WO2022129668A1 - Biomarcadores para el diagnóstico, prognosis, prevención, mejora o alivio en el tratamiento de la leucemia linfoblástica aguda de células b pediátrica - Google Patents

Biomarcadores para el diagnóstico, prognosis, prevención, mejora o alivio en el tratamiento de la leucemia linfoblástica aguda de células b pediátrica Download PDF

Info

Publication number
WO2022129668A1
WO2022129668A1 PCT/ES2021/070899 ES2021070899W WO2022129668A1 WO 2022129668 A1 WO2022129668 A1 WO 2022129668A1 ES 2021070899 W ES2021070899 W ES 2021070899W WO 2022129668 A1 WO2022129668 A1 WO 2022129668A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
expression
ccn2
pediatric
lymphoblastic leukemia
acute lymphoblastic
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/ES2021/070899
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Pedro MEDINA VICO
Marta CUADROS CELORRIO
Álvaro ANDRADES DELGADO
Daniel Jesús GARCÍA GARCÍA
María Isabel Rodríguez Lara
Juan Carlos ÁLVAREZ PÉREZ
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Universidad de Granada
Original Assignee
Universidad de Granada
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Universidad de Granada filed Critical Universidad de Granada
Publication of WO2022129668A1 publication Critical patent/WO2022129668A1/es
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6809—Methods for determination or identification of nucleic acids involving differential detection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA

Definitions

  • the present invention pertains to the field of clinical medicine and, more specifically, to the diagnosis, prognosis, prevention, amelioration, alleviation or treatment of cancer.
  • the main object of the present invention is related to the use of long non-coding RNA (IncRNA or RNAInc), particularly the LNCRNA AL133346., and mRNA (or mRNA), in particular the CCN2 mRNA, as biomarkers in diagnosis, prognosis , amelioration, alleviation or treatment of pediatric B-cell acute lymphoblastic leukemia, as well as methods, kits and devices based on such use.
  • RNAIncRNA or RNAInc long non-coding RNA
  • mRNA or mRNA
  • CCN2 mRNA in particular the CCN2 mRNA
  • Acute lymphoblastic leukemia is the most common childhood malignancy.
  • Pediatric B-cell acute lymphoblastic leukemia (B-ALL) is a heterogeneous and aggressive neoplasm in which new targeted therapies are required.
  • B-ALL B-cell acute lymphoblastic leukemia
  • ncRNAs non-coding RNAs
  • IncRNAs are transcripts longer than 200 bp that lack protein coding ability. IncRNAs are crucial regulators of gene expression due to their involvement in post-transcriptional modifications of mRNAs, including splicing, editing, trafficking, translation, and degradation [11, 12],
  • IncRNA deregulation has been described in numerous human diseases, including cancer [13-17], This deregulation has been associated with oncogenic or tumor suppressor phenotypes [18], However, few IncRNAs have been directly related to the development of leukemia. In acute myeloid leukemia (AML), chronic lymphocytic leukemia (CLL), and multiple myeloma (MM), a HOTAIR dysregulation, and its high expression levels, was associated with decreased survival in patients with AML [19]. In t(8;21) positive AML, associated with good prognosis, overexpression of CCAT 1 and PVT 1 was correlated with an unfavorable prognosis [20]. The number of studies that have analyzed the expression of IncRNAs in pediatric patients with B-ALL is still smaller.
  • TCL6 expression has been associated with ETV6-RUNX1-positive pediatric B-ALL.
  • patients who expressed low levels of expression of TCL6 had a lower disease-free survival than those patients who expressed high levels of TCL6 [21].
  • the expression levels of BALR-2 were related to : (i) cytogenetic abnormalities such as t(12;21) [ETV6/RUNX1], t(1;19) [TCF3/PBX1], and MLL-rearranged; (ii) disease subtypes; and (iii) survival of B-ALL patients [22].
  • these studies and others have shown that IncRNA expression profiles can distinguish different leukemia subtypes at the molecular level [23-28],
  • RNAInc expression profiles already described, a clinically relevant RNAInc consensus signature for pediatric B-ALL has not yet been identified. Identification of a signature of differentially expressed incRNAs and their associated protein-coding genes in pediatric B-ALL could lead to better diagnosis, a better understanding of the disease, and ultimately a better prognosis for patients.
  • FIG. 1 Heatmap of the RNAIncs differentially expressed in B-ALL vs healthy bone marrow. At the top of the heatmap, the samples LLA-B ETV6-RUNX1- Negative samples appear in blue, ETV6-RUNX1-positive ALL-B samples appear in red, and healthy bone marrows appear in green. The grouping was performed based on Spearman's correlation coefficient.
  • FIG. 1 Volcano plot of RNAIncs (A) and protein-coding genes (B) differentially expressed in pediatric samples of ALL-B vs. healthy bone marrow.
  • the red dots represent the RNAIncs differentially expressed in a statistically significant way.
  • FIG. 1 Genomic location of AL133346.1/CCN2 on chromosome 6.
  • the dashed square represents a zoom in on the locus. All exons of CCN2 are shown, while only the first exon of AL133346.1 is included. Regulatory regions GH06J131946 and GH06J131976 are represented by red squares.
  • FIG. 6 Gene Ontology (GO) analysis of the mRNAs associated with the RNAIncs differentially expressed between pediatric samples of ALL-B and healthy bone marrow. Significantly enriched upregulated (a) and downregulated (b) GO terms are shown. Only non-redundant GO terms are included as described in the Methods.
  • Figure 7. Comparison of the expression of AL133346.1 and CCN2 between the different karyotypes of pediatric patients with B-ALL from the microarray (A) and the different subtypes of pediatric patients with B-ALL from TARGET (B). Box plots are colored by ALL subtype. The BCR-ABL and MLL subtypes had 3 and no samples, respectively, so they were excluded from the box plot. Sample sizes: [TCF3-PBX1]: 7; Timomia 4-10: 10; [ETV6-RUNX1]: 10.
  • FIG. 8 Comparison of clinical features based on AL133346.1 expression in pediatric B-ALL patients from the TARGET dataset. FDR-adjusted p-values from Fisher's exact test are shown. Abbreviations: Chr: Chromosome; CNS: Central Nervous System; CNS 1 means no pathological involvement in the CNS, CNS 2 a very low level, and CNS 3 a very high level of involvement; NA: Not Available; MLL: MLL gene, t(12;21): translocation(12;21); t(1 ;19): translocation(1 ;19); t(9;22): translocation(9;22); (+): Positive; (-): Negative.
  • FIG. 9 Comparison of clinical features according to CCN2 expression in pediatric B-ALL patients from the TARGET dataset. Fisher's exact test FDR-adjusted p-values are shown. Abbreviations: Chr: Chromosome; CNS: central nervous system; CNS 1 means no CNS involvement, CNS 2 is very low level, and CNS 3 is defined CNS involvement; NA: not available; MLL: MLL gene; t (12; 21): translocation (12; 21); t (1; 19): translocation (1; 19); t (9; 22): translocation (9; 22); (+): Positive; (-): Negative.
  • FIG. 10 Kaplan-Meier overall survival curves of pediatric patients with B-ALL divided into two groups according to whether the expression of AL133346.1 was above or above the median: “AL133346.1 high” and “AL133346. 1 low”. P-value from Cox univariate analyzes is shown.
  • the inventors identified 48 incRNAs (long non-coding RNAs) that were differentially expressed between pediatric B-ALL and healthy bone marrow samples.
  • GenBank: SEQ ID 1 or SEQ AL133346.1 is identified with GenBank: AL133346.1 [https://www.ncbi.nlm.nih.gOv/nuccore/AL133346.1] while SEQ ID 2, or SEQ CCN2 is identified with GenBank ID: 1490
  • a first aspect of the invention is related to the use of mRNA and long non-coding RNA (IncRNA) in medicine. Particularly with the use of the RNAInc AL133346.1 and the mRNA CCN2 in medicine.
  • the invention specifically describes a method for using mRNA for the diagnosis of pediatric B-cell acute lymphoblastic leukemia, in which the mRNA is a long non-coding RNA (RNAInc), and more specifically the RNAInc AL133346.1, which is used as a biomarker. for the diagnosis of pediatric B-cell acute lymphoblastic leukemia.
  • RNAInc long non-coding RNA
  • AL133346.1 RNAInc AL133346.1
  • other mRNAs are also used as markers for the diagnosis of pediatric B-cell acute lymphoblastic leukemia, and more specifically the CCN2 mRNA.
  • a preferred embodiment relates to the use of AL133346.1 and CCN2 for the diagnosis, prognosis, prevention, amelioration, alleviation or treatment of pediatric B-cell acute lymphoblastic leukemia.
  • Another aspect of the invention is related to an in vitro method for obtaining useful data for the diagnosis, prognosis of pediatric B-cell acute lymphoblastic leukemia and classification of individuals into a) individuals at high risk of developing acute lymphoblastic leukemia of pediatric B-cell b) individuals at low risk for pediatric B-cell acute lymphoblastic leukemia, comprising: i) obtaining an isolated biological sample from an individual, and
  • RNAInc AL133346.1 expressed in the sample i) quantify the amount of RNAInc AL133346.1 expressed in the sample.
  • the in vitro method comprises the following step: iii) quantify the amount of one or more mRNAs present in the sample, and more specifically the CCN2 mRNA.
  • the in vitro method of the invention compares the expression products obtained in steps (ii) and (iii) with a control reference.
  • Another aspect of the invention refers to a method for the diagnosis, prognosis and classification of individuals that comprises the previous steps (i) - (iii) and that also includes assigning an individual from step (i) to the group of individuals with high risk of having pediatric B-cell acute lymphoblastic leukemia when the expression levels of AL133346.1, AL133346.1 and other mRNAs, or AL133346.1 and CCN2 are higher compared to a reference level.
  • Steps (ii) and/or (iii) of the methods described above may be fully or partially automated, for example by robotic sensing equipment to detect quantity in step (ii) or computerized comparison in step ( iii).
  • An “isolated biological sample” includes, but is not limited to, cells, tissues, and/or biological fluids of an organism, obtained by any method known to one of skill in the art.
  • the term “individual” does not is not intended to be limiting in any way; You can be of any age, sex or physical condition.
  • expression product also called “gene product” refers to the biochemical material, either RNA or protein, resulting from the expression of a gene. Sometimes a measure of the amount of gene product is used to infer how active a gene is.
  • the detection of the expression product is performed by at least one of the methods selected from: HPLC (high performance liquid chromatography), LC/MS (liquid chromatography coupled to mass spectrometry), ELISA, DAS ELISA, protein immunoprecipitation, immunoelectrophoresis, Western Blot, protein immunostaining, Northern Blot, reverse transcription PCR (RT-PCR), quantitative PCR (q-PCR), RIA (radioimmunoassay), in situ hybridization, nuclease protection assay, sequencing microarrays, immunocytochemical or immunohistochemical techniques, genomic DNA microarrays, protein microarrays, messenger RNA microarrays, cDNA microarrays, peptide microarrays, tissue microarrays, cell or transfection microarrays, antibody microarrays, lysate or serum microarrays, microarrays of reverse phase proteins, peptide microarrays or genotyping microarrays.
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • LC/MS liquid
  • the detection of the expression products SEQ AL133346.1 and SEQ CCN2 is carried out by means of quantitative RT-PCR.
  • kits or devices for the diagnosis of pediatric B-cell acute lymphoblastic leukemia that comprises all the elements necessary to detect the expression levels of mRNA of RNAInc 133346.1 and/or CCN2.
  • kits The necessary elements for the kit described in the preceding claim could be all the primers, probes and/or antibodies capable of detecting and quantifying the amounts of mRNA expressed using the quantitative RT-PCR technique.
  • the kit can include all the necessary supports and containers for commissioning and optimization.
  • the kit also comprises instructions for carrying out the methods of the invention.
  • kit or device of the invention which comprises primers, probes and/or antibodies capable of quantifying and detecting the expression products of RNAInc AL133346.1 and CCN2:
  • the primers are oligonucleotide sequences between 10 and 30 base pairs, more preferably between 15 and 25 base pairs, even more preferably between 18 and 22 base pairs, and even more preferably around 20 base pairs, which have an identity of at least 80%, more preferably at least 90%, even more preferably at least 95%, even more preferably at least 98%, and particularly 100%, with a fragment of the complementary sequence of AL133346 .1 ,
  • the probes are oligonucleotide sequences between 30 and 1100 base pairs, more preferably between 100 and 1000 base pairs, and even more preferably between 150 and 500 base pairs, which have an identity of at least 80%, more preferably at least 90%, even more preferably at least 95%, even more preferably at least 98%, and particularly 100%, with a fragment of the sequences complementary to CCN2
  • kits of the invention for the diagnosis, prognosis of pediatric B-cell acute lymphoblastic leukemia and classification of individuals in a) individuals with high risk of suffering from pediatric B-cell acute lymphoblastic leukemia b) people with low risk of developing pediatric B-cell acute lymphoblastic leukemia,
  • Another aspect of the invention relates to computer readable storage media comprising program instructions capable of causing a computer to perform the steps of any of the methods of the invention.
  • the invention also extends to computer programs adapted so that any processing means can carry out the methods of the invention.
  • Such programs may take the form of source code, object code, intermediate source code, and object code, for example, as partially compiled, or in any other form suitable for use in implementing the processes according to the invention.
  • Computer software also encompasses cloud applications based on this procedure.
  • the invention encompasses computer programs disposed on or within a carrier.
  • the operator can be any entity or device capable of supporting the program.
  • the carrier may be comprised of such cable or other device or medium.
  • the carrier could be an integrated circuit in which the program is included, the integrated circuit being adapted to execute, or to be used in the execution of, the corresponding processes.
  • the programs could be embedded in a storage medium, such as a ROM, a CD ROM or semiconductor ROM, a USB stick, or a magnetic recording medium, such as a floppy disk or disk. lasted.
  • the programs could be supported by a transmittable carrier signal.
  • it could be an electrical or optical signal that could be carried through an electrical or optical cable, by radio, or by any other means.
  • the invention also extends to computer programs adapted so that any processing means can carry out the methods of the invention.
  • Such programs may take the form of source code, object code, an intermediate source code, and object code, for example, as in partially compiled form, or in any other form suitable for use in implementing the processes according to the invention.
  • Computer software also encompasses cloud applications based on this procedure.
  • Another aspect of the invention relates to a computer-readable storage medium comprising program instructions capable of causing a person to carry out the steps of any of the methods of the invention.
  • Another aspect of the invention relates to a transmittable signal comprising program instructions capable of causing a computer to carry out the steps of any of the methods of the invention.
  • oligonucleotide and “nucleic acid” are used interchangeably herein, referring to polymehc forms of nucleotides of any length, both hbonucleotides (RNA or RNA) and deoxyhbonucleotides (DNA or DNA).
  • amino acid sequence referring to polymehc forms of nucleotides of any length, both hbonucleotides (RNA or RNA) and deoxyhbonucleotides (DNA or DNA).
  • amino acid sequence amino acid sequence
  • peptide oligopeptide
  • polypeptide polypeptide
  • protein protein
  • RNAIncs Differentially expressed mRNAs between tumor and normal samples were obtained from those with a false discovery rate (FDR) ⁇ 0.05 and a expression increment in absolute value (fold change) > 1.5 times.
  • FDR false discovery rate
  • a expression increment in absolute value (fold change) > 1.5 times was then performed hierarchical clustering based on Spearman's correlation coefficient to identify mRNA and incRNA expression patterns between tumor and healthy bone marrow samples.
  • Clinical data associated with ALL patients from the TARGET project were downloaded from the NCI-TARGET (Therapeutically Applicable Research To Generate Effective Treatments) repository (https://target-data.nci.nih.gov/Public/ALL/clinical/ ).
  • NCI-TARGET Therapeutically Applicable Research To Generate Effective Treatments
  • IncRNAs overexpressed in pediatric B-ALL were XLOC_007191 ( ⁇ 7-fold), PCNA-AS1 ( ⁇ 7-fold), and AL133346.1 ( ⁇ 6-fold), while downregulated were RP11-807H22.6 ( ⁇ 14-fold) , CXCR2P1 ( ⁇ 6-fold), and BC127858 ( ⁇ 4-fold) (Figure 2a).
  • TCGA Cancer Genome Atlas
  • TARGET-ALL-P1 and TARGET-ALL-P2 The Cancer Genome Atlas
  • the TARGET population consisted of 320 patients (120 B-ALL and 200 T-ALL).
  • the incRNAs can regulate the expression of the mRNAs by several mechanisms, which can result in a significant pattern of correlation between the expression of the incRNA and the associated mRNA [29].
  • our research group reported that there was a strong correlation between AL133346.1 and CCN2 mRNA levels in external data from three microarray studies with pediatric patients with B-ALL [21],
  • AL133346.1 and CCN2 are located on chromosome 6 (q23.2) on different chains. Both genes are oriented head-to-head, partially overlapping, and their transcription start sites are 2,770 bp apart. According to the GeneHancer database [33], which integrates information on transcriptional promoters and enhancers from different databases, AL133346.1 and CCN2 share two of their high-scoring predicted promoters/enhancers: GH06J131946 and GH06J131976 ( Figure 4). These two transcriptional enhancers are classified as high probability enhancers (noted "elite”) and show a strong enhancer-gene association.
  • elite high probability enhancers
  • CCN2 belongs to the Cellular Communication Network (CCN) family of proteins. This family of extracellular matrix-associated proteins is characterized by having four conserved cysteine-rich domains and is involved in intercellular signaling [35]. In hematopoietic neoplasms, the CCN family plays an important role in the differentiation of hematopoietic stem cells ( HSC) and mesenchymal stem cells [36], The prognostic value of the CCN family of proteins varies in different hematological neoplasms [36], According to their results, several studies significantly correlated the expression of CCN2 with a higher overall survival in lymphomas treated with chemotherapy [37,38]. However, more specific studies in pediatric B-ALL are needed to determine if the expression levels of CCN2 could influence the treatment outcome of the patient.
  • CCN Cellular Communication Network
  • IncRNA lincNMR regulates nucleotide metabolism via a YBX1 - RRM2 axis in cancer. Nat Commun. 2020 June 25; 11(1):3214. DOI: 10.1038/s41467-020-17007-9.
  • RNA LINC00467 facilitates the progression of acute myeloid leukemia by targeting the miR-339/SKI pathway. Leuk Lymphoma. 2020 Oct 15; 1-10. DOI: 10.1080/10428194.2020.1832667.
  • Kang, H.; et al. Gene expression classifiers for relapse-free survival and minimal residual disease improve risk classification and outcome prediction in pediatric B-precursor acute lymphoblastic leukemia. Blood. 2010; 115(7), 1394-1405. DOI: 10.1182/blood-2009-05-218560.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

La presente invención describe el uso del lncRNA AL133346.1, combinado o no con mRNAs, para el diagnóstico, pronóstico, prevención, mejora, alivio o tratamiento de leucemia linfoblástica aguda de células B pediátrica y métodos, kits y dispositivos basados en dicho uso.

Description

BIOMARCADORES PARA EL DIAGNÓSTICO, PROGNOSIS, PREVENCIÓN, MEJORA O ALIVIO EN EL TRATAMIENTO DE LA LEUCEMIA LINFOBLÁSTICA AGUDA DE CÉLULAS B PEDIÁTRICA
CAMPO TÉCNICO
La presente invención pertenece al campo de la medicina clínica y, más específicamente, al diagnóstico, pronóstico, prevención, mejora, alivio o tratamiento del cáncer.
El objeto principal de la presente invención está relacionado con el uso de RNA no codificante largo (IncRNA o RNAInc), particularmente el LNCRNA AL133346., y de mRNA (o RNAm), en particular del mRNA CCN2, como biomarcadores en el diagnóstico, pronóstico, mejora, alivio o tratamiento de la leucemia linfoblástica aguda de células B pediátrica, así como métodos, kits y dispositivos basados en dicho uso.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La leucemia linfoblástica aguda (LLA) es la neoplasia maligna infantil más común. La leucemia linfoblástica aguda de células B pediátrica (LLA-B) constituye una neoplasia heterogénea y agresiva en la que se requieren nuevas terapias dirigidas. En los últimos años, nuevas técnicas genómicas y transcriptómicas han acelerado el descubrimiento y la identificación de vahos tipos de RNA no codificantes (ncRNA) que pueden desempeñar un papel importante en la biología celular [7-10], Los ncRNA largos (IncRNA) son transcripciones de más de 200 pb que carecen de capacidad de codificación de proteínas. Los IncRNA son reguladores cruciales de la expresión génica debido a su participación en las modificaciones postranschpcionales de los mRNA, incluido el empalme, la edición, el tráfico, la traducción y la degradación [11 , 12],
La desregulación de los IncRNA se ha descrito en numerosas enfermedades humanas, incluido el cáncer [13-17], Esta desregulación se ha asociado a fenotipos oncogénicos o o supresores de tumores [18], Sin embargo, pocos IncRNA se han relacionado directamente con el desarrollo de la leucemia. En la leucemia mieloide aguda (LMA), la leucemia linfocítica crónica (LLC) y el mieloma múltiple (MM), se ha observado una desregulación de HOTAIR, y sus niveles elevados de expresión se asoció con una supervivencia menor en pacientes con LMA [19], En la LMA t (8; 21) positiva, asociada con un buen pronóstico, la sobreexpresión de CCAT 1 y PVT 1 se correlacionó con un pronóstico desfavorable [20], Aún es menor el número de estudios que han analizado la expresión de los IncRNA en pacientes pediátricos con LLA-B. Recientemente, la expresión de TCL6 se ha asociado con la LLA-B pediátrica ETV6-RUNX1-positiva. Asimismo, pacientes que expresaron niveles de expresión bajos de TCL6 tuvieron una supervivencia libre de enfermedad más baja que aquellos pacientes que expresaron niveles altos de TCL6 [21], En otro estudio basado en microarrays, los niveles de expresión de BALR-2 estaban relacionados con: (i) anomalías citogenéticas como t (12; 21) [ETV6 / RUNX1], t (1 ; 19) [TCF3 / PBX1] y MLL -reorganizado; (¡i) subtipos de enfermedades; y (iii) supervivencia de los pacientes con LLA-B [22], Curiosamente, estos estudios y otros han demostrado que los perfiles de expresión de IncRNA pueden distinguir a nivel molecular distintos subtipos de leucemia [23-28],
A pesar de todos los perfiles de expresión de RNAInc ya descritos, aún no se ha identificado una firma consenso de RNAInc clínicamente relevante para LLA_B pediátrica. La identificación de una firma de RNAInc expresados diferencialmente y sus genes codificadores de proteínas asociados en la LLA-B pediátrica podría conducir a un mejor diagnóstico, a una mejor comprensión de la enfermedad y, en última instancia, a un mejor pronóstico para los pacientes.
Previamente, nuestro grupo de investigación desarrolló un estudio comparativo de los perfiles de expresión de RNAInc de LLA-B pediátrica con y sin la fusión génica ETV6- RUNX1 (Gene Expression Omnibus Accession GSE128254). La expresión elevada del RNAInc TCL6 se asoció con la LLA-B pediátrica ETV6-RUNX1 -positiva y con una mejor supervivencia libre de enfermedad, incluso dentro del subtipo positivo para ETV6- RUNX1 [21], En este trabajo, hemos realizado un estudio comparativo de los perfiles de IncRNA de pacientes pediátricos de LLA-B versus muestras normales, así como cohortes externas independientes.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1. Heatmap de los RNAIncs expresados diferencialmente en LLA-B vs médula ósea sana. En la parte superior del heatmap, las muestras LLA-B ETV6-RUNX1- negativas aparecen en color azul, las muestras LLA-B ETV6-RUNX1 -positivas aparecen en color rojo, y las médulas óseas sanas aparecen en color verde. La agrupación fue realizada en base al coeficiente de correlación de Spearman.
Figura 2. Volcano plot de los RNAIncs (A) y los genes codificantes de proteínas (B) expresados diferencialmente, en muestras pediátriccas de LLA-B vs. médula ósea sana. La línea discontinua horizontal representa un umbral FDR = 0.05. La línea discontinua vertical representa un umbral “fold change” = -1 ,5 y 1 ,5. Los puntos rojos representan los RNAIncs expresados diferencialmente de forma estadísticamente significativa.
Figura 3. Comparación de la expresión de AL133346.1/CCN2 entre muestras pediátricas LLA-B y LLA-T procedentes de los repositorios TARGET (a) y CCLE (b). Los gráficos de dispersión se encuentran coloreados en función del subtipo de LLA. Los tamaños de muestras y la correlación de expresión génica son: TARGET: 120 LLA-B (Coeficiente de correlación de Spearman = 0.717, p < 0.0001) vs. 200 LLA-T (Coeficiente de correlación de Spearman = 0.099, p = 0.163). CCLE: 14 LLA-B (Coeficiente de correlación de Spearman = 0.799, p = 0.001) vs. 16 LLA-T (No disponible).
Figura 4. Localización genómica de AL133346.1/CCN2 en el cromosoma 6. El cuadrado con rayas discontinuas representa un aumento de zoom en el locus. Se muestran todos los exones de CCN2, mientras que solo se incluye el primer exón de AL133346.1. Las regiones reguladoras GH06J131946 y GH06J131976 están representadas mediante cuadrados rojos.
Figura 5. Curvas de supervivencia general Kaplan-Meier de los pacientes LLA-B divididos en dos grupos según si la expresión de RNAm de CCN2 se encontraba por encima o por debajo de la mediana: “CCN2 high” y “CCN2 low”. Se muestran los p-valores del análisis univariable Cox.
Figura 6. Análisis Gene Ontology (GO) de los RNAms asociados con los RNAIncs expresados diferencialmente entre muestras pediátricas de LLA-B y médulas óseas sanas. Se muestran los términos GO regulados al alza (a) y a la baja (b) significativamente enriquecidos. Se incluyen únicamente los términos GO no redundantes tal como se describe en los Métodos. Figura 7. Comparación de la expresión de AL133346.1 y CCN2 entre los diferentes cariotipos de pacientes pediátricos con LLA-B del microarray (A) y los diferentes subtipos de pacientes pediátricos con LLA-B de TARGET (B). Los diagramas de caja están coloreados según el subtipo de LLA. Los subtipos BCR-ABL y MLL tenían 3 y ninguna muestra respectivamente, por lo que fueron excluidos del diagrama de cajas. Tamaños de muestra: [TCF3-PBX1]: 7; Tñsomía 4-10: 10; [ETV6-RUNX1]: 10.
Figura 8. Comparación de las características clínicas según la expresión de AL133346.1 en pacientes pediátricos con LLA-B del conjunto de datos de TARGET. Se muestran los p-valores ajustados por FDR del test exacto de Fisher. Abreviaciones: Chr: Cromosoma; CNS: Sistema Nervioso Central; CNS 1 significa ninguna implicación patológica en el CNS, CNS 2 un nivel muy bajo, and CNS 3 un nivel de implicación muy alto; NA: No Disponible; MLL: gen MLL, t(12;21): translocación(12;21); t(1 ;19): translocación(1 ;19); t(9;22): translocación(9;22); (+): Positivo; (-): Negativo.
Figura 9. Comparación de las características clínicas de acuerdo con la expresión de CCN2 en pacientes pediátricos con LLA-B del conjunto de datos TARGET. Se muestran los valores p ajustados por FDR del test exacto de Fisher. Abreviaturas: Chr: Cromosoma; SNC: sistema nervioso central; El SNC 1 significa que no hay afectación del SNC, el SNC 2 es un nivel muy bajo y el SNC 3 es una afectación definida del SNC; NA: no disponible; MLL: gen MLL; t (12; 21): translocación (12; 21); t (1 ; 19): translocación (1 ; 19); t (9; 22): translocación (9; 22); (+): Positivo; (-): Negativo.
Figura 10. Curvas de supervivencia global de Kaplan-Meier de pacientes pediátricos con LLA-B divididos en dos grupos según si la expresión de AL133346.1 estaba por encima o por encima de la mediana: “AL133346.1 alto” y “AL133346.1 bajo”. Se muestra el valor p de los análisis univariados de Cox.
Figura 11. Curvas de supervivencia global de Kaplan-Meier de pacientes pediátricos con LLA-T divididos en dos grupos según si la expresión de AL133346.1 (a) y CCN2 (b) no era nula o nula: “AL133346.1 alta”, “AL133346 .1 bajo ”,“ CCN2 alto ”y“ CCN2 bajo ”. Se muestran los valores p del análisis univahado de Cox. DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
Los inventores identificaron 48 RNAInc (RNA no codificante largo) que se expresaron diferencialmente entre LLA-B pediátrica y muestras de médula ósea sana. El par RNAInc/RNAm más relevante fue AL133346.1/CCN2 (anteriormente conocidos como RP11-6918.3/CTGF), cuya expresión se correlacionó positivamente y aumentó en las muestras de LLA-B. Su patrón de expresión diferencial y su fuerte correlación se validaron en datos externos de LLA-B del repositorio The Cancer Genome Atlas (TCGA). El análisis de la curva de supervivencia demostró que los pacientes con niveles de expresión de RNAm "high" de CCN2 tenían una supervivencia general más alta que aquellos con niveles "low" (p = 0,042), de modo que este gen podría ser un biomarcador pronóstico independiente en LLA-B pediátrica. Estos hallazgos muestran una de las primeras descripciones detalladas de los perfiles de expresión de IncRNA en LLA-B pediátrica e indican que estos biomarcadores potenciales podrían ayudar en la clasificación de subtipos de leucemia y que la expresión de CCN2 podría predecir la supervivencia de los pacientes con leucemia linfoblástica aguda de células B pediátrica.
Las secuencias fueron definidas previamente y están disponibles en Genbank: SEQ ID 1 o SEQ AL133346.1 se identifica con GenBank: AL133346.1 [https://www.ncbi.nlm.nih.gOv/nuccore/AL133346.1] mientras que SEQ ID 2, o SEQ CCN2 se identifica con GenBank ID: 1490
[https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/7terrr l490].
Así, un primer aspecto de la invención está relacionado con el uso de RNAm y de RNA no codificante largo (IncRNA) en medicina. Particularmente con el uso del RNAInc AL133346.1 y el RNAm CCN2 en medicina.
La invención describe específicamente un método para usar RNAm para el diagnóstico de leucemia linfoblástica aguda de células B pediátrica, en el cual el RNAm es un RNA largo no codificante (RNAInc), y más específicamente el RNAInc AL133346.1 , que se usa como biomarcador para el diagnóstico de leucemia linfoblástica aguda de células B pediátrica. En este caso, junto con el RNAInc AL133346.1 , se utilizan otros RNAm también como marcadores para el diagnóstico de leucemia linfoblástica aguda de células B pediátrica, y más específicamente el RNAm CCN2. Una realización preferida se refiere al uso de AL133346.1 y CCN2 para el diagnóstico, pronóstico, prevención, mejora, alivio o tratamiento de la leucemia linfoblástica aguda de células B pediátrica.
Otro aspecto de la invención se relaciona con un método in vitro para la obtención de datos útiles para el diagnóstico, pronóstico de la leucemia linfoblástica aguda de células B pediátrica y clasificación de los individuos en a) individuos con alto riesgo de padecer leucemia linfoblástica aguda de células B pediátrica b) individuos con bajo riesgo de padecer leucemia linfoblástica aguda de células B pediátrica, que comprende: i) obtener una muestra biológica aislada de un individuo, y
¡i) cuantificar la cantidad del RNAInc AL133346.1 expresada en la muestra.
Adicionalmente, el método in vitro comprende incluye el siguiente paso: iii) cuantificar la cantidad de uno o más RNAm presentes en la muestra, y más específicamente el RNAm CCN2.
En otra realización particular, el método in vitro de la invención compara los productos de expresión obtenidos en las etapas (¡i) y (iii) con una referencia control.
Otro aspecto de la invención se refiere a un método para el diagnóstico, pronóstico y clasificación de individuos que comprende los pasos previos (i) - (iii) y que además incluye asignar un individuo del paso (i) al grupo de individuos con alto riesgo de padecer de leucemia linfoblástica aguda de células B pediátricas cuando los niveles de expresión de AL133346.1 , de AL133346.1 y otros RNAm, o AL133346.1 y CCN2 son más altos en comparación con un nivel de referencia.
Los pasos (¡i) y/o (iii) de los métodos descritos anteriormente pueden automatizarse total o parcialmente, por ejemplo, mediante un equipo sensor robótico para detectar la cantidad en el paso (¡i) o la comparación computarizada en el paso (iii).
Una "muestra biológica aislada" incluye, pero no se limita a, células, tejidos y/o fluidos biológicos de un organismo, obtenidos mediante cualquier método conocido por un experto en la técnica.
El término "individuo", como se usa en la descripción, se refiere a animales, preferiblemente mamíferos, y más preferiblemente humanos. El término "individuo" no pretende ser limitante en ningún aspecto; puede ser de cualquier edad, sexo o condición física.
El término "producto de expresión", también llamado "producto génico", se refiere al material bioquímico, ya sea RNA o proteína, resultante de la expresión de un gen. A veces, se usa una medida de la cantidad de producto génico para inferir cómo de activo se encuentra un gen.
En una realización particular, la detección del producto de expresión se realiza mediante al menos uno de los métodos seleccionados entre: HPLC (cromatografía líquida de alta resolución), LC/MS (cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas), ELISA, DAS ELISA, inmunoprecipitación de proteínas, inmunoelectroforesis, Western Blot, inmunotinción de proteínas, Northern Blot, PCR de transcripción inversa (RT-PCR), PCR cuantitativa (q-PCR), RIA (radioinmunoensayo), hibridación in situ, ensayo de protección de nucleasas, secuenciación masiva, técnicas inmunocitoquímicas o inmunohistoquímicas, microarrays de DNA genómico, microarrays de proteínas, microarrays de RNA mensajero, microarrays de DNAc, microarrays de péptidos, micorarrays de tejidos, microarrays de células o transfección, microarrays de anticuerpos, microarraysde lisado o suero, microarrays de proteínas de fase reversa, microarrays de péptidos o microarrays de genotipado.
En otra realización particular, la detección de los productos de expresión SEQ AL133346.1 and SEQ CCN2 se lleva a cabo mediante RT-PCR cuantitativa.
KIT O DISPOSITIVO DE LA INVENCIÓN
Otro aspecto de la invención es un kit o dispositivo para el diagnóstico de leucemia linfoblástica aguda de células B pediátrica que comprende todos los elementos necesarios para detectar los niveles de expresión de RNAm del RNAInc 133346.1 y/o CCN2.
Los elementos necesarios para el kit descrito en la reivindicación anterior podrían ser todos los cebadores, sondas y/o anticuerpos capaces de detectar y cuantificar las cantidades de RNAm expresadas usando la técnica de RT-PCR cuantitativa. Además, el kit puede incluir todos los soportes y contenedores necesarios para la puesta en marcha y optimización. Preferiblemente, el kit también comprende instrucciones para realizar los métodos de la invención.
En una realización particular, el kit o dispositivo de la invención, que comprende cebadores, sondas y/o anticuerpos capaces de cuantificar detectan los productos de expresión de RNAInc AL133346.1 y de CCN2:
- los cebadores son secuencias de oligonucleótidos de entre 10 y 30 pares de bases, más preferiblemente entre 15 y 25 pares de bases, incluso más preferiblemente entre 18 y 22 pares de bases, y aún mucho más preferiblemente alrededor de 20 pares de bases, que tienen una identidad de al menos 80% , más preferiblemente de al menos 90%, incluso más preferiblemente de al menos 95%, aún mucho más preferiblemente de al menos 98%, y particularmente 100%, con un fragmento de la secuencia complementaria de AL133346.1 ,
- las sondas son secuencias de oligonucleótidos de entre 30 y 1100 pares de bases, más preferiblemente entre 100 y 1000 pares de bases, e incluso más preferiblemente entre 150 y 500 pares de bases, que tienen una identidad de al menos 80%, más preferiblemente al menos 90%, incluso más preferiblemente al menos 95%, aún mucho más preferiblemente al menos 98%, y particularmente 100%, con un fragmento de las secuencias complementarias a CCN2
Otro aspecto se refiere al uso del kit de la invención para el diagnóstico, pronóstico de leucemia linfoblástica aguda de células B pediátrica y clasificación de los individuos en a) individuos con alto riesgo de padecer leucemia linfoblástica aguda de células B pediátrica b) personas con bajo riesgo de padecer leucemia linfoblástica aguda de células B pediátrica,
INVENCIÓN IMPLEMENTADA EN ORDENADOR
Otro aspecto de la invención se refiere a medios de almacenamiento legibles por computadora que comprenden instrucciones de programa capaces de hacer que una computadora realice los pasos de cualquiera de los métodos de la invención.
La invención también se extiende a programas de ordenador adaptados para que cualquier medio de procesamiento pueda realizar los métodos de la invención. Dichos programas pueden adoptar la forma de código fuente, código objeto, una fuente intermedia de código y código objeto, por ejemplo, como en forma parcialmente compilada, o en cualquier otra forma adecuada para su uso en la implementación de los procesos según la invención. Los programas informáticos también abarcan aplicaciones en la nube basadas en este procedimiento.
En particular, la invención abarca programas informáticos dispuestos en o dentro de un soporte. El operador puede ser cualquier entidad o dispositivo capaz de respaldar el programa. Cuando el programa está incorporado en una señal que puede ser transportada directamente por un cable u otro dispositivo o medio, el portador puede estar compuesto por dicho cable u otro dispositivo o medio. Como vahante, el portador podría ser un circuito integrado en el que se incluya el programa, estando adaptado el circuito integrado para ejecutar, o para ser utilizado en la ejecución de los procesos correspondientes.
Por ejemplo, los programas podrían estar incrustados en un medio de almacenamiento, como una ROM, un CD ROM o una ROM de semiconductores, una memoria USB o un medio de grabación magnético, por ejemplo, un disquete o un disco. Durado. Alternativamente, los programas podrían apoyarse en una señal portadora transmisible. Por ejemplo, podría ser una señal eléctrica u óptica que podría ser transportada a través de un cable eléctrico u óptico, por radio o por cualquier otro medio.
La invención también se extiende a programas de ordenador adaptados para que cualquier medio de procesamiento pueda realizar los métodos de la invención. Dichos programas pueden adoptar la forma de código fuente, código objeto, una fuente intermedia de código y código objeto, por ejemplo, como en forma parcialmente compilada, o en cualquier otra forma adecuada para su uso en la implementación de los procesos según la invención. Los programas informáticos también abarcan aplicaciones en la nube basadas en este procedimiento.
Por tanto, otro aspecto de la invención se refiere a un medio de almacenamiento legible por ordenador que comprende instrucciones de programa capaces de hacer que un lleve a cabo los pasos de cualquiera de los métodos de la invención.
Otro aspecto de la invención se refiere a una señal transmisible que comprende instrucciones de programa capaces de hacer que una computadora lleve a cabo los pasos de cualquiera de los métodos de la invención.
Los términos "oligonucleótido" y "ácido nucleico" se usan indistintamente en este documento, refiriéndose a formas poliméhcas de nucleótidos de cualquier longitud, tanto hbonucleótidos (RNA o RNA) como desoxirhbonucleótidos (DNA o DNA). Los términos "secuencia de aminoácidos", "péptido", "oligopéptido", "polipéptido" y "proteína" se utilizan indistintamente en el presente documento y se refieren a una forma polimérica de aminoácidos de cualquier longitud, que puede ser codificante o no codificante modificado química o bioquímicamente.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones, la palabra "comprende" y sus vanantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la técnica, otros objetos, ventajas y características de la invención surgirán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención.
Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración y no pretenden limitar la presente invención.
EJEMPLOS DE LA INVENCIÓN
Materiales y métodos
A menos que se especifique lo contrario, todos los análisis se realizaron utilizando R (versión 4.0.1) y Bioconductor (versión 3.11).
Análisis estadístico
La normalización de los datos continuos se evaluó mediante los gráficos Q-Q y el test de Shapiro-Wilk. Para los datos normales, se obtuvo la media y la desviación estándar, y se realizaron pruebas t de Student de dos colas tras verificar la igualdad de las varianzas. Para los datos no normales, se obtuvo la mediana y los cuartiles, y se aplicaron pruebas de suma de rangos de Wilcoxon bilateral. Se realizaron ajustes de comparaciones múltiples utilizando el método Benjamini-Hochberg para los casos aplicables.
Análisis de los datos de microarray
Los valores de expresión génica sin procesar y normalizados para cada muestra en el análisis de nuestro estudio previo de microarray [21] están disponibles públicamente en Gene Expression Omnibus (GSE128254). Los métodos para el procesamiento de muestras, la hibridación de microarrays y el análisis de los datos se explican de forma detallada en la sección “Preprocesamiento de datos y análisis de expresión diferencial” de los Métodos Suplementarios de la publicación original [21], Los RNAIncs/RNAms diferencialmente expresados entre muestras tumorales y normales se obtuvieron de aquellos que presentaban una tasa de descubrimiento falso (FDR) < 0,05 y un incremento de expresión en valor absoluto (fold change) > 1 ,5 veces. Luego, realizamos un agrupamiento jerárquico basado en el coeficiente de correlación de Spearman para identificar los patrones de expresión de RNAm y RNAInc entre el tumor y las muestras de médula ósea sana.
Análisis Gene Ontology
Realizamos un análisis Gene Ontology para identificar rutas biológicas, funciones moleculares o componentes celulares significativamente enriquecidas relacionados con los RNAIncs expresados diferencialmente identificados en el análisis de microarray entre muestras tumorales y normales (FDR < 0,05, fold change (absoluto) > 1.5). Los genes codificantes de proteínas asociados a los pares RNAInc/RNAm expresados diferencialmente fueron predichos por el fabricante del microarray basándose en su proximidad genómica, uniones de RNAmi predichas y la literatura científica, tal como se describe en “Diseño de microarrays y regulación predicha entre RNAIncs y genes codificantes de proteínas” de los Métodos Suplementarios de la publicación original [21]. Usando estas predicciones, realizamos el análisis Gene Ontology de la siguiente manera: i. Encontrando los RNAIncs importantes regulados al alza o a la baja en nuestro análisis de LLA-B pediátrica frente a médula ósea sana. Analizamos los RNAIncs regulados al alza o a la baja de manera separada.
¡i. Usando las predicciones de RNAInc/RNAm, encontrando los RNAms que se predijeron que estaban asociados con los RNAIncs seleccionados. iii. Introducir la lista de RNAms en el programa Enhchr [39,40] para encontrar términos ontológicos de genes enriquecidos de forma significativa. iv. Simplificar los términos de la ontología genética utilizando el programa ReviGO [41] con los parámetros predeterminados y proporcionando los valores de FDR para cada término GO.
Análisis de conjuntos de datos externos
Descargamos los datos de expresión génica de los pacientes con LLA del portal de datos Genomic Data Commons (Proyecto TARGET, última actualización 6 Junio 2020; N = 506). Los datos fueron descargados utilizando el paquete de R TCGABiolinks (v2.16.0). En el caso de las muestras procedentes del mismo paciente, se descartaron aquellas con un menor tamaño de librería (N = 477). Para los datos de expresión, las lecturas crudas por gen fueron normalizadas utilizando el método TMM. Posteriormente, estos valores fueron transformados a Iog2 (lecturas por millón) mediante el paquete de R edgeR (v3.30.3). Para el análisis de supervivencia, los pacientes mayores de 14.99 años fueron filtrados (N = 321). Así, se obtuvo la población que presentaba el subtipo B (N = 120) y el subtipo T (N = 200) para el análisis completo. En este caso, la población del subtipo B consistía en muestras pre-B (112/120, 93,33%) y muestras B (8/120, 6,67%), mientras que la población que presentaba el subtipo T mostraba únicamente muestras T.
Adicionalmente, descargamos los datos externos de expresión génica para las líneas celulares LLA procedentes del repositorio Cancer Cell Line Encyclopedia (https://portals.broadinstitute.org/ccle/data). Se descargaron los datos de expresión génica normalizados en valores TPM procedentes del repositorio de dicha base de datos (version 2019-09-29, N = 1019). Gracias a la información sobre las líneas celulares disponible en el portal DepMap, se seleccionaron las líneas celulares LLA-B (N = 14) y LLA-T (N = 16). Los datos de expresión génica normalizados fueron transformados a la escala logarítmica Iog2 para los siguientes análisis. Estos últimos datos ya transformados se utilizaron para obtener la información de la expresión génica de ALL133346.1 y CCN2.
Los datos descargados de ambas bases de datos fueron utilizados para la comparación de la expresión génica entre ambos subtipos mencionados y para estudiar la correlación del RNAInc/RNAm usando el coeficiente de correlación de Spearman.
Análisis de supervivencia
Los datos clínicos asociados a los pacientes con LLA procedentes del proyecto TARGET se descargaron del repositorio NCI-TARGET (Therapeutically Applicable Research To Generate Effective Treatments) (https://target-data.nci.nih.gov/Public/ALL/clinical/). Usamos los niveles de expresión de AL133346.1 y CCN2 de los datos de TARGET para analizar su correlación con la supervivencia general de los pacientes con LLA, considerando las muertes como eventos. Dividimos a los pacientes en dos grupos para ambos genes según sus niveles de expresión. Estas variables de expresión génica se dicotomizaron en subgrupos "Low" y "High" utilizando el valor de la mediana de la expresión génica como umbral para CCN2 y AL133346.1 para LLA-B. Estas variables se dicotomizaron en los mismos subgrupos mencionados si los valores de expresión eran nulos o no nulos para el subtipo T, respectivamente. La asociación entre las características clínicas y los grupos de expresión génica se midió utilizando la prueba exacta de Fisher. Representamos las curvas de Kaplan-Meier para los grupos de pacientes "Low" y “High" para ambos genes utilizando los paquetes de R survival (v3.1- 11) y survminer (vO.4.6), y la significancia se del análisis de midió usando el univariante prueba de rango logarítmico. Además, estudiamos el efecto de diferentes covariables clínicas sobre la supervivencia global de los pacientes realizando el test de rangos logarítmicos univariante. Las covariables clínicas que mostraron una p < 0,2 en el análisis univariante se utilizaron para una regresión de Cox multivariante.
Resultados
RNAInc expresados en LLA-B
Para determinar los perfiles de expresión de RNAInc en LLA-B pediátrica, comparamos los niveles de expresión de RNAInc en 42 muestras de pacientes pediátricos con LLA- B con 4 muestras de médula ósea sanaS (Figura 1), [42], A pesar de la heterogeneidad molecular de la LLA-B pediátrica, identificamos un perfil de expresión diferencial común que podría distinguir las muestras de LLA-B pediátrica de las muestras de médula ósea sanas. Estableciendo un fold change > 1 ,5 y FDR <0,05, identificamos 48 RNAInc que se expresaban de forma diferente entre todos los B-ALL muestras tumorales y sanas. De los 48, 20 estaban regulados al alza y 28 a la baja (Tabla de material suplementario 1 , en [42]). Los IncRNA sobreexpresados en la LLA-B pediátrica fueron XLOC_007191 (~ 7 veces), PCNA-AS1 (~ 7 veces) y AL133346.1 (~ 6 veces), mientras que los reprimidos fueron RP11-807H22.6 (~ 14 veces), CXCR2P1 (~ 6 veces) y BC127858 (~ 4 veces) (Figura 2a). CCN2 fue el cuarto gen codificador de proteínas sobreexpresado (logFC = 2,56, FDR = 3,0 ■ 10-6) (Figura 2b) [42],
Debido a la falta de anotación funcional de los IncRNA, para analizar las funciones biológicas de los RNAInc expresados diferencialmente entre LLA-B pediátrica y las muestras de médula ósea sana, realizamos un análisis de Ontología de los genes codificantes de proteínas asociados a los RNAInc expresados diferencialmente según el fabricante de microarrays. En el top de los términos de la Ontología de Genes sobreexpresados aparecían términos relacionados con la regulación de la angiogénesis (p = 0,019) (ANGPTL4, NF1 y TNFAIP3), reparación del DNA (p = 0,025) (PONA y UBE2V1) y la vía de transducción de señales de la proteína RAS. (p = 0,025) (NF1 , RAB4A y RAB11 B) (Figura 6a). Los términos de Ontología de Genes reprimidos incluían términos relacionados con la regulación negativa de la secreción de interleucina-1 (p = 7,36 ■ 10-5) (CARD17 y CARD18), la regulación de la respuesta al estímulo de daño del DNA (p = 6,20 ■ 10-4) (HMGA2 y FEM1 B) y la regulación del proceso apoptótico (p = 1.04 ■ 10-3) (ACTN1 , EPHA1 , HMGA2, JUN y NOTCH2) (Figura 6b). En conjunto, estos resultados sugieren una firma oncogénica general asociada con los perfiles de expresión de RNAInc/RNAm en LLA-B pediátrica en comparación con muestras de médula ósea sana.
Los niveles de expresión de AL133346.1/CCN2 están incrementados en LLA-B
Al comparar los perfiles de expresión de RNAInc/RNAm de los pacientes con LLA-B pediátrica vs. médulas óseas sanas, la pareja AL133346.1/CCN2 (anteriormente conocidos como RP11-6918.3/CTGF) presentó diferencias entre ambos grupos de muestras. Asimismo, AL133346.1/CCN2 se sobrexpresaron en pacientes ETV6- RUNX1-positivo vs. ETV6-negativo (fold change = 1 ,79, p ajustado = 0,036) [21], Además, tanto AL133346.1 como CCN2 estuvieron, individualmente, entre los principales RNAInc expresados diferencialmente y genes codificantes de proteínas, respectivamente (Figura 2) [42], En análisis anteriores de múltiples conjuntos de datos independientes, los niveles de expresión de AL133346.1 y CCN2 fueron los más fuertemente correlacionados entre todos los pares RNAInc/RNAm [21], Sus patrones de expresión diferenciales y su fuerte correlación nos llevaron a investigar más a fondo AL133346.1 CCN2 en bases de datos externas.
Ampliamos el análisis de AL133346.1/CCN2 al The Cancer Genome Atlas (TCGA) (TARGET-ALL-P1 y TARGET-ALL-P2), que es la mayor colección disponible de datos de expresión génica de ALL pediátrica. Después de excluir a los pacientes mayores de 14,99 años y aquellos sin datos de expresión de AL133346.1 y CCN2, la población TARGET consistió en 320 pacientes (120 LLA-B y 200 LLA-T). El conjunto de datos LLA-B pediátrica de TARGET consistió principalmente en muestras pre-B (112/120, 93,33%) siendo su cohorte más representativa el fenotipo común B (38/42, 90,48%). Debido a que no había mejores controles, evaluamos la especificidad de la expresión de AL133346.1 y CCN2 comparando su expresión en LLA-B y en LLA-T. Las LLA-B mostraron niveles de expresión mayores de AL133346.1 y CCN2 que LLA-T (Figura 3a). AL133346.1 y CCN2 se expresaron en todos los subtipos analizados de LLA-B pediátrica, expresando mayor cantidad las LLA-B ETV6/RUNX1 -positivas (Figura 7). Nuestros resultados se validaron también en la base de datos de de líneas celulares Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE) (Figura 3b). En general, estos resultados confirman que AL133346.1 y CCN2 se expresan en LLA-B pediátrica y que su expresión es baja o ausente en LLA-T. La expresión de AL133346.1/CCN2 está correlacionada en muestras pediátricas de LLA-B
Los RNAInc pueden regular la expresión de los RNAm mediante varios mecanismos, lo que puede dar como resultado un patrón de correlación significativo entre la expresión del RNAInc y el RNAm asociado [29], Previamente, nuestro grupo de investigación publicó que que existía una fuerte correlación positiva entre los niveles de RNAm de AL133346.1 y CCN2 en datos externos de tres estudios de microarrays con pacientes pediátricos con LLA-B [21],
Para confirmar estos hallazgos, realizamos un análisis de correlación de Spearman entre los niveles de expresión de AL133346.1 y CCN2 medidos por secuenciación de RNA en muestras LLA-B procedentes del proyecto TARGET y de la CCLE. Encontramos una correlación positiva estadísticamente significativa entre la expresión de AL133346.1 y CCN2 en pacientes pediátricos de LLA-B de TARGET (N = 120, coeficiente de correlación de Spearman = 0,717, p <0,0001). Por el contrario, los niveles de expresión de AL133346.1 y CCN2 no se correlacionaron en LLA-T pediátrica (N = 200, coeficiente de correlación de Spearman = 0,099, p = 0,163), sugiriendo que la correlación es específica de LLA-B o que AL133346. 1 no se expresa en LLA-T. De manera similar, obtuvimos una fuerte correlación en las líneas celulares LLA-B de la CCLE (N = 14, coeficiente de correlación de Spearman = 0.799, p = 0.001), mientras que esta correlación no se encontró en las líneas celulares LLA-T (N = 16) porque AL133346.1 no se expresó en ninguna línea celular LLA-T. Además, los niveles de RNAm y proteínas de CCN2 están moderadamente correlacionados (coeficiente de correlación de Spearman = 0,518, p = 0,001) según los datos de Yang y colbs [30],
Para evaluar si AL133346.1 podría estar involucrado en la regulación de otros genes, analizamos las correlaciones por pares de la expresión de AL133346.1 y la expresión de todos los genes (codificantes y no codificantes de proteínas) en nuestros datos del microarray y en TARGET. En nuestro propio microarray, que incluía 1906 genes codificadores de proteínas, la expresión de AL133346.1 solo se correlacionó significativamente con la expresión de CCN2. En los datos del proyecto TARGET, 9.080 genes mostraron una correlación estadísticamente significativa con la expresión de AL133346.1 en los datos de LLA-B pediátricos, y CCN2 se encontraba entre los 100 primeros. En cualquier caso, señalan que la correlación entre estos dos genes, AL133346.1 y CCN2, no significa necesariamente que uno de ellos modula al otro.
Análisis de los mecanismos de regulación de AL133346.1/CCN2 Aunque la expresión de un RNAInc y su gen codificante de proteína vecino se encuentre correlacionada, los RNAIncs podrían no estar regulando directamente a estos genes. Estudios de referencia en este campo han demostrado que la función de regulación que ejercen ciertos genes de RNAInc podrían no encontrarse en el mismo producto RNA sino en los elementos reguladores contenidos dentro del mismo gen del RNAInc. Así, un factor de transcripción común podría modular la expresión tanto del RNAInc como de su gen codificante de proteína vecino produciendo esta transcripción correlacionada [31 ,32], Para evaluar si este fenómeno puede explicar la coexpresión de AL133346.1 y CCN2, los inventores estudiaron la localización genómica de ambos genes y buscaron los promotes cercanos y las regiones reguladoras proximales. AL133346.1 y CCN2 se localizan en el cromosoma 6 (q23.2) en diferentes cadenas. Ambos genes se encuentran orientados “head-to-head” solapando parcialmente y sus lugares de inicio de transcripción se encuentran separados 2,770 pb. De acuerdo a la base de datos GeneHancer [33], que integra información sobre promotores y potenciadores de la transcripción de distintas bases de datos, AL133346.1 y CCN2 comparten dos de sus promotores/potenciadores predichos con alta puntuación: GH06J131946 y GH06J131976 (Figura 4). Estos dos potenciadores de transcripción se clasifican como potenciadores de alta probabilidad (anotados como “élite”) y muestran una fuerte asociación potenciador-gen. Los resultados de la corrrelación positiva mencionados anteriormente en LLA-B indican la posibilidad de que el gen codificante de proteína CCN2 y su RNAInc antisentido AL133346.1 se expresan de manera tejido específica cuando su locus se encuentra transcripcionalmente activo. Según estos resultados, los inventores proponen como modelo: (i) AL133346.1 regula la expresión de CCN2 en c/s; o (¡i) AL133346.1 y CCN2 se encuentran específicamente modulados en LLA-B por los mismos elementos reguladores.
Una elevada expresión de CCN2 se asocia con un mejor pronóstico
Para determinar el valor pronóstico de la expresión de AL133346.1 y CCN2, realizamos un análisis de supervivencia utilizando datos clínicos pediátricos de LLA-B de TARGET. La información clínica incluyó sexo, edad al diagnóstico, afectación del sistema nervioso central, t(12;21) [ETV6/RUNX1], t(1 ;19) [TCF3/PBX1], t(9;22) [BCR/ABL1], reordenamiento MLL, trisomía de los cromosomas 4 y 10 y número de cromosomas (Tabla de material complementario 2).
Encontramos una diferencia estadísticamente significativa entre los subgrupos de pacientes con expresión "alta" y "baja" de AL133346.1 y CCN2 y covariables clínicas (Figura 8, Figura 9; Tabla de material suplementario 3, en [42]). Dos de los parámetros clínicos más fiables para determinar la agresividad, las translocaciones t(12;21) [ETV6/RUNX1] y t(1 ;19) [TCF3/PBX1] [34], no se distribuyeron homogéneamente en los subgrupos analizados. Observamos que los subgrupos de expresión "alta" de AL133346.1 y CCN2 incluían el 90% y el 100% de los pacientes con la t(12;21) [ETV6- RUNX1], mientras que sólo tenían 29% y 0% de los pacientes con la t(1 ;19) [TCF3- PBX1], respectivamente (Figura 8, Figura 9; Tabla de material suplementario 3, en [42]). Los análisis univariables de Cox para las variables tradicionalmente relacionadas con la supervivencia en la LLA-B pediátrica revelaron que el género masculino (p = 0,030), la fusión del gen TCF3-PBX1 (p < 0,001) y la ploidía (hipodiploidía: p = 0,005; hiperdiploidía parcial: p = 0,033; hiperdiploidía alta: p = 0,019) se asociaron significativamente con una supervivencia más corta, mientras que la edad al diagnóstico (p = 0,186), la afectación del SNC (p = 0,943), la fusión del gen ETV6-RUNX1 (p = 0,490), la fusión del gen BCR- ABL1 (p = 0,689) y la trisomía de los cromosomas 4 y 10 (p = 0,418) no fueron estadísticamente significativas en esta cohorte. Al dividir a los pacientes usando la mediana de la expresión de AL133346.1 o CCN2, encontramos que los pacientes con alta expresión de CCN2 (CCN2 "high)" se asociaron con tiempos de supervivencia general (SG) más largos (p = 0,042; HR: 0,566, IC del 95%: 0,328-0,980) (Figura 5) mientras que no hubo asociación entre la SG y la expresión de AL133346.1 (p = 0,77) (Figura 10).
Aunque la expresión de AL133346.1 y CCN2 se correlacionaron significativamente, y CCN2 fue el gen codificante de proteína más altamente correlacionado con AL133346.1 , sólo CCN2 se asoció significativamente con OS. Este hecho se puede explicar porque la correlación entre AL133346.1 y CCN2 no es perfecta. Esto sugiere que AL133346.1 puede participar en procesos biológicos independientes de CCN2, lo que interferiría con la asociación de AL133346.1 con OS. Además, todas las covariables clínicas con p < 0,2 en el análisis univariable de Cox, junto con la expresión de CCN2, se utilizaron para un análisis multivariable de Cox. El gen de fusión TCF3-PBX1 fue la variable más importante en la SG de LLA-B pediátrica (p = 0,003). Estos resultados revelaron que la expresión "alta" de CCN2 (CCN2 ’’high”) podría ser un factor pronóstico asociado a una SG más prolongada (p = 0,045) (HR: 0,448, IC del 95%: 0,204-0,984) (Tabla de material suplementario 4, en [42]). Aunque el subgrupo de expresión "alta" de CCN2 se enriqueció significativamente en pacientes con la translocación t(12;21) [ETV6-RUNX1] (p = 0,0001) y sin la translocación t(1 ;19) [TCF3-PBX1] (p = 0,002) (Tabla de Material Complementario 3), no se encontró asociación entre t(12;21) [ETV6/RUNX1] y OS, y tuvieron en cuenta la translocación t(1 ;19) [TCF3-PBX1] en el modelo multivariable de Cox. Por tanto, la expresión de CCN2 podría distinguir entre dos subgrupos clínicamente diferentes independientemente de las translocaciones en las leucemias.
Finalmente, para evaluar si CCN2 podría ser un biomarcador de pronóstico específico de LLA-B pediátrica, los inventores realizaron un análisis de supervivencia utilizando datos clínicos de LLA-T (Tabla S5). La expresión "alta" de CCN2 no se asoció (p = 0,29) con un beneficio en la supervivencia para los pacientes con LLA-T (Figura 11a), lo que indica un papel específico de CCN2 en LLA-B pediátrica. Además, no hubo asociación entre la SG y la expresión de AL133346.1 (p = 0.39) en pacientes pediátricos con LLA- T (Figura 11b).
CCN2 pertenece a la familia de proteínas Cellular Communication Network (CCN). Esta familia de proteínas asociadas a la matriz extracelular se caracteriza por tener cuatro dominios conservados ricos en cisteína y está implicada en la señalización intercelular [35], En las neoplasias hematopoyéticas, la familia CCN juega un papel importante en la diferenciación de células madre hematopoyéticas (HSC) y células madre mesenquimales [36], El valor pronóstico de la familia de proteínas CCN varía en las diferentes neoplasias hematológicas [36], De acuerdo con sus resultados, vahos estudios correlacionaron significativamente la expresión de CCN2 con una mayor supervivencia global en linfomas tratados con quimioterapia [37,38], Sin embargo, se necesitan más estudios específicos en la LLA-B pediátrica para determinar si los niveles de expresión de CCN2 podrían influir en el resultado del tratamiento del paciente.
Referencias
1. Karol, S.E.; Pui, C. Personalized therapy in pediatric high-risk B-cell acute lymphoblastic leukemia. Therapeutic Advances in Hematology 2020; 11 : 2040620720927575. DOI: 10.1177/2040620720927575.
2. Malouf, C.; Ottersbach, K. Molecular processes involved in B cell acute lymphoblastic leukaemia. Cell Mol Life Sci. 2018; 75(3): 417-446. DOI: 10.1007/S00018-017-2620-z.
3. Hein, D.; Borkhardt, A.; Fischer, U. Insights into the prenatal origin of childhood acute lymphoblastic leukemia. Cancer Metastasis Rev. 2020; 39(1): 161-171. DOI: 10.1007/S10555-019-09841-1 .
4. Mohseni, M.; Uludag, H.; Brandwein, J.M. Advances in biology of acute lymphoblastic leukemia (ALL) and therapeutic implications. Am J Blood Res. 2018; 8(4): 29-56. PMID: 30697448. Terwilliger, T.; Abdul-Hay, M. Acute lymphoblastic leukemia: a comprehensive review and 2017 update. Blood Cancer J. 2017 Jun; 7(6): e577. DOI: 10.1038/bcj.2017.53. Coccaro, N.; Anelli, L; Zagaria, A.; Specchia, G.; Albano, F. Next-Generation Sequencing in Acute Lymphoblastic Leukemia. Int J Mol Sci. 2019 Jun; 20(12): 2929. DOI: 10.3390/ijms20122929. Medina, P.P.; Slack, F.J. microRNAs and cancer: an overview. Cell Cycle. 2008 Aug 15;7(16):2485-92. DOI: 10.4161/CC.7.16.6453. Trang, P.; Medina, P.P.; Wiggins, J.F.; Ruffino, L; Kelnar, K.; Omotola, M.; Homer, R.; Brown, D.; Bader, A.G.; Weidhaas J.B.; Slack, F.J. Regression of murine lung tumors by the let-7 microRNA. Oncogene 2010 Mar 18;29(11):1580-7. DOI: 10.1038/onc.2009.445. Medina, P.P.; Nolde, M.; Slack, F.J. OncomiR addiction in an in vivo model of microRNA-21-induced pre-B-cell lymphoma. Nature. 2010 Sep 2; 467(7311): 86-90. DOI: 10.1038/nature09284. Zhang, G.; Pian, C.; Chen, Z.; Zhang, J.; Xu, M.; Zhang, L; Chen, Y. Identification of cancer-related miRNA-IncRNA biomarkers using a basic miRNA-IncRNA network. PLoS One. 2018; 13(5): e0196681. DOI: 10.1371/journal.pone.0196681. Ponting, C.P.; Oliver, P.L.; Reik, W. Evolution and Functions of Long Noncoding RNAs. Cell. 2009; 136(4), 629-641. DOI: 10.1016/j.cell.2009.02.006. Marchese, F.P.; Raimondi, I.; Huarte, M. The multidimensional mechanisms of long noncoding RNA function. Genome Biology. 2017; 18(1). DOI: 10.1186/s 13059-017- 1348-2. Fu, S.; Wang, Y.; Hang, L.; Chen, L.; Liu, Q. Regulatory Networks of LncRNA MALAT-1 in Cancer. Cancer Manag Res. 2020 Oct 15; 12:10181-10198. DOI: 10.2147/CMAR.S276022. Carlevaro-Fita, J.; Lanzós, A.; Feuerbach, L.; Hong, C.; Mas-Ponte, D.; Pedersen, J.S.; PCAWG Drivers and Functional Interpretation Group; Johnson, R.; PCAWG Consortium. Cancer LncRNA Census reveals evidence for deep functional conservation of long noncoding RNAs in tumorigenesis. Commun Biol. 2020 Feb 5; 3(1):56. DOI: 10.1038/s42003-019-0741-7. Huarte, M. The emerging role of IncRNAs in cancer. Nat Med. 2015 Nov; 21 (11):1253-61. DOI: 10.1038/nm.3981 . Gandhi, M.; GroB, M.; Holler, J.M.; Coggins, S.A.; Patil, N.; Leupold, J.H.; Munschauer, M.; Schenone, M.; Hartigan, C.R.; Allgayer, H.; Kim, B.; Diederichs, S. The IncRNA lincNMR regulates nucleotide metabolism via a YBX1 - RRM2 axis in cancer. Nat Commun. 2020 Jun 25; 11 (1):3214. DOI: 10.1038/s41467-020- 17007- 9.
17. Schmitt, A.M.; Chang, H.Y. Long Noncoding RNAs in Cancer Pathways. Cancer Cell. 2016; 29(4), 452-463. DOI: 10.1016/j.ccell.2016.03.010.
18. Peinado, P.; Herrera, A.; Baliñas, C.; Martín- Padrón, J.; Boyero, L.; Cuadros, M.; Coira, I.F.; Rodríguez M.I.; Reyes-Zurita, F.J.; Rufino-Palomares, E.E.; Lupiáñez, J. A.; Medina, P.P. Cancer and Noncoding RNAs: Chapter 6 - Long Noncoding RNAs as Cancer Biomarkers. In: SM Chakrabarti J, M. Sanga, editors. 2018; Vol. 1 , Elsevier, p. 95-114.
19. Tang, Q.; Hann, S.S. HOTAIR: An Oncogenic Long Non-Coding RNA in Human Cancer. Cellular Physiology and Biochemistry 2018; 47(3), 893-913. DOI: 10.1159/000490131.
20. El-Khazragy, N.; Elayat, W.; Matbouly, S.; Seliman, S.; Sami, A.; Safwat, G.; Diab, A. The prognostic significance of the long non-coding RNAs “CCAT1 , PVT1” in t(8;21) associated Acute Myeloid Leukemia. Gene. 2019; 707, 172-177. DOI: 10.1016/j.gene.2019.03.055.
21. Cuadros, M.; Andrades, A.; Coira, I.F.; Baliñas, C.; Rodríguez, M.I.; Álvarez-Pérez, J.C.; Peinado, P.; Arenas, A.M.; García, D.J.; Jiménez, P.; Camós, M.; Jiménez- Velasco, A.; Medina, P.P. Expression of the long non-coding RNA TCL6 is associated with clinical outcome in pediatric B-cell acute lymphoblastic leukemia. Blood Cancer Journal. 2019; 9(12). DOI: 10.1038/s41408-019-0258-9.
22. Fernando, T.R.; Rodhguez-Malave, N.I.; Waters, E.V.; Yan, W.; Casero, D.; Basso, G.; Pigazzi, M.; Rao, D.S. LncRNA Expression Discriminates Karyotype and Predicts Survival in B-Lymphoblastic Leukemia. Molecular Cancer Research. 2015; 13(5), 839-851. DOI: 10.1158/1541 -7786. MCR-15-0006-T.
23. Dou, B.; Jiang, Z.; Chen, X.; Wang, C.; Wu, J.; An, J.; Sheng, G. Oncogenic Long Noncoding RNA DARS-AS1 in Childhood Acute Myeloid Leukemia by Binding to microRNA-425. Technol Cancer Res Treat. Jan-Dec 2020; 19:1533033820965580. DOI: 10.1177/1533033820965580.
24. Lu, J.; Wu, X.; Wang, L; Li, T.; Sun, L. Long noncoding RNA LINC00467 facilitates the progression of acute myeloid leukemia by targeting the miR-339/SKI pathway. Leuk Lymphoma. 2020 Oct 15; 1-10. DOI: 10.1080/10428194.2020.1832667.
25. Ghazavi, F.; et al.. Unique long non-coding RNA expression signature in ETV6/RUNX1 -driven B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia. 2016; Oncotarget, 7(45), 73769-73780. DOI: 10.18632/oncotarget.12063. 26. Ouimet, M.; Drouin, S.; Lajoie, M.; Caron, M.; St-Onge, P.; Gioia, R.; Sinnett, D. A childhood acute lymphoblastic leukemia-specific IncRNA implicated in prednisolone resistance, cell proliferation, and migration. Oncotarget. 2016; 8(5), 7477-7488. DOI: 10.18632/oncotarget.13936.
27. Bárcenas-López, D.A. et al. S. Transcriptome Analysis Identifies LINC00152 as a Biomarker of Early Relapse and Mortality in Acute Lymphoblastic Leukemia. Genes (Basel). 2020 Mar 13;11(3):302. DOI: 10.3390/genesl 1030302.
28. Zuo, W.; Zhou, K.; Deng, M.; Lin, Q.; Yin, Q.; Zhang, C.; Zhou, J.; Song, Y. LINC00963 facilitates acute myeloid leukemia development by modulating miR- 608/MMP-15. Aging (Albany NY). 2020 Oct 4; 12(19): 18970-18981. DOI: 10.18632/aging.103252.
29. Zhang, Y.; Xu, Y.; Feng, L; Li, F.; Sun, Z.; Wu, T.; Shi, X.; Li, J.; Li, X. Comprehensive characterization of IncRNA-mRNA related ceRNA network across 12 major cancers. Oncotarget. 2016 Sep 27; 7(39): 64148-64167. DOI: 10.18632/oncotarget.11637.
30. Yang M., Vesterlund M., Siavelis I., Moura-Castro L.H., Castor A., Fioretos T. Proteogenomics and Hi-C reveal transcriptional dysregulation in high hyperdiploid childhood acute lymphoblastic leukemia. Nature Communications. Volume 10, Article number: 1519 (2019). DOI: 10.1038/s41467-019-09469-3).
31. Paralkar, V.R.; Taborda, C.C.; Huang, P.; Yao, Y.; Kossenkov, A.V.; Prasad, R.; Luán, J.; Davies, J.O.J.; Hughes, J.R.; Hardison, R.C.; Blobel, G.A.; Weiss, M.J. Unlinking an IncRNA from Its Associated cis Element. Mol Cell. 2016 Apr 7;62(1):104-10. DOI: 10.1016/j.molcel.2016.02.029.
32. Kopp, F.; Mendell, J.T. Functional Classification and Experimental Dissection of Long Noncoding RNAs. Cell 2018 Jan 25;172(3):393-407. DOI: 10.1016/j.cell.2018.01 .011 .
33. Fishilevich, S.; Nudel, R.; Rappaport, N.; Hadar, R.; Plaschkes, I.; Stein, T.I.; Rosen, N.; Kohn, A.; Twik, M.; Safran, M.; Lancet, D.; Cohen, D. GeneHancer: genomewide integration of enhancers and target genes in GeneCards. Database (Oxford). 2017; bax028. DOI: 10.1093/database/bax028.
34. Kang, H.; et al.. Gene expression classifiers for relapse-free survival and minimal residual disease improve risk classification and outcome prediction in pediatric B- precursor acute lymphoblastic leukemia. Blood. 2010; 115(7), 1394-1405. DOI: 10.1182/blood-2009-05-218560.
35. Perbal, B. CCN proteins: A centralized communication network. J Cell Commun Signal 2013 Aug;7(3): 169-77. DOI: 10.1007/s12079-013-0193-7. 36. Wells, J.E.; Howlett, M.; Cheung, L.C.; Kees, U.R. The role of CCN family genes in haematological malignancies. J Cell Commun Signal 2015 Sep;9(3):267-78. DOI: 10.1007/S12079-015-0296-4.
37. Lenz, G. et al. .; Lymphoma/Leukemia Molecular Profiling Project. Stromal gene signatures in large-B-cell lymphomas. N Engl J Med. 2008 Nov 27;359(22):2313-23. DOI: 10.1056/NEJMoa0802885.
38. Rimsza, L.M.; et al. Gene expression predicts overall survival in paraffin-embedded tissues of diffuse large B-cell lymphoma treated with R-CHOP. Blood. 2008 Oct 15;112(8):3425-33. DOI: 10.1182/blood-2008-02- 137372.
39. Chen, E.Y.; Tan, C.M.; Kou, Y.; Duan, Q.; Wang, Z.; Meirelles, G.V.; Clark, N.R.; Ma’ayan, A. Enrichr: interactive and collaborative HTML5 gene list enrichment analysis tool. BMC Bioinformatics. 2013; 14, 128. DOI: 10.1186/1471-2105-14-128.
40. Kuleshov, M.V.; et al. Enrichr: a comprehensive gene set enrichment analysis web server 2016 update. Nucleic Acids Res. 2016 Jul 8; 44(Web Server issue): W90- W97. DOI: 10.1093/nar/gkw377.
41. Supek, F.; Bosnjak, M.; Skunca, N.; Smuc, T. REVIGO summarizes and visualizes long lists of gene ontology terms. PLoS One. 2011 ; e21800. DOI: 10.1371/journal.pone.0021800.
42. Cuadras, M., Garcia, D. J.. Andrades, A., Arenas, A. ., Coira, I. F., Baiiñas-Gavira, C., . & Medina, P. P. (2020). LncRNA-mRNA Co-Expression Analysis identifies AL133346. 1/CCN2 as Biomarkers in Pediatric B-Cell Acute Lymphoblastic Leukemia. Cancers, 12(12), 3803. [doi:10.3390/cancers12123803]

Claims

REIVINDICACIONES
1.- Uso del IncRNA AL133346.1 como marcador para el diagnóstico, prognosis, prevención, mejora o alivio en el tratamiento de la leucemia linfoblástica aguda de células B pediátrica.
2.- Uso del IncRNA AL133346.1 como marcador para el diagnóstico de la leucemia linfoblástica aguda de células B pediátrica.
3.- Uso, según reivindicación anterior, que además emplea al menos otros RNAs mensajeros (mRNA) para el diagnóstico de la leucemia linfoblástica aguda pediátrica.
4.- Uso, según reivindicación anterior, en el que el mRNA es CCN2.
5.- Método de obtención de datos útiles, para el diagnóstico, prognosis, prevención, mejora o alivio en el tratamiento de la leucemia linfoblástica aguda, que comprende: i) obtención de una muestra aislada de médula ósea del individuo
¡i) cuantificar las cantidades de IncRNA AL133346.1 expresadas en dicha muestra.
6.- Método de obtención de datos útiles, según reivindicación anterior, que además comprende la cuantificación de las cantidades de uno o más mRNAs presentes en la muestra.
7.- Método de obtención de datos útiles, según reivindicación anterior, en la que el mRNA es CCN2.
8.- Método según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, que además comprende: iii) comparar las cantidades de mRNA cuantificadas con unas cantidades de referencia
9.- El método según cualquiera de las reivindicaciones 5-8, donde los pasos (¡i) e (iii) pueden ser total o parcialmente automatizados.
10.- Un método según cualquiera de las reivindicaciones 7-10, que además comprende asignar al individuo del que se toma la muestra al grupo de individuos que padecen leucemia linfoblástica aguda pediátrica cuando presentan unos niveles de expresión del
23 IncRNA AL133346.1 , de AL133346.1 y otro mRNA, o de AL133346.1 y CCN2, superiores a la cantidad de referencia.
11.- Método según las reivindicaciones anteriores, donde la muestra biológica es una muestra de médula ósea.
12.- Un kit o dispositivo para diagnosticar leucemia linfoblástica aguda pediátrica de células B que comprende los elementos necesarios para detectar los niveles de expresión de IncRNA AL133346.1
13.- Un kit o dispositivo según reivindicación anterior que comprende los elementos necesarios para detectar los niveles de expresión de IncRNA y al menos un mRNA.
14.- Un kit o dispositivo según reivindicación anterior que comprende los elementos necesarios para detectar los niveles de expresión de IncRNA y CCN2.
15.- Un kit, según reivindicaciones 12, 13 o 14, que comprende primers, sondas y/o anticuerpos capaces de detectar y cuantificar las cantidades de mRNA expresados mediante RT-PCR.
16.- Programa de ordenador que implementa el procedimiento para que cualquier medio de procesamiento pueda llevar a cabo los métodos según reivindicaciones 5 a 11.
PCT/ES2021/070899 2020-12-15 2021-12-15 Biomarcadores para el diagnóstico, prognosis, prevención, mejora o alivio en el tratamiento de la leucemia linfoblástica aguda de células b pediátrica Ceased WO2022129668A1 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ES202031253A ES2914723A1 (es) 2020-12-15 2020-12-15 Biomarcadores para el diagnóstico, prognosis, prevención, mejora o alivio en el tratamiento de la leucemia linfoblástica aguda de células B pediátrica
ESP202031253 2020-12-15

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2022129668A1 true WO2022129668A1 (es) 2022-06-23

Family

ID=81972116

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/ES2021/070899 Ceased WO2022129668A1 (es) 2020-12-15 2021-12-15 Biomarcadores para el diagnóstico, prognosis, prevención, mejora o alivio en el tratamiento de la leucemia linfoblástica aguda de células b pediátrica

Country Status (2)

Country Link
ES (1) ES2914723A1 (es)
WO (1) WO2022129668A1 (es)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010056351A2 (en) * 2008-11-14 2010-05-20 Stc.Unm Gene expression classifiers for relapse free survival and minimal residual disease improve risk classification and out come prediction in pedeatric b-precursor acute lymphoblastic leukemia

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2640524B1 (es) * 2016-04-01 2018-09-24 Universidad Autónoma de Madrid Uso de tcfl5/cha como nuevo marcador para el pronóstico y/o diagnóstico diferencial de leucemias linfoblásticas agudas

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010056351A2 (en) * 2008-11-14 2010-05-20 Stc.Unm Gene expression classifiers for relapse free survival and minimal residual disease improve risk classification and out come prediction in pedeatric b-precursor acute lymphoblastic leukemia

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AFFINITO ORNELLA, PANE KATIA, SMALDONE GIOVANNI, ORLANDELLA FRANCESCA MARIA, MIRABELLI PEPPINO, BENEDUCE GIULIANA, PARASOLE ROSANN: "lncRNAs–mRNAs Co–Expression Network Underlying Childhood B–Cell Acute Lymphoblastic Leukaemia: A Pilot Study", CANCERS, vol. 12, no. 9, 2 September 2020 (2020-09-02), pages 2489, XP055950003, DOI: 10.3390/cancers12092489 *
CUADROS MARTA, ANDRADES ÁLVARO, COIRA ISABEL F., BALIÑAS CARLOS, RODRÍGUEZ MARÍA I., ÁLVAREZ-PÉREZ JUAN CARLOS, PEINADO PAOLA, ARE: "Expression of the long non-coding RNA TCL6 is associated with clinical outcome in pediatric B-cell acute lymphoblastic leukemia", BLOOD CANCER JOURNAL, vol. 9, no. 12, 1 December 2019 (2019-12-01), pages 93, XP055950007, DOI: 10.1038/s41408-019-0258-9 *
CUADROS MARTA, GARCÍA DANIEL J., ANDRADES ALVARO, ARENAS ALBERTO M., COIRA ISABEL F., BALIÑAS-GAVIRA CARLOS, PEINADO PAOLA, RODRÍG: "LncRNA-mRNA Co-Expression Analysis Identifies AL133346.1/CCN2 as Biomarkers in Pediatric B-Cell Acute Lymphoblastic Leukemia", CANCERS, vol. 12, no. 12, 17 December 2020 (2020-12-17), pages 3803, XP055949996, DOI: 10.3390/cancers12123803 *
D. GARCÍA, M. CUADROS, A. ANDRADES, A. ARENAS, I. COIRA, C. BALIÑAS-GAVIRA, P. PEINADO, M. RODRÍGUEZ, J. ÁLVAREZ-PÉREZ, F. RUIZ-CA: "O0216 / #525 Bioinformatic Analysis Identifies SpecificCo-Expression of LNCRNA/MRNA in Pediatric B-Cell AcuteLymphoblastic Leukemia", PEDIATRIC BLOOD AND CANCER, vol. 68, no. S5, 31 October 2021 (2021-10-31) - 24 October 2021 (2021-10-24), pages S108 - S109, XP009538261, ISSN: 1545-5017, DOI: 10.1002/pbc.29349 *
LAJOIE MATHIEU, DROUIN SIMON, CARON MAXIME, ST-ONGE PASCAL, OUIMET MANON, GIOIA ROMAIN, LAFOND MARIE-HÉLÈNE, VIDAL RAMON, RICHER C: "Specific expression of novel long non-coding RNAs in high-hyperdiploid childhood acute lymphoblastic leukemia", PLOS ONE, vol. 12, no. 3, 27 March 2017 (2017-03-27), pages e0174124, XP055950022, DOI: 10.1371/journal.pone.0174124 *
SI JJ, WANG WM, YU D, GAN SL, WU FF, SUN L, WAN DM, XIE XS, LIU YF, WANG C, SUN H: "Long Non Coding RNA RP11-69I8.3 expression in acute leukemia and its clinical significance", ZHONGGUO SHI YAN XUE YE XUE ZA ZHI = JOURNAL OF EXPERIMENTAL HEMATOLOGY, vol. 26, no. 4, 31 July 2018 (2018-07-31), CN , pages 978 - 983, XP009538338, ISSN: 1009-2137, DOI: 10.7534/j.issn. 1009-2137 . 2018.04.00 6 *
WANG W., MA J., GAN S., JIANG Z., SUN L., SUN H.: "PF171 DIFFERENTIAL EXPRESSION PATTERNS OF SPECIFIC LONG NONCODING RNAS AND COMPETING ENDOGENOUS RNA NETWORK IN ACUTE LYMPHOCYTE LEUKEMIA", HEMASPHERE, vol. 3, no. S1, 13 June 2019 (2019-06-13), pages 37, XP055950017, DOI: 10.1097/01.HS9.0000558900.13359.d2 *

Also Published As

Publication number Publication date
ES2914723A1 (es) 2022-06-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Ma et al. USP1 inhibition destabilizes KPNA2 and suppresses breast cancer metastasis
Hassan et al. The expression profile and prognostic significance of eukaryotic translation elongation factors in different cancers
Idichi et al. Regulation of actin-binding protein ANLN by antitumor miR-217 inhibits cancer cell aggressiveness in pancreatic ductal adenocarcinoma
Ji et al. MicroRNA-181a promotes tumor growth and liver metastasis in colorectal cancer by targeting the tumor suppressor WIF-1
Lin et al. RETRACTED ARTICLE: MicroRNA-30d promotes angiogenesis and tumor growth via MYPT1/c-JUN/VEGFA pathway and predicts aggressive outcome in prostate cancer
Lim et al. Overexpression of miR-196b and HOXA10 characterize a poor-prognosis gastric cancer subtype
Shapiro et al. An EMT–driven alternative splicing program occurs in human breast cancer and modulates cellular phenotype
Ayoub et al. ANO1 amplification and expression in HNSCC with a high propensity for future distant metastasis and its functions in HNSCC cell lines
Sun et al. C/EBP-β-activated microRNA-223 promotes tumour growth through targeting RASA1 in human colorectal cancer
Wang et al. MiR-196a binding-site SNP regulates RAP1A expression contributing to esophageal squamous cell carcinoma risk and metastasis
Fukumoto et al. The tumor-suppressive microRNA-23b/27b cluster regulates the MET oncogene in oral squamous cell carcinoma
Wu et al. Global phosphotyrosine survey in triple-negative breast cancer reveals activation of multiple tyrosine kinase signaling pathways
Kumar et al. Reduced expression of IQGAP2 and higher expression of IQGAP3 correlates with poor prognosis in cancers
Li et al. Dysregulated miR-27a-3p promotes nasopharyngeal carcinoma cell proliferation and migration by targeting Mapk10
Chen et al. Characterization of tumor suppressive function of cornulin in esophageal squamous cell carcinoma
Zhao et al. Increased IGFBP7 expression correlates with poor prognosis and immune infiltration in gastric cancer
Li et al. Increased expression of miR-93 is associated with poor prognosis in head and neck squamous cell carcinoma
Wen et al. USP33, a new player in lung cancer, mediates Slit-Robo signaling
Shenoy et al. Molecular implications of HOX genes targeting multiple signaling pathways in cancer
CA3044709A1 (en) Method to distinguish tumor suppressive foxo activity from oxidative stress
Yang et al. Prognosis and modulation mechanisms of COMMD6 in human tumours based on expression profiling and comprehensive bioinformatics analysis
Swellam et al. Potential diagnostic role of circulating MiRNAs in breast cancer: Implications on clinicopathological characters
Han et al. HOXB1 is a tumor suppressor gene regulated by miR-3175 in glioma
Radhakrishnan et al. Dysregulation of splicing proteins in head and neck squamous cell carcinoma
Guo et al. miR-193b directly targets STMN1 and inhibits the malignant phenotype in colorectal cancer

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 21905877

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 21905877

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1