのC末端に融合しているレポータータンパク質ＥであるR siVcytoV1は細胞質内において発現している転写因子SigVの活性を阻害するタンパク質である。そのため、このRsiVcytoV1は細胞質内に存在しないとレポータータンパク質Ｅの機能を発揮しない。本実施例では、リガンドＤ依存的にSigVの活性を抑制した（GFP蛍光が低下しmCherry蛍光が増加した）という結果は、レポータータンパク質ＥであるRsiVが細胞質に提示されていることを示す。
（３－２）
　PhoAは金属タンパク質であり、機能構造形成に金属イオン（亜鉛及びマグネシウム）が必要である。そのため、キレート剤により環境中の金属イオンをキレートし、PhoAが該金属イオンを利用できなくすることによって、PhoAの機能構造形成が阻害される。これをレポータータンパク質ＥであるRsiV機能で読み出せるか確かめるために、キレート剤であるEDTAに対する用量応答性を確認した。400 μMのBCIPを含む液体培地において、EDTAを最大濃度400 μMとして８点ふり（2倍の段階希釈系列）、RsiV機能を解析したところ、EDTA濃度依存的にmCherry/GFPの値が低下した（図８Ｂ）。これはキレート剤により環境中の金属イオン濃度が低下し、PhoAが基質と結合できなくなったため、機能構造を形成できずRsiVが機能発現できなくなったことを示している。
（３－３）
　EDTA存在化において金属イオンを過剰に添加することで、金属イオン濃度に依存したTetA-リンカー-PhoA-RsiVcytoV1の機能構造形成をレポータータンパク質ＥであるRsiV機能で読み出せると仮定し、BCIPとEDTA存在下における金属イオンに対する用量応答性を確認した。
　400 μMのBCIPと400 μMのEDTAを含む液体培地において、ZnCl２とMgCl２が2:1となる金属溶液を最大濃度1000 μMとして８点ふり（2倍の段階希釈系列）、レポータータンパク質ＥであるRsiV機能を解析したところ、金属イオン濃度に依存してmCherry/GFPの値が上昇することが確認された（図８Ｃ）。これは、金属イオンに依存したPhoA機能構造形成をレポータータンパク質ＥであるRsiV機能として読み出せることを意味している。
　以上の結果から、タンパク質ＡであるPhoA、膜タンパク質ＢであるTetA、両タンパク質同士を連結する変異を導入したリンカー及びレポータータンパク質ＥであるRsiVを含む融合タンパク質を発現する細胞は、PhoAに特異的なリガンドＤであるBCIPに対して、用量応答性を示すバイオセンサーであることを確認した。
　加えて、本実施例においては、レポータータンパク質ＥであるRsiVcytoV1およびSigVは、他生物由来のタンパク質であり、かつSigVが特異的に制御するプロモータから蛍光タンパク質を発現させている。これらのタンパク質は、宿主である大腸菌の他のタンパク質の影響を受けないので、実質的にはクロストークは起きない。
（実施例４）分子認識タンパク質Ａ、膜タンパク質Ｂ、リンカーＣ及びレポータータンパク質Ｅを含む融合タンパク質を含む（発現する）細胞の構築例２
　本実施例では、細胞質内のレポータータンパク質ＥとしてRsiV以外のタンパク質を利用できるかを確認するために、転写因子AraCをレポーターとしたセンサーの構築を行った。
　AraCは全長291アミノ酸で基質結合ドメイン（LBD）とDNA結合ドメイン（DBD）の２つのドメインからできている細胞内転写因子であり、活性化するとDBDが制御（ParaBAD）プロモータと結合、転写が起こり遺伝子が発現する。このAraCのDBD部分のみ(168番‐291番まで)をTetA+PhoAのLin-27のC末端に融合したタンパク質遺伝子の載ったセンサープラスミドを構築した（図９Ａ）。
　また、レポータープラスミドには、AraCによって正に制御されるParaBAD7プロモータの制御下にsfGFPを配しており、AraCDBD（配列番号５）が機能発現するとsfGFPが発現し、緑色蛍光を示す（図９ＡＢ）。
　AraCDBDでも、PhoAと基質の結合による安定化を読み出せるかを調べるために、BCIPに対する用量応答性を確認した。図９Ａに示すプラスミドを用いて、内在のaraC遺伝子を欠損している大腸菌JW0063を形質転換し、コロニーを形成させた。そこから３つのコロニーをピックし、液体培地において、BCIPを最大濃度400 μMとして８点ふり（2倍の段階希釈系列）、AraCDBD機能を解析した。
　以上の結果、野生型（WT）およびTetA機能が向上するように調整した変異体（Mut：配列番号６）ともに、BCIP濃度依存的なsfGFP蛍光の上昇が見られ（図１０）、AraCDBD系においても、細胞外で起こるPhoAと基質の結合イベントを読み出せることが示された。
　以上の結果から、タンパク質ＡであるPhoA、膜タンパク質ＢであるTetA、両タンパク質同士を連結する変異を導入したリンカーＣ及びレポータータンパク質ＥであるAraCを含む融合タンパク質を発現する細胞は、PhoAに特異的なリガンドＤであるBCIPに対して、用量応答性を示すバイオセンサーであることを確認した。
　実施例３及び本実施例において融合タンパク質のレポータータンパク質Ｅとして用いたRsiVcytoV1およびSigVは、膜タンパク質Ｂを連結するリンカーＣには変異を導入することなく（リンカーの配列に限定することなく）、バイオセンサーとしての機能を示していることに特徴がある。
　詳しくは、分子認識タンパク質ＡのリガンドＤ認識により、安定化されるとき、膜タンパク質Ｂは機能構造を維持できる。さらに、それにテザリングされているレポータータンパク質Ｅは、膜タンパク質Ｂが機能構造を維持している条件（場合）には、機能構造を維持することができる（タンパク質活性を示す）ことを確認した。
　以上により、本発明の融合タンパク質が発現している又は発現可能な細胞は、分子認識タンパク質Ａに結合するリガンドＤの探索（スクリーニング）、よりリガンドＤに結合する分子認識タンパク質Ａ変異体の探索、競合物質が存在する環境でもリガンドＤと結合する分子認識タンパク質Ａ変異体の探索に使用することができる。
　本実施例においては、レポータータンパク質ＥであるRsiVcytoV1およびSigVは、他生物由来のタンパク質であり、かつSigVが特異的に制御するプロモータから蛍光タンパク質を発現させている。これらのタンパク質は、宿主である大腸菌の他のタンパク質の影響を受けないので、実質的にはクロストークは起きない。
(実施例５) リンカー変異体Lin-27を含む大腸菌細胞の基質特異性の評価
　本実施例では、前記（実施例１）で選抜されたTetA::PhoAのリンカー変異体の１つであるLin-27を発現させた大腸菌の基質特異性を評価する。
　そのため、Lin-27変異体を含む大腸菌の液体培地に対して、PhoAのリン酸化基質であるBCIP，パラニトロフェノールリン酸（p-nitrophenylphosphate：pNPP），ピリドキサールリン酸（Pyridoxal-phosphate: PLP）を添加し、各リン酸化基質に対しての用量応答性を比較した（図１８）。
　具体的には、Lin-27変異体を発現させた大腸菌を5、 7.5、 10μg/mlのテトラサイクリン（Tc）を含む各液体培地において，各基質を最大PhoA濃度500μMとして８点ふり（1.6倍の段階希釈系列）、当該大腸菌の生育を測定した。
　その結果，BCIPに対しては，どのTc濃度おいてもBCIP濃度依存的に濁度が上昇し，Tc濃度が7.5μl/mlにおいて最大のS/N比は12倍であった。また，Tc5μg/mlにおいては，pNPPに対しても濃度依存的な濁度の上昇が見られ、そのS/N比は6倍であった。一方で，PLPに対しては応答性が見られなかった。
　このように、膜タンパク質Ａとして、Tc耐性機能を有するTetAのような、細胞毒性耐性機能を有する膜タンパク質を用いれば、細胞の生育度合いを指標として細胞外の環境変化を提示できる「Whole cell sensor」を提供できることを示すことができた。
（実施例６）分子認識タンパク質ＡとしてZinTを用いたメタルセンサーの構築：ZinTをセンサー素子としたCdの細胞外→内伝達機構
　本実施例では、水溶性タンパク質Ａとして大腸菌由来亜鉛結合タンパク質ZinT（配列番号８）を用いたメタルセンサーの構築を試みた。ZinTは，外環境中に存在する亜鉛の取り込みに関与するペリプラズムタンパク質であるが，カドミウムに対してより強く結合することが知られている（参考文献２： BBRC,364:66-71(2007)）。ライブラリ化したリンカーによってzinT遺伝子をTetAの６番目のペリプラズムループへin-frame融合挿入した。このTetAには、前記（実施例１）で用いたTetA::PhoAと同様、そのC末端にRsiVcytoを付してある。(図２０) 
　このライブラリをレポータープラスミドを持った大腸菌に導入し，亜鉛に応答してRsiV機能を示す変異体を探索した。300μMのZnCl2を含むLB個体培地でコロニーを形成させ，その中で、「TI型」レポーターシステムを採用したとき、黄色から赤色の蛍光を示すコロニーを88個ランダムに選抜した。
　選抜したコロニーを300μMのZnCl2の有無のLB液体培地で培養し、RsiV活性（PSigVの転写抑制能力、すなわち　mCherry/GFPの蛍光比が向上したもの（図１９）を比較したところ，ZnCl2に依存してRsiV活性が1.2倍以上に上昇したリンカー変異体が４つ見出された（図１９Ｂ）。
　このうち３つのリンカー変異体（図２１）についてプラスミドを回収し、再度TIレポーターシステムをもつ大腸菌に再導入し，コロニーを形成させた．生えたコロニーをピックし金属応答性を再検証した。すなわちZnCdCl2，CuCl2，CdCl2を最大濃度500μMとして８点ふり（1.6倍の段階希釈系列），蛍光を測定した。その結果、Linker-2とLinker-3については，ZnCl2に対して用量依存的にRsiV活性の上昇がわずかに見られ，その最大S/N 比は1.2倍であった。一方で，CuCl2に対してはどのリンカー変異体も応答を示さなかった．また，全てのリンカー変異体について，CdCl2に対し用量依存的なRsiV活性が上昇した。特に、Linker-3が300μMの条件で最大S/N比1.8倍を示した（図１９Ｃ～Ｅ）。
　以上のように、Cdに対して強く結合することが知られている亜鉛結合タンパク質ZinTをセンサー素子とすることで、細胞外のメタル（Cd）と結合することによって、細胞内伝達機構が働き、TetAの薬剤放出機能と、RsiV機能（PSigVの転写開始に必要なSigVを捕縛する）が起動する、メタルセンサーを構築できることを示すことができた。
　つまり、細胞外に提示しているセンサ素子がZinTであり、出力がRsiVになるという機能を有する「Whole cell sensor」が提供できたと表現することもできる。
　本発明は、細胞外の情報（特に、タンパク質、酵素の基質やリガンド、補酵素などの有無）を細胞内に伝達する機能を有する細胞並びに該細胞を使用した各用途を提供することができる。

Claims (14)

  1. 　以下の融合タンパク質が発現している又は発現可能な細胞であり、細胞外の標的化学分子の存在量・濃度又はその変化量に係る分子認識情報を、当該融合タンパク質を介して細胞内に伝達する機能を有する細胞であって、
    　当該融合タンパク質は、分子認識タンパク質Ａ、膜タンパク質Ｂ及びリンカーＣを含み、ここで、該分子認識タンパク質Ａは該膜タンパク質Ｂの細胞外ループに該リンカーＣを介して融合しており、かつ、該分子認識タンパク質Ａは細胞外に提示されている、
    　並びに、
    　該融合タンパク質は該分子認識タンパク質ＡによるリガンドＤを認識していない時は不安定な状態であり、及び
    　該融合タンパク質は該分子認識タンパク質ＡによるリガンドＤを認識している時は安定な状態であり、該安定化により、該分子認識タンパク質Ａ及び該膜タンパク質Ｂのタンパク質フォールディング能が向上し、さらに該膜タンパク質Ｂの機能が向上する、
    　細胞。
  2. 　以下の融合タンパク質が発現している又は発現可能な細胞であり、細胞外の標的化学分子の存在量・濃度又はその変化量に係る分子認識情報を、当該融合タンパク質を介して細胞内に伝達する機能を有する細胞であって、
    　当該融合タンパク質は、分子認識タンパク質Ａ、膜タンパク質Ｂ及びリンカーＣを含み、ここで、該分子認識タンパク質Ａは該膜タンパク質Ｂの細胞外ループに該リンカーＣを介して融合しており、かつ、該分子認識タンパク質Ａは細胞外に提示されている、及び、
    　レポータータンパク質ＥはリンカーＦを介する又は介さずに該膜タンパク質Ｂと融合しており、ここで、該レポータータンパク質Ｅは細胞質に提示されている、
    　並びに、
    　該融合タンパク質は該分子認識タンパク質ＡによるリガンドＤを認識していない時は不安定な状態であり、及び
    　該融合タンパク質は該分子認識タンパク質ＡによるリガンドＤを認識している時は安定な状態であり、該安定化により、該分子認識タンパク質Ａ及び該膜タンパク質Ｂ及びレポータータンパク質Ｅのタンパク質フォールディング能が向上し、さらに該レポータータンパク質Ｅの機能が向上する、
    　細胞。
  3. 　前記細胞外は、ペリプラズム空間である、請求項１又は２に記載の細胞。
  4. 　前記リガンドＤは外膜通過可能な性質を有する、請求項３に記載の細胞。
  5. 　前記リガンドＤの有無により、前記膜タンパク質Ｂの機能が調節及び／又は制御されている、請求項１又は２に記載の細胞。
  6. 　前記リガンドＤの有無により、前記レポータータンパク質Ｅの機能が調節及び／又は制御されている、請求項２に記載の細胞。
  7. 　前記レポータータンパク質Ｅの機能が細胞増殖、細胞死、分裂、生合成、シグナル伝達
    、遺伝子発現制御又は電子伝達である、請求項６に記載の細胞。
  8. 　請求項１又は２に記載の細胞からなる、バイオセンサー。
  9. 　細胞外での前記リガンドＤの検出及び／又は環境中のリガンドＤの濃度を定量するためのバイオセンサーである、請求項８に記載のバイオセンサー。
  10. 　以下の工程を含む、環境中のリガンドＤのモニタリング方法、
    （１）請求項１又は２に記載の細胞を、リガンドＤを含む環境中に投入する工程、及び
    （２）前記レポータータンパク質Ｅの機能を指標として、該環境中の該リガンドＤの濃度をモニタリングする工程。
  11. 　以下の工程を含む、分子認識タンパク質ＡのリガンドＤのスクリーニング方法、
    （１）請求項１又は２に記載の細胞を、リガンドＤ候補化合物Ｄ’を含む環境中に投入する工程、及び
    （２）前記レポータータンパク質Ｅの機能を指標として、リガンドＤ候補化合物Ｄ’の活性を検出する工程。
  12. 　前記（１）の工程において、リガンドＤの競合物質が存在している、請求項１１に記載の方法。
  13. 　分子認識タンパク質Ａ、膜タンパク質Ｂ及びリンカーＣを含む融合タンパク質、
    　ここで、該分子認識タンパク質Ａは該膜タンパク質Ｂの細胞外ループに該リンカーＣを介して融合しており、
    　並びに、
    　該融合タンパク質は該分子認識タンパク質ＡによるリガンドＤを認識していない時は不安定な状態であり、及び
    　該融合タンパク質は該分子認識タンパク質ＡによるリガンドＤを認識している時は安定な状態であり、該安定化により、該分子認識タンパク質Ａ及び該膜タンパク質Ｂのタンパク質フォールディング能が向上し、さらに該膜タンパク質Ｂの機能が向上する、
    　融合タンパク質。
  14. 　分子認識タンパク質Ａ、膜タンパク質Ｂ、リンカーＣ及びレポータータンパク質Ｅを含む融合タンパク質、
    　ここで、該分子認識タンパク質Ａは該膜タンパク質Ｂの細胞外ループに該リンカーＣを介して融合しており、かつ、該レポータータンパク質ＥはリンカーＦを介する又は介さずに該膜タンパク質Ｂと融合しており、
    　並びに、
    　該融合タンパク質は該分子認識タンパク質ＡによるリガンドＤを認識していない時は不安定な状態であり、及び
    　該融合タンパク質は該分子認識タンパク質ＡによるリガンドＤを認識している時は安定な状態であり、該安定化により、該分子認識タンパク質Ａ、該膜タンパク質Ｂ及びレポータータンパク質Ｅのタンパク質フォールディング能が向上し、さらに該レポータータンパク質Ｅの機能が向上する、
    　融合タンパク質。
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