WO2024138762A1 - 重组蛋白及其应用 - Google Patents

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宋承威
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    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)

Definitions

  • the A family DNA polymerase is selected from at least one of a Bst DNA polymerase having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:1, a Taq DNA polymerase having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:9, an Escherichia coli DNA polymerase having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:10, and a Bsu DNA polymerase having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:11.
  • the homologous sequence in the A family DNA polymerase is replaced by a sequence comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:3, a sequence essentially consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:3, or a sequence consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:3.
  • sequence of SEQ ID NO:14 is: VVKKTKTGY
  • sequence of SEQ ID NO:4 is:
  • sequence of SEQ ID NO:16 is:
  • sequence of SEQ ID NO:19 is:
  • the method specifically includes: searching through the sequence database of A family polymerase and comparing homologous sequences to determine a candidate chimeric sequence for replacing the homologous sequence in the wild-type polymerase; using tools such as Alphafold, Autodock and Gromacs to perform (1) structural prediction, (2) molecular docking simulation of DNA double strands and recombinant protein and (3) kinetic simulation analysis on the recombinant protein with a chimeric sequence according to an embodiment of the present invention; using a prokaryotic expression system to express and purify the recombinant protein determined by the simulation analysis, and determine its activity; and confirming the protein sequence by sequencing.
  • the homologous sequence in the A family DNA polymerase is replaced by a sequence comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:3, a sequence essentially consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:3, or a sequence consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:3.
  • the amino acid sequence of the recombinant protein is selected from at least one of SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16 and SEQ ID NO:17.
  • an embodiment of the present invention provides a method for amplifying a target DNA, wherein the target DNA is amplified using the recombinant protein described in any embodiment of the first aspect.
  • the amplification is isothermal amplification
  • the isothermal amplification is selected from rolling circle amplification RCA, multiple displacement amplification MDA, recombinase polymerase amplification reaction RPA, strand displacement amplification SDA, and loop-mediated isothermal amplification LAMP.
  • the chimeric sequence is derived from human DNA polymerase ⁇ (Human pol theta, POL ⁇ ), and SEQ ID NO:3 is approximately 24 amino acids longer than SEQ ID NO:2, approximately XX amino acids longer than SEQ ID NO:12, approximately XX amino acids longer than SEQ ID NO:13, and approximately XX amino acids longer than SEQ ID NO:14.
  • Bst-HS-1 Amino acid sequence of chimeric Bst DNA polymerase (Bst-HS-1) (SEQ ID NO: 4):
  • Taq-LF WT The sequence of wild-type Taq DNA polymerase large fragment (Taq-LF WT) is SEQ ID NO:9:
  • Taq-HS-1 Amino acid sequence of chimeric Taq DNA polymerase (Taq-HS-1) (SEQ ID NO: 15):
  • Ecoli-LF WT The sequence of wild-type Escherichia coli DNA polymerase large fragment (Ecoli-LF WT) SEQ ID NO: 10:
  • the sequence of wild-type Bsu DNA polymerase large fragment (Bsu-LF WT) is SEQ ID NO: 11:
  • the optimized structure was subjected to 25 ns kinetic simulation at a simulation temperature of 330 K.
  • the amino acid sequence NFN at positions 515 to 517 in the finger domain of the chimeric Bst DNA polymerase and K268 in the thumb domain can be continuously maintained at a distance of 4-6 angstroms, allowing the DNA template chain to be clamped in the pocket structure formed by the two, while the extended region can also maintain a tight bond with the newly synthesized double-stranded DNA.
  • the Qubit dsDNA Assay Kit was used according to the instructions, and the MDA product concentration was detected using Qubit fluorometor 3.0.
  • first and second are used for descriptive purposes only and cannot be understood as indicating or implying relative importance or implicitly indicating the number of the indicated technical features. Therefore, the features defined as “first” and “second” may explicitly or implicitly include at least one of the features. In the description of the present invention, the meaning of "plurality” is at least two, such as two, three, etc., unless otherwise clearly and specifically defined.
  • the terms “one embodiment”, “some embodiments”, “examples”, “specific examples”, or “some examples” etc. mean that the specific features, structures, materials or characteristics described in conjunction with the embodiment or example are included in at least one embodiment or example of the present invention.
  • the schematic representations of the above terms do not necessarily refer to the same embodiment or example.
  • the described specific features, structures, materials or characteristics may be combined in any one or more embodiments or examples in a suitable manner.
  • those skilled in the art may combine and combine different embodiments or examples and features of different embodiments or examples described in this specification without contradiction.

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Abstract

提供了具有提高的扩增性能的重组蛋白，编码该重组蛋白的核酸，包含该核酸的载体,包含上述蛋白、核酸或载体的试剂盒，制备上述重组蛋白的方法，以及利用该重组蛋白扩增目的DNA的方法。重组蛋白作为嵌合型A家族DNA聚合酶具有提高的持续合成能力，其扩增性能显著优于野生型A家族DNA聚合酶，而且热稳定性高于B家族DNA聚合酶。

Description

重组蛋白及其应用 技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及重组蛋白，编码该重组蛋白的核酸，包含该核酸的载体，包含上述蛋白、核酸或载体的试剂盒，制备上述重组蛋白的方法，以及利用该重组蛋白扩增目的DNA的方法。
背景技术
DNB-SEQ测序方法中通常使用phi29 DNA聚合酶进行滚环扩增(RCA)反应和多重置换扩增(MDA)反应。phi29 DNA聚合酶是B家族聚合酶，尽管具有极高的链置换活性和可持续合成能力，但是phi29 DNA聚合酶的热稳定性较差以致容易失活，因此需要将其在严苛条件下低温保存且保质期较短。此外，phi29 DNA聚合酶的非特异结合能力强且难以洗脱，导致了phi29DNA聚合酶在测序中产生较强荧光背景。
Bst聚合酶是A家族聚合酶，具有耐高温的特性，其最适反应温度在60-65℃。因此无论在其制备还是应用过程中，A家族聚合酶对温度具有更好的耐受性，且同样具有较高的链置换活性。在测序中，A家族聚合酶相比于phi29聚合酶更容易被洗脱，并且在复杂体系表现更好。然而，相比于B家族的DNA聚合酶(如phi29、Pfu、Kod聚合酶)，A家族聚合酶的拇指结构域与DNA模板结合的区域较小，导致包括Bst聚合酶在内的A家族聚合酶的可持续扩增能力较弱。
因此，需要研究开发具有高持续合成能力的A家族聚合酶。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。
为此，本发明的实施方案提供了具有在扩增反应中加强DNA聚合酶与目的DNA相互作用的氨基酸序列的重组蛋白，编码该重组蛋白的核酸，包含该核酸的载体，包含上述蛋白、核酸或载体的试剂盒，制备上述重组蛋白的方法，以及利用该重组蛋白扩增目的DNA的方法。本发明实施方案提供的重组蛋白为具有提高的持续合成能力以及加强的热稳定性、聚合活性和DNA双链亲和力的嵌合型A家族DNA聚合酶，可用于扩增目的DNA。
第一方面，本发明的实施方案提供了一种重组蛋白，该重组蛋白的氨基酸序列是用在扩增反应中能够加强DNA聚合酶与目的DNA相互作用的氨基酸序列替换野生型的A家族DNA聚合酶中的同源序列获得的氨基酸序列。
在一些实施例中，A家族DNA聚合酶选自由大肠杆菌DNA聚合酶I、T3 DNA聚合酶、 T5 DNA聚合酶、T7 DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、Bsu DNA聚合酶和Bst DNA聚合酶组成的组。
在一些实施例中，A家族DNA聚合酶选自具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的Bst DNA聚合酶、具有SEQ ID NO:9所示氨基酸序列的Taq DNA聚合酶、具有SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的大肠杆菌DNA聚合酶和具有SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的Bsu DNA聚合酶中的至少一种。
在一些实施例中，A家族DNA聚合酶中的同源序列来源于拇指结构域。
在一些实施例中，A家族DNA聚合酶中的同源序列选自以下中的至少一种：
如SEQ ID NO:2所示的Bst DNA聚合酶中的第546位至第554位氨基酸序列；
如SEQ ID NO:12所示的Taq DNA聚合酶中的第199位至第209位氨基酸序列；
如SEQ ID NO:13所示的大肠杆菌DNA聚合酶中的第276位至第285位氨基酸序列；或
如SEQ ID NO:14所示的大肠杆菌Bsu聚合酶中的第249位至第257位氨基酸序列。
在一些实施例中，A家族DNA聚合酶中的同源序列被替换为包含SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的序列、基本上由SEQ ID NO:3所示氨基酸序列组成的序列、或由SEQ ID NO:3所示氨基酸序列组成的序列。
在一些实施例中，重组蛋白的氨基酸序列选自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17中的至少一种。
在一些实施例中，重组蛋白还包含额外的保守突变、添加和缺失中的任一种。
在一些实施例中，重组蛋白作为嵌合型DNA聚合酶的持续合成能力高于野生型的所述A家族DNA聚合酶。
第二方面，本发明的实施方案提供了一种核酸，该核酸编码如第一方面任一实施方案所述的重组蛋白。
在一些实施例中，所述核酸分子的核苷酸序列选自SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20中的至少一种。
第三方面，本发明的实施方案提供了一种载体，该载体包含如第二方面任一实施方案所述的核酸。
第四方面，本发明的实施方案提供了一种试剂盒，包含如第一方面任一实施方案所述的重组蛋白、如第二方面任一实施方案所述的核酸、或如第三方面任一实施方案所述的载体。
第五方面，本发明的实施方案提供了一种制备第一方面任一实施方案所述的重组蛋白的方法，该方法包括：用在扩增反应中能够加强DNA聚合酶与目的DNA相互作用的氨基 酸序列替换野生型的A家族DNA聚合酶中的同源序列获得的氨基酸序列，以获得所述重组蛋白。
在一些实施例中，所述方法包括：对来自所述野生型A家族DNA聚合酶的多个氨基酸序列进行序列比对，以确定嵌合序列；和用所述嵌合序列替换所述野生型A家族DNA聚合酶序列中的同源序列，以获得候选重组蛋白序列。
在一些实施例中，所述方法还包括：对所述候选重组蛋白序列进行计算机模拟分析，以确定重组蛋白序列，其中所示重组蛋白序列表现出减小的拇指结构域与手指结构域之间的空间构型。
在一些实施例中，对所述候选重组蛋白序列进行计算机模拟分析，以获得重组蛋白序列，包括：对所述候选重组蛋白序列进行结构预测，以获得重组蛋白的三级结构；对所述重组蛋白的三级结构进行模拟，以获得所述重组蛋白的分子对接结构；对所述分子对接结构进行基于配体的结构优化，以获得优化的重组蛋白结构；和对所述优化的重组蛋白结构进行动力学模拟，以确定重组蛋白序列。
在一些实施例中，所述方法还包括：表达并纯化所述重组蛋白序列。
在一些实施例中，A家族DNA聚合酶选自由大肠杆菌DNA聚合酶I、T3 DNA聚合酶、T5 DNA聚合酶、T7 DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、Bsu DNA聚合酶和Bst DNA聚合酶组成的组。
在一些实施例中，A家族DNA聚合酶选自具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的Bst DNA聚合酶具有SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列的Taq DNA聚合酶、具有SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的大肠杆菌DNA聚合酶和具有SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的Bsu DNA聚合酶中的至少一种。
在一些实施例中，所述A家族DNA聚合酶中的同源序列来源于拇指结构域序列。
在一些实施例中，所述A家族DNA聚合酶中的同源序列选自以下中的至少一种：
如SEQ ID NO:2所示的Bst DNA聚合酶中的第546位至第554位氨基酸序列；
如SEQ ID NO:12所示的Taq DNA聚合酶中的第199位至第209位氨基酸序列；
如SEQ ID NO:13所示的大肠杆菌DNA聚合酶中的第276位至第285位氨基酸序列；或
如SEQ ID NO:14所示的大肠杆菌Bsu聚合酶中的第249位至第257位氨基酸序列。
在一些实施例中，A家族DNA聚合酶中的同源序列被替换为包含SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的序列、基本上由SEQ ID NO:3所示氨基酸序列组成的序列、或由SEQ ID NO:3所示氨基酸序列组成的序列。
在一些实施例中，重组蛋白的氨基酸序列选自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:15、SEQ ID  NO:16和SEQ ID NO:17中的至少一种。
第六方面，本发明的实施方案提供了一种扩增目的DNA的方法，使用第一方面任一实施方案所述的重组蛋白对目的DNA进行扩增。
在一些实施例中，所述扩增是等温扩增，所述等温扩增选自滚环扩增RCA、多重置换扩增MDA、重组酶聚合酶扩增反应RPA、链置换扩增SDA、环介导等温扩增LAMP。
在一些实施例中，所述扩增用于构建DNA文库或测序。
本发明实施方案中的重组蛋白作为嵌合型A家族DNA聚合酶具有提高的持续合成能力，其扩增性能显著优于野生型A家族DNA聚合酶。此外，与B家族DNA聚合酶相比，本发明实施方案中的重组蛋白还具有以下优势：热稳定性高、方便洗脱且易于储存。
附图说明
为了更清楚地说明本公开实施例的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本公开的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为Bst DNA聚合酶大片段的结构示意图。
图2为野生型Bst DNA聚合酶大片段与根据本发明实施例的嵌合型DNA聚合酶的序列比对示意图。
图3为根据本发明实施例的嵌合型DNA聚合酶Taq-HS-1(a)、Ecoli-HS-1(b)、Bsu-HS-1(c)和Bst-HS-1(d)与DNA分子对接后的结构示意图。
图4为根据本发明实施例的嵌合型DNA聚合酶与DNA分子复合物的动力学模拟后的结构示意图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
A家族DNA聚合酶包括诸如大肠杆菌聚合酶I、Bst DNA聚合酶、T7 DNA聚合酶和Taq DNA聚合酶，后者在PCR中已被广泛应用。来自嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)的Bst DNA聚合酶是一种多功能酶，以耐高温、强大的链置换活性和可实现环介导的等温扩增为特点，然而其可持续扩增能力仍有待改进。Bst DNA聚合酶属于A家族DNA聚合酶，具有典型的右手结构，分为拇指结构域、手掌结构域、手指结构域和5’-3’外切酶结构域，其中在聚合反应中目的DNA和部分新合成的DNA夹在拇指结构域和手指结构域之间。在生物技术应用中，Bst DNA聚合酶的5’-3’外切酶结构域通常会被敲除，只保 留包含拇指结构域、手掌结构域、手指结构域的Bst聚合酶大片段(Bst-LF)，其结构如图1所示。
目前应用于测序的DNA聚合酶主要是以phi29聚合酶为主的B家族链置换酶。phi29聚合酶是来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的噬菌体phi29中的聚合酶，具有较高的连续合成能力和链置换活性，常应用于基于RCA的DNB制备及基于MDA的单细胞全基因组扩增。phi29聚合酶是一种中温恒温酶，最适反应温度在30℃左右，但在65℃孵育10分钟即可完全失活。phi29聚合酶具有强链置换能力及高持续合成能力主要是因为它的TPR2(terminal protein region 2)结构域。TPR2结构域在链合成过程中可以将模板的双链解链，只允许模板链进入并会把模板一直夹在Exo结构域和TPR2结构域之间，使酶和模板不能分离，从而使phi29聚合酶具有>70000nt的持续扩增能力。但是，phi29聚合酶存在保存条件严苛、保质期较短、测序时荧光背景较大等缺陷。
相比于B家族的DNA聚合酶(如phi29、Pfu、Kod聚合酶)，A家族聚合酶的拇指结构域与DNA模板结合的区域较小，且与新生DNA链的相互作用也较小，导致包括Bst聚合酶在内的A家族聚合酶的可持续扩增能力较弱。此外，由于5’-3’外切结构域具有DNA结合作用，能阻止聚合酶与模板的彻底解离，在敲除5’-3’外切结构域的情况下，A家族聚合酶大片段的持续合成能力会下降，通常不能很好的合成长度大于10kb的DNA链。
基于以上问题，发明人以Bst聚合酶、Taq DNA聚合酶、大肠杆菌DNA聚合酶和Bsu DNA聚合酶为例对A家族聚合酶的结构进行了探索，以期提供一种对DNA双链具有高亲和力且持续合成能力高的聚合酶变体。根据本申请实施方案提供的重组蛋白，即嵌合型A家族聚合酶，其在结构方面实现了使得拇指结构域向手指结构域方向延伸的改造，缩小了拇指结构域与手指结构域之间的空间，使模板链和部分新合成的DNA链保持在拇指结构域和手指结构域之间，从而起到类似于phi29聚合酶中TPR2结构域的效果，加强了拇指结构域与DNA双链的相互作用并且形成环绕DNA模板链的环形滑动夹，提高了A家族DNA聚合酶的持续合成能力。
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种重组蛋白，该重组蛋白的氨基酸序列是用在扩增反应中能够加强DNA聚合酶与目的DNA相互作用的氨基酸序列替换野生型的A家族DNA聚合酶中的同源序列获得的氨基酸序列。
需要说明的是，本发明的实施例提供的重组蛋白的拇指结构域中替换为一段嵌合蛋白序列。该序列加强了拇指结构域与DNA双链的互作，并且形成环绕DNA模板链的环形滑动夹，使聚合酶对DNA双链的亲和力提高，从而提高持续合成能力的效果。该重组蛋白也由此具有提高的持续合成能力，加强的热稳定性、聚合活性、DNA双链亲和力，可用于建库和测序中的多种DNA等温扩增反应。
需要说明的是，聚合酶的持续合成能力可定义为在一次结合中处理的核苷酸数量。DNA聚合酶的合成能力通常反应了合成率和合成速度，以及酶与底物的亲和力。合成能力高的DNA聚合酶适用于扩增长模板、具有二级结构和富含GC的序列，以及存在肝素、木聚糖和腐殖酸等PCR抑制剂的血液和植物组织样品。
在一些实施例中，A家族DNA聚合酶选自由大肠杆菌DNA聚合酶I、T3 DNA聚合酶、T5 DNA聚合酶、T7 DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、Bsu DNA聚合酶和Bst DNA聚合酶组成的组。
在一些实施例中，A家族DNA聚合酶选自具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的Bst DNA聚合酶、具有SEQ ID NO:9所示氨基酸序列的Taq DNA聚合酶、具有SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的大肠杆菌DNA聚合酶和具有SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的Bsu DNA聚合酶中的至少一种。
SEQ ID NO:1的序列为：
Figure PCTCN2022144377-appb-000001
(加粗下划线为同源序列SEQ ID NO:2)
SEQ ID NO:9的序列为：
Figure PCTCN2022144377-appb-000002
Figure PCTCN2022144377-appb-000003
Figure PCTCN2022144377-appb-000004
(加粗下划线为同源序列SEQ ID NO:12)
SEQ ID NO:10的序列为：
Figure PCTCN2022144377-appb-000005
Figure PCTCN2022144377-appb-000006
(加粗下划线为同源序列SEQ ID NO:13)
SEQ ID NO:11的序列为：
Figure PCTCN2022144377-appb-000007
Figure PCTCN2022144377-appb-000008
(加粗下划线为同源序列SEQ ID NO:14)
在一些实施例中，所述A家族DNA聚合酶中的同源序列来源于拇指结构域序列。
在一些实施例中，所述A家族DNA聚合酶中的同源序列选自以下中的至少一种：
如SEQ ID NO:2所示的Bst DNA聚合酶中的第546位至第554位氨基酸序列；
如SEQ ID NO:12所示的Taq DNA聚合酶大片段中的第199位至第209位氨基酸序列；
如SEQ ID NO:13所示的大肠杆菌DNA聚合酶大片段中的第276位至第285位氨基酸序列；或
如SEQ ID NO:14所示的大肠杆菌Bsu聚合酶大片段中的第249位至第257位氨基酸序列。
SEQ ID NO:2的序列为：VLKKTKTGY。
SEQ ID NO:12的序列为：AIGKTEKTGKR
SEQ ID NO:13的序列为：PLKKTPGGAP
SEQ ID NO:14的序列为：VVKKTKTGY
在一些实施例中，A家族DNA聚合酶中的同源序列被替换为包含SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的序列、基本上由SEQ ID NO:3所示氨基酸序列组成的序列、或由SEQ ID NO:3所示氨基酸序列组成的序列。SEQ ID NO:3的序列为：PNREMKNQGSKKTLGSTRRGIDNGRKLRLGRQF。
在一些实施例中，重组蛋白的氨基酸序列选自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17中的至少一种。
SEQ ID NO:4的序列为：
Figure PCTCN2022144377-appb-000009
Figure PCTCN2022144377-appb-000010
(加粗下划线为嵌合序列SEQ ID NO:3)
SEQ ID NO:15的序列为：
Figure PCTCN2022144377-appb-000011
Figure PCTCN2022144377-appb-000012
Figure PCTCN2022144377-appb-000013
(加粗下划线为嵌合序列SEQ ID NO:3)
SEQ ID NO:16的序列为：
Figure PCTCN2022144377-appb-000014
Figure PCTCN2022144377-appb-000015
(加粗下划线为嵌合序列SEQ ID NO:3)
SEQ ID NO:17的序列为：
Figure PCTCN2022144377-appb-000016
Figure PCTCN2022144377-appb-000017
(加粗下划线为嵌合序列SEQ ID NO:3)
在一些实施例中，重组蛋白还包含额外的保守突变、添加和缺失中的任一种。
在一些实施例中，重组蛋白作为嵌合型DNA聚合酶的持续合成能力高于野生型的所述A家族DNA聚合酶。
根据本发明的又一个方面，本发明提供了一种核酸，该核酸编码如第一方面任一实施 方案所述的重组蛋白。
在一些实施例中，该核酸分子的核苷酸序列选自SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20中的至少一种。
SEQ ID NO:5的序列为：
Figure PCTCN2022144377-appb-000018
Figure PCTCN2022144377-appb-000019
SEQ ID NO:18的序列为：
Figure PCTCN2022144377-appb-000020
Figure PCTCN2022144377-appb-000021
SEQ ID NO:19的序列为：
Figure PCTCN2022144377-appb-000022
Figure PCTCN2022144377-appb-000023
SEQ ID NO:20的序列为：
Figure PCTCN2022144377-appb-000024
Figure PCTCN2022144377-appb-000025
根据本发明的又一个方面，本发明的实施方案提供了一种载体，该载体包含如第二方面任一实施方案所述的核酸。
根据本发明的又一个方面，本发明的实施方案提供了一种试剂盒，包含如第一方面任一实施方案所述的重组蛋白、第二方面任一实施方案所述的核酸、或第三方面任一实施方案所述的载体。
根据本发明的又一个方面，本发明的实施方案提供了一种制备第一方面任一实施方案所述的重组蛋白的方法，该方法包括：用在扩增反应中能够加强DNA聚合酶与目的DNA相互作用的氨基酸序列替换野生型的A家族DNA聚合酶中的同源序列获得的氨基酸序列，以获得所述重组蛋白。
在一些实施例中，所述方法包括：对来自所述野生型A家族DNA聚合酶的多个氨基酸序列进行序列比对，以确定嵌合序列；和用所述嵌合序列替换所述野生型A家族DNA聚合酶序列中的同源序列，以获得候选重组蛋白序列。
在一些实施例中，所述方法还包括：对所述候选重组蛋白序列进行计算机模拟分析，以确定重组蛋白序列，其中所示重组蛋白序列表现出减小的拇指结构域与手指结构域之间的空间构型。
在一些实施例中，对所述候选重组蛋白序列进行计算机模拟分析，以获得重组蛋白序列，包括：对所述候选重组蛋白序列进行结构预测，以获得重组蛋白的三级结构；对所述重组蛋白的三级结构进行模拟，以获得所述重组蛋白的分子对接结构；对所述分子对接结构进行基于配体的结构优化，以获得优化的重组蛋白结构；和对所述优化的重组蛋白结构进行动力学模拟，以确定重组蛋白序列。
在一些实施例中，所述方法还包括表达并纯化所述重组蛋白序列。
在一些具体实施例中，该方法具体包括：通过A家族聚合酶的序列数据库搜寻和同源序列对比，以确定候选嵌合序列用于替换野生型聚合酶中的同源序列；利用Alphafold、Autodock和Gromacs等工具对根据本发明实施例的具有嵌合序列的重组蛋白进行(1)结 构预测、(2)DNA双链与重组蛋白的分子对接模拟和(3)动力学模拟分析；利用原核表达系统对模拟分析确定的重组蛋白进行表达和纯化，并测定其活性；并且上机测序确认蛋白序列。
可以理解的是，该方法中的序列比对包括全局比对、局部比对、双重序列比对、多重序列比对等多种比对策略。
可以理解的是，A家族DNA聚合酶的结构较为保守相似，通过所述制备重组蛋白的方法，能够应用于多种A家族DNA聚合酶的同源序列替换，并制备所述重组蛋白。
在本发明的实施例中，术语“分子对接”是指通过计算机模拟将小分子(配体)放置于大分子靶标(受体)的结合区域，使其通过调整物理化学参数计算配体与受体的结合力和结合方式，能够获得二者在其活性区域相结合时能量最低的构象。在本发明中，分子对接的配体与受体分别为嵌合聚合酶以及DNA。模拟分子和蛋白质在原子水平上的相互作用，有助于发现对嵌合聚合酶进行进一步改造的策略。
在本发明的实施例中，术语“动力学模拟”是指用牛顿经典力学计算分子在空间中的轨迹，求解系统中的分子或原子间作用势能和系统外加约束共同作用的分子或原子的牛顿方程，模拟系统随时间推进的微观过程。蛋白质和配体的柔性使它们在相互结合时会寻求最吻合、能量最低的构象。通常情况下，对接完成后，通过打分函数得到的配体蛋白复合物准确度不是很高时，需要借助动力学模拟来计算结合能，验证蛋白与筛选出的小分子配体的有效结合情况。
在一些实施例中，所述A家族DNA聚合酶选自由大肠杆菌DNA聚合酶I、T3 DNA聚合酶、T5 DNA聚合酶、T7 DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、Bsu DNA聚合酶和Bst DNA聚合酶组成的组。
在一些实施例中，所述A家族DNA聚合酶选自具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的Bst DNA聚合酶、具有SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列的Taq DNA聚合酶、具有SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的大肠杆菌DNA聚合酶和具有SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的Bsu DNA聚合酶中的至少一种。
在一些实施例中，所述A家族DNA聚合酶中的同源序列来源于其拇指结构域。
在一些实施例中，所述A家族DNA聚合酶中的同源序列选自以下中的至少一种：
如SEQ ID NO:2所示的Bst DNA聚合酶中的第546位至第554位氨基酸序列；
如SEQ ID NO:12所示的Taq DNA聚合酶中的第199位至第209位氨基酸序列；
如SEQ ID NO:13所示的大肠杆菌DNA聚合酶中的第276位至第285位氨基酸序列；或
如SEQ ID NO:14所示的大肠杆菌Bsu聚合酶中的第249位至第257位氨基酸序列。
在一些实施例中，所述A家族DNA聚合酶中的同源序列被替换为包含SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的序列、基本上由SEQ ID NO:3所示氨基酸序列组成的序列、或由SEQ ID NO:3所示氨基酸序列组成的序列。
在一些实施例中，所述重组蛋白的氨基酸序列选自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17中的至少一种。
根据本发明的又一个方面，本发明的实施方案提供了一种扩增目的DNA的方法，使用前述第一方面任一实施方案所述的重组蛋白对目的DNA进行扩增。
在一些实施例中，所述扩增是等温扩增，所述等温扩增选自滚环扩增RCA、多重置换扩增MDA、重组酶聚合酶扩增反应RPA、链置换扩增SDA、环介导等温扩增LAMP。
在一些实施例中，所述扩增用于构建DNA文库或测序。
实施例
实施例1
本实施例基于A家族DNA聚合酶中Bst聚合酶、Taq DNA聚合酶、大肠杆菌DNA聚合酶和Bsu DNA聚合酶的序列，进行数据库搜寻和MSA同源序列对比，以确定候选嵌合序列用于替换野生型聚合酶中的同源序列；利用Alphafold、Autodock和Gromacs等工具对本发明实施例中的具有嵌合序列的重组蛋白进行结构预测，DNA双链与重组蛋白的分子对接和动力学模拟分析等计算模拟。
1.1确定嵌合序列
利用Protein-blast工具在NCBI蛋白质序列库中比对A家族聚合酶的同源序列，确定出了嵌合序列(SEQ ID NO:3)与Bst DNA聚合酶拇指结构域中氨基酸第546-554位(SEQ ID NO:2)、Taq DNA聚合酶大片段拇指结构域中氨基酸第199-209位(SEQ ID NO:12)、大肠杆菌DNA聚合酶大片段拇指结构域中氨基酸第276-285位(SEQ ID NO:13)和Bsu DNA聚合酶大片段拇指结构域中氨基酸第249-257位(SEQ ID NO:14)同源，比对结果如图2所示。该嵌合序列来自人类DNA聚合θ(Human pol theta，POLθ)，并且SEQ ID NO:3比SEQ ID NO:2长约24个氨基酸、比SEQ ID NO:12长约XX个氨基酸、比SEQ ID NO:13长约XX个氨基酸、比SEQ ID NO:14长约XX个氨基酸。
1.2用嵌合序列替换野生型A家族DNA聚合酶中的同源序列
1.2.1根据上述同源序列比对，将野生型Bst DNA聚合酶大片段(Bst-LF WT)中的同源序列SEQ ID NO:2替换为嵌合序列SEQ ID NO:3，从而得到嵌合型Bst DNA聚合酶，具有SEQ ID NO:4所述的序列。
野生型Bst DNA聚合酶大片段(Bst-LF WT)的序列SEQ ID NO:1：
>Bst-LF WT[Geobacillus stearothermophilus]氨基酸序列(293-831)
Figure PCTCN2022144377-appb-000026
(加粗下划线为同源序列SEQ ID NO:2)
嵌合型Bst DNA聚合酶(Bst-HS-1)的氨基酸序列(SEQ ID NO:4)：
Figure PCTCN2022144377-appb-000027
Figure PCTCN2022144377-appb-000028
(加粗下划线为嵌合序列SEQ ID NO:3)
1.2.2根据上述同源序列比对，将野生型Taq DNA聚合酶大片段(Taq-LF WT)中的同源序列SEQ ID NO:12替换为嵌合序列SEQ ID NO:3，从而得到嵌合型Taq DNA聚合酶，具有SEQ ID NO:15所述的序列。
野生型Taq DNA聚合酶大片段(Taq-LF WT)的序列SEQ ID NO:9：
>Taq-LF WT[Thermus aquaticus]氨基酸序列(1-529)
Figure PCTCN2022144377-appb-000029
Figure PCTCN2022144377-appb-000030
Figure PCTCN2022144377-appb-000031
(加粗下划线为同源序列SEQ ID NO:12)
嵌合型Taq DNA聚合酶(Taq-HS-1)的氨基酸序列(SEQ ID NO:15)：
Figure PCTCN2022144377-appb-000032
Figure PCTCN2022144377-appb-000033
(加粗下划线为嵌合序列SEQ ID NO:3)
1.2.3根据上述同源序列比对，将野生型大肠杆菌DNA聚合酶大片段(Ecoli-LF WT)中的同源序列SEQ ID NO:13替换为嵌合序列SEQ ID NO:3，从而得到嵌合型大肠杆菌DNA聚合酶，具有SEQ ID NO:16所述的序列。
野生型大肠杆菌DNA聚合酶大片段(Ecoli-LF WT)的序列SEQ ID NO:10：
>Ecoli-LF WT[Escherichia coli]氨基酸序列(1-606)
Figure PCTCN2022144377-appb-000034
Figure PCTCN2022144377-appb-000035
Figure PCTCN2022144377-appb-000036
(加粗下划线为同源序列SEQ ID NO:13)
嵌合型大肠杆菌DNA聚合酶(Ecoli-HS-1)的氨基酸序列(SEQ ID NO:16)：
Figure PCTCN2022144377-appb-000037
Figure PCTCN2022144377-appb-000038
(加粗下划线为嵌合序列SEQ ID NO:3)
1.2.4根据上述同源序列比对，将野生型Bsu DNA聚合酶大片段(Bsu-LF WT)中的同源序列SEQ ID NO:14替换为嵌合序列SEQ ID NO:3，从而得到嵌合型Bsu DNA聚合酶，具有SEQ ID NO:17所述的序列。
野生型Bsu DNA聚合酶大片段(Bsu-LF WT)的序列SEQ ID NO:11：
>Bsu-LF WT[Bacillus subtilis]氨基酸序列(1-603)
Figure PCTCN2022144377-appb-000039
Figure PCTCN2022144377-appb-000040
(加粗下划线为同源序列SEQ ID NO:14)
嵌合型Bsu DNA聚合酶(Bsu-HS-1)的氨基酸序列(SEQ ID NO:17)：
Figure PCTCN2022144377-appb-000041
Figure PCTCN2022144377-appb-000042
(加粗下划线为嵌合序列SEQ ID NO:3)
1.3结构预测
利用Alphafold2对嵌合型A家族DNA聚合酶Bst-HS-1、Taq-HS-1、Ecoli-HS-1和Bsu-HS-1的序列进行重组蛋白三级结构预测。
1.4分子对接模拟
基于所预测的结构，利用Autodock工具在dNTP的存在下对DNA双链与嵌合型A家族DNA聚合酶Bst-HS-1、Taq-HS-1、Ecoli-HS-1和Bsu-HS-1的进行分子对接模拟，确认改造后具有延长的拇指结构域的嵌合型DNA聚合酶与目的DNA的结合强度。如图3所示，分子对接模拟显示了嵌合序列不仅缩小了拇指结构域与手指结构域之间的空间，从而使模板链保持在拇指结构域和手指结构域之间，而且能够与新合成的双链DNA持续保持紧密结合，从而稳定了聚合酶-DNA结构。
1.5配体结构优化
用Gromacs工具对接后的嵌合型A家族DNA聚合酶Bst-HS-1、Taq-HS-1、Ecoli-HS-1和Bsu-HS-1的与DNA分子的复合物利进行配体结构优化。
1.6动力学模拟
将经过优化的结构进行25ns动力学模拟，模拟温度为330K。如图4所示，嵌合型Bst DNA聚合酶中手指结构域中的第515至517位氨基酸序列NFN与拇指结构域中的K268可持续保持在4-6埃的距离，使DNA模板链能被夹在二者形成的口袋结构中，同时延长的区域也能和新合成的双链DNA持续保持紧密结合。
此外，实验结构表明，还可以对嵌合序列中的数个位点进行额外突变，以加强嵌合体的热稳定性及聚合活性，并能进一步提高嵌合型聚合酶对DNA双链的亲和力及持续合成能力。
对于所有A家族聚合酶，如Bst、Taq、Ecoli、BSU等，都可以在相应的拇指区域插入该嵌合片段，即可起到与Bst上改造结构类似作用，加强与DNA双链的亲和力及持续合成能力。
下列数据为4种A家族聚合酶与其嵌合突变体和DNA双链结合能模拟计算的对比，可见所有聚合酶在加入嵌合片段后都能加强与DNA双链的亲和力：
1.Bst-LF WT：-164.2kJ/mol
Bst-HS-1：-272.0kJ/mol
ΔΔG＝-107.8kJ/mol
2.Taq-LF WT：-150.2kJ/mol
Taq-HS-1：-277.6kJ/mol
ΔΔG＝-127.4kJ/mol
3.Ecoli-LF WT：-186.3kJ/mol
Ecoli-HS-1：-327.9kJ/mol
ΔΔG＝-141.6kJ/mol
4.BSU-LF WT：-178.4kJ/mol
BSU-HS-1：-283.3kJ/mol
ΔΔG＝-104.9kJ/mol
实施例2
本实施例基于合理设计的嵌合型聚合酶Bst-HS-1，利用原核表达系统对其进行蛋白的表达和纯化，以获得用于实际应用的Bst-HS嵌合型DNA聚合酶。
2.1制备嵌合型DNA聚合酶质粒
针对实施例1确定的嵌合型DNA聚合酶序列(即SEQ ID NO:4)设计用于引入嵌入序列(SEQ ID NO:3)的上游引物和下游引物，以包含编码野生型Bst DNA聚合酶(SEQ ID NO:1)的核酸序列(SEQ ID NO:6)质粒为模板，使用诺唯赞点突变试剂盒(C112-01) 进行点突变PCR，以获得编码DNA聚合酶序列(即SEQ ID NO:4)的核酸序列(SEQ ID NO:5)。
编码野生型Bst DNA聚合酶的核酸序列(SEQ ID NO:6)的序列为：
Figure PCTCN2022144377-appb-000043
Figure PCTCN2022144377-appb-000044
2.1.1按照如表1所示的PCR反应体系和如表2所示的PCR反应条件进行上述点突变PCR，以获得包含扩增产物的反应溶液。
表1 PCR反应体系
Figure PCTCN2022144377-appb-000045
上游引物(SEQ ID NO:7)：TACTTTCAGGGCGCCGAGGGTGAAAAACCTCTG
下游引物(SEQ ID NO:8)：GGGTTAACCTTATTTAGCATCATACCAGGTCGGG
表2 PCR反应条件
Figure PCTCN2022144377-appb-000046
2.1.2向体积为20μl的包含扩增产物的反应溶液添加0.4μl dpn1酶，在37℃的温度对扩增产物消化3小时，以获得包含消化产物的溶液。
2.1.3取体积为5μl的包含消化产物的溶液对100μl感受态细胞进行转化，并将转化后的感受态细胞涂板于固体LB培养基，在4℃过夜孵育。
2.1.4挑取单克隆菌落，在37℃对其摇菌后送样测序，以获得测序结果。
2.1.5将测序结果进行比对，以确定含有正确突变的质粒。
2.2 Bst-HS嵌合型突变体的诱导表达
2.2.1利用Bst-HS嵌合突变体质粒对BL21感受态细胞进行转化，以获得转化有 Bst-HS嵌合突变体的细胞。
2.2.2向50ml离心管加入转化有Bst-HS嵌合突变体的细胞和20mL新鲜培养基，并在37℃的温度以220rpm振摇培养过夜，以获得第一菌液。
2.2.3将20ml第一菌液转移到含1L培养基的5L锥形瓶中，在37℃以220rpm振摇培养，直到OD值为0.8-1获得第二菌液。
2.2.4向第二菌液加入IPTG诱导剂达到IPTG的终浓度为0.2mM，并在16℃的温度进行孵育，持续16小时，以获得第三菌液，该第三菌液包含表达Bst-HS嵌合突变体的菌体。
2.2.5将第三菌液以12000rpm离心10min，收集作为沉淀物的菌体。
2.3 Bst-HS嵌合突变体蛋白纯化
2.3.1将沉淀物混悬于40ml A溶液，并在700bar的压力下以高压破碎机对菌体进行破碎，持续5分钟，以获得第四菌液。
A溶液(pH7.4)
Figure PCTCN2022144377-appb-000047
2.3.2在60℃温度的水浴中对第四菌液进行热处理，持续15分钟，以获得终溶液。将终溶液以13000rpm离心30分钟，然后用0.22μm滤膜对上清液进行过滤并收集滤液。
2.3.3将滤液加载到镍柱上进行纯化，其中用50％B溶液进行洗脱，以获得目的蛋白。
B溶液(pH7.4)
Figure PCTCN2022144377-appb-000048
2.3.4通过透析的方式，将包含目的蛋白的B溶液置换为透析液，以获得纯化后的目的蛋白。
透析液(pH7.6)
Figure PCTCN2022144377-appb-000049
2.3.5将纯化后的目的蛋白分装储存，以用于后续的活性测定。
实施例3
本实施例中，对纯化后的嵌合型DNA聚合酶Bst-HS与野生型DNA聚合酶大片段Bst-LF-WT进行聚合活性测试，对比二者的持续合成能力。具有His6标签的野生型Bst DNA聚合酶溶液及实施例2制备的具有His6标签的嵌合型DNA聚合酶Bst DNA溶液为待测酶溶液。
3.1嵌合型DNA聚合酶在RCA扩增中的合成能力
3.1.1制备文库
将40μl的初始单链环状DNA(自合成Ecoli V3单链环状文库，1.82ng/μl)与1.06μl的文库互补引物(5μM)以1:1的摩尔比混合，并按照表2所述的条件进行退火，以获得文库+引物的混合物(浓度约为1.77ng/μl，)。
3.1.2 RCA反应
将文库+引物的混合物配制在如下表3的RCA反应体系中，并在65℃的温度孵育1小时。使用0.1μl的0.5M EDTA终止扩增反应，以获得RCA反应产物。
表3 RCA反应体系
Figure PCTCN2022144377-appb-000050
3.1.3 RCA产物浓度检测
使用qubit ssDNA检测试剂盒，按说明书操作，使用Qubit fluorometor 3.0检测RCA反应产物浓度。结果如下：
Bst-LF-WT:33.6ng/uL
Bst-HS-1:39.9ng/uL
由此可见，在RCA等温扩增中，重组蛋白(即嵌合型A家族DNA聚合酶)的合成能力高于野生型A家族DNA聚合酶。
3.2嵌合型DNA聚合酶在MDA扩增中的合成能力
3.2.1 DNB的制备
3.2.1.1将单链环状DNA(自合成Ecoli V3单链环状文库，浓度为c)与DNB制备缓冲液、和TE缓冲液混合在PCR管中，并将PCR管置于冰盒上约0.5小时。使用漩涡振荡器对PCR管震荡5秒以使混合物混合均匀，短暂离心并置于冰上备用。将PCR管置于PCR仪中进行如下程序：95℃持续1min，65℃持续1min，40℃持续1min，热盖温度为102℃，4℃保持。
Figure PCTCN2022144377-appb-000051
3.2.1.2反应后，将PCR管置转移至冰上，并向PCR管中加入如下表所示体积的DNB聚合酶混合液Ⅰ和DNB聚合酶混合液Ⅱ。将PCR管再次置于PCR仪中，进行如下程序：30℃持续30分钟，热盖温度35℃，4℃保持。
Figure PCTCN2022144377-appb-000052
3.2.1.3向PCR管加入1微升DNB终止缓冲液，震荡混匀以获得DNB。
3.2.2 MDA反应
3.2.2.1取3.2.1制备的DNB，按下述反应体系在PCR管中混匀，进行如下程序：95℃ 持续1分钟，65℃持续1分钟，40℃持续1分钟，热盖温度为102℃，4℃保持。
Figure PCTCN2022144377-appb-000053
3.2.2.2反应后，将PCR管转移至冰上，并向PCR管中加入下表所示成分。混匀后，将PCR管再次置于PCR仪中，进行如下程序：65℃持续30分钟；热盖温度70℃，4℃保持。
Figure PCTCN2022144377-appb-000054
3.2.3MDA产物浓度检测
采用Qubit dsDNA Assay Kit按说明书操作，使用Qubit fluorometor 3.0检测MDA产物浓度。
检测结果如下：
Bst-LF-WT:29.6ng/uL
Bst-HS-1:34.8ng/uL
由此可见，在MDA等温扩增中，重组蛋白(即嵌合型A家族DNA聚合酶)的合成能力高于野生型A家族DNA聚合酶。
在本发明中，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。
在本发明中，术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示 例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Figure PCTCN2022144377-appb-000055
Figure PCTCN2022144377-appb-000056
Figure PCTCN2022144377-appb-000057
Figure PCTCN2022144377-appb-000058
Figure PCTCN2022144377-appb-000059
Figure PCTCN2022144377-appb-000060
Figure PCTCN2022144377-appb-000061
Figure PCTCN2022144377-appb-000062
Figure PCTCN2022144377-appb-000063

Claims (27)

  1. 一种重组蛋白，其特征在于，所述重组蛋白的氨基酸序列是用在扩增反应中能够加强DNA聚合酶与目的DNA相互作用的氨基酸序列替换野生型的A家族DNA聚合酶中的同源序列获得的氨基酸序列。
  2. 根据权利要求1所述的重组蛋白，其特征在于，所述A家族DNA聚合酶选自由大肠杆菌DNA聚合酶I、T3 DNA聚合酶、T5 DNA聚合酶、T7 DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、Bsu DNA聚合酶和Bst DNA聚合酶组成的组。
  3. 根据权利要求1或2所述的重组蛋白，其特征在于，所述A家族DNA聚合酶选自具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的Bst DNA聚合酶、具有SEQ ID NO:9所示氨基酸序列的Taq DNA聚合酶、具有SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的大肠杆菌DNA聚合酶和具有SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的Bsu DNA聚合酶中的至少一种。
  4. 根据权利要求1至3中任一项所述的重组蛋白，其特征在于，所述A家族DNA聚合酶中的同源序列来源于其拇指结构域。
  5. 根据权利要求1至4中任一项所述的重组蛋白，其特征在于，所述A家族DNA聚合酶中的同源序列选自以下中的至少一种：
    如SEQ ID NO:2所示的Bst DNA聚合酶中的第546位至第554位氨基酸序列；
    如SEQ ID NO:12所示的Taq DNA聚合酶中的第199位至第209位氨基酸序列；
    如SEQ ID NO:13所示的大肠杆菌DNA聚合酶中的第276位至第285位氨基酸序列；或
    如SEQ ID NO:14所示的大肠杆菌Bsu聚合酶中的第249位至第257位氨基酸序列。
  6. 根据权利要求1至5中任一项所述的重组蛋白，其特征在于，所述A家族DNA聚合酶中的同源序列被替换为包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的序列、基本上由SEQ ID NO:3所示氨基酸序列组成的序列、或由SEQ ID NO:3所示氨基酸序列组成的序列。
  7. 根据权利要求1至6中任一项所述的重组蛋白，其特征在于，所述重组蛋白的氨基酸序列选自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17中的至少一种。
  8. 根据权利要求1至7中任一项所述的重组蛋白，其特征在于，所述重组蛋白还包含额外的保守突变、添加和缺失中的任一种。
  9. 根据权利要求1至8中任一项所述的重组蛋白，其特征在于，所述重组蛋白作为嵌合型DNA聚合酶的持续合成能力高于野生型的所述A家族DNA聚合酶。
  10. 一种核酸，其特征在于，所述核酸编码如权利要求1至9中任一项所述的重组蛋 白。
  11. 根据权利要求10所述的核酸，其特征在于，所述核酸分子的核苷酸序列选自SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20中的至少一种。
  12. 一种载体，其特征在于，所述载体包含如权利要求11所述的核酸。
  13. 一种试剂盒，包含如权利要求1至9中任一项所述的重组蛋白、如权利要求10或11所述的核酸、或如权利要求12所述的载体。
  14. 一种制备权利要求1至9中任一项所述的重组蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括：用在扩增反应中能够加强DNA聚合酶与目的DNA相互作用的氨基酸序列替换野生型的A家族DNA聚合酶中的同源序列获得的氨基酸序列，以获得所述重组蛋白。
  15. 根据权利要求14所述的制备重组蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括：
    对来自所述野生型A家族DNA聚合酶的多个氨基酸序列进行序列比对，以确定嵌合序列；和
    用所述嵌合序列替换所述野生型A家族DNA聚合酶序列中的同源序列，以获得候选重组蛋白序列。
  16. 根据权利要求15所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：
    对所述候选重组蛋白序列进行计算机模拟分析，以确定重组蛋白序列，
    其中所示重组蛋白序列表现出减小的拇指结构域与手指结构域之间的空间构型。
  17. 根据权利要求16所述的方法，其特征在于，对所述候选重组蛋白序列进行计算机模拟分析，以获得重组蛋白序列，包括：
    对所述候选重组蛋白序列进行结构预测，以获得重组蛋白的三级结构；
    对所述重组蛋白的三级结构进行模拟，以获得所述重组蛋白的分子对接结构；
    对所述分子对接结构进行基于配体的结构优化，以获得优化的重组蛋白结构；和
    对所述优化的重组蛋白结构进行动力学模拟，以确定重组蛋白序列。
  18. 根据权利要求16或17所示的方法，其特征在于，还包括：表达并纯化所述重组蛋白序列。
  19. 根据权利要求14至18中任一项所述的方法，其特征在于，所述A家族DNA聚合酶选自由大肠杆菌DNA聚合酶I、T3 DNA聚合酶、T5 DNA聚合酶、T7 DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、Bsu DNA聚合酶和Bst DNA聚合酶组成的组。
  20. 根据权利要求14至19中任一项所述的方法，其特征在于，所述A家族DNA聚合酶选自具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的Bst DNA聚合酶、具有SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列的Taq DNA聚合酶、具有SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的大肠杆菌DNA聚合酶和具有SEQ ID NO:11所示氨基酸序列的Bsu DNA聚合酶中的至少一种。
  21. 根据权利要求14至20中任一项所述的方法，其特征在于，所述A家族DNA聚合酶中的同源序列来源于其拇指结构域。
  22. 根据权利要求14至21中任一项所述的方法，其特征在于，所述A家族DNA聚合酶中的同源序列选自以下中的至少一种：
    如SEQ ID NO:2所示的Bst DNA聚合酶中的第546位至第554位氨基酸序列；
    如SEQ ID NO:12所示的Taq DNA聚合酶中的第199位至第209位氨基酸序列；
    如SEQ ID NO:13所示的大肠杆菌DNA聚合酶中的第276位至第285位氨基酸序列；或
    如SEQ ID NO:14所示的大肠杆菌Bsu聚合酶中的第249位至第257位氨基酸序列。
  23. 根据权利要求14至22中任一项所述的方法，其特征在于，所述A家族DNA聚合酶中的同源序列被替换为包含SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的序列、基本上由SEQ ID NO:3所示氨基酸序列组成的序列、或由SEQ ID NO:3所示氨基酸序列组成的序列。
  24. 根据权利要求14至23中任一项所述的方法，其特征在于，所述重组蛋白的氨基酸序列选自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17中的至少一种。
  25. 一种扩增目的DNA的方法，其特征在于，使用权利要求1至9中任一项所述的重组蛋白对所述目的DNA进行扩增。
  26. 根据权利要求25所述的方法，其特征在于，所述扩增是等温扩增，所述等温扩增选自滚环扩增RCA、多重置换扩增MDA、重组酶聚合酶扩增反应RPA、链置换扩增SDA或环介导等温扩增LAMP。
  27. 根据权利要求25或26所述的方法，其特征在于，所述扩增用于构建DNA文库或测序。
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