WO2024257862A1 - アミンの分離方法 - Google Patents

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amines
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徹 柴田
聡 新蔵
寛弘 川原
雄一 藤岡
朱莉 山本
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/26—Conditioning of the fluid carrier; Flow patterns
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
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    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86

Definitions

  • This disclosure relates to a method for separating amines.
  • polysaccharide-based CSPs separation agents that use polysaccharide derivatives as chiral selectors (hereinafter referred to as "polysaccharide-based CSPs") are known to be extremely effective in separating many enantiomers and substances that are difficult to separate with general separation agents due to their similar structures, such as structural isomers.
  • An object of the present disclosure is to provide a method for separating amines, which has excellent separation performance.
  • the method further comprises an analysis step of analyzing the amine separated by the separation step, In the analysis step, analysis is performed using at least a mass spectrometer.
  • [3] The method for separating an amine according to [1] or [2], wherein the base is at least one selected from the group consisting of ammonia, a primary amine, a secondary amine, and a tertiary amine.
  • [4] The method for separating an amine according to [3], wherein the base is at least one selected from the group consisting of ammonia, ethylamine, n-propylamine, 2-propylamine, dimethylamine, diethylamine, trimethylamine, triethylamine, pyrrolidine, and piperidine.
  • the base is at least one selected from the group consisting of ammonia, ethylamine, n-propylamine, 2-propylamine, dimethylamine, diethylamine, trimethylamine, triethylamine, pyrrolidine, and piperidine.
  • the mobile phase contains at least oxalic acid as the specific acid.
  • [6] The method for separating amines according to any one of [1] to [5], wherein at least one of the oligosaccharides, polysaccharides, and derivatives thereof has an optically active site.
  • [7] The method for separating an amine according to any one of [1] to [6], wherein the solvent is one or more selected from the group consisting of water, acetonitrile, ethanol, methanol, 2-propanol, hexane, heptane, THF, and liquid carbon dioxide.
  • the solvent is one or more selected from the group consisting of water, acetonitrile, ethanol, methanol, 2-propanol, hexane, heptane, THF, and liquid carbon dioxide.
  • the present disclosure provides an amine separation method with excellent separation performance.
  • 1 is a liquid chromatogram obtained by analysis of amines in Example 1.
  • 1 is a liquid chromatogram obtained by analysis of an amine in Comparative Example 1.
  • 1 is a liquid chromatogram obtained by analysis of an amine in Comparative Example 2.
  • 1 is a liquid chromatogram obtained by analysis of an amine in Comparative Example 3.
  • 1 is a liquid chromatogram obtained by analysis of amines in Example 2.
  • 1 is a liquid chromatogram obtained by analysis of an amine in Comparative Example 4.
  • 1 is a liquid chromatogram obtained by analysis of amines in Example 3.
  • 1 is a liquid chromatogram obtained by analysis of an amine in Comparative Example 5.
  • 1 is a liquid chromatogram obtained by analysis of amines in Example 4.
  • 1 is a liquid chromatogram obtained by analysis of an amine in Comparative Example 6.
  • 1 is a liquid chromatogram obtained by analysis of amines in Example 5.
  • 1 is a liquid chromatogram obtained by analysis of an amine in Comparative Example 7.
  • 1 is a liquid chromatogram obtained by analysis of amines in Example 6.
  • 1 is a liquid chromatogram obtained by analysis of an amine in Comparative Example 8.
  • 1 is a liquid chromatogram obtained by analysis of an amine in Comparative Example 9.
  • 1 is a liquid chromatogram obtained by analysis of amines in Example 7.
  • 1 is a liquid chromatogram obtained by analysis of an amine in Comparative Example 10.
  • 1 is a liquid chromatogram obtained by analysis of amines in Example 8.
  • 1 is a liquid chromatogram obtained by analysis of an amine in Comparative Example 11.
  • 1 is a liquid chromatogram obtained by analysis of amines in Example 9.
  • 1 is a liquid chromatogram obtained by analysis of amines in Example 10.
  • 1 is a liquid chromatogram obtained by analysis of amines in Example 11.
  • 1 is a liquid chromatogram obtained by analysis of amines in Example 12.
  • 1 is a liquid chromatogram obtained by analysis of amines in Example 13.
  • 1 is a liquid chromatogram obtained by analysis of amines in Example 14.
  • 1 is a liquid chromatogram obtained by analysis of an amine in Comparative Example 12.
  • 1 is a liquid chromatogram obtained by analysis of amines in Example 15.
  • 1 is a liquid chromatogram obtained by analysis of an amine in Comparative Example 13.
  • 1 is a liquid chromatogram obtained by analysis of amines in Example 16.
  • 1 is a liquid chromatogram obtained by analysis of an amine in Comparative Example 14.
  • 1 is a liquid chromatogram obtained by analysis of amines in Example 17.
  • 1 is a liquid chromatogram obtained by analysis of amines in Example 18.
  • 1 is a liquid chromatogram obtained by analysis of amines in Example 19.
  • 1 is a mass spectrum obtained by mass spectrometry of the amine in Example 20.
  • 1 is a mass spectrum obtained by mass spectrometry of the amine in Example 21.
  • 1 is a mass spectrum obtained by mass spectrometry of the amine in Example 22.
  • 1 is a mass spectrum obtained by mass spectrometry of the amine in Example 23.
  • 1 is a mass spectrum obtained by mass spectrometry of the amine in Example 24.
  • the method for separating an amine comprises: A stationary phase comprising at least one of an oligosaccharide, a polysaccharide, and a derivative thereof; a mobile phase comprising one or more specific acids selected from the group consisting of oxalic acid, acetic acid, formic acid, and trifluoroacetic acid, one or more bases, and a solvent; and isolating the amine by chromatography using where A is a value calculated for each specific acid contained in the mobile phase by the following formula (1), SA is a total value of A calculated for each specific acid, B is a value calculated for each base contained in the mobile phase by the following formula (2), and SB is a total value of B calculated for each base, and SB/SA is 0.05 or more and 0.95 or less.
  • Formula (1): A valence of specific
  • the above-mentioned amine separation method may include a step other than the above-mentioned separation step, such as an analysis step of analyzing (e.g., identifying) the separated amine, a quantification step of quantifying the separated amine, a step of predicting the structure of the separated amine, or a recovery step of recovering the separated amine.
  • the mobile phase in the above embodiment is a mobile phase before it contains the amines to be separated, and the "amine content in the mobile phase" is the amine content in the mobile phase before it contains the amines to be separated.
  • an oligosaccharide is a sugar having five or more sugar residues.
  • oligosaccharides and polysaccharides can be distinguished by molecular weight, with those with a molecular weight of 3,000 or less being considered oligosaccharides and those with a molecular weight of more than 3,000 being considered polysaccharides.
  • a specific acid includes both a free acid and an acid anion
  • a specific base includes both a free acid and a cation.
  • an acid anion and a cation may form a salt with each other or with other ions.
  • oligosaccharide/polysaccharide derivatives oligosaccharides, polysaccharides, and their derivatives (hereinafter collectively referred to as "oligosaccharide/polysaccharide derivatives") and a mobile phase containing one or more specific acids selected from the group consisting of oxalic acid, acetic acid, formic acid, and trifluoroacetic acid, one or more bases, and a solvent, and further adjusting the content of these acids and bases, the separation performance of amines can be improved.
  • the inventors have found that by adding a base to the mobile phase at a molar concentration lower than the molar concentration (content) of the acid, and neutralizing a portion of the acid to convert it into a salt, the concentration of the counter anion in the mobile phase can be adjusted to a preferred level even if the acid is a weak acid. Furthermore, based on the above-described mechanism discovered by the inventors, the inventors have further investigated the type of acid, and the contents of acid and amine, and as a result have found that the configuration according to the above-described embodiment can improve the separation performance of amines, specifically, can ensure sufficient retention time of the analyte in chromatography.
  • the present inventors have further studied and found that when the stationary phase is acidic and causes non-specific adsorption of the sample amine, for example, when the stationary phase contains silica gel as a carrier, a phenomenon called peak tailing, which is thought to be caused by the silanol group, often occurs.
  • the above-mentioned aspect of the present embodiment can improve the separation performance of the amine, specifically, can make the peak of the chromatogram obtained by analysis sharper. If an ionic interaction occurs between the above-mentioned cation and the conjugated anion of the dissociated silanol, the peak of the chromatogram obtained by analysis will become broad.
  • the present inventors speculate that in the embodiment described here, the presence of excess acid suppresses the dissociation of silanol, thereby suppressing this ionic interaction.
  • the pH of the mobile phase is made high and the sample amine is retained as a neutral molecule in the non-ionic stationary phase.
  • the stationary phase contains silica gel, the silica gel is likely to dissolve under such conditions and the column is likely to deteriorate, so measures are taken to prevent the pH from rising too high by adding a salt with a buffering effect such as ammonium bicarbonate and inserting a guard column, which is cheaper to replace than the main column, before the main column and saturating the mobile phase flowing through the main column with silica, thereby suppressing the elution of silica from the main column.
  • the pH is lowered by the excess acid, so that it is not necessary to take the above-mentioned measures, which is also a major advantage.
  • Non-Patent Document 1 when a separation operation using the mobile phase disclosed in Non-Patent Document 1 is applied to the separation of amines, a non-volatile salt having a high boiling point is added to the mobile phase, and the salt is likely to remain after the solvent in the mobile phase is evaporated, resulting in a decrease in the separation performance of the amines.
  • salts containing an anion of one or more specific acids selected from the group consisting of oxalic acid, acetic acid, formic acid, and trifluoroacetic acid and an amine cation are generated in the mobile phase, but these salts are easily volatilized or thermally decomposed, and therefore high-boiling, non-volatile salts are unlikely to remain even if the solvent is evaporated.
  • the amines to be separated are not particularly limited as long as they are compounds containing an amino group, and may be any of primary amines, secondary amines, and tertiary amines.
  • Specific examples of amines include amino acids such as alanine, cysteine, glutamic acid, methionine, leucine, tyrosine, and tryptophan; amino acid derivatives such as esters and amides of the above amino acids; amino alcohols such as dimethylaminoethanol, propanolamine, methioninol, and norephedrine; phenylethylamine; cyclic amines such as 1-phenyl-1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline; and other basic pharmaceuticals containing an amino group, particularly their enantiomers.
  • the separation method according to this embodiment can achieve high separation performance that distinguishes between molecular shapes, and can therefore separate mixtures of amines that are difficult to separate due to their similar structures into individual amines.
  • Examples of mixtures of amines that are similar in structure include mixtures of chain isomers, mixtures of positional isomers, mixtures of geometric isomers, and mixtures of analogues.
  • the greatest feature is that a mixture of enantiomers can be separated into individual enantiomers by using a chiral stationary phase having an oligosaccharide/polysaccharide derivative with optically active sites as the stationary phase.
  • the stationary phase may contain at least one of oligosaccharides, polysaccharides, and their derivatives (hereinafter, these are also collectively referred to as “oligosaccharide/polysaccharide derivatives") as an adsorbent (also referred to as “separation agent”), and the form in which the oligosaccharide/polysaccharide derivative is contained is not particularly limited.
  • the adsorbent may be a solidified mixture of oligosaccharides/polysaccharide derivatives or oligosaccharide/polysaccharide derivatives and other components, or a mixture of oligosaccharides/polysaccharide derivatives or oligosaccharide/polysaccharide derivatives and other components supported on a carrier.
  • polysaccharides or oligosaccharide derivatives insolubilized by a method such as providing a chemical bond between the carrier, providing a chemical bond between the oligosaccharide/polysaccharide derivative, or providing a polymer-impermeable layer on the surface of the oligosaccharide/polysaccharide derivative are particularly useful.
  • the shape of the stationary phase is not particularly limited, and may be, for example, crushed and amorphous, but is preferably spherical. In this case, it can be used in column chromatography, in which the particles are packed in a column.
  • the oligosaccharide/polysaccharide derivative itself may be granulated, but from the viewpoint of superior efficiency, pressure resistance, and ease of use, it is preferable to support it on a carrier such as porous silica gel. In the case of a porous carrier, only the surface may be porous, and when the oligosaccharide/polysaccharide derivative is supported, it may be distributed near the surface (variously called core-shell, surface porous, or peripheral).
  • the stationary phase is spherical in shape
  • its diameter is not particularly limited, but is preferably 0.5 to 100 ⁇ m, more preferably 0.5 to 50 ⁇ m, and even more preferably 1 to 20 ⁇ m (from the viewpoint of affordability in current chromatography devices). From the viewpoint of amine separation, a smaller diameter is preferable, but when used in a large-scale device for fractionation, a larger diameter is preferable in order to reduce the flow resistance.
  • "spherical” also includes a nearly spherical shape.
  • oligosaccharide/polysaccharide derivative is not particularly limited, and may be, for example, an oligosaccharide/polysaccharide in which a part or all of the hydroxyl or amino groups of an oligosaccharide or polysaccharide (hereinafter, these are also collectively referred to as "oligosaccharide/polysaccharide") are substituted with a substituent.
  • the polysaccharide derivative is, for example, obtained by reacting a part or all of the hydroxyl or amino groups of an oligosaccharide/polysaccharide with another compound, and an example is an oligosaccharide/polysaccharide in which a part or all of the hydroxyl groups of the oligosaccharide/polysaccharide are esterified with an aliphatic carboxylic acid, benzoic acid, or phenylcarbamic acid, which may further contain one or more substituents.
  • an oligosaccharide/polysaccharide in which at least one hydrogen atom contained in a benzene ring is esterified with a benzoic acid or phenylcarbamic acid, each of which is independently substituted with a methyl group or a halogen atom is preferred.
  • the oligosaccharide/polysaccharide derivatives may be used alone or in any combination of two or more.
  • oligosaccharide or polysaccharide that serves as the parent of the oligosaccharide or polysaccharide derivative.
  • the number of sugar residues in an oligosaccharide or polysaccharide is not particularly limited as long as it is 5 or more, and may be, for example, 10 or more, 20 or more, or less than 1,000, 500 or less, 100 or less, 75 or less, or 50 or less.
  • the type of monosaccharide constituting the oligosaccharide/polysaccharide is not particularly limited, and examples thereof include aldotetroses such as erythrose or threose, aldopentoses such as ribose, lyxose, xylose, or arabinose, aldohexoses such as allose, talose, gulose, glucose, altrose, mannose, galactose, or idose, ketotetroses such as erythrulose, ketopentoses such as xylose or ribulose, or ketohexoses such as psicose, fructose, sorbose, or tagatose, etc.
  • glucose, fructose, and glucosamine are preferred as they are highly pure and easily available as raw materials.
  • These monosaccharides may be used alone or in combination of two or more.
  • examples of polysaccharides include amylose, amylopectin, glycogen, cellulose, curdlan, paramylon, chitin, chitosan, dextran, nigeran, agarose, carrageenan, heparin, alginic acid, hyaluronic acid, pectin, xyloglucan, xylan, glucomannan, and levan.
  • cellulose, amylose, chitin, chitosan, curdlan, schizophyllan, agarose, and the like are preferred from the viewpoints of excellent separation performance, high purity, and easy availability.
  • Amylose and amylopectin may be used alone, or may be used in a form containing both, such as starch.
  • oligosaccharide/polysaccharide derivatives having optically active sites are preferred.
  • the amount of oligosaccharide/polysaccharide derivatives in the stationary phase is not particularly limited, and can be appropriately set with reference to known methods in which oligosaccharide/polysaccharide derivatives are used as separation agents in the stationary phase.
  • the content of oligosaccharide/polysaccharide derivatives in the stationary phase may be 100% by mass, and when the above-mentioned carriers are used, it is preferably 5% by mass or more and 50% by mass or less, more preferably 5% by mass or more and 30% by mass or less, and even more preferably 10% by mass or more and 30% by mass or less.
  • the embodiment containing oligosaccharide/polysaccharide derivatives is not particularly limited, and the oligosaccharide/polysaccharide derivative or the oligosaccharide/polysaccharide derivative itself may be made into particles, porous particles, or porous monoliths as necessary, a solidified mixture of oligosaccharide/polysaccharide derivatives or oligosaccharide/polysaccharide derivatives and other components may be used, or a mixture of oligosaccharide/polysaccharide derivatives or oligosaccharide/polysaccharide derivatives and other components supported on a carrier may be used, but an oligosaccharide/polysaccharide derivative or a mixture of oligosaccharide/polysaccharide derivatives and other components supported on a carrier is preferred, and an oligosaccharide/polysaccharide derivative supported on a carrier is more preferred.
  • a known method can be adopted, and it may be physical supporting or chemical supporting.
  • the chemical supporting for example, a method in which the oligosaccharide/polysaccharide derivative is supported on the carrier by a chemical bond such as a covalent bond can be preferably adopted.
  • a method in which a reactive group is introduced into the oligosaccharide/polysaccharide derivative, the raw material of the oligosaccharide/polysaccharide derivative, or the intermediate of the oligosaccharide/polysaccharide derivative, and this substituent is reacted with the reactive group present on the carrier surface can be mentioned.
  • a treatment for providing a chemical bond between the oligosaccharide/polysaccharide derivative may be carried out.
  • the reactive group present on the carrier surface may be a group present on the surface of an untreated carrier, or may be a group introduced on the carrier surface by surface treating the carrier with a surface treatment agent, for example, a silane coupling agent such as 3-aminopropyltriethoxysilane and 3-glycidyloxypropyltrimethoxysilane.
  • a method in which a pair of so-called click reaction is respectively bound to the stationary phase and the oligosaccharide/polysaccharide derivative and reacted with each other can also be mentioned.
  • an insolubilized layer can be formed on the surface of the carrier by forming a so-called cross-linking bond between atomic groups containing the oligosaccharide/polysaccharide derivative.
  • the oligosaccharide/polysaccharide derivative may be supported on the carrier by, for example, a method of impregnating silica gel with a solution of the oligosaccharide/polysaccharide derivative and evaporating it to physically adsorb (e.g., coat) the oligosaccharide/polysaccharide derivative onto the carrier.
  • the oligosaccharide/polysaccharide derivative from the viewpoint of suppressing dissolution of the oligosaccharide/polysaccharide derivative in the solvent, it is preferable to insolubilize the oligosaccharide/polysaccharide derivative by forming some kind of chemical bond between the silica gel and the oligosaccharide/polysaccharide derivative backbone, or by forming some kind of chemical bond between the oligosaccharide/polysaccharide derivative on the carrier. Note that, in order to suppress dissolution of the oligosaccharide/polysaccharide derivative in the solvent, it is preferable to provide a chemical bond between the oligosaccharide/polysaccharide derivative even when a carrier is not used.
  • the carrier is not particularly limited as long as it can immobilize oligosaccharide/polysaccharide derivatives on the carrier.
  • the carrier may be an inorganic carrier or an organic carrier, but is preferably an inorganic carrier.
  • inorganic carriers include silica gel, alumina, magnesia, glass, kaolin, titanium oxide, silicate, zirconia, and hydroxyapatite.
  • organic carriers include cross-linked polystyrene, cross-linked poly(meth)acrylamide, cross-linked poly(meth)acrylate, and polysaccharide.
  • Hybrid silica gels in which a polyfunctional silane coupling agent is copolymerized when forming silica gel can also be used. It is preferable that these organic carriers are insolubilized by being cross-linked with a cross-linking agent.
  • the shape of the carrier is not particularly limited, and examples include particles and porous cylinders (monoliths) that are liquid-tightly contained in a column tube.
  • the inner wall of a capillary can also be used as a carrier. If the separation factor is sufficiently large, a membrane-type carrier can be used and developed in the thickness direction, or it can be developed in the surface direction as thin-layer chromatography.
  • the carrier is preferably silica gel.
  • silica gel has the above-mentioned characteristics, i.e., excellent separation performance, and is hard and durable.
  • so-called core-shell type silica gel may be used, and silica gel with a chemically modified surface may also be used.
  • the mobile phase comprises one or more specific acids selected from the group consisting of oxalic acid, acetic acid, formic acid, and trifluoroacetic acid, one or more bases, and a solvent.
  • the mobile phase may contain components other than the above components as long as the components do not impair the separation performance.
  • the mobile phase is preferably a homogeneous system (single-phase system) at least under the conditions for carrying out the analysis.
  • the term “mobile phase” refers to a liquid that is poured into the stationary phase together with the material to be separated in chromatography such as liquid chromatography and supercritical fluid chromatography, moves together with the material to be separated, and then elutes the separated material from the stationary phase.
  • the salt content in the mobile phase is not particularly limited, but from the viewpoint of ensuring the desired separation performance, it is preferably 0.5 mmol/L to 1000 mmol/L, more preferably 1 mmol/L to 200 mmol/L, even more preferably 1 mmol/L to 50 mmol/L, and particularly preferably 1 mmol/L to 20 mmol/L.
  • MS mass spectrometry
  • the content of high-boiling point salts is low.
  • high-boiling point salts include salts containing metal ions as cations or salts containing quaternary ammonium ions.
  • the content of the salt is preferably 5 mM or less, and more preferably substantially absent (below the detection limit).
  • the mobile phase contains one or more specific acids selected from the group consisting of oxalic acid, acetic acid, formic acid, and trifluoroacetic acid. Of these, it is preferable that at least one or more acids selected from the group consisting of oxalic acid and trifluoroacetic acid are included because of their relatively high acidity.
  • oxalic acid is included as a specific acid, since it does not have such a tendency, is easily decomposed into low molecular weight carbon monoxide, carbon dioxide, and water at the temperature of the MS detector, is unlikely to adversely affect MS analysis, and is obtained inexpensively as easy-to-handle dihydrate crystals that are not hygroscopic.
  • These acids may be one type alone, or may be a combination of any two or more types in any ratio.
  • other acids may be included within the range in which the effects of the present disclosure can be obtained.
  • oxalic acid has the advantage that it can be separated by precipitation using calcium ions when the eluate is separated.
  • a specific acid contained in the mobile phase preferably provides counter ions that promote retention of sample ammonium in the stationary phase in ion pair chromatography by forming a salt in part, and also exists as an acid in part to ensure that the sample amine is converted to an ammonium ion. Since the sample amine is dilute under chromatographic conditions, there is a high probability that it will exist as an ammonium ion even if the mobile phase is nearly neutral, but this can be ensured by using an excess of acid.
  • the content of the specific acid in the mobile phase is preferably 1 mmol/L or more, and is preferably 1000 mmol/L or less, more preferably 200 mmol/L or less, even more preferably 50 mmol/L or less, and particularly preferably 20 mmol/L or less, from the viewpoint of improving the separation performance of the amine. If the content is equal to or greater than the lower limit of the range, the effect of retaining the sample is substantially obtained (however dilute the concentration is, to a greater or lesser extent, but a certain concentration is necessary to obtain a practical effect). If the content is equal to or less than the upper limit of the range, there is no adverse effect on detection, particularly detection by MS. That is, preferred ranges of the content in the mobile phase include, for example, 1 to 1000 mmol/L, 1 to 200 mmol/L, 1 to 50 mmol/L, and 1 to 20 mmol/L.
  • acids other than the specific acid examples include methanesulfonic acid, nitric acid, phosphoric acid, glycolic acid, etc., and from the viewpoint of being less likely to form a high-boiling point non-volatile salt, organic acids such as nitric acid or glycolic acid are preferred, and from the viewpoint of being less corrosive to the equipment, sulfonic acids, phosphoric acid, and organic acids are preferred.
  • These acids other than the specific acid may be one type alone or a combination of any two or more types in any ratio.
  • the mobile phase contains a base.
  • a base with a molar concentration smaller than that of the specific acid is added to neutralize a part of the specific acid.
  • the base include metals, hydroxides, and carbonates of quaternary ammonium.
  • the salt may be a salt of an acid weaker than the specific acid, and is preferably an amine. When it is an amine, it dissociates into the specific acid and the amine by heat and volatilizes, so that it does not inhibit detection by mass spectrometry (MS). Note that since the mobile phase is an environment of excess acid, the base basically exists as a salt in the mobile phase.
  • the base is contained so as to satisfy the condition that, when the value calculated for each specific acid contained in the mobile phase by the following formula (1) is A, the total value of A calculated for each specific acid is SA, the value calculated for the base contained in the mobile phase by the following formula (2) is B, and the total value of B calculated for each base is SB, SB/SA is 0.05 or more and 0.95 or less.
  • the valence of acetic acid is 1, the valence of formic acid is 1, and the valence of trifluoroacetic acid is 1.
  • the valence of oxalic acid can be 1 or 2, but since there is a difference of 10 ⁇ 3 between the first-stage and second-stage dissociation constants, it is assumed that the second-stage dissociation occurs only to a negligible extent under the conditions of the present disclosure in which the amount of base is smaller than the number of moles of acid ( ⁇ 0.095), and therefore, in the present disclosure, it is treated as 1.
  • the valence of each of the specific acids is 1, and therefore the above formula (1) can also be expressed by the following formula (1)'.
  • Formula (1)': A molar concentration of a specific acid (mol/L)
  • the above SB/SA is not particularly limited as long as it is 0.05 or more and 0.95 or less, but from the viewpoint of improving the separation performance of amines, it is preferably 0.1 or more, more preferably 0.2 or more, and even more preferably 0.4 or more, and from the viewpoint of reducing the acidity of the system and possibly causing the sample amines to not be completely ionized, it is preferably 0.9 or less, and more preferably 0.7 or less.
  • preferred ranges of content in the mobile phase include, for example, 0.1 to 0.9, 0.2 to 0.7, and 0.4 to 0.7.
  • the mobile phase contains X1 mol/L of acetic acid (valence: 1) as a specific acid and Y1 mol/L of triethylamine (valence: 1) as a base
  • An acid having a degree of dissociation smaller than that of the specific acid may be contained at any concentration, but when an acid having a degree of dissociation larger than that of the specific acid is contained, this acid will preferentially consume the "base", so the above SB/SA may be calculated by regarding SB as (above SB) - (valence of acid having a degree of dissociation larger than that of the specific acid contained in the mobile phase) x (concentration (mol/L) of acid having a degree of dissociation larger than that of the specific acid contained in the mobile phase).
  • the second term is multiplied by the number of charges up to the stage having a degree of dissociation larger than that of the "specific acid".
  • the above dissociation degree is the degree of dissociation in water at 25° C. This dissociation degree is described in, for example, “pKa Data Compiled by R. Williams” published by the American Chemical Society.
  • Another embodiment of the present disclosure is an embodiment in which the above SB/SA is set taking into consideration only the concentrations of a specific acid and base.
  • the above formulas (1) and (2) are replaced with the following formulas (1)" and (2)", respectively.
  • the valence of oxalic acid is treated as 1 or 2.
  • the valence when oxalic acid exists as a monovalent acid, the valence is 1, and when oxalic acid exists as a divalent acid, the valence is 2.
  • the conditions of the above-mentioned embodiment can be applied in the same way.
  • the type of amine is not particularly limited, and examples include ammonia, primary amines, secondary amines, and tertiary amines, and it is preferable that the amine is one or more types selected from the group consisting of ammonia, primary amines, secondary amines, and tertiary amines.
  • the amine may be one type alone or a combination of any two or more types in any ratio.
  • primary amines examples include primary amines having an alkyl group.
  • preferred examples include monoalkylamines such as methylamine, ethylamine, n-propylamine, 2-propylamine, and butylamine.
  • Secondary amines include, for example, secondary amines each having two independent alkyl groups.
  • preferred examples include non-cyclic dialkylamines such as dimethylamine, diethylamine, diisopropylamine, and dibutylamine; and cyclic amines such as N-unsubstituted pyrrolidine and N-unsubstituted piperidine.
  • tertiary amines include tertiary amines each having three independent alkyl groups.
  • preferred examples include non-cyclic trialkylamines such as trimethylamine, triethylamine, diisopropylethylamine, and tributylamine; and cyclic trialkylamines such as N-substituted pyrrolidine, N-substituted piperidine, and 1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane.
  • the number of carbon atoms in the alkyl group bonded to each of the above amines is not particularly limited, but those with small molecular weights have the problem of being highly volatile and difficult to handle, and those with large molecular weights are likely to cause noise in MS detection, so the number may be 1 or more, 2 or more, 3 or more, 10 or less, 8 or less, or 6 or less, and in particular, 1 to 4 is preferable, and 1 to 2 is more preferable.
  • primary to tertiary ammonium ions with small alkyl group carbon numbers have small molecular weights, so when chromatography is performed by LC-MS, ions with masses close to the amines to be separated are unlikely to be generated, and noise is reduced.
  • triethylamine is convenient for the analysis of samples with molecular weights exceeding 200, taking ease of handling into consideration.
  • ammonia is used as a base, the solubility of its salt in organic solvents is generally low, so amines with alkyl substituents may be more advantageous.
  • the substituents bonded to the N-substituted pyrrolidine, N-substituted piperidine, or N,N-disubstituted pyrrolidine, N,N-disubstituted piperidine are not particularly limited, but are preferably alkyl groups, and the conditions for the alkyl group can be the same as those for the alkyl groups bonded to the above-mentioned amines. This is because, as mentioned above, in LC-MS, it is preferable for the molecular weight of the ammonium ion to be small.
  • the amine is preferably at least one selected from the group consisting of ammonia, ethylamine, n-propylamine, 2-propylamine, dimethylamine, diethylamine, trimethylamine, triethylamine, pyrrolidine, and piperidine, and more preferably at least one selected from the group consisting of ammonia, diethylamine, triethylamine, and 2-propylamine, for reasons such as a low boiling point, ease of availability, applicability to UV detection, volatility, and a small molecular weight that makes it unlikely to interfere with MS detection.
  • an alkali metal such as lithium, sodium, or potassium, or other metals can be used.
  • the method of using a specific acid and a base that partially neutralizes the acid is the simplest method of preparing the mobile phase according to this embodiment, but an equivalent mobile phase can also be obtained by adding a salt of the specific acid and the specific acid, and the preparation method is not limited to this method.
  • the specific acid added here does not necessarily have to be a specific acid corresponding to the salt, and may be any one or more selected from the group consisting of oxalic acid, acetic acid, formic acid, and trifluoroacetic acid.
  • the solvent contained in the mobile phase in this embodiment is not particularly limited as long as it can dissolve the amines to be separated and various components such as specific acids, and water or a liquid other than water (hereinafter sometimes referred to as a "nonaqueous solvent”) can be used.
  • nonaqueous solvent include organic solvents (water content: 0% by volume), and subcritical or supercritical carbon dioxide.
  • the solvent contained in the mobile phase include water only; nonaqueous solvent only; a mixed solvent of water and a nonaqueous solvent, pressurized carbon dioxide and a nonaqueous solvent, and a mixed solvent containing a trace amount of water as necessary.
  • the two or more kinds of solvents are preferably a combination of solvents that do not cause phase separation under the separation conditions of the amine.
  • a solvent having low polarity that is, a so-called normal phase solvent
  • a mixture of a more polar alcohol, ester, ether, nitrile, halogenated hydrocarbon, etc. with a hydrocarbon such as hexane or heptane, or a mixture of water to the extent that it dissolves uniformly therein can be preferably used.
  • supercritical fluid chromatography which is called subcritical or supercritical carbon dioxide
  • the organic solvent is not particularly limited, but is preferably an organic solvent capable of dissolving the amine to be separated.
  • Suitable organic solvents include, for example, acetonitrile, acetone, tetrahydrofuran (THF), tert-butyl methyl ether, methanol, ethanol, n-propanol, 2-propanol, dimethyl sulfoxide (DMSO), dimethylformamide (DMF), or dimethylacetamide (DMAc).
  • the organic solvent may contain a hydrocarbon such as hexane, hexane, or heptane; or a halogenated hydrocarbon such as dichloromethane; etc.
  • the organic solvent preferably contains one or more selected from the group consisting of acetonitrile, acetone, methanol, ethanol, 2-propanol, hexane, heptane, THF, and tert-butyl methyl ether, and more preferably acetonitrile. It is particularly preferable that the solvent contained in the mobile phase contains 70% or more by volume of acetonitrile.
  • the organic solvent may be one type alone or a combination of any two or more types in any ratio.
  • the organic solvent may be a mixture of an alcohol and a hydrocarbon having 5 to 8 carbon atoms, which is commonly used in chromatography.
  • An example of such a mixture is a hexane/ethanol mixture that is compatible with water. If the organic solvent has a hexane/ethanol mixing ratio of, for example, 100/100 (v/v), it is possible to prepare a mixed solvent with a water content of about 10% by volume. The addition of water slightly reduces retention, but increases the peak plate number and improves the time efficiency of analysis. Hexane/ethanol/methanol also give good peak plate numbers in the compatible range.
  • a mixture of alcohol and a hydrocarbon with 5 to 8 carbon atoms has low viscosity, making it possible to achieve high flow rates at low pressures in chromatography, and also has low UV absorption, making it possible to detect amines by UV absorption.
  • the chromatography is performed by a supercritical fluid chromatograph.
  • a mixed solvent of water and an organic solvent, or an organic solvent (water content 0 volume %) as an auxiliary solvent in combination with the subcritical or supercritical carbon dioxide so that the target component can be dissolved in the mobile phase at the target concentration.
  • the organic solvent here has the same meaning as the organic solvent listed as the non-aqueous solvent.
  • the mixed solvent of water and an organic solvent as the auxiliary solvent and the organic solvent are preferably exemplified by a mixed solvent of water and methanol, or methanol, respectively.
  • the volume of the solvent is calculated based on the density of liquid carbon dioxide at -20°C, which is 1.030 g/mL, for convenience.
  • solvents have been explained above, but from the standpoints of low viscosity, transparency to ultraviolet light (in the case of ultraviolet light detection, which is the most commonly used method), non-high toxicity and danger, low cost, and the tendency of chiral stationary phases made of polysaccharide derivatives to provide good separation, it is preferable to use one or more solvents selected from the group consisting of water, acetonitrile, ethanol, methanol, 2-propanol, hexane, heptane, THF, and liquid carbon dioxide.
  • the content of the solvent in the mobile phase (the total content when two or more types are included) is not particularly limited and can be set appropriately depending on the application. For example, it may be 90% by mass or more, 95% by mass or more, 98% by mass or more, 99% by mass or more, less than 100% by mass, 99.9% by mass or less, or 99.5% by mass or less.
  • the mobile phase may contain remaining components other than the specific acids and bases described above.
  • an example of the mixing ratio of each component when the solvent is a ternary mixture is described below.
  • An example of a reverse phase solvent is a mixture of acetonitrile, alcohols, and THF containing 50% by volume or more of water, and a water content of 70% by volume or more is preferable to provide good separation.
  • An example of a normal phase solvent is a mixture containing 40% by volume or more of hexane and/or heptane, with the remainder being 2-propanol or ethanol, and a small amount of water.
  • the mobile phase may contain components other than the above-mentioned components (other components) within the range in which the effects of the present disclosure can be obtained.
  • components that give non-volatile salts are not preferable.
  • the mobile phase can be prepared by a known solution preparation method or a method similar to a known solution preparation method, for example, a method of mixing the above-mentioned components.
  • a known method is to form a salt from an acid and a base and use it to prepare the mobile phase.
  • the expression "containing an acid and a base” is used, but both may literally be dissolved in an appropriate amount in the mobile phase solvent.
  • substantially the same mobile phase can be obtained by dissolving the acid and the salt of the acid and the base in the mobile phase solvent.
  • This method of preparing the mobile phase by contacting the acid and the base in a solvent rather than directly contacting them is preferable in that it is simple and can avoid problems caused by neutralization heat such as evaporation of some components.
  • a highly volatile amine such as ammonia
  • a solvent such as water may be used, and the composition of the mobile phase solvent may be corrected as necessary.
  • a salt of a weak acid such as a carbonate or hydrogen carbonate as a precursor.
  • the weak acid by-product here does not have a significant effect on retention whether it remains in the mobile phase as it is or is gasified and volatilized.
  • the mobile phase can be prepared by dissolving the commercially available product in a solvent and mixing it with an acid to adjust the acidity as necessary.
  • the need to adjust the acidity arises when the retention of the sample amine is insufficient or the peak shape is undesirable.
  • the chromatography used in this embodiment is not particularly limited, and examples thereof include liquid chromatography, supercritical fluid chromatography, etc.
  • the form of the chromatography is also not particularly limited, and any known form can be adopted, and not only column chromatography but also thin layer chromatography, chromatography provided with a layer formed by depositing a fibrous adsorbent, or chromatography using a capillary or microchannel in which a thin layer of an adsorbent layer is provided in some form on the inner wall of a thin tube, etc. can be adopted.
  • the chromatography can be carried out using a commercially available chromatograph, such as a liquid chromatograph or a supercritical fluid chromatograph, etc.
  • the column equilibration conditions, flow rate, and other conditions can be appropriately selected depending on the column size, sample volume, type of mobile phase, and the like.
  • the amine separation method according to this embodiment may further include an analysis step of analyzing the amine separated in the separation step.
  • the method for detecting amines in chromatography is not particularly limited, the method according to the present embodiment includes a method using a mass spectrometer.
  • the formation of volatile salts can be promoted by appropriately selecting an additive, and therefore, it is a great advantage that a mass spectrometer can be used as an analyzer.
  • Amine separation and analysis may be performed using the same device, or each device may be performed using a separate device.
  • amine separation and mass analysis of the separated amines can be performed consecutively using liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS), which combines liquid chromatography with mass spectrometry (MS).
  • LC-MS liquid chromatography-mass spectrometry
  • MS mass spectrometry
  • the mass analysis of the amines may be a quantitative or qualitative analysis of the separated amines.
  • a UV detector may be used alone, or even more information can be obtained by using a mass analyzer in combination.
  • the ionization method in mass analysis can be appropriately selected from atmospheric pressure chemical ionization (APCI), atmospheric pressure photoionization (APPI), electrospray (ESI), fast atom bombardment (FAB), thermospray (TSP), etc., depending on the type of salt, type of acid, type of amine, and the purpose of analysis.
  • the mass detector can be appropriately selected from quadrupole mass spectrometers (Q-MS), ion trap mass spectrometers (IT-MS), time-of-flight mass spectrometers (TOF-MS), etc., depending on the required sensitivity and resolution.
  • Example 1 [Preparation of mobile phase] 1260 mg of oxalic acid dihydrate was weighed and transferred to a 1000 mL volumetric flask. Water and acetonitrile were weighed out in a ratio of 800.0 g and 156.6 g, respectively, into this volumetric flask, and about 20 mL of the mixed solvent (volume ratio 80/20) was added, and then 506 mg of triethylamine was added. Then, the above water/acetonitrile (80/20 (v/v)) mixed solvent was added to the volumetric flask, and the mobile phase was obtained by stirring until no undissolved matter remained.
  • the solvent was weighed to the nearest 0.1 g and the additives were weighed to the nearest 1 mg, and the concentrations were calculated based on this.
  • the density of water was 1.00 g/mL, and the density of acetonitrile was 0.783 g/mL.
  • the amine to be separated represented by the following formula (3) (“Pindolol” manufactured by USP), was dissolved in a water/acetonitrile (1/1 (v/v)) mixed solvent to a concentration of about 1 mg/mL, and 2 ⁇ L of the obtained solution was injected into the column by an autosampler. The mobile phase was pumped at 0.43 mL/min to the column, the temperature of which was adjusted to 30° C. Details of the amine separation and analysis methods are given below.
  • Example 2 The same procedure as in Example 1 was carried out except that oxalic acid dihydrate was not used and that ammonium bicarbonate (AHC) and diethylamine (DEA) were used instead of triethylamine, to prepare a mobile phase having an AHC content of 10.0 mmol/L and a DEA content of 15.5 mmol/L, respectively. Separation and analysis of the amine represented by the above formula (3) were carried out in the same manner as in Example 1, except that the above mobile phase was used as the mobile phase and a guard column described in the notes at the end of Table 1 was inserted before the CHIRALPAK IB-N column (only in this Comparative Example). The results are shown in Figure 3.
  • AHC ammonium bicarbonate
  • DEA diethylamine
  • the amine represented by the above formula (3) was separated and analyzed in the same manner as in Example 1, except that the above mobile phase was used as the mobile phase. The results are shown in Figure 5.
  • Example 4 The same procedure as in Example 2 was carried out except that oxalic acid dihydrate was not used and diethylamine ("DEA" in Table 1) was used instead of triethylamine, to prepare a mobile phase with a DEA content of 10.0 mmol/L.
  • DEA diethylamine
  • the amine represented by the above formula (3) was separated and analyzed in the same manner as in Example 1, except that the above mobile phase was used as the mobile phase. The results are shown in Figure 6.
  • Example 3 As the column, a column packed with a chiral stationary phase in which cellulose tris(3-chloro-4-methylphenylcarbamate) was supported on silica gel (CHIRALPAK IM (manufactured by Daicel Corporation, registered trademark), average packing diameter 5 ⁇ m, length 250 mm, inner diameter 4.6 mm ⁇ ) was used, and separation and analysis of the amine to be analyzed were carried out in the same manner as in Example 2, except that the amine to be analyzed was changed to an amine represented by the following formula (4): The results are shown in Figure 7.
  • CHIRALPAK IM manufactured by Daicel Corporation, registered trademark
  • Example 4 The amine to be analyzed was separated and analyzed in the same manner as in Example 2, except that the object to be analyzed was changed to an amide of phenylglycine represented by the following formula (5).
  • C 6 H 5 -CH(NH 2 )-CONH 2 manufactured by Tokyo Kasei
  • the results are shown in Figure 9.
  • the amine represented by the above formula (4) was separated and analyzed in the same manner as in Example 3, except that the above mobile phase was used as the mobile phase, and a column packed with a chiral stationary phase in which amylose tris (3-chlorophenylcarbamate) was supported on silica gel (CHIRALPAK ID (manufactured by Daicel Corporation, registered trademark), average packing diameter 5 ⁇ m, length 250 mm, inner diameter 4.6 mm ⁇ ) was used as the column. The results are shown in Figure 11.
  • CHIRALPAK ID manufactured by Daicel Corporation, registered trademark
  • Example 7 The same procedure as in Example 5 was carried out except that oxalic acid dihydrate and triethylamine were not added, to prepare a mobile phase containing 0 mmol/L of OXA and 0 mmol/L of TEA, respectively.
  • the amine represented by the above formula (4) was separated and analyzed in the same manner as in Example 5, except that the above mobile phase was used as the mobile phase. The results are shown in Figure 12.
  • Example 6 The amine represented by the above formula (4) was separated and analyzed in the same manner as in Example 5, except that a column packed with a chiral stationary phase in which amylose tris (3,5-dichlorophenylcarbamate) was supported on silica gel (CHIRALPAK IE (manufactured by Daicel Corporation, registered trademark), average packing diameter 5 ⁇ m, length 250 mm, inner diameter 4.6 mm ⁇ ) was used.
  • the amine represented by the above formula (4) was separated and analyzed in the same manner as in Example 5, except that the above mobile phase was used as the mobile phase. The results are shown in Figure 13.
  • Example 8 The same procedure as in Example 6 was carried out except that oxalic acid dihydrate and triethylamine were not added, and a mobile phase containing OXA and TEA at concentrations of 0 mmol/L and 0 mmol/L, respectively, was prepared.
  • the amine represented by the above formula (4) was separated and analyzed in the same manner as in Example 6, except that the above mobile phase was used as the mobile phase. The results are shown in Figure 14.
  • AN stands for acetonitrile
  • OxA stands for oxalic acid
  • TEA triethylamine
  • AHC ammonium bicarbonate
  • DEA diethylamine
  • Example 1 By comparing Example 1 with Comparative Examples 1 and 3, Example 5 with Comparative Example 7, and Example 6 with Comparative Example 8, it can be seen that even when the same solvent is used, if nothing is added, peak tailing is generally severe and the degree of separation is low, or the chromatogram obtained is unstable due to the column history before and after (Comparative Examples 1 and 3 use the same mobile phase, but are sandwiched between Example 1 and Comparative Example 2, respectively), but stable retention and separation can be obtained by using the mobile phase according to the embodiment of the present disclosure.
  • Comparative Example 9 is a separation using a mobile phase in which only oxalic acid was added, but the peak shape and separation are clearly poorer than those of Example 2.
  • Comparative Example 2 is one such condition, and uses an alkaline mobile phase.
  • the peak width is larger than in Example 1, and the time efficiency of separation is poor.
  • a mobile phase that is more basic for a stationary phase containing silica gel it is necessary to prevent deterioration of the column by inserting a guard column (pre-column) containing silica gel, and the same method is used in this comparative example.
  • the peak shape became abnormal in Comparative Example 3 after this analysis, indicating that a history was left in the column.
  • TFA trifluoroacetic acid
  • the amine represented by the above formula (3) was separated and analyzed in the same manner as in Example 1, except that the above mobile phase was used as the mobile phase. The results are shown in Figure 15.
  • the amine represented by the above formula (3) was separated and analyzed in the same manner as in Example 1, except that the above mobile phase was used as the mobile phase. The results are shown in Figure 16.
  • the amine represented by the above formula (3) was separated and analyzed in the same manner as in Example 1, except that the above mobile phase was used as the mobile phase. The results are shown in Figure 18.
  • TFA trifluoroacetic acid
  • Example 7 By comparing Example 7 with Comparative Example 9, and Example 8 with Comparative Example 10, it can be seen that the degree of separation is improved when SB/SA is 0.05 or more and 0.95 or less.
  • Example 11 A mobile phase was prepared in the same manner as in Example 1, except that AcOH was used instead of OxA so that the content of acetic acid (AcOH) in the mobile phase was 10.0 mol/L, and TEA was not used.
  • the amine represented by the above formula (3) was separated and analyzed in the same manner as in Example 1, except that the above mobile phase was used as the mobile phase. The results are shown in Figure 19.
  • Example 9 A mobile phase (TEA content: 5.0 mol/L) was prepared in the same manner as in Example 1, except that AcOH was used instead of OxA so that the AcOH content in the mobile phase was 10.0 mol/L.
  • the amine represented by the above formula (3) was separated and analyzed in the same manner as in Example 1, except that the above mobile phase was used as the mobile phase. The results are shown in Figure 20.
  • Example 10 A mobile phase was prepared in the same manner as in Example 9, except that ammonium acetate (NH 4 OAc) was used instead of TEA so that the content of NH 4 OAc in the mobile phase was 5.0 mol/L.
  • the amine represented by the above formula (3) was separated and analyzed in the same manner as in Example 1, except that the above mobile phase was used as the mobile phase. The results are shown in Figure 21.
  • the amine represented by the above formula (3) was separated and analyzed in the same manner as in Example 1, except that the above mobile phase was used as the mobile phase. The results are shown in Figure 22.
  • the amine represented by the above formula (3) was separated and analyzed in the same manner as in Example 1, except that the above mobile phase was used as the mobile phase. The results are shown in Figure 23.
  • Example 13 The amine to be analyzed was separated and analyzed in the same manner as in Example 12, except that the amine to be analyzed was changed to an amine represented by the following formula (6) (1-phenyl-1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline). The results are shown in Figure 24.
  • Example 14 A mobile phase was prepared in the same manner as in Example 12, except that AcOH was used so that the content of AcOH in the mobile phase was 10.0 mol/L, and NH 4 OAc was used so that the content of NH 4 OAc in the mobile phase was 10.0 mol/L.
  • the amine represented by the above formula (3) was separated and analyzed in the same manner as in Example 1, except that the above mobile phase was used as the mobile phase. The results are shown in Figure 25.
  • ammonium acetate was added as a base instead of ammonia. Therefore, in addition to the acetic acid added as an acid, the mobile phase also contains acetic acid that is generated by dissociation of ammonium acetate. Therefore, when a molar ratio of acetic acid:ammonium acetate is used at 1:1, the molar ratio of acetic acid:ammonia in the mobile phase is 2:1, and SB/SA is 0.5.
  • the amine represented by the above formula (3) was separated and analyzed in the same manner as in Example 1, except that the above mobile phase was used as the mobile phase. The results are shown in Figure 26.
  • the amine represented by the above formula (3) was separated and analyzed in the same manner as in Example 1, except that the above mobile phase was used as the mobile phase. The results are shown in Figure 27.
  • Example 16 The amine to be analyzed was separated and analyzed in the same manner as in Example 15, except that the amine to be analyzed was changed to the amine represented by the above formula (6) (phenyl- ⁇ -isoquinoline). The results are shown in Figure 29.
  • Example 15 By comparing Example 15 with Comparative Example 12 and Example 16 with Comparative Example 13, it can be seen that the degree of separation is improved when SB/SA is 0.05 or more and 0.95 or less.
  • Example 14> The same procedure as in Example 2 was carried out except that TEA was not added, to prepare a mobile phase having an OxA content of 10.0 mmol/L.
  • the amine represented by the above formula (3) was separated and analyzed in the same manner as in Example 2, except that the above mobile phase was used as the mobile phase. The results are shown in Figure 30.
  • Example 17 The mobile phase was prepared in the same manner as in Example 2, except that OxA was used so that the content of OxA in the mobile phase was 2.50 mol/L, and TEA was used so that the content of TEA in the mobile phase was 1.25 mol/L.
  • the amine represented by the above formula (3) was separated and analyzed in the same manner as in Example 1, except that the above mobile phase was used as the mobile phase. The results are shown in Figure 31.
  • Example 18 The mobile phase was prepared in the same manner as in Example 2, except that OxA was used so that the content of OxA in the mobile phase was 5.0 mol/L, and TEA was used so that the content of TEA in the mobile phase was 2.5 mol/L.
  • the amine represented by the above formula (3) was separated and analyzed in the same manner as in Example 1, except that the above mobile phase was used as the mobile phase. The results are shown in Figure 32.
  • the amine represented by the above formula (3) was separated and analyzed in the same manner as in Example 1, except that the above mobile phase was used as the mobile phase. The results are shown in Figure 33.
  • HPLC device ACQUITY UPLC H-Class PLUS Ionization method: ESI Measurement mode: Positive ⁇ Probe temperature: 400°C ⁇ Source temperature: 120°C
  • the results are shown in Figure 34.
  • the vertical axis of the graph in the figure represents the maximum value of the highest peak as 100%. This is the same in the following Figures 35 to 38.
  • the detected masses m/z (relative mass of ions divided by their charge) obtained by the above analysis are shown in Table 6 below.
  • Example 21 The mobile phase was prepared in the same manner as in Example 1 above. Separation and analysis of the amine to be analyzed were performed in the same manner as in Example 20, except that the method shown in Example 20 above was used for separation and analysis of the amine, and the analyte was changed to the amine represented by the above formula (6) (1-phenyl-1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline). The results are shown in FIG.
  • Example 22 The mobile phase was prepared in the same manner as in Example 2 above.
  • the amine represented by formula (3) above was separated and analyzed in the same manner as in Example 2, except that the method for separating and analyzing the amine was used as shown in Example 20 above. The results are shown in FIG.
  • Example 23 The mobile phase was prepared in the same manner as in Example 3 above.
  • the amine represented by formula (3) above was separated and analyzed in the same manner as in Example 3, except that the method for separating and analyzing the amine was used as shown in Example 20 above. The results are shown in FIG.
  • Example 24 The mobile phase was prepared in the same manner as in Example 3 above. Separation and analysis of amines were performed in the same manner as in Example 3, except that the method shown in Example 20 above was used for separation and analysis of amines, and the analyte was changed to an amine represented by the following formula (7) (nicardipine). The results are shown in FIG.
  • the amine separation method according to the embodiment of the present disclosure can improve the amine separation performance.
  • the method can be applied to LC-MS by appropriately selecting components contained in the mobile phase from those that can avoid or reduce adverse effects on detection by a mass spectrometer. Therefore, such an amine separation method can be widely applied to analysis and purification by various types of liquid chromatography, and is expected to be used in the fields of organic chemistry, medicine, pharmacology, and the like.

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Abstract

オリゴ糖、多糖、及びこれらの誘導体の少なくともいずれかを含む固定相と、シュウ酸、酢酸、ギ酸、及びトリフルオロ酢酸からなる群から選択される１種以上の特定の酸、１種以上の塩基、並びに溶媒を含む移動相と、を用いてクロマトグラフィーによりアミンを分離する分離工程を含み、前記移動相に含まれる各特定の酸について下記式（１）で算出される値をＡ、各特定の酸で算出された各Ａの合計値をＳＡ、前記移動相に含まれる塩基について下記式（２）で算出される値をＢ、各塩基で算出された各Ｂの合計値をＳＢとした場合において、ＳＢ／ＳＡが、０．０５以上、０．９５以下である、アミンの分離方法。式（１）：Ａ＝特定の酸の価数×特定の酸のモル濃度（ｍｏｌ／Ｌ）式（２）：Ｂ＝塩基の価数×塩基のモル濃度（ｍｏｌ／Ｌ）

Description

アミンの分離方法
　本開示は、アミンの分離方法に関する。
　多糖の誘導体をキラルセレクタとする分離剤（以下、「多糖系ＣＳＰ」とも称する。）は、多くのエナンチオマーや、構造が似ているために一般的な分離剤による分離が困難な物質、たとえば構造異性体などの分離に極めて効果的であることが知られている。これらの多糖系ＣＳＰは一般に吸着剤が中性分子であるため、分析条件においてイオン性であるような試料を分析する場合には、何らかの理由、おそらくは試料イオンが溶媒和されているために分離剤との親和性が低くなっているため、イオン性分子の吸着が静電反発を起こし負荷量を低下させるため、また分離剤の中にごく少量混在するイオン性又は極性の原子団（担体として用いられるシリカゲルに起源するシラノールが多くの場合に問題視される。）が極めて強く相互作用するため、等の理由で、ほとんど保持されなかったり、いちじるしく幅が広い、又は変形した形状のピークを与え、意図した分析ができないことが少なくない。
　非特許文献１には、移動相に適切な塩を添加することにより上記の問題を解決する方法が開示されている。具体的には、試料陽イオンが適切な陰イオンと同時に固定相に保持される、いわゆるイオンペアクロマトグラフィーであると考えられている。
A. Ishikawa, T. Shibata, "Cellulosic Chiral Stationary Phase Under Reversed-Phase Condition", Journal of Liquid Chromatography, 1993, Vol. 16, 859-878
　しかし、非特許文献１に開示されるような移動相を用いた分離操作では、分離対象物質の分離性能が十分でなく、改善の余地が残されていた。
　本開示は、分離性能に優れるアミンの分離方法を提供することを課題とする。
　本発明者らは、鋭意検討を行った結果、オリゴ糖誘導体及び多糖誘導体の少なくともいずれかを含む固定相と、特定の濃度の酸及びアミンを含む移動相とを用いることにより、上記課題を解決できることを見出し、本開示に係る発明の完成に至った。すなわち、本開示の要旨は、以下の通りである。
［１］　オリゴ糖、多糖、及びこれらの誘導体の少なくともいずれかを含む固定相と、
　シュウ酸、酢酸、ギ酸、及びトリフルオロ酢酸からなる群から選択される１種以上の特定の酸、１種以上の塩基、並びに溶媒を含む移動相と、
を用いてクロマトグラフィーによりアミンを分離する分離工程を含み、
　前記移動相に含まれる各特定の酸について下記式（１）で算出される値をＡ、各特定の酸で算出された各Ａの合計値をＳＡ、前記移動相に含まれる各塩基について下記式（２）で算出される値をＢ、各塩基で算出された各Ｂの合計値をＳＢとした場合において、ＳＢ／ＳＡが、０．０５以上、０．９５以下である、
　アミンの分離方法。
式（１）：Ａ＝特定の酸の価数×特定の酸のモル濃度（ｍｏｌ／Ｌ）
式（２）：Ｂ＝塩基の価数×塩基のモル濃度（ｍｏｌ／Ｌ）
［２］　前記分離工程により分離されたアミンを分析する分析工程をさらに含み、
　前記分析工程において、少なくとも質量分析器を用いた分析が行われる、
　［１］に記載のアミンの分離方法。
［３］　前記塩基が、アンモニア、第１級アミン、第２級アミン、及び第３級アミンからなる群より選択される１種以上である、［１］又は［２］に記載のアミンの分離方法。
［４］　前記塩基が、アンモニア、エチルアミン、ｎ－プロピルアミン、２－プロピルアミン、ジメチルアミン、ジエチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ピロリジン、及びピペリジンからなる群より選択される１種以上である、［３］に記載のアミンの分離方法。
［５］　前記移動相が、前記特定の酸として、少なくともシュウ酸を含む、［１］～［４］のいずれかに記載のアミンの分離方法。
［６］　前記オリゴ糖、多糖、及びこれらの誘導体の少なくともいずれかが、光学活性部位を有する、［１］～［５］のいずれかに記載のアミンの分離方法。
［７］　前記溶媒が、水、アセトニトリル、エタノール、メタノール、２－プロパノール、ヘキサン、ヘプタン、ＴＨＦ、及び液体二酸化炭素からなる群から選択される１種以上である、［１］～［６］のいずれかに記載のアミンの分離方法。
　本開示によれば、分離性能に優れるアミンの分離方法を提供することができる。
実施例１におけるアミンの分析により得られた液体クロマトグラムである。 比較例１におけるアミンの分析により得られた液体クロマトグラムである。 比較例２におけるアミンの分析により得られた液体クロマトグラムである。 比較例３におけるアミンの分析により得られた液体クロマトグラムである。 実施例２におけるアミンの分析により得られた液体クロマトグラムである。 比較例４におけるアミンの分析により得られた液体クロマトグラムである。 実施例３におけるアミンの分析により得られた液体クロマトグラムである。 比較例５におけるアミンの分析により得られた液体クロマトグラムである。 実施例４におけるアミンの分析により得られた液体クロマトグラムである。 比較例６におけるアミンの分析により得られた液体クロマトグラムである。 実施例５におけるアミンの分析により得られた液体クロマトグラムである。 比較例７におけるアミンの分析により得られた液体クロマトグラムである。 実施例６におけるアミンの分析により得られた液体クロマトグラムである。 比較例８におけるアミンの分析により得られた液体クロマトグラムである。 比較例９におけるアミンの分析により得られた液体クロマトグラムである。 実施例７におけるアミンの分析により得られた液体クロマトグラムである。 比較例１０におけるアミンの分析により得られた液体クロマトグラムである。 実施例８におけるアミンの分析により得られた液体クロマトグラムである。 比較例１１におけるアミンの分析により得られた液体クロマトグラムである。 実施例９におけるアミンの分析により得られた液体クロマトグラムである。 実施例１０におけるアミンの分析により得られた液体クロマトグラムである。 実施例１１におけるアミンの分析により得られた液体クロマトグラムである。 実施例１２におけるアミンの分析により得られた液体クロマトグラムである。 実施例１３におけるアミンの分析により得られた液体クロマトグラムである。 実施例１４におけるアミンの分析により得られた液体クロマトグラムである。 比較例１２におけるアミンの分析により得られた液体クロマトグラムである。 実施例１５におけるアミンの分析により得られた液体クロマトグラムである。 比較例１３におけるアミンの分析により得られた液体クロマトグラムである。 実施例１６におけるアミンの分析により得られた液体クロマトグラムである。 比較例１４におけるアミンの分析により得られた液体クロマトグラムである。 実施例１７におけるアミンの分析により得られた液体クロマトグラムである。 実施例１８におけるアミンの分析により得られた液体クロマトグラムである。 実施例１９におけるアミンの分析により得られた液体クロマトグラムである。 実施例２０におけるアミンの質量分析により得られたマススペクトルである。 実施例２１におけるアミンの質量分析により得られたマススペクトルである。 実施例２２におけるアミンの質量分析により得られたマススペクトルである。 実施例２３におけるアミンの質量分析により得られたマススペクトルである。 実施例２４におけるアミンの質量分析により得られたマススペクトルである。
　以下に、本開示について具体的な実施形態を挙げて説明するが、各実施形態における各構成及びそれらの組み合わせ等は、一例であって、本開示の主旨から逸脱しない範囲内で、適宜、構成の付加、省略、置換、及びその他の変更が可能である。本開示は、実施形態によって限定されることはなく、クレームの範囲によってのみ限定される。
　また、本開示に開示された各々の態様は、本開示に開示された他のいかなる特徴とも組み合わせることができる。
　なお、本開示において、数値範囲の下限値及び上限値を分けて記載する場合、前記数値範囲は、それらのうち任意の下限値と任意の上限値とを組み合わせたものとすることができる。また、本開示において、「～」を用いてその前後に数値又は物性値を挟んで表現する場合、端点である下限及び上限の値を含むものとして用いることとする。また、「Ａ～Ｂ」又は「Ａ以上Ｂ以下」で表される数値範囲が段階的（例えば、好ましい順）に記載されている場合、各数値範囲の上限及び下限は任意に組み合わせることができる。
　また、本開示において「Ａ又はＢ」の表現は、「Ａ及びＢからなる群から選択される少なくとも１つ」と読み替えることができる。
＜アミンの分離方法＞
　本開示の一実施形態に係るアミンの分離方法（以下、単に「アミンの分離方法」とも称する。）は、
　オリゴ糖、多糖、及びこれらの誘導体の少なくともいずれかを含む固定相と、
　シュウ酸、酢酸、ギ酸、及びトリフルオロ酢酸からなる群から選択される１種以上の特定の酸、１種以上の塩基、並びに溶媒を含む移動相と、
を用いてクロマトグラフィーによりアミンを分離する分離工程を含み、
　前記移動相に含まれる各特定の酸について下記式（１）で算出される値をＡ、各特定の酸で算出された各Ａの合計値をＳＡ、前記移動相に含まれる各塩基について下記式（２）で算出される値をＢ、各塩基で算出された各Ｂの合計値をＳＢとした場合において、ＳＢ／ＳＡが、０．０５以上、０．９５以下である、
　アミンの分離方法である。
式（１）：Ａ＝特定の酸の価数×特定の酸のモル濃度（ｍｏｌ／Ｌ）
式（２）：Ｂ＝塩基の価数×塩基のモル濃度（ｍｏｌ／Ｌ）
　上記のアミンの分離方法は、上記の分離工程以外の工程、例えば、分離されたアミンを分析（例えば、同定）する分析工程、分離されたアミンを定量する定量工程、分離されたアミンの構造を推定する工程、又は分離されたアミンを回収する回収工程等を含んでいてもよい。
　また、上記の実施形態に係る移動相は、分離対象となるアミンを含む前の移動相であり、「前記移動相中のアミンの含有率」は、分離対象となるアミンを含む前の移動相中のアミンの含有率である。
　また、本開示において、オリゴ糖は、糖残基数が５以上の糖である。
　また、本開示におけるオリゴ糖と多糖との区別について、分子量で分けることができ、分子量が３０００以下であるものをオリゴ糖とし、３０００超であるものを多糖とする。
　また、本実施形態において、特定の酸は遊離しているもの及び酸アニオンとなっているものの両方を含み、塩基は遊離しているもの及びカチオンとなっているものの両方を含む。また、酸アニオン及びカチオンは、互いに、又は他のイオンとともに、塩を形成していてもよい。
　オリゴ糖、多糖、及びこれらの誘導体の少なくともいずれか（以下、これらを総称して「オリゴ糖・多糖誘導体」とも称する。）を含む固定相と、シュウ酸、酢酸、ギ酸、及びトリフルオロ酢酸からなる群から選択される１種以上の特定の酸、１種以上の塩基、並びに溶媒を含む移動相とを用い、さらに、これらの酸と塩基の含有率を調整することによりアミンの分離性能が向上することを本発明者らは見出した。この理由について、本発明者らは以下のように推測している。
　移動相が酸過剰の環境（塩基よりも酸が多い環境）においては、酸アニオンが生じるとともに、分析対象（アミン）がプロトン化されてアンモニウム陽イオンが生じ、これらの酸アニオンとアンモニウム陽イオンによりイオンペアが生成される。このイオンペアは、極性が弱いため、やはり極性が弱いオリゴ糖・多糖誘導体に吸着し、分析対象の分離を可能とする。
　本発明者らが鋭意検討した結果、移動相に、酸のモル濃度（含有率）よりも低いモル濃度で塩基を加え、酸の一部を中和して塩に変換することで、酸が弱酸であったとしても、移動相中の対アニオンの濃度を好ましいレベルに調整できることを見出した。
　さらに、本発明者らは、本発明者らによって見出された上記の機構をもとに、酸の種類、並びに酸及びアミンの含有率等の検討を重ねた結果、上記の本実施形態に係る構成によりアミンの分離性能を向上させる、具体的にはクロマトグラフィーにおける分析対象の保持時間を十分にすることができることを見出した。
　また、本発明者はさらに鋭意検討し、固定相が酸性を有し、これが試料アミンの非特異的な吸着を惹き起こすような場合、例えば該固定相が、シリカゲルを担体として含むような場合に、しばしばそのシラノール基が惹き起こすと考えられるピークテイリングと呼ばれる現象が起きる。このような場合において、上記の本実施形態に係る態様によれば、アミンの分離性能を向上させる、具体的には分析により得られるクロマトグラムのピークをシャープなものとすることができることを見出した。
　上述したカチオンと、解離されたシラノールの共役陰イオンとの間でイオン的な相互作用が生じた場合、分析により得られるクロマトグラムのピークがブロードになってしまうが、本実施形態に係る態様では過剰の酸の存在により、シラノールの解離が抑制され、このイオン的な相互作用が抑制されたと本発明者らは推測している。
　また、従来技術では、移動相のｐＨを高めにし、試料アミンを中性分子として非イオン性の固定相に保持させるという手法もある。しかし固定相がシリカゲルを含む場合には、このような条件ではシリカゲルが溶解してカラムの劣化が起きやすいため、ｐＨが上がり過ぎないように、炭酸水素アンモニウムのような緩衝作用を有する塩を添加するとともに本カラムより安価に交換できるガードカラムを本カラムの前に挿入し、本カラムに流れる移動相をシリカ分で飽和させることにより、本カラムからのシリカの溶出を抑制するといった対策が取られている。
　一方で、本実施形態に係る態様では、過剰の酸によりｐＨが低くなるため、上記のような対策を取る必要がないことも大きな利点である。
　また、アミンの分離において、非特許文献１で開示される移動相を用いた分離操作を適用した場合、該移動相には高沸点の不揮発性の塩が添加されるため、移動相中の溶媒を蒸発させた後に該塩が残りやすいため、アミンの分離性能が低下してしまう。
　一方で、上記の本実施形態における移動相において、塩基としてアミンを採用した場合、移動相中では、シュウ酸、酢酸、ギ酸、及びトリフルオロ酢酸からなる群から選択される１種以上の特定の酸のアニオン及びアミンのカチオンを含む塩が生じるが、これらの塩は、揮発又は熱分解しやすいため、溶媒を蒸発させたとしても高沸点の不揮発性の塩が残りにくい。
［アミン］
　本実施形態に係る分離方法によれば、複数のアミンの混合物を各アミンに分離したり、アミンと非アミンとを含む混合物からアミンを分離したりすることができる。特にアミンのエナンチオマー（鏡像異性体）を分離できることは科学技術における重要性が大きい。
　分離対象となるアミンは、アミノ基を含む化合物である限り特に限定されず、１級アミン、２級アミン、及び３級アミンのいずれであってよい。具体的なアミンとしては、アラニン、システイン、グルタミン酸、メチオニン、ロイシン、チロシン、もしくはトリプトファン等のアミノ酸；前記アミノ酸のエステル、アミド等のアミノ酸誘導体；ジメチルアミノエタノール、プロパノールアミン、メチオニノール、もしくはノルエフェドリン等のアミノアルコール；フェニルエチルアミン；１－フェニル－１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリン等の環状アミン；又はその他のアミノ基を含む塩基性医薬品等、とりわけそれらのエナンチオマーが挙げられる。
　本実施形態に係る分離方法によれば、分子の形状を区別する高い分離性能を達成し得ることから、構造が互いに類似するために分離が難しいアミンの混合物を各アミンに分離することもできる。構造が互いに類似するアミンの混合物としては、連鎖異性体の混合物、位置異性体の混合物、幾何異性体の混合物、及び類縁体の混合物等が挙げられる。さらに、固定相として、光学活性部位を有するオリゴ糖・多糖誘導体を有するキラル固定相を用いることにより、エナンチオマーの混合物を各エナンチオマーに分離できることが最大の特長である。
［固定相］
　固定相は、吸着剤（「分離剤」とも称する。）としてオリゴ糖、多糖及びこれらの誘導体の少なくともいずれか（以下、これらを総称して「オリゴ糖・多糖誘導体」とも称する。）を含んでいればよく、オリゴ糖・多糖誘導体を含む態様は特段制限されない。例えば、吸着剤として、オリゴ糖・多糖誘導体又はオリゴ糖・多糖誘導体と他の成分との混合物を固化したものを用いてもよく、オリゴ糖・多糖誘導体又はオリゴ糖・多糖誘導体と他の成分との混合物を担体に担持させたものを用いてもよい。また担持において、担体との間に化学結合を設ける、オリゴ糖・多糖誘導体間に化学結合を設ける、又はオリゴ糖・多糖誘導体表面に高分子不透過性の層を設けるなどの方法により、多糖又はオリゴ糖誘導体を不溶化したものは特に有用性が高い。
　固定相の形状は特段制限されず、例えば、破砕されて無定形等の形状であってもよいが、球形であることが好ましい。この場合、粒子をカラムに充填して用いるカラムクロマトグラフィーに利用することができる。オリゴ糖・多糖誘導体そのものを造粒してもよいが、効率、耐圧性、使いやすさの面で優れる観点から、多孔質シリカゲル等の担体に担持させることが好ましい。多孔質の場合、表面だけが多孔質になるようにし、オリゴ糖・多糖誘導体を担持した時に、表面近くに分布するようにしたもの（コアシェル、表面多孔性、又はペリフェラル等の様々な呼び方がある。）であってもよい。
　固定相の形状が球形である場合、その直径は特段制限されないが、好ましくは０．５～１００μｍであり、より好ましくは０．５～５０μｍであり、さらに好ましくは(現状におけるクロマトグラフィー装置において手ごろであるという観点から）１～２０μｍである。該直径は、アミンの分離の観点からは小さい方が好ましいが、分取用としての大型装置に利用する場合には通液抵抗を下げるため大きい方が好ましい。本開示において、「球形」は略球形の形状も含む。
　オリゴ糖・多糖誘導体の種類は特段制限されず、例えば、オリゴ糖又は多糖（以下、これらを総称して「オリゴ糖・多糖」とも称する。）の水酸基もしくはアミノ基の一部又は全部が置換基で置換されたオリゴ糖・多糖であってよい。多糖誘導体は、例えば、オリゴ糖・多糖の水酸基もしくはアミノ基の一部又は全部が他の化合物と反応して得られるものであり、一例を示すと、オリゴ糖・多糖の水酸基の一部もしくは全部を、更に一つ又は複数の置換基を含んでもよい、脂肪族カルボン酸、安息香酸、又はフェニルカルバミン酸のエステルとしたものである。これらの中でも、分離性能の観点から、ベンゼン環に含まれる少なくとも１つの水素原子が、それぞれ独立して、メチル基又はハロゲン原子で置換された、安息香酸、又はフェニルカルバミン酸のエステルとしたオリゴ糖・多糖が好ましい。
　なお、オリゴ糖・多糖誘導体は、１種類を単独でも用いてもよく、２種以上を任意の組み合わせで併用してもよい。
　オリゴ糖・多糖誘導体の母体となるオリゴ糖・多糖の種類は特段制限されない。
　オリゴ糖・多糖の糖残基数は、５以上であれば特段制限されず、例えば、１０以上であってもよく、２０以上であってもよく、また、１０００未満であってもよく、５００以下であってもよく、１００以下であってもよく、７５以下であってもよく、５０以下であってもよい。
　オリゴ糖・多糖を構成する単糖の種類は特段制限されず、例えば、エリトロース、もしくはトレオース等のアルドテトロース；リボース、リキソース、キシロース、もしくはアラビノース等のアルドペントース；アロース、タロース、グロース、グルコース、アルトロース、マンノース、ガラクトース、もしくはイドース等のアルドヘキソース；エリトルロース等のケトテトロース；キシロース、もしくはリブロース等のケトペントース；又はプシコース、フルクトース、ソルボース、もしくはタガトース等のケトヘキソース；等が挙げられる。これらの中でも、素材として高純度で入手しやすいものとしてグルコース、フルクトース、グルコサミンが好ましい。
　なお、これらの単糖は、１種類を単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。
　より具体的に、多糖としては、例えば、アミロース、又はアミロペクチン、グリコーゲン、セルロース、カードラン、パラミロン、キチン、キトサン、デキストラン、ニゲラン、アガロース、カラギーナン、ヘパリン、アルギン酸、ヒアルロン酸、ペクチン、キシログルカン、キシラン、グルコマンナン、又はレバンが挙げられる。これらの中でも、分離性能が優れること、高純度で入手しやすいという観点ではセルロース、アミロース、キチン、キトサン、カードラン、シゾフィラン、アガロース等が好ましい。なお、アミロースやアミロペクチンは、それぞれが単体で用いられていてもよく、デンプンのように両方が含まれる態様で用いられてもよい。
　また、上述したように、エナンチオマーの混合物を各エナンチオマーに分離できる観点から、光学活性部位を有するオリゴ糖・多糖誘導体が好ましい。
　固定相におけるオリゴ糖・多糖誘導体の量は特段制限されず、オリゴ糖・多糖誘導体を固定相の分離剤として使用した公知の方法を参照して適宜設定することができる。例えば、固定相中のオリゴ糖・多糖誘導体の含有率は、１００質量％であってもよく、上述した担体等を用いる場合には、５質量％以上、５０質量％以下であることが好ましく、５質量％以上、３０質量％以下であることがより好ましく、１０質量％以上、３０質量％以下であることがさらに好ましい。
　上述したように、オリゴ糖・多糖誘導体を含む態様は特段制限されず、オリゴ糖・多糖誘導体又はオリゴ糖・多糖誘導体そのものを必要に応じて、粒子化、多孔質粒子化、多孔質モノリス化したものでもよく、オリゴ糖・多糖誘導体又はオリゴ糖・多糖誘導体、と他の成分との混合物を固化したものを用いてもよく、オリゴ糖・多糖誘導体又はオリゴ糖・多糖誘導体と他の成分との混合物を担体に担持させたものを用いてもよいが、オリゴ糖・多糖誘導体又はオリゴ糖・多糖誘導体と他の成分との混合物を担体に担持させたものが好ましく、オリゴ糖・多糖誘導体を担体に担持させたものがより好ましい。
　上記の担持の方法としては、公知の方法を採用することができ、物理的な担持であってもよく、化学的な担持であってもよい。化学的な担持としては、例えば共有結合等の化学結合によりオリゴ糖・多糖誘導体が担体に担持される方法を好適に採用することができる。具体的には、オリゴ糖・多糖誘導体、オリゴ糖・多糖誘導体の原料又はオリゴ糖・多糖誘導体の中間体に反応性基を導入し、この置換基と担体表面に存在する反応性基とを反応させる方法が挙げられる。この際、オリゴ糖・多糖誘導体間に化学結合を設ける処理を行ってもよい。なお、担体表面に存在する反応性基とは、未処理の担体の表面に存在する基であってもよく、担体を表面処理剤、例えば３－アミノプロピルトリエトキシシラン及び３－グリシジルオキシプロピルトリメトキシシラン等のシランカップリング剤で表面処理することにより担体表面に導入された基であってもよい。この他、いわゆるクリック反応のペアをそれぞれ固定相とオリゴ糖・多糖誘導体に結合し、互いに反応させる方法も挙げられる。或いは、オリゴ糖・多糖誘導体と担体の間に結合を形成する方法だけではなく、オリゴ糖・多糖誘導体を含む原子団の間でいわゆる架橋結合を形成することによって、担体表面に不溶化された層を形成することもできる。さらに、物理的な担持としては、例えば、シリカゲルにオリゴ糖・多糖誘導体溶液を含浸、蒸発させることによりオリゴ糖・多糖誘導体を担体上に物理吸着（例えば、コーティング）する方法により、オリゴ糖・多糖誘導体を担体に担持してもよい。
　これらの方法の中でも、溶媒へのオリゴ糖・多糖誘導体の溶解を抑制できる観点から、好ましくは、シリカゲルとオリゴ糖・多糖誘導体骨格との間に何らかの化学結合を形成する方法、又は担体上のオリゴ糖・多糖誘導体間に何らかの化学結合を形成す方法により不溶化することが好ましい。なお、溶媒へのオリゴ糖・多糖誘導体の溶解を抑制するため、担体を用いない場合でも、オリゴ糖・多糖誘導体間に化学結合を設けることが好ましい。
　担体としては、オリゴ糖・多糖誘導体を担体に固定することができる限り、特に制限されない。担体は、無機担体であってもよく、有機担体であってもよいが、無機担体であることが好ましい。無機担体としては、例えばシリカゲル、アルミナ、マグネシア、ガラス、カオリン、酸化チタン、ケイ酸塩、ジルコニア、又はヒドロキシアパタイト等が挙げられる。有機担体としては、例えば架橋ポリスチレン、架橋ポリ（メタ）アクリルアミド、架橋ポリ（メタ）アクリレート、又はポリサッカライド等が挙げられる。またシリカゲルを形成する際に多官能シランカップリング剤を共重合させたハイブリッドシリカゲルも利用できる。これらの有機担体は、架橋剤によって架橋されることで不溶化していることが好ましい。
　担体の形状は、特に制限されず、例えば粒子、及びカラム管に液密に収容される多孔性の円柱体（モノリス）等が挙げられる。また、担体としてキャピラリーの内壁を挙げることもできる。分離係数が十分に大きい場合には、メンブレン型の担体を用い、厚み方向に展開してもよいし、薄層クロマトグラフィーとして面方向に展開することも可能である。
　また、本実施形態において、担体は、シリカゲルであることが好ましい。シリカゲルは、前述した特性、即ち分離性能に優れ、また硬くて丈夫だからである。シリカゲルとして、全多孔性のものに加え、いわゆるコア－シェル型のものを用いてもよく、表面が化学修飾されたシリカゲルを用いてもよい。
［移動相］
　移動相は、シュウ酸、酢酸、ギ酸、及びトリフルオロ酢酸からなる群から選択される１種以上の特定の酸、１種以上の塩基、並びに溶媒を含む。
　移動相は、分離性能を阻害しない範囲で、上記の成分以外の成分を含んでいてもよい。また、移動相は、少なくとも分析を実施する条件において、均一系（単相系）であることが好ましい。
　なお、本開示において、「移動相」とは、液体クロマトグラフィー及び超臨界流体クロマトグラフィー等のクロマトグラフィーにおいて、分離対象とともに固定相に流し込まれ、分離対象とともに移動し、その後、固定相から分離物を溶出させる液体を意味する。
　移動相に含まれる塩の含有率は特段制限されないが、所望の分離性能を確保する観点から、０．５ｍｍｏｌ／Ｌ以上１０００ｍｍｏｌ／Ｌ以下であることが好ましく、１ｍｍｏｌ／Ｌ以上、２００ｍｍｏｌ／Ｌ以下であることがより好ましく、１ｍｍｏｌ／Ｌ以上、５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下であることがさらに好ましく、１ｍｍｏｌ／Ｌ以上、２０ｍｍｏｌ／Ｌであることが特に好ましい。上述したように、質量分析法（ＭＳ）を採用する場合、高沸点の塩の含有率は低い方が好ましい。高沸点の塩としては、例えばカチオンとして金属イオンを含む塩、又は四級アンモニウムイオンを含む塩が挙げられ、具体的に、該塩の含有率は、５ｍＭ以下が好ましく、実質的に含まない（検出限界未満である）ことがより好ましい。
（特定の酸）
　移動相は、シュウ酸、酢酸、ギ酸、及びトリフルオロ酢酸からなる群から選択される１種以上の特定の酸を含む。これらのうち、酸性度が比較的高いことから、シュウ酸、及びトリフルオロ酢酸からなる群から選択される１種以上の酸が少なくとも含まれることが好ましい。さらに、液体クロマトグラフィーの部材に吸着するなどして他の分析にコンタミネーションを起こしやすく、かつ廃棄後、環境に対するフッ素汚染を防止する注意を求められるトリフルオロ酢酸に対し、そのような傾向がなく、またＭＳ検出器の温度で容易に低分子量の一酸化炭素、二酸化炭素、及び水に分解するためＭＳ分析に悪影響を及ぼしにくく、また吸湿性などがない扱いやすい２水結晶として安価に得られる、シュウ酸が特定の酸として少なくとも含まれることが特に好ましい。これらの酸は、１種単独であってもよく、任意の２種以上を任意の比率で組み合わせたものであってもよい。また、本開示の効果が得られる範囲で、他の酸を含んでいてもよい。
　なお、シュウ酸は、溶出液を分取した場合に、カルシウムイオンを用いて沈殿分離することが出来るという利点もある。
　移動相に含まれる特定の酸は、一部が塩になることでイオンペアクロマトグラフィーにおいて試料アンモニウムの固定相への保持を促す対イオンを供給するとともに、一部は酸として存在させ、試料アミンを確実にアンモニウムイオンに変換することが好ましい。試料アミンはクロマトグラフィー条件において稀薄であるため、移動相がほぼ中性であってもアンモニウムイオンとして存在する確率が高いが、酸を過剰にすることによってこれを確実にすることが出来る。
　移動相に含まれる特定の酸の含有率（２種以上併用する場合は、合計含有率）は、アミンの分離性能を向上させる観点から、１ｍｍｏｌ／Ｌ以上であることが好ましく、また、１０００ｍｍｏｌ／Ｌ以下であることが好ましく、２００ｍｍｏｌ／Ｌ以下であることがより好ましく、５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下であることがさらに好ましく、２０ｍｍｏｌ／Ｌ以下であることが特に好ましい。
　上記の含有率が上記範囲の下限以上であれば、実質的に（どれだけ薄くても大なり小なりの効果は得られるが、実際的な効果が得るためにはある程度の濃度が必要）試料を保持させる効果が得られる。また、上記の含有率が上記範囲の上限以下であれば、検出、特にＭＳによる検出に対し悪影響がない。すなわち、移動相に含まれる含有率の好ましい範囲としては、例えば１～１０００ｍｍｏｌ／Ｌ、１～２００ｍｍｏｌ／Ｌ、１～５０ｍｍｏｌ／Ｌ、１～２０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲が挙げられる。
　特定の酸以外の酸としては、例えば、メタンスルホン酸、硝酸、リン酸、又はグリコール酸等が挙げられ、高沸点の不揮発性の塩を形成しにくい観点においては、硝酸、又はグリコール酸などの有機酸が好ましく、装置に対する腐食が少ないという観点においてはスルホン酸類、リン酸、有機酸が好ましい。これらの特定の酸以外の酸は、１種単独であってもよく、任意の２種以上を任意の比率で組み合わせたものであってもよい。
（塩基）
　移動相は、塩基を含む。上述した特定の酸の一部を共役アニオンとしたイオンペアクロマトグラフィーとしての保持を確実にするためには、該特定の酸よりも小さいモル濃度の塩基を加え、特定の酸の一部を中和する。この塩基としては、例えば、金属、４級アンモニウムの水酸化物、又は炭酸塩等が挙げられる。該塩は、前記特定の酸よりも弱い酸の塩であってもよく、アミンであることが好ましい。アミンである場合には、熱によって特定の酸とアミンに解離し、揮発することによって質量分析法（ＭＳ）による検出を阻害しない。なお、移動相は酸過剰の環境となっているため、塩基は基本的に移動相中では塩として存在している。
　移動相に含まれる塩基の含有率（２種以上併用する場合は、合計含有率）について、アミンの分離性能を向上させる観点から、移動相に含まれる各特定の酸について下記式（１）で算出される値をＡ、各特定の酸で算出された各Ａの合計値をＳＡ、移動相に含まれる塩基について下記式（２）で算出される値をＢ、各塩基で算出された各Ｂの合計値をＳＢとした場合において、ＳＢ／ＳＡが、０．０５以上、０．９５以下である、という条件を満たすように塩基が含有される。
式（１）：Ａ＝特定の酸の価数×特定の酸のモル濃度（ｍｏｌ／Ｌ）
式（２）：Ｂ＝塩基の価数×塩基のモル濃度（ｍｏｌ／Ｌ）
　なお、酢酸の価数は１、ギ酸の価数は１、トリフルオロ酢酸の価数は１である。シュウ酸の価数は１又は２となり得るが、第１段と第２段の解離定数に１０の３乗の開きがあるため、塩基の量が酸のモル数より小さい（＜０．０９５）本開示の条件においては、第２段解離は無視できる程度にしか起こらないと推定されることから本開示においては１として扱う。
　なお、上記の通り、特定の酸の価数はいずれも１となるため、上記式（１）は、下記式（１）’で表すこともできる。
式（１）’：Ａ＝特定の酸のモル濃度（ｍｏｌ／Ｌ）
　上記のＳＢ／ＳＡは、０．０５以上、０．９５以下であれば特段制限されないが、アミンの分離性能を向上させることができる観点から、０．１以上であることが好ましく、０．２以上であることがより好ましく、０．４以上であることがさらに好ましく、また、系の酸性度が低下して、試料アミンを完全にイオン化できない可能性が生じる観点から、０．９以下であることが好ましく、０．７以下であることがより好ましい。すなわち、移動相に含まれる含有率の好ましい範囲としては、例えば、一価酸の場合には、０．１～０．９、０．２～０．７、０．４～０．７の範囲が挙げられる。
　例えば、移動相中に、特定の酸として酢酸（価数：１）がＸ１ｍｏｌ／Ｌ含まれ、塩基としてトリエチルアミン（価数：１）がＹ１ｍｏｌ／Ｌ含まれる場合、上記式（１）で算出されるＡはＸ１ｍｏｌ／Ｌ（＝１×Ｘ１）となり、上記式（２）で算出されるＢはＹ１ｍｏｌ／Ｌ（＝１×Ｙ１）となる。また、酸の種類は１種類であり、塩基の種類も１種類であるため、ＳＡ＝Ｘ１、ＳＢ＝Ｙ１となるため、ＳＢ／ＳＡ＝Ｙ１／Ｘ１となる。
　なお、特定の酸よりも解離度が小さい酸は任意の濃度で含まれていてもよいが、解離度が特定の酸よりも大きい酸が含まれている場合、この酸が「塩基」を優先的に消費してしまうため、（上記のＳＢ）－（移動相に含まれる特定の酸よりも解離度が大きい酸の価数）×（移動相に含まれる特定の酸よりも解離度が大きい酸の濃度（ｍｏｌ／Ｌ））をＳＢとみなして上記のＳＢ／ＳＡを算出してもよい。この計算を行う場合で、特定の酸よりも解離度が大きい酸が多価酸である場合には、第２項は「特定の酸」よりも解離度が大きい段階までの荷数を乗じたものとする。
　なお、上記の解離度は、２５℃水中での解離度とする。この解離度は、例えば、American Chemical Societyから発行されている“pKa Data Compiled by R. Williams”に記載されている。
　また、本開示の別の実施形態は、上記のＳＢ／ＳＡが、特定の酸及び塩基の濃度のみを考慮して設定される態様である。この態様では、上記の式（１）及び式（２）が、それぞれ以下の式（１）”及び式（２）”に置き換わる。式の置き換え以外は、上述した実施形態の条件を同様に適用することができる。
式（１）”：Ａ＝特定の酸のモル濃度（ｍｏｌ／Ｌ）
式（２）”：Ｂ＝塩基のモル濃度（ｍｏｌ／Ｌ）
　また、本開示のさらに別の実施形態は、シュウ酸の価数を１又は２として扱う態様である。この態様では、シュウ酸が１価の酸として存在している場合には価数を１とし、２価の酸として存在している場合には価数を２とする。この点以外は、上述した実施形態の条件を同様に適用することができる。
　これらの２つの別の実施形態は、酸及び／又は塩基の価数の観点から上述した実施形態とは異なるものの、上述した実施形態により得られる効果と同様の効果を得ることができる。
　以下、塩基の好ましい態様であるアミンについて詳細に説明する。
　アミンの種類は特段制限されず、アンモニア、第１級アミン、第２級アミン、及び第３級アミン等が挙げられ、アンモニア、第１級アミン、第２級アミン、及び第３級アミンからなる群より選択される１種以上であることが好ましい。なお、アミンは、１種単独であってもよく、任意の２種以上を任意の比率で組み合わせたものであってもよい。
　第１級アミンとしては、例えば、アルキル基を有する第１級アミンが挙げられる。この中でも、メチルアミン、エチルアミン、ｎ－プロピルアミン、２－プロピルアミン、又はブチルアミン等のモノアルキルアミンが好適に例示される。
　第２級アミンとしては、例えば、それぞれ独立にアルキル基を２つ有する第２級アミンが挙げられる。この中でも、ジメチルアミン、ジエチルアミン、ジイソプロピルアミン、もしくはジブチルアミン等の非環状のジアルキルアミン；又はＮ－無置換ピロリジン、もしくはＮ－無置換ピペリジン等の環状アミンが好適に例示される。
　第３級アミンとしては、例えば、それぞれ独立にアルキル基を３つ有する第３級アミンが挙げられる。この中でも、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、もしくはトリブチルアミン等の非環状のトリアルキルアミン；又はＮ－置換ピロリジン、Ｎ－置換ピペリジン、もしくは１，４－ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン等の環状のトリアルキルアミンが好適に例示される。
　上記の各アミンに結合するアルキル基の炭素数は特段制限されないが、分子量が小さいものは揮発性が高く扱いにくい問題があり、分子量が大きいと、ＭＳ検出においてはノイズの原因となり易いので、１以上であってよく、２以上であってよく、３以上であってよく、また、１０以下であってよく、８以下であってよく、６以下であってよく、特に、１～４であることが好ましく、１～２であることがより好ましい。このようにアルキル基の炭素数が少ない第１級～第３級アンモニウムイオンは、分子量が小さいため、クロマトグラフィーをＬＣ－ＭＳにより行う場合、分離対象であるアミンに近い質量のイオンが生じにくく、ノイズが少なくなる。ただし、分子量２００を超すような試料の分析においては、扱いやすさも考慮すればトリエチルアミンが便利である。一方、塩基としてアンモニアを用いる場合には、その塩の有機溶媒に対する溶解度は一般に低いため、アルキル置換基を有するアミンの方が有利な場合もある。
　また、Ｎ－置換ピロリジン、Ｎ－置換ピペリジン、又はＮ，Ｎ－二置換ピロリジン、Ｎ，Ｎ－二置換ピペリジンに結合している置換基は、特に限定されないが、それぞれ、アルキル基であることが好ましく、該アルキル基の条件は、上述した各アミンに結合するアルキル基で示したアルキル基と同様の条件を採用することができる。上述したように、ＬＣ－ＭＳにおいてはアンモニウムイオンの分子量が小さい方が好ましいためである。
　アミンは、沸点の低さ、入手しやすさ、ＵＶ検出に適用できること、揮発性かつ分子量が小さくＭＳ検出の障害になりにくい等の理由から、アンモニア、エチルアミン、ｎ－プロピルアミン、２－プロピルアミン、ジメチルアミン、ジエチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ピロリジン、及びピペリジンからなる群より選択される１種以上であることが好ましく、アンモニア、ジエチルアミン、トリエチルアミン、及び２－プロピルアミンからなる群より選択される１種以上であることがより好ましい。
　なお、アンモニアをはじめとする低沸点アミンは、蒸気圧が高いため定量的に添加することが困難な場合がある。このような場合、それらアミンの炭酸塩あるいは炭酸水素塩を用い、少量の水の中で該塩に含まれる酸と反応させ、二酸化炭素を発生させることにより、アンモニア単体を添加するのと実質的に同じ添加物を得ることができる。
　また、塩基として金属を用いる場合には、例えば、リチウム、ナトリウム、もしくはカリウム等のアルカリ金属、又はその他の金属を用いることができる。
　なお、特定の酸と該酸を部分的に中和する塩基を用いる方法は、本実施形態に係る移動相を調製するもっとも簡便な方法であるが、該特定の酸の塩と該酸とを加えることによっても等価な移動相が得られ、調製の仕方は該方法に限定されない。また、ここで加える特定の酸は、必ずしも塩に対応する特定の酸である必要はなく、シュウ酸、酢酸、ギ酸、及びトリフルオロ酢酸からなる群より選択される１種以上のいずれであってもよい。
（溶媒）
　本実施形態における移動相に含まれる溶媒は、分離対象であるアミン、並びに特定の酸等の各種成分を溶解できる限り特段制限されず、水、又は水以外の液体（以下、「非水溶媒」と称することがある。）等を用いることができる。
　非水溶媒としては、例えば、有機溶媒（水含有率０体積％）、又は亜臨界もしくは超臨界二酸化炭素等が挙げられる。
　移動相に含まれる溶媒としては、例えば、水のみ；非水溶媒のみ；水と非水溶媒との混合溶媒、加圧二酸化炭素と非水溶媒、必要に応じて微量の水を含む混合溶媒等が挙げられる。移動相に含まれる溶媒が、２種以上の溶媒からなる混合溶媒である場合、前記２種以上の溶媒は、アミンの分離条件において相分離を起こさない溶媒の組み合わせであることが好ましい。具体的には、例えば、極性の低いもの、いわゆる順相溶媒を用いることができ、ヘキサンもしくはヘプタン等の炭化水素に、より極性の高いアルコール、エステル、エーテル、ニトリルもしくはハロゲン化炭化水素等を混和したもの、又はこれに更に均一溶解する範囲で水を混和したものが好ましく用いられる。より具体的には、例えば、有機溶媒を基本とする極性の高い組成を有する溶媒であり、アセトニトリルをベースとし、少量（１～２０体積％）の水を含むもの、水をベースとし、更に極性が高い逆相溶媒として少量（通常１～４０体積％）のアセトニトリル、もしくはメタノールを含むもの、又は一般的に超臨界流体クロマトグラフィーと称される加圧二酸化炭素であり、亜臨界もしくは超臨界二酸化炭素と呼ばれるものを溶媒として用いることができる。
　なお、本技術分野では、通常、「超臨界」は、全ての組成や温度において、厳密に超臨界状態にあるというものには限らず、二酸化炭素を主とする溶媒を用いた場合に「超臨界」の呼称が用いられることが多い。本開示でも「超臨界」の語は同様に扱う。
　有機溶媒としては、特に限定されないが、分離対象であるアミンを溶解し得る有機溶媒であることが好ましい。好適な有機溶媒としては、例えばアセトニトリル、アセトン、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ｔｅｒｔ－ブチルメチルエーテル、メタノール、エタノール、ｎ－プロパノール、２－プロパノール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、又はジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）等が挙げられる。また、分離対象であるアミン、並びにシュウ酸、酢酸、ギ酸、及びトリフルオロ酢酸からなる群から選択される１種以上の特定の酸等の各種成分を溶解できる限り、有機溶媒は、ヘキサン、もしくはヘキサン、もしくはヘプタン等の炭化水素；又はジクロロメタン等のハロゲン化炭化水素；等を含んでいてもよい。これらのうち、化学的な安定性が高い点で、有機溶媒は、アセトニトリル、アセトン、メタノール、エタノール、２－プロパノール、ヘキサン、ヘプタン、ＴＨＦ、及びｔｅｒｔ－ブチルメチルエーテルからなる群より選択される１種以上を含むことが好ましく、アセトニトリルであることがより好ましい。移動相に含まれる溶媒は、アセトニトリルを７０体積％以上含むことが特に好ましい。前記有機溶媒は、１種単独であってもよく、任意の２種以上を任意の比率で組み合わせたものであってもよい。
　有機溶媒は、クロマトグラフィーに汎用される、炭素数５以上８以下の炭化水素とアルコールとの混合液であってもよい。このような混合液としては、例えば、水と相溶し得るヘキサン／エタノール混合液が挙げられる。ヘキサン／エタノール混合割合が、例えば１００／１００（ｖ／ｖ）である有機溶媒であれば、水含有率１０体積％程度の混合溶媒を調製することが可能であり、水の添加は保持をやや低下させるが、ピーク段数を高くし、分析の時間効率を上げる。またヘキサン／エタノール／メタノールも相容する範囲において良好なピーク段数を与える。
　炭素数５以上８以下の炭化水素とアルコールとの混合液は、粘度が低いため、クロマトグラフィーにおいて低圧力で高流速を実現でき、その上、紫外線吸収が小さいため、紫外線吸収によるアミンの検出を実現し得る。
　非水溶媒が亜臨界又は超臨界二酸化炭素を含む場合、クロマトグラフィーは、超臨界流体クロマトグラフにより行われる。この場合、目的の成分が移動相中に目的濃度で溶解し得るよう、亜臨界又は超臨界二酸化炭素に、補助溶媒として水と有機溶媒との混合溶媒、又は有機溶媒（水含有率０体積％）を併用することが好ましい。ここでいう有機溶媒は、非水溶媒として挙げた有機溶媒と同義である。補助溶媒である水と有機溶媒との混合溶媒、及び有機溶媒としては、それぞれ、水とメタノールとの混合溶媒、又はメタノールが好ましく例示される。
　なお、移動相に含まれる溶媒が、亜臨界又は超臨界二酸化炭素を含む場合、これらの体積は、便宜上、－２０℃における液体二酸化炭素の密度１．０３０ｇ／ｍＬに基づいて算出するものとする。
　溶媒の種類を説明してきたが、粘度が低いこと、紫外線に対して透明であること（もっとも一般的に用いられる紫外線検出の場合）、強い毒性や危険性を持たないこと、安価であること、及び多糖誘導体からなるキラル固定相が良好な分離を与える傾向にあること等の観点から、水、アセトニトリル、エタノール、メタノール、２－プロパノール、ヘキサン、ヘプタン、ＴＨＦ、及び液体二酸化炭素からなる群から選択される１種以上であることが好ましい。
　移動相中の溶媒の含有率（２種以上含む場合にはその合計の含有率）は特段制限されず、用途に応じて適宜設定することができ、例えば、９０質量％以上であってよく、９５質量％以上であってよく、９８質量％以上であってよく、９９質量％以上であってよく、また、１００質量％未満であってよく、９９．９質量％以下であってよく、９９．５質量％以下であってよい。また、移動相において、上述した特定の酸及び塩基以外の残りの成分であってもよい。なお、溶媒が３元系混合物である場合における各成分の混合比率の例を以下に述べる。逆相溶媒としては、水を５０体積％以上含む、アセトニトリル、アルコール類、及びＴＨＦの混合物が例示され、良好な分離を与えるには水含量が７０体積％以上であることが好ましい。また、順相溶媒としては、ヘキサン及び／又はヘプタンを４０体積％以上含み、残りを２－プロパノール又はエタノール、さらに少量の水を含む混合物が例示される。
（その他の成分）
　移動相は、本開示の効果が得られる範囲で、上述した成分以外の成分（その他の成分）を含んでいてもよい。ただし、質量分析法（ＭＳ）による検出を行う場合には、不揮発性の塩を与える成分は好ましくない。
（移動相の調製方法）
　移動相の調製方法は、公知の溶液調製方法又は公知の溶液調製方法に準じた方法により行うことができる。例えば、上記の各成分を混合する方法が挙げられる。
　公知の方法としては、酸と塩基とから塩を形成し、これを用いて移動相を調製する方法が挙げられる。本実施形態において酸と塩基を含むという表現をとったが、文字通り両者を適量、移動相溶媒に溶かしてもよい。一方、該酸と、該酸と該塩基とからなる塩を移動相溶媒に溶かしても、実質的に同じ移動相を得ることができる。このように酸と塩基とを直接接触させるのではなく、溶媒中で接触させて移動相を調製する手法は、簡便である点、及び一部の成分が気化する等の中和熱に起因するトラブルを回避できる点で好適である。塩基として、アンモニアなど揮発性の高いアミンを用いる場合には、水などの溶媒を用い、必要に応じて移動相溶媒の組成を補正してもよい。また、上述したように、炭酸塩または炭酸水素塩等の弱い酸の塩を先駆体として用いることも可能である。ここで副成した弱い酸は、そのまま移動相中に残留してもガス化して揮散しても、保持に大きい影響を与えることはない。
　カチオンと酸アニオンとの塩が市販されているか、容易に入手できる場合には、前記市販品を溶媒に溶解し、必要に応じて酸性度調整用の酸と混合することで、移動相を調製することもできる。酸性度調整の必要が生じるのは、試料アミンの保持が不十分であったり、ピークの形状が好ましくない場合である。
［クロマトグラフィー］
　本実施形態において用いられるクロマトグラフィーは、特に限定されず、例えば液体クロマトグラフィー、又は超臨界流体クロマトグラフィー等が挙げられる。また、クロマトグラフィーの形態も特段制限されず、公知の形態を採用することができ、カラムクロマトグラフィーだけでなく、薄層クロマトグラフィー、繊維状の吸着剤が堆積して成る層を設けたクロマトグラフィー、又は細管の内壁に何らかの形で吸着剤層の薄層を設けたキャピラリー又はマイクロ流路によるクロマトグラフィー等も採用することができる。
　クロマトグラフィーは、市販のクロマトグラフ、例えば液体クロマトグラフ及び超臨界流体クロマトグラフ等を用いて行うことができる。カラムの平衡化条件及び流速等の諸条件は、カラムサイズ、試料容量、又は移動相の種類等に応じて適宜選択することができる。
　本実施形態に係るアミンの分離方法は、分離工程により分離されたアミンを分析する分析工程をさらに含んでいてもよい。
　クロマトグラフィーにおいてアミンを検出する方法は特段制限されないが、本実施形態に係る方法では、質量分析器を用いた方法が挙げられる。本実施形態では、添加物を適切に選ぶことにより揮発性の塩の形成を促すことができるため、分析器として質量分析器を適用できることは大きい長所である。
　アミンの分離分析は、同一の装置により行ってもよく、それぞれ別々の装置により行ってもよい。例えば、クロマトグラフィーとして液体クロマトグラフィーを採用する場合、液体クロマトグラフィーを質量分析法（ＭＳ）と組み合わせた液体クロマトグラフィー－質量分析法（ＬＣ－ＭＳ）により、アミン分離と分離されたアミンの質量分析とを続けて行うことができる。なお、アミンの質量分析は、分離されたアミンを定量分析するものであってもよく、定性分析するものであってもよい。またＵＶ検出器単独でもよいし、質量分析器を併用することで一層多くの情報を得ることが出来る。
　質量分析としては、ＬＣ－ＭＳで使用される公知の質量分析法を採用することができる。例えば、質量分析におけるイオン化法は、大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）、大気圧光イオン化（ＡＰＰＩ）、エレクトロスプレー法（ＥＳＩ）、高速原子衝撃法（ＦＡＢ）、又はサーモスプレー法（ＴＳＰ）等から、塩の種類、酸の種類、アミンの種類、及び分析目的等に応じて適宜選択することができる。また、質量検出器は、四重極型質量分析計（Ｑ－ＭＳ）、イオントラップ型質量分析計（ＩＴ－ＭＳ）、又は飛行時間型質量分析計（ＴＯＦ－ＭＳ）等から、要求される感度及び分解能等に応じて適宜選択して用いることができる。
　以下、本開示を実施例によりさらに具体的に説明するが、本開示はその要旨を逸脱しない限り、下記の実施例に限定されるものではない。
＜実験Ｉ－１＞
＜実施例１＞
［移動相の調製］
　シュウ酸二水和物１２６０ｍｇを秤取り、１０００ｍＬのメスフラスコに移した。このメスフラスコに水とアセトニトリルをそれぞれ８００．０ｇ、１５６．６ｇの割合で秤取、混合した混合溶媒（体積比換算８０／２０）の約２０ｍＬを入れ、次いで、トリエチルアミン５０６ｍｇを入れた。その後、上記の水／アセトニトリル（８０／２０（ｖ／ｖ））混合溶媒でメスアップし、未溶解物がなくなるまで撹拌することで、移動相を得た。該移動相中の溶媒の組成は、水／アセトニトリル＝８０／２０（ｖ／ｖ）であり、移動相中のシュウ酸（ОｘＡ）及びトリエチルアミン（ＴＥＡ）の含有率は、それぞれ１０．０ｍｍｏｌ／Ｌ及び５．０ｍｍｏｌ／Ｌであった。なお、シュウ酸二水和物に含まれる水の量はわずかであるため溶媒組成への影響はない。また、２００℃に加熱したステンレス板上に１００μＬの移動相を滴下したが、残渣は見られなかった。この結果は以下の他の実施例でも同様であった。
　なお、以下の移動相の調製も同様に、溶媒は０．１ｇ、添加物は１ｍｇの桁まで秤量し、これにもとづいて濃度を計算した。
　また、水の密度は１．００ｇ／ｍＬ、アセトニトリルの密度は０．７８３ｇ／ｍＬとした。
［アミンの分離・分析］
　カラムとして、セルローストリス（３，５－ジメチルフェニルカルバメート）をシリカゲルに担持したキラル固定相が充填されたカラム（ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ　ＩＢ－Ｎ（株式会社ダイセル製、登録商標）、平均充填剤径５μｍ、長さ２５０ｍｍ、内径４．６ｍｍφ）を用い、液体クロマトグラフとして高速液体クロマトグラフを用いてアミンの分離を行った。このとき、分離対象である下記の式（３）で表されるアミン（ＵＳＰ社製「Ｐｉｎｄｏｌｏｌ」）は、水／アセトニトリル（１／１（ｖ／ｖ））混合溶媒に約１ｍｇ／ｍＬの濃度となるように溶解し、得られた溶液２μＬをオートサンプラによってカラムに注入した。また、移動相は、０．４３ｍＬ／分で３０℃に調温したカラムに送液した。
　アミンの分離方法や分析方法の詳細を次に示す。
（分離方法・分析方法）
　高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）の検出器としてＳＰＤ－Ｍ２０Ａ（株式会社島津製作所製、ダイオードアレイのＵＶ－Ｖｉｓ検出器）を用い、カラムに１時間以上移動相を１．０ｍＬ／ｍｉｎで送液した後、試料を約１ｍｇ／ｍＬで移動相に溶解した試料液５μＬをオートサンプラにより注入し、同じ流速で、カラム温度を３０℃に設定し、アミンの分離及び分析を行った。
　ＨＰＬＣで用いた装置、及びデータ処理装置の詳細を以下に示す。以下の装置は全て株式会社島津製作所製である。
・ＨＰＬＣ装置：システムコントローラ　ＣＢＭ－２０Ａ、ポンプ　ＬＣ－２０ＡＤ、オートサンプラ　ＳＩＬ－２０ＡＣ、カラムオーブン　ＳＰＤ－Ｍ２０Ａ
・データ処理装置：ＬａｂＳｏｌｕｔｉｏｎｓ　Ｖｅｒｓｉｏｎ　５．９７
　結果を図１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
＜比較例１＞
　実施例１で分離及び分析を実施した後のカラムに移動相として、水／アセトニトリル（８０／２０（ｖ／ｖ））混合溶媒を用い、１時間以上試料注入せずに通液したこと以外は実施例１と同様の方法で、再度上記の式（３）で表されるアミンの分離、分析を行った。なお、用いた移動相には、酸及びアミンを添加していないため、移動相中の酸及びアミンの含有率は、それぞれ０ｍｍｏｌ／Ｌ及び０ｍｍｏｌ／Ｌであった。
　結果を図２に示す。
＜比較例２＞
　シュウ酸二水和物を用いなかったこと、トリエチルアミンの代わりに炭酸水素アンモニウム（ＡＨＣ）及びジエチルアミン（ＤＥＡ）を用いたこと以外は実施例１と同様の操作を行い、ＡＨＣ及びＤＥＡの含有率が、それぞれ１０．０ｍｍｏｌ／Ｌ及び１５．５ｍｍｏｌ／Ｌである移動相を調製した。
　移動相として上記の移動相を用いたことと、ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ　ＩＢ－Ｎのカラムの前に、表１下注記載のガードカラムを挿入したこと（本比較例のみ）以外は実施例１と同様の方法で上記の式（３）で表されるアミンの分離、分析を行った。
　結果を図３に示す。
＜比較例３＞
　比較例２で分離及び分析を実施した後のカラムに移動相として、水／アセトニトリル（８０／２０（ｖ／ｖ））混合溶媒を用い、１時間以上試料注入せずに通液したこと以外は実施例１と同様の方法で上記の式（３）で表されるアミンの分離、分析を行った。なお、用いた移動相には、酸及びアミンを添加していないため、移動相中の酸及びアミンの含有率は、それぞれ０ｍｍｏｌ／Ｌ及び０ｍｍｏｌ／Ｌであった。
　結果を図４に示す。
＜実施例２＞
　溶媒を、水とアセトニトリルから、ヘキサンとエタノール（ヘキサン／エタノール＝５０／５０（ｖ／ｖ）に変更したこと以外は実施例１と同様の操作を行い、ОｘＡ及びＴＥＡの含有率が、それぞれ１０．０ｍｍｏｌ／Ｌ及び５．０ｍｍｏｌ／Ｌである移動相を調製した。
　移動相として上記の移動相を用いたこと以外は実施例１と同様の方法で上記の式（３）で表されるアミンの分離、分析を行った。
　結果を図５に示す。
＜比較例４＞
　シュウ酸二水和物を用いなかったこと、トリエチルアミンの代わりにジエチルアミン（表１における「ＤＥＡ」）を用いたこと以外は実施例２と同様の操作を行い、ＤＥＡの含有率が１０．０ｍｍｏｌ／Ｌである移動相を調製した。
　移動相として上記の移動相を用いたこと以外は実施例１と同様の方法で上記の式（３）で表されるアミンの分離、分析を行った。
　結果を図６に示す。
＜実施例３＞
　カラムとして、セルローストリス（３－クロロ－４－メチルフェニルカルバメート）をシリカゲルに担持したキラル固定相が充填されたカラム（ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ　ＩＭ（株式会社ダイセル製、登録商標）、平均充填剤径５μｍ、長さ２５０ｍｍ、内径４．６ｍｍφ）を用い、分析対象を下記の式（４）で表されるアミンに変更したこと以外は実施例２と同様の方法で分析対象であるアミンの分離、分析を行った。
　結果を図７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
＜比較例５＞
　カラムとして実施例３で用いたカラムを用いたこと以外は比較例４と同様の方法で上記の式（４）で表されるアミンの分離、分析を行った。
　結果を図８に示す。
＜実施例４＞
　分析対象を下記の式（５）で表されるフェニルグリシンのアミドに変更したこと以外は実施例２と同様の方法で分析対象であるアミンの分離、分析を行った。
　　Ｃ６Ｈ５－ＣＨ（ＮＨ２）－ＣＯＮＨ２　（東京化成製）　（５）
　結果を図９に示す。
＜比較例６＞
　分析対象を上記の式（５）で表されるフェニルグリシンのアミドに変更したこと以外は比較例５と同様の方法で分析対象であるアミンの分離、分析を行った。
　結果を図１０に示す。
＜実施例５＞
　溶媒を、ヘキサンとエタノールから、ヘキサンとエタノールとメタノール（ヘキサン／エタノール／メタノール＝７０／２０／１９（ｖ／ｖ／ｖ））に変更したこと以外は実施例３と同様の操作を行い、ОｘＡ及びＴＥＡの含有率が、それぞれ１０．０ｍｍｏｌ／Ｌ及び５．０ｍｍｏｌ／Ｌである移動相を調整製した。
　移動相として上記の移動相を用いたこと、及びカラムとして、アミローストリス（３－クロロフェニルカルバメート）をシリカゲルに担持したキラル固定相が充填されたカラム（ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ　ＩＤ（株式会社ダイセル製、登録商標）、平均充填剤径５μｍ、長さ２５０ｍｍ、内径４．６ｍｍφ）を用いたこと以外は実施例３と同様の方法で上記の式（４）で表されるアミンの分離、分析を行った。
　結果を図１１に示す。
＜比較例７＞
　シュウ酸二水和及びトリエチルアミンの添加を行わなかったこと以外は実施例５と同様の操作を行い、ОｘＡ及びＴＥＡの含有率が、それぞれ０ｍｍｏｌ／Ｌ及び０ｍｍｏｌ／Ｌである移動相を調整製した。
　移動相として上記の移動相を用いたこと以外は実施例５と同様の方法で上記の式（４）で表されるアミンの分離、分析を行った。
　結果を図１２に示す。
＜実施例６＞
　カラムとして、アミローストリス（３，５－ジクロロフェニルカルバメート）をシリカゲルに担持したキラル固定相が充填されたカラム（ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ　ＩＥ（株式会社ダイセル製、登録商標）、平均充填剤径５μｍ、長さ２５０ｍｍ、内径４．６ｍｍφ）を用いたこと以外は実施例５と同様の方法で上記の式（４）で表されるアミンの分離、分析を行った。
　移動相として上記の移動相を用いたこと以外は実施例５と同様の方法で上記の式（４）で表されるアミンの分離、分析を行った。
　結果を図１３に示す。
＜比較例８＞
　シュウ酸二水和及びトリエチルアミンの添加を行わなかったこと以外は実施例６と同様の操作を行い、ОｘＡ及びＴＥＡの含有率が、それぞれ０ｍｍｏｌ／Ｌ及び０ｍｍｏｌ／Ｌである移動相を調整した。
　移動相として上記の移動相を用いたこと以外は実施例６と同様の方法で上記の式（４）で表されるアミンの分離、分析を行った。
　結果を図１４に示す。
　実施例１～４、及び比較例１～６の分離条件を以下の表１にまとめた。
（分離度）
　各実施例及び比較例における分離度は、島津製作所のクロマトグラフィーデータ解析プログラム　ＬａｂＳｏｌｕｔｉｏｎｓ　Ｖｅｒｓｉｏｎ　５．９７によってして自動算出したＵＳＰ分離度である。結果を表１に示す。
　以下の各表において、「ＡＮ」はアセトニトリル、「ＯｘＡ」はシュウ酸、「ＴＥＡ」はトリエチルアミン、「ＡＨＣ」は炭酸水素アンモニウム、「ＤＥＡ」はジエチルアミンを表す。
　以下の表１～５に上述したＳＢ／ＳＡを示す。なお、シュウ酸の大部分は解離度から計算すると一価酸として存在している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　実施例１と比較例１及び比較例３、実施例５と比較例７、実施例６と比較例８を比較することにより、同じ溶媒を用いても、何も添加しない場合には一般的にピークのテイリングが激しく分離度が低い、あるいは前後のカラム履歴により得られるクロマトグラムが不安定である（比較例１と３は同じ移動相であるが、それぞれ実施例１と比較例２を挟んでいる）が、本開示の実施形態に係る移動相により、安定した保持と分離が得られることが解る。
　また、酸のみを添加した比較例９に係る移動相と比較すると、部分中和された移動相を用いた実施例２では良好な分離を達成できる。具体的には、比較例９は、シュウ酸のみを添加した移動相による分離であるが、実施例２に比べて明らかにピーク形状も分離も悪い。
　また、アミン試料のクロマトグラフィーにおいては、しばしば移動相に低分子量のアミンを添加するという方法が採られる。クロマトグラフィー充填剤、あるいはその担体として多くの場合に用いられるシリカゲルはシラノールと呼ばれる酸性原子団を有しており、これが試料と塩を形成するため著しいピークのテイリングを起こすと考えられている。この場合にアミンを添加すると、試料がシラノールとの塩を形成することを抑えることにより、試料の異常な保持を抑えることが出来る。比較例４、比較例５、比較例６は、この目的によく用いられるジエチルアミンを添加したものである。比較例４、５、６は、それぞれ実施例２、３、４に対応する。比較例４、５について、ピークのテイリングはほとんど生じてないものの、それぞれ実施例２、３よりも分離度が小さいことが分かる。
　また、従来、水を主とする移動相においては、移動相をアルカリ性に傾けてアミン試料のプロトン化を抑え、中性分子として固定相に保持させるという方法もとられている。比較例２はこのような条件の一つであり、アルカリ性の移動相である。この場合、実施例１より、ピーク幅は大きく、分離の時間効率は悪い。さらに、シリカゲルを含む固定相に対して塩基性よりの移動相を用いるときには、シリカゲルを含むガードカラム（プレカラム）を挿入するなどしてカラムの劣化を防ぐ必要があり、本比較例においても同じ手法をとっている。しかしながら、この分析を行った後の比較例３においてピーク形状が異常になったことから、カラムに履歴を残していることが判る。
＜実験Ｉ－２＞
＜比較例９＞
　溶媒を、水／アセトニトリル＝８０／２０（ｖ／ｖ）の混合溶液から水／アセトニトリル＝２．５／９７．５（ｖ／ｖ）の混合溶液に変更し、移動相中のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）の含有率が１０．０ｍｏｌ／ＬとなるようにＯｘＡの代わりにＴＦＡを用い、ＴＥＡを用いなかったこと以外は実施例１と同様の操作を行い、移動相を調製した。
　移動相として上記の移動相を用いたこと以外は実施例１と同様の方法で上記の式（３）で表されるアミンの分離、分析を行った。
　結果を図１５に示す。
＜実施例７＞
　溶媒を、水／アセトニトリル＝５０／５０（ｖ／ｖ）の混合溶液から水／アセトニトリル＝２．５／９７．５（ｖ／ｖ）の混合溶液に変更し、移動相中のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）の含有率が１０．０ｍｏｌ／ＬとなるようにＯｘＡの代わりにＴＦＡを用いたこと以外は実施例１と同様の操作を行い、移動相（ＴＥＡの含有率は５．０ｍｏｌ／Ｌ）を調製した。
　移動相として上記の移動相を用いたこと以外は実施例１と同様の方法で上記の式（３）で表されるアミンの分離、分析を行った。
　結果を図１６に示す。
＜比較例１０＞
　溶媒を、水／アセトニトリル＝２．５／９７．５（ｖ／ｖ）の混合溶液からヘキサン／エタノール＝５０／５０（ｖ／ｖ）の混合溶液に変更したこと以外は比較例９と同様の操作を行い、移動相を調製した。
　移動相として上記の移動相を用いたこと以外は実施例１と同様の方法で上記の式（３）で表されるアミンの分離、分析を行った。
　結果を図１７に示す。
＜実施例８＞
　溶媒を、水／アセトニトリル＝２．５／９７．５（ｖ／ｖ）の混合溶液からヘキサン／エタノール＝５０／５０（ｖ／ｖ）の混合溶液に変更したこと以外は実施例７と同様の操作を行い、移動相を調製した。
　移動相として上記の移動相を用いたこと以外は実施例１と同様の方法で上記の式（３）で表されるアミンの分離、分析を行った。
　結果を図１８に示す。
　実施例７～８及び比較例９～１０の分離条件を以下の表２にまとめた。
（分離度）
　各実施例及び比較例における分離度は、島津製作所のクロマトグラフィーデータ解析プログラム　ＬａｂＳｏｌｕｔｉｏｎｓ　Ｖｅｒｓｉｏｎ　５．９７によってして自動算出したＵＳＰ分離度である。結果を表１に示す。
　以下の各表において、「ＴＦＡ」はトリフルオロ酢酸を表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　実施例７と比較例９、及び実施例８と比較例１０を比較することにより、ＳＢ／ＳＡが０．０５以上、０．９５以下である場合に分離度が向上することが解る。
＜実験Ｉ－３＞
＜比較例１１＞
　移動相中の酢酸（ＡｃＯＨ）の含有率が１０．０ｍｏｌ／ＬとなるようにＯｘＡの代わりにＡｃＯＨを用い、ＴＥＡを用いなかったこと以外は実施例１と同様の操作を行い、移動相を調製した。
　移動相として上記の移動相を用いたこと以外は実施例１と同様の方法で上記の式（３）で表されるアミンの分離、分析を行った。
　結果を図１９に示す。
＜実施例９＞
　移動相中のＡｃＯＨの含有率が１０．０ｍｏｌ／ＬとなるようにＯｘＡの代わりにＡｃＯＨを用いたこと以外は実施例１と同様の操作を行い、移動相（ＴＥＡの含有率は５．０ｍｏｌ／Ｌ）を調製した。
　移動相として上記の移動相を用いたこと以外は実施例１と同様の方法で上記の式（３）で表されるアミンの分離、分析を行った。
　結果を図２０に示す。
＜実施例１０＞
　移動相中の酢酸アンモニウム（ＮＨ４ＯＡｃ）の含有率が５．０ｍｏｌ／ＬとなるようにＴＥＡの代わりにＮＨ４ＯＡｃを用いたこと以外は実施例９と同様の操作を行い、移動相を調製した。
　移動相として上記の移動相を用いたこと以外は実施例１と同様の方法で上記の式（３）で表されるアミンの分離、分析を行った。
　結果を図２１に示す。
＜実施例１１＞
　溶媒を、水／アセトニトリル＝８０／２０（ｖ／ｖ）の混合溶液からヘキサン／エタノール＝５０／５０（ｖ／ｖ）の混合溶液に変更したこと以外は実施例９と同様の操作を行い、移動相を調製した。
　移動相として上記の移動相を用いたこと以外は実施例１と同様の方法で上記の式（３）で表されるアミンの分離、分析を行った。
　結果を図２２に示す。
＜実施例１２＞
　溶媒を、水／アセトニトリル＝８０／２０（ｖ／ｖ）の混合溶液からヘキサン／エタノール＝５０／５０（ｖ／ｖ）の混合溶液に変更したこと以外は実施例１０と同様の操作を行い、移動相を調製した。
　移動相として上記の移動相を用いたこと以外は実施例１と同様の方法で上記の式（３）で表されるアミンの分離、分析を行った。
　結果を図２３に示す。
＜実施例１３＞
　分析対象を下記の式（６）で表されるアミン（１－フェニル－１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリン）に変更したこと以外は実施例１２と同様の方法で分析対象であるアミンの分離、分析を行った。
　結果を図２４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
＜実施例１４＞
　移動相中のＡｃＯＨの含有率が１０．０ｍｏｌ／ＬとなるようにＡｃＯＨを用いたこと、移動相中のＮＨ４ＯＡｃの含有率が１０．０ｍｏｌ／ＬとなるようにＮＨ４ＯＡｃを用いたこと以外は実施例１２と同様の操作を行い、移動相を調製した。
　移動相として上記の移動相を用いたこと以外は実施例１と同様の方法で上記の式（３）で表されるアミンの分離、分析を行った。
　結果を図２５に示す。
　実施例９～１４及び比較例１１の分離条件を以下の表３にまとめた。
（分離度）
　各実施例及び比較例における分離度は、島津製作所のクロマトグラフィーデータ解析プログラム　ＬａｂＳｏｌｕｔｉｏｎｓ　Ｖｅｒｓｉｏｎ　５．９７によってして自動算出したＵＳＰ分離度である。結果を表３に示す。
　以下の各表において、「ＡｃＯＨ」は酢酸、「ＮＨ４ＯＡｃ」は酢酸アンモニウム、「Ｐｈ－β－ｉｓｏｑ」はフェニル－β－イソキノリンを表す。
　なお、実施例１０、１２、１３、及び１４では、塩基としてアンモニアを加える代わりに酢酸アンモニウムを添加した。よって、移動相には、酸として添加している酢酸以外にも、酢酸アンモニウムが解離して生じる酢酸が存在する。このため、酢酸：酢酸アンモニウムの比率をモル比で１：１で用いた場合、移動相中の酢酸：アンモニアの比率はモル比で、２：１となり、ＳＢ／ＳＡは０．５となる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　実施例９～１４と比較例１１を比較することにより、ＳＢ／ＳＡが０．０５以上、０．９５以下である場合に分離度が向上することが解る。
＜実験Ｉ－４＞
＜比較例１２＞
　溶媒を、水／アセトニトリル＝８０／２０（ｖ／ｖ）の混合溶液からヘキサン／エタノール＝５０／５０（ｖ／ｖ）の混合溶液に変更したこと、移動相中のギ酸（ＦＡ）の含有率が１０．１ｍｏｌ／ＬとなるようにＯｘＡの代わりにＦＡを用い、ＴＥＡを用いなかったこと以外は実施例１と同様の操作を行い、移動相を調製した。
　移動相として上記の移動相を用いたこと以外は実施例１と同様の方法で上記の式（３）で表されるアミンの分離、分析を行った。
　結果を図２６に示す。
＜実施例１５＞
　溶媒を、水／アセトニトリル＝８０／２０（ｖ／ｖ）の混合溶液からヘキサン／エタノール＝５０／５０（ｖ／ｖ）の混合溶液に変更したこと、移動相中のギ酸（ＦＡ）の含有率が１０．０ｍｏｌ／ＬとなるようにＯｘＡの代わりにＦＡを用いたこと以外は実施例１と同様の操作を行い、移動相（ＴＥＡの含有率は５．０ｍｏｌ／Ｌ）を調製した。
　移動相として上記の移動相を用いたこと以外は実施例１と同様の方法で上記の式（３）で表されるアミンの分離、分析を行った。
　結果を図２７に示す。
＜比較例１３＞
　分析対象を上記の式（６）で表されるアミン（フェニル－β－イソキノリン）に変更したこと以外は比較例１２と同様の方法で分析対象であるアミンの分離、分析を行った。
　結果を図２８に示す。
＜実施例１６＞
　分析対象を上記の式（６）で表されるアミン（フェニル－β－イソキノリン）に変更したこと以外は実施例１５と同様の方法で分析対象であるアミンの分離、分析を行った。
　結果を図２９に示す。
　実施例１５～１６及び比較例１２～１３の分離条件を以下の表４にまとめた。
（分離度）
　各実施例及び比較例における分離度は、島津製作所のクロマトグラフィーデータ解析プログラム　ＬａｂＳｏｌｕｔｉｏｎｓ　Ｖｅｒｓｉｏｎ　５．９７によってして自動算出したＵＳＰ分離度である。結果を表４に示す。
　以下の各表において、「ＦＡ」はギ酸を表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　実施例１５と比較例１２及び実施例１６と比較例１３を比較することにより、ＳＢ／ＳＡが０．０５以上、０．９５以下である場合に分離度が向上することが解る。
＜実験Ｉ－５＞
＜比較例１４＞
　ＴＥＡを添加しなかったこと以外は実施例２と同様の操作を行い、ОｘＡの含有率が１０．０ｍｍｏｌ／Ｌである移動相を調整した。
　移動相として上記の移動相を用いたこと以外は実施例２と同様の方法で上記の式（３）で表されるアミンの分離、分析を行った。
　結果を図３０に示す。
＜実施例１７＞
　移動相中のＯｘＡの含有率が２．５０ｍｏｌ／ＬとなるようにＯｘＡを用いたこと、移動相中のＴＥＡの含有率が１．２５ｍｏｌ／ＬとなるようにＴＥＡを用いたこと以外は実施例２と同様の操作を行い、移動相を調製した。
　移動相として上記の移動相を用いたこと以外は実施例１と同様の方法で上記の式（３）で表されるアミンの分離、分析を行った。
　結果を図３１に示す。
＜実施例１８＞
　移動相中のＯｘＡの含有率が５．０ｍｏｌ／ＬとなるようにＯｘＡを用いたこと、移動相中のＴＥＡの含有率が２．５ｍｏｌ／ＬとなるようにＴＥＡを用いたこと以外は実施例２と同様の操作を行い、移動相を調製した。
　移動相として上記の移動相を用いたこと以外は実施例１と同様の方法で上記の式（３）で表されるアミンの分離、分析を行った。
　結果を図３２に示す。
＜実施例１９＞
　溶媒を、水とアセトニトリルの混合溶液から、ヘキサンとエタノールと水（ヘキサン／エタノール／水＝５０／５０／２（ｖ／ｖ／ｖ））の混合溶液に変更したこと以外は実施例１と同様の操作を行い、ОｘＡ及びＴＥＡの含有率が、それぞれ１０．０ｍｍｏｌ／Ｌ及び５．０ｍｍｏｌ／Ｌである移動相を調整した。
　移動相として上記の移動相を用いたこと以外は実施例１と同様の方法で上記の式（３）で表されるアミンの分離、分析を行った。
　結果を図３３に示す。
　実施例１７～１９及び比較例１４の分離条件を以下の表５にまとめた。
（分離度）
　各実施例及び比較例における分離度は、島津製作所のクロマトグラフィーデータ解析プログラム　ＬａｂＳｏｌｕｔｉｏｎｓ　Ｖｅｒｓｉｏｎ　５．９７によってして自動算出したＵＳＰ分離度である。結果を表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　実施例１７～１８と比較例１４を比較することにより、ＳＢ／ＳＡが０．０５以上、０．９５以下である場合に分離度が向上することが解る。
＜実験ＩＩ＞
＜実施例２０＞
［移動相の調製］
　上述した実施例１と同様の方法で移動相を調製した。
［アミンの分離］
　アミンの分離及び分析を次に示す方法を用いたこと以外は実施例１と同様の方法で、上記の式（３）で表されるアミンの分離及び分析を行った。
（分離方法・分析方法）
　高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）の検出器としてＡＣＱＵＩＴＹ　Ｑｄａ（日本ウォーターズ株式会社製、質量検出器）を用い、カラムに１時間移動相を０．７５ｍＬ／ｍｉｎで送液した後、試料を約１～２ｍｇ／ｍＬ溶液（フィルターでろ過済み）で移動相に溶解した試料液１μＬをオートサンプラにより注入し、同じ流速で、カラム温度を室温（約２５℃）に設定し、アミンの分離及び分析を行った。
　ＨＰＬＣで用いた装置の詳細を以下に示す。
・ＨＰＬＣ装置：ＡＣＱＵＩＴＹ　ＵＰＬＣ　Ｈ－Ｃｌａｓｓ　ＰＬＵＳ
・イオン化法：ＥＳＩ
・測定モード：Ｐｏｓｉｔｉｖｅ
・Ｐｒｏｂｅ温度：４００℃
・Ｓｏｕｒｓｅ温度：１２０℃
　結果を図３４に示す。図中のグラフの縦軸は、最も高いピークの最大値を１００％としている。これは以下の図３５～３８でも同様である。
　また、上記の分析により得られた検出質量ｍ／ｚ（イオンの相対質量を価数で割った値）を以下の表６に示す。
＜実施例２１＞
　上述した実施例１と同様の方法で移動相を調製した。
　アミンの分離及び分析を上記の実施例２０に示す方法を用いたたこと、及び分析対象を分析対象を上記の式（６）で表されるアミン（１－フェニル－１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリン）に変更したこと以外は実施例２０と同様の方法で分析対象であるアミンの分離、分析を行った。
　結果を図３５及び表６に示す。
＜実施例２２＞
　上述した実施例２と同様の方法で移動相を調製した。
　アミンの分離及び分析を上記の実施例２０に示す方法を用いたたこと以外は実施例２と同様の方法で、上記の式（３）で表されるアミンの分離及び分析を行った。
　結果を図３６及び表６に示す。
＜実施例２３＞
　上述した実施例３と同様の方法で移動相を調製した。
　アミンの分離及び分析を上記の実施例２０に示す方法を用いたたこと以外は実施例３と同様の方法で、上記の式（３）で表されるアミンの分離及び分析を行った。
　結果を図３７及び表６に示す。
＜実施例２４＞
　上述した実施例３と同様の方法で移動相を調製した。
　アミンの分離及び分析を上記の実施例２０に示す方法を用いたたこと、及び分析対象を下記の式（７）で表されるアミン（ニカルジピン）に変更したこと以外は実施例３と同様の方法でアミンの分離及び分析を行った。
　結果を図３８及び表６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
　以下の表２に上述したＳＢ／ＳＡを示す。該ＳＢ／ＳＡの計算において、シュウ酸の大部分は一価酸として存在するため、シュウ酸の価数は１として計算した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　図３４～３８及び表６で明らかなように、良好なマスクロマトグラム（質量検出器で得たクロマトグラム）を得ることができた。このことは、本開示の実施形態に係る方法がアミン、特にそのエナンチオマーの分離に有効であるのみならず、ＬＣ－ＭＳという検出法に対して好適に用い得るものであることを示している。ＬＣ－ＭＳは、クロマトグラフィーにおいて複数の溶出ピークが重なっても、質量により区別できるため、近年利用が拡がっている手法であり、これに適用できることの産業上の意味は大きい。
　以上より、本開示の実施形態に係るアミンの分離方法であれば、アミンの分離性能を向上させることができることが分かる。また、移動相に含まれる成分を、質量分析器による検出への悪影響を回避又は軽減し得るものから適切に選択することで、ＬＣ－ＭＳへの適用も可能であると考えられる。
　したがって、かかるアミンの分離方法は、各種液体クロマトグラフィーによる分析及び精製等に広く適用することができ、有機化学、医学、及び薬学等の分野での展開が期待される。

Claims (7)

  1. 　オリゴ糖、多糖、及びこれらの誘導体の少なくともいずれかを含む固定相と、
    　シュウ酸、酢酸、ギ酸、及びトリフルオロ酢酸からなる群から選択される１種以上の特定の酸、１種以上の塩基、並びに溶媒を含む移動相と、
    を用いてクロマトグラフィーによりアミンを分離する分離工程を含み、
    　前記移動相に含まれる各特定の酸について下記式（１）で算出される値をＡ、各特定の酸で算出された各Ａの合計値をＳＡ、前記移動相に含まれる各塩基について下記式（２）で算出される値をＢ、各塩基で算出された各Ｂの合計値をＳＢとした場合において、ＳＢ／ＳＡが、０．０５以上、０．９５以下である、
    　アミンの分離方法。
    式（１）：Ａ＝特定の酸の価数×特定の酸のモル濃度（ｍｏｌ／Ｌ）
    式（２）：Ｂ＝塩基の価数×塩基のモル濃度（ｍｏｌ／Ｌ）
  2. 　前記分離工程により分離されたアミンを分析する分析工程をさらに含み、
    　前記分析工程において、少なくとも質量分析器を用いた分析が行われる、
    　請求項１に記載のアミンの分離方法。
  3. 　前記塩基が、アンモニア、第１級アミン、第２級アミン、及び第３級アミンからなる群より選択される１種以上である、請求項１又は２に記載のアミンの分離方法。
  4. 　前記塩基が、アンモニア、エチルアミン、ｎ－プロピルアミン、２－プロピルアミン、ジメチルアミン、ジエチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ピロリジン、及びピペリジンからなる群より選択される１種以上である、請求項３に記載のアミンの分離方法。
  5. 　前記移動相が、前記特定の酸として、少なくともシュウ酸を含む、請求項１又は２に記載のアミンの分離方法。
  6. 　前記オリゴ糖、多糖、及びこれらの誘導体の少なくともいずれかが、光学活性部位を有する、請求項１又は２に記載のアミンの分離方法。
  7. 　前記溶媒が、水、アセトニトリル、エタノール、メタノール、２－プロパノール、ヘキサン、ヘプタン、ＴＨＦ、及び液体二酸化炭素からなる群から選択される１種以上である、請求項１又は２に記載のアミンの分離方法。
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