WO2024190856A1 - 抗ｂｃｍａ抗体およびキメラ抗原受容体 - Google Patents

抗ｂｃｍａ抗体およびキメラ抗原受容体 Download PDF

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    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione

Definitions

  • the present invention relates to an antibody specific to B cell maturation antigen (BCMA), an antigen-binding fragment thereof, and a chimeric antigen receptor containing said fragment.
  • BCMA B cell maturation antigen
  • BCMA also known as CD269 or TNFRSF17
  • BCMA is a member of the tumor necrosis factor receptor superfamily and its ligands are B cell-activating factor (BAFF) and proliferation-inducing ligand (APRIL). Binding of BCMA to BAFF or APRIL activates NF-kB and induces upregulation of anti-apoptotic Bcl-2 members, such as Bcl-xL or Bcl-2 and Mcl-1.
  • BAFF B cell-activating factor
  • APRIL proliferation-inducing ligand
  • BCMA expression is restricted to the B cell lineage, being expressed in plasmablasts, plasma cells and some mature B cells, and increasing during peripheral B cell differentiation. However, it is not expressed in most B cells, including naive B cells, memory B cells and germinal center B cells, and in other organs. BCMA is also highly expressed in cancer cells, and has been detected in cells from patients with multiple myeloma (MM), plasma cell leukemia (PL) and Hodgkin's lymphoma (HL).
  • MM multiple myeloma
  • PL plasma cell leukemia
  • HL Hodgkin's lymphoma
  • CAR-T cells T cells genetically modified to express chimeric antigen receptors (CARs) (CAR-T cells) are being developed.
  • CARs contain an antigen recognition domain and a T cell activation domain.
  • CARs can target without being restricted by MHC by utilizing the antigen-binding properties of monoclonal antibodies.
  • MHC multiple myeloma
  • the object of the present invention is to provide a CAR that targets BCMA, an anti-BCMA antibody that targets BCMA, and an antigen-binding fragment thereof.
  • BCMA complementarity determining region
  • amino acid sequences of the VL domain and the VH domain are selected from the group consisting of the following (1) to (6): (1) SEQ ID NOs: 37 and 38, (2) SEQ ID NOs: 39 and 40, (3) SEQ ID NOs: 41 and 42, (4) SEQ ID NOs: 43 and 44, (5) SEQ ID NOs: 45 and 46, and (6) SEQ ID NOs: 47 and 48.
  • [3] The antibody or antigen-binding fragment thereof according to [1] or [2], wherein the antibody or antigen-binding fragment thereof is selected from the group consisting of IgG, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv, and single domain antibody (dAB).
  • [4] The antigen-binding fragment of [3], wherein the antigen-binding fragment is an scFv.
  • [5] A nucleic acid encoding the antibody or antigen-binding fragment thereof according to any one of [1] to [4].
  • a chimeric antigen receptor comprising (i) an antigen-binding domain, (ii) a transmembrane domain, and (iii) an intracellular domain, A CAR, wherein the antigen-binding domain comprises the antigen-binding fragment according to any one of [1] to [4].
  • the intracellular domain comprises a costimulatory domain and an activation domain.
  • the costimulatory domain comprises an intracellular fragment of CD28.
  • the activation domain comprises an intracellular fragment of CD3 ⁇ .
  • a vector comprising a nucleic acid encoding the antibody or antigen-binding fragment thereof according to [5], or a nucleic acid encoding the CAR according to [10].
  • a cell comprising a nucleic acid encoding the antibody or antigen-binding fragment thereof according to [5], or a nucleic acid encoding the CAR according to [10].
  • a pharmaceutical composition comprising the cell according to [13] as an active ingredient.
  • a method for producing a cell expressing a CAR comprising a step of transducing a nucleic acid encoding the antibody or antigen-binding fragment thereof according to [5], a nucleic acid encoding the CAR according to [10], or the vector according to [11] into the cell.
  • the present invention provides an antibody specific to BCMA and its antigen-binding fragment, a chimeric antigen receptor (CAR) useful in the field of genetically modified immune cell therapy targeting BCMA, a nucleic acid encoding the CAR, a vector containing the nucleic acid, a cell expressing the CAR, a method for producing the cell, a pharmaceutical composition containing the cell as an active ingredient, and a method for preventing (including prevention of recurrence, the same applies below) or treating a disease, characterized by administering the pharmaceutical composition to a subject.
  • Cells expressing the CAR of the present invention have a high killing ability against cells expressing BCMA, and are expected to have a high therapeutic effect.
  • FIG. 1 is a diagram comparing the amino acid sequences of anti-BCMA antibodies 1 to 6.
  • FIG. 1 shows the structure of BCMA-CAR.
  • FIG. 1 shows cell signaling intensity of BCMA-CAR-expressing cells.
  • FIG. 1 is a diagram comparing the linker lengths of anti-BCMA antibodies.
  • FIG. 1 shows measurement of cytotoxic activity of BCMA-CAR-expressing cells.
  • FIG. 1 shows IFN- ⁇ production in BCMA-CAR-expressing cells.
  • FIG. 13 shows in vivo bioluminescence imaging of luciferase activity in tumor cells over time after infusion of BCMA-CAR-expressing cells, and a graph showing the numerical values of luminescence intensity.
  • FIG. 1 shows the effect of BCMA-CAR-expressing cells in suppressing the progression of anemia.
  • FIG. 1 shows the effect of BCMA-CAR-expressing cells in suppressing the progression of anemia.
  • FIG. 13 shows the inhibitory effect of BCMA-CAR-expressing cell therapy on the progression of bone region.
  • FIG. 13 shows the inhibitory effect of BCMA-CAR-expressing cell therapy on the progression of bone region.
  • the present invention provides an antibody that specifically binds to human BCMA, or a fragment of said antibody that specifically binds to human BCMA.
  • the antibody and fragment thereof comprise the amino acid sequences of complementarity determining region (CDR) 1, CDR2, and CDR3 of the VL region, and CDR1, CDR2, and CDR3 of the VH region, derived from any one selected from the group consisting of anti-B cell maturation antigen (BCMA) antibodies 1 to 6 shown in the Examples below.
  • the amino acid sequences of the complementarity determining regions CDR1 to 3 of the VL region, and CDR1 to 3 of the VH region are shown in (1) to (6) below, respectively.
  • SEQ ID NOs: 1 to 6 (2) SEQ ID NOs: 7 to 12, (3) SEQ ID NOs: 13 to 18, (4) SEQ ID NOs: 19 to 24, (5) SEQ ID NOs: 25 to 30, (6) SEQ ID NOs: 31 to 36.
  • the amino acid sequences of the VL and VH regions of the anti-BCMA or antigen-binding fragment thereof of the present invention are selected from the group consisting of (1) to (6) below.
  • amino acid sequences of the VL CDRs and VH CDRs of anti-BCMA antibodies 1 to 6 of the present invention are shown in Table 1 below.
  • Anti-BCMA antibody 1 which is an example of an antibody of the present invention, has CDRs 1 to 3 in the VL region that are composed of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1 to 3, respectively, and CDRs 1 to 3 in the VH region that are composed of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 4 to 6, respectively, and for example, the VL region and VH region contain the amino acids of SEQ ID NOs: 37 and 38, respectively, and for example, the VL region and VH region contain the nucleic acid sequences of SEQ ID NOs: 49 and 50, respectively.
  • Anti-BCMA antibody 2 which is an example of an antibody of the present invention, has CDRs 1 to 3 in the VL region that are composed of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 7 to 9, respectively, and CDRs 1 to 3 in the VH region that are composed of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 10 to 12, respectively, and for example, the VL region and VH region contain the amino acids of SEQ ID NOs: 39 and 40, respectively, and for example, the VL region and VH region contain the nucleic acid sequences of SEQ ID NOs: 51 and 52, respectively.
  • Anti-BCMA antibody 3 which is an example of an antibody of the present invention, has CDRs 1 to 3 in the VL region that are composed of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 13 to 15, respectively, and CDRs 1 to 3 in the VH region that are composed of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 16 to 18, respectively, and for example, the VL region and VH region contain the amino acids of SEQ ID NOs: 41 and 42, respectively, and for example, the VL region and VH region contain the nucleic acid sequences of SEQ ID NOs: 53 and 54, respectively.
  • Anti-BCMA antibody 4 which is an example of an antibody of the present invention, has CDRs 1 to 3 in the VL region that are composed of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 19 to 21, respectively, and CDRs 1 to 3 in the VH region that are composed of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 22 to 24, respectively, and for example, the VL region and VH region contain the amino acids of SEQ ID NOs: 43 and 44, respectively, and for example, the VL region and VH region contain the nucleic acid sequences of SEQ ID NOs: 55 and 56, respectively.
  • Anti-BCMA antibody 5 which is an example of an antibody of the present invention, has CDRs 1 to 3 of the VL region consisting of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 25 to 27, respectively, and CDRs 1 to 3 of the VH region consisting of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 28 to 30, respectively, and for example, the VL region and VH region contain the amino acids of SEQ ID NOs: 45 and 46, respectively, and for example, the VL region and VH region contain the nucleic acid sequences of SEQ ID NOs: 57 and 58, respectively.
  • Anti-BCMA antibody 6 which is an example of an antibody of the present invention, has CDRs 1 to 3 of the VL region consisting of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 31 to 33, respectively, and CDRs 1 to 3 of the VH region consisting of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 34 to 36, respectively, and for example, the VL region and VH region contain the amino acids of SEQ ID NOs: 47 and 48, respectively, and for example, the VL region and VH region contain the nucleic acid sequences of SEQ ID NOs: 59 and 60, respectively.
  • the above anti-BCMA antibodies 1 to 6 may contain one or more mutations as long as they specifically bind to human BCMA.
  • further examples of the antibodies or antigen-binding fragments thereof of the present invention include antibodies or antigen-binding fragments thereof that contain a VL region and a VH region containing amino acid sequences selected from the group consisting of the following (1') to (6') and have specific binding to human BCMA: (1') (i) an amino acid sequence of SEQ ID NO: 37, or a variant amino acid sequence of SEQ ID NO: 37, which comprises one or more mutations; and (ii) an amino acid sequence of SEQ ID NO: 38, or a variant amino acid sequence of SEQ ID NO: 38, which comprises one or more mutations, wherein at least one of (i) and (ii) is a variant amino acid sequence.
  • the term "mutation" includes deletion, addition, insertion, and substitution of amino acid residues.
  • the one or more mutations may be any combination of deletion, addition, insertion, and substitution of amino acid residues.
  • the substitution of the amino acid residue may be either conservative or non-conservative, but is preferably conservative.
  • Conservative substitution is a substitution between amino acid residues having similar properties that does not substantially alter the activity of the peptide, and is well known to those skilled in the art. For example, substitution between non-polar (hydrophobic) amino acids, substitution between polar (neutral) amino acids, substitution between basic amino acids, and substitution between acidic amino acids are included.
  • non-polar (hydrophobic) amino acids examples include alanine, valine, isoleucine, leucine, proline, tryptophan, phenylalanine, methionine, etc.
  • polar (neutral) amino acids examples include glycine, serine, threonine, tyrosine, glutamine, asparagine, cysteine, etc.
  • basic amino acids examples include arginine, histidine, and lysine.
  • acidic amino acids examples include aspartic acid and glutamic acid.
  • the one or more mutations are preferably in a region other than the CDR.
  • the one or more mutations may be, for example, 1 to 10 mutations, preferably 1 to 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 or 2 mutations, more preferably 1 to 3 mutations, and even more preferably 1 or 2 mutations.
  • the mutant amino acid sequence is, for example, an amino acid sequence having at least 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% sequence identity to any of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 37 to 48.
  • the percent (%) identity is determined by aligning the reference amino acid sequence and the comparison amino acid sequence to maximize the percent identity.
  • the percent (%) identity can be determined using a method known in the art, for example, BLAST, FASTA, etc.
  • an “antibody” is an immunoglobulin that specifically binds to an antigen and may comprise at least two heavy chains (H chains) and two light chains (L chains) inter-connected by disulfide bonds, or antigen-binding molecules thereof.
  • Each H chain comprises a VH region and a heavy chain constant region.
  • the heavy chain constant region comprises three constant domains, namely CH1, CH2 and CH3.
  • Each light chain comprises a VL region and a light chain constant region.
  • the light chain constant region comprises one constant domain, namely the CL region.
  • the VH and VL regions may be further subdivided into conserved regions called framework regions (FR) and regions of hypervariability called complementarity determining regions (CDR).
  • FR framework regions
  • CDR complementarity determining regions
  • VH and VL each comprise three CDRs and four FRs, arranged from amino-terminus to carboxy-terminus in the following order: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 and FR4.
  • the variable regions of the heavy and light chains contain antigen-binding sites that interact with antigens.
  • antibody includes, for example, monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, recombinant antibodies, multispecific antibodies (including bispecific antibodies), human antibodies, humanized antibodies, antibody variants, chimeric antibodies, synthetic antibodies, antibody light chain monomers, antibody heavy chain monomers, antibody light chain dimers, antibody heavy chain dimers, antibody light chain-antibody heavy chain pairs, intrabodies, antibody fusions (antibody conjugates), single chain antibodies (scFv), affibodies, Fab fragments, F(ab')2 fragments, disulfide-linked Fv (sdFv), anti-idiotypic (anti-Id) antibodies (including, for example, anti-anti-Id antibodies), minibodies, domain antibodies, antibody mimetics, and antigen-binding fragments of any of the above.
  • IgA, IgD, IgE, IgG, and IgM There are major classes of antibodies, IgA, IgD, IgE, IgG, and IgM, and based on the amino acid sequence of the heavy chain constant domain, they are known as alpha ( ⁇ ), delta ( ⁇ ), epsilon ( ⁇ ), gamma ( ⁇ ), and mu ( ⁇ ), which give rise to antibodies of the classes IgA, IgD, IgE, IgG, including subclasses such as IgG1, IgG2, IgG3, and IgG4, and IgM, respectively. Based on the amino acid sequence of the light chain constant domain, they are known as subclasses, such as kappa ( ⁇ ) or lambda ( ⁇ ).
  • the antibodies of the present invention may be of any class or subclass.
  • Antigen-binding fragment refers to any antigen-binding molecule that contains the antigen-binding portion (e.g., CDR) of an antibody.
  • the antigen-binding fragment of the present invention contains the CDR derived from the antibody of the present invention, and examples thereof include, but are not limited to, Fab, Fab', F(ab')2, Fv fragments, linear antibodies, scFv, single domain antibodies, and multispecific antibodies formed from antigen-binding molecules.
  • the antigen-binding fragment of the present invention may be in any of the above forms, and an example of one embodiment is scFv.
  • the scFv is a VH and VL heterodimer covalently linked by a linker peptide.
  • the linker peptide is, for example, a peptide of about 10 amino acids to about 25 amino acids, which is rich in glycine for flexibility, as well as rich in serine or threonine for solubility.
  • the linker can either link the N-terminus of the VH region to the C-terminus of the VL region, or link the C-terminus of the VH region to the N-terminus of the VL region. That is, the order from the N-terminus may be VL-linker-VH or VH-linker-VL.
  • Linker sequences useful in the present invention include, but are not limited to, glycine/serine linkers, such as GGGSGGGSGGGS (SEQ ID NO: 61), Gly4Ser(G4S) linkers, such as (G4S)3 linkers (SEQ ID NO: 62: GGGGSGGGGSGGGGGS) and (G4S)4 linkers (SEQ ID NO: 63: GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS), and the linker sequence GGSSRSSSSGGGGGSGGGG (SEQ ID NO: 64).
  • scFv maintains the specificity of the original immunoglobulin despite the removal of the constant region and the introduction of the linker.
  • the antibodies and antigen-binding fragments thereof of the present invention may have FRs derived from antibodies 1 to 6, or may have FRs derived from different antibodies, for example, FRs derived from antibodies of different animal species, so long as they retain the ability to bind to human BCMA.
  • Antibodies and antigen-binding fragments thereof produced by grafting the CDRs provided by the present invention to other FRs by methods well known to those skilled in the art are also encompassed by the present invention.
  • the antibodies of the present invention may have a constant region derived from antibodies 1 to 6, or may have a constant region of other antibodies, for example, antibodies derived from different animal species.
  • the binding affinity of the antibody of the present invention to the antigen can generally be expressed by the dissociation constant (KD).
  • KD dissociation constant
  • Affinity can be measured and/or expressed in many ways known in the art, including but not limited to the equilibrium dissociation constant (KD) and equilibrium association constant (KA).
  • KD is calculated from the quotient of koff/kon, while KA is calculated from the quotient of kon/koff.
  • kon refers to the association rate constant of, for example, an antibody to an antigen
  • koff refers to the dissociation constant of, for example, an antibody to an antigen.
  • kon and koff can be determined by techniques known to those skilled in the art, such as BIACORETM or KinExA.
  • the present invention includes a chimeric antigen receptor (CAR) comprising (i) an antigen-binding domain, (ii) a transmembrane domain, and (iii) an intracellular domain, wherein the antigen-binding domain comprises an anti-BCMA antibody of the present invention or an antigen-binding fragment thereof.
  • the CAR of the present invention is a recombinant receptor. Nucleic acids encoding these receptors are easily introduced into immune cells, including T cells, by techniques known in the art and expressed by the cells. The immune cells recognize BCMA through the CAR and are activated via the CAR bound to BCMA at the same time, attacking and destroying cells expressing BCMA. When BCMA is present on tumor cells, the immune cells expressing the CAR can damage and kill the tumor cells.
  • the antigen-binding domain contained in the CAR of the present invention is a polypeptide having six CDRs derived from any of the anti-BCMA antibodies 1 to 6 of the present invention, and is preferably an antigen-binding fragment of the antibodies 1 to 6, for example, one or more scFvs.
  • the antigen-binding domain optionally including a spacer domain and a leader peptide described below, may also be referred to as an extracellular domain.
  • the CAR of the present invention may include a hinge domain or spacer domain between the antigen-binding domain and the transmembrane domain.
  • hinge domain and “spacer domain” are used interchangeably.
  • This domain contains up to 300 amino acids, preferably 10 to 100 amino acids, and most preferably 25 to 50 amino acids.
  • the spacer domain is preferably a sequence that promotes binding between the CAR and the antigen and enhances signal transduction into the cell. Examples of amino acids that are expected to promote binding include cysteine, charged amino acids, or amino acids such as serine or threonine within a potential glycosylation site, and can be used as amino acids that constitute the spacer domain.
  • the spacer domain may be a whole or a part of amino acid numbers 118 to 178 of the hinge region of CD8 ⁇ (NCBI RefSeq: NP_001759.3), amino acid numbers 135 to 195 of CD8 ⁇ (GenBank: AAA35664.1), amino acid numbers 315 to 396 of CD4 (NCBI RefSeq: NP_000607.1), or amino acid numbers 137 to 152 of CD28 (NCBI RefSeq: NP_006130.1).
  • a part of the constant region of an antibody H chain or L chain (CH1 region or CL region) may also be used as the spacer domain.
  • the spacer domain may be an artificially designed sequence.
  • the CAR of the present invention may be designed to be a multimer, particularly a dimer. For example, CAR is multimerized (dimerized) by inserting cysteine into the spacer domain and/or transmembrane domain.
  • the CAR of the present invention may further comprise a leader peptide (also referred to herein as a "signal peptide” or “leader sequence”) at its N-terminus.
  • a leader peptide also referred to herein as a "signal peptide” or "leader sequence”
  • Polynucleotide and polypeptide sequences of leader peptides are known in the art.
  • the leader peptide of the GM-CSF receptor can be used.
  • the CAR of the present invention comprises a transmembrane domain that directly or indirectly links the antigen-binding domain and the intracellular domain.
  • the CAR of the present invention may also comprise an optional linker sequence or spacer sequence between these domains.
  • the transmembrane domain may be derived from a natural polypeptide or may be artificially designed.
  • the transmembrane domain derived from a natural polypeptide can be obtained from any membrane-binding protein or transmembrane protein.
  • the transmembrane domains of the ⁇ and ⁇ chains of the T cell receptor can be used.
  • the artificially designed transmembrane domain may also be a polypeptide that mainly contains hydrophobic residues such as leucine and valine. Also preferably, triplets of phenylalanine, tryptophan and/or valine are found at each end of the artificial transmembrane domain.
  • a short oligopeptide or polypeptide linker for example a linker consisting of a sequence of 2 to 10 amino acids in length, can be placed between the transmembrane domain and the intracellular domain.
  • a linker sequence having a glycine-serine consecutive sequence can be used.
  • the transmembrane domain can be a transmembrane domain having a sequence of amino acids 153 to 180 of CD28 (NCBI RefSeq: NP_006130.1).
  • a transmembrane domain can be a transmembrane domain having a sequence of amino acids 162 to 183 of GITR (NCBI RefSeq: NP_004186.1).
  • the CAR of the present invention comprises an intracellular domain.
  • the intracellular domain is a molecule capable of transmitting a signal into a cell when an antigen-binding domain present in the same molecule binds (interacts) with an antigen. It is known that a signal generated only through the T cell receptor (TCR) complex is insufficient for activating T cells, and that a secondary or costimulatory signal is also required.
  • TCR T cell receptor
  • Natural T cell activation signals are transmitted by two different types of cytoplasmic signaling sequences, i.e., a sequence (activation domain) that initiates antigen-dependent primary activation via the TCR complex, and a sequence (costimulatory domain) that acts antigen-independently to provide a secondary or costimulatory signal.
  • the CAR of the present invention comprises the activation domain and/or the costimulatory domain as the intracellular domain.
  • Activation domains may contain signal transduction motifs known as immunoreceptor tyrosine-based activation motifs (ITAMs) [Nature, vol. 338, pp. 383-384 (1989)].
  • Activation domains that can be used in the present invention include, for example, ITAMs derived from CD3 ⁇ , FcR ⁇ , FcR ⁇ , CD3 ⁇ , CD3 ⁇ , CD3 ⁇ , CD5, CD22, CD79a, CD79b, and CD66d.
  • amino acid numbers 51 to 164 of CD3 ⁇ (NCBI RefSeq: NP_932170.1), amino acid numbers 45 to 86 of Fc ⁇ RI ⁇ (NCBI RefSeq: NP_004097.1), amino acid numbers 201 to 244 of Fc ⁇ RI ⁇ (NCBI RefSeq: NP_000130.1), amino acid numbers 139 to 182 of CD3 ⁇ (NCBI RefSeq: NP_000064.1), amino acid numbers 128 to 171 of CD3 ⁇ (NCBI RefSeq: NP_000723.1), and amino acid number 15 of CD3 ⁇ (NCBI RefSeq: NP_000724.1).
  • amino acid numbers 402 to 495 of CD5 (NCBI RefSeq: NP_055022.2), amino acid numbers 707 to 847 of CD22 (NCBI RefSeq: NP_001762.2), amino acid numbers 166 to 226 of CD79a (NCBI RefSeq: NP_001774.1), amino acid numbers 182 to 229 of CD79b (NCBI RefSeq: NP_000617.1), and amino acid numbers 177 to 252 of CD66d (NCBI RefSeq: NP_001806.2), and variants thereof having the same function as these.
  • the amino acid numbers based on the NCBI RefSeq ID and GenBank amino acid sequence information described in this specification are numbers assigned to the full length precursors of each protein (including signal peptide sequences, etc.).
  • Co-stimulatory domains include sequences derived from, for example, CD2, CD4, CD5, CD8 ⁇ , CD8 ⁇ , CD28, CD134, CD137, ICOS, and CD154.
  • Specific examples include amino acid numbers 236-351 of CD2 (NCBI RefSeq: NP_001758.2), amino acid numbers 421-458 of CD4 (NCBI RefSeq: NP_000607.1), amino acid numbers 402-495 of CD5 (NCBI RefSeq: NP_055022.2), amino acid numbers 207-235 of CD8 ⁇ (NCBI RefSeq: NP_001759.3), amino acid numbers 196-210 of CD8 ⁇ (GenBank: AAA35664.1), and CD Examples of such peptides include peptides having the sequences of amino acid numbers 181 to 220 of CD137 (4-1BB, NCBI RefSeq: NP_001552.2), amino acid numbers 214 to 255 of CD134 (OX40, NCBI RefSeq:
  • the present invention includes CARs that contain one or more, for example two or three, activation domains or costimulatory domains as the intracellular domain.
  • Particularly preferred examples include CARs that contain the activation domain of CD3 ⁇ as the intracellular domain, and CARs that contain the activation domain of CD3 ⁇ and the costimulatory domain of CD28 as the intracellular domain.
  • CARs in which multiple intracellular domains of the same type are linked in tandem are also included in the present invention.
  • an oligopeptide linker or a polypeptide linker can be inserted between each domain contained in the intracellular domain to link them.
  • a linker consisting of 2 to 10 amino acids in length can be used.
  • a linker having a glycine-serine consecutive sequence can be used.
  • the present invention provides a nucleic acid encoding the antibody or antigen-binding fragment thereof of (1) and the CAR of (2).
  • the nucleic acid of the present invention can express the antibody, antigen-binding fragment thereof, or CAR of the present invention in a cell.
  • the nucleic acid encoding the VL region and VH region of the anti-BCMA antibody 1 of the present invention has, for example, the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 49 and 50
  • the nucleic acid encoding the VL region and VH region of the anti-BCMA antibody 2 of the present invention has, for example, the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 51 and 52
  • the nucleic acid encoding the VL region and VH region of the anti-BCMA antibody 3 of the present invention has, for example, the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 53 and 54
  • the nucleic acid encoding the VL region and VH region of the anti-BCMA antibody 4 of the present invention has, for example, the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 55 and 56
  • the nucleic acid encoding the VL region and VH region of the anti-BCMA antibody 5 of the present invention has, for example, the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 57 and 58
  • nucleic acid of the present invention is not limited, and single-stranded nucleic acid, double-stranded nucleic acid, DNA, or RNA can be used.
  • DNA include double-stranded DNA, single-stranded DNA, and cDNA
  • RNA examples include mRNA.
  • the nucleic acids of the present invention can be linked to nucleic acids having a promoter sequence so as to be expressed in a cell.
  • promoters include promoters that constitutively promote expression of a gene or an operably linked construct, and promoters that induce expression of a gene or an operably linked construct by the action of a drug, etc. (e.g., tetracycline or doxorubicin).
  • the nucleic acids of the present invention can also be linked to nucleic acids comprising other regulatory elements that cooperate with the promoter or transcription initiation site, such as enhancer sequences or terminator sequences, to obtain efficient transcription of the nucleic acid.
  • the nucleic acid of the invention is a nucleic acid that is codon-optimized for expression in a particular host cell.
  • the present invention provides a vector comprising the nucleic acid of the present invention described above in (3).
  • the vector of the present invention can deliver and express the antibody, antigen-binding fragment thereof, or CAR of the present invention in a desired cell.
  • the multiple peptides when expressing multiple polypeptides, may be transcribed and translated by separate promoters, or may be transcribed and translated by a single promoter using an internal ribosome entry site (IRES).
  • IRS internal ribosome entry site
  • a nucleic acid encoding a polypeptide in which multiple polypeptides are connected to each other via a self-cleaving peptide may be transcribed and translated by a single promoter.
  • a vector that can be used in the present invention contains an appropriate control sequence that is functionally linked to the nucleic acid of the present invention so as to express the nucleic acid of the present invention in an appropriate host cell.
  • control sequence include a promoter for transcribing the nucleic acid of the present invention, an arbitrary operator sequence for controlling transcription, a ribosome binding site sequence, an enhancer, a polyadenylation sequence, and a sequence that controls the termination of transcription or translation.
  • promoters that control transcription in mammalian cells include mammalian-derived promoters (PGK promoter, EF1- ⁇ promoter, ⁇ -globin promoter, etc.), virus-derived promoters (CMV promoter, SV40 promoter, MMLV-LTR promoter, HIV-LTR promoter, etc.), and artificially constructed promoters (CAG promoter, etc.).
  • the vector may contain various sequences known to those skilled in the art, such as restriction enzyme cleavage sites, marker genes (selection genes) such as drug resistance genes, signal sequences, leader sequences, etc., as necessary. These various sequences or sites can be appropriately selected and used by those skilled in the art depending on the type of polypeptide to be expressed, the host cell to be used, the culture medium, and other conditions.
  • the vector of the present invention may contain, in addition to the nucleic acid of the present invention, a gene that can serve as a marker for confirming that the vector has been introduced into a cell (e.g., a drug resistance gene, a gene encoding a reporter enzyme, or a gene encoding a fluorescent protein) or a therapeutic gene.
  • a gene that can serve as a marker for confirming that the vector has been introduced into a cell e.g., a drug resistance gene, a gene encoding a reporter enzyme, or a gene encoding a fluorescent protein
  • Vectors that can be used in the present invention include vectors that are integrated into the genome of a host cell, vectors that are not integrated, and episomal vectors that exist in the cytoplasm and replicate autonomously.
  • plasmid vectors virus vectors, transposon vectors, artificial chromosomes, etc. can be preferably used.
  • virus vectors retrovirus vectors (including oncoretrovirus vectors, lentivirus vectors, and pseudotype vectors), adenovirus vectors, adeno-associated virus (AAV) vectors, simian virus vectors, vaccinia virus vectors, Sendai virus vectors, Epstein-Barr virus (EBV) vectors, HSV vectors, and other virus vectors can be used.
  • retrovirus vectors including oncoretrovirus vectors, lentivirus vectors, and pseudotype vectors
  • AAV adeno-associated virus vectors
  • simian virus vectors simian virus vectors
  • vaccinia virus vectors Sendai virus
  • virus vectors those that have been deficient in replication ability so that the virus cannot replicate autonomously in infected cells are preferred.
  • Various virus vectors and methods for producing them are well known to those skilled in the art.
  • commercially available virus vectors may be used in the present invention.
  • Non-viral vectors can also be used in combination with condensing agents such as liposomes and cationic lipids.
  • the nucleic acid of the present invention can be introduced into cells by calcium phosphate transfection, DEAE-dextran, electroporation, and particle bombardment.
  • the present invention provides cells expressing the antibody or antigen-binding fragment thereof of (1) above and the CAR of (2) above.
  • the origin of the cells of the present invention is not particularly limited, and cells derived from mammals, for example, human cells, or cells derived from non-human mammals such as monkeys, mice, rats, pigs, horses, and dogs, can be used.
  • the cells of the present invention are preferably human cells.
  • the antibodies of the present invention or antigen-binding fragments thereof can be produced by culturing the cells of the present invention.
  • the type of cells of the present invention is not particularly limited, and any cell can be used.
  • cells collected, isolated, or purified from body fluids, tissues, or organs such as blood (peripheral blood, umbilical cord blood, etc.) or bone marrow, or cells obtained by differentiating the above-mentioned cells or reprogramming them to produce pluripotent stem cells (iPSCs) can be used (see, for example, Themeli et al. 2013).
  • PBMCs Peripheral blood mononuclear cells
  • immune cells umbilical cord blood mononuclear cells
  • fibroblasts fibroblasts
  • adipocyte precursors hepatocytes
  • skin keratinocytes mesenchymal stem cells
  • adipose stem cells various cancer cell lines
  • neural stem cells can be used.
  • NK cells or T cells precursor cells of T cells (hematopoietic stem cells, lymphocyte precursor cells, etc.), or cell populations containing them can be used.
  • T cells include CD8-positive T cells, CD4-positive T cells, regulatory T cells, cytotoxic T cells, and tumor-infiltrating lymphocytes.
  • the cell population containing T cells and precursor cells of T cells includes PBMCs.
  • the above-mentioned cells may be collected from a living body, obtained by expanding cells collected from a living body, or established as a cell line. Furthermore, cells obtained by differentiation from pluripotent stem cells (ES cells, iPS cells, etc.), such as immune cells, may be used as the cells of the present invention.
  • ES cells pluripotent stem cells
  • iPS cells can be produced from a clone of T cells that has the ability to recognize and damage specific cells, and then differentiated to obtain T cells.
  • the T cells thus obtained have the same specific cytotoxic activity as the starting T cell clone, and are in a more undifferentiated state.
  • a nucleic acid encoding the antibody of the present invention or a vector carrying said nucleic acid is introduced into a cell suitable for producing a recombinant protein.
  • said cells include Chinese hamster ovary (CHO) cell lines and immortalized cells originating from lymphatic tissue.
  • CHO cells deficient in dihydrofolate reductase (DHFR) are suitable as host cells for producing antibodies.
  • immune cells refers to all cells involved in immune function in the body, including hematopoietic stem cells, neutrophils, basophils, macrophages, lymphocytes (B cells and T cells), monocytes, dendritic cells, natural killer (NK) cells, plasma cells, etc. Of these, T cells and NK cells are preferred for the present invention. Note that “immune cells” in this specification also include “immune cell precursor cells” that have the ability to differentiate into the above-mentioned immune cells.
  • nucleic acid When transplantation of the cells of the present invention or cells differentiated from the cells of the present invention into an organism is desired, it is preferable to introduce the nucleic acid into the organism itself or into cells taken from the same organism.
  • the cells of the present invention may express the antibody or antigen-binding fragment thereof, or the CAR of the present invention, and may further express a polypeptide (enzyme, antibody, cytokine, receptor, etc.) or a nucleic acid (siRNA, etc.) that is useful for treating a disease.
  • a polypeptide enzyme, antibody, cytokine, receptor, etc.
  • a nucleic acid siRNA, etc.
  • target cells refers to cells that are desired to be reduced or eliminated in a patient, and examples thereof include tumor cells and cells infected with a pathogen.
  • the target cells are preferably tumor cells, and more preferably hematopoietic tumor cells and solid tumor cells.
  • Immune cells expressing the CAR of the present invention have the ability to recognize cells expressing BCMA and destroy those cells through their cytotoxic activity.
  • This cytotoxic activity can be evaluated by known methods.
  • the cytotoxic activity of the cells of the present invention against target cells labeled with a radioactive substance, fluorescent substance, etc. can be evaluated by measuring the intensity of the radioactivity or fluorescent substance released from the target cells destroyed by the cells of the present invention. It can also be detected by measuring the amount of cytokines such as GM-CSF and IFN- ⁇ that are specifically released from the cells of the present invention or target cells.
  • the present invention provides a method for producing a cell, comprising the step of introducing the nucleic acid of the present invention described in (3) above into a cell. That is, the cell of the present invention described in (5) above can be produced by the method for producing a cell of the present invention.
  • This step is usually carried out ex vivo.
  • it can be produced by transforming cells ex vivo using the nucleic acid (3) or the vector (4).
  • cells derived from mammals such as humans, or cells derived from non-human mammals, such as monkeys, mice, rats, pigs, cows, and dogs, can be used.
  • mammals such as humans
  • non-human mammals such as monkeys, mice, rats, pigs, cows, and dogs
  • the above-mentioned cells may be collected from a living body, expanded and cultured, or established as a cell line.
  • the efficiency of nucleic acid introduction into cells can be improved by stimulating the cells before the introduction of the nucleic acid or vector.
  • a specific type of cell can be enriched.
  • PBMCs are cultured in the presence of an anti-CD3 antibody
  • the ratio of T cells is improved.
  • PBMCs are cultured in the presence of an anti-CD3 antibody and retronectin, a recombinant fibronectin fragment, a cell population rich in CD8-positive T cells can be obtained.
  • Non-viral vectors can also be used in the present invention when used in combination with adjuvants such as liposomes, cationic lipids, and polyethyleneimine.
  • the nucleic acid of the present invention can be introduced into cells by calcium phosphate transfection, DEAE-dextran, electroporation, and particle bombardment.
  • Retroviral particles or lentiviral particles can also be produced using 293 cells or 293T cells, which have high transfection efficiency.
  • Many types of viral vectors produced based on retroviruses and lentiviruses, as well as packaging cells and packaging kits that can be used to package the vectors, are widely available commercially from various companies.
  • the number of cells can be expanded by culturing the cells into which the nucleic acid of the present invention has been introduced outside the body.
  • a medium suitable for the cells may be used, and may be selected from known or commercially available media.
  • media that can be used for culturing lymphocytes and other immune cells are known to those skilled in the art, and media with various compositions are commercially available. These media include those containing human or animal serum (e.g., fetal bovine serum; FBS or FCS), xeno-free media, media that do not contain unknown components (defined media), etc., and may be selected according to the purpose.
  • culture vessels plates, petri dishes, flasks, bags, culture tanks, etc.
  • culture conditions may be the same as those for normal cell culture (e.g., 32 to 37°C, 5% CO2, etc.).
  • operations such as adding fresh medium to the culture at appropriate time intervals to dilute the culture, replacing the medium, and replacing the cell culture vessel can be performed.
  • composition of the Present Invention provides a pharmaceutical composition comprising the cell of the present invention described in (5), for example, an immune cell expressing the CAR of the present invention, as an active ingredient.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may comprise a pharmaceutical acceptable excipient.
  • compositions are well known to those skilled in the art, and include, for example, phosphate buffered saline (e.g., 0.01 M phosphate, 0.138 M NaCl, 0.0027 M KCl, pH 7.4), an aqueous solution containing a mineral acid salt such as hydrochloride, hydrobromide, phosphate, or sulfate, physiological saline, a solution of glycol or ethanol, and a salt of an organic acid such as acetate, propionate, malonate, or benzoate. Auxiliaries such as wetting agents or emulsifiers, and pH buffers may also be used. Pharmaceutically acceptable excipients are also described in Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be in a known form suitable for parenteral administration, for example, injection or infusion.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further contain formulation auxiliary agents such as suspending agents, preservatives, stabilizers and/or dispersing agents, and preservatives to extend the shelf life during storage.
  • the present invention also provides pharmaceutical compositions other than cell medicines.
  • the antibody and its antigen-binding fragment of the present invention can be used to prepare antibody-drug conjugates (ADCs) in combination with anticancer drugs or other drugs.
  • the conjugates can specifically deliver drugs to cells, tissues, etc. that express BCMA.
  • the antibody or antigen-binding fragment can be bound to a drug by an appropriate means, taking into account the structure of the drug.
  • the present invention can be used to prepare bispecific antibodies.
  • a bispecific T cell-inducing antibody (BiTE) in which the antigen-binding fragment of the present invention is bound to an antigen-binding fragment of an anti-CD3 antibody exerts an antitumor effect by inducing T cells to BCMA-expressing cells.
  • a bispecific antibody can be prepared by recombinant DNA technology using the nucleic acid of the present invention and a nucleic acid encoding another antibody or a fragment thereof.
  • the present invention provides a method for preventing or treating a disease, comprising administering the pharmaceutical composition of the present invention described in (7) above to a subject.
  • the disease to which the pharmaceutical composition of the present invention, for example, cells expressing the CAR of the present invention, is administered may be any disease sensitive to cells contained in the composition as an active ingredient, and examples thereof include, but are not limited to, diseases associated with cells expressing BMCA.
  • diseases that can be prevented or treated by the pharmaceutical composition of the present invention include B cell-related diseases, and include multiple myeloma (MM), non-Hodgkin's lymphoma (NHL), B cell proliferation of indeterminate grade, lymphomatoid granulomatosis, post-transplant lymphoproliferative disorder, immunoregulatory disorders, rheumatoid arthritis, myasthenia gravis, idiopathic thrombocytopenic purpura, antiphospholipid syndrome, Chagas disease, Graves' disease, Wegener's granulomatosis, polyarteritis nodosa, Sjogren's syndrome, pemphigus vulgaris, scleroderma, multiple sclerosis, antiphospholipid syndrome, ANCA-associated vasculitis, Goodpasture's disease, Kawasaki disease, autoimmune hemolytic anemia and rapidly progressive glomerulonephritis, heavy chain disease, primary or immune cell-associated amyloidosis, or monoclonal MM
  • MM includes overt multiple myeloma, smoldering multiple myeloma, plasma cell leukemia, nonsecretory myeloma, IgD myeloma, osteosclerotic myeloma, isolated plasmacytoma of bone, and extramedullary plasmacytoma.
  • NHL includes Burkitt's lymphoma, chronic lymphocytic leukemia/small lymphocytic lymphoma (CLL/SLL), diffuse large B-cell lymphoma, follicular lymphoma, immunoblastic large cell lymphoma, precursor B-lymphoblastic lymphoma, and mantle cell lymphoma.
  • the pharmaceutical composition may be administered intradermally, subcutaneously, intravenously, or systemically or locally to the affected area or nearby tissue, for example, subcutaneously.
  • the dosage may be adjusted appropriately depending on the age, weight, administration method, etc. of the subject to be administered. In such cases, the number of administrations and the administration interval in the case of multiple administrations should also be taken into consideration.
  • the subject to be administered is an animal, preferably a mammal, such as a human, or a non-human mammal such as a monkey, mouse, rat, pig, horse, or dog. More preferably, the subject is a human.
  • a ligand that binds to the CAR expressed by the cells of the present invention is administered to a subject to which the cells of the present invention have been administered, thereby inducing proliferation of the cells of the present invention in the body and/or extending the duration of the cells in the body.
  • a method of administering the ligand there are no particular limitations on the method of administering the ligand, but an appropriate method is selected taking into consideration the distribution of the cells of the present invention in the body, etc.
  • the dosage and administration schedule of the ligand may also be appropriately set taking into consideration the type and dosage of cells to be combined, the type of disease, etc.
  • Example 1 Cloning of anti-BCMA antibody Three BALB/c mice were immunized with Recombinant Human BCMA/TNFRSF17 Fc Chimera (R&D Systems, Cat. No. 193-BC) by the iliac lymph node method. The iliac lymph nodes of the immunized mice were collected, and lymphocytes were fused with SP2/0 myeloma cells to clone antibody-producing hybridomas. Total RNA was extracted from six hybridoma clones producing anti-human BCMA antibodies using NucleoSpin RNA (Takara Bio). Using 350 ng of hybridoma-derived total RNA as a template, reverse transcription (RT reaction) was performed using SMARTer RACE 5'/3' Kit (Takara Bio) to synthesize cDNA.
  • RT reaction reverse transcription
  • PCR of the DNA encoding the VL region was performed using a primer pair consisting of a UPM sense primer corresponding to the 5' end of the 5'-RACE cDNA (sequence number 67: GATTACGCCAAGCTTCTCATTCCTGTTGAAGCTCTTGACAAT) and an antisense primer corresponding to the end of the L chain constant region of mIgG1 (sequence number 68: GATTACGCCAAGCTTCTCAATTTTCTTGTCCACCTTGGTGC), while PCR of the DNA encoding the VH region was performed using a primer pair consisting of a UPM sense primer corresponding to the 5' end of the 5'-RACE cDNA and an antisense primer corresponding to the end of the CH1 end of the H chain constant region of mIgG1.
  • PCR was performed using 2.5 ⁇ L of the solution after the RT reaction (cDNA solution) diluted 5.5-fold with Tricine-EDTA Buffer, adding 10x sense primer, 50 nM antisense primer, 2x SeqAmp Buffer, and SeqAmp DNA polymerase (Takara Bio) to make a total volume of 50 ⁇ L, and repeating 25 cycles of 94°C for 30 seconds, 68°C for 30 seconds, and 72°C for 3 minutes in a TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice (Takara Bio).
  • the PCR products were separated by agarose gel electrophoresis, and the amplified variable region DNA fragments, i.e., DNA encoding the LV region and HV region, were cloned. That is, after electrophoresis, the bands corresponding to the amplified fragments were cut out as gel blocks, and the DNA was purified using NucleoSpin Gel and PCR Clean-up (Takara Bio Inc.), and an In-Fusion reaction with the cloning vector was carried out.
  • variable region DNA fragments were determined by sequencing the plasmids in which their insertion was confirmed using 3.2 pmol of M13 reverse primer (SEQ ID NO: 69: CAGGAAACAGCTATGAC) and M13 forward primer (SEQ ID NO: 70: GTAAAACGACGGCCAGT).
  • the CDR1 of the L chain was 24th to 38th amino acids, CDR2 was 54th to 60th, and CDR3 was 113th to 121st.
  • CDR1 of the H chain was located at amino acids 31-35, CDR2 at 50-66, and CDR3 at 99-110.
  • the antibodies thus obtained are called anti-BCMA antibodies 1-6.
  • the sequences of the CDR, VL, and VH of anti-BCMA antibodies 1-6 are shown in Tables 2-1 to 2-5.
  • a comparison of the amino acid sequences of anti-BCMA antibodies 1-6 is shown in Figure 1.
  • Example 2 Anti-BCMA CAR (1) Construction of CAR expression vector plasmid CARs containing antigen-binding fragments of each anti-BCMA antibody obtained in Example 1 were prepared. A nucleic acid was prepared encoding a CAR containing, from the N-terminus, a signal peptide sequence of a GM-CSF receptor, a VL region of an anti-BCMA antibody, a linker sequence (18 amino acids, SEQ ID NO: 64, also referred to as "18aa linker”), a VH region of an anti-BCMA antibody, an extracellular region, a transmembrane region and an intracellular region of CD28, and a CD3 ⁇ intracellular region. This CAR was named BCMA-CAR.
  • the 293T cell line and the PG13 cell line were cultured in DMEM/F-12 medium supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) and 100 U/mL Penicillin-Streptomycin.
  • FBS fetal bovine serum
  • each retroviral vector solution was prepared by the procedure shown below.
  • a transient retroviral vector supernatant was prepared in 293T cells.
  • Retroviral packaging plasmids Gag-pol expression plasmid pGP, VSV-G expression plasmid pVSV-G (Uchibori R, et al. Mol Ther Oncolytics. 2018; 12: 16-25.)
  • retroviral plasmid pMEI-5/BCMA-CAR were introduced into 293T cells by the calcium phosphate method, and the cells were cultured for 7 hours under conditions of 37°C and 5% CO2 .
  • the entire medium was replaced with DMEM/F-12 medium supplemented with 5 mM sodium butyrate (STEMCELL Technologies Inc.) at a final concentration, and the cells were cultured for 16 hours at 37°C and 5% CO2 .
  • the entire medium was replaced with DMEM/F-12 medium, and the cells were cultured for 24 hours at 32°C and 5% CO2 .
  • the cells were centrifuged at 2,000 ⁇ g for 10 minutes to recover the virus vector supernatant, and then filtered using a 0.45 ⁇ m filter to remove cell debris.
  • Retro-X Concentrator (Takara Bio Inc.) was added to the virus supernatant, mixed, and then allowed to stand overnight at 4°C. The mixture was centrifuged at 2,000 ⁇ g for 10 minutes, and the pellet was resuspended in 1 mL of DMEM/F-12 medium to obtain a concentrated virus solution.
  • a retroviral vector was produced using the PG13 cell line as a packaging cell line. That is, PG13 cells seeded on a 6-well plate were exposed to the purified virus solution in the presence of 8 ⁇ g/mL polybrene, and left for 7 hours in an incubator set at 37° C. and 5% CO 2 , after which 1 mL of DMEM/F-12 medium was added and left in the incubator overnight. The next day, the entire medium was replaced and left for 6 hours in an incubator set at 37° C. and 5% CO 2 , after which the transduced cells were detached and the entire amount was passaged to a T-75 flask.
  • the cells were cultured for 7 to 10 days in an incubator set at 37° C. and 5% CO 2.
  • the cells detached from the wells by trypsin treatment were seeded on a 12-well plate and cultured for 3 to 4 days in an incubator set at 37° C. and 5% CO 2 .
  • the cells were detached from the wells by trypsinization, and 3/4 of the cells were resuspended in a cryopreservation solution (Cell Banker: manufactured by Nippon Zenyaku Kogyo Co., Ltd.) and frozen and stored in a -80°C freezer.
  • the remaining 1/4 of the cells were seeded on a 12-well plate and cultured for 3-4 days in an incubator set at 37°C and 5% CO2.
  • the entire medium was replaced with DMEM/F-12 medium supplemented with sodium butyrate at a final concentration of 5 mM.
  • the culture was left to stand for 48 hours in an incubator set at 32°C and 5% CO2 .
  • the culture was centrifuged at 2,000 x g for 10 minutes, and the supernatant was collected and filtered using a 0.45 ⁇ m filter to remove cell debris, resulting in a retroviral vector solution.
  • retroviral vector solution was collected and the titer (Retrovirus Titer Set (for Real Time PCR): Takara Bio) was measured, and the remainder was dispensed into cryo-ceramic tubes and frozen and stored in a -80°C freezer until use.
  • a stably producing retroviral vector clone was established by measuring and selecting the virus supernatant titer (Retrovirus Titer Set (for Real Time PCR)) of each clone.
  • the thawed frozen preserved cells were seeded in a T-75 flask, and then expanded to a T-225 flask. When the cells reached confluence, the medium was replaced with DMEM/F-12 medium supplemented with 5 mM sodium butyrate at a final concentration.
  • the retroviral vector solution was collected in the same manner as described above, dispensed into cryo-ceramic tubes, and frozen and stored in a -80°C freezer until use.
  • a self-inactivating retroviral vector solution carrying an expression cassette having a switch function that induces expression of a luciferase gene in response to an activation signal from CAR was prepared by the procedure shown below.
  • This expression cassette can test the function of BCMA-CAR.
  • a transient retroviral vector supernatant was prepared in 293T cells.
  • Retroviral packaging plasmids (Gag-pol expression plasmid pGP, VSV-G expression plasmid pVSV-G) and retroviral plasmid pRetro-X Q/BR6N-ELuc were introduced into 293T cells by the calcium phosphate method, and the cells were cultured for 7 hours under conditions of 37°C and 5% CO2 (Uchibori R, et al. Mol Ther Oncolytics. 2018; 12: 16-25.). The entire medium was replaced with DMEM/F-12 medium supplemented with 5 mM sodium butyrate (STEMCELL Technologies Inc.) at a final concentration, and the cells were cultured for 16 hours at 37° C. and 5% CO 2.
  • the entire medium was replaced with DMEM/F-12 medium, and the cells were cultured for 24 hours at 32° C. and 5% CO 2. After the culture, the cells were centrifuged at 2,000 ⁇ g for 10 minutes to recover the viral vector supernatant, and then filtered using a 0.45 ⁇ m filter to remove cell debris.
  • RetroNectin-conjugated virus infection method J Biochem. 2001 Sep; 130(3): 331-4
  • 20 ⁇ g/mL RetroNectin solution (manufactured by Takara Bio) diluted with PBS was added at 0.5 mL/well to a 24-well plate with an untreated surface and allowed to stand at 4°C.
  • the RetroNectin solution was removed, and blocking solution (phosphate buffered saline (PBS) supplemented with 2% bovine serum albumin (BSA)) was added at 0.5 mL/well, and the plate was allowed to stand at room temperature for 30 minutes to perform blocking treatment.
  • PBS phosphate buffered saline
  • BSA bovine serum albumin
  • Example BR6N-ELuc retrovirus vector solution (diluted to 4.0 x 10 9 copies/mL with PBS) prepared in Example 2-(3) was added to each RetroNectin-coated plate at 0.5 mL/well.
  • the plate to which the retrovirus was added was set in a centrifuge kept at 32°C and centrifuged at 32°C and 1,960 x g for 2 hours to promote adsorption of virus particles onto RetroNectin.
  • the virus dilution solution was removed from the plate and washed with 1 mL of PBS supplemented with 1% BSA.
  • Jurkat cells (diluted to 4.0 x 10 5 cells/mL with RPMI1640 medium) were added to the virus-adsorbed plate at 1 mL/well and centrifuged at 32°C and 1,960 x g for 10 minutes. The plate was left to stand overnight in an incubator set at 37°C and 5% CO 2 to perform transduction. The transduced Jurkat cells were collected the next day, suspended in 7.5 mL of RPMI 1640 medium, and placed in an incubator set at 37°C and 5% CO2 (Day 1). In order to isolate single cell clones by limiting dilution at the subconfluent stage, the cells were cultured for 7 to 10 days in an incubator set at 37°C and 5% CO2 .
  • the cells were collected from the wells, seeded on a 12-well plate, and cultured for 3 to 4 days in an incubator set at 37°C and 5% CO2 .
  • the cells were collected from the wells, seeded on a T-25 flask, and cultured for 3 to 4 days in an incubator set at 37°C and 5% CO2 .
  • 1.0 x 105 cells/well were seeded on a 96-well white microplate for luminescence signal detection, and the remaining cells were seeded on a T-75 flask to continue the culture.
  • TPA (12-O-tetradecanoylphorbol 13-acetate) and Ionomycin were added to the cells seeded on a 96-well white microplate, and 24 hours later, luciferase assay was performed to measure the luminescence intensity.
  • Cells with low luminescence intensity in the non-stimulated group and excellent luminescence intensity ratio between the non-stimulated group and the stimulated group were used as transduced Jurkat cells (Jurkat/iELuc cells) to be used in the functional assay of BCMA-CAR.
  • Jurkat/iELuc cells were expanded to a T-225 flask, and when they reached confluence, they were suspended in a freezing storage solution (Cell Banker: manufactured by Nippon Zenyaku Kogyo Co., Ltd.), dispensed into freezing ceramic tubes, and frozen and stored in a -80°C freezer until use.
  • Cell Banker manufactured by Nippon Zenyaku Kogyo Co., Ltd.
  • the prepared transduced cells were collected on Day 7, and mixed with chronic myeloid leukemia cell line K562 cells, K562 cells expressing BCMA (K562-BCMA), or human myeloma cell line U266 cells expressing BCMA in a 96-well white microplate for luminescence signal detection at an effector:target ratio of 1:1, and co-cultured for 18 hours in an incubator set at 37°C and 5% CO2 .
  • Bright-Glo Luciferase Assay reagent Promega was added to measure the luminescence intensity of the transduced cells. The results are shown in Figure 3.
  • non-transduced cells Jurkat cells and Jurkat/iELuc cells
  • Bright-Glo Luciferase Assay reagent Promega
  • FIG. 4 shows that in Jurkat/iELuc cells transduced with BCMA-CAR, a BCMA-specific increase in luminescence intensity was observed.
  • the L20H construct had the highest reactivity, with the luminescence intensity of the control (transduced cells only) being low, and the luminescence intensity ratio of the control group to the U266 co-culture group being 62.8 times.
  • BCMA-CAR(L20H) A CAR having an LH construct derived from antibody 1 and a linker length of 20 is designated as BCMA-CAR(L20H), and its amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 65.
  • the base sequence of the nucleic acid encoding BCMA-CAR(L20H) is shown in SEQ ID NO: 66 (Table 3).
  • Example 3 Evaluation of anti-BCMA-CAR (1) Transduction of anti-BCMA-CAR construct into T cells Peripheral blood was collected from volunteers who had given informed consent into BD Vacutainer CPT mononuclear cell isolation blood collection tubes, and the peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) separated by centrifugation at 25°C and 1,500 ⁇ g for 15 minutes were collected, and plasma was also collected.
  • PBMCs peripheral blood mononuclear cells
  • PBMCs were washed twice with CELLOTION (Nihon Zenyaku Kogyo Co., Ltd.), mixed with a mixture of cell cryopreservation solution CP-1 (Kyokuto Pharmaceutical Industrial Co., Ltd.), human serum albumin (HSA) (Albuminar; CSL Behring) and RPMI, and frozen and stored at -80°C until use. Plasma was inactivated for 30 minutes in a water bath set at 56°C, and frozen and stored at -80°C until use.
  • CELLOTION Non Zenyaku Kogyo Co., Ltd.
  • CP-1 Korean serum albumin
  • HSA human serum albumin
  • Plasma was inactivated for 30 minutes in a water bath set at 56°C, and frozen and stored at -80°C until use.
  • CD3 Monoclonal Antibody (OKT3) (Thermo Fisher Scientific)
  • 20 ⁇ g/mL RetroNectin (Takara Bio) diluted with ACD-A solution (Terumo) were added to a 6-well plate with an untreated surface at 1 mL/well, and the plate was left to stand for 3 hours in an incubator set at 37°C and 5% CO2 , and then left overnight at 4°C to prepare an OKT3/RetroNectin-coated plate.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • GT-T551 medium Takara Bio
  • IL-2 0.1% inactivated autologous plasma
  • the above cell suspension was added at 6.5 mL/well to an OKT3/RetroNectin-coated plate that had been washed three times with DMEM/F-12 medium (containing no FBS or penicillin-streptomycin).
  • DMEM/F-12 medium containing no FBS or penicillin-streptomycin.
  • the plate was left in an incubator set at 37°C and 5% CO2 for four days to promote activation and proliferation of T cells in the PBMCs.
  • a RetroNectin-conjugated virus infection method was used for transduction of T cells.
  • a RetroNectin-coated 24-well plate was prepared by adsorbing a retroviral vector solution containing a nucleic acid encoding BCMA-CAR (L20H) derived from antibody 1 prepared in Example 2-(6) using the same procedure as in Example 2-(4).
  • 4 mL/well of T cells activated with OKT3/Retronectin diluted to 4.0 ⁇ 10 5 cells/mL with GT-T551 medium supplemented with 175 IU/mL IL-2 and 0.1% heat-inactivated autologous plasma was added to this plate, and centrifuged at 32° C. and 1,960 ⁇ g for 10 minutes.
  • the plate was left to stand overnight in an incubator set at 37° C. and 5% CO 2 for transduction.
  • the transduced T cells were collected the next day, suspended in 30 mL of basal medium (GT-T551 medium (Takara Bio) supplemented with 0.1% heat-inactivated autologous plasma) supplemented with IL-2 at a final concentration of 175 IU/mL, and placed in an incubator set at 37°C and 5% CO2 (Day 1). On Days 4, 7, 9, and 11, an equal volume of basal medium supplemented with IL-2 at a final concentration of 175 IU/mL was added. On Day 14, the cells were collected and washed with CELLOTION.
  • basal medium GT-T551 medium (Takara Bio) supplemented with 0.1% heat-inactivated autologous plasma
  • IL-2 at a final concentration of 175 IU/mL
  • the transduced cells (GMC) prepared in Example 3-(1) were mixed with chronic myeloid leukemia cell line K562 cells, BCMA-expressing K562 cells (K562-BCMA), or BCMA-expressing human myeloma cell line U266 cells in a V-bottom 96-well microplate at effector:target ratios of 25:1, 12.5:1, 6.25:1, or 3.13:1, and co-cultured for 18 hours in an incubator set at 37° C. and 5% CO 2.
  • non-transduced cells (NGMC) were also co-cultured in the same manner.
  • the microplate was centrifuged at 250 ⁇ g and room temperature for 10 minutes, and the supernatant was dispensed into a flat-bottom 96-well microplate at 100 ⁇ L/well, and the cytotoxic activity was measured using an LDH Cytotoxicity Detection Kit (Takara Bio Inc.) As shown in Figure 5, T cells expressing BCMA-CAR showed BCMA-specific cytotoxic activity.
  • Example 3-(1) IFN- ⁇ Production by CAR-transduced T cells
  • the transduced cells prepared in Example 3-(1) were mixed with K562 cells, K562-BCMA cells, and human myeloma cell line U266 cells in RPMI-1640 Medium (Invitrogen) containing 1% final concentration of BSA at an effector:target ratio of 1:1, transferred to a V-bottom 96-well microplate, and co-cultured for 18 hours in an incubator set at 37° C. and 5% CO 2.
  • the microplate was centrifuged at 250 ⁇ g, room temperature, and for 10 minutes, and the supernatant was collected, and IFN- ⁇ production was measured using Human IFN gamma ELISA Ready-SET-Go (eBioscience).
  • T cells expressing BCMA-CAR were shown to produce IFN- ⁇ in a BCMA-specific manner.
  • Figure 8 shows in vivo bioluminescence imaging of the luciferase activity of tumor cells over time after infusion and the luciferase activity in response to CAR signals, as well as a graph quantifying the luminescence intensity.
  • iELuc-T cell-treated group partial activation of the infused cells was observed, but the tumor cells continued to grow thereafter (B, C, F, and G in Fig. 8-2 and Fig. 8-3).
  • the CAR/iELuc-T cell-treated group systemic activation of the infused cells was observed, and the tumor cells disappeared (D, E, H, and I in Fig. 8-2 and Fig. 8-3). It was confirmed that the infused CAR-T cells exhibited tumor cell-specific cytotoxicity. Interestingly, the activation of the infused T cells also rapidly decreased with the disappearance of the tumor cells.
  • Erythropoiesis occurs in structural and functional units of bone marrow, called erythroblastic islands (EBIs). After partial maturation in the bone marrow, reticulocytes enter the blood where they become mature erythrocytes. Myeloma cells infiltrating the bone marrow damage the function and structure of EBIs by secreting cytokines. The total number of macrophages in the bone marrow of MM patients is inversely correlated with the area of bone marrow infiltration by myeloma cells.
  • FIG. 9B Hematological parameters before and 21 days after treatment are shown in Figure 9B.
  • WBC white blood cells
  • RBC red blood cells
  • Hb hemoglobin
  • Hf hematocrit
  • MCV mean corpuscular volume
  • MCH mean corpuscular hemoglobin
  • MCHC mean corpuscular hemoglobin concentration
  • PLT platelet count
  • Reti reticulocyte count.
  • mice treated with saline and NGMC showed a tendency toward anemia over time, with reduced red blood cells and reticulocytes.
  • mice treated with GMC the progression of anemia was prevented and was similar to that observed in normal mice ( Figure 9-2, B).
  • BS/BV is the bone surface area/volume ratio
  • BS/TV is the bone volume per tissue volume
  • Tb.Th is the trabecular width
  • Tb.N is the trabecular number
  • Tb.Sp is the trabecular center distance.
  • mice showed slightly more advanced bone lesions than normal mice. However, the bone surface was similar to that of normal mice (Fig. 10-1 and Fig. 10-2, A, C). Mice treated with saline or NGMC showed progressive bone lesions. Severe destruction of the condyles and bone surface was observed (Fig. 10-1 and Fig. 10-2, B, C). In contrast, in mice treated with GMC, the progression of bone lesions was strongly prevented, and the bone surface was similar to that of normal mice. Due to the short observation period, the phenomenon observed in this study is thought to be a reduction in the progression of bone lesions, rather than an improvement caused by GMC administration.
  • the present invention provides a CAR useful in the field of genetically modified immune cell therapy targeting BCMA, a nucleic acid encoding the CAR, a vector containing the nucleic acid, a cell expressing the chimeric receptor, a method for producing the cell, a pharmaceutical composition containing the cell as an active ingredient, and a method for preventing (including prevention of recurrence, the same applies below) or treating a disease, characterized by administering the pharmaceutical composition to a subject.
  • Cells expressing the CAR of the present invention have a high killing ability against cells expressing BCMA, and are expected to have a high therapeutic effect.

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Abstract

本発明は、軽鎖可変（ＶＬ）領域及び重鎖可変（ＶＨ）領域を含むＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）抗体又はその抗原結合フラグメントであって、ＶＬ領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３並びにＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列が特定される抗体又はその抗原結合フラグメント、前記フラグメントを含むキメラ抗原受容体を提供する。

Description

抗ＢＣＭＡ抗体およびキメラ抗原受容体
　本発明は、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）に特異的な抗体、その抗原結合フラグメント、前記フラグメントを含むキメラ抗原受容体に関する。
　ＢＣＭＡは、ＣＤ２６９またはＴＮＦＲＳＦ１７とも呼ばれ、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーのメンバーで、そのリガンドはＢ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）および増殖誘導リガンド（ＡＰＲＩＬ）である。ＢＣＭＡとＢＡＦＦ又はＡＰＲＩＬの結合はＮＦ－ｋＢを活性化させ、抗アポトーシスＢｃｌ－２のメンバー、たとえばＢｃｌ－ｘＬまたはＢｃｌ－２およびＭｃｌ－１の上方調節を誘導する。ＢＣＭＡとそのリガンドの相互作用は様々な面から体液免疫、Ｂ細胞の生長、分化を調節することによって人体内環境の安定した平衡を維持する。
　ＢＣＭＡの発現はＢ細胞系に限られ、形質芽球、形質細胞および一部の成熟Ｂ細胞で発現され、末梢Ｂ細胞の分化時に増加する。一方、大半のＢ細胞、たとえばナイーブＢ細胞、メモリーＢ細胞や胚中心Ｂ細胞、およびほかの器官では発現されない。ＢＣＭＡはがん細胞でも高度に発現し、たとえば多発性骨髄腫（ＭＭ）や形質細胞性白血病（ＰＬ）、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）の患者の細胞でもＢＣＭＡが検出されている。
　最近、免疫療法、特に養子Ｔ細胞療法は、血液系の悪性腫瘍を治療する臨床試験において強い治療効果が示されている。Ｔ細胞はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝子修飾したＴ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）の開発が進められている。ＣＡＲは抗原認識ドメインおよびＴ細胞活性化ドメインを含む。ＣＡＲはモノクローナル抗体の抗原結合の性質を利用してＭＨＣに拘束されずにターゲッティングすることができる。このような非ＭＨＣ拘束性抗原認識によって、腫瘍が免疫機構から逃避する機序の一つが避けられる。本分野では、多発性骨髄腫などの腫瘍を治療する、ＢＣＭＡを標的とするＣＡＲ－Ｔ細胞の開発が切望されている（非特許文献１）。
Scand J Immunol. 2020 Aug;92(2):e12910.
　本発明の目的は、ＢＣＭＡを標的とするＣＡＲ、ＢＣＭＡを標的とする抗ＢＣＭＡ抗体及びその抗原結合フラグメントを提供することにある。
　本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意研究した結果、ＢＣＭＡを標的とする新規な抗ＢＣＭＡ抗体及びその抗原結合フラグメントを見出し、ＢＣＭＡを標的とする効果的なＣＡＲを作製して本発明を完成させた。
　すなわち、本発明は、以下に関する。
［１］　軽鎖可変（ＶＬ）領域及び重鎖可変（ＶＨ）領域を含む抗ヒトＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）抗体又はその抗原結合フラグメントであって、ＶＬ領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３並びにＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列が、それぞれ以下の（１）～（６）からなる群より選択される配列番号に示されたアミノ酸配列である抗体又はその抗原結合フラグメント：
（１）配列番号１～６、
（２）配列番号７～１２、
（３）配列番号１３～１８、
（４）配列番号１９～２４、
（５）配列番号２５～３０、および
（６）配列番号３１～３６。
［２］　前記ＶＬ領域及びＶＨ領域のアミノ酸配列が、以下の（１）～（６）からなる群より選択される請求項１記載の抗体又はその抗原結合フラグメント：
（１）配列番号３７及び３８、
（２）配列番号３９及び４０、
（３）配列番号４１及び４２、
（４）配列番号４３及び４４、
（５）配列番号４５及び４６、および
（６）配列番号４７及び４８。
［３］　前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、及びシングルドメイン抗体（ｄＡＢ）からなる群から選択される、［１］又は［２］に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
［４］　前記抗原結合フラグメントはｓｃＦｖである、［３］に記載の抗原結合フラグメント。
［５］　［１］～［４］のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする核酸。
［６］　（ｉ）抗原結合ドメインと、（ｉｉ）膜貫通ドメインと、（ｉｉｉ）細胞内ドメインとを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、
　前記抗原結合ドメインが、［１］～［４］のいずれか１項に記載の抗原結合フラグメント含む、ＣＡＲ。
［７］　前記細胞内ドメインが共刺激ドメイン及び活性化ドメインを含む、［６］に記載のＣＡＲ。
［８］　前記共刺激ドメインがＣＤ２８の細胞内フラグメントを含む、［７］に記載のＣＡＲ。
［９］　前記活性化ドメインがＣＤ３ζの細胞内フラグメントを含む、［７］又は［８］に記載のＣＡＲ。
［１０］　［６］～［９］のいずれか一項に記載のＣＡＲをコードする核酸。
［１１］　［５］に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする核酸もしくは［１０］に記載のＣＡＲをコードする核酸を含むベクター。
［１２］　［５］に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする核酸もしくは［１０］に記載のＣＡＲをコードする核酸を含む細胞。
［１３］　前記細胞は、Ｔ細胞である、［１２］に記載の細胞。
［１４］　［１３］に記載の細胞を有効成分として含む医薬組成物。
［１５］　ＣＡＲを発現する細胞を製造する方法であって、細胞に、［５］に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする核酸、［１０］に記載のＣＡＲをコードする核酸もしくは［１１］に記載のベクターを形質導入する工程含む、方法。
　本発明により、ＢＣＭＡに特異的な抗体とその抗原結合フラグメント、ならびにＢＣＭＡを標的にした遺伝子改変免疫細胞療法の分野において有用なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、前記ＣＡＲをコードする核酸、前記核酸を含むベクター、前記ＣＡＲを発現する細胞、前記細胞の製造方法、前記細胞を有効成分として含む医薬組成物、ならびに当該医薬組成物を対象に投与することを特徴とする疾病の予防（再発予防を含む、以下同じ）または治療方法が提供される。本発明のＣＡＲを発現する細胞は、ＢＣＭＡを発現する細胞に対し高い殺傷能力を有し、高い治療効果が期待される。
抗ＢＣＭＡ抗体１～６のアミノ酸配列を比較した図である。 ＢＣＭＡ－ＣＡＲの構造を示す図である。 ＢＣＭＡ－ＣＡＲ発現細胞の細胞シグナル伝達強度を示す図である。 抗ＢＣＭＡ抗体のリンカーの長さを比較した図である。 ＢＣＭＡ－ＣＡＲ発現細胞の細胞傷害活性の測定を示す図である。 ＢＣＭＡ－ＣＡＲ発現細胞におけるＩＦＮ－γ産生を示す図である。 ＢＣＭＡ－ＣＡＲ発現細胞の輸注後の経時的な腫瘍細胞のルシフェラーゼ活性のインビボ生物発光イメージングと、発光強度を数値化したグラフを示す図である。 担がんマウスに対するＢＣＭＡ－ＣＡＲ発現細胞のｉｎ　ｖｉｖｏにおける抗腫瘍効果を示す図である。 担がんマウスに対するＢＣＭＡ－ＣＡＲ発現細胞のｉｎ　ｖｉｖｏにおける抗腫瘍効果を示す図である。 担がんマウスに対するＢＣＭＡ－ＣＡＲ発現細胞のｉｎ　ｖｉｖｏにおける抗腫瘍効果を示す図である。 ＢＣＭＡ－ＣＡＲ発現細胞の貧血の進行抑制効果を示す図である。 ＢＣＭＡ－ＣＡＲ発現細胞の貧血の進行抑制効果を示す図である。 骨領域の進行に対するＢＣＭＡ－ＣＡＲ発現細胞療法の抑制効果を示す図である。 骨領域の進行に対するＢＣＭＡ－ＣＡＲ発現細胞療法の抑制効果を示す図である。
　以下に本発明について詳細に説明する。
（１）本発明の抗体又はその抗原結合フラグメント
　本発明は、ヒトＢＣＭＡに特異的に結合する抗体、または前記抗体の、ヒトＢＣＭＡに特異的に結合するフラグメントを提供する。前記抗体およびそのフラグメントは、下記実施例に示す抗Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）抗体１～６からなる群より選択されるいずれかに由来するＶＬ領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３、並びにＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む。前記のＶＬ領域の相補性決定領域ＣＤＲ１～３、およびＶＨ領域のＣＤＲ１～３のアミノ酸配列は、それぞれ以下の（１）～（６）に示される。
（１）配列番号１～６、
（２）配列番号７～１２、
（３）配列番号１３～１８、
（４）配列番号１９～２４、
（５）配列番号２５～３０、
（６）配列番号３１～３６。
　本発明の一態様として、本発明の抗ＢＣＭＡ又はその抗原結合フラグメントのＶＬ領域及びＶＨ領域のアミノ酸配列は、以下の（１）～（６）からなる群より選択される。
（１）配列番号３７及び３８、
（２）配列番号３９及び４０、
（３）配列番号４１及び４２、
（４）配列番号４３及び４４、
（５）配列番号４５及び４６、および
（６）配列番号４７及び４８。
　本発明の抗ＢＣＭＡ抗体１～６の各ＶＬ　ＣＤＲおよびＶＨ　ＣＤＲのアミノ酸配列、ＶＬおよびＶＨそれぞれの全長アミノ酸配列、ＶＬおよびＶＨ全長をそれぞれコードする塩基配列の配列番号を以下の表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　本発明の抗体の一例である抗ＢＣＭＡ抗体１は、ＶＬ領域のＣＤＲ１～３はそれぞれ配列番号１～３のアミノ酸配列からなり、ＶＨ領域のＣＤＲ１～３はそれぞれ配列番号４～６のアミノ酸配列からなり、例えばＶＬ領域及びＶＨ領域はそれぞれ配列番号３７及び３８のアミノ酸を含み、例えばＶＬ領域及びＶＨ領域はそれぞれ配列番号４９及び５０の核酸配列を含む。
　本発明の抗体の一例である抗ＢＣＭＡ抗体２は、ＶＬ領域のＣＤＲ１～３はそれぞれ配列番号７～９のアミノ酸配列からなり、ＶＨ領域のＣＤＲ１～３はそれぞれ配列番号１０～１２のアミノ酸配列からなり、例えばＶＬ領域及びＶＨ領域はそれぞれ配列番号３９及び４０のアミノ酸を含み、例えばＶＬ領域及びＶＨ領域はそれぞれ配列番号５１及び５２の核酸配列を含む。
　本発明の抗体の一例である抗ＢＣＭＡ抗体３は、ＶＬ領域のＣＤＲ１～３はそれぞれ配列番号１３～１５のアミノ酸配列からなり、ＶＨ領域のＣＤＲ１～３はそれぞれ配列番号１６～１８のアミノ酸配列からなり、例えばＶＬ領域及びＶＨ領域はそれぞれ配列番号４１及び４２のアミノ酸を含み、例えばＶＬ領域及びＶＨ領域はそれぞれ配列番号５３及び５４の核酸配列を含む。
　本発明の抗体の一例である抗ＢＣＭＡ抗体４は、ＶＬ領域のＣＤＲ１～３はそれぞれ配列番号１９～２１のアミノ酸配列からなり、ＶＨ領域のＣＤＲ１～３はそれぞれ配列番号２２～２４のアミノ酸配列からなり、例えばＶＬ領域及びＶＨ領域はそれぞれ配列番号４３及び４４のアミノ酸を含み、例えばＶＬ領域及びＶＨ領域はそれぞれ配列番号５５及び５６の核酸配列を含む。
　本発明の抗体の一例である抗ＢＣＭＡ抗体５は、ＶＬ領域のＣＤＲ１～３はそれぞれ配列番号２５～２７のアミノ酸配列からなり、ＶＨ領域のＣＤＲ１～３はそれぞれ配列番号２８～３０のアミノ酸配列からなり、例えばＶＬ領域及びＶＨ領域はそれぞれ配列番号４５及び４６のアミノ酸を含み、例えばＶＬ領域及びＶＨ領域はそれぞれ配列番号５７及び５８の核酸配列を含む。
　本発明の抗体の一例である抗ＢＣＭＡ抗体６は、ＶＬ領域のＣＤＲ１～３はそれぞれ配列番号３１～３３のアミノ酸配列からなり、ＶＨ領域のＣＤＲ１～３はそれぞれ配列番号３４～３６のアミノ酸配列からなり、例えばＶＬ領域及びＶＨ領域はそれぞれ配列番号４７及び４８のアミノ酸を含み、例えばＶＬ領域及びＶＨ領域はそれぞれ配列番号５９及び６０の核酸配列を含む。
　上記抗ＢＣＭＡ抗体１～６は、ヒトＢＣＭＡに特異的に結合するかぎり、１以上の変異を含んでいてもよい。したがって、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントの更なる例として、以下の（１’）～（６’）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＶＬ領域及びＶＨ領域を含み、かつ、ヒトＢＣＭＡに特異的結合性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントが挙げられる。
（１’）（ｉ）配列番号３７のアミノ酸配列、又は配列番号３７のアミノ酸配列において１以上の変異を含む変異アミノ酸配列、及び（ｉｉ）配列番号３８のアミノ酸配列、又は配列番号３８のアミノ酸配列において１以上の変異を含む変異アミノ酸配列、ここに、前記（ｉ）及び（ｉｉ）の少なくとも一方は変異アミノ酸配列である、
（２’）（ｉ）配列番号３９のアミノ酸配列、又は配列番号３９のアミノ酸配列において１以上の変異を含む変異アミノ酸配列、及び（ｉｉ）配列番号４０のアミノ酸配列、又は配列番号４０のアミノ酸配列において１以上の変異を含む変異アミノ酸配列、ここに、前記（ｉ）及び（ｉｉ）の少なくとも一方は変異アミノ酸配列である、
（３’）（ｉ）配列番号４１のアミノ酸配列、又は配列番号４１のアミノ酸配列において１以上の変異を含む変異アミノ酸配列、及び（ｉｉ）配列番号４２のアミノ酸配列、又は配列番号４２のアミノ酸配列において１以上の変異を含む変異アミノ酸配列、ここに、前記（ｉ）及び（ｉｉ）の少なくとも一方は変異アミノ酸配列である、
（４’）（ｉ）配列番号４３のアミノ酸配列、又は配列番号４３のアミノ酸配列において１以上の変異を含む変異アミノ酸配列、及び（ｉｉ）配列番号４４のアミノ酸配列、又は配列番号４４のアミノ酸配列において１以上の変異を含む変異アミノ酸配列、ここに、前記（ｉ）及び（ｉｉ）の少なくとも一方は変異アミノ酸配列である、
（５’）（ｉ）配列番号４５のアミノ酸配列、又は配列番号４５のアミノ酸配列において１以上の変異を含む変異アミノ酸配列、及び（ｉｉ）配列番号４６のアミノ酸配列、又は配列番号４６のアミノ酸配列において１以上の変異を含む変異アミノ酸配列、ここに、前記（ｉ）及び（ｉｉ）の少なくとも一方は変異アミノ酸配列である、
（６’）（ｉ）配列番号４７のアミノ酸配列、又は配列番号４７のアミノ酸配列において１以上の変異を含む変異アミノ酸配列、及び（ｉｉ）配列番号４８のアミノ酸配列、又は配列番号４８のアミノ酸配列において１以上の変異を含む変異アミノ酸配列、ここに、前記（ｉ）及び（ｉｉ）の少なくとも一方は変異アミノ酸配列である。
　本明細書で使用される場合、「変異」という用語には、アミノ酸残基の欠失、付加、挿入、及び置換が包含される。前記１以上の変異は、アミノ酸残基の欠失、付加、挿入、及び置換のいずれかの組み合わせであってもよい。前記アミノ酸残基の置換は、保存的置換又は非保存的置換のいずれであってもよいが、好ましくは保存的置換である。保存的置換は、ペプチドの活性を実質的に改変しないような、類似の性質を有するアミノ酸残基間での置換であり、当業者によく知られている。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸間での置換、極性(中性）アミノ酸間での置換、塩基性アミノ酸間での置換、及び酸性アミノ酸間での置換が挙げられる。非極性（疎水性）アミノ酸としては、例えば、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニン等が挙げられる。極性（中性）アミノ酸としては、例えば、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システイン等が挙げられる。塩基性アミノ酸としては、例えば、アルギニン、ヒスチジン、リジン等が挙げられる。酸性アミノ酸としては、例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸等が挙げられる。
　前記１以上の変異は、好ましくはＣＤＲ以外の領域にある。前記１以上の変異は、例えば１～１０個の変異、好ましくは１～９、８、７、６、５、４、３又は２個の変異、より好ましくは１～３個の変異、さらにより好ましくは１又は２個の変異であってもよい。
　前記変異アミノ酸配列は、例えば、配列番号３７～４８のいずれかのアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列である。ここで、パーセント（％）同一性は、参照アミノ酸配列と比較アミノ酸配列とを、最大の％同一性となるように整列させて求められる。パーセント（％）同一性は、当該分野で既知の方法、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ等を用いて決定することができる。
　「抗体」（Ａｂ）は、抗原に特異的に結合する免疫グロブリンであり、ジスルフィド結合によって相互に連結された少なくとも２本の重鎖（Ｈ鎖）及び２本の軽鎖（Ｌ鎖）、又はそれらの抗原結合分子を含み得る。各Ｈ鎖は、ＶＨ領域及び重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、３つの定常ドメイン、すなわちＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含む。各軽鎖は、ＶＬ領域及び軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、１つの定常ドメイン、すなわちＣＬ領域を含む。ＶＨ領域及びＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる保存された領域と、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域に更に細分され得る。ＶＨ及びＶＬはそれぞれ、アミノ末端からカルボキシ末端にＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４の順で並ぶ、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲを含む。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する抗原結合部位を含む。
　「抗体」という用語には、例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、多重特異的抗体（二重特異的抗体を含む）、ヒト抗体、ヒト化抗体、抗体変異体、キメラ抗体、合成抗体、抗体軽鎖単量体、抗体重鎖単量体、抗体軽鎖二量体、抗体重鎖二量体、抗体軽鎖－抗体重鎖対、イントラボディ（ｉｎｔｒａｂｏｄｉｅｓ）、抗体融合体（抗体コンジュゲート）、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、アフィボディ（ａｆｆｉｂｏｄｉｅｓ）、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ジスルフィド連結Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば抗－抗－Ｉｄ抗体を含む）、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｉｅｓ）、ドメイン抗体、抗体模倣物、及び上記のいずれかの抗原結合フラグメントが含まれる。抗体には、主要なクラスとして、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭが存在し、重鎖定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４のサブクラスを含むＩｇＧ、並びにＩｇＭのクラスの抗体をそれぞれ生じさせる、アルファ（α）、デルタ（δ）、イプシロン（ε）、ガンマ（γ）、及びミュー（μ）が知られている。軽鎖定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、例えばカッパー（κ）又はラムダ（λ）のサブクラスが知られている。本発明の抗体は、いずれのクラス又はサブクラスであってもよい。
　「抗原結合フラグメント」は、抗体の抗原結合部（例えばＣＤＲ）を含む任意の抗原結合分子を指す。本発明の抗原結合フラグメントは、本発明の抗体に由来するＣＤＲを含み、例えば、限定するものではないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖフラグメント、直鎖抗体、ｓｃＦｖ、シングルドメイン抗体、及び抗原結合分子から形成される多重特異性抗体が挙げられる。本発明の抗原結合フラグメントは前記のいずれの形態のものであってもよいが、一態様としてはｓｃＦｖが例示される。ｓｃＦｖは、リンカーペプチドにより共有結合で連結されたＶＨ及びＶＬヘテロダイマーである。リンカーペプチドは、例えば、約１０アミノ酸～約２５アミノ酸のペプチドで、柔軟性のためにグリシンに富むだけでなく、可溶性のためにセリン又はトレオニンに富んでいる。リンカーは、ＶＨ領域のＮ末端とＶＬ領域のＣ末端とを連結し得るか、又はＶＨ領域のＣ末端とＶＬ領域のＮ末端とを連結し得るかのいずれかである。すなわち、Ｎ末端側からＶＬ－リンカー－ＶＨの順でもよく、ＶＨ－リンカー－ＶＬの順でもよい。本発明に有用なリンカー配列には、限定されないが、グリシン／セリンリンカー、例えば、ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号６１）、Ｇｌｙ４Ｓｅｒ（Ｇ４Ｓ）リンカー、例えば（Ｇ４Ｓ）３リンカー（配列番号６２：ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）及び（Ｇ４Ｓ）４リンカー（配列番号６３：ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）、ＧＧＳＳＲＳＳＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号：６４）のリンカー配列が含まれる。ｓｃＦｖは、定常領域の除去及びリンカーの導入にもかかわらず当初の免疫グロブリンの特異性を維持する。
　本発明の抗体およびその抗原結合フラグメントは、ヒトＢＣＭＡに結合する能力を保持する限り、抗体１～６に由来するＦＲを有していてもよく、異なる抗体に由来するＦＲ、例えば異なる動物種の抗体に由来するＦＲを有していてもよい。本発明により提供されるＣＤＲを当業者に周知の方法で他のＦＲに移植して作製された抗体およびその抗原結合フラグメントも本発明に包含される。また、本発明の抗体は抗体１～６に由来する定常領域を有していてもよく、他の抗体、例えば異なる動物種に由来する抗体の定常領域を有していてもよい。
　本発明の抗体の抗原（ＢＣＭＡ）に対する結合親和性は、一般的には、解離定数（ＫＤ）によって表され得る。親和性は、限定されないが、平衡解離定数（ＫＤ）及び平衡会合定数（ＫＡ）を含む、当該技術分野で知られている多くの方法で測定され得る及び／又は表され得る。ＫＤはｋｏｆｆ／ｋｏｎの商から計算されるが、ＫＡはｋｏｎ／ｋｏｆｆの商から計算される。ｋｏｎは、例えば抗原に対する抗体の会合速度定数を指し、ｋｏｆｆは、例えば抗原に対する抗体の解離定数を指す。ｋｏｎ及びｋｏｆｆは、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）又はＫｉｎＥｘＡ等の当業者に知られている技術によって決定され得る。
（２）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
　本発明は、（ｉ）抗原結合ドメインと、（ｉｉ）膜貫通ドメインと、（ｉｉｉ）細胞内ドメインとを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、前記抗原結合ドメインが、本発明の抗ＢＣＭＡ抗体又はその抗原結合フラグメントを含む、ＣＡＲを含む。本発明のＣＡＲは、組換え受容体である。これらの受容体をコードする核酸は、当該技術分野で知られている技術によりＴ細胞を含む免疫細胞に容易に導入され、その細胞によって発現される。ＣＡＲによりＢＣＭＡを認識し、同時にＢＣＭＡに結合したＣＡＲを介して活性化された免疫細胞は、ＢＣＭＡを発現する細胞を攻撃して破壊させる。腫瘍細胞上にＢＣＭＡが存在する場合、ＣＡＲを発現する免疫細胞は、腫瘍細胞を傷害、死滅させることができる。
（ｉ）抗原結合ドメイン
　本発明のＣＡＲに含まれる抗原結合ドメインは、本発明の抗ＢＣＭＡ抗体１～６のいずれかに由来する６つのＣＤＲを有するポリペプチドであり、好ましくは抗体１～６の抗原結合フラグメント、例えば１種以上のｓｃＦｖである。抗原結合ドメインは、場合により後述のスペーサードメイン、リーダーペプチドも含めて、細胞外ドメインと呼ぶこともある。
　本発明の一態様として、本発明のＣＡＲは、抗原結合ドメインと膜貫通ドメインの間にヒンジドメイン又はスペーサードメインを含んでもよい。本明細書において「ヒンジドメイン」及び「スペーサードメイン」という用語は区別なく使用される。このドメインは、３００個までのアミノ酸、好ましくは１０～１００個のアミノ酸、最も好ましくは２５～５０個のアミノ酸を含む。スペーサードメインは、ＣＡＲと抗原の結合を促進し、細胞内へのシグナル伝達を亢進する配列であることが好ましい。結合を促進すると予想されるアミノ酸としては、システイン、荷電アミノ酸又は潜在的なグリコシル化部位内のセリン又はスレオニンなどのアミノ酸が例示され、スペーサードメインを構成するアミノ酸として使用することができる。スペーサードメインは、ＣＤ８α（ＮＣＢＩ　ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿００１７５９．３）のヒンジ領域であるアミノ酸番号１１８～１７８、ＣＤ８β（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ３５６６４．１）のアミノ酸番号１３５～１９５、ＣＤ４（ＮＣＢＩ　ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿０００６０７．１）のアミノ酸番号３１５～３９６、又はＣＤ２８（ＮＣＢＩ　ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿００６１３０．１）のアミノ酸番号１３７～１５２の全部又は一部分を使用することができる。また、スペーサードメインとして、抗体Ｈ鎖又はＬ鎖の定常領域の一部（ＣＨ１領域又はＣＬ領域）も使用することができる。さらに、スペーサードメインは、人為的に設計された配列であってもよい。本発明のＣＡＲは、多量体、特に二量体となるよう設計することができる。例えば、スペーサードメイン及び／又は膜貫通ドメインにシステインを挿入することにより、ＣＡＲが多量体化（二量体化）される。
　本発明の一態様として、本発明のＣＡＲは、そのＮ末端にリーダーペプチド（本明細書では「シグナルペプチド」又は「リーダー配列」とも呼ばれる）を更に含み得る。リーダーペプチドのポリヌクレオチド配列及びポリペプチド配列は、当該技術分野において知られている。例えば、ＧＭ－ＣＳＦ受容体のリーダーペプチドを使用できる。
（ｉｉ）膜貫通ドメイン
　本発明のＣＡＲは、抗原結合ドメインと細胞内ドメインを直接的又は間接的に連結する膜貫通ドメインを含む。また、本発明のＣＡＲは、これらのドメインの間に、任意にリンカー配列やスペーサー配列を含みうる。膜貫通ドメインは天然のポリペプチドに由来するものでもよく、人為的に設計したものでもよい。天然のポリペプチド由来の膜貫通ドメインは、任意の膜結合タンパク質又は膜貫通タンパク質から取得することができる。例えば、Ｔ細胞受容体のα、β鎖、ＣＤ３ζ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＩＣＯＳ、ＣＤ１５４、ＧＩＴＲの膜貫通ドメインを使用することができる。また、人為的に設計された膜貫通ドメインは、ロイシン及びバリンなどの疎水性残基を主に含むポリペプチドであってもよい。また、フェニルアラニン、トリプトファン及び／又はバリンのトリプレットが、人工膜貫通ドメインの各末端に見出されることが好ましい。場合により、短いオリゴペプチドリンカー又はポリペプチドリンカー、例えば長さが２～１０個のアミノ酸配列からなるリンカーを、膜貫通ドメインと細胞内ドメインとの間に配置することができる。特にグリシン－セリン連続配列を有するリンカー配列を使用することができる。本発明の一態様として、膜貫通ドメインはＣＤ２８（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿００６１３０．１）のアミノ酸番号１５３～１８０の配列を有する膜貫通ドメインが使用できる。更に別の態様として、ＧＩＴＲ（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿００４１８６．１）のアミノ酸番号１６２～１８３の配列を有する膜貫通ドメインが使用できる。
（ｉｉｉ）細胞内ドメイン
　本発明のＣＡＲは、細胞内ドメインを含む。細胞内ドメインは、同一分子内に存在する抗原結合ドメインが抗原と結合（相互作用）した際に、細胞内にシグナルを伝達することが可能な分子である。Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の複合体のみを介して発生されたシグナルは、Ｔ細胞の活性化に不十分であること、そして二次又は共刺激シグナルも必要であることが知られている。天然のＴ細胞活性化シグナルは、２つの異なる種類の細胞質シグナル伝達配列、すなわちＴＣＲ複合体を介して抗原依存的一次活性化を開始させる配列（活性化ドメイン）及び抗原非依存的に作用して二次又は共刺激シグナルを提供する配列（共刺激ドメイン）によって伝達されている。好適な態様において、本発明のＣＡＲは、細胞内ドメインとして、前記活性化ドメイン及び／又は共刺激ドメインを含む。
　活性化ドメインは、免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）として知られるシグナル伝達モチーフを含むことがある［ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、第３３８巻、第３８３－３８４頁（１９８９）］。本発明で使用できる活性化ドメインは、例えば、ＣＤ３ζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、及びＣＤ６６ｄに由来するＩＴＡＭを包含する。具体的には、ＣＤ３ζ（ＮＣＢＩ　ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿９３２１７０．１）のアミノ酸番号５１～１６４、ＦｃεＲＩγ（ＮＣＢＩ　ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿００４０９７．１）のアミノ酸番号４５～８６、ＦｃεＲＩβ（ＮＣＢＩ　ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿０００１３０．１）のアミノ酸番号２０１～２４４、ＣＤ３γ（ＮＣＢＩ　ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿００００６４．１）のアミノ酸番号１３９～１８２、ＣＤ３δ（ＮＣＢＩ　ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿０００７２３．１）のアミノ酸番号１２８～１７１、ＣＤ３ε（ＮＣＢＩ　ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿０００７２４．１）のアミノ酸番号１５３～２０７、ＣＤ５（ＮＣＢＩ　ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿０５５０２２．２）のアミノ酸番号４０２～４９５、ＣＤ２２（ＮＣＢＩ　ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿００１７６２．２）のアミノ酸番号７０７～８４７、ＣＤ７９ａ（ＮＣＢＩ　ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿００１７７４．１）のアミノ酸番号１６６～２２６、ＣＤ７９ｂ（ＮＣＢＩ　ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿０００６１７．１）のアミノ酸番号１８２～２２９、ＣＤ６６ｄ（ＮＣＢＩ　ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿００１８０６．２）のアミノ酸番号１７７～２５２の配列を有するペプチド及びこれらと同一の機能を有するその変異体が挙げられる。なお、本明細書に記載するＮＣＢＩ　ＲｅｆＳｅｑ　ＩＤやＧｅｎＢａｎｋのアミノ酸配列情報に基づくアミノ酸番号は、各タンパク質の前駆体（シグナルペプチド配列などを含む）を全長として付された番号である。
　共刺激ドメインには、例えば、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ８β、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＩＣＯＳ、及びＣＤ１５４に由来する配列が含まれる。具体的な例としては、ＣＤ２（ＮＣＢＩ　ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿００１７５８．２）のアミノ酸番号２３６～３５１、ＣＤ４（ＮＣＢＩ　ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿０００６０７．１）のアミノ酸番号４２１～４５８、ＣＤ５（ＮＣＢＩ　ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿０５５０２２．２）のアミノ酸番号４０２～４９５、ＣＤ８α（ＮＣＢＩ　ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿００１７５９．３）のアミノ酸番号２０７～２３５、ＣＤ８β（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ３５６６４．１）のアミノ酸番号１９６～２１０、ＣＤ２８（ＮＣＢＩ　ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿００６１３０．１）のアミノ酸番号１８１～２２０、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ、ＮＣＢＩ　ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿００１５５２．２）のアミノ酸番号２１４～２５５、ＣＤ１３４（ＯＸ４０、ＮＣＢＩ　ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿００３３１８．１）のアミノ酸番号２４１～２７７、ＩＣＯＳ（ＮＣＢＩ　ＲｅｆＳｅｑ：ＮＰ＿０３６２２４．１）のアミノ酸番号１６６～１９９の配列を有するペプチド及びこれらと同一の機能を有するその変異体が挙げられる。
　本発明は、細胞内ドメインとして活性化ドメイン又は共刺激ドメインを１つ又は複数、例えば２つ又は３つ含むＣＡＲを含む。特に好適には、細胞内ドメインとして、ＣＤ３ζの活性化ドメインを含むＣＡＲ、ＣＤ３ζの活性化ドメイン及びＣＤ２８の共刺激ドメインを含むＣＡＲが例示される。同じ種類の細胞内ドメインを複数個タンデムに連結したＣＡＲも本発明に含まれる。本発明のＣＡＲでは、細胞内ドメインに含まれる各ドメインの間にオリゴペプチドリンカー又はポリペプチドリンカーを挿入して連結することができる。好ましくは長さが２～１０個のアミノ酸からなるリンカーが使用できる。特にグリシン－セリン連続配列を有するリンカーを使用することができる。
（３）本発明の核酸
　本発明は、前記（１）の抗体又はその抗原結合フラグメント及び前記（２）のＣＡＲをコードする核酸を提供する。本発明の核酸は、細胞内で本発明の抗体、その抗原結合フラグメント又はＣＡＲを発現することができる。本発明の抗ＢＣＭＡ抗体１のＶＬ領域及びＶＨ領域をコードする核酸は、例えば配列番号４９及び５０の核酸配列を有し、本発明の抗ＢＣＭＡ抗体２のＶＬ領域及びＶＨ領域をコードする核酸は、例えば配列番号５１及び５２の核酸配列を有し、本発明の抗ＢＣＭＡ抗体３のＶＬ領域及びＶＨ領域をコードする核酸は、例えば配列番号５３及び５４の核酸配列を有し、本発明の抗ＢＣＭＡ抗体４のＶＬ領域及びＶＨ領域をコードする核酸は、例えば配列番号５５及び５６の核酸配列を有し、本発明の抗ＢＣＭＡ抗体５のＶＬ領域及びＶＨ領域をコードする核酸は、例えば配列番号５７及び５８の核酸配列を有し、本発明の抗ＢＣＭＡ抗体６のＶＬ領域及びＶＨ領域をコードする核酸は、例えば配列番号５９及び６０の核酸配列を有する。
　本発明の核酸の種類は限定されず、一本鎖核酸、二本鎖核酸、ＤＮＡ、又はＲＮＡが使用できる。うち、ＤＮＡとしては二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、ｃＤＮＡが例示され、ＲＮＡとしてはｍＲＮＡが例示される。
　本発明の核酸は、細胞内で発現されるようにプロモーター配列を有する核酸に連結することができる。プロモーターの例には、遺伝子または作動可能に連結された構築物の発現を構成的に促進するプロモーター、薬物など（例えば、テトラサイクリンまたはドキソルビシン）の作用により遺伝子または作動可能に連結された構築物の発現を誘導するプロモーターが含まれる。本発明の核酸はまた、核酸の効率的な転写を得るために、プロモーターまたは転写開始部位と協働する他の調節エレメント、例えば、エンハンサー配列またはターミネーター配列を含んでなる核酸と連結することもできる。
　ある実施形態では、本発明の核酸は、特定の宿主細胞での発現のためにコドンが最適化された核酸である。
（４）本発明のベクター
　本発明は、前記（３）の本発明の核酸を含むベクターを提供する。本発明のベクターは、所望の細胞に本発明の抗体、その抗原結合フラグメント又はＣＡＲを運び、発現させることができる。
　本発明のベクターの態様としては、複数のポリペプチドを発現させる場合に、当該複数のペプチドはそれぞれ別々のプロモーターにより転写、翻訳されてもよく、内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）を使用して一つのプロモーターで転写、翻訳されてもよい。さらに、複数のポリペプチドが自己切断ペプチドを介して相互に接続されたポリペプチドをコードする核酸が一つのプロモーターで転写、翻訳される構成であってもよい。
　本発明に使用可能なベクターは、適切な宿主細胞中で本発明の核酸を発現するように、本発明の核酸と機能的に連結している適切な制御配列を含む。制御配列としては、本発明の核酸を転写させるためのプロモーター、転写を制御するための任意のオペレーター配列、リボソーム結合部位配列、エンハンサー、ポリアデニル化配列、及び転写や翻訳の終了を制御する配列等が例示される。哺乳動物細胞内で転写を制御するプロモーターとしては、哺乳動物由来のプロモーター（ＰＧＫプロモーター、ＥＦ１－αプロモーター、β－グロビンプロモーター等）、ウイルス由来のプロモーター（ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＭＭＬＶ－ＬＴＲプロモーター、ＨＩＶ－ＬＴＲプロモーター等）、人工的に構築されたプロモーター（ＣＡＧプロモーター等）が例示される。さらにベクターは、当業者に公知の各種の配列、例えば、制限酵素切断部位、薬剤耐性遺伝子等のマーカー遺伝子（選択遺伝子）、シグナル配列、リーダー配列等を必要に応じて含んでいても良い。これらの各種配列又は部位は、発現させるポリペプチドの種類、使用する宿主細胞、培養培地等の条件に応じて、当業者が適宜選択して使用することができる。
　本発明のベクターは、本発明の核酸に加え、細胞にベクターが導入されたことを確認するためのマーカーとなり得る遺伝子（例えば、薬剤耐性遺伝子、リポーター酵素をコードする遺伝子、または蛍光タンパク質をコードする遺伝子）や治療用遺伝子を含んでもよい。
　本発明に使用可能なベクターは、宿主細胞のゲノムに組み込まれるベクター、組み込まれないベクター、細胞質に存在して自律的に複製するエピソーマルベクターのいずれもが使用できる。例えば、プラスミドベクター、ウイルスベクター、トランスポゾンベクター、人工染色体等が好適に使用できる。ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター（オンコレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、シュードタイプベクターを包含する）、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、シミアンウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、センダイウイルスベクター、エプスタイン－バーウイルス（ＥＢＶ）ベクター、ＨＳＶベクターなどのウイルスベクターが使用できる。上記ウイルスベクターとしては、感染した細胞中でウイルスが自己複製できないように複製能を欠損させたものが好適である。種々のウイルスベクターとその製造方法は当業者に周知である。また、市販されているウイルスベクターを本発明に使用してもよい。
　また、リポソーム及び陽イオン脂質などの縮合剤との併用により、非ウイルスベクターも使用することができる。更に、リン酸カルシウム形質移入、ＤＥＡＥ－デキストラン、エレクトロポレーション、パーティクルボンバードメントにより細胞に本発明の核酸を導入することができる。
（５）本発明の細胞
　本発明は、前記（１）の抗体又はその抗原結合フラグメント及び前記（２）のＣＡＲを発現する細胞を提供する。本発明の細胞の由来は特に限定されず、哺乳動物由来の細胞、例えば、ヒト細胞、またはサル、マウス、ラット、ブタ、ウマ、およびイヌなどの非ヒト哺乳動物由来の細胞を使用することができる。本発明の細胞は、好適には、ヒト細胞である。本発明の細胞を培養することにより、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントを製造することができる。
　本発明の細胞の種類は特に限定されず、いずれの細胞も使用可能である。例えば、体液、組織もしくは器官、例えば、血液（末梢血、臍帯血など）もしくは骨髄から採取、単離、もしくは精製された細胞、または上述の細胞を分化させる、もしくは多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を作製するために初期化することにより得られた細胞が使用可能である（例えば、Themeli et al 2013参照）。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、免疫細胞、臍帯血単核細胞、線維芽細胞、脂肪細胞前駆体、肝細胞、皮膚ケラチノサイト、間葉幹細胞、脂肪幹細胞、種々の癌細胞株、または神経幹細胞が使用可能である。例えば、ＮＫ細胞またはＴ細胞、Ｔ細胞の前駆細胞（造血幹細胞、リンパ球前駆細胞など）またはそれらを含有する細胞集団が使用可能である。Ｔ細胞の例には、ＣＤ８陽性Ｔ細胞、ＣＤ４陽性Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、および腫瘍浸潤リンパ球が含まれる。Ｔ細胞およびＴ細胞の前駆細胞を含有する細胞集団には、ＰＢＭＣが含まれる。上述の細胞は、生体から採取してもよく、生体から採取した細胞の拡大培養により得てもよく、または細胞株として樹立してもよい。さらに多能性幹細胞（ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞等）から分化させて得られる細胞、例えば免疫細胞を本発明の細胞として使用してもよい。特定の細胞を認識して傷害する能力を有するＴ細胞のクローンよりｉＰＳ細胞を作製し、次いでこれを分化させてＴ細胞を得ることができる。こうして得られたＴ細胞は、出発材料としたＴ細胞クローンと同じ特異性の細胞傷害活性を有し、かつより未分化な状態にある。このようなＴ細胞に本発明のキメラ型受容体をコードする核酸を導入することにより、優れた治療効果を発揮する細胞を簡便に調製することが可能となる。
　抗体の産生を目的とする場合は、組換えタンパク質の製造に適した細胞に本発明の抗体をコードする核酸または前記核酸を有するベクターが導入される。前記細胞としては、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系やリンパ組織を起源とする不死化細胞が例示される。例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）を欠損したＣＨＯ細胞は抗体産生用の宿主細胞として好適である。
　本明細書において「免疫細胞」とは、生体内において免疫機能に関与している細胞全般を言い、造血幹細胞、好中球、好塩基球、マクロファージ、リンパ球〈Ｂ細胞およびＴ細胞〉、単球、樹状細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、形質細胞等が例示される。これらのうち、本発明にはＴ細胞およびＮＫ細胞が好適である。なお、本明細書における「免疫細胞」には前記の免疫細胞に分化する能力を有する「免疫細胞の前駆細胞」も包含される。
　本発明の細胞または本発明の細胞から分化させた細胞の生体への移植が望まれる場合は、その移植を受ける生体自体またはその同種の生体から採取した細胞に核酸を導入することが好ましい。
　本発明の細胞は、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメント、もしくは本発明のＣＡＲを発現する他、疾病の治療に有用なポリペプチド（酵素、抗体、サイトカイン、受容体等）や核酸（ｓｉＲＮＡ等）をさらに発現するものであってもよい。
　本明細書において「標的細胞」とは、患者において低減または排除することが望まれる細胞を意味し、腫瘍細胞や病原体が感染した細胞が例示される。特に限定されないが、好ましくは腫瘍細胞であり、さらに好ましくは造血器腫瘍細胞であり、固形腫瘍細胞である。
　本発明のＣＡＲを発現する免疫細胞は、ＢＣＭＡを発現する細胞を認識する能力を有し、当該細胞を、その細胞傷害活性により破壊する。この細胞傷害活性は公知の方法により評価できる。例えば、放射性物質、蛍光物質等で標識した標的細胞に対する、本発明の細胞の細胞傷害活性を、本発明の細胞により破壊された標的細胞より遊離される放射活性や蛍光物質の強度を測定することによって評価できる。また、本発明の細胞や標的細胞より特異的に遊離されるＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮ－γ等のサイトカイン量を測定することにより検出することもできる。
（６）本発明の細胞の製造方法
　本発明は、前記（３）の本発明の核酸を細胞に導入する工程を含む、細胞の製造方法を提供する。すなわち、本発明の細胞の製造方法により、前記（５）の本発明の細胞を製造することができる。
　当該工程は通常、生体外（ｅｘ　ｖｉｖｏ）で実施される。例えば、前記（３）の核酸や（４）のベクターを利用して、細胞を生体外で形質転換することにより製造することができる。
　本発明の細胞の製造方法には、哺乳動物、例えばヒト由来の細胞又はサル、マウス、ラット、ブタ、ウシ、イヌ等の非ヒト哺乳動物由来の細胞が使用できる。本発明の方法に使用される細胞に特に限定はなく、前記されている、任意の細胞を使用することができる。前記の細胞は生体より採取されたもの、それを拡大培養したもの又は細胞株として樹立されたもののいずれでもよい。製造された細胞又は当該細胞より分化させた細胞を生体に移植することが望まれる場合には、その生体自身又は同種の生体から採取された細胞に核酸やベクターを導入することが好ましい。また、核酸やベクターの導入前に細胞を刺激することにより、細胞への核酸導入の効率を向上させることができる。また、特定の種類の細胞を富化しておくことができる。例えば、ＰＢＭＣを抗ＣＤ３抗体存在下で培養した場合にはＴ細胞の比率が向上する。さらに抗ＣＤ３抗体と組換えフィブロネクチンフラグメントであるレトロネクチンの共存下にＰＢＭＣを培養した場合にはＣＤ８陽性Ｔ細胞を高含有する細胞集団が得られる。
　リポソーム、陽イオン脂質、ポリエチレンイミンなどの補助剤との併用により、非ウイルスベクターも本発明に使用することができる。更に、リン酸カルシウム形質移入、ＤＥＡＥ－デキストラン、エレクトロポレーション、パーティクルボンバードメントにより細胞に本発明の核酸を導入することができる。
　各種ウイルスベクターの製造方法、細胞への導入方法も当業者に周知である。例えばレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターを使用する場合、ベクターが有しているＬＴＲ配列及びパッケージングシグナル配列に基づいて適切なパッケージング細胞を選択し、これを使用してウイルス粒子を調製して遺伝子導入を実施することができる。また、トランスフェクション効率の高い２９３細胞や２９３Ｔ細胞を用いてレトロウイルス粒子またはレンチウイルス粒子を作製することもできる。レトロウイルス、レンチウイルスを基に製造された多くの種類のウイルスベクター及び当該ベクターのパッケージングに使用可能なパッケージング細胞やパッケージングキットは、各社より広く市販されている。
　本発明の核酸が導入された細胞を生体外で培養することにより、細胞数を拡大することができる。細胞の培養には、当該細胞に適した培地を使用すればよく、公知のまたは市販の培地から選択して使用することができる。例えば、リンパ球やその他の免疫細胞の培養に使用可能な培地も当業者には公知であり、また、種々の組成のものが市販されている。これらの培地はヒトまたは動物由来の血清（例えばウシ胎児血清；ＦＢＳ又はＦＣＳ）を含むものの他、異種由来成分不含（ｘｅｎｏ－ｆｒｅｅ）培地、未知成分を含有しない培地（ｄｅｆｉｎｅｄ　ｍｅｄｉｕｍ）等があり、目的に応じて選択することができる。また、細胞の培養には公知の培養用容器（プレート、シャーレ、フラスコ、バッグ、培養槽等）を使用することができる。また、培養の条件も通常の細胞培養と同じ条件（例えば３２～３７℃、５％ＣＯ２等）とすればよい。さらに、適当な時間間隔をおいて培養物に新鮮な培地を加えて希釈する、培地を交換する、細胞培養用容器を交換するなどの操作を行うことができる。
（７）本発明の医薬組成物
　本発明は、前記（５）の本発明の細胞、例えば本発明のＣＡＲを発現する免疫細胞を有効成分として含む医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、薬学上許容可能な賦形剤を含むことができる。薬学上許容可能な賦形剤は、当業者にはよく知られており、例えば、リン酸緩衝生理食塩水（例えば、０．０１Ｍリン酸塩、０．１３８Ｍ　ＮａＣｌ、０．００２７Ｍ　ＫＣｌ、ｐＨ７．４）、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩などの鉱酸塩を含有する水溶液、生理食塩液、グリコール又はエタノールなどの溶液及び酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などの有機酸の塩を含む。湿潤剤又は乳化剤などの補助剤、及びｐＨ緩衝剤も使用することができる。薬学上許容可能な賦形剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ　Ｐｕｂ．Ｃｏ．、Ｎ．Ｊ．１９９１）にも記載される。本発明の医薬組成物は、非経口投与、例えば、注射又は注入に適した公知の形態とすることができる。本発明の医薬組成物は更に、懸濁化剤、保存剤、安定化剤及び／又は分散剤などの製剤補助剤、保存中の有効期限を延ばすために保存剤を含んでいてもよい。
　本発明はまた、細胞医薬とは異なる医薬組成物も提供する。本発明の抗体およびその抗原結合フラグメントは、抗がん剤やその他の薬物と組み合わせた抗体薬物複合体（ＡＤＣ）の作製に利用することができる。前記複合体はＢＣＭＡを発現する細胞、組織等に薬物を特異的に送達することができる。抗体又は抗原結合性フラグメントと薬物との結合は、当該薬物の構造等を考慮して適切な手段を選択すればよい。さらに、本発明は二重特異性抗体の作製に利用することができる。例えば、本発明の抗原結合性フラグメントを抗ＣＤ３抗体の抗原結合性フラグメントに結合させた二重特異性Ｔ細胞誘導抗体（ＢｉＴＥ）は、ＢＣＭＡ発現細胞にＴ細胞を誘導することで抗腫瘍効果を発揮する。二重特性抗体は本発明の核酸と他の抗体又はそのフラグメントをコードする核酸とを利用した組換えＤＮＡ技術により作製することが可能である。
（８）本発明の疾病の予防または治療方法
　本発明は、前記（７）の本発明の医薬組成物を対象に投与することを特徴とする疾病の予防または治療方法を提供する。本発明の医薬組成物、例えば本発明のＣＡＲを発現する細胞が投与される疾病としては、前記組成物に有効成分として含まれる細胞に感受性を示す疾患であればよく、ＢＭＣＡを発現する細胞が関連する疾患が例示されるが、これらに限定はされない。本発明の医薬組成物により予防または治療される疾患としては、例えば、Ｂ細胞関連疾患が例示され、多発性骨髄腫（ＭＭ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、不確定な悪性度のＢ細胞増殖、リンパ腫様肉芽腫症、移植後リンパ増殖性障害、免疫調節性障害、関節リウマチ、重症筋無力症、特発性血小板減少性紫斑病、抗リン脂質抗体症候群、シャーガス病、グレーブス病、ウェゲナー肉芽腫症、結節性多発動脈炎、シェーグレン症候群、尋常性天疱瘡、強皮症、多発性硬化症、抗リン脂質抗体症候群、ＡＮＣＡ関連血管炎、グッドパスチャー病、川崎病、自己免疫性溶血性貧血及び急速進行性糸球体腎炎、重鎖病、原発性もしくは免疫細胞関連アミロイドーシス、または意義不明の単クローン性免疫グロブリン血症が含まれる。ＭＭには、顕性多発性骨髄腫、くすぶり型多発性骨髄腫、形質細胞性白血病、非分泌型骨髄腫、ＩｇＤ骨髄腫、骨硬化性骨髄腫、骨の孤立性形質細胞腫、及び髄外性形質細胞腫が含まれる。ＮＨＬは、バーキットリンパ腫、慢性リンパ球性白血病／小リンパ球性リンパ腫（ＣＬＬ／ＳＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、免疫芽球性大細胞型リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫、及びマントル細胞リンパ腫が含まれる。
　医薬組成物の投与方法としては、皮内投与、皮下投与、静脈内投与などが利用でき、全身投与、患部局所またはその近傍の組織、例えば皮下に局所投与しても良い。投与量は、投与される対象の年齢、体重、投与方法等により適宜調整することができる。その際には投与回数や複数回投与される場合の投与間隔も考慮される。投与される対象は、動物であり、好ましくは哺乳動物、例えばヒト、又はサル、マウス、ラット、ブタ、ウマ、イヌなどの非ヒト哺乳動物であってもよい。より好ましくは、ヒトである。
　本発明の疾病の予防または治療方法では、本発明の細胞が投与された対象に、本発明の細胞が発現するＣＡＲに結合するリガンドを投与することにより、生体内での本発明の細胞の増殖を誘導しおよび／または当該細胞の生体内での存続期間を延長することができる。リガンドの投与方法には特に限定はないが、生体内における本発明の細胞の分布等を考慮して、適切な方法が選択される。リガンドの投与量や投与スケジュールも、組み合わせる細胞の種類や投与量、疾病の種類等を考慮して適宜設定すればよい。
　以下の実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例によって限定されない。
実施例１　抗ＢＣＭＡ抗体のクローニング
　ＢＡＬＢ／ｃマウス３匹へＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｈｕｍａｎ　ＢＣＭＡ／ＴＮＦＲＳＦ１７　Ｆｃ　Ｃｈｉｍｅｒａ（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社製、Ｃａｔ．　Ｎｏ．　１９３－ＢＣ）を腸骨リンパ節法で免疫した。免疫したマウスの腸骨リンパ節を採取してリンパ球とＳＰ２／０ミエローマ細胞を融合し、抗体産生ハイブリドーマをクローニングした。抗ヒトＢＣＭＡ抗体を産生するハイブリドーマ６クローンからＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ　ＲＮＡ（タカラバイオ社製）を用いて全ＲＮＡを抽出した。３５０ｎｇのハイブリドーマ由来全ＲＮＡを鋳型とし、ＳＭＡＲＴｅｒ　ＲＡＣＥ　５’／３’　Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて逆転写反応（ＲＴ反応）を行い、ｃＤＮＡを合成した。
　各ハイブリドーマから産生される抗体のアイソタイプ判定は全てＩｇＧ１及びκであったため、ＶＬ領域をコードするＤＮＡのＰＣＲは、５’－ＲＡＣＥ　ｃＤＮＡの５’末端に対応するＵＰＭセンスプライマー（配列番号６７：GATTACGCCAAGCTTCTCATTCCTGTTGAAGCTCTTGACAAT）とｍＩｇＧ１のＬ鎖定常領域の末端に対応するアンチセンスプライマー（配列番号６８：GATTACGCCAAGCTTCTCAATTTTCTTGTCCACCTTGGTGC）を混合したプライマー対で、一方、ＶＨ領域をコードするＤＮＡのＰＣＲは５’－ＲＡＣＥ　ｃＤＮＡの５’末端に対応するＵＰＭセンスプライマーとｍＩｇＧ１のＨ鎖定常領域ＣＨ１の末端に対応するアンチセンスプライマーを混合したプライマー対で行った。つまり、ＰＣＲは、Ｔｒｉｃｉｎｅ－ＥＤＴＡ　Ｂｕｆｆｅｒで５．５倍に希釈したＲＴ反応後の溶液（ｃＤＮＡ溶液）２．５μＬを用いて、１０×センスプライマー、５０ｎＭアンチセンスプライマー、２×ＳｅｑＡｍｐ　Ｂｕｆｆｅｒ、ＳｅｑＡｍｐ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を加えて総量５０μＬとし、ＴａＫａＲａ　ＰＣＲ　Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ　Ｄｉｃｅ（タカラバイオ社製）にて９４℃で３０秒、６８℃で３０秒、７２℃で３分を２５サイクル繰り返した。
　次に、アガロースゲル電気泳動でＰＣＲ産物を分離し、増幅された可変領域ＤＮＡ断片、すなわちＬＶ領域及びＨＶ領域をそれぞれコードするＤＮＡについてクローニングを行った。つまり、電気泳動の後に増幅断片に相当するバンドをゲルブロックとして切り出して、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ　Ｇｅｌ　ａｎｄ　ＰＣＲ　Ｃｌｅａｎ－ｕｐ（タカラバイオ社製）を用いてＤＮＡを精製し、クローニングベクターとのＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ反応を行った。つまり、クローニングベクター　５０ｎｇ、アガロースゲルからの精製産物　７．０μＬ、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（タカラバイオ社製）　２．０μＬを加えて総量１０μＬとし、ＴａＫａＲａ　ＰＣＲ　Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ　Ｄｉｃｅにて５０℃で１０分間反応させた。この反応物２．５μＬと大腸菌（Ｓｔｅｌｌａｒ　Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　Ｃｅｌｌｓ：タカラバイオ社製）を用いてトランスフォーメーションを行った。ＬＶ領域及びＨＶ領域をコードする各ＤＮＡについて得られたコロニーを１０個選択して培養した。ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ　Ｐｌａｓｍｉｄ　ＥａｓｙＰｕｒｅを用いて培養物よりプラスミドを抽出し、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで二重消化することで、増幅された可変領域ＤＮＡ断片の挿入を確認した。
　可変領域ＤＮＡ断片の塩基配列は、それらの挿入が確認できたプラスミドについて、３．２ｐｍｏｌのＭ１３　ｒｅｖｅｒｓｅ　ｐｒｉｍｅｒ（配列番号６９：CAGGAAACAGCTATGAC）とＭ１３　Ｆｏｒｗａｒｄ　ｐｒｉｍｅｒ（配列番号７０：GTAAAACGACGGCCAGT）を用いてシークエンスすることで決定した。
　得られた塩基配列をＢＬＡＳＴで検索したところ、全てのクローンがＩｇＧ　Ｌ鎖またはＨ鎖の塩基配列と相同性を示したことから、クローニングしたＰＣＲ産物はＬ鎖、Ｈ鎖の可変領域をコードする核酸を含むＤＮＡ断片であることが確認された。この塩基配列中で定常領域の５’端より上流に存在し、かつ定常領域がイン・フレームとなるような開始コドンＡＴＧを検索して、アミノ酸配列を推定した。各クローンの軽鎖および重鎖各々の推定アミノ酸配列をＣｌｕｓｔａｌＷ２　Ｍｕｌｔｉｐｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ａｌｉｇｎｍｅｎｔにて比較し、相同性を最大に調整する操作を行った後、Ｋａｂａｔの定義による相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎ：ＣＤＲ）について比較した。Ｌ鎖のＣＤＲ１はアミノ酸が２４～３８番目、ＣＤＲ２は５４～６０番目、ＣＤＲ３は１１３～１２１番目であった。一方、Ｈ鎖のＣＤＲ１はアミノ酸が３１～３５番目、ＣＤＲ２は５０～６６番目、ＣＤＲ３は９９～１１０番目であった。また、一連の解析結果から、各ハイブリドーマのクローンが産生する抗体は全て異なるものであると推定された。かくして得られた抗体を抗ＢＣＭＡ抗体１～６と称す。抗ＢＣＭＡ抗体１～６のＣＤＲ、ＶＬ、ＶＨそれぞれの配列を表２－１～表２－５に示す。抗ＢＣＭＡ抗体１～６のアミノ酸配列の比較を図１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
実施例２　抗ＢＣＭＡ　ＣＡＲ
（１）ＣＡＲ発現ベクタープラスミドの構築
　実施例１で取得した各抗ＢＣＭＡ抗体の抗原結合フラグメントを含むＣＡＲを作製した。Ｎ末端より、ＧＭ－ＣＳＦ受容体のシグナルペプチド配列、抗ＢＣＭＡ抗体のＶＬ領域、リンカー配列（１８アミノ酸、配列番号６４、「１８ａａリンカー」ともいう）、抗ＢＣＭＡ抗体のＶＨ領域、ＣＤ２８の細胞外領域、膜貫通領域および細胞内領域、ならびにＣＤ３ζ細胞内領域を含むＣＡＲをコードする核酸を作製した。このＣＡＲをＢＣＭＡ－ＣＡＲと命名した。ＶＨ領域とＶＬ領域の順を入れ替えたＣＡＲをコードする核酸も作製した。なお、ＶＨ領域とＶＬ領域の順序を区別して表現する場合は、ＢＣＭＡ－ＣＡＲのＬＨコンストラクトまたはＨＬコンストラクトと称する。さらに、リンカー長を区別して表現する場合は、例えば１８アミノ酸長リンカーの場合、ＢＣＭＡ－ＣＡＲのＬ１８ＨコンストラクトまたはＨ１８Ｌコンストラクトと称する。これらのＣＡＲの構造を図２に示す。この核酸をｐＭＥＩ－５　ＤＮＡベクター（タカラバイオ社製）に挿入してレトロウイルスプラスミドｐＭＥＩ－５／ＢＣＭＡ－ＣＡＲを調製した。
（２）レトロウイルスベクター溶液の調製
　２９３Ｔ細胞株とＰＧ１３細胞株（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ－１０６８６）は、特に断らない限り、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および１００　Ｕ／ｍＬ　Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎを添加したＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地で培養した。
　以下に示す操作で、実施例２－（１）で作製した各種レトロウイルスプラスミドを使用してそれぞれのレトロウイルスベクター溶液を調製した。まず、２９３Ｔ細胞で一過性のレトロウイルスベクター上清を調製した。２９３Ｔ細胞に、レトロウイルスパッケージングプラスミド（Ｇａｇ－ｐｏｌ発現プラスミドｐＧＰ、ＶＳＶ－Ｇ発現プラスミドｐＶＳＶ－Ｇ（Ｕｃｈｉｂｏｒｉ　Ｒ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｍｏｌ　Ｔｈｅｒ　Ｏｎｃｏｌｙｔｉｃｓ．　２０１８；１２：１６－２５．））ならびにレトロウイルスプラスミドｐＭＥＩ－５／ＢＣＭＡ－ＣＡＲをリン酸カルシウム法で導入し、３７℃、５％　ＣＯ２の条件で７時間培養した。終濃度５ｍＭ酪酸ナトリウム（ＳＴＥＭＣＥＬＬ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　Ｉｎｃ．社製）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地に培地を全量交換し、３７℃、５％　ＣＯ２の条件で１６時間培養した。ＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地に培地を全量交換し、３２℃、５％　ＣＯ２の条件で２４時間培養した。培養後、２，０００×ｇで１０分間の遠心分離を行ってウイルスベクター上清を回収し、さらに０．４５μｍフィルターを用いたろ過により細胞破片を除去した。このウイルス上清にＲｅｔｒｏ－Ｘ　Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（タカラバイオ社製）を添加して混和した後に４℃で一晩静置し、混合物を２，０００×ｇで１０分間の遠心分離に供した後にペレットを１ｍＬのＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地に再懸濁して濃縮ウイルス溶液とした。
　次に、パッケージング細胞株としてＰＧ１３細胞株を使用してレトロウイルスベクターの製造を行った。すなわち、６ウェルプレートへ播種したＰＧ１３細胞を、８μｇ／ｍＬのポリブレン存在下で、前記の精製したウイルス溶液に暴露し、３７℃、５％　ＣＯ２に設定したインキュベータ内に７時間静置した後にＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地を１ｍＬ添加し、インキュベータ内にさらに一晩静置した。翌日に培地を全量交換して３７℃、５％　ＣＯ２に設定したインキュベータ内に６時間静置した後、形質導入した細胞を剥がして全量をＴ－７５フラスコへ継代した。サブコンフルエントに達した段階で限界希釈法により単一細胞クローンを単離するために、３７℃、５％　ＣＯ２に設定したインキュベータ内で７～１０日間培養した。トリプシン処理でウェルから剥離させた細胞を１２ウェルプレートに播種して３７℃、５％　ＣＯ２に設定したインキュベータ内で３～４日間培養した。トリプシン処理でウェルから細胞を剥離し、３／４量の細胞を凍結保存液（セルバンカー：日本全薬工業株式会社製）に再懸濁して－８０℃フリーザー内で冷凍保存した。残りの１／４量を１２ウェルプレートに播種して３７℃、５％　ＣＯ２に設定したインキュベータ内で３～４日間培養した。細胞がコンフルエントに達した時点で、終濃度５ｍＭ酪酸ナトリウムを添加したＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地に培地を全量交換した。培養物は３２℃、５％　ＣＯ２に設定したインキュベータ内に４８時間静置した。培養物を２，０００×ｇで１０分間の遠心分離に供した後、上清を回収して０．４５μｍフィルターを用いたろ過により細胞破片を除去し、レトロウイルスベクター溶液とした。レトロウイルスベクター溶液の一部を分取して力価（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ　Ｔｉｔｅｒ　Ｓｅｔ　（ｆｏｒ　Ｒｅａｌ　Ｔｉｍｅ　ＰＣＲ）：タカラバイオ社製）を測定し、残りは凍結セラムチューブに分注して使用時まで－８０℃フリーザー内で冷凍保存した。各クローンのウイルス上清力価（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ　Ｔｉｔｅｒ　Ｓｅｔ　（ｆｏｒ　Ｒｅａｌ　Ｔｉｍｅ　ＰＣＲ））を測定して選別することにより、レトロウイルスベクター安定産生クローン株を樹立した。上清中のウイルス力価が４．０×１０９　ｃｏｐｉｅｓ／ｍＬ以上であったレトロウイルスベクター安定産生クローン株については解凍した凍結保存細胞をＴ－７５フラスコに播種し、その後Ｔ－２２５フラスコへと拡大培養を行い、コンフルエントに達した時点で培地を終濃度５ｍＭ酪酸ナトリウムを添加したＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地に交換した。前述の方法と同様の手順でレトロウイルスベクター溶液を回収し、凍結セラムチューブに分注して使用時まで－８０℃フリーザー内で冷凍保存した。
（３）抗ＢＣＭＡ－ＣＡＲの機能検定に用いるＪｕｒｋａｔ細胞の作製
　Ｊｕｒｋａｔ細胞株（ＥＣＡＣＣ　ＥＣ８８０４２８０３）およびその形質導入細胞は、特に断らない限り、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および１００　Ｕ／ｍＬ　Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎを添加したＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。
　以下に示す操作で、ＣＡＲからの活性化シグナルに応答してルシフェラーゼ遺伝子の発現が誘導されるスイッチ機能を有した発現カセットを搭載した自己不活化型レトロウイルスベクター溶液を調製した。この発現カセットはＢＣＭＡ－ＣＡＲの機能を検定することができる。まず、２９３Ｔ細胞で一過性のレトロウイルスベクター上清を調製した。２９３Ｔ細胞に、レトロウイルスパッケージングプラスミド（Ｇａｇ－ｐｏｌ発現プラスミドｐＧＰ、ＶＳＶ－Ｇ発現プラスミドｐＶＳＶ－Ｇ）ならびにレトロウイルスプラスミドｐＲｅｔｒｏ－Ｘ　Ｑ／ＢＲ６Ｎ－ＥＬｕｃをリン酸カルシウム法で導入し、３７℃、５％　ＣＯ２の条件で７時間培養した（Ｕｃｈｉｂｏｒｉ　Ｒ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｍｏｌ　Ｔｈｅｒ　Ｏｎｃｏｌｙｔｉｃｓ．　２０１８；１２：１６－２５．）。終濃度５ｍＭ酪酸ナトリウム（ＳＴＥＭＣＥＬＬ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　Ｉｎｃ．社製）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地に培地を全量交換し、３７℃、５％　ＣＯ２の条件で１６時間培養した。その後、ＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地に培地を全量交換し、３２℃、５％　ＣＯ２の条件で２４時間培養した。培養後、２，０００×ｇで１０分間の遠心分離を行ってウイルスベクター上清を回収し、さらに０．４５μｍフィルターを用いたろ過により細胞破片を除去した。
（４）抗ＢＣＭＡ－ＣＡＲの機能検定
　Ｊｕｒｋａｔ細胞への形質導入には、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ結合ウイルス感染法（Ｊ　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　２００１　Ｓｅｐ；１３０（３）：３３１－４）を用いた。ＰＢＳで希釈した２０μｇ／ｍＬ　ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ溶液（タカラバイオ社製）を表面未処理の２４ウェルプレートに０．５ｍＬ／ウェル加えて４℃で放置した。ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ溶液を除き、ブロッキング溶液（２％　ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を添加したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ））を０．５ｍＬ／ウェル加え、室温で３０分間静置してブロッキング処理を行った。ブロッキング溶液を除き、ＰＢＳを０．５ｍＬ／ウェル加えて一度洗浄し、ＰＢＳを除去した。実施例実施例２－（３）で調製したＢＲ６Ｎ－ＥＬｕｃレトロウイルスベクター溶液（ＰＢＳで４．０×１０９　ｃｏｐｉｅｓ／ｍＬに希釈）をＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎコートプレート上にそれぞれ０．５ｍＬ／ウェル加えた。３２℃に保温した遠心機にレトロウイルスを加えたプレートをセットし、３２℃、１，９６０×ｇの条件で２時間遠心し、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ上へのウイルス粒子の吸着を促した。プレートからウイルス希釈液を除去し、１％　ＢＳＡを添加したＰＢＳ　１ｍＬで洗浄した。Ｊｕｒｋａｔ細胞（ＲＰＭＩ１６４０培地で４．０×１０５　ｃｅｌｌｓ／ｍＬに希釈）をウイルス吸着済みのプレートに１ｍＬ／ウェル加え、３２℃、１，９６０×ｇの条件で１０分間遠心した。プレートは３７℃、５％　ＣＯ２に設定したインキュベータ内に一晩静置して形質導入を行った。形質導入したＪｕｒｋａｔ細胞を翌日に回収し、ＲＰＭＩ１６４０培地７．５ｍＬに懸濁し、３７℃、５％　ＣＯ２に設定したインキュベータ内に静置した（Ｄａｙ１）。サブコンフルエントに達した段階で限界希釈法により単一細胞クローンを単離するために、３７℃、５％　ＣＯ２に設定したインキュベータ内で７～１０日間培養した。ウェルから細胞を採取し、１２ウェルプレートに播種して３７℃、５％　ＣＯ２に設定したインキュベータ内で３～４日間培養した。ウェルから細胞を採取し、Ｔ－２５フラスコに播種して３７℃、５％　ＣＯ２に設定したインキュベータ内で３～４日間培養した。１．０×１０５　ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌを発光シグナル検出用の９６ウェルホワイトマイクロプレートに播種し、残りの細胞はＴ－７５フラスコに播種して培養を継続した。９６ウェルホワイトマイクロプレートに播種した細胞にＴＰＡ（１２－Ｏ－Ｔｅｔｒａｄｅｃａｎｏｙｌｐｈｏｒｂｏｌ　１３－ａｃｅｔａｔｅ）およびＩｏｎｏｍｙｃｉｎを添加して、２４時間後にルシフェラーゼアッセイを行って発光強度を測定した。無刺激群の発光強度が低値であり、かつ無刺激群と刺激群の発光強度比が優れている細胞を、ＢＣＭＡ－ＣＡＲの機能検定として用いる形質導入Ｊｕｒｋａｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ／ｉＥＬｕｃ細胞）とした。Ｊｕｒｋａｔ／ｉＥＬｕｃ細胞はＴ－２２５フラスコへと拡大培養を行い、コンフルエントに達した時点で凍結保存液（セルバンカー：日本全薬工業株式会社製）に懸濁して凍結セラムチューブに分注し、使用時まで－８０℃フリーザー内で冷凍保存した。
（５）抗ＢＣＭＡ－ＣＡＲ構築物のＪｕｒｋａｔ／ｉＥＬｕｃ細胞への形質導入
（抗ＢＣＭＡ－ＣＡＲの機能検定）
　Ｊｕｒｋａｔ／ｉＥＬｕｃ細胞への形質導入には、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ結合ウイルス感染法を用いた。実施例２－（４）と同じ操作でＢＣＭＡ－ＣＡＲレトロウイルスを吸着させたＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎコート２４ウェルプレートにＪｕｒｋａｔ／ｉＥＬｕｃ細胞（ＲＰＭＩ１６４０培地で４．０×１０５　ｃｅｌｌｓ／ｍＬに希釈）を１ｍＬ／ウェル加え、３２℃、１，９６０×ｇの条件で１０分間遠心した。プレートは３７℃、５％　ＣＯ２に設定したインキュベータ内に一晩静置して形質導入を行った。形質導入したＪｕｒｋａｔ／ｉＥＬｕｃ細胞を翌日に回収し、ＲＰＭＩ１６４０培地７．５ｍＬに懸濁し、３７℃、５％　ＣＯ２に設定したインキュベータ内に静置した（Ｄａｙ１）。
　作製された形質導入細胞（ＧＭＣ）をＤａｙ７に回収し、慢性骨髄性白血病細胞株Ｋ５６２細胞、ＢＣＭＡを発現するＫ５６２細胞（Ｋ５６２－ＢＣＭＡ）、又はＢＣＭＡを発現するヒト骨髄腫細胞株Ｕ２６６細胞と、発光シグナル検出用の９６ウェルホワイトマイクロプレートにエフェクター：ターゲット比１：１で混和し、３７℃、５％　ＣＯ２に設定したインキュベータ内に１８時間静置して共培養した。Ｂｒｉｇｈｔ－Ｇｌｏ　Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ　Ａｓｓａｙ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を添加して、形質導入細胞の発光強度を測定した。その結果を図３に示す。図３に示す通り、ＢＣＭＡ－ＣＡＲを形質導入したＪｕｒｋａｔ／ｉＥＬｕｃ細胞では、ＢＣＭＡ特異的に発光強度の増加が観察された。特に抗ＢＣＭＡ抗体１由来のＬＨコンストラクトは、コントロール（形質導入細胞のみ）の発光強度が低く、かつコントロール群とＵ２６６共培養群の発光強度比が４６．９倍と、最も反応性に優れていた。
（６）リンカーの長さの比較
　抗ＢＣＭＡ抗体１由来のＬＨコンストラクトについて、実施例２－（１）と同様の手順でリンカーアミノ酸長を１５残基（Ｌ１５Ｈ、配列番号６２）または２０残基（Ｌ２０Ｈ、配列番号６３）に置換したレトロウイルスプラスミドを構築し、レトロウイルスベクター溶液をそれぞれ調製した。実施例２－（２）～（５）と同様の手順でＪｕｒｋａｔ／ｉＥＬｕｃ細胞に形質導入し、Ｋ５６２細胞、Ｋ５６２－ＢＣＭＡ細胞、又はＵ２６６細胞と、発光シグナル検出用の９６ウェルホワイトマイクロプレートにエフェクター：ターゲット比１：１で混和し、３７℃、５％　ＣＯ２に設定したインキュベータ内に１８時間静置して共培養した。コントロールとして、形質導入していない細胞（Ｊｕｒｋａｔ細胞およびＪｕｒｋａｔ／ｉＥＬｕｃ細胞）も同様に共培養した。Ｂｒｉｇｈｔ－Ｇｌｏ　Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ　Ａｓｓａｙ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を添加して、形質導入細胞の発光強度を測定した。その結果を図４に示す。図４に示す通り、ＢＣＭＡ－ＣＡＲを形質導入したＪｕｒｋａｔ／ｉＥＬｕｃ細胞では、ＢＣＭＡ特異的に発光強度の増加が観察された。特にＬ２０Ｈコンストラクトは、コントロール（形質導入細胞のみ）の発光強度が低く、かつコントロール群とＵ２６６共培養群の発光強度比が６２．８倍と、最も反応性に優れていた。抗体１由来のＬＨコンストラクトを有しリンカーの長さが２０であるＣＡＲをＢＣＭＡ－ＣＡＲ（Ｌ２０Ｈ）とし、そのアミノ酸配列を配列番号６５に示す。また、ＢＣＭＡ－ＣＡＲ（Ｌ２０Ｈ）をコードする核酸の塩基配列を配列番号６６に示す（表３）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
実施例３　抗ＢＣＭＡ－ＣＡＲの評価
（１）抗ＢＣＭＡ－ＣＡＲ構築物のＴ細胞への形質導入
　インフォームド・コンセントが得られたボランティアから末梢血をＢＤ　バキュテイナＣＰＴ単核球分離用採血管に採取し、２５℃、１，５００×ｇの条件で１５分間遠心して分離された末梢血単核球（ＰＢＭＣ：　ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ　ｂｌｏｏｄ　ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ　ｃｅｌｌｓ）と血漿をそれぞれ回収した。ＰＢＭＣはＣＥＬＬＯＴＩＯＮ（日本全薬工業株式会社製）で２回洗浄し、細胞凍結保存液ＣＰ－１（Ｋｙｏｋｕｔｏ　ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　ｃｏ．　ｌｔｄ．社製）とヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）（Ａｌｂｕｍｉｎａｒ；　ＣＳＬ　Ｂｅｈｒｉｎｇ社製）とＲＰＭＩの混合液に混和して－８０℃で使用時まで凍結保存した。血漿は５６℃に設定したウォータバスで３０分の非働化処理を行い、－８０℃で使用時まで凍結保存した。
　ＰＢＭＣの活性化に際し、ＡＣＤ－Ａ液（テルモ社製）で希釈した５　μｇ／ｍＬ　ＣＤ３　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　（ＯＫＴ３）（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）と２０μｇ／ｍＬ　ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（タカラバイオ社製）を表面未処理の６ウェルプレートに１ｍＬ／ウェル加え、３７℃、５％　ＣＯ２に設定したインキュベータ内で３時間静置した後、４℃で一晩放置してＯＫＴ３／ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎコートプレートを作製した。解凍したＰＢＭＣを培地（１７５　ＩＵ／ｍＬ　ＩＬ－２と０．１％　非働化済み自己血漿を添加したＧＴ－Ｔ５５１培地（タカラバイオ社製））に懸濁して２．０×１０５　ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整した細胞懸濁席を調製した。ＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地（ＦＢＳ不含、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ不含）で３回洗浄したＯＫＴ３／ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎコートプレートに、前記の細胞懸濁液を６．５ｍＬ／ウェル加えた。プレートは３７℃、５％　ＣＯ２に設定したインキュベータ内に４日間静置し、ＰＢＭＣ中のＴ細胞の活性化と増殖を促進させた。
　Ｔ細胞への形質導入には、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ結合ウイルス感染法を用いた。実施例２－（４）と同じ操作で、実施例２－（６）で調製した抗体１由来のＢＣＭＡ－ＣＡＲ（Ｌ２０Ｈ）をコードする核酸を含むレトロウイルスベクター溶液を吸着させたＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎコート２４ウェルプレートを作製した、このプレートにＯＫＴ３／Ｒｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎで活性化したＴ細胞（１７５　ＩＵ／ｍＬ　ＩＬ－２と０．１％　非働化済み自己血漿を添加したＧＴ－Ｔ５５１培地で４．０×１０５　ｃｅｌｌｓ／ｍＬに希釈）を４ｍＬ／ウェル加え、３２℃、１，９６０×ｇの条件で１０分間遠心した。プレートは３７℃、５％　ＣＯ２に設定したインキュベータ内に一晩静置して形質導入を行った。形質導入したＴ細胞を翌日に回収し、終濃度１７５　ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を添加した基本培地（０．１％の非働化済み自己血漿を添加したＧＴ－Ｔ５５１培地（タカラバイオ社製））３０ｍＬに懸濁し、３７℃、５％　ＣＯ２に設定したインキュベータ内に静置した（Ｄａｙ１）。Ｄａｙ４、７、９、１１に、終濃度１７５　ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を添加した基本培地を等量加えた。Ｄａｙ１４に細胞を回収して、ＣＥＬＬＯＴＩＯＮで洗浄した。
（２）細胞傷害活性測定
　実施例３－（１）で作製された形質導入細胞（ＧＭＣ）を、慢性骨髄性白血病細胞株Ｋ５６２細胞、ＢＣＭＡを発現するＫ５６２細胞（Ｋ５６２－ＢＣＭＡ）、又はＢＣＭＡを発現するヒト骨髄腫細胞株Ｕ２６６細胞と、Ｖ底９６ウェルマイクロプレートでエフェクター：ターゲット比２５：１、１２．５：１、６．２５：１、３．１３：１で混和し、３７℃、５％　ＣＯ２に設定したインキュベータ内に１８時間静置して共培養した。コントロールとして、形質導入していない細胞（ＮＧＭＣ）も同様に共培養した。２５０×ｇ、室温、１０分間の条件でマイクロプレートを遠心した後、上清を１００μＬ／ウェルずつ平底９６ウェルマイクロプレートに分取し、ＬＤＨ　Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて細胞傷害活性を測定した。図５に示す通り、ＢＣＭＡ－ＣＡＲを発現するＴ細胞はＢＣＭＡ特異的に細胞傷害活性を示した。
（３）ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞によるＩＦＮ－γの産生
　実施例３－（１）で作製した形質導入細胞を、Ｋ５６２細胞、Ｋ５６２－ＢＣＭＡ細胞、ヒト骨髄腫細胞株Ｕ２６６細胞をエフェクター：ターゲット比１：１でＢＳＡを終濃度１％添加したＲＰＭＩ－１６４０　Ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に混和してＶ底９６ウェルマイクロプレートに移し、３７℃、５％　ＣＯ２に設定したインキュベータ内に１８時間静置して共培養した。２５０×ｇ、室温、１０分間の条件でマイクロプレートを遠心した後に上清を分取し、Ｈｕｍａｎ　ＩＦＮ　ｇａｍｍａ　ＥＬＩＳＡ　Ｒｅａｄｙ－ＳＥＴ－Ｇｏ　（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いてＩＦＮ－γの産生を測定した。図６に示す通り、ＢＣＭＡ－ＣＡＲを発現するＴ細胞はＢＣＭＡ特異的にＩＦＮ－γを産生することを示した。
（４）担がんマウスに対するＣＡＲ－Ｔ細胞のｉｎ　ｖｉｖｏ抗腫瘍効果１
　免疫不全ＮＯＧマウスに、Ｅｍｅｒａｌｄルシフェラーゼ遺伝子を形質導入したヒト骨髄腫細胞株Ｕ２６６細胞を尾静脈から１ｘ１０６個接種し、その４２日後に実施例３－（１）で作製したＣＡＲ形質導入細胞を２ｘ１０６個輸注した（各ｎ＝１０）。各形質導入Ｔ細胞の輸注後の経時的な腫瘍細胞のルシフェラーゼ活性のインビボ生物発光イメージングと、発光強度を数値化したグラフを図７に示す。ＢＣＭＡ－ＣＡＲを発現するＴ細胞はｉｎ　ｖｉｖｏにおける高い抗腫瘍活性が確認された。
（５）担がんマウスに対するＣＡＲ－Ｔ細胞のｉｎ　ｖｉｖｏ抗腫瘍効果２
　誘導性遺伝子発現システム（Ｕｃｈｉｂｏｒｉ　Ｒら、Ｍｏｌ　Ｔｈｅｒ　Ｏｎｃｏｌｙｔｉｃｓ　２０１９、１２：１６－２５）を使用して、注入されたＣＡＲ－Ｔ細胞が腫瘍特異的応答を示したかどうかを分析した。ｉＥＬｕｃ－ＴはＣＡＲのシグナルに応答してルシフェラーゼを発現するＴ細胞である。ＣＡＲを発現しないｉＥＬｕｃ－Ｔ細胞（ｉＥＬｕｃ－Ｔ細胞処理グループ）とＣＡＲを発現するｉＥＬｕｃ－Ｔ細胞（ＣＡＲ／ｉＥＬｕｃ－Ｔ細胞処理グループ）を、実施例３－（４）と同様に担がんマウスに輸注した（図８－１中、Ａ）。グループの輸注後の経時的な腫瘍細胞のルシフェラーゼ活性とＣＡＲのシグナルに応答したルシフェラーゼ活性のインビボ生物発光イメージングと、発光強度を数値化したグラフを図８に示す。ｉＥＬｕｃ－Ｔ細胞処理グループでは、注入された細胞の部分的な活性化が観察されたが、その後も腫瘍細胞は増殖を続けた（図８－２および図８－３中、Ｂ、Ｃ、Ｆ、およびＧ）。対照的に、ＣＡＲ／ｉＥＬｕｃ－Ｔ細胞処理グループでは、注入された細胞の全身的な活性化が観察され、腫瘍細胞が消失した（図８－２および図８－３中、Ｄ、Ｅ、Ｈ、およびＩ）。注入されたＣＡＲ－Ｔ細胞は腫瘍細胞特異的な細胞傷害性反応を示すことが確認された。興味深いことに、注入されたＴ細胞の活性化も、腫瘍細胞の消失とともに急速に減少した。
（６）貧血の進行抑制効果
　赤血球生成は骨髄の構造単位および機能単位で起こり、赤芽球島（ＥＢＩ）と呼ばれる。骨髄内で部分的に成熟した後、網赤血球は血液に入り、そこで成熟赤血球になる。骨髄に浸潤した骨髄腫細胞は、サイトカインを分泌することによってＥＢＩの機能と構造を損傷する。ＭＭ患者の骨髄内のマクロファージの総数は、骨髄腫細胞による骨髄浸潤の面積と逆相関する。ＥＢＩのセントラルマクロファージは骨髄マクロファージ全体のわずかな割合であるが、骨髄のセントラルマクロファージ集団が比例して減少すると、ＥＢＩ数と赤血球生成活性が低下する。担がんマウス（Ｕ２６６＋）では正常マウス（Ｎｏｒｍａｌ）に比べて脾臓重量が顕著に増加していることが判明した。これは、骨髄へのＵ２６６細胞の浸潤が正常な髄内造血を阻害し、その結果脾臓での髄外造血が亢進したためと考えられる。脾臓の重量もＧＭＣ治療グループで正常よりも高いものの減少し、正常な重量に戻ったことが示された（図９－１、Ａ）。
　さらに、マウスの胎児肝臓造血は生後約２週間で消失する。しかし、急性の実験的な貧血では、成体マウスの肝臓で髄外造血が起こる。したがって、ＭＭ患者の貧血病態をマウスで再現することは技術的に困難であると推測される。治療前および治療後２１日の血液学的パラメーターを図９Ｂに示す。図９Ｂ中、ＷＢＣは白血球、ＲＢＣは赤血球、Ｈｂはヘモグロビン、Ｈｆはヘマトクリット、ＭＣＶは平均血球容積、ＭＣＨは平均赤血球ヘモグロビン量、ＭＣＨＣは平均赤血球ヘモグロビン濃度、ＰＬＴは血小板数、Ｒｅｔｉは網状赤血球数を示す。この研究では、治療開始時に担がんマウスのＭＣＨが大幅に減少したが、ＲＢＣと網状赤血球の数は増加する傾向が確認された。しかし、生理食塩水（Ｓａｌｉｎｅ）とＮＧＭＣで治療したマウスは時間の経過とともに貧血傾向を示し、赤血球と網状赤血球が減少した。対照的に、ＧＭＣで治療したマウスでは、貧血の進行が防止され、正常なマウスで観察されたものと同様であった（図９－２、Ｂ）。
（７）骨領域の進行に対するＣＡＲ－Ｔ療法の抑制効果
　マイクロＣＴを使用して骨梁の形態を評価した（図１０－１および図１０－２）。図１０－２中、ＢＳ／ＢＶは骨表面積／体積比、ＢＳ／ＴＶは組織体積あたりの骨体積、Ｔｂ．Ｔｈは骨梁幅、Ｔｂ．Ｎは骨梁数、Ｔｂ．Ｓｐは骨梁中心距離を示す。
　治療開始時、担がんマウスは正常なマウスに比べてわずかに進行した骨病変を示した。しかし、骨表面は正常なマウスと同様だった（図１０－１および図１０－２、Ａ、Ｃ）。生理食塩水またはＮＧＭＣで治療したマウスは進行性の骨病変を示した。顆と骨表面の重度の破壊が観察された（図１０－１および図１０－２、Ｂ、Ｃ）。対照的に、ＧＭＣで治療したマウスでは、骨病変の進行が強力に防止され、骨表面は正常なマウスと同様だった。観察期間が短いため、本研究で観察された現象は、ＧＭＣ投与によって引き起こされた骨病変の改善ではなく、進行の減少であったと考えられる。
　本発明により、ＢＣＭＡを標的にした遺伝子改変免疫細胞療法の分野において有用なＣＡＲ、前記ＣＡＲをコードする核酸、前記核酸を含むベクター、前記キメラ型受容体を発現する細胞、前記細胞の製造方法、前記細胞を有効成分として含む医薬組成物、ならびに当該医薬組成物を対象に投与することを特徴とする疾病の予防（再発予防を含む、以下同じ）または治療方法が提供される。本発明のＣＡＲを発現する細胞は、ＢＣＭＡを発現する細胞に対し高い殺傷能力を有し、高い治療効果が期待される。

Claims (15)

  1. 　軽鎖可変（ＶＬ）領域及び重鎖可変（ＶＨ）領域を含む抗ヒトＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）抗体又はその抗原結合フラグメントであって、ＶＬ領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３並びにＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列が、それぞれ以下の（１）～（６）からなる群より選択される配列番号に示されたアミノ酸配列である抗体又はその抗原結合フラグメント：
    （１）配列番号１～６、
    （２）配列番号７～１２、
    （３）配列番号１３～１８、
    （４）配列番号１９～２４、
    （５）配列番号２５～３０、および
    （６）配列番号３１～３６。
  2. 　前記ＶＬ領域及びＶＨ領域のアミノ酸配列が、以下の（１）～（６）からなる群より選択される請求項１記載の抗体又はその抗原結合フラグメント：
    （１）配列番号３７及び３８、
    （２）配列番号３９及び４０、
    （３）配列番号４１及び４２、
    （４）配列番号４３及び４４、
    （５）配列番号４５及び４６、および
    （６）配列番号４７及び４８。
  3. 　前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、及びシングルドメイン抗体（ｄＡＢ）からなる群から選択される、請求項１又は２に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
  4. 　前記抗原結合フラグメントはｓｃＦｖである、請求項３に記載の抗原結合フラグメント。
  5. 　請求項１～４のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする核酸。
  6. 　（ｉ）抗原結合ドメインと、（ｉｉ）膜貫通ドメインと、（ｉｉｉ）細胞内ドメインとを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、
    　前記抗原結合ドメインが、請求項１～４のいずれか１項に記載の抗原結合フラグメント含む、ＣＡＲ。
  7. 　前記細胞内ドメインが共刺激ドメイン及び活性化ドメインを含む、請求項６に記載のＣＡＲ。
  8. 　前記共刺激ドメインがＣＤ２８の細胞内フラグメントを含む、請求項７に記載のＣＡＲ。
  9. 　前記活性化ドメインがＣＤ３ζの細胞内フラグメントを含む、請求項７又は８に記載のＣＡＲ。
  10. 　請求項６～９のいずれか１項に記載のＣＡＲをコードする核酸。
  11. 　請求項５に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする核酸もしくは請求項１０に記載のＣＡＲをコードする核酸を含むベクター。
  12. 　請求項５に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする核酸もしくは請求項１０に記載のＣＡＲをコードする核酸を含む細胞。
  13. 　前記細胞は、Ｔ細胞である、請求項１２に記載の細胞。
  14. 　請求項１３に記載の細胞を有効成分として含む医薬組成物。
  15. 　ＣＡＲを発現する細胞を製造する方法であって、細胞に、請求項５に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする核酸、請求項１０に記載のＣＡＲをコードする核酸、もしくは請求項１１に記載のベクターを形質導入する工程含む、方法。
PCT/JP2024/009945 2023-03-15 2024-03-14 抗ｂｃｍａ抗体およびキメラ抗原受容体 Ceased WO2024190856A1 (ja)

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