WO2023008451A1 - 肺線維症の治療および修復方法 - Google Patents

肺線維症の治療および修復方法 Download PDF

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俊彦 小林
ダット ティエン グェン
貴夫 大曲
温人 杉山
信有 泉
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Definitions

  • the present invention provides a method of treating and/or repairing diseases of the pulmonary interstitium, particularly pulmonary fibrosis, by maintaining a human body (such as a patient) in a fasting state, and the metabolites induced by the fasting state.
  • methods of treating pulmonary fibrosis and compositions for use therein comprising modulating the function of amino acid/oligopeptide transporters, comprising modulating the function of hydrolytic enzymes , methods of treating pulmonary fibrosis and compositions used in such methods, methods of treating pulmonary fibrosis and compositions used in such methods, comprising modulating the function of AMPK.
  • the interstitium of the lung refers to the alveolar walls (alveolar walls) and the tissue that surrounds and supports the alveoli. Diseases in this tissue region have a direct and significant impact on respiratory function, leading to life-sustaining or life-threatening crises. can directly lead to a decline in the quality of Diseases of the pulmonary interstitium, particularly pulmonary fibrosis (PF), are pulmonary diseases characterized by progressive scarring and matrix deposition and generally have a poor prognosis. The etiology of PF is not well understood, but many patients present with an inflammatory response triggered by infection or exposure to hazardous materials such as asbestos and silica. Pulmonary fibrosis (PF), an incurable disease with increasing prevalence, is a serious public health problem.
  • PF pulmonary fibrosis
  • solute carrier family-15 member-3 (SLC15A3) is an amino acid/oligopeptide transporter that is strongly expressed in innate immune cells, mainly in both human and mouse innate immune cells (macrophages). and neutrophils) (see A and B in Figure 1)
  • SLC15A3 was found in both human and mouse lung tissues, and in the lungs of PF patients, and strong expression was found in M ⁇ s, especially alveolar M ⁇ s (AM ⁇ s) (Fig. S1a-c).
  • a ⁇ s alveolar M ⁇ s
  • SLC15A3 is largely unknown, and its cognate SLC15A4 mediates endolysosome-dependent inflammatory and metabolic signals that are often associated with fibrosis, leading to symptoms of colitis and lupus. I only know how to promote
  • amino acid/oligopeptide transporters and/or hydrolytic enzymes have contributed to the disease of We have found that amino acid/oligopeptide transporter expression and/or loss and/or hydrolytic enzyme activity and/or inhibition in the body are of critical importance in the regulation of fibrosis. It has also found application in the treatment and repair of disease.
  • the present invention provides a method of treating pulmonary fibrosis, characterized by making the patient fast for at least 12 hours a day.
  • the invention provides methods of treating pulmonary fibrosis and compositions for use in such methods, comprising modulating the function of an amino acid/oligopeptide transporter.
  • the invention provides methods of treating pulmonary fibrosis and compositions for use in such methods, comprising modulating the function of hydrolytic enzymes.
  • the invention provides methods of treating pulmonary fibrosis and compositions for use in such methods, comprising modulating the function of AMPK.
  • the present invention provides a method of treating pulmonary fibrosis, comprising administering a compound that enhances the function of an arginine-metabolizing enzyme to a subject in need of pulmonary fibrosis treatment.
  • the present invention provides a composition for use in treating pulmonary fibrosis containing a compound that enhances the function of an arginine-metabolizing enzyme.
  • the present invention provides a method of treating pulmonary fibrosis, comprising administering a compound that inhibits the function of an amino acid transporter to a subject in need of pulmonary fibrosis treatment.
  • the present invention provides a composition for use in treating pulmonary fibrosis containing a compound that inhibits amino acid transporter function.
  • compounds that inhibit the function of amino acid transporters enhance the function of arginine-metabolizing enzymes.
  • the present invention provides a method of treating pulmonary fibrosis, comprising administering a compound that enhances AMPK function to a subject in need of pulmonary fibrosis treatment.
  • the present invention provides a composition for use in treating pulmonary fibrosis containing a compound that enhances the function of AMPK.
  • compounds that function as AMPK enhance the function of arginine-metabolizing enzymes.
  • the present invention provides a system for measuring metabolite measurements induced by the fasting state and analyzing the measurements.
  • the present invention provides a system for measuring metabolite measurements induced by the fasting state and analyzing the measurements.
  • the present invention provides a system for detecting and analyzing fasting-induced metabolites.
  • the present invention more specifically provides the following.
  • [Item 1] A composition for use in treating pulmonary fibrosis containing a compound that enhances the function of an arginine-metabolizing enzyme.
  • [Item 2] A composition according to item 1, wherein the compound that enhances the function of an arginine-metabolizing enzyme is a compound that enhances the expression of an arginine-metabolizing enzyme.
  • the arginine-metabolizing enzyme is arginase II.
  • 4. 4.
  • a composition according to item 1 wherein the compound that enhances the function of Arginase II is a compound that inhibits the function of an amino acid transporter.
  • the compound that inhibits the function of an amino acid transporter is a compound that inhibits the expression of an amino acid transporter.
  • said amino acid transporter is SLC15A3.
  • the compound that inhibits the function of SLC15A3 is an anti-SLC15A3 antibody or an antigen-binding fragment thereof, a nucleic acid molecule that inhibits SLC15A3 gene expression, polyamine, arginine, methionine, 3-hydroxy-3-methylbutyrate, cytosine, and acetoacetic acid. , 3-hydroxybutyric acid and acetone.
  • the compound that enhances the function of AMPK is a compound that enhances expression of AMPK.
  • composition of item 10 wherein said compound that enhances the function of AMPK is selected from class III PI3 kinase inhibitors, wortmannin and PI4K.
  • item 12 The composition according to any one of items 1 to 11, which is a pharmaceutical composition, functional food, food or drink, or feed.
  • treatment is used in the broadest sense.
  • treatment includes preventing, inhibiting, and/or alleviating or reversing the onset of a disease, disorder or condition.
  • treating pulmonary fibrosis refers to repairing lung tissue.
  • antibody is used in the broadest sense and includes, but is not limited to, monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, and antibody fragments that exhibit the intended antigen-binding activity.
  • a full-length antibody comprises heavy and light chains that are primarily composed of polypeptides.
  • the heavy and light chains each contain regions that recognize antigens, called variable regions, and these regions are commonly referred to as heavy and light chain variable regions, respectively.
  • the variable region has, in order from the amino terminus, sites called CDRs 1 to 3, which are specified as antigen-recognizing sites in more detail.
  • CDRs 1 to 3 are also referred to in more detail as heavy chain CDR1, heavy chain CDR2, heavy chain CDR3, light chain CDR1, light chain CDR2, light chain CDR3, and the like.
  • regions other than CDR1-3 of heavy and light chains are referred to as heavy chain FR1-4 and light chain FR1-4, respectively, in order from the amino terminus.
  • Antibodies may be in the form of two heavy chains and two light chains, as well as in the form of antibodies consisting of one heavy chain and one light chain (also called single-chain antibodies).
  • Antibodies may be of any class, such as IgG, IgE, IgM, IgD, IgA or IgY, or subclass, such as IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 or IgA2.
  • An antibody may have an amino acid sequence derived from the same species or may have amino acids derived from a different species.
  • derived from the same species for example, human-derived, mouse-derived, rat-derived, hamster-derived, rabbit-derived, goat-derived, donkey-derived, pig-derived, bovine-derived, horse-derived, chicken-derived, monkey-derived, chimpanze-derived, camel-derived origin, llama origin, and the like.
  • heterologous origin there is no particular limitation, for example, human, mouse, rat, hamster, rabbit, goat, sheep, donkey, pig, cow, horse, chicken, monkey, chimpanzee, camel, llama, etc. Antibodies derived from more than one are included.
  • an "antigen-binding fragment" of an antibody refers to one or more fragments of an antibody that retain the ability to specifically bind to an antigen. It has been found that the ability of an antibody to specifically bind to an antigen can be retained by a partial fragment thereof.
  • an "antigen-binding fragment" of an antibody consists of a light chain variable region (VL), a heavy chain variable region (VH), a light chain constant region (CL) and a CH1 domain that is part of the heavy chain constant region.
  • Fab fragment an F(ab')2 fragment comprising two Fab fragments linked by a disulfide bridge at the hinge region, an Fd fragment consisting of the VH and CH1 domains, an Fv consisting of the VL and VH domains of the single arm of the antibody.
  • Fd fragment consisting of the VH and CH1 domains
  • Fv consisting of the VL and VH domains of the single arm of the antibody. It can be, but is not limited to, fragments, dAb fragments containing a single variable domain, and isolated complementarity determining regions (CDRs).
  • CDRs complementarity determining regions
  • the antibody of the present invention may be a CDR-grafted antibody.
  • a CDR-grafted antibody has the sequences of some or all of the CDR regions of an antibody from one animal species replaced with CDR sequences from another animal species.
  • one or more murine antibody CDRs have been replaced with human antibody CDR sequences.
  • CDR identification may be based on information in public databases.
  • the present invention relates to the loss of expression of amino acid/oligopeptide transporters in the body and/or activation of hydrolytic enzymes caused by keeping patients in a fasting state for at least 12 hours a day for the treatment of PF. provides a method of treating diseases of the pulmonary interstitium.
  • the present invention aims to induce loss of expression of amino acid/oligopeptide transporters and/or hydrolytic enzymes in the patient for the treatment of PF by directly providing the patient with metabolites that change with fasting. is directly given to the patient to provide a main component for treating and repairing pulmonary interstitial diseases by activating hydrolytic enzymes.
  • a pharmaceutical composition comprising the principal ingredient, variants thereof, derivatives thereof, or pharmaceutically acceptable salts thereof.
  • the present invention provides supplementary food (supplementary food that reduces hunger and enhances therapeutic effects) for supporting fasting to maintain a fasting state.
  • the present invention provides metabolites obtained by maintaining a state of fasting for a certain period of time, for example, measured values of ketone bodies appearing in peripheral blood, measured values of blood glucose, and metabolism contained in breath, blood, or urine.
  • a system is provided for measuring and analyzing physical measurements, such as nitrogen, arginine metabolites, and the like.
  • the patient prefferably in a fasting state for at least 12 hours a day, particularly 16 hours, and more preferably 18 hours or more. Furthermore, it is preferable to maintain a fasting state for 16 hours from 18:00 to 12:00 of the next day.
  • the present invention treats pulmonary interstitial disease, comprising the step of administering a composition comprising a compound that enhances the function of a hydrolase to a patient in need of treatment for pulmonary interstitial disease.
  • the compound that enhances the function of hydrolase is not particularly limited as long as it is a compound that has the effect of enhancing or expressing the function of hydrolase in vivo.
  • a compound that enhances the function of a hydrolase can enhance the function of a hydrolase through actions such as enhancing enzymatic activity, promoting localization, enhancing expression, and increasing stability.
  • the compound that enhances the function of hydrolase enhances the expression of hydrolase.
  • the hydrolases of the present invention are, for example, enzymes such as nitric oxide synthase, Arg1, Arg2, and Gatm, which are mainly expressed in lung M ⁇ s.
  • Arginase II which is a mitochondrial enzyme that decomposes arginine into ornithine and urea, is particularly preferred.
  • the compound that enhances the function of the hydrolase of the present invention is not particularly limited, and can be obtained by screening by methods generally known to those skilled in the art.
  • a compound that enhances the function of hydrolase when obtaining a compound that increases the expression level of the same enzyme, after applying the compound to arginase II-expressing cells such as macrophages, arginine in the cells - quantify the transcription amount of ZeII mRNA or the amount of intracellular or secreted arginase II protein by a standard method, and after a certain period of time elapses, for example, 10 minutes, 20 minutes, 30 minutes, 40 minutes, 50 minutes, 60 minutes, 2 hours, 3 hours, 4 hours, 5 hours, 6 hours, 7 hours, 8 hours, 9 hours, 10 hours, 11 hours, 12 hours, 13 hours, 14 hours, 15 hours, 16 hours, 17 hours, 18 hours , 19 hours, 20 hours, 21 hours, 22 hours, 23 hours, 24 hours, or longer than a certain percentage of the negative control, such as 10%, 20%, 30%,
  • a compound that enhances the function of a hydrolase when obtaining a compound that increases the activity of the same enzyme, after applying the compound to alginase II-expressing cells such as macrophages, By measuring the inactivity of Arginase II after a certain period of time, a compound that increases the activity by a certain ratio or more as described above can be obtained as a compound that enhances the function of hydrolase.
  • Compounds that enhance the function of the hydrolase of the present invention include polypeptides, nucleic acids, and low-molecular-weight compounds.
  • polypeptides for example, using semi-essential amino acids that are metabolized by pathways involving these hydrolases can be used that are metabolized by multiple pathways.
  • dipeptides including Ala-Tyr, Lys-Tyr, Gln-Tyr, etc. induced by fasting can be used as compounds that enhance the function of hydrolases.
  • the hydrolase is Arginase II
  • a fatty acid metabolism inhibitor such as MJN110
  • an endoplasmic reticulum stress-inducing compound such as Thapsigargin
  • compounds that inhibit the function of amino acid/oligopeptide transporters described below or compounds that enhance the function of AMPK can be used as compounds that enhance the function of hydrolases.
  • the compound that enhances the function of a hydrolase is a class III PI3 kinase inhibitor, wortmannin, or a low-molecular-weight compound that controls PI4K or the like, and that enhances glycolysis and oxidative phosphorylation.
  • low-molecular-weight compounds that disrupt the metabolic homeostasis of cells, and the like can be used.
  • variants, derivatives, or pharmaceutically acceptable salts thereof of the above compounds can be used.
  • the animal targeted by the method of the present invention is not particularly limited.
  • mammals such as humans, mice, rats, guinea pigs, rabbits, hamsters, dogs, cats, weasels, cows and pigs, birds such as chickens, and the like can be targeted.
  • Method of treating pulmonary interstitial disease comprising the step of administering a composition containing a compound that inhibits the function of an amino acid/oligopeptide transporter
  • the present invention provides an interpulmonary system comprising the step of administering to a patient in need of treatment for a disease of the pulmonary interstitium a composition comprising a compound that inhibits the function of an amino acid/oligopeptide transporter.
  • a method for treating quality disorders is provided.
  • compounds that inhibit the function of amino acid/oligopeptide transporters enhance the function of arginine-metabolizing enzymes.
  • the compound that inhibits the function of amino acid/oligopeptide transporter is not particularly limited as long as it is a compound that has the effect of reducing or eliminating the function of amino acid/oligopeptide transporter in vivo.
  • a compound that inhibits the function of amino acid/oligopeptide transporters can inhibit amino acid/oligopeptide transporter activity, localization, expression, and stability of amino acid/oligopeptide transporters. It can inhibit the function of transporters.
  • the compound that inhibits amino acid/oligopeptide transporter function inhibits amino acid/oligopeptide transporter expression.
  • compounds that inhibit the function of amino acid/oligopeptide transporters can be obtained by screening by methods generally known to those skilled in the art. These compounds include antibodies or antigen-binding fragments thereof, polypeptides, nucleic acids such as siRNA or shRNA, or nucleic acids encoding these, low molecular weight compounds.
  • examples of low-molecular-weight compounds that impair amino acid/oligopeptide transporter expression in the patient's body include amino acid metabolites such as polyamines and arginine and methionine.
  • Polyamines containing putrescine, such as ketone bodies, 3-hydroxy-3-methylbutyrate, cytosine, acetoacetic acid, 3-hydroxybutyric acid, and acetone are particularly preferred.
  • GABA, pantothenic acid, and ophthalmic acid have been confirmed as the above metabolites in the present invention, and are preferred as metabolites in the present invention.
  • polyamines include all polyamines in the body, unless specifically excluded here. Polyamines are preferred, including putrescine, including hydroxybutyric acid, acetone, and the like. Among them, ketone bodies are particularly preferred.
  • dipeptides including Ala-Tyr, Lys-Tyr, Gln-Tyr, etc. induced by the fasting state can be used as compounds that inhibit the function of amino acid/oligopeptide transporters.
  • class III PI3 kinase inhibitors as compounds that inhibit the function of amino acid/oligopeptide transporters, class III PI3 kinase inhibitors, wortmannin or low-molecular-weight compounds that regulate PI4K and the like, and glycolysis and oxidative phosphorylation
  • a low-molecular-weight compound or the like that enhances oxidative reaction and disrupts the metabolic homeostasis of cells can be used.
  • variants, derivatives, or pharmaceutically acceptable salts thereof of the above compounds can be used.
  • the amino acid/oligopeptide transporter in the present invention is preferably an amino acid transporter localized in intracellular organelles including lysosomes.
  • member-3 of solute carrier family-15 SLC15A4, SLC38A9, SLC38A2, SLC7A5 (LAT1), SLC3A2, SLC36A1 (PAT1), SLC36A2 (PAT2), SLC36A4, etc. are preferred.
  • the animal targeted by the method of the present invention is not particularly limited.
  • mammals such as humans, mice, rats, guinea pigs, rabbits, hamsters, dogs, cats, weasels, cows and pigs, birds such as chickens, and the like can be targeted.
  • Method for treating pulmonary interstitial disease comprising administering a composition containing a compound that enhances AMPK function
  • a method of treating a pulmonary interstitial disease comprising administering a composition comprising a compound that enhances AMPK function to a patient in need of treatment for a pulmonary interstitial disease.
  • compounds that enhance the function of AMPK enhance the function of arginine-metabolizing enzymes.
  • the compound that inhibits the function of AMPK includes an inhibitor of class III PI3 kinase, wortmannin, or a low-molecular-weight compound that controls PI4K, etc., and enhances glycolysis and oxidative phosphorylation, Low-molecular-weight compounds that disrupt the metabolic homeostasis of the body can be used.
  • the animal targeted by the method of the present invention is not particularly limited.
  • mammals such as humans, mice, rats, guinea pigs, rabbits, hamsters, dogs, cats, weasels, cows and pigs, birds such as chickens, and the like can be targeted.
  • composition The present invention provides the above (method for treating pulmonary interstitial disease comprising a step of fasting), (pulmonary interstitial disease comprising the step of administering a composition containing a compound that enhances the function of an arginine-metabolizing enzyme (a method of treating a disease of the pulmonary interstitium comprising administering a composition comprising a compound that inhibits the function of an amino acid/oligopeptide transporter) and/or (a method of inhibiting the function of AMPK A method of treating a disease of the pulmonary interstitium comprising administering a composition comprising a potentiating compound.
  • composition of the present invention is preferably provided as a pharmaceutical composition, functional food, food or drink, or feed, but is not limited to these.
  • the compositions of the present invention are used as adjuncts to support fasting to maintain a fasting state. It can be provided as a diet and/or nutritional diet. Supplements and/or nutritional foods to support fasting to maintain a fasted state do not inhibit the production of metabolites that are expected to provide therapeutic effects and attenuate hunger. It is a restricted diet that enhances the production of this metabolite, and can be provided not only to patients in the treatment stage of pulmonary fibrosis and the like, but also to patients who have been discharged from the hospital and are recovering at home.
  • Method for treating pulmonary interstitial disease comprising the step of administering a composition containing a compound that enhances the function of an arginine-metabolizing enzyme), (a compound that inhibits the function of an amino acid/oligopeptide transporter) of the present invention and/or (treating a disease of the pulmonary interstitium comprising administering a composition comprising a compound that enhances the function of AMPK) method
  • the composition of the present invention is provided as a pharmaceutical composition, functional food, food, drink, or feed to subjects who are in the process of treating pulmonary interstitial diseases, as well as patients in the recovery stage. can do.
  • composition of the present invention When the composition of the present invention is used as a pharmaceutical composition, a pharmaceutically acceptable carrier or additive may be added together with the active ingredient compound.
  • Pharmaceutically acceptable carriers or additives include any carrier, diluent, excipient, suspending agent, lubricant, adjuvant, vehicle, delivery system, emulsifier, disintegrant, absorbent, preservative, It means a surfactant, coloring agent, flavoring agent, or sweetener, and known ones may be adopted.
  • the dosage and administration method of the pharmaceutical composition of the present invention are determined according to the type, sex, species, age, general condition, severity of the disease, degree of desired effect, etc. It may be set as appropriate.
  • the active ingredient can be administered in the range of 0.001 to 100 mg/kg body weight/day.
  • the administration method of the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited, and can be appropriately selected according to the properties of the active ingredient compound, the subject of administration, and the like.
  • oral administration, respiratory tract administration, nasal administration, transmucosal administration, enteral administration, intravenous administration, subcutaneous injection, transdermal administration and the like can be selected.
  • Oral administration is preferably used.
  • the administration interval of the pharmaceutical composition according to the present invention is not particularly limited, and can be appropriately selected according to the properties of the compound of the active ingredient, the subject of administration, and the like. For example, it may be administered once a day, or may be administered in several doses. In addition, it may be administered at intervals of daily, every other day, every week, every other week, every 2 to 3 weeks, every month, every 2 to 3 months, or every 2 to 3 months, as long as it has a therapeutic effect.
  • composition of the present invention is a functional food or a food or drink
  • it is a general food, a food for specified health use including a food for specified health use, a dietary supplement, a functional food, a food for the sick, or the like. good.
  • the specific form of the functional food or food and drink of the present invention is not particularly limited, for example, beverages such as soft drinks, carbonated drinks, nutritional drinks, fruit drinks, lactic acid drinks, milk drinks; Frozen desserts such as beds and shaved ice; Sweets such as candy, candy, gum, chocolate, tablets, snacks, biscuits, jellies, jams, creams, and baked goods; Noodles such as instant noodles; Fish and livestock processed foods such as fish paste, ham, and sausage; Dairy products such as processed milk and fermented milk; Salad oil, tempura oil, margarine, mayonnaise, shortening, Examples include fats and fats such as whipped cream and dressings, and fat and oil processed foods; seasonings such as sauces and sauces; In the case of foods for specified health uses, dietary supplements, functional foods, etc., the forms include powders, granules, capsules, pastilles, tablets, syrups, and the like.
  • composition of the present invention is a feed
  • its specific form is not particularly limited. Alternatively, if necessary, it may be mixed with other ingredients that can be incorporated into a normal feed to form a feed composition, or the feed composition itself may be used as a feed.
  • lung interstitial disease Diseases of the pulmonary interstitium of the present invention include, for example, pulmonary fibrosis, idiopathic pulmonary fibrosis (IPF), chronic hypersensitivity pneumonitis (CHP), collagen disease-associated interstitial pneumonia (CVD-IP), idiopathic nonspecific interstitial pneumonia (NSIP), interstitial pneumonia with dermatomyositis, exfoliative interstitial pneumonia, lymphocytic interstitial pneumonia, diffuse alveolar disease, or granulomatous interstitial pneumonia.
  • the present invention is preferably applied to the treatment of pulmonary fibrosis.
  • Pulmonary fibrosis is caused by inflammation in the lungs due to various causes, resulting in progressive scarring and deposition of matrices such as collagen on alveolar walls, lung lobules, pleura, etc., resulting in loss of lung function. It is a general term for the diseases that cause it and is collectively called interstitial pneumonia. Interstitial pneumonia is caused by idiopathic interstitial pulmonary fibrosis whose cause is unknown, autoimmune interstitial lung disease caused by autoimmune diseases, and pneumoconiosis caused by occupational environmental factors. These diseases include interstitial lung disease, idiopathic interstitial lung disease caused by radiation and drugs, and interstitial pneumonia as a sequela of respiratory infections.
  • Disease targets of the present invention include idiopathic interstitial pneumonia, silicosis, pulmonary fibrosis including interstitial pneumonia as a sequela of COVID-19, cardiac fibrosis due to ischemic heart disease, renal fibrosis, etc. It is a disease that results in organ dysfunction accompanied by Furthermore, it includes stroke sequelae, chronic graft-versus-host disease (GVHD) complications of hematopoietic stem cell transplantation, liver fibrosis, and chronic inflammatory diseases in which macrophages are involved in the pathology.
  • GVHD chronic graft-versus-host disease
  • the present invention provides a system for measuring and analyzing fasting-induced metabolite measurements.
  • the data of the measurement and analysis are aggregated on the patient's own smartphone, and the service of the hospital where the doctor in charge is present. It is possible to check the patient's recovery status after treatment with the doctor in charge. thereby maintaining motivation to fast or as an indirect indicator of therapeutic efficacy.
  • the present invention provides a system for detecting and analyzing fasting-induced metabolites.
  • a system for detecting and analyzing fasting-induced metabolites consists of a metabolite detection part and an analysis part.
  • the metabolite detection unit detects metabolites induced by the patient reaching a fasting state as a result of diet restriction under the guidance of the attending physician, such as ketone bodies and blood glucose appearing in the peripheral blood.
  • a device that detects and measures physical quantities (numerical values) such as weight percent is used.
  • the analysis unit is a computer capable of inputting numerical data related to metabolites measured by the metabolite detection unit, and graphically displaying, for example, time-series changes in the input numerical data. -The device is used.
  • the metabolite detection unit and the analysis unit are connected so as to be able to communicate with each other, for example, through a wireless communication line such as Wi-Fi or a fixed communication line such as optical fiber.
  • the metabolite detector is a device that measures the physical amounts of ketone bodies and glucose contained in peripheral blood collected from the patient's fingertips, etc., and is a device of a size that can be carried by the patient. is desirable. If the patient measures metabolites by himself/herself using a portable measuring device corresponding to the metabolite detection unit, it becomes possible for the patient to continue medical fasting at home without hospitalization. . When an operator such as a patient activates the device to measure metabolites, the measurement results are sent to the analysis unit via a communication line. It should be noted that the metabolite detection unit itself does not need to transmit the measurement data directly to the analysis unit. The data may be transmitted once, and the measurement data received by the portable terminal may be transmitted to the analysis unit.
  • the analysis unit receives, as input data, metabolite measurement data directly or indirectly transmitted from the metabolite detection unit.
  • the metabolite measurement data input to the analysis unit indicates that the patient does not immediately reach a fasting state by starting food restriction, and that the steady-state value of the metabolite measurement data In view of the fact that there are differences, it is desirable to graphically display the measured data in chronological order on the display unit provided in the analysis unit so that the doctor in charge can make a judgment.
  • the analysis unit may also include a data storage device for storing and holding the metabolite measurement data transmitted from the metabolite detection unit, and the data stored in such a data storage device may be stored in the data storage device.
  • the doctor in charge who is viewing the measurement data of the patient at the analysis unit can Comments, such as whether the patient is in a fasting state, which is desirable for treating pulmonary fibrosis, may be sent directly to the patient's mobile device. For example, receiving comments from attending physicians stating that pulmonary fibrosis is improving as a result of continued medical fasting contributes to increased motivation for patients to continue fasting.
  • the doctor in charge may send a message instructing the patient to start fasting from a personal computer or tablet terminal that functions as an analysis unit to the portable terminal owned by the patient. A message may be sent to instruct the measuring device functioning as the metabolite detector to be activated and to send the measured data.
  • a user interface related to mobile terminal operations and the like may be implemented as a so-called application program.
  • Pulmonary fibrosis is a lung disease characterized by progressive scarring and matrix deposition, and generally has a poor prognosis (references 1 and 2). Although the etiology of PF is not well understood, many patients exhibit an inflammatory response triggered by infection or exposure to hazardous materials (such as asbestos and silica) (refs 1, 3, 4). Since therapeutic options for PF are limited (refs. 1-3), it is of great importance to identify potential novel targets for future therapy. Solute carrier family-15 member-3 (SLC15A3) is an amino acid/oligopeptide transporter (refs. 5, 6) and is primarily used by both human and mouse innate immune cells (macrophages [M ⁇ s] and neutrophils) (Fig. 1a, b).
  • SLC15A3 was found in both human and mouse lung tissues, and lungs of PF patients, with strong expression in M ⁇ s, especially alveolar M ⁇ s (AM ⁇ s) (Fig. 1a–c).
  • SLC15A3 is associated with fibrosis (ref. 2, 11).
  • SLC15A4 mediates endolysosome-dependent inflammatory and metabolic signals (refs. 8, 10) that are often associated with fibrosis (refs. 2, 11), thereby reducing colitis (ref.
  • SLC15A3 contributes to pulmonary inflammation (such as fibrosis) and used a mouse model to investigate the role of SLC15A3 in the pathogenesis of PF.
  • mice All animal experiments in this invention were approved by the National Center for Global Health and Medicine's Animal Care and Use Committee (approval number 20050) and were conducted in accordance with institutional procedures, national guidelines, and relevant national laws regarding the protection of animals. rice field.
  • WT C57BL/6 strain mice were purchased from Japan CLEA.
  • Slc15a3 ⁇ / ⁇ mice were generated by CRISPR-Cas9 technology as described in figS2. Cas9 and sgRNA targeting sequences around the first ATG of exon 1 of Slc15a3 were co-injected into WT embryos.
  • CRISPR direct https://crispr.dbcls.jp/) was used to design the sgRNA sequences.
  • the target sequence is 5'-CAGGATGTCTGCCCCCTCGCGCGG-3'.
  • B6 SJL mice were purchased from Taconic and housed. Except for the DF experiment, all mice were housed in a specific pathogen-free environment and given food and water ad libitum. Cages were changed weekly. The animal room was maintained at 22 ⁇ 1° C., 30%-70% humidity, and daily exposures began at 8:00 am and ended at 8:00 pm.
  • Antibodies and reagents The following antibodies were used in this invention.
  • ⁇ -CD146 ME-9F1
  • ⁇ -EpCAM G8.8
  • ⁇ -PDGFRa APA5
  • ⁇ -CD31 390
  • ⁇ - ⁇ ER-119 TER119
  • ⁇ -CD45 (30F11)
  • ⁇ -CD45.1 A20
  • ⁇ -20CD45.2 104
  • ⁇ -CD11b M1/70
  • ⁇ -CD11c N418)
  • ⁇ -Ly6G (1A8) ⁇ -Ly6C (HK1.4)
  • ⁇ - SiglecF S17007L
  • ⁇ I-Ab AF6-120.1
  • ⁇ -CD44 (1M7)
  • ⁇ -CD62L MEL-14
  • ⁇ -CD4 GK1.5
  • ⁇ -TCRb H57-597 was purchased from Biolegend (USA).
  • ⁇ SMA (ab5694) for immunoblotting was purchased from Abcam (UK).
  • ⁇ -phospho-STAT3 Y705 (D3A7)
  • ⁇ -STAT3 (124H6)
  • ⁇ -phospho-SMAD2 Ser465/467 /Smad3 Ser423/425 (D27F4)
  • ⁇ -SMAD3 (C67H9)
  • GAPDH (D16H11) were isolated from CellSignalingTech ( USA).
  • IL-11 (A-9), Pro-COL1A2 (D-6), and FAPa (F11-24) were purchased from SantaCruzBiotechnology (USA).
  • TGF ⁇ RII (FAB532P) was purchased from R&D Systems (USA).
  • ⁇ -SMA (1A4), ⁇ -Lyve1 (ALY7), ⁇ -CD19 (eBio1D3), and ⁇ -CD64 (X54-5/7.1) for flow-cytometry were purchased from Invitrogen (USA).
  • cytokines (IL-1b, IL-4, IL-6, IL-10, TNF ⁇ , IL-17, and leukemia inhibitory factor) were obtained from PeproTech (USA). Reagents used were lipopolysaccharide (Sigma-Aldrich, USA), ODN1668-CpGB and DMXAA (InvivoGen, USA), hydroxychloroquine (Tokyo Chemical Industry, Japan), ABH and BEC (Cayman Chemical, USA), BLM sulfate (Japan Kayaku, Japan) and silica MIN-U-SIL5 (mass-median diameter [d50] Z: 1.4 ⁇ m; American Silica, USA).
  • lipopolysaccharide Sigma-Aldrich, USA
  • ODN1668-CpGB and DMXAA InvivoGen, USA
  • hydroxychloroquine Tokyo Chemical Industry, Japan
  • ABH and BEC Cayman Chemical, USA
  • BLM sulfate Japan
  • SLC15A3, ARGII, and ARGI expression in humans and mice Expression levels of either human SLC15A3 or mouse Slc15a3 in tissues or cells were analyzed by assembling and recalculating publicly available databases. To avoid bias in SLC15A3 expression determined using RNA-seq data, raw data were obtained from three or more data sets. Reads per kilobase of transcript per million map reads (RPKM) for each data set were normalized to the median and pooled into a single set. RPKM values from common tissues or cells across data sets are displayed.
  • RPKM transcript per million map reads
  • RNA sequencing of total RNA from 20 human tissues https://db.cngb.org/search/project/PRJNA280600/.
  • BLM sulfate (2 mg/kg dissolved in 50 ⁇ L sterile saline) or crystalline silica particles (400 mg/kg suspended in 50 ⁇ L sterile saline) were administered intraperitoneally to 8-10 week old mice. bottom. It was achieved by intraperitoneal administration of an M/M/B anesthetic consisting of a mixture of medetomidine (0.75 mg/kg), midazolam (4 mg/kg) and butorphanol (Meiji Seika, Japan) under deep anesthesia. was due to the inhalation of
  • the silica suspension was prepared as follows. Silica particles were suspended in 1 M HCl (Nacalai Tesque, Japan) at 3% (w/v), boiled at 105°C for 1 hour, washed with dH2O, and dried at 110°C overnight. Particles were weighed, heat sterilized at 200° C. for 2 hours, and resuspended in sterile saline. Prior to administration, the silica suspension was sonicated for 30 minutes with a Bioruptor I ultrasonicator (BM Equipment, Japan).
  • Arginase inhibitor treatment Beginning 15 days after silica treatment and continuing twice weekly for 3 weeks, mice were anesthetized with the above M/M/B mixture, 50 ⁇ L PBS, 0.3 mM BEC. , or ABH were subjected to intranasal administration of 0.25 mM.
  • mice After 6-8 week old mice were irradiated (8.5 Gy), 5 individuals were reconstituted with 2 ⁇ 10 6 BM cells from the indicated mice. Eight weeks after BM cell transplantation, mice were administered BLM as described above.
  • DF treatment DF experiment: From day 15 of silica administration, mice were divided into two feeding regimens, AL or DF. AL mice were fed ad libitum. DF mice were fed once daily at 12:00 pm ⁇ 1 hour for 3 hours. After 3 hours of feeding, DF mice were transferred to new clean cages without food. Food intake before and after feeding and body weight were measured daily. AL mice were fed on the hopper and DF mice were fed on the floor of the cage.
  • BMM ⁇ culture BMM ⁇ s: Differentiated from BM mononuclear cells in the presence of mouse macrophage-dicolonyi-stimulating factor (M-CSF; 50 ng/mL, R&D Systems).
  • M-CSF mouse macrophage-dicolonyi-stimulating factor
  • BM cells were obtained from 8-10 week old mice by separating the tibia and femur and flushing with RPMI-1640 medium (Sigma-Aldrich).
  • the medium was changed on the 3rd and 6th days.
  • BMM ⁇ s were collected on day 7 by incubation with Accutase (Nacalai Tesque) at 37°C for 10 minutes.
  • BMM ⁇ Endotracheal Implantation BMM ⁇ s were administered directly to the lungs of mice by oropharyngeal aspiration 15 days after silica administration. Mice were deeply anesthetized with M/M/B anesthetic as described above and restrained to a flat plate with rubber bands placed on the maxillary incisors. Each mouse was placed in a semi-recumbent (45 degrees) position with the ventral surface and rostral side facing up. The tongue was gently and partially retracted rostrally by a pair of simple forceps. A laryngoscope blade (Model LS-1, Penn Century, USA) was used to achieve optimal visualization of the trachea and epiglottis.
  • HL-60 and U937 cells were purchased from ATCC (USA) (CCL-240 and CRL-1593.2 respectively). Cells were cultured in complete RPMI-1640 medium in humidified air with 5% CO2 at 37°C. Cells were passaged at 2-3 day intervals. To differentiate 5 U937 cells into M ⁇ s, U937 cells seeded in 6-well plates at a density of 5 ⁇ 10 5 cells/well in complete RPMI 1640 medium were added with 100 nM phorbol 12-myristate 13-acetate. -to (Sigma-Aldrich) for 24 hours.
  • PBS phosphate-buffered saline
  • Plasma samples were stored at -80°C until use.
  • Biochemical parameters in plasma total cholesterol, glucose, urea nitrogen, aspartate aminotransferase, alanine aminotransferase, and creatinine
  • Micro-CT analysis and assessment of respiratory function Following induction and maintenance of anesthesia with 2% isoflurane, the lungs of mice were scanned with an in vivo microCT system (CosmoScan Fx; Rigaku Corporation, Japan) with the mice in the supine position. Images were acquired with the respiratory gate technique using the following parameters. X-ray tube voltage, 90 kV X-ray tube current, 88 ⁇ A; field of view, 36 mm; total scan time 4 minutes. The acquisition protocol yielded two 3D data sets with a reconstructed voxel size of 72 ⁇ m, corresponding to two different phases of the respiratory cycle (ie inspiration and expiration).
  • hydroxyproline quantification lung tissue was harvested after right ventricular perfusion with 10 mL PBS, minced, and resuspended in 2 mL ultrapure water. The suspension was further homogenized with a Polytron (Kinematica AG, Switzerland) and 200 ⁇ L of the suspension was transferred to a polytetrafluoroethylene-lined, capped pressure resistant polypropylene vial. The remaining suspension was aliquoted and stored at -80°C for gene expression assays. Subsequently, 200 ⁇ L of 12M HCl was added to the pressure resistant polypropylene vial. The sample was hydrolyzed at 120°C for 3 hours and filtered. The hydroxyproline content of each sample was measured using a hydroxyproline assay kit (MAK008-1KT, Sigma-Aldrich) according to the manufacturer's protocol.
  • MAK008-1KT Sigma-Aldrich
  • Erythrocytes were removed by Pacoll gradient centrifugation (25% top/65% bottom, middle layer collected, GE Healthcare, USA) for 20 minutes at 1000 ⁇ g at room temperature.
  • the resulting single cell 5 suspension was blocked with a custom preparation of Fc Block 2.4G2 and stained with the appropriate antibody mix (all antibodies diluted in PBS with 2% FBS).
  • the gating protocol for fibroblast isolation was CD45-CD31-EpCAM-CD146-PDGFR ⁇ + .
  • Flow Cytometry Cultured cells, BM cells, or lung cells were stained with monoclonal antibodies and analyzed by flow cytometry, as indicated in each figure. For intracellular staining, cells were fixed with 4% paraformaldehyde in PBS, permeabilized with 1xBD Perm/Wash (BD Biosciences), and stained with the indicated monoclonal antibodies followed by fluorochrome-labeled secondary antibodies. stained with All antibodies were used at a dilution of 1:200 unless otherwise stated. Fluorescence intensity was analyzed on a FACSVerse or FACSCalibur flow cytometer, or a FACSAria II cell cytometer (BD Biosciences, USA) using FlowJo software (version 10.7.1; Tree Star, USA). bottom. Cell sorting was performed using a FACSAria II cell sorter.
  • BALF BALF was aliquoted and stored at -80°C until analysis.
  • Luminex 100 Luminex Corp, USA
  • Cytokines were detected using a cytokine panel (Bio-Plex Pro Mouse Cytokine 23-plex Assay #M60009RDPD).
  • the lower limit of cytokine detection varied between cytokines and experiments, and typically ranged from 0.1-100 pg/mL.
  • Cytokine ELISA Concentrations of IL-11 in cell culture supernatants were quantified using a mouse IL11 DuoSet ELISA kit (DY418, R&D Systems). Enzyme-linked immunosorbent assay was performed according to the manufacturer's protocol.
  • RNA from cells was purified with ISOGEN (Nippon Gene, Japan) and reverse transcribed using LunaScript RT SuperMix Kit (New England Biolabs, USA). SYBR-based reverse transcriptase-quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) was performed using mouse gene specific primers (listed in Supplementary Table 1) and THUNDERBIRD SYBR qPCR in a StepOne Plus real-time PCR system (Thermo Fisher Scientific). I ran it using mix. Gene expression was normalized to hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1 levels. For gene expression in lung tissue, a 200 ⁇ L homogenized lung tissue aliquot was thawed and added to 1 mL of ISOGEN reagent. Gene expression assays were performed in a similar manner on cells.
  • AM ⁇ separation AM ⁇ s were collected by bronchoalveolar lavage. For each mouse, BALF was pooled from 10 separate 1 mL bronchoalveolar lavages with 37° C. lavage (2 mM ethylenediaminetetraacetic acid, 0.5% FBS in PBS) and stored on ice. Erythrocyte lysis was then performed for 3 minutes at room temperature (erythrocyte lysis buffer, Thermo Fisher Scientific). Flow cytometric analysis was performed to assess the quality of AM ⁇ . Typically >95% of BALF cells were AM ⁇ s. Cells were seeded at a density of 1 ⁇ 10 5 cells/well in 24-well plates containing complete RPMI-1640 medium as described above. For subsequent experiments, the medium was supplemented with 20 ng/mL recombinant mouse granulocyte-macrophage-di-colony-stimulating factor (PeproTech).
  • Lung fibroblast culture Primary mouse lung fibroblasts were isolated from WT C57BL/6 and Slc15a3 ⁇ / ⁇ mice using the Helichrysum protocol with some modifications. Lungs were harvested after perfusing the right ventricle with 10 mL of PBS. Lung lobes were minced and mixed with 5 mL of protease solution [1000 U/mL collagenase XI (Sigma-Aldrich), 10 U/mL Dispase II (Roche), and 2000 U/mL DNase I and 10 mM in DMEM supplemented with 10% FBS. HEPES] was triturated with a micropipette at 20 min intervals for 60 min at 37°C.
  • cells were passed through a 70 ⁇ m strainer, washed with DMEM supplemented with 5% FBS, and added with complete DMEM [10% FBS, 2 mM L-glutamine, 50 ⁇ M 2-mercaptoethanol, 1% (v/v) essential amino acids, 100 U/mL penicillin, and 100 ⁇ g/mL streptomycin] at 37° C. to allow fibroblasts to attach and grow.
  • fibroblasts When fibroblasts reached 80% confluence, they were harvested with 0.25% trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (Thermo Fisher Scientific) using an AutoMACS Pro separator (Miltenyi Biotec, Germany) according to the manufacturer's protocol. , mouse CD45 (leukocytes), CD31 (endothelial cells), and EpCAM (epithelial cells) by negative selection using magnetic beads. Mouse lung fibroblasts between passages 2-5 were used for subsequent experiments. For in vitro assays of gene or protein expression, fibroblasts were plated on day 1 at 1 x 10 5 cells/well of a 24-well plate (gene expression) or 2 x 10 5 cells/well of a 12-well plate (protein expression). Plated in DMEM containing %FBS. Cells were stimulated or unstimulated with the indicated cytokines for 24-72 hours.
  • Histological processing Serial 4 ⁇ m serial sections of paraffin-embedded tissue were stained with hematoxylin and eosin. To visualize collagen content and deposition in lung tissue, deparaffinized sections were stained with Masson's trichrome. For ⁇ SMA staining, sections were subjected to deparaffinization and antigen retrieval, then incubated in 0.3% hydrogen peroxide in methanol for 30 minutes. Diluted ⁇ SMA antibody (Abcam) was applied to each slide (4°C, overnight). Diluted horseradish peroxidase-labeled secondary antibody was applied for 60 minutes at room temperature.
  • Single cell analysis Lung cells were collected from 6 BLM-treated mice (day 2-10 and day 1-21 mice per group) from WT and Slc15a3 ⁇ / ⁇ mouse groups. After isolation of single-cell suspensions from each lung, cells were stained with TotalSeq mouse hashtag antibody (BioLegend, USA). The 20,000 labeled cells were then trapped and reverse transcribed using BDRhapsody TM (BD Bioscience, USA) according to the manufacturer's instructions. For scRNA-seq, cDNA libraries and hashtag libraries were prepared by an optimized process similar to magnetic bi-based bulk RNA-seq methods.
  • Sequencing libraries were generated using the NEBNext Ultra II FS Library Prep Kit (New England Biolabs, USA) and final library quality was determined by MultiNA (Shimadzu, Japan) and qPCR library-quantitation assays ( KAPA Biosystems, USA). Samples were sequenced on an Illumina NovaSeq 6000 S4 flow cell (67 bp read 1 and 140 bp read 2) (Illumina, USA) to a depth of approximately 100,000 reads per cell. After removing the adapter using Cutadpat-v2.10, I used a modified Python script for the BD Rhapsody workflow to match the reading of the server code to the server code. .
  • the reference cDNA read was aligned to the GRCm38 release-101 reference transcriptome by Bowtie2-2.3.4.1.
  • a count matrix was generated using a custom-built shell script and a modified Python script for the BDRhapsody workflow.
  • Valid selva codes are selva codes exceeding the inflection threshold of a ni-plot of total read counts for each selva code identified using the DropletUtils package (46). identified as
  • Variable genes for dimensionality reduction were selected using the FindVariableGenes function of the Seurat package.
  • Visualization of Seurat-identified clusters on a two-dimensional map was performed using a Python implementation of optimized t-distributed stochastic neighbor embedding (opt-SNE).
  • UMAP Uniform Manifold Approximation and Projection
  • Geneset enrichment analysis and network analysis Gene set enrichment analysis was performed using genes ranked according to the logarithmic difference in mean expression of WT and Slc15a3 using a comparative toxicogenomics database (http://ctdbase.org/, MeSHID: D011658). It was performed using the pulmonary fibrosis gene set. Genes were ranked according to the logarithmic difference in mean expression between WT and Slc15a3 ⁇ / ⁇ lungs on day 10 or 21 of each cluster. An enrichment plot is displayed with normalized enrichment scores and false discovery rate q-values for significant clusters.
  • Immunoblotting analysis Fibroblasts in 12-well plates, with or without the above stimulation, were harvested in 1x Cell Lysis Buffer (Cell Signaling Technology) supplemented with 1x Halt Protease Inhibitor Cocktail. bottom. Whole cell lysates were subjected to sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis and transferred to polyvinylidene fluoride membranes. The membrane was blocked with a blocking reagent (Blocking-One or Blocking-one P, Nacalai Tesque) to prevent absorption of non-specific antibodies. Immunoblotting was performed using primary antibodies.
  • Immunoblotting was performed using a primary antibody as indicated in each figure, followed by incubation with an orthella dish peroxidase-conjugated secondary antibody. All antibodies were used at the manufacturer's recommended dilutions. Orcera dish peroxidase signal was detected with Supersignal West Femto or Supersignal West Pico chemiluminescent substrate (Thermo Fisher Scientific) in the LAS-3000 detection system (Fujifilm, Japan). Band intensities were quantified with ImageGauge (Fujifilm) and normalized to the band intensities of loading controls where necessary.
  • Statistical analysis was performed using Prism software version 8.4.3. Differences in mean ⁇ standard deviation of two groups were analyzed using two-tailed Student's t-test or Mann-Whitney U-test. For comparisons involving more than two groups, a one-way ANOVA followed by Tukey's post-test or a two-way ANOVA followed by Sidak's post-test was performed. P ⁇ 0.05 was considered statistically significant.
  • SLC15A3 deficiency attenuates progression in two different mouse models of PF.
  • the results can be corroborated by multiple assessments of profibrotic parameters, including computed tomography (CT) images (Fig. 3c), lung histology (Figs.
  • the BLM-induced PF mouse model shows rapid disease progression and slow recovery. Therefore, the effects of SLC15A3 deficiency were further investigated using an irreversible silica-induced PF mouse model. Slc15a3 ⁇ / ⁇ mice also showed PF alleviation in the silica-induced PF model; There was no significant difference in weight (Fig. 5a,b). These results suggested that SLC15A3 plays an important role in the progression of fibrosis regardless of the pathogenic mechanism.
  • Slc15a3 can be detected mainly in immune cells (M ⁇ s, neutrophils, regulatory T cells, etc.). It was less present in non-hematopoietic cells (such as fibroblasts and epithelial cells) (Fig. 6b). Although no apparent differences in cluster structure were detected between WT and Slc15a3 ⁇ / ⁇ lungs at the indicated time points (Fig. 6c, Fig. 7c), multiple clusters were associated with comparative toxicity of pulmonary fibrosis. Genomics database entries (Fig. 7b) could show a significant enrichment of different genes associated with pulmonary fibrosis. Additional detailed analysis of the scRNAseq data revealed large differences in gene expression patterns in various cell types, especially the M ⁇ subsets (Fig. 6c-g, Fig. 7d-f).
  • BM transplantation experiments have revealed that the contribution of hematopoietic and non-hematopoietic cells to the progression of PF differs according to the pathology of PF.
  • loss of SLC15A3 in hematopoietic cells mainly contributed to mitigation of fibrosis, as indicated by decreased hydroxyproline content in Slc15a3 ⁇ / ⁇ BM transplanted lungs (Fig. 9a).
  • hematopoietic and non-hematopoietic SLC15A3-expressing cells were differentially involved in the anti-inflammatory phenotype at different time points in the BLM model (Fig. 9c-e).
  • hematopoietic SLC15A3-expressing cells strongly contributed to inflammatory cell infiltration (day 21) and collagen gene expression on day 10 (Fig. 9f,g).
  • CD45-based assessment of the donor cell population showed that the engrafted BMM ⁇ s were maintained in the lungs for more than 30 days, with some expressing cell surface markers indicative of AM ⁇ s (Fig. 10d). ). Twenty days after BMM ⁇ s transplantation (35 days after silica inhalation), Slc15a3 ⁇ / ⁇ BMM ⁇ s receptor WT lungs showed marked reduction in collagen deposition (FIG. 11c) and improved respiratory function (FIGS. 11d, 12b). However, body weight did not differ between groups (Fig. 12a). Micro-CT analysis also showed that alveolar air spaces were restored in Slc15a3 ⁇ / ⁇ BMM ⁇ s receptor WT lungs compared to WT BMM ⁇ s receptor WT lungs (FIG. 11a). These results indicate that Slc15a3 ⁇ / ⁇ M ⁇ s make a crucial contribution to tissue repair in lungs with PF.
  • SLC15a3 causes increased expression of arginine-metabolizing enzymes in M ⁇ s
  • scRNAseq analysis revealed that genes involved in metabolic pathways were enriched in Slc15a3 ⁇ / ⁇ immune cells (especially AM) (FIG. 6e).
  • all M ⁇ clusters of Slc15a3 ⁇ / ⁇ lungs showed enhanced arginine-metabolizing enzymes such as arginase II (Arg2) and glycine amidinotransferase (Gatm) ( Figure 6d-g), suggesting possible alterations in arginine biosynthesis in these cells.
  • Arg2 arginase II
  • Gatm glycine amidinotransferase
  • arginine-metabolizing enzymes were mainly expressed in lung M ⁇ s (Fig. 11e).
  • Arginine is a semi-essential amino acid and is metabolized by multiple pathways involving enzymes such as nitric oxide synthase, Arg1, Arg2 and Gatm.
  • Arg2 is a mitochondrial enzyme that catabolizes arginine to ornithine and urea, whereas Gatm mediates the production of ornithine and guanidinoacetate from arginine and glycine and promotes creatine synthesis.
  • Arg2 expression was increased in BALF cells (FIG. 11g) and lung tissue (FIG. 12c) of silica-treated Slc15a3 ⁇ / ⁇ mice compared with WT mice, and Arg1 expression was unaffected (FIG. 11g, Figure 12c). Elevated levels of Arg2 expression were present in steady-state Slc15a3 ⁇ / ⁇ AM ⁇ s and were further elevated upon cytokine stimulation in Slc15a3 ⁇ / ⁇ AM ⁇ s, but only marginally in WT AM ⁇ s (FIG. 11h). On the other hand, Arg1 expression was again indistinguishable between WT and Slc15a3 ⁇ / ⁇ AM ⁇ s regardless of PF progression (FIG. 12c) and cytokine stimulation (FIG. 12d).
  • Arg2 of M ⁇ s greatly contributes to the reduction of PF.
  • silica-treated Slc15a3 ⁇ / ⁇ mice were treated with an arginase inhibitor, the arginase inhibitor amino, which inhibits the activity of both Arg1 and Arg2.
  • -2-borono-6-hexanoic acid (ABH) or S-(2-boronoethyl)-L-cysteine (BEC) were intranasally exposed twice weekly (Fig. 14a).
  • DF daily fasting and time-restricted feeding
  • ALT Total cholesterol, urea nitrogen, glucose, and alanine aminotransferase (ALT) were lower in blood samples of the DF group than in the ad libitum (AL) (i.e., normal feeding) group. Observe that (Fig. 14c). In blood samples of the DF group, less total cholesterol, urea nitrogen, glucose, alanine aminotransferase (ALT), and triglycerides were observed compared to the AL (ad libitum) normal diet group. (Fig. 17c).
  • Arg2 expression in the lung was enhanced after DF initiation and remained higher than the AL group until the end point (Fig. 16b, f, Fig. 17g), with IM ⁇ s and AM ⁇ s showing enhanced Arg2 expression and decreased Slc15a3 expression ( Fig. 17g). Supports a causal relationship between enhanced expression of Arg2 in the lung and a corresponding anti-fibrotic effect.
  • HMB -hydroxymethylbutyric acid
  • ⁇ -Hydroxybutyrate (-HB) concentrations were increased in the serum and lungs of the DF group (Fig. 16j, Fig. 18a). Since HB is an endogenous histone deacetylase (HDAC) inhibitor, we examined the effects of common HDAC inhibitors on Arg2 expression and found that both trichostatin A (TSA) and sodium butyrate (NaB) inhibited AM ⁇ s. increased Arg2 transcription of (Fig. 18b). However, Hmgcs2 ⁇ / ⁇ mice, which produce few ketone bodies, also showed increased Arg2 transcription by DF (FIG. 18c,d), indicating that increased ketone bodies are not required for Arg2 induction.
  • HDAC histone deacetylase
  • Enhanced OXPHOS was also detectable in Slc15a3 ⁇ / ⁇ AM ⁇ s, which exhibited a higher rate of oxygen consumption (OCR) and produced more ATP than WT AM ⁇ s (Fig. 19f,g, Fig. 20c).
  • Slc15a3 ⁇ / ⁇ AMs had increased dependence on FA for oxidative phosphorylation (OXPHOS) but decreased metabolic flexibility (FIGS. 19h, 20d) compared with WT AM ⁇ s, indicating that metabolic was shown to be indicative of the level of vulnerability of Slc15a3 ⁇ / ⁇ AMs in adaptive adaptation.
  • Slc15a3 deficiency also showed enhanced AMPK activity (Fig.
  • the present invention provides an innovative approach for SLC15A3 deficiency to improve lung function.
  • Loss of SLC15A3 has broad effects on gene expression patterns of multiple cell subsets (such as M ⁇ s and fibroblasts), promoting the conversion of these cells from profibrotic to antifibrotic phenotypes. do.
  • SLC15A3 affects different functions in different cell types. scRNAseq analysis revealed that loss of SLC15A3 caused alterations in various lung cell metabolic processes.
  • FIG. 3 shows analysis of SLC15A3 gene expression of the present invention.
  • a and b RPKM of human SLC15A3 (A) or mouse Slc15a3 (B) in the indicated tissues (top) or cell types (bottom) calculated from pools of at least two data sets as described in the methods of the present invention. Expression values are indicated.
  • c Boxplot of SLC15A3 expression across cells identified from IPF lungs from normal controls and IPF cell atlas database.
  • e RPKM of human SLC15A3 (A) or mouse Slc15a3 (B) in the indicated tissues (top) or cell types (bottom) calculated from pools of at least two data sets as described in the methods of the present invention. Expression values are indicated.
  • c Boxplot of SLC15A3 expression across cells identified from IPF lungs from normal controls
  • FIG. 1 shows the generation and characterization of Slc15a3 ⁇ / ⁇ mice of the invention.
  • a Schematic representation of Slc15a3 mutant alleles. Exon 1 of the Slc15a3 gene was targeted and partially deleted by CRISPR-Cas9. Arrows indicate genotyping primers.
  • b Genotyping results of Slc15a3 ⁇ / ⁇ mice by PCR using primer sets specific for exon 1.
  • the primer-sequences are: Fwd, 5'-GCAGTTAACCGGGGACACTA-3', Rev, 5'-CGCCTAGGAAGAGGAGTGTG-3'.
  • Slc15a3 transcripts in WT and Slc15a3 ⁇ / ⁇ neutrophils in the peritoneal cavity were analyzed by RT-qPCR. P ⁇ 0.01 (determined by unpaired t-test).
  • E and F are flow cytometric analyzes of lymphoid and myeloid lineages in the spleen and BM of Slc15a3 ⁇ / ⁇ mice.
  • Single-cell suspensions prepared from spleens (E) or BM (F) of native WT and Slc15a3 ⁇ / ⁇ mice were analyzed by staining with the indicated antibodies. Results are representative of three independent experiments.
  • Slc15a3 transcript levels in the lung during the course of BLM-induced PF expressed as relative quantification (RQ).
  • RQ relative quantification
  • 3D is a three-dimensional (3D) CT image of a lung processed with BLM.
  • d Lung CT images (left) and Masson's trichrome staining of BLM-treated lung sections of WT and Slc15a3 ⁇ / ⁇ mice at day 21 (middle). Higher magnification images are shown in the right column.
  • g BALF cell numbers in BLM-induced PF, and h.
  • Collagen gene expression in the lung The number of mice per group is the same as in Fig. 1a.
  • i BALF cytokine levels at indicated time points in BLM-induced PF model mice.
  • j Expression levels of Il11 transcripts in WT and Slc15a3 ⁇ / ⁇ lung tissues during the course of BLM-induced PF.
  • K Lung hydroxyproline content at day 28 in silica-induced PF model (silicosis).
  • l Relative lung volume changes during silicosis determined using mean values on day 7 from CT scans.
  • m Representative 3DCT images of pulmonary silicosis in WT and Slc15a3 ⁇ / ⁇ mice at 7 and 28 days.
  • FIG. 4 shows increased expression of Arg2 in Slc15a3 ⁇ / ⁇ lungs treated with BLM.
  • FIG. 3 shows relaxation of PF in Slc15a3 ⁇ / ⁇ mice in a silica-induced PF model.
  • PF silica-induced pulmonary fibrosis
  • FIG. 2 shows the results of scRNAseq analysis of lung cells in BLM-induced PF.
  • b Optimized t-distributed stochastic neighbor embedding
  • Slc15a3 expression in lung cell populations was analyzed by scRNAseq. Clusters expressing Slc15a3 were gated.
  • c Comparison of monocyte/macrophage clusters between WT and Slc15a3 ⁇ / ⁇ mice on days 10 and 21 by comparative opt-SNE display. Light and dark dots represent WT and Slc15a3 ⁇ / ⁇ mice, respectively.
  • b Optimized t-distributed stochastic neighbor embedding
  • FIG. 4 shows the results of gene expression analysis in Slc15a3 ⁇ / ⁇ lungs.
  • a A human map representing the top 30 differentially expressed genes among 40 clusters (0-39) in scRNAseq analysis.
  • Gene set enrichment analysis was performed using the comparative Toxicogenomics database pulmonary fibrosis gene set, logarithmic differences in mean expression between WT and Slc15a3 ⁇ / ⁇ mice in each cluster at the indicated time points. was performed using genes ranked by For clusters with q-values less than 0.05, enrichment plots are displayed with normalized enrichment scores and false positive q-values.
  • Gene set enrichment analysis was performed using the comparative Toxicogenomics database pulmonary fibrosis gene set to determine the mean expression between WT and Slc15a3 ⁇ / ⁇ mice in each cluster at the indicated time points. It was performed with genes ranked by logarithmic difference.
  • Bubble color represents expression intensity and bubble size represents positive cell fraction.
  • f Bubble plot representation of cluster-16 (IM) chemokine ligands and receptors in WT and Slc15a3 ⁇ / ⁇ mice on days 10 and 21.
  • FIG. g and h Network analysis of DEGs in epithelial cells (g) (clusters-21 and 25) and endothelial cells (h) (clusters-4 and 24).
  • FIG. 4 shows the results of gene expression analysis in Slc15a3 ⁇ / ⁇ lungs.
  • UMAP Homogeneous manifold approximation and projection
  • FIG. 4 shows the role of Slc15a3-expressing hematopoietic and non-hematopoietic cells in PF development as assessed by the generation of BM chimeric mice.
  • a. Slc15a3 expression levels and hydroxyproline content in lungs on day 35 of silicosis.
  • b Arg2 expression levels in lung and BALF cells on day 35 of silicosis.
  • d Slc15a3 expression levels in the lungs of BM chimeric mice on days 10 and 21 of BLM-induced PF.
  • e BALF cell counts of BM chimeric mice on days 10 and 21 of BLM-induced PF.
  • f Number of inflammatory cells in BALF on days 10 and 21.
  • Granulocytes were recognized as CD45+CD11b+Ly6G+ cells and monocytes were recognized as CD45+CD11b+Ly6G- cells.
  • FIG. 3 shows the results of examining the involvement of BM-derived M ⁇ s in PF.
  • Intratracheal Slc15a3 ⁇ / ⁇ BMM ⁇ transplantation ameliorates pulmonary silicosis.
  • a Representative 3DCT images of pulmonary silicosis before (day 14) and after (day 35) BMM ⁇ transplantation.
  • b Hydroxyproline content at days 0 and 14 in silicosis-induced WT lungs.
  • j Expression levels of Arg2 in SLC15A3 knockdown human M ⁇ cell lines. Data are shown as mean ⁇ SD.
  • FIG. 10 shows the results of a study investigating the relationship between PF tissue repair and Slc15a3 ⁇ / ⁇ M ⁇ s. a and b.
  • Arg2 shows the importance of Arg2 in PF relaxation.
  • a Expression levels of A, Arg2, Gatm, and Arg1 in lung cell populations analyzed by scRNAseq.
  • b to e Effect of SLC15A3 loss on gene expression of arginine-metabolizing enzymes.
  • d and e Expression levels of Arg2 mRNA in BMM ⁇ (D) and LC15A3 knockdown human M ⁇ cell lines (E) cultured for 24 h with the indicated cytokines or stimulants.
  • f and g Effect of arginase inhibition on progression of silicosis in Slc15a3 ⁇ / ⁇ mice. f.
  • FIG. 10 shows that Arg2 of M ⁇ s contributes greatly to mitigating PF.
  • a Schematic representation of a strategy for administering arginase 5 inhibitors to Slc15a3 ⁇ / ⁇ silicosis model mice.
  • c Representative three-dimensional (3D) CT images of lungs after inhibitor treatment. d.
  • Arg2 ⁇ / ⁇ mice Boxplots of whole cell ARG2 and ARG1 expression identified from normal controls and IPF donors. Generation and characterization of Arg2 ⁇ / ⁇ mice.
  • a and b Schematic representation of the deleted DNA sequences of CRISPR/Cas9 targeted Arg2 exons 1 and 2 (a) and the resulting Arg2KO mutant allele (b). Arrows indicate the position of primers used for genotyping.
  • c PCR genotyping of Arg2 ⁇ / ⁇ mice using the following primers: Common, 5′-GAGAGCTGTAGTCCTCCGAGA-3′; and E2a, 5′-GTAGCAGCTTGGCACCTGTA-3′.
  • d PCR genotyping of Arg2 ⁇ / ⁇ mice using the following primers: Common, 5′-GAGAGCTGTAGTCCTCCGAGA-3′; and E2a, 5′-GTAGCAGCTTGGCACCTGTA-3′.
  • Figure 2 shows that daily fasting and timed feeding upregulate Arg2 in alleviating PF.
  • FIG. 2 shows the relationship between daily fasting and Arg2 expression.
  • DF-induced ketogenesis is dispensable on Arg2 induction.
  • a ⁇ -Hydroxybutyrate levels in serum (Fig. 17b-f).
  • b Arg2 expression in BMM ⁇ s of WT and Slc15a3 ⁇ / ⁇ mice cultured with 50 nM trichostatin A (TSA) or 1 mM sodium butyrate (NaB) for several hours.
  • TSA nM trichostatin A
  • NaB sodium butyrate
  • Data are presented as mean ⁇ SD. Mann-Whitney-U test (a); one-way ANOVA followed by Tukey's post hoc test (bd). ***P ⁇ 0.0001, ***P ⁇ 0.001, (ns) non-significant. All results are representative of at least two independent experiments.
  • c and d Lysosomal distribution of the indicated proteins examined by lysosomal fractionation experiments.
  • c Cell homogenates from WT or Slc15a3 ⁇ / ⁇ BMM ⁇ cultured under normal conditions were separated by density gradient ultracentrifugation and the proteins indicated in each fraction were examined by immunoblotting.
  • FIG. 4 shows that compound NCGM-1006, which enhances Arg2 expression in AM ⁇ , suppresses PF. a.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of a strategy for applying an Arg2-enhancing compound to a silicosis model mouse. b. Fig.
  • FIG. 1 shows the general mechanism underlying the effects of DF and Slc15a3 deficiency in mice. In M ⁇ s of DF lungs, sustained and enhanced activation of AMPK is caused by fuel starvation. Since SLC15A3 is associated with the Rab2 and Rab7 proteins that regulate lysosomal trafficking, fuel starvation may also occur in Slc15a3-deficient M ⁇ s, possibly due to lysosomal dysregulated behavior.
  • SLC15A3 is associated with AMPK phosphatase and may be involved in the negative feedback regulation of AMPK. Loss of SLC15A3 may reduce the accessibility of these phosphatases, resulting in sustained and enhanced AMPK activity regardless of the ATP:AMP ratio.
  • the present invention provides compounds that treat and/or mitigate the progression of pulmonary fibrosis, dietary supplements to support fasting, and/or management systems that keep patients fasting for at least 16 hours or more per day. offers a strategy for treating and/or slowing the progression of pulmonary fibrosis, and can be utilized in repairing fibrotic scarring, particularly after COVID-19 infection.
  • TASL Sedlyarov, K. Papakostas, A. Cesar-Razquin, P. Essletzbichler, U. Goldmann, A. Stefanovic, J. W. Bigentechnik, S. Scorzoni, M. D. Pizzagalli, A. Bensimon, A. C. Muller, F. J. King, J. Li, E. Girardi, M. L. Mbow, C. E. Whitehurst, M. Rebsamen, G. Superti-Furga, TASL is the SLC15A4-associated adapter for IRF5 activation by TLR7-9 Nature (2020), doi:10.1038/s41586-020-2282-0. 11. X. Zhao, J. Y. Y. Kwan, K.

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Abstract

本発明は、人体（患者等）を絶食状態に維持することで、肺間質の疾患、特に肺線維症の治療または修復もしくはその両方を行う方法、および、当該絶食状態によって誘発される代謝産物を検出し分析するシステム、アミノ酸／オリゴペプチドトランスポ-タ-の機能を調節する工程を含む、肺線維症の治療方法および当該方法に使用する組成物、加水分解酵素の機能を調節する工程を含む、肺線維症の治療方法および当該方法に使用する組成物、AMPKの機能を調節する工程を含む、肺線維症の治療方法および当該方法に使用する組成物に関する。

Description

肺線維症の治療および修復方法
　本発明は、人体（患者等）を絶食状態に維持することで、肺間質の疾患、特に肺線維症の治療または修復もしくはその両方を行う方法、および、当該絶食状態によって誘発される代謝産物を検出し分析するシステム、アミノ酸／オリゴペプチドトランスポ-タ-の機能を調節する工程を含む、肺線維症の治療方法および当該方法に使用する組成物、加水分解酵素の機能を調節する工程を含む、肺線維症の治療方法および当該方法に使用する組成物、AMPKの機能を調節する工程を含む、肺線維症の治療方法および当該方法に使用する組成物に関する。
　肺の間質は肺胞の壁（肺胞壁）や肺胞を取り囲んで支持している組織を指し、この組織領域における疾患は、呼吸機能に直接大きな影響を及ぼし、生命維持の危機もしくは生活の質の低下に直結しうる。
　肺間質の疾患、特に肺線維症（ＰＦ）は、進行性の瘢痕化とマトリックス沈着を特徴とする肺疾患であり、一般的に予後は不良である。ＰＦの病因はよく理解されていないが、多くの患者は、感染または危険物（アスベストやシリカなど）への曝露によって引き起こされる炎症反応を示す。有病率が増加する難病である肺線維症（ＰＦ）は、深刻な公衆衛生上の問題である。
　また、肺間質の疾患、特に肺線維症が一旦治癒されても、残る線維性瘢痕は、広範囲にわたる臓器不全を引き起こすことが知られている。重要なことに、ＰＦは、環境汚染（アスベストやＰＭ２．５など）および最近のコロナウイルス病２０１９のパンデミック（ロングＣＯＶＩＤなど）のためにますます一般的になっている。よって、治療後の修復が必要である。
　また、溶質キャリアファミリ-１５のメンバ-３（ＳＬＣ１５Ａ３）は、自然免疫細胞で強力に発現するアミノ酸／オリゴペプチドトランスポ-タ-であり、主にヒトとマウスの両方の自然免疫細胞（マクロファ-ジや好中球など）で発現します（図１のＡ、Ｂを参照）
　さらに、ヒトとマウスの両方の肺組織、およびＰＦ患者の肺でＳＬＣ１５Ａ３の強い発現が見られ、ＭΦｓ、特に肺胞ＭΦｓ（ＡＭΦｓ）で強い発現が見られた（図Ｓ１ａ-ｃ）。だがＳＬＣ１５Ａ３の機能はほとんど知られておらず、その同族体であるＳＬＣ１５Ａ４は、線維症に関連することが多いエンドリソソ-ム依存性の炎症および代謝シグナルを媒介することにより、大腸炎および狼瘡の症状を促進することしかわかっておらず。
Ｍ．Ｗｉｊｓｅｎｂｅｅｋ，Ｖ．Ｃｏｔｔｉｎ，ＳｐｅｃｔｒｕｍｏｆＦｉｂｒｏｔｉｃＬｕｎｇＤｉｓｅａｓｅｓ．Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３８３，９５８-９６８（２０２０）。
Ｎ．Ｃ．Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ，Ｆ．Ｒｉｅｄｅｒ，Ｔ．Ａ．Ｗｙｎｎ，Ｆｉｂｒｏｓｉｓ：ｆｒｏｍｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｔｏｍｅｄｉｃｉｎｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ．５８７，５５５-５６６（２０２０）。
Ｋ．Ｓａｋａｔａ，Ｔ．Ｙａｍａｓｈｉｔａ，Ｍ．Ｍａｅｄａ，Ｙ．ＭＯＲＩＹＡＭＡ，Ｓ．ＳＨＩＭＡＤＡ，Ｍ．ＴＯＨＹＡＭＡ，Ｃｌｏｎｉｎｇｏｆａｌｙｍｐｈａｔｉｃｐｅｐｔｉｄｅ／ｈｉｓｔｉｄｉｎｅｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３５６，５３-６０（２００１）。
Ｆ．Ｓｏｎｇ，Ｙ．Ｙｉ，Ｃ．Ｌｉ，Ｙ．Ｈｕ，Ｊ．Ｗａｎｇ，Ｄ．Ｅ．Ｓｍｉｔｈ，Ｈ．Ｊｉａｎｇ，Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎａｎｄｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｒｏｌｅｏｆｔｈｅｐｅｐｔｉｄｅ／ｈｉｓｔｉｄｉｎｅｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒＳＬＣ１５Ａ３ｉｎＴｏｌｌ-ｌｉｋｅｒｅｃｅｐｔｏｒ-ｍｅｄｉａｔｅｄｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｒｅｓｐｏｎｓｅｓｉｎｍａｃｒｏｐｈａｇｅ．ＣｅｌｌＤｅａｔｈＤｉｓ．９，１-１５（２０１８）．
　現在、ＰＦの治療法が５つの選択肢に限られているため、将来の治療のための潜在的な新規選択肢を増やす必要がある。また、治療後の線維性瘢痕による影響を最小限にするためにもその修復方法が求められている。間質性肺炎の病型により、原因が明確な場合は原因物質の除去と抗線維化薬が使用されるが、原因不明の場合は抗線維化薬のみでしかない。特に、ステロイドや抗凝固剤などは国際ガイドラインに基づいて使用しないことが強く推奨されている。
　そこで、本発明者らが、間質性肺炎の病型へのより多くの治療方法について鋭意に研究を重ねた結果、アミノ酸／オリゴペプチドトランスポ-タ-、および／または加水分解酵素が肺間質の疾患に寄与することを明らかにした。体内におけるアミノ酸／オリゴペプチドトランスポ-タ-発現または喪失もしくはその両方、および／または、加水分解酵素の活性または抑制もしくはその両方で、線維症の調節において極めて重要であることを見出し、肺間質の疾患の治療および修復にも適用することを見出した。
　本発明は、患者に一日少なくとも１２時間以上絶食状態にすることを特徴とする肺線維症を治療する方法を提供する。別の態様において、本発明は、アミノ酸／オリゴペプチドトランスポ-タ-の機能を調節する工程を含む、肺線維症の治療方法および当該方法に使用する組成物を提供する。別の態様において、本発明は、加水分解酵素の機能を調節する工程を含む、肺線維症の治療方法および当該方法に使用する組成物を提供する。別の態様において、本発明は、AMPKの機能を調節する工程を含む、肺線維症の治療方法および当該方法に使用する組成物を提供する。
　本発明は一態様において、肺線維症の治療を必要とする対象に対して、アルギニン代謝酵素の機能を増強する化合物を投与する工程を含む、肺線維症を治療する方法を提供する。
　本発明は一態様において、アルギニン代謝酵素の機能を増強する化合物を含有する、肺線維症の治療における使用のための組成物を提供する。
　本発明は一態様において、肺線維症の治療を必要とする対象に対して、アミノ酸トランスポ-タ-の機能を阻害する化合物を投与する工程を含む、肺線維症を治療する方法を提供する。
　本発明は一態様において、アミノ酸トランスポ-タ-の機能を阻害する化合物を含有する、肺線維症の治療における使用のための組成物を提供する。一態様において、アミノ酸トランスポ-タ-の機能を阻害する化合物は、アルギニン代謝酵素の機能を増強する。
　本発明は一態様において、肺線維症の治療を必要とする対象に対して、ＡＭＰＫの機能を増強する化合物を投与する工程を含む、肺線維症を治療する方法を提供する。
　本発明は一態様において、ＡＭＰＫの機能を増強する化合物を含有する、肺線維症の治療における使用のための組成物を提供する。一態様において、ＡＭＰＫの機能をする化合物は、アルギニン代謝酵素の機能を増強する。
　本発明は一態様において、絶食状態によって誘発される代謝物の測定値を測定し、当該測定値を分析するシステムを提供する。
　本発明は一態様において、絶食状態によって誘発される代謝物の測定値を測定し、当該測定値を分析するシステムを提供する。
　本発明は一態様において、絶食状態によって誘発される代謝物を検出し分析するシステムを提供する。
　本発明は一態様において、より具体的に下記を提供する。
[項目１]
　アルギニン代謝酵素の機能を増強する化合物を含有する、肺線維症の治療における使用のための組成物。
[項目２]
　前記アルギニン代謝酵素の機能を増強する化合物がアルギニン代謝酵素の発現を増強する化合物である、項目１に記載の組成物。
[項目３]
　前記アルギニン代謝酵素がアルギナ-ゼＩＩである、項目１に記載の組成物。
[項目４]
　前記アルギナ-ゼＩＩの機能を増強する化合物が、ジペプチドＡｌａ-Ｔｙｒ、Ｌｙｓ-Ｔｙｒ、Ｇｌｎ-Ｔｙｒ、ＭＪＮ１１０およびタプシガルギン（Ｔｈａｐｓｉｇａｒｇｉｎ）から選択されるものである、項目３に記載の組成物。
[項目５]
　前記アルギナ-ゼＩＩの機能を増強する化合物がアミノ酸トランスポ-タ-の機能を阻害する化合物である、項目１に記載の組成物。
[項目６]
　前記アミノ酸トランスポ-タ-の機能を阻害する化合物がアミノ酸トランスポ-タ-の発現を阻害する化合物である、項目５に記載の組成物。
[項目７]
　前記アミノ酸トランスポ-タ-がＳＬＣ１５Ａ３である、項目６に記載の組成物。
[項目８]
　前記ＳＬＣ１５Ａ３の機能を阻害する化合物が、抗ＳＬＣ１５Ａ３抗体またはその抗原結合性フラグメント、ＳＬＣ１５Ａ３遺伝子の発現を阻害する核酸分子、ポリアミン、アルギニン、メチオニン、３-ヒドロキシ-３-メチルブチレ-ト、シトシン、アセト酢酸、３-ヒドロキシ酪酸およびアセトンから選択されるものである、項目７に記載の組成物。
[項目９]
　前記アルギナ-ゼＩＩの機能を増強する化合物がＡＭＰＫの機能を増強する化合物である、項目１に記載の組成物。
[項目１０]
　前記ＡＭＰＫの機能を増強する化合物がＡＭＰＫの発現を増強する化合物である、項目９に記載の組成物。
[項目１１]
　前記ＡＭＰＫの機能を増強する化合物がクラスＩＩＩ　ＰＩ３キナ-ゼ阻害剤、ｗｏｒｔｍａｎｎｉｎおよびＰＩ４Ｋから選択されるものである、項目１０に記載の組成物。
[項目１２]
　医薬組成物、機能性食品、飲食品又は飼料である、項目１～１１のいずれか一項に記載の組成物。
（定義）
　本明細書において、複数の数値の範囲が示された場合、それら複数の範囲の任意の下限値および上限値の組み合わせからなる範囲も同様に意味する。
　本明細書において、「治療」とは最も広い意味において使用される。一態様において、治療は疾患、障害または状態の発生を予防すること、阻害すること、および／または軽減または逆転することを含む。一態様において、肺線維症の治療は、肺組織の修復を意味する。
　本明細書において、「抗体」とは最も広い意味において使用され、意図された抗原結合活性を示すモノクロ-ナル抗体、ポリクロ-ナル抗体、及び抗体断片を含むが、これらに限定されない。全長抗体は主としてポリペプチドで構成される重鎖及び軽鎖を含む。重鎖および軽鎖は、それぞれ抗原を認識する可変領域と呼ばれる部位を含み、当該部位は一般的に、それぞれ重鎖可変領域及び軽鎖可変領域と呼ばれる。当該可変領域は、さらに詳細に抗原を認識する部位として特定される、それぞれＣＤＲ１～３と呼ばれる部位をアミノ末端から順に有する。なお、これらのＣＤＲ１～３は、より詳細に重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、重鎖ＣＤＲ３、軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、軽鎖ＣＤＲ３等とも呼ばれる。また、重鎖及び軽鎖のＣＤＲ１～３以外の領域は、それぞれアミノ末端から順に、重鎖ＦＲ１～４及び軽鎖ＦＲ１～４と呼ばれる。抗体は２つの重鎖および２つの軽鎖からなる形態のほか、１つの重鎖および１つの軽鎖からなる抗体（１本鎖抗体とも呼ばれる）の形態であってもよい。
　抗体は、任意のクラス、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡもしくはＩｇＹ等、あるいはサブクラス、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１もしくはＩｇＡ２等であってよい。
　抗体は同一種に由来するアミノ酸配列を有していても異種に由来するアミノ酸を有していてもよい。同一種由来の場合、例えば、ヒト由来、マウス由来、ラット由来、ハムスタ-由来、ウサギ由来、ヤギ由来、ロバ由来、ブタ由来、ウシ由来、ウマ由来、ニワトリ由来、サル由来、チンパンジ-由来、ラクダ由来、ラマ由来等が挙げられる。
　異種由来の場合も、特に限定はされないが、例えばヒト、マウス、ラット、ハムスタ-、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ロバ、ブタ、ウシ、ウマ、ニワトリ、サル、チンパンジ-、ラクダ、ラマ等の何れか２つ以上に由来する抗体が挙げられる。
　本明細書において、抗体の「抗原結合断片」は、抗原に特異的に結合する能力を保持する、抗体の１つ以上の断片を指す。抗体の抗原に特異的に結合する能力は、その一部からなる断片によっても維持されうることがわかっている。一態様として、抗体の「抗原結合断片」は、軽鎖可変領域（ＶＬ）、重鎖可変領域（ＶＨ）、軽鎖定常領域（ＣＬ）および重鎖定常領域の一部であるＣＨ１ドメインからなるＦａｂ断片、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結した２つのＦａｂ断片を含むＦ（ａｂ’）２断片、ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、抗体の単一のア-ムのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、単一の可変ドメインを含むｄＡｂ断片、および単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）であり得るが、これらに限定されない。
　本発明の抗体は、ＣＤＲグラフト化された抗体であってもよい。一例において、ＣＤＲグラフト化された抗体では、１つの動物種に由来する抗体のＣＤＲ領域の一部または全部の配列が、別の動物種のＣＤＲ配列で置換されている。例えば、１つ以上のマウス抗体のＣＤＲがヒト抗体のＣＤＲ配列で置換されている。
　抗体の重鎖可変領域中の重鎖ＣＤＲ１～３および軽鎖可変領域中の軽鎖ＣＤＲ１～３を同定する際には当業者に周知の方法を用いることができる。例えば、例えば当業者に周知の「Ｋａｂａｔ定義」（Ｋａｂａｔら、Ａｎｎ．ＮＹ　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ．１９７１、Ｖｏｌ．１９０、ｐｐ．３８２-３９１およびＫａｂａｔ、Ｅ．Ａ．らＳｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、１９９１、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ、ｐｐ．９１-３２４２）、「Ｃｈｏｔｈｉａ定義」（Ｃｈｏｔｈｉａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ、１９８９、Ｖｏｌ．３４２、ｐｐ．８７７-８８３）、「接触定義」（ＭａｃＣａｌｌｕｍ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９６、Ｖｏｌ．２６２、ｐｐ．７３２-７４５）などを用いることができる。抗体内のＣＤＲ配列を同定するのに、公共デ-タベ-スの情報に基づいてＣＤＲを同定してもよい。
（絶食状態にする工程を含む肺間質の疾患を治療する方法）
　本発明は、ＰＦの治療のために患者に一日少なくとも１２時間以上の絶食状態を維持することで引き起こされる体内のアミノ酸／オリゴペプチドトランスポ-タ-発現喪失、および／また加水分解酵素の活性化によって肺間質の疾患の治療方法を提供する。
　本発明は、絶食に伴って変化する代謝産物を患者に直接に与えることで、ＰＦの治療のために患者の体内のアミノ酸／オリゴペプチドトランスポ-タ-発現喪失の誘発、および／または加水分解酵素の活性化促進剤を患者に直接に与えることで加水分解酵素の活性化によって肺間質の疾患の治療のみならず修復する主成分を提供する。または当該主成分、その変異、その誘導体、またはその薬学的に許容される塩を含む医薬組成物を提供する。
　本発明は、絶食状態を維持するための絶食をサポ-トするための補助食（空腹感を減弱し、かつ治療効果を増強する補助食品）を提供する。
　本発明は、一定時間の絶食状態が維持されたことによる代謝物、たとえば、末梢血に現れるケトン体の測定数値、血中グルコ-ス測定値、および呼気または血中または尿中に含まれる代謝物の測定値、例えば、窒素、アルギニン代謝産物などを測定し分析するシステムを提供する。
　本発明でいう絶食状態について、患者に一日少なくとも１２時間以上の絶食状態が好ましく、特に１６時間、さらに好ましくは１８時間以上が好ましい。さらに、一日の中、１８時から翌日１２時の間の１６時間を絶食状態維持することが好ましい。
（アルギニン代謝酵素の機能を増強する化合物を含む組成物を投与する工程を含む、肺間質の疾患を治療する方法）
　本発明は一態様において、肺間質の疾患の治療を必要とする患者に対して、加水分解酵素の機能を増強する化合物を含む組成物を投与する工程を含む、肺間質の疾患を治療する方法を提供する。
　本発明において、加水分解酵素の機能を増強する化合物は、生体内で加水分解酵素の機能を亢進または発現させる効果を有する化合物であれば特に限定されない。例えば、加水分解酵素の機能を増強する化合物は、加水分解酵素の酵素活性増強、局在化促進、発現亢進、安定性増加等の作用によって、加水分解酵素の機能を増強することができる。好ましくは、加水分解酵素の機能を増強する化合物は、加水分解酵素の発現を亢進する。
　本発明の加水分解酵素は例えば、主に肺のＭΦｓで発現する一酸化窒素合成酵素、Ａｒｇ１、Ａｒｇ２、Ｇａｔｍなどの酵素である。特にアルギニンをオルニチンと尿素に分解するミトコンドリア酵素であるアルギナ-ゼＩＩが好ましい。
　本発明の加水分解酵素の機能を増強する化合物は特に限定されず、当業者に一般的に知られた方法によってスクリ-ニングにより取得することもできる。例えば、加水分解酵素の機能を増強する化合物として、同酵素の発現量を増加させる化合物を取得する場合、マクロファ-ジなどのアルギナ-ゼＩＩ発現細胞に当該化合物を適用した後、細胞中のアルギナ-ゼＩＩのｍＲＮＡ転写量または細胞内または分泌アルギナ-ゼＩＩタンパク質量などを定法によって定量し、一定時間経過後、例えば、１０分、２０分、３０分、４０分、５０分、６０分、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間、２４時間、またはそれ以上長い時間経過した時点において、陰性対照に対して一定以上の比率、例えば、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％以上ｍＲＮＡ転写量またはタンパク質量を増加させる化合物を、加水分解酵素の機能を増強する化合物として取得することができる。また、例えば、加水分解酵素の機能を増強する化合物として、同酵素の活性を増加させる化合物を取得する場合、マクロファ-ジなどのアルギナ-ゼＩＩ発現細胞に当該化合物を適用した後、上記のような一定時間後におけるアルギナ-ゼＩＩの非活性を測定して、上記のような一定比率以上活性を上昇させる化合物を、加水分解酵素の機能を増強する化合物として取得することができる。
　本発明の加水分解酵素の機能を増強する化合物は、ポリペプチド、核酸、低分子化合物を含む。例えば、これら加水分解酵素が関与する経路によって代謝される半必須アミノ酸を使用することが関与する複数の経路によって代謝される半必須アミノ酸を使用することができる。
　一態様において、加水分解酵素の機能を増強する化合物として、絶食状態によって誘発されるＡｌａ-Ｔｙｒ，Ｌｙｓ-Ｔｙｒ，Ｇｌｎ-Ｔｙｒ等を含むジペプチド、を用いることができる。加水分解酵素がアルギナ-ゼＩＩである場合、脂肪酸代謝阻害剤、例えばＭＪＮ１１０、または小胞体ストレス誘導化合物、例えばＴｈａｐｓｉｇａｒｇｉｎを用いることができる。
　一態様において、加水分解酵素の機能を増強する化合物として、以下に述べるアミノ酸／オリゴペプチドトランスポ-タ-の機能を阻害する化合物、またはＡＭＰＫの機能を増強する化合物を用いることができる。一態様において、加水分解酵素の機能を増強する化合物として、クラスＩＩＩ　ＰＩ３キナ-ゼの阻害剤、ｗｏｒｔｍａｎｎｉｎまたは、ＰＩ４Ｋ等を制御する低分子化合物、および解糖系と酸化的リン酸化反応を亢進し、細胞の代謝恒常性をかく乱する低分子化合物等を用いることができる。
　一態様において、上記化合物の変異体、誘導体、またはその薬学的に許容される塩を使用することができる。
　本発明の方法が対象とする動物は特に限定されない。例えば、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ハムスタ-、イヌ、ネコ、イタチ、ウシ、ブタ等の哺乳類、ニワトリなどの鳥類等を対象とすることができる。
（アミノ酸／オリゴペプチドトランスポ-タ-の機能を阻害する化合物を含む組成物を投与する工程を含む、肺間質の疾患を治療する方法）
　本発明は一態様において、肺間質の疾患の治療を必要とする患者に対して、アミノ酸／オリゴペプチドトランスポ-タ-の機能を阻害する化合物を含む組成物を投与する工程を含む、肺間質の疾患を治療する方法を提供する。一態様において、アミノ酸／オリゴペプチドトランスポ-タ-の機能を阻害する化合物は、アルギニン代謝酵素の機能を増強する。　本発明において、アミノ酸／オリゴペプチドトランスポ-タ-の機能を阻害する化合物は、生体内でアミノ酸／オリゴペプチドトランスポ-タ-の機能を減少または喪失させる効果を有する化合物であれば特に限定されない。例えば、アミノ酸／オリゴペプチドトランスポ-タ-の機能を阻害する化合物は、アミノ酸／オリゴペプチドトランスポ-タ-の活性阻害、局在化阻害、発現阻害、安定性阻害等の作用によって、アミノ酸／オリゴペプチドトランスポ-タ-の機能を阻害することができる。好ましくは、アミノ酸／オリゴペプチドトランスポ-タ-の機能を阻害する化合物は、アミノ酸／オリゴペプチドトランスポ-タ-の発現を阻害する。
　また、アミノ酸／オリゴペプチドトランスポ-タ-の機能を阻害する化合物は、当業者に一般的に知られた方法によって、スクリ-ニングして取得することができる。これらの化合物は、抗体またはその抗原結合性断片、ポリペプチド、核酸、例えばｓｉＲＮＡ若しくはｓｈＲＮＡ、またはこれらをコ-ドする核酸、低分子化合物を含む。
　一態様において、患者の体内のアミノ酸／オリゴペプチドトランスポ-タ-発現を喪失させる低分子化合物として、ポリアミン、アルギニンやメチオニン等のアミノ酸代謝産物などを例として挙げられる。特にプトレシンを含むポリアミン類、例えばケトン体、３-ヒドロキシ-３-メチルブチレ-ト、シトシン、アセト酢酸、３-ヒドロキシ酪酸、アセトンなどが好ましい。本発明での上記代謝産物には、例えば、ＧＡＢＡ、パントテン酸、オフタルミン酸が確認されており、本発明の代謝産物として好ましい。ここでいう、ポリアミンは特にここで除外しない限り、体内にあるすべてのポリアミンを含み、本発明の例として、たとえば、ケトン体、３-ヒドロキシ-３-メチルブチレ-ト、シトシン、アセト酢酸、３-ヒドロキシ酪酸、アセトンなどを含むプトレシンを含むポリアミン類が好ましい。その中特に、ケトン体が好ましい。
　一態様において、アミノ酸／オリゴペプチドトランスポ-タ-の機能を阻害する化合物として、絶食状態によって誘発されるＡｌａ-Ｔｙｒ，Ｌｙｓ-Ｔｙｒ，Ｇｌｎ-Ｔｙｒ等を含むジペプチドを用いることができる。
　一態様において、アミノ酸／オリゴペプチドトランスポ-タ-の機能を阻害する化合物として、クラスＩＩＩ　ＰＩ３キナ-ゼの阻害剤、ｗｏｒｔｍａｎｎｉｎまたは、ＰＩ４Ｋ等を制御する低分子化合物、および解糖系と酸化的リン酸化反応を亢進し、細胞の代謝恒常性をかく乱する低分子化合物等を用いることができる。
　一態様において、上記化合物の変異体、誘導体、またはその薬学的に許容される塩を使用することができる。
　本発明でいうアミノ酸／オリゴペプチドトランスポ-タ-は、リソソ-ムを含む細胞内のオルガネラに局在するアミノ酸トランスポ-タ-であることが好ましい。例えば、溶質キャリアファミリ-１５のメンバ-３を始め、ＳＬＣ１５Ａ４、ＳＬＣ３８Ａ９、ＳＬＣ３８Ａ２、ＳＬＣ７Ａ５（ＬＡＴ１）、ＳＬＣ３Ａ２、ＳＬＣ３６Ａ１（ＰＡＴ１）、ＳＬＣ３６Ａ２（ＰＡＴ２）、ＳＬＣ３６Ａ４などが好ましい。本発明では、特に溶質キャリアファミリ-１５のメンバ-３であることが好ましい。
　本発明の方法が対象とする動物は特に限定されない。例えば、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ハムスタ-、イヌ、ネコ、イタチ、ウシ、ブタ等の哺乳類、ニワトリなどの鳥類等を対象とすることができる。
（ＡＭＰＫの機能を増強する化合物を含む組成物を投与する工程を含む、肺間質の疾患を治療する方法）
　本発明は一態様において、肺間質の疾患の治療を必要とする患者に対して、ＡＭＰＫの機能を増強する化合物を含む組成物を投与する工程を含む、肺間質の疾患を治療する方法を提供する。一態様において、ＡＭＰＫの機能を増強する化合物は、アルギニン代謝酵素の機能を増強する。
　一態様において、ＡＭＰＫの機能を阻害する化合物として、クラスＩＩＩ　ＰＩ３キナ-ゼの阻害剤、ｗｏｒｔｍａｎｎｉｎまたは、ＰＩ４Ｋ等を制御する低分子化合物、および解糖系と酸化的リン酸化反応を亢進し、細胞の代謝恒常性をかく乱する低分子化合物等を用いることができる。
　本発明の方法が対象とする動物は特に限定されない。例えば、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ハムスタ-、イヌ、ネコ、イタチ、ウシ、ブタ等の哺乳類、ニワトリなどの鳥類等を対象とすることができる。
（組成物）
　本発明は、上記（絶食状態にする工程を含む肺間質の疾患を治療する方法）、（アルギニン代謝酵素の機能を増強する化合物を含む組成物を投与する工程を含む、肺間質の疾患を治療する方法）、（アミノ酸／オリゴペプチドトランスポ-タ-の機能を阻害する化合物を含む組成物を投与する工程を含む、肺間質の疾患を治療する方法）および／または（ＡＭＰＫの機能を増強する化合物を含む組成物を投与する工程を含む、肺間質の疾患を治療する方法）において用いられる組成物を提供する。
　本発明の組成物は、好ましくは医薬組成物、機能性食品、飲食品又は飼料として提供されるが、これらに限定されない。
　本発明の（絶食状態にする工程を含む肺間質の疾患を治療する方法）に使用される場合、本発明の組成物は、絶食状態を維持するための絶食をサポ-トするための補助食および／または栄養食として提供することができる。絶食状態を維持するための絶食をサポ-トするための補助食および／または栄養食は、当該補助食が治療効果をもたらすことが期待される代謝産物の産生を阻害せず、空腹感を減弱する、あるいは当該代謝産物の産生を増強する制限食であり、肺線維症等の治療段階のみならず、退院し自宅で回復段階にある患者にも提供することができる。
　本発明の（アルギニン代謝酵素の機能を増強する化合物を含む組成物を投与する工程を含む、肺間質の疾患を治療する方法）、（アミノ酸／オリゴペプチドトランスポ-タ-の機能を阻害する化合物を含む組成物を投与する工程を含む、肺間質の疾患を治療する方法）および／または（ＡＭＰＫの機能を増強する化合物を含む組成物を投与する工程を含む、肺間質の疾患を治療する方法）に使用される場合、本発明の組成物は、肺間質の疾患を治療中である対象の他、回復段階にある患者に医薬組成物、機能性食品、飲食品又は飼料として提供することができる。
　本発明の組成物を医薬組成物として用いる場合、有効成分となる化合物と共に、薬学的に許容可能な担体或いは添加物を配合しても良い。薬学的に許容可能な担体或いは添加物とは、任意の担体、希釈剤、賦形剤、懸濁剤、潤滑剤、アジュバント、媒体、送達システム、乳化剤、錠剤分解物質、吸収剤、保存剤、界面活性剤、着色剤、香料、または甘味料を意味し、公知のものを採用すればよい。
　本発明の医薬組成物の投与量並びに投与方法は、投与対象となる個体が罹患する腸内疾患の種類、性別、種、年齢、全身状態、疾患の重篤度、所望する効果の程度等に応じて適宜設定すればよい。例えば、有効成分として０．００１～１００ｍｇ／体重ｋｇ／日の範囲で投与することができる。
　本発明の医薬組成物の投与方法は特に限定はされず、有効成分の化合物の特性、投与対象などに応じて適宜選択することができる。例えば経口投与、経気道的投与、経鼻投与、経粘膜投与、経腸投与、静脈投与、皮下注射、経皮投与等を選択することができる。好ましくは経口投与を用いる。
　本発明に係る医薬組成物の投与間隔は特に限定はされず、有効成分の化合物の特性、投与対象などに応じて適宜選択することができる。例えば、１日に１度に投与してもよく、数回に分けて投与してもよい。また、治療効果を有する範囲において、毎日、隔日、毎週、隔週、２～３週毎、毎月、隔月または２～３ヶ月毎の間隔で投与してもよい。
　本発明の組成物が機能性食品または飲食品である場合、これらは、一般の食品、特定保健用食品を含む特定保健用食品、栄養補助食品、機能性食品、病者用食品等であってよい。
　本発明の機能性食品または飲食品の具体的な形態は特に限定はされないが、例えば、清涼飲料、炭酸飲料、栄養飲料、果実飲料、乳酸飲料、乳飲料等の飲料；アイスクリ-ム、アイスシャ-ベット、かき氷等の冷菓；飴、キャンディ-、ガム、チョコレ-ト、錠菓、スナック菓子、ビスケット、ゼリ-、ジャム、クリ-ム、焼き菓子等の菓子類；そば、うどん、はるさめ、中華麺、即席麺等の麺類；かまぼこ、ハム、ソ-セ-ジ等の水産・畜産加工食品；加工乳、発酵乳等の乳製品；サラダ油、てんぷら油、マ-ガリン、マヨネ-ズ、ショ-トニング、ホイップクリ-ム、ドレッシング等の油脂及び油脂加工食品；ソ-ス、たれ等の調味料；ス-プ、シチュ-、サラダ、惣菜、ふりかけ、漬物、パン、シリアル等を例示できる。また、特定保健用食品、栄養補助食品、機能性食品等の場合であれば、粉末、顆粒、カプセル、トロ-チ、タブレット、シロップ等の形態が挙げられる。
　本発明の組成物が飼料である場合、その具体的な形態は特に限定はされないが、例えば上述した本発明に係る飼料組成物が発揮する効果が損なわれない限りにおいて、通常の飼料に混合、又は必要に応じて通常の飼料に配合可能な成分と共に混合して飼料組成物とすればよく、飼料組成物そのものを飼料としてもよい。
（肺間質の疾患）
　本発明の肺間質の疾患は、例えば肺線維症、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、慢性過敏性肺炎（ＣＨＰ）、膠原病関連間質性肺炎（ＣＶＤ-ＩＰ）、特発性非特異性間質性肺炎（ＮＳＩＰ）、皮膚筋炎合併間質性肺炎、剥離性間質性肺炎、リンパ球性間質性肺炎、びまん性肺胞障害、または肉芽腫性間質性肺炎である。特に本発明は肺線維症の治療に適用するのが好ましい。
　肺線維症は、様々な原因により肺に炎症が起こり、その結果肺胞壁、肺小葉、胸膜等に進行性の瘢痕化およびコラ-ゲン等のマトリクスの沈着をきたすことにより、肺機能喪失をもたらす疾患の総称であり、間質性肺炎として総称される。間質性肺炎は、原因が不明とされる特発性間質性肺線維症、自己免疫疾患が原因となる自己免疫性の間質性肺疾患、職業環境性因子が原因となるじん肺等の間質性肺疾患、放射線や薬剤が原因となる医元性の間質性肺疾患、呼吸器感染症の後遺症としての間質性肺炎を含む疾患である。
　本発明の疾患対象は、特発性間質性肺炎、珪肺、ＣＯＶＩＤ-１９後遺症の間質性肺炎を含む肺線維症のほか、虚血性心疾患による心臓の線維化、腎線維化など、線維化を伴う臓器機能喪失をもたらす疾患である。さらに脳卒中の後遺症、造血幹細胞移植の合併症である慢性移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）がもたらす線維化病変、肝線維化、慢性炎症性疾患でマクロファ-ジが病態に関わる疾患を含む。
（絶食状態によって誘発される代謝物の測定値を測定し分析するシステム）
　本発明は一態様として、絶食状態によって誘発される代謝物の測定値を測定し分析するシステムを提供する。
　本発明が提供する、絶食状態によって誘発される代謝物の測定値を測定し分析するシステムについて、当該測定・分析のデ-タを患者自分のスマホで集約し、担当医師のいる病院のサ-バ-に送信し、担当医師とともに患者の治療後の回復状況を確認することができる。それによって、絶食のモチベ-ションを維持、または治療効果の間接的指標とする。
（絶食状態によって誘発される代謝物を検出し分析するシステム）
　本発明は一態様として、絶食状態によって誘発される代謝物を検出し分析するシステムを提供する。
　絶食状態によって誘発される代謝物を検出し分析するシステムは、代謝物検出部と分析部から構成される。代謝物検出部は、患者が担当医師の指導の下で食事制限を行った結果により絶食状態に到達したことで誘発される代謝物、例えば、末梢血に現れるケトン体や血中グルコ-スを検出して重量パ-セント等の物理量（数値）を測定する装置が用いられる。分析部は、代謝物検出部によって測定された代謝物に係る数値デ-タを入力し、例えば、入力された数値デ-タの時系列変化の状況をグラフィック表示することが可能なコンピュ-タ-装置が用いられる。代謝物検出部と分析部は、例えば、Ｗｉ-Ｆｉのような無線通信回線や、光ファイバ-のような固定通信回線によって相互通信可能に接続されている。
　より具体的には、代謝物検出部は患者の指先等から採取した末梢血に含まれるケトン体やグルコ-スの物理量を測定する装置であって、患者が携帯可能な大きさの装置であることが望ましい。代謝物検出部に対応する携帯可能な大きさの測定装置を用いて患者が自ら代謝物を測定する場合は、入院によらずに患者の自宅で医療目的の絶食を継続することも可能になる。患者のような操作者が当該装置を起動して代謝物を測定すると、測定結果が通信回線を経由して分析部に送信される。なお、代謝物検出部自体が分析部に直接測定デ-タを送信する必要はなく、例えばＢｌｕｅｔｏｏｔｈのような近距離通信網経由で操作者が所持するスマ-トフォンのような携帯端末に測定デ-タを一旦送信し、携帯端末が受け取った測定デ-タを分析部に送信するようにしてもよい。
　分析部は、代謝物検出部から直接又は間接的に送信された代謝物の測定デ-タを入力デ-タとして受信する。分析部に入力された代謝物の測定デ-タは、患者が食事制限を開始したことで即時的に絶食状態に到達する訳ではないこと、代謝物の測定デ-タの定常値には個人差がある等の事情を鑑み、測定デ-タを時系列に分析部が備える表示部でグラフィック表示して、担当医師の判断を仰ぐようにすることが望ましい。また、分析部は代謝物検出部から送信された代謝物の測定デ-タを記憶保持するためのデ-タ蓄積装置を備えていてもよく、そのようなデ-タ蓄積装置に記憶された大量の代謝物の測定デ-タを学習デ-タとして人工知能装置に入力することで、担当医師の判断によらずに任意の患者の測定デ-タから当該患者が絶食状態にあるかどうかを自動判定するようにしてもよい。
　患者自身が所持する携帯端末が代謝物の測定デ-タを分析部へ送信することができる場合、当該患者に係る測定デ-タを分析部で閲覧している担当医師は、患者の状態が肺線維症の治療に望ましい状態の絶食状態にあるかどうか等のコメントを患者の携帯端末へ直接送信するようにしてもよい。例えば、医療目的の絶食を継続することで肺線維症が改善している旨のコメントを担当医師から受け取ることは、患者にとって絶食を継続するモチベ-ションの向上に寄与する。また、担当医師は、分析部として機能するパ-ソナルコンピュ-タ-やタブレット端末から、患者が所持する携帯端末へ絶食の開始を指示するメッセ-ジを送るようにしてもよいし、患者が代謝物検出部として機能する測定装置を起動して測定デ-タを送信するように指示するメッセ-ジを送信してもよい。代謝物測定装置が出力する測定デ-タを送信する装置として携帯端末を利用する場合、測定デ-タを携帯端末に転送するための携帯端末操作、測定デ-タを分析部に送信するための携帯端末操作等に係るユ-ザ-インタ-フェ-スは、所謂アプリケ-ションプログラムとして実現してもよい。
　以下、溶質キャリアファミリ-１５のメンバ-３の喪失、および、アルギナ-ゼＩＩの活性化を例に本発明をさらに詳細に説明する。これらは例示に過ぎず本開示を限定するものではない。
　肺線維症（ＰＦ）は、進行性の瘢痕化とマトリックス沈着を特徴とする肺疾患であり、一般的に予後は不良である（参考文献１、２）。ＰＦの病因はよく理解されていませんが、多くの患者は、感染または危険物（アスベストやシリカなど）への曝露によって引き起こされる炎症反応を示す（参考文献１、３、４）。ＰＦの治療選択肢は限られているため（参考文献１～３）、将来の治療のための潜在的な新規標的を特定することが非常に重要である。溶質キャリアファミリ-１５メンバ-３（ＳＬＣ１５Ａ３）は、アミノ酸／オリゴペプチドトランスポ-タ-（参考文献５、６）であり、主にヒトとマウスの両方の自然免疫細胞（マクロファ-ジ［ＭΦｓ］や好中球など）で発現する（図１ａ、ｂ）。さらに、ヒトとマウスの両方の肺組織、およびＰＦ患者の肺でＳＬＣ１５Ａ３の強い発現が見られ、ＭΦｓ、特に肺胞ＭΦｓ（ＡＭΦｓ）で強い発現が見られた（図１ａ-ｃ）。特発性肺線維症（ＩＰＦ）患者の肺におけるＳＬＣ１５Ａ３タンパク質の発現も確認された（図１ｄ）ＳＬＣ１５Ａ３の機能はほとんど知られていないが、その相同体であるＳＬＣ１５Ａ４は、線維症（参考文献２、１１）。ＳＬＣ１５Ａ４は、線維症（参考文献２、１１）に関連することが多いエンドリソソ-ム依存性の炎症および代謝シグナル（参考文献８、１０）を媒介することにより、大腸炎（参考文献７）および狼瘡（参考文献８、９）の症状を促進する。発明者らは、ＳＬＣ１５Ａ３が肺の炎症（線維症など）に寄与すると仮定し、マウスモデルを使用してＰＦの病因におけるＳＬＣ１５Ａ３の役割を調査した。
　（材料および方法）
　マウス：
　本発明でのすべての動物実験は、国立国際医療研究センタ-の動物管理使用委員会（承認番号２００５０）によって承認され、動物の保護に関する制度的手順、国内ガイドライン、および関連する国内法に従って実施された。
　ＷＴ（Ｃ５７ＢＬ／６系統）マウスは、ＪａｐａｎＣＬＥＡから購入した。Ｓｌｃ１５ａ３-／-マウスは、ｆｉｇＳ２で説明されているように、ＣＲＩＳＰＲ-Ｃａｓ９技術によって生成された。Ｓｌｃ１５ａ３のエクソン１の最初のＡＴＧ周辺の配列を標的とするＣａｓ９とｓｇＲＮＡをＷＴ胚に同時注入した。ｓｇＲＮＡ配列を設計するために、ＣＲＩＳＰＲダイレクト（ｈｔｔｐｓ：／／ｃｒｉｓｐｒ．ｄｂｃｌｓ．ｊｐ／）が使用された。タ-ゲットシ-ケンスは、５’-ＣＡＧＧＡＴＧＴＣＴＧＣＣＣＣＴＣＧＣＧＣＧＧ-３’である。
　Ｂ６．ＳＪＬマウスはＴａｃｏｎｉｃから購入し、飼育した。ＤＦ実験を除いて、すべてのマウスは特定病原体除去環境で飼育され、餌と水を自由に与えられた。ケ-ジは毎週交換された。動物室は２２±１°Ｃ、湿度３０％～７０％に維持され、毎日の露光は午前８時に始まり、午後８時に終わった。
　抗体と試薬：
　この発明では、次の抗体を使用した。α-ＣＤ１４６（ＭＥ-９Ｆ１）、α-ＥｐＣＡＭ（Ｇ８．８）、α-ＰＤＧＦＲａ（ＡＰＡ５）、α-ＣＤ３１（３９０）、α-ΤＥＲ-１１９（ＴＥＲ１１９）、α-ＣＤ４５（３０Ｆ１１）、α-ＣＤ４５．１（Ａ２０）、α-２０ＣＤ４５．２（１０４）、α-ＣＤ１１ｂ（Ｍ１／７０）、α-ＣＤ１１ｃ（Ｎ４１８）、α-Ｌｙ６Ｇ（１Ａ８）、α-Ｌｙ６Ｃ（ＨＫ１．４）、α-ＳｉｇｌｅｃＦ（Ｓ１７００７Ｌ）、αＩ-Ａｂ（ＡＦ６-１２０．１）、α-ＣＤ４４（１Ｍ７）、α-ＣＤ６２Ｌ（ＭＥＬ-１４）、α-ＣＤ４（ＧＫ１．５）、およびα-ＴＣＲｂ（Ｈ５７-５９７）をバイオレジェンド（ＵＳＡ）から購入した。
　イムノブロッティング用のαＳＭＡ（ａｂ５６９４）はＡｂｃａｍ（ＵＫ）から購入した。α-ｐｈｏｓｐｈｏ-ＳＴＡＴ３Ｙ７０５（Ｄ３Ａ７）、α-ＳＴＡＴ３（１２４Ｈ６）、α-ｐｈｏｓｐｈｏ-ＳＭＡＤ２Ｓｅｒ４６５／４６７／Ｓｍａｄ３Ｓｅｒ４２３／４２５（Ｄ２７Ｆ４）、α-ＳＭＡＤ３（Ｃ６７Ｈ９）、およびＧＡＰＤＨ（Ｄ１６Ｈ１１）は、ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＵＳＡ）から購入した。ＩＬ-１１（Ａ-９）、Ｐｒｏ-ＣＯＬ１Ａ２（Ｄ-６）、およびＦＡＰａ（Ｆ１１-２４）は、ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＵＳＡ）から購入した。
　ＴＧＦβＲＩＩ（ＦＡＢ５３２Ｐ）はＲ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ（ＵＳＡ）から購入した。フロ-サイトメトリ-用のαＳＭＡ（１Ａ４）、α-Ｌｙｖｅ１（ＡＬＹ７）、α-ＣＤ１９（ｅＢｉｏ１Ｄ３）、およびα-ＣＤ６４（Ｘ５４-５／７．１）は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（ＵＳＡ）から購入した。
　マウス組換えサイトカイン（ＩＬ-１ｂ、ＩＬ-４、ＩＬ-６、ＩＬ-１０、ＴＮＦα、ＩＬ-１７、および白血病抑制因子）は、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ（ＵＳＡ）から入手した。使用した試薬は、リポ多糖（Ｓｉｇｍａ-Ａｌｄｒｉｃｈ、米国）、ＯＤＮ１６６８-ＣｐＧＢおよびＤＭＸＡＡ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、米国）、ヒドロキシクロロキン（東京化成工業、日本）、ＡＢＨおよびＢＥＣ（ＣａｙｍａｎＣｈｅｍｉｃａｌ、米国）、ＢＬＭ硫酸塩（日本化薬、日本）およびシリカＭＩＮ-Ｕ-ＳＩＬ５（質量-中央径［ｄ５０］Ｚ：１．４μｍ；米国シリカ、米国）であった。
　ヒトおよびマウスにおけるＳＬＣ１５Ａ３、ＡＲＧＩＩ、およびＡＲＧＩ発現の分析：
　組織または細胞におけるヒトＳＬＣ１５Ａ３またはマウスＳｌｃ１５ａ３のいずれかの発現レベルは、公的に利用可能なデ-タベ-スを組み立てて再計算することによって分析された。ＲＮＡ-ｓｅｑデ-タを使用して決定されたＳＬＣ１５Ａ３発現の偏りを回避するために、生デ-タは３つ以上のデ-タセットから取得された。
　各デ-タセットの１００万マップリ-ド（ＲＰＫＭ）あたりのトランスクリプトのキロベ-スあたりのリ-ドは、中央値に正規化され、単一のセットにプ-ルされた。デ-タセット間で共通の組織または細胞からのＲＰＫＭ値が表示される。
　組織におけるヒトＳＬＣ１５Ａ３の発現に関するデ-タは、次の３つのデ-タセットからダウンロ-ドされた。ＨＰＡＲＮＡ-ｓｅｑ正常組織（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｔｅｉｎａｔｌａｓ．ｏｒｇ／）と、イルミナｂｏｄｙＭａｐ２トランスクリプト-ム（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ａｒｒａｙｅｘｐｒｅｓｓ／ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ／Ｅ-ＭＴＡＢ-５１３／）と、２０のヒト組織からのト-タルＲＮＡのＲＮＡシ-ケンシング（ｈｔｔｐｓ：／／ｄｂ．ｃｎｇｂ．ｏｒｇ／ｓｅａｒｃｈ／ｐｒｏｊｅｃｔ／ＰＲＪＮＡ２８０６００／）とである。
　細胞内のヒトＳＬＣ１５Ａ３に関するデ-タは、ｇｃｒｍａ（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｇｐｓ．ｏｒｇ／ｄａｔａｓｅｔ／ＢＤＳ＿０００１１／ｎｃｉ６０-ｏｎ-ｕ１３３ａ-ｇｃｒｍａ／）のＵ１３３ＡのＮＣＩ６０および一次電池アトラス（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｇｐｓ．ｏｒｇ／ｄａｔａｓｅｔ／ＢＤＳ＿０００１３／ｐｒｉｍａｒｙ-ｃｅｌｌ-ａｔｌａｓ／）からダウンロ-ドされた。
　組織と細胞の両方におけるマウスＳｌｃ１５ａ３の発現パタ-ンに関するデ-タは、ＧｅｎｅＡｔｌａｓＧＮＦ１Ｍ、ｇｃｒｍａ（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｇｐｓ．ｏｒｇ／ｄａｔａｓｅｔ／ＢＤＳ＿００００９／ｇｅｎｅａｔｌａｓ-ｇｎｆ１ｍ-ｇｃｒｍａ／）およびＧｅｎｅＡｔｌａｓＭＯＥ４３０、ｇｃｒｍａ（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｇｐｓ．ｏｒｇ／ｄａｔａｓｅｔ／ＧＳＥ１０２４６／ｇｅｎｅａｔｌａｓ-ｍｏｅ４３０-ｇｃｒｍａ／）からダウンロ-ドされた。
　特発性肺線維症（ＩＰＦ）および正常なヒト肺の細胞におけるＳＬＣ１５Ａ３、ＡＲＧＩＩ、およびＡＲＧＩの発現パタ-ンに関しては、ＩＰＦ　Ｃｅｌｌ　Ａｔｌａｓ（３９）のｓｃＲＮＡ-ｓｅｑデ-タセットを使用した（ＧＥＯアクセッション番号：ＧＳＥ１３６８３１）。
　ＢＬＭ、シリカ、またはアルギナ-ゼ阻害剤のマウス肺への投与：
　８～１０週齢のマウスに、ＢＬＭ硫酸塩（２ｍｇ／ｋｇを５０μＬの滅菌生理食塩水に溶解）または結晶性シリカ粒子（４００ｍｇ／ｋｇを５０μＬの滅菌生理食塩水に懸濁）を腹腔内投与した。それは、メデトミジン（０．７５ｍｇ／ｋｇ）、ミダゾラム（４ｍｇ／ｋｇ）およびブトルファノ-ルの混合物（明治製菓、日本）からなるＭ／Ｍ／Ｂ麻酔薬の腹腔内投与によって達成された深麻酔下での吸引によるものであった。
　シリカ懸濁液は次のように調製した。シリカ粒子を１ＭＨＣｌ（ＮａｃａｌａｉＴｅｓｑｕｅ、Ｊａｐａｎ）に３％（ｗ／ｖ）で懸濁し、１０５°Ｃで１時間煮沸し、ｄＨ２Ｏで洗浄し、１１０℃で一晩乾燥させた。粒子を秤量し、２００℃で２時間熱滅菌し、滅菌生理食塩水に再懸濁した。投与前に、シリカ懸濁液をＢｉｏｒｕｐｔｏｒＩ超音波超音波処理装置（ＢＭ　Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ、日本）で３０分間超音波処理した。
　アルギナ-ゼ阻害剤治療は：シリカ処理後１５日目から開始し、週に２回、３週間継続して、マウスを上記のＭ／Ｍ／Ｂ混合物で麻酔し、５０μＬのＰＢＳ、ＢＥＣ０．３ｍＭ、またはＡＢＨ　０．２５ｍＭの鼻腔内投与に供した。
　ＢＭ転送：
　６～８週齢のマウスに照射（８．５Ｇｙ）を行った後、示されたマウスに由来する２×１０６個のＢＭ細胞で５個体を再構成した。ＢＭ細胞移植の８週間後、マウスに上記のようにＢＬＭを投与した。
　ＤＦ治療：
　ＤＦ実験：シリカ投与の１５日目から、マウスをＡＬまたはＤＦの２つの給餌レジメンに分けた。ＡＬマウスは自由摂食であった。ＤＦマウスは１日１回１２：００ｐｍ±１時間で３時間給餌された。３時間の給餌後、ＤＦマウスを餌のない新しい清潔なケ-ジに移した。摂食前後の摂餌量と体重を毎日測定した。ＡＬマウスはホッパ-で餌を受け取り、ＤＦマウスはケ-ジの床で餌を受け取った。
　ＢＭＭΦ培養：
　ＢＭＭΦｓ：マウスマクロファ-ジコロニ-刺激因子（Ｍ-ＣＳＦ；５０ｎｇ／ｍＬ、Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ）の存在下でＢＭ単核細胞から分化した。ＢＭ細胞は、脛骨と大腿骨を分離し、ＲＰＭＩ-１６４０培地（Ｓｉｇｍａ-Ａｌｄｒｉｃｈ）で洗い流すことにより、８～１０週齢のマウスから得られた。
　赤血球が溶解した後、単核細胞に、完全ＲＰＭＩ-１６４０培地［１０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）（Ｂｉｏｗｅｓｔ、Ｆｒａｎｃｅ）、１０ｍＭ４　-（２-ヒドロキシエチル）-１-ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ；ナカライテスク）、２ｍＭＬ-グルタミン（ナカライテスク）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（ナカライテスク）、５０μＭ２-メルカプトエタノ-ル（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）、１％（ｖ／ｖ）非必須アミノ酸Ｔｈｅｒｍｏフィッシャ-サイエンティフィック、１００Ｕ／ｍＬペニシリン（ナカライテスク）、および１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（ナカライテスク）］、５０ｎｇ／ｍＬマウスＭ-ＣＳＦを添加し播種した。
　培地は３日目と６日目に交換した。ｉｎｖｉｔｒｏまたは気管内移動実験では、７日目にＡｃｃｕｔａｓｅ（ＮａｃａｌａｉＴｅｓｑｕｅ）と３７℃で１０分間インキュベ-トすることによりＢＭＭΦｓを回収した。
　ＢＭＭΦ気管内移植：
　ＢＭＭΦｓは、シリカ投与後１５日目に口腔咽頭吸引によりマウスの肺に直接投与された。上記のようにマウスをＭ／Ｍ／Ｂ麻酔薬で深く麻酔し、上顎切歯に輪ゴムを配置して平らな板に拘束した。
　各マウスは、腹側表面と吻側を上に向けて、半横臥（４５度）の位置に配置された。舌は、一対の単純な鉗子によって吻側に穏やかにそして部分的に引っ込められた。喉頭鏡ブレ-ド（モデルＬＳ-１、ペンセンチュリ-、米国）を使用して、気管と喉頭蓋の最適な視覚化を実現した。
　続いて、Ｐ１００マイクロピペットを使用して４００万個のＢＭＭΦｓを含む５０ｍＬのＰＢＳを口腔の後ろに配置した。ＰＢＳと細胞は、直接視覚化された後の呼吸努力によって肺に吸入された。麻酔からの回復中にマウスを観察して、投与された体液および細胞の継続的な保持を確実にした。その後、日常の手入れと取り扱いのためにケ-ジに戻された。
　肺および他の臓器に移植されたＢＭＭΦｓの生存および局在を評価するために、ＷＴまたはＳｌｃ１５ａ３-／-ＢＭＭΦｓを気管内にＢ６．ＳＪＬマウス（ＣＤ４５．１＋）に移した。移植後３０日で、肺を採取し、フロ-サイトメトリ-分析のためにこの記事に記載されているように肺の単細胞懸濁液を調製した。
　細胞株の培養と分化：
　ＨＬ-６０およびＵ９３７細胞は、ＡＴＣＣ（ＵＳＡ）から購入した（それぞれＣＣＬ-２４０およびＣＲＬ-１５９３．２）。細胞は、３７℃で５％ＣＯ２を含む加湿空気中の完全ＲＰＭＩ-１６４０培地で培養された。細胞は２～３日間隔で継代された。５つのＵ９３７細胞をＭΦｓに分化させるために、完全ＲＰＭＩ　１６４０培地で５×１０５細胞／ウェルの密度で６ウェルプレ-トに播種したＵ９３７細胞を、１００ｎＭホルボ-ル１２-ミリステ-ト１３-アセテ-ト（Ｓｉｇｍａ-Ａｌｄｒｉｃｈ）で２４時間刺激した。
　次に、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄して、非接着細胞と残留ホルボ-ル１２-ミリステ-ト１３-アセテ-トを除去した。接着細胞は、遺伝子発現アッセイのために採取する前に、新鮮な培地でさらに２４時間培養した。
　血漿生化学的パラメ-タの測定：
　血漿サンプルは使用するまで-８０℃で保存した。血漿中の生化学的パラメ-タ-（総コレステロ-ル、グルコ-ス、尿素窒素、アスパラギン酸アミノトランスフェラ-ゼ、アラニンアミノトランスフェラ-ゼ、およびクレアチニン）は、Ｓｐｏｔｃｈｅｍ　Ｄ-Ｃｏｎｃｅｐｔ　Ｄ-０２システム（Ａｒｋｒａｙ　ＪＡＰＡＮ）を備えたＳｐｏｔｃｈｅｍ　ＤＴｏｔａｌ-Ａ２ストリップによって測定された。
　マイクロＣＴ分析と呼吸機能の評価：
　２％イソフルランによる麻酔導入と維持に続いて、マウスの肺を、マウスを仰臥位にして、ｉｎ　ｖｉｖｏマイクロＣＴシステム（ＣｏｓｍｏＳｃａｎ　Ｆｘ；　Ｒｉｇａｋｕ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｊａｐａｎ）でスキャンした。画像は、次のパラメ-タを使用して呼吸ゲ-ト技術で取得された。
　Ｘ線管電圧、９０ｋＶのＸ線管電流、８８μＡ；視野、３６ｍｍ；合計スキャン時間は４分。取得プロトコルにより、呼吸サイクルの２つの異なるフェ-ズ（つまり、吸気と呼気）に対応する、７２μｍの再構成されたボクセルサイズを持つ２つの３次元デ-タセットをもたらした。
　ヒドロキシプロリンの定量化：
　ヒドロキシプロリンの定量化のために、１０ｍＬのＰＢＳで右心室灌流後に肺組織を採取し、細かく刻んでから、２ｍＬの超純水に再懸濁した。懸濁液をポリトロン（Ｋｉｎｅｍａｔｉｃａ　ＡＧ、スイス）でさらに均質化し、２００μＬの懸濁液をポリテトラフルオロエチレンで裏打ちされたキャップ付きの耐圧ポリプロピレンバイアルに移した。
　残りの懸濁液を等分し、遺伝子発現アッセイのために-８０℃で保存した。続いて、２００μＬの１２ＭＨＣｌを耐圧ポリプロピレンバイアルに添加した。サンプルを１２０°Ｃで３時間加水分解し、ろ過した。各サンプルのヒドロキシプロリン含有量は、製造元のプロトコルに従って、ヒドロキシプロリンアッセイキット（ＭＡＫ００８-１ＫＴ、Ｓｉｇｍａ-Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して測定した。
　選別用の肺単細胞懸濁液の調製：
　肺組織が白っぽく見えるまで、右心室を介して肺をＰＢＳで灌流した。３７°Ｃで６０分間、灌流した肺をかみそりの刃で細かく切り、０．２５ｍｇ／ｍＬ　Ｌｉｂｅｒａｓｅ　ＴＭ（Ｒｏｃｈｅ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）および２ｋＵ／ｍＬ　ＤＮａｓｅ　Ｉ（Ｓｉｇｍａ-Ａｌｄｒｉｃｈ）を含む５ｍＬのＲＰＭＩ１６４０培地（１０％ＦＢＳおよび１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳを添加）で消化した。
　消化中、１５分間隔でピペッティングすることにより懸濁液を穏やかに攪拌した。懸濁液を７０μｍセルストレ-ナ-（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡ）でろ過した。次に、細胞を洗浄し、５％ＦＢＳおよび１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳを添加したダルベッコ改変イ-グル培地（ＤＭＥＭ；ナカライテスク）に再懸濁した。
　赤血球は、パ-コ-ル勾配遠心分離（２５％上部／６５％下部、中間層が回収された、ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、米国）により、室温で１０００×ｇで２０分間除去された。得られた単一細胞５懸濁液を、Ｆｃブロック２．４Ｇ２のカスタム調製物でブロックし、適切な抗体混合物で染色した（すべての抗体を２％ＦＢＳ添加のＰＢＳで希釈した）。線維芽細胞分離のゲ-ティングプロトコルはＣＤ４５-ＣＤ３１-ＥｐＣＡＭ-ＣＤ１４６-ＰＤＧＦＲα＋であった。
　フロ-サイトメトリ-：
　各図に示すように、培養細胞、ＢＭ細胞、または肺細胞をモノクロ-ナル抗体で染色し、フロ-サイトメトリ-で分析した。細胞内染色では、細胞をＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒドで固定し、１ｘＢＤ　Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で透過処理した後、指定のモノクロ-ナル抗体で染色し、次に蛍光色素標識二次抗体で染色した。
　特に明記しない限り、すべての抗体は１：２００希釈の希釈で使用された。ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（バ-ジョン１０．７．１；Ｔｒｅｅ　Ｓｔａｒ、ＵＳＡ）を使用して、ＦＡＣＳＶｅｒｓｅまたはＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフロ-サイトメ-タ-、またはＦＡＣＳＡｒｉａ　ＩＩセルソ-タ-（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡ）で蛍光強度を分析した。セルソ-ティングは、ＦＡＣＳＡｒｉａＩＩセルソ-タ-を使用して実行された。
　ＢＡＬＦサイトカインの多重分析：
　ＢＡＬＦを分注し、分析まで-８０°Ｃで保存した。Ｌｕｍｉｎｅｘ　１００（Ｌｕｍｉｎｅｘ　Ｃｏｒｐ、ＵＳＡ）は、メ-カ-の仕様に従って使用された。サイトカインパネル（Ｂｉｏ-Ｐｌｅｘ　Ｐｒｏ　Ｍｏｕｓｅ　Ｃｙｔｏｋｉｎｅ　２３-ｐｌｅｘ　Ａｓｓａｙ＃Ｍ６０００９ＲＤＰＤ）を使用してサイトカインを検出した。サイトカイン検出の下限は、サイトカインおよび実験ごとに異なり、通常は０．１～１００ｐｇ／ｍＬの範囲であった。
　サイトカインＥＬＩＳＡ：
　細胞培養上清中のＩＬ-１１の濃度は、マウスＩＬ１１　ＤｕｏＳｅｔ　ＥＬＩＳＡキット（ＤＹ４１８、Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して定量化された。酵素結合免疫吸着測定法は、製造元のプロトコルに従って実行された。
　遺伝子発現アッセイ：
　細胞からのＲＮＡをＩＳＯＧＥＮ（Ｎｉｐｐｏｎ　Ｇｅｎｅ、Ｊａｐａｎ）で精製し、ＬｕｎａＳｃｒｉｐｔ　ＲＴ　ＳｕｐｅｒＭｉｘ　Ｋｉ　ｔ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、ＵＳＡ）を使用して逆転写した。ＳＹＢＲベ-スの逆転写酵素定量的ポリメラ-ゼ連鎖反応（ＲＴ-ｑＰＣＲ）は、ＳｔｅｐＯｎｅ　ＰｌｕｓリアルタイムＰＣＲシステム（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でマウス遺伝子の特定のプライマ-（補足表１に記載）とＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ　ＳＹＢＲｑＰＣＲミックスを使用して実行した。遺伝子発現は、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラ-ゼ１のレベルに正規化された。肺組織での遺伝子発現のために、２００μＬの均質化された肺組織アリコ-トを解凍し、１ｍＬのＩＳＯＧＥＮ試薬に添加した。遺伝子発現アッセイは、細胞に対して同様の方法で実施された。
　ＡＭΦ分離：
　ＡＭΦｓは気管支肺胞洗浄によって採取された。各マウスについて、ＢＡＬＦを３７°Ｃの洗浄液（２ｍＭエチレンジアミン四酢酸、０．５％ＦＢＳを含むＰＢＳ）で１０回の個別の１ｍＬ気管支肺胞洗浄液からプ-ルし、氷上で保存した。
　次に、赤血球溶解を室温で３分間行った（赤血球溶解緩衝液、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。ＡＭΦの品質を評価するためにフロ-サイトメトリ-分析を実施した。通常、ＢＡＬＦ細胞の＞９５％はＡＭΦｓであった。上記のように、完全ＲＰＭＩ-１６４０培地を含む２４ウェルプレ-トに細胞を１×１０５細胞／ウェルの密度で播種した。次の実験のために、培地に２０ｎｇ／ｍＬの組換えマウス顆粒球-マクロファ-ジ-コロニ-刺激因子（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）を添加した。
　肺線維芽細胞培養：
　初代マウス肺線維芽細胞は、いくつかの変更を加えたヘリクリサムのプロトコルを使用して、ＷＴ　Ｃ５７ＢＬ／６およびＳｌｃ１５ａ３-／-マウスから分離された。１０ｍＬのＰＢＳで右心室を灌流した後に肺を採取した。肺葉を細かく切り刻み、５ｍＬのプロテア-ゼ溶液［１０００Ｕ／ｍＬコラゲナ-ゼＸＩ（Ｓｉｇｍａ-Ａｌｄｒｉｃｈ）、１０Ｕ／ｍＬ　ＤｉｓｐａｓｅＩＩ（Ｒｏｃｈｅ）、および１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ中の２０００Ｕ／ｍＬ　ＤＮａｓｅＩ、および１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ］を３７℃で６０分間、マイクロピペットで２０分間隔で粉砕した。
　消化後、細胞を７０μｍストレ-ナ-に通し、５％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭで洗浄し、完全ＤＭＥＭ［１０％ＦＢＳ、２ｍＭＬ-グルタミン、５０μＭ２-メルカプトエタノ-ル、１％（ｖ／ｖ）非必須アミノ酸、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、および１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン］で３７℃で培養し、線維芽細胞を付着させて増殖させた。
　線維芽細胞が８０％のコンフルエンスに達したとき、０．２５％トリプシン-エチレンジアミン四酢酸（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で回収し、ＡｕｔｏＭＡＣＳ　Ｐｒｏセパレ-タ-（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ、ドイツ）を製造元のプロトコルに従って使用し、マウスＣＤ４５（白血球）、ＣＤ３１（内皮細胞）、およびＥｐＣＡＭ（上皮細胞）に特異的な磁気ビ-ズを用いたネガティブセレクションにより濃縮した。２～５継代の間のマウス肺線維芽細胞をその後の実験に使用した。
　遺伝子発現またはタンパク質発現のｉｎ　ｖｉｔｒｏアッセイでは、線維芽細胞を１日目に２４ウェルプレ-トの１ｘ１０５細胞／ウェル（遺伝子発現）または１２ウェルプレ-トの２ｘ１０５細胞／ウェル（タンパク質発現）に１％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭでプレ-ティングした。細胞は、示されたサイトカインで２４～７２時間刺激されたか、刺激されなかった。
　組織学上処理：
　パラフィン包埋組織の連続した４μｍの連続切片をヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。コラ-ゲン含有量と肺組織への沈着を視覚化するために、脱パラフィンした切片をマッソンのトリクロ-ムで染色した。αＳＭＡ染色では、切片を脱パラフィンおよび抗原回復に供し、次にメタノ-ル中の０．３％過酸化水素中で３０分間インキュベ-トした。希釈したαＳＭＡ抗体（Ａｂｃａｍ）を各スライドに適用した（４°Ｃ、一晩）。希釈した西洋ワサビペルオキシダ-ゼ標識二次抗体を、室温で６０分間適用した。ペルオキシダ-ゼ染色ＤＡＢキット
　（ナカライテスク）から調製した３，３’-ジアミノベンジジン溶液をスライドに約５分間適用して、αＳＭＡシグナルを可視化した後、ヘマトキシリンで対比染色した。画像は、タイリングソフトウェア（ｅ-Ｔｉｌｉｎｇ、三谷商事、日本）を備えたＢＸ５３顕微鏡（オリンパス、日本）で取得された。
　単一細胞分析：
　肺細胞は、ＷＴおよびＳｌｃ１５ａ３-／-マウスグル-プからの６匹のＢＬＭ処置マウス（１グル-プあたり２日-１０マウスおよび１日-２１マウス）から収集された。各肺から単細胞懸濁液を分離した後、細胞をＴｏｔａｌＳｅｑマウスハッシュタグ抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、ＵＳＡ）で染色した。次に、製造元の指示に従って、ＢＤＲｈａｐｓｏｄｙＴＭ（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＵＳＡ）を使用して、２０，０００個の標識細胞をトラップして逆転写した。ｓｃＲＮＡ-ｓｅｑの場合、ｃＤＮＡライブラリ-とハッシュタグライブラリ-は、磁気ビ-ズベ-スのバルクＲＮＡ-ｓｅｑ法と同様の最適化されたプロセスによって調製された。
　シ-ケンスライブラリ-は、ＮＥＢＮｅｘｔ　ＵｌｔｒａＩＩ　ＦＳライブラリ-調製キット（ニュ-イングランドバイオラボ、米国）を使用して生成し、最終的なライブラリ-品質は、ＭｕｌｔｉＮＡ（島津、日本）およびｑＰＣＲライブラリ-定量アッセイ（ＫＡＰＡバイオシステムズ、米国）を使用して評価した。サンプルは、イルミナＮｏｖａＳｅｑ　６０００　Ｓ４フロ-セル（６７ｂｐ読み取り１および１４０ｂｐ読み取り２）（イルミナ、米国）で、セルあたり約１００，０００読み取りの深さまでシ-ケンスされた。Ｃｕｔａｄｐａｔ-ｖ２．１０を使用してアダプタ-を削除した後、ＢＤ　Ｒｈａｐｓｏｄｙワ-クフロ-用に変更されたＰｙｔｈｏｎスクリプトを使用して、セルバ-コ-ドの読み取りをセルバ-コ-ドに合わせた。
　参照ｃＤＮＡリ-ドは、Ｂｏｗｔｉｅ２-２．３．４．１によってＧＲＣｍ３８リリ-ス-１０１参照トランスクリプト-ムにアラインメントされた。カウントマトリックスは、ＢＤＲｈａｐｓｏｄｙワ-クフロ-用にカスタムビルドされたシェルスクリプトと変更されたＰｙｔｈｏｎスクリプトを使用して生成された。有効なセルバ-コ-ドは、ＤｒｏｐｌｅｔＵｔｉｌｓパッケ-ジ（４６）を使用して識別された、各セルバ-コ-ドの合計読み取りカウントのニ-プロットの屈折しきい値を超えるセルバ-コ-ドとして識別された。
　各サンプルの起源とダブレットは、ハッシュタグ抗体の正規化された読み取りカウントの倍数変化に基づいて識別された。すべてのダウンストリ-ム分析のデ-タは対数変換され［ｌｏｇ（ＴＰＭ＋１）］、そのほとんどはＲソフトウェアのＳｅｕｒａｔパッケ-ジ（バ-ジョン２．３．４）を使用して実行された。検出された遺伝子が２００未満、ミトコンドリア遺伝子が４０％を超える、またはリボソ-ムＲＮＡ遺伝子が５％を超える細胞は、除外された。
　次元削減のための可変遺伝子は、Ｓｅｕｒａｔパッケ-ジのＦｉｎｄＶａｒｉａｂｌｅＧｅｎｅｓ関数を使用して選択された。正準相関分析の削減されたデ-タのグラフベ-スのクラスタリングは、Ｓｅ　ｕｒａｔパッケ-ジのＦｉｎｄＣｌｕｓｔｅｒｓ関数を使用して実行された（解像度＝４、ｄｉｍｓ．ｕｓｅ＝１：７３）。２次元マップ上のＳｅｕｒａｔで識別されたクラスタ-の視覚化は、最適化されたｔ-ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ確率的隣接埋め込み（ｏｐｔ-ＳＮＥ）のＰｙｔｈｏｎ実装を使用して実行された。
　バイオリン図と遺伝子発現レベルがオ-バ-レイされたｏｐｔ-ＳＮＥプロットは、Ｓｅｕｒａｔパッケ-ジを使用して生成された。Ｓｅｕｒａｔパッケ-ジのＦｉｎｄＡｌｌＭａｒｋｅｒｓ関数（ｔｅｓｔ．ｍｅｔｈｏｄ＝”ｗｉｌｃｏｘ”、ｏｎｌｙ．ｐｏｓ＝ＴＲＵＥ）を使用して、各クラスタ-で差次的に発現する遺伝子を特定した。
　統合されたデ-タセットに対して共同グラフベ-スのクラスタリングを実行し、Ｕｎｉｆｏｒｍ　Ｍａｎｉｆｏｌｄ　Ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ（ＵＭＡＰ）次元削減アルゴリズムを使用して結果を視覚化し、細胞が細胞タイプに従って完全にグル-プ化されていることを確認した。細胞タイプの注釈は、ｐａｎｇｌａｏＤＢを使用して実行された。疑似時間分析は、Ｓｌｉｎｇｓｈｏｔを使用して実行された。前駆体クラスタ-は、クラスタ-の差次的発現と遺伝子セット濃縮を使用して決定された。細胞間相互作用分析は、ＣｅｌｌＣｈａｔを使用して実行された。これは、マスアクションモデルを使用して細胞間通信ネットワ-クを定量的に推測し、細胞相互作用の視覚化を可能にした。
　遺伝子セット濃縮分析とネットワ-ク分析：
　遺伝子セット濃縮分析は、ＷＴとＳｌｃ１５ａ３の平均発現の対数差に従ってランク付けされた遺伝子を使用して、比較トキシコゲノミクスデ-タベ-ス（ｈｔｔｐ：／／ｃｔｄｂａｓｅ．ｏｒｇ／、ＭｅＳＨＩＤ：Ｄ０１１６５８）の肺線維症遺伝子セットを使用して実行された。各クラスタ-の１０日目または２１日目のＷＴ肺とＳｌｃ１５ａ３-／-肺の間の平均発現の対数差に従って遺伝子をランク付けした。有意なクラスタ-について、正規化された濃縮スコアおよび偽発見率のｑ値とともに濃縮プロットが表示されます。各クラスタ-の１０日目または２１日目のＷＴ肺とＳｌｃ１５ａ３-／-肺の間の平均発現の対数差に従ってランク付けされた遺伝子は、遺伝子発現プロファイリングの視覚的分析のためにネットワ-ク分３．０（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｅｔｗｏｒｋａｎａｌｙｓｔ．ｃａ）にかけられた。
　イムノブロッティング分析：
　上記の刺激の有無にかかわらず、１２ウェルプレ-トの線維芽細胞を、１ｘ　Ｈａｌｔプロテア-ゼ阻害剤カクテル（Ｐｒｏｔｅａｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　Ｃｏｃｋｔａｉｌ）を添加した１ｘＣｅｌｌ溶解緩衝液（Ｌｙｓｉｓ　Ｂｕｆｆｅｒ）（Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で回収した。全細胞溶解物をドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、ポリフッ化ビニリデン膜に転写した。非特異的抗体の吸収を防ぐために、メンブレンをブロッキング試薬（Ｂｌｏｃｋｉｎｇ-ＯｎｅまたはＢｌｏｃｋｉｎｇ-ｏｎｅ　Ｐ、Ｎａｃａｌａｉ　Ｔｅｓｑｕｅ）でブロックした。イムノブロッティングは、一次抗体を使用して実行された。
　各図に示されているように一次抗体を使用してイムノブロッティングを行い、続いてオルセラディッシュペルオキシダ-ゼ結合二次抗体とインキュベ-トした。すべての抗体は、メ-カ-に推奨される希釈率で使用された。オルセラディッシュペルオキシダ-ゼシグナルは、ＬＡＳ-３０００検出システム（富士フイルム、日本）のＳｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ　ＷｅｓｔＦｅｍｔｏまたはＳｕｐｅｒｓｉｇｎａｌＷｅｓｔ　Ｐｉｃｏ化学発光基質（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で検出された。バンド強度はＩｍａｇｅＧａｕｇｅ（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ）で定量化され、必要に応じてロ-ディングコントロ-ルのバンド強度に正規化された。
　統計分析：
　統計分析は、Ｐｒｉｓｍソフトウェアバ-ジョン８．４．３を使用して実行された。２つのグル-プの平均±標準偏差の差は、両側スチュ-デントのｔ検定またはマンホイットニ-のＵ検定を使用して分析された。３つ以上のグル-プを含む比較では、一元配置分散分析とそれに続くテュ-キ-の事後検定、または二元配置分散分析とそれに続くシダックの事後検定を実行した。Ｐ＜０．０５は統計的に有意であると見なされた。
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　（結果）
　ＳＬＣ１５Ａ３欠損症は、ＰＦの２つの異なるマウスモデルの進行を緩和する。
　ＳＬＣ１５Ａ３欠損（Ｓｌｃ１５ａ３-／-）マウス（図２ａ-ｄ）を作成し、ブレオマイシン（ＢＬＭ）投与によりＰＦを誘導し、肺におけるＳＬＣ１５Ａ３発現レベルは、ＢＬＭ治療後に徐々に増加し（図３ａ）、ＳＬＣ１５Ａ３欠損（Ｓｌｃ１５ａ３-／-）マウスはＢＬＭ誘発性ＰＦから保護されることを確認することができる（図３ｂ-ｈ）。その結果をコンピュ-タ-断層撮影（ＣＴ）画像（図３ｃ）、肺組織学（図３ｄ、図４ａ）、肺および身体を含む線維化促進パラメ-タの複数の評価によって裏付けられることができる。また、重量（図３ｂ、ｅ）、ヒドロキシプロリン含有量（図３ｆ）、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）細胞数（図３ｇ、図４ｂ）、およびコラ-ゲン遺伝子発現（図３ｈ）で確認することができる。
　Ｓｌｃ１５ａ３の欠損がＢＬＭ誘発性線維症の炎症および／または線維化期への寄与の評価：
　Ｓｌｃ１５ａ３-／-マウスは、免疫細胞の定常状態の発達に明らかな異常を示さなかった（図２ｅ、ｆ）。ＢＬＭ投与後１０日目のＢＡＬＦの炎症細胞数と炎症誘発性サイトカインレベルは、ＩＬ-６発現を除いて、野生型（ＷＴ）マウスとＳｌｃ１５ａ３-／-マウスの間でほぼ同等である（図３ｇ、ｉ、図４ｂ）。従って急性期の炎症の程度には差がないにも関わらず、線維化病態が改善する。特に、ＢＬＭ投与後２１日目に、炎症細胞数と炎症誘発性サイトカインレベルがＷＴマウスと比較してＳｌｃ１５ａ３-／-マウスで減少し（図３ｉ）、Ｓｌｃ１５ａ３欠損がＢＬＭ投与後の線維化段階の炎症反応を軽減したことを示唆することができる。
　ＢＬＭによって誘発された炎症が存在したとしても、Ｓｌｃ１５ａ３-／-肺ではコラ-ゲン産生誘導における責任サイトカインであるＩＬ-１１の有意な発現減少が認められた。ＢＬＭ処理後のＷＴ肺の場合（図３ｊ）、ＩＬ-１１はサイトカインのＩＬ-６ファミリ-のメンバ-であり、線維芽細胞を刺激して細胞外マトリックスを生成することにより、ＰＦの進行に寄与する（例：コラ-ゲン）。これらの結果は、ＳＬＣ１５Ａ３が線維症の進行に寄与し、その欠乏が初期の炎症の存在にもかかわらず、ＰＦ肺の抗線維化変化を引き起こしたことを示す。
　ＢＬＭ誘発ＰＦマウスモデルは、急速な病勢進行と緩やかな回復を示す。そこで、不可逆的であるシリカ誘発ＰＦマウスモデルを用いて、ＳＬＣ１５Ａ３欠損の影響をさらに検討した。Ｓｌｃ１５ａ３-／-マウスもシリカ誘発ＰＦモデルにおいてＰＦの緩和を示した；（例えば、コラ-ゲン沈着の減少、呼吸機能の改善）（図３ｋ-ｍ、図５ｃ-ｄ）、しかし肺と体の重量には有意な差がなかった（図５ａ，ｂ）。これらの結果は、発症機序に関わらず、ＳＬＣ１５Ａ３が線維化の進行に重要な役割を担っていることを示唆した。
　ＳＬＣ１５Ａ３の喪失は、代謝遺伝子の発現に大きく影響し、複数の抗線維化経路を活性化する。
　Ｓｌｃ１５ａ３-／-肺における抗線維化変換のメカニズムを調査するために、ＢＬＭ投与前及び投与後にＷＴおよびＳｌｃ１５ａ３-／-肺のシングルセルＲＮＡシ-ケンス（ｓｃＲＮＡｓｅｑ）を実行した。ＢＬＭを投与された肺では、合計４０個のクラスタ-が同定され、クラスタ-化の結果を、最適化されたｔ-分散確率的ネイバ-埋め込み（ｏｐｔ-ＳＮＥ）（図６ａ、図７ａ）および均一多様体近似およびプロジェクション（ＵＭＡＰ）（図８ａ）によって視覚化させた。Ｓｌｃ１５ａ３の発現は、主に免疫細胞（例えば、Ｍｓ、好中球、制御性Ｔ細胞）で検出され、非造血細胞（例えば、線維芽細胞、上皮細胞）ではあまり検出されなかった（図２ｂ）。
　Ｓｌｃ１５ａ３の発現は、主に免疫細胞（ＭΦｓ、好中球、制御性Ｔ細胞など）で検出されることができる。非造血細胞（線維芽細胞や上皮細胞など）にはあまり存在されなかった（図６ｂ）。示された時点でＷＴ肺とＳｌｃ１５ａ３-／-肺の間でクラスタ-構造に明らかな違いは検出されなかったが（図６ｃ、図７ｃ）、複数のクラスタ-は、肺線維症の比較トキシコゲノミクスデ-タベ-スエントリ（図７ｂ）によると肺線維症に関連する異なる遺伝子の有意な濃縮を示すことができた。ｓｃＲＮＡｓｅｑデ-タの追加の詳細な分析により、さまざまな細胞タイプ、特にＭΦサブセットにおける遺伝子発現パタ-ンの大きな違いが明らかになった（図６ｃ-ｇ、図７ｄ-ｆ）。
　すべてのＭΦクラスタ-がＳｌｃ１５ａ３を発現しており、ＡＭΦｓはＰＦの過程でＳＬＣ１５Ａ３の発現を維持していた（図６ｄ-ｇ）。特に、ＭΦクラスタ-はＳｌｃ１５ａ３の消失により、アルギニン代謝酵素（Ａｒｇ２、Ｇａｔｍ）の発現が特徴的に増加した（図６ｅ-ｇ）。ＡＭΦｓは、Ｓｌｃ１５ａ３の有無に応じて成長因子や線維症関連遺伝子などのさまざまな遺伝子の発現レベルの変化を示し（図６ｈ）、Ｓｌｃ１５ａ３-／-ＡＭΦｓの機能変化；組織修復／抗炎症機能の増強（例えば、Ｈｇｆ、Ｉｆｇ１、Ｔｇｆｂ１およびＥａｒ１／Ｎｒ１ｄ１の発現の増加）、および、分解機能の増強（例えば、Ｃａｒ４およびＣｔｓｋなどのプロテア-ゼ遺伝子の増加、プロテア-ゼ阻害因子ＷΦｄｃ２１の抑制など）の増強が示唆された。ＭΦクラスタ-の中で、Ｓｐｐ１の発現を特徴とするＭΦ系統サブセットであるクラスタ-９（図７ｅ）は、酸化的リン酸化の増強とそれに続く食細胞機能の強力な誘導を示した（図６ｄ）。
　これらの細胞はまた、リソソ-ム酵素（例えば、カテプシンおよびリゾチ-ム）のレベルの上昇を示し（図７ｅ）、ＳＬＣ１５Ａ３の喪失後にスカベンジャ-機能を獲得したことを示唆した。クラスタ-９はＵＭＡＰのクラスタ-７に対応し。疑似時間分析によると、間質性ＭΦ関連の集団であることが疑われた（図８ｄ）。
　ＣｅｌｌＣｈａｔを使用した細胞間コミュニケ-ション分析により、この集団はＳｌｃ１５ａ３-／-肺の他の細胞型からのほとんどすべての主要なシグナル伝達入力を失ったことが明らかとなった（図８ｃ）。さらに、ＡＭΦｓ、間質性ＭΦｓ（ＩＭΦｓ）、および線維芽細胞は、複数のメタロプロテイナ-ゼの発現の増強を示し（図６ｉ）、Ｓｌｃ１５ａ３-／-肺におけるコラ-ゲン分解活性が高いことを示唆した。
　さらに、Ｓｌｃ１５ａ３-／-肺では、上皮細胞におけるＨｉｐｐｏ経路関連遺伝子（図７ｇ）、内皮細胞クラスタ-のＷｎｔシグナル伝達経路（図７ｈ）など、組織修復／炎症消散に関与するさまざまな遺伝子の発現レベルの増加が示された（図７ｈ）。定常状態では、Ｓｅｕｒａｔパッケ-ジを用いて３２のクラスタ-が同定され、ＷＴとＳｌｃ１５ａ３-／-の肺を比較しても、いくつかのクラスタ-におけるＣｙｐとＨｓｐ遺伝子を除いて、遺伝子発現にほとんど変化は検出されなかった（図８ｄ-ｅ）。これらのデ-タは、ＳＬＣ１５Ａ３の喪失が、特にＭΦサブセットにおいて、ＰＦの過程で複数の抗線維化経路の活性化につながることを示した。
　ＳＬＣ１５Ａ３欠損ＭΦはＰＦ緩和において極めて重要な役割を果たす。
　どの細胞がＳｌｃ１５ａ３-／-肺のＰＦ緩和に寄与するかを調べた。
　骨髄（ＢＭ）移植実験により、ＰＦの進行に対する造血系細胞および非造血系細胞の寄与が、ＰＦの病態によって異なることが明らかになった。シリカ誘発ＰＦモデルでは、Ｓｌｃ１５ａ３-／-ＢＭ移植肺のヒドロキシプロリン含量の減少によって示されるように、造血細胞におけるＳＬＣ１５Ａ３の喪失は、線維化の緩和に主に寄与した（図９ａ）。一方、造血系および非造血系のＳＬＣ１５Ａ３発現細胞は、ＢＬＭモデルにおいて異なる時点で抗炎症表現型に異なる形で関与した（図９ｃ-ｅ）。非造血ＳＬＣ１５Ａ３発現細胞と比較して、造血ＳＬＣ１５Ａ３発現細胞は、炎症細胞の浸潤（２１日目）および１０日目のコラ-ゲン遺伝子の発現に強く寄与した（図９ｆ、ｇ）。
　以上の結果から、線維化促進特性における造血系ＳＬＣ１５Ａ３の重要性が示唆されたが、非造血系ＳＬＣ１５Ａ３の寄与の程度は線維化のタイプに依存することが明らかとなった。そこで、ＰＦ進行の緩和に寄与する造血系細胞サブセットの同定を目指した。
　ｓｃＲＮＡｓｅｑ解析の結果、Ｓｌｃ１５ａ３の発現はＭΦｓで最も高く、Ｓｌｃ１５ａ３-／-ＭΦｓでは遺伝子発現が大きく変化していたことから、ＭΦｓの役割に注目した。そこで、Ｓｌｃ１５ａ３-／-ＢＭ由来のＭΦｓ（ＢＭＭΦｓ）またはＷＴ　ＢＭＭΦｓを気管内投与することにより、ＰＦが明らかになった（図１１ａ、ｂ）、シリカ吸入１５日後のＷＴ肺のＰＦを改善できるか調べた（図１０ａ）。ＢＭＭΦｓの増殖能と細胞表面マ-カ-は、ＳＬＣ１５Ａ３の有無にかかわらず差がなかった（図１０ｂ、ｃ）。
　ＣＤ４５に基づくドナ-細胞集団の評価により、移植されたＢＭＭΦｓは肺内で３０日以上維持され、一部はＡＭΦｓを示す細胞表面マ-カ-を発現していることが示された（図１０ｄ）。ＢＭＭΦｓ移植後２０日目（シリカ吸入後３５日目）、Ｓｌｃ１５ａ３-／-ＢＭＭΦｓ受容体ＷＴ肺は、コラ-ゲン沈着の著しい減少（図１１ｃ）および呼吸機能の改善（図１１ｄ、図１２ｂ）を示したが、体重には群間差はなかった（図１２ａ）。また、マイクロＣＴ解析により、Ｓｌｃ１５ａ３-／-ＢＭＭΦｓ受容体ＷＴ肺では、ＷＴ　ＢＭＭΦｓ受容体ＷＴ肺と比較して肺胞気隙が回復していることが示された（図１１ａ）。これらの結果は、Ｓｌｃ１５ａ３-／-ＭΦｓがＰＦを有する肺の組織修復に極めて重要な貢献をしていることを示している。
　ＳＬＣ１５ａ３の欠損は、ＭΦｓにおけるアルギニン代謝酵素の発現の増加を引き起こす
　次に、Ｓｌｃ１５ａ３-／-ＭΦがＰＦの病因を軽減するメカニズムを調査した。ｓｃＲＮＡｓｅｑ解析の結果、Ｓｌｃ１５ａ３-／-免疫細胞（特にＡＭ）において代謝経路に関わる遺伝子が濃縮されていることが判明した（図６ｅ）。さらに、Ｓｌｃ１５ａ３-／-肺のすべてのＭΦクラスタ-（クラスタ-９を除く）では、アルギナ-ゼＩＩ（Ａｒｇ２）やグリシンアミジノトランスフェラ-ゼ（Ｇａｔｍ）などのアルギニン代謝酵素の増強が示され（図６ｄ-ｇ）、これらの細胞におけるアルギニン生合成の変化の可能性を示が示唆された。これらのアルギニン代謝酵素は、主に肺ＭΦｓで発現していた（図１１ｅ）。アルギニンは準必須アミノ酸であり、一酸化窒素合成酵素、Ａｒｇ１、Ａｒｇ２、Ｇａｔｍなどの酵素が関与する複数の経路で代謝される。Ａｒｇ２はミトコンドリア酵素で、アルギニンをオルニチンと尿素に異化するが、Ｇａｔｍはアルギニンとグリシンからオルニチンとグアニジノ酢酸の生成を仲介し、クレアチン合成を促進する。
　両方の酵素は、アルギニンの供給について一酸化窒素シンタ-ゼと競合し、アルギニンのバイオアベイラビリティを変化させる。ｉ．ｔ．に使用したＳｌｃ１５ａ３-／-ＢＭＭΦｓは、定常状態でＡｒｇ２の発現をかなり増強し、炎症刺激存在下ではさらにその発現が増強した（図１１ｆ）。また、Ｓｌｃ１５ａ３-／-ＢＭＭでは、Ａｒｇ２よりも少ない発現量であったが、Ｇａｔｍの発現量も増加した（図１１ｆ）。
　ＷＴマウスと比較して、シリカ処理したＳｌｃ１５ａ３-／-マウスのＢＡＬＦ細胞（図１１ｇ）および肺組織（図１２ｃ）におけるＡｒｇ２の発現は増加し、Ａｒｇ１の発現には影響がなかった（図１１ｇ、図１２ｃ）。
　Ａｒｇ２の発現レベルの上昇は、定常状態のＳｌｃ１５ａ３-／-ＡＭΦｓに存在し、Ｓｌｃ１５ａ３-／-ＡＭΦｓではサイトカイン刺激によりさらに上昇したが、ＷＴ　ＡＭΦｓではわずかに上昇したのみであった（図１１ｈ）。一方、Ａｒｇ１の発現は、ＰＦの進行（図１２ｃ）およびサイトカイン刺激（図１２ｄ）にかかわらず、再びＷＴおよびＳｌｃ１５ａ３-／-ＡＭΦｓの間で差がなかった。
　Ａｒｇ２の発現量の増加は、ＢＬＭで処理したＳｌｃ１５ａ３-／-の肺でも検出され、Ｓｌｃ１５ａ３-／-のＢＭを移植したキメラマウスの肺でも検出された（図４ｃ，９ｂ）。１３Ｃ標識アルギニンを用いたＳｌｃ１５ａ３-／-ＢＭＭΦｓのメタボロ-ム解析では、シトルリンが減少し、オルニチンが増加しており（図１１ｉ）、Ａｒｇ２の発現が増加していることと矛盾しないことが示された。また、ヒトの骨髄系細胞であるＨＬ６０とＵ９３７のＳＬＣ１５Ａ３ノックダウンでもＡＲＧ２の発現が亢進しており（図１１ｊ）、ＳＬＣ１５Ａ３によるＡｒｇ２遺伝子発現の制御はヒトとマウスで共通であることが示唆される。これらの結果を踏まえ、我々はＰＦ緩和におけるＡｒｇ２の役割に着目した。
　ＭΦｓのＡｒｇ２は、ＰＦの軽減に大きく貢献する。
　Ｓｌｃ１５ａ３-／-肺におけるＰＦ緩和へのＡｒｇ２の寄与を評価するために、シリカ投与Ｓｌｃ１５ａ３-／-マウスを、Ａｒｇ１とＡｒｇ２の両方の活性を阻害するアルギナ-ゼ阻害剤、アルギナ-ゼ阻害剤アミノ-２-ボロノ-６-ヘキサン酸（ＡＢＨ）またはＳ-（２-ボロノエチル）-Ｌ-システイン（ＢＥＣ）に週２回経鼻的に暴露した（図１４ａ）。Ｓｌｃ１５ａ３-／-肺へのＢＥＣ投与は、線維化促進効果を発揮し、コラ-ゲン沈着および呼吸機能との関連でＰＦ悪化を引き起こさせる（図１３ａ、ｂ、図１４ｂ、ｃ）。ＡＢＨ投与は同様の傾向をもたらした（図１３ａ，ｂ，図１４ｂ，ｃ）。上記の他の実験とは異なり、ＰＦの軽減はコントロ-ルのＳｌｃ１５ａ３-／-肺（例えば、リン酸緩衝生理食塩水［ＰＢＳ］で処理したリング）では明らかではなかった。おそらく、鼻腔内投与に使用された麻酔が体温と血糖値の変化を引き起こしたためと考えられる。Ａｒｇ２の重要な役割は、Ｓｌｃ１５ａ３-／-Ａｒｇ２-／-ＢＭＭΦｓのｉ．ｔ．によってさらに確認された（図１３ｃ、図１５ａ-ｄ）。Ｓｌｃ１５ａ３-／-ＢＭＭΦｓにおけるＡｒｇ２欠損は、線維化に対するＳｌｃ１５ａ３欠損の改善効果を打ち消すように思われた（図１３ｄ-ｇ）。これらの結果から、ＭΦｓにおけるＡｒｇ２の発現の増加が、Ｓｌｃ１５ａ３-／-肺における抗線維化機構の主要な要因であることが示唆された。
　毎日の絶食は、Ａｒｇ２の発現を誘発することによってＰＦ症状を改善する可能性がある
　ＰＦ患者のＭΦｓおよびＡＭΦｓでは、Ａｒｇ２の発現量は検出されず、Ａｒｇ１の発現量も低かった（図１４ｄ）。肺ＭΦｓでのＡｒｇ２の発現誘導は、Ｓｌｃ１５ａ３-／-肺で観察されるように、ＰＦに有益な効果を及ぼすと推測された。以前、絶食が肝細胞でＡｒｇ２の発現を誘発し、高脂肪食によって誘発される炎症反応から肝細胞を保護することが報告されている。我々は、絶食が肺におけるＡｒｇ２の転写を誘導することを観察した（図１７ａ）。
　さらに、毎日の絶食と時間制限給餌（ＤＦ）の組み合わせは、ベ-スライン値の漸増を伴うＡｒｇ２転写物（Ａｒｇ１転写は促進されない）の周期的な増強を誘発した。興味深いことに、Ｓｌｃ１５ａ３の転写は徐々に継続的に減少した（図１６ａ）。Ａｒｇ２はＳｌｃ１５ａ３-／-肺のＰＦ軽減に大きく寄与していることから、ＤＦはＡｒｇ２の機能増強を介してＷＴ肺のＰＦに対して抗線維化作用を示すと考えた。ＤＦはシリカ投与後１５日目に開始し、体重と食物摂取量を毎日評価した（図１７ｂ）。体重は絶食中に減少したが、摂食のみによって、摂食３時間後にはほぼ完全に回復した（図１６ｃ）。
　ＤＦグル-プの血液サンプルでは、随意（ＡＬ）（つまり、通常の摂食）グル-プよりも総コレステロ-ル、尿素窒素、グルコ-ス、およびアラニンアミノトランスフェラ-ゼ（ＡＬＴ）が少ないことを観察する（図１４ｃ）。ＤＦ群の血液サンプルでは、ＡＬ（ａｄ　ｌｉｂｉｔｕｍ）普通食群と比較して、総コレステロ-ル、尿素窒素、グルコ-ス、アラニンアミノトランスフェラ-ゼ（ＡＬＴ）、トリグリセライドが少ないことが観察された（図１７ｃ）。
　驚くべきことに、ＤＦは、周期的ＣＴ、生化学および組織化学によって示されるように、シリカ投与されたＷＴ肺のＰＦの改善を達成し、ＡＬ給餌は達成しなかった（図１６ｄ、ｅ、ｈ、ｉ、図１７ｄ、ｅ）；肺重量は、２群間で差がなかった（図１７ｆ）。肺におけるＡｒｇ２の発現は、ＤＦ開始後に増強され、終点までＡＬ群より高い値を維持し（図１６ｂ、ｆ、図１７ｇ）、ＩＭΦｓおよびＡＭΦｓはＡｒｇ２発現の増強およびＳｌｃ１５ａ３発現の減少を示した（図１７ｇ）。肺におけるＡｒｇ２の発現増強と対応する抗線維化効果との間の因果関係を裏付けている。エネルギ-代謝や中枢神経支配などの他の影響もこれらのＤＦ実験におけるＰＦの病理に影響を及ぼした可能性があるが、食事療法がＰＦの効果的な治療として役立つ可能性があることが明らかになる。
　Ａｒｇ２依存性のアルギニン触媒作用によって生成されるポリアミン種であるプトレシンは、一貫してＤＦ群の肺でＡＬ群より高値を示した（図１６ｇ）。ＤＦ開始後、肺ではアルギニン消費の増加によると思われるアルギニンの減少が見られ、肺ではプトレスシン合成の増加時に見られるようにポリアミンを生成するためにこの代謝物の消費が増加したためかオルニチンの減少が見られた（図１６ｋ）。さらに、組織修復反応を刺激するロイシンの代謝物である-ヒドロキシメチル酪酸（ＨＭＢ）が、ＤＦ開始後の肺で増加していた（図１６ｋ）。これらの結果は、肺におけるＡｒｇ２の発現と抗線維化作用の因果関係を強く支持するものである。
　ＤＦ下でのケトン体の増加はＡｒｇ２誘導に不可欠である。
　断食は、我々のＰＦモデルマウスと同様に、ケトン体の産生を誘導する。β-ヒドロキシブチレ-ト（-ＨＢ）濃度はＤＦ群の血清と肺で増加した（図１６ｊ、図１８ａ）。ＨＢは内因性ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害剤であるため、一般的なＨＤＡＣ阻害剤のＡｒｇ２発現への影響を調べたところ、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）および酪酸ナトリウム（ＮａＢ）はともにＡＭΦｓのＡｒｇ２転写を増加させた（図１８ｂ）。しかし、ケトン体をほとんど産生しないＨｍｇｃｓ２-／-マウスもＤＦによってＡｒｇ２転写の増加を示し（図１８ｃ、ｄ）、ケトン体の増加はＡｒｇ２誘導に必要でないことが示された。
　ＤＦおよびＳＬＣ１５Ａ３欠損症下でのＭΦ機能変化の共通メカニズム
　プトレスシンは強力な食細胞受容体であるＭｅｒＴＫを誘導することにより、ＭΦｓのクリアランス機能を高めることが、以前の研究で報告されている。ＤＦ群マウスでは、肺ＭΦｓにおけるＭｅｒｔｋの発現が増加しており（図１６ｍ）、ＤＦ時にＭΦｓがクリアランス／スカベンジング活性を高めることが示唆された。また、Ｓｌｃ１５ａ３-／-ＭΦｓ（図６ｈ、ｉ）で増加していたＥａｒ１やマトリックスメタロプロテア-ゼＭｍｐ１４の発現量もＤＦにより増強された（図１６ｍ）。これらの結果は、ＤＦ条件下で飼育されたＭΦｓとＳＬＣ１５Ａ３なしで飼育されたＭΦｓは、Ａｒｇ２を含む下流遺伝子の発現を修飾する主要なメカニズムを共有していることを示唆するものであった。そこで、ＤＦとＳＬＣ１５Ａ３欠損の共通作用点を調べることを試みた。絶食状態によってある程度引き起こされる可能性のある栄養供給量の制限実験により、脂肪酸（ＦＡ）供給量の減少がＷＴ　ＡＭΦｓのＡｒｇ２転写を増加させることが示された（図１９ａ）。さらに、モノアシルグリセロ-ルリパ-ゼの阻害剤であるＭＪＮ１１０を用いたＦＡ供給の阻害は、すでにＦＡ利用率が制限された環境、すなわち子牛胎児血清（ＦＣＳ）を減らした培地で生体外培養したＡＭΦｓにおいて、Ａｒｇ２の発現をさらに増加させた（図１９ｂ、図２０ａ）。ＭＪＮ１１０で誘導されたＡｒｇ２遺伝子の発現をアクチノマイシンＤ（ＡｃｔＤ）で阻害したところ（図１９ｂ）、Ａｒｇ２の誘導は転写制御されていることが示された。
　これらの結果から、ＷＴ　ＡＭはＦＡ量が代謝に不十分になるとＡｒｇ２を発現し始めることが示唆された。ミトコンドリアグルタミナ-ゼの阻害剤であるＣｏｍｐｏｕｎｄ　９６８によるグルタミン利用阻害はＡｒｇ２をわずかに増加させ、２ＤＧによる解糖阻害はそうではなかった（図２０ｂ）。したがって、燃料の不足はＦＡに限られず、炭素燃料の不足とそれに伴う代謝ストレス（例えば、ＡＴＰ合成の不足）がＡｒｇ２遺伝子の発現誘導に寄与している可能性が高いことが示唆された。この考えは、絶食させた肺のＡＭΦｓでＡＭＰ活性化プロテインキナ-ゼ（ＡＭＰＫ）の活性の増大が検出されたことからも裏付けられた（図１９ｃ，ｄ）。これと一致して、パントテン酸の産生の増強が絶食した肺で検出され（図１９ｅ）、これは酸化的リン酸化（ＯＸＰＨＯＳ）の増強を表していた。
　ＯＸＰＨＯＳの増強は、Ｓｌｃ１５ａ３-／-ＡＭΦｓでも検出可能であり、ＷＴ　ＡＭΦｓよりも高い酸素消費率（ＯＣＲ）を示し、より多くのＡＴＰを生成した（図１９ｆ、ｇ、図２０ｃ）。Ｓｌｃ１５ａ３-／-ＡＭは、ＷＴ　ＡＭΦｓと比較して、酸化的リン酸化（ＯＸＰＨＯＳ）のためのＦＡへの依存性が増加したが、代謝的柔軟性は低下し（図１９ｈ、図２０ｄ）、代謝的適応におけるＳｌｃ１５ａ３-／-ＡＭの脆弱性のレベルを示唆するものであることが示された。Ｓｌｃ１５ａ３欠損はＡＭＰＫ活性の増強も示し（図１９ｉ、ｊ、ｋ）、シリカ処理したＳｌｃ１５ａ３-／-肺では、シリカ処理したＷＴ肺と比較してＡＭＰＫ活性の増強も観察された（図１９ｉ、ｋ）。ｅｘ　ｖｉｖｏのＳｌｃ１５ａ３-／-ＡＭのＡＴＰ濃度はＷＴ　ＡＭのそれよりも高く（図２０ｅ）、Ｓｌｃ１５ａ３-／-ＡＭがＷＴ　ＡＭと比較して高いＯＣＲおよびＡＴＰ生成を示したという観察と一致する（図１９ｆ、ｇ、図２０ｃ）。オリゴマイシン添加後のＡＴＰ減少率で評価したＡＴＰ消費率は、Ｓｌｃ１５ａ３-／-とＷＴ　ＡＭΦｓの間で差がなかった（図２０ｅ）ことから、少なくとも定常状態では、ＡＴＰ：ＡＭＰ比はＳｌｃ１５ａ３-／-とＷＴ　ＡＭΦｓで大きく異ならない可能性がある。
　ＡＭＰＫのＡＭＰ結合状態からＡＴＰ結合状態への移行に伴い、ＡＭＰＫサブユニットのＴｈｒ１７２でのリン酸化が進行し、その後、活性化したＡＭＰＫがＡＴＰ合成を促進させる。ＡＴＰ：ＡＭＰ比が増加すると、ＡＭＰＫの活性は抑制され、エネルギ-恒常性維持に重要な役割を果たす。このことから、Ｓｌｃ１５ａ３-／-ＡＭΦｓではＡＭＰＫの負の制御機構が損なわれており、ＰＰ２やＰＰ６などのＰＰ２ファミリ-ホスファタ-ゼがＡＭＰＫのリン酸化酵素として主要な役割を果たしている可能性が考えられた。免疫沈降法およびオルガネラ分画法により、ＳＬＣ１５Ａ３はＰＰＰ６Ｒ１およびＰＰ２Ａ-Ｃと相互作用し（図１９ｌ）、ＰＰＰ６Ｒ１の細胞内分布に影響を与えることが示された（図２１ａ、ｂ、ｃ）。ＰＰ６を含むＰＰ２ファミリ-ホスファタ-ゼを岡田酸で阻害すると、ＷＴおよびＳｌｃ１５ａ３-／-ＡＭΦｓの両方でＡｒｇ２の発現が増加したが（図２１ａ）、Ｓｌｃ１５ａ３-／-ＡＭΦｓにおける増加の程度はＷＴでＳｌｃ１５ａ３-／-ＡＭΦｓより大きかった（図１９ｍ）。これらの結果は、ＳＬＣ１５Ａ３がこれらのホスファタ-ゼのＡＭＰＫへのアクセス性を確保するために重要であることを示唆している。さらに、ＳＬＣ１５Ａ３はＲａｂ２およびＲａｂ７と結合し（図１９ｌ）、これらのＲａｂタンパク質のオルガネラ膜への分布を制御していた（図２１ｃ、ｄ）。Ｒａｂタンパク質に対する阻害剤は、ＷＴ　ＡＭｓのＡｒｇ２の増加とともにＡＭＰＫのリン酸化を増加させた（図１９ｎ、ｏ）。アンチマイシンやオリゴマイシンはＡｒｇ２の発現を抑制しなかったことから（図２１ｅ）、ＯＸＰＨＯＳの増強よりもＡＭＰＫ活性自体の増強がＡｒｇ２の発現量増加に主に寄与していることが示唆された。これらの結果から、ＳＬＣ１５Ａ３は、リン酸化酵素のアクセス性と小胞輸送を制御することによりＡＭＰＫ活性を制御するために重要であり、おそらくＲａｂ依存的にリソソ-ム輸送や融合などのエンドリソソ-ム挙動を制御し、ＡＭＰＫ-Ａｒｇ２軸を介したエネルギ-恒常性に大きな影響を与えることが示唆された。
　Ａｒｇ２の発現を増加させる化合物による肺線維症抑制効果
　AＭΦｓにおいてＡｒｇ２の発現を増加させる化合物をスクリ-ニングした。具体的には、候補化合物のパネルを準備し、マウスにシリカを投与して15日間経過後、化合物ごとに異なる濃度でマウスに週2回経鼻投与を行った。経鼻投与後24時間後、48時間後にそれぞれ肺を採取し、RNAおよびタンパク質抽出を行い、Arg IIのmRNAとタンパク質の発現をそれぞれPCRとウエスタンブロット法で解析した。その結果、有意にＡｒｇ２タンパク質の発現を増加させる化合物として、化合物ＮＣＧＭ-１００６を含む複数の化合物を取得することができた。このうち、化合物ＮＣＧＭ-１００６をＰＦモデルマウスに経気道投与したところ、シリカ投与により肺気量の減少が抑制され、肺線維症が抑制されることが確認された。
　本発明は、ＳＬＣ１５Ａ３欠損症が肺機能改善のための革新的なアプロ-チを提供する。ＳＬＣ１５Ａ３の喪失は、複数の細胞サブセット（ＭΦｓや線維芽細胞など）の遺伝子発現パタ-ンに幅広い影響を及ぼし、これらの細胞で線維化促進性から抗線維化性の表現型への変換を促進する。ＳＬＣ１５Ａ３がさまざまなタイプの細胞のさまざまな機能に影響を与える。ｓｃＲＮＡｓｅｑ分析により、ＳＬＣ１５Ａ３の喪失がさまざまな肺細胞の代謝プロセスの変化を引き起こすことが明らかになった。
　代謝過程と代謝物は遺伝子発現に強く影響するため、ＰＦ緩和に対するＳＬＣ１５Ａ３喪失の影響は代謝過程と密接に関連している。アルギニン代謝の変化はまた、アルギニン由来の代謝物を介して遺伝子発現を変化させることになる。たとえば、ポリアミンと一酸化窒素は、遺伝子発現のエピジェネティックな調節に異なって寄与する。したがって、Ａｒｇ２発現の増加は、Ｓｌｃ１５ａ３-／-ＭΦｓの遺伝子発現パタ-ンに影響を及ぼす。Ａｒｇ１とＡｒｇ２の発現レベルは細胞型によって異なるが、ＰＦの病因におけるアルギナ-ゼＩＩの役割が明らかになった。
　そして、Ａｒｇ２の発現を増加させる化合物を経気道的投与することにより、肺線維化進行が有意に抑制され、ＳＬＣ１５Ａ３、ＡＭＰＫ、Ａｒｇ２といった生体内酵素の活性を制御することにより、絶食と同様のメカニズムにより肺線維症を治療し得ることが確認された。これら酵素の活性を調整する化合物を用いることにより、また、絶食と組み合わせて用いることにより、肺線維症の効果的な治療手段を提供することができる（図２３）。
本発明のＳＬＣ１５Ａ３遺伝子発現の分析を示す図である。ａおよびｂ．本発明の方法に記載されている少なくとも２つのデ-タセットのプ-ルから計算した、示された組織（上）または細胞型（下）におけるヒトＳＬＣ１５Ａ３（Ａ）またはマウスＳｌｃ１５ａ３（Ｂ）のＲＰＫＭ発現値が示されている。ｃ．正常コントロ-ルおよびＩＰＦセルアトラスデ-タベ-スからのＩＰＦ肺から同定された細胞にわたるＳＬＣ１５Ａ３発現の箱ひげ図。ｄ．ＩＰＦ患者の肺切片のＨＥ、ＥＶＧ、＃８３　ＳＬＣ１５Ａ３、ＣＤ４５およびコントロ-ルＩｇＧ染色の代表的な画像、バ-＝１ｍｍ。ｅ．ＩＰＦ患者の肺切片のポリクロ-ナルＳＬＣ１５Ａ３、ＣＤ４５、およびコントロ-ルＩｇＧ染色の代表的な画像。 本発明のＳｌｃ１５ａ３-／-マウスの生成と特性評価を示す図である。ａ．Ｓｌｃ１５ａ３変異対立遺伝子の概略図である。Ｓｌｃ１５ａ３遺伝子のエクソン１は、ＣＲＩＳＰＲ-Ｃａｓ９によって標的にされ、部分的に削除された。矢印はジェノタイピングプライマ-を示している。ｂ．エクソン１に特異的なプライマ-セットを使用したＰＣＲによるＳｌｃ１５ａ３-／-マウスの遺伝子型決定結果である。プライマ-配列は次のとおり、Ｆｗｄ、５’-ＧＣＡＧＴＴＡＡＣＣＧＧＧＧＡＣＡＣＴＡ-３’、Ｒｅｖ、５’-ＣＧＣＣＴＡＧＧＡＡＧＡＧＧＡＧＴＧＴＧ-３’である。ｃ．ＷＴにおけるＳｌｃ１５ａ３転写物および腹腔内のＳｌｃ１５ａ３-／-好中球を、ＲＴ-ｑＰＣＲによって分析した結果である。Ｐ＜０．０１（対応のないｔ検定で決定）。ｄ．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によるＳｌｃ１５ａ３遺伝子のｅｘｏｎ１の削除されたＤＮＡ配列である。ＥおよびＦがＳｌｃ１５ａ３-／-マウスの脾臓およびＢＭにおけるリンパ系および骨髄系のフロ-サイトメトリ-分析結果である。ｅ．ネイティブＷＴおよびＳｌｃ１５ａ３-／-マウスの脾臓（Ｅ）またはＢＭ（Ｆ）から調製した単細胞懸濁液を、示された抗体で染色することにより分析した。結果は、３つの独立した実験を表す。 マウスモデルにおいて、Ｓｌｃ１５ａ３の欠如がＰＦを軽減することを示す図である。ａ．相対的定量化（ＲＱ）として表される、ＢＬＭ誘発性ＰＦの経過中の肺におけるＳｌｃ１５ａ３転写レベル。ａ．各個体からのプロット（ＷＴおよびＳｌｃ１５ａ３-／-マウスの両方でｄ０：ｎ＝３、ｄ１０：ｎ＝５、ｄ２１：ｎ＝６、ｄ２８：ｎ＝５）およびガウス最小二乗適合が各グル-プについて示されている。ｂ．ＰＦ発生中（０日目＝１００％）のＢＬＭ処理ＷＴ（ｎ＝６）およびＳｌｃ１５ａ３-／-（ｎ＝６）マウスの相対体重変化である。ｃ．ＢＬＭで処理された肺の３次元（３Ｄ）ＣＴ画像である。ｄ．肺ＣＴ画像（左）および２１日目（中央）のＷＴおよびＳｌｃ１５ａ３-／-マウスのＢＬＭ処理肺切片のマッソントリクロ-ム染色である。高倍率の画像が右の列に表示される。ｅ．ＢＬＭ誘発ＰＦモデルマウスにおける２１日目の肺重量、および、ｆ．肺のヒドロキシプロリン含有量（ＷＴ　ＰＢＳ：ｎ＝６、Ｓｌｃ１５ａ３-／-ＰＢＳ：ｎ＝６、ＷＴ　ＢＬＭ：ｎ＝９、Ｓｌｃ１５ａ３-／-ＢＬＭ：ｎ＝１４）。ｇ．ＢＬＭ誘発ＰＦ中のＢＡＬＦの細胞数、およびｈ．肺のコラ-ゲン遺伝子の発現。グル-プあたりのマウスの数は図１ａと同じである。ｉ．ＢＬＭ誘発ＰＦモデルマウスの示された時点でのＢＡＬＦのサイトカインレベルである。ｊ．ＢＬＭ誘発ＰＦの経過中のＷＴおよびＳｌｃ１５ａ３-／-肺組織におけるＩｌ１１転写産物の発現レベルである。Ｋ．シリカ誘発性ＰＦモデル（珪肺症）の２８日目の肺のヒドロキシプロリン含有量。ｌ、ＣＴスキャンによる７日目の平均値を使用して決定された珪肺症中の相対的な肺気量の変化。ｍ．７日目および２８日目のＷＴおよびＳｌｃ１５ａ３-／-マウスの肺珪肺症の代表的な３ＤＣＴ画像。ここで、平均±ＳＤ（Ｂｂ、ｈ、ｉ、ｊ、ｋ、およびｌ）、平均値（ｅ、ｆ、およびｇ）、二元配置分散分析（ｂ、およびｌ）、一元配置分散分析とそれに続くテュ-キ-の事後検定（ｅおよびｆ）、二元配置分散分析とそれに続くシダックの事後検定（ａ、ｇ、ｈ、ｉ、およびｊ）。ここで、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５、ｎｓ、重要ではなく、すべての結果は、少なくとも２つの独立した実験を表している。 ＢＬＭで処理したＳｌｃ１５ａ３-／-の肺におけるＡｒｇ２の発現量増加を示す図である。ａ．２１日目のＷＴおよびＳｌｃ１５ａ３-／-マウスのＢＬＭ処理肺切片の代表的なａＳＭＡ染色結果である。ｂ．１０、２１、および２８日目のＷＴおよびＳｌｃ１５ａ３-／-マウスの肺の細胞数である。ここで＊＊＊Ｐ＜０．００１、および、＊Ｐ＜０．０５のマンホイットニ-Ｕ検定で決定した。ｃ．二元配置分散分析とそれに続くＳｉｄａｋの事後検定によって決定された、ＢＬＭ誘発ＰＦの経過中のＷＴおよびＳｌｃ１５ａ３-／-肺組織におけるＡｒｇ２転写の発現レベル。＊Ｐ＜０．０５。すべての結果は、少なくとも２つの独立した実験を表す。 シリカ誘発ＰＦモデルにおけるＳｌｃ１５ａ３-／-マウスのＰＦの緩和を示す図である。ａ．シリカ誘発性肺線維症（ＰＦ）（珪肺症）モデルマウスにおける２８日目の肺重量である。各グル-プの平均±ＳＤ（ＷＴ、ｎ＝７；Ｓｌｃ１５ａ３-／-、ｎ＝８）が示されている。ｎｓ、マンホイットニ-Ｕ検定によると有意ではない。ｂ．ＰＦ発生中の珪肺症モデルマウスの相対体重変化（０日目＝１００％）である。各グル-プの平均±ＳＤ（ＷＴ、ｎ＝７；Ｓｌｃ１５ａ３-／-、ｎ＝８）が各時点で示されている。ｃ．ＷＴおよびＳｌｃ１５ａ３-／-の７日目および２８日目の体重および肺気量が示されている。ｄ．示された時点でのＷＴおよびＳｌｃ１５ａ３-／-マウスの肺珪肺症の代表的な３ＤＣＴ画像である。ｅ．示された時点でのＷＴおよびＳｌｃ１５ａ３-／-マウスからのシリカ処理肺切片のマッソントリクロ-ム染色。すべての結果は、少なくとも２つの独立した実験を表す。 ＢＬＭ誘発ＰＦにおける肺細胞のｓｃＲＮＡｓｅｑ解析の結果を示す図である。ａ．ｓｃＲＮＡｓｅｑ解析による遺伝子発現に基づく細胞クラスタリングの最適化されたｔ-ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ確率的隣接埋め込み（ｏｐｔ-ＳＮＥ）による表示。１０日目および２１日目のＢＬＭ処理マウスの肺の単細胞（ｎ＝１０４７１）を解析した。ｂ．肺細胞集団のＳｌｃ１５ａ３発現をｓｃＲＮＡｓｅｑで解析した。Ｓｌｃ１５ａ３を発現するクラスタ-をゲ-トした。ｃ．比較ｏｐｔ-ＳＮＥディスプレイによる１０日目と２１日目のＷＴマウスとＳｌｃ１５ａ３-／-マウス間の単球／マクロファ-ジクラスタ-の比較。薄い点と濃い点は、それぞれＷＴマウスとＳｌｃ１５ａ３-／-マウスを表している。ａ．ｓｃＲＮＡｓｅｑによる遺伝子発現に基づく細胞クラスタリングの最適化されたｔ-ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ確率的隣接埋め込み（ｏｐｔ-ＳＮＥ）表示である。１０日目と２１日目のＢＬＭ処理マウスの肺からの単一細胞（ｎ＝１０４７１）を分析した。ｂ．肺細胞集団におけるＳｌｃ１５ａ３発現をｓｃＲＮＡｓｅｑによって分析した結果である。Ｓｌｃ１５ａ３を発現するクラスタ-をゲ-トした。ｃ．ｏｐｔ-ＳＮＥディスプレイによる１０日目と２１日目のＷＴマウスとＳｌｃ１５ａ３-／-マウスの間の単球／マクロファ-ジクラスタ-の比較である。薄い点と濃い点は、それぞれＷＴマウスとＳｌｃ１５ａ３-／-マウスを表している。ｄ-ｇ．図２Ａに示されているクラスタ-９（Ｄ）、６（ＡＭΦ、Ｅ）、１１（ＩＭΦ、Ｆ）、および１６（ＩＭΦ、Ｇ）で差次的に発現する遺伝子を、火山プロット（上）とネットワ-ク分析（下）に示す。火山プロットの水平線と垂直線は、それぞれしきい値Ｐ値０．０５または倍数変化（ＦＣ）値２を示す。ｈおよびｉ．１０日目および２１日目の遺伝子発現プロファイルのバブルプロット表現である。ｈ．肺胞マクロファ-ジ（ＡＭΦ）の組織修復および線維症に関与する遺伝子の発現プロファイルである。ｉ．肺胞マクロファ-ジ（ＡＭΦ）、間質性マクロファ-ジ（ＩＭΦ）、および線維芽細胞（Ｆｂ）におけるＭｍｐ遺伝子の発現プロファイルである。 Ｓｌｃ１５ａ３-／-肺における遺伝子発現解析の結果を示す図である。ａ．ｓｃＲＮＡｓｅｑ分析で４０個のクラスタ-（０～３９）の中で差次的に発現する遺伝子の上位３０個を表すヒ-トマップである。遺伝子セット濃縮分析は、比較トキシコゲノミクスデ-タベ-ス肺線維症遺伝子セットを使用して、示された時点での各クラスタ-におけるＷＴマウスとＳｌｃ１５ａ３-／-マウス間の平均発現の対数差によってランク付けされた遺伝子を使用して実行された。ｑ値が０．０５未満のクラスタ-について、正規化された濃縮スコアと誤検出率のｑ値とともに濃縮プロットが表示される。ｂ．遺伝子セット濃縮分析は、比較トキシコゲノミクスデ-タベ-ス肺線維症遺伝子セットを使用して、示された時点での各クラスタ-におけるＷＴマウスとＳｌｃ１５ａ３-／-マウスとの間の平均発現の対数差によってランク付けされた遺伝子で実施された。ｑ値が０．０５未満のクラスタ-について、正規化された濃縮スコアと誤検出率のｑ値とともに濃縮プロットが表示される。ｃ．１０日目から２１日目までの肺細胞集団の分析結果である。薄い点と濃い点は、それぞれＷＴマウスとＳｌｃ１５ａ３-／-マウスを表している。ｄ．図６ａに示されている好中球（クラスタ-２６）および制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）（クラスタ-３１）で差次的に発現する遺伝子（ＤＥＧ）が火山プロットに示されている。火山プロットの点線の水平線と垂直線は、それぞれしきい値Ｐ値０．０５と倍率変化（ＦＣ）値２を示している。ｅ．１０日目と２１日目のＷＴおよびＳｌｃ１５ａ３-／-のクラスタ-９のシグネチャ-遺伝子のバブルプロット表現である。バブルの色は発現強度を表し、バブルのサイズは正の細胞比率を表す。ｆ．１０日目および２１日目のＷＴおよびＳｌｃ１５ａ３-／-マウスにおけるクラスタ-１６（ＩＭ）のケモカインリガンドおよび受容体のバブルプロット表現である。ｇおよびｈ．上皮細胞（ｇ）（クラスタ-２１および２５）および内皮細胞（ｈ）（クラスタ-４および２４）におけるＤＥＧのネットワ-ク分析。 Ｓｌｃ１５ａ３-／-肺における遺伝子発現解析の結果を示す図である。ａ．ｓｃＲＮＡｓｅｑによる遺伝子発現に基づく細胞クラスタリングの均一多様体近似および投影（ＵＭＡＰ）表示である。ｂ．ＭΦクラスタ-の疑似時間分析、ＭΦクラスタ-９とＭΦクラスタ-１６および１１の間の接続を示す。ｃ．ＭΦクラスタ-９のＣｅｌｌＣｈａｔ分析。ｄ．ｓｃＲＮＡｓｅｑによる遺伝子発現に基づく細胞クラスタリングのｏｐｔ-ＳＮＥ表示。左：未処理のＷＴおよびＳｌｃ１５ａ３-／-マウスの肺からの単一細胞の分析。右：肺細胞集団におけるＳｌｃ１５ａ３の発現。ｅ．Ｓｌｃ１５ａ３＋クラスタ-０および９のＤＥＧの火山プロット。火山プロットの水平および垂直の点線は、それぞれしきい値Ｐ値０．０５およびＦＣ値２を示す。
ＢＭキメラマウスの生成によって評価した、ＰＦ発生におけるＳｌｃ１５ａ３を発現する造血細胞および非造血細胞の役割を示す図である。ａおよびｂ．珪肺ＰＦモデルマウス：５つの矢印で示されるドナ-とレシピエントの組み合わせ（それぞれｎ＝５）。ａ．珪肺症の３５日目の肺におけるＳｌｃ１５ａ３発現レベルおよびヒドロキシプロリン含有量。ｂ．珪肺症の３５日目の肺およびＢＡＬＦ細胞におけるＡｒｇ２発現レベル。ｃ-ｆ．ＢＬＭ誘発ＰＦモデルマウスでは、ｄ１０の組み合わせはＷＴ-＞ＷＴ（ｎ＝６）、Ｓｌｃ１５ａ３-／--＞ＷＴ（ｎ＝６）、ＷＴ-＞Ｓｌｃ１５ａ３-／-（ｎ＝４）、Ｓｌｃ１５ａ３-／--＞Ｓｌｃ１５ａ３-／-（ｎ＝４）、およびｄ２１の組み合わせはＷＴ-＞ＷＴ（ｎ＝５）、Ｓｌｃ１５ａ３-／--＞ＷＴ（ｎ＝５）、ＷＴ-＞Ｓｌｃ１５ａ３-／-（ｎ＝４）、およびＳｌｃ１５ａ３-／--＞Ｓｌｃ１５ａ３-／-（ｎ＝５）。ｃ．２１日目のＢＬＭ処理肺切片のマッソントリクロ-ム染色。ｄ、ＢＬＭ誘発ＰＦの１０日目および２１日目のＢＭキメラマウスの肺におけるＳｌｃ１５ａ３発現レベル。ｅ．ＢＬＭ誘発ＰＦの１０日目および２１日目のＢＭキメラマウスのＢＡＬＦの細胞数。ｆ．１０日目と２１日目のＢＡＬＦの炎症細胞の数。顆粒球はＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ＋細胞として認識され、単球はＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ-細胞として認識されました。ｇ．ＢＬＭ誘発ＰＦ中のコンジェニックＢＭキメラの肺組織におけるＣｏｌ３ａ１　ｍＲＮＡ発現：矢印で示されるドナ-とレシピエントの組み合わせ。デ-タは平均±ＳＤとして表す。＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１；＊＊＊Ｐ＜０．００１；＊＊Ｐ＜０．０１；＊Ｐ＜０．０５、一元配置分散分析とそれに続くテュ-キ-の事後検定（ａおよびｂ）、二元配置分散分析とそれに続くシダックの事後検定（ｄ、ｅ、ｆ、およびｇ）によって決定される。すべての結果は、少なくとも２つの独立した実験を表す。 ＢＭ由来のＭΦｓのＰＦへの関与を調べた結果を示す図である。ａ．珪肺症モデルマウスへの気管内ＢＭＭΦ移植の戦略の概略図である。ｂ．１ｘ１０７個のＢＭ細胞から７日目に採取されたＢＭＭΦの数である。ｃ．移植前の細胞表面表現型マ-カ-のフロ-サイトメトリ-評価によるＷＴおよびＳｌｃ１５ａ３-／-マウスからのＢＭＭｆｓの特性評価である。ｄ．未処理の８週齢のＢ６．ＳＪＬ（ＣＤ４５．１＋）マウスは、年齢を一致させたＷＴおよびＳｌｃ１５ａ３-／-マウスからＢＭＭｆｓを１回移植した。３０日後、フロ-サイトメトリ-を使用してマウスを評価し、示された臓器のＣＤ４５．２＋細胞を検出した。肺胞マクロファ-ジのマ-カ-（ＣＤ１１ｃ＋ＳｉｇｌｅｃＦ＋）を使用して、転送されたＢＭＭΦｓを特徴付けた。 ＰＦおよびＡｒｇ２のアップレギュレ-ションの緩和におけるＳｌｃ１５ａ３-／-ＭΦの重要性を示す図である。ａ-ｄ．気管内Ｓｌｃ１５ａ３-／-ＢＭＭΦ移植は肺珪肺症を改善する。ａ、ＢＭＭΦ移植前（１４日目）および移植後（３５日目）の肺珪肺症の代表的な３ＤＣＴ画像。ｂ．珪肺症誘発性ＷＴ肺における０日目および１４日目のヒドロキシプロリン含有量。ｃ．３５日目のＷＴおよびＳｌｃ１５ａ３-／-ＢＭＭΦ移植（各ｎ＝７）を伴う珪肺症誘発ＷＴ肺のヒドロキシプロリン含有量。ｄ．平均値に基づく、ＢＭＭΦ移植後の肺気量の相対的変化。１４日目（ＢＭＭΦ移植日）、ＣＴスキャンによる（各ｎ＝７）。ｅ-ｊ．ＳＬＣ１５Ａ３欠損細胞におけるＡｒｇ２のアップレギュレ-ション。ｅ．ｓｃＲＮＡｓｅｑによって分析された肺細胞集団におけるＡｒｇ２、Ｇａｔｍ、およびＡｒｇ１の発現レベル。ｆ．示されたサイトカインとの２４時間の培養後のＢＭＭΦにおけるＡｒｇ２およびＧａｔｍ転写レベルの変化（ＷＴ、ｎ＝３；Ｓｌｃ１５ａ３-／-、ｎ＝３）。ｇ．珪肺症ＷＴおよびＳｌｃ１５ａ３-／-マウス（ＷＴ、ｎ＝７；Ｓｌｃ１５ａ３-／-、ｎ＝８）のＢＡＬＦ細胞におけるＡｒｇ２またはＡｒｇ１転写産物の発現レベル。ｈ、示されたサイトカインとの２４時間の培養後のＡＭΦにおけるＡｒｇ２転写レベル（ＷＴ、ｎ＝３；Ｓｌｃ１５ａ３-／-、ｎ＝３）。ｉ、ＩＬ-６またはＩＬ-１０とともに２４時間培養したＷＴおよびＳｌｃ１５ａ３-／-ＢＭＭΦにおけるアルギニン代謝のフラックス分析（それぞれｎ＝３）。ｊ．ＳＬＣ１５Ａ３ノックダウンヒトＭΦ細胞株におけるＡｒｇ２の発現レベル。デ-タは平均±ＳＤとして示されています。ウェルチのｔ検定（ｂ）、一元配置分散分析とそれに続くテュ-キ-の事後検定（ｃ、ｆ、ｈ、ｉ）、双方向反復測定分散分析とそれに続くシダックの事後検定（ｄ）、マンホイットニ-Ｕ検定（ｇ）、および両側ｔ検定（ｊ）；＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１；＊＊＊Ｐ＜０．００１；＊＊Ｐ＜０．０１；＊Ｐ＜０．０５；ｎｓ、非有意。すべての結果は、少なくとも２つの独立した実験を表す。 ＰＦの組織修復とＳｌｃ１５ａ３-／-ＭΦｓの関係を調べた試験結果を示す図である。ａおよびｂ．ＰＦ発生およびＢＭＭΦの気管内移植（０日目＝１００％）を受けている珪肺症モデルマウスの体重（ａ）および肺気量（ｂ）の相対変化。各グル-プの平均±ＳＤとして表す（移植されていないコントロ-ル、ｎ＝８；ＷＴ、ｎ＝７；Ｓｌｃ１５ａ３-／-、ｎ＝７）。各時点で；＊Ｐ＜０．０５、双方向ＡＮＯＶＡとそれに続くＳｉｄａｋの事後検定によって決定された。ｃ．珪肺症ＷＴおよびＳｌｃ１５ａ３-／-マウスの肺におけるＳｌｃ１５ａ３、Ａｒｇ２、およびＡｒｇ１　ｍＲＮＡの発現レベル（ＷＴ、ｎ＝７；Ｓｌｃ１５ａ３-／-、ｎ＝８）；＊＊＊Ｐ＜０．００１、有意ではない（ｎｓ）、マンホイットニ-Ｕ検定で決定した。ｄ．示されたサイトカインとの２４時間の培養後のＡＭΦにおけるＡｒｇ１ｍＲＮＡ発現パタ-ンの変化（ＷＴ、ｎ＝３；Ｓｌｃ１５ａ３-／-、ｎ＝３）；ｎｓ、一元配置分散分析とそれに続くテュ-キ-の事後検定によって決定した。すべての結果は、少なくとも２つの独立した実験を表す。 ＰＦ緩和におけるＡｒｇ２の重要性を示す図である。ａ．ｓｃＲＮＡｓｅｑによって分析された肺細胞集団におけるＡ、Ａｒｇ２、Ｇａｔｍ、およびＡｒｇ１の発現レベルである。ｂからｅ．アルギニン代謝酵素の遺伝子発現に対するＳＬＣ１５Ａ３喪失の影響である。ｂ．示されたサイトカインとの２４時間の培養後のＡＭΦｓにおけるＡｒｇ２、Ｇａｔｍ、およびＡｒｇ１のｍＲＮＡ発現パタ-ンの変化（ＷＴ、ｎ＝３；Ｓｌｃ１５ａ３-／-、ｎ＝３）である。ｃ．珪肺症ＷＴおよびＳｌｃ１５ａ３-／-マウス（ＷＴ、ｎ＝７；Ｓｌｃ１５ａ３-／-、ｎ＝８）のＢＡＬＦ細胞におけるＡｒｇ２、Ｇａｔｍ、およびＡｒｇ１転写産物の発現レベルである。ｄおよびｅ．示されたサイトカインまたは刺激剤とともに２４時間培養されたＢＭＭΦ（Ｄ）およびＬＣ１５Ａ３ノックダウンヒトＭΦ細胞株（Ｅ）におけるＡｒｇ２ｍＲＮＡの発現レベルである。ｆおよびｇ．Ｓｌｃ１５ａ３-／-マウスの珪肺症の進行に対するアルギナ-ゼ阻害の効果である。ｆ．アルギナ-ゼ阻害剤で処理されたＳｌｃ１５ａ３-／-１０珪肺症モデルマウスにおける３５日目の肺のヒドロキシプロリン含有量である。ｇ．ＣＴスキャンで測定したアルギナ-ゼ阻害剤治療後（１５～３５日目）の肺気量の相対的変化である。ＨからＬが毎日の絶食と時間制限給餌（ＤＦ）による珪肺症の改善である。ｈ．２日間のＤＦ中のＷＴ　ｌｕｎｇｓ（ｎ＝４）の遺伝子発現レベルである。ｉ．ＤＦを有するＷＴ珪肺症モデルマウスにおける３５日目の肺の遺伝子発現レベル（各ｎ＝１３）である。ｊ．シリカ治療開始日の平均値（各ｎ＝１３）および各マウスによる平均摂餌量（右ｙ軸）を使用して決定された体重の相対的変化（左ｙ軸）である。ｋ．ＤＦを有するＷＴ珪肺症モデルマウスにおける３５日目の肺のヒドロキシプロリン含有量である。ＬがＣＴスキャンによるＤＦ開始日（１５日目）の平均値を使用して決定された（各ｎ＝１３）肺気量の相対的変化である。デ-タは平均±ＳＤとして示されている。一元配置分散分析とそれに続くテュ-キ-の事後検定（ｂ、ｄ、およびｆ）、マンホイットニ-Ｕ検定（ｃ、ｉ、およびｋ）、双方向反復測定分散分析（ｇ、ｈ、およびｌ）、対応のないｔ-テスト（ｅ）。ここで、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１；＊＊＊Ｐ＜０．００１；＊＊Ｐ＜０．０１；＊Ｐ＜０．０５；ｎｓ、非有意、すべての結果は、少なくとも２つの独立した実験を表す。 ＭΦｓのＡｒｇ２は、ＰＦの軽減に大きく貢献することを示す図である。ａ．Ｓｌｃ１５ａ３-／-珪肺症モデルマウスにアルギナ-ゼ５阻害剤を投与するための戦略の概略図である。ｂ．ＰＦの発生および阻害剤の投与中の珪肺症モデルマウスの相対的な体重変化（０日目＝１００％）である。各グル-プ（ＰＢＳ、ｎ＝７；ＢＥＣ、ｎ＝８；ＡＢＨ、ｎ＝８）の平均±ＳＤが各時点で示されている。ｃ．阻害剤治療後の肺の代表的な３次元（３Ｄ）ＣＴ画像である。ｄ．正常コントロ-ルおよびＩＰＦドナ-から同定された細胞全体のＡＲＧ２およびＡＲＧ１発現の箱ひげ図である。 Ａｒｇ２-／-マウスの生成と特性評価を示す図である。　ａおよびｂ．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の標的となるＡｒｇ２エクソン１および２の削除されたＤＮＡ配列（ａ）および結果として生じるＡｒｇ２ＫＯ変異対立遺伝子の概略図（ｂ）。矢印は、ジェノタイピングに使用されるプライマ-の位置を示す。ｃ．以下のプライマ-を使用したＡｒｇ２-／-マウスのＰＣＲ遺伝子型決定：共通、５’-ＧＡＧＡＧＣＴＧＴＡＧＴＣＣＴＣＣＧＡＧＡ-３’；およびＥ２ａ、５’-ＧＴＡＧＣＡＧＣＴＴＧＧＣＡＣＣＴＧＴＡ-３’。ｄ．ＲＴ-ｑＰＣＲで分析した同腹仔ＷＴ、Ａｒｇ２-／-および正常ＷＴマウス（各ｎ＝３）の末梢血リンパ球におけるＡｒｇ２転写。＊＊＊＊Ｐ＜０．００１、一元配置分散分析とそれに続くテュ-キ-の事後検定によって決定した。 毎日の絶食と時間制限のある摂食は、ＰＦの緩和においてＡｒｇ２をアップレギュレ-トすることを示す図である。ａ．ＤＦの２日間のＷＴ肺（ｎ＝４）における遺伝子発現レベル。ｂ．ＤＦまたはＡＬ給餌を受けている珪肺症モデルマウスのエンドポイント（３５日目）での肺の遺伝子発現レベル（各ｎ＝１３）。ｃ．０日目の平均値（各ｎ＝１３）および各マウスの平均摂餌量（右ｙ軸）に基づく体重の相対的変化（左ｙ軸）。ｄ．ＤＦまたはＡＬのＷＴ珪肺症モデルマウスにおける３５日目の肺のヒドロキシプロリン含有量。ｅ．ＣＴスキャンによって測定されたＤＦまたはＡＬ開始日（１５日目）の平均値に基づく肺気量の相対的変化（各ｎ＝１３）。ｆおよびｇ．ＤＦの珪肺症モデルにおけるＰＦの経過中の肺におけるＡｒｇ２転写（ｆ）およびプトレシン（ｇ）のレベル（各ｎ＝３）。（-）シリカなし、（＋）シリカ）。ｈ．指定された時間のＤＦまたはＡＬ前後の肺珪肺症の代表的な３ＤＣＴ画像。ｉ．指定された時点でのシリカ処理肺切片のマッソントリクロ-ム染色。ｊおよびｋ．ＤＦまたはＡＬの珪肺症モデルにおけるＰＦの４０日間の経過中の肺組織中の代謝物（各ｎ＝３）：β-ヒドロキシ酪酸（ｊ）、およびアルギニン、オルニチン、およびβ-ＨＭＢ（ｋ）；（-）シリカなし、（＋）シリカ）。ｍ．ＤＦまたはＡＬの１日または４日間の肺から選別されたＩＭΦにおけるＭｅｒｔｋ、Ｅａｒ１、およびＭｍｐ１４ｍＲＮＡの発現レベル。（各ｎ＝３）。デ-タは平均±ＳＤとして示す。二元配置分散分析とそれに続くＳｉｄａｋの事後検定（ａ、ｄ、ｆ、ｇ、ｊ、およびｋ）、マンホイットニ-Ｕ検定（ｃ、ｅ、およびｍ）。＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１；＊＊＊Ｐ＜０．００１；＊＊Ｐ＜０．０１；＊Ｐ＜０．０５；ｎｓ、非有意。すべての結果は、少なくとも２つの独立した実験を表す。 毎日の絶食とＡｒｇ２の発現の関係を示す図である。ａ．１日間のＤＦ中のＷＴ肺（各ｎ＝３）における遺伝子発現レベルである。２１時間の絶食および３時間の再給餌。ここで、統計的有意性は、時間０と示された時点の間で比較された。ｂ-ｆ．珪肺症モデルマウスにおけるＤＦまたは自由（ＡＬ）摂食の影響（各ｎ＝１３）。ｂ．評価戦略の概略図。ｃ．３５日目に血清で測定された６つの臨床生化学パラメ-タ-の比較。こｄ．示された時点の代表的な３ＤＣＴ画像。ｅ．経時的な肺気量の変化である。ｆ．３５日目の肺重量である。ｇ．４日間ＤＦに供されたマウスの選別されたＭΦサブセットにおけるＡｒｇ２、Ｓｌｃ１５ａ３、およびＡｒｇ１の発現レベルである。デ-タは平均±ＳＤとして示す。一元配置分散分析とそれに続くテュ-キ-の事後検定（ａ）またはマンホイットニ-Ｕ検定（ｃおよびｆ）。双方向反復測定ＡＮＯＶＡ（ｅ）；対応のないｔ検定（ｇ）；＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５、非有意（ｎｓ）。すべての結果は、少なくとも２つの独立した実験を表す。 Ａｒｇ２誘導においてＤＦ誘導ケトン体増加が不要であることを示す図である。ａ．β-血清中のヒドロキシ酪酸レベル（図１７ｂ-ｆ）。ｂ．５０　ｎＭトリコスタチンＡ（ＴＳＡ）または１ｍＭ酪酸ナトリウム（ＮａＢ）で数時間培養したＷＴおよびＳｌｃ１５ａ３-／-マウスのＢＭＭΦにおけるＡｒｇ２発現。ｃおよびｄ．肺でのＡｒｇ２発現（ｃ）および４日間のＤＦまたはＡＬ給餌でのＷＴおよびＨｍｇｃｓ２-／-マウスからの血清中のβ-ヒドロキシ酪酸レベル（ｄ）（ＷＴ　ＡＬ、ｎ＝５；ＷＴ　ＤＦ、ｎ＝５；Ｈｍｇｃｓ２-／-ＡＬ、ｎ＝４；Ｈｍｇｃｓ２-／-ＤＦ、ｎ＝４）。デ-タは平均±ＳＤとして示す。マンホイットニ-Ｕ検定（ａ）；一元配置分散分析とそれに続くテュ-キ-の事後検定（ｂ-ｄ）。＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、（ｎｓ）非有意。すべての結果は、少なくとも２つの独立した実験を表す。 ＤＦまたはＳＬＣ１５Ａ３欠損症下でのＭΦ機能変化の共通メカニズムを示す図である。ａ、ｂ、ｃ、示された培地で２１時間培養した後のＷＴマウス（ｎ＝３）からのプ-ルされたＡＭΦにおけるＡｒｇ２発現（ａ）；１％ＦＣＳ含有培地で１８時間、続いてＭＪＮ１１０処理、ＡｃｔＤありまたはなし（ｂ）；または１％ＦＣＳで１８時間、続いて指定の試薬で３時間処理（ｃ）。ｄおよびｅ．ＳｅａｈｏｒｓｅＸＦで測定した、通常の培養条件下でのＡＭΦにおけるＯＣＲ（ｄ）およびＡＴＰ（ｅ）の生成。ｆ．Ｓｅａｈｏｒｓｅ　ＸＦ　Ｍｉｔｏ　Ｆｕｅｌ　Ｆｌｅｘ　Ｔｅｓｔで測定した、ＡＭΦのミトコンドリア呼吸を促進するためのＦＡへの依存性とグルコ-スおよびグルタミンへの柔軟性。ｇおよびｈ．異なる培養条件下でのＡＭΦにおけるＬＤの定量化。Ｇ．フロ-サイトメトリ-によって測定されたＷＴまたはＳｌｃ１５ａ３-／-マウスからのｅｘ　ｖｉｖｏＡＭΦにおけるＬＤプロ-ブの蛍光強度。ｈ．示された時点で分析されたＷＴおよびＳｌｃ１５ａ３-／-マウスからの培養ＡＭΦのＬＤレベル。１０％または１％ＦＣＳで１日後、培地を保持するか、それぞれ１％または１０％ＦＣＳに切り替えた。ｉ．ＷＴおよびＳｌｃ１５ａ３-／-マウスからのＡＭΦ溶解液のイムノブロッティング。細胞を１０％ＦＣＳで培養し、１００ｎｇ／ｍＬのリポ多糖で指定の期間（０～６時間）刺激した。ｊ．ＷＴおよびＳｌｃ１５ａ３-／-マウスのＡＭΦにおけるリソソ-ムのｐＨおよび質量を、それぞれＬｙｓｏｓｅｎｓｏｒおよびＬｙｓｏｔｒａｃｋｅｒによって評価した。細胞を１０％または１％ＦＣＳ含有培地で１日間培養した。ｋ．ＡＬまたはＤＦ下で飼育されたＷＴマウスからのｅｘ　ｖｉｖｏＡＭΦおよび肺のイムノブロッティング分析（各ｎ＝５）。ｌ．イメ-ジゲ-ジで測定した、（ｋ）に示すブロットにおけるリン酸化（ｐ）-ＡＭＰＫとＡＭＰＫおよびｐ-Ｓ６ＫとＳ６Ｋの比率。ｍ．示された培地±５μＭの化合物Ｃ（ＣＣ）で２１時間培養されたＷＴ　ＡＭΦにおけるＡｒｇ２発現。ｍ．ｅｘ　ｖｉｖｏまたは２μＭオリゴマイシンを含む１０％ＦＣＳ含有培地での培養後の示された期間後におけるＷＴまたはＳｌｃ１５ａ３-／-ＡＭΦのＡＴＰレベル。デ-タは平均±ＳＤとして示す。一元配置分散分析とそれに続くテュ-キ-の事後検定（ａ、ｂ、ｃ、およびｍ）、ウェルチのｔ検定（ｄ、ｅ、ｇ、ｌ、およびｎ）。＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１；＊＊Ｐ＜０．０１；＊Ｐ＜０．０５；ｎｓ、非有意。すべての結果は、少なくとも２つの独立した実験を表す。 ＤＦおよびＳＬＣ１５Ａ３欠損症下でのＭΦ機能変化の共通メカニズムを示す図である。ａ．解糖、脂肪分解、細胞プロセスの操作が、１％ＦＣＳで培養されたＷＴ　ＢＭＭΦのＡｒｇ２発現に及ぼす影響：５μＭ　３ＰＯ、１０ｍＭオキサメ-トナトリウム（Ｏｘａ）、５ｍＭ　ＤＣＡ、１００ｎＭ　６ＡＮ、５０μＭ　ＣＰＩ-６１３（ＣＰＩ）、１０μＭ　ＦＢＰＩｎｓ、２００μＭ　ＢＳＡ-ＯＡ、１ｍＭメトホルミン、１００ｎＭタプシガルギン、４０μＭ　ウロリチンＡ、または４０μＭ　アグリスタチン、１８時間。および２００μＭ　ＡＩＣＡＲまたは５μＭ　ＭＪＮ１１０で３時間。ｂ．グルタミノリシス（左パネル）および解糖（右パネル）操作が、示された試薬を使用して１％ＦＣＳで１８時間培養されたＷＴ　ＡＭΦのＡｒｇ２発現に及ぼす影響：１μＭ　α-ケトグルタル酸（αＫＧ）、１０μＭ　ｃ９６８または２０ｍＭ　２ＤＧ。ｃ．異なる栄養条件下で培養されたＷＴおよびＳｌｃ１５ａ３-／-マウスからのＡＭΦにおけるＯＣＲのＭｉｔｏ　Ｓｔｒｅｓｓテスト分析。ｄ．Ｓｌｃ１５ａ３-／-マウスのＡＭΦにおけるＯＣＲのＭｉｔｏ　Ｆｕｅｌ　Ｆｌｅｘ　Ｔｅｓｔアッセイ。ＦＡへの依存性とミトコンドリア呼吸を促進する能力を示す。ｅ．ＷＴまたはＳｌｃ１５ａ３-／-ＡＭΦのｅｘ　ｖｉｖｏでのＡＴＰレベル、または２μＭオリゴマイシンを含む１０％ＦＣＳ含有培地での培養後。デ-タは平均±ＳＤとして示されています。一元配置分散分析とそれに続くテュ-キ-の事後検定（ａおよびｂ）。対応のないｔ検定（ｅ）；＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５。すべての結果は、少なくとも２つの独立したものを表す。 ＳＬＣ１５Ａ３はＡＭＰＫ活性を制御するために重要であることを示す図である。ａおよびｂ．（ａ）１％ＦＣＳ含有培地±５０ｎＭ　ＯＡまたは（ｂ）１％ＦＣＳ含有培地±１０μＭ　ＭＬ１４１で６時間培養したＷＴおよびＳｌｃ１５ａ３-／-ＡＭΦでのＡｒｇ２発現。ｃおよびｄ．リソソ-ム分画実験によって調べられた示されたタンパク質のリソソ-ム分布。ｃ．通常の条件下で培養されたＷＴまたはＳｌｃ１５ａ３-／-ＢＭＭΦからの細胞ホモジネ-トを密度勾配超遠心分離によって分離し、各画分に示されたタンパク質をイムノブロッティングによって調べた。ｄ．イメ-ジゲ-ジによって測定された（ｃ）の各画分における示されたタンパク質の分布（％）。ｅ．１％ＦＣＳで１８時間培養したＷＴ　ＡＭΦのＡｒｇ２発現に対する１０μＭアンチマイシンＡ（ＡＭＡ）または１μＭＣＣＣＰによるミトコンドリア調節の効果。デ-タは平均±ＳＤとして示す。二元配置分散分析とそれに続くＳｉｄａｋの事後検定（ａ、ｂ、およびｅ）。＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５。すべての結果は、少なくとも２つの独立した実験を表す。 ＡＭΦにおけるＡｒｇ２発現を亢進する化合物ＮＣＧＭ-１００６が、ＰＦを抑制することを示す図である。ａ．珪肺症モデルマウスへＡｒｇ２発現亢進化合物を適用する戦略の概略図である。ｂ．Ａｒｇ２発現亢進化合物によって、ＡＭΦにおけるＡｒｇ２の発現が更新したことを示す。ｃ．Ａｒｇ２発現亢進化合物によって、シリカ投与後の肺容量低下が抑制されたことを示す。 マウスにおけるＤＦおよびＳｌｃ１５ａ３欠損の影響の根底にある一般的なメカニズムを示す図である。ＤＦ肺のＭΦでは、ＡＭＰＫの持続的かつ増強された活性化は、燃料不足によって引き起こされる。ＳＬＣ１５Ａ３はリソソ-ムの輸送を調節するＲａｂ２およびＲａｂ７タンパク質に関連しているため、燃料不足はおそらくリソソ-ムの調節不全の行動が原因でＳｌｃ１５ａ３欠損ＭΦでも発生する可能性がある。さらに、ＳＬＣ１５Ａ３はＡＭＰＫホスファタ-ゼと関連しており、ＡＭＰＫの負のフィ-ドバック調節に関与している可能性がある。ＳＬＣ１５Ａ３の喪失により、これらのホスファタ-ゼのアクセス可能性が低下し、ＡＴＰ：ＡＭＰ比に関係なく、ＡＭＰＫ活性が持続および増強される可能性がある。
　本発明は、肺線維症の治療および／または進行を緩和する化合物、絶食をサポ-トするための補助食、および／または、患者に一日少なくとも１６時間以上絶食状態を維持している管理システムを提供することで、肺線維症の治療および／または進行を緩和の対策を提唱し、特にＣＯＶＩＤ-１９感染後の線維性瘢痕の修復に利用されることができる。
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Claims (12)

  1. 　アルギニン代謝酵素の機能を増強する化合物を含有する、肺線維症の治療における使用のための組成物。
  2. 　前記アルギニン代謝酵素の機能を増強する化合物がアルギニン代謝酵素の発現を増強する化合物である、請求項１に記載の組成物。
  3. 　前記アルギニン代謝酵素がアルギナ-ゼＩＩである、請求項１に記載の組成物。
  4. 　前記アルギナ-ゼＩＩの機能を増強する化合物が、ジペプチドＡｌａ-Ｔｙｒ、Ｌｙｓ-Ｔｙｒ、Ｇｌｎ-Ｔｙｒ、ＭＪＮ１１０およびタプシガルギン（Ｔｈａｐｓｉｇａｒｇｉｎ）から選択されるものである、請求項３に記載の組成物。
  5. 　前記アルギナ-ゼＩＩの機能を増強する化合物がアミノ酸トランスポ-タ-の機能を阻害する化合物である、請求項１に記載の組成物。
  6. 　前記アミノ酸トランスポ-タ-の機能を阻害する化合物がアミノ酸トランスポ-タ-の発現を阻害する化合物である、請求項５に記載の組成物。
  7. 　前記アミノ酸トランスポ-タ-がＳＬＣ１５Ａ３である、請求項６に記載の組成物。
  8. 　前記ＳＬＣ１５Ａ３の機能を阻害する化合物が、抗ＳＬＣ１５Ａ３抗体またはその抗原結合性フラグメント、ＳＬＣ１５Ａ３遺伝子の発現を阻害する核酸分子、ポリアミン、アルギニン、メチオニン、３-ヒドロキシ-３-メチルブチレ-ト、シトシン、アセト酢酸、３-ヒドロキシ酪酸およびアセトンから選択されるものである、請求項７に記載の組成物。
  9. 　前記アルギナ-ゼＩＩの機能を増強する化合物がＡＭＰＫの機能を増強する化合物である、請求項１に記載の組成物。
  10. 　前記ＡＭＰＫの機能を増強する化合物がＡＭＰＫの発現を増強する化合物である、請求項９に記載の組成物。
  11. 　前記ＡＭＰＫの機能を増強する化合物がクラスＩＩＩ　ＰＩ３キナ-ゼ阻害剤、ｗｏｒｔｍａｎｎｉｎおよびＰＩ４Ｋから選択されるものである、請求項１０に記載の組成物。
  12. 　医薬組成物、機能性食品、飲食品又は飼料である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の組成物。
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