WO2023210644A1 - がん細胞由来細胞外小胞群の単離濃縮方法、分析方法、薬剤選択方法、キット、及び抗がん剤 - Google Patents

がん細胞由来細胞外小胞群の単離濃縮方法、分析方法、薬剤選択方法、キット、及び抗がん剤 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a method for isolating and concentrating cancer cell-derived extracellular vesicles, an analysis method, a drug selection method, a kit, and an anticancer drug.
  • CAC Cancer-associated cachexia
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and is a method for isolating and concentrating cancer cell-derived extracellular vesicles, an analysis method, and a drug selection method that enable highly accurate and non-invasive diagnosis of cancer. , kits, and anticancer drugs.
  • the present invention includes the following aspects.
  • a substance with affinity for sugar chain antigen CA19-9 is brought into contact with a group of extracellular vesicles isolated from patient-derived blood, and a group of cancer cell-derived extracellular vesicles is isolated from the group of extracellular vesicles.
  • [3] The method for isolating and concentrating cancer cell-derived extracellular vesicles according to [1], wherein the substance with affinity for sugar chain antigen CA19-9 further contains a carrier.
  • [4] The method for isolating and concentrating cancer cell-derived extracellular vesicles according to [3], wherein the carrier is a bead.
  • the sugar chain antigen CA19-9 affinity substance is an anti-CA19-9 antibody.
  • the sugar chain antigen CA19-9 affinity substance contains a carrier.
  • the carrier is a bead.
  • cancer can be diagnosed with high precision and non-invasively.
  • FIG. 3 shows Western blotting of factors associated with intracellular lipolytic signaling in human adipocyte lysates treated with EVs (1.5 ⁇ g) from the indicated cells for 1 hour. Representative images from three independent experiments are shown. Band intensities of phosphorylated HSL (pHSL; HSL phosphorylated at Ser660) relative to total HSL protein levels, and band intensities of total HSL and ATGL relative to ⁇ -actin protein levels are shown below the panels.
  • FIG. 2 is a diagram showing a method for establishing Panc-1 cells having a HiBiT sequence downstream of the ACTB gene.
  • the HiBiT peptide sequence was inserted just before the stop codon of ACTB by Cas9-mediated gene editing to generate endogenous HiBiT peptide-bound ⁇ -actin.
  • EV 1.5 ⁇ g
  • endocytosis inhibitors (20 ⁇ M chlorpromazine (CPZ), 10 ⁇ M nocodazole, 20 ⁇ M cytochalasin D (CytD), or 2.5 ⁇ g/mL nystatin, or incubation at 4°C).
  • CPZ chlorpromazine
  • CytD cytochalasin D
  • nystatin 2.5 ⁇ g/mL nystatin
  • Figure 2 is a graph of glycerin release from adipocytes treated with Panc-1 cell-derived EVs (1.5 ⁇ g) for 24 hours in the presence and absence of endocytosis inhibitors.
  • Statistical analysis was performed using Welch's t-test.
  • FIG. 1 Band intensities of phosphorylated HSL (pHSL) relative to total HSL protein levels, and total HSL and ATGL band intensities relative to ⁇ -actin protein levels are shown below the panels.
  • pHSL pHSL
  • P 0.87 (normal)
  • ns no significant difference.
  • Figure 2 is a graph showing cAMP levels in adipocytes treated for 1 hour with EV from 2.5 ⁇ L of pooled serum from 5 healthy controls (normal) or 5 pancreatic cancer patients (cancer).
  • Figure 2 is a graph showing cAMP levels in EVs from 2.5 ⁇ L of pooled serum from 5 healthy controls (normal) or 5 pancreatic cancer patients (cancer).
  • A-B Treatment with 109 particles of EV (A) or 1 ⁇ g of EV (B) from pooled serum of 5 healthy controls (normal) or 5 pancreatic cancer patients (cancer) for 24 hours.
  • 1 is a table showing the clinical characteristics of patients included in the study in this application.
  • Statistical analysis was performed using Welch's t test. It is a figure which shows the size change procedure of EV. EVs were isolated from high or low glucose media of Panc-1 cells. EV-high glucose (EV-H): EVs from high glucose culture; EV-low glucose (EV-L): EVs from low glucose culture. It is a graph showing the size distribution of EV-H and EV-L. The size of the EV-L was smaller. Representative results of at least three independent experiments are shown. Results of Western blotting of ⁇ -actin protein levels in 10 9 particles of EV (EV-H and EV-L from Panc-1 cells). Representative images of three independent experiments are shown. The band intensity of ⁇ -actin relative to the EV marker CD9 is shown.
  • FIG. 4 is a diagram showing a scheme for processing EV with NP40.
  • EV-NP40 After EV isolation from the culture medium, EVs were treated with NP40, followed by purification on a qEV column.
  • Figure 2 is a graph showing the size distribution of EV and EV-NP40 from Panc-1 cell culture medium. Representative results of at least three independent experiments are presented in mode and average.
  • CA19- of EVs (1 ⁇ g) from normal human pancreatic ductal epithelial cells (HPDE and HPNE) and pancreatic cancer cell lines (Panc-1, Miapaca-2, BxPC-3, and Capan-2) as determined by ELISA. It is a graph showing 9 levels. EVs derived from normal human pancreatic ductal epithelial cells, Panc-1, and Miapaca-2 cells hardly express CA19-9. Data are mean ⁇ SD (n 4). ns, no significant difference observed. ** P ⁇ 10-5 . Representative Western blotting results of CA19-9 levels in cell lysates and EVs (0.8 ⁇ g) from the indicated cell lines. Representative images of three independent experiments are displayed.
  • EVs derived from Huh7 cells were AFP positive and CA19-9 negative (hepatoma cells).
  • EVs derived from Capan-2 cells were AFP negative and CA19-9 positive (pancreatic cancer cells). Representative images of at least three independent experiments are displayed.
  • (A) It is a graph showing the KRAS mutation frequency (KRAS mut/WT ratio: ratio of mutant type and wild type KRAS RNA frequencies) in RNA of Huh7 cell-derived EVs and Capan-2 cell-derived EVs by ddPCR.
  • Huh7 has a wild-type KRAS gene
  • Capan-2 has a heterozygous mutant KRAS gene.
  • FIG. 2 is a schematic diagram of an in vivo experiment.
  • Figure 2 is a graph showing weight change from baseline in mice 4 weeks after injection. Data are mean ⁇ SD.
  • Figure 2 is a graph showing gWAT body weight 4 weeks after injection.
  • Figure 2 is a graph showing the amount of internalized EV estimated by serum, lung, and muscle luciferase activities of representative mice.
  • FIG. 2 is a conceptual diagram of detection of EV surface proteins using oligo DNA. These are the results of quantitative PCR for TF.
  • a substance with affinity for sugar chain antigen CA19-9 is brought into contact with a group of extracellular vesicles isolated from blood derived from a patient, and cancer cell-derived extracellular vesicles are collected from the group of extracellular vesicles.
  • a method for isolating and concentrating cancer cell-derived extracellular vesicles is provided.
  • the carbohydrate antigen CA19-9 is a sialyl Lea antigen recognized by the mouse monoclonal antibody NS19-9 and is known as one of the tumor markers.
  • Target cancers are not particularly limited, and include breast cancer (e.g., invasive ductal carcinoma, ductal carcinoma in situ, inflammatory breast cancer, etc.), prostate cancer (e.g., hormone-dependent prostate cancer, (hormone-independent prostate cancer, etc.), pancreatic cancer (e.g., pancreatic ductal cancer, etc.), gastric cancer (e.g., papillary adenocarcinoma, mucinous adenocarcinoma, adenosquamous cell carcinoma, etc.), lung cancer (e.g., non-small cell lung cancer, small cell lung cancer, malignant mesothelioma, etc.), colon cancer (e.g., gastrointestinal stromal tumor, etc.), rectal cancer (e.g., gastrointestinal stromal tumor, etc.), colorectal cancer (e.g., familial colorectal cancer, hereditary non-polyposis colorectal cancer, gastrointestinal stromal tumor, etc.), small intestine
  • epithelial ovarian cancer extragonadal germ cell tumor, ovarian germ cell tumor, ovarian low-grade tumor, etc.
  • bladder cancer urethral cancer
  • skin cancer e.g., intraocular (ocular) melanoma, Merkel cell carcinoma, etc.
  • hemangioma malignant lymphoma (e.g. , reticular sarcoma, lymphosarcoma, Hodgkin's disease, etc.), melanoma (malignant melanoma), thyroid cancer (e.g. medullary thyroid cancer, etc.), parathyroid cancer, nasal cavity cancer, sinus cancer, bone tumor (e.g.
  • osteosarcoma Ewing's tumor, uterine sarcoma, soft tissue sarcoma, etc.
  • metastatic medulloblastoma angiofibroma
  • dermatofibrosarcoma protuberans retinal sarcoma
  • penile cancer testicular cancer
  • pediatric solid tumors e.g.
  • Kaposi's sarcoma Kaposi's sarcoma caused by AIDS, maxillary sinus tumor, fibrous histiocytoma, leiomyosarcoma, rhabdomyosarcoma, chronic myeloproliferative diseases, leukemia (e.g., acute myeloid leukemia, acute lymphoblastic leukemia, etc.), but is not limited to these.
  • leukemia e.g., acute myeloid leukemia, acute lymphoblastic leukemia, etc.
  • the substance with affinity for sugar chain antigen CA19-9 is not limited as long as it has affinity for sugar chain antigen CA19-9, and examples thereof include mucin and anti-CA19-9 antibody. and anti-CA19-9 antibodies are preferred.
  • antibodies include monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, multispecific antibodies (eg, bispecific antibodies), antibody fragments, and the like.
  • the sugar chain antigen CA19-9 affinity substance further contains a carrier.
  • the carrier include beads of silicon, titanium dioxide, aluminum oxide, glass, polystyrene, cellulose, polyamide, and the like.
  • the following steps are specifically mentioned. First, serum isolated from patient-derived blood is centrifuged at 2000 xg for 10 minutes at 4°C, and then the supernatant is filtered using a 0.45 ⁇ m filter. Next, the supernatant after filtration is applied to a size exclusion column to obtain a group of extracellular vesicles. Anti-CA19-9 antibody-bound protein A/G magnetic beads were brought into contact with the obtained extracellular vesicles, and cancer cell-derived extracellular vesicles were isolated from the extracellular vesicles by a conventional immunoprecipitation method. Separate and concentrate.
  • the precipitate obtained using the anti-CA19-9 antibody may be labeled using a label for molecules that are highly expressed in CA19-9-positive EVs.
  • the label is not particularly limited, and includes a method of labeling using a labeled antibody against the molecule.
  • substances used for labeling antibodies include labeling enzymes, such as horseradish peroxidase and alkaline phosphatase.
  • it may be labeled using an antibody against the molecule bound to an oligonucleotide. By performing quantitative PCR on this oligonucleotide, the expression level of the molecule on EVs can be quantified.
  • cancer-related genes in a group of cancer cell-derived extracellular vesicles isolated and concentrated using the above method for isolating and enriching a group of cancer cell-derived extracellular vesicles are analyzed, and Provides a method for analyzing genotypes.
  • EVs derived from cells having a KRAS mutation can be isolated and concentrated.
  • Cancer-related genes in the isolated and concentrated cancer cell-derived extracellular vesicles are analyzed using, for example, a next-generation sequencer.
  • Oncogenes include gene groups encoding growth factors such as sis; gene groups encoding receptor-type tyrosine kinases such as erbB, fms, and ret; gene groups encoding non-receptor-type tyrosine kinases such as fes; ras, etc.
  • a gene group encoding GTP/GDP binding proteins a gene group encoding serine/threonine kinases such as src, mos, and raf; a gene group encoding nuclear proteins such as myc, myb, fos, jun, and erbA; crk A group of genes encoding signal transduction adapter molecules such as Bcr-Abl; and fusion genes such as Bcr-Abl.
  • oncogenes include Ras-MAP kinase pathway-related genes such as Shc, Grb2, Sos, MEK, Rho, and Rac genes; phospholipase C gamma-protein kinase C pathway-related genes such as PLC ⁇ and PKC; PI3K, Akt, and Bad. PI3K-Akt pathway-related genes such as; JAK-STAT pathway-related genes such as JAK and STAT; and GAP system pathway-related genes such as GAP, p180, and p62. Furthermore, mutations in tumor suppressor genes such as p53, Rb, and BRCA1 may be analyzed.
  • This embodiment provides a drug selection method that selects a drug to be administered based on a patient's genotype analyzed using the above analysis method.
  • a KRAS inhibitor can be selected.
  • the drug selection method of this embodiment uses EVs isolated from blood and is therefore non-invasive.
  • This embodiment is a kit for isolating and concentrating a group of cancer cell-derived extracellular vesicles from a group of extracellular vesicles isolated from patient-derived blood, and includes a substance with affinity for carbohydrate antigen CA19-9.
  • the present embodiment provides an anticancer agent containing as an active ingredient an anti-CA19-9 antibody that neutralizes the function of the sugar chain antigen CA19-9.
  • the anticancer agent of the present embodiment may be administered orally in the form of a tablet, coated tablet, pill, powder, granule, capsule, liquid, suspension, emulsion, or as an injection or suppository. It can also be administered parenterally in the form of external preparations for skin and the like.
  • binders such as gelatin, cornstarch, gum tragacanth, and gum arabic
  • excipients such as starch and crystalline cellulose
  • leavening agents such as alginic acid
  • solvents for injections such as water, ethanol, and glycerin
  • adhesives such as rubber adhesives and silicone adhesives.
  • Pharmaceutically acceptable carriers can be used alone or in combination of two or more.
  • the anticancer agent of this embodiment may further contain an additive.
  • Additives include lubricants such as calcium stearate and magnesium stearate; sweeteners such as sucrose, lactose, saccharin, and maltitol; flavoring agents such as peppermint and red oil; stabilizers such as benzyl alcohol and phenol; phosphoric acid. Buffers such as salts and sodium acetate; solubilizing agents such as benzyl benzoate and benzyl alcohol; antioxidants; preservatives and the like.
  • the additives can be used alone or in combination of two or more.
  • the method of administering the anticancer drug of this embodiment is not particularly limited, and may be determined as appropriate depending on the patient's symptoms, weight, age, sex, etc. For example, tablets, coated tablets, pills, powders, granules, capsules, solutions, suspensions, emulsions, etc. are administered orally. Injections are administered intravenously alone or mixed with normal replacement fluids such as glucose and amino acids, and further intraarterially, intramuscularly, intradermally, subcutaneously, or intraperitoneally as necessary.
  • the dosage of the anticancer drug of this embodiment varies depending on the patient's symptoms, weight, age, sex, etc., and cannot be determined unconditionally, but in the case of oral administration, it is, for example, 1 ⁇ g to 10 g per day, for example, 1 ⁇ g to 10 g per day. 0.01 to 2000 mg of the active ingredient may be administered per day.
  • the active ingredient may be administered in an amount of, for example, 0.1 ⁇ g to 1 g per day, for example 0.001 to 200 mg per day.
  • the active ingredient may be administered in an amount of, for example, 1 ⁇ g to 10 g per day, for example 0.01 to 2000 mg per day.
  • CAC is a paraneoplastic syndrome characterized by weight loss, wasting of skeletal mass, and atrophy of adipose tissue.
  • CAC occurs in the majority of cancer patients, but it often appears in early-stage pancreatic cancer, which has a high mortality rate.
  • Ghrelin receptor agonists are currently used in hospitals to reverse anorexia in CAC, but new treatments are needed for this multifactorial disease.
  • Reduction in fat mass is an important feature of CAC, where lipolysis is activated in adipocytes and the size of adipocytes is reduced.
  • other features, including muscle wasting are also characteristic of CAC, crosstalk between adipocytes and other organs suggests an important role for adipocytes in systemic metabolic complications.
  • extracellular vesicles may also be involved. EVs, nanoparticles released into the bloodstream by all cells, contain bioactive factors that act as mediators of intercellular communication. Cancer cell-derived EVs are involved in the mechanisms underlying CAC, as cancer cells actively release large numbers of EVs throughout the body.
  • EVs with a modal diameter of 100-150 nm were isolated from various sources, except for EVs from Capan-2 cells, which were approximately 240 nm. The number of EVs in the serum of cancer patients was higher than that of controls. Since the expression of exosome markers such as TSG101 and CD63 in EVs was confirmed, it was confirmed that EV isolation was appropriate (see Figure 1). To examine the effects of EV, mature human adipocytes were induced from human adipose-derived mesenchymal stem cells (hAD-MSCs) and subjected to EV treatment (see Figures 2 to 4).
  • hAD-MSCs human adipose-derived mesenchymal stem cells
  • Glycerin a surrogate marker of lipolysis levels, was released at significantly higher levels from adipocytes treated with EVs derived from Panc-1 cells, Miapapaca-2 cells, and BxPC-3 cells, and at significantly higher levels than EVs derived from Capan-2 cells. It was not observed in adipocytes treated with (see Figure 5).
  • HSL phosphorylation levels and intracellular cAMP levels were significantly upregulated in adipocytes treated with EVs derived from Panc-1, Miapapaca-2, and BxPC-3 cells, and those from Capan-2 cells. It was not observed in adipocytes treated with EV (see Figures 6-7).
  • total HSL and adipose triglyceride lipase (ATGL) levels were similar in all samples (see Figure 6).
  • H89 PKA inhibitor
  • Orlistat HSL and ATGL inhibitor
  • Cay10499 HSL inhibitor
  • ⁇ -actin is contained as a pan-EV marker in human serum and most EVs derived from human cell lines.
  • reporter cells Panc-1-ACTB-HiBiT cells
  • HiBiT peptide sequence at the 3' end of the ACTB locus of Panc-1 cells (Fig. 11, 12).
  • High luciferase activity was detected in cell lysates and EVs derived from these cells, confirming the presence of ⁇ -actin-HiBiT protein in EVs (see FIGS. 13(A) and (B)).
  • Luciferase values in adipocyte lysates were upregulated 1 hour after addition of EVs and were similar to those using chlorpromazine, a clathrin-mediated endocytosis inhibitor, but not with the microtube destabilizing agent.
  • nocodazole an inhibitor of actin F, which is associated with macropinocytosis, and nystatin, an inhibitor of caveolae-mediated transport, all endocytic pathways were inhibited at 4°C. The case was significantly lower (see Figure 14).
  • NP40 As a second method to change EV size, NP40 was added to isolated EVs at a final concentration of 0.5% (see Figure 30). Upon addition of NP40, the lipid bilayer membrane of EV was partially damaged and reduced in size (EV-NP40) (see Figure 31). Furthermore, EV-NP40 had a significantly lower luciferase value (see Figure 32(A)). This is due to loss of ⁇ -actin-HiBiT protein due to damage to the lipid bilayer membrane. However, the luciferase values of adipocyte lysates treated with the same number of EVs were significantly higher when EV-NP40 was used (see Figure 32(B)). These results confirmed that EV uptake increases as the size decreases.
  • CA19-9 Carbohydrate chain antigen 19-9 (CA19-9) is a cell surface sugar chain. Although CA19-9 is produced in the normal pancreas, its synthesis is significantly increased by abnormal sialylation in the pancreas. Since EVs are produced by recycling cell membranes, CA19-9 should be present on the surface of EVs from CA19-9 positive cells. As expected, CA19-9 was abundant in the bulk serum of pancreatic cancer patients and the EVs therein (see Figure 33).
  • CA19-9-positive EVs In order to establish a method to isolate CA19-9-positive EVs, we used cells derived from normal human pancreatic ductal epithelial cells (HPDE and HPNE) and CA19-9-negative pancreatic cancer cells (Panc-1 and Miapaca-2). CA19-9 negative EVs and CA19-9 negative EVs derived from pancreatic cancer cells (BxPC- and Capan-2) (see Figures 34 to 36) were used. CA19-9 positivity in EVs indicates CA19-9 positivity in cells including hepatocellular carcinoma cells (Huh7), colorectal cancer cells (HT-29), lung cancer cells (A549), and leukemia cells (HL-60). (See Figure 35.)
  • Panc-1-ACTB-HiBiT cell-derived EVs (EV-H and EV-L) of different sizes were intravenously administered to mice (see FIG. 44). Mice treated with larger EVs (EV-H) showed a slight reduction in weight gain compared to controls 4 weeks after administration, whereas mice treated with smaller EVs (EV-L) showed Compared to the control, the weight gain was suppressed by 63.6% (see Figure 45). EV-L treated mice showed less weight gain (see Figure 46).
  • the gonadal white adipose tissue (gWAT) of EV-L treated mice was significantly smaller in weight and size (see Figures 47 and 48). Consistent with the in vitro results, EV-L was highly taken up by gWAT, as estimated by HiBiT luciferase activity (see Figure 49). Smaller EVs (EV-L) were taken up by the lungs, but not by the muscles, more than EV-H, and EV-H levels in the serum after 3 days were higher (see Figure 50). Significantly smaller lipid droplets were seen in gWAT of EV-L treated mice (see Figure 51). Consistently, phosphorylation of HSL Ser660 in gWAT was higher in EV-L treated mice (see Figure 52).
  • EVs were more taken up by adipocytes, resulting in greater induction of lipolysis.
  • Cancer cells rely on glycolysis for energy production, so the tumor microenvironment of solid tumors typically has low glucose levels.
  • the small size of EVs derived from pancreatic cancer cells may be due to the low glucose in the tumor microenvironment of pancreatic cancer tissues. Together with the fact that more EVs are released by cancer cells, this indicates that tumor-derived EVs in pancreatic cancer mediate systemic induction of lipolysis as a hallmark of cancer cachexia. .
  • cancer can be diagnosed with high precision and non-invasively.

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Abstract

患者由来の血液から単離された細胞外小胞群に、糖鎖抗原ＣＡ１９－９親和性物質を接触させ、前記細胞外小胞群から、がん細胞由来細胞外小胞群を単離濃縮する、がん細胞由来細胞外小胞群の単離濃縮方法。

Description

がん細胞由来細胞外小胞群の単離濃縮方法、分析方法、薬剤選択方法、キット、及び抗がん剤
　本発明は、がん細胞由来細胞外小胞群の単離濃縮方法、分析方法、薬剤選択方法、キット、及び抗がん剤に関する。
　疾患の診断等の目的で、血中の細胞外小胞（ＥＶ）を単離してその内容物を解析する研究が全世界的に勧められている。
　がん関連悪液質（ＣＡＣ）は、進行がん、特に膵臓がんの患者によく見られる消耗状態である。ＣＡＣは多因子疾患であり、その特徴の１つは全身性脂肪分解である（例えば、非特許文献１参照。）。介入法の開発には、ＣＡＣにおける脂肪分解の分子基盤をより深く理解する必要がある。がん細胞から放出された細胞外小胞（ＥＶ）の解析が、ＣＡＣの介入法の開発に貢献できるものと考えられる。
Fearon, K. C. H., Glass, D. J. & Guttridge, D. C. Cancer Cachexia: Mediators, Signaling, and Metabolic Pathways. Cell Metabolism 16, 153-166, doi:10.1016/j.cmet.2012.06.011 (2012).
　しかし、雑多な集団である血中の細胞外小胞を一括して解析するのでは、感度や正確性が欠けることが想定される。一方、特定の病変を患う患者の細胞・臓器等から放出される細胞外小胞のみを特異的に単離濃縮することは難しく、新たに血中の細胞外小胞の一群から特異的な臓器・細胞由来の細胞外小胞サブセットを単離濃縮する方法が求められている。
　本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、高精度かつ非侵襲的にがんを診断できる、がん細胞由来細胞外小胞群の単離濃縮方法、分析方法、薬剤選択方法、キット、及び抗がん剤を提供する。
　本発明は、以下の態様を含む。
［１］患者由来の血液から単離された細胞外小胞群に、糖鎖抗原ＣＡ１９－９親和性物質を接触させ、前記細胞外小胞群から、がん細胞由来細胞外小胞群を単離濃縮する、がん細胞由来細胞外小胞群の単離濃縮方法。
［２］前記糖鎖抗原ＣＡ１９－９親和性物質は、抗ＣＡ１９－９抗体である、［１］に記載のがん細胞由来細胞外小胞群の単離濃縮方法。
［３］前記糖鎖抗原ＣＡ１９－９親和性物質は、更に担体を含む、［１］に記載のがん細胞由来細胞外小胞群の単離濃縮方法。
［４］前記担体は、ビーズである、［３］に記載のがん細胞由来細胞外小胞群の単離濃縮方法。
［５］［１］～［４］のいずれかに記載のがん細胞由来細胞外小胞群の単離濃縮方法を用いて単離濃縮されたがん細胞由来細胞外小胞群におけるがん関連遺伝子の解析を行い、前記患者の遺伝子型を分析する、分析方法。
［６］［５］に記載の分析方法を用いて分析された患者の遺伝子型に基づき、投与すべき薬剤を選択する、薬剤選択方法。
［７］患者由来の血液から単離された細胞外小胞群から、がん細胞由来細胞外小胞群を単離濃縮するキットであって、糖鎖抗原ＣＡ１９－９親和性物質を含む、キット。
［８］前記糖鎖抗原ＣＡ１９－９親和性物質は、抗ＣＡ１９－９抗体である、［７］に記載のキット。
［９］前記糖鎖抗原ＣＡ１９－９親和性物質は、担体を含む、［７］に記載のキット。
［１０］前記担体は、ビーズである、［９］に記載のキット。
［１１］糖鎖抗原ＣＡ１９－９の機能を中和する抗ＣＡ１９－９抗体を有効成分として含有する、抗がん剤。
　本発明によれば、高精度かつ非侵襲的にがんを診断できる。
細胞培養培地からの０．８μｇＥＶ（左パネル）並びに健常コントロールの混合血清（ｎ＝５）及び膵臓がん患者の混合血清（ｎ＝５）からの １．５μｇＥＶ（右パネル）における細胞外小胞マーカー（ＣＤ６３及びＴＳＧ１０１）のウエスタンブロッティングの結果である。 ヒト脂肪細胞由来間葉系幹細胞（ｈＡＤ－ＭＳＣ）を脂肪細胞に分化させる方法を示す図である。 オイルレッドＯ染色によるｈＡＤ－ＭＳＣ及び分化脂肪細胞の画像である。スケールバー：２０μｍ。比色分析によって決定された細胞内のオイルレッドＯレベルを示す。データは平均±ＳＤ（ｎ＝３）である。＊＊Ｐ ＝ ０．０００２０。 分化後の脂肪細胞マーカーの発現を示すグラフである。ＲＴ－ｑＰＣＲによるｈＡＤ－ＭＳＣ及び分化脂肪細胞におけるＣ／ＥＢＰα、ＦＡＢＰ４、ＨＳＬ、およびＧＬＵＴ４のｍＲＮＡレベルを示す。データは平均±ＳＤ（ｎ＝３）である。＊＊Ｐ＝ ０．００２８（Ｃ/ＥＢＰα）、＊＊Ｐ＝０．０００２３（ＦＡＢＰ４）、＊＊Ｐ＝０．００２１（ＨＳＬ）、＊＊Ｐ＝０．０００６５（ＧＬＵＴ４）。統計分析は、ウェルチのt検定を使用して実行された。 示された細胞由来のＥＶ（１．５μｇ）で２４時間処理されたヒト脂肪細胞からのグリセロール放出を示すグラフである。ネガティブコントロールとしてＰＢＳを使用した。データは平均±ＳＤ（ｎ＝４である。＊＊Ｐ＝０．００１１（Ｐａｎｃ－１）、＊＊Ｐ＝０．０００１９（Ｍｉａｐａｐａｃａ－２）、＊＊Ｐ＝０．００１３（ＢｘＰＣ－３）、Ｐ＝０．９９（Ｃａｐａｎ－２）。 示された細胞由来のＥＶ（１．５μｇ）で１時間処理されたヒト脂肪細胞ライセートにおける細胞内脂肪分解シグナル伝達に関連する因子のウエスタンブロッティングを示す図である。３つの独立した実験での代表的な画像を表示している。総ＨＳＬタンパク質レベルに対するリン酸化ＨＳＬ（ｐＨＳＬ；Ｓｅｒ６６０でリン酸化されたＨＳＬ）のバンド強度、及びβ-アクチンタンパク質レベルに対する総ＨＳＬ及びＡＴＧＬのバンド強度は、パネルの下に示した。 ＥＶ（１．５μｇ）で１時間処理した脂肪細胞のｃＡＭＰレベルを示すグラフである。データは平均±ＳＤ（ｎ＝３）である。＊＊Ｐ＝０．００２３（Ｐａｎｃ－１）、＊＊Ｐ＝０．００１９（Ｍｉａｐａｐａｃａ－２）、＊＊Ｐ＝０．０００２３（ＢｘＰＣ－３）、Ｐ＝０．１１（Ｃａｐａｎ－２）。 １０μＭ Ｈ８９（ＰＫＡ 阻害剤）、０．５μＭ オルリスタット（ＯＬＳＴ、ＨＳＬ及びＡＴＧＬの阻害剤)、及び０．１μＭＣａｙ１０４９９（ＨＳＬ阻害剤）の有無における、Ｐａｎｃ－１細胞由来ＥＶ（１．５μｇ）で処理したヒト脂肪細胞からのグリセリン放出を示すグラフである。 （Ａ）３０μＭ ＳＱ２２５３６（ＳＱ、アデニリルシクラーゼ阻害剤）で２４時間処理の有無における、１０μＭ イソプロテレノール（ＩＳＯ）で処理した脂肪細胞からのグリセリン放出を示すグラフである。データは平均±ＳＤ（ｎ＝３）である。＊＊Ｐ＝０．００２５。（Ｂ）３０μＭ ＳＱ２２５３６で２４時間処理の有無における、Ｐａｎｃ－１細胞由来ＥＶ（１．５μｇ）で処理した脂肪細胞からのグリセリン放出を示すグラフである。データは平均±ＳＤ（ｎ＝３）である。Ｐ＝０．６５。ｎｓ，有意な差が認められない。Ｐ＝０．６５。 ＰＢＳ及びＰａｎｃ－１及びＣａｐａｎ－２培養培地からのＥＶ（１．５μｇ）で５時間処理した脂肪細胞の免疫蛍光画像である。ＥＶの膜は、Ｅｘｏｓｐａｒｋｌｅｒで標識した。核は ＤＡＰＩで染色した。３つの独立した実験での代表的な画像を表示している。スケールバー：３０μｍ。統計分析は、ウェルチのt検定を使用して実行された。 膵臓がん細胞由来のＥＶにおけるβ－アクチンタンパク質のウエスタンブロッティングの結果である。３つの独立した実験での膵臓がん細胞由来のＥＶ（０．８μｇ）におけるβ－アクチンレベルの代表的なウエスタンブロッティングを示す。ＢｘＰＣ－３細胞由来のＥＶのレベルを１として調整したバンド強度を示す。 ＡＣＴＢ遺伝子の下流にＨｉＢｉＴ 配列を持つＰａｎｃ－１細胞を樹立する方法を示す図である。ＨｉＢｉＴペプチド配列は、Ｃａｓ９を介した遺伝子編集によってＡＣＴＢの終止コドンの直前に挿入され、内在性ＨｉＢｉＴ ペプチド結合β－アクチンが生成された。 （Ａ）野生型細胞及びＡＣＴＢ－ＨｉＢｉＴ細胞のβ－ａｃｔｉｎ－ＨｉＢｉＴにおけるウエスタンブロッティングの結果である。３つの独立した実験での代表的な図を示す。β－アクチンによって補正されたＨｉＢｉＴレベルの相対バンド強度を示す。データは平均±ＳＤ（ｎ＝３）である。＊＊Ｐ＜１０－４。（Ｂ）野生型Ｐａｎｃ－１細胞（野生型）とＰａｎｃ－１－ＡＣＴＢ－ＨｉＢｉＴ 細胞（ＡＣＴＢ－ＨｉＢｉＴ）のルシフェラーゼ値（左パネル）、及び野生型細胞とＡＣＴＢ－ＨｉＢｉＴ細胞からの１０９個のＥＶ粒子 (右パネル) のルシフェラーゼ値を示すグラフである。データは平均±ＳＤ（ｎ＝４）である。＊＊Ｐ＜１０－４（細胞ライセート）、＊＊Ｐ＜１０－５（ＥＶ）。 Ｐａｎｃ－１細胞由来のＥＶにおけるβ－ａｃｔｉｎ－ＨｉＢｉＴのルシフェラーゼ活性によって決定される、ヒト脂肪細胞に添加されたＥＶの内在化の結果である。エンドサイトーシス阻害剤（２０μＭ クロルプロマジン（ＣＰＺ）、１０μＭ ノコダゾール、２０μＭ サイトカラシンＤ（ＣｙｔＤ）、または２．５μｇ／ｍＬ ナイスタチン、或いは ４℃ でのインキュベーション）処理有無での、ＥＶ（１．５μｇ）で１時間処理した脂肪細胞のルシフェラーゼ値であって、ネガティブコントロール（ＰＢＳ）と比較して示した値である。データは平均±ＳＤ（ｎ＝３）である。Ｐ＝０．７４（ＣＰＺ）、＊Ｐ＝０．０２９ (ノコダゾール)、＊Ｐ＝０．０３２（ＣｙｔＤ）、＊＊Ｐ＝０．００７８ (ナイスタチン)、＊＊Ｐ＝０．００７４（４℃）、ＥＶのみで処理した細胞と比較 (コントロール）。 エンドサイトーシスの阻害剤の有無での、Ｐａｎｃ－１細胞由来のＥＶ（１．５μｇ）で２４時間処理した脂肪細胞からのグリセリン放出のグラフである。阻害剤の投与量は図１４の通りである。データは平均±ＳＤ（ｎ＝３）である。Ｐ＝０．４０（ＣＰＺ）、＊Ｐ＝０．０２７ (ノコダゾール)、＊Ｐ＝０．０１２（ＣｙｔＤ）、＊＊Ｐ＝０．００６５ (ナイスタチン)、＊＊Ｐ＝０．００７４（４℃）、ＥＶのみで処理した細胞と比較 (コントロール）。統計分析は、ウェルチのt検定を使用して実行された。 （Ａ）５人の健常コントロール（正常）又は５人の膵臓がん患者（癌）からの２．５μＬのプールされた血清由来のＥＶで２４時間処理されたヒト脂肪細胞からのグリセリン放出のグラフである。ネガティブコントロールとしてＰＢＳを使用した。データは平均±ＳＤ（ｎ＝３）である。*Ｐ＝０．０４４ （正常）、＊＊Ｐ＝０．０００７７ （癌）、*Ｐ＝０．０３２（正常対癌）。（Ｂ）５人の健常コントロール（正常）又は５人の膵臓がん患者（癌）からの２．５μＬのプールされた血清からのＥＶで１時間処理されたヒト脂肪細胞のライセートにおける細胞内脂肪分解シグナル伝達に関連する因子のウエスタンブロッティングの結果である。３つの独立した実験での代表的な図を示す。総ＨＳＬタンパク質レベルに対するリン酸化ＨＳＬ（ｐＨＳＬ）のバンド強度、及びβ-アクチンタンパク質レベルに対する総ＨＳＬ及びＡＴＧＬのバンド強度は、パネルの下に示した。データは平均±ＳＤ（ｎ＝３）である。ｐＨＳＬに関して、Ｐ＝０．８７ （正常）、＊＊Ｐ＜１０－５（癌）、ｎｓ，有意な差が認められない。 ５人の健常コントロール（正常）又は５人の膵臓がん患者（癌）からの ２．５μＬのプールされた血清からのＥＶで１時間処理された脂肪細胞のｃＡＭＰレベルを示すグラフである。データは平均±ＳＤ（ｎ＝３）である。*Ｐ＝０．０１５ (正常)、＊＊Ｐ＝０．００３３（癌）、*Ｐ＝０．０２３（正常対癌）。 ５人の健常コントロール（正常）又は５人の膵臓がん患者（癌）からの ２．５μＬ のプールされた血清からのＥＶのｃＡＭＰレベルを示すグラフである。 （Ａ－Ｂ）５人の健常コントロール（正常）又は５人の膵臓がん患者（癌）のプールされた血清からの１０９粒子のＥＶ（Ａ）又は１μｇのＥＶ（Ｂ）で２４時間処理された脂肪細胞からのグリセリン放出を示すグラフである。コントロールとしてＰＢＳを使用した。データは平均±ＳＤ（ｎ＝３）である。＊＊Ｐ＜０．０１。正常とがんの差のＰ値は次の通りである。＊＊Ｐ＜１０－４（Ａ）、＊Ｐ＝０．００２２（Ｂ）。 統計分析は、ウェルチのｔ検定を使用して実行された。 本願における試験に含まれる患者の臨床的特徴を示す表である。 （Ａ）健常コントロールの血清由来の１μｇのＥＶ（正常のＥＶ;ｎ＝１０）及び膵臓がん患者の血清由来の１μｇのＥＶ（癌のＥＶ;ｎ＝１０）で ２４時間処理したヒト脂肪細胞からのグリセリン放出のグラフである。データは、平均±標準偏差である。＊Ｐ＝０．０１７。（Ｂ）健常コントロール（正常のＥＶ;ｎ＝１０）及び膵臓がん患者（癌のＥＶ;ｎ＝１０）のそれぞれの血清に由来する１μｇのＥＶのｃＡＭＰレベルを示すグラフである。データは、平均±ＳＤである。ｎｓ，有意な差が認められない。Ｐ ＝ ０．２９。 （Ａ－Ｂ）ＥＶ処理脂肪細胞からのグリセリン放出とＥＶのｃＡＭＰレベルとの間の相関（Ａ）、又はグリセロール放出と血清ＥＶのモードサイズとの間の相関（Ｂ）を示すグラフである。グラフの円は、それぞれ健常コントロール由来のＥＶ(黒丸：ｎ＝１０) と膵臓がん患者由来のＥＶ(白丸：ｎ＝１０)を示す。破線は回帰直線である。相関は、ピアソンの相関係数によって推定された。 健常コントロール（正常のＥＶ;ｎ＝１０）及び膵臓がん患者（癌のＥＶ; ｎ＝１９) 由来のＥＶのモード サイズのグラフである。データは、平均±標準偏差である。＊Ｐ＝０．０１４。ウェルチの t 検定を使用して統計分析を実行した。 ＥＶのサイズ変更手順を示す図である。ＥＶは、Ｐａｎｃ－１細胞の高グルコース培地又は低グルコース培地から単離された。ＥＶ－高グルコース （ＥＶ－Ｈ）: 高グルコース培養由来のＥＶ、ＥＶ－低グルコース （ＥＶ－Ｌ）: 低グルコース培養由来のＥＶ。 ＥＶ－ＨとＥＶ－Ｌのサイズ分布を示すグラフである。ＥＶ－Ｌのサイズの方が小さかった。少なくとも３つの独立した実験の代表的な結果を表示した。 ＥＶ（Ｐａｎｃ－１細胞からのＥＶ－Ｈ及びＥＶ－Ｌ）の１０９個の粒子におけるβ-アクチンタンパク質レベルのウエスタンブロッティングの結果である。３ つの独立した実験の代表的な画像を表示した。ＥＶマーカーＣＤ９に対するβ－アクチンのバンド強度を示した。データは平均±ＳＤ（ｎ＝３）である。ｎｓ，有意な差が認められない。Ｐ＝０．２４。 （Ａ）ＥＶの１０９個の粒子におけるβ－ａｃｔｉｎ－ＨｉＢｉＴのレベルを反映する相対ルシフェラーゼ値を示すグラフである。野生型：ネガティブコントロールのＰａｎｃ－１細胞 （ＨｉＢｉＴを発現していない） 由来のＥＶ、ＥＶ－Ｈ及びＥＶ－Ｌ: それぞれ高グルコースおよび低グルコースで培養された Ｐａｎｃ－１－ＡＣＴＢ－ＨｉＢｉＴ 細胞由来のＥＶ。データは平均±ＳＤ（ｎ＝４）である。＊＊Ｐ ＜１０－４ （ＥＶ－Ｈ）、＊＊Ｐ＜１０－５（ＥＶ－Ｌ）。ｎｓ，有意な差が認められない。Ｐ＝０．６１（ＥＶ－Ｈ対ＥＶ－Ｌ）。（Ｂ）ＥＶ－Ｈ及びＥＶ－Ｌの１０９個の粒子のｃＡＭＰレベルを示すグラフである。データは平均±ＳＤ（ｎ＝４）である。ｎｓ，有意な差が認められない。Ｐ ＝ ０．７２。（Ｃ）ＥＶのヒト脂肪細胞への内在化レベルを示すグラフである。Ｐａｎｃ－１－ＡＣＴＢ－ＨｉＢｉＴ 細胞由来の１０９粒子のＥＶ（ＥＶ－Ｈ及び ＥＶ－Ｌ）で １時間処理した脂肪細胞の相対ルシフェラーゼ値を、ネガティブコントロール（ＰＢＳ）と比較した。データは平均±ＳＤ（ｎ＝３）である。＊＊Ｐ＝０．００１１。 ＰＢＳ及びＰａｎｃ－１細胞培養培地由来のＥＶ（ＥＶ－Ｈ及びＥＶ－Ｌ）で１時間処理したヒト脂肪細胞の免疫蛍光画像である。ＥＶ膜は、Ｅｘｏｓｐａｒｋｌｅｒで標識した。核はＤＡＰＩで染色した。スケールバー：５０μｍ。 １０９粒子のＰａｎｃ－１細胞由来ＥＶ（ＥＶ－Ｈ及びＥＶ－Ｌ）で２４時間処理したヒト脂肪細胞からのグリセロール放出を示すグラフである。ネガティブコントロールとしてＰＢＳを使用した。データは平均±ＳＤ（ｎ＝３）である。＊＊Ｐ＝０．０００５６（ＥＶ－Ｈ）、＊＊Ｐ＝０．０００２６（ＥＶ－Ｌ）、＊Ｐ＝０．０１５（ＥＶ－Ｈ対ＥＶ－Ｌ）。統計分析は、ウェルチのｔ検定を使用して実行された。 ＥＶをＮＰ４０で処理するスキームを示す図である。ＥＶ－ＮＰ４０：培養液からＥＶを単離した後、ＥＶをＮＰ４０で処理し、続いて、ｑＥＶカラムでの精製を行った。 Ｐａｎｃ－１細胞培養培地からのＥＶ及びＥＶ－ＮＰ４０のサイズ分布を示すグラフである。少なくとも３つの独立した実験の代表的な結果は、モードと平均で表示した。 （Ａ）ＥＶにおけるβ－ａｃｔｉｎ－ＨｉＢｉＴタンパク質レベルの指標としてのルシフェラーゼ値を示すグラフである。野生型；ネガティブコントロールのＰａｎｃ－１細胞 (ＨｉＢｉＴを発現していない)、ＥＶ及びＥＶ－ＮＰ４０； Ｐａｎｃ－１－ＡＣＴＢ－ＨｉＢｉＴ細胞由来のＥＶ。サンプルあたり１０９粒子を使用した。データは平均±ＳＤ（ｎ＝３）である。＊＊Ｐ＝０．００１７（ＥＶ）、＊＊Ｐ＜１０－４（ＥＶ－ＮＰ４０）、＊＊Ｐ＝０．００２６（ＥＶ 対 ＥＶ－ＮＰ４０）。（Ｂ）ＥＶのヒト脂肪細胞への内在化を示すグラフである。Ｐａｎｃ－１－ＡＣＴＢ－ＨｉＢｉＴ 細胞由来のＥＶ 又はＥＶ－ＮＰ４０（１０９粒子）で １ 時間処理した脂肪細胞ライセートのルシフェラーゼ値を、ネガティブコントロール（ＰＢＳ）と比較して示した。データは平均±ＳＤ（ｎ＝３）である。＊Ｐ＝０．０４５。統計分析は、ウェルチのｔ検定を使用して実行された。 （Ａ）ＥＬＩＳＡを用いて測定したＣＡ１９－９レベルを示すグラフである。５人の健常コントロール(正常) 又は５人の膵臓がん患者 (癌)のプールされた血清１ｍＬ (左パネル) における、或いはプールされた血清１ｍＬ由来のＥＶ (右パネル) におけるＣＡ１９－９ レベルを示す。データは平均±ＳＤ (血清ではｎ＝２、ＥＶでは ｎ ＝ ４) である。＊＊Ｐ＝０．０００５０（血清）、＊＊Ｐ＜１０－６（ＥＶ）。（Ｂ）５人の健常コントロール(正常) 又は５人の膵臓がん患者 (癌)のプールされた血清からの 0.2 μg のＥＶにおけるＣＡ１９－９のウエスタンブロッティングの結果である。 ＥＬＩＳＡによって決定された、正常なヒト膵管上皮細胞（ＨＰＤＥ及びＨＰＮＥ）並びに膵臓がん細胞株（Ｐａｎｃ－１、Ｍｉａｐａｃａ－２、ＢｘＰＣ－３、及びＣａｐａｎ－２）由来のＥＶ（１μｇ）のＣＡ１９－９レベルを示すグラフである。正常なヒト膵管上皮細胞、Ｐａｎｃ－１、及びＭｉａｐａｃａ－２細胞由来のＥＶ は、ＣＡ１９－９をほとんど発現していない。データは平均±ＳＤ（ｎ＝４）である。ｎｓ，有意な差が認められない。＊＊Ｐ＜１０－５。 示された細胞株からの細胞ライセート及びＥＶ（０．８μｇ）における ＣＡ１９－９レベルの代表的なウエスタンブロッティングの結果である。３つの独立した実験の代表的な画像を表示した。β－アクチン (細胞ライセート) 又はＣＤ９（ＥＶ） に対するＣＡ１９－９のバンド強度は下図に示した。データは平均±ＳＤ（ｎ＝３）である。 Ｐａｎｃ－１（ＣＡ１９－９陰性）及びＢｘＰＣ－３（ＣＡ１９－９陽性) 細胞における免疫蛍光染色像である。核はＤＡＰＩで染色した。３つの独立した実験の代表的な画像を表示した。スケールバー：１０μｍ。統計分析は、ウェルチのｔ検定を使用して実行した。 抗ＣＡ１９－９抗体を使用して免疫沈降したＥＶ (３μｇ) を、抗ＣＡ１９－９抗体及び抗ＡＦＰ抗体を用いてウエスタンブロッティングにかけた結果である。コントロールとしてアイソタイプＩｇＧを使用した。インプットは、免疫沈降前のＥＶの ２％であった。Ｈｕｈ７細胞由来のＥＶは、ＡＦＰ陽性で、ＣＡ１９－９陰性 (肝がん細胞) であった。Ｃａｐａｎ－２細胞由来のＥＶは、ＡＦＰ陰性、ＣＡ１９－９陽性 (膵臓がん細胞) であった。少なくとも３つの独立した実験の代表的な画像を表示した。 （Ａ）ｄｄＰＣＲによるＨｕｈ７細胞由来ＥＶ及びＣａｐａｎ－２細胞由来ＥＶのＲＮＡにおけるＫＲＡＳ突然変異頻度（ＫＲＡＳ ｍｕｔ／ＷＴ比: 突然変異型及び野生型ＫＲＡＳ ＲＮＡ頻度の比)を示すグラフである。Ｈｕｈ７は野生型のＫＲＡＳ遺伝子を有し、Ｃａｐａｎ－２は変異型ＫＲＡＳをヘテロに有する。データは平均±ＳＤ（ｎ＝３）である。（Ｂ）ｄｄＰＣＲにより１：１の比率でプールされたＨｕｈ７細胞及びＣａｐａｎ－２細胞由来のＥＶのＲＮＡにおけるＫＲＡＳ変異頻度のグラフである。ＫＲＡＳ変異頻度は、プレ増幅ＰＣＲの有無にかかわらず決定された。データは平均±ＳＤ（ｎ＝３）である。ｎｓ，有意な差が認められない。Ｐ＝０．５５。 Ｈｕｈ７細胞及びＣａｐａｎ－２細胞由来のＥＶ （ＩＰ前のサンプル) の １：１ 混合物からＣＡ１９－９抗体を使用して免疫沈降（ＩＰ）したＥＶのＲＮＡにおける、ｄｄＰＣＲによるＫＲＡＳ変異頻度の分析結果である。データは平均±ＳＤ（ｎ＝３）である。＊＊Ｐ＝０．００８０。 ＣＡ１９－９をターゲットとするＩＰによる患者の血清からの膵臓がん由来ＥＶを単離した結果である。５人の健常コントロール(正常) 又は５人の膵臓がん患者 (癌)のプールされた血清由来のＥＶ（１０μｇ）をＩＰにかけた。ＩＰ（２％）前の各サンプルのアリコットをインプットとして使用した。ＩＰには抗ＣＡ１９－９抗体を使用し、ネガティブコントロールにはアイソタイプＩｇＧを使用した。３つの独立した実験の中でのＣＡ１９－９の代表的なウエスタンブロッティングを示す。ＮＳ;非特異的バンドを示す。 膵臓がん患者のプールされた血清（ＩＰ前）由来のＥＶ又はプールされた血清からの抗ＣＡ１９－９ビーズ（ＩＰ）によって捕捉されたがん由来ＥＶのＲＮＡにおけるＫＲＡＳ変異頻度に関する ｄｄＰＣＲの結果である。データは平均±ＳＤ（ｎ＝３）である。＊Ｐ＝０．０２６。 Ｈｕｈ７細胞由来ＥＶ（左パネル、インプット）と抗ＣＤ６３抗体を使用して免疫沈降して溶出したＨｕｈ７細胞由来ＥＶ(右パネル、ＩＰ及び溶出)のサイズ分布の結果である。少なくとも３つの独立した実験の代表的な結果は、モードと平均で表示される。 ５人の膵臓がん患者のプールされた血清から単離されたＥＶのサイズ分布 (左パネル、入力)、及びバルクＥＶからの抗ＣＡ１９－９抗体を使用して免疫沈降して溶出した膵臓がん特異的ＥＶのサイズ分布(右パネル、ＩＰおよび溶出）の結果である。少なくとも３つの独立した実験の代表的な結果は、モードと平均で表示した。統計分析は、ウェルチのｔ検定を使用して実行した。 インビボ実験の概略図である。Ｐａｎｃ－１－ＡＣＴＢ－ＨｉＢｉＴ細胞の培養液からのＥＶ－Ｈ及びＥＶ－Ｌ（５×１０１０粒子) 又はＰＢＳ (コントロール) を ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝３（ＰＢＳ）、ｎ＝４（ＥＶ－Ｈ）、ｎ＝４（ＥＶ－Ｌ））の尾静脈に週２回、４週間投与した。 注射後４週間でのマウスのベースラインからの体重変化を示すグラフである。データは平均±ＳＤである。Ｐ＝０．１３（ＥＶ－Ｈ）、＊Ｐ＝０．０４７（ＥＶ－Ｌ）、＊Ｐ＝０．０３７（ＥＶ－Ｈ 対 ＥＶ－Ｌ）。 平均体重の変化を示すグラフである。 注射後４週間のｇＷＡＴの体重を示すグラフである。データは平均±ＳＤである。Ｐ＝０．３９（ＥＶ－Ｈ）、＊Ｐ＝０．０２８（ＥＶ－Ｌ）、Ｐ＝０．２２（ＥＶ－Ｈ 対 ＥＶ－Ｌ）。 注射後４週間の腹部臓器の代表的な写真である。破線はｇＷＡＴを示す。 組織抽出物ルシフェラーゼ活性によって推定される、注射後のＥＶの分布を示すグラフである。ｇＷＡＴの相対ルシフェラーゼ値（ｎ＝３）を表示する。データは平均±ＳＤである。Ｐ＝０．０７２（ＥＶ－Ｈ)、＊＊Ｐ＝０．０００２５（ＥＶ－Ｌ）、＊＊Ｐ＝０．０００２７（ＥＶ－Ｈ 対 ＥＶ－Ｌ)。 代表的なマウスの血清、肺、及び筋肉のルシフェラーゼ活性によって推定される内在化ＥＶ量を示すグラフである。データは平均±ＳＤ（ｎ＝３）である。ｎｓ，有意な差が認められない。＊Ｐ＜０．０５; ＊＊Ｐ＜０．０１。 ｇＷＡＴのＨ＆Ｅ染色の代表的な画像である。スケールバー：５０μｍ。脂肪滴のサイズ分布を下図に示す。３００個の脂肪滴のサイズを、１グループあたり３匹のマウスで分析した。 注射後４週間のｇＷＡＴライセートにおける細胞内脂肪分解シグナル伝達に関連する因子のウエスタンブロッティングの結果である。グループあたり２匹のマウスからの代表的な画像を表示した。総ＨＳＬタンパク質に対するｐＨＳＬのバンド強度、及びβ－アクチンタンパク質に対する総ＨＳＬ及びＡＴＧＬのバンド強度を下図に示した。データは平均±ＳＤ（ｎ＝３）である。統計分析は、ウェルチのｔ検定を使用して実行した。 オリゴＤＮＡを用いたＥＶ表面タンパク質の検出の概念図である。 ＴＦに対する定量ＰＣＲの結果である。
≪がん細胞由来細胞外小胞群の単離濃縮方法≫
　本実施形態は、患者由来の血液から単離された細胞外小胞群に、糖鎖抗原ＣＡ１９－９親和性物質を接触させ、前記細胞外小胞群から、がん細胞由来細胞外小胞群を単離濃縮する、がん細胞由来細胞外小胞群の単離濃縮方法を提供する。
　実施例において後述するように、本発明者は、膵臓がん患者から単離されたＥＶに、糖鎖抗原ＣＡ１９－９が豊富に含まれていることを見出した。
　糖鎖抗原ＣＡ１９－９は、マウスモノクローナル抗体ＮＳ１９－９で認識されるシアリルＬｅａ抗原であり、腫瘍マーカーの１つとして知られている。
　対象のがんとしては、特に限定されず、乳がん（例えば、浸潤性乳管がん、非浸潤性乳管がん、炎症性乳がん等）、前立腺がん（例えば、ホルモン依存性前立腺がん、ホルモン非依存性前立腺がん等）、膵がん（例えば、膵管がん等）、胃がん（例えば、乳頭腺がん、粘液性腺がん、腺扁平上皮がん等）、肺がん（例えば、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、悪性中皮腫等）、結腸がん（例えば、消化管間質腫瘍等）、直腸がん（例えば、消化管間質腫瘍等）、大腸がん（例えば、家族性大腸がん、遺伝性非ポリポーシス大腸がん、消化管間質腫瘍等）、小腸がん（例えば、非ホジキンリンパ腫、消化管間質腫瘍等）、食道がん、十二指腸がん、舌がん、咽頭がん（例えば、上咽頭がん、中咽頭がん、下咽頭がん等）、頭頚部がん、唾液腺がん、脳腫瘍（例えば、松果体星細胞腫瘍、毛様細胞性星細胞腫、びまん性星細胞腫、退形成性星細胞腫等）、神経鞘腫、肝臓がん（例えば、原発性肝がん、肝外胆管がん等）、腎臓がん（例えば、腎細胞がん、腎盂と尿管の移行上皮がん等）、胆嚢がん、膵臓がん、子宮内膜がん、子宮頸がん、卵巣がん（例、上皮性卵巣がん、性腺外胚細胞腫瘍、卵巣性胚細胞腫瘍、卵巣低悪性度腫瘍等）、膀胱がん、尿道がん、皮膚がん（例えば、眼内（眼）黒色腫、メルケル細胞がん等）、血管腫、悪性リンパ腫（例えば、細網肉腫、リンパ肉腫、ホジキン病等）、メラノーマ（悪性黒色腫）、甲状腺がん（例えば、甲状腺髄様がん等）、副甲状腺がん、鼻腔がん、副鼻腔がん、骨腫瘍（例えば、骨肉腫、ユーイング腫瘍、子宮肉腫、軟部組織肉腫等）、転移性髄芽腫、血管線維腫、隆起性皮膚線維肉腫、網膜肉腫、陰茎がん、精巣腫瘍、小児固形がん（例えば、ウィルムス腫瘍、小児腎腫瘍等）、カポジ肉腫、ＡＩＤＳに起因するカポジ肉腫、上顎洞腫瘍、線維性組織球腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、慢性骨髄増殖性疾患、白血病（例えば、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病等）等が挙げられ、これらに限定されない。
　本実施形態の単離濃縮方法において、糖鎖抗原ＣＡ１９－９親和性物質としては、糖鎖抗原ＣＡ１９－９に親和性を有するものであれば限定されず、ムチン、抗ＣＡ１９－９抗体が挙げられ、抗ＣＡ１９－９抗体が好ましい。抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、抗体断片等が挙げられる。
　糖鎖抗原ＣＡ１９－９親和性物質は、更に担体を含むことが好ましい。担体としては、ケイ素、二酸化チタン、酸化アルミニウム、ガラス、ポリスチレン、セルロース、ポリアミド等のビーズが挙げられる。
　本実施形態の単離濃縮方法の一例として、以下の工程が具体的に挙げられる。先ず、患者由来の血液から単離した血清を、２０００×ｇで４℃１０分間遠心分離した後、上清を０．４５μｍのフィルターを用いて濾過する。次いで、濾過後の上清をサイズ排除カラムにかけて細胞外小胞群を得る。
　得られた細胞外小胞群に抗ＣＡ１９－９抗体結合プロテインＡ／Ｇ磁気ビーズを接触させ、通常の免疫沈降法により、細胞外小胞群から、がん細胞由来細胞外小胞群を単離濃縮する。
　更に、抗ＣＡ１９－９抗体を用いて得られた沈降物を、ＣＡ１９－９陽性ＥＶで高発現している分子に対する標識物を用いて標識してもよい。標識物としては特に限定されず、当該分子に対する標識抗体を用いて標識する方法が挙げられる。抗体の標識に用いられる物質としては、標識酵素が挙げられ、ホースラデッシュ・ペルオキシダーゼやアルカリ・フォスファターゼが挙げられる。
　また、実施例において後述するように、当該分子に対する抗体にオリゴヌクレオチドが結合したものを用いて標識してもよい。このオリゴヌクレオチドに対して定量ＰＣＲを行うことにより、ＥＶ上の当該分子の発現量を定量できる。
≪分析方法≫
　本実施形態は、上記がん細胞由来細胞外小胞群の単離濃縮方法を用いて単離濃縮されたがん細胞由来細胞外小胞群におけるがん関連遺伝子の解析を行い、前記患者の遺伝子型を分析する方法を提供する。
　実施例において後述するように、本実施形態の単離濃縮方法を用いることにより、ＫＲＡＳ変異を有する細胞由来のＥＶを単離濃縮することができる。単離濃縮されたがん細胞由来細胞外小胞群のがん関連遺伝子を、例えば次世代シークエンサーを用いて分析する。
　がん遺伝子としては、ｓｉｓ等の増殖因子をコードする遺伝子群；ｅｒｂＢ、ｆｍｓ、ｒｅｔ等のレセプター型チロシンキナーゼをコードする遺伝子群；ｆｅｓ等の非レセプター型チロシンキナーゼをコードする遺伝子群；ｒａｓ等のＧＴＰ／ＧＤＰ結合タンパク質をコードする遺伝子群；ｓｒｃ、ｍｏｓ、ｒａｆ等のセリン／スレオニンキナーゼをコードする遺伝子群；ｍｙｃ、ｍｙｂ、ｆｏｓ、ｊｕｎ、ｅｒｂＡ等の核内タンパク質をコードする遺伝子群；ｃｒｋ等のシグナル伝達アダプター分子をコードする遺伝子群；Ｂｃｒ－Ａｂｌ等の融合遺伝子が挙げられる。
　更に、がん遺伝子として、Ｓｈｃ、Ｇｒｂ２、Ｓｏｓ、ＭＥＫ、Ｒｈｏ、Ｒａｃ遺伝子等のＲａｓ－ＭＡＰキナーゼ経路関連遺伝子；ＰＬＣγ、ＰＫＣ等のホスホリパーゼＣガンマ-プロテインキナーゼＣ経路関連遺伝子；ＰＩ３Ｋ、Ａｋt、Ｂａｄ等のＰＩ３Ｋ－Ａｋｔ経路関連遺伝子；ＪＡＫ、ＳＴＡＴ等のＪＡＫ－ＳＴＡＴ経路関連遺伝子；ＧＡＰ、ｐ１８０、ｐ６２等のＧＡＰ系経路関連遺伝子が挙げられる。
　また、ｐ５３、Ｒｂ、ＢＲＣＡ１等のがん抑制遺伝子の変異を分析してもよい。
≪薬剤選択方法≫
　本実施形態は、上記分析方法を用いて分析された患者の遺伝子型に基づき、投与すべき薬剤を選択する、薬剤選択方法を提供する。
　例えば、本実施形態の分析方法を用いて、がん化学療法後の患者由来のＥＶの遺伝子型がＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ変異陽性であることが判明した場合、ＫＲＡＳ阻害薬を選択することができる。本実施形態の薬剤選択方法は、血液から単離されたＥＶを用いるため、非侵襲である。
≪キット≫
　本実施形態は、患者由来の血液から単離された細胞外小胞群から、がん細胞由来細胞外小胞群を単離濃縮するキットであって、糖鎖抗原ＣＡ１９－９親和性物質を含む、キットを提供する。キットの構成は、≪がん細胞由来細胞外小胞群の単離濃縮方法≫で述べたものと同様である。
≪抗がん剤≫
　本実施形態は、糖鎖抗原ＣＡ１９－９の機能を中和する抗ＣＡ１９－９抗体を有効成分として含有する、抗がん剤を提供する。
　本実施形態の抗がん剤は、例えば、錠剤、被覆錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤、懸濁剤、乳剤等の形態で経口的に、又は、注射剤、坐剤、皮膚外用剤等の形態で非経口的に投与することもできる。
　薬学的に許容される担体としては、通常の製剤に用いられるものを特に制限なく用いることができる。より具体的には、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、アラビアゴム等の結合剤；デンプン、結晶性セルロース等の賦形剤；アルギン酸等の膨化剤；水、エタノール、グリセリン等の注射剤用溶剤；ゴム系粘着剤、シリコーン系粘着剤等の粘着剤等が挙げられる。薬学的に許容される担体は、１種を単独で又は２種以上を混合して用いることができる。
　本実施形態の抗がん剤は、更に添加剤を含んでいてもよい。添加剤としては、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム等の潤滑剤；ショ糖、乳糖、サッカリン、マルチトール等の甘味剤；ペパーミント、アカモノ油等の香味剤；ベンジルアルコール、フェノール等の安定剤；リン酸塩、酢酸ナトリウム等の緩衝剤；安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等の溶解補助剤；酸化防止剤；防腐剤等が挙げられる。
　添加剤は、１種を単独で又は２種以上を混合して用いることができる。
（投与方法）
　本実施形態の抗がん剤の投与方法は特に限定されず、患者の症状、体重、年齢、性別等に応じて適宜決定すればよい。例えば、錠剤、被覆錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤、懸濁剤、乳剤等は経口投与される。また、注射剤は、単独で、又はブドウ糖、アミノ酸等の通常の補液と混合して静脈内投与され、更に必要に応じて、動脈内、筋肉内、皮内、皮下又は腹腔内投与される。
（投与量）
　本実施形態の抗がん剤の投与量は、患者の症状、体重、年齢、性別等によって異なり、一概には決定できないが、経口投与の場合には、例えば１日あたり１μｇ～１０ｇ、例えば１日あたり０．０１～２０００ｍｇの有効成分を投与すればよい。また、注射剤の場合には、例えば１日あたり０．１μｇ～１ｇ、例えば１日あたり０．００１～２００ｍｇの有効成分を投与すればよい。また、坐剤の場合には、例えば１日あたり１μｇ～１０ｇ、例えば１日あたり０．０１～２０００ｍｇの有効成分を投与すればよい。
　以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
　ＣＡＣは、体重減少、骨格質量の消耗、及び脂肪組織の萎縮を特徴とする腫瘍随伴症候群である。ＣＡＣはがん患者の大部分に発生するが、死亡率の高い早期の膵臓がんに現れることが多い。グレリン受容体アゴニストは現在、ＣＡＣにおける食欲不振を回復するために病院で使用されているが、この多因子疾患に対して新しい治療法が必要である。
　脂肪量の減少は、脂肪細胞で脂肪分解が活性化され、脂肪細胞のサイズが縮小するＣＡＣの重要な特徴である。筋肉の消耗を含む他の特徴は、ＣＡＣの特徴でもあるが、脂肪細胞と他の臓器との間のクロストークは、全身性代謝合併症における脂肪細胞の重要な役割を示唆している。
　腫瘍由来のシグナル伝達因子、全身性炎症、及び代謝機能不全がＣＡＣの原因である可能性があるが、細胞外小胞（ＥＶ）も関与している可能性がある。すべての細胞から血流に放出されるナノ粒子であるＥＶは、細胞間コミュニケーションのメディエーターとして作用する生理活性因子を含む。がん細胞が全身に多数のＥＶを積極的に放出することから、がん細胞由来のＥＶは、ＣＡＣの根底にあるメカニズムに関与している。
［膵臓がん細胞由来ＥＶにおける、エンドサイトーシス後の脂肪分解誘導の検討］
　約２４０ ｎｍのＣａｐａｎ－２細胞由来のＥＶを除き、さまざまなソースからモード径が１００～１５０ｎｍのＥＶを単離した。がん患者の血清中のＥＶの数は、対照よりも多かった。ＥＶにおけるＴＳＧ１０１及びＣＤ６３などのエキソソームマーカーの発現が確認されたことから、ＥＶ単離が適切であることが確認された（図１参照。）。ＥＶの効果を調べるために、成熟したヒト脂肪細胞を、ヒト脂肪由来間葉系幹細胞（ｈＡＤ－ＭＳＣ）から誘導し、ＥＶ処理を行った（図２～４参照。）。脂肪分解レベルの代替マーカーであるグリセリンは、Ｐａｎｃ－１細胞、Ｍｉａｐａｐａｃａ－２細胞、及びＢｘＰＣ－３細胞由来のＥＶで処理した脂肪細胞から有意に高いレベルで放出され、Ｃａｐａｎ－２細胞由来のＥＶで処理した脂肪細胞からは観察されなかった（図５参照。)。
　一般に、脂肪細胞における細胞内サイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）レベル、プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）活性、ホルモン感受性リパーゼ（ＨＳＬ）のＳｅｒ ６６０のリン酸化は、脂肪分解において、重要な役割を果たす。一貫して、ＨＳＬリン酸化レベルと細胞内ｃＡＭＰレベルは、Ｐａｎｃ－１、Ｍｉａｐａｐａｃａ－２、及びＢｘＰＣ－３細胞由来のＥＶで処理された脂肪細胞で有意に上方制御され、Ｃａｐａｎ－２細胞由来のＥＶで処理した脂肪細胞からは観察されなかった（図６～７参照。）。一方、総ＨＳＬレベルと脂肪トリグリセリドリパーゼ（ＡＴＧＬ）レベルは、すべてのサンプルで類似していた（図６参照。）。Ｈ８９（ＰＫＡ 阻害剤）、Ｏｒｌｉｓｔａｔ（ＨＳＬ及びＡＴＧＬの阻害剤）、並びにＣａｙ１０４９９（ＨＳＬ阻害剤）は、放出されたグリセリンレベルを大幅に低下させたため（図８参照。）、これらの分子は、脂肪分解に必須であった。したがって、ヒト脂肪細胞の脂肪分解は、細胞内ｃＡＭＰレベルの上方制御を介して特定のＥＶによって誘導されることが確認された。
　更に、新たに合成されたｃＡＭＰ下でＥＶによって誘導される脂肪分解の依存性を調べた。一般に、イソプロテレノールなどのβ刺激剤はＧタンパク質を活性化し、続いてｃＡＭＰの合成につながるアデニリルシクラーゼを活性化する。実際、イソプロテレノールは、アデニリルシクラーゼ阻害剤ＳＱ２２５３６によって大幅に阻害された脂肪細胞の脂肪分解を誘導する。しかしながら、ＳＱ２２５３６はＰａｎｃ－１由来のＥＶによって誘導される脂肪分解を阻害しなかった(図９（Ａ）（Ｂ）参照。)。これは、ＥＶによって誘導される脂肪分解が、新しく合成されたｃＡＭＰに依存しておらず、取り込まれたＥＶにおけるｃＡＭＰに依存することを示唆する。一貫して、Ｃａｐａｎ－２細胞由来のＥＶよりもＰａｎｃ－ １細胞由来のＥＶの方が、ＥＶ処理５時間後に脂肪細胞に多く取り込まれた（図１０参照。）。
　β－アクチンは、ヒト血清及びヒト細胞株由来のほとんどのＥＶに汎ＥＶマーカーとして含まれている。ＥＶのエンドサイトーシスレベルをモニターするために、Ｐａｎｃ－１細胞のＡＣＴＢ遺伝子座の３’末端にＨｉＢｉＴペプチド配列をノックインすることによりレポーター細胞（Ｐａｎｃ－１－ＡＣＴＢ－ＨｉＢｉＴ細胞）を樹立した（図１１、１２参照。）。細胞ライセートおよびこれらの細胞由来のＥＶにおいて、高いルシフェラーゼ活性を検出し、β－ａｃｔｉｎ－ＨｉＢｉＴタンパク質がＥＶに存在することを確認した（図１３（Ａ）、（Ｂ）参照。）。
　脂肪細胞ライセートのルシフェラーゼ値は、ＥＶを添加してから１時間後に上方制御され、クラスリン媒介エンドサイトーシス阻害剤であるクロルプロマジンを使用した場合の値と同様だったが、マイクロチューブ不安定化剤であるノコダゾール、マクロピノサイトーシスに関連するアクチンＦの阻害剤であるサイトカラシンＤ、カベオラ媒介性輸送の阻害剤であるナイスタチンを使用した場合と、４℃で全てのエンドサイトーシス経路を阻害する場合は、有意に低かった（図１４参照。）。
　したがって、エンドサイトーシス経路は、クラスリン媒介エンドサイトーシスを除いて、脂肪細胞によるＥＶの取り込みに関与していた。比例して、放出されたグリセリンレベルは、エンドサイトーシスが阻害されると大幅に減少した（図１５参照。）。
　次に、膵臓がん患者の血清から分離されたＥＶがｉｎ ｖｉｔｒｏで脂肪分解を誘導するかどうかを調べた。健常者のコントロールからのＥＶもわずかに脂肪細胞からのグリセリン放出を誘導したが、膵臓がん患者のＥＶは、脂肪分解を大幅に誘導した（図１６（Ａ）参照。）。膵臓がん患者のＥＶで処理された脂肪細胞は、一貫して、ＨＳＬのリン酸化レベルと細胞内ｃＡＭＰレベルが有意に高かった（図１７参照。）。一方、健常者のコントロールからのＥＶで処理された脂肪細胞も同様であったが、観察されたレベルは低かった （図１６（Ａ）（Ｂ）、図１７参照。）。また、健常者のコントロールからのＥＶ自体と患者からのＥＶ自体との間でｃＡＭＰレベルに有意差は観察されなかった（図１８参照。）。がん患者の血清は、健常対照者よりも多くのＥＶを含んでいたが、ＥＶ数またはタンパク質重量を調整すると、結果は同様であった（図１９（Ａ）（Ｂ）参照。）。したがって、がん患者のＥＶは脂肪分解を誘発することが確認された。
［膵臓がん患者のＥＶのサイズ及び脂肪分解誘発の検討］
　次に、個々の症例のＥＶを調べたところ、ほぼすべての膵臓がん症例で体重が大幅に減少していた (図２０参照。）。対照例からのＥＶも脂肪分解を誘発したが、膵臓がん患者からのＥＶは大幅に脂肪分解を誘発した（図２１（Ａ）参照。）。ドナー間でＥＶのｃＡＭＰレベルに有意な差は無かった（図２１（Ｂ）参照。）。さらに、コントロールおよびがん症例からのＥＶのｃＡＭＰレベルは、脂肪分解レベルと相関しなかった（図２２（Ａ）参照。）。むしろ、脂肪分解レベルは、コントロールと膵臓がんの両方の症例でＥＶの差分サイズと有意に相関していた(P = 1.32×10-5、r = -0.81297)（図２２（Ｂ）参照。）。重要なことに、膵臓がん患者の血清は、健常コントロールのものよりも有意に少なかった（図２３参照。）。これらの結果は、ヒト脂肪細胞における脂肪分解の誘導は、ＥＶサイズの減少とともに程度が増加することを示唆している。
［脂肪細胞によるＥＶの取り込みの検討］
　ＥＶサイズを変更するために２つの方法を適用した。低グルコース培地で培養した細胞からのＥＶ（ＥＶ－Ｌｏｗ： ＥＶ－Ｌ）は、高グルコース培地で培養された細胞からのＥＶ（ＥＶ－Ｈｉｇｈ：ＥＶ－Ｈ）よりも有意に小さかった（図２４、２５参照。）。低グルコース培地又は高グルコース培地で培養したＰａｎｃ－１－ＡＣＴＢ－ＨｉＢｉＴ細胞由来のＥＶにおいて、β－アクチンタンパク質、ＨｉＢｉＴペプチド、ｃＡＭＰレベルには有意差はなく（図２６、２７（Ａ）（Ｂ）参照。）、ＥＶ－ＨとＥＶ－Ｌは、サイズ以外は同等であった。しかしながら、ＥＶで処理した脂肪細胞ライセートからのルシフェラーゼ値は、ＥＶ－Ｌを使用した場合に、有意に高かった（図２７（Ｃ）参照。）。これは、ＥＶの取り込みが、サイズが小さくなるにつれて増加することを示唆する。同様に、蛍光標識されたＥＶ－Ｌは、脂肪細胞によってより多く取り込まれ（図２８参照。）、脂肪分解誘導の有意な増加を示した（図２９参照。）。
　ＥＶサイズを変更する２つ目の方法として、ＮＰ４０を単離されたＥＶへ終濃度０．５％で添加した（図３０参照。）。ＮＰ４０の添加により、ＥＶの脂質二重膜は部分的に破損し、サイズが縮小した（ＥＶ－ＮＰ４０）（図３１参照。）。また、ＥＶ－ＮＰ４０はルシフェラーゼ値が有意に低かった（図３２（Ａ）参照。）。これは、脂質二重膜の損傷による β－ａｃｔｉｎ－ＨｉＢｉＴ タンパク質の損失によるものである。しかしながら、同じ数のＥＶで処理した脂肪細胞ライセートのルシフェラーゼ値は、ＥＶ－ＮＰ４０を使用すると大幅に高くなった（図３２（Ｂ）参照。）。これらの結果から、EV の取り込みは、サイズが小さくなるにつれて増加することが確認された。
［患者血清中のがん細胞由来のＥＶサイズの検討］
　がん細胞由来のＥＶを特徴付けるために、免疫沈降（ＩＰ）によって特定のＥＶ集団を単離した。糖鎖抗原１９－９（ＣＡ１９－９）は、細胞表面糖鎖である。ＣＡ１９－９は正常な膵臓でも産生されるが、その合成は、膵臓における異常なシアリル化によって著しく増加する。ＥＶは細胞膜のリサイクルによって生成されるため、ＣＡ１９－９ はＣＡ１９－９陽性細胞からのＥＶの表面に存在するはずである。予想通り、ＣＡ１９－９は、膵臓がん患者のバルク血清およびその中のＥＶに豊富に含まれていた（図３３参照。）。ＣＡ１９－９陽性ＥＶを単離する方法を確立するために、正常なヒト膵管上皮細胞（ＨＰＤＥ 及び ＨＰＮＥ）、及びＣＡ１９－９-陰性の膵臓がん細胞 （Ｐａｎｃ－１及びＭｉａｐａｃａ－２）由来のＣＡ１９－９陰性ＥＶ、並びに膵臓がん細胞（ＢｘＰＣ－及びＣａｐａｎ－２）由来のＣＡ１９－９陰性ＥＶ（図３４～３６参照。）を使用した。ＥＶにおけるＣＡ１９－９陽性は、肝細胞がん細胞（Ｈｕｈ７）、結腸直腸がん細胞（ＨＴ－２９）、肺がん細胞（Ａ５４９）、及び白血病細胞（ＨＬ－６０）を含む細胞でのＣＡ１９－９の発現に比例していた（図３５参照。）。
　ＣＡ１９－９をターゲットとするＩＰ法の理論的根拠を確認するために、Ｈｕｈ７細胞由来のＥＶ（ＣＡ１９－９陰性）、Ｃａｐａｎ－２細胞由来ＥＶ（ＣＡ１９－９陽性）、及びそれらの混合物を免疫沈降した。ＩＰサンプルのウェスタンブロッティングにより、高濃度のＣＡ１９－９陽性ＥＶが確認された。特異性は、アイソタイプＩｇＧをＩＰに使用すること、及びＨｕｈ７細胞由来のＥＶでのみ検出されたＡＦＰ（肝細胞がんのマーカーとして使用される異常タンパク質）をアッセイすることにより確認した (図３７参照。)。ほぼ全ての膵臓がん患者は、がん細胞にＫＲＡＳ変異対立遺伝子を持っているため、ＩＰ法の特異性を検証するために、ＥＶのｍＲＮＡのＫＲＡＳ変異頻度を調べた。同数のＨｕｈ７細胞（野生型ＫＲＡＳのみを保有）由来ＥＶとＣａｐａｎ－２細胞（ヘテロで変異ＫＲＡＳを保有）由来ＥＶにおけるインプットサンプル（ＩＰ前）とＩＰ サンプルのＫＲＡＳ変異頻度を調べた（図３８（Ａ）参照。）。前増幅が結果に影響を与えないことを確認した後（図３８（Ｂ）参照。)、ＫＲＡＳ変異頻度は、インプットサンプルよりもＩＰサンプルの方が高いことが確認された（図３９参照。)。これは、ＣＡ１９－９陽性Ｃａｐａｎ－２細胞由来ＥＶが濃縮されていることを示す。
　細胞由来のＥＶと同様に、ＣＡ１９－９陽性ＥＶは、膵臓がん患者の血清由来ＥＶを使用して濃縮された（図４０参照。）。ＫＲＡＳ変異頻度は、ＩＰによって濃縮されたＥＶにおいて有意に高かった（図４１参照。）。ＩＰと溶出がＥＶサイズ分布に影響しないことを確認した後（図４２参照。）、がん細胞由来のＥＶが膵臓がん患者の血清からの総ＥＶよりも有意に小さかったことが確認された（図４３参照。）。
［膵臓がん細胞由来ＥＶにおける脂肪分解誘導の検討］
　上記の結果をｉｎ ｖｉｖｏで確認するために、マウスに異なるサイズのＰａｎｃ－１－ＡＣＴＢ－ＨｉＢｉＴ細胞由来ＥＶ（ＥＶ－Ｈ及びＥＶ－Ｌ）を静脈投与した（図４４参照。）。より大きなＥＶ（ＥＶ－Ｈ）で処理されたマウスは、投与４週間後にコントロールと比較してわずかな体重増加の抑制を示したが、より小さなＥＶ（ＥＶ－Ｌ）で処理されたマウスは、コントロールと比較して、６３．６％の体重増加の抑制を示した（図４５参照。）。ＥＶ－Ｌ処理マウスは体重増加が少ないことを示した（図４６参照。)。ＥＶ－Ｌ処理マウスの性腺白色脂肪組織（ｇＷＡＴ）は、重さとサイズが大幅に小さかった（図４７、４８参照。)。Ｉｎ ｖｉｔｒｏの結果と一致して、ＨｉＢｉＴルシフェラーゼ活性によって推定されるように（図４９参照。）、ＥＶ－ＬはｇＷＡＴにより多く取り込まれた。より小さなＥＶ（ＥＶ－Ｌ）は、ＥＶ－Ｈよりも肺に取り込まれるが、筋肉には取り込まれず、３ 日後の血清中のＥＶ－Ｈレベルは高かった（図５０参照。）。有意により小さな脂肪滴が、ＥＶ－Ｌ処理マウスのｇＷＡＴに見られた（図５１参照。）。一貫して、ｇＷＡＴにおけるＨＳＬ Ｓｅｒ６６０のリン酸化は、ＥＶ－Ｌ処理マウスの方が高かった（図５２参照。）。したがって、小さいＥＶほど脂肪細胞に多く取り込まれ、脂肪分解のより大きな誘導をもたらした。がん細胞は、エネルギー生産のために解糖に依存しているため、一般に、固形がんの腫瘍微小環境は、グルコースレベルが低い。膵臓がん細胞由来のＥＶが小さいのは、膵臓がん組織の腫瘍微小環境における低グルコースによる可能性がある。より多くのＥＶががん細胞によって放出されるという事実とともに、これは、膵臓がんにおける腫瘍由来のＥＶが、がん悪液質の特徴としての脂肪分解の全身の誘導を媒介することを示す。
［オリゴＤＮＡを用いたＥＶ表面タンパク質の検出の検討］
　抗ＣＡ１９－９抗体結合ビーズとＥＶをｉｎｃｕｂａｔｉｏｎして、抗ＣＡ１９－９抗体結合ビーズとＥＶとの第１の複合体を形成した。次いで、この第１の複合体に抗Ｔｉｓｓｕｅ Ｆａｃｔｏｒ（ＴＦ）抗体結合オリゴを添加し、ビーズに結合したＥＶと抗TＦ抗体を結合させ、第２の複合体を形成させた。この第２の複合体に対して定量ＰＣＲを行った（図５３参照。）。この定量ＰＣＲでの増幅産物量がもともとのＥＶに結合していたＤｅｔｅｃｔ抗体の量、すなわち、ＥＶ上に発現する表面抗原（今回はＴＦ）の量に比例する。結果を図５４に示す。ＣＡ１９－９陽性ＥＶでＴＦが高発現していることが確認された。
　本実施形態によれば、高精度かつ非侵襲的にがんを診断できる。

Claims (11)

  1. 　患者由来の血液から単離された細胞外小胞群に、糖鎖抗原ＣＡ１９－９親和性物質を接触させ、前記細胞外小胞群から、がん細胞由来細胞外小胞群を単離濃縮する、がん細胞由来細胞外小胞群の単離濃縮方法。
  2. 　前記糖鎖抗原ＣＡ１９－９親和性物質は、抗ＣＡ１９－９抗体である、請求項１に記載のがん細胞由来細胞外小胞群の単離濃縮方法。
  3. 　前記糖鎖抗原ＣＡ１９－９親和性物質は、更に担体を含む、請求項１に記載のがん細胞由来細胞外小胞群の単離濃縮方法。
  4. 　前記担体は、ビーズである、請求項３に記載のがん細胞由来細胞外小胞群の単離濃縮方法。
  5. 　請求項１～４のいずれか一項に記載のがん細胞由来細胞外小胞群の単離濃縮方法を用いて単離濃縮されたがん細胞由来細胞外小胞群におけるがん関連遺伝子の解析を行い、前記患者の遺伝子型を分析する、分析方法。
  6. 　請求項５に記載の分析方法を用いて分析された患者の遺伝子型に基づき、投与すべき薬剤を選択する、薬剤選択方法。
  7. 　患者由来の血液から単離された細胞外小胞群から、がん細胞由来細胞外小胞群を単離濃縮するキットであって、糖鎖抗原ＣＡ１９－９親和性物質を含む、キット。
  8. 　前記糖鎖抗原ＣＡ１９－９親和性物質は、抗ＣＡ１９－９抗体である、請求項７に記載のキット。
  9. 　前記糖鎖抗原ＣＡ１９－９親和性物質は、担体を含む、請求項７に記載のキット。
  10. 　前記担体は、ビーズである、請求項９に記載のキット。
  11. 　糖鎖抗原ＣＡ１９－９の機能を中和する抗ＣＡ１９－９抗体を有効成分として含有する、抗がん剤。
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