WO2023187244A1 - Uso de sifnar2 en el tratamiento de la infección por sars-cov-2 - Google Patents

Uso de sifnar2 en el tratamiento de la infección por sars-cov-2 Download PDF

Info

Publication number
WO2023187244A1
WO2023187244A1 PCT/ES2023/070210 ES2023070210W WO2023187244A1 WO 2023187244 A1 WO2023187244 A1 WO 2023187244A1 ES 2023070210 W ES2023070210 W ES 2023070210W WO 2023187244 A1 WO2023187244 A1 WO 2023187244A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
sifnar2
agents
protein
sars
cov
Prior art date
Application number
PCT/ES2023/070210
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Óscar FERNÁNDEZ FERNÁNDEZ
Begoña OLIVER MARTOS
Isaac HURTADO GUERRERO
José PAVÍA MOLINA
Antonio Alcamí Pertejo
María Isabel SOLA GURPEGUI
Luis ENJUANES SÁNCHEZ
Jesús HURTADO TAMAYO
Original Assignee
Servicio Andaluz De Salud
Universidad De Málaga
Consejo Superior De Investigaciones Científicas
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Servicio Andaluz De Salud, Universidad De Málaga, Consejo Superior De Investigaciones Científicas filed Critical Servicio Andaluz De Salud
Publication of WO2023187244A1 publication Critical patent/WO2023187244A1/es

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A61K38/1793—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • C07K14/7156—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for interferons [IFN]

Definitions

  • the present invention is within the field of biomedicine and biotechnology, and refers to the use of the recombinant SIFNAR2 soluble receptor in the treatment of infection by the SARS-CoV-2 coronavirus.
  • Viruses are intracellular parasites that use the metabolic machinery of the infected host cell. Therefore, the development of antivirals presents a series of difficulties associated with this obligate parasitic nature. It is difficult to achieve adequate antiviral activity without affecting the metabolism of the host cell and without causing negative effects on other uninfected cells in the body.
  • coronaviruses In the 21st century, we have seen coronaviruses emerge in Asia, the East and the West. Coronaviruses are a family of viruses that cause respiratory diseases. In 2002- In 2003, severe acute respiratory syndrome (SARS) affected 238 people and killed 33 in Singapore, including healthcare workers. Ten years after that, the Middle East respiratory syndrome coronavirus (MERS or nCoV-2012) emerged in the Middle East and continues to emerge with sporadic cases and localized outbreaks, including one in Korea. The outbreak of pneumonia caused by the acute respiratory disease Novel Coronavirus 2019-nCoV (also named as COVID-19 by WHO on February 11, 2020) in Wuhan, Hubei province of China, at the end of 2019 is a great challenge for public health and clinical treatment.
  • SARS severe acute respiratory syndrome
  • RNA viruses with crown-shaped spikes on their envelope have been predicted to be emerging pathogens with outbreak potential due to their inherent propensity for rapid mutation and recombination due to their large genomes.
  • Type I interferons (alpha, beta and omega) exert their action through the interaction with the membrane receptor IFNAR, formed by two subunits IFNAR1 and IFNAR2.
  • interferon beta - IFNB after the binding of IFNI3. to IFNAR2, the dimehzation of the two subunits occurs and the activation of the intracellular signaling cascade whose signal is transduced to the nucleus through the Jak-Stat pathway. In this way, the antiviral, antiproliferative and immunomodulatory activities of I FNI3> are exerted.
  • the IFNAR2 subunit of the receptor undergoes alternative processing of the mRNA that gives rise to three different forms: a short form (IFNAR2b), a functionally active long form (IFNAR2c) and the soluble form (SIFNAR2, IFNAR2.3 or IFNAR2a). ).
  • IFNAR2c acts as a functional receptor together with IFNAR1 and is capable of mediating the biological effects of I FNI3>.
  • SIFNAR2 which lacks cytoplasmic and transmembrane domains, has been identified in human biological fluids and although its role is not defined, it has been suggested that it may have neutralizing capacity for the binding of I FNI3> with the IFNAR2 receptor. In this way it could exert modulating functions depending on the concentration at which it is located; On the one hand, it could neutralize the binding of IFNI3. to the IFNAR receptor or, on the contrary, prolong the half-life of IFNI3. circulating, preventing its degradation or the formation of oligomers. To date, the function of the soluble variant of IFNAR2 remains unknown.
  • SIFNAR2 is very similar to that of interferon beta-IFN-p, also producing a decrease in pro-inflammatory cytokines, showing an antiproliferative effect and presenting a antiviral activity against the encephalomyocarditis virus.
  • SIFNAR2 in in vivo treatment in muhine models with multiple sclerosis produced an improvement in the severity of the disease, a reduction in the activation state of CD4+ T lymphocytes and a decrease in the major inflammatory process. than the other two types of treatment under study, proposing its use in the treatment of diseases that cause inflammation (Suard ⁇ az, M. et al., 2016).
  • RNA viruses such as encephalomyocarditis, vesicular stomatitis, human immunodeficiency virus, human respiratory syncytial virus and human metapneumovirus.
  • the inventors of the present invention have verified the antiviral effect of a recombinant SIFNAR2 protein, analogous to the soluble form of the IFNB receptor, against SARS-Cov2.
  • the authors of the present invention have produced the SIFNAR2 protein recombinantly, a protein analogous to the human soluble IFN beta receptor: It was cloned in E.coli and has 239 amino acids and a molecular weight of 29 KDa. This protein has been tested in the Coronavirus unit of the National Center for Microbiology in cellular models infected with Coronavirus.
  • Vero cells were infected with SARS-Cov-2 (MOI: 0.001) for 48 hours in the presence of 5 different concentrations of SIFNAR2 (3.75, 7.5, 15, 30 and 60 (ug/ml). With the concentration of 60ug/ml, a significant reduction in the number of UPF/ml was found, as shown in Figure 1.
  • a first aspect of the invention refers to the protein lFNAR2, of amino acid sequence SEQ ID NO: 2, or a protein with an identity of at least: a) 90% with SEQ ID NO: 2, b) A 95% with SEQ ID NO: 2, c) 99% with SEQ ID NO:2, and that has the activity and structural characteristics of the SIFNAR2 protein, from now on "protein of the invention", for its use in the prevention, improvement, relief and/or treatment of coronavirus infection.
  • Coronaviruses are organisms of the Virus Superkingdom, order Nidovirales, suborder Cornidovirineae Family Coronaviridae', Subfamily Orthocoronavirinae-, Genus Betacoronavirus', Subgenus Sarbecovirus', Species Severe acute respiratory syndrome-related coronavirus.
  • coronavirus SARS-CoV-2 In a preferred embodiment of the invention the coronavirus SARS-CoV-2.
  • antibodies or fragments thereof capable of binding to the recombinant protein of the invention are also an object of the present invention. These antibodies or fragments thereof can be easily obtained from antisera.
  • Antisera to the recombinant protein described in the present invention can be generated by standard techniques, for example, by injection of the recombinant protein. invention in an appropriate animal and collection and purification of antisera from the animals.
  • Antibodies or fragments thereof that bind to SEQ ID NO: 2, or a variant sequence thereof according to the invention can be identified by standard immunoassays.
  • the antibodies thus obtained (hereinafter referred to as antibodies of the invention) can be used for the diagnostic method of the invention.
  • the antibodies or fragments thereof are monoclonal antibodies.
  • the invention relates to an antibody or a fragment thereof that specifically recognizes the protein of the invention, hereinafter antibody of the invention, for use as a medicine for the prevention, improvement, relief and/or or treatment and/or relief of coronavirus infection. It also refers to the use of the antibody of the invention for the diagnosis of a coronavirus infection.
  • Antibodies contemplated in the context of the present invention include polyclonal antisera, purified IgG molecules, supernatants or ascitic fluid containing monoclonal antibodies, Fv, Fab, Fab' and F(ab') 2 fragments, ScFvdiabodies, triabodies, tetrabodies and humanized antibodies .
  • composition of the invention comprising the protein of the invention or the antibody of the invention, for the prevention, improvement, alleviation and/or treatment of infection. by coronavirus.
  • the composition is a pharmaceutical composition that optionally further comprises a pharmaceutically acceptable carrier and/or pharmaceutically acceptable excipients.
  • the composition of the invention further comprises another active ingredient.
  • this active ingredient is selected from the list consisting of other antivirals, analgesics, antipyretics, decongestants or other active ingredients used in the treatment of viral diseases.
  • the coronavirus is SARS-SARS-SARS-SARS-SARS-SARS-SARS-SARS-SARS-SARS-SARS-SARS
  • Adjuvants and “pharmaceutically acceptable vehicles” refer to those substances, or combinations of substances, known in the pharmaceutical sector, used in the preparation of pharmaceutical forms of administration and include, but are not limited to, solids, liquids, solvents or surfactants. .
  • the pharmaceutically acceptable carriers that can be used in the present invention are those carriers known in the state of the art.
  • the dosage to obtain a therapeutically effective amount depends on a variety of factors, such as the age, weight, sex or tolerance, of the individual to whom it is administered.
  • the expression "therapeutically effective amount” refers to the amount of the pharmaceutical composition of the invention that produces the desired effect and, in general, will be determined, among other causes, by the characteristics of said compounds and said pharmaceutical composition and the therapeutic effect to be achieved.
  • composition of the invention further comprises a pharmaceutically acceptable carrier.
  • composition of the invention further comprises another active ingredient or therapeutic agent.
  • Said therapeutic agent is preferably selected from an analgesic agent (in the treatment of inflammation and pain) or an anti-infective agent (in the prevention of infection).
  • analgesics such as non-spheroid anti-inflammatory drugs; opioid agonists and salicylates; anti-infective agents such as anthelmintics, antianaerobics, antibiotics, aminoglycoside antibiotics, antifungal antibiotics, cephalosporins, macrolide antibiotics, various beta-lactam antibiotics, penicillins, quinolone antibiotics, sulfonamide antibiotics, tetracycline antibiotics, antimycobacterials, antituberculous antimycobacterials, anti-protozoa rivers, antimalarial antiprotozoals, antiviral agents, anti-retroviral agents, scabicides, anti-inflammatory agents, anti-inflammatory corticosteroids, topical antipruritic/local anesthetics, anti-infectives, topical anti-infective antifungals, topical anti-infective antivirals; electrolyte and
  • useful therapeutic agents include: (1) analgesics in general, such as lidocaine or its derivatives, and analgesic non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs), including diclofenac, ibuprofen, ketoprofen, naproxen, (2 ) opioid agonist analgesics, such as codeine, fentanyl, hydromorphone, and morphine; (3) salicylate analgesics, such as aspirin (ASA), (4) antihistamine H1 blockers, such as terfenadine, clemastine, (5) anti-infective agents, such as mupirocin; (6) anti-anaerobic anti-infectives, such as chloramphenicol and clindamycin; (7) antifungal anti-infective antibiotics, such as amphotericin B, clotrimazole, fluconazole and ketoconazole; (8) macrolide antibiotic such as azithromycin and erythromycin
  • active ingredient means any component that potentially provides a pharmacological activity or other different effect in the diagnosis, cure, mitigation, treatment, or prevention of a disease, or that affects the structure or function of the body of the man or other animals.
  • the term includes those components that promote a chemical change in the preparation of the drug and are present in the drug in an intended modified form that provides the specific activity or effect.
  • medicine refers to any substance used for prevention, diagnosis, alleviation, treatment or cure of diseases or prevention of unwanted physiological states in man and animals.
  • the term “individual” is not intended to be limiting in any aspect, and may be of any age, sex and physical condition.
  • SIFNAR2 is available with GenBank (NCBI) accession number L41943.1 and is named here as SEQ ID NO: 2.
  • SIFNAR2 is also defined by a nucleotide or polynucleotide sequence, which constitutes the coding sequence of the protein included in SEQ ID NO: 2, and which would comprise various variants coming from: a) acid molecules nucleic acid that encode a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, b) nucleic acid molecules whose complementary chain hybridizes with the polynucleotide sequence of a), c) nucleic acid molecules whose sequence differs from a) and/ or b) due to degeneration of the genetic code, d) nucleic acid molecules that encode a polypeptide comprising the amino acid sequence with an identity of at least 90%, 95%, 98% or 99% with SEQ ID NO: 2, and in which the polypeptide encoded by said nucleic acids has the activity and structural characteristics of the SIFNAR2 protein.
  • GenBank NCBI sequence L41943.1
  • polynucleotide and “nucleic acid” are used interchangeably here, referring to polymeric forms of nucleotides of any length, both ribonucleotides (RNA or RNA) and deoxyribonucleotides (DNA or DNA).
  • amino acid sequence refers to a polymeric form of amino acids of any length, which may be coding or non-coding, chemically or biochemically modified.
  • Fig. 1 Evaluation of the effect of SIFNAR2 in Vero E6 cells infected with SARS-Cov-2.
  • the cells were infected with SARS-Cov-2 (MOI: 0.001) and incubated for 48 hours in the presence of 5 different concentrations of SIFNAR2 (0, 3 .75, 7.5, 15, 30 and 60 ug/ml). With the concentration of 60ug/ml, a significant reduction in the number of plaque-forming units (PFU)/mi was found.
  • Fig. 2 Evaluation of the effect of SIFNAR2 in Vero E6 cells infected with SARS-Cov-2. Graph of viral growth (relative units) in the presence of different concentrations of the compound SIFNAR2. The cells were infected with SARS-Cov-2 (MOI: 0.001) and incubated for 48 hours in the presence of 5 different concentrations of SIFNAR2 (0, 3.75, 7.5, 15, 30 and 60 ug/ml). It is observed how viral growth decreases as the concentration of SIFNAR2 increases, reaching practically zero at concentrations of 60 pg/ml.
  • Fig. 3 Evaluation of cell viability in the presence of SIFNAR2. Vero E6 cells were incubated for 72 hours in the presence of 5 different concentrations of SIFNAR2 (0, 3.75, 7.5, 15, 30 and 60 ug/ml) and subsequently the percentage of cell viability was evaluated by the MTT method. Cell viability was close to 100% at all concentrations tested, even the highest, which shows the non-toxicity of the SIFNAR2 compound on cells.
  • the cloning of the protein was carried out at the IBIMA Research Laboratory (Málaga, Spain).
  • the experiments with SARS-CoV2 were carried out at the “National Center of Microbiology. Carlos III Health Institute” (Madrid, Spain).
  • the protein cloning and purification process is briefly described.
  • the prokaryotic expression system pEcoli-Cterm 6xHN Linear (Clontech®) was chosen to ligate the SIFNAR2 insert and after that, the DH5a Competent CellsTM (Invitrogen®) were transformed with the plasmid.
  • the purified plasmid was introduced into BL21 (DE3) bacteria (Invitrogen®) to produce recombinant human SIFNAR2 or rh-slFNAR2.
  • recombinant SIFNAR2 was detected by Western blot using anti-IFNAR2 human MaxPab antibody (Abnova®) and identified by mass spectrometry (MALDI-TOF).
  • each batch of soluble 6xHN-tagged SIFNAR2 protein was purified by affinity chromatography on an ⁇ KTA FPLC system (GE Healthcare), according to standard procedures. Fractions were analyzed on 10% SDS polyacrylamide gels stained with Coomassie Brilliant Blue (BIORAD). The recombinant SIFNAR2 protein was dialyzed against phosphate-buffered saline (PBS) and then quantified and loaded onto a gel. The final product has a purity greater than 95%. Protein densitometry was performed using ImageJ 1.440 software (HIH, Bethesda, MD) to determine their concentration.
  • Vero E6 cells were cultured in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM; Merck) supplemented with 25 mM HEPES (Gibco), 50 pg/ml gentamicin (Sigma-Aldrich, USA), 2 mM L-glutamine (Sigma-Aldrich), 1% (v/v) non-essential amino acids (Sigma-Aldrich) and 10% (v/v) HyCloneTM fetal bovine serum (FBS, Gibco). Infected cells were maintained in DMEM supplemented with 2% FBS.
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium
  • FBS HyCloneTM fetal bovine serum
  • Vero E6 cells were infected with the virus (rSARS-CoV-2 - WT-Wuhan Hu-1 GenBank MN908947) at a multiplicity of infection (MOI) of 0.001 PFU/cell in supplemented DMEM. with 25 mM HEPES (PanReac) and 2% FBS, and infection was allowed to proceed for 48 h at 37°C.
  • the titer of the viral stock was 1 x10 7 PFU/ml.
  • Viral infections were carried out following standard procedures and using closed fiascos. To control the absence of contamination, the supernatants of infected cells were titrated. simulated, which were maintained in parallel with the infected cultures; In none of the experiments was infectivity detected in the mock-infected cultures.
  • M24 wells were infected in triplicate with confluent Vero E6 cells at a multiplicity of infection (MOI) of 0.001 with rSARS-CoV-2-WT (Wuhan Hu-1 GenBank MN908947), in the presence of different concentrations of rh-slFNAR2 compound (0, 3.75, 7.5, 15, 30 and 60 pg/mi).
  • MOI multiplicity of infection
  • the infection was incubated for 48 hours and the supernatant was subsequently taken for assessment by plaque lysis assay.
  • Virus titers were determined by plaque assays on Vero E6 cells grown to 100% confluency in 12-well plates. The plates were incubated at 37°C in sealed plastic bags. The titration test was carried out in a biosafety level 3 laboratory (BSL3) of the National Biotechnology Center (CNB-CSIC). Supernatants from SIFNAR2-treated and rSARS-CoV-2-WT-infected cells were serially diluted in PBS and seeded onto Vero E6 cells.
  • BSL3 biosafety level 3 laboratory
  • CNB-CSIC National Biotechnology Center
  • an MTT assay (a colorimetric assay that measures cellular metabolic activity) was performed to study the toxicity of this compound in Vero E6 cells and cell viability, testing different concentrations ranging from 0, 3.75, 7, 5, 15, 30 and 60 pg/mi, incubated for 72 hours, with viability not altered at any of the concentrations tested (Fig. 3).
  • the MTT assay consisted of adding 10 ⁇ l of MTT reagent (3-(4,5-dimethylthiazol-2- ⁇ l)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) (5 mg/mL) per well of M96.
  • MTT (Merck_Ref: M2128) dissolved in 1X PBS (5 mg/mL) and sterilized by filtration. Incubate 2 hours at 37 °C. The culture medium was removed with a vacuum cleaner, avoiding dragging the formazan crystals (purple crystals) from the monolayer.
  • 150 pL of DMSO Merck_Ref: D2650

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

Uso del receptor soluble sIFNAR2 en el tratamiento de la infección por el coronavirus SARS-CoV-2, y composiciones que comprenden dicha proteína.

Description

USO DE SIFNAR2 EN EL TRATAMIENTO DE LA INFECCIÓN POR SARS-COV-2
DESCRIPCIÓN
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se encuentra dentro del campo de la biomedicina y la biotecnología, y se refiere al uso del receptor soluble SIFNAR2 recombinante en el tratamiento de la infección por el coronavirus SARS-CoV-2.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Los avances producidos en la terapia de las enfermedades virales son de menor magnitud que los que se han conseguido para el tratamiento de las infecciones bacterianas. El desarrollo de agentes antivirales de amplio espectro altamente eficaces es un objetivo primordial compartido por los campos de la virología y la farmacología.
Los virus son parásitos intracelulares que utilizan la maquinaria metabólica de la célula hospedadora infectada. Por tanto, el desarrollo de antivirales presenta una serie de dificultades asociados a dicho carácter parasitario obligado. Es complicado alcanzar una actividad antiviral adecuada sin afectar al metabolismo de la célula hospedadora y sin causar efectos negativos en otras células no infectadas del organismo.
Las estrategias actuales de control de la infectividad viral se basan en la identificación de agentes capaces de intervenir en los pasos esenciales de la infección viral, como la entrada (fusión, endocitosis), replicación, ensamblaje, además de fármacos dirigidos frente a la envoltura viral. Otra estrategia ¡ría dirigida a la modulación del sistema de defensa celular.
La identificación de agentes antivirales de amplio espectro focalizados en disminuir la infectividad viral o para modular las defensas del huésped supondría una contribución importante en el campo de la virología para la mejora de la salud humana y control epidemias virales.
En el siglo XXI, hemos visto surgir coronavirus en Asia, Oriente y Occidente. Los coronavirus son una familia de virus que causan enfermedades respiratorias. En 2002- 2003, el síndrome respiratorio agudo severo (SRAS) afectó a 238 personas y mató a 33 en Singapur, incluidos los trabajadores de la salud. Diez años después de eso, el coronavirus del síndrome respiratorio del Medio Oriente (MERS o nCoV-2012) surgió en el Medio Oriente y continúa apareciendo con casos esporádicos y brotes localizados, incluido uno en Corea. El brote de neumonía causada por la enfermedad respiratoria aguda Nuevo Coronavirus 2019-nCoV (también nombrada como COVID- 19 por la OMS el 11 de febrero de 2020) en Wuhan, provincia de Hubei de China, al final de 2019 es un gran desafío para la salud pública y el tratamiento clínico. Todos estos coronavirus han tenido una morbilidad y mortalidad humanas significativas. Se ha predicho que estos virus de ARN con picos en forma de corona en su envoltura son patógenos emergentes con potencial de brote debido a su propensión inherente a una rápida mutación y recombinación debido a sus genomas grandes.
En la actualidad es urgente investigar los medicamentos antivirales que podrían ser útiles en el tratamiento de la COVID-19 provocada por el coronavirus SARS-CoV2.
El uso de interferones resulta clave en la búsqueda de estos tratamientos antivirales.
Los interferones tipo I (alpha, beta and omega), ejercen su acción a través de la interacción con el receptor de membrana IFNAR, formado por dos subunidades IFNAR1 e IFNAR2.
En concreto, en el caso del interferon beta - IFNB, Tras la unión del IFNI3. a IFNAR2, se produce la dimehzación de las dos subunidades y la activación de la cascada de señalización intracelular cuya señal es transducida al núcleo a través de la vía Jak- Stat. De esta forma se ejercen las actividades antivirales, antiproliferativas e inmunomoduladoras del I FNI3>.
La subunidad IFNAR2 del receptor sufre un procesamiento alternativo del ARNm que da lugar a tres ¡soformas distintas: una ¡soforma corta (IFNAR2b), una ¡soforma larga funcionalmente activa (IFNAR2c) y la ¡soforma soluble (SIFNAR2, IFNAR2.3 o IFNAR2a).
Solamente IFNAR2c actúa como receptor funcional junto con IFNAR1 y es capaz de mediar los efectos biológicos del I FNI3>. SIFNAR2 que carece de dominios citoplasmáticos y transmembrana, ha sido identificada en fluidos biológicos humanos y aunque su papel no está definido, se ha sugerido que pueda tener capacidad neutralizante de la unión del I FNI3> con el receptor IFNAR2. De esta forma podría ejercer funciones moduladoras según la concentración a la que se encuentre; por un lado podría neutralizar la unión del IFNI3. al receptor IFNAR o por el contrario, prolongar la vida media del IFNI3. circulante, impidiendo su degradación o la formación de oligómeros. A día de hoy sigue siendo desconocida la función de la vanante soluble de IFNAR2.
En estudios realizados con ratones transgénicos que tras la infección con SARS-CoV- 2 desarrollan una patología similar a la de los pacientes gravemente enfermos o a la de los que padecen COVID persistente (Sefik, E. et al., 2021} se ha sugerido el uso de anticuerpos frente a IFNAR2 que inhiban su señal en terapia combinadas para tratar la COVID persistente, al observarse una mejoría en estos ratones y una reducción en el estado inflamatorio de los mismos.
Otros autores (Hurtado-Guerrero, J. et al, 2020) señalan que la actividad biológica de SIFNAR2 es muy semejante a la del interferon beta- IFN-p, produciendo igualmente una disminución de citoquinas pro inflamatorias, mostrando un efecto antiproliferative y presentando una actividad antiviral frente al virus de la encefalomiocarditis.
Otros estudios comprobaron que la administración de SIFNAR2 en el tratamiento ¡n vivo en modelos muhnos con esclerosis múltiple produjo una mejoría en la severidad de la enfermedad, una reducción en el estado de activación de los linfocitos T CD4+y una disminución del proceso inflamatorio mayor que los otros dos tipos de tratamiento objeto de estudio, proponiéndose su utilización en el tratamiento de enfermedades que cursan con inflamación (Suardíaz, M. et al., 2016).
Así, tanto Hurtado-Guerrero, J. et al. como Suardíaz, M. et al. señalan que la actividad tanto in vitro como in vivo de IFNAR2.3 podría ser muy semejante a la del interferon beta- IFN-p. En ambos casos esta actividad parece ser independiente de la presencia de IFN-p y parece cursar mediante la activación de una vía de señalización celular diferente. En contraposición, otros estudios (Samarajiwa, S. A. et al., 2014), señalan que la actividad inmunomoduladora de SIFNAR2 parece derivarse de una mayor activación de la vía de señalización del IFN-p, al menos en la respuesta producida en el choque séptico.
Así pues, función concreta de la variante soluble de IFNAR2 y el mecanismo de acción que media en su actividad biológica no están aun claros.
En WO2017/109257 se demuestra la actividad antiviral de la ¡soforma soluble de SIFNAR2 frente a algunos virus ARN de cadena sencilla como el de la encefalomiocarditis, el de la estomatitis vesicular, el virus de la inmunodeficiencia humana, el virus respiratorio sincitial humano y el metaneumovirus humano.
Sin embargo, ninguno de los estudios previos sugiere la aplicación de la ¡soforma soluble de SIFNAR2 en el tratamiento de las infecciones producidas por virus de la familia Coronaviridae, como el SARS-CoV-2. Tampoco se aborda en el estado de la técnica la influencia que podría tener SIFNAR2 en la evolución de una infección con SARS-CoV-2.
Los inventores de la presente invención han comprobado el efecto antiviral de una proteína recombinante SIFNAR2, análoga a la ¡soforma soluble del receptor de IFNB, frente al SARS-Cov2.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
Los autores de la presente invención han producido la proteína SIFNAR2 de manera recombinante, proteína análoga al receptor soluble de IFN beta humano: Fue clonada en E.coli y tiene 239 aminoácidos y un peso molecular de 29 KDa. Esta proteína ha sido probada en la unidad de Coronavirus del Centro Nacional de Microbiología en modelos celulares infectados con Coronavirus.
Células Vero fueron infectadas con el SARS-Cov-2 (MOI: 0.001) durante 48 horas en presencia de 5 concentraciones diferentes de SIFNAR2 (3.75, 7.5, 15, 30 y 60 (ug/ml). Con la concentración de 60ug/ml se encontró una reducción significativa en el número de UPF/ml, tal y como se muestra en la Figura 1.
Posteriormente, en las mismas condiciones, se observó como disminuyó el crecimiento viral a medida que aumentaba la concentración de SIFNAR2, tal y como se muestra en la Figura 2.
La viabilidad celular no se vio afectada en ninguna de las concentraciones de SIFNAR2 probadas, tal y como se muestra en la Figura 3.
Usos de la proteína de la invención
Por tanto, un primer aspecto de la invención se refiere a la proteínaslFNAR2, de secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 2, o una proteína con una identidad de al menos: a) Un 90% con la SEQ ID NO: 2, b) Un 95% con la SEQ ID NO: 2, c) Un 99% con la SEQ ID NO:2, y que posee la actividad y las características estructurales de la proteína SIFNAR2, , de ahora en adelante “proteína de la invención”, para su uso en la prevención, mejora, alivio y/o tratamiento de la infección por coronavirus.
Los coronavirus son organismos del Superreino Virus, orden Nidovirales, suborden Cornidovirineae Familia Coronaviridae', Subfamilia Orthocoronavirinae-, Género Betacoronavirus', Subgénero Sarbecovirus', Especie Severe acute respiratory syndrome-related coronavirus.
En una realización preferida de la invención el coronavirus el SARS-CoV-2.
Además, el uso de los anticuerpos o fragmentos de los mismos capaces de unirse a la proteína recombinante de la invención son también un objeto de la presente invención. Estos anticuerpos o fragmentos de los mismos se pueden obtener fácilmente a partir de antisueros.
Los antisueros para la proteína recombinante descrita en la presente invención pueden ser generados por técnicas estándar, por ejemplo, por inyección de la proteína de la invención en un animal apropiado y recogida y purificación de los antisueros de los animales. Los anticuerpos o fragmentos de los mismos que se unen a la SEQ ID NO: 2, o una secuencia vanante de la misma de acuerdo con la invención pueden ser identificados por inmunoensayos estándar. Los anticuerpos así obtenidos (en lo sucesivo, anticuerpos de la invención) se pueden usar para el método de diagnóstico de la invención. Preferiblemente, los anticuerpos o fragmentos de los mismos son anticuerpos monoclonales.
Así pues, en otro aspecto la invención se refiere a un anticuerpo o un fragmento del mismo que reconoce específicamente la proteína de la invención, de ahora en adelante anticuerpo de la invención, para su uso como medicamento para la prevención, mejora, alivio y/o tratamiento y/o alivio de la infección por coronavirus. También se refiere al uso del anticuerpo de la invención para el diagnostico de una infección por coronavirus. Anticuerpos contemplados en el contexto de la presente invención incluyen antisueros policlonales, moléculas de IgG purificadas, sobrenadantes o líquido ascítico que contiene anticuerpos monoclonales, fragmentos Fv, Fab, Fab' y F(ab')2, ScFvdiabodies, triabodies, tetrabodies y anticuerpos humanizados.
Composición de la invención
Otro aspecto de la invención se refiere a una composición, de ahora en adelante “composición de la invención”, que comprende la proteína de la invención o el anticuerpo de la invención, para la prevención, mejora, alivio y/o tratamiento de la infección por coronavirus.
En una realización preferida de este aspecto de la invención, la composición es una composición farmacéutica que opcionalmente además comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y/o excipientes farmacéuticamente aceptables.
En otra realización preferida de este aspecto de la invención, la composición de la invención además comprende otro principio activo. Preferiblemente, este principio activo se selecciona de la lista que consiste en otros antivirales, analgésicos, antipiréticos, descongestivos u otros principios activos utilizados en el tratamiento de enfermedades víricas. En otra realización preferida de este aspecto de la invención, el coronavirus es SARS-
CoV2
Los "adyuvantes" y "vehículos farmacéuticamente aceptables" se refieren a aquellas sustancias, o combinación de sustancias, conocidas en el sector farmacéutico, utilizadas en la elaboración de formas farmacéuticas de administración e incluyen, pero sin limitarse, sólidos, líquidos, disolventes o tensioactivos. Los vehículos farmacéuticamente aceptables que pueden ser utilizados en la presente invención son los vehículos conocidos en el estado de la técnica.
La dosificación para obtener una cantidad terapéuticamente efectiva depende de una variedad de factores, como por ejemplo, la edad, peso, sexo o tolerancia, del individuo al que se administre. En el sentido utilizado en esta descripción, la expresión "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a la cantidad de la composición farmacéutica de la invención que produzca el efecto deseado y, en general, vendrá determinada, entre otras causas, por las características propias de dichos compuestos y de dicha composición farmacéutica y el efecto terapéutico a conseguir.
En otra realización preferida, la composición de la invención además comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable. En otra realización preferida, la composición de la invención además comprende otro principio activo o agente terapéutico. Dicho agente terapéutico se selecciona, preferiblemente, de entre un agente analgésico (en el tratamiento de la inflamación y del dolor) o un agente antiinfeccioso (en la prevención de infección).
En particular, algunos ejemplos no limitantes de agentes terapéuticos de utilidad de acuerdo a la invención incluyen las siguientes categorías terapéuticas: analgésicos como los medicamentos anti-inflamatorios no esferoides; agonistas opiáceos y salicilatos; agentes anti-infecciosos tales como antihelmínticos, antianaeróbicos, antibióticos, antibióticos aminoglucósidos, antibióticos antifúngicos, cefalosporinas, antibióticos macrólidos, diversos antibióticos beta-lactámicos, penicilinas, antibióticos quinolonas, antibióticos sulfonamidas, antibióticos de tetraciclina, antimicobacterianos, antimicobacterianos antituberculosos, anti protozoa ríos, antiprotozoarios antimaláricos, agentes antivirales, agentes anti-retrovirales, escabicidas, agentes anti-inflamatorios, corticosteroides antiinflamatorios, antipruriginosos/anestésicos tópicos locales, antiinfecciosos, antimicóticos tópicos anti infecciosos, antivirales tópicos antiinfecciosos; agentes electrolíticos y renales tales como agentes acidificantes, agentes alcalinizantes, diuréticos, inhibidores de la anhidrasa carbónica, diuréticos, diuréticos de asa, diuréticos osmóticos, diuréticos ahorradores de potasio, diuréticos de tiazida, suplementos de electrolitos, y agentes uricosúricos; enzimas tales como enzimas pancreáticas y las enzimas trombolíticos; agentes gastrointestinales tales como antidiarreicos, antieméticos, anti-inflamatorios gastrointestinales, el salicilato de agentes anti-inflamatorios, antiácidos anti-úlcera gástrica, agentes inhibidores de la bomba de ácido, agentes antiulcerosos de la mucosa gástrica, agentes antiulcerosos bloqueantes H2, agentes antiulcerosos colelitolíticos, agentes digestivos, eméticos, laxantes y ablandadores de heces y agentes procinéticos; anestésicos generales tales como los anestésicos inhalatorios halogenados, anestésicos inhalatorios, anestésicos intravenosos, barbitúricos, benzodiacepinas, anestésicos intravenosos anestésicos por vía intravenosa de opiáceos, y anestésicos intravenosos agonistas; hormonas y modificadores hormonales tales como abortivos, agentes corticoesteroides suprarrenales, agentes suprarrenales, los andrógenos, antiandrógenos; agentes inmunobiológicos tales como inmunoglobulinas, inmunosupresores, toxoides, y vacunas; anestésicos locales tales como amida de los anestésicos locales, anestésicos locales de tipo éster; agentes musculoesqueléticos tales como agentes antiinflamatorios anti-gota, corticoesteroides anti-inflamatorios, agentes, compuestos de oro anti-inflamatorios, agentes inmunosupresores, agentes antiinflamatorios, fármacos anti-inflamatorios no esteroideos (AINE), agentes anti-inflamatorios; salicilato, minerales y vitaminas tales como la vitamina A, vitamina B, vitamina C, vitamina D, vitamina E y vitamina K.
En una realización particular, los agentes terapéuticos útiles según las categorías anteriores incluyen: (1) analgésicos en general, tales como lidocaína o sus derivados, y fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE) analgésicos, incluyendo diclofenaco, ibuprofeno, ketoprofeno, naproxeno, (2) analgésicos opiáceos agonistas, como la codeína, fentanilo, hidromorfona y la morfina; (3) analgésicos de salicilato, como la aspirina (ASA), (4) bloqueadores H1 antihistamínicos, tales como terfenadina, clemastina , (5) agentes anti-infecciosos, tales como mupirocina; (6) antianaeróbicos anti-infecciosos, tales como cloranfenicol y clindamicina; (7) antifúngicos antibióticos antiinfecciosos, tales como anfotericina B, clotrimazol, fluconazol y ketoconazol; (8) antibiótico macrólido tales como la azitromicina y eritromicina; (9) diversos beta- lactámico anti infecciosos, tales como aztreonam y imipenem; (10) antibiótico de penicilina, tales como nafcilina, oxacilina, penicilina G, penicilina V y; (11) quinolona antibióticos, tales como ciprofloxacina y norfloxacina; (12) antibiótico tetraciclina, tales como doxiciclina, minociclina y tetraciclina; (13) antituberculosos antimicobacterianos, tales como isoniazida (INH), rifampicina y; (14) antiprotozoarios, como atovacuona y dapsona; (15) antipalúdicos antiprotozoarios, tales como cloroquina y pirimetamina; (16) anti-retrovirales, tales como ritonavir y zidovudina; (17) contra agentes antivirales, tales como aciclovir, ganciclovir, interferon alfa, y rimantadina; (18) antifúngicos tópicos, tales como anfotericina B, clotrimazol, miconazol, nistatina y; (19) antivirales tópicos , tales como el aciclovir; (20) agentes electrolíticas y renales, como la lactulosa; (21) diuréticos de asa, como la furosemida, (22) diuréticos ahorradores de potasio, como triamtereno; (23) diuréticos tiazídicos, tales como hidroclorotiazida (HCTZ), (24) agentes uricosúricos, tales como probenecid; (25) enzimas, tales como RNasa y DNasa; (26) antieméticos, tales como proclorperazina; (27) salicilato gastrointestinales inflamatorias anti-agentes, tales como sulfasalazina; (28) - agentes inhibidores de úlceras de la bomba gástrica de ácido, tales como el omeprazol; (29) agentes anti-úlcera bloqueantes de H2, , tales como cimetidina, famotidina, nizatidina y ranitidina; (30) digestivos, tales como pancrelipasa; (31) agentes procinéticos, tales como la eritromicina (32); anestésicos locales, tales como benzocaína y procaína; (33) agentes corticosteroides anti-inflamatorios musculoesqueléticos, tales como beclometasona, betametasona, cortisona, dexametasona, hidrocortisona, y prednisona; (34) inmunosupresores antiinflamatoriosmusculoesqueléticos , tales como azatioprina, ciclofosfamida y metotrexato; (35) antiinflamatorios musculoesqueléticos no esteroideos (AINE), tales como diclofenaco, ibuprofeno, ketoprofeno, ketorlac, y naproxeno; (36) minerales, tales como hierro, calcio y magnesio; (37) los compuestos de vitamina B , tales como la cianocobalamina (vitamina B12) y la niacina (vitamina B3); (38) compuestos de vitamina C, tales como ácido ascórbico, y (39) compuestos de vitamina D, tales como calcitriol.
Como se emplea aquí, el término "principio activo", "sustancia activa", "sustancia farmacéuticamente activa", "ingrediente activo" ó "ingrediente farmacéuticamente activo" significa cualquier componente que potencialmente proporcione una actividad farmacológica u otro efecto diferente en el diagnóstico, cura, mitigación, tratamiento, o prevención de una enfermedad, o que afecta a la estructura o función del cuerpo del hombre u otros animales. El término incluye aquellos componentes que promueven un cambio químico en la elaboración del fármaco y están presentes en el mismo de una forma modificada prevista que proporciona la actividad específica o el efecto.
El término “medicamento”, tal y como se usa en esta memoria, hace referencia a cualquier sustancia usada para prevención, diagnóstico, alivio, tratamiento o curación de enfermedades o prevención de estados fisiológicos no deseados en el hombre y los animales.
El término “individuo”, tal y como se utiliza en la descripción, se refiere a animales, preferiblemente mamíferos, y más preferiblemente, humanos. El término “individuo” no pretende ser limitativo en ningún aspecto, pudiendo ser éste de cualquier edad, sexo y condición física.
La secuencia aminoacídica de SIFNAR2 se encuentra disponible con número de acceso en el GenBank (NCBI) L41943.1 y es aquí nombrada como la SEQ ID NO: 2.
En el contexto de la presente invención, SIFNAR2 se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótido, que constituye la secuencia codificante de la proteína recogida en la SEQ ID NO: 2, y que comprendería diversas vahantes procedentes de: a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la SEQ ID NO: 2, b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a), c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético, d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 2, y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína SIFNAR2. Entre dichas moléculas de ácido nucleico se encuentra la recogida en la secuencia del GenBank (NCBI) L41943.1, aquí nombrada como la SEQ ID NO: 1.
Los términos “polinucleótido” y “ácido nucleico” se usan aquí de manera intercambiable, refiriéndose a formas poliméricas de nucleótidos de cualquier longitud, tanto ribonucleótidos (ARN o RNA) como desoxiribonucleótidos (ADN o DNA).
Los términos “secuencia aminoacídica”, “péptido”, “oligopéptido”, “polipéptido” y “proteína” se usan aquí de manera intercambiable, y se refieren a una forma polimérica de aminoácidos de cualquier longitud, que pueden ser codificantes o no codificantes, química o bioquímicamente modificados.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus vanantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Fig. 1. Evaluación del efecto de SIFNAR2 en células Vero E6 infectadas con SARS- Cov-2. Gráfico del título viral (UFP / mi) en presencia de diferentes concentraciones del compuesto SIFNAR2 Las células fueron infectadas con el SARS-Cov-2 (MOI: 0.001) e incubadas durante 48 horas en presencia de 5 concentraciones diferentes de SIFNAR2 (0, 3,75, 7,5, 15, 30 y 60 ug/ml). Con la concentración de 60ug/ml se encontró una reducción significativa en el número de unidad formadora de placas (UFP) /mi. Relativizando el resultado a porcentajes de crecimiento viral en las diferentes condiciones y tomando como 100% la condición sin tratamiento (0 ug/ml de SIFNAR2), se concluye que la concentración más alta del compuesto ensayado (60 pg/ml) obtiene cerca del 90% de inhibición.
Fig. 2. Evaluación del efecto de SIFNAR2 en células Vero E6 infectadas con SARS- Cov-2. Gráfico del crecimiento viral (unidades relativas) en presencia de diferentes concentraciones del compuesto SIFNAR2. Las células fueron infectadas con el SARS- Cov-2 (MOI: 0.001) e incubadas durante 48 horas en presencia de 5 concentraciones diferentes de SIFNAR2 (0, 3,75, 7,5, 15, 30 y 60 ug/ml). Se observa como disminuye el crecimiento viral a medida que aumenta la concentración de SIFNAR2, llegando prácticamente a cero a concentraciones de 60 pg/ml.
Fig. 3. Evaluación de la viabilidad celular en presencia de SIFNAR2. Células Vero E6 fueron incubadas durante 72 horas en presencia de 5 concentraciones diferentes de SIFNAR2 (0, 3,75, 7,5, 15, 30 y 60 ug/ml) y posteriormente se evaluó el porcentaje de viabilidad celular por el método MTT. La viabilidad celular fue próxima al 100% en todas las concentraciones probadas, incluso en las más altas, lo que da muestra de la no toxicidad del compuesto SIFNAR2 sobre las células.
EJEMPLOS DE LA INVENCIÓN
Material y métodos
La clonación de la proteína se llevó a cabo en el Laboratorio de investigación del IBIMA (Málaga, España) Los experimentos con SARS-CoV2, se llevaron a cabo en el “Centro Nacional de Microbiología. Instituto de Salud Carlos III” (Madrid, España).
Ética y seguridad
Los diferentes experimentos se realizaron con los protocolos de seguridad e instalaciones requeridos en cada centro, incluyendo Niveles de Bioseguhdad (BSL) 2 a 3 según sea necesario.
Estadísticas
En estos estudios no se requirieron tamaños de muestra y se utilizó estadística exclusivamente descriptiva (n y porcentajes).
Clonación y purificación de rh-slFNAR2 El proceso de clonación y purificación de la proteína se describe brevemente. Se eligió el sistema de expresión procariota pEcoli-Cterm 6xHN Linear (Clontech®) para ligar el inserto SIFNAR2 y después de eso, las DH5a Competent Cells ™ (Invitrogen®) se transformaron con el plásmido. El plásmido purificado se introdujo en la bacteria BL21 (DE3) (Invitrogen®) para producir el SIFNAR2 recombinante humano o rh-slFNAR2. Después de la purificación, se detectó SIFNAR2 recombinante mediante Wetern blot utilizando anticuerpo MaxPab humano anti-IFNAR2 (Abnova®) y se identificó mediante espectrometría de masas (MALDI-TOF).
Después de eso, cada lote de proteína SIFNAR2 etiquetada con 6xHN soluble se purificó mediante cromatografía de afinidad en un sistema ÁKTA FPLC (GE Healthcare), de acuerdo con los procedimientos estándar. Las fracciones se analizaron en geles de poliacrilamida SDS al 10% teñidos con Azul Brillante Coomassie (BIORAD). La proteína recombinante SIFNAR2 se dializó contra solución salina tamponada con fosfato (PBS) y luego se cuantificó y se cargó en un gel. El producto final tiene una pureza superior al 95%. La densitometría de proteínas se realizó utilizando el software ImageJ 1.440 (HIH, Bethesda, MD) para determinar su concentración.
Actividad antiviral frente a la infección por SARS-CoV-2 en células Vero E6
Las células Vero E6 se cultivaron en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM; Merck) suplementado con 25 mM de HEPES (Gibco), 50 pg/ml de gentamicina (Sigma-Aldrich, EE.UU.), 2 mM de L-glutamina (Sigma-Aldrich), 1% (v/v) de aminoácidos no esenciales (Sigma-Aldrich) y 10% (v/v) de suero fetal bovino HyCloneTM (FBS, Gibco). Las células infectadas se mantuvieron en DMEM suplementado con un 2% de FBS.
Para preparar un stock de virus, se infectaron 3 x106 células Vero E6 con el virus (rSARS-CoV-2 - WT-Wuhan Hu-1 GenBank MN908947) a una multiplicidad de infección (MOI) de 0,001 PFU/célula en DMEM suplementado con 25 mM HEPES (PanReac) y 2% FBS, y se dejó que la infección procediera durante 48 h a 37°C. El título del stock viral fue de 1 x107 PFU/ml. Las infecciones víricas se llevaron a cabo siguiendo procedimientos estándar y utilizando fiascos cerrados. Para controlar la ausencia de contaminación, se valoraron los sobrenadantes de células infectadas simuladas, que se mantuvieron en paralelo con los cultivos infectados; en ninguno de los experimentos se detectó infectividad en los cultivos infectados simuladamente.
Para estudiar la capacidad antiviral del compuesto rh-slFNAR2, se infectaron pocilios de M24 por triplicado con células Vero E6 confluentes a una multiplicidad de infección (MOI) de 0,001 con rSARS-CoV-2-WT (Wuhan Hu-1 GenBank MN908947), en presencia de diferentes concentraciones de compuesto rh-slFNAR2 (0, 3,75, 7,5, 15, 30 y 60 pg / mi).
La infección se incubó durante 48 horas y posteriormente se tomó el sobrenadante para valoración mediante ensayo de lisis de placa.
Las valoraciones del virus se determinaron mediante ensayos de placas en células Vero E6 cultivadas hasta una confluencia del 100% en placas de 12 pocilios. Las placas se incubaron a 37°C en bolsas de plástico selladas. El ensayo de titulación se realizó en un laboratorio de bioseguridad de nivel 3 (BSL3) del Centro Nacional de Biotecnología (CNB-CSIC). Los sobrenadantes de las células tratadas con SIFNAR2 e infectadas con rSARS-CoV-2-WT se diluyeron en serie en PBS y se sembraron en células Vero E6. Brevemente, tras 1 h de absorción a 37 °C con 50 pl de diluciones seriadas 1 :10 de virus, se retiró el medio y se añadió sobre las células medio de recubrimiento (DMEM suplementado con 4 mM de glutamina, 1% v/v de aminoácidos no esenciales, 2% v/v de FBS, 0,16 mg/ml de DEAE-Dextran y 1% de agarosa de bajo punto de fusión). Tras 96 h a 37°C, las células se fijaron con formaldehído al 10% y se tiñeron con violeta cristal al 0,1% (p/v) en metanol al 20%. Los títulos se determinaron multiplicando el número de unidades formadoras de placas (UFP) por el factor de dilución y se refirieron a un volumen de 1 mi (UFP/ml).
Se observó como disminuye el crecimiento viral a medida que aumenta la concentración de SIFNAR2 (Fig. 2), llegando prácticamente a cero a concentraciones de 60 pg/ml.
También se observó que a una concentración de 60pg/ml se daba una reducción significativa en el número de Unidades Formadoras de Placas por mililitro (UFP /mi). (Fig.1). Relativizando el resultado a porcentajes de crecimiento viral en las diferentes condiciones y tomando como 100% la condición sin tratamiento (0 ug/ml de SIFNAR2), se concluye que la concentración más alta del compuesto ensayado (60 pg/ml) obtiene cerca del 90% de inhibición.
Por otro lado, se realizó un ensayo MTT (un ensayo colorimétrico que mide la actividad metabólica celular) para estudiar la toxicidad de este compuesto en células Vero E6 y la viabilidad celular, probando diferentes concentraciones que van desde 0, 3,75, 7,5, 15, 30 y 60 pg / mi, incubadas durante 72 horas, no alterándose la viabilidad en ninguna de las concentraciones probadas (Fig. 3).
El ensayo ensayo MTT consistió en añadir 10 pl de reactivo MTT (3-(4,5-dimetilt¡azol- 2-¡l)-2,5-bromuro de difeniltetrazolio) (5 mg / mL) por pocilio de M96. MTT (Merck_Ref: M2128) disuelto en 1X PBS (5 mg / mL) y esterilizado por filtración. Incubar 2 horas a 37 °C. Se retiró el medio de cultivo con un aspirador, evitando arrastrar los cristales de formazán (cristales morados) de la monocapa. Se añadió 150 pL de DMSO (Merck_Ref: D2650) por pocilio de M96 y se disolvieron los cristales de formazán pipeteando y/o agitando durante 15 minutos. Se midió la absorbancia a 570 nm en un lector de placas, comparando los resultados de las células no tratadas (Mock) y las células tratadas.
La viabilidad fue próxima al 100% en todas las concentraciones probadas.
Referencias
1. Sefik, E. et al 2021 , “Viral replication in human macrophages enhances an inflammatory cascade and interferon driven chronic COVID-19 in humanized mice”, bioRxiv 2021.09.27.461948. https://doi.org/10.1101/2021.09.27.461948.
2. Hurtado-Guerrero, J. et al, 2020, “Antiviral, Immunomodulatory and Antiproliferative Activities of Recombinant Soluble IFNAR2 without IFN-I3> Mediation”, Jounal of Clinical Medicine, 9, 959; doi:10.3390/jcm9040959.
3. Suardíaz, M. et al., 2016, “Recombinant soluble IFN receptor (slFNAR2) exhibits intrinsic therapeutic efficacy in a murine model of Multiple Sclerosis”, Neuropharmacology Volume 110, Part A, Pages 480-492. 4. Samarajiwa, S. A. et al., 2014, “Soluble IFN Receptor Potentiates In Vivo Type I IFN Signaling and Exacerbates TLR4-Mediated Septic Shock” J Immunol, 192 (9) 4425-4435; DOI: https://doi.org/10.4049/jimmunol.1302388

Claims

REIVINDICACIONES
1. Proteína SIFNAR2, de secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 2 o proteína con una identidad de al menos un 95% con SEQ ID NO: 2 y que posee la actividad y las características estructurales de la proteína SIFNAR2, para su uso en el tratamiento de la infección por SARS-CoV-2.
2- Una composición que comprende la proteína según la reivindicación 1, para su uso en el tratamiento de la infección por SARS-CoV-2.
3.- La composición según la reivindicación anterior que es una composición farmacéutica.
4.- La composición según cualquiera de las reivindicaciones 2-3, que además comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y/o excipientes farmacéuticamente aceptables.
5.- La composición según cualquiera de las reivindicaciones 2-4, que además comprende otro principio activo.
PCT/ES2023/070210 2022-03-31 2023-03-30 Uso de sifnar2 en el tratamiento de la infección por sars-cov-2 WO2023187244A1 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ESP202230293 2022-03-31
ES202230293A ES2953479A1 (es) 2022-03-31 2022-03-31 Uso de sIFNAR2 en el tratamiento de la infección por SARS-CoV-2

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2023187244A1 true WO2023187244A1 (es) 2023-10-05

Family

ID=88199596

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/ES2023/070210 WO2023187244A1 (es) 2022-03-31 2023-03-30 Uso de sifnar2 en el tratamiento de la infección por sars-cov-2

Country Status (2)

Country Link
ES (1) ES2953479A1 (es)
WO (1) WO2023187244A1 (es)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017109257A1 (es) * 2015-12-21 2017-06-29 Servicio Andaluz De Salud Procedimiento de obtención de la proteína ifnar recombinante así como su uso como antiviral

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017109257A1 (es) * 2015-12-21 2017-06-29 Servicio Andaluz De Salud Procedimiento de obtención de la proteína ifnar recombinante así como su uso como antiviral

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BAGHERI, A.: "Interferon-inducer antivirals: Potential candidates to combat COVID-19", INTERNATIONAL IMMUNOPHARMACOLOGY, vol. 91, no. 107245, February 2021 (2021-02-01), XP055860824, ISSN: 1567-5769, DOI: 10.1016/j.intimp.2020.107245 *
FRICKE-GALINDO INGRID, MARTÍNEZ-MORALES ALFONSO, CHÁVEZ-GALÁN LESLIE, OCAÑA-GUZMÁN RANFERI, BUENDÍA-ROLDÁN IVETTE, PÉREZ-RUBIO GLO: "IFNAR2 relevance in the clinical outcome of individuals with severe COVID-19", FRONTIERS IN IMMUNOLOGY, vol. 13, XP093098482, DOI: 10.3389/fimmu.2022.949413 *
HURTADO-GUERRERO ISAAC, HERNÁEZ BRUNO, PINTO-MEDEL MARÍA J., CALONGE ESTHER, RODRIGUEZ-BADA JOSÉ L., URBANEJA PATRICIA, ALONSO ANA: "Antiviral, Immunomodulatory and Antiproliferative Activities of Recombinant Soluble IFNAR2 without IFN-ß Mediation", JOURNAL OF CLINICAL MEDICINE, vol. 9, no. 4, pages 959, XP093098486, DOI: 10.3390/jcm9040959 *
KOTSEV STANISLAV VASILEV, MITEVA DIMITRINA, KRAYSELSKA STANISLAVA, SHOPOVA MARTINA, PISHMISHEVA-PELEVA MARIA, STANILOVA SPASKA ANG: "Hypotheses and facts for genetic factors related to severe COVID-19", WORLD JOURNAL OF VIROLOGY, PLEASANTON, CA : BAISHIDENG PUBL, 2012, US, vol. 10, no. 4, 25 July 2021 (2021-07-25), US , pages 137 - 155, XP093098489, ISSN: 2220-3249, DOI: 10.5501/wjv.v10.i4.137 *
SAMARAJIWA SHAMITH A., MANGAN NIAMH E., HARDY MATTHEW P., NAJDOVSKA MERI, DUBACH DAPHNE, BRANIFF SUSIE-JANE, OWCZAREK CATHERINE M.: "Soluble IFN Receptor Potentiates In Vivo Type I IFN Signaling and Exacerbates TLR4-Mediated Septic Shock", THE JOURNAL OF IMMUNOLOGY, WILLIAMS & WILKINS CO., US, vol. 192, no. 9, 1 May 2014 (2014-05-01), US , pages 4425 - 4435, XP093098490, ISSN: 0022-1767, DOI: 10.4049/jimmunol.1302388 *
SEFIK ESEN; QU RIHAO; JUNQUEIRA CAROLINE; KAFFE ELEANNA; MIRZA HARIS; ZHAO JUN; BREWER J. RICHARD; HAN AILIN; STEACH HOLLY R.; ISR: "Inflammasome activation in infected macrophages drives COVID-19 pathology", CLEO: APPLICATIONS AND TECHNOLOGY 2019 SAN JOSE, CALIFORNIA UNITED STATES 5–10 MAY 2019, OPTICA, vol. 606, no. 7914, 28 April 2022 (2022-04-28), pages 585 - 593, XP037898736, DOI: 10.1038/s41586-022-04802-1 *
SUARDIAZ, M. ET AL.: "Recombinant soluble IFN receptor (sIFNAR2) exhibits intrinsic therapeutic efficacy in a murine model of Multiple Sclerosis", NEUROPHARMACOLOGY, vol. 110, no. A, November 2016 (2016-11-01), pages 480 - 492, XP029733846, ISSN: 0028-3908, DOI: 10.1016/j.neuropharm. 2016.07.02 6 *

Also Published As

Publication number Publication date
ES2953479A1 (es) 2023-11-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11191817B2 (en) Treatment of infection by human enterovirus D68
Rebuck et al. Pharmacokinetics of intravenous and oral levofloxacin in critically ill adults in a medical intensive care unit
Wilson Rational selection of antimicrobials for use in horses
BRPI0510004A (pt) artigo de manufatura, métodos para administrar uma composição terapêutica a um epitélio de um indivìduo, para tratar uma condição mediada por micróbio de um epitélio de um indivìduo, para melhorar um sintoma de uma condição e para prevenir uma condição, e, uso de composto tipo peg pma
US11058653B2 (en) Compositions comprising desaminotyrosine and uses thereof to enhance type I interferon stimulation
AU2013288416B2 (en) Colicins for treating bacterial infections
US10953078B2 (en) Treatment and/or prevention of sepsis
Mary et al. Rationale for COVID-19 treatment by nebulized interferon-β-1b–Literature review and personal preliminary experience
Joseph et al. The ineluctable role of ACE-2 receptors in SARS COV-2 infection and drug repurposing as a plausible SARS COV-2 therapy: a concise treatise
WO2023187244A1 (es) Uso de sifnar2 en el tratamiento de la infección por sars-cov-2
Thakur et al. Respiratory delivery of favipiravir-tocilizumab combination through mucoadhesive protein-lipidic nanovesicles: prospective therapeutics against COVID-19
Nabi-Afjadi et al. A cellular and molecular biology-based update for ivermectin against COVID-19: is it effective or non-effective?
US20150246095A1 (en) Methods and pharmaceutical compositions for the prophylactic treatment of bacterial superinfections post-influenza
KR20220035931A (ko) 2세대 세네카 밸리 바이러스 종양용해 요법: 이의 조성물 및 방법
Yadav et al. The immune-adjunctive potential of recombinant LAB vector expressing murine IFNλ3 (MuIFNλ3) against Type A Influenza Virus (IAV) infection
He et al. C-Fiber Degeneration Enhances Alveolar Macrophage-Mediated IFN-α/β Response to Respiratory Syncytial Virus
Marín et al. Pharmacokinetics of danofloxacin after single dose intravenous, intramuscular and subcutaneous administration to loggerhead turtles Caretta caretta
WO2017109257A1 (es) Procedimiento de obtención de la proteína ifnar recombinante así como su uso como antiviral
Antos et al. IFNλ: balancing the light and dark side in pulmonary infection
EP3679943A1 (en) Pegylated interferon lambda for oral administration, and method for producing same
AU2003303338C1 (en) Use of synergistic bacteriophage lytic enzymes for prevention and treatment of bacterial infections
Singh Survival after fatal pentobarbital ingestion
Sunilkumar Staphylococcal scalded skin syndrome-A case series with review of literature.
WO2023023676A1 (en) Compositions and methods for treating post-covid conditions of fatigue
Areej et al. A REVIEW ON ASPECTS OF CURRENT PHARMACOTHERAPIES FOR COVID-19

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 23778564

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1