WO2024138570A1 - 生物纳米孔传感器、其制备方法及应用 - Google Patents

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郭斐
黎宇翔
章文蔚
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/416—Systems
    • G01N27/49—Systems involving the determination of the current at a single specific value, or small range of values, of applied voltage for producing selective measurement of one or more particular ionic species

Definitions

  • Protein is the material basis of life activities. Proteins with different sequences and structures determine different functions of proteins in life activities. Changing the sequence and structure of proteins may change cell signaling pathways and material metabolism pathways, thereby inducing various diseases. Therefore, it is necessary to develop a simple and reliable method to detect proteins or achieve protein sequencing.
  • the method further comprises washing with a buffer solution to remove the residual free hydrophilic protein.
  • a sequencing method which comprises using the biological nanopore sensor prepared by the above-mentioned method, or the above-mentioned biological nanopore sensor, or the above-mentioned nanopore sequencing device, to detect and analyze the electrical signal generated when the biological molecule to be tested passes through the nanopore of the hydrophilic protein, so as to determine the sequence of the biological molecule to be tested.
  • the hydrophilic protein includes MCM protein; preferably, the biomolecule to be detected includes modified or unmodified DNA, RNA, or polypeptide; preferably, the polypeptide includes polypeptide monomers or polypeptide polymers; preferably, the electrical signal includes current amplitude and/or residence time.
  • hydrophilic proteins such as MCM proteins
  • the hydrophilic proteins are successfully inserted into the membrane layer to prepare a biological nanopore sensor, which can achieve operations such as sequencing and identification of biological samples like other nanopore sensors in the prior art.
  • FIG. 1 shows a schematic structural diagram of a nanopore sensor embedded with MCM protein according to Example 3 of the present invention.
  • FIG. 4 shows the current changes generated when a single MCM protein according to Example 3 of the present invention is embedded in a phospholipid bilayer.
  • a method for preparing a biological nanopore sensor comprising: a) preparing a hydrophilic protein into a liposome; b) mixing the liposome with a membrane layer to cause the liposome to insert into the membrane layer to obtain a biological nanopore sensor; the hydrophilic protein has nanopores.
  • MCM protein The minichromosome maintenance (MCM) protein family is encoded by the MCM gene and is widely present from Archaean organisms to higher eukaryotes. It is a protein family with highly conserved sequences. MCM protein is a hydrophilic hexameric complex with a ring structure composed of 6 subunits (i.e., MCM protein monomers). It has helicase activity and plays an important role in the initiation and extension of DNA replication. It contains nanometer-scale pores in the middle. MCM protein has a high expression level in the Escherichia coli recombinant protein expression system, and its hexameric structural characteristics give it the advantage of developing into a biological nanopore. However, since this protein is not a natural membrane protein, its outer side has low hydrophobicity and cannot be directly inserted into phospholipids.
  • hydrophilic proteins such as MCM proteins are firstly encapsulated by lipophilic materials such as phospholipids to prepare MCM liposomes, and then the MCM liposomes are mixed with the membrane layer, so that the MCM liposomes, i.e., the MCM proteins, are inserted into and penetrate the membrane layer, thereby obtaining a biological nanopore sensor with a pore connecting both sides.
  • the more mature nanopore sequencing technology is the chain sequencing method, which is commercialized by Oxford Nanopore Technologies (ONT) in the UK.
  • the core principle of the ONT chain sequencing method is that the helicase unwinds the double-stranded DNA into single-stranded DNA and controls the single-stranded DNA to pass through the nanopore protein (the helicase and the porin are two independent proteins).
  • the new biological nanopore sensor constructed in the present invention is different from the technology of ONT: the MCM protein is reported in the literature to be a helicase with unwinding activity and contains a pore; the MCM protein used in the present invention realizes the role of both the porin and the helicase, combining the functions of the two independent proteins of the chain sequencing method into one.
  • the biological nanopore sensor prepared by the above method can be used for DNA sequencing.
  • the enzyme activity detection experiment proves that the biological nanopore sensor constructed by the present invention has unwinding activity, and the conductance and analyte permeation prove the formation of pores in the sensor.
  • the above two key results prove that this biological nanopore sensor has the potential for DNA sequencing.
  • the MCM protein includes a protein formed by covalently or non-covalently linking two or more MCM protein monomers; preferably, the MCM protein monomers include: 1) a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1; 2) a protein mutant, wherein the amino acid sequence of the protein mutant is substituted, deleted and/or one or more amino acids are added at least one of the following positions of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1: 318, 331, 346, 359, 366, 374, 404, 423, 424 , 430, 448, 473, 488, and the protein mutants have the same protein binding and DNA functions, and have the function of forming nanopores; 3) a pore protein monomer that is at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, or at least 99% identical to the protein in 1) or 2), and has the same protein binding and DNA functions, and has the function of forming nanopores
  • the MCM protein comprises a protein formed by non-covalently linking 6 MCM protein monomers.
  • the biological nanopore sensor in this application specifically refers to a detector composed of a nanopore protein inserted into a membrane layer.
  • an MCM protein with a pore is inserted into the membrane layer, and the pore of the MCM protein runs through the membrane layer, connecting the two sides of the membrane layer through the pore.
  • an electric field force is applied, ions on both sides of the membrane migrate through the nanopore channel, thereby generating current.
  • Figure 1 The schematic diagram of the biological nanopore sensor based on the MCM protein is shown in Figure 1.
  • the MCM protein monomer shown in SEQ ID NO: 1 has high temperature resistance and is modified from the wild-type protein Sso MCM shown in SEQ ID NO: 3 from the thermophilic archaeon Saccharolobus solfataricus.
  • Identity in this specification refers to the "identity" between amino acid sequences or nucleic acid sequences, that is, the total ratio of the same type of amino acid residues or nucleotides in the amino acid sequence or nucleic acid sequence.
  • the identity of amino acid sequences or nucleic acid sequences can be determined using alignment programs such as BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) and FASTA.
  • amino acid residues are abbreviated as follows: alanine (Ala; A), asparagine (Asn; N), aspartic acid (Asp; D), arginine (Arg; R), cysteine (Cys; C), glutamic acid (Glu; E), glutamine (Gln; Q), glycine (Gly; G), histidine (His; H), isoleucine (Ile; I), leucine (Leu; L), lysine (Lys; K), methionine (Met; M), phenylalanine (Phe; F), proline (Pro; P), serine (Ser; S), threonine (Thr; T), tryptophan (Trp; W), tyrosine (Tyr; Y) and valine (Val; V).
  • conservative amino acid replacements include but are not limited to:
  • Hydrophobic amino acids (Ala, Cys, Gly, Pro, Met, Val, Ile, Leu) are replaced by other hydrophobic amino acids;
  • hydrophobic amino acids with bulky side chains (Phe, Tyr, Trp) are replaced by other hydrophobic amino acids with bulky side chains;
  • Amino acids with polar, uncharged side chains (Ser, Thr, Asn, Gln) are replaced by other amino acids with polar, uncharged side chains.
  • a) comprises: placing an organic solution containing phospholipids in a container to form a lipid film on the container wall; adding a solution containing hydrophilic proteins to the container and shaking to hydrate the lipid film; extruding and filtering the solution after the hydration of the lipid film to obtain liposomes;
  • the phospholipids include diphytylphosphatidylcholine, more preferably 1,2-diphytanoyl-sn-glyceryl-3-phosphocholine;
  • filtering includes filtering using a polycarbonate membrane, more preferably the diameter of the polycarbonate membrane is 0.1-1 ⁇ m, more preferably 0.4 ⁇ m.
  • the hydrophilic proteins such as MCM protein can be prepared into MCM liposomes by using the above method or the method for preparing liposomes in the prior art.
  • the oscillation includes but is not limited to ultrasonic oscillation and vortex oscillation.
  • the above phospholipids and porins are inserted into the phospholipid membrane in a consistent manner, which helps to maintain the stability of the system.
  • the liposomes prepared above are mixed with the membrane layer in a solution, a voltage is applied in the solution. Under the action of the voltage, the liposomes can be inserted into the membrane layer, and the current in the solution is monitored in real time.
  • the applied voltage is reduced to prevent other hydrophilic proteins from continuing to insert into the membrane layer, thereby obtaining a biological nanopore sensor with a single hydrophilic protein embedded.
  • the embedding or insertion of proteins refers to the situation in which proteins penetrate the membrane layer in the cell flow mosaic theory; in particular, it refers to proteins with pores penetrating the membrane layer, and the pores connect the two sides of the membrane layer; rather than proteins embedded in the surface of the membrane layer.
  • the method further comprises washing with a buffer solution to remove residual free hydrophilic proteins.
  • the nanopore sensor is rinsed after being obtained to remove free hydrophilic proteins.
  • the membrane layer comprises a lipid layer or an artificial polymer membrane; preferably, the lipid layer comprises amphiphilic lipids; preferably, the amphiphilic lipids comprise a phospholipid bilayer; preferably, the lipid layer comprises a planar membrane layer or a liposome; preferably, the liposome comprises a multilayer liposome or a unilamellar liposome; preferably, the lipid layer comprises a phospholipid bilayer composed of diphytylphosphatidylcholine, more preferably a phospholipid bilayer composed of 1,2-diphytanoyl-sn-glyceryl-3-phosphocholine.
  • Artificial polymer membranes include, but are not limited to, polysiloxanes, polyolefins, perfluoropolyethers, perfluoroalkyl polyethers, polystyrenes, polyoxypropylenes, polyvinyl acetates, polyoxybutylenes, polyisoprene, polybutadiene, polyvinyl chlorides, polyalkyl acrylates, polyalkyl methacrylates, polyacrylonitrile, polypropylene, PTHF, polymethacrylates, polyacrylates, polysulfones, polyethylene ethers, poly(propylene oxide) and copolymers thereof, alkyl-substituted C1-C6 alkyl acrylates and methacrylates, acrylamides, methacrylamides, (C1-C6 alkyl) acrylamides and methacrylamides, N,N-dialkyl-acrylamides, ethoxy acrylates and methacrylates, polyethylene glycol mono
  • a biological nanopore sensor is provided.
  • the biological nanopore sensor is a biological nanopore sensor prepared by the above method.
  • a biological nanopore sensor which includes: a membrane layer and a hydrophilic protein with nanopores, the nanopores of the hydrophilic protein penetrate the membrane layer, and when an electric field force is applied across the membrane layer, an electric current is formed in the pores.
  • the hydrophilic protein comprises MCM protein.
  • the MCM protein includes a protein formed by covalently or non-covalently linking two or more MCM protein monomers; the MCM protein monomers include: 1) a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1; 2) a protein mutant, wherein the amino acid sequence of the protein mutant is substituted, deleted and/or one or more amino acids are added at least one of the following positions of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1: 318, 331, 346, 359, 366, 374, 404, 423, 424, 430, 448, 473, 488, and the protein mutant has the same protein and DNA binding function and has The ability to form nanopore function; 3) a porin monomer that is at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, or at least 99% identical to the protein in 1) or 2), and has the same protein binding and DNA binding function, and has the ability to form nanopore function; preferably, the MCM protein
  • a nanopore sequencing device which includes a biological nanopore sensor prepared by the above method, or the above biological nanopore sensor.
  • the nanopore sequencing device includes: an electrolytic cell, which contains an electrolyte; a nanopore sensor, which is located in the center of the electrolytic cell and divides the electrolytic cell and the electrolyte into a positive electrolyte region and a negative electrolyte region; a first electrode and a second electrode, the first electrode and the second electrode are respectively arranged in the positive electrolyte region and the negative electrolyte region.
  • a sequencing method which includes using the biological nanopore sensor prepared by the above method, or the above biological nanopore sensor, or the above nanopore sequencing device to detect and analyze the electrical signal generated when the biological molecule to be tested passes through the nanopore of the hydrophilic protein, so as to determine the sequence of the biological molecule to be tested.
  • a biological nanopore sensor prepared by the above method, or the above biological nanopore sensor, or the above nanopore sequencing device, or the above sequencing method is provided, and its application in nucleic acid detection, protein detection or protein conformation differentiation.
  • the above-mentioned nanopore sensor, or the method for preparing the nanopore sensor, or the nanopore sequencing device, or the sequencing method can sequence biological samples (including but not limited to DNA, RNA or polypeptides) to obtain their specific sequences; it can also identify and distinguish the three-dimensional structure (such as monomer, polymer, secondary structure, tertiary structure or quaternary structure) of the above-mentioned biological samples, such as detecting and distinguishing different polypeptides, and can also be used to distinguish polypeptide monomers and polymers.
  • the above-mentioned protein detection includes protein marker detection, and further application thereof to the screening detection of related diseases or tumors.
  • the MCM gene was synthesized into a pet28a(+) vector with a his-tag, and transformed into a BL21 competent cell for expansion culture. When OD 600 reached 0.6-1, 500 ⁇ M IPTG was added, and the temperature was adjusted to 16°C overnight to induce protein expression. The harvested cells were crushed by high pressure, and the unbroken cells and relatively large membrane pieces were removed by high-speed centrifugation at 20,000 rpm; the supernatant was collected and purified by IMAC (Immobilized metal affinity chromatography), Ion-exchange (ion exchange) and SEC (size-exclusion chromatography).
  • IMAC Immobilized metal affinity chromatography
  • Ion-exchange ion exchange
  • SEC size-exclusion chromatography
  • DNA1 SEQ ID NO: 4
  • DNA2 SEQ ID NO: 5
  • DNA1 (SEQ ID NO: 4): agcgtcgaaaagcagtacttaggcatt.
  • DNA2 (SEQ ID NO: 5): aatgcctaagtactgcttttcgacgcttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttt.
  • Reaction buffer 1 was 20 mM HEPES (pH 8.0), 4 mM ATP, 4 mM MgCl 2 , 0.3 M KCl;
  • Reaction buffer 2 was 20 mM HEPES (pH 8.0), 4 mM ATP, 4 mM MgCl 2 , 1.0 M KCl.
  • MCM protein is inserted into the phospholipid bilayer membrane using liposomes, and the analyte passes through the pores of the MCM protein pores (MCM channels), causing changes in electrical signals, and the analyte is analyzed by analyzing the changed electrical signals.
  • MCM channels MCM protein pores
  • the electrical properties of the nanopore biofilm were evaluated by applying different voltages (+0.02V, -0.02V, +0.03V, -0.03V, 0.04V, -0.04V, +0.05V) and recording the corresponding current values ( Figures 5A and 5B).
  • the MCM channel was stable, and the current of a single MCM channel was about 60pA.
  • polypeptide used in this example was synthesized and purified by GenScript, and the sequence is:
  • Peptide 2 peptide CYGRKKRRQRRR (SEQ ID NO: 7).
  • Peptide 2 peptide forms dimers due to the presence of cysteine at the end.
  • the opening current is recorded as I 0
  • the current during perforation is recorded as I.
  • MOSAIC is used to analyze the perforation event.
  • the amplitude of Peptide 1 during permeation is smaller and the residence time is shorter ( Figure 6B, Figure 6C, Figure 7B, Figure 7C).
  • the two peptides can be distinguished by amplitude and residence time, which shows the potential of MCM as a biological nanopore in distinguishing different peptides.
  • this implementation case uses Peptide 2 peptide.
  • Two peptides can form a disulfide bond through cysteine to form a dimer.
  • Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) is a thiol reducing agent with the property of reducing disulfide bonds. After the peptide dimer is treated with TCEP, the disulfide bonds are reduced and the peptide exists in monomeric form.

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Abstract

本发明提供了一种生物纳米孔传感器及其制备方法。其中，上述制备生物纳米孔传感器的方法包括：a)将亲水性蛋白制备为脂质体；b)将脂质体与膜层混合，促使脂质体插入膜层中，获得生物纳米孔传感器，亲水性蛋白具有纳米孔道。本发明方法能够解决现有技术中的难以将亲水性蛋白制备为生物纳米孔传感器的问题，适用于纳米孔测序领域。

Description

生物纳米孔传感器、其制备方法及应用 技术领域
本发明涉及纳米孔测序领域，具体而言，涉及一种生物纳米孔传感器、其制备方法及应用。
背景技术
蛋白质是生命活动的物质基础，不同序列和结构的蛋白质决定了蛋白质在生命活动中的不同功能；改变蛋白质的序列和结构可能改变细胞信号通路和物质代谢途径，从而诱发各种疾病。因此有必要开发一种简便可靠的方法来检测蛋白质或实现蛋白质测序。
纳米孔技术作为一种简单高效的单分子分析方法，在生物医学方面具有广泛的应用。待分析物在电场力作用下通过生物孔或固态孔，与之相互作用从而引起电流变化。通过分析不同待测物独特电信号特征从而实现鉴别的目的。生物纳米孔大多是天然存在的膜蛋白，可以插入到磷脂膜中，从而形成可检测待分析物的纳米孔。
但现有技术中的生物纳米孔蛋白，大多在重组表达系统中表达水平较低，且疏水性较强，溶解度较低。目前已被应用于纳米孔领域的生物孔大多为生物体内膜蛋白，例如：葡萄球菌α溶血素(alpha-hemolysin)、气单胞菌溶素(aerolysin)、大肠杆菌膜蛋白(CsgG)、耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)MspA等。在纯化过程中往往需要表面活性剂提高此种疏水性较强的蛋白溶解性和辅助聚体组装。因此制备生物纳米孔传感器的成本较高；并且这类表面活性剂也会影响插入孔蛋白的磷脂膜的稳定性，造成检测失败。而在现有技术中难以将亲水性较强的蛋白制备为生物纳米孔传感器。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种生物纳米孔传感器、其制备方法及应用，以解决现有技术中的难以将亲水性蛋白制备为生物纳米孔传感器的问题。
为了实现上述目的，根据本发明的第一个方面，提供了一种制备生物纳米孔传感器的方法，该方法包括：a)将亲水性蛋白制备为脂质体；b)将脂质体与膜层混合，促使脂质体插入膜层中，获得生物纳米孔传感器，其中，亲水性蛋白具有纳米孔道。
进一步地，亲水性蛋白包括MCM蛋白，a)包括将MCM蛋白制备为MCM脂质体。
进一步地，MCM蛋白包括由2个或更多个MCM蛋白单体通过共价或非共价连接而成的蛋白质；优选地，MCM蛋白单体包括：1)由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)蛋白质突变体，蛋白质突变体的氨基酸序列在SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的如下至少一个位点发生取代、缺失和/或添加一个或几个氨基酸：318、331、346、359、366、 374、404、423、424、430、448、473、488，且蛋白质突变体具有相同的结合蛋白和DNA功能、且具有形成纳米孔道的功能；3)与1)或2)中的蛋白质具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少99％同一性，且具有相同的结合蛋白和DNA功能、且具有形成纳米孔道功能的孔蛋白单体；优选地，MCM蛋白单体含有与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列具有90％以上同一性的核心区域。
进一步地，MCM蛋白包括由6个MCM蛋白单体通过非共价连接而成的蛋白质。
进一步地，a)包括：将含有磷脂的有机溶液置于容器中，以在容器壁形成脂膜；向容器中加入含有亲水性蛋白的溶液，震荡使脂膜水化；对脂膜水化后的溶液进行挤出、过滤，获得脂质体；优选地，磷脂包括二植酰磷脂酰胆碱，更优选为1，2-二植烷酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱；优选地，过滤包括利用聚碳酸酯膜进行过滤，更优选聚碳酸酯膜的直径为0.1-1μm，更优选为0.4μm。
进一步地，b)包括：将脂质体与膜层在溶液中混合并向溶液的两侧施加电压，促使脂质体插入膜层中，同时监测溶液中的电流；当电流恒定时，表示脂质体插入膜层，获得生物纳米孔传感器；优选地，b)进一步包括：计算电导率，电导率＝电流/电压；当电导率≥2.8nS时，脂质体插入膜层，获得生物纳米孔传感器；优选地，电压为大于0V，且小于等于0.5V；优选地，获得生物纳米孔传感器后，将电压降低至0V。
进一步地，在获得生物纳米孔传感器后，方法还包括利用缓冲液洗涤去除残留的游离亲水性蛋白。
进一步地，膜层包括脂质层或人造高分子膜；优选地，脂质层包括两亲脂类；优选地，两亲脂类包括磷脂双分子层；优选地，脂质层包括平面膜层或脂质体；优选地，脂质体包括多层脂质体或单层脂质体；优选地，脂质层包括二植酰磷脂酰胆碱组成的磷脂双分子层，更优选为1，2-二植烷酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱组成的磷脂双分子层。
为了实现上述目的，根据本发明的第二个方面，提供了一种生物纳米孔传感器，该生物纳米孔传感器为利用上述方法制备获得的生物纳米孔传感器。
为了实现上述目的，根据本发明的第三个方面，提供了一种生物纳米孔传感器，该生物纳米孔传感器包括：膜层和具有纳米孔道的亲水性蛋白，亲水性蛋白的纳米孔道贯穿膜层，当跨越膜层施加电场力时，孔道中形成电流。
进一步地，亲水性蛋白包括MCM蛋白。
进一步地，MCM蛋白包括由2个或更多个MCM蛋白单体通过共价或非共价连接而成的蛋白质；MCM蛋白单体包括：1)由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)蛋白质突变体，蛋白质突变体的氨基酸序列在SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的如下至少一个位点发生取代、缺失和/或添加一个或几个氨基酸：318、331、346、359、366、374、404、423、424、430、448、473、488，且蛋白质突变体具有相同的结合蛋白和DNA功能、且具有形成纳米孔道功能的能力；3)与1)或2)中的蛋白质具有至少70％、至少75％、至 少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少99％同一性，且具有相同的结合蛋白和DNA功能、且具有形成纳米孔道功能的能力的孔蛋白单体；优选地，MCM蛋白包括由2-10个MCM蛋白单体通过共价或非共价连接而成的蛋白质；优选地，MCM蛋白包括由6个MCM蛋白单体通过非共价连接而成的蛋白质；优选地，MCM蛋白单体含有与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列具有90％以上同一性的核心区域。
为了实现上述目的，根据本发明的第四个方面，提供了一种纳米孔测序装置，该纳米孔测序装置包括利用上述方法制备的生物纳米孔传感器、或上述生物纳米孔传感器。
进一步地，纳米孔测序装置包括：电解槽，电解槽含有电解液；生物纳米孔传感器，生物纳米孔传感器位于电解槽的中央，并将电解槽及电解液分割为正极电解液区和负极电解液区；第一电极和第二电极，第一电极和第二电极分别设置在正极电解液区和负极电解液区。
为了实现上述目的，根据本发明的第五个方面，提供了一种测序方法，该测序方法包括利用上述方法制备的生物纳米孔传感器、或上述生物纳米孔传感器、或上述纳米孔测序装置，检测并解析待测生物分子通过亲水性蛋白的纳米孔道时产生的电信号，确定待测生物分子的序列。
进一步地，，亲水性蛋白包括MCM蛋白；优选地，待测生物分子包括修饰或未修饰的DNA、RNA、或多肽；优选地，多肽包括多肽单体或多肽聚体；优选地，电信号包括电流振幅和/或停留时间。
为了实现上述目的，根据本发明的第六个方面，提供了一种利用上述方法制备的生物纳米孔传感器、或上述生物纳米孔传感器、或上述纳米孔测序装置、或上述测序方法，在核酸检测、蛋白检测或蛋白构象区分中的应用。
作为亲水性蛋白，MCM蛋白能够在大肠杆菌等表达系统中大量表达，易于纯化和大量制备。且作为多聚体的MCM蛋白既含有孔道，又属于具有解旋活性的解旋酶，其在生物纳米孔传感器中能够同时发挥孔蛋白的作用和解旋酶的作用。利用此种蛋白制备获得的生物纳米孔传感器，能够将现有技术中纳米孔测序法所需的两个独立蛋白的功能合二为一，具有极好的应用前景。但在现有技术中，亲水性蛋白无法直接插入磷脂膜中，因此现有技术中无法利用MCM蛋白制备生物纳米孔传感器。本发明开发了一种制备生物纳米孔传感器的方法，利用脂质体包裹MCM蛋白等亲水性蛋白后，成功将亲水性蛋白插入膜层中制备获得生物纳米孔传感器，能够如现有技术中其他纳米孔传感器一样，实现对于生物样品的测序和鉴定等操作。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1示出了根据本发明实施例3的嵌有MCM蛋白的纳米孔传感器的结构示意。
图2A和图2B示出了根据本发明实施例1的MCM蛋白的纯化结果，其中，图2A示出了MCM蛋白的分子筛Superdex 200纯化结果，图2B示出了MCM蛋白的凝胶电泳结果。
图3A和图3B示出了根据本发明实施例2的MCM的活性检测结果，其中，图3A示出了在0.15M KCl盐浓度下的MCM活性检测结果，图3B示出了在0.5M KCl盐浓度下的MCM活性检测结果。
图4示出了根据本发明实施例3的单一MCM蛋白嵌入磷脂双分子层时产生的电流变化情况。
图5A至图5C示出了根据本发明实施例3的纳米孔传感器的电学性质，其中，图5A和图5B显示了依次施加+0.02V，-0.02V，+0.03V，-0.03V，0.04V，-0.04V，+0.05V电压时，单一MCM通道的电流轨迹，图5C示出了了纳米孔传感器的电导分布情况(N＝63)。
图6A至图6C示出了根据本发明实施例4的Peptide 1肽在-0.02V下通过MCM蛋白孔道的易位和参数表征，其中，图6A示出了Peptide 1肽在-0.02V下通过MCM通道时的易位信号，图6B示出了Peptide 1肽穿孔时电流振幅的分析结果(N＝436)，图6C示出了Peptide 1肽穿孔时停留时间的分析结果(N＝436)。
图7A至图7C示出了根据本发明实施例4的Peptide 2肽在-0.02V下通过MCM蛋白孔道的易位和参数表征，其中，图7A显示了Peptide 2肽在-0.02V下通过MCM通道时的易位信号，图7B示出了Peptide 2肽穿孔时电流振幅的分析结果(N＝270)，图7C示出了Peptide 2肽穿孔时停留时间的分析结果(N＝270)。
图8A至图8C示出了根据本发明实施例5的经过TCEP处理的Peptide 2肽在-0.02V下通过MCM通道的易位和参数表征，其中，图8A示出了经过TCEP处理的Peptide2肽在-0.02V下通过MCM通道时的易位信号，图8B示出了经过TCEP处理的Peptide 2肽穿孔时电流振幅的分析结果(N＝270)，图8C示出了经过TCEP处理的Peptide 2肽穿孔时停留时间的分析结果(N＝270)。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
如背景技术所提到的，现有技术中的生物纳米孔蛋白，大多在重组表达系统中表达水平较低，且不易纯化，制备较困难。因而，在本申请中发明人尝试开发一种制备生物纳米孔传感器的方法，利用脂质体包裹亲水性蛋白后，成功将亲水性蛋白插入膜层中制备获得生物纳米孔传感器。因而提出了本申请的一系列保护方案。
在本申请第一种典型的实施方式中，提供了一种制备生物纳米孔传感器的方法，该方法包括：a)将亲水性蛋白制备为脂质体；b)将脂质体与膜层混合，促使脂质体插入膜层中，获得生物纳米孔传感器；上述亲水性蛋白具有纳米孔道。
在一种优选的实施例中，亲水性蛋白包括MCM蛋白，a)包括将MCM蛋白制备为MCM脂质体。
微小染色体维持(minichromosome maintenance，MCM)蛋白家族由MCM基因编码，从太古生物到高等真核生物中均广泛存在，是一种序列高度保守的蛋白质家族。MCM蛋白是由6个亚单位(即MCM蛋白单体)组成的环形结构的亲水性六聚体复合物，具有解链酶活性，在DNA复制的起始和延伸过程中起到重要作用，中间含有孔径为纳米级别的孔道。MCM蛋白在大肠杆菌重组蛋白表达系统中具有较高的表达水平，且其六聚体的结构特性使之具备发展成为生物纳米孔的优势。但由于该蛋白并非天然膜蛋白，其外侧疏水性较低，无法直接插入磷脂中。
因此，本申请发明人提供了一个新的可用于将非天然膜蛋白插入膜层中的方法。在该方法中，首先利用磷脂等亲脂性材料包裹MCM蛋白等亲水性蛋白，将其制备为MCM脂质体，然后将MCM脂质体与膜层混合，从而使MCM脂质体、即MCM蛋白插入并贯穿膜层，获得具有孔道连通两侧的生物纳米孔传感器。
在现有技术中，较为成熟的纳米孔测序技术为链测序法，该技术由英国牛津纳米孔科技公司(ONT)商业化。ONT链测序法的核心原理是：解旋酶将双链DNA解旋为单链DNA，并且控制单链DNA穿过纳米孔蛋白(解旋酶和孔蛋白是两个独立的蛋白)。本发明中构建的新型生物纳米孔传感器与ONT的技术不同：MCM蛋白在文献中报道是具有解旋活性的解旋酶，且含有孔道；本发明中利用MCM蛋白既实现了孔蛋白的作用，又实现了解旋酶的作用，将链测序法的两个独立蛋白的功能合二为一。
上述方法制备获得的生物纳米孔传感器可用于DNA测序，在本申请实施例中，酶活检测实验证明了本发明构建的生物纳米孔传感器具有解旋活性，电导和分析物穿孔证明了传感器中孔道的形成。上述两个关键结果证明了此种生物纳米孔传感器具有DNA测序的潜力。
在一种优选的实施例中，MCM蛋白包括由2个或更多个MCM蛋白单体通过共价或非共价连接而成的蛋白质；优选地，MCM蛋白单体包括：1)由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)蛋白质突变体，蛋白质突变体的氨基酸序列在SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的如下至少一个位点发生取代、缺失和/或添加一个或几个氨基酸：318、331、346、359、366、374、404、423、424、430、448、473、488，且蛋白质突变体具有相同的结合蛋白和DNA功能、且具有形成纳米孔道的功能；3)与1)或2)中的蛋白质具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少99％同一性，且具有相同的结合蛋白和DNA功能、且具有形成纳米孔道功能的孔蛋白单体；优选地，MCM蛋白单体含有与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列具有90％以上同一性的核心区域。
在一种优选的实施例中，MCM蛋白包括由6个MCM蛋白单体通过非共价连接而成的蛋白质。
本申请中的生物纳米孔传感器特指有纳米孔蛋白插入膜层构成的检测器。此种纳米孔传感器，在膜层中插入带有孔道的MCM蛋白，MCM蛋白的孔道贯穿该膜层，通过孔道连通膜 层两侧。施加电场力，膜两侧的离子发生迁移穿过纳米孔通道，从而产生电流。基于MCM蛋白的生物纳米孔传感器的示意图如图1所示。
SEQ ID NO：1所示的MCM蛋白单体具有耐高温特性，是由来自于嗜热古细菌硫化叶菌(Saccharolobus solfataricus)的SEQ ID NO：3所示的野生型蛋白质Sso MCM改造而来。
Figure PCTCN2022143622-appb-000001
上述SEQ ID NO：1所示的MCM蛋白单体为一种高度保守的蛋白质，与其具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％以上同一性、具有相同的结合蛋白和DNA功能、且具有形成孔道结构功能的蛋白质，也属于MCM蛋白，也能够插入膜层形成具有相同功能的纳米孔传感器。蛋白及聚集体稳定性、孔径、孔道内壁氨基酸残基、待测生物分子通过性能等性质，与SEQ ID NO：1所示的蛋白质大概率相同。上述“相同功能”包括但不限于：DNA或蛋白等待测生物分子在电场力的作用下，能够穿过MCM蛋白的孔道，并产生与每一个核苷酸或氨基酸相对应的电流。
本说明书中的同一性(Identity)是指氨基酸序列或核酸序列之间的“同一性”，即氨基酸序列或核酸序列中的种类相同的氨基酸残基或核苷酸的比率的总计。氨基酸序列或核酸序列的同一性可以利用BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)、FASTA等比对程序来确定。
70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％以上(比如85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、98.5％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％以上，甚至99.9％以上)同一性且具有相同功能的蛋白质，其活性位点、活性口袋、活性机制、蛋白结构等均和1)序列提供的蛋白质大概率相同。
如本文所用，氨基酸残基缩写如下：丙氨酸(Ala；A)、天冬酰胺(Asn；N)、天冬氨酸(Asp；D)、精氨酸(Arg；R)、半胱氨酸(Cys；C)、谷氨酸(Glu；E)、谷氨酰胺(Gln；Q)、甘氨酸(Gly；G)、组氨酸(His；H)、异亮氨酸(Ile；I)、亮氨酸(Leu；L)、赖氨酸(Lys；K)、蛋氨酸(Met；M)、苯丙氨酸(Phe；F)、脯氨酸(Pro；P)，丝氨酸(Ser；S)、苏氨酸(Thr；T)、色氨酸(Trp；W)、酪氨酸(Tyr；Y)和缬氨酸(Val；V)。
一般情况下，根据取代、替换等规则，性质类似的氨基酸之间相互替换后的效果也类似。例如，在上述同源蛋白中，可发生保守的氨基酸替换。“保守的氨基酸替换”包括但不限于：
疏水性氨基酸(Ala、Cys、Gly、Pro、Met、Val、Ile、Leu)被其他疏水性氨基酸取代；
侧链粗大的疏水性氨基酸(Phe、Tyr、Trp)被其他侧链粗大的疏水性氨基酸取代；
侧链带正电的氨基酸(Arg、His、Lys)被其他侧链带正电的氨基酸取代；
侧链有极性不带电的氨基酸(Ser、Thr、Asn、Gln)被其他侧链有极性不带电的氨基酸取代。
本领域技术人员也可以根据现有技术中的“blosum62评分矩阵”等本领域技术人员熟知的氨基酸替换规则对氨基酸进行保守替换。
MCM蛋白家族有一个大约200个氨基酸残基组成的高度保守的核心区域，如SEQ ID NO：2所示。该核心区域能够较大程度地影响MCM蛋白的功能和立体结构，因此与该核心区域具有较高同一性(具有90％、95％、97％、98％、99％乃至99.5％以上同一性)的蛋白，也具有类似的“相同功能”和立体结构(包括但不限于孔道)。
Figure PCTCN2022143622-appb-000002
在一种优选的实施例中，a)包括：将含有磷脂的有机溶液置于容器中，以在容器壁形成脂膜；向容器中加入含有亲水性蛋白的溶液，震荡使脂膜水化；对脂膜水化后的溶液进行挤出、过滤，获得脂质体；优选地，磷脂包括二植酰磷脂酰胆碱，更优选为1，2-二植烷酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱；优选地，过滤包括利用聚碳酸酯膜进行过滤，更优选聚碳酸酯膜的直径为0.1-1μm，更优选为0.4μm。
利用上述方法，或现有技术中制备脂质体的方法，均能够将MCM蛋白等亲水性蛋白制 备为MCM脂质体。震荡包括但不限于超声震荡、涡旋震荡。上述磷脂与孔蛋白插入磷脂膜的成分保持一致，有助于保持体系稳定性。
在一种优选的实施例中，b)包括：将脂质体与膜层在溶液中混合并向溶液的两侧施加电压，促使脂质体插入膜层中，同时监测溶液中的电流；当电流恒定时，表示脂质体插入膜层，获得生物纳米孔传感器；优选地，b)进一步包括：计算电导率，电导率＝电流/电压；当电导率≥2.8nS时，脂质体插入膜层，获得生物纳米孔传感器；优选地，电压为大于0V，且小于等于0.5V；优选地，获得纳米孔传感器后，将电压降低至0V。
将上述制备获得的脂质体与膜层在溶液中混合后，在溶液中施加电压，在电压的作用下脂质体能够插入膜层中，并实时监测溶液中的电流，利用公式“电导率＝电流/电压”计算膜层的电导率。当亲水性蛋白的纳米孔道贯穿膜层时，由于纳米孔道连通膜层两端，会导致电导率增加，电流增大并且在一定时间内达到恒定，即表示获得生物纳米孔传感器。
优选地，在电导率增大后，降低施加的电压，防止其他亲水性蛋白继续插入膜层中，从而获得单一亲水性蛋白嵌入的生物纳米孔传感器。本申请中蛋白的嵌入或插入，均指细胞流动镶嵌学说中蛋白贯穿膜层的情况；尤其指带有孔道的蛋白贯穿膜层，且孔道连通膜层两侧；而非蛋白嵌在膜层表面。
在一种优选的实施例中，在获得生物纳米孔传感器后，方法还包括利用缓冲液洗涤去除残留的游离亲水性蛋白。
为了防止未插入膜层中的亲水性蛋白对后续的测序等操作产生影响，在获得纳米孔传感器后进行冲洗，除去游离亲水性蛋白。
在一种优选的实施例中，膜层包括脂质层或人造高分子膜；优选地，脂质层包括两亲脂类；优选地，两亲脂类包括磷脂双分子层；优选地，脂质层包括平面膜层或脂质体；优选地，脂质体包括多层脂质体或单层脂质体；优选地，脂质层包括二植酰磷脂酰胆碱组成的磷脂双分子层，更优选为1，2-二植烷酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱组成的磷脂双分子层。
人造高分子膜包括但不限于聚硅氧烷、聚烯烃、全氟聚醚、全氟烃基聚醚、聚苯乙烯、聚氧丙烯、聚乙酸乙烯酯、聚氧丁烯、聚异戊二烯、聚丁二烯、聚氯乙烯、聚烷基丙烯酸酯、聚烷基甲基丙烯酸酯、聚丙烯腈、聚丙烯、PTHF、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酸酯、聚砜、聚乙烯醚、聚(环氧丙烷)及其共聚物、基取代的C1-C6烷基丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、(C1-C6烷基)丙烯酰胺和甲基丙烯酰胺、N，N-二烷基-丙烯酰胺、乙氧基丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯、聚乙二醇单甲基丙烯酸酯和聚乙二醇单甲基醚甲基丙烯酸酯、羟基取代的(C1-C6烷基)丙烯酰胺和甲基丙烯酰胺、羟基取代的C1-C6烷基乙烯基醚、乙烯基磺酸钠、苯乙烯基磺酸钠、2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸、N-乙烯基吡咯、N-乙烯基-2-吡咯烷酮、2-乙烯基恶唑啉、2-乙烯基-4，4′-双烷基恶唑啉基-5-酮、2，4-乙烯基吡啶、总共具有3-5个碳原子的乙烯化不饱和羧酸，氨基(C1-C6烷基)-、单(C1-C6烷氨基)(C1-C6烷基)-和双(C1-C6烷氨基)(C1-C6烷基)-丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯、烯丙醇、3-三甲基铵甲基丙烯酸2-羟丙基酯氯化物、二甲基氨乙基甲基丙烯酸酯(DMAEMA)、二甲基氨乙基甲基丙烯 酰胺、甘油甲基丙烯酸酯、N-(1，1-二甲基-3-氧代丁基)丙烯酰胺、环亚氨基醚、乙烯基醚、包含环氧衍生物的环醚、环不饱和醚、N-取代环乙亚胺、β-内酯和β-内酰胺、乙烯酮缩醛、乙烯基缩醛或正膦中的一种或多种。
在本申请第二种典型的实施方式中，提供了一种生物纳米孔传感器，该生物纳米孔传感器为利用上述方法制备获得的生物纳米孔传感器。
在本申请第三种典型的实施方式中，提供了一种生物纳米孔传感器，该生物纳米孔传感器包括：膜层和具有纳米孔道的亲水性蛋白，亲水性蛋白的纳米孔道贯穿膜层，当跨越膜层施加电场力时，孔道中形成电流。
在一种优选的实施例中，亲水性蛋白包括MCM蛋白。
在一种优选的实施例中，MCM蛋白包括由2个或更多个MCM蛋白单体通过共价或非共价连接而成的蛋白质；MCM蛋白单体包括：1)由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)蛋白质突变体，蛋白质突变体的氨基酸序列在SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的如下至少一个位点发生取代、缺失和/或添加一个或几个氨基酸：318、331、346、359、366、374、404、423、424、430、448、473、488，且蛋白质突变体具有相同的结合蛋白和DNA功能、且具有形成纳米孔道功能的能力；3)与1)或2)中的蛋白质具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少99％同一性，且具有相同的结合蛋白和DNA功能、且具有形成纳米孔道功能的能力的孔蛋白单体；优选地，MCM蛋白包括由2-10个MCM蛋白单体通过通过共价或非共价连接而成的蛋白质；优选地，MCM蛋白包括由6个MCM蛋白单体通过非共价连接而成的蛋白质；优选地，MCM蛋白单体含有与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列具有90％以上同一性的核心区域。
在本申请第四种典型的实施方式中，提供了一种纳米孔测序装置，该纳米孔测序装置包括利用上述方法制备的生物纳米孔传感器、或上述生物纳米孔传感器。
上述纳米孔测序装置，除了纳米孔传感器有改进外，其他结构组成可以与现有技术中相同，也可以根据本申请的纳米孔传感器的不同对其他结构组成进行相应调整。在一种优选的实施例中，纳米孔测序装置包括：电解槽，其含有电解液；纳米孔传感器，其位于电解槽的中央，并将电解槽及电解液分割为正极电解液区和负极电解液区；第一电极和第二电极，第一电极和第二电极分别设置在正极电解液区和负极电解液区。
在本申请第五种典型的实施方式中，提供了一种测序方法，该测序方法包括利用上述方法制备的生物纳米孔传感器、或上述生物纳米孔传感器、或上述纳米孔测序装置，检测并解析待测生物分子通过亲水性蛋白的纳米孔道时产生的电信号，确定待测生物分子的序列。
在一种优选的实施例中，亲水性蛋白包括MCM蛋白；优选地，待测生物分子包括修饰或未修饰的DNA、RNA、或多肽；优选地，多肽包括多肽单体或多肽聚体；优选地，电信号包括电流振幅和/或停留时间。
在本申请第六种典型的实施方式中，提供了一种上述方法制备的生物纳米孔传感器、或上述生物纳米孔传感器、或上述纳米孔测序装置、或上述测序方法，在核酸检测、蛋白检测或蛋白构象区分中的应用。
在对于生物样品的检测中，上述纳米孔传感器、或制备纳米孔传感器的方法、或纳米孔测序装置、或测序方法，能够对生物样品(包括但不限于DNA、RNA或多肽)进行测序，获得其具体的序列；也能够对上述生物样品的立体结构(如单体、多聚体、二级结构、三级结构或四级结构)进行鉴别和区分，如对不同多肽进行检测和区分，还可以用于多肽单体和聚体的区分。对于上述蛋白检测，包括蛋白标志物检测，以及包括将其进一步应用到相关疾病或肿瘤的筛查检测中。
下面将结合具体的实施例来进一步详细解释本申请的有益效果。
实施例1 MCM的克隆、表达和纯化
将MCM基因合成到pet28a(+)带有his-tag的载体中，转化到BL21感受态中进行扩大培养，OD 600达到0.6-1时，加入500μM IPTG，同时温度调到16℃过夜诱导蛋白表达。将收获的细胞进行高压破碎，20000rpm高速离心去掉未破碎的细胞以及比较大的膜片；收集上清，通过IMAC(Immobilized metal affinity chromatography，固相金属亲和层析)，Ion-exchange(离子交换)和SEC(size-exclusion chromatography，体积排除色谱)进行蛋白纯化。经过纯化，最终可得到较大量的纯度良好的MCM蛋白，平均每克菌纯化出目的蛋白10mg左右。MCM蛋白的分子筛Superdex 200纯化结果以及胶图结果展现在图2A和图2B中。
实施例2 MCM蛋白的ATPase活性检测
(1)制备双链DNA(dsDNA)和单链DNA(ssDNA)
将DNA1(SEQ ID NO：4)、DNA2(SEQ ID NO：5)分别用TE缓冲液(pH＝8)溶解为终浓度100μM的母液。
DNA1(SEQ ID NO：4)：agcgtcgaaaagcagtacttaggcatt。
DNA2(SEQ ID NO：5)：aatgcctaagtactgcttttcgacgcttttttttttttttttttttt。
将100μM的DNA2用TE缓冲液(pH＝8)稀释到10μM，作为ssDNA；将DNA1和DNA2退火为3’悬挂20个T的dsDNA，退火流程为95℃孵育5分钟，0.1℃/s的降温速度降至25℃，继续孵育30分钟，退火配方见表1。
表1 dsDNA退火配方
溶液 体积
100μM DNA1 5μL
100μM DNA2 5μL
TE缓冲液(pH＝8) 40μL
(2)配制反应缓冲液(2×)
反应缓冲液1为20mM HEPES(pH 8.0)、4mM ATP、4mM MgCl 2、0.3M KCl；
反应缓冲液2为20mM HEPES(pH 8.0)、4mM ATP、4mM MgCl 2、1.0M KCl。
(3)稀释MCM蛋白
用1×PBS将实施例获得的MCM蛋白稀释到10μM。
(4)ATP水解反应
按表2的反应体系加入相应试剂，充分混匀，30℃孵育30min，80℃灭活5min，4℃保持。其中①②③为实验组，④⑤⑥为相应的对照组。
表2 ATP水解反应体系
编号 反应缓冲液(2×) DNA MCM H 2O
① 10μL 1μL(dsDNA) 1μL 8μL
② 10μL 1μL(ssDNA) 1μL 8μL
③ 10μL —— 1μL 9μL
④ 10μL 1μL(dsDNA) —— 9μL
⑤ 10μL 1μL(ssDNA) —— 9μL
⑥ 10μL —— —— 10μL
(5)检测反应剩余ATP
步骤(4)获得的反应产物用H 2O稀释250倍，为测试样品；配置0.1μM、0.3μM、1μM、3μM、10μM ATP溶液，为标准品。使用ATP检测试剂盒(碧云天，S0026B)测定反应剩余ATP浓度。在黑色酶标板中混匀50μL检测试剂盒中的ATP检测工作液和10μl测试样品或标准品，反应30min，酶标仪检测化学发光值，每个样品重复测定三次。由于荧光强度与ATP的浓度成正比，通过测定反应后溶液的荧光强度可以得出溶液中ATP的浓度，结果如图3A和图3B所示。从图3A和3B可知，在0.15M和0.5M的盐浓度下，MCM蛋白的存在均会导致荧光强度的下降，说明MCM蛋白在0.15M和0.5M KCl条件下均具有水解ATP的活性。①、②、③、④、⑤、⑥分别为MCM+dsDNA组、MCM+ssDNA组、MCM组、dsDNA组、ssDNA组、Control组(阴性对照组)。
实施例3 将MCM蛋白脂质体插入到磷脂双层膜中
(1)制备MCM脂质体
取100μL浓度为10mg/mL的1，2-二植烷酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DPhPC，Avanti Polar Lipids)的氯仿溶液于圆底烧瓶中，通过旋转蒸发仪除去氯仿，于圆底烧瓶瓶壁形成一层脂膜。加入300μL含有MCM蛋白(浓度：1mg/mL)的水合缓冲溶液(3M KCl，5mM HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)，250mM Sucrose(蔗糖)，pH 7.6)，涡旋至薄膜完全水化。使用挤出 机(Avanti Polar Lipids)对蛋白脂质体进行均一化处理。将制备得到的MCM脂质体通过0.4μm聚碳酸酯膜过滤30次，得到的MCM脂质体溶液储存于-20℃备用。
(2)将MCM蛋白脂质体插入到磷脂双分子层膜中
使用Avanti Polar Lipids的DPhPC形成的磷脂双分子层脂膜进行实验。取步骤(1)获得的50μL的MCM脂质体溶液与250μL的缓冲液(0.47M KCl，25mM HEPES，1mM EDTA，pH＝8.1)混合均匀，通过进样口加入至含有磷脂双分子层的流动池中。通过施加0.1V电压以促进MCM脂质体插入到磷脂膜中，一旦插入到膜中，电流将增大至360pA左右，原始电流图展示在图4中。如图4所示，未嵌入时电流约为0pA。施加0.1V电压，嵌入磷脂层后电流约为360pA。MCM蛋白成功嵌入磷脂膜后，改变电压至0.02V，此时电流约为90pA。
MCM蛋白的纳米孔生物膜的示意图如图1所示。MCM蛋白利用脂质体插入到磷脂双分子膜上，待分析物穿过MCM蛋白孔的孔道(MCM通道)，引起电信号的变化，通过分析变化的电信号对待分析物进行分析。
(3)电学表征
完成插孔后，使用嵌孔缓冲液(0.47M KCl，25mM HEPES，1mM EDTA，pH＝8.1)推走流动池中残留的MCM蛋白。通过施加不同电压(+0.02V，-0.02V，+0.03V，-0.03V，0.04V，-0.04V，+0.05V)并记录相应的电流值，评估纳米孔生物膜的电学性质(图5A和图5B)。在0.02V的电压下，MCM通道稳定，单一的MCM通道的电流约为60pA。收集单一嵌孔后的多个电压及电流数据，通过公式(电导率＝电流/电压)计算得到MCM在测序缓冲液中的电导值约为2.8nS(如图5C所示)。
实施例4 利用MCM区分不同多肽
本实施例中使用的多肽由金斯瑞合成和纯化，序列为：
Peptide 1肽：RRRRRRRRRR(SEQ ID NO：6)。
Peptide 2肽：CYGRKKRRQRRR(SEQ ID NO：7)。
为探索MCM通道潜在的生物医学应用，收集了两种不同长度、不同序列的多肽的穿孔信号。将多肽加入到300μL的缓冲溶液中(终浓度：1-10μg/mL)混合均匀，通过进样口加入到已嵌孔的流动池中，施加-0.02V电压观察肽易位信号，5kHz的频率下收集数据。利用Clampfit10.7软件以及MOSAIC对数据进行处理，原始数据展示在图6A及图7A中。Peptide 1肽及Peptide2肽带有正电性，其中Peptide 1肽以单体形式存在。而Peptide2肽因末端存在半胱氨酸，会形成二聚体。将开孔电流记作I 0，穿孔时的电流记作I，利用MOSAIC对穿孔事件进行分析。相较于Peptide 2肽的电流信号，Peptide 1肽穿孔时的振幅更小，停留时间更短(图6B、图6C、图7B、图7C)。通过振幅及停留时间可以区分两种多肽，这展现出了MCM作为生物纳米孔在区分不同多肽时的潜力。
实施例5 利用MCM区分多肽的单体或聚体形式
本实施例中使用的多肽由金斯瑞合成和纯化，序列为：
Peptide 2肽：CYGRKKRRQRRR(SEQ ID NO：7)。
为区别多肽的不同形式，本实施案例选择使用Peptide 2肽。Peptide 2肽末端有一个半胱氨酸。两个多肽之间可通过半胱氨酸形成二硫键，从而形成二聚体。三(2-羧乙基)膦(TCEP)是一种硫醇类的还原剂，具有还原二硫键的性质。经过TCEP处理的多肽二聚体，二硫键被还原，多肽以单体形式存在。
将多肽加入到含有1mM三(2-羧乙基)膦(TCEP)的缓冲溶液中(终浓度：1-10μg/mL)混合均匀，室温下孵育30分钟后，通过进样口加入到已嵌孔的流动池中，施加-0.02V电压观察肽易位信号，5kHz的频率下收集数据。利用Clampfit 10.7软件以及MOSAIC对数据进行处理，原始数据及处理结果展示在图7中。多肽在电势作用下，穿过MCM通道，引起不同的电信号。未经过TCEP处理的Peptide 2肽带电荷更多，穿孔事件多于被还原的多肽(图7A和图8A)。此外，经过TCEP处理的Peptide 2肽为单体形式，其穿孔事件的振幅更低，停留时间更短(图8B和图8C)。不同多肽穿过纳米孔的检测信号不同，根据信号差异能够实现对于多肽的区分。该实施案例展现了MCM作为生物纳米孔在区分多肽的不同形式方面的潜力。
从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：应用本发明的技术方案，利用MCM蛋白和膜层构建的纳米孔传感器，具有贯穿膜层两侧的孔道，在跨越膜层施加电场力时，电荷能够在孔道中定向移动从而形成电流。在使用中，待测生物样品能够在电势作用下，穿过MCM蛋白通道，产生不同的电信号，实现对于生物样品的测序、鉴定等操作。MCM蛋白能够在大肠杆菌等表达系统中大量表达，且不属于天然膜蛋白，无法自主插入到表达系统的膜层中，易于纯化和大量制备，制备成本显著降低。另外，作为多聚体的MCM蛋白既含有孔道，又属于具有解旋活性的解旋酶，在生物纳米孔传感器中能够同时发挥孔蛋白的作用和解旋酶的作用。利用此种蛋白制备获得的生物纳米孔传感器，能够将现有技术中链测序法所需的两个独立蛋白的功能合二为一，具有极好的应用前景。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (17)

  1. 一种制备生物纳米孔传感器的方法，其特征在于，所述方法包括：
    a)将亲水性蛋白制备为脂质体；
    b)将所述脂质体与膜层混合，促使所述脂质体插入所述膜层中，获得所述生物纳米孔传感器；
    其中，所述亲水性蛋白具有纳米孔道。
  2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述亲水性蛋白包括MCM蛋白，所述a)包括将所述MCM蛋白制备为MCM脂质体。
  3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述MCM蛋白包括由2个或更多个MCM蛋白单体通过共价或非共价连接而成的蛋白质；
    优选地，所述MCM蛋白单体包括：
    1)由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
    2)蛋白质突变体，所述蛋白质突变体的氨基酸序列在SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的如下至少一个位点发生取代、缺失和/或添加一个或几个氨基酸：318、331、346、359、366、374、404、423、424、430、448、473、488，且所述蛋白质突变体具有相同的结合蛋白和DNA功能、且具有形成纳米孔道的功能；
    3)与1)或2)中所述的蛋白质具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少99％同一性，且具有相同的结合蛋白和DNA功能、且具有形成纳米孔道功能的孔蛋白单体；
    优选地，所述MCM蛋白单体含有与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列具有90％以上同一性的核心区域。
  4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述MCM蛋白包括由6个所述MCM蛋白单体通过非共价连接而成的蛋白质。
  5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述a)包括：
    将含有磷脂的有机溶液置于容器中，以在容器壁形成脂膜；
    向所述容器中加入含有所述亲水性蛋白的溶液，震荡使所述脂膜水化；
    对所述脂膜水化后的溶液进行挤出、过滤，获得所述脂质体；
    优选地，所述磷脂包括二植酰磷脂酰胆碱，更优选为1，2-二植烷酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱；
    优选地，所述过滤包括利用聚碳酸酯膜进行过滤，更优选所述聚碳酸酯膜的直径为0.1-1μm，更优选为0.4μm。
  6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述b)包括：
    将所述脂质体与所述膜层在溶液中混合并向所述溶液的两侧施加电压，促使所述脂质体插入所述膜层中，同时监测所述溶液中的电流；
    当所述电流恒定时，表示所述脂质体插入所述膜层，获得所述生物纳米孔传感器；
    优选地，所述b)进一步包括：计算电导率，所述电导率＝所述电流/所述电压；当所述电导率≥2.8nS时，所述脂质体插入所述膜层，获得所述生物纳米孔传感器；
    优选地，所述电压为大于0V，且小于等于0.5V；
    优选地，获得所述生物纳米孔传感器后，将所述电压降低至0V。
  7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在获得所述生物纳米孔传感器后，所述方法还包括利用缓冲液洗涤去除残留的游离亲水性蛋白。
  8. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述膜层包括脂质层或人造高分子膜；
    优选地，所述脂质层包括两亲脂类；
    优选地，所述两亲脂类包括磷脂双分子层；
    优选地，所述脂质层包括平面膜层或脂质体；
    优选地，所述脂质体包括多层脂质体或单层脂质体；
    优选地，所述脂质层包括二植酰磷脂酰胆碱组成的磷脂双分子层，更优选为1，2-二植烷酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱组成的磷脂双分子层。
  9. 一种生物纳米孔传感器，其特征在于，所述生物纳米孔传感器为利用权利要求1至8中任一项所述的方法制备获得的生物纳米孔传感器。
  10. 一种生物纳米孔传感器，其特征在于，所述生物纳米孔传感器包括：膜层和具有纳米孔道的亲水性蛋白，所述亲水性蛋白的纳米孔道贯穿所述膜层，
    当跨越所述膜层施加电场力时，所述孔道中形成电流。
  11. 根据权利要求10所述的生物纳米孔传感器，其特征在于，所述亲水性蛋白包括MCM蛋白。
  12. 根据权利要求11所述的生物纳米孔传感器，其特征在于，所述MCM蛋白包括由2个或更多个MCM蛋白单体通过共价或非共价连接而成的蛋白质；
    所述MCM蛋白单体包括：
    1)由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
    2)蛋白质突变体，所述蛋白质突变体的氨基酸序列在SEQ ID NO：1所示的氨基酸 序列的如下至少一个位点发生取代、缺失和/或添加一个或几个氨基酸：318、331、346、359、366、374、404、423、424、430、448、473、488，且所述蛋白质突变体具有相同的结合蛋白和DNA功能、且具有形成纳米孔道功能的能力；
    3)与1)或2)中所述的蛋白质具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少99％同一性，且具有相同的结合蛋白和DNA功能、且具有形成纳米孔道功能的能力的孔蛋白单体；
    优选地，所述MCM蛋白包括由2-10个所述MCM蛋白单体通过共价或非共价连接而成的蛋白质；
    优选地，所述MCM蛋白包括由6个所述MCM蛋白单体通过非共价连接而成的蛋白质；
    优选地，所述MCM蛋白单体含有与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列具有90％以上同一性的核心区域。
  13. 一种纳米孔测序装置，其特征在于，所述纳米孔测序装置包括利用权利要求1至8中任一项所述的方法制备的生物纳米孔传感器、或权利要求9所述的生物纳米孔传感器、或权利要求10至12中任一项所述的生物纳米孔传感器。
  14. 根据权利要求13所述的纳米孔测序装置，其特征在于，所述纳米孔测序装置包括：
    电解槽，所述电解槽含有电解液；
    生物纳米孔传感器，所述生物纳米孔传感器位于所述电解槽的中央，并将所述电解槽及所述电解液分割为正极电解液区和负极电解液区；
    第一电极和第二电极，所述第一电极和所述第二电极分别设置在所述正极电解液区和所述负极电解液区。
  15. 一种测序方法，其特征在于，所述测序方法包括利用权利要求1至8中任一项所述的方法制备的生物纳米孔传感器、或权利要求9所述的生物纳米孔传感器、或权利要求10至12中任一项所述的生物纳米孔传感器、或权利要求13或14所述的纳米孔测序装置，检测并解析待测生物分子通过所述亲水性蛋白的纳米孔道时产生的电信号，确定所述待测生物分子的序列。
  16. 根据权利要求15所述的测序方法，其特征在于，所述亲水性蛋白包括MCM蛋白；
    优选地，所述待测生物分子包括修饰或未修饰的DNA、RNA、或多肽；
    优选地，所述多肽包括多肽单体或多肽聚体；
    优选地，所述电信号包括电流振幅和/或停留时间。
  17. 利用权利要求1至8中任一项所述的方法制备的生物纳米孔传感器、或权利要求9所述的生物纳米孔传感器、或权利要求10至12中任一项所述的生物纳米孔传感器、或权利要求13或14所述的纳米孔测序装置、或权利要求15或16所述的测序方法，在核酸检测、蛋白检测或蛋白构象区分中的应用。
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