WO2023217911A1 - Production de glycosidases a partir d'une source de carbone simple par un microorganisme fongique genetiquement modifie - Google Patents

Production de glycosidases a partir d'une source de carbone simple par un microorganisme fongique genetiquement modifie Download PDF

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WO2023217911A1
WO2023217911A1 PCT/EP2023/062505 EP2023062505W WO2023217911A1 WO 2023217911 A1 WO2023217911 A1 WO 2023217911A1 EP 2023062505 W EP2023062505 W EP 2023062505W WO 2023217911 A1 WO2023217911 A1 WO 2023217911A1
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WO
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glycosidases
carbon source
fungal microorganism
production
simple carbon
Prior art date
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PCT/EP2023/062505
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Peter Jan Punt
Willem Theodoor DE BONTE
Gijsbert Petrus VOSHOL
Virginie NEUGNOT
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Adisseo France S.A.S.
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    • C12Y302/01008—Endo-1,4-beta-xylanase (3.2.1.8)
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    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi

Definitions

  • TITLE PRODUCTION OF GLYCOSIDASES FROM A SIMPLE CARBON SOURCE BY A GENETICALLY MODIFIED FUNGAL MICROORGANISM.
  • the present invention relates to a fungal microorganism genetically modified for the production of glycosidases (EC 3.2.1) in the presence of a simple carbon source and a method for producing glycosidases (EC 3.2.1).
  • Enzymes have long been used industrially for a variety of applications in diverse fields such as the food industry, stationery, textiles, the production of biofuels and detergents... They are particularly widely used in animal nutrition in which they compensate for the absence or insufficiency, in animals, of enzymes capable of hydrolyzing particular chemical bonds or degrading certain complex substrates. They thus make it possible to release molecules easily assimilated by the animal or molecules beneficial to its digestive health, to deconstruct complex molecular networks thus improving the accessibility of nutrients to the animal's endogenous enzymes, to degrade antinutritional factors contained in foods thus limiting their action, to degrade soluble polysaccharides thus reducing the viscosity of the digestive bolus, and, ultimately, improve the digestibility of foods.
  • glycosidases (also called glycoside hydrolases or glycosyl hydrolases) constitute one of the groups of enzymes mainly used in animal nutrition. They catalyze the hydrolysis of glycosidic bonds present in complex sugars, that is to say in large molecules of high molecular weight such as cellulose, hemicelluloses, pectins and starch.
  • glycosidases includes xylanases, arabinofuranosidases, amylases, cellulases, glucanases and even pectinases.
  • Endo-pl,4-xylanases or xylanases are mainly responsible for the hydrolysis of p-1,4 bonds present in the main chain of xylans, which are non-starchy polysaccharides very abundant in nature and main components of hemicelluloses present in plant cell walls. In other words, they catalyze the hydrolysis of (l->4)-pD-xylosidic bonds in xylans to release oligosaccharides.
  • the a-L-arabinofuranosidases (EC 3.2.1.55) are the enzymes involved in the hydrolysis of L-arabinose bonds. In particular, they catalyze the hydrolysis of the non-reducing terminal residues a-L-1,2-, a-L-1,3- and a-L-1,5-arabinofuranosyl of different oligosaccharides and polysaccharides, including arabinoxylans which are major components of the cell walls of plants, thus releasing arabinose molecules and facilitating access of xylanases to the main chain of xylans.
  • Glycosidases are essential enzymes for the degradation of hemicelluloses, one of the main constituents of cell walls in plants. Mammals are, however, not capable of producing these enzymes or at least not in sufficient quantities for effective hydrolysis.
  • the diets used in animal nutrition being rich in plant fibers, it is generally advantageous to provide exogenous glycosidases in the food, in particular for livestock, in order to optimize the use of the fibrous part of the food. the food by the animal and thus improve the growth performance of these livestock.
  • Glycosidases can be produced naturally by many organisms such as plants, algae, gastropods, arthropods, yeasts, fungi, bacteria, protozoa. Their level of production will depend on the level of expression of the genes coding these proteins, expression controlled very precisely by activation and repression mechanisms dependent, among other things, on the carbon source(s). present in their environment. In particular, the presence of a simple carbon source(s), such as glucose, sucrose or even glycerol, will trigger a catabolic repression mechanism (Adnan et al ., 2017; Galinier, 2018). This mechanism, very conserved among microorganisms, allows them to save energy by preventing them from synthesizing superfluous proteins under given conditions.
  • this phenomenon allows microorganisms to preferentially use certain carbon sources.
  • non-preferential carbon sources such as complex carbon sources, will trigger mechanisms to induce the production of enzymes involved in their degradation and catabolism, thus allowing their use by the microorganism.
  • a fungus will grow in a first phase by first assimilating rapidly metabolizable carbon sources, then in a second phase by assimilating non-preferential carbon sources.
  • the mechanisms of repression and induction of gene expression involve numerous transcription factors, essential proteins which interact with the regulatory sequences upstream of genes and with RNA polymerase.
  • the activation or inhibition of these transcription factors is itself dependent on the environment in which the microorganism is found, in particular the carbon sources present.
  • enzymes are essentially produced by fermentation of microorganisms, by so-called batch, fed batch or continuous processes, in a solid or liquid medium, in the presence of appropriate substrates.
  • filamentous fungi are particularly adapted to the secretion of high quantities of enzymes (Wôsten, 2019).
  • One of the major challenges of this production is that it is economically profitable. Consequently, it is preferred to use inexpensive and easy-to-use carbon sources, for example which are in a soluble form, such as glucose and sucrose or even glycerol.
  • these carbon sources induce catabolic repression mechanisms which result in the repression of the expression of genes, in particular those encoding glycosidases such as cellulases and hemicellulases.
  • the solution generally provided to enable enzymes to be produced in the presence of a simple carbon source is to genetically modify the production strain in order to deactivate the catabolic repression mechanisms.
  • creA transcription factor
  • CreA protein which is a highly conserved protein in fungi (different species of Aspergillus, Trichoderma), seems essential for growth, establishing an important role for CreA in the transport of amino acids. and nitrogen assimilation.
  • the inventors have developed, in an unexpected and surprising manner, genetically modified microorganisms, in particular genetically modified filamentous fungi, having an increased capacity to produce enzymes participating in the degradation of a complex carbon source such as glycosidases (EC 3.2 .1), from a simple carbon source, independently of the catabolic repression mechanism, in comparison with the parent microorganisms or microorganisms of the state of the art.
  • a complex carbon source such as glycosidases (EC 3.2 .1)
  • An objective of the present invention is to produce a high titer of glycosidases, in particular hemicellulases, in particular xylanases and/or arabinofuranosidases, from a simple carbon source using a genetically modified microorganism, in particular a fungal microorganism.
  • the present invention relates to a fungal microorganism genetically modified for the production of glycosidases (EC 3.2.1) in the presence of a simple carbon source, a modification of the genome of which comprises, advantageously consists of, inactivation, alteration or deletion of the expression:
  • sequence SEQ ID NO: 2 a sequence presenting at least 65% or even 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% or even 99% identity with the peptide sequence of sequence SEQ ID NO: 2.
  • a genetically modified fungal microorganism according to the invention or implemented in a use or a process according to the invention is genetically modified to circumvent the catabolic repression mechanism naturally present in fungal microorganisms, for example in filamentous fungi, according to which, if a simple carbon source such as glucose is present in the medium, the microorganism “saves its strength” by stopping the synthesis of enzymes, such as glycosidases, involved in the degradation of more complex substrates.
  • the fungal microorganism does not naturally have a capacity to produce glycosidases from a simple carbon source and the genetic modifications made aim to confer this capacity on it.
  • the present invention therefore presents various advantages, in particular:
  • the expression "genetically modified microorganism” means that the microorganism according to the invention is not found in nature and is modified by introduction of new genetic elements and/or by deletion and/or modification of endogenous genetic elements of the microorganism. This modification can be generated by genome editing techniques, in vivo evolution, genomic recombination, directed or random mutagenesis or any other strain engineering technique known to those skilled in the art.
  • the terms “inactivation” and “alteration” and “deletion” are used interchangeably and refer to the absence of production of the corresponding protein or the production of a non-functional corresponding protein obtained, by for example, for the implementation of the gene silencing technique corresponding to transcriptional gene silencing or post-transcriptional gene silencing, by the introduction of a mutation in the promoter sequence which controls the expression of the gene coding for said protein and/or in the coding sequence for said protein, by shifting the reading frame causing the introduction of an early stop codon in the coding sequence for the protein or by deletion of the gene coding for the promoter which controls the expression of the gene coding for said protein and/or of the gene coding for said protein.
  • the terms “identical” and “homologous” are used interchangeably and refer to the sequence identity between two polypeptides. When a position in each of the two compared sequences is occupied by the same monomeric amino acid subunit, then the molecules are homologous or identical for that position.
  • the percentage identity between two sequences is a function of the number of corresponding positions shared by the two sequences, and corresponds to this number divided by the number of positions compared and multiplied by 100. For example, if 6 out of 10 of the positions in two sequences matched are identical, then the two sequences are 60% identical. Typically, the comparison is performed by aligning the two sequences to give maximum homology/identity.
  • coding or “coding for”, “code” or “code for” are used interchangeably and refer to the inherent property of specific nucleotide sequences in a polynucleotide, such as a gene, cDNA or mRNA, to serve as a template for the synthesis of other polymers having a defined sequence of amino acids, and the biological properties which result therefrom.
  • a gene encodes a protein if transcription and translation of the mRNA corresponding to that gene produces the protein in a cell or other biological system.
  • Both the coding strand, whose nucleotide sequence is identical to the mRNA sequence and which is generally described in sequence listings and databases, and the non-coding strand, used as a template for the transcription of a gene or cDNA, may be designated as encoding the protein or other product of this gene or cDNA.
  • the expression “simple carbon source” designates a nutrient providing the carbon necessary for the production of enzymes according to the invention.
  • This so-called “simple” carbon source is a molecule of small size and low molecular weight, that is to say a molecular weight less than or equal to 500 g/mol, such as a monosaccharide, a disaccharide or even a polyol .
  • a “simple carbon source” is opposed to a “complex carbon source” which corresponds to a molecule of large size and higher molecular weight, that is to say a molecular weight greater than 500 g/mol.
  • the expression “inducing substrate” designates an inducing carbon source for the production of enzymes according to the invention. Furthermore, this inducing carbon source is not the total carbon source for the production of said enzymes.
  • the subject of the present invention is a fungal microorganism genetically modified for the production of glycosidases (EC 3.2.1) in the presence of a simple carbon source as defined having the following technical characteristics, taken alone or in combination:
  • the fungal microorganism is selected from the Ascomycetes
  • the fungal microorganism is selected from the group consisting of the class Eurotiomycetes or Sordariomycetes;
  • the fungal microorganism is selected from the group consisting of the family Trichocomaceae, Aspergillaceae or Hypocreaceae;
  • the fungal microorganism is selected from the group consisting of the genus Talaromyces, Aspergillus, Trichoderma or Penicillium;
  • the fungal microorganism is selected from the group consisting of the species Talaromyces versatilis, Talaromyces cellulolyticus, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus nidulans, Trichoderma reesei or Penicillium chrysogenum;
  • the fungal microorganism is a filamentous fungus
  • the fungal microorganism has a “wild” genotype, that is to say that it is a microorganism in its natural/reference form, which consists of the presence of a standard allele at the level of a given locus;
  • the fungal microorganism has a “mutated” or “mutant” genotype, that is to say that it is a microorganism which is not in its natural/reference form, which consists of the presence of an allele different from the standard allele at a given locus.
  • the genetically modified fungal microorganism according to the invention is capable of growing in the presence of a simple carbon source, advantageously as the sole carbon source.
  • the simple carbon source according to the invention comprises, advantageously consists of, a monosaccharide and/or a disaccharide and/or a polyol, preferably glucose, sucrose, lactose, glycerol or mixtures thereof, more preferably glucose.
  • Modification of the genome of the fungal microorganism according to the invention unexpectedly makes it possible to induce production of enzymes involved in the degradation of complex sugars, such as glycosidases (EC 3.2.1), in particular hemicellulases, in particular xylanases. and/or arabinofuranosidases, in the presence of a simple carbon source generally known as an activator of catabolic repression mechanisms.
  • complex sugars such as glycosidases (EC 3.2.1), in particular hemicellulases, in particular xylanases. and/or arabinofuranosidases
  • the genetically modified fungal microorganism of the invention induces a production of glycosidases (EC 3.2.1) in the presence of a second simple or complex substrate called “inducing substrate” (the inducing substrate is different from a simple carbon source in the sense of the invention in particular in terms of function and/or activity with regard to the growth of the microorganism of the invention), such as xylose, oligoxyloses, xylans, hemicelluloses, cellulose or their mixtures, said substrate inducer being present in the culture medium in a small proportion, that is to say a proportion lower than that of the simple carbon source.
  • the proportion of inducing substrate is not renewed in the culture medium after its consumption by the microorganism of the invention.
  • a rapidly assimilable carbon source for the growth of the genetically modified fungal microorganism according to the invention i.e. a simple carbon source, in particular soluble, such as glucose and/or sucrose
  • an inducing substrate e.g. xylose
  • the genetically modified fungal microorganism according to the invention in particular a filamentous fungus, can be used for the production of glycosidases (EC 3.2.1) by aerobic fermentation in a solid or liquid medium.
  • glycosidases EC 3.2.1
  • the process for producing glycosidases according to the invention comprises the following steps:
  • (d) carry out the fermentation for at least 12 hours, advantageously at least 24 hours, or even at least 48 hours or at least 72 hours, preferably at least 96 hours, preferably between 12 hours and 300 hours, in particular between 24 hours and 300 hours, in fueling with a simple carbon source.
  • the subject of the present invention is a process for producing glycosidases (EC 3.2.1) as defined above having the following technical characteristics, taken alone or in combination:
  • - glycosidases (EC 3.2.1) are hemicellulases, in particular xylanases and/or arabinofuranosidases
  • the simple carbon source comprises a monosaccharide and/or a disaccharide and/or a polyol, preferably glucose, sucrose, lactose, glycerol or mixtures thereof, more preferably glucose;
  • the simple carbon source consists of a monosaccharide and/or a disaccharide and/or a polyol, preferably glucose, sucrose, lactose, glycerol or their mixtures, more preferably glucose;
  • the inducing substrate is selected from the group consisting of xylose, a xylose polymer, cellulose, hemicellulose, xylan and their mixtures;
  • the simple carbon source is present in a concentration greater than that of the inducing substrate
  • the simple carbon source is present in a concentration equal to that of the inducing substrate
  • the simple carbon source is present in a concentration strictly greater than that of the inducing substrate
  • the simple carbon source is included in the culture medium at a concentration between 10 and 60 g/L of culture medium, preferably between 10 and 30 g/L;
  • the inducing substrate is included in the culture medium at a concentration of between 5 and 60 g/L of culture medium, preferably between 5 and 30 g/L;
  • the at least one source of nitrogen is, for example, ammonium sulfate, ammonium phosphate or their mixture;
  • the at least one source of nitrogen is included in the culture medium at a concentration of, for example, between 0.1 and 5% of the total mass of the culture medium, advantageously between 0.1 and 2% of the total mass of the culture medium;
  • the minerals included in the culture medium according to step (a) are, for example ammonium sulfate, advantageously in a concentration of between 0.5 and 3% of the total mass of the culture medium; potassium phosphate; calcium chloride; magnesium sulfate; copper sulfate; iron sulfate; manganese sulfate; zinc sulfate and their mixtures;
  • the nutrients included in the culture medium according to step (a) are, for example, cell growth factors;
  • step (d) - feeding with a simple carbon source according to step (d) is carried out in continuous, semi-continuous or discontinuous mode;
  • the method of the invention further comprises a step (e) aimed at recovering the culture supernatant containing the glycosidases, said recovery being a continuous withdrawal or not;
  • the process of the invention further comprises a step (e) carried out by centrifugation or ultrafiltration.
  • FIG. 1 Xylanase activity of a strain according to the invention and of a wild strain during 72 hours of fermentation in a culture medium comprising glucose as the sole source of simple carbon.
  • the xylanase activity (expressed in U DNS/g of culture supernatant) was determined in the fermentation medium after 0 hours, 48 hours and 72 hours of fermentation in a medium comprising glucose at a concentration of 11 g/L of culture centre.
  • FIG. 2 Arabinofuranosidase activity of a strain according to the invention and of a wild strain during 72 hours of fermentation in a culture medium comprising glucose as the only source of simple carbon.
  • Arabinofuranosidase activity was determined in the fermentation medium after 72 hours of fermentation in a medium comprising glucose at a concentration of 11 g/L of culture medium.
  • the Talaromyces versatilis strain Tr3864 was obtained by genetic modification of the Talaromyces versatilis strain IMI 378536. Mutations were introduced into the gene consisting of the nucleotide sequence SEQ. ID NO: 1 by genome editing tools so as to create a shift in the reading frame and the introduction of a stop codon resulting in the production of a truncated and non-functional peptide. strain versatilis Tr3864 grown in the presence of
  • the fungus according to the invention i.e. strain Talaromyces versatilis Tr3864, is pre-cultured in an Erlenmeyer flask in order to produce sufficient biomass for inoculation of the fermenter.
  • the preculture medium consists of a simple carbon source (glucose) and a nitrogen nutrient source (Corn Steep Liquor).
  • the duration of the preculture is approximately 25 hours.
  • the fermenter is inoculated with the preculture at a rate of 5% (v/v).
  • the fermentation medium consists of a single source of simple carbon (glucose), an inducer (mixture of cellulose and hemicelluloses), several sources of nitrogen (sulfate ammonium, diammonium phosphate, Corn Steep Liquor), minerals (CaCL, KH2PO4, MgSCU), and trace elements (MnSCU, FeSCU, ZnSCU).
  • the temperature is 30°C
  • the pH is 4
  • agitation varies between 500 and 950 rpm
  • aeration is 75 L/h.
  • a glucose feed is implemented. This supply is continuous, at a rate of between 1 and 2 grams of glucose/hour/Liter.
  • the culture is continued for a total duration of approximately 72 hours.
  • the xylanase activity of the culture supernatant was evaluated by the dinitrosalicylic acid (DNS) assay method. This method consists of incubating a diluted solution of the fermentation supernatant in the presence of beech xylan for 10 minutes at 50°C. Xylanase cuts the xylan chain (composed of xyloses) into shorter chains or oligosaccharides and thus releases reducing ends or reducing xyloses.
  • DMS dinitrosalicylic acid
  • the DNS attaches to the reducing oses revealing a yellow-orange color proportional to the quantity of reduced oses and measurable with the spectrophotometer at 540 nm. Each measurement is carried out in duplicate. Quantification is carried out using a standard range of xylose, a reducing sugar.
  • the biomass was separated from the supernatant by centrifugation.
  • the arabinofuranosidase activity of the culture supernatant was evaluated by hydrolysis of an arabinoxylan substrate followed by a determination of the arabinose released by anion exchange chromatography.
  • a diluted solution of the fermentation supernatant is incubated in the presence of wheat xylan for 15 minutes at 50°C.
  • Arabinofuranosidase is capable of hydrolyzing the saccharide bonds between the branched arabinofuranosides and the main xylan chain.
  • a filamentous fungus genetically modified according to the invention to alter the gene consisting of the nucleotide sequence SEQ. ID NO: 1 ensures efficient production of xylanases (EC 3.2.1.8) and arabinofuranosidases (EC 3.2.1.55) in the presence of a simple, inexpensive carbon source (i.e. glucose).
  • a simple, inexpensive carbon source i.e. glucose
  • this microorganism shows no alteration in its viability or colony morphology.
  • the present invention ensures efficient growth of the microorganism without disrupting the transport of amino acids and the assimilation of nitrogen.

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Abstract

La présente invention concerne un microorganisme fongique génétiquement modifié pour la production de glycosidases (EC 3.2.1) en présence d'une source de carbone simple et un procédé de production de glycosidases (EC 3.2.1).

Description

TITRE : PRODUCTION DE GLYCOSIDASES A PARTIR D'UNE SOURCE DE CARBONE SIMPLE PAR UN MICROORGANISME FONGIQUE GENETIQUEMENT MODIFIE.
DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention concerne un microorganisme fongique génétiquement modifié pour la production de glycosidases (EC 3.2.1) en présence d'une source de carbone simple et un procédé de production de glycosidases (EC 3.2.1).
ETAT DE LA TECHNIQUE
Les enzymes sont depuis longtemps utilisées industriellement pour une variété d'applications dans des domaines divers tels que l'agro-alimentaire, la papèterie, les textiles, la production de biocarburants et de détergents ... Elles sont en particulier largement utilisées en nutrition animale dans laquelle elles viennent pallier l'absence ou l'insuffisance, chez l'animal, d'enzymes capables d'hydrolyser des liaisons chimiques particulières ou de dégrader certains substrats complexes. Elles permettent ainsi de libérer des molécules facilement assimilables par l'animal ou des molécules bénéfiques à sa santé digestive, de déconstruire des maillages moléculaires complexes améliorant ainsi l'accessibilité des nutriments aux enzymes endogènes de l'animal, de dégrader des facteurs antinutritionnels contenus dans les aliments limitant ainsi leur action, de dégrader des polysaccharides solubles diminuant ainsi la viscosité du bol digestif, et, in fine, améliorent la digestibilité des aliments.
Outre les phytases et les protéases, les glycosidases (également appelées glycoside hydrolases ou glycosyl hydrolases) constituent un des groupes d'enzymes majoritairement utilisés en alimentation animale. Elles catalysent l'hydrolyse des liaisons glycosidiques présentent dans les sucres complexes, c'est-à-dire dans des molécules de grandes tailles et de poids moléculaire élevé tels que la cellulose, les hémicelluloses, les pectines et l'amidon.
Le groupe des glycosidases comprend les xylanases, les arabinofuranosidases, les amylases, les cellulases, les glucanases ou encore les pectinases.
Les endo-p-l,4-xylanases ou xylanases (EC 3.2.1.8) sont principalement responsables de l'hydrolyse des liaisons p-1,4 présentes dans la chaîne principale des xylanes, qui sont des polysaccharides non amylacés très abondants dans la nature et composants principaux des hémicelluloses présentes dans les parois cellulaires des plantes. En d'autres termes, elles catalysent l'hydrolyse des liaisons (l->4)-p-D-xylosidiques dans les xylanes pour libérer des oligosaccharides.
Les a-L-arabinofuranosidases (EC 3.2.1.55) sont les enzymes impliquées dans l'hydrolyse des liaisons L-arabinose. En particulier, elles catalysent l'hydrolyse des résidus terminaux non réducteurs a-L-1,2-, a-L-1,3- et a-L-l,5-arabinofuranosyl de différents oligosaccharides et polysaccharides, dont les arabinoxylanes qui sont des composants majeurs des parois cellulaires des plantes, libérant ainsi des molécules d'arabinose et facilitant l'accès des xylanases à la chaîne principale des xylanes.
Les glycosidases, en particulier les xylanases et les arabinofuranosidases, sont des enzymes essentielles à la dégradation des hémicelluloses, l'un des constituants principaux des parois cellulaires chez les plantes. Les mammifères ne sont cependant pas aptes à produire ces enzymes ou en tout cas pas en quantité suffisante pour une hydrolyse efficace. Les régimes utilisés en nutrition animale étant riches en fibres végétales, il est généralement avantageux d'apporter des glycosidases exogènes dans l'aliment, en particulier pour les animaux d'élevage, et ceci afin d'optimiser l'utilisation de la part fibreuse de l'aliment par l'animal et ainsi améliorer les performances de croissance de ces animaux d'élevage.
Les glycosidases peuvent être produites naturellement par de nombreux organismes comme des plantes, des algues, des gastropodes, des arthropodes, des levures, des champignons, des bactéries, des protozoaires. Leur niveau de production va dépendre du niveau d'expression des gènes codant ces protéines, expression contrôlée de manière très précise par des mécanismes d'activation et de répression dépendants, entre autres, de la (des) source(s) carbonée(s) présente(s) dans leur environnement. En particulier, la présence d'une (de) source(s) carbonée(s) simple(s), telle(s) que le glucose, le saccharose ou encore le glycérol, va déclencher un mécanisme de répression catabolique (Adnan et al., 2017 ; Galinier, 2018). Ce mécanisme, très conservé chez les microorganismes, leur permet une économie d'énergie en leur évitant de synthétiser des protéines superflues dans des conditions données. En d'autres termes, ce phénomène permet aux microorganismes d'utiliser préférentiellement certaines sources de carbone. Lorsque la source de carbone simple n'est plus disponible, et donc lorsque la répression catabolique est levée, les sources de carbone non préférentielles, telles que les sources carbonées complexes, vont déclencher des mécanismes d'induction de la production des enzymes impliquées dans leur dégradation et leur catabolisme, permettant ainsi leur utilisation par le microorganisme. Par exemple, un champignon va croître dans une première phase en assimilant d'abord les sources de carbone rapidement métabolisables, puis dans une seconde phase en assimilant les sources de carbone non préférentielles.
Les mécanismes de répression et d'induction de l'expression des gènes mettent en jeu de nombreux facteurs de transcription, protéines indispensables qui interagissent avec les séquences régulatrices en amont des gènes et avec l'ARN-polymérase. L'activation ou l'inhibition de ces facteurs de transcription est elle-même dépendante de l'environnement dans lequel se trouve le microorganisme, notamment des sources carbonées présentes.
Chez les champignons filamenteux plusieurs facteurs de transcription, tels que XlnR, AraR, ClrA, ClrB, ManR, et AraA, ont été décrits comme étant des régulateurs positifs de l'expression de gènes codant les glycosidases, alors que CreA et ACEI sont les principaux régulateurs négatifs identifiés.
A l'échelle industrielle, les enzymes sont essentiellement produites par fermentation de microorganismes, par des procédés dits batch, fed batch ou continus, en milieu solide ou liquide, en présence de substrats appropriés. Parmi ces microorganismes, les champignons filamenteux sont particulièrement adaptés à la sécrétion de quantités élevées d'enzymes (Wôsten, 2019). Un des enjeux majeurs de cette production est qu'elle soit économiquement rentable. Par conséquent, il est privilégié la mise en œuvre de sources carbonées peu chères et faciles à utiliser, par exemple qui se présentent sous une forme soluble, telles que le glucose et le saccharose ou encore le glycérol. Cependant, ces sources de carbone induisent dans la plupart des organismes les mécanismes de répression catabolique qui ont pour effet la répression de l'expression de gènes, en particulier ceux codant les glycosidases comme les cellulases et hémicellulases.
La solution généralement apportée pour permettre de produire des enzymes en présence d'une source de carbone simple est de modifier génétiquement la souche de production afin de désactiver les mécanismes de répression catabolique. Généralement, ceci consiste à désactiver le facteur de transcription creA, qui est un élément majeur dans la répression catabolique, ou à désactiver l'expression du gène codant correspondant. Cependant, des études montrent qu'une délétion complète et/ou partielle du gène creA induit des effets délétères comme une réduction sévère de la viabilité chez Aspergillus nidulans ou encore une altération de la morphologie des colonies, du développement d'hyphes aériens et de la sporulation chez Trichoderma reesei. Il apparaît donc qu'une région spécifique de la protéine CreA, qui est une protéine très conservée chez les champignons (différentes espèces d' Aspergillus, Trichoderma), semble essentielle pour la croissance, établissant un rôle important de CreA dans le transport des acides aminés et l'assimilation de l'azote.
Il ressort de ce qui précède qu'il existe un besoin évident de développer de nouvelles solutions techniques permettant une production efficace de glycosidases, notamment à l'échelle industrielle, ne présentant pas les inconvénients de l'art antérieur tels qu'une production coûteuse, longue et/ou dépendante de la présence dans le milieu de culture d'une source de carbone adaptée.
DESCRIPTION DE L'INVENTION
Les inventeurs ont mis au point, de manière inattendue et surprenante, des microorganismes génétiquement modifiés, notamment des champignons filamenteux génétiquement modifiés, ayant une capacité accrue à produire des enzymes participant à la dégradation d'une source de carbone complexe comme les glycosidases (EC 3.2.1), à partir d'une source de carbone simple, indépendamment du mécanisme de répression catabolique, ceci en comparaison avec les microorganismes parents ou des microorganismes de l'état de la technique.
Un objectif de la présente invention est de produire un titre élevé de glycosidases, notamment les hémicellulases, en particulier les xylanases et/ou arabinofuranosidases, à partir d'une source de carbone simple en utilisant un microorganisme génétiquement modifié, en particulier un microorganisme fongique.
Ainsi, la présente invention concerne un microorganisme fongique génétiquement modifié pour la production de glycosidases (EC 3.2.1) en présence d'une source de carbone simple, dont une modification du génome comprend, avantageusement consiste en, l'inactivation, l'altération ou la délétion de l'expression :
- du gène consistant en la séquence nucléotidique présentée par la séquence SEQ ID NO: 1 ;
- d'une séquence nucléotidique codant la séquence peptidique présentée par la séquence SEQ. ID NO: 2 ; ou
- d'une séquence présentant au moins 65% voire 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou même 99% d'identité avec la séquence peptidique de séquence SEQ ID NO: 2.
Cette modification a pour conséquence l'absence de production de la protéine correspondante ou la production d'une protéine non fonctionnelle ou encore la production d'une protéine tronquée et donc non fonctionnelle.
Un microorganisme fongique modifié génétiquement selon l'invention ou mis en œuvre dans une utilisation ou un procédé selon l'invention est modifié génétiquement pour contourner le mécanisme de répression catabolique présent naturellement chez les microorganismes fongiques, par exemple chez les champignons filamenteux, selon lequel, si une source de carbone simple comme du glucose est présente dans le milieu, le microorganisme « économise ses forces » en stoppant la synthèse des enzymes, comme les glycosidases, impliquées dans la dégradation de substrats plus complexes.
Selon l'invention, le microorganisme fongique ne présente pas naturellement une capacité à produire des glycosidases à partir d'une source de carbone simple et les modifications génétiques apportées ont pour but de lui conférer cette capacité.
La présente invention présente donc divers avantages, notamment :
- un intérêt industriel pour la production d'enzymes impliquées dans l'alimentation des animaux, notamment des animaux d'élevage, sans altération de la viabilité et de la morphologie du microorganisme ;
- un intérêt économique via l'utilisation d'une source de carbone simple peu coûteuse et soluble ;
- une bio-production efficace de glycosidases par des microorganismes à des rendements industriels.
Dans le cadre de l'invention, l'expression « microorganisme modifié génétiquement » signifie que le microorganisme selon l'invention ne se trouve pas dans la nature et est modifié par introduction de nouveaux éléments génétiques et/ou par délétion et/ou modification des éléments génétiques endogènes du microorganisme. Cette modification peut être générée par les techniques d'édition du génome, d'évolution in vivo, de recombinaison génomique, de mutagénèse dirigée ou aléatoire ou tout autre technique d'ingénierie des souches connue de l'Homme du métier.
Dans le cadre de l'invention, les termes « inactivation » et « altération » et « délétion » sont utilisés indifféremment et se réfèrent à l'absence de production de la protéine correspondante ou la production d'une protéine correspondante non fonctionnelle obtenue, par exemple, par la mise en œuvre de la technique d'extinction de gène (gene silencing) correspondant à une extinction transcriptionnelle (transcriptional gene silencing) ou post-transcriptionnelle (post transcriptional gene silencing), par l'introduction d'une mutation dans la séquence du promoteur qui contrôle l'expression du gène codant pour ladite protéine et/ou dans la séquence codante pour ladite protéine, par le décalage du cadre de lecture à l'origine de l'introduction d'un codon stop précoce dans la séquence codante pour la protéine ou encore par la délétion du gène codant pour le promoteur qui contrôle l'expression du gène codant pour ladite protéine et/ou du gène codant pour ladite protéine.
Dans le cadre de l'invention, les termes « identique » et « homologue » sont utilisés indifféremment et se réfèrent à l'identité de séquence entre deux polypeptides. Quand une position dans chacune des deux séquences comparées est occupée par la même sous-unité monomère d'acide aminé, alors les molécules sont homologues ou identiques pour cette position. Le pourcentage d'identité entre deux séquences est fonction du nombre de positions correspondant partagées par les deux séquences, et correspond à ce nombre divisé par le nombre de positions comparées et multiplié par 100. Par exemple, si 6 sur 10 des positions dans deux séquences appariées sont identiques, alors les deux séquences sont identiques à 60%. En règle générale, la comparaison est effectuée en alignant les deux séquences de façon à donner une homologie/identité maximale.
Les termes « codant » ou « codant pour », « code » ou « code pour » sont utilisés indifféremment et se réfèrent à la propriété inhérente aux séquences spécifiques de nucléotides dans un polynucléotide, tel qu'un gène, un ADNc ou un ARNm, à servir de matrice pour la synthèse d'autres polymères ayant une séquence définie d'acides aminés, et les propriétés biologiques qui en découlent. Ainsi, un gène code pour une protéine si la transcription et la traduction de l'ARNm correspondant à ce gène produisent la protéine dans une cellule ou un autre système biologique. Tant le brin codant, dont la séquence nucléotidique est identique à la séquence d'ARNm et qui est généralement décrite dans les listages de séquences et bases de données, que le brin non codant, utilisé comme matrice pour la transcription d'un gène ou de l'ADNc, peuvent être désignés comme codant pour la protéine ou un autre produit de ce gène ou ADNc.
Dans le cadre de la présente invention, l'expression « source de carbone simple » désigne un nutriment fournissant le carbone nécessaire à la production d'enzymes selon l'invention. Cette source de carbone dite « simple » est une molécule de petite taille et de faible poids moléculaire, c'est-à-dire un poids moléculaire inférieur ou égale à 500 g/mol, tel qu'un monosaccharide, un diholoside ou encore un polyol. Selon l'invention, une « source de carbone simple » s'oppose à une « source de carbone complexe » qui correspond à une molécule de grande taille et de poids moléculaire plus élevé, c'est-à-dire un poids moléculaire supérieur à 500 g/mol.
Dans le cadre de la présente invention, l'expression « substrat inducteur » désigne une source de carbone inductrice pour la production d'enzymes selon l'invention. En outre, cette source de carbone inductrice n'est pas la source de carbone totale pour la production desdites enzymes.
De préférence, la présente invention a pour objet un microorganisme fongique modifié génétiquement pour la production de glycosidases (EC 3.2.1) en présence d'une source de carbone simple tel que défini présentant les caractéristiques techniques suivantes, prises seules ou en combinaison :
- le microorganisme fongique est sélectionné parmi les Ascomycètes ;
- le microorganisme fongique est sélectionné dans le groupe constitué par la classe des Eurotiomycetes ou Sordariomycètes ;
- le microorganisme fongique est sélectionné dans le groupe constitué par la famille des Trichocomaceae, Aspergillaceae ou Hypocreaceae ;
- le microorganisme fongique est sélectionné dans le groupe constitué par le genre Talaromyces, Aspergillus, Trichoderma ou Pénicillium ;
- le microorganisme fongique est sélectionné dans le groupe constitué par l'espèce Talaromyces versatilis, Talaromyces cellulolyticus, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus nidulans, Trichoderma reesei ou Pénicillium chrysogenum ;
- le microorganisme fongique est un champignon filamenteux ;
- le microorganisme fongique est Talaromyces versatilis;
- le microorganisme fongique présente un génotype « sauvage », c'est-à-dire qu'il s'agit d'un microorganisme sous sa forme naturelle/de référence, qui consiste en la présence d'un allèle standard au niveau d'un locus donné ;
- le microorganisme fongique présente un génotype « muté » ou « mutant », c'est-à-dire qu'il s'agit d'un microorganisme qui n'est pas sous sa forme naturelle/de référence, qui consiste en la présence d'un allèle différent de l'allèle standard au niveau d'un locus donné. Le microorganisme fongique génétiquement modifié selon l'invention est apte à croître en présence d'une source de carbone simple, avantageusement, comme unique source de carbone. La source de carbone simple selon l'invention comprend, avantageusement consiste en, un monosaccharide et/ou un diholoside et/ou un polyol, de préférence le glucose, le saccharose, le lactose, le glycérol ou leurs mélanges, plus préférentiellement le glucose.
La modification du génome du microorganisme fongique selon l'invention permet de manière inattendue d'induire une production d'enzymes intervenant dans la dégradation de sucres complexes, telles que les glycosidases (EC 3.2.1), notamment les hémicellulases, en particulier les xylanases et/ou arabinofuranosidases, en présence d'une source de carbone simple généralement connue comme activatrice des mécanismes de répression catabolique.
Le microorganisme fongique génétiquement modifié de l'invention induit une production de glycosidases (EC 3.2.1) en présence d'un second substrat simple ou complexe dit « substrat inducteur » (le substrat inducteur est différent d'une source simple de carbone au sens de l'invention notamment en terme de fonction et/ou d'activité au regard de la croissance du microorganisme de l'invention), tel que le xylose, les oligoxyloses, les xylanes, les hémicelluloses, la cellulose ou leurs mélanges, ledit substrat inducteur étant présent dans le milieu de culture dans une faible proportion, c'est-à-dire une proportion inférieure à celle de la source de carbone simple. Avantageusement, la proportion de substrat inducteur n'est pas renouvelée dans le milieu de culture après sa consommation par le microorganisme de l'invention.
Dans le but d'obtenir de bonnes productivités en enzymes, il est nécessaire d'apporter une source de carbone rapidement assimilable pour la croissance du microorganisme fongique modifié génétiquement selon l'invention (i.e. une source de carbone simple, notamment soluble, telle que le glucose et/ou le saccharose) et un substrat inducteur (e.g. le xylose) qui permette l'expression des glycosidases selon l'invention et la sécrétion dans le milieu de culture.
Le microorganisme fongique modifié génétiquement selon l'invention, en particulier un champignon filamenteux, peut être mis en œuvre pour la production de glycosidases (EC 3.2.1) par fermentation aérobie en milieu solide ou liquide.
Le procédé de production de glycosidases selon l'invention comprend les étapes suivantes:
(a) préparer un milieu de culture contenant au moins une source de carbone simple, un substrat inducteur pour la production des glycosidases, au moins une source d'azote, ainsi que l'ensemble des minéraux et nutriments nécessaires à la croissance du microorganisme fongique de l'invention, tel que décrit précédemment, pour la production de biomasse et de protéines ;
(b) ensemencer le milieu de fermentation avec une souche de microorganisme fongique modifié génétiquement selon l'invention;
(c) contrôler et maintenir la température du milieu de fermentation à une valeur comprise entre 25°C et 34°C, le pH du milieu de fermentation à une valeur comprise entre 3,5 et 5 et une pression partielle en oxygène (PO2) supérieure à 30%; et
(d) conduire la fermentation pendant au moins 12h, avantageusement au moins 24h, voire au moins 48h ou au moins 72h, de préférence au moins 96 heures, préférentiellement entre 12 heures et 300 heures, en particulier entre 24 heures et 300 heures, en alimentant avec une source de carbone simple.
De préférence, la présente invention a pour objet un procédé de production de glycosidases (EC 3.2.1) tel que défini précédemment présentant les caractéristiques techniques suivantes, prises seules ou en combinaison :
- les glycosidases (EC 3.2.1) sont des hémicellulases, en particulier les xylanases et/ou les arabinofuranosidases
- la source de carbone simple comprend un monosaccharide et/ou un diholoside et/ou un polyol, de préférence le glucose, le saccharose, le lactose, le glycérol ou leurs mélanges, plus préférentiellement le glucose ;
- la source de carbone simple consiste en un monosaccharide et/ou un diholoside et/ou un polyol, de préférence le glucose, le saccharose, le lactose, le glycérol ou leurs mélanges, plus préférentiellement le glucose ;
- le substrat inducteur est sélectionné dans le groupe constitué par le xylose, un polymère de xylose, la cellulose, l'hémicellulose, le xylane et leurs mélanges ;
- dans le milieu de culture, la source de carbone simple est présente dans une concentration supérieure à celle du substrat inducteur ;
- dans le milieu de culture, la source de carbone simple est présente dans une concentration égale à celle du substrat inducteur ;
- dans le milieu de culture, la source de carbone simple est présente dans une concentration strictement supérieure à celle du substrat inducteur ;
- la source de carbone simple est comprise dans le milieu de culture à une concentration comprise entre 10 et 60 g/L de milieu de culture, de préférence entre 10 et 30 g/L ;
- le substrat inducteur est compris dans le milieu de culture à une concentration comprise entre 5 et 60 g/L de milieu de culture, de préférence entre 5 et 30 g/L ;
- la au moins une source d'azote est, par exemple, le sulfate d'ammonium, le phosphate d'ammonium ou leur mélange ;
- la au moins une source d'azote est comprise dans le milieu de culture à une concentration comprise, par exemple, entre 0,1 et 5% de la masse totale du milieu de culture, avantageusement entre 0,1 et 2% de la masse totale du milieu de culture ;
- les minéraux compris dans le milieu de culture selon l'étape (a) sont, par exemple le sulfate d'ammonium, avantageusement dans une concentration comprise entre 0,5 et 3% de la masse totale du milieu de culture ; le phosphate de potassium ; le chlorure de calcium ; le sulfate de magnésium ; le sulfate de cuivre ; le sulfate de fer ; le sulfate de manganèse ; le sulfate de zinc et leurs mélanges ;
- les nutriments compris dans le milieu de culture selon l'étape (a) sont, par exemple, des facteurs de croissance cellulaire ;
- l'alimentation avec une source de carbone simple selon l'étape (d) est effectuée en mode continu, semi-continu ou discontinu ; et
- le procédé de l'invention comprend, en outre, une étape (e) visant à récupérer le surnageant de culture contenant les glycosidases, ladite récupération étant un soutirage continu ou non ;
- le procédé de l'invention comprend, en outre, une étape (e) effectuée par centrifugation ou ultrafiltration.
Figures :
[Fig. 1] : Activité xylanase d'une souche selon l'invention et d'une souche sauvage pendant 72 heures de fermentation en milieu de culture comprenant du glucose comme seule source de carbone simple.
L'activité xylanase (exprimée en U DNS/g de surnageant de culture) a été déterminée dans le milieu de fermentation après 0 heure, 48 heures et 72 heures de fermentation dans un milieu comprenant du glucose à une concentration de 11 g/L de milieu de culture.
[Fig. 2] : Activité arabinofuranosidases d'une souche selon l'invention et d'une souche sauvage pendant 72 heures de fermentation en milieu de culture comprenant du glucose comme seule source de carbone simple.
L'activité arabinofuranosidase (exprimée en U /mL de surnageant de culture) a été déterminée dans le milieu de fermentation après 72 heures de fermentation dans un milieu comprenant du glucose à une concentration de 11 g/L de milieu de culture
La présente invention est illustrée de manière non limitative par les exemples suivants.
EXEMPLES DE REALISATION
Figure imgf000012_0001
filamenteux selon l'invention
1. Souche
Figure imgf000012_0002
versatilis Tr3864
La souche Talaromyces versatilis Tr3864 a été obtenue par modification génétique de la souche Talaromyces versatilis IMI 378536. Des mutations ont été introduites dans le gène consistant en la séquence nucléotidique SEQ. ID NO : 1 par des outils d'édition du génome de façon à créer un décalage du cadre de lecture et l'introduction d'un codon stop ayant pour conséquence la production d'un peptide tronqué et non fonctionnel.
Figure imgf000012_0003
la souche
Figure imgf000012_0004
versatilis Tr3864 cultivée en présence de
Figure imgf000012_0005
1. Culture du
Figure imgf000012_0006
en fermenteur
Préalablement à la fermentation, le champignon selon l'invention, i.e. souche Talaromyces versatilis Tr3864, fait l'objet d'une préculture en fiole Erlenmeyer afin de produire une biomasse suffisante à l'inoculation du fermenteur. Le milieu de préculture est constitué d'une source de carbone simple (glucose) et d'une source nutritive azotée (Corn Steep Liquor).
La durée de la préculture est d'environ 25 heures.
A l'issue de cette préculture, le fermenteur est inoculé avec la préculture à un taux de 5% (v/v).
Le milieu de fermentation est constitué d'une seule source de carbone simple (glucose), d'un inducteur (mélange de cellulose et hémicelluloses), de plusieurs sources d'azote (sulfate d'ammonium, phosphate de diammonium, Corn Steep Liquor), de minéraux (CaCL, KH2PO4, MgSCU), et d'éléments traces (MnSCU, FeSCU, ZnSCU).
Parmi les principaux paramètres de la culture qui sont régulés, la température est de 30°C, le pH est de 4, l'agitation varie entre 500 et 950 rpm, et l'aération est de 75 L/h.
Après environ 24 heures de croissance, une alimentation de glucose est mise en œuvre. Cette alimentation est continue, à un débit compris entre 1 et 2 grammes de glucose/heure/Litre.
La culture est poursuivie jusqu'à une durée totale d'environ 72 heures.
2. Suivi de l'activité xylanase au cours de la fermentation
Après 48 heures et 72 heures de culture en fermenteur, la biomasse a été séparée du surnageant par centrifugation. L'activité xylanase du surnageant de culture a été évaluée par la méthode de dosage à l'acide dinitrosalicylique (DNS). Cette méthode consiste à incuber une solution diluée du surnageant de fermentation en présence de xylane de hêtre pendant 10 minutes à 50°C. La xylanase coupe la chaine de xylane (composée de xyloses) en chaînes plus courtes ou oligosaccharides et libère ainsi des extrémités réductrices ou xyloses réducteurs. Ceux-ci sont dosés par le DNS à 95°C et à pH alcalin, le DNS se fixe sur les oses réducteurs laissant apparaître une couleur jaune-orangée proportionnelle à la quantité d'oses réduits et mesurable au spectrophotomètre à 540 nm. Chaque mesure est réalisée en duplicat. La quantification est faite grâce à une gamme étalon de xylose, sucre réducteur.
Les résultats sont représentés par la figure 1 et montrent une production de xylanases au cours de la culture alimentée en glucose très significativement supérieure pour la souche mutante de l'invention (i.e. T. versatilis Tr3864) que pour la souche parente (i.e. T. versatilis IM I 378536) ; la production étant pour cette dernière quasiment nulle du fait des mécanismes de répression catabolique induits par le glucose.
3. Suivi de l'activité arabinofuranosidase au cours de la fermentation
Après 72 heures de culture en fermenteur, la biomasse a été séparée du surnageant par centrifugation. L'activité arabinofuranosidase du surnageant de culture a été évaluée par hydrolyse d'un substrat arabinoxylane suivi d'un dosage de l'arabinose libéré par chromatographie échangeuse d'anion. Une solution diluée du surnageant de fermentation est incubée en présence de xylane de blé pendant 15 minutes à 50°C. L'arabinofuranosidase est capable d'hydrolyser les liaisons osidiques entre les arabinofuranosides ramifiés et la chaine principale de xylane. Il en résulte la libération de monomères d'arabinoses qui sont alors séparés par chromatographie ionique (High Pressure Anion Exchange Chromatography) sur colonne CarboPac PAIO puis quantifiés par détection ampérométrique. Les résultats sont représentés par la figure 2 et montrent une production d'arabinofuranosidases au cours de la culture alimentée en glucose très significativement supérieure pour la souche mutante de l'invention (i.e. T. versatilis Tr3864) que pour la souche parente (i.e. T. versatilis I M I 378536) ; la production étant pour cette dernière quasiment nulle du fait des mécanismes de répression catabolique induits par le glucose. 4. Conclusion
Il ressort clairement de ces données qu'un champignon filamenteux modifié génétiquement selon l'invention pour altérer le gène consistant en la séquence nucléotidique SEQ. ID NO : 1 assure une production efficace de xylanases (EC 3.2.1.8) et d'arabinofuranosidases (EC 3.2.1.55) en présence d'une source de carbone simple (i.e. le glucose), peu coûteuse. En outre, ce microorganisme ne présente aucune altération de sa viabilité ou de la morphologie des colonies.
En d'autres termes, la présente invention assure une croissance efficace du microorganisme sans perturber le transport des acides aminés et l'assimilation de l'azote.

Claims

REVENDICATIONS
1. Microorganisme fongique génétiquement modifié pour la production de glycosidases (EC 3.2.1) en présence d'une source de carbone simple, dont le génome comprend l'inactivation de l'expression :
- du gène consistant en la séquence nucléotidique présentée par la séquence SEQ ID NO: 1 ;
- d'une séquence nucléotidique codant la séquence peptidique présentée par la séquence SEQ. ID NO: 2 ;ou
- d'une séquence présentant au moins 65% d'identité avec la séquence peptidique de séquence SEQ ID NO: 2.
2. Microorganisme fongique selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est sélectionné parmi les Ascomycètes.
3. Microorganisme fongique selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il est sélectionné dans le groupe constitué par la classe des Eurotiomycetes ou Sordariomycètes.
4. Microorganisme fongique selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il est sélectionné dans le groupe constitué par la famille des Trichocomaceae, Aspergillaceae ou Hypocreaceae.
5. Microorganisme fongique selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il est sélectionné dans le groupe constitué par le genre Talaromyces, Aspergillus, Trichoderma ou Pénicillium.
6. Microorganisme fongique selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il est sélectionné dans le groupe constitué par l'espèce Talaromyces versatilis, Talaromyces cellulolyticus, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus nidulans, Trichoderma reesei ou Pénicillium chrysogenum.
7. Microorganisme fongique selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il présente un génotype sauvage ou un génotype muté.
8. Procédé de production de glycosidases (EC 3.2.1) comprenant les étapes suivantes de :
(a) préparer un milieu de culture contenant au moins une source de carbone simple, un substrat inducteur pour la production des glycosidases, au moins une source d'azote, ainsi que l'ensemble des minéraux et nutriments nécessaires à la croissance du microorganisme fongique pour la production de biomasse et de protéines ;
(b) ensemencer le milieu de fermentation avec une souche de microorganisme fongique modifié génétiquement selon l'une des revendications 1 à 5 ;
(c) contrôler et maintenir la température du milieu de fermentation à une valeur comprise entre 25°C et 34°C, le pH du milieu de fermentation à une valeur comprise entre 3,5 et 5 et une pression partielle en oxygène (PO2) supérieure à 30%; et
(d) conduire la fermentation pendant au moins 12h en alimentant avec une source de carbone simple.
9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que les glycosidases (EC 3.2.1) sont des hémicellulases.
10. Procédé selon la revendication 8 ou 9, caractérisé en ce que les glycosidases (EC 3.2.1) sont des xylanases et/ou des arabinofuranosidases.
11. Procédé selon l'une des revendications 8 à 10, caractérisé en ce que la source de carbone simple comprend un monosaccharide et/ou un diholoside et/ou un polyol, de préférence le glucose, le saccharose, le lactose, le glycérol ou leurs mélanges, plus préférentiellement le glucose.
12. Procédé selon l'une des revendications 8 à 11, caractérisé en ce que le milieu de culture comprend en outre un substrat inducteur sélectionné dans le groupe constitué par le xylose, un polymère de xylose, la cellulose, l'hémicellulose, le xylane et leurs mélanges.
13. Procédé selon l'une des revendications 8 à 12, caractérisé en ce que la source de carbone simple est présente dans le milieu de culture à une concentration supérieure à celle du substrat inducteur.
14. Procédé selon l'une des revendications 8 à 13, caractérisé en ce qu'il comprend en outre, une étape (e) visant à récupérer le surnageant de culture contenant les glycosidases.
PCT/EP2023/062505 2022-05-13 2023-05-10 Production de glycosidases a partir d'une source de carbone simple par un microorganisme fongique genetiquement modifie WO2023217911A1 (fr)

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
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