WO2022211352A1 - 비알콜성 지방간염 동물모델 및 이의 제조방법 - Google Patents

비알콜성 지방간염 동물모델 및 이의 제조방법 Download PDF

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전경희
강혁구
백정환
김다현
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Definitions

  • the present invention relates to an animal model of nonalcoholic steatohepatitis overexpressing DLL4 and a method for preparing the same.
  • Nonalcoholic fatty liver disease is the world's most common liver disease, a condition in which excess fat is stored in the liver and not due to excessive drinking (alcoholic liver disease).
  • Nonalcoholic fatty liver disease causes major problems such as hepatic inflammation, fibrosis and hepatocellular carcinoma, in addition to obesity, insulin resistance, type 2 diabetes ( It is known to be associated with an increase in the prevalence of type 2 diabetes) and metabolic disease.
  • the incidence in the US population is estimated to be 25-30%, and is increasing.
  • NASH non-alcoholic steatohepatitis
  • This disease can cause complications such as cirrhosis and liver cancer, and suffers from conditions such as fat, tissue degeneration, inflammation, cellular degeneration, cirrhosis, and an increase in free fatty acids.
  • NASH is generally known to be associated with hyperlipidemia, hyperglycemia, obesity, and type 2 diabetes, and treating it is considered another approach to treat obesity, insulin resistance, type 2 diabetes and metabolic diseases. .
  • An object of the present invention is to provide an animal model for nonalcoholic steatohepatitis and a method for preparing the same.
  • a method for producing a non-alcoholic steatohepatitis mouse animal model comprising: feeding a high-fat diet to the DLL4 overexpressing mouse.
  • Non-alcoholic steatohepatitis mouse animal model prepared by the method of any one of 1 to 5 above.
  • the nonalcoholic steatohepatitis mouse animal model production method of the present invention can prevent nonalcoholic steatohepatitis by increasing the expression of genes related to the accumulation of fat in the liver cells, fibrosis of the liver cells, and inflammation according to the overexpression of DLL4 and feeding the high-fat diet.
  • a induced animal model can be provided.
  • Figure 2 is the result of confirming by tissue immunostaining (IHC) that the mouse overexpressing DLL4 was subjected to a high-fat diet (HFD), weight gain and non-alcoholic steatohepatitis (NASH) occurred in the mouse. .
  • IHC tissue immunostaining
  • HFD high-fat diet
  • NASH non-alcoholic steatohepatitis
  • the present invention comprises the steps of overexpressing DLL4 (Delta Like Canonical Notch Ligand 4) in the liver of a mouse; and feeding a high-fat diet to the mouse overexpressing the DLL4;
  • DLL4 Delta Like Canonical Notch Ligand 4
  • the DLL4 (Delta Like Canonical Notch Ligand 4) gene is a homologue of the Drosophila delta gene, and the delta gene family is a gene encoding a Notch ligand characterized by a DSL domain, an EGF repeat sequence and a transmembrane domain, which is a T-cell It is known to bind to Notch 1 to efficiently initiate development, and its origin is not limited, and may be the sequence of SEQ ID NO: 1 as the DLL4 gene (Gene ID: 54485) of the mouse. However, the present invention is not limited thereto.
  • a high-fat diet refers to a diet with a high fat content, and the fat content may be, for example, 50 to 70%, 60 to 80%, 50 to 80%, or 60 to 70%, but is limited thereto. it's not going to be
  • the high-fat diet is paid until it causes nonalcoholic steatohepatitis, and the period is not limited, but for example, 15 to 30 weeks, 20 to 30 weeks, 22 to 28 weeks, 25 to 28 weeks, However, the present invention is not limited thereto.
  • Non-alcoholic steatohepatitis is a chronic liver disease that accompanies inflammation along with fat accumulation and hepatocellular damage.
  • nonalcoholic steatohepatitis is differentiated from simple steatosis, a benign disease with a clinically good prognosis with excessive fat deposition. It is reported that the 67%, 10-year survival rate is lowered to 59%.
  • DLL4 overexpression in the liver of a mouse may be performed by crossing a DLL4 overexpressing mouse and an albumin-cre transgenic mouse.
  • the method for preparing a DLL4 overexpressing mouse in hepatocytes is a DLL4 overexpressing mouse and an albumin- crossing the cre transgenic mice; Selecting heterotype mice by confirming the genotype; crossbreeding heterotype mice; And by confirming the genotype may include the step of selecting a homotype mouse.
  • the DLL4 overexpressing mouse may be implemented by a method of transducing an expression vector containing a specific gene known in the art, and the expression vector may be a vector containing a promoter, a specific gene, or a loxP gene.
  • the expression vector may additionally include a gene for selecting a transformed mouse, for example, a CAT (Chloramphenicol acetyltransferase) gene, but is not limited thereto.
  • a gene for selecting a transgenic mouse may be located, for example, between two loxP sites, but is not limited thereto.
  • the loxP gene is an essential component of the cre/loxP system. Two loxP sites located on the same or separate DNA fragments are recognized by cre recombinase, and the site between the loxPs is cut and site-specific recombination. This is induced
  • the cre/loxP system is a powerful system for regulating the expression of two genes (cre and loxP) derived from P1 bacteriophage, and is a site-specific recombinase system that is particularly widely used for mouse transformation.
  • the present invention can provide a non-alcoholic steatohepatitis mouse animal model.
  • the nonalcoholic steatohepatitis is a chronic liver disease that exhibits complex pathological characteristics accompanied by fibrosis and inflammation along with fat accumulation and hepatocyte damage. It cannot be considered suitable as a research model for hepatitis. Therefore, a non-alcoholic steatohepatitis animal model showing pathological characteristics such as fat accumulation, fibrosis and inflammation is required.
  • genes FBP4, CEPb, PPARg, aSMA, Col1a1, Col3a1
  • the nonalcoholic steatohepatitis mouse animal model can be prepared by feeding a high-fat diet to a mouse overexpressing DLL4 specifically in liver tissue, and a mouse overexpressing DLL4 in a liver tissue-specific manner is a DLL4 overexpressing mouse and albumin-cre crossing the transgenic mice; Selecting heterotype mice by confirming the genotype; crossbreeding heterotype mice; And by confirming the genotype can be prepared by a manufacturing method comprising the step of selecting a homotype mouse.
  • PCR was performed according to the instructions provided in the Ex-Taq (TaKaRa) manual.
  • Real-time PCR was performed with an ABI instrument (Applied Biosystems Inc.) using SYBR Premix Ex Taq (Clontech Laboratories), and all results were normalized by beta-actin.
  • Cell lysate extraction was performed in RIPA buffer (1% Triton X-100; 1% sodium deoxycholate; 0.1 sodium dodecyl sulfate; 150 mM NaCl; 50 mM Tris-HCl, pH 7.5; and 2 mM EDTA, pH 8.0). was prepared with The cell lysate was incubated on ice for 20 minutes and then centrifuged at 13,200 rpm at 4°C for 25 minutes. The supernatant was transferred to a new microtube, and the concentration of the supernatant was measured using a protein assay reagent (Thermo Scientific). Protein samples were loaded onto SDS-PAGE gels and transferred to PVDF or nitrocellulose membranes (Merck Millipore).
  • the membrane was blocked with 5% skim milk or BSA for 1 hour at room temperature, and then incubated overnight at 4°C with primary antibody.
  • the membrane was washed 3 times for 10 min with PBST and incubated with HRP-conjugated secondary antibody (Bethyl Laboratories) for 1 h at room temperature.
  • the membrane was washed 3 times for 10 min with PBST.
  • FUSION SOLO S Vilber was used for image detection according to the manufacturer's instructions, and all results were normalized by beta-actin.
  • Tissue specimens were fixed with 4% paraformaldehyde (BioWorld). The fixed tissue was embedded in a paraffin block and sliced into 0.4 ⁇ m thick sections. ⁇ -SMA, DLL4 and F4 80 in liver slides were detected immunohistochemically using the Vectastain ABC kit and DAB substrate kit (Vector Laboratories) according to the manufacturer's instructions.
  • DLL4 overexpressing transgenic mice BRC No: RBRC01372, ICR strain
  • Alb-cre transgenic mice Stock No: 003574, C57BL/6 strain, homozygous were purchased from another laboratory at The Jackson Laboratory. It was purchased and used to prepare liver-specific DLL4 overexpressing mice.
  • DLL4 overexpressing mice were purchased as sperm, and progeny were produced through surrogate mice (Balb/C strain) through in vitro fertilization (IVF). DLL4 overexpressing mice were selected by genotyping, and DLL4 overexpressing mice were backcrossed with wild-type C57BL/6 mice to secure DLL4 overexpressing C57BL/6 mice. Thereafter, a DLL4 overexpressing (hetero) / Alb-cre (hetero) mouse is prepared by crossing a homozygous Alb-cre mouse and a secured DLL4 overexpressing mouse. The produced mice are crossed with each other to produce wild-type / Homozygous Alb-Cre mice and DLL4 overexpressing (homo) / Homozygous Alb-Cre mice.
  • PCR was performed using the primers of SEQ ID NOs: 2 to 5 to select DLL overexpressing mice. PCR was performed using PCR buffer (10X), dNTPs and primers (SEQ ID NOs: 32 to 35) and DNA and Taq polymerase (Cat. No. BM1418432, Roche) extracted from the target mouse, and the conditions were 94 °C for 5 minutes, After proceeding to 94 °C for 30 seconds and 55 °C for 30 seconds, the step of proceeding to 72 °C for 60 seconds was repeated 35 cycles, and finally proceeded to 72 °C for 5 minutes.
  • the PCR product made by SEQ ID NOs: 34 and 35 is an endogenous control (interleukin-2) with 324 bp, and the PCR product made by SEQ ID NOs: 32 and 33 is 389 bp transformed.
  • liver morphology and evaluate liver fibrosis H&E staining and Sirius red staining were performed, respectively.
  • Liver specimens were fixed in 10% neutral buffered formalin (Sigma), embedded in paraffin, and cut into 4 ⁇ m sections. Next, the specimens were deparaffinized, hydrated and stained by standard methods.
  • a high-fat diet (HFD) was fed to liver-specific DLL4 overexpressing mouse models to induce obesity and characterize the phenotype ( FIG. 2A ).
  • HFD high-fat diet
  • the male group of DLL4 TG x Alb cre mice gradually gained more body weight than the group of WT mice (Fig. 2B).
  • DLL4 TG x Alb cre mice had much higher body weight than WT (Fig. 2C).
  • the livers of DLL4 TG x Alb cre mice were relatively more beige, larger and heavier (Figs. 2D-2F).
  • DLL4 TG x Alb cre mice had more lipid droplets compared to WT mice (Fig. 2G).

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Abstract

본 발명은 마우스의 간에서 DLL4 를 과발현 시키고 고지방식이를 급여하여 비알콜성 지방간염 마우스 동물모델을 제조하는 방법 및 이에 의해 제조된 비알콜성 지방간염 마우스 동물모델에 관한 것이다. 본 발명의 비알콜성 지방간염 마우스 동물모델 제조방법은 DLL4의 과발현 및 고지방식이 급여에 따라 간 세포에 지방 축적, 간 세포의 섬유화 및 염증에 관련된 유전자의 발현을 증가시켜 비알콜성 지방간염이 유발된 동물모델을 제공할 수 있다.

Description

비알콜성 지방간염 동물모델 및 이의 제조방법
본 발명은 DLL4를 과발현하는 비알콜성 지방간염 동물모델 및 이를 제조하는 방법에 관한 것이다.
비알코올성 지방간 질환 (NAFLD)은 세계에서 가장 흔한 간 질환으로, 과도한 지방이 간에 저장되는 상태로 이는 과음(알코올성 간질환)으로 인한 것이 아니다. 비알코올성 지방간 질환은 간 염증 (hepatic inflammation), 섬유증 (fibrosis) 및 간세포 암종 (hepatocellular carcinoma)과 같은 주요 문제를 유발하며, 그 외에도 비만 (obesity), 인슐린 저항성 (insulin resistance), 제2형 당뇨병 (type 2 diabetes) 및 대사 질환 (metabolic disease)의 유병률 (prevalence) 증가와 관련이 있는 것으로 알려져 있다. 미국 인구 내 발생률 (incidence)은 25-30%로 추정되며, 점점 증가하고 있는 추세이다.
또한 NAFLD 환자의 약 20 %가 비알콜성 지방간염 (non-alcoholic steatohepatitis, NASH)을 가지고 있는 것으로 추정되는데, 비알콜성 지방간염은 섬유증을 특징으로 하는 만성 간 질환의 한 형태이다. 이 질환은 간경변 (cirrhosis) 및 간암 (liver cancer)과 같은 합병증을 유발할 수 있으며, 지방질, 조직 변성, 염증, 세포변성, 간경변, 유리 지방산의 증가 등의 병태를 겪는다. 또한, NASH는 일반적으로 고지질혈증, 고혈당증, 비만, 및 제2형 당뇨병과 관련이 있는 것으로 알려져, 이를 치료하는 것은 비만, 인슐린 저항성, 제2형 당뇨병 및 대사 질환을 치료하는 다른 접근법으로 간주된다.
현재 NAFLD 또는 NASH에 대한 효과적인 치료법은 알려진 바가 없다. 따라서 이러한 질환을 치료하는 방법 및 치료제를 발굴하기 위한 동물 모델을 개발하는 것이 바람직하다.
본 발명은 비알콜성 지방간염 동물 모델 및 이의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
1. 마우스의 간에서 DLL4 (Delta Like Canonical Notch Ligand 4) 과발현시키는 단계; 및
상기 DLL4를 과발현하는 마우스에게 고지방식이를 급여하는 단계;를 포함하는 비알콜성 지방간염 마우스 동물모델의 제조 방법.
2. 위 1에 있어서, 상기 과발현은 DLL4 과발현 마우스와 알부민-cre 형질전환 마우스를 교배하여 수행되는 것인 비알콜성 지방간염 마우스 동물모델의 제조 방법.
3. 위 1에 있어서, 상기 고지방식이를 20주 내지 25주간 급여하는 비알콜성 지방간염 마우스 동물모델의 제조 방법.
4. 위 2에 있어서, 상기 DLL4 과발현 마우스는 프로모터, 서열번호 1로 구성된 DLL4 유전자 및 loxP 서열을 포함하는 벡터로 형질전환된 것인, 비알콜성 지방간염 마우스 동물모델 제조방법.
5. 위 1 내지 5 중 어느 한 항의 방법으로 제조된 비알콜성 지방간염 마우스 동물모델.
본 발명의 비알콜성 지방간염 마우스 동물모델 제조방법은 DLL4의 과발현 및 고지방식이 급여에 따라 간 세포에 지방 축적, 간 세포의 섬유화 및 염증에 관련된 유전자의 발현을 증가시켜 비알콜성 지방간염이 유발된 동물모델을 제공할 수 있다.
도 1은 DLL4를 과발현시킨 마우스의 간에 지방이 축적됨을 확인하고, 야생형 대비 DLL4 과발현한 마우스의 체중 및 간의 무게가 증가되었음을 확인한 결과이다.
도 2는 DLL4 과발현 마우스에 고지방 식이(high-fat diet, HFD)를 진행한 결과, 해당 마우스의 몸무게 증가 및 비알콜성 지방간염(NASH)가 발생하였음을 조직면역 염색(IHC)으로 확인한 결과이다.
도 3은 DLL4 과발현 마우스에 고지방 식이를 진행한 후, 지방 축적, 섬유화 및 염증에 관련된 유전자들의 mRNA 발현 수준을 정량적 PCR로 확인한 결과이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 마우스의 간에서 DLL4 (Delta Like Canonical Notch Ligand 4) 과발현시키는 단계; 및 상기 DLL4를 과발현하는 마우스에게 고지방식이를 급여하는 단계;를 포함하는 비알콜성 지방간염 마우스 동물모델의 제조 방법을 제공한다.
DLL4 (Delta Like Canonical Notch Ligand 4) 유전자는 Drosophila delta 유전자의 상동체로, 델타 유전자 패밀리는 DSL 도메인, EGF 반복 서열 및 막관통(transmembrane) 도메인으로 특징 지어지는 Notch 리간드를 암호화하는 유전자로, T-세포 발달을 효율적으로 개시하기 위해 Notch 1에 결합하는 것으로 알려져 있으며, 그 유래는 제한되지 않으며, 마우스의 DLL4 유전자(Gene ID: 54485)로 서열번호 1의 서열일 수 있으나. 이에 제한되는 것은 아니다.
고지방식이 (high-fat diet, HFD)는 지방함량이 높은 식이를 말하며, 지방함량은 예를 들면 50 내지 70%, 60 내지 80%, 50 내지 80% 또는 60 내지 70%일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
고지방식이의 급여는 비알콜성 지방간염을 유발하는 때까지 이루어지는 것으로 그 기간은 제한되지 않으나, 예를 들면 15 내지 30주, 20 내지 30주, 22 내지 28주, 25 내지 28주일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
비알콜성 지방간염 (non-alcoholic steatohepatitis, NASH)은 지방 축적, 간세포 손상과 함께 염증을 동반하는 만성 간 질환으로 간섬유화, 간경변증, 간세포 암종을 초래할 수 있는 것으로 알려져 있다. 또한 비알콜성 지방간염은 과도하게 지방이 침착된 상태로 임상적으로 예후가 양호한 양성질환인 단순지방간(simple steatosis)과는 구분되는 것으로, 지방침착과 함께 간세포손상 및 염증이 동반되므로 5년 생존율이 67%, 10년 생존율이 59%로 낮아진다고 보고되어 있다.
본 발명에서 마우스의 간에 DLL4를 과발현시키는 것은 DLL4 과발현 마우스와 알부민-cre 형질전환 마우스를 교배하여 수행되는 것일 수 있고, 구체적으로 간세포에서 DLL4를 과발현하는 마우스를 제조하는 방법은 DLL4 과발현 마우스와 알부민-cre 형질전환 마우스를 교배시키는 단계; 유전자형을 확인하여 hetero type의 마우스를 선별하는 단계; hetero type의 마우스끼리 교배시키는 단계; 및 유전자형을 확인하여 homo type의 마우스를 선별하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 DLL4 과발현 마우스는 당 분야에 공지된 특정 유전자를 포함하고 있는 발현 벡터를 형질 도입하는 방법에 의해 구현될 수 있으며, 상기 발현 벡터는 프로모터, 특정 유전자, loxP 유전자를 포함하는 벡터일 수 있다.
상기 발현 벡터는 형질전환된 마우스를 선별하기 위한 유전자를 추가적으로 포함할 수 있으며, 예를 들면 CAT (Chloramphenicol acetyltransferase) 유전자일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 형질전환된 마우스를 선별하기 위한 유전자는 예를 들면 2개의 loxP 사이트의 사이에 위치할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 loxP 유전자는 cre/loxP 시스템의 필수 구성요소로서, 동일한 또는 별도의 DNA 조각에 위치하는 2개의 loxP 사이트가 cre 재조합 효소(recombinase)에 의해 인식되고, loxP 사이의 부위가 절단되어 부위 특이적 재조합이 유도된다. 상기 cre/loxP 시스템은 P1 박테리오파지에서 유래된 2가지 유전자(cre 및 loxP)의 발현을 조절하는 강력한 시스템으로, 특히 쥐 형질전환에 많이 이용되는 부위-특이적 재조합효소 시스템이다.
본 발명은 비알콜성 지방간염 마우스 동물모델을 제공할 수 있다.
상기 비알콜성 지방간염은 지방 축적, 간세포 손상과 함께 섬유화 및 염증을 동반하는 복잡한 병리학적 특성을 나타내는 만성 간 질환으로, 간 또는 간암 세포주는 상기 병리학적 특성을 모두 반영하지 못하므로 비알콜성 지방간염의 연구 모델로서 적합하다고 볼 수 없다. 따라서 지방축적, 섬유화 및 염증 등의 병리학적 특성을 나타내는 비알콜성 지방간염 동물모델이 요구되는바, 본 발명에서는 상기 병리학적 특성에 관여하는 유전자(FABP4, CEPb, PPARg, aSMA, Col1a1, Col3a1, CCL2)의 발현이 높아진 비알콜성 지방간염 마우스 동물모델을 제공할 수 있다.
상기 비알콜성 지방간염 마우스 동물모델은 간 조직 특이적으로 DLL4를 과발현하는 마우스에 고지방식이를 급여하여 제조할 수 있으며, 간 조직 특이적으로 DLL4를 과발현하는 마우스는 DLL4 과발현 마우스와 알부민-cre 형질전환 마우스를 교배시키는 단계; 유전자형을 확인하여 hetero type의 마우스를 선별하는 단계; hetero type의 마우스끼리 교배시키는 단계; 및 유전자형을 확인하여 homo type의 마우스를 선별하는 단계를 포함하는 제조방법에 의해 제조될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것으로, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
1. 실험 방법
(1) 전체 RNA 분리 및 역전사 중합효소 연쇄반응 (RT-PCR)
RNA는 제조업체의 지침에 따라 TRIzol®시약 (Invitrogen)을 사용하여 분리되었다. 역전사-중합 효소 연쇄 반응 (RT-PCR)은 역전사 시스템 (TOYOBO) 및 표 1에 나열된 프라이머를 사용하여 수행되었다. PCR은 Ex-Taq (TaKaRa) 메뉴얼에 제공된 지침에 따라 이루어졌다. 실시간 PCR은 SYBR Premix Ex Taq (Clontech Laboratories)를 사용하여 ABI 기기 (Applied Biosystems Inc.)로 수행되었으며, 모든 결과는 베타-엑틴에 의해 정규화되었다.
프라이머 서열 (5'-3')
β-actin 정방향: 서열번호 2
역방향: 서열번호 3
DLL4 정방향: 서열번호 4
역방향: 서열번호 5
CD36 정방향: 서열번호 6
역방향: 서열번호 7
FABP4 정방향: 서열번호 8
역방향: 서열번호 9
CEBPb 정방향: 서열번호 10
역방향: 서열번호 11
Pparg 정방향: 서열번호 12
역방향: 서열번호 13
a-SMA 정방향: 서열번호 14
역방향: 서열번호 15
Col1a1 정방향: 서열번호 16
역방향: 서열번호 17
Col1a2 정방향: 서열번호 18
역방향: 서열번호 19
Col3a1 정방향: 서열번호 20
역방향: 서열번호 21
Col4a1 정방향: 서열번호 22
역방향: 서열번호 23
IL-10 정방향: 서열번호 24
역방향: 서열번호 25
CCL2 정방향: 서열번호 26
역방향: 서열번호 27
TNFa 정방향: 서열번호 28
역방향: 서열번호 29
TNFb 정방향: 서열번호 30
역방향: 서열번호 31
(2) 웨스턴 블로팅
세포 용해물(cell lysate) 추출은 RIPA 버퍼 (1% Triton X-100; 1% 나트륨 데옥시콜레이트; 0.1 나트륨 도데실 설페이트; 150mM NaCl; 50mM Tris-HCl, pH 7.5; 및 2mM EDTA, pH 8.0)로 준비되었다. 세포 용해물을 얼음에서 20분간 배양한 뒤, 4 ℃에서 25분간 13,200 rpm로 원심 분리하였다. 상청액을 새로운 마이크로 튜브로 옮기고, 단백질 분석 시약 (Thermo Scientific)을 사용하여 상청액의 농도를 측정하였다. 단백질 샘플을 SDS-PAGE 젤에 로딩하고 PVDF 또는 니트로 셀룰로오스 멤브레인 (Merck Millipore)으로 트랜스퍼하였다. 멤브레인은 실온에서 1시간 동안 5 % 스킴 밀크 또는 BSA로 블로킹한 후, 1차 항체와 함께 4 ℃에서 밤새 배양하였다. 멤브레인을 PBST로 10분간 3회 세척하고 HRP-접합 2차 항체 (Bethyl Laboratories)와 함께 실온에서 1시간 동안 배양했다. 멤브레인을 PBST로 10분간 3회 세척하였다. FUSION SOLO S (Vilber)는 제조업체의 지시에 따라 이미지 검출에 사용되었으며, 모든 결과는 베타-엑틴에 의해 정규화되었다.
(3) 조직면역 염색
조직 표본은 4 % 파라포름알데히드 (바이오세상)으로 고정되었다. 고정된 조직은 파라핀 블록에 포매되고, 0.4μm 두께의 섹션으로 얇게 절단되었다. 간 슬라이드의 α-SMA, DLL4 및 F4 80은 제조업체의 지침에 따라 Vectastain ABC 키트 및 DAB 기질 키트 (Vector Laboratories)를 사용하여 면역 조직 화학적으로 검출되었다.
(4) 동물 실험
모든 동물 실험은 연세대학교 의과 대학 기관 심의위원회의 승인을 받았으며 실험실 동물의 관리 및 사용에 관한 대학 지침 (2015-0376)에 따라 특정 병원균이 없는 시설에서 수행되었다. 6주된 C57BL/6 마우스는 Orientbio에서 구입하였다. 쥐 안정화 1주 후, 60% 지방이 포함된 고지방식(Research Diets사의 60kcal% Fat)을 22 주간 먹였다 (12시간 빛 - 12시간 어둠 주기).
(5) 마우스 형질전환
DLL4 과발현 형질전환 마우스(BRC No: RBRC01372, ICR strain)는 Priken BRC에서, Alb-cre 형질전환 마우스(Stock No: 003574, C57BL/6 strain, homozygous 상태로 다른 실험실에서 분양받았음)는 The Jackson Laboratory에서 구매하였으며, 간 특이적 DLL4 과발현 마우스를 제조하는데 이용하였다.
DLL4 과발현 마우스는 sperm 상태로 구매하였으며, 체외수정 (In vitro fertilization, IVF)을 진행하여 대리모 마우스(Balb/C strain)를 통해 자손을 생산하였다. Genotyping을 진행하여 DLL4 과발현 마우스를 선별하였으며, 상기DLL4 과발현 마우스는 야생형C57BL/6 마우스와 역교배 (backcrossing)를 수행하여 DLL4 과발현 C57BL/6 를 확보한다. 이후, Homozygous Alb-cre 마우스와 확보한 DLL4 과발현 마우스를 교배하여 DLL4 과발현 (hetero) / Alb-cre (hetero) 마우스를 제작한다. 제작된 이 마우스끼리 교배하여 야생형 / Homozygous Alb-Cre 마우스와 DLL4 과발현 (homo) / Homozygous Alb-Cre 마우스를 생산한다.
Western blot, PCR 분석을 통해 DLL4 과발현 마우스의 간 조직에서 정상 쥐에 비해 DLL4의 발현이 증가되어 있는 것을 확인하였다.
(6) 유전자형 분석 (Genotyping)
DLL 과발현 마우스를 선별하기 위해 서열번호 2 내지 5의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR은 PCR 버퍼 (10X), dNTP 및 프라이머 (서열번호 32 내지 35)와 대상 마우스로부터 추출한 DNA 및 Taq polymerase(Cat. No. BM1418432, Roche)를 사용하여 수행하였으며, 조건은 94 ℃로 5 분, 94 ℃로 30 초, 55 ℃로 30초 진행한 후, 72 ℃로 60초 진행하는 단계는 35사이클 반복하고, 최종적으로 72 ℃로 5분 진행하였다.
서열번호 34 및 35에 의해 만들어지는 PCR 생산물은 324 bp로 내재적 대조군 (인터루킨-2)이고, 서열번호 32 및 33에 의해 만들어지는 PCR 생산물은 389bp로 형질전환되었음을 확인할 수 있다.
(7) 시리우스 레드 염색
간 형태를 검사하고 간 섬유증을 평가하기 위해 H&E 염색과 Sirius red 염색을 각각 수행하였다. 간 표본은 10 % 중성 완충 포르말린 (Sigma)에 고정되고, 파라핀에 포매되어 4μm 섹션으로 절단했다. 다음으로, 표본은 표준 방법으로 파라핀 제거, 수화 및 염색되었다.
(8) 통계적 분석
데이터의 통계적 평가는 평균 ± SEM으로 표시되었다. 치료군에 대한 평균 값 간의 차이의 통계적 유의성은 소프트웨어 GraphPad Prism 소프트웨어 (버전 6; GraphPad Software Inc)를 사용하여 Student 's t-test 및 일원 분산 분석 (ANOVA)에 의해 분석되었다. 데이터는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다 (*p<0.05, **p<0.01 및 ***p<0.001).
2. 실험 결과
(1) HFD 유발 비만 마우스 간 조직 내 DLL4 발현 수준 상승 확인
먼저 Notch 신호 관련 유전자의 mRNA 발현 수준을 대조군과 HFD를 먹인 비만 마우스에서 측정하였다. 흥미롭게도 DLL4의 발현 수준은 대조군보다 HFD를 먹인 비만 마우스에서 더 높았다 (도 1A). 마우스 간에서 DLL4의 역할을 확인하기 위해 DLL4의 간-특이적 과발현 마우스 (DLL4 TG x Alb cre)가 제작되었다 (도1B). DLL4 TG 마우스에게 20주간 정상식이를 먹였을 때 수컷 마우스는 야생형 마우스 그룹에 비해 체중이 매우 증가하였고 (도 1C), 간 무게 또한 매우 증가했다 (도1D). 이러한 결과를 바탕으로 DLL4와 간 대사 사이에 관련이 있다고 가정할 수 있다.
(2) DLL4 과발현 비만 마우스는 체중이 더 높고 지방간이 악화되었다.
간 특이적 DLL4 과발현 마우스 모델에 고지방식이(HFD)를 먹여 비만을 유도하고 표현형을 특성화하였다 (도 2A). HFD의 22 주 동안, DLL4 TG x Alb cre 마우스의 수컷 그룹은 WT 마우스 그룹보다 점차적으로 체중이 더 증가하였다 (도 2B). 22 주 후, DLL4 TG x Alb cre 마우스의 체중은 WT보다 훨씬 높았다 (도 2C). 또한 DLL4 TG x Alb cre 마우스의 간은 상대적으로 베이지 색이 더 많고, 더 크고 무거웠다 (도 2D-2F). 간 섹션의 H&E 염색에서 DLL4 TG x Alb cre 마우스는 WT 마우스에 비해 더 많은 지질 방울이 더 많았다 (도 2G). 이러한 생체 내 데이터는 간-특이적으로 DLL4를 과발현하는 비만 마우스가 지질 축적 및 체중 증가에 더 취약함을 시사한다.
(3) DLL4 과발현 마우스는 HFD를 먹인 후 NASH 표현형이 발생한다.
마우스 모델의 간에서 DLL4의 역할을 조사하기 위해 이들 마우스의 혈청을 분석한 결과, ALT와 AST가 모두 DLL4 과발현 마우스에서 더 높았으며, 이는 간 손상을 의미한다 (도 3A). 더욱이, DLL4 과발현 마우스의 총 TG, 포도당 수준, 총 콜레스테롤 및 유리 지방산은 WT 마우스보다 유의하게 높은 수준을 보였다. 그 후, 22주간 HFD를 먹인 WT 및 DLL4 TG x Alb cre 마우스의 간 섹션을 추가 분석에 사용했다. (도 3B). H&E 염색에 의하면, 더 크고 더 많은 지질 방울이 관찰되었다. 간의 섬유증 수준을 분석하기 위해 Sirius red 염색이 수행되었다. 결과에 따르면, DLL4 TG x Alb cre 마우스는 콜라겐 분포가 더 많았다. 또한 α-SMA의 IHC 염색은 섬유화가 발생했음을 확실시하고 F4/80 염색은 DLL4 TG x Alb cre 마우스 간에서 더 많은 염증이 발생했음을 보여준다. 따라서 이들 간에서 NASH 마커의 mRNA 발현 수준을 분석하였다. 지질 축적, 섬유증 및 염증 관련 유전자 발현 수준은 DLL4 과발현 마우스에서 더 높았다 (도 3C-3E).

Claims (5)

  1. 마우스의 간에서 DLL4 (Delta Like Canonical Notch Ligand 4) 과발현시키는 단계; 및
    상기 DLL4를 과발현하는 마우스에게 고지방식이를 급여하는 단계;를 포함하는 비알콜성 지방간염 마우스 동물모델의 제조 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 과발현은 DLL4 과발현 마우스와 알부민-cre 형질전환 마우스를 교배하여 수행되는 것인 비알콜성 지방간염 마우스 동물모델의 제조 방법.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 고지방식이를 20주 내지 25주간 급여하는 비알콜성 지방간염 마우스 동물모델의 제조 방법.
  4. 청구항 2에 있어서, 상기 DLL4 과발현 마우스는 프로모터, 서열번호 1로 구성된 DLL4 유전자 및 loxP 서열을 포함하는 벡터로 형질전환된 것인, 비알콜성 지방간염 마우스 동물모델 제조방법.
  5. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항의 방법으로 제조된 비알콜성 지방간염 마우스 동물모델.
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